BRPI0715036A2

BRPI0715036A2 - mÉtodo de expansço para cÉlulas-tronco adultas do sangue, particulamente sangue perifÉrico, e aplicaÇço relativa no campo mÉdico

Info

Publication number: BRPI0715036A2
Application number: BRPI0715036-9A
Authority: BR
Inventors: Alessandra Gambacurta; Marco Polettini
Original assignee: Sales Engineering Ag
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2007-09-11
Publication date: 2013-05-28
Also published as: AU2007299043A1; EP2076588B1; IL197575A; CN101553565B; ITRM20060498A1; WO2008034740A1; RS53039B; JP2010504083A; ES2435080T3; KR101570446B1; US20120308535A1; SI2076588T1; US8263400B2; JP5340941B2; CN101553565A; CA2663072A1; ZA200901748B; AU2007299043B2; IL197575A0; EA200970294A1

Abstract

MÉTODO DE EXPANSçO PARA CÉLULAS-TRONCO ADULTAS DO SANGUE, PARTICULARMENTE SANGUE PERIFÉRICO, E APLICAÇçO RELATIVA NO CAMPO MÉDICO. O método para a expansão das células-tronco adultas do sangue, particularmente, mas não exclusivamente do sangue periférico, compreendendo uma primeira etapa de expansão das células-tronco do sangue, imediatamente após elas terem sido coletadas, por meio do tratamento in vitro com MCSF em uma concentração compreendida entre 8-15 nM e uma segunda etapa de purificação das células-tronco expandidas.

Description

"MÉTODO DE EXPANSÃO PARA CÉLULAS-TRONCO ADULTAS DO SANGUE, PARTICULARMENTE SANGUE PERIFÉRICO, E APLICAÇÃO RELATIVA NO CAMPO MÉDICO"

A presente invenção diz respeito a um método de expansão para células-tronco do sangue, particularmente, mas não exclusivamente, do sangue periférico de mamíferos adultos, e a aplicação relativa no campo médico, em particular no campo veterinário, para o tratamento de lesões, patologias inflamatórias crônicas e/ou agudas, e patologias neurológicas e neurodegenerativas.

Aqui, e doravante na descrição, e como é conhecida na literatura, a palavra "expansão" refere-se ao processo de aumentar o número de células seja por divisão celular ou, como no caso específico descrito e reivindicado, pela "desdiferenciação", ou seja, o processo pelo qual as células presentes no sangue são transformadas em células-tronco após o tratamento adequado in vitro, como será visto adiante.

Nos anos recentes, o uso de células tronco na terapia tem tido grande aprovação devido ao sucesso obtido no tratamento de várias patologias anteriormente consideradas incuráveis. Entretanto, os processos para obter células-tronco conhecidos até agora têm sido trabalhosos e dispendiosos.

As células-tronco pluripotentes (PSC) são uma fonte disponível não só para pesquisa, mas também para a criação de medicamentos para transplantes (Wagers A. J. e outros., 2002; Griffith L. G. e outros., 2002).

Existem duas categorias amplas de células-tronco, embrionárias e adultas: a primeira deriva de embriões, e mais exatamente de blastocistos de 8 dias, enquanto que ao contrário, as células-tronco adultas podem ser obtidas principalmente da medula óssea, tecido adiposo ou muscular e do sangue periférico.

A definição de célula-tronco está constantemente evoluindo e, no momento, não existe um consenso geral ou método padrão para isolá-las ou identificá-las. Para todas essas células, embrionárias (ES) e adultas, tanto hematopoiéticas (HSC) como mesenquimais (MSC) (Kuwana M. e outros., 2003), foram identificados diferentes marcadores genéticos, alguns dos quais são comuns a vários tipos de células (Condomines M. e outros., 2006; Kang W. J. e outros., 2006; Zhao Y. e outros., 2003;

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Rabinovitch M. e outros., 1976).

Em particular, Zhao Y. e outros, tanto no Artigo "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as , 15 pluripotent stem cells" como no WO 2004/043990, revelam um método para preparar células-tronco derivadas de monócito, o qual inclui as etapas de isolamento de um monócito do sangue periférico, o contato dele com um componente mitogênico e subseqüentemente a cultura do monócito do sangue periférico sob condições adequadas para a propagação das células.

Este método, que requer em primeiro lugar uma etapa de isolamento do monócito e em segundo lugar, uma etapa de expansão em um meio de cultura, envolve tempo muito longo para obter um número significativo de células-tronco, na ordem de 15-20 dias, e não é capaz de obter células-tronco do tipo totipotente, ou seja, não-especializadas, adequadas para serem diretamente inoculadas no paciente em tempo bem curto a partir da primeira coleta. Inúmeros trabalhos científicos descrevem a habilidade de as célula-tronco regenerarem diferentes tipos de lesões, regenerando tecidos mecanicamente danificados ou danificados por várias patologias, eliminando a causa-raiz que gerou a patologia e não simplesmente agindo sobre seus efeitos.

No momento, a pesquisa está mais voltada para o uso de células-tronco isoladas do tecido embrionário, fetos ou do cordão umbilical, mas isto está levantando várias questões éticas e legais. Acima de tudo, hoje o uso dessas células traz várias contra-indicações tais como os riscos de infecção, de rejeição se transplantadas e, em cavalos, o surgimento de teratomas.

Γ

Para atenuar esses problemas, foi pensado, portanto, em usar na terapia "in vivo" as células-tronco autólogas isoladas preferivelmente da medula óssea, tecido adiposo ou sangue periférico. Esses métodos, usados a partir das células-tronco adultas, fornecem uma etapa de diferenciação "in vitro" (ou "ex vivo") das células-tronco na linhagem celular desejada por meio de fatores específicos de indução da diferenciação, e uma etapa subsequente de transplante "in vivo" da linhagem celular diferenciada obtida. Nesses métodos, o limite se deve ao fato de ocorrerem fenômenos de rejeição observáveis devido às células diferenciadas introduzidas no paciente não serem reconhecidas como células autólogas, pois durante a etapa de diferenciação induzida in vitro elas perdem o auto-reconhecimento. No homem, retirar células-tronco do sangue

periférico exige sua purificação através de um processo denominado "aferese" ou "leucoferese". Na prática, as células são extraídas do sangue, coletadas e então inoculadas nos pacientes imediatamente após a quimioterapia ou radioterapia. Na aferese, que dura de 6 a 8 horas, o sangue é retirado da veia de um braço ou da veia do pescoço ou do tórax e passado através de uma máquina que remove as células-tronco. O sangue assim purificado retorna para o paciente, enquanto as células coletadas são preservadas por meio de refrigeração em nitrogênio liquido (Condomines M. e outros., 2006; Kang W.J. e outros., 2006). Esta técnica não é apenas dolorosa, mas também extremamente estressante para o paciente. Além do mais, é impraticável para animais de pequeno ou grande porte; acima de tudo, a técnica não fornece uma discriminação e/ou purificação real das células-tronco circulantes.

Atualmente, na ciência veterinária, as células- tronco são usadas com sucesso principalmente na reconstrução de tendões e ligamentos lesionados. As principais técnicas de purificação são:

- uso de fatores do crescimento ou derivados de plaquetas (TGF-B, VEGF), mas os custos econômicos de sua extração são proibitivos (Hou M. e outros., 2006); - isolamento de células-tronco retiradas da

medula óssea. Esta técnica permite sua purificação e então o uso para terapia somente de 15% das células contidas no material extraído;

isolamento de células-tronco retiradas do tecido adiposo. Esta técnica, que requer a remoção cirúrgica prévia de quantidades consideráveis de tecido do animal doador, não permite a administração intravenosa;

IGF-I (fator de crescimento 1 similar à "1 ■ 5

insulina) conhecido como Tendotrofina (Fiedler J. e outros., 2006);

- UBM (matriz de bexiga urinária) : esta é um derivado de porco contendo citocina (mas não células nucleadas), que induz a cicatrização da ferida mas não a regeneração da zona com lesões (Zhang Y.S. e outros., 2005).

Em vista do acima, é óbvio que são necessários métodos para a expansão e purificação de células-tronco adultas de fontes facilmente acessíveis que devem também permitir a obtenção de células-tronco adequadas para uso como medicação no campo médico-veterinário as quais, quando administradas no mamífero, não dêem origem ao fenômeno de rejeição e que sejam fáceis de preservar.

Existe também uma necessidade óbvia de obter células-tronco do tipo pluripotente e totipotente, ou seja, não- especializadas, que possam ser inoculadas diretamente no paciente e com tempo de produção muito mais curto do que o obtido presentemente.

Os autores da presente invenção aperfeiçoaram agora um método para a expansão e purificação in vitro de células- tronco do sangue periférico que permite obter células-tronco que não ocasionam efeitos colaterais tais como os fenômenos da rejeição, infecção, teratomas, quando administradas no mamífero adulto, capazes de serem diferenciadas "in vivo" e comportar-se como células-tronco pluripotentes.

Os autores observaram que as células assim expandidas, quando injetadas local ou intravenosamente, adquirem "in vivo" (e não "in vitro", como os métodos conhecidos no estado da técnica por meio de fatores de crescimento adequados e/ou estímulos químicos (Gulati R. e outros., 2003; Katz R. L. e outros., 2002; Okazaki T. e outros., 2005)) todas as características morfológicas e químicas das células macrofágicas, linfocíticas, epiteliais, endoteliais, neuronais e hepatocitárias, de acordo com as necessidades e patologias dos animais tratados. O método é ainda menos invasivo do que outros métodos utilizados até agora para coletar células-tronco, indolor (se comparado com a aferese), econômico e tecnicamente o mais adequado para ser usado em todas as espécies animais (pequenos e grandes).

Finalmente, a possibilidade de se obter essas células facilmente e então ser capaz de preservá-las por um longo tempo refrigeradas em nitrogênio líquido torna as células obtidas com o método de acordo com a invenção adequadas para transplantes autólogos, para o tratamento de várias patologias humanas e veterinárias (lesões de vários tipos, doenças metabólicas, patologias neurológicas e inflamatórias agudas e crônicas) ou para o melhoramento do desempenho competitivo de alguns animais tais como os cavalos.

A presente invenção, portanto, diz respeito

especificamente a um método para a expansão de células-tronco adultas do sangue, particularmente mas não exclusivamente, do sangue periférico, compreendendo as seguintes etapas.

A primeira etapa compreende duas subetapas: a) uma primeira subetapa de expansão das células-

tronco do sangue, particularmente, mas não exclusivamente, do sangue periférico, imediatamente após elas terem sido retiradas, por meio de tratamento in vitro com MCSF (Fator Estimulante da Colônia de Macrófagos) em uma concentração compreendida entre 8-15 nM, pref erivelmente 10 nM; a etapa de expansão pode ter uma duração variável dependendo das condições nas quais o tratamento in vitro é realizado; os autores verificaram experimentalmente que uma duração do tratamento in vitro com MCSF compreendida entre 24 e 96 horas, sendo mais vantajoso entre 48 e 72 horas, levou à estabilização da expansão, com identificação da presença simultânea dos marcadores CD 90, CD34 e CD 90/CD 34 misturados. Esta condição foi considerada a ideal. "Imediatamente" significa aqui o tempo mais curto

possível entre a coleta das células-tronco do sangue e o início do tratamento in vitro, de qualquer modo não mais que 10 minutos, sendo mais vantajoso não mais que 5 minutos (para evitar a coagulação do sangue e para obter o número de células-tronco necessárias no menor tempo entre a amostra de sangue e o tratamento final).

b) após a primeira subetapa, uma segunda subetapa de purificação, preferivelmente por meio de fracionamento em gradiente de Ficoll. A etapa de purificação é fundamentalmente

projetada para destruir os corpúsculos vermelhos.

Portanto, ao contrário do estado da técnica, a presente invenção fornece primeiramente uma etapa de expansão das células, contatando-as com MCSF e um possível produto anticoagulante, por exemplo, em um tubo de ensaio adequado; essa etapa de expansão é realizada imediatamente após as células do sangue terem sido retiradas do paciente, sem isolar partes específicas delas e sem usar qualquer meio de cultura. Uma configuração da presente invenção diz respeito ao dito método de expansão para células-tronco do sangue periférico de mamíferos adultos.

Após a etapa de purificação, uma outra etapa é

provida:

c) expansão adicional das células-tronco do sangue, particularmente mas não exclusivamente do sangue periférico, purificadas na etapa b) por meio de tratamento in vitro com MCSF em uma concentração entre 35-55 nM, preferivelmente 50 nM, mais preferivelmente 45 nM.

Esta etapa também pode ter uma duração variável entre 24 e 96 horas, preferivelmente entre 48 e 72 horas.

Foi observado que usando MCSF em uma concentração acima de 55 nM (isto é 70 nM) logo após 24 horas, as células não mantêm o fenótipo de células-tronco pluripotentes (vide a fig. 12). Em particular, a etapa a) da expansão prévia em suspensão com MCSF imediatamente após o sangue ter sido coletado permite aumentar a porcentagem de células-tronco (vide a fig. 13). A etapa subsequente permite obter células-tronco pluripotentes que são diferenciadas diretamente in vivo, sem causar os fenômenos de rejeição ou infecção.

A invenção também diz respeito ao uso de células- tronco adultas obtidas de acordo com o método de expansão descrito acima para a preparação de uma medicação para tratar lesões. As lesões tratáveis são aquelas do grupo ao qual as seguintes pertencem: lesões cutâneas, lesões dos tendões, lesões dos ligamentos, lesões ósseas, lesões das membranas mucosas em mamíferos ou fraturas. A presente invenção também diz respeito ao uso de células-tronco adultas obtidas de acordo com o método descrito para a preparação de uma medicação para tratar patologias neurológicas ou neurodegenerativas escolhidas do grupo que inclui: doença de Cushing, balanço da cabeça, sindrome de Wobbler, dificuldades respiratórias, paralisia dos membros; patologias inflamatórias agudas ou crônicas escolhidas entre laminite, periostite, gastrite, artrose, inflamações causadas por agentes virais, bacterianos, parasitários, micóticos; dilatação-torção do estômago em mamíferos.

A invenção também diz respeito ao uso de células- tronco obtidas com o método de acordo com a invenção para tratar infertilidade em éguas, precocidade em potros e para melhorar o desempenho competitivo em mamíferos. A presente invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica consistindo nas células-tronco adultas obtidas de acordo com o método de expansão descrito acima como princípio ativo, juntamente com adjuvantes e/ou excipientes farmacologicamente aceitáveis.

De acordo com uma forma particularmente preferida de configuração, as células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido acima, usadas como princípio ativo, estão presentes em uma concentração entre 90-250xl03 células/ml na composição, preferivelmente 150xl03 células/ml, juntamente com os adjuvantes e/ou excipientes farmacologicamente aceitáveis, sendo a dita composição formulada para injeção intravenosa.

De acordo com uma forma alternativa de configuração, as células-tronco adultas obtidas de acordo com o método de expansão definido acima, usadas como princípio ativo, estão presentes em uma concentração compreendida entre 4-40xl06 células/ml na composição, juntamente com os adjuvantes e/ou excipientes farmacologicamente aceitáveis, sendo a dita composição formulada para aplicação local (também tópica no caso de feridas externas).

As composições farmacêuticas mencionadas acima podem também compreender um antibiótico como principio ativo em uma concentração compreendida entre 5-15 nM, preferivelmente 10 nM, de acordo com uma forma particularmente preferida de configuração da invenção. Preferivelmente o dito antibiótico é gentamicina ou amicacina.

A invenção também diz respeito ao uso de uma composição farmacêutica conforme definido acima (isto é, adequada para aplicação local, com ou sem antibiótico) como medicação para tratar lesões escolhidas entre o grupo consistindo em lesões cutâneas, lesões dos tendões, lesões dos ligamentos, lesões ósseas, lesões das membranas mucosas em mamíferos.

De acordo com uma outra característica, a invenção diz respeito ao uso da composição farmacêutica conforme definido acima (isto é, adequada para aplicação local, com ou sem antibiótico) como uma medicação para tratar fraturas em mamíferos.

A presente invenção também diz respeito ao uso de uma composição farmacêutica conforme definido acima (isto é, adequada para administração intravenosa), como medicação para tratar patologias neurológicas ou neurodegenerativas escolhidas do grupo que inclui: doença de Cushing, balanço da cabeça, síndrome de Wobbler, dificuldades respiratórias, paralisia dos membros em mamí feros - 10 r

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De acordo com uma outra forma de configuração, a invenção diz respeito ao uso de uma composição farmacêutica conforme definido acima (isto é, adequada para administração intravenosa), como medicação para tratar patologias inflamatórias agudas ou crônicas escolhidas entre laminite, periostite, gastrite, artrose, inflamações causadas por agentes virais, bacterianos, parasitários, micóticos em mamíferos.

A invenção também diz respeito ao uso da composição farmacêutica conforme definido acima (isto é, adequada para a administração intravenosa), como medicação para tratar a síndrome de dilatação-torção do estômago em mamíferos. A composição farmacológica de acordo com a invenção é também usável em patologias da vesícula biliar, patologias cardiovasculares, estresse com conseqüente depressão e, na reprodução, infertilidade das éguas e precocidade dos potros e também para melhorar as atividades competitivas dos animais.

Em uma forma preferencial de configuração da presente invenção, os usos no campo médico têm uma aplicação preferida no campo veterinário e os mamíferos tratados são escolhidos entre cavalos, cães, gatos ou o homem.

A presente invenção será agora descrita como um exemplo não-restritivo em suas formas preferidas de configuração, com referência particular ao desenhos aqui anexos:

A Fig. 1 mostra uma lesão de 20 cm entre o metatarso e a primeira falange com clostrídia e destruição do tendão extensor em uma égua;

A Fig. 2 mostra a mesma égua da fig 1 três meses após a aplicação local das células-tronco de acordo com a invenção;

A Fig. 3 mostra a égua após seis meses de

tratamento;

A Fig. 4 mostra a ultrassonografia de um cavalo com uma lesão de 80% da superfície do tendão flexor;

A Fig. 5 mostra a ultrassonografia do cavalo cerca de três meses e meio após o tratamento local com células- tronco de acordo com a invenção;

A Fig. 6 mostra a ultrassonografia do cavalo cerca de três meses e meio após o tratamento local com células- tronco;

A Fig. 7 mostra a ultrassonografia do cavalo após cerca de quatro meses do tratamento local; observa-se a regeneração quase completa do tendão e a ausência de tecido de cicatriz;

A Fig. 8 mostra a ultrassonograf ia de uma égua com lesão no tendão de entidade menor (menos de 1 cm de diâmetro);

A Fig. 9 mostra a ultrassonografia da mesma égua da fig. 7 após um mês de tratamento local; A Fig. 10 mostra um cavalo de 17 anos de idade

com debilitação geral, operado por cólica, antes do tratamento com as células-tronco de acordo com a invenção;

A Fig. 11 mostra o desempenho do cavalo de 17 anos após o tratamento intravenoso com as células-tronco de acordo com a invenção;

A Fig. 12 mostra o número de células obtidas com diferentes quantidades de MCSF da etapa c) do presente método (para determinar a concentração ideal de MCSF): 15 nM (linha pontilhada com cruzes), 25 nM (linha pontilhada com triângulos, vértice para baixo), 35 nM (linha pontilhada com triângulos, vértice para cima), 50 nM (linha pontilhada com círculos pretos), 60 nM (linha pontilhada com quadrados brancos), 70 nM (linha pontilhada com círculos brancos); os resultados são a média das células contadas de três amostras do sangue periférico;

A Fig. 13 mostra o aumento do número de células do sangue periférico da etapa a) do presente método, pré-tratadas com MCSF (linha pontilhada com pontos pretos), não tratadas com MCSF (linha pontilhada com cruzes) ; os resultados são a média das células contadas das três amostras de sangue periférico.

EXEMPLO 1 : Expansão e purificação de células- tronco adultas do sangue periférico e seus usos médicos

As células isoladas do sangue periférico agem "in vivo" como células-tronco pluripotentes (PSC) após a expansão de acordo com a invenção e são capazes de resolver, no espaço de alguns meses, lesões ou patologias incuráveis ou apenas lentamente curáveis com as metodologias e/ou drogas clássicas.

MATERIAIS E MÉTODOS Amostragem

Cada amostra de sangue periférico consistiu em cerca de 5-7 ml, foi coletada dos membros inferiores de cavalos e cães e imediatamente colocadas em tubos de ensaio contendo, por exemplo, heparina (150 U), e MCSF (10 nM). No entanto, a heparina pode ser substituída por

uma outra substância anticoagulante adequada.

Purificação

As amostras de sangue (5-7 ml) foram diluídas a 1:5 em PBS (Solução Salina de Tampão de Fosfato) contendo NH4Cl (200 mM), para causar Iise dos corpúsculos vermelhos, centrifugadas a 10.000 g, lavadas duas vezes com PBS e centrifugadas novamente a 200 g. As células nucleadas obtidas foram incubadas por 7-12 horas a 37°C, preferencialmente por 10-12 horas, e purificadas por meio de fracionamento em gradiente de Ficoll, e então isoladas e lavadas três vezes com meio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, New York). Depois de purificadas, as células que continham aproximadamente 95% de células com fenótipo CD90 (determinado por meio de análise citofluorimétrica em fotômetro de fluxo FACScan - Becton Dickinson) , foram incubadas por mais 24 horas em 50 ng/ml de MCSF 45 nM e então expandidas para obter o número de células necessárias para o tratamento local ou centrifugadas a 10.000 g e ressuspensas em PBS em uma concentração de aproximadamente 90xl03 células/ml para tratamentos intravenosos.

ImunocoIo ração

Para cito-fenotipagem, as células foram lavadas em PBS e então fixadas em lâminas em formaldeido 4% em PBS por 20 minutos a 20°C.

Para identificar as proteínas intracelulares, as células foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,5% por 5 minutos a 20°C e então incubadas por 1 horas com anticorpos primários diluídos em PBS contendo BSA a 1% (para bloquear os sítios antigênicos específicos). Após três lavagens sucessivas, as lâminas foram então incubadas por 45 minutos com o conjugado de anticorpo secundário com o fluorocromo mais apropriado FITC, isotiocianato de tetrametilrodamina B (TRITC), ou Cy5. Todos os anticorpos secundários foram desenvolvidos, usando o asno como hospedeiro, pela Jackson ImmunoResearch. As imunocitoquimicas foram realizadas à temperatura de 4 0C e em atmosfera saturada de umidade. Após três lavagens, as lâminas foram montadas usando "gelvatol-PBS". As imagens da fluorescência foram então obtidas por meio de um microscópio de fluorescência usando como padrão interno uma imunofluorescência dirigida contra o gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase (anticorpo policlonal de carneiro produzido pela Cortex Biochem, San Leandro, CA) . Como controles negativos e para calibrar os níveis do fundo da fluorescência, foram usadas lâminas incubadas com anticorpos específicos do mesmo isótipo das amostras envolvidas.

As imagens que foram obtidas mostram as células observadas através de um microscópio de contraste de fase, sobrepostas na imagem da fluorescência dos lipídios corados com Vermelho Nilo e sobre a imagem dos núcleos corados com DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). A barra de referência mede 40 Dm. A intensidade da fluorescência relativa foi examinada por meio de microscopia quantitativa da proporção entre as células tratadas com MCSF e os macrófagos.

0 método descrito acima foi usado para identificar todos os marcadores investigados (CD 90, CD 34, CD90/CD34). RESULTADOS

Uso local

As células foram aplicadas diretamente nos casos de feridas externas. Por outro lado, no caso de lesões nos tendões, ligamentos e fraturas, as células foram inoculadas diretamente no local da lesão em uma concentração final, exceto onde indicado de outra forma, de 5-lOxlO6 células/ml de acordo com a seriedade da lesão; nos casos onde as células não podiam ser inseridas com precisão nas lesões, o seguinte método foi utilizado:

• para as lesões em ligamentos colaterais, a injeção foi feita entre a segunda e terceira falange,

• para as lesões nos naviculares, a injeção foi feita no túnel do carpo,

• para as lesões nas articulações sacroiliacas e nos casos de Wobbler, a injeção foi feita entre a quinta e a sexta cervical ou entre a sexta e a sétima.

Lesões cutâneas

Caso de uma égua com uma ferida entre o metatarso

e a primeira falange, com 20 cm de diâmetro e complicações de clostridia que tinham levado à destruição dos tecidos subjacentes, incluindo o tendão extensor (fig. 1) . A primeira aplicação foi feita um ano após o acidente e após duas cirurgias para remover os quelóides, sendo repetida três vezes mais em um intervalo de 15 dias, usando de 10 a 400xl06 células ressuspensas em uma solução fisiológica na presença de gentamicina. Após 100 dias a ferida foi completamente cicatrizada (fig. 2) e após 6 meses o pelo tinha reaparecido em 70% da zona da cicatriz (fig. 3). Tendões

Foram tratados três cavalos com lesões de 80% do tendão flexor superficial que já após três meses de tratamento com aproximadamente 300xl06 células não apresentavam mais zonas hipoecogênicas ao exame de ultrassom e, pelo contrário, a espessura do tendão (que tinha aumentado após a laceração e os processos inflamatórios) tinha visivelmente reduzido em 80%, como pode ser visto nas ultrassonografias mostradas nas figs. 4-7.

Outros cavalos com lesões menores do tendão (1 cm de diâmetro) 1 mês após o tratamento não mostravam a lesão (figs. 8 e 9) .

Ligamentos

Entre as lesões tratadas tivemos uma inserção do ligamento suspensor abaixo do jarrete com conseqüente coxeadura; menos de três meses após uma inoculação local o cavalo voltou às atividades, sem coxeadura, e após um ano não houve recidiva.

Em outros cavalos tratados, com lesões entre os ramos e o corpo central do ligamento suspensor, frontal e traseiro, elas foram todas resolvidas com recuperação total.

Fraturas

Entre as fraturas tratadas tivemos o caso de um cão com fêmur fraturado o qual, 4 meses após cirurgia ainda não estava formando calo ósseo. Após a aplicação local de IOxlO6 células houve recuperação completa em 30 dias.

Membranas mucosas

Com relação à cicatrização de lesões das membranas mucosas, várias úlceras crônicas foram tratadas. O caso mais notável foi o de um cavalo de adestramento com várias úlceras na boca, que já tinha sido submetido a duas cirurgias plásticas. Após o tratamento, o cavalo parou de sangrar já três dias após a aplicação local de 4xl05 células. Após 15 dias as lesões estavam completamente curadas. Concluindo, a aplicação local de células isoladas enriquecidas com nosso método nos tendões, ligamentos, articulações e fraturas mostrou mais de 80% dos casos perfeitamente resolvidos em algumas semanas ou, no máximo, em quatro meses. Os restantes 20% dos casos mostraram de alguma forma melhoras consideráveis. Os métodos comumente utilizados atualmente na ciência veterinária nesses casos apresentam resultados positivos em não mais que 60% dos casos, após um tratamento de aproximadamente 6-15 meses e melhoras em somente 5% dos casos. Uso intravenoso

As células foram usadas intravenosamente (1 dose = 150xl03 células) nas seguintes patologias:

Doença de Cushing: esta é uma patologia causada por hipertrofia da hipófise intermediária com redução da produção de dopamina pelo hipotálamo, muito similar ao mal de Parkinson em humanos.

Foi tratado um pônei afetado, o qual tinha também, fora os sintomas clássicos da doença, defesas imunológicas reduzidas com hemólise. Após três tratamentos em um intervalo de 5 dias com 150xl03 células por tratamento, foram notadas melhoras. Após 4 ciclos repetidos em um intervalo de 40 dias, os sintomas desapareceram completamente. Mais quatro cavalos tratados do mesmo modo tiveram o mesmo resultado.

Balanço de cabeça: patologia neurológica do sistema nervosa central com complicações secundárias do trigêmeo que leva ao continuo balanço da cabeça e problemas de fotofobia. 0 cavalo tratado vinha apresentando esses sintomas há seis meses. 0 tratamento compreendeu um ciclo de 150xl03 células em um intervalo de uma semana, por 5 semanas. Já na terceira semana os sintomas tinham desaparecido. Dois outros cavalos tratados com o mesmo protocolo mostraram os mesmos resultados.

Três casos de Wobbler: esta é uma compressão neurológica cervical congênita. Os casos tratados com a administração de três doses (intravenosamente e local) no intervalo de uma semana, mostraram remissão completa dos sintomas após o tratamento.

O uso intravenoso de células-tronco expandidas e purificadas descrito mostrou como essas células são capazes "in vivo" de resolver patologias que afetam o tecido neuronal propiciando os primeiros resultados já após uma semana de tratamento.

Reconstrução vascular. Em um cavalo afetado por laminite (destruição da vascularização periférica no pé, com a resultante coxeadura extremamente dolorosa que impede o movimento), a dor tinha quase desaparecido 12-24 horas após a administração de uma dose, inoculada nos vasos digitais. 0 mesmo resultado foi obtido para dois outros casos de cavalos afetados pela mesma patologia.

Outros casos gerais onde as células foram administradas intravenosamente foram:

- Caso de um cavalo com fratura do navicular que reiniciou sua atividade competitiva após a administração

simultânea das células-tronco nos vasos periféricos, na bolsa do navicular e na superfície articular entre o tendão flexor profundo e o osso navicular;

- Caso de um cavalo que sofria de periostite o qual, com a administração de duas doses intravenosas, melhorou sua coxeadura;

- Caso de um cavalo de dezessete anos de idade operado por cólica e depois colocado no pasto por não ser mais

capaz de continuar a atividade competitiva devido ao estado de debilitação geral persistente. Após 4 ciclos de 3 doses a cada 5 dias, o cavalo reiniciou a atividade competitiva, participando de competições e obtendo resultados que nunca tinha tido antes (figs. e 11);

- Caso de um cavalo de vinte anos de idade com

suspeita de isquemia cerebral com a conseqüente perda de coordenação em três membros, o qual, após o tratamento farmacológico à base de derivados de cortisona, continuava ainda a manter uma andadura incerta e cambaleante. Após a administração de

duas doses em um intervalo de uma semana, o animal reiniciou sua atividade normal sem mostrar mais nenhum sintoma;

- Caso de uma égua de vinte e três anos de idade, com prenhez aos 21 anos de idade, que, após o período de lactação ter terminado, foi tratada com duas doses de células

intravenosamente. Após o tratamento a égua reiniciou sua atividade competitiva por completo (aos 20, um cavalo é considerado muito velho para atividade competitiva);

- Caso de um cavalo com a pelve fraturada o qual, após duas doses de células, reiniciou sua atividade competitiva

internacional;

- Caso de um cavalo de quinze anos de idade com dificuldades respiratórias e índole muito nervosa, que após o tratamento com duas doses começou a competir novamente em nível internacional e sem a mais leve dificuldade respiratória;

- Caso de dois cavalos com extrema coxeadura, por mais de dois anos após em conseqüência de distensão do ligamento colateral entre a primeira e a segunda falange. Essa patologia é

considerada irreversível em 75% dos casos. Após o tratamento com três doses por três meses, ambos os animais tratados votaram a competir normalmente;

Caso de um cavalo de treze anos de idade operado por cólica aos 7 e castrado aos 12. Após a segunda operação, o animal tinha tido complicações bacterianas não remitentes apesar do tratamento com antibióticos e anti- inf lamatórios. Além do mais, o animal sofria de gastrite crônica, comprovada por gastroscopia. Após a administração de 4 doses em um intervalo de uma semana, foi feita nova gastroscopia que mostrou a regeneração completa da membrana mucosa gástrica. O mesmo resultado foi obtido em outros 10 cavalos de corrida;

- Caso de um cavalo com murmúrio pan-sistólico e numerosos murmúrios atípicos à auscultação cardíaca, com exame de sangue positivo para uma forma ativa de vírus da Herpes 1 que

causava problemas neurológicos e perda do equilíbrio; neste caso, foram administradas três doses intravenosas três vezes em um intervalo de 5 dias, seguidas da quarta dose administrada no nível da coluna vertebral. Logo após dois meses, o cavalo começou a movimentar-se novamente, recuperando quase completamente o equilíbrio;

- Caso de um cavalo de dezenove anos de idade quase completamente aposentado da atividade competitiva devido a deterioração física geral, que após a administração de 200xl03 células, duas vezes em um intervalo de uma semana e com o tratamento repetido, após três meses voltou a ser um dos melhores em sua categoria (em competições de salto, saltando alturas de 1,35-1,40 m).

O mesmo tipo de tratamento foi aplicado a cães

bem idosos com o mesmo resultado. Em cães, foram tratadas as seguintes patologias:

- dois casos de cães com torção do estômago: o primeiro era um Dinamarquês de seis ano de idade submetido a

cirurgia mas com recidiva após uma semana e portanto submetido novamente a outra cirurgia; após a primeira administração de 150xl03 células o cão começou a comer novamente e após duas doses em um intervalo de uma semana o cão voltou à sua atividade normal; o segundo caso foi uma fêmea de Dinamarquês de dez anos de idade, que sofria de artrose, diagnosticada com diabetes, que tinha sido submetida a histerectomia-ooforectomia; quatro meses após a operação, ela teve uma torção do estômago com subsequente cirurgia a qual, no entanto, não trouxe grande melhora. Neste ponto, foram administradas duas doses, em um intervalo de uma semana e quatro outros ciclos nos quatro meses seguintes. Atualmente, oito meses após o ultimo ciclo, a cadela não só tem glicemia normal, mas também sua habilidade de caminhar melhorou em 80%;

- Caso de um cão vira-lata, 13 anos de idade, macho, com paralisia dos membros traseiros e incontinência; até

aquele momento ele tinha sido tratado somente com cortisona, sem resultados apreciáveis. Quinze dias após a cortisona ser suspensa, as células foram administradas e o cão foi submetido a um ciclo de duas doses em um intervalo de uma semana. Seis dias após o ultimo tratamento, o cão não só tinha readquirido o uso das patas, mas estava urinando e defecando normalmente.

Os resultados obtidos com o método de acordo com a invenção tornam este procedimento extremamente versátil, graças ao fato de que, atualmente, nenhuma técnica "in vivo" provê a expansão de células pluripotentes. Além disso, a ausência de qualquer forma de rejeição ou infecção após a administração em todas as histórias dos casos relatados acima torna esta técnica adequada para procedimentos de transplante autólogo.

Claims

1. Método para a expansão de células-tronco adultas do sangue, particularmente, mas não exclusivamente do sangue periférico, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) uma primeira etapa de expansão das células- tronco do sangue, imediatamente após elas serem coletadas, por meio de tratamento in vitro com MCSF em uma concentração compreendida entre 8-15 nM e b) uma segunda etapa de purificação das células- tronco expandidas.

2. 0 método como na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa in vitro com MCSF tem uma duração compreendia entre 2 4 e 96 horas.

3.0 método como na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa in vitro com MCSF tem uma duração compreendida entre 48 e 72 horas.

4. 0 método como na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o tratamento in vitro ser iniciado em não mais do que cerca de 10 minutos após a amostra ter sido coletada, sendo mais vantajoso em não mais que 5 minutos.

5. 0 método como em qualquer reivindicação acima, caracterizado pelo fato de que ele provê a etapa adicional de: c) expansão das células-tronco do sangue purificadas na etapa b) por meio de tratamento in vitro com MCSF em uma concentração compreendida entre cerca de 35-55 nM por 24-72 horas.

6. O método como em qualquer reivindicação acima, caracterizado pelo fato de que a dita concentração de MCSF da etapa a) é preferivelmente 10 nM.

7. O método como na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita concentração do MCSF da etapa c) é preferivelmente 50 nM, mais preferivelmente 45 nM.

8. O método como em qualquer reivindicação acima, caracterizado pelo fato de que o tratamento in vitro com MCSF na etapa a) e/ou na etapa c) dura 24-48 horas, preferivelmente 45-48 horas.

9.0 método como em qualquer reivindicação acima, caracterizado pelo fato de que a etapa de purificação b) ocorre por meio de fracionamento em gradiente de Ficoll.

10. 0 uso de células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma medicação para o tratamento de lesões escolhidas no grupo consistindo em lesões cutâneas, lesões dos tendões, dos ligamentos, dos ossos, das membranas mucosas em mamíferos, ou fraturas.

11. O uso de células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma medicação para o tratamento de patologias neurológicas ou neurodegenerativas escolhidas do grupo consistindo na doença de Cushing, balanço da cabeça, síndrome de Wobbler, dificuldades respiratórias, paralisia dos membros em mamíferos.

12. O uso de células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de -1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma medicação para o tratamento de patologias inflamatórias agudas ou crônicas escolhidas entre laminite, periostite, gastrite, artrose, inflamações causadas por agentes virais, bacterianos, parasitários, micóticos em mamíferos.

13. 0 uso de células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma medicação para o tratamento de síndrome de dilatação-torção do estômago de mamíferos.

14. O uso de células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma medicação para o tratamento de infertilidade em éguas, precocidade em potros ou para melhorar as atividades competitivas em mamíferos.

15. A composição farmacêutica consistindo nas células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 caracterizada pelo fato de que é como princípio ativo, juntamente com adjuvantes e/ou excipientes farmacologicamente aceitáveis.

16. A composição farmacêutica consistindo nas células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 caracterizada pelo fato de que em uma concentração compreendida entre 90-250xl03 células/ml, preferivelmente 100-120xl03 células/ml, como princípio ativo, juntamente com adjuvantes e/ou excipientes farmacologicamente aceitáveis, sendo a dita composição formulada para injeção intravenosa.

17. A composição farmacêutica consistindo nas células-tronco adultas obtidas de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 caracterizada pelo fato de que em uma concentração compreendida entre 4-40xl06 células/ml, preferencialmente 7xl06 células/ml, como principio ativo, juntamente com adjuvantes e/ou excipientes farmacologicamente aceitáveis, sendo a dita composição formulada para aplicação local.

18. A composição como na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende também um antibiótico como principio ativo na concentração compreendida entre 5-15 nM, preferivelmente 10 nM.

19. A composição como na reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o antibiótico é gentamicina.

20. O uso da composição farmacêutica definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 e de 17 a 19, caracterizado pelo fato de que, é utilizado como medicação para o tratamento de lesões escolhidas de um grupo consistindo em lesões cutâneas, lesões dos tendões, dos ligamentos, dos ossos, das membranas mucosas em mamíferos.

21. O uso da composição farmacêutica definida de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 e de 17 a 19, caracterizado pelo fato de que é utilizado como uma medicação para o tratamento de fraturas em mamíferos.

22. O uso da composição farmacêutica definida na reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que é utilizado como uma medicação para o tratamento de patologias neurológicas ou neurodegenerativas escolhidas entre o grupo consistindo na doença de Cushing, balanço de cabeça, sindrome de Wobbler, dificuldades respiratórias, paralisia dos membros em mamíferos.

23. 0 uso da composição farmacêutica definida na reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que é utilizado como uma medicação para o tratamento de patologias inflamatórias agudas ou crônicas escolhidas entre laminite, periostite, gastrite, artrose, inflamações causadas por agentes virais, bacterianos, parasitários, micóticos em mamíferos.

24. O uso da composição farmacêutica definida na reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que é utilizado como uma medicação para o tratamento da sindrome da dilatação- torção do estômago em mamíferos.

25. O uso da composição farmacêutica definida na reivindicação 15 ou 16 caracterizado pelo fato de que é para o tratamento da infertilidade em éguas, precocidade em potros ou para melhorar as atividades competitivas em mamíferos.

26. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 24, caracterizado pelo fato de que a dita composição consiste em células-tronco adultas obtidas em uma concentração equivalente a 150xl03 células/ml e é administrada uma vez por semana intravenosamente.

27. O uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 14 ou de 20 a 26, caracterizado pelo fato de que os ditos mamíferos são escolhidos entre o homem, cavalos, gatos ou cães.