BRPI0715415A2 - Moduladores de atividade de receptor de quimiocina, formas cristalinas e processo - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA- DORES DE ATIVIDADE DE RECEPTOR DE QUIMIOCINA, FORMAS CRISTALINAS E PROCESSO".

Este pedido reivindica prioridade de Pedido Provisório dos Esta- dos ligados Nos 60/834.235, e 60/896.026 depositado em 28 de julho de 2006, e 21 de março de 2007, respectivamente, as descrições de ambos os quais estão incorporadas aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)- 2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -

il)cicloexil)acetamida, ou um sal, solvato ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável deste, tendo uma combinação inesperada de características far- macológicas desejáveis. Formas cristalinas da presente invenção também são fornecidas. Composições farmacêuticas contendo as mesmas e méto- 15 dos de emprego das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, de câncer e/ou cardiovas- culares também são um objetivo desta invenção. A presente invenção tam- bém fornece um processo para a preparação de compostos de Fórmula (I), incluindo N-((1R,2S,5R)-5-(fórc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) 20 quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida:

que são intermediários úteis do processo são também forncedidos aqui. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Quimiocinas são citocinas quimiotáticas, de peso molecular de 6

H

em que R1, R81 R91 R10

, são tais como descritos aqui. Compostos a 15 kDa, que são liberadas por uma ampla variedade de células para atrair e ativar, entre outros tipos de células, macrófagos, linfócitos TeB, eosinófi- los, basófilos e neutrófilos (revisado em: Charo e Rasonhoff, New. Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Luster, New. Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445; e 5 Rollins, Bllod 1997, 90, 909-928). Há duas classes principais de quimiocinas, CXC e CC, dependendo de que as primeiras duas cisteínas na seqüência de aminoácidos sejam separadas por um único aminoácido (CXC) ou sejam adjacentes (CC). As quimiocinas CXC, tais como interleucina-8 (IL-8), prote- ína-2 ativadora de neutrófilos (NAP-2) e proteína de atividade estimuladora 10 do crescimento melanona (MGSA) são quimiotáticas principalmente para neutrófilos e linfócitos T, enquanto as quimiocinas CC, tais como RANTES, MIP-1a, ΜΙΡ-1β, as proteínas quimiotáticas de monócitos (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, e MCP-5) e as eotaxinas (-1 e -2) são quimiotáticas para, entre outros tipos de células, macrófagos, linfócitos T, eosinófilos, células 15 dendríticas, e basófilos. Nesse contexto existem também as quimiocinas linfotactina-1, linfotactina-2 (ambas quimiocinas C), e fractalcina (uma qui- miocina CX3C) que não se incluem em qualquer das subfamílias de quimio- cina principais.

As quimiocinas ligam-se a receptores de superfície celular espe- cíficos que pertencem à família de proteínas de domínio de sete- transmembrana acopladas à proteína G (revisado em: Horuk, Trends Pharm. Sc/. 1994, 15, 159-165) que são denominados "receptores de quimi- ocina". Na ligação de seus Iigantes cognatos, receptores de quimiocina transduzem um sinal intracelular através das proteínas G triméricas associ- adas, resultando em, entre outras respostas, um aumento rápido na concen- tração de cálcio intracelular, mudanças na forma celular, expressão aumen- tada de moléculas de adesão celular, desgranulação, e promoção de migra- ção celular. Há pelo menos dez receptores de quimiocina humana que se ligam ou respondem à quimiocinas CC com os seguintes padrões caracterís- ticos (revisado em Zlotnik e Oshie Immunity 2000, 12, 121): CCR-1 (ou 11C- KR-1" ou "CC-CKR-1") [MIP-1a, MCP-3, MCP-4, RANTES] (Ben-Barruch, e outros, Cell 1993, 72, 415-425, e Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436- 445); CCR-2A e CCR-2B (ou "CKR-2A"/"CKR-2B" ou "CC-CKR-2ATCC- CKR-2B" [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5] (Charo, e outros, Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 1994, 91, 2752-2756, e Luster, New. Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-3 (ou "CKR-3" ou "CC-CKR-3") [eotaxina-1, eota- xina-2, RANTES, MCP-3, MCP-4] (Combadiere, e outros, J. Biol. Chem.

1995, 270, 16491-16494, e Luster, New. Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-4 (ou "CKR-4" ou "CC-CKR-4") [TARC, MDC] (Power, e outros, J. Biol. Chem. 1995, 270, 19495-19500, e Luster, New. Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445); CCR-5 (ou "CKR-5" OR "CC-CKR-5") [MIP-1a, RANTES, ΜΙΡ-1β] 10 (Sanson, e outros, Biochemistry 1996, 35, 3362-3367); CCR-6 (ou "CKR-6" ou "CC-CKR-6") [LARC] (Baba, e outros, J. Biol. Chem. 1997, 272, 14893- 14898); CCR-7 (ou "CKR-7" ou "CC-CKR-7") [ELC] (Yoshie e outros, J. Leu- koc. Biol. 1997, 62, 634-644); CCR-8 (ou "CKR-8" ou "CC-CKR-8") [I-309] (Napolitano e outros, J. Immunol., 1996, 157, 2759-2763); CCR-10 (ou "Ο- Ι 5 KR-10’ ou "CC-CKR-10") [MCP-1, MCP-3] (Bonini, e outros, DNA. E CeIL Biol. 1997, 16, 1249-1256); e CCR-11 [MCP-1, MCP-2, e MCP-4] (Schweic- kert, e outros, J. Biol. Chem. 2000, 275, 90550).

Além dos receptores de quimiocina mamífera, foi mostrado que citomegaloviroses herpesviroses e poxviroses mamíferas expressam, em 20 células infectadas, proteínas com as propriedades de ligação de receptores de quimiocina (revisado em: Wells e Schwartz, Curr. Op/n. Biotech. 1997, 8, 741-748). Quimiocinas CC humanas, tais como RANTES e MCP-3, podem causar mobilização rápida de cálcio por meio destes receptores viralmente codificados. A expressão de receptor pode ser permissiva com relação à 25 infecção permitindo a subversão da vigilância do sistema imune normal e resposta à infecção. Adicionalmente, receptores de quimiocina humana, tais como CXCR4, CCR2, CCR3, CCR5 e CCR8, podem agir como co- receptores para a infecção de células de mamíferos por micróbioscomo no caso de, por exemplo, os vírus da imunodeficiência humana (HIV).

As quimiocinas e seus receptores cognatos foram implicados

como sendo mediadores importantes de distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas, e imunorreguladoras, incluindo asma e doenças alérgicas; as- sim como patologias autoimunes, tais como artrite reumatóide e esclerose múltipla; e doenças metabólicas, tais como aterosclerose e diabetes (revisa- do em: Charo e Rasonhoff, New. Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621; Z. Gao e W. A. Metz, Chem. Rev. 2003, 103, 3733; P. Horas. Carter, Current Opinion 5 in Chemical Biology 2002, 6, 510; Trivedi, e outros, Ann. Reports. Med. Chem. 2000, 35, 191; Saunders e Tarby, Drug Disc. Today 1999, ,4,80; Premack e Schall, Nature Medicine 1996, 2, 1174). Por exemplo, o quimioa- traente-1 de monócito de quimiocina (MCP-1) e seu Receptor 2 de Quimio- cina CC receptora (CCR-2) desempenham um papel fundamental na atra- 10 ção de leucócitos à sítios de inflamação e subseqüentemente na ativação destas células. Quando a quimiocina MCP-1 liga-se à CCR-2, isto induz um aumento rápido em concentração de cálcio intracelular, expressão aumen- tada de moléculas de adesão celular, e a promoção da migração de leucóci- tos. A demonstração da importância da interação de MCP-1 /CCR-2 foi de- 15 terminada por experimentos com camundongos geneticamente modificados. Camundongos de MCP-I7' foram impossibilitados de recrutar monócitos em sítios de inflamação depois de vários tipos diferentes de desafio imune (Bao Lu, e outros, J. Exp. Med. 1998, 187, 601). Igualmente, camundongos de CCR-27' foram impossibilitados de recrutar monócitos ou produzir interferon- 20 Y quando desafiados com vários agentes exógenos; além disso, os leucóci- tos de camundongos nulos de CCR-2 não migraram em resposta à MCP-1 (Landin Boring, e outros, J. CHn. Invest. 1997, 100, 2552), desse modo de- monstrando a especificidade da interação de MCP-1 /CCR-2. Dois outros grupos independentemente apresentaram resultados equivalentes com Ii- 25 nhagens diferentes de camundongos de CCR-27' (William A. Kuziel, e ou- tros, Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A. 1997, 94, 12053, e Takao Kurihara, e outros, J. Exp. Med. 1997, 186, 1757). A viabilidade e saúde geralmente normal dos animais de MCP-17' e CCR-27' são notáveis, pelo fato de que a interrupção da interação de MCP-1/CCR-2 não induz crise fisiológica. Con- 30 siderados conjuntamente, estes dados conduzem alguém à conclusão de que moléculas que bloqueiam as ações de MCP-1/CCR2 seriam úteis no tratatamento de vários distúrbios inflamatórias e autoimunes (revisado em: M. Feria e F. Díaz-González, Exp. Opin. Ther. Patents 2006, 16, 49; e J. Dawson, W. Miltz, e C. Wiessner, C. Exp. Opin. Ther. Targets 2003, 7, 35). Esta hipótese foi validada agora em vários modelos de doença animais dife- rentes, como descrito abaixo.

5 É sabido que MCP-1 é super-regulada em pacientes com artrite

reumatóide (Alisa Koch, e outros, J. Clin. invest. 1992, 90, 772 - 779). Além disso, vários estudos pré-clínicos demonstraram o valor terapêutico potenci- al do antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de artrite reumatóide. Foi mostrado recentemente que uma vacina de DNA codifican- 10 do MCP-1 melhora artrite induzida por poliadjuvante crônica em ratos (Saw- san Youssef, e outros, J. Clin. Invest. 2000, 106, 361). Igualmente, os sin- tomas da doenças podem ser controlados por meio de administração direta de anticorpos para MCP-1 à ratos com artrite induzida por colágeno (Hiroomi Ogata, e outros, J. Pathol. 1997, 182, 106), ou artrite induzida por parede 15 celular estreptocócica (Ralph C. Schimmer, e outros, J. Immunol. 1998, 160, 1466). Talvez mais significativamente, foi mostrado que um antagonista de peptídeo de MCP-1, MCP-1 (9-76), igualmente previne início de doença e reduz sintomas de doença (dependendo do tempo de administração) no modelo de camundongo de MRL-Ipr de artrite (Jiang-Hong Gong, e outros, J. 20 Exp. Med. 1997, 186, 131). Além disso, foi demonstrado que a administra- ção de antagonistas de CCR2 de molécula pequena reduziu o escore clínico em modelos de roedores de artrite (C. M. Brodmerkel, e outros, J., Immunol.

2005, 175, 5370; e M. Xia, e outros Patente dos Estados ligados N9 0069123, 2006). A administração de um anticorpo anti-CCR2 teve efeitos 25 variados em murino CIA, dependendo do tempo de administração (H. Bruhl, e outros J. Immunol. 2004, 172, 890). Recentes estudos com camundongos de CCR2"7' sugeriram que a deleção de CCR2 pode exacerbar modelos de artrite de roedores em circunstâncias experimentais específicas (Μ. P. Qui- nones, e outros J. Clin. Invest. 2004, 113, 856; Μ. P. Quinones, e outros J. 30 Mol. Med. 2006, 84, 503).

É sabido que MCP-1 é super-regulada em lesões ateroscleróti- cas, e foi mostrado que os níveis circulantes de MCP-1 são reduzidos por meio de tratamento com agentes terapêuticos (Abdolreza Rezaie-Majd, e outros, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 1194 - 1199). Vários es- tudos fundamentais demonstraram o valor terapêutico potencial do antago- nismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratando de aterosclerose. Por e- 5 xemplo, quando camundongos de MCP-17' são cruzados com camundongos com deficiência de receptor de LDL1 uma redução de 83% em deposição de lipídeos aórtica foi observada (Long Gu, e outros, Moi cell 1998, 2,275). Si- milarmente, quando MCP-1 foi geneticamente removida de camundongos que já super-expressavam apolipoproteína B humana, os camundongos re- 10 sultantes foram protegidos da formação de lesão aterosclerótica em relação aos camundongos de controle MCP-1+/+ apoB (Jennifa Gosling, e outros, J. Clin. Invest. 1999, 103, 773). Igualmente, quando camundongos de CCR-27' são cruzados com camundongos de apolipoproteína E 7', uma diminuição significante na incidência de lesões ateroscleróticas foi observada (Landin 15 Boring, e outros, Nature 1998, 394, 894; T. C. Dawson, e outros Atheroscle- rosis 1999, 143, 205). Finalmente, quando camundongos de apolipoproteína E7' são administrados com um gene codificando um antagonista de peptídeo de CCR2, então o tamanho da lesão é diminuído e a estabilidade de placa é aumentada (W. Ni, e outros Circulation 2001, 103, 2096-2101). O transplan- 20 te de medula óssea de camundongos de CCR27' para camundongos de A- poE3-Leiden inibiu aterogênese precosse (J. Guo, e outros Arterioscler. T- hromb. Vasc. Biol. 2003, 23, 447), mas teve efeitos mínimos em lesões a- vançadas (J. Guo, e outros Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005, 25, 1014). Pacientes com diabetes melito do tipo 2 tipicamente apresentam 25 resistência à insulina como um das características de indicação da doença. A resistência à insulina também está associada com o agrupamento de a- normalidades conhecido como a "síndrome metabólica" ou "síndrome X", que inclui obesidade, aterosclerose, hipertensão, e dislipidemia (revisado em: Eckel, e outros Lancet 2005, 365, 1415). É bem reconhecido que a in- 30 flamação desempenha um papel na exacerbação do processo de doença em patologias de diabetes do tipo 2 e da "síndrome X" (revisado em: Chen, Pharmcological Research 2006, 53, 469; Neels e Olefsky, J. Clin. Invist. 2006, 116, 33; Danadona e Aljada, Am J Cardiol 2002, 90, 27G-33G; Pic- kup e Crook, Diabetologia 1998, 41, 1241). MCP-1 é reconhecida como de- sempenhando um papel na resistência à insulina induzida por obesidade. Em cultura, pré-adipócitos humanas expressaram constitutivamente MCP-1 5 (Gerhardt, Mol. Cell. Endocrinology 2001, 175, 81). CCR2 é expresso em adipócitos; a adição de MCP-1 à adipócitos diferenciados in vitro diminui a captação de glicose estimulada por insulina e a expressão de vários genes adipogênicos (LpL, adipsina, GLU-4, aP2, receptor 33-adrenérgico, e PPARy) (P. Sartipy e D. Loskutoff, Proc. NatL Acad. Sci E.U.A. 1999, 96, 10 6902). Pacientes com diabetes do tipo 2 tiveram maiores níveis de MCP-1 circulante do que controles não diabéticos (S. Nomura, e outros Clin. Exp. Immunol. 2000, 121, 437), e a liberação de MCP-1 do tecido adiposo pode ser reduzida através de tratamento com terapias anti-diabéticas tais como metformina ou tiazolidinedionas (J. M. Bruun, e outros J. Clin. Endocrinol. 15 Metab. 2005, 90, 2282). Igualmente, MCP-1 também foi super-expressa em modelos experimentais de murino de obesidade, e foi produzida principal- mente por tecido adiposo (Sartipy e Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A.

2003, 100, 7265). Em camundongos obesos, a expressão de MCP-1 igual- mente precedeu e ocorreu simultaneamente com o início da resistência à insulina (H. Xu1 e outros J. Clin. Invest. 2003, 112, 1821). Outro estudo mos- trou que a expressão de MCP-1 correlacionou-se positivamente com a mas- sa corporal no tecido adiposo perigonadal de camundongos (Weisberg, e outros J. Clin. Invest. 2003, 112, 1796). Consistente com estes dados, o de- senvolvimento de resistência à insulina em camundongos db/db foi melho- rado ou por meio de deleção genética de MCP-1 ou por expressão induzida por gene de um peptídeo negativo dominante (H. Kanda, e outros J. Clin. Invest. 2006, 116, 1494). O oposto lógico também pode ser demonstrado: a super-expressão de MCP-1 em tecido adiposo promoveu resistência à insu- lina (N. Kamei, e outros J. Biol. Chem. 2006, 281, 26602). Um resultado con- flitante mostrando que a deleção genética de MCP-1 não produz resistência à insulina no camundongo db/db também foi publicado (F. Y. Chow, e outros Diabetologia 2007, 50, 471). Consistente com os dados sobre MCP-1, estu- dos diretos com CCR2 (o receptor de MCP-1) mostraram que ele desempe- nha um papel na formação de obesidade e resistência à insulina induzida por obesidade. A manutenção de uma dieta hiperlipídica aumentou os nú- meros de monócitos inflamatórios de CCR2+ circulantes em ambos os ca- 5 mundongos do tipo selvagem (C. L. Tsou, e outros J. Clin. Invest. 2007, 117, 902) e ApoE7' (F. Tacke, e outros J. Clin. Invest. 2007, 117, 185). A deleção genética de CCR2 reduziu os números de macrófagos ativados em tecido adiposo de murino (C. N. Lumeng1 e outros Diabetes 2007, 56, 16), mas não afetou uma população de macrófagos adiposos de M2 os quais se pensa 10 que mantêm o estado "magro" (C. N. Lumeng, e outros J. Clin. Invest. 2007, 117, 175). A deleção genética de CCR2 reduziu a obesidade induzida por dieta e melhorou a sensibilidade à insulina em modelo de obesidade induzi- da por dieta (S. P. Weisberg, e outros, J. Clin. Invest. 2006, 116, 115; P Cornelius, RP Gladue, RS Sebastian, patente WO 2006/013427 A2, 2006), 15 dependendo das condições experimentais (A. Chen, e outros Obes. Res. 2005, 13, 1311). A administração de um antagonista de CCR2 de molécula pequena também melhorou a sensibilidade à insulina neste mesmo modelo (S. P. Weisberg, e outros J. Clin. Invest. 2006, 116, 115).

Dois estudos descreveram o papel importante de CCR2 em in- flamação vascular, remodelação, e hipertrofia induzidas por hipertensão (E Bush e outros, Hypertension 2000, 36, 360; M Ishibashi, e outros Circ. Res. 2004, 94, 1203).

É sabido que MCP-1 é super-regulada em esclerose múltipla humana, e foi mostrado que a terapia eficaz com interferon β-1 b reduz a 25 expressão de MCP-1 em células mononucleares de sangue periférico, suge- rindo que MCP-1 desempenha um papel na progressão de doença (Carla larlori, e outros, J. Neuroimmunol. 2002, 123, 170 - 179). Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial do antagonismo da interação de MCP-1/CCR-2 no tratamento de esclerose múltipla; todos estes estudos fo- 30 ram demonstrados em encefalomielite autoimune experimental (EAE), o modelo animal convencional para escelerose múltipla. A administração de anticorpos para MCP-1 à animais com EAE diminuiu significantemente a reincidência da doença (K. J. Kennedy, e outros, J. Neuroimmunol. 1998, 92, 98). Além disso, dois relatórios mostraram que camundongos de CCR-2'7' são resistentes a EAE (B. T. Fife, e outros, J. Exp. Med. 2000, 192, 899; L. Izikson, e outros, J. Exp. Med. 2000, 192, 1075). Um relatório subseqüente 5 estendeu estas observações iniciais examinando os efeitos da deleção de CCR2 em camundongos de linhagens diferentes (S. Gaupp, e outros Am. J. Pathol. 2003, 162, 139). Notavelmente, a administração de um antagonista de CCR2 de molécula pequena também abrandou a progressão de doença em camundongos C57BLV6 (C. M. Brodmerkel, e outros J. Immunol. 2005, 10 175,5370).

É sabido que MCP-1 é super-regulada em pacientes que desen- volvem síndrome de bronquiolite obiiterante depois de transplante de pul- mão (Martine Reynaud-Gaubert, e outros, J. of Heart and Lung Transplant., 2002, 21, 721-730; John Belperio, e outros, J. Clin. Invest. 2001, 108, 547 - 15 556). Em um modelo de murino de síndrome de bronquiolite obiiterante, a administração de um anticorpo para MCP-1 conduziu a atenuação da oblite- ração das vias aéreas; igualmente, camundongos de CCR2'7' foram resisten- tes à obliteração das vias aéreas neste mesmo modelo (John Belperio, e outros, J. Clin. Invest. 2001, 108, 547 - 556). Estes dados sugerem que o 20 antagonismo de MCP-1/CCR2 pode ser benéfico no tratamento de rejeição de órgãos em seguida à transplante. Além disso, estudos mostraram que o rompimento do eixo de MCP-1/CCR2 foi capaz de prolongar a sobrevivência de transplante de ilhota (I Lee e outros J Immunol 2003, 171, 6929; R Abdi e outros, J Immunol 2004, 172, 767). Em modelos de enxerto de rato, foi mos- 25 trado que CCR2 e MCP-1 são super-regulados em enxertos que desenvol- vem vasculopatia de enxerto (K Horiguchi e outros, J Heart Lung Transplant. 2002, 21, 1090). Em outro estudo, a terapia de gene anti-MCP-1 atenuou a vasculopatia de enxerto (A Saiura e outros, Artherioscler Thromb Vasc Biol 2004, 24, 1886). Um estudo descreveu a inibição de formação neoíntima de 30 enxerto de veia experimental por bloqueio de MCP-1 (H Tatewaki e outros, J Vasc Surg. 2007, 45,1236).

Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial do antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de asma. A se- qüestração de MCP-1 com um anticorpo neutralizador em camundongos desafiados por ovalbumina resultou em diminuição acentuada em hipersen- sibilidade e inflamação brônquicas (Jose-Angel Gonzalo, e outros, J. Exp.

5 Med. 1998, 188, 157). Isto mostou ser possível reduzir inflamação das vias aéreas alérgica em camundongos desafiados por ovos de Schistosoma mansoni por meio da administração de anticorpos para MCP-1 (Nicholas W. Lukacs, e outros, J. Immunol. 1997, 158, 4398). Consistente com isto, ca- mundongos de MCP-1'/_ exibiram uma resposta reduzida ao desafio com ovo 10 de Schistosoma mansoni (Bao Lu, e outros, J. Exp. Med. 1998, 187, 601).

Outros estudos demonstraram o valor terapêutico potencial do antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de doença de rim. A administração de anticorpos para MCP-1 em um modelo de murino de glomerulonefrite resultou em uma diminuição acentuada em formação e de- 15 posição crescente glomerular de colágeno do tipo I (Clare M. Lloyd, e outros, J. Exp. Med. 1997, 185, 1371). Além disso, camundongos de MCP-17' com nefrite sérica nefrotóxica induzida apresentaram dano tubular significante- mente menor do que suas contrapartes de MCP-1+/+ (Gregory horas. Tesch, e outros, J. Clin. Invest. 1999, 103, 73).

Vários estudos demonstraram o valor terapêutico potencial do

antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de lúpus eritema- toso sistêmico. Camundongos de CCR27' apresentaram sobrevivência pro- longada e doença renal reduzida em relação às suas contrapartes de WT em um modelo de murino de lúpus eritematoso sistêmico (G. Perez de Le- 25 ma, e outros J. Am. Soe. Neph. 2005, 16, 3592). Estes dados são consisten- tes com a atividade modificadora da doença constatada em recentes estu- dos sobre deleção genética de MCP-1 (S. Shimizu, e outros Rheumatology (Oxford) 2004, 43, 1121; Gregory horas. Tesch, e outros, J. Exp. Med. 1999, 190, 1813) ou administração de um antagonista de peptídeo de CCR2 (H. 30 Hasegawa, e outros Arthritis & Rheumatism 2003, 48, 2555) em modelos de roedores de lúpus.

Um aumento notável de 30 vezes em linfócitos de lâmina própria de CCR2+ foi observado nos intestinos delgados dos pacientes de Crohn em relação a Neo não doente (S. J. Connor, e outros Gut 2004, 53, 1287). Tam- bém de nota, houve uma expansão no subgrupo de monócitos de C- CR2+/CD14+/CD56+ circulantes em pacientes com a doença de Crohn ativa 5 em relação aos controles. Vários estudos em roedores demonstraram o va- lor terapêutico potencial do antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de doença / colite de Crohn. Camundongos de CCR-27' foram protegidos dos efeitos de colite induzida por sulfato de sódio de dextrana (Pietro G. Andres, e outros, J. Immunol. 2000, 164, 6303). A administração 10 de um antagonista de molécula pequena de CCR2, CCR5, e CXCR3 (afini- dades de ligação de murino = 24, 236, e 369 nM, respectivamente) também protegeu contra colite induzida por sulfato de sódio de dextrana (H. Toku- yama, e outros Int. Immunol. 2005, 17, 1023). Finalmente, camundongos de MCP-17' apresentaram dano colônico substancialmente reduzido (tanto ma- 15 croscópico quanto histológico) em um modelo de colite induzido por hapteno (W. I. Khan, e outros Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006, 291, G803).

Dois relatórios descreveram a super-expressão de MCP-1 nas células epiteliais intestinais e mucosa do intestino de pacientes com doença inflamatória do intestino (H. C. Reinecker, e outros, Gastroenterology 1995, 108, 40, e Michael C. Grimm, e outros, J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804).

Um estudo descreveu a associação de polimorfismo promotor no gene de MCP-1 com esclerodermia (esclerose sistêmica) (S Karrer e ou- tros, J Invest Dermatol. 2005, 124, 92). Em modelos relacionados de fibrose 25 de tecido, a inibição do eixo de CCR2/MCP-1 reduziu fibrose em pele (T Yamamoto e K Nishioka, J Invest Dermatol 2003, 121, 510; AM Ferreira e outros, J Invest Dermatol. 2006, 126, 1900), pulmão (T Okuma e outros, J Pathol. 2004, 204, 594; M Gharaee-Kermani e outros, Cytokine 2003, 24, 266), rim (K Kitagawa e outros, Am J Pathol. 2004, 165, 237; T Wada e ou- 30 tros, J Am. Soc Nephrol 2004, 15, 940), coração (S Hayashidari\ e outros, Circulation 2003, 108, 2134j, e fígado (S Tsuruta e outros, Int J Mol Med.

2004, 14, 837). Um estudo demonstrou o valor terapêutico potencial do antago- nismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de alveolite. Quando ratos com lesão pulmonar por imunocomplexo de IgA foram tratados intra- venosamente com anticorpos aumentados contra MCP-1 de rato (JE), os 5 sintomas de alveolite foram parcialmente aliviados (Michael L. Jones, e ou- tros, J. Immunol. 1992, 149,2147).

Vários estudos demonstraram o valor terapêutico potencial do antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de câncer (revi- sado em: M. J. Craig e R. D. Loberg, Cancer Metastasis Rev. 2006, 25, 611; 10 I. Conti e B. Rollins, Seminars in Cancer Biology 2004, 14, 149; R. Giles e R. D. Loberg, Curr. Caneer Drug Targets 2006, 6, 659). Quando camundongos imunodeficientes transportando células de carcinoma de mama humanas foram tratados com um anticorpo anti-MCP-1, a inibição de micrometástases pulmonares e aumentos em sobrevivência foram observados (Rosalba Sal- - 15 cedo, e outros, Blood 2000, 96, 34-40). Empregando-se espécimes de tumor clínicos humanos, a expressão de CCR2 foi associada com progressão de câncer da próstata (Y. Lu, e outros J. CeH. Bioehem. 2007, 101, 676). In vi- tro, foi mostrado que a expressão de MCP-1 medeia crescimento e invasão de células de câncer de próstata (Y. Lu, e outros Prostate 2006, 66, 1311); 20 além disso, MCP-1 expressa por células de câncer de próstata induziu pro- genitores de medula óssea humana para reabsorção óssea (Y. Lu, e outros, Caneer Res. 2007, 67, 3646).

Estudos múltiplos descreveram o valor terapêutico potencial do antagonismo da interação de MCP-1/CCR2 no tratamento de reestenose. 25 Em seres humanos, níveis de MCP-1 correlacionam-se diretamente com risco com relação à reestenose (F. Cipollone, e outros Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 327). Camundongos com deficiência em CCR2 ou em MCP-1 apresentaram reduções na área íntima e na relação de íntima/média (em relação à filhotes do tipo selvagem) depois de lesão arterial (Merce Ro- 30 que, e outros Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 554; A. Schober, e outros Circ. Res. 2004, 95, 1125; W. J. Kim, e outros Bioehem Biophys Res Commun. 2003, 310, 936). Em camundongos, a transfecção de um inibidor negativo dominante de MCP-1 no músculo esquelético (K. Egashira, e ou- tros Circ. Res. 2002, 90, 1167) também reduziu hiperplasia íntima depois de lesão arterial. O bloqueio de CCR2 empregando-se um anticorpo neutraliza- dor reduziu hiperplasia neoíntima depois de sondagem em primatas (C. Hor- vath, e outros Circ. Res. 2002, 90, 488).

Dois relatórios descrevem a super-expressão de ratos de MCP-1 com trauma cerebral induzido (J. S. King, e outros, J. Neuroimmunol. 1994, 56, 127, e Joan W. Berman, e outros, J. Immunol. 1996, 156, 3017). Além disso, estudos mostraram que tanto camundongos de CCR27' (O. B. Dimitri- 10 jevic, e outros Stroke 2007, 38, 1345) quanto de MCP-Γ7' (P. M. Hughes, e outros J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002, 22, 308) são parcialmente prote- gidos de lesão de isquemia/reperfusão.

É sabido que monócitos/ macrófagos desempenham um papel importante no desenvolvimento de dor neuropática (Liu T, van Rooijen N, Tracey DJ, Pain 2000, 86, 25). Consistente com esta noção, um papel po- tencial para CCR2 no tratamento de ambas as dores inflamatória e neuropá- tica foi descrito recentemente. Camundongos de CCR27' apresentaram res- postas alteradas à dor inflamatória em relação às suas contrapartes de WT, incluindo comportamento de dor reduzida depois de injeção de formalina intraplantar e alodinia mecânica ligeiramente reduzida depois de injeção de CFA intraplantar (C. Abbadie, e outros Proc. Natl. Acad. Sci., E.U.A. 2003, 100, 7947). Além disso, camundongos de CCR2'/_ não apresentaram alodi- nia mecânica significante depois de lesão do nervo ciático. Igualmente, um antagonista de CCR2 de molécula pequena reduziu alodinia mecânica a -80% dos níveis pré-lesão depois de administração oral (C. Abbadie, J. A. Lindia, e horas. Wang, WO PCT 110376, 2004).

Um estudo descreveu o papel crítico de MCP-1 em miocardiopa- tia isquêmica (N. G. Frangogiannis, e outros, Circulation 2007, 115, 584). Outro estudo descreveu a atenuação de insuficiência cardíaca experimental em seguida à inibição de MCP-1 (S Hayashidani e outros, Circulation 2003, 108, 2134).

Outros estudos forneceram a evidência de que MCP-1 é super- expressa em vários estados de doença não mencionados acima. Estes rela- tórios fornecem evidência correlativa de que antagonistas de MCP-1 possam ser produtos terapêuticos úteis para tais doenças. Outro estudo demonstrou a super-expressão de MCP-1 em aloenxertos cardíacos de roedores, suge- 5 rindo um papel para MCP-1 na patogênese de arteriosclerose de transplante (Mary E. Russell, e outros Proc. NatL Acad. Sei. E.U.A. 1993, 90, 6086). a super-expressão de MCP-1 foi observada nas células de endoteliais pulmo- nares de pacientes com fibrose pulmonar idiopática (Harry N. Antoniades, e outros, Proc. NatL Acad. Sei. E.U.A. 1992, 89, 5371). Similarmente, a super- 10 expressão de MCP-1 foi observada na pele de pacientes com psoríase (M. Deleuran, e outros, J. Dermatol. Sei. 1996, 13, 228, e R. Gillitzer, e outros, J. Invest. Dermatol. 1993, 101, 127); resultados correlativos com predominân- cia de células de CCR2+ também foram relatados (C. Vestergaard, e outros Acta Derm. Venerol. 2004, 84, 353). Finalmente, um recente relatório mos- 15 trou que MCP-1 é super-expressa nos cérebros e líquido cerebroespinal de pacientes com demência associada com HIV-1 (Alfredo Garzino-Demo, WO 99/46991).

Além disso, foi mostrado que o polimorfismo de CCR2 está as- sociado com sarcoidose pelo menos em um subgrupo de pacientes (P. Spagnolo, e outros Am J Respir Crit Care Med. 2003, 168, 1162).

Também deve ser obsevado que CCR-2 foi implicado como um co-receptor para algumas linhagens de HIV (B. J. Doranz, e outros, Cell

1996, 85, 1149). Também foi determinado que o emprego de CCR-2 como um co-receptor de HIV pode estar correlacionado com a progressão da do- 25 ença (Ruth I. Connor, e outros, J. Exp. Med. 1997, 185, 621). Este resultado é consistente com a recente descoberta que a presença de um mutante de CCR-2, CCR2-64I, está positivamente correlacionada com início retardado de HIV na população humana (Michael W. Smith, e outros, Science 1997, 277, 959). Embora MCP-1 não tenha sido implicada nestes processos, pode 30 ser que antagonistas de MCP-1 que agem por meio de ligação à CCR-2 possam ter efeitos terapêuticos benéficos no retardamento da progressão de doença para AIDS em pacientes infectados com HIV. Deve ser observado que CCR2 também é o receptor para as quimiocinas humanas MCP-2, MCP-3, e MCP-4 (Luster, New. Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445). Uma vez que os novos compostos de fórmula (I) des- critos aqui antagonizam MCP-1 ligando-se ao receptor de CCR-2, pode ser 5 que estes compostos de fórmula (I) também sejam antagonistas eficazes das ações de MCP-2, MCP-3, e MCP-4 que são mediadas por CCR-2. Por conseguinte, quando referência é feita aqui à "antagonismo de MCP-1", de- ve ser assumido que esta é equivalente à "antagonismo de estimulação de quimiocina de CCR-2".

Por conseguinte, compostos que modulam a atividade de quimi-

ocina poderiam demonstrar uma ampla faixa de utilidades no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoimunes, metabólicas, de câncer e/ou cardiovasculares. A publicação de patente W02005021500 A1 (incorporada aqui por referência e designada para o presente requerente) descreve com- 15 postos que modulam atividade de MCP-1, MCP-2, MCP-3 de MCP-4 por meio de CCR2. A referência também descreve vários processos para prepa- rar estes compostos incluindo sínteses de múltiplas etapas que incluem a introdução e remoção subseqüente de grupos de proteção.

É desejável encontrar novos compostos com características 20 farmacológicas melhoradas comparados com moduladores de quimiocina conhecidos. Por exemplo, é desejável encontrar novos compostos com ati- vidade inibidora de CCR-2 e seletividade com relação à CCR-2 melhoradas versus outros receptores acoplados à proteína G (isto é receptor de 5HT2A). Também é desejável encontrar compostos com características vantajosas e 25 melhoradas em uma ou mais das categorias seguintes:

(a) propriedades farmacêuticas (isto é solubilidade, permeabili- dade, acessibilidade para formulações de liberação prolongada);

(b) exigências de dosagem (por exemplo, dosagens mais baixas e/ou dosagem de uma vez por dia);

(c) fatores que diminuem as características de pico circulante de

concentração sangüínea (isto é liberação e/ou volume de distribuição);

(d) fatores que aumentam a concentração de fármaco ativo no receptor (isto é ligação de proteína, volume de distribuição);

(e) fatores que diminuem o risco com relação à interações de fármaco-fármaco clínicas (inibição ou indução de enzima P450 de citocro- mo, tal como inibição de CYP 2D6, veja G.K. Dresser, J.D. Spence, D.G.

Bailey, Clin. Pharmacokinet. 2000, 38, 41-57, que está por meio deste incor- porado por referência);

(f) fatores que diminuem o potencial com relação à efeitos cola- terais adversos (por exemplo seletividade farmacológica além de receptores acoplados à proteína G, reatividade química ou metabólica potencial, pene-

tração do CNS limitada, e/ou seletividade de canal de íon). É especialmente desejável encontrar compostos que têm uma combinação desejável das ca- racterísticas farmacológicas acima mencionadas.

Também é desejável na técnica fornecer processos novos e/ou melhorados para preparar tais compostos. Estes processos podem ser ca- 15 racterizados, sem limitação, por a) adaptação fácil à produção em escala maior, tal como escalas de planta piloto ou de produção; b) etapas e/ou téc- nicas de processo que que permitem melhoras na pureza (incluindo pureza quiral), estabilidade e/ou facilidade de manipulação de intermediários e/ou compostos finais; e/ou c) menos etapas de processo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece um novo antagonista ou agonis- ta/antagonista parcial de atividade de receptor de MCP-1: N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirroli- din-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal, solvato ou pró-fármaco farmaceuti- 25 camente aceitável deste, tendo uma combinação inesperada de característi- cas farmacológicas desejáveis. Formas cristalinas da presente invenção também são fornecidas. Composições farmacêuticas que contêm as mes- mas e métodos de emprego das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, de 30 câncer e/ou cardiovasculares também são um objetivo desta invenção. A presente descrição também fornece um processo para a preparação de compostos de Fórmula (I), incluindo N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-

f ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)ace-

tamida:

((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorc>metil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal, solvato ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, meta- bólicas, de câncer e/ou cardiovasculares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1. Padrões de pó experimentais e simulados de N-

((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, hemi-hidrato, Forma HO,5-4.

Figura 2. Padrões de pó experimentais e simulados de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, Forma N-2.

Figura 3. Padrões de pó experimentais e simulados de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, 1,75 moles de H2O, Forma H1,75- 5.

Figura 4. Padrões de pó experimentais e simulados de N-

((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de mono-etanol, Forma E-

H

em que R1, R8, R9, R10, e são tais como descritos aqui. Compostos

que são intermediários úteis do processo são também forncedidos aqui.

A presente descrição também providencia o emprego de N- 1.

Figura 5. Padrões de pó experimentais e simulados de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de ácido mono-acético, Forma HAC-1.

Figura 6. Padrões de pó experimentais e simulados de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de mono-R-propileno glicol, Forma RPG-3.

Figura 7. DSC de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-

3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, he- mi-hidrato, Forma HO,5-4.

Figura 8. TGA de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo- 3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, he- mi-hidrato, Forma HO,5-4.

Figura 9. DSC de N-((1R,2S,5R)-5-(ferc-butilamino)-2-((S)-2-oxo- 3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ba- se livre, Forma N-2.

Figura 10. TGA de N-((1 R,2S,5R)-5-(íerc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, Forma N-2.

Figura 11. Isoterma de Absorção de Vapor de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, Forma N-2 a 25QC.

Figura 12. DSC de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-

oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida,

1,75 moles de H2O, Forma H1,75-5.

Figura 13. TGA de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, 1,75 moles de H2O, Forma H1,75-5.

Figura 14. DSC de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de ácido mono-acético, Forma HAC-1.

Figura 15. TGA de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de ácido mono-acético, Forma HAC-1.

Figura 16. DSC de N-((1 R,2S,5R)-5-(ferc-butilamino)-2-((S)-2-

oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de mono-etanol, Forma E-1.

Figura 17. TGA de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de mono-etanol, Forma E-1.

Figura 18. DSC de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, solvato de mono-R-propileno glicol, Forma RPG-3.

Figura 19. TGA de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, solvato de mono-R-propileno glicol, Forma RPG-3.

Figura 20. Modelo de desafio intradérmico em macaco cinomol- go: Exemplo 1 inibiu o recrutamento de célula mononuclear para a pele.

Figura 21. Peritonite de TG de 48 horas em camundongo de hCCR2 Kl: Inibição do Exemplo 1 de infiltração de monócito/ macrófago em cavidade peritoneal.

Figura 22. EAE (encefalomielite autoimune experimental) de camundongo de hCCR2 Kl: O tratamento de Exemplo 1 reduziu o escore clínico.

Figura 23. Espectros de RMN de próton do Exemplo 1, 2- Prepa- ração Alternativa, Etapa 3 - Composto 7.

Figura 24. Espectros de RMN de próton do Exemplo 1, 2- Prepa- ração Alternativa, Etapa 4 - Composto 8.

Figura 25. Espectros de RMN de próton do Exemplo 1, 2- Prepa- ração Alternativa, Etapa 4 - Composto 9.

Figura 26. Espectros de RMN de próton do Exemplo 1, 2- Prepa- ração Alternativa, Etapa 4 - Composto 10 Figura 27. Espectros de RMN de próton do Exemplo 1, 2- Prepa- ração Alternativa, Etapa 5 - Composto 11.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção fornece um novo antagonista ou agonis- ta/antagonista parcial de atividade de receptor de MCP-1: N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirroli- din-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal, solvato ou pró-fármaco farmaceuti- camente aceitável deste, tendo uma combinação inesperada de característi- cas farmacológicas desejáveis. Formas cristalinas da presente invenção também são fornecidas. Composições farmacêuticas que contêm as mes- mas e métodos de emprego das mesmas como agentes para o tratamento de doenças inflamatórias, doenças alérgicas, autoimunes, metabólicas, de câncer e/ou cardiovasculares também são um objetivo desta invenção. A presente descrição também fornece um processo para a preparação de compostos de Fórmula (I), incluindo N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2- ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida:

til) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, inesperadamente demonstra uma combinação desejável de características farmacológicas incluindo um grau surpreendentemente alto de biodisponibilidade oral em combinação com indicações de que é altamente eficaz e tem excelentes critérios de segurança.

H

em que R1, R8, R9, R10, e são tais como descritos aqui. Compostos que são intermediários úteis do processo são também forncedidos aqui.

[N-((1R,2S,5R)-5-(íerc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorome- Moduladores conhecidos de receptores de CCR2, tais como a- queles descritos na Publicação de Patente W02005021500 publicada em 10 de março de 2005 (Patente dos Estados ligados Ns 7,163,937, emitida em 16 de janeiro de 2007, designada para o presente requerente) que de- 5 monstram um grau adequado de permeabilidade de membrana (um fator crítico de biodisponibilidade oral), não são suficientemente eficazes, como medido por sua capacidade de ligação à CCR2 (uma medida de eficácia), e/ou eles são desprovidos de critérios apropriados quanto à segurança co- mo indicado pela seletividade de canal de íon como medido por estudos de 10 canal de íon de Na+ e hERG.

Em contraste, como ilustrado pelos dados apresentados aqui na seção intitulada "Características Farmacológicas Comparativas", infra, a mo- lécula relativamente polar, N-((1R,2S,5R)-5-(ferc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3- (6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida de- 15 monstra um grau surpreendentemente alto de permeabilidade de membra- na, e ainda mantém potente capacidade de ligação à CCR2 junto com sele- tividade de canal de íon excelente.

Por conseguinte, a presente invenção fornece um novo modula- dor de quimiocina que tem características farmacológicas melhoradas o qual se espera seja útil no tratamento de doenças inflamatórias, alérgicas, autoi- munes, metabólicas, de câncer e/ou cardiovasculares.

MODALIDADES

Em uma modalidade, a descrição é dirigida a N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirro- lidin-1 -il)cicloexil)acetamida, e sais farmaceuticamente aceitáveis deste.

Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirro- lidin-1 -iI)cicloexil)acetamida, base livre.

Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirroli- din-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, em que a forma cristalina compreen- de a forma N-2. Outra modalidade é a forma N-2 caracterizada por (ou tendo) parâmetros celulares unitários substancialmente igual ao seguinte: Dimensões celulares: a = 18,7240(4)

b = 8,0171(2)

C= 19,6568(5) a = 90

β = 114,935(2) γ= 90

V(Á3) = 2675,7(1)

Grupo espacial P2-|2-i2i Moléculas / célula unitária 2

em que o referido cristal está em uma temperatura de abrange de +22eC (temperatura ambiente).

Outra modalidade na forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um

padrão de difração de pó de raio X que compreende três ou mais dos valo- res de 2Θ (CuKa λ=1,5418 Á) selecionados de 5,5, 9,1, 12,1, 14,0 e 19,2, a uma temperatura de abrange de 229C.

Outra modalidade é a forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um padrão de difração de pó de raio X também compreendendo quatro ou mais dos valores de 2Θ (CuKa A=1,5418Á) selecionados de 5,5, 9,1, 12,1, 14,0 e 19,2 a uma temperatura de abrange de 229C.

Outra modalidade é a forma N-2 caracterizada por (ou tendo) coordenadas atômicas fracionárias substancialmente como listado na Tabe- Ia 3.

Outra modalidade é a forma N-2 caracterizada por (ou tendo) um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a Figura 2.

Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino) pirroli- din-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma H1,75-5 (1,75 moles de água), caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais dos valores de 2Θ (CuKa λ=1,541δΑ) selecionados de Tabela 9; coordenada atômica fracionária co- mo listado substancialmente na Tabela 4 e/ou um padrão de difração de pó de raio X de acordo com a Figura 3.

5 Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5-

(ferc-buti)amino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirroli- din-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma HO,5-4 (hemi-hidrato) caracterizada pelos parâmetros celulares unitários encontra- dos na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais dos valores de 2Θ (CuKa λ=1,5418À) sele- 10 cionados de Tabela 9; coordenada atômica fracionária substancialmente como listado na Tabela 2 e/ou um padrão de dif ração de pó de raio X de acordo com a Figura 1.

Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (ferc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4'ilamino)pirroli- 15 din-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma e -1 (solva- to de mono-etanol) caracterizada pelos parâmetros celulares unitários en- contrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais dos valores de 2Θ (CuKa Â=1,5418Á) selecionados de Tabela 9; coordenada atômica fracionária substancialmente como listado na Tabela 5 e/ou um padrão de dif ração de pó de raio X de 20 acordo com a Figura 4.

Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirro- lidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre, compreendendo a Forma HAC-1 (solvato ácido mono-acético) caracterizada pelos parâmetros celulares unitá- 25 rios encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais dos valores de 2Θ (CuKa λ=1,541δΛ) selecionados de Tabela 9; coordenada atômica fracionária substancialmente como listado na Tabela 6 e/ou um padrão de dif ração de pó de raio X de acordo com a Figura 5.

Outra modalidade uns padrões de forma cristalinos de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida são, base livre, incluindo Forma IPA-1 (solvato de mono-isopropanol) caracterizada pelos parâmetros celula- res unitários encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais dos valores de 2Θ (CuKa A=1,5418Á) selecionados de Tabela 9; e/ou coordenadas atômicas fracionárias substancialmente como listado na Tabela 7.

Outra modalidade é uma forma cristalina de N-((1 R,2S,5R)-5- (te/r-butilamino^-^S^-oxo-S-íe-ítrifluorometiOquinazolin·^-

ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida é, base livre que inclui Forma RPG- 3 (solvato de mono-R-propileno glicol) caracterizada pelos parâmetros celu- lares unitários encontrados na Tabela 1; 3 ou 4 ou mais dos valores de 2Θ (CuKa A=1,5418Á) selecionados de Tabela 9; coordenada atômica fracioná- 10 ria substancialmente como listado na Tabela 8 e/ou um padrão de difração de pó de raio X de acordo com a Figura 6.

Outra modalidade é uma composição farmacêutica, compreen- dendo um portador farmaceuticamente aceitável e um composto dos Exem- plos.

Outra modalidade é um método para a modulação de quimioci-

na ou atividade de receptor de quimiocina compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para a modulação de atividade de receptor de CCR-2 compreendendo administrar a um paciente com ne- cessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para a modulação da atividade de MCP-1, MCP-2, MCP-3 e MCP-4, e MCP-5 que são mediadas pelo re- ceptor de CCR2 compreendendo administrar a um paciente com necessida- de deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos E- xemplos.

Outra modalidade é um método para a modulação da atividade de MCP-1 compreendendo administrar a um paciente com necessidade des- te uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para a inibição da atividade de CCR2 e CCR5 compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exem- plos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma 5 quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos dos dis- túrbios referidos sendo selecionados de diabetes, obesidade, síndrome me- tabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, miocardiopatia isquê- mica, psoríase, hipertensão, esclerodermia, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, 10 doenças auto-imunes, infecção por HIV1 demência associada com HIV, pso- ríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença inflamatória do in- testino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite sérica nefrotóxi- ca, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, pla- 15 cas vulneráveis, artrite reumatóide, reestenose, hiperplasia neoíntima veno- sa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia de aloenxerto crônica, e câncer.

Outra modalidade é um método para o tratamento de distúrbios, 20 compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de diabetes, obesidade, doença de Crohn, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença inflamatória 25 do intestino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite sérica ne- frotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, e artrite reumatóide, reestenose, transplante de órgão, e câncer.

Outra modalidade é um método para o tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistêmico, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, reestenose, e transplante de órgão.

Outra modalidade é um método para o tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de esclerose múltipla, aterosclero- se, doença de Crohn, e diabetes.

Outra modalidade é um método para o tratamento de distúrbios, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos, em que os referidos distúrbios são selecionados de reestenose, transplante de ór- gão, e câncer.

Outra modalidade é um método para o tratamento de diabetes, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de a doença

de Crohns, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exem- plos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de esclerose múltipla, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de ateroscle- rose, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de reesteno-

se, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de transplan- te de órgão, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exem- plos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para o tratamento de câncer, em que o câncer é selecionado de câncer de mama, câncer do fígado, cân- cer de próstata e melanoma.

Outra modalidade é um método para o tratamento inflamatório, alérgico, autoimune, metabólico, câncer e/ou doenças cardiovasculares compreendendo administrar a um paciente com necessidade de uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para o tratamento inflamatório,

alérgico, autoimune, metabólico, câncer e/ou de doenças cardiovasculares que são pelo menos parcialmente mediadas por CCR-2, compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para a modulação de atividade

de CCR2 compreendendo administrar a um paciente com necessidade des- te uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um método para modulação de ΜΙΡ-1β e atividade de RANTES que é mediada pelo receptor CCR5 compreendendo administrar a um paciente com necessidade deste uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de um composto dos Exemplos.

Outra modalidade é um composto dos Exemplos na preparação de um medicamento para o tratamento de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, miocardiopatia is- 25 quêmica, psoríase, hipertensão, esclerodermia, osteoartrite, aneurisma, fe- bre, doença cardiovascular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca con- gestiva, doenças auto-imunes, infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, trauma cerebral fisicamente ou quimicamente induzido, doença inflamatória 30 do intestino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite sérica ne- frotóxica, glomerulonefrite, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculi- te, placas vulneráveis, artrite reumatóide, reestenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de des- vio arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia de aloenxerto crônica, e câncer.

Outra modalidade é um composto dos Exemplos para emprego

em terapia.

A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem afastar-se do espírito ou atributos essenciais desta. Esta invenção tam- bém abrange todas as combinações dos aspectos e modalidades alternati- vos da invenção mencionados aqui. Entende-se que qualquer e todas as modalidades podem ser consideradas em conjunção com qualquer outra modalidade para descrever modalidades adicionais da presente invenção. Além disso, quaisquer elementos de uma modalidade (incluindo aspectos preferidos) são pretendidos para serem combinados com qualquer e todos os outros elementos de qualquer das modalidades para descrever modali- dades adicionais.

MODALIDADES DE PROCESSOS

A presente descrição também fornece um novo processo para produção de compostos de fórmula I:

Incluindo N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

Em uma 1- modalidade, a presente descrição fornece um novo processo por preparação de um composto de fórmula IV, o processo com- preendendo:

A acoplagem de um derivado de aminoácido da estrutura III, ou um sal deste, com um cicloexanona de fórmula II, ou um sal deste (veja pre-

H paração em W02005021500), para produzir um composto da estrutura IV, ou um sal deste tendo uma cadeia lateral de amida substituída

Il Ill IV

em que:

Ra e Rb são independentemente Ci.6alcoxi;

ou Ra e Rb juntos com o carbono ao qual eles são ambos ligados

combinam para formar uma carbonila, uma tiocarbonila, um acetal cíclico ou tioacetal cíclico, em que o acetal cíclico ou tioacetal cíclico é selecionado de

- O-Z-O - e -S-Z-S -,Zé -(CTiT2)2, -(CTiT2)3, ou Copiar a fórmula da pá- gina 26, eT!,T2eT3a cada ocorrência são independentemente seleciona- dos de hidrogênio, C1-4 alquila, C2-4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, ni- tro, CF3, OC1-4 alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4 alquila (de preferência T 1, T2 e T3 são cada qual hidrogênio);

R1, R2 e R3 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de amina;

R4 é Ci-6 alquila inferior ou benzila opcionalmente substituída;

Y é halogênio, SMe, S(Me)+Ri2, ou OSO2Ri3;

V é OH, halogênio ou OSO2Ri3;

R-I2 é hidrogênio, Ci.6 alquila, - (CH2)C(O)O Ci-6 alquila, ou - (CH2)C(O)O C1-6 alquila; e Ri3 a cada ocorrência é Ci-6 alquila.

Grupos de proteção de amina preferidos são grupos que podem ser removidos por hidrólise ou hidrogenólise sob condições padrões. Tais grupos incluem sem limitação, um grupo carbobenziloxi (Cbz), um terc- butiloxicarbonila (BOC), um grupo fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), um grupo benzila (Bn) ou um grupo p-metoxibenzila (PMB). Mais preferidos são grupos Cbz, BOC1 ou Bn (especialmente Cbz e Bn).

Em uma 2- modalidade, a presente descrição fornece um novo processo em que:

Ra e Rb juntos com os átomos de carbono aos quais eles são ambos ligados combinam para formar uma carbonila ou um grupo 1, 3- dioxolano (especialmente um grupo 1,3-dioxolano);

Ri é hidrogênio;

R2 é Cbz;

R3 é hidrogênio;

R4 é C1-6 alquila;

Y é S(Me); e

V é OH.

Em uma 3- modalidade, onde Y é - SMe, a descrição fornece um processo também compreendendo alquilação do composto de fórmula IV com um grupo Ri2X1 em que X é um halogênio, para formar um sal de sulfônio desta. O agente de alquilação é de preferência iodeto de metila.

Em uma 4- modalidade, a descrição fornece um processo em que cicloexanona de fórmula IV é um sal de toluenossulfonato.

Em uma 5ã modalidade, a descrição fornece um processo em que o composto de fórmula IV é um sal de sulfônio.

Em uma 6a modalidade, a descrição fornece um processo em que a acouplagem é administrada sob uma atmosfera inerte, tal como nitro- gênio ou argônio (de preferência nitrogênio) em um solvente aprótico tal como proprionitrilo, acetato de isopropila, acetato de n-butila, acetato de terc-butila ou acetonitrilo (especialmente acetonitrilo e/ou acetato etila).

Em uma 7- modalidade, a descrição fornece um processo em que a acoplagem pode ser arquivada pelo contato de um composto de fór- mula Il com um reagente de acoplamento de diimida na presença de um ativador, e uma base de amina terciária. O reagente de acoplamento de dii- 30 mida inclui regentes, por exemplo tais como EDAC. Exemplos de ativadores incluem HOBt (o referido termo inclui hidratos destes) e N',N'-4-dimeti- lamino-piridina. Uma base de amina terciária, inclui por exemplo, trietilamina, amina de N-N-disopropil-N-etila e tri-n-propilamina.

Em uma 8â modalidade, a descrição fornece um processo em que o reagente de acoplamento de diimida é EDAC1 o ativador, é HOBt, (o referido termo inclui hidratos desta) e a base de amina terciária é trietilami-

que as relações em mole de um composto de fórmula Il para o reagente de acoplamento de diimida para o ativador para a amina terciária é de cerca de um acerca de 0,090 - 1,50 a cerca de 0,95 - 1,50 a cerca de 2,00 a 3,00, 10 respectivamente. As referidas relações em mole são de preferência um a cerca de 0,095 - 1,05 a cerca de 0,95 - 1,10 e a cerca de 2,10 a 2,20, res- pectivamente.

Em uma 10â modalidade, a descrição fornece um novo processo

para preparação de um composto de fórmaula V tendo uma porção de éster:

,NRiR2

to de fórmula IV, ou um sal deste, para produzir um composto de fórmula V tendo uma porção de éster.

Ci-6alcóxi, ou Ra e Rb juntos com o carbono ao qual eles são ambos ligados combinam para formar um uma tiocarbonila, um acetal cíclico ou tioacetal cíclico, a descrição fornece um processo que opcionalmente também com- preende a etapa de hidrolização dos grupos Ra e Rb de forma que a combi-

ma uma carbonila. A hidrolização pode ser administrada em um solvente tal como acetona, butanona, acetonitrilo e isopropanol, ou soluções aquosas na.

Em uma 9§ modalidade, a descrição fornece um processo em

IV

v

o processo, compreendendo:

ciclização do cadeia lateral derivada aminoácido de um compos-

Em uma 11§ modalidade onde Ra e Rb são independentemente

nação do Ra e Rb juntos com o carbono ao qual eles são ambos ligados for- desta, e é administrada de preferência em acetona aquosa. De preferência, a etapa de hidrólise segue a etapa de cilização.

Em uma 12- modalidade, a descrição fornece um processo em que a ciclização é administrado combinando um composto de fórmula IV, ou 5 um sal deste, com uma base na presença de um solvente. Tais bases po- dem ser, por exemplo sem limitação, carbonato de césio, bicarbonato de césio, carbonato de potássio, terc-butilato de sódio, hexametildisilazida de sódio, e de preferência carbonato de césio.

Em uma 13â modalidade, a descrição fornece um processo em que a ciclização é administrada sob uma atmosfera inerte, tal como nitrogê- nio ou argônio (de preferência nitrogênio) um solvente incluindo, por exem- plo sem limite, DMSO, DMF, DMA, N-metilpirrolidona, sulfolano (especial- mente DMSO e/ou DMF).

Em uma 14§ modalidade, a descrição fornece processo para preparação de um composto de fórmula VI:

Vl

o processo compreendendo:

a hidrolização da porção de éster do composto de fórmula V com um agente de hidrolização para formar o ácido do composto Vl em temperaturas de cerca de -5 a cerca de 5QC. Agentes de hidrolização de és- 20 ter são bem conhecidos para aqueles habilidade na técnica e incluem hidró- xidos de metal de álcali, MOH, em que M é Li, Na ou K, de preferência o agente de hidrolização é NaOH aquoso. De preferência a etapa de hidroliza- ção é realizada sob condições bifásicas com um solvente orgânico que é parcialmente miscível em água. Solventes orgânicos preferidos são acílicos 25 ou éteres cíclicos incluindo THF, THF de 2-metila, 1,2-dimetoxietano, 1,4- dioxano, especialmente THF. Alternativamente, em uma 15§ modalidade, onde Ra e Rbjuntos com o átomo ao qual eles são ambos ligados combinam para formar uma carbonila, a descrição fornece um processo para preparação de um com- posto de fórmula VII:

NR1R2

^NR1R2

cio

HO-Z-OH

Vla

Vl

o processo compreendendo:

a reação de um composto de fórmula Via, HO-Z-OH, com um composto de fórmula IV (opcionalmente in situ) na presença de um catalisa- dor de ácido para produzir um composto de fórmula VII,

<fi

em que Z é -(CT1T2)2-, -(CT1T2)3 -, ou N==/ (Τ’,Μ ; e

T 1, T2 e T3 em cada ocorrência são independentemente sele- cionados de hidrogênio, C1-4 alquila, C2.4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCi-4 alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4 alquila (de preferência T 1, T2 e T3 são cada qual hidrogênio).

De preferência o composto de fórmula Vla é etileno glicol e o catalisador de ácido é ácido p-toluenossulfônico, ou um hidrato deste.

Em uma 16§ modalidade, a descrição fornece um processo para

preparação de um composto de fórmula VIII:

NR1R2

Cl0

Vll

^NCO

Vlll o processo compreendendo:

a transformação do cetal de fórmula Vll para um isocianato in- termediário de fórmula VIII. A transformação é de preferência administrada por uma recombinação de Curtius.

Em uma 17- modalidade, a descrição fornece um processo em

que a etapa de transformação é administrada por uma recombinação de Curtius compreendendo as etapas de:

a) misturando uma solução substancialmente anidrosa de fór- mula Vll com uma base (a base é por exemplo, sem limitação, uma alquila-

mina, especialmente uma amina terciária, de preferência trietilamina);

b) adicionando um haloformato (por exemplo, um cloroformiato, de preferência I-BuO2CCI) para a solução a uma temperatura de de cerca de -10°C a cerca de O0C durante formar um anidrido misturado do ácido de fórmula VII;

c) tratamento do anidrido misturado com um reagente de azida

(de preferência NaN3) na presença de um catalisador de transferência de fase (de preferência um sal de tetralquilamônio tal como brometo de tetrabu- tilamônio a cerca de 5 mol%) a uma temperatura de cerca de -10°C a cerca de 0°C durante formar a azida de ácido de fórmula Vila:

d) aquecimento de um solução substancialmente anidrosa da azida de acila de fórmula Vlla para formar o isocianato correspondente de fórmula VIII. De preferência a solução substancialmente anidrosa de azida de acila é secada sobre peneiras moleculares.

Em uma 18â modalidade, a descrição fornece um processo para preparação de um composto de fórmula IX tendo uma porção de cetal:

NR1R2

um composto de fórmula R10COW (por exemplo ácido acético) na presença de um correspondente ácido anidrido (isto é (Ri0CO)2O) para formar a ami- da de fórmula IX em que:

Em uma 19ã modalidade a descrição fornece um processo para preparação de um composto de fórmula X:

JMR1R2

formar um composto de fórmula X. Condições de hidrolização de cetal e re- agentes são bem conhecidos para aqueles habilidade na técnica. De prefe- rência hidrólise é administrada por aquecimento de uma solução do com- posto IX tendo uma porção de cetal em um solvente orgânico (por exemplo acetona) e ácido clorídrico (cerca de 1 N) em cerca de 45°C a cerca de 55°C

Vlll

IX

5

o processo compreendendo:

contato do isocianato de fórmula Vlll (opcionalmente in situ) com

10

Rio é Ci-6 alquila (Ri0 é de preferência metila): e W é OH ou OCi-6 alquila. durante cerca de 2 - 4 horas.

Em uma 20ê modalidade, a descrição fornece um processo para preparação de um composto de fórmula XI:

,NR1R2

ςΐο

X HNR8R9

R8^R9

Xl

o processo compreendendo:

5 a aminação reductiva do composto de fórmula X com uma ami-

na de fórmula HNR8Rg na presença de um Ácido de Lewis seguido por um agente de redução para formar um composto de fórmula Xl tendo uma por- ção de amina de pirollidonila.

Em uma 21ê modalidade, a descrição fornece um processo em

- 10 que a aminação redutiva compreende as etapas de:

a) adição de um Ácido de Lewis (de preferência um reagente de titânio incluindo, sem limite, TiCI2(0-iso-propil)2) A uma solução de composto Xea amina tendo a fórmula HNR8Rg em um solvente aprótico para formar uma imina-enamina de fórmula XA:

b) tratamento da imina-enamina de fórmula Xa com um agente de redução (de preferência sulfeto de dimetila de borano) para produzir o composto de fórmula Xl tendo uma porção de amina de pirollindonila.

Nas etapas precedentes, o solvente aprótico pode ser por e- xemplo, sem limitação, diclorometano, acetonitrilo, DMSO, DMF, e N-metil- pirrolidinona (de preferência diclorometano).

Em uma 22- modalidade, a descrição fornece um processo em que a amina de fórmula HN(R8)(R9) é de preferência amina de ferc-butila.

Em uma 23ã modalidade, a descrição fornece processo para preparação de um composto de fórmula XII:

R8^ vR9 Xll

o processo compreendendo:

a desproteção da amina de pirolidonila de fórmula Xl para for- mar um composto de fórmula XII.

Em uma 24§ modalidade, a descrição fornece um processo em que a etapa de desproteção é realizada por hidrogenação de uma solução 15 do composto de fórmula Xll na presença de um catalisador tal como paládio. De preferência a hidrogenação é realizada a cerca de 20 a cerca de 40 psig em um solvente, incluindo, sem limitação, metanol, sobre catalisador de Pd/C a 5% a cerca de 25°C durante cerca de duas a cerca de seis horas.

Em uma 255 modalidade, a descrição fornece um processo para preparação de um composto de fórmula I compreendendo acoplagem do composto de fórmula Xll com um composto de fórmula

LG

para produzir um composto de fórmula I em que:

HET é um anel de heteroarila de 3 -14 membros tendo de um a quatro heteroátomos selecionados de N, O ou S (de preferência um a três heteroátomos, especialmente um a dois átomos de nitrogênio) em pelo me- nos um dos anéis (HET é de preferência um quinazolin-4-ila 6-substituído, mais preferível 6-trifluorometil-quinazolin-4-ila); e LG é um grupo de saída selecionado de halogênio ou OSO2R16,

em que R16 é fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos selecionados de N, S1 ou O, Ci-6 alquila, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos por um a três gru- pos selecionados de halogênio, CF3 e Ci-6 alquila (de preferência LG é um halogênio, especialmente cloro).

Um grupo de saída tal como empregado aqui inclui, sem limita- ção, grupos tais como halogênios, mesilato, nonaflatos, sulfonatos, tosilatos e triflatos. Um grupo de saída preferido é halogênio ou OSO2R16, em que R16 é fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais átomos 15 selecionados de N, S ou O, C1^ alquila, ou uma cicloalquila de 3 a 7 mem- bros, todos os quais são opcionalmente substituídos por um a três grupos selecionados de halogênio, CF3, e C1-6 alquila. Na modalidade mais preferi- da LG é um halogênio, especialmente cloro.

Em uma 26â modalidade, a descrição fornece um processo para preparação de um composto de fórmula X:

incluindo as etapas de:

hidrolização da porção de éster do composto de fórmula V com um agente de hidrolização para formar 0 ácido de composto Vl a temperatu- ras de cerca de -5 a cerca de 5eC: Vl

»

reação de um composto de fórmula Via, HO-Z-OH1 com um composto de fórmula IV (opcionalmente in situ) na presença de um catalisa- dor ácido para produzir um composto de fórmula Vll tendo uma porção de ácido carboxílico:

NR1R2

do

HO-Z-OH Vl -

Vla

reação de um composto de fórmula Vla, HO-Z-OH (de preferên- cia alquileno glicol, especialmente etileno glicol), com um composto de fór- mula IV (opcionalmente in situ) na presença de um catalisador ácido (de preferência ácido p-toluenossulfônico, ou um hidrato deste) para produzir um composto de fórmula Vll tendo uma porção de ácido carboxílico:

^NR1R2

,NR1R2

N HO-Z-OH

>\\C02H

ÇJ

Vl

transformando a porção de ácido carboxílico do cetal de fórmula

Vll para um isocianato de intermediário correspondente de fórmula VIII: W VIII;

contactando o isocianato de fórmula Vlll (opcionalmente in situ),

com um composto de fórmula R10COW (por exemplo ácido acético) na pre- sença de um anidrido de ácido correspondente (isto é (RioCO)2O) para for- mar a amida de fórmula IX tendo uma porção de cetal:

IX; e

hidrolização da porção de cétal da amida de fórmula IX para formar o composto de fórmula X:

em que:

R1, e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de amina;

R4 e R10 são independentemente Ci-6 alquila ou benzila opcio- nalmente substituída;

R8 e Rg são independentemente hidrogênio ou C1-6 alquila;

NRiR2

NRiR2

O

X; W é OH ou OC1-S alquila;

Z é -(CT1T2)2 -, -(CT1T2)3 -, OU ^

T i, T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio- nados de hidrogênio, C-m alquila, C2-4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, 5 nitro, CF3, OC1^ alquila, OCF3, e 0(=0)0^ alquila.

Em uma 27- modalidade, a descrição fornece um processo para preparação de um composto de fórmula Xl em que:

o composto de fórmula Vll é ácido (7R,8S)-8-((3S)-3-(((benzi- lóxi)carbonil)amino)-2-oxo-1-pirrolidinil)-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-7-carboxí-

10 lico, ou um sal deste;

o composto de fórmula Vlla é ((3S)-1-((7R,8S)-7-(azidocarbonil)- 1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

o composto de fórmula Vlll é ((3S)-1-((7R,8S)-7-isocianato-1,4- '15 dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

0 composto de fórmula IX é ((3S)-1-((7R,8S)-7-acetamido-1,4- dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

20 o composto de fórmula X é ((3S)-1-((1S,2R)-2-acetamido-4-

oxocicloexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste; e

o composto de fórmula Xl é ((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-acetamido-4- (terc-butilamino)cicloexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

25 Em uma 28â modalidade, a descrição fornece um processo para

preparação de um composto de fórmula I: ,NR1R2

O

V

,NR1R2

ci„

NR1R2

Cio

ο

Vl

,NR1R2

Cl0

•Λ''

NCO

CJ

Ri0C(O)W

^NR1R2

cl„

""Y

ο

c;

NR1R2

O^O

-γ

ο

Vlll

IX

HNR8R9

/RlR2 NHR1

9·: ÇS

I -- ry' γ

*-Q (het) ^ Jj R

\\™ *·10

I T

.Nv =

R® R® R8" 'R9

Xl R1 Xll

*Mhet)

O

Ra R0

o processo compreendendo:

hidrolização da porção de éster do composto de fórmula V com um agente de hidrolização (de preferência um hidróxido de álcali, hidróxido especialmente de sódio) para formar um composto de fórmula VI;

reação de um composto de fórmula Va, HO-Z-OH, com o com- posto de fórmula VI, opcionalmente in situ, na presença de catalisador de ácido (de preferência ácido p-toluenossulfônico, ou um hidrato deste) para produzir um composto de fórmula Vll tendo uma porção de ácido carboxíli- co;

transformação da porção de ácido carboxílico do cetal de fórmu- la Vll para formar um isocianato intermediário correspondente de fórmula VIII;

contactando o isocianato de fórmula VIII, opcionalmente in situ, com um composto de fórmula R10COW (de preferência ácido acético) na presença de um anidrido de ácido correspondente, (RioCO)2O (de preferên- cia anidrido acético), para formar a amida de fórmula IX tendo uma porção de cetal;

hidrolização da porção de cetal da amida de fórmula IX para formar o composto de fórmula X; e

aminação redutiva do composto de fórmula X com um amina de fórmula HNR8Rg (de preferência amina de ferc-butila) na presença de um ácido de Lewis (de preferência um reagente de titânio tal como TiCI2(0-iso- propil)2) para formar um composto de fórmula Xl tendo uma porção de ami- na de pirolidonila;

desproteção da amina de pirolidinila de fórmula Xl para formar um composto de fórmula XII; e acoplagem do composto de fórmula Xll com um composto de

(HETj-LG

fórmula para produzir um composto de fórmula I;

em que:

Ri, e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de proteção de amina;

R4 e Rio são independentemente Ci-6 alquila ou benzila opcio-

nalmente substituída;

R8 e R9 são independentemente hidrogênio ou Ci-6 alquila;

W é OH ou OCi-6 alquila;

Z é -(CT1T2)2 -, -(CT1T2)3 -, ou w ;

T 1, T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio-

nados de hidrogênio, C1^ alquila, C2.4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC1-4 alquila, OCF3, e C(=0)C-|.4 alquila (de preferência Z é - (CH2)2-);

HET é um anel de heteroarila de 3 - 14membros tendo de um a quatro heteroátomos selecionados de N, O ou S (de preferência um a três 5 heteroátomos, especialmente um a dois átomos de nitrogênio) em pelo me- nos um dos anéis (HET é de preferência uma quinazolin-4-ila 6-substituída, mais preferível 6-trifluorometil-quinazolin-4-ila); e

LG é um grupo de saída selecionado de halogênio ou OSO2Rie, em que R16 é fenila, uma heteroarila de 5 a 7 membros tendo um ou mais 10 átomos selecionados de N, S, ou O, C1-6 alquila, ou uma cicloalquila de 3 a 7 membros, todos os quais são opcionalmente substituídos por um a três gru- pos selecionados de halogênio, CF3 e Ci-6 alquila (de preferência LG é um halogênio, especialmente cloro).

Em uma 29§ modalidade, a descrição fornece um composto de ,15 fórmula VI, ou um sal deste:

NR1R2 9*.

" ^CO2H O

Vl

em que:

Ri e R2 são independentemente selecionados de hidrogênio e um grupo de proteção de amina selecionados de BOC, Cbz, e benzila (de preferência Ri é hidrogênio e R2 é Cbz);

20 Zé -(CT1T2)2 -, -(CT1T2)3 -, ou W : e

T ί , T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio- nados de hidrogênio, C1^ alquila, C2.4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC1^ alquila, OCF3, e C(=0)C!-4 alquila (de preferência Z é - (CH2)2 -).

25 Um composto preferido de fórmula Vl é ácido (1R,2S)-2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5-oxocicloexanocarboxílico ou um sal deste.

Em uma 30a modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula Vl que é ácido (1R,2S)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopir- rolidin-1 -il)-5-oxocicloexanocarboxílico ou um sal deste.

Em uma 31â modalidade, a descrição fornece um novo compos- to de fórmula VII, ou um sal deste:

JMR1R2

Vll

em que:

■ 10 Ri e R2 são independentemente selecionados de hidrogênio e

um grupo de proteção de amina selecionados de BOC, Cbz, e benzila (de preferência Ri é hidrogênio e R2 é Cbz);

Z é -(CT1T2)2 -, -(CT1T2)3 -, ou e

T 1, T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio- 15 nados de hidrogênio, Ci-4 alquila, C2.4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OCv4 alquila, OCF3, e C(=0)C!-4 alquila (de preferência Z é - (CH2)2 -).

Um composto preferido de fórmula Vll é ácido (7R,8S)-8-((3S)-3- (((benziloxi)carbonil)amino)-2-oxo-1-pirrolidinil)-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-7- 20 carboxílico.

Em uma 32ê modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula Vll que é ácido (7R,8S)-8-((3S)-3-(((benziloxi)carbonil)amino)-2-oxo-

1-pirrolidinil)-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-7-carboxílico, ou um sal deste.

Em uma 33â modalidade, a descrição fornece novos compostos de fórmula Vila, ou um sal deste: .NR1R2

Vlla

em que:

Ri e R2 são independentemente selecionados de hidrogênio e um grupo de proteção de amina selecionados de BOC1 Cbz, e benzila (de preferência Ri é hidrogênio e R2 é Cbz);

fi>

Z é -(CT1T2)2 -, -(CT1T2)3 -, OU w (T^; e T 1, T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio-

nados de hidrogênio, C1^ alquila, C2.4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC1^ alquila, OCF3, e C^OJC^ alquila (de preferência Z é - (CH2)2 -).

Um composto preferido de fórmula Vlla é ((3S)-1-((7R,8S)-7- (azidocarbonil)-l ,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila.

Em uma 34â modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula Vlla que é ((3S)-1-((7R,8S)-7-(azidocarbonil)-1,4-dioxaspiro[4,5]dec- 8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

Em uma 35§ modalidade, a descrição fornece um composto de

fórmula VIII, ou um sal deste:

NR1R2

_

vNCO

-N- :°

CJ

em que: Ri e R2 são independentemente selecionados de hidrogênio e um grupo de proteção de amina selecionados de BOC, Cbz, ou benzila (de preferência Ri é hidrogênio e R2 é Cbz);

Z é -(CT1T2)2 -, -(CT1T2)3 -, ou e

T T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio- nados de hidrogênio, C1^ alquila, C2.4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC1^ alquila, OCF3, e C(=0)C-|.4 alquila (de preferência Z é - (CH2)2-).

Um composto preferido de fórmula Vlll é ((3S)-1-((7R,8S)-7- isocianato-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de ben- zila.

Em uma 36â modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula Vlll que é ((3S)-1-((7R,8S)-7-isocianato-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-

2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

Em uma 37ã modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula IX, ou um sal deste:

NR1R2 = H

Y

o

CJ

IX

em que:

R1 e R2 são independentemente selecionados de hidrogênio e um grupo de proteção de amina selecionados de BOC, Cbz, ou benzila (de preferência R-ι é hidrogênio e R2 é Cbz);

Z é -(CT1T2)2 -, -(CT1T2)3 -, OU w ,TíW;

T 1, T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio- nados de hidrogênio, C1^ alquila, C2.4 alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC1-4 alquila, OCF3, e C(=0)Ci-4 alquila (de preferência Z é - (CH2)2 -); e

R10 é C1-6 alquila (de preferência metila).

Um composto preferido de fórmula IX é ((3S)-1-((7R,8S)-7- acetamido-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de ben- zila.

Em uma 38ã modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula IX que é ((3S)-1-((7R,8S)-7-acetamido-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2- oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

Em uma 39ã modalidade, a descrição fornece um composto de

fórmula X, ou um sal deste:

NR1R2

O

X

em que:

Ri e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de pro- teção de amina selecionados de BOC, Cbz, e benzila; e R10 é C1-6 alquila.

De preferência Ri é hidrogênio, R2 é Cbz e R10 é metila. Um composto preferido de fórmula X é ((3S)-1-((1S,2R)-2-acetamido-4-oxoci- cloexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila.

Em uma 40â modalidade, a descrição fornece um composto de

fórmula X que é ((3S)-1-((1S,2R)-2-acetamido-4-oxocicloexil)-2-oxo-3- pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

Em uma 40ã modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula XI, ou um sal deste: Ό H

Rio

Xl

em que:

Ri e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de pro- teção de amina selecionado de BOC, Cbz, e benzila;

terc-butila, e Ri0 é metila. Um composto preferido de fórmula Xl é ((3S)-1- ((1S,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc-butilamino)cicloexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)car- bamato de benzila.

Em uma 41 - modalidade, a descrição fornece um composto fórmula Xl que é ((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-acetamido-4-(íerc-butilamino) cicloe- xil)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

Em uma 42ã modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula XII, ou um sal deste:

Re e Rg são independentemente hidrogênio ou Cr6 alquila; e R-io é Ci-6 alquila.

De preferência Ri é hidrogênio, R2 é Cbz, R8 é hidrogênio, Rg é

NHR1

v 1

H

Xll

em que:

Ri é hidrogênio ou um grupo de proteção de amina selecionado

de BOC, Cbz, e benzila;

R8 e Rg são independentemente hidrogênio ou C1-6 alquila; e R10 é Ci-6 alquila. De preferência Ri é hidrogênio, R8 é hidrogênio, Rg é terc-butila, e R10 é metila. Um composto preferido de fórmula Xll é N-((1R,2S,5R)-2- ((3S)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidinil)-5-(íerc-butilamino)cicloexil)acetamida.

Em uma 43§ modalidade, a descrição fornece um composto de fórmula Xll que é N-((1R,2S,5R)-2-((3S)-3-amino-2-oxo-1-pirrolidinil)-5-(ferc- butilamino)cicloexil)acetamida, ou um sal deste.

Em uma 44- modalidade, a descrição fornece um composto se- lecionado de:

ácido (7R,8S)-8-((3S)-3-(((benziloxi)carbonil)amino)-2-oxo-1 - pirrolidinil)-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-7-carboxílico, ou um sal deste;

((3S)-1-((7R,8S)-7-(azidocarbonil)-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2- oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

((3S)-1-((7R,8S)-7-isocianato-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo- 3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

((3S)-1 -((7R,8S)-7-acetamido-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-

3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

((3S)-1-((1S,2R)-2-acetamido-4-oxocicloexil)-2-oxo-3-pirrolidinil) carbamato de benzila, ou um sal deste; e

((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-acetamido-4-(ferc-butilamino)cicloexil)-2- oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

Em uma 45ã modalidade, a descrição fornece um processo em

que:

um composto de fórmula Vll é ácido (7R,8S)-8-((3S)-3- (((benziloxi)carbonil)amino)-2-oxo-1-pirrolidinil)-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-7- carboxílico, ou um sal deste;

um composto de fórmula Vlla é ((3S)-1-((7R,8S)-7- (azidocarbonil)-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

um composto de fórmula Vlll é ((3S)-1-((7R,8S)-7-isocianato- 1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

um composto de fórmula IX é ((3S)-1-((7R,8S)-7-acetamido-1,4- dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste;

um composto de fórmula X é ((3S)-1-((1S,2R)-2-acetamido-4- oxocicloexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste; e um composto fórmula Xl é ((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-acetamido-4-

(terc-butilamino)cicloexil)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.

Em uma 46§ modalidade, a descrição fornece um processo em que um composto de fórmula I é N-((1R,2S,5R)-5-(ferc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida ou um sal deste.

A presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem afastar-se do espírito e escopo ou atributos essenciais des- te. Por conseguinte, as modalidades acima não devem ser consideradas 15 limitantes. Quaisquer e todas as modalidades da presente invenção podem estar juntas em conjunção com qualquer outra modalidade ou modalidades para descrever modalidades adicionais. Cada elemento individual (incluindo aspectos preferidos) das modalidades é sua própria modalidade indepen- dente. Além disso, qualquer elemento de uma modalidade é significado ser 20 combinado com qualquer e todos os outros elementos de qualquer modali- dade para descrever uma modalidade adicional. Além disso, a presente in- venção abrange combinações de modalidade diferente, partes de modalida- des, definições, descrições, e exemplos da invenção observados aqui. DEFINIÇÕES

As seguintes são definições de termos empregados nesta espe-

cificação e reivindicações anexas. A definição inicial fornecida para um gru- po ou termo aplica aqui grupo ou termo ao longo da especificação e reivindi- cações, individualmente ou como parte de outro grupo, a menos que caso contrário indicasse.

O termo "alquila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia

linear ou ramificada tendo 1 a 12 átomos de carbono, de preferência 1 a 6 átomos de carbono. Quando os números aparecerem em um subscrito de- pois do símbolo "C", o subscrito define com mais especificidade o número de átomos de carbono que um grupo particular pode conter: Por exemplo, "Ci.6alquila" refere-se a grupos alquila de cadeia linear ou ramificada com um a seis átomos de carbono, tal como metila, etila, n-propila, isopropila, n- 5 butila, t-butila, n-pentila, e assim sucessivamente. O "0" subscrito refere-se a uma ligação. Por conseguinte, o termo hidróxi(C0-2)alquila ou (Co- 2)hidroxialquila inclui hidróxi, hidróximetila e hidróxietila. Grupos alquila po- dem ser substituídos com um a três grupos selecionados de (C-|.6)alquila, (C2.6)alquenila, hidróxi, halogênio, ciano, nitro, CF3, 0(Ci-6alquila), OCF3, 10 C(=0)H, C(=0)(Ci.6alquila), CO2H, C02(C-i-6alquila), NHC02(Ci-6alquila), - S(Ci-6 alquila), NH2, NH(Ci-6 alquila), N(Ci-6alquila)2, N(CH3)3+, S02(Ci- 6alquila), C(=0)(Ci-4alquileno)NH2, C(=0)(Ci.4alquileno)NH(alquila), C(=0) (C1-4 alquileno)N(Ci-4alquila)2, C3-7cicloalquila, fenila, benzila, feniletila, feni- lóxi, benzilóxi, naftila, um heterocilo de quatro a sete membros, e/ou uma 15 heteroarila de cinco a seis membros. Quando uma alquila substituída é substituída com um grupo arila, heterociclo, cicloalquila, ou heteroarila, os referidos sistemas de anel são tais como definidos abaixo e por conseguinte podem ter zero, um, dois, ou três substituintes, também como definido abai- xo.

Quando o termo "alquila" é empregado junto com outro grupo,

tal como em "arilalquila", esta conjunção define com mais especificidade pelo menos um dos substituintes que o alquila substituída contém. Por e- xemplo, "arilalquila" refere-se a um grupo alquila substituída tal como defini- do acima onde pelo menos um dos substituintes é uma arila, tal como benzi- 25 Ia. Por conseguinte, o termo aril(C0-4)alquila inclui uma alquila inferior substi- tuída tendo pelo menos um substituinte de arila e também inclui uma arila diretamente ligada a outro grupo, isto é, aril(Co)alquila.

O termo "alquenila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 2 a 12 átomos de carbono e pelo menos uma Ii- gação dupla. Grupos alquenila de 2 a 6 átomos de carbono e tendo uma ligação dupla são mais preferidos. Grupos alquenila podem ser substituídos tais como descritos acima para os grupos alquila. O termo "alquinila" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada tendo 2 a 12 átomos de carbono e pelo menos uma li- gação tripla. Grupos alquila de 2 a 6 átomos de carbono e tendo uma liga- ção tripla são mais preferidos. Grupos alquinila podem ser substituídos tais como descritos acima para os grupos alquila.

O termo "alquileno" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada bivalentes tendo 1 a 12 átomos de carbono, de prefe- rência 1 a 8 átomos de carbono, por exemplo, {-CH2-}n, em que n é 1 a 12, de preferência 1 a 8. grupos alquileno inferior, quer dizer, grupos alquileno 10 de 1 a 2 átomos de carbono, são mais preferidos. As expreções "alquenile- no" e "alquinileno" referem-se a radicais bivalentes de grupos alquenila e alquila, respectivamente, tais como definidos acima. Grupos alquenileno po- dem ser substituídos tais como descritos acima para grupos alquila.

O termo "alcoxi" refere-se a um átomo de oxigênio substituído por alquila, tal como definido aqui. Por exemplo, o termo "alcóxi" ou inclui o grupo -0-Ci-6alquila.

Quando um subscrito é empregado com referência para um al- cóxi, tioalquila ou aminoalquila, a subscrito refere-se ao número de átomos de carbono que o grupo pode conter além de heteroátomos.

Deveria ser entendido que as seleções para todos os grupos,

incluindo para exemplos, alcóxi, tioalquila, e aminoalquila, deve ser feito por alguém versado no campo para fornecer compostos estáveis.

O termo "carbonila" refere-se a um grupo de carbonila bivalente

(C(=0)-.

O termo "acila" refere-se a um grupo de carbonila ligado a um

radical orgânico, mais particularmente, o grupo C(=0)Re, assim como o gru- po bivalente (C(=0)Re-, que é ligado a radicais orgânicos. O grupo Re pode ser selecionado de alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, heterociclo, arila, ou heteroarila como definido aqui, ou quando apropriado, o grupo bivalente correspondente, por exemplo, alquileno.

O termo "cicloalquila" refere-se a anéis de hidrocarboneto com- pletamentenão saturado e parcialmente não saturado (e por conseguinte inclui "anéis de cicloalquenila") de 3 a 9, de preferência 3 a 7 átomos de carbono. O termo "cicloalquila" inclui tais anéis tendo zero, um, dois, ou três substituintes selecionado de (Ci-4)alquila, (C2-4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci.4alquila), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci-4alquila), CO2H, 5 C02(Ci.4alquila), NHCO2(C-MaIquiIa), S(C-|.4alquila), NH2, NH(Ci-4alquila), N(Ci-4alquila)2, N(Ci.4alquil)3+, S02(Ci-4alquila), C(=0)(Ci-4 alquileno)NH2, C(=0)(C-|.4alquileno)NH(alquila), e/ou C(=0)(Ci-4alquileno)N(Ci-4alquila)2. O termo "cicloalquila" também inclui tais anéis tendo um segundo anel fundido a estes (por exemplo incluindo anéis de benzo, heterociclo, ou heteroarila) 10 ou tendo uma ponte de carbono-carbono de 3 a 4 átomos de carbono.

O termo "halo" ou "halogênio" refere-se a cloro, bromo, fluoro e

iodo.

O termo "haloalquila" significa uma alquila substituída que tem um ou mais substituintes de halo. Por exemplo, "haloalquila" inclui mono, bi, e trifluorometila.

O termo "haloalcoxi" significa um grupo de alcóxi tedo um ou mais substituintes de halo. Por exemplo, "haloalcoxi" inclui OCF3.

O termo "heteroátomos" incluirá oxigênio, enxofre e nitrogênio.

O termo "arila" refere-se a fenila, bifenila, fluorenila, 1-naftila e 2- 20 naftila. O termo "arila" inclui tais anéis tendo zero, um, dois ou três substitu- intes selecionados de (Ci-4)alquila, (C2.4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci.4alquila), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci-4alquila), CO2H, C02(Ci-4 alquila), NHC02(Ci-4alquila), S(C-i-4 Iquila), NH2, NH(Ci-4alquila), N(C-|.4alqui- la)2, N(Ci-4alquila)3+, S02(Ci-4alquila), C(=0)(C-i-4alquileno)NH2, C(=0)(C-i-4 25 alquileno)NH(alquila), e/ou C(=0)(Ci-4alquileno)N(Ci.4alquil)2

Os termos "heterociclo" ou "heterocíclico" refere-se a anéis substituídos e não substituídos não aromáticos (que podem ser parcialmen- te ou completamente saturados) de 3 a 15 membros tendo uma a quatro heteroátomos. Tais anéis podem ser grupos monocíclicos de 3 a 7 membros 30 , grupos bicíclicos de 7 a 11 membros, e grupos tricíclicos de 10 a 15 mem- bros. Cada anel do grupo de heterociclo que contém um heteroátomo pode conter um ou dois oxigênio ou átomos de enxofre de e/ou de um a quatro átomos de nitrogênio contanto que o número total de heteroátomos em cada anel seja quatro ou menos, e além disso com a condição de que o anel com- tenha um átomo de carbono. Os anéis fundidos que completam grupos bicí- clicos e tricíclicos podem conter apenas átomos de carbono e podem ser saturados, parcialmente saturados, ou não saturados. Os átomos de nitro- gênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e os átomos de nitrogê- nio podem opcionalmente ser quaternizados. O grupo heterociclo pode ser ligado a qualquer átomo de nitrogênio ou carbono adequado. O anel de he- terociclo pode conter zero, um, dois ou três substituintes selecionados de (Ci-4)alquila, (C2.4)alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci-4 al- quila), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci-4 alquila), CO2H, C02(Ci-4alquila), NH- C02(Ci-4 alquila), S(Ci.4alquila), NH2, NH(Ci-4alquila), N(Ci.4alquila)2, N(Ci-4 alquila)3+, S02(Ci-4alquila), C(=0)(Ci.4alquileno)NH2, C(=0)(Ci-4 alquile- no)NH(alquila), e/ou C(=0)(Ci-4a)quileno)N(Ci-4alquila)2. Grupos heterocícli- cos exemplares incluem azetidinila, pirrolidinila, oxetanila, imidazolinila, oxa- zolidinila, isoxazolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, tetraidrofuranila, piperidi- la, piperazinila, 2-oxopiperazinila, 2-oxopiperidila, 2-oxopirrolodinila, 2- oxoazepinila, azepinila, 4-piperidonila, tetraidropiranila, morfolinila, tiamorfo- linila, sulfóxido de tiamorfolinila, sulfona de tiamorfolinila, 1,3-dioxolano, qui- nuclidinila. e tetraidro-1,1 -dioxotienila e outos mais.

O termo "heteroarila" refere-se a anéis de 3 a 14 membros subs- tituídos e não substituídos aromáticos tendo um a quatro heteroátomos se- lecionados de O, S, ou N em pelo menos um dos anéis. Os referidos anéis podem ser podem ser grupos monocíclicos de 5 ou 6 membros, grupos bicí- 25 clicos de 9 a 10 membros, e grupos tricíclicos de 11 a 14 membros. Cada anel do grupo heteroarila que contém um heteroatom pode conter um ou dois átomos de oxigênio ou enxofre e/ou de um a quatro átomos de nitrogê- nio contanto que o número total de heteroátomos em cada anel seja quatro ou menos e cada anel tenha pelo menos um átomo de carbono. Os anéis 30 fundidos que completam os grupos bicíclicos e tricíclicos podem conter ape- nas átomos de carbono e podem ser saturados, parcialmente saturados, ou não saturados. Os átomos de nitrogênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e os átomos de nitrogênio podem opcionalmente ser quaterniza- dos. Grupos heteroarila que são bicíclico ou tricíclico devem incluir pelo me- nos um anel completamente aromático mas o outro anel ou anéis fundidos podem ser aromáticos ou não-aromáticos. O grupo de heteroarila pode ser 5 ligado a qualquer nitrogênio ou átomo de carbono disponível de qualquer anel. O sistema de anel de heteroarila pode conter zero, um, dois ou três substituintes selecionados de (Ci-4)alquila, (C2-^alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, 0(Ci-4alquila), OCF3, C(=0)H, C(=0)(Ci-4alquila), CO2H, C02(Ci-4alquila), NHC02(Ci.4alquila), S(C1-4alquila), NH2, NH(C1-4alquila), 10 N(Ci.4alquila)2, N(C-|.4alquila)3+, S02(Ci-4alquila), C(=0)(C-4alquileno)NH2, C(=0)(Ci-4alquileno)NH(alquila), e/ou C(=0)(C-i-4alquileno)N(Ci-4alquila)2.

Grupos heteroarila exemplares incluem pirrolila, pirazolila, pira- zolinila, imidazolila, oxazolila, isoxazolila, tiazolila, tiadiazolila, isotiazolila, furanila, tienila, oxadiazolila, piridila, pirazinila, pirimidinila, piridazinila, triazi- - 15 nila, indolila, benzotiazolila, benzodioxolila, benzoxazolila, benzotienila, qui- nolinila, tetraidroisoquinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, benzopiranila, indolizinila, benzofuranila, chromonila, coumarinila, benzopiranila, cinnolinila, quinoxalinila, indazolila, pirrolopiridila, furopiridila, diidroisoindolila, tetraidro- quinolinila e outros mais. Particularmente grupos heteroarila incluem, por 20 exemplo, quinazolin-4-ila e 6-trifluorometil-quinazolin-4-ila 6-substituído.

Onde um grupo é referido como um "opcionalmente substituído", o termo é definido aqui para incluir ambos um grupo substituído e não subs- tituído.

Os compostos aqui descritos podem ter centros assimétricos. 25 Os compostos da presente invenção contendo um átomo substituído assi- metricamente podem ser isolados em formas opticamente ativas ou racêmi- cas. É bem conhecido na técnica como preparar formas opticamente ativas, tais como por resolução de formas de racêmicas ou por síntese de materiais de partida opcionalmente ativos. Muitos isômeros geométricos de olefinas, 30 ligações duplas de C=N, e simalares também podem estar presentes nos compostos descritos aqui, e todos os tais isômeros estáveis são contempla- dos na presente invenção. Isômeros geométricos cis e trans dos compostos da presente invenção são descritos e podem ser isolados como uma mistura de isômeros ou como formas isoméricas separadas. Todas as formas racê- micas, diastereoméricas, quirais e todas as formas isoméricas geométricas de uma estrutura são pretendidas, a menos que a estereoquímica ou forma 5 isomérica específica seja especificamente indicada.

Um enantiômero de compostos descritos aqui pode exibir ativi- dade superior comparado com o outro. Por conseguinte, considera-se que todas as estereoquímicas fazem parte da presente invenção. Quando exigi- do, a separação do material racêmico pode ser obtida por HPLC empregan- 10 do-se uma coluna quiral ou por uma resolução empregando-se um agente de resolução tal como cloreto canfônico como em Steven D. Young, e ou- tros, Atimicrobial Atents e Chemotherapy, 1995, 2602-2605.

A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui como referência àqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas 15 de dosagens que estão, no escopo do diagnóstico médico seguro, adequa- do para o uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação benefício / risco razoável.

Tal tal como empregado aqui, "sais farmaceuticamente aceitá- veis" refere-se a derivados dos compostos descritos onde o composto de origem é modificado por preparação de sais de ácidos ou básicos destes. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais de ácido minerais ou orgânicos de resíduos básicos tais como aminas; álcali ou sais orgânicos de resíduos acídicos tais como ácidos carboxílicos; e outros. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário do composto de origem formado, por exemplo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, tais sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como hidroclórico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e outros mais; e os sais preparados de ácidos orgânicos tais como acéticos, propiônicos, sucínicos, glicólicos, esteáricos, lácticos, málicos, tartáricos, cítricos, ascórbicos, pamóicos, maléicos, hidro- ximaléicos, fenilacéticos, glutâmicos, benzóicos, salicílicos, sulfanílicos, 2- acetoxibenzóicos, fumáricos, toluenossulfônicos, metanossuifônicos, dissul- fônicos, etano, oxálicos, isetiônicos, e outros mais.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção po- 5 dem ser sintetizados do composto de origem que contém uma porção bási- ca ou acídica através de métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados por meio de reação das formas de base ou áci- dos livres destes compostos com uma quantidade estequiométrica do ácido ou base apropriada em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mis- 10 tura dos dois; geralmente, veículos não aquosos como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrilo são preferidos. Listas de sais adequados são encontradas em fíemington’s Pharmaceutical Sciences, 17s edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, a descrição da qual está por meio deste incorporado por referência.

Uma vez que se sabe que os pró-fármacos realçam numerosas

qualidades desejáveis de produtos farmacêuticos (por exemplo, solubilida- de, biodisponibilidade, fabricação, etc.), os compostos da presente invenção podem ser liberados em forma de pró-fármaco. Por conseguinte, a presente invenção é pretendida para abranger pró-fármacos dos compostos presen- 20 temente reivindicados, métodos de liberação dos mesmos e composições que contêm os mesmos. "Pró-fármacos" são pretendidos para incluir quais- quer veículos covalentemente ligados que liberam um fármaco origem ativo da presente invenção in vivo quando tal pró-fármaco é administrado a um paciente mamífero. Os pró-fármacos da presente invenção são preparados 25 por modificação de grupos funcionais presentes no composto de tal modo que as modificações sejam clivadas, ou em manipulação de rotina ou in vi- vo, para o composto origem. Os pró-fármacos incluem compostos da pre- sente invenção em que um grupo hidróxi, amino, ou sulfidrila é ligado a qualquer grupo que, quando o pró-fármaco da presente invenção é adminis- 30 trado a um paciente mamífero, se cliva para formar um grupo hidroxila livre, amino livre, sulfidrila livre, respectivamente. Exemplos de pró-fármacos in- cluem, mas não estão limitados a, derivados de acetato, formiato e benzoato de grupos funcionais de álcool e amina nos compostos da presente inven- ção.

"Composto estável" e "estrutura estável" são pretendidos para indicar um composto que seja suficientemente robusto para sobreviver ao 5 isolamento a um grau útil de pureza de uma mistura reacional, e formulação em um agente terapêutico eficaz. A presente invenção é pretendida para incorporar compostos estáveis.

"Quantidade terapeuticamente eficaz" é pretendida para incluir uma quantidade de um composto da presente invenção sozinho ou uma 10 quantidade da combinação de compostos reivindicados ou uma quantidade de um composto da presente invenção em combinação com outros ingredi- entes ativos eficazes para inibir MCP-1 ou eficazes para tratar ou prevenir distúrbios.

Tal tal como empregado aqui, "tratando" ou "tratamento" abran- 15 gem o tratamento de um estado de doença em um mamífero, particularmen- te em um ser humano, e incluem: (a) impedir o estado de doença de ocorrer em um mamífero, em particular, quando o tal mamífero está predisposto ao estado de doença mas ainda não foi diagnosticado como tendo este; (b) ini- bir o estado de doença, isto é, interromper seu desenvolvimento; e/ou (c) 20 aliviar o estado de doença, isto é, produzir a regressão do estado de doen- ça.

Os nomes empregados aqui para caracterizar uma forma espe- cífica, por exemplo, "N-2", não devem ser considerados limitadores com respeito a qualquer outra substância possuindo características físicas e 25 químicas similares ou idênticas, mas de preferência deve ser entendido que estas designações são meros identificadores que devem ser interpretados de acordo com a informação de caracterização também apresentada aqui.

A presente invenção fornece, pelo menos em parte, formas cris- talinas da base livre de N-((1R,2S,5R)-5-(te/'í:-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida, como um material novo, em particular em uma forma farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades preferidas, formas as cristalinas da base livre estão na forma substancialmente pura. Modalidades preferidas de formas cristali- nas da base livre estão descritas no Exemplo 2 como as formas E-1, HAC-1, IPA-1, N-2, RPG-3, HO.5-4, e H1.75-5.

Tal tal como empregado aqui "polimorfo" refere-se a formas cris- 5 talinas que têm a mesma composição química mas diferentes disposições espaciais das moléculas, átomos, e/ou íons que formam o cristal.

Tal tal como empregado aqui "solvato" refere-se a uma forma cristalina de uma molécula, átomo, e/ou íons que também contêm moléculas de um solvente ou solventes incorporados na estrutura cristalina. As molécu- 10 Ias de solvente no solvato podem estar presentes em uma disposição regu- lar e/ou uma disposição não ordenado. O solvato pode compreender qual- quer uma quantidade estequiométrica ou não estequiométrica das molécu- las de solvente. Por exemplo, um solvato com uma quantidade não estequi- ométrica de moléculas de solventes pode resultar de perda parcial de sol- 15 vente do solvato.

Tal como empregado aqui "amorfo" refere-se a uma forma sóli- da de uma molécula, átomo, e/ou íons que não seja cristalina. Um sólido amorfo não apresenta um padrão de difração de raio X definitivo.

Tal como empregado aqui, "substancialmente puro," quando empregado em referência a uma forma cristalina, significa um composto tendo uma pureza maior que 90% em peso, incluindo maior que 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99% em peso, e também incluindo igual a cerca de 100% em peso do composto, baseado no peso do composto. O material restante compreende outra(s) forma(s) do composto, e/ou impurezas da re- ação e/ou impurezas do processamento originárias de sua preparação. Por exemplo, uma forma cristalina de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida pode ser considerada substancialmente pura pelo fato de que ela tem uma pureza maior que 90% em peso, conforme medido por meios que são neste momento conhecidos e geralmente aceitos na técnica, onde os menos de 10% em peso restantes do material compreende outra(s) forma(s) de N- ((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometíl)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida e/ou impurezas da reação e/ou im- purezas do processamento.

Amostras das formas cristalinas podem ser fornecidas com ho- mogeneidade de fase substancialmente pura, indicação da presença de uma quantidade dominante de uma única forma cristalina e opcionalmente quantidades menores de um ou mais outras formas cristalinas. A presença de mais de uma forma cristalina em uma amostra pode ser determinada por meio de técnicas tais como difração de pó de raio X (PXRD) ou espectros- copia de ressonância magnética nuclear de estado sólido (SSRMN). Por exemplo, a presença de picos extras na comparação de um padrão de P- XRD experimentalmente medido com um padrão de PXRD simulado pode indicar mais de uma forma cristalina na amostra. A PXRD simulado pode ser calculada a partir de dados de raios X de cristal único. Veja Smith, D.Κ., "A FORTRAN Program for Calculating X-Ray Powder Diffraction Patterns," La- wrence Radiation Laboratory, Livermore, Califórnia, UCRL-7196 (abril de

1963).

De preferência, a forma cristalina tem homogeneidade de fase substancialmente pura como indicado por menos de 10%, de preferência 5 menos de 5%, e mais preferivelmente menos de 2% da área de pico total no padrão de PXRD experimentalmente medido originário dos picos extras que estão ausentes do padrão de PXRD simulado. A mais preferida é uma forma cristalina que tem homogeneidade de fase substancialmente pura com me- nos de 1% da área de pico total no padrão de PXRD experimentalmente 10 medido originário dos picos extras que estão ausentes do padrão de PXRD simulado.

Procedimentos para a preparação de formas cristalinas são co- nhecidos na técnica. As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo por exemplo, cristalização ou recristaliza- 15 ção de um solvente adequado, sublimação, desenvolvimento de uma fusão, transformação de outra fase, cristalização de um líquido supercrítico, e va- porização a jato. Técnicas para cristalização ou recristalização de formas cristalinas de uma mistura de solvente incluem, por exemplo, Procedimentos para a preparação de formas cristalinas são co- nhecidos na técnica. As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, cristalização ou recristaliza- ção de um solvente adequado, sublimação, crescimento de um fundido, 5 transformação de estado sólido de outra fase, cristalização de um fluído su- percrítico, e vaporização a jato. Técnicas para cristalização ou recristaliza- ção de formas cristalinas de uma mistura solvente incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuindo a temperatura da mistura solvente, cris- tal semeando uma mistura solvente supersaturada da molécula e/ou sal, 10 secagem por congelamento da mistura solvente, e adição de antissolventes (contrassolventes) à mistua solvente.

As formas podem ser caracterizadas e distinguidas utilizando difração de raio-X de cristal único, que é baseada em medições de célula unitária e intensidade de um cristal único de uma forma em uma temperatu- ra analítica fixa. Uma descrição detalhada de análise de célula unitária e intensidade é fornecida em Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmillan Co., Nova Iorque (1968), Capítulo 3, que é aui incorporado por referência. Alternativamente, a única disposição de átomos em relação espacial dentro das treliça cristalina pode ser caracterizada de acordo com as coordenadas atômicas fracionais. Veja referência Stout & Jensen para determinações experimentais de coordenadas fracionais para análise estrutural. Outro método de caracterização da estrutura cristalina é por análise de difração de raio X de pó em que o perfil de difração experi- mental ou observado é comparado a um perfil simulado representando ma- terial de pó puro, ambos na mesma temperatura analítica, e medições para a forma objeto caracaterizada como uma série de valores 2Θ e intensidades.

O termo "perda de peso insignificante," como aqui empregado, como caracterizado por TGA indica a presença de uma forma cristal pura (não-solvatado).

O termo "% insignificante de captação de água," como aqui em-

pregado, como caracterizado por isoterma por absorção de umidade indica que a forma testada é não-higroscópica. Em uma modalidade da invenção, uma forma cristalina de N- ((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida é fornecidas em forma substancial- mente pura. Esta forma cristalina pode ser empregada em composições 5 farmacêuticas que podem opcionalmente incluem um ou mais outros com- ponentes selecionados, por exemplo, do grupo consistindo em excipientes, veículos, e um dos outros ingredientes farmacêuticos ativos ou entidades químicas ativas de diferentes estruturas moleculares.

Preferivelmente, a forma cristalina tem homogeneidade de fase 10 substancialmente pura como indicado por menos do que 10%, preferivel- mente menos do que 5%, e mais preferivelmente menos do que 2% da área de pico total no padrão de PXRD experimentalmente medido surgindo dos picos extraque estão ausentes do padrão de PXRD simulado. A mais referi- da é a forma cristalina tendo homogeneidade de fase substancialmente pura 15 com menos do que 1% da área de pico total no padrão de PXRD experimen- talmente medido surgindo dos picos extra que estão ausentes do padrão de PXRD simulado.

Em outra modalidade, uma composição é fornecida consistindo essencialmente das formas cristalins de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2- ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil) ace- tamida. A composição desta modalidade pode compreender pelo menos 90% em peso da forma, com base em seu peso na composição.

A presença de impurezas de reação e/ou impurezas de proces- samento podem ser determinadas por técnicas analíticas conhecidas na ar- te, tais como, por exemplo, cromatografia, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa ou espectroscopia de infra- vermelho.

As formas cristalinas podem ser preparadas por uma variedade de métodos, incluindo por exemplo, cristalização ou recristalização de um solvente adequado, sublimação, crescimento de um fundido, transformação de estado sólido de outra fase, cristalização de um fluido supercrítico, e va- porização de jato. Técnicas para cristalização ou recristalização de formas cristalinas de uma mistura solvente incluem, por exemplo, evaporação do solvente, diminuição da temperatura da mistura solvente, cristal semeando uma mistura solvente supersaturada da molécula e/ou sal, secagem por congelamento da mistura solvente, e adição de antissolventes (contrassol- 5 ventes) à mistura solvente. Técnicas de cristalização de alta produtividade podem ser empregadas para preparar formas cristalinas incluindo polimor- fos.

Cristais de fármacos, incluindo polimorfos, métodos de prepara- ção, e caracterização de cristais de fármaco são descritos em Solid-State Chemistry of Drugs, S.R. Bym, R.R. Pfeiffer, e J.G. Stowell, 2- Edição, SSCI, West Lafayette, Indiana (1999).

Para técnicas de cristalização que empregam solvente, a esco- lha de solvente ou solventes é tipicamente dependente de um ou mais fato- res, tais como solubilidade do composto, técnica de cristalização, e pressão 15 de vapor do solvente. Combinações de solventes podem ser empregadas; por exemplo, o composto pode ser solubilizado em um primeiro solvente para fornecer uma solução, seguida pela adição de um antissolvente para diminuir a solubilidade do composto na solução e para fornecer uma forma- ção de cristais. Um "antissolvente" é um solvente em que o composto tem 20 baixa solubilidade. Solventes adequados para preparar cristais incluem sol- ventes polares e não polares.

Em um método para preparar cristais, N-((1R,2S,5R)-5-(íerc- butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida é suspenso e/ou agitado em um solvente adequado 25 para fornecer uma suspensão, que pode ser aquecida para promover disso- lução. O termo "suspensão," como aqui utilizado, significa uma solução sa- turada da base livre, que pode também conter uma quantidade adicional do composto para fornecer uma mistura heterogênea do composto e um sol- vente em uma determinada temperatura. Os solventes adequados neste 30 sentido incluem, por exemplo, solventes apróticos polares e solventes próti- cos polares, e misturas de dois ou mais destes, como descrito aqui.

Os cristais semente podem ser adicionados a qualquer mistura de cristalização para promover a cristalização. Como será claro para o téc- nico versado, a semeadura é utilizada como um método de controle da for- ma cristalina particular ou como um método de controlar a distribuição de tamanho de partícula, controlando o crescimento de uma forma cristalina 5 particular ou um método de controlar o crescimento de uma forma cristalina particular forma cristalina ou como um método de controlara distribuição de tamanho de partícula do produto cristalino. Consequentemente, o cálculo da quantidade de sementes necessária depende do tamanho da semente disponível e o tamanho desejado de uma partícula de produto médio como 10 descrito, por exemplo, em "Programmed cooling of batch crystallizers," J.W. Mullin e J. Nyvlt, Chemical Engineering Science 1971, 26, 369-377. Em ge- ral, as sementes de tamanho pequeno são necessárias para eficazmente controlar o crescimento de cristais na batelada. As sementes de tamanho pequeno podem ser geradas por peneiração, moagem, ou micronização de 15 crisais maiores, ou por microcristalização de soluções. Cuidado deve ser tomado para que a moagem ou micronização de cristais não resulte em qualquer alteração em cristalinidade da forma de cristal desejada (isto é, mudança para amorfo ou para outro polimorfo).

Uma mistura resfriada pode ser filtrada sob vácuo, e os sólidos isolados podem ser lavados com solvente adequado, tal como solvente de recristalização, e secado sob uma purga de nitrogênio para fornecer a forma cristalina desejada. Os sólidos isolados podem ser analisados por uma téc- nica espectroscópica ou analítica adequada, tal como SSRMN, DSC, PXRD, ou similares, para assegurar a formação da forma cristalina preferidas do produto. A forma cristalina resultante é tipicamente produzida em uma quan- tidade maior do que cerca de 70 % em peso de produção isolada, porém preferivelmente maior do que 90 % em peso com base no peso de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida originalmente empregado no proce- dimento de cristalização. O produto pode ser co-moído ou passado através de uma peneira de malha para desaglomerar o produto, se necessário.

As formas cristalinas podem ser preparadas diretamente do meio de reação da etapa de processo final para preparar N-((1R,2S,5R)-5-(terc- butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida. Isto pode ser obtido, por exemplo, empregando-se na etapa de processo final um solvente ou mistura de solventes dos quais a 5 base livre pode ser cristalizada. Alternativamente, as formas cristalinas po- dem ser obtidass por técnicas de destilação ou adição de solvente. Solven- tes adequados para este propósito incluem quaisquer daqueles solventes descritos aqui, incluindo solventes polares próticos, tais como álcoois, e sol- ventes polares apróticos, tais como cetonas.

A título de orientação geral, a mistura reacional pode ser filtrada

para remover quaisquer impurezas indesejadas, sais inorgânicos, e simila- res, seguido por lavagem com solvente de reação ou cristalização. A solu- ção resultante pode ser concentrada para remover o excesso de solvente ou constituintes gasosos. Se a destilação for empregada, a quantidade final de 15 destilado coletado pode variar, dependendo de fatores do processo incluin- do, por exemplo, tamanho de vaso, capacidade de agitação, e similares. A título de orientação geral, a solução reacional pode ser destilada para cerca de 1/10 o volume original antes da remoção do solvente ser realizada. A reação pode ser amostrada e ensaiada para determinar a extensão da rea- 20 ção e o % em peso do produto de acordo com técnicas de processo padrão. Se desejado, solvente de reação adicional pode ser adicionado ou removido pra otimizar a concentração de reação. Preferivelmente, a concentração fi- nal é ajustada para cerca de 50 % em peso, em cujo ponto uma suspensão tipicamente resulta.

Pode ser preferível adicionar solventes diretamente ao vaso rea-

cional sem destilasr a mistura reacional. Os solventes preferidos para este propósito são aqueles que podem finalmente participar na treliça cristalina, como descrito acima com relação à troca de solvente. Embora a concentra- ção final possa variar dependendo da pureza desejada, a recuperação e 30 similar, a concentração final da base livre em solução é preferivelmente de cerca de 4% a cerca de 7%. A mistura reacional pode ser agitada seguindo a adição do solvente e simultaneamente aquecida. A título de ilustração, a mistura reacional pode ser agitada durante cerca de 1 hora ao mesmo tem- po que aquecendo para cerca de 70°C. A reação é preferivelmente filtrada quente e lavada com o solvente de reação, o solvente adicionado ou uma combinação destes. Cristais semente podem ser adicionados a qualquer 5 solução de cristalização para iniciar a cristalização.

As várias formas descritas aqui podem ser distinguíveis uma da outra por meio do uso de várias técnicas analíticas conhecidas por alguém versado na técnica. Tais técnicas incluem, porém não estão limitadas a, di- fração de pó de raio-X (PXRD) e/ou análise termogravimétrica (TGA). Espe- 10 cificamente, as formas podem ser caracterizadas e distinguidas utilizando difração de raio-x de cristal, que é baseado nas avaliações de célula unitária de um cristal simples de uma determinada forma em uma temperatura analí- tica fixa. Uma descrição detalhada de células unitárias é fornecidas em Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: A Practical Guide, Macmil- 15 Ian Co., Nova Iorque (1968), Capítulo 3, que é aqui incorporado por referên- cia. Alternativamente, a única redisposição de átomos em relação espacial dentro da treliça cristalina pode ser caracterizada de acordo com as coorde- nadas atômicas fracionais observadas. Outro método de caracterização da estrutura cristalina é por análise de difração de raio-x de pó em que o perfil 20 de difração é comparado a um perfil simulado representando material de pó puro, ambos funcionam na mesma temperatura analítica, e as avaliações quanto à forma objeto caracterizada como uma série de 2Θ valores (usual- mente quatro ou mais).

Outros métodos de caracterização da forma podem ser utilizados, tais como espectroscopia de ressonância magnética nuclear de estado sóli- do (SSRMN), calorimetria de varredura diferencial (DSC), termografia e e- xame total da morfologia cristalina ou amorfa. Estes parâmetros podem também ser utilizados em combinação para caracterizar a forma objeto.

Alguém versado na técnica apreciará que um padrão de difração de raio-X pode ser obtido com um erro de avaliação que é dependente das condições de avaliação empregadas. Em particular, é de modo geral conhe- cido que as intensidades em um padrão de difração de raio-X podem flutuar 10

15

20

dependendo das condições de avaliação empregadas e o formato ou morfo- Iogia do cristal. Deve também ser entendido que as intensidades relativas podem também variar dependendo das condições experimentais e, conse- quentemente, a ordem exata de intensidade não deve ser levada em consi- deração. Adicionalmente, um erro de avaliação de ângulo de difração quan- to a um padrão de difração de raio-X convencional é tipicamente em torno de 0,2° ou menos, preferivelmente cerca de 0,1° (como descrito a seguir), e tal grau de erro de avaliação deve ser levado em consideração como per- tencente aos ângulos de difração anteriormente mencionados. Consequen- temente, deve ser entendido que as formas de cristal da presente inenção não estão limitadas às formas de cristal que fornecem padrões de difração de raio-X completamente idênticos aos padrões de difração de raio- Xrepresentados nas Figuras de acompanhamento descritas aqui. Quaisquer formas de cristal que fornecem padrões de difração de raio-X substancial- mente idênticos àqueles descritos nas Figuras de acompanhamento inclu- em-se no escopo da presente invenção. A capacidade de verificar identida- des substanciais de padrões de difração de raio-X inclui-se na competência de alguém versado na técnica.

SÍNTESE

Esquema 1 Hidrólise de cetoéster V em cetoácido Vl

NR1R

ln2

Os,

O

V

VI

O cetoéster V é hidrolizado para seu correspondente cetoácido Vl suspendendo V em um solvente orgânico parcialmente miscível com á- gua, tal como éteres acíclico ou cíclico incluindo THF, THF de 2-metila, 1,2- dimetoxietano, 1,4-dioxano, THF sendo o prefrido, e adicionando base a- quosa tal como soluções aquosas de hidróxidos de metal de álcali MOH, onde M é Li, Na ou K1 1N de NaOH sendo a base preferida a -5°C a +5°C. A mistura bifásica é então agitada a < 5 0C durante pelo menos uma hora. Baixa temperatura para a adição de base e reação é importante para mini- mizar a epimerização no carbono adjacente ao grupo éster. Solvente não miscível em água, preferivelmente éter ferf-butílico de metila é então adicio- nado e as camadas são separadas. O produto é então transferido do solven- te aquoso novamente para o solvente orgânico, preferivelmente diclorome- tano, ajustando o pH com ácido, preferivelmente 3N de HCI, e Vl são utiliza- dos em solução para a etapa seguinte.

Esquema 2

Cetalização de cetoácido Vl em cetal ácido Vll

NRjR2

N υ

ketalization

HO-Z-OH

A solução de VI, preferivelmente em diclorometano, é permuta-

da por meio de destilação em um solvente de maior ebulição, não higroscó- pico, tal como tolueno, trifluorotolueno, xilenos, ésteres de maior ebulição tais como acetato de n-butila ou isobutila, preferivelmente tolueno. Um glicol de fórmula HO-Z-OH, (em que Z é como definido supra) é em seguida adi- 15 cionado, preferivelmente etileno glicol (1,2 eq), seguido por uma quantidade catalítica (0,5-2 M %) de um ácido, preferivelmente ácido p-toluenos- sulfônico, e a mistura é destilada em pressão atmosférica até a formação do composto Vll ser concluída. O produto Vll cristaliza-se sob adição de aceta- to de etila após resfriamento para aproximadamente 70 °C. Após outro res- 20 friamento para a temperatura ambiente, Vll é isolado por filtração e subse- quente secagem em cerca de 70 % de produção (para HO(CH2)2OH , Ri=H, R2=CBz). Esquema 3

Transformação de cetal ácido Vll em cetal isocianato não isolado Vlll e em seguida em cetal amida IX por meio de ativação/azidação de ácido, redisposição Curtius e acilação

.NR1R2 -j NR1R2

O-o rio

x\\C02H

transformation to isocyanate

Y

O

iIO

IX

Legenda da figura:

5 Transformação em isocianato;

Acilação com.

O cetoácido Vll é primeiro ativado transformando-o em seu ani- drido misto utilizando aminas terciárias, preferivelmente trietilamina, e halo- formiatos, preferivelmente cloroformiato de isobutila em solventes secos, 10 tais como tolueno, trifluorotolueno, 1,2-dicloroetano, 1-clorobutano, xilenos, preferivelmente tolueno seco, por adição de um haloformiato a uma solução pré-resfriada de Vll e trialquilamina. A temperatura preferida para formação de anidrido misto é -10°C a 0°C. Após aproximadamente 30 min, uma solu- ção aquosa de azida de metal de álcali, preferivelmente -30 % em peso de 15 azida de sódio e um catalisador de transferência de fase, tal como sais de tetralquilamônio, preferivelmente brometo de tetrabutilamônio (5 moles %) é adicionada e a mistura bifásica é vigorosamente agitada durante cerca de 1 h em -10°C a O0C. A fase orgânica é em seguida separada e a solução de azida de acila resultante é secada, peneiras moleculares de 4 Á sendo o 20 agente de secagem preferido. A redisposição Curtius e a captura concomi- tante do isocianato Vlll in situ com um ácido carboxílico para formar a cetal amida IX são realizadas primeiro por adição de um ácido carboxílico, prefe- rivelmente ácido acético, e seu anidrido correspondente, preferivelmente anidrido acético, a uma solução seca da azida de acila, e em seguida aque- cimento da mistura em 80-90 0C durante 1-4 horas. O uso de um anidrido em conjunção com ácido carboxílico é crucial para minimizar formação de impureza. Após remoção parcial do solvente e ácido carboxílico por destila- ção, o produto cristaliza-se sob resfriamento para a temperatura ambiente.

IX é isolado por filtração e secagem em 65-78 % de produção (para Z = - (CH2)2-) R-I=H1 R2=CBz, Rio=Me).

Esquema 4 Hidrólise de cetal amida IX em cetoamida X

JNiRiR2 JVR1R2

IX

Legenda da figura:

Hidrólise de cetal.

A hidrólise de cetal do composto IX na cetoamida X é realizada por aquecimento de uma solução de IX em solvente miscível em água, or- gânico, preferivelmente acetona e uma solução aquosa de ácido forte, prefe- rivelmente 1 N de HCI, durante 2-4 horas. A temperatura preferida para hi- 15 drólise é 45-55°C. Após remoção de acetona, o produto é extraído para di- clorometano, que é permutado para acetato de etila por destilação. O produ- to X cristaliza de acetato de etila sob resfriamento para a temperatura ambi- ente, e é isolado por filtração e secagem em 85-90 % de produção (para HO(CH2)2OH , R1=H, R2=CBz, R10=Me). Esquema 5

Aminação redutiva de cetoamida X na aminoamida Xl

NR1R2

" Y

R8 R»

XI

A uma solução seca de X, preferivelmente em diclorometano, uma amina primária ou secundária é adicionada, preferivelmente terc- 5 butilamina (5 eq), seguida por um ácido Lewis, preferivelmente TiCI2(OPr-I)2 (1,2 eq), em -20°C a 0°C. A mistura de imina resultante é aquecida para 10- 20°C e borano (1,1-1,2 eq) é adicionado como um complexo com sulfeto de dimetila ou THF1 preferivelmente sulfeto de dimetila. A mistura reacional é agitada durante 4-6 h e acetato de etila saturado com água é em seguida 10 adicionado. Os sais de titânio são removidos por filtração e o produto Xl é extraído do filtrado orgânico para água como seu sal com um ácido aquoso, preferivelmente 1 N de HCI. Diclorometano é em seguida adicionado e base aquosa, preferivelmente hidróxido de amônio concentrado é adicionado à mistura bifásica agitada até o pH ser ajustado para 8,0-8,5. A fase de diclo- 15 rometano rica em produto é em seguida separada e lavada duas vezes com solução de cloreto de amônio aquosa para remover o isômero trans indese- jado de XI, e finalmente com água. Diclorometano é permutado em acetato de etila por destilação e Xl cristaliza de acetato de etila sob resfriamento e adição de heptano. Xl é isolado por filtração e secagem em 65-70 % de pro- 20 dução (para Ri=H, R2=CBz, Re=H, R9=Jerc-Bu, Ri0=Me). Esquema 6 Desproteção de pirrolidonil amina Xl

NR1R2 NRxH

O=tO 0,0

H Ξ H

\xNv^R,° arnine deprotection

° O

R8 R9 Rg R9

XI XII

Legenda da figura:

Desproteção de amina.

Remoção do grupo de proteção de amina R2, onde R2 é

CO2CH2Ph ou CH2Ph1 é realizada por hidrogenação de uma solução de Xl em um álcool, preferivelmente metanol, na presença de catalisador de Pd1 preferivelmente 5 % em peso de Pd/C, durante várias horas. O catalisador é em seguida removido por filtração, e metanol é permutado em acetato de 10 etila por destilação. O produto XII, que cristaliza de acetato de etila sob res- friamento e adição de heptano, é isolado por filtração e secagem em 90-95 % de produção (para Ri=H, R2=CBz1 Rs=H, R9=terc-Bu, Ri0=Me).

Esquema 7

Acoplamento de amina Xll com heterociclo transportando um grupo de 15 saída HET-LG

Ri

NR1H N—HET

OsO OssO

= H Ξ H

coupling with

-Nv

' HETH-LG

Rg R» K* K»

R* Ro

I

XII

Legenda da figura:

Acoplamento com.

Síntese do composto I é realizada por acoplamento da pirrolido- nilamina Xll e um heterociclo transportando um grupo de saída na presença de uma amina terciária, preferivelmente trietilamina, em um solvente compa- tível, tal como diclorometano, isopropanol ou acetonitrilo, diclorometano sen- do preferido. Todos os componentes são portanto combinados e a solução é 5 reagida durante 24-48 horas em temperatura ambiente. Uma solução de componente heterocíclico cru previamente preparado pode também ser em- pregada. Após conclusão da reação, diclorometano é lavado com ácido dilu- ído, preferivelmente 5 % em peso de ácido acético aquoso, a fase aquosa é separada e diclorometano é em seguida permutado em acetato de etila por 10 destilação. O produto I, que cristaliza de acetato de etila sob resfriamento e adição de heptano, é isolado por filtração e secagem em 75-80 % de produ- ção (para Ri=H, Re=H, Rg=terc-Bu, Ri0=Me, HET=6-(trifluorometil) quinazo- lin-4-ila).

Para o processo desta invenção, materiais de partida são co- 15 mercialmente disponíveis ou podem ser facilmente preparados por alguém versado na técnica. Solventes, temperaturas, pressões, materiais de partida tendo os grupos desejados, e outras condições de reação, podem ser facil- mente selecionados como apropriado por alguém versado na técnica. O processo pode ser graduado a fim de preparar quantidades maiores do 20 composto de fórmula I, tal como em uma facilidade de produção comercial. EXEMPLOS

Os seguintes Exemplos ilustram as modalidades dos compostos inventivos e materiais de partida, e não são destinados a limitar o escopo das reivindicações.

Como apropriado, as reações foram conduzidas sob uma atmos-

fera de nitrogênio seco (ou argônio). Para reações anidrosas, solventes Dri- Solv de EM foram empregados. Para outras reações, solventes em grau de reagente ou grau de HPLC foram utilizados. A menos que de outra maneira relatado, todos os reagentes comercialmente obtidos foram utilizados como recebidos.

Medidas de LC/MS foram obtidas utilizando um sistema híbrido de espectrômetro de massa quádruplo simples Shimadzu HPLC/Waters ZQ. Dados para o pico de interesse são relatados a partir de ionização por ele- trovaporização de modo positivo. Espectros de RMN (ressonância magnéti- ca nuclear) foram tipicamente obtidos nos instrumentos de 400 MHz e 500 MHz Bruker ou JEOL nos solventes indicados. Todos os deslocamentos 5 químicos são relatados em ppm de tetrametilsilano com a ressonância de solvente como o padrão interno. Dados espectrais de 1H-RMN são tipica- mente relatados como segue: deslocamento químico, multiplicidade (s = singleto, br s = singleto amplo, d = dubleto, dd = dubleto de dubletos, t = tri- pleto, q = quarteto, sep = septeto, m = multipleto, app = aparente), constan- 10 tes de acoplamento (Hz), e integração.

Alguém versado na técnica reconhecerá as abreviações padrões utilizadas aqui, em toda a especificação. Para facilidade de referência, as abreviações incluem, porém não são necessariamente limitadas a: sat. = saturado, HPLC = cromatografia líquida de desempenho elevado, AP = por- 15 centagem de área, KF = Karl-Fischer1 RT = temperatura ambiente, mmol = milimoles, HRMS = espectroscopia de massa de resolução elevada, TBTU = tetrafluoroborato de 0-benzotriazol-2-il-N,N,N',N,-tetrametilurônio, MTBE = TBME = éter metil terc-butílico, EDAC = cloridrato de N-(3-dimetilamino- propil)-N'-etilcarbodiimida, EDC = N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbo- 20 diimida, TEA = trietilamina, DPPA = difenil fosforil azida, IPA = álcool isopro- pílico, TFA = ácido trifluoroacético, DCM = diclorometano, THF = tetraidrofu- rano, DMF = Ν,Ν-dimetilformamida, BOP = hexafIuorofosfato de (benzotria- zol-1-ilóxi)tris(dimetilamino)fosfônio, EtOAc = acetato de etila, DMSO = di- metilsulfóxido, 0C = graus Celsius, eq = equivalente ou equivalentes, g = 25 grama ou gramas, mg = miligrama ou miligramas, mL (ou ml) = mililitro ou mililitros, h = hora ou horas, M = molar, N = normal, min = minuto ou minu- tos, MHz = megahertz, tlc = cromatografia de camada fina, v/v = volume pa- ra taxa de volume, e ca. = cerca de.

"R" e "S" são designações estereoquímicas familiares àqueles versados na técnica. EXEMPLO 1

N-((1R,2S,5R)-5-(ferc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quina-

zolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida

H

bonilamino-7-oxo-6-aza-biciclo[3,2,1]octano-6-carboxilato (89,6 g, 0,24 mol, veja: P. H. Carter, e outro pedido PCT WO 2005/021500) foi dissolvido em acetato de etila (1,5 L) e a solução resultante foi lavada com NaHCOa sat. (2 x 0,45 L) e NaCI sat. (1 x 0,45 L). A solução foi secada (Na2SO4) e em se- guida filtered diretamente em um frasco de base redonda de 3 L de 3 garga- los. A solução foi purgada com injeção de nitrogênio direta antes de ser car- regada com Pd/C a 10% (13,65 g) sob atmosfera de nitrogênio. O frasco foi evacuado e novamente carregado com hidrogênio; isto foi repetido mais du- as vezes. Hidrogênio foi borbulhado através da solução durante 30 min e em seguida a reação foi agitada sob 1 atm de H2 durante 18 h. O frasco foi eva- cuado, novamente carregado com nitrogênio, e carregado com catalisador fresco (6 g de Pd/C a 10%). Hidrogênio foi borbulhado através da solução durante 30 min e em seguida a reação foi agitada sob 1 atm de H2 durante 18 h. O frasco foi evacuado e novamente carregado com nitrogênio. A mis- tura foi filtrada através de Celita; a almofada filtradora foi em seguida lavada com acetato de etila. O filtrado (-1,6 L de EtOAc de volume) foi diluído com acetonitrilo (0,3 L) e carregado seqüencialmente com L-/V-Cbz-metionina (68 g, 0,24 mol), TBTU (77 g, 0,24 mol), e N,N-diisopropiletilamina (42 mL, 0,24 mol). A reação foi agitada em temperatura ambiente durante 4 h, du- rante cujo tempo mudou de uma suspensão para uma solução clara. A rea- ção foi saciada com a adição de NH4CI sat. (0,75 L) e água (0,15 L); a mis- tura foi diluída também com EtOAc (0,75 L). As fases foram misturadas e separadas e a fase orgânica foi lavada com Na2CO3 sat. (2 x 0,9 L) e NaCI sat. (1 x 0,75 L). A solução foi secada (Na2SO4), filtrada, e concentrada em

Exemplo 1, Etapa 1: (1R, 2S, 5R)-terc-But\\ 2-benziloxicar- vácuo para fornecer 2-((S)-2-(benziloxicarbonilamino)-4-(metiltio) butanami- do)-7-oxo-6-aza-biciclo[3,2,1]octano-6-carboxilato de (1 R,2S,5R)-terc-butila como um óleo que foi levado para a etapa seguinte sem purificação adicio- nal. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 406,3; [M+Na]+ = 528,3. 1H- RMN (400 MHz, d4-MeOH): δ 7,36 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,2 (m, 1H), 4,0 (m, 1H), 2,5 - 2,7 (m, 3H), 2,25 (m, 1H), 2,11 (s, 3H), 2,05 (m, 4H), 1,9 (m, 1H), 1,7 (m, 2H), 1,54 (s, 9H). Também estão presentes EtOAc [1,26 (t), 2,03 (s), 4,12 (q)] e Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametiluréa [2,83 (s)].

Exemplo 1, Etapa 2: Uma amostra de 2-((S)-2-(benziloxicar- bonilamino)-4-(metiltio)butanamido)-7-oxo-6-aza-biciclo[3,2,1]octano-6-car- boxilato de (1R, 2S,5R)-íerc-butila (0,24 mol pretendidos; veja procedimento anterior) foi dissolvida em iodometano (1,250 g) e agitada durante 48 horas 5 a temperatura ambiente. A reação foi concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano e concentrado a vácuo. Isto foi repetido mais duas vezes. A lama resultante foi dissolvida em diclorometano (0,4 L) e ver- tida em uma solução de agitação rápida de MTBE (4,0 L). Os sólidos amare- los resultantes foram coletados por meio de filtragem de sucção e secados a 10 vácuo elevado para fornecer o sal de sulfônio (179 g). Este material foi leva- do para a etapa seguinte sem purificação adicional. LC/MS para pico primá- rio: [M-Me2S+H]+ = 458,4; [M]+ = 520,4. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH): δ

7,35 (m, 5H), 5,09 (s, 2H), 4,33 (m, 1H), 4,28 (m, 1H), 3,98 (m, 1H), 3,3 - 3,45 (m, 2H), 2,97 (s, 3H), 2,94 (s, 3H), 2,78 (m, 1H), 2,0 - 2,3 (m, 4H), 1,7 (m, 2H), 1,52 (s, 9H). Também estão presentes MTBE [1,18 (s), 3,2 (s)] e traços de Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametiluréa [2,81 (s)].

Exemplo 1, Etapa 3: A totalidade do sal de sulfônio da etapa anterior (0,24 mol pretendida) foi dissolvido em DMSO (2,0 L). A solução resultante foi agitada sob nitrogênio a temperatura ambiente e carregada 20 com carbonato de césio (216 g) em porções. A suspensão foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas e em seguida filtrada para remover os sólidos. A solução foi dividida em porções de -0,22 L e elaborada como segue: a mistura reacional (-0,22 L) foi diluída com acetato de etila (1,5 L) e lavada sucessivamente com água (3 x 0,5 L) e salmoura (1 x 0,3 L). A fase orgânica foi secada (Na2SO4)1 filtrada, e concentrada a vácuo. O (1 R^S.õRJ-te/r-butila 2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1 -il)- 7-oxo-6-azabiciclo[3,2,1]octano-6-carboxilato desejado (90,8 g, 83%) foi ob- tido como uma espuma microcristalina, livre de impureza de uréia de tetra- 5 metila. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 358,4; [M+Na]+ = 480,4. 1H- RMN (400 MHz1 d4-MeOH): 7,35 (m, 5H), 5,12 (s, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,2 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 2,64 (m, 1H), 2,28 - 2,42 (m, 2H), 2,15 (m, 1H), 1,7 - 2,0 (m, 5H), 1,55 (s, 9H). Se desejado, este material pode ser iso- lado como um sólido por dissolução em MTBE (1 volume), adição a heptano 10 (3,3 volumes), e coleta do precipitado resultante.

Exemplo 1, Etapa 4: Uma solução em agitação de (1R,2S,5R)- terc-butila 2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-7-oxo-6- azabiciclo[3,2,1] octano-6-carboxilato (108 g, 0,236 mol) em THF (1 L) foi carregada com monoidrato de hidróxido de lítio (21,74 g, 0,519 mol). Água 15 (0,3 L) foi adicionada lentamente, de modo que a temperatura não excedes- se a 20°C. A reação foi agitada a temperatura ambiente durante a noite e os voláteis foram removidos a vácuo. O pH foi ajustado para ~4 pela adição de HCI a 1N (450 mL) e NaH2PO4. O precipitado branco resultante foi coletado através de filtragem e lavado com água (2 x 1 L). O sólido foi dissolvido em 20 diclorometano (1,5 L) e água (~ 1 L). A camada orgânica foi secada (Na2SO4), filtrada, e concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtO- Ac (0,7 L) e a solução de resultante foi aquecida ao refluxo durante 1 hora. Os sólidos separados após resfriamento a temperatura ambiente, e foram coletados por meio de filtragem. Estes sólidos foram purificados através de 25 recristalização em isopropanol para fornecer o ácido (1R,2S,5R)-2-((S)-3- (benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(ferc-butoxicarbonilamino) ci- cloexanocarboxílico deseja como um sólido branco (104,5 g, 93% de produ- ção). LC/MS para pico primário: [M-tBu+H]+ = 420,2; [M-Boc+H]+ = 376,2; [M+H]+ = 476,2. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH): δ 7,35 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 30 4,35 (m, 2H), 3,71 (m, 1H), 3,45 - 3,6 (m, 2H), 2,99 (m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 2,0 (m, 2H), 1,6 - 1,9 (m, 4H), 1,46 (s, 9H).

Exemplo 1, Etapa 5: Um frasco de fundo redondo de 3 L foi carregado com ácido (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2- oxopirrolidin-1 -il)-5-(terc-butoxicarbonilamino)cicloexanocarboxílico (75,5 g, 0,158 mol), EDO HCI (33,5 g, 0,175 mol), 1-hidroxibenzotriazol (23,6 g, 0,175 mol), e diclorometano (1 L). A reação foi agitada a temperatura ambi- 5 ente durante 2 horas durante, durante cujo tempo ela mudou de uma sus- pensão branca para uma solução clara. A amônia (gás) foi borbulhada na solução até que o pH ficasse fortemente básico (papel) e a reação foi agita- da dudddrante 10 minutos; esta adição de amônia foi repetida e a reação foi agitada durante um adicional de 10 minutos. Água foi adicionada. A fase 10 orgânica foi lavada com NaHCO3 saturado, NaH2PO4, e salmoura antes de ser concentrada a vácuo. O resíduo foi suspenso com acetonitrilo (0,5 L) e em seguida concentrado para produzir (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicar- bonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(íerc-butoxicarbonilamino)cicloexanocarbo- xamida como um sólido branco (75,9 g, -100%) que foi empregado na etapa 15 seguinte sem purificação adicional. LC/MS para pico primário: [M-Boc+H]+ = 375,3; [M+H]+ = 475,4; [M-tBu+H]+ = 419,3. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH):ô

7,35 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 4,25 (m, 2H), 3,70 (m, 1H), 3,6 (m, 1H), 3,45 (m, 1H), 2,91 (m, 1H), 2,38 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,9 - 2,05 (m, 2H), 1,65 - 1,9 (m, 4H), 1,46 (s, 9H).

Exemplo 1, Etapa 6: A reação foi conduzida em três porções iguais e combinadas para preparação aquosa. Um frasco de 5 L, de fundo redondo de 3 gargalos foi carregado com (1 R,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicar- bonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(ferc-butoxicarbonilamino)cicloexanocarbo- xamida (25,3 g, 53 mmol), acetonitrilo (1,9 L), e 2,6 L de água/ gelo. A mistu- ra foi agitada e resfriada para O0C. Diacetato de iodobenzeno (25,77 g, 80 mmol) foi adicionado e a reação foi agitada durante 2 horas; outro 0,5 eq de diacetato de iodobenzeno foi adicionado. A reação foi agitada durante 9 ho- ras (temperatura de reação < 10°C). A mistura foi carregada com 8 eq de Ν,Ν-diisopropiletilamina e 2 eq anidrido acético. Durante os próximos trinta minutos, 4 eq de Ν,Ν-diisopropiletilamina e 2 eq de anidrido acético foram adicionados cada dez minutos, até que a reação continuasse até a conclu- são (HPLC). O acetonitrilo foi removido a vácuo; algum sólido separou-se do resíduo, e este foi coletado através de filtragem. O resíduo restante foi extra- ída com diclorometano (3 L, em seguida 1 L). A fase orgânica foi lavada se- qüencialmente com água, NaHCO3 saturado, e salmoura. Os sólidos coleta- dos foram adicionados à fase orgânica, junto com carbono ativado (15 g). A mistura foi agitada durante 30 minutos a 40 0C antes de ser filtrado e con- centrado a vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc (1 L), e a solução de resultante foi agitada a 75 0C durante 1 hora antes sendo permitido resfriar a temperatura ambiente. Um sólido separou e foi coletado através de filtra- gem. Este sólido foi também purificado também através de recristalização: Ele foi primeiro dissolvido em 0,5 L de CH2CI2, em seguida concentrado a vácuo, em seguida re-cristalizado de 1 L de EtOAc; este foi repetido três vezes. Os sólidos obtidos dos licores mãe do acima foram recristalizado três vezes empregando-se o mesmo método. Os sólidos combinados foram re- cristalizados duas vezes mais de acetonitrilo (0,7 L) para fornecer 66 g (84%) de (1 R,3R,4S)-3-acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxo- pirrolidin-1-il)cicloexilcarbamato de terc-butila (pureza >99,5% por HPLC). LC/MS para pico primário: [M+H]+ = 489,4; [M-tBu+H]+ = 433,3. 1H-RMN (400 MHz, d4-MeOH): δ 7,3 - 7,4 (m, 5H), 5,11 (s, 2H), 4,35 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,04 (m, 1H), 3,8 (m, 1H), 3,6 (m, 2H), 2,44 (m, 1H), 2,12 (m, 1H), 1,87 - 2,05 (m, 4H), 1,87 (s, 3H), 1,55-1,7 (m, 2H), 1,46 (s, 9H). A fidelidade este- reoquímica da recombinação de Hofmann foi confirmada através de análise de estrutura de cristal de raios X deste composto, como mostrado na Figura 1.

Exemplo 1, Etapa 7: A uma solução de (1R,3R,4S)-3- acetamido-4-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexilcarbamato de terc-butila (100 g, 0,205 mol) em diclorometano (400 ml) foi adicionado TFA (400 ml) a -209C. A solução de reação foi agitada a 5 temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente e a maioria de TFA foram removidos sob pressão reduzida, e o resíduo foi diluído com diclorometano (2 L) e a solução de K2CO3 aquosa (2 L). O pH foi ajustado para 10 com HCI a IN. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 1L). A camada orgânica combinada foi secada sobre Na2SO4, e concentrada para produzir (S)-1-((1S,2R,4R)-2-acetamido-4-aminocicloexil)-2-oxopirrolidin-3- ilcarbamato de benzila como um óleo (81 g, 100% de produção). Esta amina foi empregada diretamente nesta etapa sem purificação adicional.

Exemplo 1, Etapa 8: Uma solução de (S)-1-((1S,2R,4R)-2- acetamido-4-aminocicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila (13,3 g, 34 mmol) e 3, 5-di-terc-butilcicloexa-3,5-dieno-1,2-diona (7,54 g, 34 mmol) em metanol (160 ml) foi agitada a temperatura ambiente durante 2 horas. A solução foi concentrada e diluída com acetona (132 ml) e água (33 ml), se- guida por adição de Dowex-50WX8-200 (33 g). A reação foi agitada a tem- peratura ambiente durante 2 horas. Dowex-50WX8-200 foi removido através de filtragem e lavado com diclorometano (300 ml). O filtrado foi concentrado a vácuo para remover a maioria da acetona. O resíduo foi diluído com diclo- rometano (200 ml) e lavado com solução de NaHCO3 aquosa (200 ml) e salmoura (200 ml). As camadas aquosas combinadas foram extraídas com diclorometano (2 x 100 ml). Os extratos orgânicos combinados foram seca- dos sobre Na2SO4 e concentrados. O produto (S)-1-((1S,2R)-2-acetamido-4- oxocicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila foi obtido como um só- lido (12 g, 90% de produção) através de cristalização em EtOAc (100 ml) e Hexano (200 ml). 1H-RMN (500 MHz, DMSO-Cl6) δ ppm 7,99 (d, J = 9,35 Hz,

1 H), 7,44 (d, J = 8,80 Hz, 1 H), 7,28 -7,39 (m, 5 H), 5,03 (s, 2 H), 4,50 (s, 1 H), 4,31 (d, J= 12,10 Hz, 1 H), 4,18 (q, J = 8,98 Hz, 1 H), 3,27 (m, 2 H), 2,82 (dd, J = 15,12, 5,22 Hz, 1 H), 2,52 - 2,65 (m, 1 H), 2,40 (dd, J = 12,92, 4,67 Hz, 1 H), 2,15-2,31 (m, 2 H), 2,09 (d, J= 15,40 Hz, 1 H), 1,90 (m, 1 H), 1,81 (s, 3 H), 1,68 (m, 1 H). m/z. 388,46 [M+H].

Exemplo 1, Etapa 9: A uma solução de TiCI4 (1M em diclorome- tano, 36 ml, 36 mmol) em diclorometano (30 ml) a OsC foi adicionado Ti(OiPr)4 (10,8 ml, 36 mmol). A mistura foi em seguida agitada a temperatu- ra ambiente durante 10 minutos. A uma solução de (S)-1-((1S,2R)-2- acetamido-4-oxocicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila (23,25 g, 60 mmol) em diclorometano (600 ml) foi adicionado terc-butilamina (30 ml, 300 mmol) a temperatura ambiente, seguido pela adição da solução de Ti- CI4ZTi(OiPr)4 a -50-C. A reação foi deixada aquecer lentamente para a tem- peratura ambiente. A reação foi concluída após 2 horas (A reação foi moni- torada em HPLC extinguindo-se uma amostra de HPLC com NaBH4 em me- tanol). A solução foi resfriada para 10SC e BH3eSMe2 (1M em diclorometano, 66 ml, 66 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada a temperatura ambien- te durante 5 horas em seguida extinguida com solução aquosa de Na2CO3 (300 ml). O precipitado foi filtrado. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (600 ml). As camadas de diclorometano combinadas foram extraídas com HCI a 1N duas vezes (150 ml e 15 ml). (O produto e o trans isômero indesejado estavam ambos na fase aquosa acídica). As camadas aquosas acídicas combinadas foram neu- tralizadas com solução aquosa a 12 M de NH4OH (12 ml) para pH~8 e extra- ídas com diclorometano duas vezes (600 ml, 450 ml). (O produto estava na fase orgânica, enquanto o trans isômero ainda estava na camada aquosa). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução aquosa de NH4CI 3 vezes (3 x 200 ml) até que não houvesse sobrado nenhum trans isômero na camada orgânica. A camada orgânica foi secada sobre Na2SO4 e concentrada. O resíduo foi purificado através de cristalização em EtOAc / Hexano (200 ml / 800 ml) para produzir o desejado (S)-1-((1S,2R,4R)-2- acetamido-4-(íerc-butilamino) cicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de ben- zila (20,80 g, 78% de produção) como um sólido branco com 99,5% de pu- reza. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-Cl6) δ ppm 8,76 (s, 1 hora), 7,27 - 7,46 (m, 6 H), 5,03 (m, 2 H), 4,14 (m, 1 H), 4,07 (q, J = 8,80 Hz, 1 H), 3,83(m, 1 hora),

3,36 (m, 2H), 2,91 (s, 1 hora), 2,18 (m, 1 hora), 2,04 (m, 1 hora), 1,78 (s, 3H), 1,41 - 1,74 (m, 7H), 1,04 (s, 9H). m/z. 445,54 [M+H].

Exemplo 1, Etapa 10: A uma solução de (S)-1-((1S,2R,4R)-2- acetamido-4-(terc-butilamino)cicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de ben- zila (43,3 g, 98 mmol) em metanol (400 ml), Pd/C úmido a 10% (4,34 g) foi adicionado. A mistura foi evacuada e carregada novamente com hidrogênio 5 com um balão de hidrogênio. A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 5 horas. A mistura foi filtrada e lavada com metanol (500 ml) e con- centrada a vácuo até a secura. O produto cru obtido foi destilado com IPA (2 x 100 ml) sob pressão reduzida para produzir o produto N-((1 R,2S,5R)-2- ((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(terc-butilamino)cicloexil)acetamida como um óleo (30 g, 98% de produção). Esta amina foi empregado na etapa se- guinte sem purificação adicional.

Exemplo 1, Etapa 11: A uma solução de N-((1 R,2S,5R)-2-((S)-

3-amino-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(terc-butilamino)cicloexil)acetamida (30 g, 97 mmol) em IPA (400 ml) foi adicionado TEA (27 ml, 195 mmol) e 4-cloro-6- (trifluorometil)quinazolina (25 g, 107 mmol; veja P. Horas. Carter, e outros Pedido de PCT WO 2005/021500). A mistura foi agitada a temperatura am- biente durante a noite e em seguida agitada a 70SC durante 1 hora. A solu- ção resultante foi concentrada sob pressão reduzida até a secura. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (1 L)e extraído com solução I de ácido acé- tico (preparada por combinação de 700 ml_ de água e 22,6 ml_ de ácido acé- tico glacial) duas vezes (500 ml, 200 ml). A camada aquosa acídica (pH 4 a 5) foi extraída com diclorometano (2 x 300 ml). A camada de diclorometano foi extraída com solução Il de ácido acético (300 ml; preparada por combi- nação de 300 ml_ de água com 4 ml_ de ácido acético glacial). As camadas de ácido acético combinadas foram basificadas com NaOH a 1 M para pH > 12 e extraídas com diclorometano (3 x 700 ml). As camadas orgânicas com- binadas foram secadas e concentradas para produzir o produto cru como um sólido (45,6 g, 93% de produção). O produto cru foi purificado através de recristalização de EtOAc (400 ml) / Hexano (900 ml) para produzir 42,86 g (88%) de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida com 99,7% de pureza. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-Cl6l) δ ppm 9,71 (1 H, br. s.), 9,02 (1 H, s), 8,71 (1

H, d,J = 7,97 Hz), 8,59 (1 H, s), 8,04 (1 H, dd, J = 8,66, 1,79 Hz), 7,88 (1 H, 6, J = 8,52 Hz), 4,91 - 5,13 (1 H, m), 4,30 - 4,57 (1 H, m), 3,86 (1 H, dt, J = 11,89, 3,71, 3,64 Hz), 3,43 - 3,57 (1 H, m), 3,35 - 3,45 (1 H, m), 3,04 (1 H, t, J = 3,85 Hz), 2,23 - 2,40 (1 H, m), 2,05 - 2,22 (1 H, m), 1,90 - 1,98 (1 H, m),

I,86 - 1,93 (3 H, m), 1,50- 1,78 (5 H, m), 0,98-1,15 (9 H, m). 13C-RMN (126 MHz, DMSO-de) δ ppm 171,23, 169,35, 159,54, 156,87, 151,17, 128,97, 128,20, 125,76 (1 C, q, J = 30,52 Hz), 121,55 (1 C, br. s.), 124,04 (1 C, q, J = 272,11 Hz), 114,31, 53,26, 52,39, 50,81, 47,56, 45,70, 42,77, 34,52, 32,17, 29,14 (3 C, s), 26,49, 23,29, 20,30. 19F-RMN (471 MHz, DMSO-d6) δ ppm -60,34 (s). m/z. 507,0 [M+H]. Análise Calculada para C25H33N6O2F3: C, 59,27; H, 6,56; N, 16,59; F, 11,25. Encontrado: C, 59,44; H, 6,64; N, 16,74; F, 10,99.

PREPARAÇÃO ALTERNATIVA DO EXEMPLO 1

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 1: Um frasco de fundo redondo de 3 gargalos secado em forno foi equipado com uma barra de agitação seca, um condensador de refluxo seco, e dois septos. Após o 5 resfriamento sob N2, o frasco foi carregada seqüencialmente com ácido (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(benziloxicarbonilamino)-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(terc- butoxicarbonilamino)cicloexanocarboxílico (60 g, 126 mmol; veja Exemplo 1, Etapa 4), acetonitrilo (800 mL), N-metilmorfolina (27,7 mL, 252 mmol), e azi- da de difenilfosforila (29,9 mL, 139 mmol). A reação foi agitada a temperatu- 10 ra ambiente durante 1 hora e 40 minutos, em cujo momento 2- trimetilsililetanol (90 mL, 631 mmol) foi adicionado. A reação foi ajustada para aquecimento, e alcançou o refluxo 30 minutos depois. Ela foi deixada ao refluxo durante 1 hora, em cujo momento foi deixada resfriar para 50QC gradualmente e em seguida resfriada para 15eC com resfriamento externo. 15 A reação foi extinguida com a adição de ácido acético (1,734 mL, 30,3 mmol). A reação foi concentrada a vácuo e em seguida dissolvida em EtOAc (1,2 L). Ela foi lavada seqüencialmente com água (1 x 0,3 L), NaHCO3 satu- rado (2 x 0,3 L), HCI a 1N (1 x 0,3 L), e salmoura (2 x 0,3 L). A fase orgânica foi secada (Na2SO4), filtrada, e concentrada a vácuo. Um sólido surgiu muito 20 cedo no processo de concentração. Depois que os voláteis foram removi- dos, 800 mL de EtOAc / Hexanos a 10% foram adicionados, e a mistura foi agitada durante a noite. O sólido foi coletado e secado para produzir (1 R,3R,4S)-4-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-1-il)-3-((2-trimetil- silii) etoxicarbonilamino)cicloexilcarbamato de terc-butila (60,5 g, 102 mmol, 25 81% de produção). A HPLC mostrou que 0 material era 72% puro, com duas impurezas a 12%. Este material foi levado para a etapa seguinte sem purifi- cação. O filtrado foi depois concentrado para produzir outros 4,38 g de pro- duto. Produção total = 64,9 g (87%). Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 2: Um frasco de fundo redondo de 500 mL seco foi equipado com uma barra de agitação e carregado seqüencialmente com (1R,3R,4S)-4-((S)-3-benziloxicarbonila- mino-2-oxopirrolidin-1-il)-3-((2-trimetilsilil)etoxicarbonilamino) cicloexilcarba- 5 mato de íerc-butila (60,5 g), CH2CI2 (180 mL), e Uma solução de monoidrato de ácido para-toluenossulfônico (19,48 g, 102 mmol) em CH2CI2 (120 mL) e metanol (30 mL). A mistura foi colocada em um evaporador giratório e o vo- lume do CH2CI2 foi removido (temperatura de banho aproximadamente 20SC). Quando a mistura começou a espumar, o vácuo foi liberado, e a tem- 10 peratura de banho aumentou para 46QC (a temperatura variou entre 44 e 51 sC; ela foi controlada com a adição de gelo externo). A mistura foi girada nesta temperatura durante exatamente uma hora (a evolução de gás foi vi- sível do princípio ao fim) e em seguida diluída com EtOAc (1 L). A fase or- gânica foi lavada com NH4OH a 0,5 N (2 x 250 mL). As lavagens aquosas 15 foram combinadas e postas de lado. A fase orgânica foi lavada com NH4CI saturado (1 x 250 mL) e NaCI saturado (1 x 250 mL); estas lavagens aquo- sas foram descartadas. As lavagens de NH4OH combinadas iniciais foram re-extraídas com EtOAc (1 x 250 mL), e aquele extrato orgânico foi lavado com NH4CI saturado (1 x 60 mL) e NaCI saturado (1 x 60 mL). Todos os ex- 20 tratos orgânicos foram combinados, secados (Na2SO4), filtrados, e concen- trados. O resíduo foi purificado por eluição através de um tampão de SiO2 (13 cm de largura x 7,5 cm de altura). O primeiro eluente foi EtOAc puro (a- proximadamente 4 L). O segundo eluente foi 1:9 de (NH4OH a 10% em Me- OH)/CH2CI2 (aproximadamente 5 L). As frações contendo o produto deseja- 25 do foram agrupadas ao mesmo tempo e evaporadas para fornecer o (1R,2S,5R)-5-amino-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-1- il)cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila desejado (31,6 g, 64,4 mmol, 63% de produção).

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 3: Uma solução em agitação de (1R,2S,5R)-5-amino-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirr- olidin-1-il)cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila (400 mg, 0,82 mmol) em acetonitrilo (3 mL) foi carregada seqüencialmente com diisopropiletilamina (315,8 mg, 3 eq) e bromoacetonitrilo (109,5 mg, 1,1 eq). A mistura foi agita- da a 40°C durante 30 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica gel, empregando-se 1,5% de metanol em diclorometano como o eluente. O 5 (1 R,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-1 -il)-5-

(cianometilamino)cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila desejado foi obti- do como um sólido branco (400 mg, 93%). LC/MS encontrou [M + H]+ = 530.

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 4: Uma solução em agitação de (1 R,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirroIidin-1 -il)- 10 5-(cianometilamino)cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila (400 mg, 0,76 mmol) em diclorometano (5 mL), foi resfriada para 0°C e carregada com m- CPBA (372,6 mg, 2,2 eq) em porções. A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Solução de Na2S2O3 saturada (3 mL) e solução de NaHCO3 saturado (3 mL) foram adicionadas e a mistura foi agitada a 15 temperatura ambiente durante 0,5 hora. A mistura foi diluída com diclorome- tano (80 mL), lavada com NaHCO3 saturado (20 mL) e salmoura (20 mL). A solução foi secada sobre Na2SO4 anidroso, filtrada, e concentrada a vácuo. O resíduo obtido foi dissolvido em metanol (5 mL) e a solução foi carregada com NH2OH-HCI (262,7 mg, 5 eq). A mistura foi agitada a 60°C durante 2,5 20 horas. Depois de resfriar para a temperatura ambiente, a mistura foi diluída com diclorometano (80 mL) e filtrada através de uma almofada de celita. O filtrado foi lavado com NaHCO3 saturado (2 x 20 mL). As lavagens aquosas foram extraídas com diclorometano (30 mL). As camadas de diclorometano foram combinadas e lavadas com salmoura (30 mL). A solução foi secada 25 sobre Na2SO4 anidroso, filtrada, e concentrada a vácuo para produzir (1R,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-1-il)-5- (hidroxiamino)cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila (350 mg, 91%). LC/MS encontrou [M + H]+ = 507.

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 5: Uma solução de (1 R,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-1 -il)-5-(hidroxia- mino) cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila (350 mg, 0,69 mmol) em ace- tona (5 mL) foi agitada a temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em THF anidroso (7 mL) e resfriado para 0°C. Uma solução de MeMgBr (1,1 mL, 3M em éter de dietila, 5 eq) foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada a temperatura ambien- te durante 1,5 horas. A reação foi extinguida com água (5 mL) a 0°C. A mis- 5 tura foi diluída com acetato de etila (100 mL) e filtrada através de uma almo- fada de celita. O filtrado foi lavado com salmoura (30 mL). A solução foi se- cada sobre MgSO4 anidroso, filtrada, e concentrada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em 2 ml de acetonitrilo e 1 ml de CS2 foi adicionado. A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido e o 10 produto cru foi purificado através de cromatografia de coluna em sílica gel, empregando-se 1,5% de metanol em diclorometano como o eluente, para fornecer o (1 R,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-1 -il)-5- (terc-butilamino)cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila desejado (160 mg, 42%). LC/MS encontrou [M + H]+ = 547.

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 6: Uma solução em

agitação de (1 R,2S,5R)-2-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxopirrolidin-1 -il)- 5-(terc-butilamino)cicloexilcarbamato de 2-(trimetilsilil)etila (100 mg, 0,183 mmol) em diclorometano (3 mL) foi carregada com ácido trifluoroacético (2 mL). A reação foi agitada durante 2 horas a temperatura ambiente e concen- 20 trada a vácuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (50 mL) e lavado com NaHCOa saturado (20 mL). A camada aquosa foi extraída com dicloro- metano (3 x 30 mL). As camadas de diclorometano foram combinadas e se- cadas sobre Na2SO4 anidroso, filtradas, e concentradas a vácuo para pro- duzir (S)-1 -((1 S,2R,4R)-2-amino-4-(terc-butilamino)cicloexil)-2-oxopirrolidin- 25 3-ilcarbamato de benzila (66 mg, 90%). LC/MS encontrou [M + H]+ = 403.

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 7: Uma solução de (SH-ÍOS^R^R^-amino^-íférc-butilaminoJcicloexiO^-oxopinOlidin-S-il- carbamato de benzila (22 mg, 0,055 mmol) em diclorometano (2 mL) foi car- regada seqüencialmente com trietilamina (11,1 mg, 2 eq) e anidrido acético 30 (6,1 mg, 1,1 eq). A reação foi agitada durante 1,5 horas a temperatura am- biente, diluída com diclorometano (50 mL) e lavada com NaHCO3 saturado (20 mL). A fase orgânica foi secada sobre Na2SO4 anidroso, filtrada, e con- centrada a vácuo para produzir (S)-1-((1S,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc- butilamino)cicloexil)-2-oxopirrolidin-3-ilcarbamato de benzila (22 mg, 90%). LC/MS encontrou [M + H]+ = 445.

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 8: A uma solução 5 de (S)-1 -((1 S,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc-butilamino)cicloexil)-2-oxopirro- lidin-3-ilcarbamato de benzila (22 mg, 0,05 mmol) em metanol (2 mL) foi adi- cionado Pd(OH)2 (20 mg de catalisador úmido a 50%). O frasco foi evacua- do e recarregado com hidrogênio de um balão de hidrogênio. A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 1 hora e o catalisador foi removido 10 através de filtragem. O filtrado foi concentrado a vácuo para fornecer N- ((1 R,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-1 -il)-5-(terc-butilamino) cicloe- xil)acetamida (13 mg, 85%). LC/MS encontrou [M + H]+ = 311.

Exemplo 1, Preparação Alternativa, Etapa 9: A uma solução de N-((1 R,2S,5R)-2-((S)-3-amino-2-oxopirrolidin-1-il)-5-(terc-butilamino) ci- cloexil)acetamida (70 mg, 0,225 mmol) em isopropanol (3 mL) foi adicionado

4-cloro-6-(trifluorometil)quinazolina (63 mg, 1,2 eq) e trietilamina (56,9 mg,

2,5 eq). A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante 1,5 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado com HPLC preparativa para fornecer o composto título como seu sal de bis- TFA(110 mg, 67%). LC/MS encontrou [M + H]+ = 507.

2a PREPARAÇÃO ALTERNATIVA DE EXEMPLO 1

NH2HOTs Pd/C [H2] ^nxxNCO2EI

EtOH

i-PrOAc

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 1a: Para um hi- drogenador foram carregados sal de 4-toluenossulfonato de (7R,8S)-8-((S)- 1-fenila-etilamino)-1,4-dioxa-espiro[4,5]decano-7-carboxilato de etila 1A 25 (1417 g, 2,8 moles, c.f.: W02004098516, preparado análogo à Patente dos Estados Unidos N- 6.835.841), etanol (graduação 200, 11,4 L), e catalisador de Pd/C a 10% (50% de umidade 284 g). A mistura foi inativada com nitro- gênio, em seguida pressurizada com gás de hidrogênio (45 psig) e agitada vigorosamente a aproximadamente 40°C até que o material de partida fosse consumido (HPLC). A suspensão foi resfriada, purgada com gás de nitrogê- nio e o catalisador foi removido através de filtragem enquanto inativado. O 5 catalisador gasto foi lavado com etanol (4,3 L). O filtrado e os lavados foram combinados e concentrados a vácuo para um volume de 2 a 3 L ao mesmo tempo que mantendo a batelada entre 40- a 60°C. Acetato de isopropila (5 L) foi carregado e a mistura foi concentrada para um volume de ~2 L até que a maior parte do etanol fosse removida (< 0,5%) e o conteúdo de umidade 10 residual fosse < 1.000 ppm. O Volume de batelada foi ajustado para -7,5 L pela adição de acetato de isopropila. A mistura foi aquecida para 80°C até clarear, e em seguida resfriada para 65s a 70°C. Cristais sementes de 1 (5 g) foram adicionados e a batelada foi resfriada para 50°C durante 2 horas, e em seguida também resfriada para 20°C duante 4 horas e mantida durante 15 -10 horas. A suspensão resultante foi filtrada e a massa foi lavada com ace- tato de isopropila (2 L). O produto foi secado a vácuo a ~35°C até que os voláteis fossem reduzidos abaixo de -1% (LOD). Sal de 4-toluenossulfonato de (7R,8S)-8-amino-1,4-dioxa-espiro[4.5]decano-7-carboxilato de etila 1 foi obtido como um sólido cristalino branco (936 g, 83% de produção; pureza de 20 HPLC: 99,8%). 1H-RMN: (300MHz, CDCI3) 8,14 - 7,89 (brs, 3H), 7,75 (d, J 9,0Hz, 2H), 7,15 (d, J 8,0Hz, 2H), 4,22 - 4,04 (m, 2H), 4,01 - 3,77 (m, 4H), 3,55 - 3,43 (m, 1H), 3,20-3,13 (m, 1H), 2,40 - 2,27 (m, 4H), 2,21 - 1,94 (m, 2H), 1,81 - 1,51 (m, 3H), 1,23 (t, J7,0Hz, 3H); HPLC: WatersXterra MS C18

4,6 mm x 150 mm i.d., 3,5 μηι de tamanho de partícula, NH4OH a 0,05% (5% de ACN, 95% de H2O, solvente A), a NH4OH a 0,05% (95% de ACN, 5% de H2O, solvente B), 5% de B a 20% de B em 10 minutos, mudado para 95% de B em 25 minutos, e em seguida mudado para 5% de B em 1 minuto;

11,1 minutos (aminoéster 1). 2 3

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 1b: Sal de 4-

toluenossulfonato de (7R,8S)-8-amino-1,4-dioxa-espiro[4.5]decano-7- carboxilato de etila 1 (450,1 g; o produto da desproteção redutiva de um composto conhecido -veja R. J. Cherney, WO 2004/098516 e G. V. Delucca & S. S. Ko, WO 2004/110993) foi combinado com cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetil-amino-propil)carbo-diimida (236,3 g), hidrato de benzotriazol de 1- hidróxi (171,9 g), /V-carbobenziloxi-L-metionina (333,4 g) e acetonitrilo (3,1 L). À mistura agitada foi adicionado trietilamina (249,5 g) abaixo de 30°C. Na conclusão de reação (HPLC), a mistura foi diluída com acetato de etila (8,2 L) e lavada com solução de bicarbonato de potássio a 25% aquosa (2 x 4,5 L) seguida por água (4,5 L). A fase orgânica foi separada e concentrada sob pressão reduzida para obter uma solução de (7R,8S)-8-((S)-2-benziloxicar- bonilamino-4-metilsulfanil-butyrilamino)-1,4-dioxa-espiro[4,5]decano-7-carbo- xilato de etila 2 (1,4 L). Iodeto de metila (2,39 kg) foi adicionado, o recipiente foi protegido da Iuz e a mistura foi mantida sob agitação lenta durante apro- ximadamente 24 horas. Ao precipitado amarelo espesso foi adicionado éter de terc-butila de metila (2,7 L) e a mistura foi mantida durante aproximada- mente 1 hora. O produto foi isolado por filtragem e a massa foi lavada com éter de ferc-butila de metila (2 x1,4 L), em seguida secada a vácuo produ- zindo iodeto de [(S)-3-benziloxi-carbonilamino-3-((7R,8S)-7-etoxicarbonil-

1,4-dioxa-espiro[4,5]dec-8-ilcarbamoil)-propil]-dimetilsulfônio 3 (671,4 g, -94% de produção) como um sólido quase branco (pureza de HPLC 99,9%). > ο

NHCbz

O

NHCbz

Λ

O

O

CS2CO3

DMSO

<

VU

VU

ο

3

4

5

LEGENDA PA FIGURA:

acetona

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 2: Sal de sulfô-

nio 3 (619,4 g), e carbonato de césio (416,8 g) e sulfóxido de dimetila ani- droso (6,2 L) foram combinados em um reator equipado com um purificador para neutralizar sulfetos voláteis. Agitação vigorosa foi mantida até que a conversão completa fosse obtida (HPLC). Acetato de etila (12,4 L) foi adi- cionado, seguido por salmoura a 20% (3 L). A fase orgânica foi separada, lavada duas vezes com salmoura (2 x 3 L) e evaporada para obter uma so- lução de (7R,8S)-8-((S)-3-benziloxicarbonilamino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-1,4- dioxa-espiro[4,5]decano-7-carboxilato de etila 4 em acetato de etila (-0,8 L). Acetona (2,55 L) foi adicionada, seguida por solução de ácido hidroclórico a 0,5 M aquosa (2,3 L). Com boa misturação, a solução foi aquecida para 50 a 60QC até que a conversão de 4 para (1R,2S)-2-((S)-3-benziloxicarbonila- mino-2-oxo-pirrolidin-1-il)-5-oxo-cicloexanocarboxilato de etila 5 fosse con- cluída (HPLC). A mistura foi concentrada sob pressão reduzida ao mesmo tempo que abaixo de 40QC, resfriada para ~30SC, e água (4,1 L) foi adicio- nada. A suspensão resultante foi resfriada para 5 a 102C e agitada durante ~ 1 hora. O produto foi filtrado e a massa foi lavada com água (2 x 2,5 L). Na desumidificação, a massa foi secada para um peso constante abixo de 409C em um forno a vácuo. Cicloexanona 5 (272g, 70% de produção) foi obtida (pureza de HPLC 98,7%). Q

ΓΟ

HN

N O

Λ Jiv

T' OEt

£>

9

O

O

O

5

6

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 3: Cicloexanona 5 (100 g) foi suspensa em THF (500 mL) e resfriada para O5C. NaOH a 1N (271 g) foi adicionado a 0 a 5QC e a mistura de bifásica foi agitada a ^ 5SC durante pelo menos uma hora. MTBE (500 mL) foi adicionado e as camadas foram sepa- radas. A camada aquosa do fundo foi lavada novamente com MTBE (500 mL) e as camadas foram separadas. Diclorometano (500 mL) foi carregado para a camada aquosa rica em produto, e a mistura foi resfriada para O2C. HCI a 3N (156 g) foi carregado mantendo-se a ^ 5QC. Após a agitação du- rante pelo menos 10 minutos, a mistura foi aquecida para 20 a 25eC, e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com diclorometa- no (100 mL). As camadas orgânicas foram combinadas e o solvente foi tro- cado em tolueno por meio de destilação. O volume de solução de tolueno foi ajustado para aproximadamente 1L, e monoidrato de ácido p- toluenossulfônico (0,24 g) foi adicionado. Etileno glicol (16,22 g) foi adicio- nado, e a mistura foi destilada a pressão atmosférica até que a formação do composto 7 fosse concluída e o volume de pote foi aproximadamente 500 a 700 mL. A solução foi resfriada para aproximadamente 70SC, e acetato de etila (500 mL) foi adicionado mantendo-se aproximadamente a 70SC. A mis- tura foi resfriada e filtrada para produzir 73 g (70% de produção) do compos- to 7, ácido (7R,8S)-8-((3S)-3-(((benziloxi)carbonil)amino)-2-oxo-1-pirrolidinil)-

1,4-dioxaspiro[4,5]decano-7-carboxílico. NHCbz NHCbz NHCbz Ç^o 0*0 N ° ^vCO2H /SoCON3 >\..NCO Q Q Q O O O O O O \_/ \_/ _ VU 7 8 9 NHCbz

Ç^O

.NHAc

Ac2O

O O

\_/

10

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 4: Para uma suspensão do composto 7 (147 g) em tolueno seco (370 mL) foi carregada trietilamina (32,7 g) a 15 a 259C. Depois que a suspensão tornou-se uma solução depois de 10 a 15 minutos de agitação a 25QC, o frasco foi resfriada 5 para -10SC e cloroformiato de isobutila (44,1 g) foi carregado a -10s a 0QC. A mistura foi agitada a -10- a OqC durante cerca de 30 minutos. Uma solução de azida de sódio (42 g) e brometo de tetrabutilamônio (5,2 g) em água (130 mL) foi adicionada a -10Q a 0aC. A suspensão bifásica foi vigorosamente agi- tada durante pelo menos uma hora e tolueno (1750 mL) seguida por água 10 (300 mL) foram adicionado. As duas fases foram agitadas durante pelo me- nos 10 minutos e a camada orgânica de cima foi separada e secada com peneiras moleculares de 4 Á. Anidrido acético (76 mL) e ácido acético (28 mL) foram adicionados e a solução foi aquecida para 80 a 909C durante 1 a

4 horas, até que <2 AP do intermediário 9 fosse desctado por HPLC. O sol- 15 vente foi parcialmente destilado para aproximadamente dois terços do volu- me inicial sob pressão atmosférica, a solução foi resfriada para a temperatu- ra ambiente e a suspensão resultante foi agitada durante 16 horas. Heptano (350 mL) foi adicionado lentamente e a suspensão foi agitada durante 1 ho- ra. Os sólidos foram filtrados, lavados com tolueno/ heptano 4:1 (300 mL), e 20 secados para produzir 109 g (78% de produção) do composto 10, ((3S)-1- ((7R,8S)-7-acetamido-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3- pirrolidinil)carbamato de benzila. NHCbz

NHCbz

,,NHAc

s>NHAc

10

O

11

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 5: Para uma so-

lução do composto 10 (109 g) em acetona (760 mL) foi carregado HCI a 1N (760 mL). A mistura foi aquecida para 50QC durante 2,5 horas. A acetona foi destilada sob pressão reduzida e o produto foi extraído duas vezes com di- 5 clorometano 1 x 1 L e 1 x 0,5 L. As camadas de diclorometano foram combi- nadas e diclorometano foi trocado em acetato de etila através de destilação até que o ponto de ebulição na caldeira alcançasse 78SC e o volume final fosse aproximadamente 10 ml_/g do fornecimento de composto 10. A sus- pensão de acetato de etila foi resfriada para a temperatura ambiente, agita- 10 da durante 16 horas e os sólidos foram filtrados e lavados com acetato de etila (400 mL). O sólido foi secado para produzir 84 g (87% de produção) do composto 11, ((3S)-1 -((1 S,2R)-2-acetamido-4-oxocicloexil)-2-oxo-3-pirro- lidinil)carbamato de benzila.

Tici2(OPr1)2 foi pré-formado por adição de Ti(O1Pr)4 (11,5 mL) a uma solução de TiCI4 a 1M em diclorometano (39 mL) a 5 a 10QC e agitação subseqüente a temperatura ambiente durante 15 minutos. O composto 11 (25 g) foi dis- solvido em diclorometano (500 mL) e t-butilamina (34 mL) foi adicionada a temperatura ambiente. Depois de 10 minutos a solução foi resfriada para - 20 25 a -20eC e a solução de reagente de titânio pré-formada foi adicionada a

NHCbz

NHCbz

NHAc

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 6: O reagente de uma temperatura abaixo de -20-C. A mistura foi deixada aquecer a tempera- tura ambiente e foi agitada durante 1 hora. Uma amostra foi extraída para confirmar a completa formação de imina por mini-extinção com boroidreto de sódio em metanol (a ausência de álcoois indicou o consumo completo da

5 cetona de partida 11). Sulfeto de dimetila de borano (7,0 mL) foi em seguida adicionado a 0 a 59C e a mistura reacional foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante pelo menos 5 horas. Diclorometano foi parcial- mente (cerca de metade) evaporado sob pressão reduzida e acetato de etila úmido (300 mL, pré-formado por agitação de acetato de etila com água) foi 10 adicionado em 30 a 60 minutos. A suspensão resultante foi agitada durante pelo menos 4 horas, os sólidos foram filtrados e lavados várias vezes com diclorometano até que não mais que 5% em M do produto ficasse retido na massa. O filtrado e as lavagens foram combinados, HCI a 1N (200 mL) foi adicionado e a mistura bifásica foi agitada durante pelo menos 30 minutos 15 (a evolução de gás cessou depois de -20 minutos). A camada aquosa rica em produto (fase superior) foi separada e diclorometano (500 mL) foi adicio- nado. Hidróxido de amônio concentrado foi adicionado à mistura bifásica agitada até que pH fosse ajustado para 8 a 8,5 (-15 mL). A fase orgânica foi separada e lavada 2 x 100 mL com 14 % em peso de cloreto de amônio, 20 para remover o trans isômero indesejado do composto 12, e finalmente com água (25 mL). Diclorometano foi trocado em acetato de etila através de des- tilação sob pressão normal até que o ponto de ebulição na caldeira alcan- çasse 789C e o volume final fosse aproximadamente 5 mL/g do fornecimen- to do composto 11 (-140 mL). A solução foi resfriada para a temperatura 25 ambiente. Heptano (250 mL) foi adicionado lentamente a 40 a 50SC e com- posto 12 começou a cristalizar-se. A suspensão foi agitada a temperatura ambiente durante 3 horas e os sólidos foram filtrados, lavados com heptano (100 mL) e secados para produzir 20,1 g (70% de produção) do composto 12, ((3S)-1 -((1 S,2R,4R)-2-acetamido-4-(terc-butilamino)cicloexil)-2-oxo-3- 30 pirrolidinil)carbamato de benzila, como cristais brancos, macios. NHCbz NH2

Ç^o Çk

,NHAc h2 _ >\.,NHAc

Pd/C MeOH

^ NH NH

X ^

12 13

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 7: O composto 12 (20 g) foi dissolvido em metanol (400 mL) e catalisador de Pd/C a 5% (1,8 g, 9 % em peso) foi adicionado. A mistura foi hidrogenada a 25QC e 25 psig durante 3 horas. O catalisador foi removido através de filtragem, e o metanol foi trocado em acetato de etila por distilação contínua. O produto cristalizou-se de acetato de etila (160 mL) sob resfriamento. Heptano (160 mL) foi adicionado a 25SC, a suspensão foi agitada durante 1 hora e o pro- duto foi filtrado, lavado com heptano e secado para produzir 12,8 g (94% de produção) do composto 13, N-((1R,2S,5R)-2-((3S)-3-amino-2-oxo-1- pirrolidinil)-5-(terc-butilamino)cicloexil)acetamida.

OH Cl

S,<M SiJLJ

14 15

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 8: 6-

(trifluorometil)-4-quinazolinol, 14 (5 g; veja Ρ. H. Carter, e outros Pedido de PCT WO 2005/021500) foi suspenso em diclorometano (100 mL). N1N- diisopropiletilamina (4,2 mL, 1,05 eq) e DMF (0,4 mL, 0,2 eq) fram adiciona- dos. Cloreto de Oxalila (3,0 mL, 1,5 eq) foi em seguida adicionado à sus- pensão agitada a 20 a 25-C sob esfriamento (adição exotérmica). A suspen- são laranja foi agitada a 30 a 35QC durante 2 horas. Evolução de gás estável foi observada dur -1,5 horas em cujo ponto a suspensão se tornou-se uma solução laranja. Depois de resfriar para 20QC, a solução de reação foi adi- cionada gota a gota a 20 % em peso de K2HPO4 aquso (50 mL) sob agita- ção vigorosa e de evolução de gás. A fase orgânica inferir foi separada e lavada uma mais vez com 20% em peso de K2HPO4 (50 mL). A solução or- gânica foi empregada no estado em que se encontra para a etapa seguinte dentro de 16 horas.

,NH2

CL0

N °

,NHAc

6θτ

F3C

P

HN-(\ N

CF,

Jj

r\ N VssO

.,NHAc

1

NH

13

15

NH Example 1

LEGENDA DA FIGURA: Exemplo 1

Exemplo 1, 2- Preparação Alternativa, Etapa 8: A uma solu- ção de 15 em diclorometano (22 mL, 5,5 mmol), o sólido 13 (1,55 g, 5 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada a temperatura ambiente até que os sólidos dissolvessem. Trietilamina (1,4 mL, 11 mmol) foi adicionada e a mis- tura foi agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. Água (10 mL) foi adicionada, as duas fases foram agitadas durante 10 minutos e a fase orgâ- nica foi separada. Diclorometano foi trocado em acetato de etila através de destilação contínua até que o ponto de ebulição na caldeira alcançasse 78SC e o volume final fosse aproximadamente 10 mUg do fornecimento de composto 13 (-15 mL). A suspensão foi resfriada para a temperatura ambi- ente, heptano (15 mL) foi adicionado lentamente e a suspensão foi agitada durante 16 horas. Os sólidos foram filtrados, lavados com heptano/ acetato de etila 1:1 (5 mL) e secados para produzir 1,83 g (72% de produção) de cristais beges (forma N-2 por XRD) de N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2- ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, Exemplo 1. EXEMPLO 2

Formas de Cristais de N-((1R,2S,5R)-5-(íerc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3- (6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida

Várias formas de cristais de N-((1R,2S,5R)-5-(íerc-butilamino)-2- ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil) ace- tamida, base livre foram preparadas e caracterizadas como descrito abaixo. PROCEDIMENTOS PARA CARACTERIZAR AS FORMAS Dados de Cristal Único

Os dados foram coletados em um difratômetro serial Bruker- Nonius CAD4 (BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway Madison1 Wl 53711 E.U.A). Parâmetros celulares unitários foram obtidos por meio de a- nálise dos mínimos quadrados das determinações do difratômetro experi- mentais de 25 reflexões de ângulo elevado. As intensidades foram medidas empregando-se radiação de Cu Κα (λ = 1,5418 À) a uma temperatura cons- tante com técnica de varredura variável de Θ-2Θ só e foram corrigidas ape- nas para fatores de polarização de Lorentz. As contasgens de base foram coletadas nos extremos da varredura durante metade do tempo da varredu- ra. Alternadamente, os dados de cristal único foram coletados em um siste- ma Bruker-Nonius Kappa CCD 2000 empregando radiação Cu Κα (λ = 1,5418 Á). A indexação e processamento dos dados de intensidade medidos foram executados com o pacote de software HKL2000 (Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997) em Macromolecular Crystallography, eds. Carter, W.C. Jr & Sweet, R. M. (Academic, NY), Vol. 276, págs. 307-326) no conjunto do pro- grama Collect. (coleção Collect Data e interface do usuário de processa- mento: Coleta: software de coleta de dados, R., Hooft, Nonius B.V., 1998). Alternadamente, os dados de cristal único foram coletados em um sistema Bruker-AXS APEX2 CCD empregando radiação Cu Κα (λ = 1,5418 Á). A in- dexação e processamento dos dados de intensidade medidos foram execu- tados com o pacote de software!conjunto de programa APEX2 (coleta de dados APEX2 e interface do usuário do processamento: Manual do Usuário de APEX2, v1.27; BRUKER AXS, Inc., 5465 East Cheryl Parkway Madison, Wl 53711 E.U.A.).

Quando indicado,os cristais foram resfriados na corrente fria de um criossistema Oxford (refrigerador de Criocorrente de Criossistemas Ox- ford: J. Cosier e A. M. Glazer, J. Appl. Cryst., 1986, 19, 105) durante a cole- ta de dados.

As estruturas foram resolvidas através de métodos diretos e re- finadas com base nas reflexões observadas empregado-se ou o pacote de software SDP (SDP, Pacote de Determinação de Estrutura, Enraf-Nonius1 Bohemia NY 11716. Scattering factors, including f e f, in the SDP software were taken from the "International Tables for Crystallography", Kynoch Press, Birmingham, Inglaterra, 1974; Vol. IV, Tables 2.2A e 2.3.1) com modi- ficações locais secundárias ou os pacotes cristalográficos MAXUS (conjunto de software de solução e refinamento maXus: S. Mackay, C.J. Gilmore, C. Edwards, M. Tremayne, N. Stewart, K. Shankland. maXus: um programa de computação para a solução e refinamento de estruturas de cristal de dados de difração ou SHELXTL4. Os parâmetros atômicos derivados (coordenadas e fatores de temperatura) foram refinados por mínimos quadrados de matriz cheia. A função minimizada nos refinamentos foi IW(|F0| - |FC|)2. R é definido como Σ IIFoI - |FC||/I | F0| enquanto Rw = [ZW|F0| - |FC|)2/IW |FD|2]1/2 onde w uma função de pesagem apropriada baseada em erros nas intensidades observadas. Mapas de diferença foram examinados em todas as fases de refinamento. Hidrogênios foram introduzidos em posições idealizadas com fatores de temperatura isotrópicos, mas nenhum parâmetro de hidrogênio foi variado.

Dados de Difração de Pó de Raio X (PXRD)

Dados de PXRD foram obtidos empregando-se um Bruker C2 GADDS. A radiação foi Cu Ka (40 KV, 50 mA). A distância do detector de amostra foi 15 cm. Amostras de pó foram colocadas em tubos capilares de vidro lacrados de 1 mm ou menos de diâmetro; o tubo capilar foi girado du- rante a coleta de dados. Os dados foram coletados para 3^29<35e com um tempo de exposição da amostra de pelo menos 2000 segundos. Os arcos de difração bidimensionais resultantes foram integrados para criar um pa- drão de PXRD unidimensional tradicional com um tamanho de etapa de 0,02 graus 2Θ na faixa de 3 a 35 graus 2Θ. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)

Os experimentos de DSC foram executados em um TA Instru- ments™ modelo 01000 ou 2920. A amostra (cerca de 2 a 6 mg) foi pesada em uma tacho de alumínio e precisamente registrada para um centésimo de um miligrama, e transferida para a DSC. O instrumento foi purgado com gás de nitrogênio a 50 mU minuto. Os dados foram coletados entre a temperatu- ra ambiente e 300°C a taxa de aquecimento de 10°C/ minuto. A plotagem foi feita com os picos endotérmicos assinalados. Análise Gravimétrica Térmica (TGA) Os experimentos de TGA foram executadas em um TA Instru-

ments™ modelo Q500 ou 2950. A amostra (cerca de 10 a 30 mg) foi colo- cada em um tacho de platina previamente tarado. O peso da amostra foi medido com precisão medido e registrado para um milésimo de um miligra- ma pelo instrumento. O forno foi purgado com gás de nitrogênio a 100 mL/ minuto. Os dados foram coletados entre a temperatura ambiente e 300°C a taxa de aquecimento de 10°C/minuto. PREPARAÇÃO E ANÁLISE DAS FORMAS

Os dados celulares unitários e outras propriedades para estes exemplos são apresentados na Tabela 1. Os parâmetros celulares unitários foram obtidos da análise cristalográfica de raio X de cristal único. Uma conta detalhada de células unitárias pode ser encontrada no Capítulo 3 de Stout & Jensen, X-Ray Structure Determination: a Practical Guide, (MacMillian, 1968).

As coordenadas atômicas fracionárias para Exemplos 2a, b, c, d, e, f, e g, e as condições em que elas foram medidas são apresentadas nas Tabelas 2 a 9.

Adicionalmente, posições de pico de difração de pó de raio X características (graus 2Θ±0,1)@ temperatura ambiente para os Exemplos 2a, b, c, d, e, e f são apresentadas na Tabela 9, todas as quais são basea- das em padrões de alta qualidade coletadas com um difratômetro (CuKa) com um tubo capilar giratório com 2Θ calibrado com um NIST outro padrão adequado.

Finalmente, as Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6 apresentam padrões de XRPD para os Exemplos 2a, b, c, e, d e f, Figuras 8, 10, 13, 15, 17 e 19 descrevem a TGA dos Exemplos 2a, b, c, d, e e f, respectivamente. As Figu- ras 7, 9, 12, 14, 16 e 18 descrevem a DSC dos Exemplos 2a, b, c, d, e e f, respectivamente. A Figure 11 descreve o Isoterma de Absorção de Vapor do Exemplo 2b.

Preparação de Forma, Caracterização de DSC e TGA

Exemplo 2a, Forma HO.5-4: 150 mg de N-((1 R,2S,5R)-5-(ferc- butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin il)cicloexil)acetamida, base livre foram dissolvidos em acetato de n-butila quente saturado com água. Heptano foi adicionado até que uma turvação persistente fosse observada. A suspensão foi deixada esfriar para a tempe- ratura ambiente. A forma HO.5-4 é caracterizada por 0,5 mole de água por mole de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. A forma HO.5-4 foi caracterizada por um termograma de DSC tendo um início de en- doterma amplo tipicamente na faixa entre aproximadamente temperatura ambiente e aproximadamente 67°C de acordo com a curva de TGA; em temperaturas mais altas outros eventos podem resultar. A forma HO.5-4 foi caracterizado por uma curva térmica de TGA tendo uma perda de peso tipi- camente de 0,6% a cerca de 1,4% até aproximadamente 100°C. A perda de peso teórica para a Forma HO.5-4 é 1,7%, entretanto, não é incomum para hidratos instáveis se tornarem parcialmente desidratados na secagem.

Exemplo 2b, Forma N-2: 1 g de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-buti- lamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)

cicloexil)acetamida, base livre foi dissolvido em 10 mL de EtOAc sem água a 77-C. A solução foi resfriada para 70QC. 10 mg de sementes de N-2 foram adicinados. À suspensão, 18 mL de n-heptano foram adicionados durante 1 hora com uma bomba de seringa. A suspensão foi esfriada de 70SC para 20SC durante 1 hora, e agitada a 20SC durante a noite. O sólido foi isolado por filtragem, lavado com 3 mL de n-heptano, secado a 50SC em um forno a vácuo durante a noite. A Forma N-2 é N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2- ((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil) ace- tamida, base livre, uma forma pura (sem moléculas adicionais de água ou solvente). A Forma N-2 foi caracterizada por um termograma de DSC tendo um início endotérmico tipicamente entre aproximadamente 230°C e aproxi- madamente. 232°C como uma única fusão sem outras transformações. A Forma N-2 foi caracterizada por uma curva de TGA tendo perda de peso desprezível a até aproximadamente 200°C e de acordo com a estrutura de cristal único

Exemplo 2c, Forma H1.75-5: Uma suspensão de 50 mg de N- ((1 R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre foi vigorosamente agita- da em 1 ml_ de água durante mais de 16 horas. A Forma H1.75-5 é caracte- rizada por 1,75 moles de água por uma mole de N-((1R,2S,5R)-5-(íerc- butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, base livre. A Forma H1.75-5 foi caracterizada por um termograma de DSC tendo um início de endoterma tipicamente entre apro- ximadamente a temperatura ambiente e aproximadamente 70°C de acordo com a curva de TGA; em temperaturas mais altas outros eventos podem resultar. A Forma H1.75-5 foi caracterizada pela curva de TGA tendo uma perda de peso de aproximadamente 4,3% a aproximadamente 5,3% a tem- peraturas até aproximadamente 100°C. A perda de peso teórica é aproxi- madamente 5,9%, entretanto, não é incomum para hidratos instáveis se tor- narem parcialmente desidratados na secagem.

Exemplo 2d, HAC-1: 100 mg de N-((1 R,2S,5R)-5-(terc-butila- mino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)ciclo- exil)acetamida, base livre foram dissolvidos em 0,1 ml_ de HOAc a 80SC. A isto, 0,2 mL de t-BuOAc foi adicionado e a solução foi resfriada para 20QC. A solução foi evaporada até a secura. O sólido resultante foi agitado em hep- tano a 50QC durante 15 horas, seguido por resfriamento para 20SC. HAC-1 foi filtrado e secado a 25°C a vácuo durante a noite. A Forma HAC-1 é ca- racterizada por 1 mole de ácido acético por uma mole de N-((1 R,2S,5R)-5- (íerc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino) pirroli- din-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. A Forma HAC-1 foi caracterizada por um termograma de DSC tendo um início endotérmico tipicamente a aproxi- madamente 100°C de acordo com a curva de TGA; em temperaturas mais altas outros eventos podem resultar. A Forma HAC-1 também foi caracteri- zada por uma curva de TGA tendo aproximadamente 15,3% de perda de peso até aproximadamente 200°C. A Perda de peso teórica é aproximada- mente 10,5%, porém não é incomum quanto a quantidade menor de solven- tes de ponto de ebulição altos permanecerem associados com o sólido. Em casos como este, PXRD é diagnóstico da forma mas não sensível a peque- nas quantidades de solvente adventício.

Exemplo 2e, Forma E-1: 50 mg de N-((1 R,2S,5R)-5-(íerc- butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, base livre foram dissolvidos em < 1mL de etanol fer- vente. A solução foi resfriada para a temperatura ambiente e deixada evapo- rar lentamente. A Forma E-1 é caracterizada por 1 mole de etanol para um mole de N-((1 R,2S,5R)-5-(íerc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. A Forma E- 1 foi caracterizada por um termograma de DSC tendo um início endotérmico tipicamente a aproximadamente 100°C de acordo com as curvas de TGA; em temperaturas mais altas outros eventos podem resultar. A Forma E-1 foi caracterizada por um curva térmica de TGA tendo uma perda de peso de aproximadamente 7,1% a aproximadamente 7,6% até aproximadamente 150°C. A Perda de peso teórica é aproximadamente 8,3%, porém, não é incomum para solvatos instável se tornarem dessolvatados parcialmente na secagem.

Exemplo 2f, RPG-3: 30 a 40 mg de N-((1 R,2S,5R)-5-(íerc- butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, base livre foram dissolvidos em 2 ml_ de propileno gli- col racêmico. Água foi adicionada até que uma turvação fosse observada. O solvente foi deixado evaporar lentamente até a secura. A Forma RPG-3 é caracterizada por 1 molécula de /?-propileno glicol para uma molécula de N- ((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. A Forma RPG-3 foi ca- racterizada por um termograma de DSC tendo um início endotérmico a a- proximadamente 70°C de acordo com a curva de TGA, a tempratures mais altas outros eventos podem resultar. A Forma RPG-3 foi caracterizada por uma curva de TGA tendo uma perda de peso de aproximadamente 16,4% até aproximadamente 110°C. A perda de peso teórica é aproximadamente 13,1%, porém não é incomum para quantidade menor de solventes de ponto ebulição alto permanecerem associados com o sólido. Em casos como este, PXRD é diagnóstico da forma mas não sensível a quantias pequenas de solvente adventício.

Exemplo 2g, Forma IPA-1: 40 mg de N-((1 R,2S,5R)-5-(ferc- butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1- il)cicloexil)acetamida, base livre foram suspensos em <1mL de álcool iso- propílico. A suspensão foi suavemente aquecida para dissolver o sólido res- tante. A solução foi resfriada para a temperatura ambiente e deixada evapo- rar lentamente até que cristais fossem observados. A Forma IPA-1 é carac- terizada por 1 mole de álcool isopropílico para um mole de N-((1 R,2S,5R)-5- (terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4- ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, base livre. TABELAI

Parâmetros Celulares Unitários

Composto Forma T a(Á) b(Â) c(Â) [1° L1° V(Âa) Exp 2a HO,5-4 -50 17,7845(7) 7,6215(3) 20,9510(9) 90 109,062(3) 90 2684,1(2) Exp 2b N-2 RT 18,7240(4) 8,0171(2) 19,6568(5) 90 114,935(2) 90 2675,7(1) Exp 2c H 1,75-5 -70 12,7648(2) 34,3194(7) 12,9659(2) 90 99,053(1) 90 5609,4(2) Exp 2d HAC-1 RT 7,9766(7) 11,058(2) 33,348(4) 90 90 90 2941,4(6) Exp 2e E-1 -50 7,9866(3) 11,2594(6) 32,680(2) 90 90 90 2938,7(2) Exp 2f RPG-3 -50 10,3004(3) 10,5475(4) 15,4784(6) 90,045(3) 102,476(2) 109,083(2) 1547,0(1) Exp 2g IPA-1 RT 8,4487(2) 11,6615(3) 31,3800(9) 90 90 90 3091,7(1)

TABELA 1 (continuada) Parâmetros Celulares Unitários

I Composto Z' Vm sg dcalc Exp 2a 2 671 P2i 1,235 Exp 2b 2 669 P2i 1,258 Exp 2c 4 701 P2i 1,274 Exp 2d 1 735 P212,21 1,279 Exp 2e 1 735 P2i2121 1,249 Exp 2f 2 774 P1 1,257 Exp 2g 1 773 P2i2121 1,217

20

As variáveis empregadas na Tabela 1 estão definidas abaixo: T = temperatura em Centígrado para os dados cristalográficos (RT é temperatura ambiente que é aproximadamente +22QC) V = volume de célula unitária

Z1 = número de moléculas de fármaco por unidade assimétrica Vm = V(célula unitária) / Z(moléculas de fármaco por célula)

sg = grupo espacial dcalc = densidade de cristal calculada

TABELA 2

Coordenadas Atômicas para o Exemplo 2a, Forma HO,5-4

I Átomo X Y Z j Átomo X Y Z I F1 0,1718 0,5612 0,2388 | F138 0,9730 0,9700 0,6210 F2 0,1576 0,4167 0,1518 F139 1,0220 0,7300 0,6430 F3 0,1277 0,6827 0,1463 F140 0,9470 0,7710 0,5532 N7 0,3729 0,0177 -0,0187 0137 0,5289 1,1320 0,2702 N9 0,3967 0,3613 0,0716 I H10 0,3464 0,3422 0,0601 N11 0,5034 0,5324 0,1275 I H16 0,1889 -0,1347 -0,0192 N12 0,1513 -0,3723 -0,0803 H 85 0,2780 0,4332 0,1193 N15 0,2070 -0,0340 -0,0258 H88 0,4895 0,3182 0,0357 N18 0,4944 0,7660 0,2016 | H90 0,2688 -0,4938 -0,1162 023 0,3677 0,2704 -0,0786 H91 0,2791 -0,3427 -0,1635 025 0,2371 0,2420 0,0154 H 93 0,2277 0,1128 -0,0967 C82 0,2630 0,6176 0,1822 H95 0,3290 -0,0521 -0,1140 C83 0,4281 0,4888 0,1165 H99 0,3760 -0,3135 -0,0574 C84 0,3027 0,5269 0,1466 H100 0,3100 -0,3067 -0,0228 C86 0,3810 0,5754 0,1513 H102 0,5234 0,0450 0,0773 C87 0,4447 0,2515 0,0409 H103 0,4804 0,1033 0,1290 C89 0,2647 -0,3681 -0,1237 H105 0,1184 -0,0766 -0,1500 C92 0,2304 -0,0122 -0,0852 H106 0,1831 -0,0821 -0,1859 C94 0,3163 -0,0776 -0,0729 H110 0,3980 0,9063 0,2542 C96 0,4172 0,7161 0,1933 | H112 0,4292 -0,1628 0,0516 C97 0,1821 0,5681 0,1800 H113 0,3692 -0,0449 0,0742 C98 0,3221 -0,2755 -0,0632 H115 0,2715 0,8230 0,2452 C101 0,4735 0,0847 0,0816 H117 0,0540 -0,3914 -0,0071 C104 0,1724 -0,1130 -0,1448 H118 0,1047 -0,5613 -0,0042 C107 0,3915 0,1858 -0,0261 H119 0,0122 -0,5664 -0,0392 C108 0,2116 0,0919 0,0195 H121 0,0157 -0,2070 -0,1065 C109 0,3748 0,8103 0,2276 H122 -0,0438 -0,3568 -0,1418 cm 0,4081 -0,0451 0,0507 H123 0,0156 -0,2818 -0,1762 C114 0,2994 0,7605 0,2220 H126 0,1446 -0,3645 -0,1779 C116 0,0592 -0,4960 -0,0309 H128 0,5835 0,7006 0,1755 C120 0,0087 -0,3106 -0,1338 H130 0,2266 0,0448 0,1189 C124 0,0696 -0,4465 -0,0977 H131 0,1603 -0,0732 0,0701 C125 0,1783 -0,3101 -0,1359 H132 0,1430 0,1249 0,0800 C127 0,5309 0,6696 0,1690 H134 0,0091 -0,6633 -0,1497 C129 0,1827 0,0426 0,0774 H135 0,1005 -0,6984 -0,1175 C133 0,0611 -0,6143 -0,1412 H136 0,0686 -0,5851 -0,1833 F4 0,9541 0,9380 0,5714 H141 0,1830 -0,4440 -0,0580 F5 0,9826 0,6800 0,5759 H14 0,6945 1,0312 0,5339 [ Átomo X Y Z Atomo X Y Z F6 1,0259 0,8300 0,6655 H2I 0,7741 1,5073 0,4379 N8 0,6040 1,3694 0,4758 H28 0,7049 1,4602 0,3064 N13 0,6631 1,0203 0,5573 H29 0,6130 1,4814 0,2902 N17 0,7581 1,7462 0,3780 H 32 0,5464 1,0615 0,5430 N19 0,6266 0,8793 0,6383 H34 0,6724 1,6789 0,4661 N2O 0,7501 1,4082 0,4350 H35 0,5807 1,7062 0,4509 N22 0,7080 0,6517 0,7080 H 38 0,8152 0,9372 0,5749 024 0,7581 1,1336 0,4774 H41 0,5545 1,4575 0,3823 026 0,5442 1,1244 0,4164 H 44 0,5540 1,3350 0,5873 C27 0,6643 1,5023 0,3242 H45 0,6406 1,2709 0,6290 C30 0,6817 0,9034 0,6081 | H48 0,6272 1,8887 0,3818 C31 0,5921 1,1293 0,5402 H49 0,5627 1,7587 0,3377 C33 0,6205 1,6624 0,4324 H52 0,6566 1,2721 0,3752 C36 0,5758 1,2019 0,4701 I H55 0,6234 1,5433 0,5534 C37 0,8201 0,8496 0,6069 H56 0,6965 1,4170 0,5619 C39 0,7568 0,8126 0,6288 H58 0,8887 1,9136 0,4290 C40 0,6067 1,4694 0,4172 H59 0,9292 1,8759 0,3743 C42 0,8902 0,7591 0,6317 H60 0,9085 1,7203 0,4146 C43 0,6042 1,2934 0,5840 H62 0,6632 1,7578 0,2922 C46 0,7651 0,6822 0,6794 H64 0,8824 1,3038 0,5620 C47 0,6162 1,7663 0,3697 H65 0,8870 1,4370 0,5064 C50 0,8099 1,8166 0,3410 H66 0,9097 1,2396 0,5019 C51 0,6689 1,3952 0,3877 | H69 0,7263 1,9822 0,2803 C53 0,7895 1,2775 0,4740 H70 0,8132 2,0339 0,2846 C54 0,6389 1,4243 0,5469 H71 0,7823 2,0761 0,3450 C57 0,8917 1,8331 0,3947 H73 0,8374 1,5813 0,3078 C61 0,6751 1,6998 0,3362 I H74 0,8486 1,7393 0,2638 C63 0,8750 1,3182 0,5148 H75 0,7629 1,6701 0,2558 C67 0,9615 0,8066 0,6143 H77 0,8443 0,5011 0,7349 C68 0,7802 1,9934 0,3099 H79 0,9456 0,5638 0,6960 C72 0,8152 1,6904 0,2872 I H81 0,6060 0,7320 0,7067 C76 0,8381 0,5893 0,7029 H142 0,7500 1,8390 0,4090 C78 0,8982 0,6264 0,6799 H143 0,5333 1,1298 0,3123 C80 0,6445 0,7516 0,6862 H144 0,5194 1,0278 0,2538

TABELA 3

Coordenadas Atômicas para o Exemplo 2b, Forma de Base N-2

Atomo X Y Z Atomo X Y Z N1 0,7824 1,3195 0,3238 C71 0,9289 1,4591 0,5167 N2 0,1685 0,3056 -0,0178 H72 0,9378 1,4237 0,5668 H3 0,1633 0,1989 -0,0196 H73 0,9764 1,4359 0,5102 N4 0,6223 0,8215 0,1887 C74 0,8719 1,7574 0,6080 N5 0,2627 0,4840 -0,0849 C75 0,6719 1,2862 0,4846 N6 0,6868 0,9765 0,2943 H76 0,6246 1,2933 0,4390 H7 0,7030 0,9877 0,3420 H77 0,6814 1,3914 0,5103 N8 0,4185 0,9718 0,0742 H78 0,6660 1,2009 0,5162 N9 0,0989 0,0258 -0,1003 C79 0,9173 1,6199 0,6639 N10 0,7913 1,3680 0,4754 H80 0,8851 1,5217 0,6541 H11 0,7826 1,4618 0,4918 H81 0,9305 1,6578 0,7142 N12 0,5331 0,6005 0,1813 H 82 0,9647 1,5943 0,6584 N13 0,3353 0,7474 0,0475 C83 0,9176 1,9198 0,6225 I Átomo X Y Z Atomo X Y Z H14 0,3028 0,6896 0,0583 H 84 0,9680 1,8999 0,6220 N15 0,8501 1,6946 0,5311 H85 0,9252 1,9631 0,6707 N16 0,4567 1,1267 0,1887 H86 0,8887 1,9992 0,5842 017 0,7470 1,1042 0,4435 C87 0,7960 1,7901 0,6131 018 0,2114 0,7470 -0,1165 H88 0,7660 1,8705 0,5758 019 0,2229 0,5239 0,0583 H 89 0,8064 1,8325 0,6620 020 0,8588 1,0890 0,3360 H 90 0,7667 1,6881 0,6048 F21 0,5881 0,9034 0,4961 C91 0,2069 0,3753 0,0494 F22 0,4828 0,7754 0,4659 C92 0,1886 0,3981 -0,1294 F23 0,5874 0,6500 0,5199 H 93 0,1617 0,4641 -0,1751 C24 0,1049 -0,1653 -0,0049 C94 0,1345 0,3960 -0,0889 H25 0,1473 -0,2167 -0,0125 H95 0,1249 0,5115 -0,0787 H26 0,0773 -0,2487 0,0097 C96 0,3636 0,8982 0,1612 H27 0,1257 -0,0826 0,0338 C97 0,0560 0,3169 -0,1396 C28 0,0052 -0,2107 -0,1371 H 98 0,0300 0,3865 -0,1836 H29 -0,0334 -0,1565 -0,1806 H 99 0,0226 0,3123 -0,1131 H30 -0,0204 -0,2889 -0,1178 C100 0,0655 0,1409 -0,1647 H31 0,0423 -0,2685 -0,1506 H101 0,0138 0,0994 -0,1999 C32 -0,0102 0,0236 -0,0618 C102 0,2651 0,6526 -0,0801 H33 0,0176 0,1111 -0,0276 C103 0,3727 0,8727 0,0930 H34 -0,0371 -0,0447 -0,0399 C104 0,3129 0,8065 0,1831 H35 -0,0478 0,0713 -0,1077 H105 0,2826 0,7213 0,1525 C36 0,6347 0,8573 0,2590 | C106 0,4090 1,0275 0,2081 C37 0,7956 1,1614 0,3094 C107 0,1998 0,2249 -0,1544 C38 0,5429 0,6399 0,2526 H108 0,2268 0,1548 -0,1108 C39 0,5969 0,8058 0,3661 H109 0,2321 0,2314 -0,1820 H40 0,6303 0,8901 0,3943 C110 0,0479 -0,0823 -0,0781 C41 0,5928 0,7673 0,2949 C111 0,3943 0,5437 -0,0102 C42 0,7174 1,0886 0,2543 H112 0,4319 0,5306 0,0416 H43 0,7243 1,0288 0,2140 ι H113 0,4226 0,5469 -0,0417 C44 0,8437 1,4188 0,3806 C114 0,1202 0,1477 -0,2041 H45 0,8919 1,4020 0,3733 H115 0,0955 0,2128 -0,2496 C46 0,8266 1,6034 0,3730 | H116 0,1283 0,0355 -0,2179 H47 0,7791 1,6255 0,3797 C117 0,3076 0,8411 0,2485 H48 0,8177 1,6396 0,3230 C118 0,2292 0,2619 0,1158 C49 0,5524 0,7201 0,3942 H119 0,2846 0,2720 0,1469 C50 0,6668 1,2414 0,2237 H120 0,2172 0,1487 0,0989 H51 0,6690 1,2785 0,1776 H121 0,2001 0,2924 0,1441 H 52 0,6125 1,2182 0,2137 C122 0,3349 0,4024 -0,0337 C53 0,8609 1,3569 0,4595 H123 0,3502 0,3144 -0,0588 H54 0,8773 1,2398 0,4636 H124 0,3290 0,3556 0,0092 C55 0,4991 0,5496 0,2836 C125 0,3458 0,7009 -0,0200 H56 0,4668 0,4624 0,2569 H126 0,3682 0,7937 -0,0371 C57 0,7010 1,3718 0,2841 C127 0,4561 1,0941 0,1233 H58 0,6975 1,4822 0,2628 H128 0,4859 1,1659 0,1085 H59 0,6744 1,3722 0,3171 C129 0,4030 1,0567 0,2762 C60 0,9137 1,6472 0,5099 H130 0,4339 1,1390 0,3084 H61 0,9621 1,7039 0,5438 C131 0,2548 0,7395 0,2713 C62 0,7404 1,2441 0,4666 C132 0,3536 0,9679 0,2955 C63 0,5039 0,5898 0,3526 H133 0,3500 0,9907 0,3403 H 64 0,4747 0,5300 0,3726 F134 0,1847 0,7359 0,2156 C65 0,5722 0,6959 0,1556 F135 0,2364 0,8060 0,3220 H 66 0,5642 0,6734 0,1065 F136 0,2859 0,5920 0,2960 C67 0,8949 1,7014 0,4308 F137 0,1977 0,8329 0,2710 Átomo X Y Z Atomo X Y Z H68 0,9412 1,6866 0,4211 F138 0,2168 0,6170 0,2301 H69 0,8818 1,8193 0,4256 F139 0,2934 0,6790 0,3395 C70 0,5532 0,7632 0,4678 H140 0,8280 1,7679 0,5060 H141 0,1330 -0,0400 -0,1062

TABELA 4

Coordenadas Atômicas para o Exemplo 2c, Forma de Base H1,75-5

| Átomo X Y Z j Átomo X Y Z C1 0,3942 0,1176 0,2183 C51 0,6094 0,0443 -0,0547 C2 0,2287 0,1174 0,0897 C52 0,6750 0,0382 0,0420 N3 0,1192 0,1293 0,0594 C53 0,9963 0,1572 0,4974 N4 0,1798 0,0501 0,1322 C54 0,7176 -0,0005 0,0684 N5 0,3753 0,0509 0,2822 C55 1,1985 0,0503 0,7049 N6 -0,0927 0,1070 -0,1055 C56 1,1539 0,1133 0,4965 N7 -0,3691 0,1154 -0,3165 I C57 1,0229 0,1608 0,6162 N8 -0,2260 0,1440 -0,1970 C58 1,0367 0,1185 0,4572 09 0,1323 0,1298 -0,1137 C59 0,7341 0,1669 0,3280 010 0,0301 0,0456 0,0130 C60 1,1829 0,1168 0,6162 C11 0,0785 0,1332 -0,0419 C61 1,1435 0,1563 0,6496 C12 0,2431 0,0735 0,0697 C62 0,5636 0,1744 0,0306 C13 -0,2272 0,0747 -0,2281 C63 0,6973 0,1581 0,4320 C14 0,0812 0,0382 0,0995 C64 0,7972 0,1517 0,5115 C15 0,4135 0,0738 0,2008 C65 1,3015 0,0605 0,7775 C16 0,2774 0,1283 0,2010 C66 1,2257 0,0279 0,6122 C17 0,3592 0,0623 0,0929 C67 1,1287 0,0258 0,7652 C18 -0,3242 0,0799 -0,2978 C68 0,9017 0,0664 0,4282 C19 -0,1859 -0,0329 -0,2601 C69 0,8592 0,0308 0,4749 C20 -0,3192 0,1441 -0,2671 F70 0,7706 -0,0040 0,1659 C21 -0,1804 0,1091 -0,1748 F71 0,7890 -0,0119 0,0101 C22 -0,1842 0,0372 -0,2149 F72 0,6477 -0,0283 0,0583 C23 0,0394 0,1336 0,1281 N 73 0,7366 0,2979 0,1640 C24 -0,3330 0,0112 -0,3340 N74 0,9286 0,2769 0,3415 C25 -0,2347 0,0067 -0,2683 N75 0,9490 0,3548 0,4399 C26 0,0308 0,0146 0,1792 N76 0,6679 0,2686 0,0076 C27 -0,3753 0,0465 -0,3473 N 77 0,5468 0,3015 -0,1239 C28 -0,0381 0,1410 -0,0545 N78 1,1302 0,3587 0,6021 C29 0,4391 0,0161 0,3216 079 0,7689 0,2552 0,3756 C30 0,4331 -0,0152 0,2365 080 0,8000 0,3561 0,3182 C31 -0,0565 0,1490 0,0571 C81 0,6779 0,3005 0,0685 C32 0,5574 0,0267 0,3640 C82 0,8021 0,2636 0,1953 C33 0,3907 0,0006 0,4127 C83 0,6253 0,3363 0,0330 F34 -0,1107 -0,0374 -0,1835 C84 0,8293 0,2641 0,3145 F35 -0,1514 -0,0419 -0,3469 C85 0,9704 0,2829 0,4523 F36 -0,2560 -0,0605 -0,2519 C86 0,9612 0,3232 0,6101 N37 0,9782 0,0854 0,4895 C87 1,0815 0,3238 0,6395 N38 0,8832 0,1624 0,4564 C88 0,6395 0,3717 0,0871 N39 0,6198 0,1729 0,1273 C89 0,9221 0,3194 0,4932 N40 0,7167 0,1350 0,2533 C90 0,5107 0,3694 -0,1081 N41 0,5429 0,1472 -0,0401 C91 0,5605 0,3350 -0,0649 N42 1,1331 0,0855 0,6708 C92 0,6021 0,2715 -0,0843 043 0,9140 0,1821 0,2960 C93 0,5266 0,4037 -0,0538 I Átomo X Y Z I Átomo X Y Z 044 0,8654 0,0771 0,3382 C94 0,9119 0,2659 0,1620 C45 0,8542 0,1720 0,3563 C95 0,5911 0,4051 0,0443 C46 0,5876 0,1117 -0,0112 C96 1,1535 0,3924 0,6738 C47 0,6629 0,1387 0,1561 I C97 0,6068 0,4429 0,0984 C48 0,6954 0,0688 0,1114 C98 0,8832 0,3710 0,3595 C49 0,6512 0,1060 0,0865 C99 1,0912 0,2839 0,4757 C50 0,5679 0,0801 -0,0813 C100 1,1264 0,2872 0,5933 C101 0,9810 0,2861 0,2520 0151 0,4292 0,1756 0,7593 C102 0,9190 0,4094 0,3235 0152 0,3473 0,1636 0,8339 C103 1,0516 0,4113 0,6921 H153 0,4310 0,1254 0,2979 C104 1,2130 0,3807 0,7821 H154 0,4349 0,1341 0,1645 C105 1,2167 0,4208 0,6206 | H155 0,2779 0,1337 0,0447 F106 0,6836 0,4427 0,1806 H156 0,2164 0,0417 0,2100 F107 0,5186 0,4543 0,1375 H157 0,3714 0,0703 0,3474 F108 0,6281 0,4715 0,0364 H158 -0,0576 0,0785 -0,0868 N109 0,3031 0,2523 0,0895 H159 0,2173 0,0675 -0,0123 N110 0,3202 0,3294 0,1970 H160 0,4992 0,0681 0,2061 N111 0,5022 0,3356 0,3522 H161 0,2372 0,1127 0,2569 N112 0,0946 0,2741 -0,0674 H162 0,2676 0,1594 0,2134 N113 -0,0336 0,2377 -0,1697 H163 0,3639 0,0302 0,0854 N114 -0,2016 0,2650 -0,2433 H164 0,4006 0,0751 0,0350 0115 0,1682 0,3314 0,0829 H165 -0,3534 0,1727 -0,2828 0116 0,1499 0,2237 0,1243 H166 -0,1099 0,0321 -0,1626 C117 0,2052 0,2373 0,0644 H167 0,0215 0,1059 0,1611 C118 0,2992 0,2930 0,2475 I H168 0,0659 0,1539 0,1907 C119 -0,0515 0,3401 -0,0764 H169 -0,3750 -0,0142 -0,3730 C120 0,3416 0,2960 0,3644 H170 -0,0484 0,0061 0,1467 C121 -0,1222 0,3701 -0,0923 H171 0,0783 -0,0115 0,2000 C122 0,4698 0,2615 0,2174 H172 0,0297 0,0317 0,2489 C123 -0,1737 0,2997 -0,1931 | H173 -0,4526 0,0496 -0,3983 C124 -0,0044 0,2713 -0,1206 H174 -0,0573 0,1673 -0,1021 C125 -0,2438 0,3311 -0,2090 H175 0,4770 -0,0409 0,2650 C126 -0,0754 0,3040 -0,1278 H176 0,3484 -0,0242 0,2146 C127 0,1701 0,2420 -0,0535 H177 0,4596 -0,0045 0,1679 C128 0,3488 0,2578 0,2007 H178 -0,1282 0,1348 0,0707 C129 0,5097 0,2640 0,3350 I H179 -0,0650 0,1804 0,0686 C130 0,4624 0,2986 0,3883 H180 0,5963 -0,0009 0,3924 C131 -0,0968 0,4077 -0,0362 H181 0,5930 0,0381 0,3032 C132 0,3460 0,2683 0,0015 H182 0,5596 0,0461 0,4284 C133 -0,1317 0,2372 -0,2271 H183 0,4332 -0,0251 0,4433 C134 0,5253 0,3677 0,4289 H184 0,3902 0,0220 0,4712 C135 -0,2190 0,3662 -0,1602 H185 0,3084 -0,0081 0,3820 C136 0,2745 0,2511 -0,0941 H186 0,9987 0,0754 0,5691 C137 0,5618 0,4023 0,3689 H187 0,7487 0,1066 0,2786 C138 0,6152 0,3567 0,5186 H188 1,1096 0,0983 0,7400 C139 0,4264 0,3788 0,4754 H189 0,7448 0,0641 0,1858 C140 0,2540 0,3461 0,1186 H190 0,5192 0,0845 -0,1565 C141 0,2900 0,3831 0,0758 H191 0,5930 0,0200 -0,1086 F142 0,0020 0,4176 -0,0257 H192 1,0402 0,1792 0,4633 F143 -0,1497 0,4372 -0,0806 H193 1,1791 0,0849 0,4744 F144 -0,1239 0,4079 0,0550 H194 1,1975 0,1355 0,4619 0145 0,4346 0,1106 0,5123 H195 0,9975 0,1890 0,6409 0146 0,1371 0,2037 0,3256 H196 0,9825 0,1382 0,6530 0147 0,6629 0,2454 0,5702 | H197 1,0259 0,1190 0,3726 [ Átomo X Y Z Atomo X Y Z 0148 0,4523 0,2291 0,5970 H198 0,6972 0,1932 0,2915 0149 0,3986 0,3042 0,6776 H199 1,2687 0,1146 0,6366 0150 0,3459 0,1840 0,4326 H2OO 1,1831 0,1795 0,6123 H2OI 1,1631 0,1593 0,7328 H251 1,1684 0,4299 0,5453 H202 0,5306 0,2029 0,0082 H252 0,3950 0,3437 0,2241 H203 0,6519 0,1824 0,4545 H253 0,5749 0,3293 0,3230 H204 0,6483 0,1323 0,4245 H254 0,1193 0,3022 -0,0335 H205 0,8029 0,1216 0,5375 H255 0,2147 0,2880 0,2355 H206 0,7957 0,1702 0,5801 H256 0,0233 0,3437 -0,0249 H207 1,3466 0,0340 0,8006 H257 0,3083 0,3215 0,3958 H208 1,3500 0,0795 0,7383 H258 0,3160 0,2703 0,4028 H209 1,2843 0,0747 0,8476 H259 0,5050 0,2366 0,1841 H2IO 1,2710 0,0024 0,6388 H260 0,4927 0,2878 0,1790 H211 1,1517 0,0185 0,5635 H261 -0,3192 0,3277 -0,2606 H212 1,2687 0,0462 0,5671 H262 0,1323 0,2153 -0,0854 H213 1,1703 -0,0007 0,7926 H263 0,3327 0,2320 0,2439 H214 1,1105 0,0421 0,8313 I H264 0,4885 0,2372 0,3700 H215 1,0556 0,0182 0,7149 H265 0,5951 0,2670 0,3470 H216 0,7976 0,0176 0,4203 H266 0,4874 0,2957 0,4712 H217 0,9226 0,0100 0,4973 | H267 0,3419 0,2998 0,0019 H218 0,8269 0,0390 0,5453 H268 0,4278 0,2594 0,0040 H219 0,7349 0,3217 0,2190 H269 -0,1537 0,2100 -0,2663 H220 1,0259 0,3684 0,4660 H270 -0,2738 0,3905 -0,1734 H221 1,2052 0,3497 0,5802 H271 0,3087 0,2249 -0,1215 H222 0,7595 0,2370 0,1705 H272 0,2609 0,2719 -0,1576 H223 0,9510 0,2576 0,4964 H273 0,5805 0,4266 0,4203 H224 0,9305 0,2994 0,6498 H274 0,6328 0,3938 0,3368 H225 0,9306 0,3505 0,6365 H275 0,5006 0,4101 0,3051 H226 1,1023 0,3226 0,7234 H276 0,6311 0,3804 0,5741 H227 0,6892 0,3732 0,1634 | H277 0,5931 0,3310 0,5600 H228 0,8361 0,3164 0,4802 H278 0,6878 0,3500 0,4880 H229 0,4622 0,3687 -0,1842 H279 0,4455 0,4020 0,5307 H230 0,5955 0,2449 -0,1310 I H280 0,3644 0,3877 0,4139 H231 0,4887 0,4301 -0,0865 H281 0,4001 0,3535 0,5147 H232 0,9411 0,2373 0,1483 H282 0,2315 0,3935 0,0139 H233 0,9065 0,2830 0,0906 H283 0,3050 0,4046 0,1373 H234 1,1232 0,2576 0,4474 H284 0,3642 0,3778 0,0457 H235 1,1194 0,3088 0,4371 H297 0,5031 0,1166 0,5720 H236 1,2129 0,2887 0,6081 H298 0,4013 0,1383 0,4827 H237 1,1010 0,2618 0,6307 H291 0,1415 0,2116 0,2456 H238 0,9841 0,3173 0,2399 H292 0,0561 0,1944 0,3301 H239 1,0614 0,2747 0,2630 H285 0,7189 0,2533 0,6386 H240 0,8608 0,4208 0,2603 H286 0,7007 0,2488 0,5014 H241 0,9250 0,4304 0,3884 H287 0,4531 0,2087 0,6605 H242 0,9943 0,4069 0,2987 H288 0,5334 0,2354 0,5869 H243 1,0681 0,4363 0,7411 H289 0,4187 0,2763 0,6478 H244 1,0091 0,4217 0,6147 H290 0,4459 0,3091 0,7532 H245 1,0017 0,3911 0,7227 H293 0,3695 0,2054 0,4921 H246 1,2276 0,4062 0,8315 H294 0,2663 0,1913 0,3921 H247 1,1658 0,3601 0,8194 H295 0,4701 0,1653 0,8329 H248 1,2882 0,3671 0,7752 H296 0,4645 0,1639 0,6962 H249 1,2341 0,4465 0,6673 H299 0,2731 0,1523 0,8513 H250 1,2881 0,4078 0,6030 H300 0,4117 0,1542 0,8909 TABELA 5

Coordenadas Atômicas para o Exemplo 2e, Forma de Base E-1

| Átomo X Y Z Atomo X Y Z F18 0,2662 0,4002 0,0274 F23 0,0301 0,3722 0,0039 F19 0,0473 0,4191 0,0033 C18 0,1648 0,3165 0,0297 F20 0,1401 0,2386 0,0059 H31 0,2375 0,5477 0,2387 02 0,3035 0,7582 0,1985 H41 0,5018 0,4801 0,2585 028 0,4277 0,5819 0,1087 H42 0,4761 0,3850 0,2161 N1 0,5559 0,6627 0,1978 H51 0,6480 0,5043 0,1733 N6 0,2412 0,4989 0,1766 H52 0,7376 0,5463 0,2204 N8 0,0422 0,3993 0,2139 | H61 0,2881 0,5282 0,1472 N10 -0,1606 0,2714 0,1828 H91 -0,1519 0,3157 0,2435 N27 0,6744 0,6813 0,1115 H111 -0,2586 0,1707 0,1140 N29 0,9824 0,8036 0,1064 I H121 -0,1207 0,1964 0,0469 C2 0,3877 0,6687 0,2028 | H141 0,2343 0,4431 0,0976 C3 0,3235 0,5438 0,2136 H211 0,5921 0,8399 0,1984 C4 0,4822 0,4775 0,2252 H221 0,4827 0,7942 0,1303 C5 0,6231 0,5426 0,2028 H231 0,6846 0,8993 0,0877 C7 0,1130 0,4242 0,1780 I H232 0,6444 0,9699 0,1348 C9 -0,0900 0,3261 0,2139 H241 0,9421 0,9813 0,1221 C11 -0,1488 0,2295 0,1107 H251 1,0517 0,8711 0,1826 C12 -0,0761 0,2450 0,0735 H252 0,8644 0,9484 0,1930 C13 0,0600 0,3235 0,0687 I H261 0,8551 0,7433 0,2231 C14 0,1243 0,3844 0,1017 | H262 0,8872 0,6821 0,1741 C15 -0,0857 0,2914 0,1453 H271 0,8051 0,6804 0,1028 C16 0,0498 0,3680 0,1409 H291 1,0794 0,7695 0,1261 C17 0,1207 0,3503 0,0270 H294 0,7893 0,5312 0,0656 C21 0,6470 0,7650 0,1817 I H292 0,6583 0,4189 0,0854 C22 0,6168 0,7817 0,1361 H293 0,5951 0,5011 0,0421 C23 0,7030 0,8953 0,1212 H311 0,9885 0,9169 0,0098 C24 0,8922 0,8952 0,1304 H312 0,8322 0,8277 0,0324 C25 0,9185 0,8727 0,1765 H313 0,8750 0,9701 0,0523 C26 0,8353 0,7590 0,1910 J H321 1,2632 0,9515 0,0466 C28 0,5782 0,5936 0,0987 H 322 1,1556 1,0063 0,0897 C29 0,6596 0,5024 0,0711 H 323 1,2983 0,8878 0,0951 C30 1,0633 0,8393 0,0676 H331 1,1943 0,7459 0,0197 C31 0,9326 0,8931 0,0389 H332 1,2251 0,6857 0,0690 C32 1,2044 0,9276 0,0745 H333 1,0345 0,6616 0,0430 C33 1,1314 0,7245 0,0492 H971 -0,8355 0,1305 0,1615 099 -0,4402 0,1232 0,1894 H 972 -0,7164 0,0043 0,1747 C97 -0,7313 0,0985 0,1797 H 973 -0,7551 0,1157 0,2115 C98 -0,5812 0,1608 0,1676 H981 -0,5951 0,2544 0,1716 F21 0,3052 0,3620 0,0283 H 982 -0,5565 0,1430 0,1349 F22 0,1907 0,2403 0,0143 H991 -0,3383 0,1855 0,1847

TABELA 6

Coordenadas Atômicas para o Exemplo 2d, Forma de Base HAC-1

Atomo X Y Z | Átomo X Y Z C1 0,0418 0,3612 0,1413 H 32 -0,1504 0,2133 0,0512 N2 -0,1614 0,2566 0,1827 H2I 0,2024 0,4361 0,1001 N3 0,5574 0,6476 0,1969 I H19 -0,2633 0,1786 0,1141 I Átomo X Y Z Atomo X Y Z 04 0,4002 0,5938 0,1104 H15 -0,1260 0,2877 0,2400 N5 0,0480 0,3793 0,2136 H6 0,2703 0,5248 0,1514 N6 0,2349 0,4911 0,1766 H14 0,2507 0,5355 0,2354 N7 0,6581 0,6819 0,1120 H25A 0,5017 0,4595 0,2502 09 0,3141 0,7518 0,2032 H25B 0,4643 0,3765 0,2131 C10 0,6548 0,7519 0,1823 H22A 0,6302 0,4915 0,1724 C11 0,1091 0,4116 0,1779 H22B 0,7255 0,5203 0,2124 C12 0,6143 0,7805 0,1389 H10 0,6208 0,8184 0,1990 C13 -0,0977 0,2822 0,1453 H12 0,4961 0,7944 0,1361 C14 0,3251 0,5321 0,2128 H31A 0,7369 0,5221 0,0663 C15 -0,0849 0,3037 0,2135 H31B 0,5607 0,5108 0,0459 C16 0,5496 0,5972 0,0993 H31C 0,6086 0,4250 0,0815 C17 0,8422 0,7397 0,1888 H17A 0,8651 0,7215 0,2164 N18 0,9734 0,7976 0,1050 H17B 0,8826 0,6751 0,1722 C19 -0,1674 0,2302 0,1113 H23A 0,6885 0,9061 0,0978 C20 0,0380 0,3268 0,0698 H23B 0,6640 0,9626 0,1405 C21 0,1085 0,3827 0,1029 H28A 0,8869 0,9177 0,1920 C22 0,6188 0,5229 0,1991 H28B 1,0495 0,8473 0,1796 C23 0,7063 0,8942 0,1260 H27 0,9448 0,9635 0,1263 C24 0,3943 0,6572 0,2042 H18 1,0626 0,7570 0,1189 C25 0,4808 0,4583 0,2218 H39A 1,2479 0,9507 0,0498 C27 0,8951 0,8864 0,1321 | H39B 1,2853 0,8792 0,0894 C28 0,9305 0,8535 0,1757 H39C 1,1647 0,9911 0,0903 F29 0,2449 0,4047 0,0277 H38A 0,9706 0,9352 0,0175 C30 1,0501 0,8412 0,0669 H38B 0,8802 0,9740 0,0573 C31 0,6205 0,5052 0,0708 | H38C 0,8310 0,8527 0,0360 C32 -0,1018 0,2511 0,0743 H40A 1,1575 0,7492 0,0195 C33 0,1058 0,3467 0,0300 H40B 1,0092 0,6805 0,0403 F36 0,1168 0,2494 0,0085 H40C 1,1861 0,6845 0,0608 F37 0,0041 0,4132 0,0068 I H7 0,7708 0,6743 0,1022 C38 0,9217 0,9066 0,0421 H35A -0,8134 0,1022 0,1656 C39 1,2014 0,9229 0,0747 H35B -0,7586 0,1045 0,2107 C40 1,1073 0,7290 0,0448 H35C -0,7035 -0,0029 0,1830 08 -0,4446 0,1296 0,1963 H8 -0,3548 0,1817 0,1876 C26 -0,5724 0,1491 0,1735 034 -0,5673 0,2213 0,1458 C35 -0,7251 0,0824 0,1840 | ΓΑΒΕίΑ 7 Coordenadas Atômicas para o Exemplo 2g, Forma de Base IPA-1 Atomo X Y Z Atomo X Y Z F1 0,1519 0,3786 0,0243 H4B 0,8724 0,7912 0,1232 F3 -0,0140 0,2540 -0,0043 H3 0,6171 0,6809 0,1026 F2 0,0260 0,4241 0,0085 H1 0,1162 0,5505 0,1460 N4 0,8062 0,8075 0,1016 H10 0,3362 0,7935 0,1099 N3 0,5159 0,6834 0,1054 H9 0,3991 0,8799 0,1736 N2 0,3481 0,7197 0,1890 H6A 0,4782 0,9618 0,1051 N1 0,0675 0,5440 0,1700 H6B 0,5369 0,8805 0,0686 N5 -0,1311 0,4643 0,2095 H22 0,0665 0,4473 0,0929 N6 -0,2941 0,3121 0,1828 H5 0,7491 0,9735 0,1042 01 0,1140 0,8031 0,1697 H2I -0,3360 0,1865 0,1167 02 0,2925 0,5779 0,1031 H12A 0,5507 0,4357 0,0989 C10 0,4463 0,7911 0,1197 | H12B 0,6252 0,5211 0,0660 I Átomo X Y Z Atomo X Y Z C9 0,4471 0,8051 0,1677 H12C 0,4678 0,4565 0,0549 C4 0,9030 0,8194 0,0629 H8A 0,6698 0,7392 0,1786 C24 -0,0632 0,3232 0,0669 H8B 0,6137 0,8216 0,2153 C19 -0,0909 0,3946 0,1378 H16 0,0302 0,6334 0,2243 C6 0,5348 0,8912 0,0992 H13A 0,4882 0,6277 0,2283 C20 -0,2139 0,3158 0,1454 H13B 0,4421 0,5607 0,1863 C11 0,4342 0,5879 0,0964 H3B 0,9771 0,9859 0,0712 C22 -0,0159 0,3962 0,0980 H3C 1,0944 0,9144 0,0431 C5 0,7048 0,9021 0,1156 H3D 1,0915 0,8973 0,0926 C17 -0,0508 0,4684 0,1726 H23 -0,2112 0,1922 0,0537 C21 -0,2559 0,2399 0,1123 H18 -0,3052 0,3848 0,2368 C14 0,1869 0,7250 0,1863 H2A 0,7158 0,7853 0,0234 C12 0,5279 0,4917 0,0774 H2B 0,8604 0,8380 -0,0010 C8 0,6155 0,8107 0,1847 H2C 0,7518 0,9169 0,0270 C16 0,1187 0,6161 0,2052 H7A 0,6551 0,9825 0,1718 C13 0,4041 0,6134 0,2080 H7B 0,8129 0,9118 0,1736 C3 1,0281 0,9129 0,0679 H1A 1,0319 0,6803 0,0846 C23 -0,1824 0,2437 0,0749 H1B 1,0662 0,7077 0,0366 C18 -0,2485 0,3861 0,2114 H1C 0,9087 0,6458 0,0495 C2 0,7981 0,8420 0,0246 H15A 0,2542 0,5916 0,2593 C7 0,7045 0,9108 0,1635 H15B 0,2564 0,4841 0,2288 C1 0,9852 0,7023 0,0579 H3A -0,4990 0,1985 0,1863 C15 0,2577 0,5672 0,2298 H27 -0,6926 0,2734 0,1759 C25 0,0153 0,3263 0,0246 H26A -0,7745 0,0861 0,1320 F4 0,1640 0,2980 0,0315 H26B -0,6492 0,1771 0,1173 F5 -0,0739 0,3770 -0,0036 H26C -0,8259 0,2136 0,1243 F6 0,0440 0,2214 0,0112 H28A -0,8028 0,1216 0,2237 03 -0,5666 0,1486 0,1890 H28B -0,9203 0,1527 0,1868 C27 -0,7093 0,1903 0,1763 H28C -0,8515 0,2497 0,2160 C26 -0,7420 0,1648 0,1343 C28 -0,8290 0,1780 0,2024 C29 -0,8460 0,1070 0,1744 C30 -0,6990 0,2550 0,1410 fABELA8 Coordenadas Atômicas para o Exemplo 2f, :orma Básica RPG-3 Átomo X Y Z Átomo X Y Z F1 1,4700 0,5720 0,6614 N2 0,6350 0,3813 0,3765 F7 1,4119 0,5575 0,7000 N6 0,2687 0,8628 0,3992 F2 1,4315 0,5398 0,7741 N4 0,3398 0,7349 0,3149 F8 1,5600 0,5336 0,8131 N1 0,8898 0,3354 0,4598 F3 1,6320 0,5630 0,7860 N5 0,0527 0,9107 0,3489 F9 1,6111 0,5864 0,6960 C12 0,4202 0,2078 0,3911 N9 0,7997 -0,0295 0,8348 01 0,6129 0,7507 0,2839 N8 0,7989 0,1232 0,9974 C10 0,7273 0,4981 0,3447 I Átomo X Y Z Átomo X Y Z N11 1,1628 -0,0946 0,6829 C6 0,8597 0,4735 0,3332 N10 1,0937 0,0679 0,7424 C9 0,7661 0,6239 0,4071 N7 0,5331 0,0253 1,0441 C20 0,1173 0,7695 0,2548 N12 1,3802 -0,0414 0,6342 C19 0,0264 0,8385 0,2716 03 0,8190 0,0931 0,7142 C5 0,9561 0,4627 0,4193 04 1,0177 0,2159 0,9737 C17 0,2435 0,7914 0,3234 C34 0,7187 0,1296 0,9094 C8 0,8573 0,6109 0,4957 C45 1,3119 0,1383 0,6926 02 0,4273 0,3887 0,2980 C37 0,6769 0,0002 0,8509 C24 -0,0460 0,6680 0,1174 C30 0,4799 0,0412 0,9508 C16 0,4606 0,7449 0,3864 C42 1,1869 0,0349 0,7058 C22 0,0802 0,6875 0,1776 C31 0,5850 0,1596 0,9161 C14 0,5786 0,7190 0,3544 C49 1,4737 0,3643 0,7029 C7 0,9892 0,5850 0,4828 C33 0,5750 -0,1179 0,8869 C23 -0,1359 0,7367 0,1342 C47 1,3487 0,2751 0,7153 C18 0,1707 0,9200 0,4061 C40 0,8584 0,0198 0,7679 C25 -0,0848 0,5788 0,0372 C32 0,4447 -0,0846 0,8933 C13 0,5736 0,6259 0,4906 C41 0,9773 -0,0327 0,7663 C21 -0,1010 0,8179 0,2096 C39 1,0115 -0,0750 0,8618 C4 0,9438 0,1985 0,3554 C35 0,9405 0,1730 1,0250 C3 0,9469 0,2256 0,4509 C38 0,8681 -0,1166 0,8863 C15 0,4317 0,6466 0,4565 C28 0,4760 0,0765 1,1130 C2 1,0956 0,2572 0,5066 C43 1,2625 -0,1234 0,6483 C11 0,4953 0,3347 0,3508 C44 1,4064 0,0935 0,6556 C1 0,8466 0,1026 0,4843 C46 1,5338 0,1870 0,6430 F4 -0,1040 0,4554 0,0598 C48 1,5649 0,3202 0,6666 F5 0,0211 0,6100 -0,0030 C36 1,0000 0,1703 1,1211 F6 -0,1869 0,5900 -0,0238 C29 0,5552 0,0482 1,2020 F10 -0,2221 0,5070 0,0190 C27 0,3192 0,0052 1,1006 F11 -0,0370 0,4791 0,0400 C26 0,5156 0,2276 1,1108 F12 -0,0360 0,6334 -0,0302 I Átomo X Y Z Átomo X Y Z C50 1,5103 0,5068 0,7292 07 0,3015 0,5242 0,1820 N3 0,6420 0,6560 0,4169 08 0,5067 0,7155 0,1016 C55 0,4573 0,5719 0,0792 H12C 0,3410 0,1518 0,3473 C56 0,3131 0,5089 0,0936 H10A 0,6770 0,5138 0,2867 C54 0,4592 0,5517 -0,0152 H6A 0,8326 0,3912 0,2958 05 1,1135 0,3136 0,8309 H6B 0,9113 0,5467 0,3027 06 0,9224 0,3638 0,6775 H9 0,8236 0,6994 0,3801 C52 0,9658 0,4383 0,7607 H95 1,0446 0,4603 0,4067 C53 1,0998 0,4403 0,8150 H8B 0,8035 0,5371 0,5249 C51 0,9706 0,5801 0,7445 H8C 0,8845 0,6928 0,5336 H8 0,7521 0,0843 1,0354 H16 0,4967 0,8363 0,4153 H10 1,1043 0,1515 0,7516 H22 0,1413 0,6448 0,1660 H34 0,7767 0,2034 0,8813 H7A 1,0479 0,6636 0,4601 H37 0,6246 0,0147 0,7931 H77B 1,0425 0,5720 0,5399 H30 0,3926 0,0620 0,9462 H23 -0,2199 0,7261 0,0931 H31A 0,5395 0,1776 0,8580 H18 0,1897 0,9731 0,4584 H31B 0,6110 0,2396 0,9557 H13A 0,6288 0,6865 0,5425 H33A 0,5480 -0,1985 0,8476 H13B 0,5604 0,5340 0,5057 H33B 0,6213 -0,1349 0,9450 H2I -0,1626 0,8605 0,2204 H47 1,2884 0,3066 0,7391 H4A 0,8479 0,1679 0,3217 H32A 0,3953 -0,0742 0,8343 H4B 0,9856 0,1305 0,3502 H32B 0,3818 -0,1587 0,9172 H4C 0,9960 0,2797 0,3330 H41 0,9434 -0,1120 0,7240 H15A 0,3587 0,5626 0,4312 H39A 1,0471 -0,1496 0,8633 H15B 0,4034 0,6838 0,5038 H39B 1,0801 -0,0006 0,9013 H2A 1,1552 0,3410 0,4913 H38A 0,8152 -0,2110 0,8689 H2B 1,1310 0,1867 0,4955 H38B 0,8786 -0,0998 0,9495 H2C 1,0948 0,2640 0,5683 H43 1,2434 -0,2140 0,6327 H1A 0,8496 0,1213 0,5456 H46 1,5955 0,1582 0,6190 H1B 0,8758 0,0261 0,4785 H48 1,6483 0,3822 0,6582 H1C 0,7522 0,0839 0,4497 Átomo X Y Z Átomo X Y Z H36A 1,0650 0,1213 1,1285 H99 0,9009 0,3500 0,5070 H36B 0,9249 0,1270 1,1498 H7 0,3628 0,5029 0,2157 H36C 1,0484 0,2607 1,1471 H8A 0,5335 0,7307 0,1555 H29A 0,5101 -0,0427 1,2144 H55 0,5214 0,5322 0,1164 H29B 0,5546 0,1090 1,2479 H56A 0,2502 0,5475 0,0555 H29C 0,6509 0,0606 1,1995 H56B 0,2814 0,4136 0,0755 H27A 0,2727 0,0063 1,0399 H54A 0,4034 0,5980 -0,0510 H27B 0,2829 0,0501 1,1386 H54B 0,4208 0,4574 -0,0335 H27C 0,3022 -0,0863 1,1155 H54C 0,5546 0,5867 -0,0221 H26A 0,6150 0,2666 1,1142 H5 1,0835 0,2863 0,8748 H26B 0,4925 0,2636 1,1602 H6 0,9213 0,2865 0,6847 H26C 0,4641 0,2486 1,0564 I H52 0,8933 0,3997 0,7941 H100 0,5160 -0,0550 1,0510 H53A 1,1740 0,4907 0,7866 H2 0,6741 0,3386 0,4153 H53B 1,1148 0,4884 0,8717 H4 0,3295 0,6914 0,2656 H51A 1,0458 0,6226 0,7158 H12A 0,3879 0,2319 0,4404 H51B 0,9866 0,6294 0,8002 H12B 0,4843 0,1597 0,4113 H51C 0,8826 0,5788 0,7073

TABELA 9

Posições de pico de difração de raios X de pó características (graus 2Θ±0,1) @ temperatura ambiente para os Exemplos 2a, b, d, c, d, e, f, e g com base em um padrão de qualidade alto coletadas com um difratômetro (CuKa) com um tubo capilar giratório com 2Θ calibrado com um NIST outro padrão ade- quado__

Exp 2a Exp 2b Exp 2c Exp 2d Exp 2e Exp 2f Exp 2g 5,2 5,5 5,1 5,3 5,4 6,3 6,9 7,9 9,1 6,9 9,6 9,4 9,0 8,7 17,1 12,1 7,4 13,7 11,2 11,7 9,8 17,6 14,0 10,2 14,7 13,7 15,0 10,3 19,6 19,2 18,0 19,5 19,1 17,6 11,8 CARACTERÍSTICAS FARMACOLÓGICAS COMPARATIVAS TABELA 9

Posições de pico de difração de raio-x de pó característico (graus 2Θ10.1 )@ RT para os Exemplos 2a, b, d, c, d, e, f, e g com base em um padrão de alta qualidade co comu um difactômetro (CuKa) com um capi- lar rotatório com 2Θ calibrado com um outro padrão adequado NIST

Exp 2a Exp 2b Exp 2c Exp 2d Exp 2e Exp 2f Exp 2g 5,2 5,5 5,1 5,3 5,4 6,3 6,9 7,9 9,1 6,9 9,6 9,4 9,0 8,7 17,1 12,1 7,4 13,7 11,2 11,7 9,8 17,6 14,0 10,2 14,7 13,7 15,0 10,3 19,6 19,2 18,0 19,5 19,1 17,6 11,8

CARACTERÍSTICAS FARMACOLÓGICAS COMPARATIVAS

Ensaios e dados comparando características farmacológicas de Exemplo 1 e compostos encontrados no W02005021500 (correspondendo à Patente dos Estados Unidos nQ 7.163.937, designadas para o presente Requerente) apresentados abaixo.

Ligação de célula mononuclear de sangue periférico humana ("Ligação de CCR2")

Veja, por exemplo, Yoshimura e outro, J. Immunol. 1990, 145,

292. O ensaio de ligação de CCR2 humano foi estabelecido com células mononucleares de sangue periférico humanas (hPBMCs) utilizando 125I- MCP-1 humano como o Iigante traçador. hPBMCs foram isoladas de Ieuko- pak humano (Biological Specialty Inc.) utilizando um protocol padrão com Ficoll-Hypaque (Mediatech Celgro). hPBMCs isolados foram lavados e diluí- dos em 1x107/ml em tampão de ligação (RPMI-1640, 0,1% de BSA, 20 mM de Hepes, pH 7,4). 125I-MCP-I (NEN/Perk Elmer) foi diluído para 0.45 nM em tampão de ligação. O composto foi diluído em tampão de ligação em 3 vezes as concentrações finais utilizadas no ensaio de ligação. O ensaio de ligação foi realizado utilizando uma placa filtrante de 96 cavidades (Millipo- re). A ligação total de 125I-MCP-I foi avaliada como segue: a cada reação de um volume total de 150 μΙ foram adicionadas células 5x105, 0,15 nM de 125I- MCP-1, e o composto tal que a concentração final various de 0 a 100 nM. A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos seguida por três lavagens com RPMI-1640, 0,1% de BSA, 0,4 M de NaCI, 20 mM de Hepes, pH 7,4 utilizando uma filtração de tubo de vácuo (Millipore). Após lavagem, a placa foi secada por ar durante 60 minutos em temperatura am- biente. Isto foi seguido adicionando-se 25 μΙ de Microscint 20 em cada cavi- dade. A placa foi selada e contada no Trilux durante 1 minuto. Ligação não específico foi determinada na presence de 300 nM de MCP-1 frio (PeproTe- ch Inc.). 125I-MCP-I específico foi calculado como a diferenças entre a liga- ção total e não-específica. Todas as condições foram testadas em duplica- ta. A IC50 é definida como a concentração de composto de competição re- querida para reduzir a ligação específico em 50%. Fluxo de hERG

Células HEK293 estavelmente expressando canais hERG foram

cultivadas (37 0C, CO2 a 5%) em Dulbecco's Modified Eagle's Media suple- mentado com soro bovino fetal Sigma a 10%, aminoácidos não-essenciais, 2 mM de L-glutamina e 500 pg/ml de G418, em incubator. Tampão de dis- sociação celular foi utilizado para extrair as células de frascos, que foram então semeadas em placas pretas/claras revestinas com poli-D-lisina Cor- ning de 384 cavidades em uma densidade de 2 χ 104 células por cavidade (20 μΙ) em meios de soro a 10%, e incubadas durante 15 a 24 horas a 37 0C em uma incubadora de CO2 a 5% até uma monocamada confluente de célu- las ser obtida.

Um estoque de 2 mM de tinta BTC-AM (Molecular Probes, Eu-

gene, OR) foi preparado em 100% de DMSO e em seguida adicionado 1:1 a 10% (peso/volume) de ácido plurônico em DMSO no dia do ensaio. A tintu- ra foi então diluída em tampão EP externo de hERG (140 mM de NaCI, 4,0 mM de KCI, 1,8 mM de CaCI2, 1,0 mM de MgCI2, 10 mM de HEPES, pH 7,3 e 10 mM de glicose; todos os componentes do tampão obtidos de Sigma Chemical). Esta mistura de tintura BTC (30 μΙ) foi adicionada às células e produziram uma concentração de carregamento final de 2,5 μΜ. As células são incubadas a 210C durante 45 minutos.

Os compostos de teste foram diluídos para 10 mM de DMSO em 60 μΙ. Estes compostos foram então serialmente diluídos em uma relação de 1:2 em DMSO nas colunas 1-10 e 11-20 de uma placa de 384 cavidades. As placas prontas para o ensaio foram geradas por estampamento de 2,5 μΙ da placa serialmente diluída de DMSO, que foi preparada na Velocidade 11 BioCeI. As placas aquosas foram criadas adicionando-se 48 μΙ de tampão EP e em seguida foram diluídas 30 - 45 minutos antes do ensaio ter sido lido no FLIPR. Após o carregamento de tintura, os compostos diluídos aquosos foram adicionadas às células das três placas replicadas (10 μΙ) produzindo uma faixa de concentração de dez pontos de 80 μΜ a 0,156 nM. A concen- tração de DMSO final no ensaio é 1%. As placas aquosas prontas para o ensaio foram preparadas e diluídas em um manipulador de líquido Cybio.

As células carregadas com tinta foram ledas no FLIPR384 (Mo- lecular Devices, Sunnyvale, CA), que excita a tinta utilizando a linha de 488 nm de um laser de argônio. A emissão foi filtrada utilizando um filtro de 540 ± 30 nm de passo de faixa. Os canais de hERG são estimulados a abrir pela adição de 20 μΙ/cavidade de tampão de EP contendo 66 mM de K2SO4 e 1,3 mM de TI2SO4 (Sigma/AIdrich). Para cada placa, os dados foram coletados a cada Segundo durante um período de 12 segundos, em cujo tempo o tam- pão de estímulo contendo Tl+ foi adicionado. A coleta de dados prosseguiu a cada segundo durante 48 segundos, e então continuou a cada três segun- dos durante um adicional de 2 minutos.

A faixa dinâmica do ensaio foi determinada de cavidades vazias e totais. As cavidades totais (colunas 21 e 22) definem a ativação de hERG máxima para a placa (nenhum composto de teste presente), e as cavidades vazias (colunas 23 e 24) definem 100% de inibição de hERG. As cavidades vazias contêm 400 nM dos inibidores de hERG padrões dofetilida (Ficker e outros, 1998) ou E-4031. Os pontos de dados brutos em cada cavidade de amostra foram primeiro corrigidos para variação de célula/sinal, base de controle negativo (vazios), e normalizados para os controles positivos (totais) utilizando o software FLIPR online. As curvas de resposta de concentração de composto de teste para os dados de fluxo de Tl+ de hERG foram em se- guida ajustadas utilizando Excel Fit (ID Business Solutions Limited, Surrey, UK) com uma equação logística de sítio único, Y= A + ((B-A)/1 + ((C/X) Λ D))) onde A= inibição máxima. Os dados foram analisados por ajuste de amplitudes máximas de alteração em fluorescência para fluxo de Tl+ para uma determinada condição de composto de teste. As potências (valores de IC50) de compostos foram calculadas da média de cavidades triplicadas. Ensaio de ligação de sítio 2, canal de sódio

Veja também: W. A. Catterall, e outros J. Biol. Chem. 1981, 256, 8922. O tampão de ligação padrão conteve 50 mM de HEPES, 50 mM de Tris-HCI, pH 7,4, 130 mM de Cloreto de Colina, 5,4 mM de KCI, 0,8 mM de MgCh, 5,5 mM de glicose, 40 DgAnL de LqT. As reações de ligação foram iniciadas adicionando-se sinaptossomas (preparados de cérebro de rato Wistar) à mistura de reação contendo 5 nM de [3Hj-Batracotoxina em um tampão de ligação padrão e o composto a ser testado na concentração de- sejável. As amostras foram então misturadas e incubadas a 37°C durante 60 minutos. As reações foram paradas adicionando-se tampão de lavagem ge- lado contendo 50 mM de HEPES, 50 mM de Tris-HCI, pH 7,4, 1,8 mM de CaCl2, 0,8mM de MgCb e 1 mg/mL de albumina de soro bovino. Os sinap- tossomas foram imediatamente coletados em filtros de fibra de vidro e lava- dos 3 vezes com tampões de lavagem. A radioatividade de [3H]- Batracotoxina permanecendo nos filtros foi contada utilizando espectrôme- tros de cintilação líquida.

Ensaio de Permeabilidade de Membrana Artificial Paraela (PAMPA)

O Ensaio de Permeabilidade de Membrana Artificial Paralelo

(PAMPA) consiste em uma combinação de lipídeo com base em Iecitina es- pecialmente formulada referida como o lipídeo do trato gastrointestinal (GIT). O lipídeo do GIT é utilizado para formar uma membrana em uma montagem de placa em sanduíche similar àquela utilizada nos ensaios de Caco-2. O lipídeo de GIT rigorosamente se assemelha à composição de membrana in vivo e desempenho quando medido por compostos padrões que são conhecidos por serem passivamente absorvidos em humanos. PAMPA é amplamente usado como modelo in vitro para avaliação de per- meabilidade de compostos da descrição. A taxa de passagem de compostos através da membrana de PAMPA é utilizada para determinar um coeficiente de permeabilidade (Pc), que pode ser relacionado com a permeabilidade passiva in vivo do composto.

O coeficiente de permeabilidade (Pc) de um composto particular é examinado em um parâmetro dependente do pH com pH apical e basola- teral de 7,4. Todos os experimentos são conduzidos em determinações tri- plicadas.

Os compostos (10 mM de matérias primas em DMSO a 100%)

foram diluídos 1:100 em tampão de cavidade doadora em pH 7,4 (plON CAT # 110151), fornecendo uma solução de ensaio de 100 μΜ em DMSO a 1%. O composto diluído em tampão de cavidade doadora foi transferido para uma placa Whatman Unifilter e filtrado antes de dispersar 200 μΙ na cavida- de doadora da placa de ensaio (plON CAT #110163). A membrana de PAMPA foi formada pipetando-se 4 μΙ da solução de lipídeo (plON CAT #110169) sobre a placa de filtro (VWR CAT #13503). A membrana foi então coberta com 200 μΙ de tampão de cavidade receptora em pH 7,4 (plON CAT #110139). A placa de ensaio PAMPA (lado doador e lado receptor) foi com- binada e permitida incubar em temperatura ambiente durante 4 horas. A placa foi então desmontada e as placas de espectrofotômetro (VWR CAT #655801) foram carregadas (150 μΙ/cavidade). As placas doadoras, recepto- ras, de referência, e vazias foram lidas no leitor de placa UV SpectraMax. O dado foi capturado pelo software plON, que analisa os espectros e gera os valores de Pc.

Quimiotaxia de CCR2

O ensaio de quimiotaxia de CCR2 humano foi conduzido com a linhagem de célula monocítica humana, THP-1. As células THP-1 foram pri- meiro rotuladas com a tinta fluorescente CaIcein-AM em RPMI-1640 livre de fenol vermelho, livre de BSA (pH 7,4) em 37°C durante 30 minutos com mis- tura suave a cada 15 minutos. As células rotuladas foram então lavadas e re-suspensas em 1x105/ml em tampão de quimiotaxia (RPMI-1640 livre de fenol vermelho, 0,1% de BSA, pH 7,4). O composto de teste foi diluído em tampão de quimiotaxia tal que a concentração de ensaio final variasse de 0,01 nM a 1 μΜ. O ligando MCP-1 (PeproTech Inc.) foi diluído para 20 nM em tampão de quimiotaxia. Para realizar o ensaio, um volume igual de dilui- ções de composto de teste foi misturado com um volume igual de células THP-1 rotuladas (Mistura 1), e um volume igual de diluições de composto de teste foi misturado com um volume igual de ligando de MCP-1 diluído (Mistu- ra 2). Ambas as misturas foram incubadas independentemente a 37°C du- rante 10 minutos seguido por mistura suave. A quimiotaxia induzida por MCP-1 foi então medida em uma placa de quimiotaxia (Becton Dickinson) colocando-se 50 μΙ de Mistura 1 na câmara topo e 225 μΙ de Mistura 2 na câmara base. A placa foi coberta com uma tampa e incubada a 37°C duran- te 30 minutos. 30 minutos depois, a placa foi lida em um Cytofluor. Todas as condições foram testadas em duplicata. Para determinação de sinal/ruído, 50 μΙ de células THP-1 rotuladas únicas (5x104/cavidade) foram colocados na câmara de topo e 225 μΙ de ligando MCP-1 único foi colocado na câmara base (Concentração final de 10 nM). A inibição obtida por concentrações graduadas de composto de teste foi calculada como uma porcentagem do controle de MCP-1 livre de composto. O IC50 é definido como a concentra- ção de composto de teste requerida para alcançar 50% de inibição de qui- miotaxia celular.

Grampo de emplastro de hERG

O grampo de emplastro de célula total foi utilizado para direta- mente medir as correntes de hERG em células HEK-293 estavelmente ex- pressando a subunidade de canal α de potássio de hERG clonado. O com- posto foi testado em um tampão aquoso com pH 7,4 em temperatura ambi- ente. Os pulsos de teste repetitivos (0,05 Hz) foram aplicados de um poten- cial hoplding de -80 mV to +20 mV durante 2 segundos e correntes de cau- da foram obtidas em seguida aos pulsos de teste escalonado em voltagem para -65 mV. Os efeitos do composto foram calculados medindo-se a inibi- ção de corrente de causa de pico. Grampo de emplastro de canal de sódio O grampo de emplastro de célula total foi utilizado para direta- mente medir as correntes de sódio internas em células HEK-293 expressan- do o canal de sódio cardíaco humano, SCN5A. O composto foi testado em um tampão aquoso livre de proteína. Para determinar a inibição em estado estável, as correntes de sódio foram obtidas a cada 5 segundos utilizando o seguinte protocolo de voltagem: as células foram mantidas em um potencial de -90 mV e escalonado para to -20 mV durante 60 ms. Os efeitos foram calculados medindo-se a inibição de corrente pico durante o pulso de teste a -20 mV. A dependência de taxa de inibição foi avaliada por estimulação em freqüências de 1 Hz e 4 Hz.

Farmacocinéticos de dose única em ratos

Rato Sprague-Dawley macho (250-300 g) foi utilizado para os estudos farmacocinéticos. Os ratos foram jejuados durante a noite antes da dosagem de PO e alimentados 4 h pós-dose. As amostras de sangue (-0.3 mL) foram coletadas da veia jugular nos tubos contendo K2EDTA e em se- guida centrifugadas a 4°C (1500-2000xg) para obter plasma. Em um estudo de biodisponibilidade oral, 2 grupos de animais (N=2-3 por grupo) recebe- ram o composto de teste ou como uma infusão intravenosa (IV) (durante 10 minutos) através da veia jugular ou por gavagem oral. As amostras de san- gue em série foram obtidas em 0,17 (para IV somente), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 8, e 24 h pós-dose. As amostras de plasma, obtidas por centrifugação a 4°C (1500-2000xg), foram armazenadas a -20°C até análise por LC/MS/MS.

Farmacocinéticos de dose única em macacos

Os farmacocinéticos de vários compostos de teste foram avalia-

dos em macacos cinomolgus machos em um planejamento com cruzamen- to. Os macacos foram jejuados durante a noite antes da dosagem PO e ali- mentados 4 h pós-dose. Um grupo de 1-3 animais (3 a 5 kg) recebeu o composto por infusão IV (durante 10 min) através da veia femoral e por ga- vagem oral, com um desgaste de 1 semana entre os tratamentos. As amos- tras de sangue seriais (-0,3 mL) foram coletadas de uma artéria femoral em 0,17 (IV somente), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 8, e 24 h pós-dose, e centrifu- gadas a 4°C (1500-2000xg) para obter plasma. As amostras foram armaze- nadas a -20°C até a análise por LC/MS/MS. Análise de dados para ensaios farmacocinéticos

Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos por análise não comportamental de concentração de dado de plasma vs. tempo (software KINETICA™, Version 4.2, InnaPhase Corporation, Philadelphia, PA). A con- centração pico (Cmax) e tempo para Cmax foram registrados diretamente de observações experimentais. A área sob a curva de tempo zero ao último tempo de amostragem (AUC(O-T)) foi calculada utilizando uma combinação de somatórios lineares e Iog trapezoidais. A depuração de plasma total (CLTp), volume em estado estável de distribuição (Vss), meia vida de elimi- nação evidente (T1/2) e tempo de permanência médio (MRT) foram calcula- dos após administração IV. As estimações de T1/2 foram feitas utilizando um mínimo de 3 pontos de tempo com concentrações quantificáveis. A bio- disponibilidade oral absoluta (F) foi calculada como a razão de valores AUC de dose normalizada seguinte doses orais e IV.

Os dados abaixo encontrados para cada composto quando me- didos nos ensaios descritos abaixo.

Tabela 10. Dad os Comparativos in vitro Composto Ligação de CCR2 IC50 (nM) IC5OdeFLUXO de hERG (nM) Ligação de canal de Na+ (% de inibi- ção) Permeabilidade de PAMPA (nm/seg) Exemplo 12as, W02005021500 0.27 (1) 2,800 Não disponível Não disponível Exemplo 12aj W02005021500 0.43 ± 0.06 (2) 770 Não disponível Não disponível Exemplo 2k W02005021500 0.88 ± 0.60 (23) 51,000 97%, 10,000 nM 529 ± 157 (9) Exemplo 12bd W02005021500 1.15 ±0.07 (2) >80,000 54%, 10,000 nM 392 Exemplo 8a W02005021500 1.83 ± 0.80 (12) >80,000 3%, 10,000 nM 33%, 30,000 nM 94 ± 58 (10) Exemplo 8e, W02005021500 2.20 ± 0.03 (2) >80,000 6%, 10,000 nM 2 ±2 (2) Exemplo 9c, W02005021500 0.96 ±0.26 (19) >80,000 48%, 10,000 nM 75%, 30,000 nM 145 ±71 (S) Exemplo 1 Presente Invenção 2.74 ± 1.34(15) >80,000 13%, 10,000nM 32%, 30,000 nM 560 ± 86 (5)

Tabela 11a. Dad os Comparativos Adicionais in vitro Composto IC5O de quimiotaxia de CCR2 (nM) Grampo de emplastro de hERG (% de Inib.) Grampo de emplastro de canal de Na+ (% de Inib.) Exemplo 2k W02005021500 0,24 ±0.16 (12) 83%, 10.000 nM 52%, 10.000 nM 90%, 30.000 nM Exemplo 8a W02005021500 2,63 ± 1,24 (4) 4%, 10.000 nM 22%, 10.000 nM 49%, 30.000 nM Exemplo 9c, W02005021500 0,21 4%, 10.000 nM 19%, 10.000 nM 39%, 30.000 nM Exemplo 1, Presente Invenção 0,75 ± 0,42 (16) 12%, 10.000 nM 19%, 30.000 nM 29%, 30.000 nM

Tabela 11b. Dados Farmacocinéticos Comparativos in vivo no Rato

Composto Dose IV/PO (mg/kg) Cl (mL/min/kg) F% Oral AUC (nM*h) Exemplo 2k W02005021500 2,5 / 25 40 68 9294 Exemplo 8a W02005021500 6/72 42 1.4 690 Exemplo 9c, W02005021500 4/43 54 14 1855 Exemplo 1, Presente Invenção 2/10 25 79 10169

Tabela 11c. Dado Farmacocinético Comparativo in vivo nos Macacos

Composto Dose IV/PO (mg/kg) Cl (mL/min/kg) F% AUC Oral (nM*h) Exemplo 2k W02005021500 1/1,4 25 46 862 Exemplo 8a W02005021500 1/11 14 9,4 1896 Exemplo 9c, W02005021500 1/10 12 26 6763 Exemplo 1, Presente Invenção 1/1 12 95 2352

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UTILIDADE

Os compostos representativos dos Exemplos são mostrados serem moduladores de atividade de receptor de quimiocina utilizando ensai- os conhecidos por aqueles versados na técnica. Nesta seção, nós descre- vemos tais ensaios e damos sua referência na literatura. A maioria dos en- saios é descrita aqui na Seção intitulada "Características Farmacológicas Comparativas", supra. Ao exibir a atividade nestes ensaios de antagonismo de MCP-1, os compostos dos Exemplos são esperados serem úteis no tra- tamento de doenças humanas associadas com quimiocina e seus recepto- res cognatos. A definição de atividade destes ensaios é um composto de- monstrando um IC50 de 30 LM ou menos em concentração quando medido em um ensaio particular.

Antagonismo de ligação de MCP-1 em PBMC Humano (Yoshimura e outro, J. Immunol. 1990, 145, 292)

Pelo menos um composto descrito nos Exemplos tem atividade no antagonismo de ligação de MCP-1 em PBMC humano (células mononu- cleares de sangue periférico humano) descrito aqui.

As placas de filtro de miliporo (#MABVN1250) são tratadas com 100 Gl de tampão de ligação (0,5% de albumina de soro bovino, 20 mM de tampão de HEPES e 5 mM de cloreto de magnésio em meio RPMI 1640) durante trinta minutos em temperatura ambiente. Para medir a ligação, 50 Dl de tampão de ligação, com ou sem um composto de concentração conheci- da, são combinados com 50 n| de MCP-1 humano rotulado por 125-l (para produzir uma Concentração final de 150 pM de radioligando) e 50 Ql de tampão de ligação contendo 5x105 de células. As células usadas para tais ensaios de ligação podem incluir células mononucleares de sangue periféri- co humano, isoladas por centrifugação gradiente Ficoll-Hypaque, monócitos humanos (Weiner e outro, J. Immunol. Métodos . 1980, 36, 89), ou a linha- gem de célula THP-1 que expressa o receptor endógeno. A mistura de com- posto, células e radioligando são incubadas em temperatura ambiente du- rante trinta minutos. As placas são colocadas em um tubo a vácuo, aplicado vácuo, e as placas lavadas três vezes com tampão de ligação contendo 0,5M de NaCI. A aba de plástico é removida da placa, a placa permitida se- car ao ar, as cavidades perfuradas e contadas. A inibição percentual de li- gação é calculada utilizando a contagem total obtida na ausência de qual- quer composto de competição e na ligação de base determinada por adição de 100 nM de MCP-1 no lugar do composto de teste. Antagonismo de Influxo de Cálcio Induzido por MCP-1 - (Sullivan, e outro Methods Mol. Biol., 114, 125-133 (1999)

Pelo menos um composto descrito nos Exemplos tem atividade no antagonismo de ensaio de influxo de cálcio induzido por MCP-1 descrito aqui.

A mobilização de cálcio é medida utilizando o indicador de tinta Ca2+ fluorescente, Fluo-3. As células são incubadas em 8 χ 105 células/ml em salina tamponada por fosfato contendo 0,1% de albumina de soro bovi- no, 20 mM de tampão HEPES, 5 mM de glicose, 1% de soro bovino fetal, 4 CM de Fluo-3 AM e 2,5 mM de probenecida durante 60 minutos a 37°C. As células usadas para tais ensaios de cálcio podem incluir monócitos huma- nos isolados como descrito por Weiner e outro, J. Immunol. Methods , 36, 89-97 (1980) ou linhagens de célula que expressam o receptor CCR2 endó- geno tais como THP-1 e MonoMac-6. As células são então lavadas três ve- zes em salina tamponada por fosfato contendo 0,1% de albumina de soro bovino, 20 mM de HEPES, 5 mM de glicose e 2,5 mM de probenecida. As células são ressuspensas em salina tamponada por fosfato contendo 0,5% de albumina de soro bovino, 20 mM de HEPES e 2,5 mM de probenecida em uma concentração final de 2-4 χ 106 células/ml. Células são semeadas em microplacas de 96 cavidades, de parede escura (100 □ l/cavidade) e as placas centrifugadas em 200 χ g durante 5 minutos. Várias concentrações de composto são adicionadas às cavidades (50 □ l/cavidade) e após 5 minu- tos, 50 □ l/cavidade de MCP-1 são adicionados para produzir uma concen- tração final de 10 nM. A mobilização de cálcio é detectada utilizando-se um leitor de placa de imageamento fluorescente. A monocamada é excitada com um laser de argônio (488 nM) e fluorescência associada a célula medi- da durante 3 minutos, (cada segundo durante os primeiros 90 segundos e cada 10 segundos durante os próximos 90 segundos). Os dados são gera- dos como unidades de fluorescência arbitrária e a alteração em fluorescên- cia para cada cavidade determinada como o diferencial máximo-mínimo. A inibição dependente de composto é calculada relativa à resposta de MCP-1 sozinho.

Antagonismo de quimiotaxia de PBMC humano induzida por MCP-1 (Bacon e outro, Brit. J. PharmacoL 1988, 95, 966)

Pelo menos um composto descrito nos Exemplos tem atividade no antagonismo de ensaio de quimiotaxia de PBMC humano induzido por MCP-1 descrito aqui.

A câmara de quimiotaxia de 96 cavidades de Neuroprobe ΜΒΑ96, placa de 96 cavidades de Polyfiltronics MPC1 e filtros de 8 microns de PFD5 de policarbonato livres de polivinilpirrolidona Neuroprobe são a- quecidos em uma incubadora a 37°C. Células mononucleares de sangue periférico humanas (PBMCs) (Boyum e outro, Scand. J. Clin. Lab Invest.

Suppl. 1968, 97, 31), recentemente isoladas através de método de separa- ção de densidade ficoll padrão, são suspensas em DMEM em 1 χ 107 c/ml e aquecidas a 37°C. Uma solução de 60nM de MCP-1 humana é também a- quecida a 37°C. As diluições dos compostos de teste são feitas em 2x em concentração necessária em DMEM. A suspensão de PBMC e a solução de MCP-1 de 60nm são misturadas 1:1 em tubos de polipropileno com DMEM pré-aquecido com ou sem uma diluição dos compostos de teste. Estas mis- turas são aquecidas em um aquecedor de tubo a 37°C. Para iniciar o ensai- o, adição da mistura de MCP-1/composto nas cavidades da plava de 96 ca- vidades Polyfiltronics MPC que foram colocadas na parte de base da câma- ra de quimiotaxia Neuroprobe. O volume aproximado é 400ül para cavidade e deve haver um menisco positivo após distribuição. O filtro de 8 microns é colocado suavemente no topo da placa de 96 cavidades, uma gaxeta de borracha é ligada ao fundo da câmara superior, e a câmara é montada. Um volume de 20021 da mistura de suspensão de célula/composto é adicionado às cavidades apropriadas da câmara superior. A câmara superior é coberta com um selador de placa, e a unidade montada é colocada em uma incuba- dora a 370c durante 45 minutos. Após incubação, o selador de placa é re- movido e toda a suspensão de célula restante é aspirada. A câmara é des- montada e o filtro suavemente removido. Ao mesmo tempo em que manten- do o filtro em um ângulo de 90 graus, as células não migradas são lavadas para longe utilizando uma corrente suave de salina tamponada por fosfato e o topo do filtro limpo com uma ponta de um rolo de borracha. Repetir esta lavagem mais duas vezes. O filtro é sacado a ar e em seguida imerso com- pletamente em mancha de Wright Geimsa durante 45 segundos. O filtro é então lavado embebendo-se em água destilada durante 7 minutos, e em seguida uma lavagem adicional de 15 segundos em água destilada fresca. O filtro é novamente secado a ar. As células migradas no filtro são quantifi- cadas por microscopia visual.

Os receptores de quimiocina de mamífero fornecem um alvo para interferir com ou promover função de célula imune em um mamífero, tal como a humano. Os compostos que inibem ou promovem a função de re- ceptor de quimiocina são particularmente úteis para modular função de célu- la imune para propósitos terapêuticos. Consequentemente, a presente in- venção está voltada para compostos que são úteis na prevenção e/ou tra- tamento de uma ampla variedade de distúrbios e doenças inflamatórias, in- fecciosa, e imunorreguladora, incluindo asma e doenças alérgicas, infecção por micróbios patogênicos (que, por definição, incluem vírus), as cavidades como patologias autoimunes tais como a artrite reumatóide e aterosclerose.

Por exemplo, um composto presente que inibe uma ou mais funções de um receptor de quimiocina de mamífero (por exemplo, um recep- tor de quimiocina de humano) pode ser administrado para inibir (isto é, re- duzir ou prevenir) inflamação ou doença infecciosa. Como um resultado, um ou mais processos inflamatórios, tais como emigração de leucócito, adesão, quimiotaxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou liberação de mediador inflamatório, são inibidos.

Similarmente, um composto presente que promove uma ou mais funções do receptor de quimiocina de mamífero (por exemplo, uma quimio- cina humana) quando administrado para estimular (induzir ou realçar) uma resposta imune ou inflamatória, tais como emigração de leucócito, adesão, quimiotaxia, exocitose (por exemplo, de enzimas, histamina) ou liberação de mediador inflamatório, resultando na estimulação benéfica de processos inflamatórios. Por exemplo, os eosinófilos podem ser recrutados para com- bater as infecções parasíticas. Além disso, o tratamento das doenças infla- matórias, alérgicas e autoimunes, acima mencionadas, também pode ser contemplado para um composto presente que promova uma ou mais fun- ções do receptor de quimiocina de mamífero se este contempla a liberação de composto suficiente para causar a perda de expressão de receptor em células através da indução de internalização de receptor de quimiocina ou a liberação de composto de uma maneira que resulte na má direção das célu- Ias de migração.

Além de primatas, tais como humanos, uma variedade de outros mamíferos pode ser tratada de acordo com o método da presente invenção. Por exemplo, mamíferos, incluindo, porém não limitando a, vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, cobaias, ratos ou outros bovinos, ovinos, eqüi- nos, caninos, felinos, roedores ou espécies de murinos podem ser tratados. Entretanto, o método pode também ser praticado em outras espécies, tais como espécies de aves. O paciente tratado nos métodos acima é um mamí- fero, macho ou fêmea, em quem a modulação de atividade de receptor de quimiocina é desejada. "Modulação" como usado aqui é pretendida abran- ger antagonismo, agonismo, antagonismo parcial e/ou agonismo parcial. Ensaios funcionais e de ligação de CCR5

Derivação de célula e cultura de célula: Um grupo de células HT1080 esta- velmente expressando receptor quimiocina CC endógeno 5 (CCR5) foi de- senvolvido utilizando os métodos descritos em Harrington, Sherf, e Rundlett (veja, Patente dos Estados Unidos US 6.361.972 e US 6.410.266). Os clo- nes de expressão superior foram isolados utilizando citometria de fluxo repe- titivo, seguido por sub-clonagem. Estas células foram então cultivadas em placas de 6 cavidades em 3 χ 105 células/cavidade e transfectadas com o vetor de DNA contendo proteína G alvejada por HA quimérica Gqi5 (Molecu- lar Devices; 5 microgramas de vetor DNA Iinearizado em 15 microL of Ex- Gen de fermentos foram utilizados para transfecção). Dois dias após a transfecção, as cavidades foram combinadas e semeadas em placas P100. Sete dias após a semeação, as colônias foram escolhidas, expandidas, e analisadas quanto ao conteúdo de Gqi5 por manchamento do Oeste. Um clone (designado como 3559.1.6) tendo expressão elevada de Gqi5 (de transfecção) e de CCR5 (endógeno) foi selecionado e usado para os expe- rimentos descritos abaixo. As células HT1080 (clone 3559.1.6) foram culti- vadas com alfa-MEM suplementado com 10% de soro bovino fetal dialisado, 2% de penicilina/estreptomicina/glutamina, e 500 microgramas/mL de hi- gromicina B (concentração final) a 37° C com 5% de CO2 em uma atmosfera umedecida. Preparação de Membrana: Uma pelota de célula contendo 1 χ 108 células HT1080 (clone 3559.1.6) foi ressuspensa em 5 mL de Tampão de prepara- ção de membrana gelado (50 mM de HEPES, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2) e homogeneizada em alta velocidade em um homogenizador Poly- tron durante 20 segundos no gelo. O homogenado foi diluído com outros 25 mL de Tampão de preparação de membrana e centrifugado durante 12 min (48.000 χ g a 4°C). A pelota de célula foi ressuspensas em 5 mL de tampão de preparação de membrana antes de ser novamente homogeneizada como descrito anteriormente. O homogenado foi diluído com 5 mL de tampão de preparação de membrana e ensaiado para concentração de proteína CCR5. Ensaio de Ligação: O homogenado recentemente preparado da Preparação de Membrana descrita acima foi diluído em tampão de ligação (50 mM de HEPES, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 0,1% de BSA; um comprimido de

inibidor de protease completo foi adicionado antes do ensaio) para obter uma concentração de proteína final de 10 microgramas/cavidade (placas de 96 cavidades brancas sólidas de Corning, Inc.). Esta preparação de mem- brana foi misturada com contas de WGA-SPA (Amerhsam; pré-embebido em tampão de ligação) para produzir uma concentração de 200 microgra- mas/cavidade. A mistura de membrana/conta de SPA (100 microli- tros/cavidade) foi então adicionada a uma placa qie foi pré-interrompido com 2 microlitros de DMSO contendo várias concentrações de artigos de teste (DMSO puro para controle negativo; várias concentrações de exemplos des- ta invenção para artigos de teste; 500 nM de MIP-1 beta como um controle positivo). O ensaio de ligação foi iniciado através da adição de 50 microlitros de [125I]-MIP-1 beta (Perkin Elmer; o material foi diluído em tampão de liga- ção tal que a adição de 50 microlitros/cavidade produza uma concentração final de 0,1 nM de [125I]-MIP-1 beta). A placa foi selada e permitida repousar em temperatura ambiente durante 4 - 6 h antes de ser contada em um Pac- kard TopCount. A porcentagem de ligação para o artigo de teste foi calcula- da, utilizando controles negativos e positivos para definir a janela para cada experimento.

Ensaio Funcional com base em Leitor de Placa de Imageamento Fluoromé- tricô (FLIPFO: Células HT1080 (clone 3559.1.6) foram semeadas em 10.000 células/cavidade (30 microlitros) em placas de 384 cavidades (Biocoat PDL de fundo escuro/claro, Beckton Dickinson) e carregadas com 30 microli- tros/cavidade de tinta fluorescente Fluro-4 AM (preparada dissolvendo-se 1 mg de Fluro-4 AM em 440 microlitros de DMSO e diluindo com 100 microli- tros de solução plurônica antes de diluir ainda com 10 mL de tampão Hanks). As células foram incubadas a 37° C com 5% de CO2 durante 30 min antes de serem lavadas três vezes e suspensas em Tampão de Ensaio (20 mM de HEPES, 1,2 mM de CaCl2, 5 mM de MgCl2, 2,5 mM de Probeneci-

da, 0,5% de BSA, 1x Hanks). O artigo de teste foi serialmente diluído em DMSO e em seguida diluído 1:10 com Tampão de Ensaio antes de ser adi- cionado às células (10 microlitros/cavidade). Utilizando FLIPR, as placas foram lidas (10-70 sec) para indução de fluxo (isto é, atividade agonista). As células foram em seguida também carregadas com Solução de Agonista (30 microlitros/cavidade; preparada diluindo-se 30 microlitros de 100 micro- Molar de MIP-1 beta em 100 mL de Tampão de Ensaio; este protocolo libera uma concentração final de 5 nM de MIP-1 beta no ensaio) e as placas foram lidas utilizando FLIPR durante um minuto. A atividade antagonista do artigo de teste foi determinada relativa a 0,4% de DMSO/controle negativo de Tampão.

Pelo menos um composto da descrição é um inibidor de ambos CCR2 e CCR5 e pode ser utilizado para tratar doenças associadas com quaisquer das quimiocina. Os compostos da presente invenção são conside- rados antagonistas duais.

As doenças ou condições de humano ou outras espécies que podem ser tratadas com inibidores de função de receptor de quimiocina, incluem, porém não estão limitadas a: doenças e condições inflamatórias ou alérgicas, incluindo doenças alérgicas respiratórias tais como asma, rinite alérgica, doenças pulmonares de hipersensibilidade, pneumonite por hiper- sensibilidade, celulite eosinófila (por exemplo, síndrome de Cavidade), pneumonias eosinófila (por exemplo, síndrome de Loeffler, pneumonia eosi- nófila crônica), fasciite eosinófila (por exemplo, síndrome de Shulman), hi- persensibilidade do tipo retardada, doenças pulmonares intersticiais (ILD) (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática, ou ILD associado com artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, espondilite ancilosante, esclerose sistêmica, síndrome de Sjogren, polimiosite ou dermatomiosite); anafilaxia sistêmica ou respostas de hipersensibilidade, alergias a fármacos (por e- xemplo, a penicilina, cefalosporinas), síndrome de eosinofilia-mialgia devido à ingestão de triptofano contaminado, alergias a picadas de inseto; doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide, artrite psoriática, esclerose múlti- pla, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, diabete juvenil; glomeru- lonefrite, tiroidite autoimune, doença de Behcet; rejeição a enxerto (por e- xemplo, em transplante), incluindo rejeição a aloenxerto ou doença do en- xerto versus hospedeiro; doenças inflamatórias do intestino, tais como do- ença de Crohn e colite ulcerativa; espondiloartropatias; escleroderma; psorí- ase (incluindo psoríase mediada por célula T) e dermatoses inflamatórias tais como uma dermatite, eczema, dermatite atópica, dermatite de contato alérgica, urticária; vasculite (por exemplo, vasculite necrozante, cutânea, e por hipersensibilidade); miosite eosinófila, fasciite eosinófila; cânceres com infiltração de leucócito da pele ou órgãos. Outras doenças ou condições nas quais respostas inflamatórias indesejáveis devem ser inibidas podem ser tratadas, incluindo, porém não limitado a, vasculite, placas vulneráveis, le- são de reperfusão de hyperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio átrio-venoso, aterosclerose, certas malignidades hematológicas, toxicidade induzida por citocina (por e- xemplo, choque séptico, choque endotóxico), polimiositi, dermatomiositi. As doenças ou condições infecciosas da espécie humana ou outras que pos- sam ser tratadas com inibidores de função de receptor de quimiocina, inclu- em, porém não estão limitadas a, HIV.

Doenças ou condições de humanos ou outras espécies que po- dem ser tratadas com promotores de função de receptor de quimiocina, in- cluem, porém não estão limitadas a: imunossupressão, tal como aquela em indivíduos com síndromes de imunodeficiência tais como AIDS ou outras infecções virais, indivíduos que passam por terapia de radiação, quimiotera- pia, terapia para doenças autoimunes ou terapia de fármaco (por exemplo, terapia de corticosteróide), que causa imunossupressão; imunossupressão devido a deficiência congênita em função de receptor ou outras causas; e doenças infecciosas, tais como doenças parasíticas, incluindo, porém não limitadas a infecções de helminto, tais como nematódeos (vermes da terra); (Trichuriasis, Enterobiasis, Ascariasis, Hookworm, Strongyloidiasis, Trichino- sis, filariasis); trematódeos (linguados) (Schistosomiasis, Clonorchiasis), cestódeos (vermes de tape) (Echinococcosis, Taeniasis saginata, Cysticer- cosis); verme visceral, hemicrânia de larva visceral (por exemplo, Toxocara), gastroenterite eosinófila (por exemplo, Anisaki sp., Phocanema sp.), hemi- crânias de larva cutânea (Ancylostona braziliense, Ancylostoma caninum). Os compostos da presente invenção são consequentemente úteis na pre- venção e tratamento de uma ampla variedade de distúrbios e doenças in- flamatórias, infecciosas e imunorreguladoras. Além disso, o tratamento das doenças inflamatórias, alérgicas e

autoimunes acima mencionadas pode também ser contemplado para pro- motores de função de receptor de quimiocina se este contempla a liberação de composto suficiente para causar a perda de expressão de receptor em células através da indução de internalização de receptor de quimiocina ou liberação de composto de uma maneira que resulte na má direção das célu- las de migração.

Em outro aspecto, a presente invenção pode ser utilizada para avaliar os agonistas ou antagonistas putativos específicos de um receptor acoplado a proteína G. A presente invenção está voltada ao uso destes compostos na preparação e execução de ensaios de avaliação para com- postos que modulam a atividade de receptores de quimiocina. Além disso, os compostos desta invenção são úteis no estabelecimento ou determina- ção do sítio de ligação de outros compostos para receptores de quimiocina, por exemplo, por inibição competitiva ou como uma referência e um ensaio para comparar sua atividade conhecida a um composto com uma atividade desconhecida. Quando desenvolvendo novos ensaios ou protocolos, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para testar sua eficácia. Especificamente, tais compostos podem ser fornecidos em um kit comercial, por exemplo, para uso em pesquisa farmacêutica en- volvendo as doenças acima mencionadas. Os compostos da presente in- venção são também úteis para a avaliação de moduladores específicos pu- tativos dos receptores de quimiocina. Além disso, alguém pode utilizar os compostos desta invenção para examinar a especificidade de receptores acoplados à proteína G que não são considerados serem receptores de quimiocina, ou servindo como exemplos de compostos que não se ligam ou como variantes de compostos ativos nestes receptores que podem ajudar a definir os sítios específicos de interação.

Os compostos descritos aqui são úteis para tratar ou prevenir distúrbios selecionados de artrite reumatóide, osteoartrite, choque séptico, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, choque hemodi- nâmico, síndrome de sepse, lesão de reperfusão pós isquêmica, malária, doença de Crohn, doenças inflamatórias do intestino, infecção micobacteri- ana, meningite, psoríase, insuficiência cardíaca congestiva, doenças fibróti- cas, caquexia, rejeição a enxerto, doenças autoimunes, doenças inflamató- rias da pele, esclerose múltipla, lesão por radiação, lesão alveolar hiperóxi- ca, HIV, demência por HIV, diabetes melito não dependente de insulina, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, fibrose pulmonar idiopática, penfi- góide bolhoso, infecções parasíticas helmínticas, colite alérgica, eczema, conjuntivite, transplante, eosinofilia familiar, celulite eosinófila, pneumonia eosinófila, fasciite eosinófila, gastroenterite eosinófila, eosinofilia induzida por fármaco, fibrose cística, síndrome de Churg-Strauss, linfoma, doença de Hodgkin, carcinoma colônico, síndrome de Felty, sarcoidose, uveíte, Alzhei- mer, Glomerulonefrite, e lúpus eritematoso sistêmico, carcinoma de célula escamosa esofágico, dor neuropática, e obesidade.

Em outro aspecto, os compostos são úteis para tratar ou preve- nir distúrbios inflamatórios selecionados de artrite reumatóide, osteoartrite, aterosclerose, aneurisma, febre, efeitos cardiovasculares, doença de Crohn, doenças do intestino inflamatórias, psoríase, insuficiência cardíaca congesti- va, esclerose múltipla, doenças autoimunes, doenças inflamatórias da pele. Em outro aspecto, os compostos são usados para tratar ou pre- venir distúrbios inflamatórios selecionados de artrite reumatóide, osteoartri- te, aterosclerose, doença de Crohn, doenças do intestino inflamatórias, e esclerose múltipla.

Em outro aspecto, os exemplos descritos aqui podem ser úteis no tratamento de uma variedade de cânceres, incluindo, porém não limitado aos seguintes:

carcinoma incluindo aquele da bexiga (incluindo câncer da bexi- ga acelerado e metastático), mama, cólon (incluindo câncer colorretal), rim, fígado, pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão e câncer de pulmão de célula pequena e não pequena), ovário, próstata, testículos, trato geni- tourinário, sistema linfático, reto, laringe, pâncreas (incluindo carcinoma pancreático exócrino), esôfago, estômago, vesícula biliar, cérvix, tireóide, e pele (incluindo carcinoma de célula escamosa);

tumores hematopoiéticos de linhagem de linfóide incluindo leu- cemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda,Iinfoma de célula B, Iinfoma de célula T, Iinfoma de Hodgkin, Iinfoma de não Hodgkin, Iinfoma de célula pilosa, Iinfoma histiocítico, e Iinfoma de Burketts;

tumores hematopoiéticos de linhagem de mielóide incluindo Ieu- cemias mielogenosas agudas e crônicas, síndrome mielodisplásica, leuce- mia mielóide, e leucemia promielocítica;

tumores do sistema nervoso central e periférico incluindo astro- citoma, neuroblastoma, glioma, e schwanomas;

tumores de origem mesenquimal incluindo fibrossarcoma, rab- domiosscarcoma, e osteosarcoma; e

outros tumores incluindo melanoma, xenoderoma pigmentoso, ceratoactantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide, e teratocarcinoma.

Em outra modalidade, descritos aqui são métodos de tratar cân- cer, onde o câncer é selecionado de câncer de mama, câncer de fígado, câncer de próstata, e melanoma. Adicionalmente, os compostos descritos aqui podem ser úteis no tratamento de câncer ovariano, e mieloma múltiplo.

A presente invenção fornece métodos para o tratamento de uma variedade de doenças proliferativas não-cancerosas.

Terapia combinada para prevenir e tratar distúrbios e doenças inflamatórias, infecciosas e imunorreguladoras, incluindo asma e doenças alérgicas, bem como patologias autoimunes tais como artrite reumatóide e aterosclerose, e aquelas patologias observadas acima é ilustrada pela com- binação dos compostos desta invenção e outros compostos que são conhe- cidos para tais utilidades. Por exemplo, no tratamento ou prevenção de in- flamação, os presents compostos podem ser utilizados em conjunto com um agente anti-inflamatório ou analgesic tal como um agonista de opiato, um inibidor de lipoxigenase, um inibidor de ciclooxigenase-2, um inibidor de in- terleucina, tal como um inibidor de interleucina-1, um inibidor de fator de ne- crose de tumor, um antagonista de NMDA, um inibidor ou óxido nítrico ou um inibidor da sintase de óxido nítrico, um agente anti-inflamatório não- esteroidal, um inibidor de fosfodiesterase, ou um agente anti-inflamatório suppressor de citocina, por exemplo com um composto tal como acetamino- feno, aspirina, codeína, fentanila, ibuprofeno, indometacina, cetorolac, mor- fina, naproxen, fenacetina, piroxicam, um analgésico esteroidal, sufentanila, sunlindac, interferon alfa e similares. Similarmente, os presentes compostos podem ser administrados com um aliviador de dor; um potenciador tal como cafeína, um antagonista de H2, simeticona, hidróxido de alumínio ou mag- nésio; um descongestionante tal como fenilefrina, fenilpropanolamina, pseu- dofedrina, oximetazolina, efinefrina, nafazolina, xilometazolina, propilhexe- drina, ou levodesoxi-efedrina; e antitussígeno tais como codeína, hidrocodo- na, caramifeno, carbetapentano, ou dextrametorfan; um diurético; e uma antihistamina de sedação e não-sedação. Igualmente, os compostos aqui descritos podem ser utilizados em combinação com outros fármacos que são utilizados no tratamento/prevenção, supressão ou melhora da doença ou condições para as quais o composto da presente invenção é útil. Outros tais fármacos podem ser administrados, por uma rotina e em uma quantida- de comumente utilizada, portanto, contemporaneamente ou seqüencialmen- te com um composto da presente invenção. Quando um composto é utili- zando contemporaneamente com um ou mais outros fármacos, uma com- posição farmacêutica contendo tais outros fármacos em adição ao composto da presente invenção pode ser utilizada. Consequentemente, as composi- ções farmacêuticas incluem aqueles que também contêm um ou mais outros ingredients ativos, além de um composto da presente descrição.

Exemplos de outros ingredients ativos que podem ser combina-

dos com um composto da presente invenção, ou administrados separada- mente ou nas mesmas composições farmacêuticas, incluem, porém não estão limitados a: (a) antagonistas de integrina tais como aqueles para se- lectinas, ICAMs e VLA-4; (b) esteróides tais como beclometasona, metil- prednisolona, betametasona, prednisona, dexametasona, e hidrocortisona; (c) imunossupressores tais como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina e ou- tros imunosupressores do tipo FK-506; (d) antihistaminas (antagonistas de H1-histamina) tais como bromofeniramina, clorfeniramina, dexclorfenirami- na, triprolidina, clemastina, difenidramina, difenilpiralina, tripelennamina, hi- droxizina, metdilazina, prometazina, trimeprazina, azatadina, ciproeptadina, antazolina, feniramina, pirilamina, astemizol, terfenadina, loratadina, cetirizi- na, fexofenadina, descarboetoxiloratadina, e similares; (e) anti-asmáticos não-esteroidais tais como agonistas de b2 (terbutalina, metaproterenol, fe- noterol, isoetarina, albuteral, bitolterol, e pirbuterol), teofillina, cromolin sódi- co, atropina, brometo de ipratrópio, antagonistas de Ieucotrieno (zafirlukast, montelukast, pranlukast, iralukast, pobilukast, SKB-102,203), inibidores de biossíntese de Ieucotrieno (zileuton, BAY-1005); (f) agentes anti- inflamatórios não-esteroidais (NSAIDs) tais como derivados de ácido propiô- nico (alminoprofeno, benxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, indoprofeno, ketoprofeno, miroprofeno, naproxen, oxaprozina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofênico, e tioxaprofeno), derivados de ácido acetic (indometacina, acemetacina, alclofenac, clidanac, diclofenac, fenclofenac, fenclozic acid, fentiazac, furofenac, ibufenac, isoxepac, oxpinac, sulindac, tiopinac, tolmeti- na, zidometacina, e zomepirac), derivados de ácido fenâmico (ácido flufe- nâmico, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico e ácido tolfenâmico), derivados de ácido bifenilcarboxílico (diflunisal e flufenisal), oxicams (isoxicam, piroxicam, sudoxicam e tenoxican), salicilatos (ácido ace- tilsalicílico, sulfasalazina) e as pirazolonas (apazona, bezpiperilon, feprazo- na, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona); (g) inibidores de ciclooxi- genase-2 (COX-2); (h) inibidores de fosfodiesterase tipo IV (PDE-IV); (i) ou- tros antagonistas dos receptores de quimiocina; (j) agentes redutores de colesterol tais como inibidores de HMG-COA redutase (lovastatina, simvas- tatina e pravastatina, fluvastatina, atorvsatatina, e outras estatinas), seques- trantes (colestiramina e colestipol), ácido nicotônico, derivados de ácido fe- nofíbrico (gemfibrozil, clofibrat, fenofibrato e benzafibrato), e probucol; (k) agentes anti-diabéticos tais como insulina, sulfonilureias, biguanidas (met- formina), inibidores de a-glucosidase (acarbose) e glitazonas (troglitazona e pioglitazona); (I) preparações de interferons (interferon alfa-2a, interferon- 2B, interferon alfa-N3, interferon beta-1a, interferon beta-1b, interferon ga- ma-1b); (m) compostos antivirais tais como efavirenz, nevirapina, indinavir, ganciclovir, lamivudina, famciclovir, e zalcitabina; (o) outros compostos tais como ácido 5-aminossalicílico e pró-fármacos destes, antimetabólitos tais como azatioprina e 6-mercaptopurina, e agentes quimioterapêuticos de cân- cer citotóxicos. A relação de peso do composto da presente invenção para o Segundo ingrediente ativo pode ser variada e dependerá das doses efetivas de cada ingrediente.

Geralmente, uma dose eficaz de cada sera utilizada. Desse mo- do, por exemplo, quando um composto é combinado com um NSAID a rela- ção de peso do composto da presente invenção para o NSAID geralmente variará de cerca de 1000:1 a cerca de 1:1000, ou alternativamente de cerca de 200:1 a cerca de 1:200. Combinações de um composto da presente in- venção e outros ingredientes ativos de modo geral também se incluirão na faixa anteriormente mencionada, porém em cada caso, uma dose eficaz de cada ingrediente ativo deve ser utilizada.

No tratamento de câncer, a combinação de agentes quimiotera- pêuticos e/ou outros tratamentos (por exemplo, terapia de radiação) é fre- qüentemente vantajoso. O segundo (ou terceiro) agente pode ter o mesmo ou diferente mecanismo de ação do que o agente terapêutico primário. Pode ser especialmente útil empregar combinações de fármaco citotóxicas, em que os dois ou mais fármacos que estão sendo administrados agem de ma- neiras diferentes ou em diferentes fases do ciclo cellular, e/ou onde os dois ou mais fármacos têm toxicidades ou efeitos colaterais em sobreposição, e/ou onde os fármacos que estão sendo combinados têm uma eficácia de- monstrada no tratamento de estado de doença particular manifestado pelo paciente.

Consequentemente, os compostos descritos aqui (ou outras formulas descritas aqui) podem ser administrados em combinação com ou- tros agentes anti-câncer e citotóxicos e tratamentos úteis no tratamento de câncer ou outras doenças proliferativas. A invenção aqui também compre- ende o uso dos compostos inclusos (ou outras formulas descritas aqui), na preparação de medicamentos para o tratamento de câncer, e/ou compreen- de o empacotamento dos compostos inclusos juntamente com instruções de que os compostos sejam utilizados em combinação com outros agentes an- ti-câncer ou agentes citotóxicos e tratamentos paras o tratamento de câncer. A presente invenção também compreende combinações dos compostos de um ou mais agentes adicionais em forma de kit, por exemplo, onde eles são empacotados juntos ou colocados em pacotes separados para serem vendi- dos como um kit, ou onde eles são empacotados para serem formulados juntos.

O segundo (ou mais) agentes anti-câncer podem ser seleciona- dos de qualquer um ou mais dos seguintes:

Agentes de alquilação (incluindo mostardas de nitrogênio, sulfo- natos de alquila, nitrosoureias, derivados de etilenimina, e triazenos); anti- angiogênicos (incluindo inibidores de metaloproteinase matriz); antimetabóli- tos (incluindo inibidores de adenosina desaminase, antagonistas de ácido fólico, análogos de purina, e análogos de pirimidina); antibióticos ou anticor- pos (incluindo anticorpos monoclonais, anticorpos de CTLA-4, antraciclinas); inibidores de aromatase;

modificadores de resposta de ciclo celular; enzimas; inibidores de farnesil-proteína transferase; agentes hormonais e antihormonais e esteróides (incluindo aná- logos sintéticos, glucocorticóides, estrogênios/anti-estrogênios [por exemplo, SERMs], androgênios/anti-androgênios, progestinas, agonistas de receptor de progesterona, e agonistas e antagonistas de liberação de hormônio Iutei- nizante [LHRH]); fator de crescimento tipo insulina (IGF)/moduladores de sistema de receptor de fator de crescimento tipo insulina (IGFR) (incluindo inibidores de IGFR1); inibidores de sinalização de integrina; inibidores de cinase (incluindo inibidores de multi-cinase e/ou inibidores de Src kinase ou Src/abl, inibidores de cinase dependente de ciclina [CDK], anticorpos pa- nHer, Her-1 e Her-2, inibidores de VEGF, incluindo anticorpos anti-VEGF, inibidores de EGFR, inibidores de protein ativada por mitógeno [MAP], inibi- dores de MEK, inibidores de Aurora cinase, inibidores de PDGF, e outros inibidores de tirosina cinase ou inibidores de serina /treonina cinase;

agentes rompedores de microtúbulo, tais como ecteinascidinas ou seus análogos e derivados; agentes estabilizantes de microtúbulo tais como taxanos, e as epotilonas de ocorrência naturasl e seus análogos sinté- ticos e semi-sintéticos;

agentes desestabilizantes, de ligação de microtúbulo (incluindo alcalóides vinca); e

inibidores de topoisomerase; inibidores de prenil-proteína trans-

ferase; complexos de coordenação de platina; inibidores de transdução de sinal; e outros agentes utilizados como agentes anti-câncer e citotóxicos tais como modificadores de resposta biológica, fatores de crescimento, e imu- nomoduladores.

Adicionalmente, os compostos da presente invenção podem ser

formulados ou co-administrados com outros agentes terapêuticos que são selecionados quanto à sua utilidade particular no tratamento de efeitos cola- terais associados com as condições anteriormente mencionadas. Por e- xemplo, os compostos da invenção podem ser formulados com agentes pa- ra prevenir náusea, hipersensibilidade e irritação gástrica, tais como antie- méticos, e antihistamínicos H1 e H2.

Os outros agentes terapêuticos acima, quando empregados em combinação com os compostos da presente invenção, podem ser utilizados, por exemplo, naquelas quantidades indicadas no Physicians' Desk Referen- ce (PDR) ou como de outro modo determinado por alguém versado na téc- nica.

Os compostos são administrados a um mamífero em uma quan-

tidade terapeuticamente eficaz. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" entende-se uma quantidade de um composto da presente descrição que, quando administrado sozinho ou em combinação com um agente terapêuti- co adicional a um mamífero, é eficaz para prevenir ou melhorar a condição de doença ou a progressão da doença. DOSAGEM E FORMULAÇÃO

Os compostos desta descrição podem ser administrados em tais formas de dosage oral como comprimidos, cápsulas (cada dos quais inclui formulações de liberação sustentada ou liberação cronometrada), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes, e emulsões. Eles po- dem também ser administrados em forma intravenosa (bolo ou infusão), in- traperitoneal, subcutânea, ou intramuscular, todos utilizando formas de do- sage bem conhecidas por aqueles versados nas técnicas farmacêuticas. Eles podem ser administrados sozinhos, porém geralmente serão adminis- trados com um veículo farmacêutica selecionado com base na rotina de ad- ministração escolhida e prática farmacêutica padrão.

O regime de dosage para os compostos da presente invenção variarão, de fato, dependendo de fatores conhecidos, tais como as characte- rísticas farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e rotina de ad- ministração; as espécies, idade, sexo, saúde, condição médica, e peso do receptor; a natureza e extensão dos sintomas; o tipo de tratamento concomi- tante; a freqüência de tratamento; a rotina de administração, a função renal e hepatica do paciente, e o efeito desejado. Um medico ou veterinário pode determiner e prescrever a quantidade eficaz do fármaco requerida para pre- venir, agir contra, ou interromper o progresso do distúrbio.

Por meio de orientação geral, a dosage oral diária de cada in- grediente ativo, quando utilizando para os efeitos indicados, variarão entre cerca de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal, ou entre cerca de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal por dia, ou alternativamente, entre cerca de 1,0 a 20 mg/kg/dia. Intravenosamente, as doses variarão de cerca de 1 a cerca de 10 mg/kg/minute durante uma infusão de taxa constante. Os compostos desta invenção podem ser administrados em uma única dose diária, ou a dosage diária total pode ser administrado em doses divididas de duas, três ou quar- to vezes diárias. Em uma modalidade, a dosage oral diária do ingrediente ativo é entre 3 e 600 mg ou administrado uma vez ao dia ou em doses divi- didas administradas duas vezes ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrado nas doses de 10 a 20 mg administrados duas vezes ao dia ou 40 a 100 mg administrados uma vez ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrado uma dose de 12,5 mg duas vezes ao dia ou 75 mg uma vez ao dia. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser administrado nas doses de 3, 10, 30, 100, 300, e 600 mg administrados ou uma vez ou duas vezes ao dia.

Os compostos desta invenção podem ser administrados em forma intranasal por meio de uso tópico de veículos intranasais adequados, ou por meio de retinas transdérmicas, utilizando emplastros de pele trans- dérmicos. Quando administrado na forma de um sistema de liberação trans- dérmica, a administração de dosage sera, de fato, continua em vez intermi- tente em todo o regime de dosagem.

Os compostos são tipicamente administrados em mistura com diluentes, excipientes, ou veículos farmacêuticos adequados (coletivamente referido asqui como veículos farmacêuticos) adequadamente selecionados com respeito à forma pretendida de administração, isto é, comprimidos o- rais, cápsulas, elixires, xaropes e similares, e consistente com práticas far- macêuticas convencionais.

Por exemplo, para administração oral na forma de um comprimi- dos ou cápsula, o componente de fármaco ativo pode ser combinado com um veículo oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como lactose, amido, sacarose, glicose, metilcelulose, Estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, sulfato de cálcio, manitol, sorbitol e similares; para a ad- ministração oral em forma líquida, os componente de fármaco orais podem ser combinados com qualquer veículo oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte tal como etanol, glicerol, água, e similares. Além disso, quando desejado ou necessário, aglutinantes adequados, lubrificantes, a- gentes desintegrantes, e agentes colorants podem também ser incorporados na mistura. Aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares natu- rais tais como glicose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas tais como acácia, tragacanto, ou alginato de sódio, carboximetil- celulose, polietileno glicol, ceras, e similares. Lubrificantes utilizados nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, e simi- lares. Disintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil celulose, ágar, bentonita, goma xantana, e similares.

Os compostos da presente invenção podem também ser admi- nistrados na forma de sistemas de liberação de lipossomo, tais como vesí- culas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes, e vesículas multilamelares. Liposomos podem ser formados de uma variedade de fosfo- lipídeos, tais como colesterol, estearilamina, ou fosfatidilcolinas.

Os compostos da presente invenção podem também ser aco- piados com polímeros solúveis como veículos de fármaco alvejáveis. Tais polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, poliidroxi- propilmetacrilamida-fenol, poliidroxietilaspartamidafenol, ou polietilenooxido- polilisina substituído com residues de palmitoíla. Além disso, os compostos da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros bio- degradásveis úteis na obtenção liberação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido polilático, ácido poliglicólico, compolímeros de ácido poliláti- co ou poliglicólico, poliépsilon caprolactona, ácido poliidróxi butírico, polior- toésteres, poliacetais, polidiidropirans, policianoacilatos, e compolímeros de bloco reticulados ou anfipáticos de hidrogeis. As formas de dosage (composições farmacêuticas) adequadas

para administração podem conter de cerca de 1 miligrama a cerca de 10O miligramas de ingrediente ativo por unidade de dosagem. Nestas composi- ções farmacêuticas o ingrediente ativo ordinariamente estará presente em uma quantidade de cerca de 0,5 a 95% em peso com base no peso total da composição.

As cápsulas de gelatina podem conter o ingrediente ativo e veí- culos em pó, tais como lactose, amido, derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico, e similares. Diluentes similares podem ser utili- zados para preparar comprimidos prensados. Tanto comprimidos quanto cápsulas podem ser fabricados como produtos de liberação sustentada para prover liberação continua de medicação durante um período de horas. Comprimidos prensados podem ser revestidos por açúcar ou revestidos por película para mascara qualquer gosto desagradável e proteger o comprimi- dos da atmosfera, ou revestido por entérico para desintegração seletiva no trato gastrointestinal.

As formas de dosage líquida para administração oral podem conter colorants e aromatizantes para aumentar a aceitação do paciente.

Em geral, água, um óleo adequado, salina, dextrose aquosa (glicose), e soluções de açúcar relacionadas e glicóis tais como propileno glicol ou Polietileno glicóis são veículos adequados para soluções parente- rais. As soluções para administração parenteral podem conter um sal do ingrediente ativo solúvel em água, agentes estabilizantes adequados, e se necessário, substâncias tampão. Agentes antioxidantes tais como bissulfito de sódio, sulfite de sódio, ou ácido ascórbico, sozinhos ou combinados, são agentes estabilizantes adequados. São também utilizados o ácido citric e seus sais e EDTA de sódio. Além disso, soluções parenterais podem conter preservativos, tais como cloreto de benzolcônio, metil- ou propil-parabeno, e clorobutanol.

Veículos farmacêuticos adequados são descritos em Reming- ton's FarmacêuticaI Sciences, Mack Publishing Company, um ttexto de refe- rência padrão neste campo. Formas de dosage farmacêuticas úteis representativas para

administração dos compostos desta invenção podem ser ilustradas como segue: Cápsulas

Um grande número de cápsulas unitárias pode ser preparado carregando cápsulas de gelatin dura de duas partes padrão com 100 mili- gramas de ingrediente ativo em pó, 150 miligramas de lactose, 50 miligra- mas de celulose, e 6 miligramas de estearato de magnésio. Cápsulas de Gelatina Macias

Uma mistura de ingrediente ativo em um óleo digerível tal como óleo de soja, óleo de algodão, ou óleo de oliva, óleo de soja, óleo de semen- te de algodão ou óleo de olive podem ser preparados e injetados por meio de uma bomba de deslocamento positive em gelatin para formar cápsulas de gelatin macias contend 100 miligramas do ingrediente ativo. As cápsulas devem ser lavadas e secadas. Comprimidos

Os comprimidos podem ser preparados por procedimentos con- vencionais de modo que a unidade de dosage seja de 100 miligramas de ingrediente ativo, 0,2 miligramas de dióxido de silício coloidal, 5 miligramas de estearato de magnésio, 275 miligramas de celulose microcristalina, 11 miligramas de amido e 98,8 miligramas de lactose. Revestimentos apropria- dos podem ser aplicados para aumentar a saborosidade ou retardar a ab- sorção. Injetável

Uma composição parenteral adequada para administração por injeção pode ser preparada agitando 1,5% em peso de ingrediente ativo em 10% por volume de propileno glicol e água. A solução deve ser tornada iso- tônica com cloreto de sódio e esterilizada. Suspensão

Uma suspensão aquosa pode ser preparada para administração oral de modo que cada 5 ml_ contenham 100 mg de ingrediente ativo fina- mente dividido, 200 mg de carboximetil celulose sódica, 5 mg de benzoato de sódio, 1,0 g de solução de sorbitol, U.S.P., e 0.025 mL de vanilina.

Onde os compostos desta invenção são combinados com outros agentes anticoagulantes, por exemplo, uma dosagem diária pode ser em torno de 0,1 a 100 miligramas do composto de fórmula I e cerca de 1 a 7,5 miligramas do segundo anticoagulante, por quilograma de peso corporal do paciente. Para uma forma de dosagem de comprimido, os compostos desta invenção geralmente podem estar presente em uma quantidade de cerca de 5 a 10 miligramas por unidade de dosagem, e o segundo anti-coagulante em uma quantidade de cerca de 1 a 5 miligramas por unidade de dosagem.

Onde dois ou mais dos anteriores segundo agentes terapêuticos são administrados com o composto dos exemplos, geralmente a quantidade de cada componente em uma dosagem diária típica e forma de dosagem típica pode ser reduzida com relação à dosagem usual do agente quando administrado sozinho, em vista do efeito aditivo ou sinérgico dos agentes terapêuticos quando administrados em combinação.

Particularmente quando fornecido como uma unidade de dosa- gem única, o potencial existe para uma interação química entre os ingredi- entes ativos combinados. Por esta razão, quando o composto dos exem- plos e um segundo agente terapêutico são combinados em uma unidade de dosagem única eles são formulados de modo que embora os ingredientes ativos sejam combinados em uma unidade de dosagem única, o contato físico entre os ingredientes ativos é minimizado (isto é, reduzido). Por exem- pio, um ingrediente ativo pode ser revestido por entérico. Por revestimento entérico um dos ingredientes ativos, é possível não apenas minimizar o con- tato entre os ingredientes ativos combinados, porém também é possível controlar a liberação de um destes componentes no trato gastrointestinal tal que um destes componentes não seja liberado no estômago, porém de pre- ferência seja liberado nos intestinos. Um dos ingredientes ativos pode tam- bém ser revestido com um material que afeta uma liberação sustentada em todo o trato gastrointestinal e também serves para minimizar o contato físico entre os ingredientes ativos combinados. Além disso, o componente de libe- ração sustentada pode ser adicionalmente revestido por entérico tal que a liberação deste componente ocorra apenas no intestino. Ainda outro método envolveria a formulação de um produto de combinação em que um compo- nente é revestido com um polímero de liberação sustentada e/ou entérica, e o outro componente é também revestido com um polímero tal como um grau de baixa viscosidade de hidroxipropil metilcelulose (HPMC) ou outros mate- riais apropriados como conhecido na técnica, a fim de também separar os componentes ativos. O revestimento polímero serve para formar uma bar- reira adicional para interação com o outro componente.

Estas bem como outras maneiras de minimizar o contato entre os componentes de produtos de combinação da presente invenção, se ad- ministrados em uma forma de dosagem única ou administrados em formas separadas porém ao mesmo tempo da mesma maneira, será facilmente e- vidente para aqueles versados na técnica, uma vez em conformidade com as presente descrição.

Adicionalmente, certos compostos descritos asqui podem ser úteis como metabólitos de outros compostos. Portanto, em uma modalida- de, os compostos podem ser úteis ou como um composto substancialmente puro, que pode também então ser incorporado em uma composição farma- cêutica, ou pode ser útil como metabólito que é gerado após a administra- ção do pró-fármaco daquele composto. Em uma modalidade, um composto pode ser útil como um metabólito sendo útil para tratar distúrbios como aqui descrito.

"Substancialmente puro" como aqui utilizado destina-se a incluir

um composto tendo uma pureza maior do que cerca de 90 por cento em peso, incluindo cerca de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, e 100 por cento.

Como um exemplo, um composto descrito asqui pode ser subs- tancialmente puro, tendo uma pureza maior do que cerca de 90 por cento (em peso), onde o restante menor do que cerca de 10 por cento de material compreende outro metabólito do composto, um pró-fármaco do composto, e/ou impurezas de reação e/ou processamento que surgem de sua prepara- ção.

Obviamente, numerosas modificações e variações da presente

invenção são possíveis, levando em consideração os ensinamento acima. Deve ser portanto entendido que dentro do escopo dass reivindicações ane- xas, a invenção pode ser praticada diferente do que especificamente descri- to aqui.

ENSAIOS E EFICÁCIA EM VIVO

N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6- (trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1 -il)cicloexil)acetamida (também referido como "Exemplo 1") foi avaliado nos seguintes ensaios em vivo como descrito abaixo.

Seção 1. Recrutamento de célula mononuclear bloqueadas pelo Exem- plo 1 para a pele, após o desafio intradérmico (ID) de MCP-1 em ca- mundongos cinomolgus.

Injeção intradérmica de MCP-1 resulta na infiltração de células mononucleares no sítio de injeção. Este modelo foi inicialmente desenvolvi- do para avaliar o efeito inibidor de Antagonistas de CCR2 sobre a infiltração de células mononucleares no tecido de pele injetadas com MCP-1 humana. O infiltrado celular pode ser medido semi-quantitativamente por classificação histológica. Métodos

Cada macaco foi dosado com Exemplo 1 ou seu controle de ve- ículo (0,05 N HCI) uma vez ao dia durante três dias. O Exemplo 1 foi oral- mente administrado em doses de 0, 5, 10, ou 20 mg/kg a grupos de 4 maca- cos cinomolgus (2 por sexo por grupo). Imediatamente após a dosagem no Dia 3, todos os animais receberam 2 injeções intradérmicas de 10 μg (50 μLyinjeção ) de MCP-1 humana (R & D Systems) e 2 injeções intradérmicas de seu controle de DPBS (50 μΙ/injeção) em sítios separados no tórax dor- sal. Biópsias dérmicas de todos os sítios foram obtidas em aproximadamen- te 18 horas seguindo desafio com MCP-1 (ou DPBS). As biópsias foram processadas para escore histológico semi-quantitativo. Seções representati- vas de amostras de pele foram examinadas por microscopia de luz; lesões microscópicas e infiltração celular foram observadas e suas incidências fo- ram tabuladas.

Em adição à análise de biópsia, sangue foi coletado e avaliado quanto às contagens de sangue completas e diferenciais celulares. Foram também avaliadas amostras de plasma quanto às concentrações de com- posto (e metabólito), e amostras de soro quanto aos níveis de MCP-1 sistê- micos. Resultados

O recrutamento de células mononucleares para a pele de ani-

mais de controle tratados com o veículo em response ao desafio de MCP-1 foi significante (escore histológico médio de 2,0 com uma faixa de 1-3, Tabe- la 10). Exemplo 1 a 5, 10, e 20 mg/kg inibiu esta infiltração de célula mono- nuclear dérmica em 75%, 95% e 95%, respectivamente (Tabela 10 e Figura 20). O composto também bloqueou a infiltração de outros tipos celulares tais como eosinófilos e neutrófilos (Tabela 12). As concentrações de plasma de Exemplo 1 em 18 horas e sua ligação a níveis de inibição e valores de IC90 de Cyno quimiotaxia são sumariados na Tabela 12. Com base no valor de IC50 de 7,1 ± 2,7 nM para o Exemplo 1 em ensaio de cyno quimiotaxia, as doses de 5, 10 e 20 mg/kg resultaram em concentrações de plasma livre de 0,8-, 2,1-, e 4,3-vezes a IC90 de quimiotaxia em 18 horas após a dosagem (Tabela 12). TABELA 12

Sumário de efeitos de Exemplo 1 sobre a infiltração de células mono- nucleares e outros tipos celulares em resposta a desafio de MCP-1 em

camundongos cinomolguss a'b

Doses mg/kg Concentração de plasma livre (nM) Vezes IC90 de Quimiota- xia Escore de célula mononuclear (faixa) (inibição%) Escore de PMN0 (faixa) Escore de Eosd (faixa) Escore total de cel. (faixa) 0 0 0 2.0 (1-3) (0%) 0.3 (0-1) 1.5 (0,5 - 3) 4.0 (2 -6e) 99 0.8 0,5 (0-1) (75%) 0.1 (0 - 0,5) 1.4 (1-2) 2.0 (1-3) 248 2.1 0.1 (0 - 0,5) (95%) 0.1 (0 - 0,5) 0.8 (0,5-1) 1.0 (0,5 - 2) 512 4.3 0.1 (0 - 0,5) (95%) 0 (0-0) 0.8 (0,5-1) 0.9 (0,5-1)

a Um sistema de escalonamento arbitrário de 0 a 4 foi utilizando com cada

número representando uma designação particular de infiltrado inflamatório como segue: 0, número não significante de células inflamatórias; 0,5, traço; 1, mínimo; 2, brando; 3, moderado; 4, infiltração acentuada. b Valores médios são uma média de 8 biópsias do sítio de MCP-1, represen- tando 2 biópsias separadas de 4 macacos por grupo. As faixas representam a amplitude de classificações histológicas médias para 2 biópsias por ani- mal.

c PMN significa célula polimorfonuclear (neutrófilo). d Eos é uma abreviação para eosinófilos.

e O escore total é uma soma matemática de valores médios para cada tipo celular para demonstrar a resposta de dose. A avaliação de mudanças em mediadores inflamatórios de soro

mostrou um aumento (aproximadamente de 3 a 4 vezes) em nível de MCP-1 nos grupos tratados com o Exemplo 1 com relação ao controle de veículo. Além disso, análise de contagem de sangue completa (CBC) mostrou um aumento (~2-vezes) em neutrófilos nos grupos tratados pelo Exemplo 1, com relação ao controle de veículo, em 18 horas no dia 4 após os três dias de dosagem.

Para refinar a resposta de dose (concentração) de Exemplo 1 em um sistema mais facilmente qualificável, utilizamos camundongos Hccr2 Kl para avaliar o efeito de Exemplo 1 infiltração de monócito/macrófago em modelo de peritonite induzida por (TG) com metodologia com base em cito- metria de fluxo.

Seção 2. Exemplo 1 inibiu a infiltração de monócito/macrófago em mo- delo de peritonite de TG de 48 horas em camundongo hCCR2 Kl.

O modelo de peritonite induzidas por TG foi utilizando como um modelo de recrutamento de monócitos/macrófagos para o sítio de inflama- ção. Tanto estudos domésticos quanto publicados demonstraram que o re- crutamento de monócito/macrófago neste modelo é dependente de CCR2. Veja Boring L. e outro, Impaired monocyte migration and reduced tipo 1 (Th1) cytokine responses in C-C chemokine receptor 2 knockout mice. J Clin Invest., 100(10):2552-61. (1997); e Kuziel, W.A. e outro, Severe reduction and Ieukocyte adhesion and monocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2. Proc Natl Acad Sci USA. 94(22): 12053-8 (1997). Métodos

Para o estudo de peritonite TG de 48 horas, o Exemplo 1 was dosado duas vezes ao dia com a primeira dose administrado uma hora an- tes da injeção de TG. As contagens de célula peritoneal total foram obtidass sobre células isoladas por uma registradora celular. O sangue foi também coletado em heparina do seio retro-orbital no término de cada estudo para citometria de fluxo e em EDTA para determinação de concentração de fár- maco.

Para análise citométrica de fluxo, células de exudato peritoneal (1x106) foram lavadas uma vez com Tampão de FACS (PBS/0,5% BSA) e ressuspensas em tampão de FACS. As células foram incubadas com um anticorpo de bloqueio de Fc (BD Farmingen) sobre gelo durante 15 minutos seguido pela adição dos seguintes anticorpos (BD Farmingen): Anti-F4/80 conjugado a PE, Anti-Ly6C conjugado a FITC, e Anti-hCCR2 conjugado a Alexa 647. Após 45 minutos sobre gelo, as células foram fixadas por BD Cy- tofix durante 15 minutos sobre gelo, lavadas duas vezes com tampão de FACS, e ressuspensas em 200 μΙ tampão de FACS. Eventos celulares (40,000) foram adquiridos para cada amostra e os dados foram analisados utilizando o software FIoJo (TreeStar). Uma porta FSC/SSC foi estabelecida para incluir todos os monócitos (SSC baixo, FSC maior) ao mesmo tempo que excluindo granulócitos da análise. Esta população fechada foi então analisada quanto à expressão de Ly6C (FITC), F4/80 (PE) . Os números de monócitos/macrófagos peritoneais foram determinados multiplicando-se as contagens de célula peritoneal total obtidas pela registradora celular e a percentagem de monócitos/macrófagos identificados por F4/80+ cels de ci- tometria de fluxo. Significância estatística de diferenças entre métodos foi analisada utilizando teste t de duas caudas pareadas com a significância estabelecida em valores ρ abaixo de 0,05. Resultados

O Exemplo 1 foi avaliado em modelo de peritonite de TG de ca-

mundongo hCCR2 Kl para determinar sua EC50 na inibição de infiltração de monócito/macrófago. Aos camundongos foi administrado tioglicolato, e do- sados oralmente com o Exemplo 1 a 1, 25, ou 100 mg/kg de BID. Quarenta e oito horas após o tratamento com TG1 lavagem peritoneal foi obtida para análise de infiltrado celular por citometria de fluxo.

Para distinguir entre os monócitos/macrófagos recrutados ver- sus macrófagos e granulócitos residentes, o manchamento de ambos os marcadores de superfície de monócito/macrófago F4/80 e Ly6C foi utilizado para definir o monócito/macrófago recrutado. A inibição dependente da dose em infiltração de monócito/macrófago foi observada (Figura 21). As doses de 1, 25, e 100 mg/kg forneceram uma inibição de 24%, 74% e 78%, res- pectivamente. Em três estudos separados com doses múltiplas, a EC50 média para inibição de infiltração de monócito/macrófago por esta análise foi estimada ser de 3,9 nM.

Para avaliar o nível in vivo de ocupação do receptor pelo Exem- plo 1 no modelo de peritonite de tioglicolato de 48 horas no camundongo hCCR2 Kl mouse, os níveis de plasma de ambos Exemplo 1 e MCP-1 de camundongo foram medidos. O caveat para esta estimativa é que apenas CCR2 e seu maior Iigante MCP-1, foram considerados. A ocupação do re- ceptor de um Iigante na presença de um inibidor competitivo é definida pela equação Gaddum:

IEU = _1_

[R] l + (Kd/[L])(l + [I]/Ki)

Visto que o Exemplo 1 é um inibidor competitivo de ligação de MCP-1 a CCR2, as quantidades de ambos complexo de receptor de C- CR2/MCP-1 de camundongo e complexo de receptor de CCR2/Exemplo 1 podem ser determinadas utilizando os níveis de soro de ambos MCP-1 de camundongo e Exemplo 1 não ligado à proteína em plasma. The Kd para ligação de MCP-1 de camundongo a hCCR2 é de 0,91 +/- 0.08 nM (n=8) que foi determinado em experimentos de ligação de Iigante de competição frio utilizando 125l-human MCP-1. A Ki média para a ligação do Exemplo 1 a hCCR2 is 1.3 nM. A fração de complexos de receptor MCP-1/CCR2 de ca- mundongo é determinada utilizando a forma da equação descrita acima. Para determinar a fração de Complexos Exemplol/CCR2 a equação é rede- finida como: mil =_ι_

[R] l+(Ki/[I])(l+[L]/Kd) Finalmente, a quantidade de CCR2 livre é determinada de: [CCR2]totai = [CCR2]iivre + [camundongo MCP-1/CCR2] + [Exemplo 1/CCR2]

Como mostrado na Tabela 13, a inibição percentual de infiltra- ção de monócito/macrófago no peritôneo em 48 horas reflete a percentagem do complexo de receptor de Exemplo 1/ CCR2. TABELA 13

Determinação de ocupação de receptor in vivo de Exemplo 1 em san- gue de camundongos Hccr2 Kl no modelo de peritonite de TG de 48

horas

Dose (mg/kg) Concentração de MCP-1 de camundongo em plasma (nM) Concentração de Exemplo 1 livre em plas- ma (nM) (vezes IC90 Ligação de CCR2) % MCP-1 de ca- mundon- go ligado CCR2 % de E- xemplo 1 - CCR2 ligado % CCR2 livre % inibição de infiltração de monóci- to/macrófago3 100 0,015 53 (1,8) 0,04 97,6 2,4 78 0,017 IO Ξ ô 0,16 91,2 8,6 74 1 0,005 1,4 (0,05) 0,26 51,4 48,3 24 0 (veículo) 0 0 0 0 100 0

Seção 3. Estudos de eficácia crônica

Encefalomielite autoimune experimental (EAE) Métodos

Para avaliar o efeito de Exemplo 1 sobre modelos crônicos de doença, utilizados o modelo EAE de esclerose múltipla em camundongos hCCR2 Kl. Para estudar o efeito de Exemplo 1 sobre o modelo EAE, 10 ca- mundongos por grupo foram utilizados. No dia O, camundongos Hccr2 Kl foram imunizados subcutaneamente com um total de 200 μΙ de 300 μg gli- coproteína de oligodendrócito de mielina (MOG) 35-55 (Genemed Synthesis) misturados 1:1 com 300 μg Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) (Becton- Dickinson) em adjuvante de Freund incompleto (IFA) (Sigma-AIdrich). No dia 0 (duas horas após a imunização) e no dia 2, os camundongos foram injeta- dos intraperitonealmente com 100 μΙ de 400 ng de toxina do coqueluche . A classificação clínica começou no dia 10, continuou três vezes por semana durante todo o estudo, e foi baseada em uma escala de 0-5: 0, nenhum si- nal de doença; 0,5, fraqueza parcial do rabo; 1, rabo flácido ou andar ginga- do com tonicidade do rabo; 1.5, andar gingado com fraqueza parcial do ra- bo; 2, andar gingado com rabo flácido (ataxia); 2.5 (ataxia com paralisia de membro parcial; 3, paralisia total de um membro; 3.5, paralisia total de um membro com paralisia parcial de um segundo membro; 4, paralisia total de dois membros; 4.5, moribundo; 5, morto. A dosagem oral de Exemplo 1 a 25 mg/kg e 55 mg/kg (BID) foi iniciada no dia 1. Resultados

Exemplo 1 em ambas as doses reduziu a área sob a curva (AUC) da classificação clínica em 49% (p < 0.05) (Figura 22). A IC50 é de 3,7 nM para o Exemplo 1 em 125l-ligação de MCP-1 de camundongo a célu- las expressando hCCR2, hPBMCs (imitando o cenário de hCCR2 Kl). Com base neste valor de IC50, the 25 e 55 mg/kg doses resultou na concentra- ção de gamela de plasma livre de 1 - e 3-vezes a IC90 de ligação. Avaliação histológica da coluna espinhal no dia 22 did não demonstra uma diferença significante em infiltrado celular inflamatório total entre os camundongos tra- tados com Exemplo 1 versus veículo. Um infiltrado de neutrófilo marcado foi observado em camundongos tratados com o composto.

Claims (15)

1. Composto que é N-((1R,2S,5R)-5-(terc-butilamino)-2-((S)-2- oxo-3-(6-(trifluorometil)quinazolin-4-ilamino)pi ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1 que é uma forma cristalina de N-((1 R,2S,5R)-5-(íerc-butilamino)-2-((S)-2-oxo-3-(6-(trifluorome- til) quinazolin-4-ilamino)pirrolidin-1-il)cicloexil)acetamida, ou um sal farma- ceuticamente aceitável deste.

3. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 2, com- preendendo a forma N-2.

4. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 3 carac- terizada por parâmetros celulares unitários substancialmente iguais aos se- guintes: Dimensões celulares: a = 18,7240(4) b = 8,0171(2) C = 19,6568(5) a = 90 β = 114,935(2) γ= 90 V(Á3) = 2675,7(1) Grupo espacial P2i2i2i Moléculas / célula unitária 2 em que o referido cristal está em uma temperatura de cerca de +22SC (tem- peratura ambiente).

5. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 4 carac- terizada por um padrão de difração de pó de raio X que compreende três ou mais dos valores de 2Θ (CuKa λ=1,5418 Á) selecionados de 5,5, 9,1, 12,1,14,0 e 19,2, a uma temperatura de cerca de 22SC.

6. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 5 tam- bém caracterizada por um padrão de difração de pó de raio X que compre- ende quatro ou mais dos valores de 2Θ (CuKa A=1,5418Á) selecionados de .5,5, 9,1, 12,1, 14,0 e 19,2 a uma temperatura de cerca de 22SC.

7. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 6 carac- terizada por coordenadas atômicas fracionárias substancialmente como lis- tadas na Tabela 3.

8. Forma cristalina de acordo com as reivindicações 1 a 7 que tem um padrão de difração de pó de raio X substancialmente de acordo com a figura 2.

9. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com as reivindicações 1 a 8, e um veículo ou diluente farmaceutica- mente aceitável.

10. Método de tratamento de uma doença em um mamífero compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com as reivindicações 1 a 9 em que a do- ença é selecionada de diabetes, obesidade, síndrome metabólica, acidente vascular cerebral, dor neuropática, miocardiopatia isquêmica, psoríase, hi- pertensão, esclerodermia, osteoartrite, aneurisma, febre, doença cardiovas- cular, doença de Crohn, insuficiência cardíaca congestiva, doenças auto- imunes, infecção por HIV, demência associada com HIV, psoríase, fibrose pulmonar idiopática, arteriosclerose de transplante, trauma cerebral fisica- mente ou quimicamente induzido, doença inflamatória do intestino, alveolite, colite, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite sérica nefrotóxica, glomerulonefri- te, asma, esclerose múltipla, aterosclerose, vasculite, placas vulneráveis, artrite reumatóide, reestenose, hiperplasia neoíntima venosa, hiperplasia neoíntima de diálise-enxerto, hiperplasia íntima de desvio arteriovenoso, transplante de órgão, nefropatia de aloenxerto crônica, e câncer.

11. Método de acordo com a reivindicação 10 em que a doença é selecionada de diabetes, obesidade, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistêmico, glomerulonefrite, esclerose múltipla, aterosclerose, reestenose, e transplante de órgão.

12. Método de acordo com as reivindicações 10 a 11 em que a doença é selecionada de esclerose múltipla, aterosclerose, doença de Crohn, e diabetes.

13. Processo para a preparação de um composto tendo a fórmu- la (X) .<formula>formula see original document page 159</formula> compreendendo as etapas de: hidrólise da porção de éster do composto de fórmula V com um agente hidrolisante para formar o ácido do composto Vl a temperaturas de cerca de -5 a cerca de 5SC: <formula>formula see original document page 159</formula> reação de um composto de fórmula Via, HO-Z-OH, com um composto de fórmula IV (opcionalmente in situ) na presença de um catalisa- dor de ácido para produzir um composto de fórmula Vll que tem uma porção de ácido carboxílico: <formula>formula see original document page 159</formula> transformação da porção de ácido carboxílico do cetal de fórmu- la Vll para um isocianato correspondente de fórmula VIII: <formula>formula see original document page 160</formula> contato do isocianato de fórmula Vlll com um composto de fór- mula R10COW na presença de um anidrido de ácido correspondente, (R10CO)2O, para formar a amida de fórmula IX tendo uma porção de cetal: <formula>formula see original document page 160</formula> hidrólise da porção de cetal da amida de fórmula IX para formar o composto de fórmula X, em que: Ri e R2 são independentemente hidrogênio ou um grupo de pro- teção de amina; R4 e R10 são independentemente Ci-6 alquila ou benzila opcio- nalmente substituída; nados de hidrogênio, C1-4 alquila, C2.4alquenila, halogênio, hidróxi, ciano, nitro, CF3, OC1-4 alquila, OCF3, e 0(=0)θ!-4 alquila. R8 e R9 são independentemente hidrogênio ou Ci-6 alquila; W é OH ou OC1-6 alquila; Z é -(CT1T2)2-, -(CT1T2)3-, ou T1, T2 e T3 a cada ocorrência são independentemente selecio-

14. Processo de acordo com a reivindicação 13 em que a etapa de aminação redutiva compreende: a) adição de um Ácido de Lewis a uma solução do composto X e a amina tendo a fórmula HNR8Rg, em um solvente aprótico para formar uma imina-enamina de fórmula Xa; <formula>formula see original document page 161</formula> b) tratamento da imina-enamina de fórmula Xa com um agente redutor para fornecer o composto de fórmula X tendo uma porção de amina de pirolindonila.

15. Composto selecionado de ácido (7fl,8S)-8-((3S)-3-(((benziloxi)carbonil)amino)-2-oxo-1-pir- rolidinil)-1,4-dioxaspiro[4,5]decano-7-carboxílico, ou um sal deste; ((3S)-1-((7/?,8S)-7-(azidocarbonil)-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2- oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste; ((3S)-1-((7fl,8S)-7-isocianato-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste; ((3S)-1 -((7fl,8S)-7-acetamido-1,4-dioxaspiro[4,5]dec-8-il)-2-oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste; ((3S)-1-((1S,2fí)-2-acetamido-4-oxocicloexil)-2-oxo-3-pirrolidi- nil)carbamato de benzila, ou um sal deste; e ((SSJ-l-ÍÍIS^fí^/^^-acetamido^-Cterc-butilaminoJcicloexil)^- oxo-3-pirrolidinil)carbamato de benzila, ou um sal deste.