BRPI0717125A2 - Derivado de ftalazinona - Google Patents

Description

“DERIVADO DE FTALAZINONA” A presente invenção se refere a uma forma cristalina e métodos melhorados de sín- tese de um derivado de ftalazinona particular, intermediários na síntese e composições far- macêuticas e usos da forma cristalina.

A enzima mamífera PARP (uma proteína de multidomínio de 113-kDa) foi envolvida

na sinalização de dano ao DNA através de sua capacidade de reconhecer e rapidamente ligar-se às quebras dos filamentos de DNA (D'Amours, e outro, Biochem. J., 342, 249-268 (1999)).

Várias observações conduziram à conclusão que PARP participa em uma varieda- de de funções relacionadas ao DNA incluindo amplificação de gene, divisão celular, diferen- ciação, apoptose, reparo por excisão de DNA e da mesma forma efeitos sobre comprimento de telômero e estabilidade de cromossomo (d'Adda di Fagagna, e outro, Nature Gen., 23(1), 76-80(1999)).

Estudos sobre o mecanismo pelo qual PARP modula reparo ao DNA e outros pro- 15 cessos têm identificado sua importância na formação de cadeias de poli (ADP-ribose) dentro do núcleo celular (Althaus, F.R. e Richter, C., ADP-RibosyIation of Proteins: Enzimology and Biological Significance, Springer-Verlag, Berlin (1987)). A PARP ativada, ligada por DNA utiliza NAD para sintetizar poli (ADP-ribose) em uma variedade de proteínas alvo nucleares, incluindo topoisomerase, histonas e a própria PARP (Rhun, e outro, Biochem. Biophys. Res. 20 Commun., 245, 1-10 (1998)).

Poli (ADP-ribosil)ação tem sido da mesma forma associada com a transformação maligna. Por exemplo, atividade de PARP é mais alta nos núcleos isolados de fibroblastos transformados por SV40, enquanto tanto as células leucêmicas quanto as células de câncer de cólon mostram atividade de enzima mais alta que os leucócitos normais equivalentes e 25 mucosa de cólon (Miwa, e outro, Arco. Biochem. Biophys., 181, 313-321 (1977); Burzio, e outro, Proc. Soc. Exp. Bioi Med., 149, 933-938 (1975); e Hirai, e outro, Cancer Res., 43, 3441-3446 (1983)).

Vários inibidores de baixo peso molecular de PARP foram utilizados para elucidar o papel funcional de poli (PAD-ribosil)ação no reparo ao DNA. Em células tratadas com agen- tes de alquilação, a inibição de PARP leva a um aumento marcado na quebra de filamento de DNA e morte celular (Durkacz, e outro, Nature, 283, 593-596 (1980); Berger, N.A., Radia- tion Research, 101,4-14(1985)).

Subseqüentemente, tais inibidores foram mostrados para realçar os efeitos de res- posta à radiação suprimindo-se o reparo de dano potencialmente letal (Ben-Hur, e outro, British Journal of Cancer, 49 (Supl. VI), 34-42 (1984); Sclicker1 e outro, Int. J. Radiat. Biol., 75, 91-100 (1999)). Inibidores de PARP foram relatados ser eficazes na radiossensibilização de células de tumor hipóxicas (US 5.032.617; US 5.215.738 e US 5.041.653). Além disso, animais de nocaute de PARP (PARP -/-) exibem instabilidade genômica com respeito aos agentes de alquilação e γ-irradiação (Wang, e outro, Genes Dev., 9, 509- 520 (1995); Menissierde Murcia, e outro, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 94, 7303-7307 (1997)).

Um papel para PARP foi da mesma forma demonstrado em certas doenças vascu- 5 lares, choque séptico, lesão isquêmica e neurotoxicidade (Cantoni, e outro, Biochim. Bio- phys. Acta, 1014, 1-7 (1989); Szabo, e outro, J. Clin. Invista., 100, 723-735 (1997)). Dano ao DNA de radical oxigênio que leva às quebras do filamento em DNA, que são reconhecidas subseqüentemente por PARP, é um fator contribuinte principal para tais estados de doença como mostrado por estudos de inibidor de PARP (Cosi, e outro, J. Neurosci. Res., 39, 38-46 10 (1994); Said, e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 93, 4688-4692 (1996)). Mais recente- mente, PARP foi demonstrada desempenhar um papel na patogênese de choque hemorrá- gico (Liaudet, e outro, Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A., 97(3), 10203-10208 (2000)).

Foi da mesma forma demonstrado que infecção retroviral eficiente de células mamí- feras é bloqueada pela inibição da atividade de PARP. Tal inibição de infecções de vetor retrovirais recombinantes foi mostrada ocorrer em vários tipos celulares diferentes (Gaken, e outro, J. Virology, 70(6), 3992-4000 (1996)). Inibidores de PARP foram da mesma forma desenvolvidos para o uso em terapias antivirais e no tratamento de câncer (WO 91/18591).

Além disso, a inibição de PARP foi especulada para demorar o início de caracterís- ticas de envelhecimento em fibroblastos humanos (Rattan e Clark, Biochem. Biophys. Res. Comm., 201(2), 665-672 (1994)). Isto pode ser relacionado ao papel que PARP desempe- nha no controle da função de telômero (d'Adda di Fagagna, e outro, Nature Gen., 23(1), 76- 80 (1999)).

WO 2004/080976 descreve vários derivados de ftalazinona, sua atividade na inibi- ção de PARP, e seu uso conseqüencial no tratamento do câncer, seja como um auxiliar para radioterapia ou quimioterapia, ou como um agente independente.

WO 2005/053662 descreve o uso de inibidores de PARP, em particular derivados de ftalazinona, como inibidores de reparo por excisão de base (BER). O uso destes inibido- res na fabricação de medicamentos para o tratamento de cânceres que são deficientes na atividade de reparo ao DSB de DNA dependente de Recombinação Homóloga (HR), em particular para cânceres que têm um fenótipo deficiente de BRCA1 e/ou BRCA2, é descrito.

4-[3-(4-Ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H-ftalazin-1- ona (composto A) descrito em WO 2004/080976: O

A

O

é de interesse particular.

Em WO 2004/080976, composto A foi sintetizado como um de vários compostos de biblioteca de 4-[4-fluoro-3-(piperazina-1-carbonil)-benzil]-2H-ftalazin-1-ona (B composto):

diisopropiletil amina). Esta reação é realizada com agitação em temperatura ambiente du- rante 16 horas, e o composto resultante sendo purificado através de HPLC preparativa.

O derivado de piperazina (B) foi preparado através da desproteção de terc-butil és- ter de ácido 4-[2-fluoro-5-(4-oxo-3,4-diidro-ftalazin-1 -ilmetil)-benzoil]-piperazina-1 -carboxílico (composto C):

pelo uso de 6M de HCI e etanol durante 1 hora, seguido através da basificação com amônio em pH 9, e extração em diclorometano.

O derivado de piperazina Boc-protegido (C) foi preparado a partir de ácido 2-fluoro-

5-(4-oxo-3,4-diidro-ftalazin-1-ilmetil)-benzóico (composto D):

o

B

pela adição de cloreto de ciclopropanocarbonila:

O

5

a uma solução de (B) em diclorometano, seguiu pela base de Hünig (N,N-

o

c

o pela adição de terc-butil éster de ácido piperazina-1-carboxílico:

hO

O

Hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU) e Ν,Ν,-diisopropiletilamina em dimetilacetamida, seguido agitando-se durante 18 horas.

Formas particulares de composto A pode ter propriedades vantajosas, por exemplo 5 com respeito à sua solubilidade e/ou sua estabilidade e/ou sua biodisponibilidade e/ou seu perfil de impureza e/ou suas características de filtração e/ou suas características de seca- gem e/ou sua falta higroscopicidade, e/ou eles podem ser mais fáceis de manusear e/ou micronizar e/ou formar-se em comprimidos. É da mesma forma desejado ter um método melhorado de síntese que é adequado para síntese de composto A em uma escala de multi- _ 10 grama.

Adequadamente, um primeiro aspecto da presente invenção fornece 4-[3-(4- ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H-ftalazin-1-ona (composto A) substancialmente em forma cristalina, e em particular em Forma A.

"Substancialmente em forma cristalina" quando aqui utilizado, significa que pelo 15 menos 50% em peso de composto A são em forma cristalina, preferivelmente pelo menos 70% em peso, 80% ou 90% em peso. Em algumas modalidades, pelo menos 95% em peso, 99% em peso ou ainda 99,5% ou mais em peso podem ser em forma cristalina.

Composto A como Forma cristalina A tem um padrão de difração de Raios X (λ =1,5418Â) contendo picos específicos em:

Pico 20° (±0,1°) 1 12,0 2 17,8 3 21,1 4 22,3 29,2 20 Composto A como Forma cristalina A pode da mesma forma ter os seguintes picos

adicionais para um padrão de difração de Raios X (λ = 1.5418Â): Pico 20° (±0,1°) 6 10,5 7 14,0 8 21,7 9 24,3 26,1 Composto A como Forma cristalina A também pode ser caracterizado por qualquer combinação de três ou mais picos selecionados a partir da lista de 10 picos acima.

Um padrão de XRD de pó representativo de composto A como Forma A é mostrado na Figura 3.

Sem desejar estar ligado através de teoria, composto A pode formar facilmente uma

estrutura na qual moléculas de solventes podem ocupar posições dentro da treliça de cristal. Tais solvatos, não necessariamente estequiométricos na natureza, podem consistir em um solvato puro (por exemplo, Composto A metanolato, e Composto A Tetraidrofuranato) ou potencialmente pode consistir em mais de um componente de solvent (por exemlo, metanol

- 10 e di-etil éter). As moléculas de solventes tipicamente ficam dentro de bolsas criadas pelas moléculas de Composto A. Em certas circunstâncias, o volume destas bolsas é suficiente- mente flexível para incorporar uma faixa de solventes, resultando em pequena mudança na estrutura global do material, e conseqüentemente apenas trocas pequenas nas reflexões de XRPD.

15 Solvatos, incluindo aqueles que compartilham a mesma estrutura global, surgem da

maturação da solução e experiências de cristalização de diclorometano, acetato de etila, metanol, etanol, isopropanol, 2-butanona, t-butil metil éter, tolueno, tetraidrofurano, água, cicloexano, ciclopropil metil cetona, 1,2 dicloroetano, trifluoroacetato de etila, fluorobenzeno- exafluoro-iso-propanol, metil nonafluorobutil éter, 2-metil-1-propanol, nitrometano, propioni- 20 trila, tricloroetileno, σσσ-trifluorotolueno, heptano, dioxano, acetonitrilo, ou como solventes puros ou quando combinados com outro solvente. O padrão de difração de Raios X da es- trutura de solvato mais comum é mostrado na Figura 4, e tipicamente contém picos mais intensos em posições listadas abaixo:

Pico 20° (±0,1°) (λ=1,5418Á) 1 7,0-7,5 2 10,1-10,6 3 15,1-15,6 4 18,5-19,0 21,0-21,5 6 24,8-25,3 7 27,0-27,5 Será entendido que as intensidades relativas de picos mostrados nas figuras po- dem variar de acordo com a orientação da amostra sob teste e do tipo e colocação do ins- trumento utilizado de forma que as intensidades nos traços de XRD incluídos aqui sejam ilustrativas e não destinadas a ser utilizadas para comparação absoluta.

Forma A de composto A é substancialmente livre do solvente. O termo "substanci-

almente livre de solvente" quando aqui utilizado refere-se à forma que tem apenas quantida- des insignificantes de qualquer solvente, por exemplo, uma forma com um total de 0,5% em peso ou menos de qualquer solvente. A quantidade total de qualquer solvente, incluindo água, pode ser 0,25%, 0,1%, 0,05% ou 0,025% em peso ou menos.

Forma A do composto A pode da mesma forma ser caracterizada utilizando DSC.

Forma A do composto A quando aquecida de 25°C a 325°C a 10°C por minuto começará a derreter a 210,10C ±1°C. Um traço de DSC representativo para o composto A como Forma A é mostrado na Figura 5.

O segundo aspecto da presente invenção fornece um método de obter 4-[3-(4- ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H-ftalazin-1-ona (composto A) como Forma cristalina A que compreende cristalizar o composto A em um solvente e em seguida deslocar o solvente da forma cristalina com um agente deslocador. O agente deslo- cador pode ser água ou uma mistura de um C1^ álcool e água.

Em uma primeira modalidade, este método compreende as etapas de:

(i) cristalizar 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H-

ftalazin-1-ona (composto A) a partir de um solvente;

(ii) se o solvente original não for etanol, tratar o composto cristalino A com etanol;

(iii) tratar o composto cristalino A com água para remover etanol capturado;

(iv) secar o produto resultante.

O solvente utilizado na cristalização original pode ser, por exemplo, diclorometano

ou acetonitrilo.

Os métodos para obter Forma A geralmente podem envolver a substituição do sol- vente. Foi constatado que o composto A cristaliza-se de uma tal maneira que canais na treli- ça de cristal são formados os quais podem capturar solventes, desse modo tornando-os difíceis de remover.

O método da primeira modalidade pode ser utilizado em particular se o solvente uti- lizado na cristalização de composto A for diclorometano. A etapa de trocar o diclorometano como um solvente com etanol como um solvente pode ser realizada através da destilação da solução do composto A em pressão atmosférica na presença de etanol. A troca está completa quando a temperatura de entrada chega ao ponto de ebulição de etanol, por e- xemplo, pelo menos 73°C. Em particular, a troca pode ser realizada através da destilação da maioria do DCM1 em seguida adicionando-se um volume de etanol. A destilação é em se- guida continuada, com bateladas de substituição de destilado com volumes iguais de etanol.

A cristalização do composto A a partir do solvente de etanol pode ser realizada a- través do resfriamento da solução abaixo de 15°C, preferivelmente menor que 10°C, e mais preferivelmente em cerca de 8°C. Os cristais de composto A podem em seguida ser removi- dos a partir da solução através de filtração.

O composto cristalino A pode ser tratado com água para remover etanol capturado pelo material cristalino suspenso em água e aquecimento em refluxo durante um tempo sufi- ciente, por exemplo, pelo menos três horas, e preferivelmente durante cerca de cerca de quatro horas. O composto cristalino A pode ser removido a partir de suspensão em água através de filtração.

A secagem do produto resultante da etapa anterior é facilmente alcançada. Por e- xemplo, o aquecimento do produto em um forno em uma temperatura de pelo menos 60°C, preferivelmente em cerca de 70°C.

Em outra tal modalidade, o método compreende as etapas de:

(i) obter o composto A como forma cristalina que contém solvente;

(ii) se o solvente original utilizado na síntese de composto A na forma cristalina não for uma mistura de água e um C1^ álcool (isto é, metanol, etanol), tratar o composto A na

forma cristalina com uma mistura de água e um Ci_2 álcool;

(ii) secar o produto resultante.

O produto resultante pode ser também tratado com uma mistura de água e um C^2 álcool, e secado para também isolar o composto A em uma Forma cristalina A.

A mistura de água e Ci_2 álcool está preferivelmente na faixa de 2:1 a 1:2 em volu- me, e mais preferivelmente 1,5:1 a 1:1,5 em volume. Uma mistura particularmente preferida é 1 parte de água para 1,2 parte de Ci_2 álcool. Outra mistura particularmente preferida é 2 partes de água para 1 parte de C1^2 álcool. O C^2 álcool é preferivelmente etanol.

Composto A como Forma cristalina pode ser obtido por cristalização do composto A a partir de um solvente, como descrito acima.

O tratamento de solvente na etapa (ii) pode ser realizado através da suspensão do

composto A na mistura de água e C^2 álcool e aquecimento até o refluxo com agitação. Isto pode ser seguido através do resfriamento entre 55 e 65°C e filtragem, por exemplo, através da almofada de celite. A almofada de filtro pode ser lavada com uma mistura de água e Ci_2 álcool antes de ser destilada em pressão ambiente (normalmente 1 atm), ou acima. A desti- 35 lação pode ser interrompida para produzir uma suspensão que é deixada em temperatura ambiente antes da filtração subseqüente. A massa filtrante resultante pode ser lavada com água. A secagem do produto resultante da etapa anterior é facilmente alcançada. Por e- xemplo, através do aquecimento do produto em um forno em uma temperatura de pelo me- nos 50°C, preferivelmente em cerca de 60°C.

O outro tratamento pode proceder de uma maneira similar àquela descrita acima.

Em uma terceira modalidade, o método compreende:

(i) suspender o composto A em uma mistura de água e um Ci_2 álcool como o sol- vente:

(ii) aquecer a suspensão até o refluxo;

(iii) resfriar a solução e semear com composto A como Forma A;

(iv) secar o produto resultante.

O produto resultante pode ser também tratado com uma mistura de água e um C-i_2 álcool, e secado para também isolar o composto A em uma Forma cristalina A.

A mistura de água e C1^ álcool está preferivelmente na faixa de 2:1 a 1:5 em volu- me, e mais preferivelmente 1:2 a 1:4 em volume. Uma mistura particularmente preferida é 1 parte de água para 3 partes de C^2 álcool. O C^2 álcool é preferivelmente etanol.

Etapa (iii) pode compreender o resfriamento da solução entre 65 e 75°C (por exem- plo, 70°C) e filtragem, por exemplo, através de uma almofada de celite. A almofada de filtro pode ser lavada com uma mistura de água e C^2 álcool antes de ser destilada (por exemplo, em pressão ambiente, ou acima). A semeadura pode ocorrer depois que o filtrado resultante 20 foi resfriado entre 40 e 50°C (por exemplo 45°C). A suspensão resultante pode ser resfriada em temperatura ambiente (por exemplo 20°C) entre 2 e 3 horas (por exemplo, 2,5 horas) e mantida na referida temperatura durante tempo suficiente para estabelecer a cristalização. Isto pode estar entre 12 e 24 horas, e pode ser durante cerca de 16 horas. Ao término deste período, mais água pode ser adicionada. A quantidade pode ser quase igual ao volume de 25 solvente total (água e C^2 álcool) presente e pode ser adicionada lentamente, por exemplo durante um período de 4 a 6 (por exemplo 5) horas. A suspensão pode ser mantida em tem- peratura ambiente depois da adição de água, por exemplo durante 2 horas.

A suspensão pode em seguida ser filtrada, e a massa filtrante resultante pode ser lavada com uma mistura de C1^ álcool e água (em uma relação dentre 1:3 e 1:2, por exem- pio 1:2,3).

A secagem do produto resultante da etapa anterior é facilmente alcançada. Por e- xemplo, através do aquecimento do produto em um forno sob vácuo em uma temperatura dentre 40 e 60°C.

Um terceiro aspecto da presente invenção fornece um método de sintetizar o com- posto A do composto B compreendendo a etapa de:

(i) adicionar uma solução pré-misturada de tríetilamina e cloreto de ciclopropano carbonila, em um solvente orgânico apropriado (por exemplo, DCM (diclorometano)) de uma maneira controlada, ao composto B no mesmo solvente orgânico com a temperatura da so- lução sendo controlada para estar abaixo de 20°C.

Em algumas modalidades, o método também compreende a etapa de:

(ii) agitar (por exemplo, misturar) a solução resultante de (i) até que a reação seja concluída, embora mantendo a temperatura da solução abaixo de 20°C.

A adição na etapa (i) pode ocorrer de uma maneira gota a gota.

Este método é mais controlado que aquele descrito em WO 2004/080976, resultan- do em uma adição regiosseletiva do cloreto ácido. O método menos controlado da arte ante- rior pode levar à adição do cloreto ácido no nitrogênio de ftalazinona e ou oxigênio, bem como no nitrogênio de piperidina desejado.

É preferido que o método anterior seja realizado sob uma atmosfera de nitrogênio.

É também preferido que a temperatura da solução no estágio (ii) seja mantida entre e 15°C.

O produto da reação anterior é preferivelmente preparado por pelo menos uma eta- pa de lavagem com água. Mais preferivelmente, a preparação contém uma etapa de lava- gem com água inicial e final, e etapas de lavagem intermediárias utilizando um ácido diluído, por exemplo, solução de ácido cítrico a 5%, seguido por uma base diluída, por exemplo, solução de carbonato de sódio a 5%.

Um quarto aspecto da presente invenção fornece um método de sintetizar compos- to A do composto D compreendendo reagir o composto D com 1- (ciclopropilcarbonil)piperazina, ou um sal de ácido mineral deste, na presença de um agente de acoplamento de amida e uma base, por exemplo, uma amina (por exemplo, uma amina terciária, tal como diisopropiletilamina).

O sal de ácido mineral pode ser, por exemplo, o sal de cloridrato.

A adição de 1-(ciclopropilcarbonil)piperazina, ou um sal de ácido mineral deste, ao composto D pode ser realizada em qualquer solvente adequado, por exemplo, acetonitrilo. O agente de acoplamento de amida é preferivelmente hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol- 1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU). É preferivelmente adicionado à solução de 1- (ciclopropilcarbonil)piperazina, ou seu sal de ácido mineral, diisopropiletilamina e composto D durante um certo tempo, por exemplo 30 minutos. A temperatura da solução resultante pode ser mantida a 25°C ou abaixo (20°C ou abaixo de, por exemplo a 18°C). Depois de sua adição, a solução resultante pode ser deixada repousar durante um período de tempo. Um regime de temperatura preferido está mantendo a solução em temperatura ambiente durante 2 horas.

O composto resultante A pode ser removido a partir da solução através do resfria- mento abaixo de 10°C (ou abaixo de 5°C, por exemplo, 3°C) durante um período de tempo (por exemplo 1 hora), seguido através de filtração. O composto resultante A pode ser lava- do, por exemplo, com acetonitrilo frio.

Em WO 2004/080976, a seguinte rotina para o composto D é descrita:

E D

Dimetil fosfito foi adicionado gota a gota a uma solução de metóxido de sódio em metanol a 0°C. 2-Carboxibenzaldeído (H) foi em seguida adicionado porção a porção à mis- 5 tura reacional como uma lama em metanol, com a temperatura mantida abaixo de 5°C. A solução amarela clara resultante foi aquecida a 20°C durante 1 hora. Ácido metanossulfôni- co foi adicionado à reação gota a gota e a suspensão branca resultante foi evaporada em vácuo. O resíduo branco foi extinguido com água e extraído em clorofórmio. Os extratos orgânicos combinados foram lavados com água, secados em MgSO4, e evaporados em vá- 10 cuo para produzir dimetil éster de ácido (3-oxo-1,3-diidro-isobenzofuran-1-il)fosfônico (G) como um sólido branco (rendimento: 95%). Isto foi em seguida utilizado sem outra purifica- ção no próximo estágio.

Em uma mistura de dimetil éster de ácido (3-oxo-1,3-diidro-isobenzofuran-1- il)fosfônico (G) em tetraidrofurano e 2-fluoro-5-formilbenzonitrilo (F) em tetraidrofurano foi 15 adicionado trietilamina gota a gota durante 25 min, com a temperatura mantida abaixo de 15°C. A mistura reacional foi aquecida lentamente a 20°C durante 1 hora e concentrada em vácuo. O resíduo branco foi suspenso em água ou 30 minutos, filtrado, lavado com água, hexanoeéter, e secado para produzir 2-fluoro-5-(3-oxo-3H-isobenzofuran-1- ilidenometil)benzonitrilo (E) como uma mistura de 50:50 de isômeros EeZ (rendimento: 20 96%).

Em uma suspensãode 2-fluoro-5-(3-oxo-3H-isobenzofuran-1-ilídenometil) benzoni- trilo (E) em água foi adicionado solução de hidróxido de sódio aquosa e a mistura reacional foi aquecida sob nitrogênio a 90°C durante 30 minutos. A mistura reacional foi resfriada par- cialmente a 70°C, e hidrato de hidrazina foi adicionado e agitado durante 18 horas a 70°C. A 25 reação foi resfriada em temperatura ambiente e acidificada com 2M de HCI em pH 4. A mis- tura foi agitada durante 10 minutos e filtrada. O sólido resultante foi lavado com água, hexa- no, éter, acetato de etila e secado para produzir o composto D como um pó rosa claro (ren- dimento: 77%). É da mesma forma desejado ter um método melhorado da síntese do composto D.

Portanto, um quinto aspecto da presente invenção fornece um composto de sinteti- zação de método D, compreendendo a etapa de:

(a) sintetizar (3-oxo-1,3-diidro-2-benzofuran-1-il)fosfonato de dieltila (G) a partir de 2-carboxibenzaldeído (H);

(b) sintetizar 2-fluoro-5-[(E/Z)-(3-oxo-2-benzofuran-1 (3H)-ilideno)metil]benzonitrilo (E) a partir de (3-oxo-1,3-diidro-2-benzofuran-1-il)fosfonato de dietila.

É preferido que o composto G’ não seja isolado na síntese. Este método evita o uso do sal sódico de dimetilfosfito que é instável (Pelchowicz, e outro, J.Chem.Soc, 4348-4350 10 (1961)) em solução alcoólica. É preferido que a etapa (a) ocorra em 2-metiltetraidrofurano em que o sal sódico de dietil fosfito é estável. Este sal pode ser formado in situ através da adição de dietil fosfito a uma solução resfriada de t-amilato de sódio em 2- metiltetraidrofurano. A reação com o sal sódico de dietil fosfito pode ser seguida através da reação com ácido metanossulfônico.

Etapa (b) pode ser realizada em 2-metiltetraidrofurano, com a adição de trietilamina.

O método de sintetizar o composto D pode também compreender a etapa de:

(c) sintetizar 2-fluoro-5-[(4-oxo-3,4-diidroftalazin-1-il)metil]benzonitrilo (ED):

ED

do composto E através da reação com hidrato de hidrazina; e

(d) sintetizar o composto D do composto ED através da reação com hidróxido de

sódio.

Etapa (c) pode ser alcançada através da utilização entre 1,1 e 1,3 equivalente de hidrato de hidrazina em tetraidrofurano seguido através da neutralização do hidrato de hi- drazina em excesso utilizando ácido acético.

Um sexto aspecto da presente invenção fornece o composto ED:

ED

e seu uso na síntese do composto D.

Um aspecto adicional da invenção fornece um sal de ácido mineral de 1- (ciclopropilcarbonil)piperazina, e um método de síntese deste através da reação de pipera- zina com ácido acético, seguido através da adição de cloreto de ciclopropanocarbonila.

Um sétimo aspecto da presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um composto do primeiro aspecto e um diluente ou portador farmaceuti- camente aceitável.

Um oitavo aspecto da presente invenção fornece um composto do primeiro aspecto para uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal.

Um nono aspecto da presente invenção fornece o uso de um composto como defi- nido no primeiro aspecto da invenção na preparação de um medicamento para inibir a ativi- dadedePARP.

Outros aspectos da invenção fornecem o uso de um composto como definido no primeiro aspecto da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de: do- ença vascular; choque séptico; lesão isquêmica; neurotoxicidade; choque hemorrágico; in- fecção viral; ou doenças melhoradas pela inibição da atividade de PARP.

Outro aspecto adicional da invenção fornece o uso de um composto como definido

no primeiro aspecto da invenção na preparação de um medicamento para uso como um auxiliar na terapia de câncer ou para potencializar células de tumor para o tratamento com radiação por ionização ou agentes quimioterapêuticos.

Outros aspectos adicionais da invenção fornecem o tratamento de doença melho- 20 rado pela inibição de PARP, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como definido no pri- meiro aspecto, preferivelmente na forma de uma composição farmacêutica e o tratamento de câncer, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como definido no primeiro aspecto em 25 combinação, preferivelmente na forma de uma composição farmacêutica, simultaneamente ou consecutivamente com radiação por ionização ou agentes quimioterapêuticos.

Em aspectos adicionais da presente invenção, os compostos podem ser utilizados na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer que é deficiente na ativida- de de reparo de DSM de DNA dependente de Recombinação Homóloga (HR), ou no trata- 30 mento de um paciente de um câncer que é deficiente na atividade de reparo de DSM de DNA dependente de HR, compreendendo administrar ao referido paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto.

A série de reação de reparo de DSB de DNA dependente de HR repara as quebras de filamento duplo (DSBs) em DNA por mecanismos homólogos para reformar uma hélice de DNA contínua (K.K. Khanna e S.P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)). Os componentes da série de reação de reparo de DSB de DNA dependente de HR incluem, porém não são limitados a, ATM (NM_000051), RAD51 (NM_002875), RAD51L1 (NM_002877), RAD51C (ΝΜ_002876), RAD51L3 (ΝΜ_002878), DMC1 (ΝΜ_007068), XRCC2 (ΝΜ_005431), XRCC3 (ΝΜ_005432), RAD52 (ΝΜ_002879), RAD54L (ΝΜ_003579), RAD54B (ΝΜ_012415), BRCA1 (ΝΜ_007295), BRCA2 (ΝΜ_000059), RAD50 (ΝΜ_005732), MRE11A (ΝΜ_005590) e NBS1 (ΝΜ_002485). Outras proteínas en- 5 volveram na série de reação de reparo de DSB de DNA dependente de HR incluem fatores reguladores tal como EMSY (Hughes-Davies, e outro, Cell, 115, pp523-535). Componentes de HR são descritos em Wood, e outro, Science, 291, 1284-1289 (2001).

Um câncer que é deficiente em reparo de DSB de DNA dependente de HR pode compreender ou consistir em uma ou mais células cancerígenas que têm uma capacidade reduzida ou ab-rogada para reparar DSBs de DNA através deste caminho, relativo às célu- las normais isto é, a atividade da série de reação de reparo de DSB de DNA dependente de HR pode ser reduzida ou abolida em uma ou mais células cancerígenas.

A atividade de um ou mais componentes da série de reação de reparo de DSB de DNA dependente de HR pode ser abolida em uma ou mais células cancerígenas de um indi- 15 víduo tendo um câncer que é deficiente no reparo de DSB de DNA dependente de HR. Componentes da série de reação de reparo de DSB de DNA dependente de HR são bem caracterizados na técnica (veja por exemplo, Wood, e outro, Science, 291, 1284-1289 (2001)) e incluem os componentes listados acima.

Em algumas modalidades preferidas, as células cancerígenas podem ter um fenóti- 20 po deficiente de BRCA1 e/ou um BRCA2, isto é, atividade de BRCA1 e/ou BRCA2 é reduzi- da ou abolida nas células cancerígenas. Células cancerígenas com este fenótipo podem ser deficientes em BRCA1 e/ou BRCA2, isto é, expressão e/ou atividade de BRCA1 e/ou BRCA2 pode(m) ser reduzida(s) ou ser abolida(s) nas células cancerígenas, por exemplo por meio de mutação ou polimorfismo no ácido nucléico codificador, ou por meio de amplifi- 25 cação, mutação ou polimorfismo em um gene que codifica um fator regulador, por exemplo o gene de EMSY que codifica um fator regulador de BRCA2 (Hughes-Davies, e outro, Cell, 115, 523-535).

BRCA1 e BRCA2 são supressores de tumor conhecidos cujos alelos tipo selvagem estão freqüentemente perdidos em tumores de portadores heterozigotos (Jasin M., Oncoge- 30 ne, 21(58), 8981-93 (2002); Tutt, e outro, Trends Mol Med., 8(12), 571-6, (2002)). A associa- ção de mutações de BRCA1 e/ou BRCA2 com câncer de mama é bem caracterizada na arte (Radice, P.J., Exp Clin Cancer Res., 21(3 Supl), 9-12 (2002)). Amplificação do gene de EMSY, que codifica um fator Iigador de BRCA2, é da mesma forma conhecida por estar as- sociada com câncer de mama e ovariano.

Portadores de mutações em BRCA1 e/ou BRCA2 estão da mesma forma em risco

elevado de câncer de ovário, próstata e pâncreas.

Em algumas modalidades preferidas, o indivíduo é heterozigoto para uma ou mais variações, tais como mutações e polimorfismos, em BRCA1 e/ou BRCA2 ou um regulador destes. A detecção da variação em BRCA1 e BRCA2 é bem conhecida na arte e é descrita, por exemplo em EP 699 754, EP 705 903, Neuhausen, S.L. e Ostrander, E.A., Genet. Test,

1, 75-83 (1992); Chappnis, P.O. e Foulkes, W.D., Cancer Treat Res, 107, 29-59 (2002); Ja- natova M., e outro, Neoplasma, 50(4), 246-50 (2003); Jancarkova, N., Ceska Gynekol., 68(1), 11-6 (2003)). A determinação da amplificação do fator de ligação de BRCA2 EMSY q é descrita em Hughes-Davies, e outro, Cell, 115, 523-535).

Mutações e polimorfismos associados com câncer podem ser detectados no nível de ácido nucléico detectando-se a presença de uma seqüência de ácido nucléico variante ou no nível de proteína detectando-se a presença de um polipeptídeo variante (isto é, um mutante ou variante alélica).

Breve Descrição das Figuras

Fig. 1 mostra a NMR do composto A depois do tratamento com água (exemplo 1);

Fig. 2 mostra o padrão de XRD de pó do composto A como Forma A depois do tra- tamento com água (exemplo 1);

Fig. 3 mostra um padrão de XRD de pó representativo do composto A como Forma

A;

Fig. 4 mostra um padrão de XRD de pó representativo do composto A como Forma solvatada;

Fig. 5 mostra um traço de DSC representativo do composto A como Forma A obtida

através do aquecimento de 25°C a 325°C a 10°C por minuto.

Uso

A presente invenção fornece composto A como Forma A como um composto ativo, especificamente, ativo na inibição da atividade de PARP.

O termo "ativo" quando aqui utilizado, pertence ao composto que é capaz de inibir a

atividade de PARP. Um ensaio que pode ser utilizado convenientemente para avaliar a inibi- ção de PARP oferecida pelo composto é descrito nos exemplos abaixo.

A presente invenção também fornece um método de inibir a atividade de PARP em uma célula, compreendendo contatar a referida célula com uma quantidade eficaz do com- posto ativo, preferivelmente na forma de uma composição farmaceuticamente aceitável. Um tal método pode ser praticado in vitro ou in vivo.

Por exemplo, uma amostra de células pode ser desenvolvida in vitro e o composto ativo trazido em contato com as referidas células, e o efeito do composto sobre estas células observado. Como exemplos do "efeito", a quantidade de reparo ao DNA realizada em um 35 certo tempo pode ser determinada. Onde o composto ativo é constatado mostrar uma influ- ência sobre as células, isto pode ser utilizado como um marcador prognóstico ou diagnóstico da eficácia do composto em métodos de tratar um paciente que transporta células do mes- mo tipo celular. O termo "tratamento", quando aqui utilizado no contexto de tratar uma condição, ge- ralmente pertence ao tratamento e terapia, seja de um humano ou um animal (por exemplo, em aplicações veterinárias), em que algum efeito terapêutico desejado seja obtido, por e- xemplo, a inibição do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa do progresso, uma pausa na taxa do progresso, melhora da condição, e cura da condição. O tratamento como uma medida profilática (isto é, profilaxia) é da mesma forma incluído.

O termo "auxiliar" quando aqui utilizado se refere ao uso do composto ativo junto com meios terapêuticos conhecidos. Tais meios incluem regimes citotóxicos de fármacos e/ou radiação por ionização quando utilizados no tratamento de tipos de câncer diferentes. Em particular, os compostos ativos são conhecidos para potencializar as ações de vários tratamentos de quimioterapia de câncer, que incluem a classe de topoisomerase de venenos (por exemplo topotecana, irinotecana, rubitecana), a maior parte dos agentes de alquilação conhecidos (por exemplo, DTIC, temozolamida) e fármacos com base em platina (por e- xemplo, carboplatina, cisplatina) utilizados no tratamento de câncer.

O composto ativo pode da mesma forma ser utilizado como aditivos de cultura celu- lar para inibir PARP, por exemplo para sensibilizar células em agentes quimioterapêuticos conhecidos ou tratamentos de radiação por ionização in vitro.

O composto ativo pode da mesma forma ser utilizado como parte de um ensaio in vitro, por exemplo para determinar se um hospedeiro candidato é provável de se beneficiar do tratamento com o composto em questão.

Administração

O composto ativo ou composição farmacêutica que compreende o composto ativo pode ser administrado a um indivíduo por qualquer rotina conveniente de administração, seja sistemicamente/perifericamente ou no local de ação desejado, incluindo porém não limitada a, oral (por exemplo, através de ingestão); tópica (incluindo, por exemplo, transdér- mica, intranasal, ocular, bucal, e sublingual); pulmonar (por exemplo, através de inalação ou terapia de insuflação utilizando-se, por exemplo, um aerossol, por exemplo, através da boca ou nariz); retal; vaginal; parenteral, por exemplo, através de injeção, incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intratecal, intraespinhal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticu- lar, subaracnóide, e intraesternal; através de implante de um depósito, por exemplo, subcu- taneamente ou intramuscularmente.

O indivíduo pode ser um eucarioto, um animal, um animal vertebrado, um mamífe- ro, um roedor (por exemplo, uma cobaia, um hamster, um rato, um camundongo), murino (por exemplo, um camundongo), canino (por exemplo, um cachorro), felino (por exemplo, um gato), eqüino (por exemplo, um cavalo), um primata, símio (por exemplo, um macaco ou primata), um macaco (por exemplo, sagüi, babuíno), um primata (por exemplo, gorila, chim- panzé, orangotango, gibão), ou um humano.

Formulações

Enquanto for possível para o composto ativo ser administrado sozinho, é preferível 5 apresentá-lo como uma composição farmacêutica (por exemplo, formulação) compreenden- do o composto ativo, como definido acima, junto com um ou mais portadores farmaceutica- mente aceitáveis, adjuvantes, excipientes, diluentes, cargas, tampões, estabilizadores, pre- servativos, lubrificantes, ou outros materiais bem conhecidos por aqueles versados na arte e opcionalmente outros agentes terapêuticos ou profiláticos.

Desse modo, a presente invenção também fornece composições farmacêuticas,

como definido acima, e métodos de preparar uma composição farmacêutica que compreen- de misturar o composto ativo, como definido acima, junto com um ou mais portadores far- maceuticamente aceitáveis, excipientes, tampões, adjuvantes, estabilizadores, ou outros materiais, como descrito aqui, tal que o composto ativo permanece como Forma cristalina A. O termo "farmaceuticamente aceitável" quando aqui utilizado pertence a compos-

tos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que estão, dentro do escopo do diag- nóstico médico seguro, adequado para uso em contato com os tecidos de um indivíduo (por exemplo, humano) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação benefício/risco razoável. Cada portador, 20 excipiente, etc. deve da mesma forma ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação.

Portadores adequados, diluente, excipientes, etc. podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrões. Veja, por exemplo, "Handbook of Pharmaceutical Additives”, 2a Edi- ção (eds. M. Ash e I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), "Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 20a edição, pub. Lippíncott, Williams & Wil- kins, 2000; e "Handbook of Phrmaceutical Excipients", 2a edição, 1994.

As formulações podem ser apresentadas convenientemente em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na arte de farmá- cia. Tais métodos incluem a etapa de trazer em associação o composto ativo com o portador 30 que constitui um ou mais ingredientes adicionais. Em geral, as formulações são preparadas trazendo-se uniformemente e intimamente em associação o composto ativo com portadores líquidos ou portadores sólidos finamente divididos ou ambos, e em seguida moldando se necessário o produto.

Formulações podem ser na forma de suspensões, comprimidos, grânulos, pós, cápsulas, sinetes, pílulas ou pastas.

Formulações adequadas para administração oral (por exemplo, através de inges- tão) podem ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, selos ou com- primidos, cada qual contendo uma quantidade pré-determinada do composto ativo; como um pó ou grânulos; como uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma pasta.

Um comprimido pode ser feito por meios convencionais, por exemplo compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais adicionais. Comprimidos prensados podem ser preparados comprimindo-se em uma máquina adequada o composto ativo em uma for- ma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um ou mais aglutinantes (por exemplo, povidona, gelatina, acácia, sorbitol, tragacanto, hidroxipropilmetil celulose); cargas ou diluentes (por exemplo, lactose, celulose microcristalina, hidrogeno fos- fato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, silica); desintegran- tes (por exemplo, glicolato de amido de sódio, povidona reticulada, carboximetil celulose sódico reticulada); agentes tensoativos ou dispersão ou umectação (por exemplo, Iauril sul- fato sódico); e preservativos (por exemplo, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, ácido sórbico). Comprimidos moldados podem ser feitos moldando-se em uma máquina adequada uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou marcados e podem ser for- mulados para fornecer liberação lenta ou controlada do composto ativo neles utilizando, por exemplo, hidroxipropilmetil celulose em proporções variadas para fornecer o perfil de libera- ção desejado. Comprimidos podem ser opcionalmente fornecidos com um revestimento en- térico, para fornecer liberação em partes do intestino exceto do estômago.

Uma cápsula pode incluir o composto ativo na suspensão.

Formulações adequadas para administração tópica (por exemplo, transdérmica, in- tranasal, ocular, bucal, e sublingual) podem ser formuladas como uma pasta.

Formulações adequadas para administração tópica ao olho da mesma forma inclu- em colírios em que o composto ativo é suspenso em um portador adequado, especialmente um solvente aquoso para o composto ativo.

Formulações adequadas para administração nasal, em que o portador é um sólido, incluem um pó grosso que tem um tamanho de partícula, por exemplo, na faixa de cerca de a cerca de 500 mícrons que são administradas da maneira na qual inalação é tomada, isto é, através de inalação rápida pela passagem nasal de um recipiente do pó mantido pró- ximo ao nariz.

Formulações adequadas para administração através de inalação incluem aquelas apresentadas como um spray aerossol a partir de um pacote pressurizado, com o uso de um propulsor adequado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro- tetrafluoroetano, dióxido de carbono, ou outros gases adequados.

Dosagem

Será apreciado que dosagens apropriadas do composto ativo, e composições que compreendem o composto ativo, pode variar de paciente para paciente. A determinação da dosagem ideal geralmente envolverá o balanceamento do nível de benefício terapêutico contra qualquer risco ou efeitos colaterais danosos dos tratamentos da presente invenção. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo, porém não limitado à atividade do composto particular, a rotina de administração, o tempo de adminis- tração, a taxa de excreção do composto, a duração do tratamento, outros fármacos, com- postos, e/ou materiais utilizados em combinação, e a idade, sexo, peso, condição, saúde geral, e história médica anterior do paciente. A quantidade de composto e rotina de adminis- tração estará finalmente na discrição do médico, embora geralmente a dosagem seja para alcançar concentrações locais no local de ação que alcança o efeito desejado sem causar efeitos colaterais prejudiciais ou danosos significativos.

Administração in vivo pode ser realizada em uma dose, continuamente ou com in- termitência (por exemplo, em doses divididas em intervalos apropriados) através do curso de tratamento. Métodos de determinar os meios mais eficazes e dosagem de administração são bem conhecidos por aqueles de experiência na técnica e variarão com a formulação utilizada para terapia, o propósito da terapia, a célula alvo a ser tratada, e o indivíduo a ser tratado. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e padrão a ser selecionado pelo médico de tratamento.

Em geral, uma dose adequada do composto ativo está na faixa de cerca de 10mg a cerca de 600 mg por m2 do peso da área corporal do indivíduo por dia.

Exemplos

Exemplo 1: Síntese de composto A

o

Material de partida (D) foi sintetizado pelo método descrito em WO 2004/080976 Métodos

HPLC Preparativa Amostras foram purificadas com um sistema de purificação direcionado a massa de Waters utilizando uma bomba de LC Waters 600, coluna C18 Waters Xterra (5 μιτι 19 mm x 50 mm) e espectrômetro de massa Micromass ZQ1 operando em modo de ionização por eletrovaporização de íon positivo. Fases móveis A (0,1% de ácido fórmico em água) e B 5 (0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo) foram utilizadas em um gradiente; 5% de B para 100% durante 7 min, mantidos durante 3 min, em uma taxa de fluxo de 20 ml / min.

HPLC-MS analítica

HPLC analítico foi realizada com uma bomba Spectra System P4000 e coluna C18 Jones Genesis (4 pm, 50 mm x 4,6 mm). Fases móveis A (0,1% de ácido fórmico em água) 10 e B (acetonitrilo) foram utilizadas em um gradiente de 5% de B durante 1 min aumentando aumentando-se para 98% de B depois de 5 min, mantido durante 3 min em uma taxa de fluxo de 2 ml / min. Detecção estava por um detector TSP UV 6000LP em 254 nm de UV e faixa de 210-600 nm de PDA. O espectrômetro de Massa foi um Finnigan LCQ que opera em modo de eletrovaporização de íon positivo.

NMR

Espectros de 1H NMR foram registrados utilizando espectrômetro Bruker DPX 300 em 300 MHz. Desvios químicos foram relatados em partes por milhões (ppm) na escala δ relativa ao padrão interno de tetrametilsilano. A menos que declarado de outra maneira, to- das as amostras foram dissolvidas em DMSO-d6.

(a) terc-Butil éster de ácido 4-[2-fluoro-5-(4-oxo-3,4-diidro-ftalazin-1-ilmetil)-benzoil]-

piperazina-1-carboxílico (C)

Em uma solução agitada do material de partida D (850 g) em dimetilacetamida (DMA) (3561 ml) em temperatura ambiente sob nitrogênio foi adicionado HBTU (hexafluoro- fosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio) (1402 g) em uma porção. Base 25 de Hünig (iPr2NEt, 1096 ml) foi adicionada em seguida com a temperatura mantida entre 15 a 25°C seguido por uma solução de 1-Boc-piperazina (637 g) em DMA (1428 ml) com a temperatura mantida entre 15 a 25°C.

A solução foi agitada em temperatura ambiente durante 2 horas e testada quanto a conclusão (HPLC). Na conclusão, a solução foi adicionada em água vigorosamente agitada 30 (17085 ml) com a temperatura mantida entre 15 a 25°C e o sólido filtrado, lavando com água (2 x 7131 ml), hexano (2 x 7131 ml) e metil tert-butil éter (MTBE) (2 x 3561 ml). O sólido foi em seguida secado durante a noite e em seguida testado quanto ao teor de água e pureza química.

Esta reação foi em seguida repetida, veja tabela:

Batelada Rendimento Pureza Teor de água Rendimento cor¬ (g) (% da Área de (K.F.) rigido HPLC) 1 1571,3 86,80 24,3 1032,5 g (78%) 2 2781,6 85,00 40,3 1411,5 g (106%) a. Maior que 100% de rendimento atribuído à amostragem não representativa

(b) 4-[4-Fluoro-3-(piperazina-1-carbonil)-benzil]-2H-ftalazin-1-ona (B)

Em uma solução agitada de álcoois metilados industriais (IMS) (2200 ml) e HCI concentrado (4400 ml) foi adicionado composto C (2780,2 g) em porções em temperatura ambiente sob nitrogênio, a espumação foi controlada pela taxa de adição. A solução foi em seguida agitada a 15 a 25°C durante 30 minutos e testada quanto a conclusão (HPLC).

Na conclusão, a solução foi evaporada para remover qualquer IMS e o aquoso ex- traído com CH2CI2 (2 x 3500 ml) antes do pH ser ajustado para >8 utilizando amônia concen- trada. A suspensão resultante foi em seguida diluída com água (10000 ml) e extraída com 10 CH2CI2 (4 x 3500 ml), lavada com água (2 x 2000 ml), secada em MgSO4 (250g) e evapora- da. O produto cru foi em seguida suspenso em CH2CI2 (3500 ml) e adicionado em MTBE (5000 ml). A suspensão resultante foi filtrada e secada a 50°C durante a noite produzindo 611,0 g (58,5% de rendimento) de material com uma pureza de 94,12%

(c) 4-[3-(4-Ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H-ftalazin- 1-ona (A)

Em uma suspensão agitada de composto B (1290 g) em CH2CI2 (15480 ml) sob ni- trogênio foi adicionada uma solução pré-misturada de trietilamina (470 ml) e cloreto de ci- clopropano carbonila (306 ml) em CH2CI2 (1290 ml) gota a gota com a temperatura mantida abaixo de 20°C. A solução foi em seguida agitada a 10-15°C durante 15 minutos e testada 20 quanto a conclusão. A mistura reacional foi constatada conter apenas 1,18% de material de partida B e assim a reação foi julgada completa e a batelada foi em seguida preparada.

A mistura reacional foi lavada com água (7595 ml), 5% de solução de ácido cítrico (7595 ml), 5% de solução de carbonato de sódio (7595 ml) e água (7595 ml). A camada or- gânica foi em seguida secada em sulfato de magnésio (500g).

A camada de produto contendo CH2CI2 foi em seguida isolada, filtrada através de

Celite e carregada em um recipiente de 25I. CH2CI2 (8445 ml) foi em seguida destilado em pressão atmosférica e etanol (10000 ml) adicionado. A destilação foi em seguida continuada com cada 4000 ml de destilado que foi removido sendo substituído com etanol (4000 ml) até que a temperatura de entrada alcançasse 73,7°C. O volume de reação foi em seguida redu- 30 zido (para 7730 ml) tempo pelo qual a temperatura de entrada alcançou 78,9°C e a solução foi permitida resfriar durante a noite a 8°C. O sólido foi em seguida filtrado, lavado com eta- nol (1290 ml) e secado durante a noite a 70°C.

Rendimento = 1377,3 g (90%). Pureza de HPLC (99,34% [% da área]). Continha 4,93% de etanol e 0,45% de CH2CI2 por GC. 10

15

20

25

30

(d) Tratamento de Água do Composto A

Uma suspensão de composto A (1377,0 g), quando produzida pelo método de E- xemplo 1, em água (13770 ml) foi aquecida até o refluxo durante 4 horas, resfriada em tem- peratura ambiente e filtrada. O sólido foi lavado com água (2754 ml) e secado durante a noi- te a 70°C.

Rendimento = 1274,8 g (92,6%). Pureza de HPLC (99,49% [% da área]). Continha 0,01% de etanol e 0,01% de CH2CI2 por GC.

Espectro de 1H NMR de composto A (DMSO-d6) seguindo o tratamento de água é mostrado na Figura 1.

O padrão de XRD de pó do Composto A seguindo o tratamento de água é mostrado na Figura 2 que mostra que o composto é como a Forma A.

Exemplo 2: Síntese alternativa do Composto A utilizando l-(ciclopropilcarbonil) pi- perazina

HN

O

Métodos (da mesma forma para Exemplos 3 &4)

NMR

Espectros de 1H NMR foram registrados utilizando espectrômetro Bruker DPX 400 em 400 MHz. Desvios químicos foram relatados em partes por milhões (ppm) na escala δ relativo ao padrão interno de tetrametilsilano. A menos que declarado de outra maneira, to- das as amostras foram dissolvidas em DMSO-d6.

Espectros de massa

Espectros de massa foram registrados em um espectrômetro de massa de captura de íon Agilent XCT utilizando espectrometria de massa de tandem (MS/MS) para confirma- ção estrutural. O instrumento foi operado em um modo de eletrovaporização de íon positivo.

(a) 4-[3-(4-Ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H-ftalazin-

1-ona (Composto A)

Ácido 2-fluoro-5-[(4-oxo-3,4-diidroftalazin-1-il)metil]benzóico (D) (15,23g, 51,07 mmol) foi suspenso com agitação sob nitrogênio em acetonitrilo (96 ml). Diisopropiletilamina (19,6 ml, 112,3 mmol) foi adicionada seguido por 1-ciclopropilcarbonilpiperazina (l)(9,45g, 61,28 mmol) e acetonitrilo (1ml). A mistura reacional foi resfriada a 18°C. Hexafluorofosfato de O-Benzotriazol-1-il-tetrametilurônio (25,18g, 66,39 mmol) foi adicionado durante 30 minu- tos e a mistura reacional foi agitada durante 2 horas em temperatura ambiente. A mistura reacional foi resfriada a 3°C e mantida nesta temperatura durante 1 hora, antes de ser filtra- do. A massa filtrante foi lavada com acetonitrilo (20 ml) frio (3°C) antes de ser secada em vácuo em até 40°C para produzir o composto título como um sólido amarelo claro (20,21g).

Espectro de massa: MH+ 435

1H NMR (400MHz. DMSO-d6) ó: 0,70 (m, 4H), 1,88 (br s, 1H), 3,20 (br s, 2H), 3,56 (m, 6H), 4,31 (s, 2H), 7,17 (t, 1H), 7,34 (dd, 1H), 7,41 (m, 1H), 7,77 (dt, 1H), 7,83 (dt, 1H), 7,92 (d, 1H), 8,25 (dd, 1H), 12,53 (s, 1H).

Exemplo 3: Síntese Alternativa de Composto A utilizando sal de HCI de 1- (ciclopropilcarbonil) piperazina

o

(a) Sal de HCI de 1-(ciclopropilcarbonil)piperazina (I)

Ácido acético (700 ml) foi tratado com piperazina (50,00g, 0,581 mol) porção a porção durante 15 minutos com agitação sob nitrogênio. A mistura reacional foi aquecida a 40°C e man- tida nesta temperatura até que uma solução completa fosse obtida. Cloreto de ciclopropanocar- bonila 59,2 ml, 0,638mol) foi adicionado durante 15 minutos. A mistura reacional foi agitada du- 15 rante a noite em temperatura ambiente. A mistura reacional foi filtrada e o filtrado destilado sob pressão reduzida até que ~430ml de destilados fossem coletados. Tolueno (550 ml) foi carregado à mistura reacional e a destilação por pressão reduzida continuou até que um adicional de 400ml de destilados foram coletados. Uma carga adicional de tolueno (550 ml) foi adicionada e destila- ção por pressão reduzida continuou até que 350ml de destilados fossem coletados. A lama resul- 20 tante foi diluída com tolueno (200 ml) e agitada durante a noite. Mais tolueno (500ml) foi adicio- nado para mobilizar a lama. A lama foi filtrada, lavada com tolueno (100ml) e secada em vácuo a 40°C para produzir o composto título como um sólido quase branco (86,8g).

Espectro de massa: MH+ 155

1H NMR (400MHz. DoO) ó: 0,92 (m, 4H), 1,98 (m, 1H), 3,29 (m, 2H), 3,38 (m, 2H), 3,84 (m, 2H), 4,08 (m, 2H),

(b) Composto A

Ácido 2-fluoro-5-[(4-oxo-3,4-diidroftalazin-1-il)metil]benzóico (D)(0,95g, 3,19 mmol) foi suspenso com agitação sob nitrogênio em acetonitrilo (4 ml). Hexafluorofosfato de 2-(1H- benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU) (1,45g, 3,83 mmol) foi adicionado seguido por sal de HCI de 1-ciclopropilcarbonilpiperazina (Γ) (0,73g, 3,83 mmol). Diisopropiletilamina (1,39ml, 7,98 mmol) foi adicionada durante 3 minutos e a mistura reacional foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A mistura reacional foi resfriada a 5°C e mantida nesta temperatura du- rante 1 hora, antes de ser filtrada. A massa filtrante foi lavada com acetonitrilo (2 ml) frio (3°C) antes de ser secada em vácuo em até 40°C para produzir o composto título como um sólido a- marelo claro (0,93g).

(c) Recristalização do composto A a partir de metanol aquoso

Composto A (9,40g, 21,64 mmol) da etapa (b) foi suspenso em uma mistura de á- gua (100 ml) e metanol (120 ml). A suspensão foi aquecida até o refluxo com agitação. A solução nebulosa produzida foi em seguida resfriada a 60°C e filtrada através de uma almo- fada de harborlite. A almofada de filtro foi lavada com uma mistura de água (5 ml) e metanol 10 (5 ml). O filtrado foi destilado em pressão atmosférica até que 115 ml de destilado fossem coletados. A destilação foi, em seguida, interrompida e a suspensão produzida permitida resfriar em temperatura ambiente. A suspensão resultante foi agitada durante ~18 horas antes de ser filtrada. A massa filtrante foi lavada com água (20 ml), antes de ser secada em vácuo em até 60°C para produzir o composto título em Forma A como um sólido branco 15 (8,67 g).

Espectro de Massa: MH+ 435

1H NMR (400MHz. DMSO-d6) ó: 0,70 (m, 4H), 1,88 (br s, 1H), 3,20 (br s, 2H), 3,56 (m, 6H), 4,31 (s, 2H), 7,17 (t, 1H), 7,34 (dd, 1H), 7,41 (m, 1H), 7,77 (dt, 1H), 7,83 (dt, 1H),

7.92 (d, 1H), 8,25 (dd, 1H), 12,53 (s, 1H).

(d) Recristalização do composto A a partir de etanol aquoso

Composto A (9,40g, 21,64 mmol) da etapa (b) foi suspenso em uma mistura de á- gua (100 ml) e etanol (50 ml). A suspensão foi aquecida até o refluxo com agitação. A solu- ção nebulosa produzida foi em seguida resfriada a 60°C e filtrada através de uma almofada de harborlite. A almofada de filtro foi lavada com uma mistura de água (5 ml) e etanol (5 ml). 25 O filtrado foi destilado em pressão atmosférica até que 53 ml de destilado fossem coletados. A destilação foi em seguida interrompida e a suspensão produzida permitida resfriar em temperatura ambiente. A suspensão resultante foi agitada durante -18 horas antes de ser filtrada. A massa filtrante foi lavada com água (20 ml), antes de ser secada em vácuo a 60°C para produzir o composto título em Forma A como um sólido branco (8,74 g).

Espectro de massa: MH+ 435

1H NMR (400MHz. PMSO-d6) ó: 0,70 (m, 4H), 1,88 (br s, 1H), 3,20 (br s, 2H), 3,56 (m, 6H), 4,31 (s, 2H), 7,17 (t, 1H), 7,34 (dd, 1H), 7,41 (m, 1H), 7,77 (dt, 1H), 7,83 (dt, 1H),

7.92 (d, 1H), 8,25 (dd, 1H), 12,53 (s, 1H).

Exemplo 4: Síntese Alternativa do Composto D E ED D (a) 2-Fluoro-5-[(E/Z)-(3-oxo-2-benzofuran-1(3H)-ilideno)metil]benzonitrilo (E)

T-amilato de sódio (99,00 g, 0,854 mol) e 2-metiltetraidrofurano (960 ml) foi resfria- do a 2°C sob uma atmosfera de nitrogênio. Dietil fosfito (110 ml, 0,855 mol) foi adicionado gota a gota mantendo a temperatura a < 5°C. 2-Metiltetraidrofurano (40 ml) foi adicionado

como lavagem de linha. A reação foi agitada a 2°C durante 1 hora e 40 minutos. Uma solu- ção de 2-carboxibenzaldeído (H)(80 g, 0,533 mol) em 2-metiltetraidrofurano (200 ml) foi adi- cionada, mantendo a temperatura a < 7°C ao longo da adição. Uma lavagem de linha de 2- metiltetraidrofurano (40 ml) foi adicionada. A mistura reacional foi aquecida a 20°C e susten- tada a 20°C durante 20 minutos. Ácido metanossulfônico (66 ml, 1,01 mol) foi adicionado 10 durante 1 hora e 10 minutos, seguido por 2-metiltetraidrofurano (40 ml). A mistura reacional foi agitada a 20°C durante a noite. Ácido metanossulfônico (7 ml, 0,101 mol) foi adicionado, seguido por 2-metiltetraidrofurano (7 ml) e a reação agitada a 20°C durante um adicional de

4 horas. Água (400 ml) foi adicionada em temperatura ambiente e a mistura bifásica resul- tante agitada em temperatura ambiente durante 20 minutos. A camada aquosa inferior foi 15 removida e uma solução de bicarbonato de potássio (53,50 g, 0,534 mol) em água (400 ml) foi adicionada à camada orgânica. A mistura bifásica foi agitada em temperatura ambiente durante 20 minutos e em seguida a solução aquosa inferior foi removida. A fração orgânica foi retida (solução de (3-oxo1,3-diidro-2-benzofuran-1-il)fosfonato de dietila). 2-Fluoro-5- formilbenzonitrilo (64g, 0,429 mol) foi adicionado à fração orgânica e a mistura foi agitada a 20 20°C. Trietilamina (66 ml, 0,473 mol) foi adicionada gota a gota seguido por 2- metiltetraidrofurano (7 ml). A mistura reacional foi agitada a 20°C durante a noite, em segui- da resfriada a 5°C, filtrada, lavada com álcool metilado industrial (480 ml) e em seguida se- cado em vácuo em até 40°C para produzir o composto título (91,2 g).

Espectro de massa: MH+ 266 1H NMR (400MHz. DMSO-d6) δ: 6,89 (s, 1H, isômero maior), 6,94 (s, 1H, isômero

menor), 7,40 (dd, 1H, isômero menor), 7,58 (t, 1H, ambos isômeros), 7,70 (t, 1H, ambos i- sômeros), 7,89 (t, 1H, ambos isômeros), 7,95 (d, 1H, ambos isômeros), 8,05 (d, 1H, ambos isômeros), 8,15 (m, 2H, isômero maior).

(b) 2-Fluoro-5-[(4-oxo-3,4-diidroftalazin-1-il)metil]benzonitrilo (ED)

2-Fluoro-5-[(E/Z)-(3-oxo-2-benzofuran-1(3H)-ilideno)metil]benzonitrilo (E) (20g,

75,40 mmol) e tetraidrofurano (200 ml) foram agitados em temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio durante 30 minutos. Monoidrato de hidrazina (4,40 ml, 90,53 mmol) foi adicionado, seguido por uma lavagem de linha de tetraidrofurano (4 ml). A mistura rea- cional foi agitada em temperatura ambiente durante 1 hora e 45 minutos. Ácido acético (1,10 ml, 19,20 mmol) foi adicionado e a mistura reacional aquecida a 60°C. A mistura reacional foi mantida durante a noite a 60°C. A mistura reacional foi resfriada a 50°C e água (200 ml)

adicionada gota a gota. A temperatura foi mantida a 45°C ao longo da adição. A mistura re- acional foi resfriada a 20°C, filtrada, lavada com uma mistura de água (30 ml) e tetraidrofu- rano (30 ml), e em seguida secada em vácuo em até 40°C para produzir o composto título (18,7 g).

Espectro de massa: MH+ 280 1H NMR (400MHz. DMSO-d6) â: 4.38 (s, 2H), 7.46 (t, 1H), 7.72 (m, 1H), 7.85 (dt, 1H),

7.92 (m,2H), 7.99 (d, 1H), 8.27 (dd, 1H), 12.57 (s, 1H).

(c) Ácido 2-fluoro-5-[(4-oxo-3,4-diidroftalazin-1-il)metil]benzóico (D)

2-Fluoro-5-[(4-oxo-3,4-diidroftalazin-1-il)metil]benzonitrilo (ED) (9,60 g, 34,37 mmol) e água (40 ml) foram agitados a 20°C. 2M de Hidróxido de sódio (36 ml, 72,00 mmol) foi

adicionado, a mistura reacional aquecida a 90°C e mantida durante a noite nesta temperatu- ra. A mistura reacional foi resfriada em temperatura ambiente e filtrada. A almofada de filtro foi lavada com água (10 ml) e o filtrado combinado adicionado a 2M de HCI (56 ml, 112,00 mmol) a 60°C durante 40 minutos. A suspensão resultante foi resfriada a 50°C e filtrada, lavada com água (57 ml) e secada em vácuo em até 60°C para produzir o composto título 20 como um sólido branco (9,72 g).

Espectro de massa: MH+ 299

1H NMR (400MHz. DMSO-d6) δ\ 4,36 (s, 2H), 7,24 (dd, 1H), 7,59 (m, 1H), 7,84 (dt, 2H), 7,90 (dt, 1H), 7,98 (d, 1H), 8,27 (dd, 1H), 12,59 (s, 1H), 13,22 (br s, 1H).

Exemplo 5: Recristalização do Composto A a partir de etanol aquoso 4-(3-{[4-(Ciclopropilcarbonil)piperazin-1 -il]carbonil}-4-fluorobenzil)ftalazin-1 (2H)-ona

(composto A) (20,00g, 44,66 mmol) foi suspenso em uma mistura de água (50 ml) e etanol (150 ml). A suspensão foi aquecida até o refluxo com agitação. A solução produzida foi em seguida resfriada a 70°C e filtrada. A almofada de filtro foi lavada com uma mistura de água (8 ml) e etanol (22 ml).

O filtrado foi resfriado a 45°C com agitação. 4-(3-{[4-(ciclopropilcarbonil)piperazin-1-

il]carbonil}-4-fluorobenzil)ftalazin-1(2H)-ona (Composto A) em Forma A (0,08g) foi adiciona- do para semear a mistura. A suspensão resultante foi resfriada a 20°C durante 2,5 horas e foi agitada nesta temperatura durante um adicional de 16 horas para estabelecer a cristali- zação. Água (200 ml) foi adicionada durante 5 horas mantendo a temperatura a 20°C. Ao término da adição, a suspensão foi mantida a 20°C durante 2 horas.

A suspensão foi filtrada e a massa filtrante lavada com uma mistura de etanol (24 ml) e água (56 ml). O sólido isolado foi descarregado e secado sob vácuo a 40-60°C, para produzir o composto título (Forma A) como um sólido quase branco (18,1 g).

Métodos para obter as Figuras 3 de 5

XRD de Pó - Figura 3 (composto A como Forma A)

Difração de Pó de Raios X foi registrada com um difractômetro Bruker D5000 (com-

primento de onda de Raios X 1,5418 Â fonte de Cu, Voltagem 40kV, emissão de filamento 40 mA). Amostras foram escaneadas a partir de 2-40 2Θ utilizando uma largura de etapa de

0,02° com uma contagem de tempo de 4 segundos.

XRD de Pó - Fioura 4 (composto A como forma solvatada)

Difração de pó de raios X da família de solvato foi registrada com um difractômetro Inel XRG-3000 (comprimento de onda de raios X 1,5418 Â fonte de Cu, Voltagem 40kV, e- missão de filamento 30 mA), ajustado com um detector sensível à posição curvada (faixa 120° 2Θ). Amostras foram escaneadas a partir de 2,5-40° 2Θ utilizando uma largura de etapa de 0,03° tipicamente com um tempo de coleção total de 300s.

Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). Figura 5

DSC foi registrada utilizando um Mettler DSC820E com sistema robótico

TSO8OIRO. Tipicamente menos que 5mg de material, contidos em uma panela de alumínio de 40 μΙ ajustada com uma tampa perfurada, foram aquecidos sobre a faixa de temperatura de 25°C a 325°C em uma taxa de aquecimento constante de 10°C por minuto. Um gás de purgação de nitrogênio foi utilizado com taxa de fluxo de 100ml por minuto.

Exemplo 6

Ação Inibidora

Para avaliar a ação inibidora do composto ativo, o ensaio seguinte foi utilizado para determinar um valor de IC50.

PARP de mamífero, isolada do extrato nuclear de célula Hela, foi incubado com 25 tampão Z (25mM de Hepes (Sigma); 12,5 mM de MgCI2 (Sigma); 50mM de KCI (Sigma); 1 mM de DTT (Sigma); 10% de Glicerol (Sigma) 0,001% de NP-40 (Sigma); pH 7,4) em Placas Flash de 96 poços (MARCA COMERCIAL) (NEN, UK) e concentrações variadas dos referi- dos inibidores adicionados. Todos os compostos foram diluídos em DMSO e produziram concentrações de ensaio finais dentre 10 e 0,01 μΜ, com o DMSO estando em uma concen- 30 tração final de 1% por poço. O volume de ensaio total por poço foi de 40 μΙ.

Depois da incubação de 10 minutos a 30°C, as reações foram iniciadas pela adição de uma mistura reacional de 10 μΙ, contendo NAD (5 μΜ), 3H-NAD e DNA-oligos de filamen- to duplo de 30mer. Poços de reação positivos e negativos designados foram feitos em com- binação com poços de composto (desconhecidos) para calcular o % de atividades de enzi- 35 ma. As placas foram em seguida agitadas durante 2 minutos e incubadas a 30°C durante 45 minutos.

Seguindo a incubação, as reações foram extinguidas pela adição de 50 μΙ de ácido acético a 30% a cada poço. As placas foram em seguida agitadas durante 1 hora em tempe- ratura ambiente.

As placas foram transferidas para um TopCount NXT (MARCA COMERCIAL) (Pac- kard, UK) para contagem de cintilação. Valores registrados são contagens por minuto (cpm) seguindo uma contagem de 30 segundos de cada poço.

O % de atividade da enzima para o composto é em seguida calculado utilizando a seguinte equação:

% de Inibição =100

r 0 (cpm de desconhecidos - cpm negativa média) Λ

V

(cpm positiva média - cpm negativa média)

Valores de IC50 (a concentração na qual 50% da atividade de enzima são inibidos) foram calculados, os quais são determinados em uma faixa de concentrações diferentes, normalmente a partir de 10 μΜ até 0,001 μΜ. Tais valores de IC50 são utilizados como valo- res comparativos para identificar potências de composto aumentadas.

Composto A tem uma IC50 de cerca de 5 nM.

Fator de Potencialização

O Fator de Potencialização (PF50) para o composto ativo é calculado como uma re-

lação da IC50 do crescimento de célula de controle dividido pela IC50 de inibidor de + PARP de crescimento celular. As curvas de inibição do crescimento para igualmente células trata- das com composto e controle estão na presença do agente de alquilação metil metanossul- fonato (MMS). O composto teste foi utilizado em uma concentração fixa de 0,2 micromolar. As concentrações de MMS estavam em uma faixa de 0 a 10 μg/ml.

Crescimento celular foi avaliado utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB)

(Skehan, P., e outro, (1990) New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug scree- ning. J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107-1112.). 2.000 de células HeLa foram semeadas em cada poço de uma placa de microtpitulo de 96 cavidades com base plana em um volume de 100 μΙ e incubadas durante 6 horas a 37°C. Células foram substituídas apenas com meios ou 25 com inibidor de PARP contendo meios em uma concentração final de 0,5, 1 ou 5 μΜ. As células foram permitidas crescer durante mais uma 1 hora antes da adição de MMS em uma faixa de concentrações (tipicamente 0, 1, 2, 3, 5, 7 e 10 μg/ml) em células não tratadas ou células tratadas com inibidor de PARP. Células tratadas com apenas com inibidor de PARP foram utilizadas para avaliar a inibição de crescimento pelo inibidor de PARP.

As células foram deixadas durante um adicional de 16 horas antes de substituir os

meios e permitir as células crescerem durante mais 72 horas a 37°C. Os meios foram em seguida removidos e as células fixadas com 100 μΙ de ácido tricloroacético a 10% (p/v) frio. As placas foram incubadas a 4°C durante 20 minutos e em seguida lavadas quatro vezes com água. Cada poço de células foi em seguida manchado com 100 μΙ de SRB a 0,4% (p/v) em de ácido acético a 1% durante 20 minutos antes de lavar quatro vezes com ácido acético a 1%. As placas foram em seguida secadas durante 2 horas em temperatura ambiente. A tintura das células manchadas foi solubilizada pela adição de 100 μΙ de 10mM de Tris Base em cada poço. As placas foram suavemente agitadas e deixadas em temperatura ambiente

durante 30 minutos antes de medir a densidade óptica em 564nM em uma leitora de placa de microtítulo Microquant.

Composto A tem um PF50 em 200nM de pelo menos 20.

Claims (26)

1. 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1 -carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H-ftalazin-1 - ona, CARACTERIZADO pelo fato de ser como Forma cristalina A.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ter os seguintes picos característicos em uma XRD de pós: <table>table see original document page 30</column></row><table>

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ter os seguintes picos característicos em uma XRD de pós: <table>table see original document page 30</column></row><table>

4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que começa a fundir-se a 210,10C ±1°C quando aquecido a partir de 25°C até 325°C a 10°C por minuto em DSC.

5. Método de obter 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro- benzil]-2H-ftalazin-1-ona (composto A) como Forma cristalina A, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: (i) cristalizar 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1 -carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H- ftalazin-1-ona a partir de um solvente; (ii) se o solvente original não for etanol, tratar o composto cristalino com etanol; (iii) tratar o composto cristalino A com água para remover o etanol capturado; (iv) secar o produto resultante.

6. Método de obter 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro- benzil]-2H-ftalazin-1-ona (composto A) como Forma cristalina A, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: (i) cristalizar 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1 -carbonil)-4-fluoro-benzil]-2H- ftalazin-1-ona a partir de um solvente; (ii) se o solvente original utilizado na síntese de composto A na forma cristalina não for uma mistura de água e um C1.2 álcool, aquecer o composto com uma mistura de água e um C1-2 álcool; (iii) destilar a mistura em pressão ambiente; e (iv) secar o produto resultante.

7. Método de obter 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fiuoro- benzil]-2H-ftalazin-1-ona (composto A) como Forma cristalina A, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: (i) suspender o composto A em uma mistura de água e um C1^ álcool como o sol- vente; (ii) aquecer a suspensão até o refluxo; (iii) resfriar a solução e semear com composto A como Forma A; (iv) secar o produto resultante.

8. Método de sintetizar 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro- benzil]-2H-ftalazin-1-ona a partir de 4-[4-fluoro-3-(piperazina-1-carbonil)-benzil]-2H-ftalazin- 1-ona, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de: (i) adicionar uma solução pré-misturada de trietilamina e cloreto de ciclopropano carbonila, em um solvente orgânico de uma maneira controlada, em 4-[4-fiuoro-3- (piperazina-1-carbonil)-benzil]-2H-ftalazin-1-ona no mesmo solvente orgânico com a tempe- ratura da solução sendo controlada para estar abaixo de 20°C.

9. Método de sintetizar 4-[3-(4-ciclopropanocarbonil-piperazina-1-carbonil)-4-fluoro- benzil]-2H-ftalazin-1-ona a partir de ácido 2-fluoro-5-(4-oxo-3,4-dihidro-ftalazin-1-ilmetil)- benzóico, CARACTERIZADO pelo fato de compreender reagir ácido com ácido 2-fluoro-5- (4-oxo-3,4-dihidro-ftalazin-1-ilmetil)-benzóico com 1-(ciclopropilcarbonil)piperazina ou um sal de ácido mineral na presença de um agente de acoplamento de amida.

10. Método de sintetizar ácido 2-fluoro-5-(4-oxo-3,4-dihidro-ftalazin-1-ilmetil)- benzóico, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de: (a) sintetizar (3-oxo-1,3-diidro-2-benzofuran-1-il)fosfonato de dietila a partir de 2- carboxibenzaldeído; (b) sintetizar 2-fluoro-5-[(E/Z)-(3-oxo-2-benzofuran-1(3H)-ilideno)metil]benzonitrilo a partir de (3-oxo-1,3-diidro-2-benzofuran-1-il)fosfonato de dietila.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de também compreender a etapa: (c) sintetizar 2-fluoro-5-[(4-oxo-3,4-dihidroftalazin-1-il)metil]benzonitrilo (ED): <formula>formula see original document page 32</formula> a partir do composto E através da reação com hidrato de hidrazina; e (d) sintetizar composto D a partir do composto ED por reação com hidróxido de só- dio.

12. 2-Fluoro-5-[(4-oxo-3,4-dihidroftalazin-1 -il)metil]benzonitrilo (ED) CARACTERIZADO pelo fato de compreender: ED

13. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável.

14. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser para uso em um método de tratamento do corpo huma- no ou animal.

15. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o uso em um método de inibir PARP no tratamento do corpo humano ou animal.

16. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para inibir a atividade de PARP.

17. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o trata- mento de: doença vascular; choque séptico; lesão isquêmica; neurotoxicidade; choque he- morrágico; infecção viral; ou doenças melhoradas pela inibição da atividade de PARP.

18. Uso de um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para uso como um auxiliar na terapia de câncer ou para potencializar células de tumor para o tratamento com radiação por ionização ou agentes quimioterapêuticos.

19. Uso de um composto, de acordo com as reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para uso no tra- tamento de câncer em um indivíduo, em que o referido câncer é deficiente em série de rea- ção de reparo de DSB de DNA dependente de HR.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato do referi- do câncer compreender uma ou mais células cancerígenas tendo uma capacidade reduzida ou ab-rogada para reparar DSB de DNA por HR relativo às células normais.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato das referi- das células cancerígenas terem um fenótipo deficiente de BRCA1 ou BRCA2.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato das referi- das células cancerígenas serem deficientes em BRCA1 ou BRCA2.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, CARACTERIZADO pelo fato do referido indivíduo ser heterozigoto para uma mutação em um gene que codifica um componente da série de reação de reparo de DSB de DNA depen- dente de HB.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato do referi- do indivíduo ser heterozigoto para uma mutação em BRCA1 e/ou BRCA2.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, CARACTERIZADO pelo fato do referido câncer ser câncer de mama, ovário, pâncreas ou próstata.

26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 25, CARACTERIZADO pelo fato do referido tratamento também compreender a administração de radiação por ionização ou um agente quimioterapêutico.