BRPI0716891A2 - Oligopeptídeo cíclico, uso de oligopeptídeo cíclico, composição farmacêutica, e, método para produzir um oligopeptídeo cíclico. - Google Patents
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Description
"OLIGOPEPTÍDEO CÍCLICO, USO DE OLIGOPEPTÍDEO CÍCLICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM OLIGOPEPTÍDEO CÍCLICO"
A presente invenção refere-se a um oligopeptídeo cíclico internamente restringido, a uma composição farmacêutica compreendendo um tal oligopeptídeo, aos usos de um tal oligopeptídeo e de uma tal composição farmacêutica em medicina e a um método para produzir um tal oligopeptídeo. Fundamentos da Invenção
Receptores de proteína são conhecidos normalmente por ligarem em seus ligante alvo via epítopos, combinações de aminoácidos, que constituem uma proporção pequena da molécula de proteína total.
Receptores de proteína sobre a superfície de células são muitas vezes ativados para produzirem um sinal dentro da célula como um resultado de ligação em outras proteínas, chamadas de ligante de proteína. A porção do ligante que interage com o receptor é chamada de um epítopo, e normalmente constitui uma combinação de um número pequeno de aminoácidos em proximidade íntima de uns com os outros, mantida na estrutura principal da cadeia de peptídeo. Exemplos de epítopos são aquelas estruturas sobre a superfície de proteínas que interagem com anticorpos ou receptores de célula- T, mas na verdade qualquer estrutura sobre a superfície de uma proteína que é reconhecida especificamente por outra pode cair dentro da definição de um epítopo. Devido ao fato de a ligação de um receptor de proteína com um epítopo pode ser uma etapa importante na etiologia de uma doença, ou inversamente, no tratamento de uma condição doentia, a identificação de grupos funcionais que formam epítopos é uma avenida potencialmente frutuosa para desenvolvimento de drogas novas, onde a droga é um agente compreendendo um epítopo que se liga no receptor.
Há dois desafios que impedem esta abordagem para o desenvolvimento de droga nova. Um é a identificação de epítopos que podem ser empregados como moléculas de droga para se ligarem em receptores apropriados com o objetivo de tratar uma doença. O segundo desafio é projetar moléculas que podem manter e apresentar a combinação de aminoácidos formadores de epítopo de tal modo que uma interação de ligação forte com um receptor de célula possa ser realizada.
São conhecidos métodos para identificar a combinação de aminoácidos que podem formar epítopos. Em química combinatória tradicional, a identificação da seqüência mais favorável para ligação em um receptor específico precisa ser realizada pela síntese de centenas de combinações possíveis de grupos diferentes tais como aminoácidos, em ordens diferentes, cada uma tendo que ser testada para eficácia. Este processo é consumidor de tempo, caro e é limitado pela natureza da química que pode ser realizada em ligação de componentes diferentes juntos.
WO 01/01140 proporciona uma modo melhorado de identificar epítopos. Uma composição compreende uma montagem não- covalente de uma pluralidade de conjugados distintos, cada conjugado compreendendo um grupo cabeça e um grupo cauda. Os grupos cauda dos conjugados formam uma agregação hidrofóbica e os conjugados têm liberdade de movimento com respeito entre eles dentro da montagem de modo que, na presença de um ligante, pelo menos dois dos grupos cabeça são apropriadamente posicionados para formarem um epítopo capaz de interagir com o ligante mais fortemente do que cada um dos grupos cabeça individualmente. A pluralidade de conjugados que tem a atividade biológica desejada pode ser identificada pela seleção de um conjunto de conjugados com um arranjo de grupos cabeça, formando uma associação não-covalente entre eles, na qual os grupos cauda agregam-se hidrofobicamente e na qual os conjugados exibem liberdade de movimento com respeito a eles e ensaio da interação suficiente entre a associação não-covalente e o ligante. Este processo pode ser repetido com um arranjo modificado de grupos cabeça com o propósito de encontrar interação suficiente entre a associação não-covalente e o ligante. Este processo permite a identificação da seqüência mais favorável para ligação em um receptor específico baseando-se na proximidade dos grupos cabeça para proporcionar epítopos derivados de associação sem a necessidade da síntese de centenas de combinações possíveis de grupos diferentes usando química combinatória tradicional. O método simplesmente se baseia na proximidade dos grupos cabeça para proporcionar epítopos derivados de associação. Uma vez tendo sido sintetizado um conjunto de conjugados, nenhuma síntese orgânica adicional é exigida, apenas simples misturação dos conjugados para formar as sondas diferentes pela associação não-covalente.
Embora esta composição nova e este método novo tenham sido bem sucedidos para identificar os grupos funcionais que formam o epítopo e ligar no ligante alvo, ainda há uma exigência para proporcionar composições melhoradas que são capazes de formar o epítopo desejado e interagir com estabilidade e especificidade melhoradas com o ligante alvo para produzir uma resposta biológica.
Tentativas para produzir um peptídeo análogo ao epítopo construído apenas dos aminoácidos compreendendo o sitio de ligação muitas vezes falham porque estes peptídeos não possuem a mesma atividade biológica que a do receptor de proteína.
Onde o sítio de ligação de uma proteína é construído de oligopeptídeos de partes não-conjugadas, diferentes de uma cadeia de proteína, tentativas para construir o sítio de ligação por misturação de oligopeptídeos isolados na solução livre não resultam no sítio de ligação ativo.
Conseqüentemente, a presente invenção almeja proporcionar oligopeptídeos aperfeiçoados que são capazes de formar um epítopo desejado, que podem interagir com estabilidade e especificidade melhoradas com o ligante alvo para produzir uma resposta biológica. Sumário da Invenção
A invenção proporciona um oligopeptídeo cíclico compreendendo um anel de pelo menos seis aminoácidos para especificamente se ligar em um ligante alvo, sendo que o anel compreende uma pluralidade de domínios de aminoácido, cada domínio compreendendo pelo menos dois aminoácidos formadores de epítopo, e duas ou mais grupos funcionais associativos posicionados de modo que formem uma ou mais associações intra-cíclicas; por meio das quais o oligopeptídeo cíclico é restringido em uma conformação única de maneira que os aminoácidos formadores de epítopo formem um epítopo em cada domínio, cada epítopo sendo capaz de especificamente se ligar em um ligante alvo.
São conhecidos na técnica peptídeos cíclicos que têm uma conformação que é mais restringida do que a dos oligopeptídeos lineares. A liberdade de movimento das extremidades do peptídeo é limitada em um peptídeo cíclico porque têm sido ancoradas juntas quimicamente. Contudo, os peptídeos cíclicos ainda têm um grau de flexibilidade considerável que os torna inadequados para participarem em interações de ligação estável com um ligante alvo.
Pela construção de oligopeptídeos cíclicos com dois ou mais
grupos funcionais associativos posicionados de modo que formem uma ou mais associações intra-cíclicas, o oligopeptídeo cíclico é restringido internamente em uma conformação única. Isto permite que os aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio se ligam especificamente em um ligante alvo com estabilidade e especificidade maiores do que até agora disponível. Os aminoácidos formadores de epítopo são capazes de formarem um epítopo estável para interagir com um ligante para induzir uma resposta biológica. Devido ao fato de o epítopo ser estavelmente formado há interação melhorada com o ligante alvo. US 2005/0107289 mostra composições e agentes antimicrobianos que incluem peptídeos cíclicos tendo uma seqüência de aminoácidos de D- e L-a-aminoácidos ou β-aminoácidos alternados. Este documento adicionalmente mostra que se acredita que os peptídeos cíclicos se auto-montam em estruturas supramoleculares dentro ou pro associação com membranas microbianas. Tais estruturas supramoleculares podem ser, por exemplo, nanotubos. Cada nanotubo tem um poro no centro do tubo que está circundado por uma série de estruturas principais de peptídeo dos peptídeos
r
cíclicos empilhados. Ions e moléculas pequenas podem passar através dos poros dos nanotubos.
US 2005/0107289 não mostra que os peptídeos cíclicos compreendem aminoácidos formadores de epítopo que formam epítopos capazes de especificamente se ligarem em um ligante alvo. US 2005/0107289 também não descreve que os peptídeos cíclicos estão restringidos por associações intra-cíclicas com o objetivo de permitir a formação de tais epítopos.
G. Abbenante et al. "Conformational Control by Thiazole and Oxazoline Rings in Cyclic Octapeptides of Marine Origin. Novel Macrocyclic Chair and Boat Conformations"; J. Am. Chem. Soe. 1996, 118, 10384-10388 mostram a adaptação de blocos de construção de aminoácidos (Thr, Cys) como restrições conformacionais de anel (oxazolina, tiazol) para regular as estruturas tridimensionais e as reatividades de macrociclos marinhos. Octapeptídeo cíclico 1, c[Ile-Thr-D-Val-Cys-Ile-Thr-D-Val-Cyc-] é muito flexível, adotando muitas estruturas de energia baixa. Este octapeptídeo cíclico não tem quaisquer associações intra-cíclicas e não está restringido em uma conformação única para formar uma pluralidade de epítopos.
G. Abbenante et al. "Conformational Control by Thiazole and Oxazoline Rings in Cyclic Octapeptides of Marine Origin. Novel Macrocyclic Chair e Boat Conformations"; J. Am. Chem. Soe. 1996, 118, 10384-10388 também mostram peptídeo cíclico 2, c [Ile-Thr-D-(Val)Thz-Ile-Thr-D- (Val)Thz-], que mostrou uma conformação de pseudo-cadeira única em solução. Peptídeo cíclico 7, c[(Ile)Oxn-D-(Val)-Thz-(Ile)Oxn-D-(Val)Thz-], foi sintetizado e produziu uma macromolécula de formado de sela ou pseudo- bote elevadamente restringida. Octapeptídeo cíclico 8, produzido por hidrólise ácida de 7, mostrou uma conformação de bote com flexibilidade maior. Estes octapeptídeos cíclicos estão restringidos em um grau pela presença das oxazolinas e/ou dos tiazóis mas não formam uma pluralidade de epítopos.
R. M. Cusack et al., "Conformations of cyclic octapeptides and the influence of heterocyclic ring constraints upon calcium binding"; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 2000, 323-331 mostram quatro octapeptídeos cíclicos que diferem no número de restrições de anéis de tiazol e oxazolina heterocíclicos. Peptídeos 1, 2 e 3 adotaram formas diferentes em solução. Estes octapeptídeos cíclicos estão restringidos em um grau pela presença das oxazolinas e/ou dos tiazóis mas não formam uma pluralidade de epítopos.
R. M. Cusack et al., "Conformations of cyclic octapeptides and the influence of heterocyclic ring constraints upon calcium binding"; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 2000, 323-331 também mostram peptídeo 4 faltante de anéis de oxazolina e tiazol e modelagem molecular mostrou que tais peptídeos cíclicos faltantes de quaisquer restrições à parte da ligação de hidrogênio são muito flexíveis e podem potencialmente adotar uma miríade de conformações em solução. Peptídeo 4 não tem quaisquer associações intra-cíclicas e não está restringido em uma conformação única para formar uma pluralidade de epítopos.
O oligopeptídeo cíclico da presente invenção será agora
descrito com mais detalhe.
O oligopeptídeo cíclico compreende um anel de pelo menos seis aminoácidos, sendo que o anel compreende uma pluralidade de domínios de aminoácido, sendo que cada domínio compreende pelo menos dois aminoácidos formadores de epítopo, e dois ou mais grupos funcionais associativos.
Em uma modalidade, o oligopeptídeo cíclico consiste de um anel de seis aminoácidos, sendo que o anel consiste de dois domínios de aminoácido, cada domínio consistindo de dois aminoácidos formadores de epítopo, e dois grupos funcionais associativos. Em uma modalidade preferida, o oligopeptídeo cíclico consiste de um anel de oito aminoácidos, sendo que o anel consiste de dois domínios de aminoácido, cada domínio consistindo de três aminoácidos formadores de epítopo, e dois grupos funcionais associativos.
Em uma modalidade alternativa, o oligopeptídeo cíclico compreende um anel de mais do que oito aminoácidos. Nesta modalidade, preferivelmente o anel compreende três grupos funcionais associativos, que formam associações intra-cíclicas para produzir três domínio de aminoácido, cada domínio compreendendo três aminoácidos formadores de epítopo.
Os aminoácidos empregados no oligopeptídeo cíclico podem ser qualquer dos L-aminoácidos naturais, derivados substituídos dos mesmos, e formas-D dos mesmos.
Em uma modalidade preferida da presente invenção há três aminoácidos formadores de epítopo que têm configurações estereoquímicas alternadas, i.e. quer L-D-L quer D-L-D. Isto é particularmente vantajoso porque permite que as cadeias laterais dos aminoácidos formadores de epítopo sejam orientadas em uma configuração plana, todos faceando na mesma direção. Isto permite que os aminoácidos formadores de epítopo estejam uns com os outros em proximidade íntima para formarem o epítopo.
Em uma modalidade alternativa, o oligopeptídeo cíclico consiste de um anel de dez aminoácidos sendo que o anel consiste de dois domínios de aminoácido, cada domínio consistindo de quatro aminoácidos formadores de epítopo, e dois grupos funcionais associativos. Os aminoácidos formadores de epítopo podem ter configurações estereoquímicas iguais ou alternadas, i.e., L-L-L-L, D-D-D-D, L-D-L-L, L-L-D-L, L-L-L-D, D-L-L-L, L-L-D-D, D-D-L-L, L-D-L-D, D-L-D-L, L-D-D-L, D-L-L-D, D-L-D-D, D-D- L-D, D-D-D-L ou L-D-D-D.
Os grupos funcionais associativos estão posicionados no oligopeptídeo cíclico de modo que formem uma ou mais associações intra- cíclicas por meio das quais o oligopeptídeo cíclico é restringido em uma conformação única de maneira que os aminoácidos formadores de epítopo formem um epítopo em cada domínio. A formação de uma conformação única em um oligopeptídeo cíclico pode ser medida por numerosos métodos diferentes, que são todos conhecidos na técnica. Métodos espectroscópicos padrão, tais como espectroscopia de 1H RMN, dicroísmo circular, dispersão rotatória óptica, ou cristalografia de raios-X podem ser usados para determinar a conformação do oligopeptídeo cíclico
Os aminoácidos formadores de epítopo formam um epítopo em cada domínio porque o oligopeptídeo cíclico está restringido em uma conformação única por uma ou mais associações intra-cíclicas. Os epítopos formados são capazes de especificamente se ligarem em um ligante alvo. A estrutura específica do epítopo e do ligante alvo na presente invenção não é limitada na presente invenção. O propósito desta invenção é proporcionar uma armação de oligopeptídeo que apresenta uma pluralidade de epítopos compreendidos de qualquer combinação apropriada de pelo menos dois aminoácidos formadores de epítopo, seus análogos ou derivados, em uma tal maneira que estes aminoácidos formadores de epítopo sejam mantidos em uma configuração estável possuindo rigidez suficiente para permitir que o epítopo se ligue fortemente em um ligante alvo específico, tal como um receptor. A pessoa experiente pode conhecer a seqüência de aminoácidos formadores de epítopo ou pode usar um método tal como aquele mostrado em WO 01/01140 para proporcionar um epítopo que interage com o ligante alvo. A pessoa experiente não precisa de estruturas químicas detalhadas de todos os possíveis epítopos porque ela pode facilmente selecionar os aminoácidos adequados para formar um epítopo. Qualquer seqüência de aminoácidos formadores de epítopo pode ser adequada em qualquer dada situação e esta dependerá do ligante alvo. Ademais, a ordem dos aminoácidos em cada domínio pode determinar a atividade do epítopo formado e também dependerá do ligante alvo. Não é necessário conhecer a estrutura química exata do ligante desde que a atividade biológica do ligante alvo seja conhecida. Aminoácidos formadores de epítopo podem ser incluídos no oligopeptídeo cíclico da presente invenção sem a necessidade de conhecimento da estrutura química exata do ligante porque a função biológica associada com o ligante pode ser medida para determinar se tem ocorrido ou não a interação entre epítopo e ligante. A pessoa experiente, baseando-se nos dados experimentais obtidos no modelo de teste apropriado, pode facilmente selecionar os aminoácidos para incluir no oligopeptídeo cíclico como os aminoácidos formadores de epítopo e determinar qual ordem de aminoácidos em cada domínio proporciona a melhor atividade biológica para a atividade desejada.
Exemplos de ensaios para determinar a interação entre o oligopeptídeo cíclico e o ligante alvo podem incluir ensaios de ligação tais como aqueles utilizando o princípio de ELISA para detecção de associação entre anticorpo e antígeno. Outros ensaios in vitro adequados incluem modificação de fluorescência de sondas fluorescentes ligadas em membrana ambientalmente sensível, reações de precipitação, intensificação ou inibição de atividade enzimática etc. Ensaios baseando na capacidade de materiais de alterar o comportamento de células cultivadas in vitro também podem ser apropriados, tais como ensaios para morte celular, proliferação celular, apoptose, inibição ou estimulação de contato de célula-em-célula, secreção de citocinas ou outros produtos solúveis, síntese de m-RNA específico, transporte vesicular intracelular, alteração de processos de sinalização celular etc. Ensaios in vivo em animais ou humanos inteiros também podem ser realizados, por exemplo incorporação de radiomarcador no oligopeptídeo cíclico, seguida de investigação de sua distribuição subseqüente após administração por várias rotas.
Um epítopo é formado em cada domínio. Portanto, o número de epítopos formados no oligopeptídeo cíclico é pelo menos dois, preferivelmente dois ou três. O epítopos no oligopeptídeo cíclico podem ser iguais ou diferentes. Quando os epítopos no oligopeptídeo cíclico são diferentes, cada domínio pode ter aminoácidos diferentes ou ter os mesmos aminoácidos mas em uma ordem diferente. Um exemplo de um tal epítopo é aquele formado pela combinação dos aminoácidos serina (S), fenilalanina (F) e arginina (R), que se ligam em receptor de superfície celular sobre macrófagos. Ligação d epítopo no receptor de superfície celular causa inibição de secreção de TNF. Associações Intra-cíclicas
As uma ou mais associações intra-cíclicas servem para restringir o oligopeptídeo cíclico em uma conformação única com uma pluralidade de domínios de aminoácido. Os aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio estão apertadamente restringidos com liberdade de movimento muito limitada. Isto permite a formação de um epítopo estável em cada domínio que pode interagir com estabilidade e especificidade melhoradas com o ligante alvo para produzir uma resposta biológica.
O número de grupos funcionais associativos em cada oligopeptídeo cíclico e o tipo de grupos funcionais associativos selecionados dependerão dos aminoácidos formadores de epítopo e do ligante alvo. O número e a natureza dos grupos funcionais associativos podem afetar a atividade biológica do oligopeptídeo cíclico. A pessoa experiente na técnica pode facilmente selecionar o número ou o tipo mais efetivo de grupos funcionais associativos a usar pelo teste para a atividade desejada. As uma ou mais associações intra-cíclicas são formadas por dois ou mais grupos funcionais associativos apropriadamente posicionados. Pelo menos um grupo funcional associativo está preferivelmente posicionado entre cada um dos domínios de aminoácido.
As uma ou mais associações intra-cíclicas podem ser covalentes ou não-covalentes. Os grupos funcionais associativos no oligopeptídeo cíclico podem ser iguais ou diferentes.
Os grupos funcionais associativos podem ser provenientes de aminoácidos associativos. Em uma modalidade os grupos funcionais associativos são as cadeias laterais dos aminoácidos associativos ou as cadeias laterais modificadas dos aminoácidos associativos ou os grupos adicionados na cadeia lateral dos aminoácidos associativos. Um exemplo desta modalidade é mostrado em estrutura I abaixo.
Alternativamente, os grupos funcionais associativos podem ser provenientes dos átomos de nitrogênio de ligações peptídicas no anel de oligopeptídeo cíclico por substituição do hidrogênio ligado no nitrogênio. Um exemplo desta modalidade é mostrado em estrutura II abaixo.
Em outra modalidade alternativa, os grupos funcionais associativos podem ser provenientes de outros grupos adequados posicionados dentro do anel de oligopeptídeo, que não são aminoácidos. Um exemplo de um tal grupo é um ácido alfa-hidróxi-carboxílico, onde o grupo hidroxila participa em uma ligação éster, em vez de uma ligação peptídica.
A frase "dois ou mais grupos funcionais associativos" inclui as seguintes modalidades:
• onde a associação intra-cíclica é não-covalente: o os grupos funcionais associativos são dois grupos pendentes do anel de oligopeptídeo provenientes dos aminoácidos associativos dentro do anel, que se associam para formar a associação não-covalente;
o os grupos funcionais associativos são dois grupos pendentes do anel de oligopeptídeo provenientes dos átomos de nitrogênio de ligações peptídicas dentro do anel, que se associam para formar a associação não- covalente;
o os grupos funcionais associativos são dois grupos pendentes do anel de oligopeptídeo provenientes de outros grupos adequados posicionados dentro do anel, que se associam para formar a associação não- covalente; ou
• onde a associação intra-cíclica é covalente: o os grupos funcionais associativos são dois grupos provenientes dos aminoácidos associativos dentro do anel, que são ligados juntos para formarem a associação covalente quer diretamente quer via um ligante, tal como um grupo bifuncional;
o os grupos funcionais associativos são dois grupos provenientes dos átomos de nitrogênio de ligações peptídicas dentro do anel, que são ligados juntos para formarem a associação covalente quer diretamente quer via um ligante, tal como um grupo bifuncional; ou
o os grupos funcionais associativos são dois grupos provenientes de outros grupos adequados posicionados dentro do anel, que são ligados juntos para formarem a associação covalente quer diretamente quer via um ligante, tal como um grupo bifuncional.
A frase "proveniente(s) de" significa que os grupos associativos são quer diretamente ligados quer ligados via um ligante adequado nos aminoácidos associativos, átomos de nitrogênio ou outros grupos adequados.
Em uma modalidade preferida, as uma ou mais associações
intra-cíclicas entre os grupos funcionais associativos são não-covalente. Associações intra-cíclicas não-covalentes são particularmente preferidas na presente invenção porque permitem que o oligopeptídeo cíclico tenha o equilíbrio correto entre rigidez e flexibilidade. O oligopeptídeo cíclico é suficientemente rígido para manter a estrutura principal peptídica em uma conformação e garantir que os aminoácidos formadores de epítopo estejam posicionados juntos suficiente próximos e corretamente para formarem um epítopo capaz de especificamente se ligar em um ligante alvo. O oligopeptídeo cíclico também é suficientemente flexível para permitir movimento suficiente das cadeias laterais dos aminoácidos formadores de epítopo para se adaptarem na estrutura precisa do ligante alvo no qual podem se ligar. Portanto, os oligopeptídeos cíclicos da presente invenção compreendendo associações intra-cíclicas não-covalentes podem interagir com estabilidade e especificidade melhoradas com um ligante alvo para produzir uma resposta biológica.
Preferivelmente as associações intra-cíclicas são hidrofóbicas. Em uma modalidade particularmente preferida há dois domínios de aminoácido e dois grupos funcionais associativos lipofílicos. O uso de associações intra-cíclicas não-covalentes,
particularmente por interações hidrofóbicas, é vantajoso porque permite que associações intra-cíclicas sejam formadas das interações entre três ou mais grupos funcionais associativos, isto permite a formação de três ou mais domínios de aminoácido, que é difícil quando associações intra-cíclicas covalentes são usadas. Conseqüentemente, em outras modalidades preferidas da presente invenção o oligopeptídeo cíclico pode compreender três ou mais grupos funcionais associativos que formam associações intra-cíclicas para produzir três ou mais domínios de aminoácido. O uso de grupos funcionais associativos lipofílicos para formar associações intra-cíclicas não-covalentes por interações hidrofóbicas é particularmente vantajoso quando o oligopeptídeo cíclico é grande.
Os grupos funcionais associativos, que se posicionam para formar as uma ou mais associações intra-cíclicas não-covalentes, podem compreender qualquer molécula que é proveniente de um grupo adequado de estereoquímica apropriada que forma parte do anel de oligopeptídeo cíclico. Os grupos funcionais associativos são preferivelmente provenientes de seus aminoácidos associativos, cujos exemplos são citados abaixo, embora outros grupos capazes de inserção no anel de oligopeptídeo cíclico possam ser empregados. É geralmente preferido que os grupos dos quais os grupos funcionais associativos são provenientes sejam ligados no anel por ligações peptídicas. Em uma modalidade alternativa, uma ou mais das ligações peptídicas podem ser substituídas por outros tipos de ligação. Exemplos de tais ligações são ligações éster, ligações éter, ligações tio-éster e ligações tio- éter. Isto pode ser desejável oportunamente com o propósito de limitar o ataque por proteases em fluidos biológicos.
Os aminoácidos associativos podem compreender L- aminoácidos naturais possuindo os grupos funcionais associativos.
Preferivelmente, os aminoácidos associativos são análogos de aminoácido lipídico. Por exemplo, os aminoácidos associativos podem compreender de cisteína, glicina, lisina, ácido aspártico ou ácido glutâmico. No caso de cisteína, o grupo funcional associativo pode ser um grupo alifático adicionado na cadeia lateral da cisteína via uma funcionalidade sulfídrila. Lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico também podem ser empregados nesta maneira, pela adição do grupo funcional associativo na cadeia lateral. O aminoácido associativo pode ser alternativamente um aminoácido no qual a cadeia lateral é um único grupo alifático, que constitui o grupo funcional associativo. Por exemplo, se um aminoácido associativo é baseado em glicina, o hidrogênio alfa da glicina pode ser substituído por um grupo alifático, que constitui o grupo funcional associativo.
O grupo alifático referido acima, que pode formar o grupo funcional associativo, é preferivelmente uma cadeia de hidrocarboneto alifático preferivelmente tendo de 8 a 20 átomos de carbono e mais preferivelmente compreende de 10 a 16 átomos de carbono, muito mais preferivelmente 10 ou 12 carbonos e pode se cadeia linear ou cadeia ramificada saturada ou insaturada e não substituída ou substituída quer total quer parcialmente, por exemplo com átomos de halogênio. Alternativamente, o grupo alifático pode ser composto de grupos silano.
Na estrutura I exemplar abaixo, o aminoácido associativo é glicina, no qual o hidrogênio alfa tem sido substituído por uma cadeia de hidrocarboneto Cio-
H
NH2-C-COOH
(CH2)9
CH3
Em uma modalidade, onde os grupos funcionais associativos são provenientes dos átomos de nitrogênio de ligações peptídicas no anel, associações intra-cíclicas não-covalentes, tais como associações hidrofóbicas, podem ser realizadas pela substituição dos átomos de hidrogênio nos nitrogênios das ligações peptídicas por grupos funcionais associativos tais como, por exemplo, o grupo alifático, como definido acima.
Substituição de um átomo de hidrogênio em um nitrogênio de uma ligação peptídica no oligopeptídeo cíclico da presente invenção por um grupo funcional associativo pode ser feita primeiro substituindo o átomo de hidrogênio por um grupo metileno possuindo um grupo funcional adequado tal como, por exemplo, -SH, -OH ou -NH2, subseqüentemente seguido por derivação com o grupo funcional associativo, tal como um grupo alifático como definido acima.
Em um aspecto desta modalidade, onde o nitrogênio é de uma ligação peptídica ligando dois aminoácidos formadores de epítopo de domínios de aminoácido separados, o oligopeptídeo cíclico da presente invenção pode ter a seguinte estrutura II: A
X
C
Y
sendo que A, B, C, X, Y e Z representam os aminoácidos formadores de epítopo, N representa o nitrogênio das ligações peptídicas entre B/Z e C/Y e Φ representa os grupos funcionais associativos, tais como grupos alifáticos como definidos acima, ligados no nitrogênio.
Outra vantagem do uso de grupos funcionais associativos não- covalentes, particularmente hidrofóbicos, é que isto permite interações inter- moleculares, onde os grupos funcionais associativos hidrofóbicos de oligopeptídeos cíclicos diferentes se associam uns com os outros para produzir dímeros ou oligômeros contendo uma multiplicidade de epítopos repetidos orientados em direções diferentes. A extensão na qual tais interações ocorrem depende da estrutura da seqüência do oligopeptídeo cíclico, que determina a hidrofilicidade relativa dos domínios de aminoácido. Isto pode ser adicionalmente controlado por escola criteriosa do grupo funcional associativo, onde a quiralidade e o volume podem ser variados para controlar a quantidade precisa de superfície hidrofóbica do oligopeptídeo exposto. Isto pode ser vantajoso na modulação de interações inter-moleculares com outros oligopeptídeos cíclicos internamente-restringidos, ou interações com outras moléculas tais como proteínas ou ciclo-dextrinas. Isto pode ser vantajoso na criação de estruturas multiméricas pequenas compreendendo dois ou mais oligopeptídeos cíclicos da presente invenção, que podem se ligar ao mesmo tempo em dois ou mais receptores de superfície celular, ligando cruzadamente deste modo os receptores em uma tal maneira que um ativador de iniciação forte é apresentado à célula, resultando em uma cascata de sinais.
Interações de oligopeptídeos cíclicos da presente invenção com outros oligopeptídeos cíclicos não-idênticos da presente invenção podem ser vantajosas na criação de estruturas multiméricas que possuem funcionalidade múltipla em virtude dos epítopos diferentes contribuindo para a estrutura pelos oligopeptídeos diferentes. Assim, por exemplo, um oligopeptídeo pode compreender um ou mais epítopos que se ligam em receptores que permitem que a estrutura multimérica seja internalizada, enquanto que um segundo oligopeptídeo dentro da estrutura multimérica pode compreender um ou mais epítopos que podem interagir com componentes de uma cascata de sinalização dentro da célula, após internalização.
Ligação de ciclo-dextrinas nos oligopeptídeos cíclicos desta invenção pode ajudar a reduzir o nível de interações entre as partes hidrofóbicas de oligopeptídeos diferentes, e assim evita a formação de agregados grandes, cuja atividade pode ser reduzida comparado com monômeros ou oligômeros por causa do impedimento estérico de epítopos nestes agregados grades. Em soluções de proteínas tais como albumina ou gelatina, um
ou mais dos oligopeptídeos cíclicos da invenção podem ser ligar na superfície da proteína como um resultado de associação dos grupos lipofílicos dos grupos funcionais associativos hidrofóbicos no peptídeo com regiões da proteína que possuem uma afinidade por cadeias de hidrocarboneto alquila ou acila. Tal ligação de um ou mais oligopeptídeos cíclicos da presente invenção sobre a superfície de uma proteína grande é um modo de arranjar que um arranjo múltiplo de epítopos sobre o oligopeptídeos cíclicos é apresentado em uma tal maneira que ativação de interações de sinalização em células é maximizada.
Em uma outra modalidade, as uma ou mais associações intra-
cíclicas entre os grupos funcionais associativos são covalentes. Nesta modalidade, os grupos funcionais associativos também podem ser provenientes de aminoácido associativos. Por exemplo, os grupos funcionais associativos podem ser as cadeias laterais de cisteínas (aminoácido associativos) e a associação é formada por uma ligação de dissulfeto intra- cíclica entre estas cadeias laterais. Alternativamente, os aminoácidos associativos podem ser lisina e ácido glutâmico, que podem se associar covalentemente por formação de uma ligação peptídica através de grupos terminais em suas cadeias laterais (grupos funcionais associativos), ou ácido glutâmico e serina, que podem reagir para formar uma ligação éster. Análogos destes aminoácidos possuindo os mesmos grupos funcionais também podem ser usados.
Em uma modalidade, uma associação intra-cíclica covalente pode ser alcançada pela substituição de hidrogênios ligados nos átomos de nitrogênio de ligações peptídicas no anel por grupos funcionais associativos, que formam associações covalentes. Os grupos funcionais associativos podem ser tióis, ou outras cadeias possuindo grupos funcionais em suas terminações que podem formar uma associação covalente. Substituição de um átomo de hidrogênio em um nitrogênio de uma ligação peptídica no oligopeptídeo cíclico da presente invenção por um grupo funcional associativo pode ser feita primeiro pela substituição do átomo de hidrogênio por um grupo metileno possuindo um grupo funcional adequado tal como, por exemplo, -SH, -OH ou -NH2, subseqüentemente seguida por uma segunda etapa de ligação do grupo funcional em um reagente bifuncional. A associação covalente é formada por substituição adicional de um segundo átomo de hidrogênio (em um nitrogênio de uma ligação peptídica) por um segundo grupo metileno possuindo um grupo funcional adequado e o reagente bifuncional acima é adicionalmente ligado no grupo funcional deste segundo grupo metileno para criar uma ligação covalente entre dois átomos de nitrogênio de ligações peptídicas no oligopeptídeo cíclico. Dependendo da natureza dos grupos funcionais associativos incorporados nos oligopeptídeos cíclicos, reagentes bifuncionais apropriados seriam aqueles que compreendem uma cadeia curta na qual cada uma das terminações possui um grupo funcional selecionado de, mas não limitado à seguinte lista: grupos carboxila, amino, hidroxila, sulfidrila, bromo, iodo, ciano, azo e ácidos borônicos.
oligopeptídeo cíclico compreende dois domínios de aminoácido e dois grupos funcionais associativos, cada um proveniente de um aminoácido associativo, e um epítopo é formado de três aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio, o oligopeptídeo cíclico pode ter a seguinte estrutura:
formadores de epítopo; AeX representam D-aminoácidos e B, C, Y e Z representam L-aminoácidos ou A e X representam L-aminoácidos e B, C, Y e Z representam D-aminoácidos; um epítopo é formado do domínio C-A-B e um epítopo é formado do domínio Z-X-Y; e cada Σ representa um aminoácido associativo possuindo grupo funcional associativo.
presente invenção, o domínio Z-X-Y e/ou o domínio C-A-B pode ser selecionado de seqüências de aminoácido RFS, RSF, FSR, FRS, SRF, SFR QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS ou LSQ e cada Σ é um aminoácido lipídico com uma cadeia lateral de hidrocarboneto linear Ci0 como o grupo funcional associativo. Preferivelmente o domínio Z-X-Y é RFS no qual é preferido que fenilalanina seja de configuração D, serina seja de configuração L, arginina seja de configuração L e cada aminoácido lipídico seja de configuração L. Em uma modalidade preferida o domínio Z-X-Y e/ou o domínio C-A-B selecionados de seqüências acima formam, cada um, um epítopo capaz de suprimir secreção de TNF. Conseqüentemente, estas seqüências podem ser
Em um aspecto particular da presente invenção no qual o
sendo que A, B, C, X, Y e Z representam os aminoácidos
Em um exemplo de um oligopeptídeo cíclico de acordo com a úteis no tratamento de uma doença na qual TNF é um fator exacerbante por exemplo, uma doença selecionada de câncer, obesidade, distúrbios cardíacos, doença autoimune e doenças inflamatórias. Estas seqüências podem ser usadas para tratar uma doença autoimune selecionada de artrite reumatóide, Esclerose Múltipla e doença de Crohn.
Na estrutura acima, o domínio C-A-B pode ser igual ao ou diferente do domínio Z-X-Y.
Em um outro aspecto da presente invenção o oligopeptídeo cíclico compreende três domínios de aminoácido e um epítopo é formado dos três aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio e preferivelmente o oligopeptídeo compreende três grupos funcionais associativos.
cíclico compreende dois domínios e um epítopo é formado de quatro aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio. Em uma modalidade deste aspecto da invenção o oligopeptídeo cíclico tem a seguinte estrutura:
aminoácidos formadores de epítopo; um epítopo é formado do domínio D-C- A-B e um epítopo é formado do domínio Z-X-Y-W; e cada Σ representa um aminoácido associativo.
Em uma modalidade alternativa deste aspecto da invenção o oligopeptídeo cíclico tem a seguinte estrutura:
Em um outro aspecto da presente invenção o oligopeptídeo
sendo que A, B, C, D, W, X, Y e Z representam os
D
W sendo que A, B, C, D, W, X, Y e Z representam os aminoácidos formadores de epítopo; um epítopo é formado do domínio D-C- A-B e um epítopo é formado do domínio Z-X-Y-W; cada N representa o nitrogênio de ligações peptídicas entre B-Z e C-Y e cada Φ representa um grupo funcional associativo ligado via o nitrogênio.
Em um exemplo de um oligopeptídeo cíclico de acordo com este aspecto da presente invenção, o domínio Z-X-Y-W e/ou o domínio D-C- A-B pode ser selecionado de seqüências de aminoácido YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, YKEA5 EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EA YK, KA YE, KAEY, KYAE, KYEA, ΚΕΑ Υ, KEYA, AKEY, AK YE, AYEK, AYKE, AEYK ou AEKY e cada Σ é um aminoácido lipídico com um grupo funcional associativo de cadeia lateral de hidrocarboneto linear compreendendo uma cadeia de hidrocarboneto entre 8 e 20 átomos de carbono em comprimento. Preferivelmente o domínio Z-X-Y-W is YEKA e o domínio D-C-A-B é EYAK. Em uma modalidade preferida o domínio Z-X-Y- W e/ou o domínio D-C-A-B selecionados das seqüências acima formam, cada um, um epítopo capaz de inibir atividade proteolítica. Conseqüentemente, estas seqüências podem ser usadas para tratar uma doença na qual a atividade de protease é um fator exacerbante tal como doença cardiovascular, distúrbios de circulação e HIV.
Em uma modalidade deste aspecto da invenção, o domínio D- C-A-B é igual ao domínio Z-X-Y-W. Composições
Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o oligopeptídeo cíclico como definido acima e um adjuvante e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Este excipiente é preferivelmente selecionado de transcutol, copolímeros em bloco de poloxâmero, ciclo-dextrinas, tensoativos não-iônicos ou sais biliares. Se o excipiente é um tensoativo não-iônico ele é preferivelmente selecionado de acil-ésteres de poli(etileno-glicol) ou éteres alifáticos de poli(etileno- glicol).
Como discutido acima, em uma modalidade da invenção associações inter-cíclicas podem se formar entre oligopeptídeos cíclicos separados onde grupos funcionais associativos hidrofóbicos de oligopeptídeos cíclicos diferentes se associam uns com os outros para produzirem dímeros ou oligômeros contendo uma multiplicidade de epítopos repetidos orientados em direções diferentes. A extensão de interações inter-cíclicas pode ser modificada pela co-misturação com excipientes que ajudam na solubilização de grupos hidrofóbicos em meio aquoso. Usos
Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um oligopeptídeo cíclico como definido acima ou uma composição como definida acima, para uso como um medicamento, um agente profilático ou um agente diagnóstico.
A presente invenção também proporciona o uso de um oligopeptídeo cíclico como definido acima ou uma composição como definida acima para a manufatura de um medicamento para tratar uma doença na qual TNF é um fator exacerbante. Preferivelmente a doença é selecionada de obesidade, distúrbios cardíacos, doença autoimune e doenças inflamatórias. Mais preferivelmente a doença é artrite reumatóide ou doença de Crohn. O oligopeptídeo cíclico como definido acima pode ser usado para tratar câncer no qual TNF é um fator exacerbante. O câncer pode ser benigno ou maligno. O câncer é preferivelmente um tumor sólido. Tais cânceres incluem mas não são limitados a câncer de ovário, câncer de mama, cânceres de pele e cânceres epiteliais.
A presente invenção também proporciona o uso de um oligopeptídeo cíclico como definido acima ou uma composição como definida acima para a manufatura de um medicamento para tratar uma doença na qual a atividade de protease é um fator exacerbante, incluindo doença cardiovascular, distúrbios de circulação e HIV. Em uma modalidade específica da invenção, cada domínio no oligopeptídeo cíclico compreende aminoácidos formadores de epítopo SRER, SERE, EYKA, YEAK, SFR ou RFS, que foram mostrados em exemplo 7 em inibir atividade proteolítica de trombina.
Em uma modalidade específica desta invenção descrita acima, o oligopeptídeo cíclico compreende os aminoácidos serina, fenilalanina e arginina como os aminoácidos formadores de epítopo em pelo menos um dos domínios. Tem sido mostrado que estes oligopeptídeos exibem atividade em inibição de secreção de TNF de macrófagos. Em um aspecto preferido desta modalidade os grupos funcionais associativos são aminoácidos lipídicos com cadeias laterais de hidrocarboneto C12 e os aminoácidos formadores de epítopo são selecionados de RFS, FSR ou SRF, onde o aminoácido central está na forma D, e os outros dois aminoácidos estão na forma L.Cada epítopo no oligopeptídeo cíclico pode ser igual ou diferente.
Em virtude de sua capacidade para infra-regular a secreção de TNF, estes oligopeptídeos podem ter eficácia no tratamento de tais doenças como artrite reumatóide, doença de Crohn, Esclerose Múltipla, obesidade, distúrbios cardíacos, doença autoimune, e outras doenças onde processos inflamatórios estão envolvidos. Em virtude de sua capacidade para infra- regular a secreção de TNF, estes oligopeptídeos também têm eficácia no tratamento de câncer no qual TNF é um fator exacerbante. O câncer pode ser benigno ou maligno. Tais cânceres incluem mas não são limitados a câncer de ovário, câncer de mama, cânceres de pele e cânceres epiteliais.
Em uma modalidade específica desta invenção descrita acima, o oligopeptídeo cíclico compreende os aminoácidos A, Κ, E e Y como os aminoácidos formadores de epítopo em pelo menos um dos domínios. Tem sido mostrado que estes oligopeptídeos exibem atividade em inibição de secreção de TNF de macrófagos. Em um aspecto preferido desta modalidade os grupos funcionais associativos são aminoácidos lipídicos com cadeias laterais de hidrocarboneto Cio e os aminoácidos formadores de epítopo são selecionados de YEKA e EYAK. Cada epítopo no oligopeptídeo cíclico pode ser igual ou diferente. A eficácia de Copaxone (Glatiramer acetato), um copolímero aleatório compreendendo aminoácidos A, Κ, E e Y, no tratamento de Esclerose Múltipla, é considerada em ser refletida pela capacidade deste composto em infra-regular a secreção de TNF in vitro. (Ref: Weber MS, Starck M, Wagenpfeil S, Meinl E, Hohlfeld R & Farina C. "Multiple sclerosis: glatiramer acetate inhibits monocyte reactivity in vitro and in vivo". Brain 127 pp 13 70-8 (2004)). Com relação a isto, o oligopeptídeo cíclico ciclo(-A-K-X-Y-E-K-Α-Σ-Ε-Υ) testado em exemplo 6 também será útil no tratamento de Esclerose Múltipla, porque ele compreende os mesmos aminoácidos em uma configuração não-aleatória e exibe o mesmo efeito sobre secreção de η TNF pelos macrófagos. Outros arranjos de seqüências de A, K, EeY em oligopeptídeos cíclicos de acordo com a presente invenção também podem ser usados para tratar Esclerose Múltipla.
Uma vantagem da invenção é que interações de ligação específica forte podem ser alcançadas com o oligopeptídeo cíclico da presente invenção em comparação com os receptores convencionais. O oligopeptídeo cíclico pode ser relativamente pequeno, preferivelmente compreendendo não mais do que 6 ou 8 aminoácidos. Conseqüentemente, o oligopeptídeo cíclico de acordo com a presente invenção pode ser tornado menos imunogênico do que suas contra-partes de proteína.
De acordo com este aspecto da invenção, não apenas pode o oligopeptídeo cíclico da presente invenção ser formulado para interagir com um ligante in vitro mas também a composição pode ser usada in vivo.
O oligopeptídeo cíclico ou a composição de acordo com a presente invenção pode ser administrado(a) via qualquer rota apropriada para a doença em questão, incluindo, mas não limitada a, rotas de administração oral, nasal, retal, bucal, sublingual, pulmonar, vaginal, tópica, ocular, óptica, sub-cutânea, intra-dermal, intra-articular, intra-tecal, intra-muscular, intra- cerebral, intra-cranial e intravenosa.
Os oligopeptídeos cíclicos podem ser administrados em solução aquosa livre, ou conjuntamente com excipientes farmacêuticos na composição da presente invenção. O oligopeptídeo cíclico ou a composição também pode ser co-misturado(a) com outros princípios moleculares ativos para realizar sinergia com, ou diferentemente intensificar sua atividade como agentes terapêuticos medicinais. Quando administrado(a) por certas rotas, e.g. oral ou retal, os oligopeptídeos ou a composição pode(m) ser formado(s) como sólidos, semi-sólidos ou líquidos e em cápsulas cheias com os mesmos, ou como sólidos comprimidos em tabletes, ou extrusados em pelotas. Neste caso, as cápsulas, tabletes ou pelotas podem ser entericamente revestidas, se a rota final de administração for para ser oral. Para aplicação tópica, formulação como um gel, uma pasta ou um óleo é particularmente adequada, enquanto que para administração pulmonar ou nasal o oligopeptídeo pode estar na forma de um aerossol. Método
Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir um oligopeptídeo cíclico como definido acima, compreendendo:
i) selecionar os aminoácidos formadores de epítopo;
ii) produzir um oligopeptídeo cíclico incorporando os aminoácidos formadores de epítopo.
São conhecidos métodos para identificar epítopos. Em química combinatória tradicional, a identificação da seqüência mais favorável para ligação em um receptor específico tem que ser realizada por síntese de centenas de combinações possíveis de grupos diferentes tais como aminoácidos, em ordens diferentes, cada um tendo que ser testado para eficácia. Este processo é consumidor de tempo, caro e é limitado pela natureza da química que pode ser realizada para ligar juntos componentes diferentes.
Como discutido acima, os aminoácidos formadores de epítopo podem ser selecionados por uma variedade de métodos diferentes conhecidas pela pessoa experiente na técnica.
WO 01/01140 proporciona um método para determinar moléculas que formam um epítopo capaz de interagir com um ligante desejado que usa uma montagem não-covalente de uma pluralidade de conjugados diferentes. Como descritos nas páginas 2 a 5 de WO 01/01140, cada conjugado compreende um grupo cabeça e um grupo cauda, sendo que os grupos cauda dos conjugados formam uma agregação hidrofóbica e os conjugados têm uns em relação aos outros uma liberdade de movimento dentro da montagem de modo que, na presença de um ligante, pelo menos dois dos grupos cabeça (que são iguais ou diferentes) são apropriadamente posicionados para formarem um epítopo capaz de interagir com o ligante mais fortemente do que cada um dos grupos cabeça individualmente. Os grupos cabeça são tipicamente hidrofílicos e os grupos cauda tipicamente hidrofóbicos, e.g. lipofílicos, compostos de cadeias de hidrocarboneto, halofílicos, construídos de cadeias de fluorocarboneto, ou baseados em silano. Pela construção de conjugados com um grupo cabeça e um grupo cauda, os grupos cauda podem se associar para formar uma agregação hidrofóbica que é tipicamente uma montagem supramolecular tal como ma micela, uma estrutura lamelar, um lipossomo ou outra estrutura lipídica, na qual os conjugados estão orientados por meio do qual os grupos cabeça são trazidos em proximidade íntima quando em fase aquosa. Devido ao fato de os conjugados serem móveis dentro da montagem, os grupos cabeça são capazes de adotar numerosas posições diferentes dentro da montagem. Os grupos cabeça, que são tipicamente não-idênticos, estão portanto livres para se movimentarem dentro da montagem e, surpreendentemente, para interagirem cooperativamente para induzirem conseqüências biológicas que os grupos cabeça por si sós não são capazes de induzir.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, o método mostrado em WO 01/01140 é usado para selecionar os aminoácidos formadores de epítopo, sendo que este método compreende:
(a) selecionar um conjunto de conjugados, cada conjugado compreendendo um grupo cabeça e um grupo cauda, com um arranjo de grupos cabeça, sendo que cada grupo cabeça compreende um aminoácido;
(b) formar uma associação não-covalente dos mesmos, na qual os grupos cauda se agregam hidrofobicamente e na qual os conjugados são móveis;
(c) ensaiar a interação suficiente entre a associação não- covalente e o ligante alvo;
(d) opcionalmente repetir as etapas (a) a (c) usando um conjunto de conjugados com um arranjo modificado de grupos cabeça; e
(e) ao descobrir interação suficiente em etapa (c) selecionar os aminoácidos dos grupos cabeça do conjunto de conjugados como os aminoácidos formadores de epítopo em etapa (a).
Exemplos de ensaios para "interação suficiente" podem incluir ensaios de ligação tais como aqueles utilizando o princípio de ELISA para detecção de associação entre anticorpo e antígeno. Outros ensaios in vitro adequados incluem modificação de fluorescência de sondas fluorescentes ligadas em membrana ambientalmente sensível, reações de precipitação, intensificação ou inibição de atividade enzimática etc. Ensaios baseados na capacidade de materiais para alterar o comportamento de células cultivadas in vitro também podem ser apropriados, tais como ensaios para morte celular, apoptose, inibição ou estimulação de constato de célula-em-célula, secreção de citocinas ou outros produtos solúveis, síntese de m-RNA específico, transporte vesicular intracelular, alteração de processos de sinalização celular etc. Ensaios in vivo em humanos ou animais inteiros também podem ser realizados, por exemplo incorporação de radiomarcação em montagens supramoleculares, seguida por investigação de sua distribuição subseqüente após administração por várias rotas.
De acordo com este método uma abordagem combinatória é usada na qual uma variedade de montagens (ou "sondas") supra-moleculares diferentes é preparada, cada uma contendo uma combinação diferente de conjugados selecionado de um banco pré-selecionado. Seleção dos conjugados apropriados pode ser baseada em propriedades conhecidas do ligante alvo ou pode simplesmente envolver o uso de uma variedade muito ampla de grupos cabeça para aumentar a probabilidade de que dois ou mais dos grupos cabeça formarão um epítopo para o ligante. Neste modo, após o ensaio para interação suficiente entre a sonda e o ligante como descrito acima, a combinação de conjugados encontrada em ser mais efetiva pode ser modificada pela adição de outros grupos cabeça, remoção de alguns grupos cabeça, ou ambas, e ensaio das sondas resultantes uma vez mais para interação suficiente. Eventualmente, a combinação mais favorável de grupos cabeça pode ser identificada e selecionada para uso como os aminoácidos formadores de epítopo. EXEMPLOS
Exemplo 1- resposta de dose de oligopeptídeo cíclico em supressão de secreção de TNF estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) em uma linhagem celular de macrófago.
1. Um octapeptídeo cíclico com a estrutura: ciclo(-DF-S-Z-R-DF-S-I-R-)
foi sintetizado usando métodos padrão baseados na técnica baseada em resina de Merrifield, seguido por ciclização em fase de solução. O peptídeo purificado foi preparado como uma solução em água destilada em uma concentração de 1 mg/ml.
R, F e S representam os aminoácidos formadores de epítopo e Σ representa o grupo funcional associativo proveniente do aminoácido associativo sendo que o aminoácido associativo é um ácido L-alfa-amino- carboxílico e o grupo funcional associativo é um resíduo de cadeia lateral consistindo de uma cadeia alifática linear contendo dez átomos de carbono.
Todos aminoácidos estão na forma L a não ser se indicado de
outro modo.
Todos aminoácidos são ligados por ligações peptídicas.
2. Células J774A.1 (uma linhagem celular de macrófago) foram plaqueadas em todas as cavidades de uma placa cluster de 24 cavidades em uma densidade de semeadura de 5 χ 105células/ml/cavidade (Iml de meio de cultura RPMI 1640 por cavidade), e incubadas durante a noite a 37°C em ar / CO2 5%.
3. No dia seguinte, a solução da etapa 1 foi administrada a quinze cavidades contendo células em etapa 2, para dar três cavidades cada uma com uma concentração final de 50, 25, 12,5, 6,25 ou 3,125 ug/ml. As cavidades restantes foram deixadas não tratadas. A placa foi incubada por mais quatro horas a 37°C.
4. Lipopolissacarídeo (de E. coli cepa 0111 B4) foi adicionado nas cavidades recebendo a solução de octapeptídeo, também em três das cavidades que não receberam peptídeo. A concentração final de lipopolissacarídeo foi 0,625ug/ml.
5. A placa foi incubada durante a noite, e no dia seguinte os sobrenadantes foram ensaiados para TNF usando um kit de ELISA comercial.
Resultados obtidos, mostrados na tabela abaixo, demonstram que a atividade do oligopeptídeo cíclico em supressão de secreção de TNF estimulada por LPS está relacionada com a dose. Concentração de Peptídeo (ug/ml) Concentração de TNF (pg/ml) Desvio Padrão 0 1780,09 136,49 3,125 1494,53 127,83 6,25 1346,20 45,84 12,5 1037,31 90,01 25,0 621,75 14,53 50,0 613,70 15,46
Exemplo 2- o efeito de oligopeptídeos cíclicos com variados grupos funcionais associativos em supressão de secreção de TNF estimulada pelo fragmento de toxina B de cólera (CTB) em uma linhagem celular de macrófago.
1. Oligopeptídeos cíclicos foram preparados com as seguintes
estruturas:
ciclo(-DF-R-Xio-S-DF-R-E,o-S-)
CiCloC-DF-S-I1O-R-DF-S-X1O-R-) ciclo(-DF-R-Z4-S-DF-R-X4-S-)
ciclo(-DF-S-Z4-R-DF-S-I4-R-)
sendo que S, F e R representam os aminoácidos formadores de epítopo, Σ representa o grupo funcional associativo proveniente do aminoácido associativo, sendo que Σ10 representa um aminoácido associativo racêmico que é um ácido aminocarboxílico e o grupo funcional associativo é um resíduo de cadeia lateral consistindo de um -C1OH21 ramificado e Σ4 indica norleucina, sendo que o grupo funcional associativo é a cadeia lateral de quatro carbonos.
Estes oligopeptídeos cíclicos foram preparados como soluções em transcutol em uma concentração de 5 mg/ml, então diluídos para uma concentração de 1 mg/ml pela adição de água destilada.
2. Células J774A.1 (uma linhagem celular de macrófago) foram plaqueadas em todas as cavidades de uma placa cluster de 24 cavidades em uma densidade de semeadura de 3 χ 105células/ml/cavidade (Iml de meio
de cultura RPMI 1640 por cavidade), e incubadas durante a noite a 37°C em ar / CO2 5%. 3. No dia seguinte, as soluções de etapa 1 foram administradas a doze cavidades contendo células em etapa 2, para dar três cavidades cada uma com uma concentração final de 12,5 ug/ml. As cavidades restantes foram deixadas não tratadas. A placa foi incubada por mais quatro horas a 37°C.
4. Fragmento de toxina B de cólera (CTB) foi adicionado nas cavidades recebendo a solução de octapeptídeos, também em três das cavidades que não receberam peptídeo. A concentração de fragmento de toxina B de cólera (CTB) foi lOug/ml.
5. A placa foi incubada durante a noite, e no dia seguinte os sobrenadantes foram ensaiados para TNF usando um kit de ELISA comercial.
Resultados obtidos, mostrados na tabela abaixo, demonstram que a presença de cadeias laterais de hidrocarboneto de cadeia longa consistindo de um -CioH2I ramificado como o grupo funcional associativo causam atividade dos oligopeptídeos cíclicos em supressão de secreção de TNF estimulada pelo fragmento de toxina B de cólera (CTB). Oligopeptídeos cíclicos onde o grupo funcional associativo tem um comprimento de cadeia de apenas quatro carbonos não possuem qualquer atividade inibitória.
Peptídeo Concentração de Desvio Padrão TNF (pg/ml) Controle meio 67,5 6,7 ciclo(-DF-R-I10-S-DF-R- Σ,ο-S-) + CTB 268,5 17,9 ciclo(-DF-S- Σιο-R-DF-S- I10-R-) + CTB 85,7 13,6 ciclo(-DF-R-I4-S-DF-R-14 -S-) + CTB 664,4 57,1 ciclo(-DF-S-14 -R-DF-S- Z4 -R-) + CTB 621,1 25,3 CTB sozinho 690,8 58,6
Exemplo 3- o efeito de oligopeptídeos cíclicos com variados aminoácidos formadores de epítopo e configurações estereoquímicas dos aminoácidos associativos em supressão de secreção de TNF estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) em uma linhagem celular de macrófago.
1. Octapeptídeos cíclicos foram preparados com as seguintes
estruturas:
ciclo(-DF-S-IL-R-DF-S-XL-R-) cíc1o(-DF-S-Ll-R-DF-S-Id-R-) cíc1o(-DF-S-Id-R-DF-S-Id-R-) ciclo(-DF-R-ZL-S-DF-R-IL-S-) cíc1o(-DF-R-Il-S-DF-R-Id-S-) cíc1o(-DF-R-Ed-S-DF-R-Id-S-) sendo que F, S e R são os aminoácidos formadores de epítopo,
Zl representa um aminoácido associativo que é um ácido L-alfa-amino- carboxílico no qual o grupo funcional associativo é um resíduo de cadeia lateral consistindo de um -Ci0H2I não ramificado; Ld representa um aminoácido associativo que é um ácido D-alfa-amino-carboxílico no qual o grupo funcional associativo é um resíduo de cadeia lateral consistindo de um -Ci0H2I não ramificado. Estes oligopeptídeos cíclicos foram preparados como soluções em água destilada em uma concentração de 1 mg/ml.
2. Células J774-1 (uma linhagem celular de macrófago) foram plaqueadas em todas as cavidades de uma placa cluster de 24 cavidades em uma
densidade de semeadura de 3 χ 105células/ml/cavidade (Iml de meio de cultura RPMI 1640 por cavidade), e incubadas durante a noite a 37°C em ar / CO2 5%.
3. No dia seguinte, as soluções de etapa 1 foram administradas a dezoito cavidades contendo células em etapa 2, para dar três cavidades cada uma com uma concentração final de 50 ug/ml. As cavidades restantes foram
deixadas não tratadas. A placa foi incubada por mais quatro horas a 37°C.
4. Lipopolissacarídeo (de E. coli cepa 0111 B4) foi adicionado nas cavidades recebendo a solução de octapeptídeos, também em três das cavidades que não receberam peptídeo. A concentração de lipopolissacarídeo foi l,25ug/ml.
5. A placa foi incubada durante a noite, e no dia seguinte os sobrenadantes foram ensaiados para TNF usando um kit de ELISA comercial.
Resultados obtidos, mostrados na tabela abaixo, demonstram que oligopeptídeos cíclicos contendo aminoácidos na ordem R-DF-S têm atividade alta em supressão de secreção de TNF estimulada por LPS , e que é exigida a presença de pelo menos um aminoácido associativo que é ácido L-alfa- amino-carboxílico com um grupo funcional associativo que é um resíduo de cadeia lateral consistindo de um -CioH2I não ramificado, o outro aminoácido associativo sendo o mesmo ácido aminocarboxílico em qualquer forma L ou D.
Peptídeo Concentração TNF (pg/ml) de Desvio Padrão LPS sozinho 1861,9 108,7 cíc1o(-DF-S-Zl-R-DF-S-Il-R-) + LPS 865,4 68,1 ciclo(-DF-S-IL-R-DF-S-ED-R-) + LPS 987,1 16,1 cíc1o(-DF-S-Id-R-DF-S-Ed-R-) + LPS 1438,0 32,6 ciclo(-DF-R-IL-S-DF-R-EL-S-) + LPS 1990,4 n/a cíc1o(-DF-R-Il-S-DF-R-Id-S-) + LPS 1625,2 59,6 cíc1o(-DF-R-Id-S-DF-R-Id-S-) + LPS 1573,3 45,0
Ligação de ciclo-dextrina nos oligopeptídeos cíclicos desta invenção ajuda a reduzir o nível de interações entre as partes hidrofóbicas de oligopeptídeos diferentes, e assim previne a formação de agregados grandes, cuja atividade pode ser reduzida comparado com monômeros ou oligômeros por causa do impedimento estérico de epítopos nestes agregados grandes. Exemplo 4- efeito relacionado com dose de um oligopeptídeo cíclico internamente restringido formulado com hidróxi-propil-beta-ciclo-dextrina, e contendo epítopos formados dos aminoácidos formadores de epítopo R-DF-S, em supressão de secreção de TNF estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) em uma linhagem celular de macrófago sobre uma faixa ampla de concentrações de ciclo-dextrina.
1. Um octapeptídeo cíclico com a estrutura ciclo(-DF-S-X-R- DF-S-Z-R-) foi preparado como uma solução em transcutol em uma concentração de 5 mg/ml, onde Σ representa o aminoácido associativo como um ácido L-alfa-amino-carboxílico e o grupo funcional associativo proveniente do aminoácido associativo como um resíduo de cadeia lateral consistindo de uma cadeia alifática linear contendo dez átomos de carbono.
2. Seis alíquotas separadas de 200ul da solução em etapa 1 foram transferidas para frascos frescos de 8 ml e misturadas com agitação baixa com 800ul de uma solução de hidróxi-propil-beta-ciclo-dextrina em uma concentração de 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 ou 1,5625 mg/ml em água destilada 2. Células J774A.1 (uma linhagem celular de macrófago) foram plaqueadas em todas as cavidades de uma placa cluster de 24 cavidades em uma densidade de semeadura de 5 χ 105células/ml/cavidade (lml de meio de cultura RPMI 1640 por cavidade), e incubadas durante a noite a 37°C em ar / C02 5%.
3. No dia seguinte, cada uma das soluções de etapa 1 foram
administradas em volumes apropriados às cavidades contendo células em etapa 2, para dar três cavidades cada uma com uma concentração final de 8, 4, ou 2 ug/ml. As cavidades restantes foram deixadas não tratadas. A placa foi incubada por mais quatro horas a 37°C. 4. Lipopolissacarídeo (de E. coli cepa 0111 B4) foi adicionado
nas cavidades recebendo a solução de octapeptídeo, também em três das cavidades que não receberam peptídeo. A concentração final de lipopolissacarídeo foi 0,625ug/ml.
5. A placa foi incubada durante a noite, e no dia seguinte os sobrenadantes foram ensaiados para TNF usando um kit de ELISA comercial.
Resultados obtidos, mostrados na tabela abaixo, demonstram que a atividade do octapeptídeo em supressão de secreção de TNF estimulada
por LPS estava relacionada com dose.
Concentração de Razão em peso de Concentração de Desvio Padrão Peptídeo (ug/ml) ciclo-dextrina para peptídeo TNF (pg/ml) 0 - 2519,3 64,4 2 40 2450,2 61,2 2 20 2223,9 37,4 2 10 2278,3 89,4 2 5 2177,2 110,9 2 2,5 2314,2 101,8 2 1,25 2161,8 94,7 4 40 1646,5 98,4 4 20 1488,1 16,6 4 10 1474,8 80,6 4 5 1477,5 33,2 4 2,5 1538,7 80,4 4 1,25 1599,9 106,4 8 40 1276,9 106,5 8 20 1298,4 17,3 8 10 1218,7 20,6 8 5 1140,6 34,5 8 2,5 1105,7 35,9 8 1,25 1130,9 71,8 Os resultados demonstram que a formulação de octapeptídeo com ciclo-dextrina dá uma inibição significativa de secreção de TNF para baixo de uma concentração de 2ug/ml em cavidade de cultura de tecido, e que esta inibição é alcançada sobre uma faixa ampla de concentrações de ciclo- dextrina variando de 40:1 p:p para baixo.
Exemplo 5 - efeito de um oligopeptídeo cíclico internamente restringido formulado com hidróxi-propil-beta-ciclo-dextrina, e contendo epítopos formados dos aminoácidos formadores de epítopo R-DF-S, em supressão de secreção de TNF estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) em ratos.
1. Um octapeptídeo cíclico com a estrutura ciclo(-DF-S-E-R-
DF-S-Z-R-), onde Σ representa o aminoácido associativo como um ácido L- alfa-amino-carboxílico e o grupo funcional associativo proveniente do aminoácido associativo como um resíduo de cadeia lateral consistindo de uma cadeia alifática linear contendo dez átomos de carbono, foi preparado como
uma solução em transcutol e hidróxi-propil-beta-ciclo-dextrina como descrito em exemplo 4, onde a concentração de peptídeo foi 1 mg/ml, e a concentração final de ciclo-dextrina foi 40 mg/ml.
2. Ratos pesando 250g foram injetados i.p. com Iml de solução de peptídeo (lmg de peptídeo por rato). Um segundo grupo de ratos
recebeu 1 ml de veículo de transcutol/ciclo-dextrina não contendo peptídeo. Uma hora mais tarde, os ratos foram adicionalmente injetados com 1 mg de lipopolissacarídeo (de Salmonella abortus equi).
3. 150 minutos mais tarde, amostras de sangue foram tiradas, e níveis de TNF foram medidos em dois grupos por ELISA. Os resultados mostrados
na tabela abaixo demonstram que o peptídeo é capaz de inibir produção de TNF
pelas células em resposta a um estímulo, dando uma redução maior do que 75%.
Veículo Peptídeo TNF (pg/ml) 10717 2370
SD 6635 1831
Número de animais por grupo 3 5 Exemplo 6 - supressão de secreção de TNF por um análogo cíclico de Copaxone (Glatiramer acetato).
1. Dois oligopeptídeos cíclicos foram preparados com as seguintes estruturas:
ciclo(-A-K-Z-Y-E-K-Α-Σ-Ε-Υ-)
ciclo(-A-K-I-E-Y-K-A-E-Y-E-)
Todos aminoácidos estão na forma L a não ser se indicado de
outro modo.
Todos aminoácidos são ligados por ligações peptídicas. A, Κ, Y e E representam os aminoácidos formadores de
epítopo e Σ representa o grupo funcional associativo proveniente do aminoácido associativo sendo que o aminoácido associativo é um ácido L- alfa-amino-carboxílico e o grupo funcional associativo é um resíduo de cadeia lateral consistindo de uma cadeia alifática linear contendo dez átomos de carbono.
Os oligopeptídeos cíclicos foram preparados como soluções em hexafluoro-isopropanol (HFIP) em uma concentração de 10 mg/ml, então misturados em volumes iguais de solução de HFIP contendo beta-hidróxi- propil-ciclo-dextrina em uma concentração de 50 mg/ml. As soluções orgânicas foram secas sob nitrogênio, e o complexo de peptídeo / ciclo- dextrina foi redissolvido em água destilada para dar uma concentração final de oligopeptídeo cíclico de 1 mg/ml.
2. Células J774A.1 (uma linhagem celular de macrófago) foram plaqueadas em todas as cavidade de uma placa cluster de 24 cavidades
em uma densidade de semeadura de 3 χ 105células/ml/cavidade (lml de meio de cultura RPMI 1640 por cavidade), e incubadas durante a noite a 37°C em ar / C02 5%.
3. No dia seguinte, as soluções de etapa 1 foram administradas às cavidades contendo células em etapa 2, para dar três cavidades cada uma com uma concentração final de 12,5 ug/ml de peptídeo. Cavidades adicionais contendo ciclo-dextrina sozinha a 62,5ug/ml também foram preparadas. As cavidades restantes foram deixadas não tratadas. A placa foi incubada por mais quatro horas a 37°C.
4. Lipopolissacarídeo (de E. coli cepa 0111 B4) foi adicionado
nas cavidades recebendo a solução de oligopeptídeo cíclico, também em três das cavidades que não receberam peptídeo. A concentração final de lipopolissacarídeo foi 0,lug/ml.
5. A placa foi incubada durante a noite, e no dia seguinte os
sobrenadantes foram ensaiados para TNF usando um kit de ELISA comercial.
Peptídeo (12,5ug/ml)_LPS Concentração de TNF (pg/ml) Desvio Padrão
ciclo(-A-K-Z-Y-E-K-A-Z-E-Y) + 486,9 33,5
ciclo(-A-K-I-E-Y-K-A-I-Y-E) + 928,8 72,7
Ciclo-dextrina sozinha + 622,3 22,9
Meio+ LPS + 637,6 26,0
Controle de meio - 50,8 9,0
Resultados obtidos, mostrados em tabela, demonstram que um, mas não ambos, dos oligopeptídeos cíclicos testados têm um efeito em supressão de secreção de TNF estimulada por LPS. Conseqüentemente, a seqüência dos aminoácidos em cada domínio tem um efeito sobre a atividade biológica do oligopeptídeo. Ciclo(-A-K-X-Y-E-K-Α-Σ-Ε-Υ) será útil no tratamento de Esclerose Múltipla, porque compreende os mesmos aminoácidos (exceto em uma configuração não-aleatória) que os de Copaxone e exibe o mesmo efeito sobre a secreção de TNF por macrófagos. Exemplo 7-Inibição de atividade enzimática de trombina 1. Oligopeptídeos cíclicos das seguintes estruturas foram
sintetizados como previamente descrito, e preparados em forma complexada com ciclo-dextrina na concentração de 1 mg/ml em Soluções Salina Equilibrada de Hank usando o procedimento esboçado em exemplo 6. (i) ciclo(-R-E-E-S-R-E-R-Z-S-E-) (ii) ciclo(-A-K-L-E-Y-K-A-I-Y-E-)
(iii) ciclo(-dF-R-C-S-dF-R-C-S-) (iv) ciclo(-dF-S-C-R-dF-S-C-R-)
Todos aminoácidos estão na forma L a não ser se indicado de
outro modo.
Todos aminoácidos são ligados por ligações peptídicas.
Sendo que R, E, S, Y, K e A representam os aminoácidos formadores de epítopo, Σ representa o grupo funcional associativo proveniente do aminoácido associativo sendo que o aminoácido associativo é um ácido L-alfa-amino-carboxílico e o grupo funcional associativo é um resíduo de cadeia lateral consistindo de uma cadeia alifática linear contendo dez átomos de carbono e C representa cisteína, sendo que as cisteínas em cada anel estão oxidadas para formarem uma ponte interna.
2. Em cavidades de uma microplaca de 394 cavidades, 20ul de solução de trombina (0,01 mg/ml) foram dispensados, misturados com 60ul de solução de oligopeptídeo cíclico
3. 20ul de substrato cloridrato de boc-beta-benzil-Asp-Pro- Arg-7-amido-4-metil-cumarina (0,01 mg/ml) foram adicionados em cada cavidade, e o curso de tempo de geração de substrato foi medido.
4. Dos resultados mostrados na tabela abaixo pode ser visto que os oligopeptídeos cíclicos estudados têm efeitos diferenciais em inibição de atividade proteolítica de trombina, e que estas atividades diferenciais estão relacionadas com a natureza e a combinação dos aminoácidos incluídos no anel. Está claro que, com a escolha correta de aminoácidos, podem ser criadas estruturas baseadas no modelo de oligopeptídeo cíclico restringido que são suficientemente rígidas para exercerem efeitos significativos sobre a atividade de enzimas.
Conseqüentemente, oligopeptídeos cíclicos de acordo com a presente invenção que têm um efeito inibitório de atividade proteolítica de trombina podem ser usados para tratar doenças nas quais a atividade de protease é um fator exacerbante, incluindo doença cardiovascular, distúrbios de circulação e HIV. Inibição da atividade proteolítica de trombina (Unidades de Fluorescência- Unidades Arbitrárias)
Tempo (minuto) Controle (i) (") (iii) (iv) (enzima sozinha) 2,0 770,9 410,8 410,8 634,5 523,2 5,0 1821,1 816,4 816,4 1368,8 1205,3 10,0 2163,5 1189,4 1189,4 1786,9 1586,9 15,0 2253,2 1398,6 1398,6 1980,7 1751,7 20,0 2345,8 1592,1 1592,1 2107,4 1843,1 25,0 2359,0 1673,2 1673,2 2159,7 1864,8
Pode ser visto da tabela que alguns dos oligopeptídeos cíclicos tiveram atividade maior do que os outros dependendo da ordem de aminoácidos em cada domínio.
Exemplo 8 - supressão de secreção de TNF pelos oligopeptídeos cíclicos contendo dois epítopos diferentes.
1. Dois oligopeptídeos cíclicos foram preparados com as seguintes estruturas:
(i) ciclo(-dF-S-X-Q-dL-S-X-R-) e
(ii) ciclo(-dF-S-X-L-dQ-S-X-R)
Todos aminoácidos estão na forma L a não ser se indicado de
outro modo.
Todos aminoácidos são ligados por ligações peptídicas. Sendo que Q, L, S, R e F representam os aminoácidos formadores de epítopo e Σ representa o grupo funcional associativo proveniente do aminoácido associativo sendo que o aminoácido associativo é um ácido L-alfa-amino-carboxílico e o grupo funcional associativo é um resíduo de cadeia lateral consistindo de uma cadeia alifática linear contendo dez átomos de carbono. Estes oligopeptídeos cíclicos foram preparados como soluções
em transcutol/ciclo-dextrina, como descrito em exemplo 4, para dar uma concentração final de peptídeo de 1 mg/ml, e ciclo-dextrina a 20 mg/ml.
2. Células J774A.1 (uma linhagem celular de macrófago) foram plaqueadas em todas as cavidades de três placas cluster de 24 cavidades em uma densidade de semeadura de 3 χ 105células/ml/cavidade (lml de meio de cultura RPMI 1640 por cavidade), e incubadas durante a noite a 37°C em ar /CO2 5%.
3. No dia seguinte, as soluções de etapa 1 foram administradas às cavidades contendo células em etapa 2, para dar três cavidades cada uma com uma concentração final de 50, 25, 12,5, 6,25 ou 3,125 ug/ml de oligopeptídeo cíclico. Cavidades adicionais contendo ciclo-dextrina a 1, 0,5, 0,25, 0,125 e 0,0625 mg/ml também foram preparadas. As cavidades restantes foram deixadas não tratadas. A placa foi incubada por mais quatro horas a 37°C.
4. Lipopolissacarídeo (de E. coli cepa 0111 B4) foi adicionado nas cavidades recebendo a solução de octapeptídeo, também em três das cavidades que não receberam peptídeo. A concentração final de lipopolissacarídeo foi 0,lug/ml.
5. A placa foi incubada durante a noite, e no dia seguinte os sobrenadantes foram ensaiados para TNF usando um kit de ELISA comercial.
Resultados obtidos, mostrados na tabela abaixo, demonstram que oligopeptídeos cíclicos contendo dois epítopos não-idênticos, dos quais um é compreendido de aminoácidos F ,R e S, são capazes de infra-regular a
secreção de TNF de células J774 em uma maneira dependente de dose.
Concentração de TNF (pg/ml)
Cone. de
Peptídeo Controle
(ug/ml) Meio (i) (ü) Ciclo-dextrina 0 27+3 2856* 2856* 2856* 3,125 2856* 2648 ±43 2856* 6,25 2460 ± 83 2325 ±67 2856* 12,5 1595 ±64 1748 ±20 2856* 1341 ±50 1437 ±85 2376 ±21 50 843 ± 42 1081 ±142 2225 ± 51
* Leituras mais altas do que o limite máximo detectável.
Claims (49)
1. Oligopeptídeo cíclico internamente restringido, caracterizado pelo fato de que compreende um anel de pelo menos seis aminoácidos para especificamente se ligar a um ligante alvo, em que o anel compreende uma pluralidade de domínios de aminoácido, cada domínio compreendendo pelo menos dois aminoácidos formadores de epítopo, e duas ou mais grupos funcionais associativos posicionados de modo que formem uma ou mais associações intra-cíclicas; por meio das quais o oligopeptídeo cíclico é restringido em uma conformação única de maneira que os aminoácidos formadores de epítopo formem um epítopo em cada domínio, cada epítopo sendo capaz de especificamente se ligar a um ligante alvo.
2. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada domínio compreende três aminoácidos formadores de epítopo e os três aminoácidos formadores de epítopo têm configurações estereoquímicas alternadas.
3. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos são aminoácidos que ocorrem naturalmente, análogos de aminoácido ou suas formas-D.
4. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais associações intra- cíclicas entre os grupos funcionais associativos são covalentes.
5. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os grupos funcionais associativos são proporcionados por cisteínas unidas por uma ponte de dissulfeto.
6. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais associações intra-cíclicas entre os grupos funcionais associativos são não-covalentes.
7. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais associações intra-cíclicas entre os grupos funcionais associativos são hidrofóbicas.
8. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos um grupo funcional associativo está posicionado entre os domínios.
9. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que cada aminoácido formador de epítopo adjacente a um grupo funcional associativo tem a mesma configuração estereoquímica que a do grupo funcional associativo adjacente.
10. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que os epítopos são iguais.
11. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que os grupos funcionais associativos são provenientes de aminoácidos associativos.
12. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizado pelo fato de que os aminoácidos associativos são aminoácidos lipídicos.
13. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos grupos funcionais associativos provenientes de aminoácidos lipídicos é uma cadeia lateral de hidrocarboneto linear C8-C2O-
14. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a cadeia lateral de hidrocarboneto linear é uma cadeia lateral de hidrocarboneto linear Ci0-Ci6.
15. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de ter a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 44</formula> sendo que A, Β, C, X, Y e Z representam os aminoácidos formadores de epítopo; AeX representam D-aminoácidos e B, C, Y e Z representam L-aminoácidos ou A e X representam L-aminoácidos e B, C, Y e Z representam D-aminoácidos; um epítopo é formado do domínio C-A-B e um epítopo é formado do domínio Z-X-Y; e cada Σ representa um aminoácido associando.
16. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y e/ou o domínio C-A-B é selecionado das seqüências de aminoácidos RFS, RSF, FSR, FRS, SRF, SFR, QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS ou LSQ e cada Σ é um aminoácido lipídico com um grupo funcional associativo de cadeia lateral de hidrocarboneto linear compreendendo uma cadeia de hidrocarboneto entre 8 e 20 átomos de carbono em comprimento.
17. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y e/ou o domínio C-A-B formam um epítopo capaz de suprimir secreção de TNF.
18. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que os grupos funcionais associativos são provenientes dos átomos de nitrogênio de ligações peptídicas dentro do oligopeptídeo cíclico.
19. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ter a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 45</formula> sendo que Α, Β, C, Χ, Y e Z representam os aminoácidos formadores de epítopo; um epítopo é formado do domínio C-A-B e um epítopo é formado do domínio Z-X-Y; cada N representa o nitrogênio de ligações peptídicas entre B-Z e C-Y e cada Φ representa um grupo funcional associativo ligado via o nitrogênio.
20. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y e/ou o domínio C-A-B é selecionado das seqüências de aminoácidos RFS, RSF, FSR, FRS, SRF, SFR, QLS, QSL, SQL, SLQ, LQS ou LSQ e cada Φ representa uma cadeia de hidrocarboneto alifático entre 8 e 20 átomos de carbono em comprimento.
21. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y é RFS.
22. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y e o domínio C-A-B formam, cada um, um epítopo capaz de suprimir secreção de TNF.
23. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que fenilalanina é de configuração D, serina é de configuração L, arginina é de configuração L e cada aminoácido lipídico é de configuração L.
24. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17 ou 19 a 23, caracterizado pelo fato de que o domínio C-A-B é igual ao domínio Z-X-Y.
25. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo cíclico compreende dois domínios e um epítopo é formado dos três aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio.
26. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo compreende dois grupos funcionais associativos.
27. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou 18, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo cíclico compreende três domínios e um epítopo é formado dos três aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio.
28. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo compreende três grupos funcionais associativos.
29. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 14 ou 18, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo compreende dois domínios e um epítopo é formado de quatro aminoácidos formadores de epítopo em cada domínio.
30. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de ter a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 46</formula> sendo que A, B, C, D, W, X, Y e Z representam os aminoácidos formadores de epítopo; um epítopo é formado do domínio D-C- A-B e um epítopo é formado do domínio Z-X-Y-W; e cada Σ representa um aminoácido associando.
31. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y-W e/ou o domínio D-C-A-B é selecionado das seqüências de aminoácidos YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, YKEA, EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EAYK, KAYE, KAEY, KYAE, KYEA, KEAY, KEYA, AKEY, AKYE, AYEK, AYKE, AEYK ou AEKY e cada Σ é um aminoácido lipídico com um grupo funcional associativo de cadeia lateral de hidrocarboneto linear compreendendo uma cadeia de hidrocarboneto entre 8 e 20 átomos de carbono em comprimento.
32. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y-W é YEKA e o domínio D- C-A-B é EYAK.
33. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 31 ou reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y-W e/ou o domínio D-C-A-B formam um epítopo capaz de inibir atividade proteolítica.
34. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de ter a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 47</formula> sendo que A, B, C, D, W, X, Y e Z representam os aminoácidos formadores de epítopo; um epítopo é formado do domínio D-C- A-B e um epítopo é formado do domínio Z-X-Y-W; cada N representa o nitrogênio de ligações peptídicas entre B-Z e C-Y e cada Φ representa um grupo funcional associativo ligado via o nitrogênio.
35. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y-W e/ou o domínio D-C-A-B é selecionado das seqüências de aminoácidos YEKA, YEAK, YAKE, YAEK, YKAE, YKEA, EYKA, EYAK, EKAY, EKYA, EAKY, EAYK, KAYE, KAEY, KYAE, KYEA, KEAY, KEYA, AKEY, AKYE, AYEK, AYKE, AEYK ou AEKY e cada Φ representa uma cadeia de hidrocarboneto alifático entre 8 e 20 átomos de carbono em comprimento.
36. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y-W é YEKA e o domínio D- C-A-B é EYAK.
37. Oligopeptídeo cíclico de acordo com a reivindicação 35 ou reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio Z-X-Y-W e o domínio D-C-A-B formam, cada um, um epítopo capaz de inibir atividade proteolítica.
38. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 37, caracterizado pelo fato de que o domínio D-C-A-B é igual ao domínio Z-X-Y-W.
39. Oligopeptídeo cíclico de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento, um agente profilático ou um agente diagnóstico.
40. Uso de oligopeptídeo cíclico como definido na reivindicação 17 ou reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratar uma doença na qual TNF é um fator exacerbante.
41. Uso de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que dita doença é selecionada de câncer, obesidade, distúrbios cardíacos, doença autoimune e doenças inflamatórias.
42. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que dita doença é uma doença autoimune selecionada de artrite reumatóide, Esclerose Múltipla e doença de Crohn.
43. Uso de oligopeptídeo cíclico como definido na reivindicação 33 ou reivindicação 37, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratar uma doença na qual a atividade de protease é um fator exacerbante.
44. Uso de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que dita doença é selecionada de doença cardiovascular, distúrbios de circulação e HIV.
45. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender oligopeptídeo cíclico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 38 e um adjuvante e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
46. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o excipiente é selecionado de transcutol, copolímeros em bloco de poloxâmero, ciclodextrinas, tensoativos não-iônicos ou sais biliares.
47. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45 ou reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que os tensoativos não- iônicos são selecionados de acil-ésteres de poli(etileno-glicol) ou éteres alifáticos de poli(etileno-glicol).
48. Método para produzir um oligopeptídeo cíclico para especificamente se ligar a um ligante alvo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de compreender: i) prover os aminoácidos formadores de epítopo; ii) produzir um oligopeptídeo cíclico incorporando os aminoácidos formadores de epítopo.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a etapa de prover os aminoácidos formadores de epítopo compreende (a) selecionar um conjunto de conjugados, cada conjugado compreendendo um grupo cabeça e um grupo cauda, com um arranjo de grupos cabeça, sendo que cada grupo cabeça compreende um aminoácido; (b) formar uma associação não-covalente dos mesmos, na qual os grupos cauda agregam-se hidrofobicamente e na qual os conjugados são móveis; (c) ensaiar a interação suficiente entre a associação não- covalente e o ligante alvo; (d) opcionalmente repetir as etapas (a) a (c) usando um conjunto de conjugados com um arranjo modificado de grupos cabeça; e (e) ao descobrir interação suficiente em etapa (c) selecionar os aminoácidos dos grupos cabeça do conjunto de conjugados como os aminoácidos formadores de epítopo em etapa (a).
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