BRPI0717142A2 - Composição terapêutica e kit de reativos para uso terapêutico - Google Patents

Description

"COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA E KIT DE REATIVOS PARA USO

TERAPÊUTICO"

Setor técnico

A presente invenção se refere ao campo da Biotecnologia em particular à imunoterapia específica do câncer. Baseado no efeito sinérgico que tem sobre o crescimento das metástases o uso combinado dos anticorpos monoclonais contra o receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (AcMs anti-EGFR) com interferons (INFs) de tipo I. A presente invenção oferece uma ferramenta terapêutica que supera as limitações das monoterapias contra o EGFR. Técnica anterior

Anticorpos monoclonais anti-EGFRO

O EGFR e seus ligantes estão expressos em todos os tipos celulares a exceção das células de origem hematopoiético (Carpenter G. Annu Rev Biochem 1987; 56:881- 914). A expressão incrementada destas proteínas foi detectada na maioria dos tumores humanos de origem epitelial (Salomon DSy cols. Crit Rev Oncol Hematol 1995; 19:183-232). Estudos pré-clínicos demonstraram que os laços de ativação autocrina e paracrina que envolvem o EGFR e seus ligantes, regulam o crescimento e a habilidade das células tumorais para formar metástases (Verbeek BS y cols. FEBS Lett 1998; 425:145-50; O-CharoenratPy cols, IntJCancer 2000; 86:307-17; Radinsky R y cols. Clin Câncer Res 1995; 1:19-31). Como resultado destas observações, foram identificados um número de potentes e seletivos antagonistas da sinalização através do EGFR, que se encontram sob investigações clínicas (Pai SK, Pegram M. Anticancer Drugs 2005; 16:483- 94).

Atualmente, o AcM quimérico ICM-C225/Cetuximab representa a mais exitosa terapia anti-EGFR, encontrando-se na vanguarda dos ensaios clínicos. Este AcM se une especificamente ao subdomínio III do domínio extracelular do EGFR humano que compete com o ligante e bloqueia a ativação do receptor, afetando o processo de dimerização. Também induz eficientemente a internalização e a degradação do EGFR (Shiqing L y cols. Câncer Cell 2005; 7:301-11). Além disso, M. Namura e colaboradores demonstraram que o Cetuximab pode induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC, siglas em inglês "antibody-dependent cellular cytotocixity") através da ativação das células mononucleares de sangue periférico de humanos, sugerindo que esta pode ser outra via de ação anti-tumoral deste anticorpo (Naramura M y cols. Câncer Immunol Immunother 1993; 37:343-9). Em estudos pré-clínicos usando o AcM Cetuximab, obteve-se uma remissão completa de tumores xenogênicos EGFR-positivos (Goldstein Jy cols. JImmunol 1997; 158:872-9).

Estudos clínicos de Fase I realizados com pacientes de tumores sólidos EGFR-positivos demonstraram que o tratamento com Cetuximab é bem tolerado (.Robert Fy cols. J Clin Oncol 2001; 19:3234-43; Baselga Jy cols. J Clin Oncol 2000; 18:904-14; Shin DMy cols. Clin Câncer Res 2001; 7:1204-13). Os principais eventos adversos atribuídos a esta terapia foram reações alérgicas e toxicidade em pele (Shin DM y cols. Clin Câncer Res 2001; 7:1204-13). O Cetuximab foi recentemente aprovado pela agência regulatória para os alimentos e medicamentos de Estados Unidos (FDA, do inglês "Food and Drug Administration") para seu uso como monoterapia ou em combinação com Irinotecan em pacientes de carcinoma coloretal metastásico com expressão detectável do EGFR (ImClone Systems, Erbitux (Cetuximab). US Prescribing Information. ImClone System, 2004). Adicionalmente, encontram-se em curso estudos clínicos de Fases II e III usando este anticorpo em pacientes com carcinoma de pâncreas (Xiong HQ y cols. J Clin Oncol 2004; 22:2610- 6), câncer de pulmão de células não- pequenas (NSCLC, do inglês "non small cell Iung câncer") (Lynch TJy cols. Proc Am Soc Clin Oncol 2004; Roseli R y cols. Proc. Am. Soc Clin. Oncol. 2004) e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (SCCHN, do inglês "squamous cell carcinoma of the head and the neck") CBonner JA y cols. Proc. Am. Soe. Clin. Oncol. 2004).

Também está sendo avaliado o AcM humanizado h- R3/TheraCIM (Centro de Imunologia Molecular.CIM). Este AcM tem uma capacidade similar ao anticorpo murino original para inibir a união do EGF (EGF, do inglês "epidemial growth fator") ao receptor (Mateo C y cols. Immunotechnology 1997; 3:71-81). Em experimentos "m vitro" viu-se que o h-R3/TheraCIM inibe o crescimento das células A431 de forma similar ao AcM Cetuximab. O tratamento de animais atímicos com tumores xenogênicos EGFR-positivos com este anticorpo resulta na regressão completa dos tumores estabelecidos (Viloria-Petit A y cols. Câncer Res 2001;61:5090-101). O h-R3/TheraCIM se encontra atualmente registrado pelo Centro para o Controle Estatal da Qualidade dos Medicamentos (CECMED) de Cuba para seu uso em pacientes com tumores avançados de cabeça e pescoço (Crombet Ty cols. J Clin Oncol 2004; 22:1646-54). Também estão realizando ensaios clínicos em outras localizações tais como glioma, mama, próstata e pulmão, obtendo-se resultados alentadores (Crombet T, comunicación personal).

Outros AcMs específicos para o EGFR humano que apresentam mecanismos similares de ação estão atualmente sob investigação clínica. Este é o caso do ABX-EGF, uma IgG2 humana, que inibe a ativação dependente de ligante do EGFR e impede o crescimento de tumores xenogênicos EGFR-positivos (Yang Xy cols. Câncer Res 1999; 59:1236-43). Recentemente foram publicados resultados positivos da avaliação deste anticorpo em um ensaio clínico de Fase III em pacientes de câncer coloretal (.Tyagi P. Clin Colorectal Câncer 2005; 5:21-3), e estão em curso vários ensaios clínicos de Fase II em pacientes com câncer renal {Amato RJ. Ann Oncol 2005; 16:7-15) e NSCLC (Tiseo My cols. Curr Med Chem Anticancer Agents 2004; 4:139-48). Também foi avaliado o AcM humanizado EMD 72 OOO em um ensaio clínico em pacientes com tumores de pâncreas (Graeven Ou y cols. Br J Câncer 2006; 94:1293-9). Não obstante, o benefício do tratamento dos pacientes com câncer metastásico com estes AcMs anti-EGFR é relativamente marginal, sobretudo no que se refere a aumentar a sobrevida.

O Erbitux aplicado nos pacientes de câncer de cólon metastático que são refratários ao tratamento com Irinotecan, embora tenha permitido estabilizar a doença alguns meses, não conseguiu aumentar a sobrevida destes pacientes (Cunningham D y cols. N. Engl. J. Med. 2004; 351: 337-345). É por isto que é necessário procurar combinações terapêuticas que permitam incrementar a eficácia dos AcM anti-EGFr.

Indução de linfócitos T citotóxicos por terapia passiva com

AcMs.

A "apresentação cruzada" foi descrita por Michael Bevan 25 anos atrás (Bevan MJ. J Exp Med 1976; 143: 1283-88), e consiste na capacidade que têm as células apresentadoras de antígenos (APC, do inglês "antigen-presenting cells) de ativar linfócitos T citotóxicos (CTLs, do inglês "cytotoxic T lymphocytes") específicos por antígenos de células forasteiras capturadas por estas e apresentados nas moléculas do sistema principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês "major histocompatibility complex") classe I. Identificaram-se vários fatores que promovem este tipo de apresentação, entre estes se encontram as proteínas de choque térmico (<Suto R e Srivastava PK. Science 1995; 269: 1585-88), os exosomas (Wolfers Jy cols. Nature Medicine 2001: 7: 297-303) e os complexos imunes CRegnault A y cols. J Exp Med 1999; 189: 371-80). Por sua vez as células mortas por apoptosis ou necrosis são uma fonte muito atraente de antígenos para a "apresentação cruzada". A conseqüência imunológica da ingestão de material celular proveniente de apoptosis ou necrosis é muito controversa (Russo Vy cols. PNAS 2000; 97: 2185-90; Yrild BUy cols. J Exp Med 2000; 191: 613- 21). Em general, o material celular necrótico é considerado como imunogênico, enquanto a apoptose tem estado associada por muito tempo com o evento de tolerização. No entanto sob certas condições a morte celular apotótica mostrou ser uma atrativa fonte de antígenos para a apresentação cruzada e a ativação de CTLs por prover os "sinais de perigo" necessárias para a maturação das APC (Lake RA y Robinson B WS. Nature Reviews 2005; 5: 397- 405).

O C2B8 (Rituximab) é um AcM quimérico dirigido contra a molécula CD20 (.RelfMEy coil. Blood 1994; 83: 435-45) Este agente é usado para o tratamento de linfomas não-Hodgkin de células B, onde provoca uma eficiente eliminação das células B neoplásicas, alcançando respostas objetivas em 50% dos pacientes e intervalos livres de progressão da doença acima dos 12 meses (Maloney DG. Curr Opin Haematol 1998; 5:237-43; Coiffier By cois. Blood 1998; 92:1927-32; Hainsworth JD y cols. Blood 2000; 95:3052- 56). Múltiplos estudos indicaram que o máximo de resposta clínica e molecular com o Rituximab é alcançado vários meses depois de aplicado o tratamento, sugerindo que os mecanismos citolíticos a curto prazo tais como a apoptosis, a citotoxicidade dependente de complemento (CDC, "complement- dependent cytotoxicity") e a ADCC não são os únicos envolvidos. Em experimentos "m vitró" o Rituximab promove a Iise das células de linfoma através de algum dos mecanismos antes mencionados e a fagocitose dos produtos das células tumorais pelas APC e sua subsequente "apresentação cruzada" para ativar CTLs específicos pelo tumor (,Selenko Ny cols. J. Clin. Oncol 2002; 3:124- 130). Este possível "efeito vacinação" não foi totalmente constatado nos estudos clínicos, o que sem dúvida alguma são necessários posteriores ensaios que dêem resultados mais sólidos que possam apoiar esta hipótese.

Os interferons tipo I (α/β) como terapia anti-tumoral Os INFs tipo I (α/β) são agentes biológicos usados na terapia de 2 tipos de câncer principalmente: melanoma e carcinoma renal, (Agarwala SSeKirkwoodJM. Semin. Surg. Oncol. 1998; 14: 302-310; VlockDRyeols. J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 1996; 19:433-442; Kirkwood JM y eols. Semen. Oncol. 1997; 24: 16-23; Kirkwood JMy eols. J Clin. Oneol 1996; 14: 7-17). O INF-α foi a primeira citocina produzida pela tecnologia do DNA recombinante e demonstrou ser um importante agente regulador da proliferação e diferenciação das células tumorais {Hertzogy eols. JBiol Chem 1994; 269:14088-93)·, também foi reportou seu efeito na indução de apoptosis (<Clemens MJ. J Interferon Cytokine Res 2003; 23:277-92) e inibição dos processos de angiogênesis (Sidky YA y eols. Câncer Res 1987; 47:5155-61). Além da ação direta sobre as células tumorais, os INF-α/β exercem uma grande variedade de efeitos sobre as células imunes do hospedeiro que podem também ter um papel importante na resposta imune anti-tumoral (.Belardelli F. APMIS. 1995; 103:161-179). No entanto, os dados provenientes da efetividade clínica do INF-α na terapia de tumores sólidos são inconsistentes. De fato, somente pacientes com determinados tipos de tumores se beneficiam do tratamento com essa citocina, enquanto outros são parcial ou totalmente resistentes à mesma.

Existem estudos do papel do INF-α na regulação da expressão do EGFR em células tumorais (.Budillon A y eols. Câncer Res 1991; 51 : 1294-9; Caraglia My eols, Int J Câncer 1995; 4: 309-16; Heise Hy eols. Anti CancerDrugs 1995, 6;686-92; Scambia Gy eols, IntJCancer 1994; 58: 769-73; Yang JL y eols. Gut 2004; 53: 123- 129; Qu XJy eols. J Urology 2004; 172: 733-738). Baseado nos relatos de que esta citocina incrementa a expressão e atividade do EGFR em alguns tumores, diferentes autores estudaram "in vitro" a vantagem de combinar inibidores da atividade tirosina quinase do EGFR com INF-α nestes cenários, obtendo uma vantagem anti- tumoral da terapia combinada (Yang JL y eols. Oncology 2005; 69: 224-238; Brúeese Fy eols. Clin Câncer Res 2006; 12: 617-625; Yang JL y eols. Câncer Letters 2005; 225: 61-74). No entanto estes resultados não podem ser generalizados pois a ação do INF-α sobre a expressão do EGFR em células tumorais é muito variável (,Scambia Gy cols, Int J Câncer 1994; Yang JL y cols. Gut 2004; 53: 123-129; QuXJy cols. J Urology 2004; 172: 733-738), o qual pudesse limitar a vantagem deste tipo de tratamento só em determinados nichos de pacientes. Por outro lado tem-se evidenciado que o INF-α pode incrementar a expressão das moléculas do sistema principal de histocompatibilidade (MHC, do inglês "major histocompatibility complex") classe I nos tecidos normais (Cho HJy cols. JImmunology 2002; 168: 4907- 13; LangKSy cols. Nature Medicine 2005; 11 : 138-44). Por outro lado nesta invenção se ensina como a aplicação de ESTFa em células tumorais em cultivo pode incrementar substancialmente a expressão das moléculas de MHC-I, embora os tumores desenvolvam mecanismos de escape à pressão dos efeitores imunológicos, dentre eles a perda da expressão de moléculas de MHC-I. Por estas razões poderia ser bem mais vantajosa a combinação desta citocina com AcMs anti-EGFR, o que potencialmente poderia induzir uma resposta CTL, efeito que até o momento não foi atribuído à ação de nenhum inibidor de atividade tirosina quinase.

A presente invenção está baseada em dois eventos biológicos não descritos nem sugeridos previamente. O primeiro mostra que a terapia baseada em AcMs anti-EGFR depende centralmente da mobilização de CTLs, mais particularmente do que o efeito anti-metastásico de AcMs contra o EGFR depende diretamente da participação de células T CD8+. O segundo evidência que a ação dos INFs de tipo 1 sobre as células tumorais incrementa consideravelmente a expressão das moléculas de MHC-I. A aplicação combinada destas duas observações permite incrementar notavelmente o efeito terapêutico contra o câncer dos AcM anti-EGFR e dos INFs tipo 1. Descrição detalhada da invenção.

A presente invenção se refere a uma composição terapêutica útil no tratamento do câncer, caracterizada pelo fato de que compreende a administração simultânea ou seqüencial de um anticorpo contra o receptor do EGF e um ou mais INFs do tipo 1, onde o anticorpo monoclonal contra o receptor do EGF é um anticorpo quimérico ou a variante humanizada de referido anticorpo. Especificamente, a invenção trata da composição terapêutica que compreende o anticorpo humanizado hR3 que reconhece o receptor humano do EGF e é produzido pela linha celular com número de depósito 951 110101.

Por outro lado a composição terapêutica da presente invenção se refere ao dos INFs de tipo 1 e mais especificamente ao INF-α humano e mas especificamente ao INF-α humano recombinante.

Adicionalmente, a presente invenção se refere à forma de administração da composição terapêutica descrita, que pode ser de forma simultânea ou seqüencial.

Em outro aspecto a presente invenção se refere a um jogo de reativos que compreende um frasco contendo um anticorpo contra o receptor do EGF e um ou mais fracos adicionais que contêm um ou mais INFs bem como uma etiqueta ou outra instrução para suas dosagens e seu uso.

Dado que por razões éticas é impossível a experimentação em humanos, a presente invenção se refere além disso a um biomodelo experimental que permite demonstrar ao vivo a solução técnica proposta na presente invenção. O modelo experimental em questão, compreende a obtenção e desenvolvimento de um anticorpo monoclonal que reconhece o receptor murino do EGF, assim como a caracterização do efeito biológico do referido anticorpo sobre linhas celulares murinas.

Avaliação do efeito anti-metastásico do tratamento com AcM

anti-EGFR.

Usam-se ratos das cepas Balb/c ou C57BL/6 de 8 a 12 semanas de idade como modelo experimental para a avaliação do efeito anti- metastásico do tratamento com AcM anti-EGFR. Os ratos foram tratados com um AcM específico para o domínio extracelular do EGFR murino ou um AcM controle (anticorpo irrelevante para cada tumor, de igual isotipo que o AcM anti-EGFR) a dose que oscila entre 1 e 25 mg de AcM por Kg por peso do rato. Os AcMs foram inoculados por via intravenosa ou intraperitoneal, e o esquema de inoculação pode-se realizar de diversas maneiras:

• Começar um dia antes da inoculação tumoral e manter-se nos dias 1, 2 e 3 depois do repto com o tumor e depois cada 3 dias começando o dia 6, até o final do ensaio.

· Começar o dia 2 depois da inoculação tumoral, continuar o

dia 3 e depois cada 3 dias começando o dia 6, até o final do ensaio.

• Começar o dia 6 depois da inoculação tumoral e continuar cada 3 dias, até o final do ensaio.

Nos ratos são inoculados as células tumorais murinas que expressam o EGFR (provenientes de tumores de localizações tais como: pulmão, mama, cólon, próstata, glioma, bexiga, cabeça e pescoço) o dia 0 mediante inoculação das mesmas em um número de 1 χ 103 a 1 χ 106 células tumorais por rato, por via intravenosa, subcutânea ou intramuscular, para obter metástase em órgãos tais como pulmão e fígado. Os animais são sacrifidos por deslocamento cervical entre os dias 20 e 45 depois da inoculação tumoral, e as metástases para cada órgão individual são contadas utilizando um microscópio estereoscópico.

Medição do papel das células T CD8+ sobre o efeito anti- metastásico do AcM anti-EGFR. São inoculados ratos com a linha tumoral nas mesmas

condições com que se fez o experimento anti-metastásico anteriormente descrito e entre os dias -1 e 6 com respeito ao dia de inoculação das células tumorais (dia 0), os ratos recebem uma dose que oscila entre 5 e 50 mg de AcM por Kg de peso do rato por via intravenosa ou intraperitoneal de um AcM específico pela molécula CD8+ que é capaz de eliminar as células que contenham este marcador. A administração deste AcM é realizada a cada 4 dias até o final do ensaio. Além disso, tratam-se os animais com o AcM anti- EGFR como se descreve previamente. Os animais são sacrificados por deslocamento cervical entre os dias 20 e 45 depois da inoculação tumoral, e as metástases para cada órgão individual são contadas utilizando um microscópio estereoscópico.

Avaliação do efeito anti-metastásico da combinação do INF-a e AcM anti- EGFR.

Inoculam-se ratos com a linha tumoral nas mesmas condições com que se fez o experimento anti-metastásico anteriormente descrito, os quais são tratados com um AcM específico para o domínio extracelular do EGFR murino às doses e vias já descritas e INF-α murino a dose que oscilam entre 5 χ IO5 e 5 χ IO6 unidades por Kg por peso do rato por via intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea. O esquema de inoculação pode se realizar de diversas maneiras: (a) de maneira simultânea ambas terapias, (b) realizar um pré-tratamento com o INF-α e depois administrar o AcM anti-EGFR ou (c) realizar um pré-tratamento com o INF-α e depois administrar a composição farmacêutica que contém ambas moléculas. Os animais são sacrificados por deslocamento cervical entre os dias 20 e 45 depois da inoculação tumoral, e as metástases para cada órgão individual são contadas utilizando um microscópio estereoscópico.

Composição imunoterapêutica que compreende a imunoterapia com anticorpos monoclonais que reconheçam o receptor humano do EGF, junto com INF-a.

Administrar-se-á ao paciente, imediatamente depois do diagnóstico e/ou tratamento cirúrgico um tratamento de imunoterapia passiva com um AcM específico contra o domínio extracelular do EGFR humano, conjuntamente com um tratamento com INF-α que provoquem uma resposta de células T CD8+ nos indivíduos tratados.

A administração de uma composição terapêutica que compreende um anticorpo contra o EGF-R e INF-α, provoca um efeito sinérgico, conseguindo inibir o surgimento de metástase em pacientes de câncer.

O procedimento consiste em administrar, a pacientes com tumores de origem epitelial em estágios avançados, AcMs anti-EGFR em um

npivel de dose de 100-mais 400 mg INF-α humano em um nível de dose de 10

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- 30 χ 10° Ul/ m /dia. Os protocolos de administração podem seguir diversos esquemas. Preferivelmente a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada seguindo um dos seguintes esquemas: (a) a composição é administrada mensalmente durante uma semana ou (b) quatro semanas consecutivas a cada três meses. O tratamento será administrado até a regressão total ou parcial do tumor primário ou ante qualquer reação de toxicidade que requeira a detenção do mesmo.

Exemplos:

Exemplo 1: Obtenção de um AcM anti-EGFR murino.

Ratos da linha Balb/c foram imunizados com uma proteína recombinante que contém o domínio extracelular do EGFR murino (,Sânchez B y cols, Int J Câncer 2006, 120 em imprenta) em adjuvante de Freund e os soros são processados nos dias 0 e 60. A presença de anticorpos específicos contra a proteína recombinante foi medida mediante a técnica de ELISA. Todos os ratos desenvolveram resposta de anticorpos específicos contra a proteína recombinante, atingindo valores de títulos em um nível de 1:80 000 a 1 :100 000.

Para a realização do experimento de fusão foi selecionado um rato com alto título de anticorpos séricos contra a proteína recombinante. Obteve-se um AcM específico para o domínio extracelular do EGFR murino, o anticorpo 7Α7 (IgGI ) (Garrido G y cols. Hybridoma and Hybridomics 2004; 23 (3): 168-175). Este anticorpo reconhece especificamente as células murinas EGFR positivas mediante diferentes técnicas, tais como: "Western Blot", FACS e Imunohistoquímica.

As seqüências nucleotídica e aminoacídica deduzida da região variável da corrente pesada do AcM 7A7 (número de acesso do GenBank: DQ437656) foram mostradas na Figura 1. As seqüências nucleotídica e aminoacídica deduzida da região variável da cadeia leve (Vk) do AcM 7A7 mAb (número de acesso do GenBank: DQ437657) são mostradas na Figura 2. Exemplo 2: Efeito anti-metastásico do AcM 7A7 sobre o tumor D 122.

2,5 χ IO5 células do clone D122, do carcinoma pulmonar de Lewis (3LL), são administradas aos ratos C57BL/6 (10 ratos por grupo) pela via intravenosa pela veia da fila. Seis dias depois começou o esquema de administração com os AcMs (7A7 e controle) a dose de 2.8 mg de anticorpo por Kg por peso do rato, por via endovenosa em 100 μΐ de SSFT (solução salina tamponada com fosfato). Depois de 21 dias de experimentação, os ratos foram sacrificados e foram contadas as metástases pulmonares.

A administração do AcM 7A7 reduziu drasticamente o número de metástases pulmonares de D122 quando se compara com os ratos tratados com o AcM controle (Figura 3). A diferença no número de metástase entre ambos grupos experimentais foi estatisticamente significativa de acordo com a prova da U de Mann-Whitney realizada (p < 0.0001 ).

Exemplo 3: O efeito anti-metastásico do AcM 7A7 sobre o tumor D122 depende das células T CD8+.

2,5 χ IO5 células D122 foram administradas aos ratos C57BL/6 (10 ratos por grupo) pela via intravenosa pela veia da fila. Seis dias depois começou o esquema de administração com os AcMs (7A7 e controle) a dose de 2.8 mg de anticorpo por Kg por peso do rato, por via endovenosa em 100 μΐ de SSFT. Os anticorpos responsáveis por eliminar a população celular CD8+ foram administrados aos ratos por via intraperitoneal no mesmo dia em que começou o regime de tratamento com o AcM 7A7 ou controle, mantendo- se sua administração durante todo o ensaio. A efetividade da eliminação celular foi verificada no baço e pulmão dos ratos. Depois de 21 dias de experimentação, os ratos foram sacrificados e foram contadas as metástases pulmonares. Neste experimento, verifica-se o efeito anti-metastásico do AcM 7A7 sobre o tumor D122, observando-se uma significativa redução na média do número de metástases pulmonares de D122 no grupo de animais tratados com 7A7, quando se compara com o grupo que recebeu o AcM controle (Figura 4 e Tabela 1), diminuição que é estatisticamente significativa (p<0.01 , Prova de Dunn). A eliminação das células CD8+ abole o efeito anti- metastásico do AcM 7A7, obtendo-se inclusive um valor de média do número de metástases pulmonares de D122 para este grupo de tratamento, superior à do grupo de ratos tratados com SSFT e que receberam o anticorpo específico por CD8 (p > 0.05, Prova de Dunn) (Figura 4 e Tabela 1).

Média AcM 7A7 AcM controle AcM 7A7 + esgotamento AcM controle +esgotamento 7 44 49 44

Tabela 1. Média do número de metástases dos grupos de experimentação.

Exemplo 4: Incremento dos níveis de MHC-I por tratamento com INF-α nas células D122 e MB16F10.

As células Dl22 e MB16F10 (0.25 χ IO6 em placa de 6 poços) foram tratadas com 1000 unidades/ML de INF-α durante 12 horas. Posteriormente, o nível de expressão de MHC-I na membrana das células foi determinado nas células sem tratamento e nas células tratadas, usando Citometria de Fluxo como se descreve a seguir. Para minimizar as uniões inespecíficas, 2 χ 105 células foram incubadas durante 15 minutos a 4 0C em SSTF com azida sódica (0.01%) [v:v] e BSA a 1% [p:v] (Solução B). Depois adicionou-se um anticorpo que reconhece a molécula H-2kb de rato conjugada a FITC (diluição 1 :200) (Pharmingen, EEUU). Uma vez marcadas e lavadas extensivamente, IO4 células no mínimo foram adquiridas usando um citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, EEUU). Os dados obtidos foram analisados usando o programa WinMDI versão 2.8.

A adição do INF-α às células D122 e MBlóflO provocou um incremento das células que expressam o MHC I em membrana e também do nível de expressão deste marcador na superfície celular (Figura 5).

Exemplo 5: Efeito do INF-α sobre a expressão do EGFR nas

células D122.

As células D122 (0.25 χ IO6 em placa de 6 poços) foram tratadas com 1000 unidades/ML de INF-α durante 48 horas. Posteriormente, o nível de expressão de EGFR na membrana das células foi determinado nas células sem tratamento e nas células tratadas, usando Citometría de Fluxo como se descreve a seguir. Para minimizar as uniões inespecíficas, 2 χ IO5 células foram incubadas durante 15 minutos a 4 0C em SSTF com azida sódica (0.01%) [v:v] e BSA ao 1% [p:v] (Solução B). Depois se adicionou o AcM 7A7 a uma concentração de 1 μg/ML na solução B e foram incubados igualmente 15 minutos a 4°C; depois deste tempo foram realizadas lavagens com a solução B. Posteriormente se adicionou o soro de coelho anti-lgs totais de rato conjugado a FITC (Pharmingen, EEUU), a uma diluição 1:200 na mesma solução.

Uma vez marcadas e lavadas extensivamente, IO4 células no mínimo foram adquiridas usando um citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, EEUU). Os dados obtidos, foram analisados usando o programa WinMDI versão 2.8.

A adição do INF-α às células D122 não variou a expressão do EGFR na membrana (Figura 6). 10

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Exemplo 6: Efeito anti-metastásico da combinação do AcM 7A7 com INF-α sobre o tumor D122.

2,5 χ 105 células D122 foram administradas nos ratos C57BL/6 (10 ratos por grupo) pela via intravenosa pela veia da fila. Seis dias depois começou a administração conjunta do INF-a (5 χ IO5 unidades por Kg por peso do rato, via intraperitoneal) e do AcM 7A7 (2.8 mg de anticorpo por Kg por peso do rato, via intravenosa) que continuou três vezes por semana durante todo o ensaio. Depois de 21 dias de experimentação, os ratos foram sacrificados e foram contadas as metástases pulmonares. Os grupos de ratos que receberam de maneira independente SSFT, AcM 7A7 e IFN-α foram usados como controle.

Neste experimento, verifica-se o efeito anti-metastásico do AcM 7A7 e o IFN-α sobre o tumor D 122 (como monoterapia), observando-se uma redução no número de metástases pulmonares de D122 nestes grupos, quando se compara com o grupo que recebeu o SSFT (Ver Figura 7/Tabela 2). No entanto, este efeito anti-metastásico é incrementado significativamente quando os ratos recebem a terapia combinada (Ver Figura7/Tabela 2) (SSFT vs. AcM 7A7+IFN-a: ρ < 0,001; AcM 7A7 vs AcM 7A7+IFN-a: ρ < 0,05; IFN-α vs AcM 7A7+IFN-a: ρ < 0,05, Prova de Dunn).

SSFT AcM 7A7 IFNa- AcM 7A7 + IFN a 103 42 36 2

Tabela 2. Média do número de metástase dos grupos de experimentação. Breve descrição das figuras:

Figura 1: Seqüências nucleotídica e aminoacídica deduzida do DNAc codificante para a Vh 7A7. Os aminoácidos são numerados de acordo a Kabat. Introduziram-se espaços para maximizar os alinhamentos. Os resíduos aminoacídicos codificados por cada codón foram mostrados em cima da seqüência nucleotídica.

Figura 2: Seqüências nucleotídica e aminoacídica deduzida do DNAc codificante para a Vk 7A7. Os aminoácidos foram numerados de acordo com Kabat. Introduziram-se espaços para maximizar os alinhamentos. Os resíduos aminoacídicos codificados por cada codon se mostram acima da seqüência nucleotídica.

Figura 3: Efeito anti-metastásico do AcM 7A7 sobre o tumor D122. Os ratos C57BL/6 foram inoculados com células D122 em um modelo de metástase experimental e foram tratados com o AcM 7A7 ou um AcM controle. Os animais foram sacrificados ao final do ensaio, e o número de metástases pulmonares foi contado para cada rato individual.

Figura 4: O efeito anti-metastásico do AcM 7A7 sobre o tumor D122 depende das células T CD8+.

Os ratos C57BL/6 foram inoculados com células D122 em um modelo de metástase experimental e foram tratados com o AcM 7A7 ou um AcM controle. Conjuntamente nos ratos a população celular CD8+ foi eliminada por administração de um anticorpo específico para a referida população. Os animais foram sacrificados ao final do ensaio, e o número de metástases pulmonares foi contado para cada rato individual.

Figura 5: Incremento de expressão de MHC-I por tratamento com INF-α nas células D122 e MB16F10.

As células D122 e MB16F10 foram cultivadas durante 12 horas com INF-α. Finalmente, as células foram incubadas com um AcM que reconhece o H-2kb conjugado a FITC. A porcentagem de células positivas para este marcador foi medido por citómetro de fluxo.

Figura 6: O tratamento com o INF-α não varia a expressão do EGFR nas células D122. As células D122 foram cultivadas durante 48 horas com INF- a. Finalmente, as células foram incubadas com o AcM 7A7 para analisar a expressão do EGFR por citometria de fluxo.

Figura 7. O efeito anti-metastásico do tratamento combinado do AcM 7A7 e o IFN-α é superior ao dos tratamentos independentes. Os ratos C57BL/6 foram inoculados com células D122 em um modelo de metástase experimental e foram tratados com o AcM 7A7 e o INF-α. Os animais foram sacrificados no final do ensaio, e o número de metástases pulmonares foi contado para cada rato individual.

Claims (11)

1. Composição terapêutica útil no tratamento do câncer caracterizada pelo fato de que compreende a administração simultânea ou seqüencial de um anticorpo contra o receptor do EGF e um ou mais interferons do tipo 1.

2. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo contra o receptor do EGFi interferon e um excipiente adequado para sua administração por via intravenosa.

3. Composição terapêutica de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal contra o receptor do EGF é um anticorpo quimérico.

4. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal contra o receptor do EGF é um anticorpo humanizado.

5. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal contra o receptor do EGF é o anticorpo humanizado hR3 produzido pela linha celular com número de depósito 951110101.

6. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 1 e 2 caracterizada pelo fato de que o interferon é de tipo 1.

7. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 6 caracterizada pelo fato de que o interferon é INF-α humano.

8. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo fato de que o interferon é INF-α humano recombinante.

9. Composição terapêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal HR3 contra o receptor de EGF produzido pela linha celular com no. de Depósito 951110101 e o interferon INF-α humano recombinante.

10. Composição terapêutica de acordo com as reivindicações 1 a 9 caracterizada pelo fato de que a administração do anticorpo e o INF é seqüencial.

11. Kit de reativos para uso terapêutico caracterizado pelo fato de que compreende um frasco contendo um anticorpo contra o receptor do EGF e um ou mais frascos adicionais que contêm um ou mais interferons, todos em um excipiente apropriado, assim como uma etiqueta ou outra instrução para suas dosagens e seu uso.