BRPI0716424B1

BRPI0716424B1 - Uso do antagonista de ligante delta-like 4 (dll4)

Info

Publication number: BRPI0716424B1
Application number: BRPI0716424-6A
Authority: BR
Inventors: J. Wiegang Stanley; J. Papadopoulos Nicholas; B. Lobov Ivan
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2006-08-07
Filing date: 2007-08-07
Publication date: 2018-06-26
Also published as: GT200900029A; WO2008019144A3; RS52685B; CN101500605B; CN101500605A; TN2009000036A1; ME00591B; SV2009003161A; RU2429876C2; NO341857B1; EP2054082A2; US20080181893A1; MY150092A; ES2398253T3; IL196612A0; CA2660235C; SG174033A1; MA30667B1; CO6150190A2; RU2009107921A

Description

(54) Título: USO DO ANTAGONISTA DE LIGANTE DELTA-LIKE 4 (DLL4) (51) Int.CI.: A61K 39/39; A61P 9/00; A61K 38/18 (30) Prioridade Unionista: 07/08/2006 US 60/836,003 (73) Titular(es): REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

(72) Inventor(es): STANLEY J. WIEGANG; NICHOLAS J. PAPADOPOULOS; IVAN B. LOBOV

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DO ANTAGONISTA DE LIGANTE DELTA-LIKE 4 (Dll4).

[001] Esta invenção refere-se de modo geral a métodos para o tratamento de distúrbios vasculares e isquêmicos pela administração de composições que inibem a interação de Dll4 com receptores Notch, e/ou ativação de receptor Notch. Mais especificamente, esta invenção refere-se a métodos para o tratamento de distúrbios vasculares ou isquêmicos do olho pela administração de composições que inibem a interação de Dll4 com receptores Notch.

ANTECEDENTES [002] A angiogênese é um processo fundamental requerido para o desenvolvimento e crescimento normal de órgãos e tecidos, e envolve a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos preexistentes. A angiogênese e a homeostase de vasos sanguíneos são rigorosamente controladas através de um sistema altamente regulado de moduladores angiogênicos. O desvio de um controle tão rigoroso muitas vezes leva ou é associado com doença.

[003] Enquanto a angiogênese não regulada “excessiva” ou aberrante é característica de numerosos estados de doença, a angiogênese insuficiente, perda de vasos sangüíneos ou oclusão de vaso sangüíneo funcional ou estrutural também pode ser um sério problema médico. Promover a angiogênese e/ou prevenir a regressão de vasos sangüíneos existentes é desejável em situações onde o tecido se torna isquêmico, por exemplo, em isquemia da retina, cerebral, cardiovascular e do limbo e em condições onde um suprimento vascular deve ser estabelecido, restabelecido, melhorado ou expandido, por exemplo, em cicatrização e após transplante de tecido ou órgão, ou para estimular o estabelecimento de vasos colaterais ou senão aumentar a perfusão de um tecido ou órgão com circulação inadequada. [004] A via de sinalização Notch é um sistema para comunicação

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2/26 célula a célula usado por uma ampla faixa de eucariotos para muitos processos biológicos, tal como diferenciação, proliferação e homeostase (Artavanis-Tsakonas et al. (1999) Science 284:770 - 776). A sinalização Notch também tem sido implicada no controle do desenvolvimento vascular (Iso et al. (2003) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23:543 - 553).

[005] O Delta-like 4 (Dl4) ou ligante delta-like 4 (dll4) (daqui a diante “Dll4”) é um membro da família Delta de ligantes Notch, o qual exibe expressão altamente seletiva pelo endotélio vascular (Shutter et al. (2000) Genes Dev. 14:1313 - 1318). O Dll4 é um ligante para receptores Notch, incluindo Notch 1 e Notch 4. As sequências de ácido nucléico e de aminoácido para Dll4 humano e de camundongo são mostradas em SEQ ID NO:1 - 2 e SEQ ID NO:3 - 4, respectivamente. Camundongos de gene-alvo Dll4 foram gerados (see, por exemplo, Duarte et al. (2004) Genes Dev. 18:2474 - 2478; Krebs et al. (2004) Genes Dev. 18:2469 - 2473: Galé et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949 - 15954). Estes estudos mostraram que o Dll4 foi altamente expresso sobre os vasos sangüíneos em desenvolvimento no embrião do rato, e que a deleção genética de mesmo um único alelo de Dll4 resultou em letalidade embriônica, associada com acentuadas anormalidades vasculares.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de doenças que afetam o sistema cardiovascular com agentes capazes de bloquear a interação de Dll4 com seus receptores (“antagonistas de Dll4”). Os resultados experimentais proporcionados aqui suportam o uso de antagonistas de Dll4 para o tratamento de doenças caracterizadas por neovascularização patológica e insuficiência vascular, onde a insuficiência vascular é devido à perda de vasos sangüíneos ou mudanças funcionais vasculares que resultam em perfusão insuficiente

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3/26 de tecido. Os antagonistas de Dll4 são particularmente úteis para o tratamento de distúrbios vasculares do olho, por exemplo, retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade e outras doenças oculares caracterizadas por angiogênese patológica e/ou isquemia da retina, tal como veia da retina ou oclusão arterial.

[007] A inibição farmacológica de Dll4 é mostrada para exercer diversos efeitos benéficos em um modelo de retinopatia isquêmica, incluindo atenuação da perda de vasos sangüíneos quando aplicada no momento de uma lesão que leva à perda de vasos sangüíneos, e supressão do desenvolvimento de mudanças patológicas na vascularização ao mesmo tempo em que aumenta a rebrotação de mais vasos sangüíneos normais, funcionais quando aplicada em seguida ao estabelecimento da isquemia.

[008] Espera-se que os agentes farmacológicos que inibem a sinalização Dll4 sejam similarmente benéficos no tratamento de outras formas de lesão isquêmica, incluindo isquemia cerebral, isquemia cardíaca e condições isquêmicos que afetam o limbo e outros órgãos e tecidos do corpo. Também se espera que os inibidores de Dll4 sejam clinicamente benéficos em outras condições que requerem o estabelecimento ou restabelecimento de um suprimento vascular ou que, de outra forma, se beneficiem da perfusão aumentada de tecido. Exemplos de tais condições são más formações arteriovenosas, cicatrização, transplante de órgãos e tecidos e insuficiência placentária. Conforme mostrado no trabalho experimental relatado abaixo, a inibição de Dll4 previne o estreitamento e a oclusão arterial, indicando que os inibidores de Dll4 também seriam eficazes no tratamento de hipertensão sistêmica ou pulmonar, e distúrbios relacionados.

[009] Os antagonistas de Dll4 mostraram-se agora ser eficazes em promover angiogênese produtiva tanto em condições normais quanto patológicas. Especificamente, bloquear a sinalização Dll4Petição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 9/39

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Notch mostrou aumentar a brotação angiogênica e a proliferação de células vasculares endoteliais na vascularização em desenvolvimento da retina, e suprimir a formação de neovascularização ectópica patológica e o desenvolvimento de derivações arteriovenosas em favor de uma formação mais apropriada de vasos na retina isquêmica. Além disso, a aplicação de bloqueadores de Dll4 no momento de lesão do vaso mostrou reduzir acentuadamente a perda subseqüente de vasos sangüíneos. Estas descobertas suportam o uso de um antagonista de Dll4 no tratamento de doenças do olho caracterizadas por anormalidades vasculares, especialmente quando acompanhadas por isquemia e perda de vasos normais. Exemplos de tais doenças do olho incluem retinopatias isquêmicas, tal como degeneração macular relacionada à idade, oclusão da veia central da retina ou oclusão de ramo da veia da retina, retinopatia diabética e retinopatia da prematuridade.

[0010] Em um primeiro aspecto, a invenção retrata um método de tratamento de distúrbio ou doença do olho caracterizada por anormalidades vasculares, que compreende a administração de um antagonista de Dll4 a um indivíduo em necessidade do mesmo. O método da invenção promove o crescimento de vasos funcionais normais, inibe o crescimento de vasos anormais ou desordenados e previne a regressão patológica da vasos sangüíneos.

[0011] Em uma modalidade, o antagonista de Dll4 é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, o qual liga especificamente o Dll4 e bloqueia a ligação do Dll4 a um receptor Notch (por exemplo, receptores Notch1 e Notch4). Em outra modalidade, o antagonista de Dll4 da invenção é uma proteína ou fragmento de proteína que compreende o domínio extracelular de Dll4 ou um fragmento do mesmo, o qual em modalidades específicas pode ser fundido a um componente de multimerização e o qual liga receptores Notch sem ativá-los, desse modo bloqueando as ações do Dll4 endógeno.

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5/26 [0012] O distúrbio ou doença do olho tratado pelo método da invenção é um distúrbio da vascularização ocular caracterizado pela presença de vasos anormais e/ou perda de vasos normais ou função normal de vaso. Em modalidades específicas, a condição ou distúrbio tratado inclui retinopatia da prematuridade, retinopatia isquêmica, oclusão da veia ou artéria da retina, retinopatia diabética, neovascularização coroidéia, degeneração macular relacionada à idade, neovascularização da córnea, glaucoma neovascular ou transplanta da córnea.

[0013] O anticorpo ou fragmento de anticorpo usado no método da invenção pode ser policlonal ou monoclonal, e pode ser humanizado, quimérico ou plenamente humano. Preferentemente, o anticorpo é um anticorpo plenamente humano monoclonal ou fragmento de anticorpo monoclonal. O fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo de cadeia única, ScFv, um Fab ou um F(ab')₂.

[0014] Quando o antagonista de Dll4 é uma proteína ou fragmento de proteína, o fragmento é preferentemente o domínio extracelular de Dll4 ou um fragmento ou fragmento modificado do mesmo, e pode ser fundido a um componente de multimerização. O componente de multimerização é preferivelmente um domínio de imunoglobulina, tal como, por exemplo, um domínio de Fc, por exemplo, um Fc humano (SEQ ID NO:5). A proteína pode opcionalmente compreender uma sequência de sinal, o qual pode ser nativo à célula, recombinante ou sintético.

[0015] Em um aspecto mais amplo, o método da invenção é útil no tratamento de qualquer doença ou condição isquêmica causada por suprimento de sangue insuficiente devido à perda de vaso sanguíneo e/ou perfusão pobre, por exemplo, lesão isquêmica, isquemia cerebral, isquemia cardíaca, condições isquêmicas que afetam os limbos e outros órgãos ou tecidos, más formações arteriovenosas, cicatrização,

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6/26 transplante de órgãos ou tecidos, insuficiência placentária, estreitamento e oclusão arterial, aterosclerose e hipertensão sistêmica ou pulmonar.

[0016] Em um segundo aspecto, a invenção provê o uso de um agente capaz de inibir a atividade de Dll4 na fabricação de medicamento para tratar, inibir ou melhorar um distúrbio isquêmica ou vascular, em que o antagonista de Dll4 é um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de bloquear a ligação de Dll4 a um receptor Notch, ou um fragmento de Dll4 opcionalmente conectado a um componente de multimerização (tal como em domínio de Fc). Em uma modalidade, o distúrbio isquêmico ou vascular é uma doença ou condição do olho caracterizada pela presença de vasos sangüíneos anormais e/ou perda de vasos sangüíneos normais ou função de vaso. A doença do olho é a retinopatia da prematuridade, retinopatia isquêmica, oclusão da artéria ou veia da retina, retinopatia diabética, neovascularização coroidéia, degeneração macular relacionada à idade, neovascularização da córnea, glaucoma neovascular ou transplante da córnea.

[0017] Em outra modalidade, o distúrbio isquêmico ou vascular é lesão isquêmica, isquemia cerebral, isquemia cardíaca, condições isquêmicas que afetam os limbos e outros órgãos e tecidos, más formações arteriovenosas, cicatrização, transplante de órgãos ou tecidos, insuficiência placentária, estreitamento ou oclusão arterial, aterosclerose ou hipertensão sistêmica ou pulmonar.

[0018] Outros objetivos a vantagens se tornarão aparentes a partir de uma revisão da seguinte descrição detalhada.

BREVE SUMÁRIO DAS FIGURAS [0019] Fig. 1. Deleção genética de um único alelo de Dll4 aumentou os números de brotos angiogênicos na vascularização em desenvolvimento da retina. Os números de brotos foram quantificados em 100X campos microscópicos. Os resultados foram significantemente

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7/26 diferentes ao nível de p < 0,00001.

[0020] Fig. 2. Liberação intra-ocular de Dll4-Fc aumentou os números de proliferação de células BrdU-positivas na vascularização em desenvolvimento da retina. 4,15 mcg de mDll4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram infetados por via intravítrea em filhotes de camundongo de 7 dias de idade. A vascularização da retina foi analisada 24 horas mais tarde. Os números de células BrdUpositivas foram quantificados em campos de microscópio de 200X. Os significados foram significantemente diferentes ao nível de p < 0,05. [0021] Fig. 3A-B. Liberação intra-ocular de Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 promove a rebrotação de vasos da retina em camundongos com retinopatia isquêmica induzida por oxigênio (OIR). (A) 0,48 mcg de mDll4-hFc ou 0,5 mcg de proteína de controle de hFc humano foi injetado por via intravítrea em filhotes de camundongos OIR de 13 dias de idade (13°dia após o nascimento ou P13). A vascularização da retina foi analisada no P17. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDll4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P13. A vascularização da retina foi analisada no P17. Áreas avasculares foram medidas em montagens planas de retina. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,0001 (A) e p , 0,05 (B).

[0022] Fig. 4A-B. Liberação intra-ocular de Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 melhora a formação de neovascularização patológica in OIR.

(A) 0,48 mcg de mDll4-hFc ou 0,5 mcg de proteína de controle de hFc humano foi injetado por via intravítrea no P13. A vascularização da retina foi analisada no P17. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDll4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P13. A vascularização da retina foi analisada no P17. Áreas vasculares anormais (áreas contendo “tufos” vasculares ectópicos) foram medidas em montagens planas de retina.

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Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,0001 (A) e p < 0,05 (B).

[0023] Fig. 5. Liberação intra-ocular de Dll4-Fc melhora a perfusão da retina. 0,48 mcg de mDll4-hFc ou 0,5 mcg de proteína de controle de hFc humano foi injetado por via intravítrea no P13. No P17, os animais foram perfundidos com lecitina de tomate marcada com Texas Red e a vascularização da retina foi analisada no P17. Áreas vasculares não perfundidas foram medidas em montagens planas de retina. Os resultados foram significantes ao nível de p < 0,0005.

[0024] Fig. 6A-B. Liberação intra-ocular de Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 reduz a hipóxia/isquemia da retina. (A) 4,1 mcg de hDll4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P12. Hypoxyprobe^TM-1 foi injetado intraperitonealmente uma hora antes de sacrificar os animais. A vascularização da retina foi analisada no P17. As áreas marcadas com Hypoxyprobe foram medidas em montagens planas de retina. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDll4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P13. Hypoxyprobe^TM-1 foi injetado intraperitonealmente uma hora antes de sacrificar os animais. A vascularização da retina foi analisada no P17. As áreas marcadas com Hypoxyprobe foram medidas em montagens planas de retina. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,001 (A) e p < 0,05 (B).

[0025] Fig. 7. Deleção genética de um único alelo de Dll4 reduz a perda de vasos sangüíneos induzida por exposição à hiperoxia. Camundongos de controle Dll4+^/lacZ e littermate WT foram colocados em uma câmara de 75% de oxigênio no P7. A vascularização da retina foi analisada em montagens planas de retina no P12. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,05.

[0026] Fig. 8. Liberação intra-ocular de Dll4-Fc ou anticorpo antiPetição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 14/39

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Dll4 reduz ou previne a perda de vasos sangüíneos por exposição à hiperoxia. (A) 4,1 mcg de hDll4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio ao P9. A vascularização da retina foi analisada no P10. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDll4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P9. A vascularização da retina foi analisada no P10. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,00001 (A) e p < 0,0001 (B).

[0027] Fig. 9A-B. Liberação intra-ocular de Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 reduz a oclusão de vasos da retina. (A) 4,1 mcg de hDll4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P9. Os filhotes foram perfundidos com lecitina fluorescente e a vascularização da retina foi analisada no P10. (B) 2,55 mcg de anticorpo anti-mDll4 policlonal de coelho ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea no P8. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P9. Os filhotes foram perfundidos com lecitina fluorescente e a vascularização da retina foi analisada no P10. Os resultados foram significantemente diferentes aos níveis de p < 0,00001 (A) e p < 0,0001 (B). [0028] Fig. 10. Liberação sistêmica de Dll4-Fc reduz ou previne a perda de vasos sangüíneos da retina. 4,1 mcg d hDll4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea (ITV) ou hDll4-hFc foi injetado intraperitonealmente a uma dose de 25 mg por kg do peso corporal no P7. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P8. A vascularização da retina foi analisada no P9. Os resultados foram significantemente diferentes ao nível de p < 0,0001.

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DESCRIÇÃO DETALHADA [0029] Antes da descrição dos presentes métodos, deve ser entendido que esta invenção não é limitada aos métodos particulares e condições experimentais descritas, visto que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever as modalidades particulares apenas, e não tem a intenção de ser limitante, visto que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas. [0030] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

DEFINIÇÕES [0031] Pela expressão “antagonista de Dll4” deve ser entendido um agente capaz de inibir a atividade biológica de Dll4 pelo bloqueio da interação de Dll4 com seus receptores. A inibição da atividade de Dll4 pode ser através da inibição da ativação do receptor ou com um anticorpo para Dll4 ou com um análogo ou fragmento de Dll4, o qual liga mas não ativa o receptor (ligação não produtiva). Inibidores comuns incluem, mas não estão limitados a anticorpos, receptores solúveis, aptâmeros oligonucleotídeos, peptídeos ou outros antagonistas de molécula pequena e seus derivados, e ligantes Dll4 modificados que ligam seus receptores Notch, mas não incapazes de ativar a sinalização através de tal ligação. Outras abordagens incluem interferência com a expressão do gene que codifica para Dll4 ou bloqueio da ativação de receptor Notch, por exemplo, com inibidores de siRNAs ou gama secretase, respectivamente.

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11/26 [0032] O anticorpo “neutralizante” ou “de bloqueio” é destinado a referir a um anticorpo cuja ligação à Dll4 resulta na inibição da atividade biológica de Dll4. Esta inibição da atividade biológica de Dll4 pode ser avaliada pela medição de um ou mais indicadores da atividade biológica de Dll4. Estes indicadores da atividade biológica de Dll4 podem ser avaliados por um ou mais de diversos ensaios padrão in vivo ou in vitro conhecidos na técnica (veja exemplos abaixo). Preferencialmente, a capacidade de um anticorpo para neutralizar a atividade de Dll4 é avaliada pela inibição da ligação de Dll4 a um receptor Notch, tal como Notch 1 e Notch4.

DESCRIÇÃO GERAL [0033] As vias de sinalização Notch são evolutivamente conservadas e desempenham um papel-chave na determinação e diferenciação da célula destino em muitos tecidos durante o desenvolvimento embriônico e pós-natal. A maioria dos componentes da via Notch são expressos na vascularização e deleção genética de certos componentes da via Notch, incluindo Notch1, Notch1/Notch4, Jagged1, Dll1, Dll4, Hey1/Hey2 ou presenilinas, resulta em letalidade embriônica associada com defeitos de remodelagem vascular. Embora muitos destes genes sejam expressos em múltiplos tipos de tecido e célula, Dll4 é amplamente restrito ao endotélio vascular, sugerindo que o Dll4 é um ligante-chave para receptores Notch na vascularização.

[0034] Durante o desenvolvimento embrionário inicial, a deleção genética de mesmo um único alelo de Dll4 produz severas anormalidades vasculares que resultam em letalidade embriônica na maioria das cepas de camundongo. De fato, entre os muitos genes envolvidos na vasculogênese e angiogênese, relatou-se que a insuficiência haplóide resulta na maioria dos defeitos vasculares e letalidade embriônica apenas para Dll4 e VEGF-A. A letalidade embriônica inicial impede a maioria das manipulações experimentais, tornando difícil entenPetição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 17/39

12/26 der precisamente o papel do Dll4 durante o desenvolvimento vascular e em cenários patológicos.

[0035] Para superar esta limitação, os efeitos da deleção do gene Dll4 foram estudados em camundongos da cepa ICR, na qual a haploinsuficiência produz apenas letalidade embriônica limitada. O fenótipo vascular observado nestes camundongos mutantes foi comparado àquele obtido em camundongos do tipo selvagem, nos quais a sinalização Dll4/Notch foi seletivamente inibida pela injeção por via intravítrea de um inibidor solúvel de Dll4, Dll4-Fc, ou um anticorpo policlonal neutralizante contra o domínio extracelular de Dll4. Para estes experimentos, a retina foi selecionada como um sistema modelo onde estudar a biologia do Dll4 porque a vascularização da retina desenvolve-se após o nascimento de uma maneira estereotípica que é altamente organizada, temporal e espacialmente.

[0036] O modelo murino de retinopatia isquêmica induzida por oxigênio (OIR) é um modelo bem caracterizado de neovascularização patológica associada com elevada expressão do fator pró-angiogênico essencial, VEGF (Smith et al. 1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 35:101 111; Neely et l. 1998 Am J. Pathol 153:665 - 670; Saint-Geniez et al. 2004 Int J Dev Biol 48:1045 - 1058) e, desta forma, relevante para a angiogênese patológica associada com diversas condições de doença (Ferrarra et al. 2005 Nature 438:967 - 974). Por fim, a vascularização da retina é prontamente acessível a manipulações experimentais, incluindo microinjeções intravítreas de agentes experimentais.

[0037] Os experimentos descritos a seguir mostram que durante o desenvolvimento vascular normal da retina, e no modelo OIR, a supressão farmacológica da sinalização Dll4/Notch aumenta acentuadamente a brotação angiogênica e promove a formação de uma rede capilar primária mais densa. Coerentemente, descobriu-se que a expressão de Dll4 endógeno é particularmente proeminente nas regiões mais

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13/26 ativas do crescimento vascular tanto durante o desenvolvimento normal quanto no modelo OIR. Além disso, a inibição de Dll4 suprimiu acentuadamente a formação da vascularização anormal e preveniu a oclusão e regressão de vasos sangüíneos.

ANTAGONISTAS DE DLL4 [0038] Os antagonistas de Dll4 incluem anticorpos para Dll4 e fragmentos dos mesmos capazes de bloquear a ligação do Dll4 a um receptor Notch, por exemplo, Notch1, e proteínas ou fragmentos de proteína que compreendem o domínio extracelular de Dll4, o qual pode ser fundido a um componente de multimerização; peptídeos e pepticorpos (veja, por exemplo, a publicação da patente US 2003/0229023 Oliner et al.).

ANTICORPOS DE DLL4.

[0039] A expressão “imunoglobulina ou anticorpo”, conforme usada aqui, refere-se a um mamífero, incluindo polipeptídeo ou proteína humana que compreende uma região de estrutura a partir de um gene de imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos que especificamente ligam e reconhecem um antígeno, o qual, no caso da presente invenção, é uma proteína de Dll4 ou porção da mesma. Se o destinado anticorpo ou proteína semelhante a anticorpo será utilizado como uma imunoglobulina terapêutica de mamífero, as regiões de ligação devem ser derivadas das imunoglobulinas de mamífero correspondentes. Se a molécula destina-se o uso não terapêutico, tal como para diagnósticos e ELISAs, as regiões de ligação de imunoglobulina devem ser derivadas tanto de mamíferos humanos quanto não humanos, tal como camundongos. Os genes de imunoglobulina humanos ou fragmentos de gene incluem as regiões constantes de cappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e miu, assim como miríade de genes de região variável de imunoglobulina. Cadeias leves são classificadas tanto como cappa quanto como lambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama,

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14/26 um, alfa, delta ou épsilon, os quais por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de cada classe IgG, existem diferentes isótopos (por exemplo, IgG₁, IgG₂, etc.) assim como alótipos dos mesmos.

[0040] Uma unidade estrutural de imunoglobulina exemplar (anticorpo) de IgG humano compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois partes idênticos de cadeias de polipeptídeos, cada par tendo uma cadeia leve (cerca de 25 kD) e uma cadeia pesada (cerca de 50 - 70 kD). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 - 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis por reconhecimento de antígeno. As expressões “cadeia leve variável” (V_L) e “cadeia pesada variável” (V_H) referem-se àquelas cadeias leves e pesadas, respectivamente.

[0041] Os anticorpos existem como imunoglobulinas intactas, ou como um número de fragmentos bem caracterizados produzidos pela digestão com várias peptidases. Por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações dissulfeto na região hinge para produzir F(ab)₂, um dímero de Fab que ele próprio é uma cadeia leve unida a V_H - C_H por uma ligação dissulfeto. O F(ab)₂ pode ser reduzido sob condições amenas à quebra de ligações dissulfeto na região hinge, desse modo convertendo o dímero de F(ab)₂ em um monômero de Fab'. O monômero de Fab' é essencialmente Fab com parte da região hinge. Enquanto vários fragmentos de anticorpo são descritos em termos da digestão de um anticorpo intacto, um versado na técnica irá apreciar que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo tanto quimicamente quanto pelo uso da metodologia de DNA recombinante. Assim, a expressão anticorpo, conforme utilizada aqui, também inclui fragmentos de anticorpo tanto produzido pela modificação de anticorpos inteiros quanto aqueles sintetizados de novo usando metodologias de DNA recombinante ou gerados por bibliotecas display, tal como

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15/26 phage, bibliotecas display de E. coli ou levedura (veja, por exemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552 - 554).

FRAGMENTOS DE ANÁLOGOS DE DLL4 OU DE PROTEÍNA.

[0042] O antagonista de Dll4 pode ser um fragmento de Dll4 opcionalmente conectado a um componente de multimerização. Em modalidades específicas, um fragmento de Dll4 pode ser fundido a um componente de multimerização tal como um domínio de imunoglobulina, um domínio truncado de imunoglobulina ou uma sequência de aminoácido ente 1 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento, opcionalmente compreendendo pelo menos um resíduo de cisteína. Em uma modalidade preferida, o componente de multimerização é um domínio de imunoglobulina, preferivelmente um domínio de Fc, por exemplo, um Fc humano (SEQ ID NO:5).A proteína ou fragmento de proteína pode opcionalmente compreender uma sequência de sinal, o qual pode compreender qualquer sequência conhecida para um versado na técnica para direcionar a secreção de um polipeptídeo ou proteína a partir de uma célula, incluindo sequências naturais ou sintéticas. Geralmente, uma sequência de sinal é colocada no começo ou no terminal amino da proteína de fusão da invenção. Tal sequência de sinal pode ser nativa à célula, recombinante ou sintética.

[0043] O domínio extracelular de Dll4 é composto de um domínio Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) e oito repetições tandem semelhantes ao fator de crescimento epidérmico (EGF). Geralmente, os domínios EGF são reconhecidos como ocorrendo em cerca da posição 218 - 251 (domínio 1), 252 - 282 (domínio 2), 284 - 322 (domínio 3), 324 - 360 (domínio 4) e 362 - 400 (domínio 5), com o domínio DSL em cerca da posição 173 - 217 e o domínio N-terminal em cerca da posição 27 172 de hDll4 (SEQ ID NO:2). Em modalidades específicas, o antagonista de Dll4 compreende cerca da aminoácido 27 - 172, 27 - 217, 218 - 400, 218 - 360, 218 - 322 ou 218 - 282 de SEQ ID NO:2, opcionalPetição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 21/39

16/26 mente fundido a hFc (SEQ ID NO:5).

MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO [0044] A invenção proporciona métodos de tratamento compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um agente da invenção. Em um aspecto preferido, o agente é substancialmente purificado (por exemplo, substancialmente livre de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejáveis). O indivíduo é preferencialmente um animal, por exemplo, uma vaca, porco, cavalo, galinha, gato, cachorro, etc., e é preferencialmente um mamífero, e mais preferencialmente um ser humano. Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar as composições farmacêuticas da invenção localmente na área em necessidade de tratamento; isto pode ser alcançado, por exemplo, e não por meio de limitação, por infusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, por injeção, por meio de um cateter ou por meio de um implante.

[0045] Os métodos da invenção podem ser vantajosamente realizados pela administração à área em necessidade de tratamento por administração local, incluindo administração intravítrea, periocular, subconjuntival, justaescleral, subtenoniana ou tópica.

TERAPIAS COMBINADAS [0046] Em várias modalidades, o método da invenção é realizado com um antagonista de Dll4, tal como um anticorpo de Dll4, em combinação com um ou mais compostos ou terapias ou procedimentos médicos adicionais. Por exemplo, agentes terapêuticos adequados para uso em combinação, tanto alternada quanto simultaneamente, incluem proteínas de fusão capazes de ligar e inibir a atividade do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (veja patentes US 7,070,959 e US 7,087,411), agentes imunossupressores tais como corticosteróides, dexametasona, ciclosporina A, FK506 ou agentes antimetabólicos (veja Barker, NH, et al., (2000) CLin Exp Opthal 28:357 Petição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 22/39

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360). Outros agentes terapêuticos adequados para uso em combinação, tanto alternado quanto simultaneamente, com os antagonistas de Dll4 da invenção podem incluir agentes que podem bloquear a atividade biológica de outros membros da família do VEGF, tais como VEGFC e VEGF-D.

EXEMPLOS [0047] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a proporcionar àqueles versados na técnica com uma divulgação e descrição completas de como fazer e usar os métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Foram feitos esforços para assegurar a exatidão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, medições de área, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados.

EXEMPLO 1.

[0048] Efeito da deleção genética de um único alelo de Dll4 na brotação de vasos sangüíneos na vascularização em desenvolvimento da retina.

[0049] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da deficiência genética parcial de Dll4 na brotação de vasos sangüíneos durante o desenvolvimento normal da angiogênese da retina.

ANIMAIS.

[0050] Tecnologia Velocigene™ (Valenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:652 - 9; patente US 6,586,251) foi usada para substituir toda a região codificadora de Dll4 com o gene repórter da βgalactosidase em células estaminais embrionárias de camundongo híbrido C57BL/6:129. Machos quiméricos foram criados para fêmeas ICR. Retrocruzamentos de camundongos Dll4^+/lacZ por 3 gerações a ICR (87,5% de ICR) foram usados para este estudo.

HISTOQUÍMICA E IMUNOCOLORAÇÃO.

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18/26 [0051] Filhotes de camundongo foram humanamente eutanizados no P7. Os olhos foram enucleados e as retinas foram dissecadas, fixas durante a noite com paraformaldeído 4%, tingidas com lecitina I de Griffonia simplicifolia (GS) marcada com FITC (Vector Laboratories, Burlingame, CA), e examinadas em montagens planas. As imagens foram tomadas usando um microscópio Nikon (Melville, NY).

QUANTIFICAÇÕES.

[0052] Medições foram realizadas usando o software Scion Image. Cada condição experimental foi ensaiada pelo menos três vezes. Teste t de Student e análise de variância Two-way foram usados para avaliar a significância estatística.

RESULTADOS.

[0053] Plexo periférico foi muito mais denso em camundongos Dll4+^/lacZ do que em littermates do tipo selvagem. Visualizações de alta energia evidenciaram que o plexo periférico mais denso nas retinas de camundongos Dll4+^/lacZ consistia em capilares que eram mais largos em diâmetro, mais altamente interconectados e hiper-fundidos de modo que em algumas áreas os vasos aglutinaram para formar um sincício e, além disso, que havia muito mais brotos na frente crescente (Fig. 1); filopodia também foi observada em porções mais interiores do plexo em uma freqüência mais alta do que a freqüência normal. Análises quantitativas revelaram que, comparadas aos controles do tipo selvagem, as retinas dos camundongos Dll4+^/lacZ mostraram um aumento de 68% no número de brotos na frente crescente da vascularização superficial da retina (Fig. 1), assim como um aumento maior do que duas vezes no número de interconexões capilares por unidade de área, resultando em um aumento significante na cobertura vascular. Apesar das acentuadas mudanças morfológicas, injeção intravascular de lecitina fluoresceinada preencheu completamente o plexo vascular superficial em desenvolvimento, exceto pela filopodia que se alargou a

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19/26 partir das células da ponta, em camundongos Dll4^+/lacZ como em camundongos do tipo selvagem, indicando que todos os componentes da vascularização em desenvolvimento tinha lúmens e eram funcionais. EXEMPLO 2.

[0054] Efeito da inibição de Dll4/Notch com Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 sobre a vascularização em desenvolvimento da retina.

[0055] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da inibição farmacológica da sinalização Dll4/Notch sobre a proliferação de células endoteliais e a brotação de vasos sangüíneos durante o desenvolvimento normal da angiogênese da retina.

ANTICORPOS E REAGENTES.

[0056] Dll4-Fc compreende um domínio extracelular de Dll4 humano ou de camundongo e parte do Fc IgG humano. Dll4-Fc foi expresso em células CHO e a afinidade purificada por cromatografia de proteína A. O anticorpo anti-Dll4 foi produzido por imunização de coelhos com mDll4-hFc recombinante. O anti-soro foi parcialmente purificado por cromatografia de proteína A antes do uso.

ANIMAIS.

[0057] Camundongos C57/Bl6 (Taconic) foram usados para estudar o efeito Dll4-Fc ou anticorpo de Dll4 neutralizante na vascularização em desenvolvimento da retina.

MICRO-INJEÇÕES INTRAVÍTREAS.

[0058] Micro-injeções intravítreas (30 - 100 nl) dos compostos de pesquisa foram feitas entre o equador e o limbo da córnea usando um nano injetor Drummond Scientific (BroPA) equipado com uma agulha de vidro.

MARCAÇÃO COM BRDU.

[0059] Células proliferantes foram marcadas com a administração de BrdU (1 mg/kg i.p.) 20 horas após injeção intravítrea de hFc ou Dll4-Fc. As retinas foram colhidas 4 horas mais tarde e tingidas com

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20/26 anticorpos ant-BrdU (Dako North América, Inc., Carpinteria, CA) e VECadherin (BD PharMingen, São Diego, CA).

RESULTADOS.

[0060] Para estudar o efeito da deficiência local intra-retinal na sinalização Dll4/Notch, e não secundária a uma anormalidade sistêmica não detectada, uma versão solúvel de Dll4 (denominada Dll4-Fc), que liga receptores Notch sem ativá-los, assim bloqueando as ações do Dll4 endógeno, ou um anticorpo policlonal de neutralizante específico para o domínio extracelular de Dll4 foi injetado no vítreo de camundongos do tipo selvagem. Três dias após a administração intra-ocular de cada bloqueador de Dll4, os vasos da retina exibiram mudanças morfológicas que se assemelham estreitamente às anormalidades vasculares encontradas em camundongos Dll4^+/lacZ, incluindo densidade de vasos sangüíneos e calibre de vasos dramaticamente aumentados. Além disso, estas mudanças morfológicas características ocorreram rapidamente, sendo claramente evidentes dentro de 24 horas. [0061] A marcação com BrdU também mostrou um aumento na proliferação de células epiteliais dentro de 24 horas do bloqueio de Dll4 (Fig. 2). O aumento observado de ~17% na taxa de proliferação poderia render mais do que 50% de aumento no número de células dentro de três a quatro tempos de duplicação.

EXEMPLO 3.

[0062] Efeito do anticorpo de Dll4 e anti-Dll4 sobre a vascularização, perfusão e anormalidades vasculares da retina em camundongos com OIR.

[0063] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos do anticorpo de Dll4 e anti-Dll4 sobre o crescimento de vasos da retina, formação de anormalidades vasculares e perfusão da retina em retinopatia isquêmica induzida por oxigênio (OIR).

[0064] Para determinar se a sinalização Dll4/Notch desempenha

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21/26 um papel na angiogênese patológica assim como durante o desenvolvimento normal, o modelo de OIR foi utilizado. No modelo de OIR, a exposição dos filhotes de camundongo à hiperóxia no P7 resulta em uma rápida obstrução de capilares na retina central. Após retorno ao ar ambiente no P12, a zona avascular tornou-se severamente hipóxia, o que por sua vez produz extensa neovascularização anormal, caracterizada pelo crescimento ectópico de vasos no vítreo (“tufos” vasculares epirretinais) e a formação de derivações arteriovenosas anormais; partes centrais da retina permanecem amplamente avasculares por um período prolongado.

ANIMAIS E MODELO OIR.

[0065] Camundongos C57/Bl6 (Taconic) foram usados para estudar o efeito do Dll4-Fc ou anticorpo neutralizante de Dll4 sobre a neovascularização da retina em OIR. OIR foi produzido seguindo o método desenvolvido por Smith et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994, 35:101 - 111). Em resumo, os filhotes de camundongo e seus(suas) “dams” foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio a partir do dia (P) 7 ao P12 após o nascimento, e então retornados ao ar ambiente. A exposição a hiperoxia induz à rápida obstrução dos vasos na retina central. Quando os camundongos são retornados ao ar ambiente (P12), a perda de vasos da retina central resulta em severa hipóxia/isquemia, o que por sua vez estimula as mudanças vasculares patológicas descritas acima.

[0066] Para marcar vasos sangüíneos patentes, 50 ml de lecitina de Lycopersicon esculentum (LE) marcada de vermelho (1 mg/ml; Vector Laboratorios, CA) foram injetados no ventrículo cardíaco esquerdo e deixados circular por 5 minutos.

RESULTADOS.

[0067] A inibição de Dll4/Notch com Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 melhorou a neovascularização patológica (Fig. 3A-B), estimulou o

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22/26 crescimento de novos vasos sangüíneos (Fig. 4A-B) e aumentou a reperfusão da retina (Fig. 5).

[0068] Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 ou uma proteína de controle (hFc) foi injetado por via intravítrea no P13, um dia depois os animais foram retornados ao ar ambiente, bem após a obstrução dos vasos foi completa.

[0069] Quando as retinas foram avaliadas no P17, a administração de Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 suprimiu dramaticamente o crescimento ectópico de tufos neovasculares patológicos no vítreo (Fig. 1), e também preveniu a formação de derivações arteriovenosas anormais. As áreas ocupadas pelos tufos neovasculares foram reduzidas em 43% nas retinas tratadas com Dll4-Fc e em 85% nas retinas tratadas com anticorpo anti-Dll4, ambos em comparação às retinas de controle tratadas com hFc .

[0070] Além disso, foi verificado que Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 estimulam mais brotações extensivas de novos vasos a partir de capilares e veias no entorno da zona avascular, resultando em um recrescimento mais rápido de vasos sangüíneos na retina central, onde a vascularização tinha sido esgotada, desse modo reduzindo a área avascular da retina (Fig. 4A-B). As áreas avasculares foram reduzidas em 43% nas retinas tratadas com Dll4-Fc e em 63% nas retinas tratadas com anticorpo anti-Dll4. Particularmente, foi notável o recrescimento capilar extensivo emanando das veias na zona avascular das retinas tratadas com Dll4-Fc. Assim, a atenuação da sinalização Dll4/Notch favoreceu a extensão de novas brotações vasculares ao longo da superfície da retina, e obtundiu a formação de neovascularização epirretinal, resultando em uma reformação mais rápida do plexo vascular superficial. Os vasos recém-formados eram funcionais e exibiram reperfusão aumentada da retina, como evidente pela redução de 45% de áreas não perfundidas nas retinas tratadas com Dll4-Fc (Fig.

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23/26

5).

EXEMPLO 4.

[0071] Efeito de Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 sobre hipóxia/isquemia da retina no modelo OIR.

[0072] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 sobre a hipóxia/isquemia da retina no modelo OIR de neovascularização patológica.

[0073] Crescimento excessivo de vasos sangüíneos sob certas circunstâncias pode interferir com a circulação normal do sangue e reduzir a oxigenação do tecido. Para testar se a inibição de Dll4/Notch pode aumentar a oxigenação do tecido, HYPOXYPROBE™^-1 (Chemicon) foi usado em um ensaio não invasivo para detectar a hipóxia do tecido e determinar o efeito do tratamento de Dll4-Fc sobre a hipóxia/isquemia da retina. HYPOXYPROBE™^-1 foi injetado intraperitonealmente a 100 mg/kg uma hora antes da coleta das retinas para avaliação.

RESULTADOS.

[0074] O crescimento de novos vasos funcionais seguindo administração por via intravítrea de inibidores de Dll4/Notch reduziu eficazmente a hipóxia/isquemia do tecido como evidente em 69% e redução de 30% de áreas hypoxyprobe positivas em retinas tratadas com Dll4Fc e anticorpo anti-Dll4, respectivamente (Fig. 6A-B).

EXEMPLO 5.

[0075] Deleção genética de um único alelo de Dll4 reduz a obstrução de vasos induzida por hiperóxia.

[0076] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da deficiência genética parcial de Dll4 sobre a regressão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

ANIMAIS.

[0077] Retrocruzamentos de camundongos Dll4^+/lacZ por três geraPetição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 29/39

24/26 ções a ICR (87,5% de ICR) foram gerados, conforme descrito acima. Devido a uma mutação recessiva (rd/rd), a camada de célula fotorreceptora da retina começa a degenerar-se no P12 em camundongos ICR. Desse modo, para livrar-se de efeitos secundários potenciais de perda fotorreceptora na vascularização da retina, para avaliar estágios posteriores do desenvolvimento da retina e para todos experimentos OIR, camundongos Dll4+^/lacZ (87,5% de ICR) foram retrocruzados C57BL/6 para produzir camundongos Rd/rd,o qual não exibe degeneração fotorreceptora.

[0078] Os filhotes de camundongo foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio a partir do dia (P) 7 ao P12 após o nascimento. As retinas foram colhidas e a vascularização da retina foi analisada em montagens planas.

RESULTADOS.

[0079] A expressão reduzida de Dll4 na vascularização da retina de camundongos Dll4^+/lacZ previne parcialmente a perda de vasos sangüíneos da retina induzida por hiperóxia (Fig. 7). No modelo OIR, a exposição dos filhotes de camundongo à hiperóxia no P7 resultou em uma rápida oclusão e obstrução de capilares na retina central. Para determinar se a inibição de Dll4/Notch pode ter um efeito protetor sobre os vasos sangüíneos, o efeito da deficiência genética parcial de Dll4 em camundongos Dll4^+/lacZ sobre a obstrução de vasos induzida por hiperóxia foi analisado. Avaliando os animais no P12 (de modo a avaliar a medida da obstrução hiperóxica de vasos), verificou-se que a obstrução de vasos foi reduzida em 40% em camundongos Dll4^+/lacZem comparação aos animais de controle littermate do tipo selvagem, sugerindo que os inibidores de Dll4 podem proteger os vasos sangüíneos existentes de regressão.

EXEMPLO 6.

[0080] Efeitos de Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 sobre a obstrução

Petição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 30/39

25/26 de vasos induzida por hiperoxia.

[0081] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da inibição de Dll4/Notch com Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 sobre a regressão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

ANIMAIS.

[0082] Camundongos C57/Bl6 (Taconic) foram usados para estudar o efeito do Dll4 ou anticorpo neutralizante de Dll4 sobre a obstrução de vasos sangüíneos da retina induzida por oxigênio. Microinjeções intravítreas dos compostos de pesquisa foram realizadas no dia 8 após o nascimento. No dia 9 após o nascimento, os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio. As retinas foram colhidas 24 horas mais tarde e vascularização da retina foi analisada em montagens planas.

RESULTADOS.

[0083] Injeção intravítrea de Dll4-Fc ou anticorpo anti-Dll4 reduziu dramaticamente as áreas de vascularização obstruída em 97% e 41%, respectivamente (Fig. 8A-B).

EXEMPLO 7.

[0084] Efeitos do Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 sobre a oclusão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

[0085] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos da inibição de Dll4/Notch com Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 sobre a oclusão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia. Todos os procedimentos foram realizados conforme descrito acima.

[0086] O tratamento de Dll4-Fc e anticorpo anti-Dll4 reduziu as áreas não perfundidas da retina em 40% e 29%, respectivamente (Fig. 9A-B).

EXEMPLO 8.

[0087] Efeitos da administração sistêmica de Dll4-Fc sobre a regressão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

Petição 870170061524, de 23/08/2017, pág. 31/39

26/26 [0088] Uma investigação foi feita para determinar os efeitos do tratamento sistêmico com Dll4-Fc sobre a regressão de vasos sangüíneos induzida por hiperóxia.

[0089] 4.1 mcg de hDll4-hFc ou 5 mcg de proteína de controle de hFc humano foram injetados por via intravítrea (ITV) ou hDll4-hFc foi injetado intraperitonealmente a uma dose de 25 mg por kg do peso corporal no P7. Os filhotes foram colocados em um ambiente de 75% de oxigênio no P8 e a vascularização da retina foi analisada no P9. Todos os outros procedimentos foram realizados conforme descrito acima.

RESULTADOS.

[0090] Tanto administração local (intravítrea) quanto sistêmica (intraperitoneal) de Dll4-Fc reduziu as áreas de vascularização obstruída em 86% e 56%, respectivamente, indicando que independentemente da via de administração, os inibidores de Dll4 podem ser eficazmente usados para proteger os vasos sangüíneos de regressão (Fig. 10).

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1/1

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso do antagonista de ligante delta-like 4 (Dll4), caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para prevenir ou reduzir perda de vaso sanguíneo ou promover angiogênese produtiva, ou ambas, em um indivíduo tendo um dano isquêmico ou insuficiência vascular selecionado do grupo consistindo em retinopatia da prematuridade, retinopatia isquêmica, oclusão da artéria ou veia da retina, e retinopatia diabética, em que o antagonista de Dll4 compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente liga Dll4 e bloqueia a ligação de Dll4 a um receptor Notch ou compreende o domínio extracelular de Dll4, opcionalmente conectado a um componente de multimerização, em que o domínio extracelular de Dll4 compreende SEQ ID NO:2 ou um fragmento da mesma selecionado a partir do grupo consistindo nos resíduos 27-172, 27-217, 218-400, 218360, 218-322 e 218-282 de SEQ ID NO: 2.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de Dll4 ou fragmento de anticorpo é policlonal ou monoclonal.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é humanizado, quimérico ou é um anticorpo ou fragmento de anticorpo plenamente humano.
4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um anticorpo de cadeia única, um Fab, ou um F(ab')₂.
5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de multimerização é um domínio Fc de um IgG.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o domínio Fc compreende SEQ ID NO:5.

Petição 870180009051, de 02/02/2018, pág. 5/9

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