BRPI0715486A2 - Controle e prevenção enzimática de biofilme - Google Patents
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Classifications
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONTROLE E PREVENÇÃO ENZIMÁTICA DE BIOFILME".
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
Este pedido reivindica prioridade para o Pedido U.S. Ns 11/492.294 depositado em 24 de julho de 2006, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a composições enzimáticas e a métodos para prevenir e remover de formação de biofilme em superfícies.
Antecedentes da Invenção
Os biofilmes consistem em uma comunidade anexada de micro- organismos embutidos em uma matriz de exopolímeros viscosa que persiste apesar das tentativas de controle com abordagens tradicionais projetadas para matar os micro-organismos de flutuação livre. A resistência dos biofil- 15 mes a antibióticos, antisépticos, e mesmo aos biocidas oxidantes tem sido bem documentada. Apesar dos problemas associados ao crescimento inde- sejado de biofilmes, esses são úteis no tratamento de águas servidas e se mostram uma esperança particular para os contaminantes recalcitrantes, os fluxos de água servida misturada e a biorremediação localizada.
Métodos enzimáticos para a prevenção e/ou redução de biofil-
mes são conhecidos na técnica e podem ser encontrados nas seguintes pu- blicações: WO 06/031554; WO 01/98214; WO 98/26807; WO 04/041988; WO 99/14312; WO 01/53010.
A WO 06/031554 descreve o uso de uma alfa-amilase derivada 25 de uma bactéria para prevenir, remover, reduzir, ou interromper biofilme pre- sente em uma superfície. A WO 01/98214 descreve uma ou mais acilases e um veículo para degradar uma Iactona produzida por micro-organismos para prevenir ou remover biofilme. A WO 98/26807 descreve o uso de uma ou mais hidrolases a partir de uma fonte fúngica em combinação com uma oxi- 30 doredutase tal como uma oxidase, uma peroxidase ou uma Iacase para ma- tar as células bacterianas presentes no biofilme. A WO 04/041988 descreve uma mistura detergente enzimática de protease, esterase e/ou amilase. A WO 99/14312 descreve as misturas bacterianas enzimáticas para a degra- dação de biofilme. A WO 01/53010 descreve o uso seqüencial de, primeiro, uma carboidrase e a seguir uma enzima protease para remoção do biofilme. Entretanto, as descrições conhecidas na literatura não abordam eficiente- 5 mente a prevenção e remoção de biofilme e na prática ainda não foi reduzi- do.
Há assim uma necessidade na técnica por produtos eficazes para eliminar, prevenir e/ou reduzir biofilmes no ambiente industrial, de tra- tamento dentário e de saúde.
Sumário da Invenção
As enzimas para prevenção e controle de biofilme são aplicá- veis, mas não limitadas a, gerenciamento de água industrial tal como torres de resfriamento, água potável, água servida, higiene dentária, dispositivos e implantes médicos, sistemas de hemodiálise, recuperação de óleo, cavida- 15 des de biorremediação, processamento de polpa e celulose; cascos de navi- os; e equipamento de processamento de alimento.
Em uma primeira modalidade da presente invenção, uma mistu- ra enzimática é usada para prevenir ou reduzir a formação de biofilme.
Em uma segunda modalidade da presente invenção, mais de 40% de um biofilme são removidos seguindo o tratamento com uma mistura enzimática.
Em um aspecto da presente invenção, a mistura enzimática é composta de uma ou mais proteases, uma ou mais glucanases, e uma ou mais cutinases.
Em outro aspecto da presente invenção, a mistura enzimática
contém uma ou mais proteases, uma ou mais glucanases, por exemplo, uma celulase, uma ou mais mananases, e uma ou mais cutinases.
Em ainda outro aspecto da presente invenção, a mistura enzimá- tica é composta de uma ou mais proteases, uma ou mais glucanases, uma ou mais mananases, e uma ou mais lipases.
Em um aspecto adicional da presente invenção, a mistura enzi- mática é composta de uma ou mais amilases e uma glucanase. Em ainda outro aspecto adicional da presente invenção, a mistura enzimática é composta de uma ou mais amilases e uma ou mais proteases.
Em ainda outro aspecto adicional da presente invenção, a mistura enzimática é composta de uma ou mais celulases e uma ou mais proteases.
A mistura enzimática da presente invenção reduz o biofilme em
ao menos aproximadamente 40%, em ao menos aproximadamente 50%, em ao menos aproximadamente 60%, em ao menos aproximadamente 70%, em ao menos aproximadamente 80% e em ao menos aproximadamente 90%.
Na presente invenção, as misturas enzimáticas são eficazes na prevenção ou redução de biofilme sem a adição de um tensoativo e sem o uso de uma enzima lacase.
Na presente invenção, as misturas enzimáticas são ao menos tão eficazes como um tratamento de branqueamento 10% na remoção de biofilme.
As misturas enzimáticas podem ser usadas para remover e pre-
venir biofilmes no ambiente industrial, de tratamento dentário e de saúde. Essas aplicações de prevenção e remoção de biofilmes incluem, mas não estão limitadas ao gerenciamento de água industrial tal como torres de res- friamento, água potável, água servida, higiene dentária, dispositivos e im- 20 plantes médicos, sistemas de hemodiálise, recuperação de óleo, cavidades de biorremediação, processamento de polpa e celulose, casco de navio, e equipamento de processamento de alimento.
Outros objetivos, características e vantagens da presente inven- ção se tornarão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada. Dever- 25 se-ia entender, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos especí- ficos, enquanto indicando as modalidades preferenciais da invenção, são dados somente a título de ilustrações, visto que as várias mudanças e modi- ficações no escopo e no espírito da invenção se tornarão aparentes a um versado na técnica a partir desta descrição detalhada.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção será agora descrita em detalhes a título de referência somente usando as seguintes definições e exemplos. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as seqüências descritas em tais pa- tentes e publicações referidas aqui são expressamente incorporadas por referência.
A menos que de outra forma definido aqui, todos os termos cien- tíficos e técnicos usados aqui têm o mesmo significado como usualmente entendido por um versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Sin- gleton e outros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a Ed., John Wiley e Sons, Nova Iorque (1994), e Hale & Marham, The Harper Col- Iins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) fornecem a um dos versados um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou em testes da presente in- venção, os métodos e materiais preferenciais são descritos. As faixas numé- ricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que de outra forma indicado, os ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita na orientação de 5’ a 3’, as seqüências de aminoácido são escritas da es- querda para a direita na orientação amino a carbóxi, respectivamente. Os profissionais são particularmente direcionados a Sambrook e outros, 1989, e Ausubel FM e outros, 1993, para definições e termos da técnica. Entende-se que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos, e reagentes descritos, à medida que esses podem variar.
As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a
faixa.
A menos que de outra forma indicado, os ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita na orientação de 5’ a 3’, as seqüências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de ami- no a carbóxi, respectivamente.
Os títulos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspec- tos ou modalidades da invenção, que podem ter por referência à especifica- ção como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência à especificação como um todo. Definições
"Biofilme" significa uma comunidade de micro-organismos embu- tidos em uma matriz de polímeros extracelulares anexados a uma superfície. O biofilme pode ter um ou mais micro-organismos e inclui adicionalmente 5 água e pode incluir outras partículas capturadas. Os micro-organismos po- dem ser bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas (aeróbicas ou anaeró- bicas), alga, protozoa, e/ou fungo filamentoso ou levedura. Em algumas mo- dalidades, o biofilme é composto de células vivas de bactérias do gênero Estafilococo, Estreptomices, Pseudomonas, Listeria, Estreptococo, e Esque- 10 riquia.
"Superfície" significa qualquer estrutura que tem massa suficien- te para permitir a anexação do biofilme. Superfícies rígidas incluem, mas não estão limitadas a metal, vidro, cerâmica, madeira, minerais (rocha, pedra, mármore e granito), materiais agregados tal como concreto, plásticos, mate- 15 riais compostos, materiais de borracha rígida, e gesso. Os materiais rígidos podem ser finalizados com esmaltes e tintas. As superfícies rígidas são en- contradas, por exemplo, em tanques e equipamentos de armazenamento e tratamento d’água, instalações e equipamentos de processamento de ali- mentos e laticínios, instalações e equipamentos médicos tal como instru- 20 mentos cirúrgicos e implantes temporários e permanentes, plantas e equi- pamentos industriais farmacêuticos. As superfícies mois são, por exemplo, cabelo e todos os tipos de materiais têxteis. As superfícies porosas podem ser superfícies biológicas, tal como pele, queratina ou órgãos internos. As superfícies porosas também podem ser encontradas em certas cerâmicas 25 bem como em membranas que são usadas para filtração. Outras superfícies incluem, mas não estão limitadas aos cascos de navios e piscinas.
"Dosagem enzimática" significa a quantidade de mistura enzimá- tica, ou uma quantidade de uma única enzima usada em uma mistura enzi- mática, utilizada para tratar o biofilme. Os fatores que afetam a dosagem 30 enzimática incluem, mas não estão limitados ao tipo de enzima, a superfície a ser tratada, e o resultado pretendido. Em uma modalidade, a dosagem en- zimática é a quantidade de mistura enzimática necessária para reduzir o bio- filme em ao menos 40%. Em geral, na prática, os níveis de dosagem enzi- mática total economicamente viável são de aproximadamente 1%. Os versa- dos na técnica entenderão que níveis mais altos de enzima podem ser usa- dos, se desejado. Dosagens iguais de cada enzima na mistura enzimática 5 podem ser usadas, mas não exigidas. Em geral, o teor de enzimas na mistu- ra enzimática é, no total, de aproximadamente 1% ou menos, 2% ou menos, 3% ou menos, 4% ou manos, 5% ou menos.
"Remoção de biofilme" significa ao menos uma redução de 40% no biofilme em uma superfície através de atividade catalítica de uma mistura enzimática. A remoção é medida com um ensaio com violeta cristal como mostrado abaixo no Exemplo 2, onde as amostras imersas do ensaio em uma solução de violeta cristal (0,31% peso por volume) por dez minutos an- tes de enxaguar as amostras três vezes em PBS para remover a mancha não-ligada. A mancha ligada é extraída do biofilme usando 95% de etanol e a absorção da solução de violeta cristal/etanol é lida em 540 nm. A porcen- tagem de remoção do biofilme por Pseudomonas é calculada a partir da e- quação [(1-Fração restante de biofilme)* x 100], A fração restante de biofilme é calculada subtraindo-se a absorção do meio + soluções enzimáticas a par- tir da absorção das soluções extraídas dos biofilmes tratados por enzima dividida pela diferença na absorção destes biofilmes de controle não- tratados menos a absorção do meio de crescimento somente. Em outras modalidades da invenção, a remoção é ao menos uma redução de 50% de biofilme, ao menos uma redução de 60% de biofilme, ao menos uma redu- ção de 70% de biofilme, ao menos uma redução de 80% de biofilme, ao me- nos uma redução de 90% de biofilme, e ao menos uma redução de 100% de biofilme.
Uma "Mistura Enzimática" para tratar biofilme significa ao menos duas enzimas. Ao menos duas enzimas podem ser combinações de carboi- drases tais como celulases, endoglucanases, celobioidrolases e beta- 30 glicosidases; amilases tal como alfa-amilases; proteases tal como proteases de serina, por exemplo, subtilisinas; esterases e cutinases; enzimas hidroli- santes de amido granular; Iipases tal como a fosfolipase, e as hemicelulases tal como as mananases. As enzimas usadas nas misturas enzimáticas po- dem ser derivadas de fontes vegetais e animais, bactérias, de fungos ou le- vedura, e podem ser enzimas do tipo selvagem ou variantes.
"Condições ácidas", "condições neutras" e "condições básicas" 5 são bem conhecidas pelos versados na técnica. Para propósito desta descri- ção, as condições ácidas significam um pH de aproximadamente 4 a 6. As condições neutras significam um pH de aproximadamente 6 a 8. As condi- ções básicas significam um pH de aproximadamente 8 a 10.
As hidrolases (E.C.3) que podem ser usadas incluem, por exem- pio, proteases, glucanases (glicosil hidrolase da família 16), celulases, este- rases, mananases, e arabinases. As proteases de serina e neutras, subtilisi- nas, podem ser usadas para a presente invenção. As proteases neutras são proteases que têm atividade proteolítica ótima na faixa de pH neutro de a- proximadamente 6 a 8. As proteases neutras adequadas são aspartato- protease e metalo-proteases. As metalo-proteases comercialmente adequa- das são MULTIFECT, PARAFECT L, FNA1 PROPERASE L, PURADAX EG7000L, e GC106 de Aspergillus niger, todas disponíveis a partir da Ge- nencor International, Inc., Palo Alto, Califórnia, e Alcalase, Savinase, Espe- rase e Neutrase (Novo Nordisk A/S, Dinamarca). As proteases neutras po- dem ser derivadas de fontes bacterianas, fúngicas ou fontes de levedura, ou fontes vegetais e animais e podem ser enzimas do tipo selvagem ou varian- tes. As enzimas variantes são produzidas em fontes que expressam os ge- nes que sofreram mutações a partir de genes dos pais.
Exemplos de celulases que podem ser usadas na presente in- 25 venção podem ser endoglucanases, celobioidralases e beta-glicosidases, incluindo celulases tendo ótima atividade na faixa de pH ácido a neutro, por exemplo, PURADAX derivado de uma fonte bacteriana, LAMINEX e INDIA- GE da Genencor International, Inc., ambos derivados de uma fonte fúngica. As celulases podem ser derivadas, por exemplo, de fungos do gênero As- 30 pergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium e Penicillium.
Exemplos de enzimas hidrolisantes de amido granular úteis in- cluem as glicoamilases derivadas de cepas de Humicola, Aspergillus, e Phi- zopus. As enzimas hidrolisantes de amido granular (GSH) significam enzi- mas que hidrolisam o amido em forma granular. A glicoamilase refere-se à classe de enzimas amiloglicosidase (por exemplo, glicoamilase EC.3.2.1.3, 1,4-alfa-D-glucano glicohidrolase). Existem enzimas agindo externamente 5 que liberam os resíduos de glicosil a partir de extremidades não-redutoras de moléculas de amilase e de amilopectina. A enzima também hidrolisa as ligações alfa-1,6 e alfa-1,3. A atividade da glicoamilase pode ser medida u- sando o ensaio bem conhecido baseado na capacidade da glicoamilase de catalisar a hidrólise de p-nitrofenil-alfa-D-glicopiranosida (PNPG) para glico- 10 se e p-mitrofenol. Em um pH alcalino, o nitrofenol forma uma cor amarela que é proporcional à atividade de glicoamilase e é monitorado em 400 nm antes da comparação com um padrão de enzima medido como uma GAU. Uma GAU (unidade de atividade da glicoamilase) é definida como a quanti- dade de enzima que produzirá 1 gm de açúcar redutor, calculado como gli- 15 cose por hora a partir de um substrato de amido solúvel (4% ds) com pH 4,2 e 60C. As glicoamilases comercialmente disponíveis adequadas a partir da Genencor International, Inc. incluem OPTIDEX, DISTILLASE, e G-ZYME.
Exemplos de Iipases que podem ser usados para a presente in- venção podem ser Iipases alcalinas, neutras e ácidas e fosfolipases. As Iipa- ses e as fosfolipases disponíveis comercialmente a partir da Genencor Inter- national, Inc. incluem a LYSOMAX e a CUTINASE.
Exemplos de hemicelulase mananases que podem ser usadas para a presente invenção podem ser GC265 do Bacillus lentus, HEMICELL e PURABRITE, ambos do Bacillus lentus, da Genencor International, Inc., e as mananases descritas por Stahlbrand e outros, J. Biotechnol. 29 (1993), 229-242.
Exemplos de esterases e cutinases que podem ser usadas para a presente invenção podem ser obtidos a partir da Genencor International, Inc. a partir de qualquer fonte, incluindo, por exemplo, fontes bacterianas tal como Pseudomonas mendocina ou fontes fúngicas tal como a Humicula ou Fusarium.
Exemplos de amilases que podem ser usadas na presente in- venção incluem as alfa- e beta-amilases que podem ser obtidas a partir de fontes bacterianas e fúngicas, tal como o amilases por Bacillus (B. amyloli- quefaciens, B. licheniformis, e B. stearothermophillus) e amilases por Asper- gillus, Humicola e Trichoderma, por exemplo, (A. niger, A. kawachi, e A. ory- zae. As amilases podem ser obtidas a partir da Genencor International, Inc.
5 e incluem SPEZYME FRED, SPEZYME AA, CLARASE, AMYLEX e a mistu- ra de amilases SPEZYME ETHYL. As amilases disponíveis a partir da No- vozymes A/S (Dinamarca) incluem BAN, AQUAZYM, AQUAZYM Ultra, e TERMAMYL. Outras amilases são misturas de amilases, tal como M1 da Biocon, e Cuconc da Sumizyme, Aris Sumizyme L (endo 1,5 alfa-L arabina- 10 se), ACH Sumizyme (beta manase), Humicola Glicoamilase, dextranase, dextramase, quitinase, ENDOH, e Optimax L1000 (glicoamilase).
Na presente invenção, mais de 375 misturas enzimáticas dife- rentes foram testadas para propriedades de remoção de biofilme. A triagem resultou na identificação de 33 misturas enzimáticas surpreendentes que 15 resultaram na redução de biofilme de ao menos 40% (69% a 84%) utilizando um método de alto rendimento como descrito no Exemplo 1. Dezessete das 33 misturas enzimáticas foram usadas em condições ácidas e reduziram o biofilme em 71% a 84%, cinco das misturas enzimáticas foram usadas em condições neutras e reduziram o biofilme em 69% a 88%, e onze das mistu- 20 ras enzimáticas foram usadas em condições básicas.
As 33 misturas enzimáticas incluem misturas de uma alfa- amilase e uma mananase; uma amilase e uma protease; uma amilase e ara- binase; ao menos uma alfa-amilase e ao menos outras duas amilases; uma protease, celulase e glucanase; uma protease, celulase, e três glucanases; 25 uma protease, celulase, e mananase; uma protease, celulase, e amilase; uma protease, amilase, e glucanase; uma protease, mananase, e amilase; uma celulase, arabinase e amilase; uma protease, celulase, mananase e fosfolipase; uma protease, glucanase, amilase, e arabinase; uma protease, celulase, e duas glucanases; uma protease, celulase, e três glucanases; três 30 proteases, uma celulase, uma mananase, e uma fosfolipase; três proteases, celulase, fosfolipase e esterase; três proteases, uma mananase, fosfolipase e esterase; três proteases, uma celulase, e uma mananase; duas proteases, celulase, e glucanase; duas proteases, celulase, glucanase, e mananase; duas proteases, uma celulase, glucanases, fosfolipase e mananase; ao me- nos três amilases e uma celulase; uma amilase, arabinase, e celulase; uma amilase, arabinase e protease; ao menos três amilases e uma protease; ao 5 menos três amilases, uma protease, e uma celulase; uma glucanase e uma mistura de amilases; uma celulase e uma mistura de amilases.
Um conjunto preferencial de vinte misturas enzimáticas inclui protease, glucanase e esterase; protease, glucanase, esterase e mananase; protease, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, glucanase, 10 fosfolipase e mananase; três proteases, fosfolipase, esterase e mananase; três proteases, glucanase e mananase; duas proteases, celulase, glucanase, fosfolipase e mananase; protease, glucanase e mananase; protease, celula- se, fosfolipase e esterase; duas proteases, glucanase, fosfolipase e estera- se; duas proteases, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, ce- 15 lulase, fosfolipase e glucanase; três proteases, celulase, fosfolipase e mana- nase; três proteases, glucanase, fosfolipase e esterase; protease, celulase, glucanase, fosfolipase e esterase; duas ou mais amilases e glucanase; ao menos três amilases; ao menos duas amilases, glucanase e protease.
Quatro misturas enzimáticas particularmente preferenciais são: protease, glucanase e cutinase e podem ser preparadas usando enzimas disponíveis comercialmente, tais como, MULTIFECT, NEUTRAL; LAMINEX BG e cutinase; protease, glucanase, mananase e cutinase e podem ser pre- paradas usando enzimas disponíveis comercialmente, tais como, MULTI- FECT e NEUTRAL; LAMINEX BG, mananase e cutinase; protease, glucana- se, mananase e fosfolipase e podem ser preparadas usando enzimas dispo- níveis comercialmente, tais como, MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; mananase e LYSOMAX; e uma mistura de três proteases mais celulase, mananase, e cutinase e podem ser preparadas usando enzimas disponíveis comercialmente, tais como, PROPERASE L, PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG, mananase e cutinase.
As modalidades preferenciais da presente invenção incluem as seguintes preparações de enzimas disponíveis comercialmente da Genencor International Inc.: MULTIFECT NEUTRAL, LAMINEX, LYSOMAX, PROPE- RASE, PURADAX, PURAFECT, e SPEZYME, todas são marcas registradas da Genencor International Inc.
MULTIFECT NEUTRAL compreende uma protease por Bacillus 5 amyloliquefaciens (EC3.4.24.28); LAMINEX BG tendo um nível de atividade de aproximadamente 3200 lU/g compreende uma B-glucanase por Trichoderma (celulase EC3.3.1.6); LYSOMAX tendo um nível de atividade de aproximadamen- te 400 U/g compreende uma fosfolipase por Streptomyces violceoruber, PROS- PERASE tendo um nível de atividade de aproximadamente 1600 PU/g compre-
ende uma protease por Bacillus alcalophilus (EC3.4.21.62); PURAFECT ten- do um nível de atividade de aproximadamente 42.000 GSU/g compreende uma protease de subtilisina (EC3.4.21.62) como descrito na Patente U.S Ne 5.624.829 que é incorporada aqui por referência em sua totalidade; FNA compreende uma protease por Bacillus subtilis (EC3.4.21.62), como descrito
na Patente U.S RE 34.606 e na Patente U.S N- 5.310.675, as quais são in- corporadas aqui por referência em sua totalidade; PURADAX tendo um nível de atividade de aproximadamente 32 U/g compreende uma celulase por Tri- ehoderma reesei (EC3.2.1.4), como descrito na Patente U.S Ns 5.753.484, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade; SPEZYME FRED
tendo um nível de atividade de aproximadamente 15.100 LU/g compreende uma alfa-amilase do Bacillus Iieheninformis (EC3.2.1.1), como descrito nas Patentes U.S. N-s 5.736.499, 5.958.739, 5.824.532, que são incorporadas aqui por referência.
As misturas enzimáticas preferenciais que usam enzima dispo- nível comercialmente incluem as seguintes:
1. MULTIFECT NEUTRAL, LAMINEX BG e cutinase.
2 . MULTIFECT NEUTRAL, LAMINEX BG, mananase e cutinase.
3. MULTIFECT NEUTRAL, LAMINEX BG, mananase e LYSOMAX.
4 . PROPERASE L, PURAFECT L, FNA, LAMINEX BG, mananase e cutinase.
5. PROPERASE L, PURAFECT L, FNA, mananase, cutinase e LYSOMAX.
6. PROPERASE L, PURAFECT L, FNA, mananase, LAMINEX BG.
7 . MULTIFECT NEUTRAL, LAMINEX BG, e mananase. 8 . FNA, PURADAX EG 7000L, LAMINEX BG1 e cutinase.
9 . PURAFECT L, FNA1 LAMINEX BG, e LYSOMAX.
10 . PROPERASE L, FNA, LAMINEX BG, e LYSOMAX.
11. PROPERASE L, PURAFECT L, FNA, LAMINEX BG, PURADAX EG 7000L, e LYSOMAX
12. PROPERASE L, PURAFECT L, LAMINEX BG, PURADAX EG 7000L, e LY- SOMAX
13. MULTIFECT NEUTRAL, PURADAX EG 7000L, LAMINEX BG, LYSOMAX, e cutinase
14 . PROPERASE L, LAMINEX BG, LYSOMAX e cutinase.
As misturas enzimáticas mais particularmente preferenciais são as combinações 1, 2, 3, e 4 listadas acima. As combinações enzimáticas adicionais particularmente preferenciais incluem: SPEZYME, que compreen- de uma alfa-amilase obtida a partir do Bacillus Iicheniformis; CuCONC, que é 15 a marca para a cepa Koji de glicoamilase Rhizopus niveus que tem atividade hidrolisante de amido granular (Shin Nihon Chemical Co. Ltd. Japão); AFP GC106, que é uma protease ácida de fungos (Shin Nihon Chemical Co. Ltd. Japão); M1, que está disponível a partir da Biocon lndia, Ltd, Bangalore, ín- dia); ARIS SUMIZYNE (1,5-alfa arabinase), e ACH SUMIZYNE.
15. SPEZYME FRED L, CuCON e LAMINEX BG.
16. SPEZYME FRED L, Aris SUMIZYME e LAMINEX BG.
17 . SPEZYME FRED L, e CuCONC.
18. SPEZYME FRED L, CuCONCeGCI06.
19. SPEZYME FRED LeGCI06.
20. SPEZYMEFREDLeMI.
21. SPEZYME FRED L, Aris SUMIZYNE e GC106.
22 . SPEZYME FRED L, CuCONC, LAMINEX BG e GC106.
23 . SPEZYME FRED L, ACH SUMIZYME e GC106.
24 . SPEZYME FRED L, Aris SUMIZYME, LAMINEX BG e GC106.
25. CuCONC e LAMINEX BG.
26. SPEZYME FRED Le Aris SUMIZYME.
27. M1 e LAMINEX BG. 28. SPEZYME FRED L, LAMINEX BGeGCI06.
29. CuCONC, LAMINEX BGeGCI06.
Metodologia
As misturas enzimáticas desta invenção são adicionadas ao bio- 5 filme em quantidades eficazes para remover o biofilme. A dosagem precisa não é crucial para a invenção e pode variar amplamente dependendo da na- tureza da superfície a ser tratada, e nas condições de tratamento, tais como o pH e a temperatura. Nos exemplos, a quantidade de enzima usada foi até uma quantidade total de aproximadamente 1%, e em alguns casos de 3% a 10 aproximadamente 6%.
O método da presente invenção é preferencialmente executado dentro de uma faixa de pH onde as enzimas da mistura enzimática estão ativas. Geralmente, o pH da composição de remoção de biofilme está na faixa de aproximadamente 4 a aproximadamente 9.
O método da invenção é preferencialmente executado em uma
temperatura onde as enzimas que compreendem a mistura estão ativas, e geralmente é de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50°C.
Na descrição experimental que segue, as seguintes abreviações se aplicam: eq (equivalentes); M (Molar), μΜ (micromolar); N (Normal); mol 20 (mois); mmol (milimoles); μιηοΙ (micromols); nmol (nanomols); g (gramas); mg (miligramas); kg (quilogramas); μg (microgramas); L (litros); ml (mililitros); μΙ (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μηη (micrometros); nm (nanometros); 0C (graus Centígrados); h (horas); min (minutos); seg (segun- dos); mseg (milisegundos); U (unidade); IU (Unidade Internacional).
Preparação das Misturas Enzimáticas
Todas as várias combinações de misturas enzimáticas para tria- gem da eficiência contra a prevenção e remoção de biofilme foram prepara- das com base no peso. Em alguns casos, 1% do peso de cada enzima foi misturado para uma combinação enzimática desejada em um tampão dese- 30 jado, criando as misturas enzimáticas em uma dosagem de 3% do peso, 4% do peso, 5% do peso, e 6% do peso. A adição de todas as enzimas foi se- qüencial e as proteases foram adicionadas por último antes do início do tra- tamento de biofilme. Uma mistura enzimática economicamente mais relevan- te para estudos adicionais foi criada, onde a combinação de todas as enzi- mas em uma mistura foi configurada para a quantidade combinada total final de 1%. Novamente, a adição de todas as enzimas foi seqüencial e as prote- 5 ases foram adicionadas por último antes do início do tratamento de biofilme. As enzimas na mistura não necessitam ser adicionadas seqüencialmente e podem ser adicionadas ao mesmo tempo.
Exemplos
A presente invenção é descrita em detalhes adicionais nos se- 10 guintes exemplos que não pretendem de forma alguma limitar o escopo da invenção como reivindicado. As figuras em anexo são consideradas como partes integrais da especificação e descrição da invenção. Todas as referên- cias citadas estão aqui especificamente incorporadas por referência para tudo que é descrito aqui. Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, 15 mas não limitar a invenção reivindicada.
A variedade de misturas enzimáticas foi submetida à triagem testando a capacidade de cada mistura em remover os biofilmes Pseudomo- nas aeruginosa. A triagem foi executada usando um método de placas de microtitulação de 96 cavidades de alto rendimento.
Exemplo 1:
Configuração Experimental Geral
Um método de alto rendimento foi usado para submeter à tria- gem um grande número de misturas enzimáticas baseadas em uma matriz de enzimas de estudo projetada. PBS e tampões de acetato foram usados 25 para preparar as soluções (tampão Tris: pH 7,0 ou 8,5 e tampão acetato: pH 5,0). Várias combinação de misturas enzimáticas foram feitas a partir de en- zimas de acordo com as especificações de pH e temperatura das enzimas. Uma tabela contendo todas as 375 diferentes combinações está incluída como um apêndice A em anexo. Um método com 96 cavidades foi usado 30 para triagem das 375 diferentes combinações de enzimas com 4 cópias de cada. Esta análise permitiu a formação de biofilmes nas cavidades das pla- cas de microtitulação de 96 cavidades, que podem ser usadas para fornecer até 96 amostras de teste diferentes. O cultivo de inóculo bacteriano (Pseu- domonas aeruginosa, P01, formação de biofilme) foi desenvolvido em caldo tríptico de soja (TSB) a 210C de um dia para o outro em um frasco de agita- ção. 20 ml desse caldo foram então adicionados a outros 180 ml de caldo 5 tríptico de soja fresco em outro frasco de agitação. 200 μΙ desse inóculo dilu- ído foram então adicionados a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades usando um replicador de 96 pinos. A cada 8-10 horas, os nutrientes, as célu- las planctônicas e meios planctônicos foram aspirados e substituídos com o meio TSB fresco. Os biofilmes foram desenvolvidos nas cavidades por 24 10 horas a 21 °C. Seguindo a formação de biofilme, os meios foram removidos da placa de 96 cavidades e as várias enzimas e várias soluções de trata- mento de controle foram transferidos às cavidades da placa. Os biofilmes foram molhados por um dado período de tempo (90 minutos foram usados para esse estudo). As cavidades foram então enxaguadas duas vezes, com 15 a água desionizada, para remover qualquer solução de tratamento restante e células suspensas do sistema. O biofilme foi então manchado com violeta cristal por 10 minutos. As cavidades foram enxaguadas 4 vezes para remo- ver qualquer excesso de mancha do sistema, e então eluídas com 300 μΙ de etanol. A etapa de eluição aperfeiçoou a detecção de mancha durante as 20 análises. A placa foi então lida imediatamente com um leitor de placa de mi- crotitulação (J. microbiological methods 54 (2003) 269-276). Todos os trata- mentos foram executados com ao menos 4 cópias. Sob as condições de tri- agem, os controles de branqueamento tiveram uma redução de 75% com pH de 7,0, de 75% em pH de 5,0, e uma redução de 93% em pH 8,0.
Remoção de biofilme sob condição de pH ácido
As enzimas específicas tais como proteases, lipases, celulases, e outras carboidrases que são eficazes para suas ações hidrolíticas sob condições ácidas (pH 5) foram selecionadas para triagem por sua eficiência em remover biofilme. Por exemplo, a protease ácida GC106 foi usada para 30 esse estudo em combinações com lipases, celulases e outras carboidrases que são eficazes em suas ações sob condições ácidas. 17 matrizes de com- binações enzimáticas fora das 375 combinações triadas a partir desse estu- do alcançaram 69-88% de remoção de biofilme.
Remoção de biofilme sob condição de pH neutro
As enzimas específicas tais como proteases, lipases, celulases, e carboidrases que são eficazes para suas ações hidrolíticas sob condições 5 neutras (pH 7) foram selecionadas para triagem por sua eficácia para remo- ver biofilme. Por exemplo, a protease neutra foi usada para esse estudo em combinações com lipases, celulases e outras carboidrases que são eficazes em suas ações sob condições neutras. 5 matrizes de combinações enzimáti- cas triadas a partir desse estudo alcançaram 71-84% de remoção de biofil- 10 me.
Remoção de biofilme sob condição de pH básico
As enzimas específicas tais como proteases alcalinas, lipases, celulases, e outras carboidrases que são eficazes para suas ações hidrolíti- cas sob condições alcalinas (pH 8,4) foram selecionadas para triagem pela 15 sua eficácia em remover biofilme. Por exemplo, as proteases de serina tal como a FNA, Purafact, Proparase foram usadas para esse estudo em com- binações com lipases, celulases e outras carboidrases que são eficazes em suas ações sob condições básicas. 11 matrizes de combinações enzimáticas triadas a partir desse estudo alcançaram 70-80% de remoção de biofilme.
Análise Estatística de Dados
Os dados foram analisados por significância estatística. Uma análise da variância determinou as seguintes trinta e três (33) misturas enzimáti- cas como sendo estatisticamente diferentes dos controles. A taxa de erro em famílias foi configurada em 0,05, ou seja, para ser 95% confiante de que não ha- 25 verá resultados positivos falsos em um conjunto de 143 resultados de testes a partir do exemplo 4. Para executar isso, configura-se cada taxa de erro de com- paração para Epc = 0,00036 porque 0,05 = 1-(1-0,00036)143. Os resultados in- dividuais derivados desta análise são Definitivamente Significativos, isto é, esta- tisticamente significativamente maior que zero em um nível Epc de 0,00036. Os 30 detalhes deste método para análise estatística podem ser encontrados no se- guinte website. http://core.ecu.edu/psvc/wuenschk/docs30/multcomp.doc e o conceito está bem ilustrado nesse website http://www.brettscaife.net/statistics/introstat/08multiple/lecture.html.
As misturas enzimáticas eficazes para remoção de biofilme de ao menos 40% de biofilme são listadas na Tabela 1 em suas ordens de re- dução para cada um dos diferentes conjuntos de enzimas.
Tabela 1. Remoção de biofilme para várias combinações de enzimas
Combinação de enzimas Porcentagem Condições de remoção Controle de alvejante 93 Básica Pep 3, Cel 2, Pal 2 84 Básica Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 2 82 Básica Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 1 80 Básica Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1, Pal 1 80 Básica Pep 1,2,4, Car 1, Pal 1, Pal 2 78 Básica Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1 77 Básica Pep 2,4, Cel 1, Cel 2, Car 1, Pal 1 76 Básica Pep 4, Cel 1, Pal 1, Pal 2 75 Básica Pep 2,4, Cel 2, Pal 1 75 Básica Pep 1,4, Cel 2, Car 1, PaM 74 Básica Controle de alvejante 75 Neutra Pep 1,2,4, Cel 1, Cel 2, Pal 1 72 Neutra Pep 1,2,4, Cel 1, Car 1, Pal 1 72 Neutra Pep 1,2,4, Cel 2, Pal 1, Pal 2 72 Neutra Pep 3, Cel 1, Cel 2, Pal 1, Pal 2 72 Neutra Pep 1,4, Cel 2, Pal 1, Pal 2 70 Neutra Controle de alvejante 75 Ácida Car 2&7, Cel 2 88 Ácida Car 2&4, Cel 2 83 Ácida Car2&7 81 Ácida Car 2&7, Pep 5 81 Ácida Car 2, Pep 5 81 Ácida Car 2&6, 78 Ácida Combinação de enzimas Porcentagem Condições de remoção Car 2&4, Pep 5 78 Ácida Car 2&7, Cel 2, Pep 5 77 Ácida Car 2&5, Pep 5 77 Ácida Car 2&4, Cel 2, Pep 5 77 Ácida Car 7, Cel 2 75 Ácida Car 2&4 75 Ácida Car 6, Cel 2 74 Ácida Car 2, Cel 2, Pep 5 72 Ácida Car 7, Cel 2, Pep 5 72 Ácida Car 2&6, Cel 2 69 Ácida Car 2&5, Cel 2, Pep 5 69 Ácida A tabela 2 abaixo fornece uma chave para identificar a enzima nas misturas mostradas na Tabela 1.
Código Nome da enzima Tipo de enzima CAR1 GC265 MANANASE CAR2 SPEZYME FRED-L ALFA-AMILASE CAR4 ARIS SUMIZYME 1,5-alfa L arabinase CAR5 ACH SUMIZYME Beta mananase CAR6 BIOCON M1 Mistura de amilase CAR7 CUCONC SUMIZYME Mistura de amilase CEL1 PURADAX CELULASE CEL 2 LAMINEX BG GLUCANASE PAL1 LYSOMAX FOSFOLIPASE PAL2 CUTINASE ESTERASE PEP1 PROPERASE PROTEASE PEP2 PURAFECT PROTEASE PEP3 MULTIFECT NEUTRAL PROTEASE PEP4 FNA PROTEASE PEP5 GC106 PROTEASE Os dados fornecidos pelo método de alto rendimento foram úteis na triagem de um número grande de misturas. A investigação adicional das misturas candidatas foi a seguir executada para confirmar sua eficácia con- tra os biofilmes, incluindo os biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, Listeria 5 moncytogenes, Staphylococcus aureus, e biofilmes de consórcio com água potável.
Trinta misturas enzimáticas foram avaliadas para remoção do biofilme por Pseudomonas e as seis misturas enzimáticas de mais alto de- sempenho foram usadas para avaliar a remoção de outros biofilmes como descrito abaixo.
Exemplo 2: Avaliação das Misturas Enzimáticas da Tabela 1 com o Reator de biofilme DCD Materiais e métodos
As misturas enzimáticas na Tabela 1 foram avaliadas para re- moção de biofilme usando um sistema de modelo em laboratório, o Reator de Biofilme CDC (modelo CBR 90, Corporação de Tecnologias de Biosuper- fície, Bozeman, MT). Esse sistema foi desenvolvido pelos Centros de Con- trole de Doenças e tem sido usado para estudar os biofilmes formados por várias espécies de bactérias. O Reator de Biofilme CDC consiste de um re- cipiente de um litro com oito porta-cupons de polipropileno suspensos a par- tir da tampa. Cada porta-cupom pode acomodar três cupons de amostra com diâmetro de 12,7 mm (0,5 polegada). Para os experimentos relatados aqui, os cupons de amostra foram construídos de poliestireno, para serem consis- tentes com ensaios de triagem de alto rendimento que foram executados usando placas de microtitulação de poliestireno. Dois reatores de biofilme CDC foram operados em paralelo fornecendo um total de 48 cupons amostra por experimento. O meio de crescimento líquido inserido através do topo do recipiente e excitado via uma porta de descarga de braço lateral. Uma barra de agitação magnética incorporando uma lâmina de mistura forneceu a mis- tura de fluidos e o cisalhamento de superfície.
1. Biofilme de Pseudomonas aeruginosa
Os recipientes do Reator de Biofilme CDC com um volume de trabalho de aproximadamente 400 ml contendo o meio de caldo tríptico de soja com concentração de 10% foram inoculados com P. aeruginosa e ope- rados no modo por lote (sem meio de entrada) por 6 horas a 37°C. Após es- tabelecer o cultivo por lote, o fluxo de meio em uma taxa de 600 ml/h foi for- 5 necido para 42 horas adicionais para estabelecer biofilmes de P. aeruginosa nos cupons de amostra de poliestireno. No final do período de crescimento de biofilme, seis cupons de controle foram removidos de cada um dos dois reatores e enxaguados com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para remover bactérias não-ligadas. Três dos cupons de cada reator 10 foram então analisados para biofilme usando o método de coloração com violeta cristal descrito abaixo. Os três cupons de controle restantes de cada reator foram sonicados em PBS, serialmente diluídos, e laminados em ágar tríptico de soja para enumerar o número de bactérias cultiváveis dentro do biofilme.
Os 30 cupons de teste restantes e os 6 cupons de controle fo-
ram transferidos às placas de cultivo de tecido de 12 cavidades e tratados com as misturas enzimáticas de alto desempenho, usadas em uma dosagem de enzima de 1% do peso total da enzima, em tampão por 90 minutos a 45°C. Os seis cupons de controle foram tratados com o mesmo tampão usa- 20 do para preparar as misturas enzimáticas. Seguindo os tratamentos, os cu- pons foram enxaguados por três vezes com PBS e analisados para biofilme usando o método de coloração com violeta cristal. Esse método consistiu de imergir os cupons em uma solução de violeta cristal (0,31% do peso por vo- lume) por dez minutos, enxaguar os cupons três vezes em PBS para remo- 25 ver a mancha não-ligada. A mancha ligada foi então extraída do biofilme u- sando 95% de etanol e a absorção da solução de violeta cristal/etanol foi lida em 540 nm. A porcentagem de remoção de biofilme de Pseudomonas foi calculada a partir da equação [(1-Fração restante de biofilme)* x 100]. A fra- ção restante de biofilme foi calculada subtraindo-se a absorção do meio + 30 soluções enzimáticas da absorção das soluções extraídas dos biofilmes tra- tados com enzima e que foi dividida pela diferença na absorção desses bio- filmes de controle não-tratados menos a absorção do meio de crescimento somente. A espessura média dos biofilmes era 0,2 mm.
1. Biofilme Pseudomonas aeruginosa
A porcentagem de remoção de biofilme avaliada usando biofil- mes desenvolvidos no CDC-BR foi ligeiramente menor que aqueles determi- nados previamente usando o Ensaio de Triagem de Alto Rendimento (HTA), como mostrado abaixo na Tabela 3. Isso ocorre provavelmente devido à na- tureza mais tenaz dos biofilmes desenvolvidos no CDC-BR. O CDC-BR cria um ambiente de cisalhamento mais elevado que o método de placa de mi- crotitulação de 96 cavidades usada para ο ΗΤΑ, o que provavelmente resul- tou em biofilmes que eram mais difíceis de remover. Entretanto, a remoção de biofilme de até 77% foi observada com algumas das combinações enzi- máticas. A combinação de "Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1, Pal 1" classificou um nono dos testes HTA em 80% de remoção, mas desempenhou melhor do que qualquer outra combinação nos biofilmes CDC-BR com 77% de remo- ção. A remoção de biofilme de porcentagem mais elevada foi observada pa- ra misturas enzimáticas preparadas em tampão alcalino (50 mM Bis-Tris, pH 8,5).
Tabela 3. Resultados dos testes de remoção de biofilme usando os biofilmes Pseudomonas aeruginosa desenvolvidos com o Reator de Biofilme CDC.
Combinação enzimática Remoção* Remoção Desvio- n CDC-BR de % HTA de % Padrão CDC-BR CDC-BR Controle de alvejante 75-93 75-93 Pep 3, Cel 2, Pal 2 84 51 15 4 Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 2 82 61 19 4 Pep 3, Cel 2, Car 1, Pal 1 80 51 17 4 Pep 1,2,4, Cel 2, Car 1, Pal 1 80 77 5 3 Pep 1,2,4, Car 1, Pal 1, Pal 2 78 73 j 13 3 Pep 1,2,4, Cel 1, Cel 2, Car 1, Pal 1 77 75 7 3 Pep 2,4, Cel 1, Cel 2, Car 1, Pal 1 76 58 13 3 Pep 3, Cel 2, Car 1 76 51 26 3 Pep 4, Cel 1, Pal 1, Pal 2 75 66 4 3 Combinação enzimática Remoção* Remoção Desvio- n CDC-BR de % HTA de % Pad rão CDC-BR CDC-BR Pep 2,4, Cel 2, Pal 1 75 63 8 3 Pep 1,4, Cel 2, Car 1, Pal 1 74 59 23 3 Pep 1,2,4, Cel 1, Cel 1, Pal 1 72 74 9 3 Pep 1,2,4, Cel 2, Pal 1, Pal 2 72 58 28 3 Pep 3, Cel 1, Cel 2, Pal 1, Pal 2 71 60 9 4 Car 2&4, Cel 2 83 67 5 3 Car2&7 81 51 11 2 Car 2&7, Pep 5 81 37 25 3 Car 2, Pep 5 81 35 32 2 Car 2&6 78 15 20 2 Car 2&4, Pep 5 78 28 4 2 Car 2&7, Cel 2, Pep 5 77 35 n/a 1 Car 2&5, Pep 5 77 31 n/a 1 Car 2&4, Cel 2, Pep 5 77 24 n/a 1 Car 7, Cel 2 75 36 33 3 Car 2&4 75 50 12 3 Car 6, Cel 2 74 26 4 2 Car 2, Cel 2, Pep 5 72 9 7 2 Car 7, Cel 2, Pep 5 72 54 18 3 O teste das 30 misturas enzimáticas usando o sistema de Reator
de Biofilme CDC com Pseudomonas aeruginosA revelou vinte misturas en- zimáticas com remoção de biofilme maior que 40%, 19 misturas com porcen- tagens de remoção de biofilme maiores que 50%, 10 misturas com porcen- 5 tagens de remoção de biofilme maiores que 60%, e 4 misturas maiores que 70%. A maioria das misturas enzimáticas preferenciais que revelou-se ser mais eficazes na remoção de biofilme Pseudomonas está em condições al- calinas a neutras baseadas em ambas as análises de remoção de biofilme baseadas em reatores HTP e CDC de biofilme Pseudomonas aeruginosa.
Sob condições ácidas, a mistura de desempenho mais elevado encontrada foi Car2 + Car7 + Cel2. A Cel2 foi encontrada na maioria das misturas enzi- máticas eficazes testadas para a remoção de biofilme por Pseudomonas. Exemplo 3
As seguintes misturas enzimáticas foram testadas para verificar suas eficácias em oposição a três outras baseadas em biofilme comercial- mente relevante baseado em dados CDC de Pseudomonas e um estudo de HTP separado em um modelo de quatro espécies de biofilme dentário. Con- siderando o tempo prático disponível para a limpeza e a possível dosagem econômica. O tempo de contato de mistura enzimática de limpeza com os cupons de biofilme foi reduzido em 40 minutos e a concentração enzimática final de todos os componentes de enzima nas misturas enzimáticas foi limi- tada a um total de 1%. Por exemplo, a mistura enzimática PEP5 + CAR2 + CEL3 continha 0,33 + 0,33 + 0,34% de cada enzima fornecendo a dosagem de mistura enzimática final para teste de 1%.
O teste foi conduzido em três pHs listados abaixo usando seis misturas enzimáticas listadas abaixo. Os testes foram conduzidos em biofil- mes por Listeria, Estafilococo, e água potável. pH 5,5
1. PEP5 + CAR2 + CEL3
2. PEP5 + CAR2 + CEL2 pH 7,0
1. PEP6 + PAL2 + CEL3
1. PEP3 + PAL2 + CEL2
pH 8,5
1. PEP1 + PEP2 + PEP4 + CEL2 + CAR1 + PAL1
1. PEP4 + CEL1 + PAL1 + PAL2 Exemplo 4: Biofilme por Listeria moncytogenes
Os recipientes do Reator de Biofilme CDC tendo cupons de aço inoxidável com um volume de trabalho de aproximadamente 400 ml conten- do o meio de Infusão de Cérebro e Coração (BHI) com concentração de 10% foram inoculados com 4 ml de um cultivo de Listeria monocytogenes de um dia para o outro (ATCC 19112) em Infusão de Cérebro e Coração (BHI) com concentração de 10% a 37°C. O reator CDR foi operado em um modo por batelada por 24 horas seguido pela alimentação contínua de fluxo (meio BHI) em 7 ml/min pelas próximas 24 horas. Após 48 horas (24 por batelada + 24 contínuas), o reator foi desligado e desmontado. Pinças estéreis foram 5 usadas para remover todos os cupons de aço inoxidável dos bastões, tocan- do o menos possível a frente e a traseira dos cupons, e os cupons foram colocados em placas estéreis de 12 cavidades para tratamento. Um total de
24 cupons por reator estava disponível e três cupons foram tratados com cada combinação de mistura enzimática (seis combinações, concentração 10 de misturas enzimáticas total de 1% de todos os componentes enzimáticos combinados, 40 minutos, 45°C. Três cupons não foram tratados e foram u- sados como controles não-tratados. Todos os cupons tratados foram remo- vidos do tratamento e enxaguados em PBS por três vezes e colocados em uma solução de violeta cristal a 75% (Protocolo Violeta Cristal) em uma pla- 15 ca de doze cavidades, por dez minutos. Após a coloração, os cupons foram enxaguados em PBS por três vezes e colocados em 5,0 ml de etanol a 95% e colocados no agitador em temperatura ambiente por 5 minutos para eluir o violeta cristal. As soluções eluídas foram então pipetadas em cadinhos e lidas no espectrofotômetro em 540 nm. A porcentagem de remoção do bio- 20 filme por Listeria foi calculada a partir da equação [(1-Fração restante de biofilme)* 100], A fração restante de biofilme foi calculada subtraindo-se a absorção do meio + soluções enzimáticas da absorção das soluções extraí- das dos biofilmes tratados por enzima e essa foi dividida pela diferença na absorção destes biofilmes de controle não-tratados menos a absorção do
meio de crescimento somente.
Tabela 4: Resultados da remoção do biofilme por Listeria pelas misturas en- zimáticas da Genencor usando o reator CDC
Combinação enzimática Remoção Desvio- n CDC-BR de % padrão CDC-BR CDC-BR Controle de alvejante (Básico) 93 Controle de alvejante (Neutro) 75 Combinação enzimática Remoção Desvio- n CDC-BR de % padrão CDC-BR CDC-BR Controle de alvejante (Ácido) 75 PEP5 + CAR2 + CEL3 39 8 3 PEP5 + CAR2 + CEL2 30 35 3 PEP3 + PAL2 + CEL2 40 2 3 PEP6 + PAL2 + CEL3 41 10 3 PEP4 + CEL1 + PAL1 + PAL2 51 21 3 PEP1 + PEP2 + PEP4 + CEL2 + CAR1 + PAL1 56 13 3 Todas as seis misturas enzimáticas testadas mostraram alguma eficácia em direção à remoção de biofilme por Listeria, e quatro combina- ções enzimáticas baseadas em pH alcalino forneceram mais de 40% de re- moção de biofilme, particularmente a mistura enzimática PEP1 + PEP2 + 5 PEP4 + CEL2 + CAR1 + PAL1.
Exemplo 5: Biofilme por Staphylococcus aureus
Os recipientes do Reator de Biofilme CDC tendo cupons de poli- uretano com um volume de trabalho de aproximadamente 400 ml contendo o meio de caldo tríptico de soja (TSB) a 10% foram inoculados com 4 ml de 10 uma cultura de um dia para o outro de Staphylococcus aureus (SRWC- 10943) em meio TSB a 10% a 37°C. O reator CDR foi operado em um modo por batelada por 24 horas seguidas pela alimentação contínua de fluxo (meio TSB) em 7 ml/min pelas próximas 24 horas. Após 48 horas (24 por batelada + 24 contínuas), o reator foi desligado e desmontado. Pinças estéreis foram 15 usadas para remover todos os cupons de poliuretano dos bastões, tocar o menos possível a frente e a traseira dos cupons, e os cupons foram colocados nas placas estéreis de 12 cavidades para tratamento. Um total de 24 cupons por reator estava disponível e três cupons foram tratados com cada combi- nação de mistura enzimática (sete combinações, um total de 1% de concen- 20 tração de misturas enzimáticas de todos os componentes combinados, 40 minutos, 45°C). Três cupons não foram tratados e foram usados como con- troles não-tratados. Todos os cupons tratados foram removidos do tratamen- to e enxaguados em PBS por três vezes e colocados em uma solução de violeta cristal a 75% (Protocolo de Violeta Cristal) em uma placa de doze cavidades, por dez minutos. Após coloração, os cupons foram enxaguados em PBS por três vezes e colocados em 5,0 ml de etanol a 95% e colocados 5 no agitador em temperatura ambiente por 5 minutos para eluir o violeta cris- tal. As soluções eluídas foram então pipetadas em cadinhos e lidas no es- pectrofotômetro em 540 nm. A porcentagem de remoção de biofilme por Lis- teria foi calculada a partir da equação [(1-Fração restante de biofilme)* 100]. A fração restante de biofilme foi calculada subtraindo-se a absorção do meio 10 + soluções enzimáticas da absorção das soluções extraídas dos biofilmes tratados por enzima e dividida pela diferença na absorção destes biofilmes de controle não-tratados menos a absorção do meio de crescimento somen- te.
Tabela 5: Resultados da remoção de biofilme por Staphylococcus aureus pelas misturas enzimáticas usando o Reator CDC
Combinação enzimática Remoção Desvio- n CDC-BR de % padrão CDC-BR CDC-BR Controle de alvejante (Básico, Neutro e Ácido) 93, 75, 75 PEP5 + CAR2 + CEL3 25 8 3 PEP5 + CAR2 + CEL2 30 10 3 PEP3 + PAL2 + CEL2 36 8 3 PEP6 + PAL2 + CEL3 32 19 3 PEP4 + CEL1 + PAL1 + PAL2 28 18 3 PEP1 + PEP2 + PEP4 +CEL2 + CAR1 + PAL1 41 8 3 Todas as seis enzimas testadas mostraram alguma eficácia em
direção à remoção de biofilme Listeria, e uma combinação enzimática base- ada em pH alcalino, forneceram ao menos 40% de remoção de biofilme. Exemplo 6: Biofilme de Consórcio de Água Potável Um garrafão estéril para ácidos de 20 L com 19 L de água potá-
vel BAC/GAC (contendo consórcio de água potável misturado de baixo CFU) e 1 L de solução de alteração de carbono dos seguintes ingredientes foi pre- parado para alcançar a concentração de carbono adicional, ácido L-glutâmico...0,0047 g/L ácido L-aspártico....0,0053 g/L
L-serina...................0.0055 a/L
L-alanina.................0,0047 g/L
D+ glicose...............0,0048 g/L
D+ galactose...........0,0048 g/L
D- arabinose............0,0048 g/L
Os reatores CDC estéreis foram colocados em uma capela de 10 fluxo laminar e foram depositados na saída com água BAC/GAC. No incuba- dor a 37°C, a conexão de todos os tubos à entrada e saída foi feita e os rea- tores CDC foram colocados na placa de agitação. Os reatores foram ligados por 24 horas em bateladas seguidos pelo fluxo contínuo de água BAC/GAC suplementada por carbono) em 7 ml/min pelas próximas 24 horas. No final 15 de 48 horas (24 por batelada + 24 contínuas), o fluxo influente foi desligado, o meio foi derramado a partir dos reatores em um recipiente para resíduos e os reatores foram localizados em uma capela de fluxo laminar.
Usando pinças estéreis, todos os cupons foram removidos dos bastões, sem tocar a frente e traseira dos cupons. Os cupons de PVC con- tendo o biofilme de consórcio de água potável foram então colocados em placas estéreis de 12 cavidades para tratamento.
Um total de 24 cupons por reator estava disponível e três cupons foram tratados com cada combinação de mistura enzimática (sete combina- ções, um total de 1% de concentração, 40 minutos, 45°C). Três cupons não
foram tratados e foram usados como controles não-tratados. Todos os cu- pons tratados foram removidos do tratamento e enxaguados em PBS por três vezes e colocados em uma solução de violeta cristal a 75% (Protocolo de Violeta Cristal) em uma placa de doze cavidades, por dez minutos. Após coloração, os cupons foram enxaguados em PBS por três vezes e colocados 30 em 5,0 ml de etanol a 95% e colocados no agitador em temperatura ambien- te por 5 minutos para eluir o violeta cristal. As soluções eluídas foram então pipetadas em cadinhos e lidas no espectrofotômetro em 540 nm. A porcen- tagem de remoção do biofilme por Listeria foi calculada a partir da equação [(1-Fração restante de biofilme)* 100], A fração restante de biofilme é calcu- lada subtraindo-se a absorção do meio + soluções enzimáticas da absorção das soluções extraídas dos biofilmes tratados por enzima e essa foi dividida 5 pela diferença na absorção desses biofilmes de controle não-tratados menos a absorção do meio de crescimento somente.
Tabela 7: Resultados da remoção de biofilme de consórcio de água potável por misturas enzimáticas da Genencor usando o reator CDC
Combinação enzimática Remoção Desvio- n CDC-BR de % padrão CDC-BR CDC-BR Controle de alvejante (Básico, Neutro e Ácido) 93, 75, 75 PEP5 + CAR2 + CEL3 7 29 4 PEP5 + CAR2 + CEL2 12 18 4 PEP3 + PAL2 + CEL2 47 22 4 PEP6 + PAL2 + CEL3 43 16 4 PEP4 + CEL1 + PAL1 + PAL2 53 8 4 PEP1 + PEP2 + PEP4 + CEL2 + CAR1 + PAL1 59 8 4 Todas as seis enzimas testadas mostraram alguma eficácia em
direção à remoção de biofilme de consórcio de água potável, e quatro com- binações enzimáticas baseadas em pH alcalino, forneceram mais de 40% de remoção de biofilme, particularmente a mistura enzimática PEP1 + PEP2 + PEP4 + CEL2 + CAR1 + PAL1.
A maioria das misturas enzimáticas eficazes para todos os tipos 15 de remoção de biofilme foi uma combinação de FNA, Purafect L, Properase L, Laminex BG, Mananase GC265, e Lysomax sob condições alcalinas mo- deradas. Em condições neutras a ácidas, embora não tão eficaz quanto as mencionadas acima, a mistura enzimática foi compreendida de enzimas Mul- tifect Neutral, Laminex BG, e Cutinase.
Entende-se que os exemplos e modalidades descritos aqui são
somente para propósitos ilustrativos e que essas várias modificações ou mudanças devido a esses serão sugeridas aos versados na técnica e serão incluídas dentro do espírito e do alcance desta aplicação e do escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de pa- tentes citados aqui são incorporados aqui por referência em sua totalidade para todos os propósitos.
Apêndice A
pH 8,5; 45°C pH 8,5; 45°C PEP-1 PEP-2 PEP-1 + CEL-1 PEP-2 + CEL-1 PEP-1 + CEL-2 PEP-2 + CEL-2 PEP-1 + CEL-1 + CEL-2 PEP-2 + CEL-1 + CEL-2 PEP-1 + PAL-1 PEP-2 + PAL-1 PEP-1 + PAL-2 PEP-2 + PAL-2 PEP-1 + CAR-1 PEP-2 + CAR-1 PEP-1 + PAL-1 + PAL-2 PEP-2 + PAL-1 + PAL-2 PEP-1 + PAL-1 + CEL-1 PEP-2 + PAL-1 + CEL-1 PEP-1 + PAL-1 + CEL-2 PEP-2 + PAL-1 + CEL-2 PEP-1 + PAL-2 + CEL-1 PEP-2 + PAL-2 + CEL-1 PEP-1 + PAL-2 + CEL-2 PEP-2 + PAL-2 + CEL-2 PEP-1 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1 PEP-2 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1 PEP-1 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2 PEP-2 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2 PEP-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-2 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-1 + CEL-1 + CEL-2 +PAL-2 PEP-2 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2 PEP-1 + PAL-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2 PEP-2 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2 PEP-1 + CAR-1 + CEL-1 PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 PEP-1 + CAR-1 + CEL-2 PEP-2 + CAR-1 + CEL-2 PEP-1 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 PEP-1 + CAR-1 + PAL-1 PEP-2 + CAR-1 + PAL-1 PEP-1 + CAR-1 + PAL-2 PEP-2 + CAR-1 + PAL-2 PEP-1 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2 PEP-2 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2 PEP-1 + CAR-1 + CEL-1 + PAL-1 PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + PAL-1 PEP-1 + CAR-1 + CEL-1 +PAL-2 PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + PAL-2 PEP-1 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-2 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-1 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2 PEP-2 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2 PEP-1 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-1 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2 PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2 PEP-1 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2 PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2 CEL1 CEL1 + CEL2 CEL2 PAL1 + PAL2 PAL1 CEL1 + CAR1 PAL2 CEL2 + CAR1 CAR1 PAL1 + CAR1 PAL2 + CAR1 CEL1 + PAL1 CEL2 + PAL1 CEL2 + PAL2 CEL1 + PAL2 pH 7; 45°C_
PEP-3_
PEP-3 + CEL-1_
PEP-3 + CEL-2_
PEP-3 + CEL-1+ CEL-2_
PEP-3 + PAL-1_
PEP-3 + PAL-2_
PEP-3 + CAR1_
PEP-3 + PAL-1 + PAL-2_
PEP-3 + PAL-1 + CEL-1_
PEP-3 + PAL - 1 + CEL-2
PEP-3 + PAL-2 + CEL-1_
PEP-3 + PAL-2 + CEL-2_
PEP-3 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1 PEP-3 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2 PEP-3 + CEL-1 + CEL-2 + PAL1_
PEP-3 + CEL-1 + CEL-2 + PAL2_
PEP-3 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-1_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-2_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-1+ CEL-2_
PEP-3 + CAR-1 + PAL-1_
PEP-3 + CAR-1 + PAL-2_
PEP-3 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-1 + PAL1_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-1 + PAL2_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2_
PEP-3 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2 PEP-3 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2
pH 8,5; 45°C_
PEP-4_
PEP-4 + CEL-1_
PEP-4 + CEL-2_
PEP-4 + CEL-1 + CEL-2
PEP-4 + PAL-1_
PEP-4 + PAL-2_
PEP-4 + CAR-1_
PEP-4 + PAL-1 + PAL-2 PEP-4 + PAL-1 + CEL-1 PEP-4 + PAL-1 + CEL-2 PEP-4 + PAL-2 + CEL-1 PEP-4 + PAL-2 + CEL-2 PEP-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1_
PEP-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2_
PEP-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL1_
PEP-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL2_
PEP-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-1_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-2_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2_
PEP-4 + CAR-1 + PAL-1_
PEP-4 + CAR-1 + PAL-2_
PEP-4 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL1_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL2_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2_
PEP-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2
pH 8,5; 45°C_
PEP-1 + PEP-2_
PEP-1 + PEP-2 + CEL-1_
PEP-1 + PEP-2 + CEL-2_
PEP-1 + PEP-2 + CEL-1 + CEL-2
PEP-1 + PEP-2 + PAL-1_
PEP-1 + PEP-2 + PAL-2_
PEP-1 + PEP-2 + CAR1_
PEP-1 + PEP-2 + PAL-1 + PAL-2 PEP-1 + PEP-2 + PAL-1 + CEL-1 PEP-1 + PEP-2 + PAL-1 + CEL-2 PEP-1 + PEP-2 + PAL-2 + CEL-1 PEP-1 + PEP-2 + PAL-2 + CEL-2 PEP-1 + PEP-2 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1 PEP-1 + PEP-2 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2 PEP-1 + PEP-2 + CEL-1 + CEL-2 + PAL1 PEP-1 + PEP-2 + CEL-1 + CEL-2 + PAL2 PEP-1 + PEP-2 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-2 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + PAL-1 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + PAL-2 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + PAL1 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + PAL2 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 PEP-1 + PEP-2 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2 pH 8,5; 45°C_
PEP-1 + PEP-4_
PEP-1 + PEP-4 + CEL-1_
PEP-1 + PEP-4 + CEL-2_
PEP-1 + PEP-4 + CEL-1 +CEL-2
PEP-1 + PEP-4 + PAL-1_
PEP-1 + PEP-4 + PAL-2_
PEP-1 + PEP-4 + CAR-1_
PEP-1 + PEP-4 + PAL-1 + PAL-2 PEP-1 + PEP-4 + PAL-1 + CEL-1 PEP-1 + PEP-4 + PAL-1 + CEL-2 PEP-1 + PEP-4 + PAL-2 + CEL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 + CEL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CÀR- H CEL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2 pH 8,5; 45°C_
ΡΕΡ-1 + PEP4_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + CEL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 + CEL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ4 + CEL-1 + CEL-1 + PAL-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2 ___
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + CEL-2 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2
ρΗ 8,5; 45°C_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + CEL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 + CEL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 + CEL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ4 + CAR-1 + CEL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 CAR-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1 _____ _
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2_
ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2
ρΗ 8,5 cn 0 O ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 ΡΕΡ1 ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + CEL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + CEL-2_
ΡΕΡ1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 + CEL-1_
ΡΕΡ1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-2 + CEL-2_
ΡΕΡ1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + PAL-1 + PAL-2 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL2_
ΡΕΡ1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ4 + CAR-1 + CEL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + PAL-1 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + PAL2_
ΡΕΡ1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-1_
ΡΕΡ1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ4 + CAR-1 + CEL-2 + PAL-2_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1_
ΡΕΡ-1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-2_
PAP- 1 + ΡΕΡ-2 + ΡΕΡ-4 + CAR-1 + CEL-1 + CEL-2 + PAL-1 + PAL-2
ρΗ 5; 50°C ρΗ 5; 50°C ρΗ 5; 50°C ρΗ 5; 50°C CAR2 CAR3 CAR4 CAR5 CAR2 + ΡΕΡ5 CAR3 + ΡΕΡ5 CAR4 + ΡΕΡ5 CAR5 + ΡΕΡ5 CAR2 + CEL2 CAR3 + CEL2 CAR4 + CEL2 CAR 5 + CEL2 CAR2 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR3 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR4 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR5 + ΡΕΡ5 + CEL2 ΡΕΡ5 ΡΕΡ5 + CEL2 ρΗ 5; 50°C ρΗ 5; 50°C pH 5; 50°C CAR6 CAR7 CAR8 CAR6 + PEP5 CAR7 + PEP5 CAR8 + PEP5 CAR6 + CEL2 CAR7 + CEL2 CAR8 + CEL2 CAR6 + PEP5 +CEL2 CAR7 + PEP5 + CEL2 CAR8 + CEL2 + PEP5 pH 5; 50°C pH 5: 50°C pH 5; 50°C CAR2 + CAR3 CAR2 + CAR4 CAR2 + CAR5 CAR2 + CAR3 + PEP5 CAR2 + CAR4 + PEP5 CAR2 + CAR5 + PEP5 CAR2 + CAR3 + CEL2 CAR2 + CAR4 + CEL2 CAR2 + CAR5 + CEL2 CAR2 + CAR3 + PEP5 + CEL2 CAR2 + CAR4 + PEP5 + CEL2 CAR2 + CAR5 + PEP5 + CEL2 pH 5; 50°C pH 5; 50°C pH 5; 50°C CAR2 + CAR6 CAR2 + CAR7 CAR2 + CAR8 CAR2 + CAR6 + PEP5 CAR2 + CAR7 + PEP5 CAR2 + CAR8 + PEP5 CAR2 + CAR6 + CEL2 CAR2 + CAR7 + CEL2 CAR2 + CAR8 + CEL2 CAR2 + CAR6 + PEP5 + CEL2 CAR2 + CAR7 + PEP5 + CEL2 CAR2 + CAR8 + PEP5 + CEL2 CAR3 + CAR4 CAR3 + CAR5 CAR3 + CAR6 CAR3 + CAR4 + PEP5 CAR3 + CAR5 + PEP5 CAR3 + CAR 6 + PEP5 CAR3 + CAR4 + CEL2 CAR3 + CAR5 + CEL2 CAR3 + CAR 6 + CEL2 CAR3 + CAR4 + PEP5 +CEL2 CAR3 + CAR5 + PEP5 + CEL2 CAR3 + CAR 6 + PEP5 + CEL2 CAR3 + CAR7 CAR3 + CAR8 CAR4 + CAR5 CAR3 + CAR7 + PEP5 CAR3 + CAR8 + PEP5 CAR4 + CAR5 + PEP5 CAR3 + CAR7 + CEL2 CAR3 + CAR8 + CEL2 CAR4 + CAR5 + CEL2 CAR3 + CAR7 + PEP5 + CEL2 CAR3 + CAR8 + PEP5 + CEL2 CAR4 + CAR5 + PEP5 + CEL2 CAR4 + CAR6 CAR4 + CAR7 CAR4 + CAR8 CAR4 + CAR6 + ΡΕΡ5 CAR4 + CAR7 + ΡΕΡ5 CAR4 + CAR8 + ΡΕΡ5 CAR4 + CAR6 + CEL2 CAR4 + CAR7 + CEL2 CAR4 + CAR8 + CEL2 CAR4 + CAR6 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR4 + CAR7 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR4 + CAR8 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR5 + CAR6 CAR5 + CAR7 CAR5 + CAR8 CAR5 + CAR6 + ΡΕΡ5 CAR5 + CAR7 + ΡΕΡ5 CAR5 + CAR8 + ΡΕΡ5 CAR5 + CAR6 + CEL2 CAR5 + CAR7 + CEL2 CAR5 + CAR8 + CEL2 CAR5 + CAR6 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR5 + CAR7 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR5 + CAR8 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR6 + CAR7 CAR6 + CAR8 CAR6 + CAR7 + ΡΕΡ5 CAR6 + CAR8 + ΡΕΡ5 CAR6 + CAR7 + CEL2 CAR6 + CAR8 + CEL2 CAR6 + CAR7 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR6 + CAR8 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR7 + CAR8 CAR2 + CAR3 + CAR4 CAR7 + CAR8 + ΡΕΡ5 CAR2 + CAR3 + CAR4 + ΡΕΡ5 CAR7 + CAR8 + CEL2 CAR2 + CAR3 + CAR4 + CEL2 CAR7 + CAR8 + ΡΕΡ5 + CEL2 CAR2 + CAR3 + CAR4 + CEL2 + ΡΕΡ5 CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + ΡΕΡ5_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CEL2_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + PEP 5 + CEL2
5
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + ΡΕΡ5_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CEL2_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CEL2 + ΡΕΡ5 CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CAR7 CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CAR7 + ΡΕΡ5_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CAR7 + CEL2_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CAR7 + ΡΕΡ5 + CEL2_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CAR7 + CAR8_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR 5 + CAR6 + CAR7 + CAR8 + ΡΕΡ5_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CAR7 + CAR8 + CEL-2_
CAR2 + CAR3 + CAR4 + CAR5 + CAR6 + CAR7 + CAR8 + CEL2 + PEP5
Claims (18)
1. Composição para remover o biofilme de uma superfície, a composição compreendendo uma mistura enzimática tendo ao menos duas enzimas diferentes selecionadas a partir de protease, celulase, esterase, mananase, glucanase, fosfolipase e amilase.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a mis- tura enzimática é selecionada a partir da protease, glucanase e esterase; protease, glucanase, esterase e mananase; protease, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, glucanase, fosfolipase e mananase; três prote- ases, fosfolipase, esterase e mananase; três proteases, glucanase e mana- nase; duas proteases, celulase, glucanase, fosfolipase e mananase; protea- se, glucanase e mananase; protease, celulase, fosfolipase e esterase; duas proteases, glucanase, fosfolipase e esterase; duas proteases, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, celulase, fosfolipase e glucanase; três proteases, celulase, fosfolipase e mananase; três proteases, glucanase, fosfolipase e esterase; protease, celulase, glucanase, fosfolipase e esterase; duas ou mais amilases e glucanase; ao menos três amilases; ao menos du- as amilases, glucanase e protease.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a mis- tura enzimática é selecionada a partir de protease, glucanase, esterase e mananase; três proteases, glucanase, fosfolipase e mananase; três protea- ses, fosfolipase, esterase e mananase; três proteases, glucanase e mana- nase; protease, celulase, fosfolipase e esterase; duas proteases, glucanase, fosfolipase e esterase; três proteases, celulase, fosfolipase e mananase; protease, celulase, glucanase, fosfolipase e esterase; duas ou mais amilases e glucanase; e ao menos três amilases.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a mis- tura enzimática é selecionada a partir de três proteases, glucanase, fosfoli- pase e mananase; três proteases, fosfolipase, esterase e mananase; três proteases, glucanase e mananase; três proteases, celulase, fosfolipase e mananase.
5. Composição para remover biofilme de uma superfície com- preendendo uma mistura enzimática que consiste em três proteases, gluca- nase, fosfolipase e mananase.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, em que as pro-teases são de Bacillus subtilis EC 3.3.2.6 e Bacillus alcalophilus EC3.4.2.6, a glucanase é da espécie Trichoderma EC 3.3.1.6, a fosfolipase é da espé- cie Streptomyces EC 3.1.1.4, e a mananase é do Bacillus lentus.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita protease é selecionada a partir das proteases ácidas, neutras e básicas.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a pro- tease é selecionada a partir das seguintes proteases disponíveis comercial- mente: PROPERASE, PURAFECT, MULTIFECT NEUTRAL, FNA e GC106.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a celu- lase é PURADAX disponível comercialmente.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a es- terase é CUTINASE disponível comercialmente.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a mananase é GC265 ou HEMICELL disponíveis comercialmente.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a glucanase é LAMINEX BG disponível comercialmente.
13. Composição para remover biofilme em um pH neutro ou bá- sico que consiste essencialmente em uma mistura enzimática selecionada a partir do grupo que consiste em protease, glucanase e esterase; protease, glucanase, esterase e mananase; protease, glucanase, fosfolipase e mana- nase; três proteases, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, fosfolipase, esterase e mananase; três proteases, glucanase e mananase; duas proteases, celulase, glucanase, fosfolipase e mananase; protease, glu- canase e mananase; protease, celulase, fosfolipase e esterase; duas prote- ases, glucanase, fosfolipase e esterase; duas proteases, glucanase, fosfoli- pase e mananase; três proteases, celulase, fosfolipase e glucanase; três proteases, celulase, fosfolipase e mananase; três proteases, glucanase, fos- folipase e esterase; protease, celulase, glucanase, fosfolipase e esterase; duas ou mais amilases e glucanase; ao menos três amilases; ao menos du- as amilases, glucanase e protease.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, adicional- mente incluindo uma endoarabinase.
15. Composição para limpar biofilmes em uma mistura compre- endendo pHs ácidos consistindo essencialmente em uma mistura de enzi- mas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma mistura de amila- ses e glucanase; amilase, arabinase e glucanase; amilase e arabinase; e uma mistura de amilase, glucanase e protease.
16. Método para reduzir o biofilme em uma superfície, compre- endendo: a) fornecer uma mistura enzimática selecionada a partir de pro- tease, glucanase e esterase; protease, glucanase, esterase e mananase; protease, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, fosfolipase, esterase e mananase; três proteases, glucanase e mananase; duas proteases, celulase, glucanase, fosfolipase e mananase; protease, glucanase e mananase; protease, celula- se, fosfolipase e esterase; duas proteases, glucanase, fosfolipase e estera- se; duas proteases, glucanase, fosfolipase e mananase; três proteases, ce- lulase, fosfolipase e glucanase; três proteases, celulase, fosfolipase e mana- nase; três proteases, glucanase, fosfolipase e esterase; protease, celulase, glucanase, fosfolipase e esterase; duas ou mais amilases e glucanase; ao menos três amilases; ao menos duas amilases, glucanase e protease; e b) aplicar a mistura ao biofilme em uma superfície por um tempo suficiente para reduzir o biofilme em ao menos 40%.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, em que a) adi- cionalmente compreende fornecer uma mistura enzimática tendo aproxima- damente 1% a aproximadamente 6% de enzimas.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16, em que o biofil- me é Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, ou Staphylococcus aureus.
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| US20150299622A1 (en) * | 2012-11-05 | 2015-10-22 | Novozymes A/S | Enzyme Compositions Enabling Re-use of Water in Laundry |
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| US10842969B2 (en) | 2013-10-25 | 2020-11-24 | Mercator Medsystems, Inc. | Systems and methods of treating malacia by local delivery of hydrogel to augment tissue |
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| KR101587244B1 (ko) * | 2014-04-04 | 2016-01-20 | 서울대학교산학협력단 | 과열수증기를 이용한 바이오필름의 제거방법 |
| CN104286030A (zh) * | 2014-09-30 | 2015-01-21 | 中国海洋石油总公司 | 一种用于循环冷却水的生物酶生物粘泥抑制剂 |
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| CN105753142B (zh) * | 2016-04-18 | 2019-03-26 | 南京大学 | 一种曝气生物滤池填料生物膜的原位活化剂及原位活化方法 |
| EP3468583B1 (fr) * | 2016-06-08 | 2021-07-07 | OneLIFE S.A. | Composition comprenant au moins une enzyme et au moins une molécule microbicide pour la prévention ou le traitement des infections post-implantatoires |
| JP2019195281A (ja) * | 2018-05-08 | 2019-11-14 | 学校法人慈恵大学 | バイオフィルム抑制及び／又は除去剤 |
| CN110284359B (zh) * | 2019-05-30 | 2020-03-17 | 南京林业大学 | 使用基因工程菌控制造纸过程生物膜污染的方法 |
| GB202017605D0 (en) * | 2020-11-06 | 2020-12-23 | Smarti Env Ltd | biocidal Composition |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5310675A (en) * | 1983-06-24 | 1994-05-10 | Genencor, Inc. | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| US5624829A (en) * | 1984-07-03 | 1997-04-29 | Gist-Brocades, B.V. | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them |
| US4977523A (en) * | 1989-01-06 | 1990-12-11 | Eastman Kodak Company | Apparatus for the measurement of snow quality |
| CA2001538A1 (en) * | 1989-03-13 | 1990-09-13 | Christopher L. Wiatr | Application of glucanase to control industrial slime |
| US4994390A (en) * | 1989-03-13 | 1991-02-19 | Nalco Chemical Company | Enzyme blend containing cellulase to control industrial slime |
| US5071765A (en) * | 1989-03-13 | 1991-12-10 | Nalco Chemical Company | Application of multiple enzyme blend to control industrial slime on equipment surfaces |
| US5475101A (en) * | 1990-10-05 | 1995-12-12 | Genencor International, Inc. | DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase |
| DK0525166T3 (da) * | 1991-02-12 | 1995-09-25 | Buckman Labor Inc | Sammensætning og fremgangsmåder til fjernelse eller hindring af biofilm |
| PT867504E (pt) * | 1993-02-11 | 2003-08-29 | Genencor Int | Alfa-amilase estavel a oxidacao |
| TW474900B (en) * | 1995-05-19 | 2002-02-01 | Betzdearborn Inc | Use of mannanases as slime control agents |
| US5736499A (en) * | 1995-06-06 | 1998-04-07 | Genencor International, Inc. | Mutant A-amylase |
| US5958739A (en) * | 1996-06-06 | 1999-09-28 | Genencor International Inc. | Mutant α-amylase |
| US6100080A (en) * | 1996-12-18 | 2000-08-08 | Novo Nordisk A/S | Method for enzymatic treatment of biofilm |
| DE29825085U1 (de) * | 1997-08-14 | 2004-09-16 | The Procter & Gamble Company, Cincinnati | Detergenszusammensetzung umfassend eine Mannanase und eine Protease |
| US6274538B1 (en) * | 1997-11-10 | 2001-08-14 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions |
| US6777223B2 (en) * | 2000-06-19 | 2004-08-17 | Novozymes Biotech, Inc. | Methods for eliminating the formation of biofilm |
| AUPR575401A0 (en) * | 2001-06-18 | 2001-07-12 | Unisearch Limited | Method of causing sloughing |
| FR2846665B1 (fr) * | 2002-10-31 | 2006-09-08 | Karine Marion | Procede d'elimination du biofilm |
| US20050079594A1 (en) * | 2002-10-31 | 2005-04-14 | Karine Marion | Method of removing a biofilm |
| EP2258837A1 (en) * | 2004-09-10 | 2010-12-08 | Novozymes North America, Inc. | Methods for preventing, removing, reducing, or disrupting biofilm |
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