BRPI0717155A2 - Agonistas do receptor de epo humana, composições, métodos e usos para prevenção ou tratamento das condições relacionadas á intolerância á glicose - Google Patents

Agonistas do receptor de epo humana, composições, métodos e usos para prevenção ou tratamento das condições relacionadas á intolerância á glicose Download PDF

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Kristen Picha
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGONISTAS DO RECEPTOR DE EPO HUMANA, COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DAS CONDIÇÕES RELACIONA- DAS À INTOLERÂNCIA À GLICOSE".
Antecedente da Invenção Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a pelo menos um agonista do re- ceptor da EPO humana método para prevenção ou tratamento de intolerân- cia à glicose e/ou anemia associada à doença renal, incluindo composições terapêuticas, métodos e dispositivos. Técnica Relacionada
Certos estados de doença envolvem eritropoiese anormal. EPO recombinante humana (rHuEPO) está sendo usada terapeuticamente em diversos países. Nos Estados Unidos, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou o uso da rHuEPO no tratamento de anemia associada com estágio final da doença renal. Os pacientes submetidos à hemodiálise para tratar esto distúrbio tipicamente sofrem de anemia severa, causada pela ruptura e morte prematura dos eritrócitos em conseqüência do tratamento de diálise. EPO é também útil no tratamento de outros tipos da anemia. Por exemplo, anemia induzida pela quimioterapia, anemia associada com mielodisplasia, associada com vários distúrbios congênitos, anemia relacionada à Aids, e anemia associada à prematuridade, podem ser tratados com EPO. Adicio- nalmente, EPO pode desempenhar um papel em outras áreas, tais como ajuda a restabelecer mais rapidamente um hematócrito normal em pacientes de transplante de medula óssea, em pacientes que se preparam para trans- fusões autólogas de sangue, e em pacientes que sofrem de distúrbios de excesso de ferro.
Eritropoietina (EPO) é um hormônio glicoproteico composto de 165 aminoácidos e quatro cadeias de carboidratos, que funciona como regu- lador primário da eritropoiese através da ligação a um receptor específico na superfície de células precursoras dos eritrócitos. Essa ligação sinaliza sua proliferação e diferenciação em células sangüíneas vermelhas maduras. O receptor da eritropoietina é uma glicoproteína de 484 aminoáci- dos com a alta afinidade por eritropoietina. Para o receptor da eritropoietina, homodimerização induzida pelo Iigante pode ser um dos eventos-chave que governa a ativação.
Eritropoietina tem uma meia-vida relativamente curta. Eritropoie-
tina administrada intravenosamente é eliminada em uma velocidade compa- tível com a cinética de primeira ordem com uma meia-vida de circulação va- riando de aproximadamente 3 a 4 horas em pacientes com CRF. Dentro da faixa da dose terapêutica, os níveis detectáveis de eritropoietina plasmática são mantidos durante pelo menos 24 horas. Após administração subcutânea de eritropoietina, os níveis séricos máximos são alcançados dentro de 5 a 24 horas e declinam lentamente após isso.
O mercado do manejo da anemia é dominado por agentes esti- mulantes da eritropoiese (ESAs) que visam o receptor do fator de crescimen- to eritropoietina (EPO), que estimula a produção das células vermelhas do sangue. EPOs recombinantes epoetina-alfa (Epogen; Amgen e Pro- crit/Eprex; Johnson & Johnson) e epoetina-beta (NeoRecormon/Eprex; Ro- che) estiveram no mercado por muitos anos.
Darbepoetina de Amgen (Aranesp) é uma variante da EPO hi- perglicosilada (resultante de duas substituições de aminoácido) e tem uma meia-vida mais longa comparada com epoetina, que permite a darbepoetina manter níveis alvo de hemoglobina com dosagem menos freqüente (uma vez a cada 3 a 4 semanas com darbepoetina contra uma vez por semana com epoetina). Epoetina pegilada da Roche CERA (ativador do receptor contínuo de eritropoiese) está passando por testes clínicos e também tem uma meia- vida mais longa do que EPO. Hematida compreende um peptídeo dimérico, não relacionado em seqüência a outra EPO natural ou comercializada, que se liga ao receptor da EPO e estimula a eritropoiese.
Pequenos peptidomiméticos de eritropoietina foram identificados por vários grupos através da triagem de bibliotecas randômicas de peptídeo expostos em fago para afinidade ao receptor da eritropoietina. Estas se- qüências não têm nenhuma homologia com a eritropoietina. Em ensaios fun- cionais vários destes peptídeos mostraram atividade, mas só 1/100.000° a- quele do recombinante eritropoietina. Embora tenham sido feitas várias ten- tativas para aumentar a potência destes peptídeos através da preparação de dímeros ou multímeros covalentes de peptidomiméticos, estes compostos podem ser 1.000 a 10.000 vezes menos ativos do que a eritropoietina em uma base molar e têm meias-vidas muito curtas que os faz não adequados para o uso terapêutico.
Vários agonistas do receptor da EPO estão atualmente em de- senvolvimento para anemia, CHF e outras indicações: Fármaco Companhia Indicação Situação
Eritropoietinas
Darbepoetina-alfa (Aranesp) Amgen Anemia relacionada ao câncer Fase Ill
Falência cardíaca congestiva Fase Il
CERA (ativador do receptor contínuo da eritropoiese) Roche CKD BLA arquivado
CIA Fase Ill
NE-180 (GIicoPEGEritro-
poietina) Neose CKD, CIA Fase I
EPO-Fc Syntonix CKD1 CIA Fase I
AMG 114 (análogo hipergli-
cosilado da darbepoetina) Amgen CIA Fase I
Agonista sintético do receptor da eritropoietina
Hematida Affymax/ *CKD, CIA, anemia em
Takeda pacientes com PRCA Fase Il
Reposição de eritropoietina
FG-2216 FibroGen CKD1CIA Fasell
FG-4592 FibroGen Anemia devido à deficiência
no processamento de ferro Fase I (CIA, anemia induzida pela quimioterapia; CKD, doença renal crônica; PEG, polietileno gli- col; PRCA, aplasia pura de células vermelhas)
Entretanto, há uma necessidade de fornecer novos usos para os agonistas do receptor da EPO1 que superam mais um destes e outros pro- blemas conhecidos na técnica e encontrar novas indicações e tratamentos. Sumário da Invenção
A presente invenção fornece agonistas do EPOR humana, inclu- indo pequenas moléculas agonistas, peptídeos ou proteínas agonistas, anti- corpos agonistas ou imunoglobulinas modificadas, produtos de clivagem e outras porções especificadas e variantes das mesmas, e ácido nucleico, ve- tores e células hospedeiras que codificam os mesmos, bem como composi- ções, formulações, terapias combinadas e similares agonistas do EPOR, ácidos nucleicos de codificação ou complementares, vetores, células hospe- deiras, composições, formulações, dispositivos, e métodos de composição e utilização dos mesmos, para prevenção ou tratamento da intolerância à gli- cose e condições relacionadas, e/ou anemia associada à doença renal, co- mo descrito e/ou permitido neste pedido, em combinação com o que é co- nhecido na técnica.
A presente invenção também fornece composições, métodos e
dispositivos para prevenção ou tratamento de intolerância à glicose e/ou a- nemia associada à doença renal, usando pelo menos um agonista do recep- tor isolado da EPO (EPOR) ou porção especificada ou variante como descri- ta neste pedido e/ou como conhecido na técnica. Os agonistas da EPOR são bem conhecidos na técnica e inclu-
em, mas não são limitados a, agonista da EPO ou do EPOR (ou agonistas que têm efeito de ativar EPOR, por exemplo, HIF): peptídeos, proteínas, compostos químicos ou pequenas moléculas e similares, e ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras que codificam tais peptídeos ou proteínas, tais como, mas não limitado a EPO, EPO modificada, proteína da EPO e peque- nas moléculas miméticas, anticorpos agonistas da EPO ou do EPOR ou fragmentos ou fusões dos mesmos.
A presente invenção também fornece pelo menos uma composi- ção para prevenção ou tratamento de intolerância à glicose e/ou anemia as- sociada à doença renal, compreendendo (a) pelo menos um agonista isolado do EPOR; e (b) um veículo ou diluente adequados. Veículo ou diluente po- dem opcionalmente ser farmaceuticamente aceitáveis, de acordo com méto- dos conhecidos. A composição pode opcionalmente compreender ainda pelo menos um composto, proteína ou composição adicionais.
A presente invenção fornece ainda pelo menos um agonista, porção especificada ou variante do EPOR em um método ou composição, quando administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz, para a modulação, para tratamento ou redução dos sintomas de pelo menos intole- rância à glicose e/ou anemia associada à doença renal. (Vide, por exemplo, The Merck Manual, 17th ed., Merck Research Laboratories, Merck and Co., Whitehouse Station, NJ (1999), inteiramente incorporada neste pedido por referência), como necessário em muitas condições diferentes, tal como, mas não limitado a, antes de, subsequente a, ou durante uma doença relaciona- da ou condição de tratamento, como conhecido na técnica.
A presente invenção também fornece pelo menos uma composi- ção, método e/ou dispositivo de distribuição de uma quantidade terapeuti- camente ou profilaticamente eficaz de pelo menos um agonista ou porção especificada ou variante do EPOR, de acordo com a presente invenção, pa- ra prevenção ou tratamento de intolerância à glicose e/ou anemia associada à doença renal.
A presente invenção também fornece pelo menos uma composi- ção compreendendo (a) um agonista isolado da EPOR codificado por ácido nucleico e/ou agonista do EPOR como descrito neste pedido; e (b) veículo ou diluente adequados, para prevenção ou tratamento de intolerância à gli- cose e/ou anemia associada à doença renal. O veículo ou diluente podem opcionalmente ser farmaceuticamente aceitáveis, de acordo com veículos ou diluentes conhecidos. A composição pode compreender opcionalmente ain- da pelo menos um composto, proteína ou composição adicionais.
É também fornecida uma composição compreendendo pelo me- nos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO humana isolada e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição pode ainda compreender opcionalmente uma quantidade efi- caz de pelo menos um composto ou proteína selecionada a partir de pelo menos um marcador ou relato detectável, um fármaco anti-infeccioso, um fármaco relacionado à intolerância à glicose, um fármaco relacionado à anemia renal, um fármaco para trato gastrointestinal (Gl), um fármaco hor- monal, um fármaco para equilíbrio de fluido ou eletrolítico, um fármaco he- matológico, um antagonista do TNF alfa, um relaxante muscular, um narcóti- co, um fármaco anti-inflamatório não-esteroidal (NTHE), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscu- lar, um antimicrobiano, um antipsoriático, um corticosteroide, um esteroide anabólico, um modulador de glicose, uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, um hormônio do crescimento, um fármaco para repo- sição hormonal, um medicamento radiofarmacêutico, um antidepressivo, um antipsicótico, um estimulante, uma medicação para asma, um agonista beta, um esteroide inalável, uma epinefrina ou análogo, uma citocina, ou um anta- gonista de citocina.
Também é fornecido um método para diagnóstico, prevenção ou tratamento de intolerância à glicose e/ou anemia associada à doença renal em uma célula, tecido, órgão ou animal, compreendendo
(a) contato ou administração de uma composição compreen- dendo uma quantidade eficaz de pelo menos um agonista do EPOR com, ou para a, célula, tecido, órgão ou animal. O método pode ainda compreender opcionalmente a utilização de uma quantidade eficaz de 0,00001 a 500 mg/kg para células, tecido, órgão ou animal. O método pode ainda compre- ender opcionalmente a utilização de contato ou administração através de pelo menos um modo selecionado de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, in- tracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricu- lar, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraósseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intra- prostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmico.
A presente invenção fornece ainda qualquer invenção descrita neste pedido. Descrição das Figuras
Figura 1A-B. Camundongos diabéticos (db/db) foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) ou o controle negativo MMB (desprovido de um peptídeo). A. Um IPGTT foi feito 10 minutos após o tra- tamento. B. Um IPGTT foi feito 7 dias após o tratamento.
Figura 2A-B. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) ou o controle negativo MMB (desprovido de um peptídeo). A. Um IPGTT foi feito 10 minutos após o tra- tamento. B. Um IPGTT foi feito 7 dias após o tratamento. Figura 3. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via
intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) ou o controle negativo MMB (des- provido de um peptídeo). Sete dias após o tratamento, os animais foram sa- crificados e sangrados.
Figura 4A-F. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) ou PBS. IPGTTs foram feitos a- pós 10 minutos (A) 7 dias (B), 14 dias (C), 21 dias (D), 28 dias (E), 35 dias (F).
Figura 5A-C. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) ou PBS. Os animais foram sacri- ficados depois de diversos tempos e sangue foi coletado para medições he- matológicas. Os níveis de hemoglobina são mostrados A. 21 dias B. 28 dias e C. 35 dias após o tratamento.
Figura 6A-C. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) ou PBS. Os animais foram sacri- ficados depois de diversos tempos e sangue foi coletado para medições de insulina. Os níveis de insulina circulante são mostrados A. 21 dias B. 28 dias e C. 35 dias após o tratamento.
Figura 7A-B. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com EPO (0,03, 0,1, 0,3 mg/kg) ou PBS. IPGTTs foram feitos dias depois. (A) níveis de Glicose em todas as partes do IPGTT (B) Área sob a curva de A.
Figura 8A-B. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com EPO (0,03, 0,1, 0,3 mg/kg) ou PBS (A) Hemoglobina e (B) Reticulócitos foram medidos cinco dias depois.
Figura 9A-B. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com darbepoetina(0,01, 0,03, 0,1 mg/kg) ou PBS. IPGTTs foram feitos 7 dias depois. (A) níveis de Glicose em todas as partes do IPGTT(B)AreasobacurvadeA.
Figura 10. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com darbepoetina (0,01, 0,03, 0,1 mg/kg) ou PBS. A glicose sangüínea em jejum foi medida 7 dias depois.
Figura 11A-B. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com darbepoetina (0,03, 0,1, 0,3 mg/kg) ou PBS (A) Hemo- globina e (B) Reticulócitos foram medidos sete dias depois.
Figura 12. Glicose sangüínea de camundongos em jejum de tipo selvagem (camundongos C57BI6) ou camundongos transgênicos (heterozi- gotos ou homozigotos) superexpressando EPO humana. Figura 13. GTT em camundongos de tipo selvagem (camundon-
gos C57BI6) ou transgênicos (heterozigotos ou homozigotos) superexpres- sando EPO humana.
Figura 14A-B. Camundongos diabéticos (DIO) foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) ou PBS. Glicose (A) e níveis de insulina (B) foram medidos após jejum durante a noite e 20 minutos depois de um desafio com glicose.
Figura 15. Os níveis de glicose de jejum e de insulina mostrados na figura 14 foram usados para calcular HOMA.
Figura 16. Efeito da administração da EPO na Hemoglobina em pacientes com HbAIC referência acima de 6,0
Figura 17. Efeito da administração da EPO na Hemoglobina A1C em pacientes com HbAIC referência acima de 6,0
Figura 18. Efeito da administração da EPO na glicose sangüínea em jejum em pacientes com HbAIC referência acima de 6,0. Figura 19: Efeito da administração da EPO nos níveis de HbAIC
com base nas diferenças do nível de HbAIC referência acima de 6.
Figura 20: Efeitos da administração da EPO e níveis de HbAIC referência nos níveis de HbAIC dei a 2 e de 4 a 6 meses (dados longitudi- nais)
Figura 21: Efeito da EPO nos níveis de glicose sangüínea no jejum 1 a 2 e 4 a 6 meses em pacientes para os quais dados estavam dispo- níveis uma linha de base de t (2 meses antes da administração da EPO) e em seções de tempo subsequentes (1 a 3 meses e 4 a 6 meses). Descrição da Invenção
A presente invenção relaciona-se a pelo menos um método ago- nista do receptor da EPO humana para prevenção ou tratamento da intole- rância à glicose e/ou anemia associada à doença renal, incluindo composi- ções terapêuticas, métodos e dispositivos.
Os agonistas do EPOR são bem conhecidos na técnica e inclu- em, mas não são limitados a, agonista da EPO ou do EPOR (ou agonistas que têm o efeito de ativar EPOR, por exemplo, HIF): peptídeos, proteínas, compostos químicos ou pequenas moléculas e similares, tais como, mas não limitado a, EPO, EPO modificado, proteína da EPO e pequenas moléculas miméticas, anticorpos agonistas da EPO ou do EPOR ou fragmentos ou fu- sões dos mesmos.
Exemplos não-limitantes de como fazer e usar os agonistas do EPOR, são fornecidos pelas publicações PCT listadas que relacionam-se a isso na tabela seguinte, publicações as quais são inteiramente incorporadas neste pedido por referência, como mostram o estado da técnica de como fazer e usar os agonistas do receptor da EPO para métodos e tratamentos da presente invenção. Exemplos não-limitantes de agonistas do receptor da EPO, conhecidos na técnica incluem EPO, fragmentos ativos e miméticos da mesma e agonista químico do receptor da EPO, que também são revelados nas publicações seguintes que são inteiramente incorporadas neste pedido por referência:
Publicação de PCT Título W09818926A1 Agonistas do Receptor da Eritropoietina Permutado Circu- Iarmente
W006017772A1 Formulações de Suspensão Estável de Agonistas do Re- ceptor da Eritropoietina
W006017773A1 Formulações de Partícula Estável de Agonistas do Recep- tor da Eritropoietina
W005025606A1 Eritropoietinas de Longa Atuação Que Mantêm Atividade Protetora de Tecido da Eritropoietina Endógena
W004022577A2 Eritropoietinas de Longa Atuação Que Mantêm Atividade Protetora de Tecido da Eritropoietina Endógena
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W005063808A1 PROTEÍNA DE FUSÃO de Fc À ERITROPOIETINA COM FARMACOCINÉTICA MELHORADA W005051327A2 Eritropoietina Glicopegilada
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W09905268A1 Produção de Eritropoietina através da Ativação Gênica En- dógena
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Eritropoietinas
Darbepoetina-alfa (Aranesp) Amgen Anemia relacionada ao câncer Faselll
Falência cardíaca congestiva Fase Il
CERA (ativador do receptor contínuo da eritropoiese)
Roche
CKD CIA
BLA arquivado Fase Ill
NE-180 (GlicoPEGE
ritropoietina) Neose CKD, CIA Fase I
EPO-Fc Syntonix CKD, CIA Fase I
AMG 114 (análogo hiper-
glicosilado da darbepoetina) Amgen CIA Fase I
Agonista sintético do receptor da eritropoietina
Hematida Affymax/ *CKD, CIA, anemia em
Takeda pacientes com PRCA Fase Il
Repositores de eritropoietina
FG-2216 FibroGen CKD, CIA Fase Il
FG-4592 FibroGen Anemia devido à deficiência
no processamento de ferro Fase I (CIA, anemia induzida pela quimioterapia; CKD, doença renal crônica; PEG, polietileno gli- col; PRCA, aplasia pura de células vermelhas) Outros antagonistas do receptor da EPO da presente invenção incluem a proteína de fusão a anticorpo contendo peptídeos do agonista do receptor da EPO , algum dos quais pode ser usado de acordo com a presen- te invenção. Exemplos não Iimitantes incluem corpos miméticos da EPO co- mo revelados no Pedido de Patente U. S. Nos 10/609.783, depositado em 30 de junho de 2003 e 10/935.005, depositado em 3 de setembro de 2004, cada um inteiramente incorporado neste pedido por referência. Outro exemplo não-limitante de um agonista do EPOR que pode ser usado nos métodos da presente invenção, a presente invenção também fornece pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO isolado ou porção específica ou variante como descrito neste pedido e/ou como conhecido na técnica. O corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO pode compreender opcionalmente pelo menos uma região CH3 diretamente ligada com pelo menos uma região CH2 diretamente ligada com pelo menos uma região de articulação ou fragmento da mesma (H), diretamente ligado com uma seqüência Iigadora opcional (L)1 diretamente ligada a pelo menos um peptídeo terapêutico (P), opcionalmente ainda diretamente ligado com pelo menos uma porção de pelo menos uma seqüência variável de anticorpo (V).
Em uma modalidade preferencial um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO compreende a fórmula (I):
((V(m)-P(n)-L(o)-H(p)-CH2(q)-CH3(r))(s),
onde V é pelo menos uma porção de um N-terminal de uma região variável da imunoglobulina, P é pelo menos um peptídeo bioativo, L é o polipeptídeo que fornece flexibilidade estrutural permitindo que o corpo mimético tenha orientações alternativas e propriedades de ligação, H é pelo menos uma porção de uma região de articulação variável da imunoglobulina, CH2 é pelo menos uma porção de uma região constante CH2 da imunoglobulina, CH3 é pelo menos uma porção de uma região constante CH3 da imunoglobulina, m, n, o, p, q, r, e s podem ser independentemente um número inteiro entre 0, 1 ou 2 e 10, imitando tipos diferentes de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, mas não limitado a, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 IgM1 IgD1 IgE, e similares, ou combinação das mesmas. O monômero onde m=1 pode ser ligado a outros monômeros através de associação ou ligação covalente, tais como, mas não limitado a, uma ligação dissulfeto Cys-Cys ou outra sequên- cia de imunoglobulina. Corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO da presente invenção imita uma estrutura de anticorpo com suas pro- priedades e funções inerentes, as quais fornecem um peptídeo terapêutico e suas propriedades ou atividades inerentes ou adquiridas in vitro, in vivo ou in situ. As diversas porções do anticorpo e as porções terapêuticas do peptídeo de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO da presente invenção podem variar como descrito neste pedido em combinação com o que é conhecido na técnica.
Como usado neste pedido, um "corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO," "porção de corpos miméticos de núcleo de articulação mimética da EPO", ou "fragmento de corpos miméticos de núcleo de articulação mimética da EPO" e/ou " variante de corpos miméticos de nú- cleo de articulação mimética da EPO" e similares mimetizam, tem ou simu- lam pelo menos uma ligação ao Iigante ou pelo menos atividade biológica de pelo menos uma proteína, tal como ligação ao Iigante ou atividade in vitro, in situ e/ou preferencialmente in vivo, tal como mas não limitado a pelo menos uma das SEQ ID NoS:1 a 30. Por exemplo, um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO adequado, porção específica ou variante da presente invenção pode ligar pelo menos um Iigante de proteína e inclui pelo menos um Iigante de proteína, receptor, receptor solúvel, e similares. Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO adequado, a por- ção especificada, ou variante também pode modular, aumentar, modificar, ativar, pelo menos uma sinalização de receptor de proteína ou outra ativida- de mensurável ou detectável.
Corpos miméticos úteis nos métodos e as composições da pre- sente invenção são caracterizados pela afinidade de ligação adequada a Iigantes de proteína ou receptores e opcionalmente e preferencialmente têm baixa toxicidade. Em particular, um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO, onde os componentes individuais, tais como a porção da região variável, região constante (sem uma porção CH1) e estrutura, ou qualquer porção dos mesmos (por exemplo, uma porção das regiões J, D ou V da cadeia variável pesada ou leve; pelo menos uma porção de pelo menos uma região de articulação de cadeia pesada constante ou cadeia leve, e si- milares) individualmente e/ou coletivamente opcionalmente e preferencial- mente possui imunogenicidade baixa, é útil na presente invenção. Os corpos miméticos que podem ser usados na invenção são opcionalmente caracteri- zados pela sua capacidade de tratar pacientes durante períodos extensos com bom a excelente alívio de sintomas e toxicidade baixa. Baixa imunoge- nicidade e/ou alta afinidade, bem como outras propriedades não definidas, podem contribuir para os resultados terapêuticos alcançados. "Baixa imuno- genicidade" é definida neste pedido como causadora de respostas HAMA, HACA ou HAHA significantes, em menos de aproximadamente 75%, ou pre- ferencialmente menos de aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 35, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, e/ou 1% dos pacientes tratados e/ou que causa bai- xa titulação no paciente tratado (menos de aproximadamente 300, preferen- cialmente menos de aproximadamente 100 medido com um imunoensaio com duplo antígeno enzimático) (vide, por exemplo, Elliott et ai, Lancet 344:1125-1127 (1994)). Utilidade
Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser usados para a produção de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO, fragmento ou variantes específicas dos mes- mos, que podem ser usados (ou a codificação de DNA) para efetuar em uma célula, tecido, órgão ou animal (incluindo mamíferos e seres humanos), para modular, tratar, aliviar, ajudar a prevenir a incidência de, ou reduzir os sinto- mas de, pelo menos uma condição, selecionada de, mas não limitada a, pelo menos intolerância à glicose e/ou anemia associada à doença renal, bem como outras conhecidas ou relacionadas condições relacionadas à proteína especificada.
Tal método pode compreender a administração de uma quanti- dade eficaz de uma composição ou uma composição farmacêutica compreen- dendo pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou porção especificada ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção, ou redução de sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode com- preender uma quantidade de aproximadamente 0,0001 a 500 mg/kg por admi- nistração única ou múltipla, ou para atingir uma concentração sérica de 0,0001 a 5000 Mg/ml por administração única ou múltipla, ou qualquer faixa ou valor eficaz nesse pedido, como feito e determinado usando métodos conhecidos, como descrito neste pedido ou conhecido nas técnicas relevantes. Citações
Todas as publicações ou patentes citadas neste pedido são in- teiramente incorporadas neste pedido por referência como mostram o estado da técnica no momento da presente invenção e/ou fornecer a descrição e capacidade da presente invenção. Publicações referem-se a qualquer publi- cação científica ou patente, ou qualquer outra informação disponível em qualquer formato de meios, incluindo todos os formatos registrados, eletrôni- cos ou impressos. As referências seguintes são inteiramente incorporadas neste pedido por referência: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecu- lar Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2006); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2η<^ Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2006); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2006).
Corpos miméticos ou agonistas do receptor da EPO da Presente Invenção
O corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO pode compreender opcionalmente pelo menos uma região CH3 diretamente ligada com pelo menos uma região CH2 diretamente ligada com pelo menos uma porção de pelo menos um fragmento de região de articulação (H), tal como compreendendo pelo menos uma região de articulação principal, dire- tamente ligada com uma seqüência Iigadora opcional (L), diretamente ligada a pelo menos um peptídeo terapêutico (P)1 ainda opcionalmente diretamente ligado com pelo menos uma porção de pelo menos uma seqüência variável de anticorpo (V). Em uma modalidade preferencial um par de um CH3-CH2- H-L-V1 o par ligado por associação ou ligação covalente. Dessa forma, um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO da presente in- venção mimetiza uma estrutura de anticorpo com suas propriedades e fun- ções inerentes, fornecendo um peptídeo terapêutico e suas propriedades ou atividades inerentes ou adquiridas in vitro, in vivo ou in situ. As várias por- ções do anticorpo e as porções peptídicas terapêuticas de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO da presente in- venção podem variar como descrito neste pedido em combinação com o que é conhecido na técnica.
Corpos miméticos da presente invenção dessa forma fornecem pelo menos uma propriedade adequada quando comparadas com as proteí- nas conhecidas, tais como, mas não limitadas, pelo menos a uma meia-vida aumentada, atividade aumentada, atividade mais específica, aumento da avidez, aumento ou diminuição de velocidade, um subconjunto selecionado ou mais adequado de atividades, menos imunogenicidade, aumento da qua- lidade ou da duração de pelo menos um efeito terapêutico desejado, menos efeitos colaterais, e similares.
Fragmentos de corpos miméticos de acordo com a Fórmula (I) podem ser produzidos através de clivagem enzimática, técnicas de síntese ou recombinação, como conhecidas na técnica e/ou como descrito neste pedido. Corpos miméticos também podem ser produzidos em várias formas truncadas usando genes de anticorpo nos quais um ou mais códons de pa- rada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. As várias porções de corpos miméticos podem ser quimicamente reunidas em conjun- to por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua usando técnicas de engenharia genética. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica pelo menos uma das regiões constantes de uma ca- deia de anticorpo humano pode ser expresso para produzir uma proteína contígua para uso em corpos miméticos da presente invenção. Vide, por e- xemplo, Ladner et al, Patente U.S. N0 4,946,778 e Bird, R.E. et al, Science, 242: 423-426 (1988), quanto a anticorpos de cadeia única.
Como usado neste pedido, o termo "corpo mimético humano" re- fere-se a um anticorpo no qual se espera substancialmente que cada parte da proteína (por exemplo, peptídeo mimético EPO, estrutura, domínios de CL, Ch (por exemplo, CH2, CH3), articulação, (VL, Vh)) seja substancialmente não-imunogênica em humanos com modificações ou variações de seqüência somente sem importância. Tais modificações ou variações opcionalmente e preferencialmente conservam ou reduzem a imunogenicidade em humanos em relação a anticorpos humanos não-modificados, ou corpos miméticos da presente invenção. Dessa forma, um anticorpo humano e corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO correspondente da presente inven- ção é distinto de um anticorpo quimérico ou humanizado. Foi indicado que um anticorpo humano e corpos miméticos de núcleo de articulação mimética da EPO podem ser produzidos por um animal ou célula não-humana que é capaz de expressar genes de imunoglobulinas humanas (por exemplo, ca- deia pesada e/ou cadeia leve).
Em uma modalidade preferencial, pelo menos um corpo miméti- co de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção é produzi- do por pelo menos uma linhagem celular, linhagem celular misturada, células imortalizadas ou a população clonal de células imortalizadas e/ou cultivadas. As células imortalizadas para produção de proteína podem ser produzidas usando métodos adequados. Preferencialmente, pelo menos um corpo mi- mético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do re- ceptor da EPO ou porção especificada ou variante é gerado através do for- necimento de ácido nucleico ou vetores compreendendo derivado de DNA ou que têm uma seqüência substancialmente similar a, pelo menos um Iocus da imunoglobulina humana que é funcionalmente rearranjado, ou que pode sofrer o rearranjo funcional, e que ainda compreende uma estrutura de corpo mimético como descrito neste pedido, por exemplo, mas não limitado à Fór- mula (I), em que as porções das regiões variáveis C- e N-terminal podem ser usadas para V, regiões de articulação de H, CH2 de CH2 e CH3 de CH3, como conhecido na técnica. Moléculas de Ácido Nucleico
Utilizando a informação fornecida neste pedido e o que é conhe- cido na técnica, tal como a codificação de seqüências de nucleotídeos para vários peptídeos ou proteínas agonistas do EPO R, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção que codifica pelo menos um agonista do EPO R pode ser obtida usando métodos descritos neste pedido ou como conheci- do na técnica.
As moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem es-
tar na forma de RNA1 tal como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra for- ma, ou na forma de DNA1 incluindo, mas não limitadas a, cDNA e DNA ge- nômico obtido através de clonagem ou produzido sinteticamente, ou qual- quer combinação dos mesmos. O DNA pode ser de tripla fita, dupla fita ou de fita simples, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer porção de pelo menos uma fita de DNA ou RNA pode ser a fita de codificação, também conhecida como a fita senso, ou pode ser a fita de não-codificação, também tratada como a fita antissenso.
As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de leitura aberta (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, moléculas de ácido nucleico compreendendo a seqüência de codificação de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante; e moléculas de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos substancialmente diferente dos descritos acima, mas que devido à degeneração do código ge- nético, ainda codificam pelo menos um corpo mimético de núcleo de articu- lação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO como descrito neste pedido e/ou como conhecido na técnica. Naturalmente, o código gené- tico é bem conhecido na técnica. Dessa forma, seria rotineiro para um ver- sado na técnica gerar tais variantes de ácidos nucleicos degenerados que codificam para corpo mimético de núcleo de articulação mimética para EPO específico ou outro agonista do receptor da EPO1 ou porção especificada ou variantes da presente invenção. Vide, por exemplo, Ausubel, et al. supra, e tais variantes de ácidos nucleicos estão incluídos na presente invenção.
Como indicado neste pedido, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção compreendendo um ácido nucleico que codifica um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante podem incluir, mas não são limitadas a, as que codificam a seqüência de aminoácidos de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro fragmento de agonista do receptor da EPO, por si mesmo; a seqüência de codificação do corpo mimético de núcleo de articulação mimética EPO inteiro ou outro ago- nista do receptor da EPO ou porção dos mesmos; a seqüência de codifica- ção de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO, fragmento ou porção, bem como se- quências adicionais, tais como a seqüência de codificação de pelo menos um peptídeo sinal líder ou de fusão, com ou sem as seqüências de codifica- ção adicionais acima mencionadas, tais como pelo menos um íntron, em conjunto com seqüências adicionais, seqüências não-codificantes, incluindo mas não limitadas a, seqüências não-codificantes 5' e 3', tais como as se- quências transcritas, não-traduzidas que desempenham um papel na trans- crição, processamento do mRNA, incluindo splicing e sinais de poliadenila- ção (por exemplo, ligação de ribossomo e estabilidade do mRNA); uma se- qüência de codificação adicional que codifica aminoácidos adicionais, tais como aqueles que fornecem funcionalidades adicionais. Dessa forma, a se- quência que codifica um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante pode ser fusionada a uma seqüência marcadora, tal como uma se- qüência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do corpo miméti- co de núcleo de articulação mimética EPO fundido ou outro agonista do re- ceptor da EPO ou porção especificada ou variante compreendendo um cor- po mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro fragmento ou porção do agonista do receptor da EPO. Polinucleotídeos que Hibridizam Seletivamente a um Polinucleotídeo como Descrito Neste Pedido
A presente invenção fornece ácidos nucleicos isolados que hi- bridizam sob condições de hibridização seletivas a um polinucleotídeo reve- lado neste pedido, ou outros revelados neste pedido, incluindo porções ou variantes especificadas dos mesmos. Dessa forma, os polinucleotídeos des- ta modalidade podem ser usados para isolamento, detecção e/ou quantifica- ção de ácidos nucleicos compreendendo tais polinucleotídeos.
Condições de hibridização de estringência baixa ou moderada são tipicamente, mas não exclusivamente, empregadas com seqüências que têm uma identidade de seqüência reduzida em relação às seqüências com- plementares. Condições de estringência moderada e alta podem ser opcio- nalmente empregadas para seqüências de maior identidade. As condições de estringência baixa permitem hibridização seletiva de seqüências que têm identidade de seqüência de aproximadamente 40 a 99% e podem ser em- pregadas para identificar seqüências ortólogas ou parálogas.
Opcionalmente, os polinucleotídeos desta invenção codificarão pelo menos uma porção de um corpo mimético de núcleo de articulação mi- mética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especifica- da ou variante codificada pelos polinucleotídeos descritos neste pedido. Os polinucleotídeos desta invenção incluem seqüências de ácidos nucleicos que podem ser empregadas para hibridização seletiva a um polinucleotídeo que codifica um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção. Vide, por exemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, cada um inteiramente incorporado neste pedido por referência. Construção de Ácidos nucleicos
Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser feitos usando (a) métodos de recombinação, (b) técnicas de síntese, (c) téc- nicas de purificação, ou combinações dos mesmos, como bem conhecido na técnica.
Os ácidos nucleicos podem compreender convenientemente se- quências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de clonagem múltipla compreendendo um ou mais sítios de restri- ção para endonuclease podem ser inseridos no ácido nucleico para ajudar no isolamento do polinucleotídeo. Além disso, seqüências traduzíveis podem ser inseridas para ajudar no isolamento do polinucleotídeo traduzido da pre- sente invenção. Por exemplo, uma seqüência marcador hexa-histidina forne- ce um meio adequado de purificar a proteína da presente invenção. O ácido nucleico da presente invenção - excluindo a seqüência de codifica- ção - é opcionalmente um vetor, adaptador, ou Iigador para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção.
Seqüências adicionais podem ser adicionadas a tais seqüências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função na clonagem e/ou expressão, ajudar no isolamento do polinucleotídeo, ou melhorar a introdu- ção do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clonagem, veto- res de expressão, adaptadores e Iigadores é bem conhecido na técnica. Vi- de, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra. Métodos de Recombinacão para Construção de Ácidos Nucleicos
As composições de ácido nucléico isoladas desta invenção, tais como RNA, cDNA, DNA genômico, ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas que usam qualquer número de metodologias de clonagem conhecidas por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, sondas de oligonucleotídeos que hibridizam sele- tivamente aos polinucleotídeos da presente invenção, sob condições de es- tringência adequadas, são usados para identificar a seqüência desejada em uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA, e a cons- trução de bibliotecas cDNA e genômicas, são bem conhecidos para aqueles versados na técnica ordinária. (Vide, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sam- brook, supra).
Métodos Sintéticos para Construção de Ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção também po-
dem ser preparados através da síntese química direta por métodos conheci- dos (vide, por exemplo, Ausubel, et al., supra). A síntese química geralmente produz um oligonucleotídeo de fita simples, que pode ser convertido em DNA de dupla fita através da hibridização com uma seqüência complemen- tar, ou pela polimerização com uma DNA polimerase utilizando a fita única como um molde. Um versado na técnica reconhecerá que enquanto a sínte- se química do DNA pode ser limitada a seqüências de aproximadamente 100 ou mais bases, as seqüências mais longas podem ser obtidas através da ligação de seqüências mais curtas. Cassetes de Expressão Recombinante
A presente invenção fornece ainda cassetes de expressão re- combinante compreendendo um ácido nucleico da presente invenção. Uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção, por exemplo, uma se- qüência de cDNA ou genômica que codifica um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou por- ção especificada ou variante da presente invenção, pode ser usada para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introduzido em pelo menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante compreenderá tipicamente um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a seqüências reguladoras da iniciação transcricional que dirigirão a transcrição do polinucleotídeo na célula hospe- deira desejada. Tanto promotores heterólogos como não-heterólogos (isto é, endógenos) podem ser empregados para dirigir a expressão dos ácidos nu- cleicos da presente invenção.
Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos isolados que ser- vem como promotores, potencializadores, ou outros elementos podem ser introduzidos na posição apropriada (a montante, a jusante ou em íntron) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção de modo regular para cima ou para baixo a expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, promotores endógenos podem ser altera- dos in vivo ou in vitro através de mutação, deleção e/ou substituição, como conhecido na técnica. Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser expresso na orientação senso ou antissenso como desejado. Será apreciado que o controle da expressão gênica na orientação senso ou antissenso pode ter um impacto direto nas características observáveis. Outro método de su- pressão é a supressão senso. Mostrou-se que a introdução de ácido nuclei- co configurado na orientação senso é um meio eficaz pelo qual é bloqueada a transcrição de genes alvo.
Vetores e Células Hospedeiras
A presente invenção também se relaciona a vetores que incluem moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção, células hospe- deiras que são geneticamente projetadas com os vetores de recombinação, e a produção de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especifi- cada ou variante por técnicas de recombinação, como é bem conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra, cada um inteiramente incorporado neste pedido por referência.
Os polinucleotídeos podem ser opcionalmente reunidos a um ve- tor contendo um marcador selecionável da propagação em um hospedeiro. Geralmente, um vetor plasmidial é introduzido em uma célula usando méto- dos adequados conhecidos, tais como eletroporação e similares, outros mé- todos conhecidos incluem o uso do vetor como um precipitado, tal como um fosfato de cálcio precipitado, ou em um complexo com um lipídio carregado. Se o vetor for um vírus, pode ser empacotado in vitro utilizando uma linha- gem celular de empacotamento apropriado e então transduzidas em células hospedeiras.
O inserto de DNA deve ser operacionalmente ligado a um pro- motor apropriado. Os construtos de expressão conterão ainda opcionalmen- te pelo menos sítios de iniciação de transcrição, terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação a ribossomo para tradução. A porção de codifi- cação dos transcritos maduros expressa pelos construtos incluirá preferenci- almente um códon de iniciação de tradução no começo e um de terminação (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado no fim do mRNA a ser traduzido, com UAA e UAG preferencial para a expressão de célula de mamífero ou eucariótica.
Os vetores de expressão incluirão preferencialmente, mas op- cionalmente pelo menos, um marcador selecionável. Tais marcadores inclu- em, por exemplo, mas não limitados a, metotrexato (MTX), di-hidrofolato re- dutase (DHFR, Patente U. S. Nos 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, ampicilina, neomicina (G418), ácido mico- fenólico, ou glutamina sintetase (GS, Patente U. S. Nos 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) genes de resistência para cultura de célula eucarióti- ca, e de resistência à ampicilina ou tetraciclina para cultivo em E. coli e ou- tras bactérias ou procariotas (as patentes acima mencionadas são inteira- mente incorporadas neste pedido por referência). Os meios de cultura apro- priados e as condições acima mencionadas para células hospedeiras descri- tas são conhecidas na técnica. Os vetores adequados serão prontamente evidentes para o técnico versado. A introdução de um construto de vetor em uma célula hospedeira pode ser efetuada através da transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção mediada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, tal como Sambrook, su- pra, Chapters 1-4e 16-18; Ausubel, supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16.
Pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação miméti- ca da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção pode ser expresso em uma forma modificada, tal como uma proteína de fusão, e pode incluir não somente sinais de secre- ção, mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carre- gados, pode ser adicionada ao N-terminal de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante para melhorar a estabilidade e a persistên- cia na célula hospedeira, durante a purificação, ou durante manejo subse- quente e armazenamento. Além disso, porções peptídicas podem ser adicio- nadas a um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser remo- vidas antes da preparação final de um corpo mimético de núcleo de articula- ção mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou pelo menos um fragmento das mesmas. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tais como Sambrook, (2003) supra, Chapters 17.29- 17.42 and 18.1-18.74; Ausubel (2003), supra, Chapters 16, 17 and 18.
Aqueles versados na técnica ordinária são conhecedores de vá-
rios sistemas de expressão disponíveis para a expressão de um ácido nucle- ico que codifica uma proteína da presente invenção.
Ilustração de culturas celulares úteis para a produção de corpos miméticos, de porções especificadas ou variantes dos mesmos, são células de mamíferos. Os sistemas de células de mamíferos muitas vezes serão na forma de monocamadas de células embora suspensões ou biorreatores de células mamíferas também possam ser usados. Diversas linhagens de células hospedeiras adequadas capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas foram desenvolvidas na técnica, e incluem COS 1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS 7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK, HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610, DG-44) e li- nhagens celulares BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células hepG2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, células HeLa e similares, que estão prontamente disponíveis em, por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va. Células hospedeiras preferenciais incluem células de origem linfoide, tais como células de mieloma e linfoma. Particularmente, células hos- pedeiras preferenciais são células P3X63Ag8.653 (Número de acesso ATCC CRL-1580) e células SP2/0-Ag14 (Número de acesso ATCC CRL-1851).
Vetores de expressão para estas células podem incluir uma ou mais das seguintes seqüências de controle de expressão, tais como, mas não limitadas a uma origem de replicação; um promotor (por exemplo, pro- motores tardios ou iniciais SV40, o promotor CMV (por exemplo, Patente U. S. Nos 5.168.062; 5.385.839), um promotor HSV tk, um promotor pgk (fosfo- glicerato quinase), um promotor EF-1 alfa (por exemplo, Patente U. S. N0 5.266.491), pelo menos um promotor de imunoglobulina humana; um poten- cializador, e/ou sítios processadores de informação, tais como sítios de liga- ção de ribossomos, sítios de splice de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição poli A de SV40 TAg amplo), e seqüências trans- cricionais terminadoras. Vide, por exemplo, Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. Outras células úteis para produção de ácidos nucleicos ou pro- teína da presente invenção são conhecidas e/ou disponíveis, por exemplo, a partir de American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hy- bridomas (www.atcc.org) ou outras fontes conhecidas ou comerciais.
Quando células eucarióticas hospedeiras são empregadas, as seqüências terminadoras de transcrição ou poliadenilação são tipicamente incorporadas no vetor. Um exemplo de uma seqüência terminadora é a se- quência de poliadenilação do gene do hormônio do crescimento bovino. As seqüências para splicing exato do transcrito também podem estar incluídas. Um exemplo de uma seqüência de splicing é o íntron VP1 de SV40 (Spra- gue, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Adicionalmente, seqüências genéti- cas para controlar a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, como conhecido na técnica.
Purificação de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro aqonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante dos mesmos
Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante pode ser recuperado e purificado a partir de culturas celulares recombinan- tes através de métodos bem conhecidos incluindo, mas não limitado a, puri- ficação em proteína A, precipitação em sulfato de amônio ou etanol, extra- ção ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afini- dade, cromatografia em hidroxilapatita e cromatografia em lectina. Cromato- grafia líquida de alta performance ("HPLC") também pode ser empregada para a purificação. Vide, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immu- nology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2006), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada um inteiramente incorpo- rado neste pedido por referência.
Corpos miméticos ou porções especificadas ou variantes da pre- sente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de pro- cedimentos de síntese química, e produtos produzidos através técnicas re- combinantes em um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, levedu- ra, plantas superiores, inseto e células de mamífero. Dependendo do hospe- deiro empregado em um procedimento de produção de um recombinante, ou corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção pode estar glicosilado ou pode estar não-glicosilado, com glicosilado como preferencial. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tais como Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12,13, 16,18 and 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14, todos inteiramente incorporados neste pedido por referência. Corpos Miméticos, Fragmentos Especificados e/ou Variantes
Os corpos miméticos isolados da presente invenção compreen- dem um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante codificada por qualquer um dos polinucleotídeos da presente invenção como discutido mais inteiramente neste pedido, ou qualquer isolado ou preparado de corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante do mesmo.
Preferencialmente, o corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção de liga- ção ao Iigante ou variante ligado a pelo menos um Iigante de proteína ou receptor EPO, e, por meio disso fornece pelo menos uma atividade biológica EPO da proteína correspondente ou fragmento da mesma. Proteínas signifi- cantes diferentes terapeuticamente ou diagnosticamente são bem conheci- das na técnica e ensaios ou atividades biológicas adequados de tais proteí- nas são também bem conhecidos na técnica.
Exemplos não-limitantes de peptídeos miméticos adequados da EPO desta invenção aparecem na Tabela 1 abaixo. Estes peptídeos podem ser preparados por métodos revelados e/ou conhecidos na técnica. As abre- viaturas de aminoácido de letra única são usadas na maioria dos casos. Os X nestas seqüências (e em todas as partes desta especificação, a menos que especificado de outra maneira em um exemplo particular) significam que algum dos 20 de ocorrência natural ou resíduos de aminoácido conhecidos ou derivados conhecidos dos mesmos podem estar presentes, ou algum a- minoácido conhecido modificado dos mesmos. Alguns destes peptídeos po- dem estar ligados in tandem (isto é, seqüencialmente), com ou sem Iigado- res, e alguns exemplos ligados in tandem são fornecidos na tabela. Ligado- res são listados como "Δ" e podem ser algum dos Iigadores descritos neste pedido. As repetições e Iigadores seqüenciais são mostrados separados por traços para esclarecer. Qualquer peptídeo contendo um resíduo cisteinil po- de estar opcionalmente em ligação cruzada com outro peptídeo contendo Cys, um ou ambos os quais podem estar ligados a um veículo. Alguns e- xemplos de ligação cruzada são fornecidos na tabela. Qualquer peptídeo que tem mais de um resíduo Cys pode formar uma ligação dissulfeto intra- peptídica, também; vide, por exemplo, peptídeos miméticos da EPO na Ta- bela 1. Alguns exemplos de peptídeos ligados por dissulfeto intrapeptídico são especificados na tabela. Algum destes peptídeos podem ser derivatiza- dos como descrito neste pedido, e alguns exemplos derivatizados são forne- cidos na tabela. Para derivados nos quais a carboxila terminal pode ser Iiga- da com um grupo amino, o grupo amino Iigante é mostrado como -NH2. Para derivados nos quais os resíduos de aminoácido são substituídos por outras porções com exceção de resíduos de aminoácido, as substituições são de- notadas por um δ, que significa qualquer das porções conhecidas na técnica, por exemplo, como descrito em Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9 e Cuthbertson et al. (1997), J. Med. Chem. 40:2876-82, que são intei- ramente incorporados por referência. O substituinte J e os substituintes Z (Z5, Z6, ... Z40) são como definidos em Patente U.S. Nos 5.608.035, 5.786.331, e 5.880.096, que são inteiramente incorporados neste pedido por referência. Para seqüências miméticas da EPO (Tabela 1), os substituintes X2 a Xn e o número inteiro "n" são como definidos em WO 96/40772, que é inteiramente incorporado por referência. Resíduos que aparecem em negrito são D-aminoácidos, mas podem ser opcionalmente L-aminoácidos. Todos os peptídeos são ligados através de ligações peptídicas a menos que observa- do de outra maneira. Abreviações estão listadas no fim deste relatório. Na coluna "SEQ ID N0:", "NR" significa que nenhuma listagem de seqüência é necessária para a seqüência dada. Tabela 1 - Seqüências de peptídeo miméticos da EPO Sequência/estrutura SEQ ID N0:
YXCXXGPXTWXCXP 1
YXCXXGPXTWXCXP-YXCXXGPXTWXCXP 2
YXCXXGPXTWXCXP-Λ-YXCXXGPXTWXCXP 3
YXCXXGPXTWXCXP- Λ- (ε-amina) 4
/
Ba
YXCXXGPXTWXCXP- Λ- (a-amina)
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG
6
GGVYACRMGPITWVCSPLGG VGNYMCHPGPITWVCRPGGG GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG
8
10
q
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG
11
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-A-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GGT YSCHFG PLT WCKPQGGS SK GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK
12
13
14
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-A-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK 15
GGTY SC-HFG PLTWVCKPQGGS S (ε- amina)
K
/
βΑ
/
GGTYSCHFGPLTívVCKPQGGSS (a- amina)
16
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK (-Λ- biotina) CXsX ·; G P X c.TW X ·? C
17
18 GGTYSCHGPLTWVCKPQGG 19 VGNYMAHMGPITfJVCRPGG 20 GGPHHVYACRMGPLTWIC 21 GGTYSCHFGPLTWVCKPQ 22 GGLYACHMGPMTWVCQPLRG 23 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 24 YSCHFGPLTSfVCK 25 YCHFGPLTWVC 26 X3X4X5GPX6TWX7X8 27 YX?X?X4XSGPX6TWX7X6 M CO y.iYXsXsX-iXsGPXgX-íXsXoXíoXi: 2S X1YX2CX4X5GPX6TWX1CX9XicXU 30 GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG 31 GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 32 VGNYMCHFGPITWVCRPGGG 33 G GVYA C RMG PITWC SPLGG 34 TIAQYICYMGPETWECRPSPKA 35 YSCftFGPLTWVCK 36 YCHFGPLTWVC 37 SCHFGPLTVfVCK 38 (AX2) PiX3X4XsGPX6TWX7Xs 39
* Atividades biológicas são bem-conhecidas na técnica. Vide, por exemplo tem um efeito quimiostático positivo e mitogênico em células endo- télicas. Procedimentos da National Academy of Science (USA) 87: 5978-82 (1990); Fandrey J and Jelkman WE Interleukin 1 and tumor necrosis factor- alpha inhibit erythropoietin production in vitro. Annals of the New York Aca- demy of Science 628: 250-5 (1991); Geissler K et al Recombinant human erythropoietin: A multipotential hemopoietic growth factor in vivo and in vitro. Contrib. Nephrol. 87: 1-10 (1990); Gregory CJ Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system. Studies of three erythropoi- etic colony responses in culture. Journal of Cellular Physiology 89: 289-301 (1976); Jelkman W et al Monokines inhibiting erythropoietin production in human hepatoma cultures and in isolated perfused rat kidneys. Life Sei. 50: 301-8 (1992); Kimata H et al Human recombinant erythropoietin directly sti- mulates B cell immunoglobulin production and proliferation in serum-free médium. Clinicai and Experimental Immunology 85: 151-6 (1991); Kimata H et al Erythropoietin enhances immunoglobulin production and proliferation by human plasma cells in a serum-free médium. Clin. Immunology Immunopa- thol. 59: 495- 501 (1991); Kimata H et al Effect of recombinant human eryt- hropoietin on human IgE production in vitro Clinicai and Experimental Immu- nology 83: 483-7 (1991); Koury MJ and Bondurant MC Erythropoietin retards DNA breakdown and prevents programmed cell death in erythroid progenitor cells. Science 248:378-81 (1990); Lim VS et al Effect of recombinant human erythropoietin on renal function in humans. Kidney International 37: 131-6 (1990); Mitjavila MT et al Autocrine stimulation by erythropoietin and auto- nomous growth of human erythroid Ieukemic cells in vitro. Journal of Clinicai Investigation 88: 789- 97 (1991); Andre M et al Performance of an immuno- radiometric assay of erythropoietin and results for specimens from anemic and polycythemic patients. Clinicai Chemistry 38: 758-63 (1992); Hankins WD et al Erythropoietin-dependent and erythropoietin-producing cell lines. Implications for research and for Ieukemia therapy. Annals of the New York Academy of Science 554: 21-8 (1989); Kendall RGT et al Storage and prepa- ration of samples for erythropoietin radioimmunoassay. Clin. Lab. Haemato- Iogy 13: 189-96 (1991); Krumvieh D et al Comparison of relevant biological assays for the determination of biological active erythropoietin. Dev. Biol. Stand. 69: 15-22 (1988); Ma DD et al Assessment of an EIA for measuring human serum erythropoietin as compared with RIA and an in-vitro bioassay. British Journal of Haematology 80: 431-6 (1992); Noe G et al A sensitive sandwich ELISA for measuring erythropoietin in human serum British Journal of Haematology 80: 285-92 (1992); Pauly JU et al Highly specific and highly sensitive enzyme immunoassays for antibodies to human interleukin 3 (IL3) and human erythropoietin (EPO) in serum. Behring Institut Mitteilungen 90: 112-25 (1991); Sakata S and Enoki Y Improved microbioassay for plasma erythropoietin based on CFU-E colony formation. Ann. Hematology 64: 224- 30 (1992); Sanengen T et al Immunoreactive erythropoietin and erythropoie- sis stimulating factor(s) in plasma from hypertransfused neonatal and adult mice. Studies with a radioimmunoassay and a cell culture assay for erythro- poietin. Acta Physiol. Scand. 135: 11-6 (1989); Widness JA et al A sensitive and specific erythropoietin immunoprecipitation assay: application to phar- macokinetic studies. Journal of Lab. Clin. Med. 119: 285-94 (1992); para in- formação adicional, vide também linhagens celulares usadas em bioensaios individuais. Cada uma das referências acima mencionadas é inteiramente incorporada neste pedido por referência. EPO pode ser analisada através do emprego de linhagens celulares, tais como HCD57, NFS 60, TF-1 e UT-7, que respondem ao fator. A atividade da EPO pode ser avaliada também em um ensaio da formação de colônia através da determinação do número de CFU-E a partir de células de medula óssea. Um método de detecção alterna- tivo e inteiramente diferente é a quantificação de citocinas por RT-PCR.
Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO1 ou porção especificada ou variante do mesmo, que parcialmente ou preferencialmente fornece substancialmente pelo menos uma atividade biológica de pelo menos uma proteína ou frag- mento, pode ligar o Iigante da proteína ou fragmento e por meio disso forne- cer pelo menos uma atividade que é de outra maneira mediada através da ligação da proteína a pelo menos um Iigante ou receptor proteico ou através de outros mecanismos dependentes ou mediados por proteína. Como usado neste pedido, o termo "atividade do corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO" refere-se a um cor- po mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO que pode modular ou causar pelo menos uma atividade dependente da proteína até 20 a 10.000%, preferencialmente por pelo me- nos aproximadamente 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000% ou mais dependendo do ensaio.
A capacidade de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especifi- cada ou variante fornecer pelo menos uma atividade dependente de proteína é preferencialmente avaliada por pelo menos um ensaio biológico de proteí- na adequado, como descrito neste pedido e/ou como conhecido na técnica. Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro ago- nista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da invenção pode ser similar a qualquer classe (IgG, IgA1 IgM1 etc.) ou isotipo e pode compreender pelo menos uma porção de uma de cadeia leve kappa ou lambda. Em uma modalidade, o corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especifi- cada ou variante compreende um fragmento de cadeia variável pesada da IgG, região de articulação, CH2 e CH3, por exemplo, pelo menos um dos isotipos, IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4.
Pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação miméti- ca da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da invenção liga pelo menos um Iigante especificado específico a pelo menos uma proteína, subunidade, fragmento, porção ou qualquer com- binação dos mesmos. Pelo menos um peptídeo mimético da EPO de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO, porção especificada ou variante da pre- sente invenção pode ligar opcionalmente pelo menos um epítopo Iigante es- pecificado do ligante. O epítopo de ligação pode compreender qualquer combinação de pelo menos uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 1 a 3 aminoácidos à porção especificada inteira de aminoácidos contíguos das seqüências selecionadas a partir do grupo composto de um ligante de prote- ína, tal como um receptor da EPO ou porção do mesmo.
Tais corpos miméticos podem ser preparados pela junção de várias porções da Fórmula (I) do corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO utilizando técnicas conhecidas, através da preparação e expressão de pelo menos uma (isto é, uma ou mais) moléculas de ácido nucleico que codificam corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO, usando técnicas conhecidas da tecnologia de DNA recombinante ou pelo uso de qualquer outro método adequado, tal como síntese química.
Corpos miméticos que se ligam a Iigantes ou receptores da EPO humana e que compreendem pelo menos uma porção definida da região vari- ável da cadeia pesada ou leve pode ser preparada usando métodos adequa- dos, tais como exposição a fago (Katsube, Y., et ai, Int J Mol. Med1 1 (5):863- 868 (1998)) ou métodos que empregam animais transgênicos, como conheci- dos na técnica e/ou como descrito neste pedido. O corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO1 por- ção especificada ou variante pode ser expresso usando o ácido nucleico codi- ficante ou porção do mesmo em uma célula hospedeira adequada.
Preferencialmente, tais corpos miméticos ou fragmentos de Iiga- ção ao Iigante dos mesmos podem se ligar Iigantes ou receptores da EPO humana com alta afinidade (por exemplo, Kd menor ou igual a aproximada- mente 10"7 M). As seqüências de aminoácidos que são substancialmente as mesmas como as seqüências descritas neste pedido incluem seqüências compreendendo substituições de aminoácidos conservativas, bem como in- serções e/ou deleções de aminoácidos. Uma substituição de aminoácido conservativa refere-se à substituição de um primeiro aminoácido por um se- gundo aminoácido que tem propriedades químicas e/ou físicas (por exemplo, carga, estrutura, polaridade, hidrofobicidade/hidrofilicidade) que são simila- res àqueles do primeiro aminoácido. Substituições conservativas incluem a substituição de um aminoácido pelo outro dentro dos seguintes grupos: Iisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) e glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Υ), K, R, H, D e E; alani- na (A), valina (V), Ieucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), trip- tofano (W), metionina (M), cisteína (C) e glicina (G); F, W e Y; C, S e T. Códigos de Aminoácido
Os aminoácidos que compõem corpos miméticos ou porções especificadas ou variantes da presente invenção muitas vezes são abrevia- dos. As designações de aminoácido podem ser indicadas indicando aminoá- cido pelo seu código de letra única, seu código de três letras, nome, ou có- don(s) de três nucleotídeos como é bem entendido na técnica (vide Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell5 Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994), como apresentado na Tabela Tabela 2
CÓDIGO DE LETRA ÚNICA CÓDIGO DE TRÊS LETRAS NOME CÓDON(S) DE TRÊS NUCLEOTÍ- DEOS A Ala Alanina GCA1 GCC, GCG, GCU C Cys Cisteína UGC, UGU D Asp Ácido Aspártico GAC, GAU E Glu Ácido Glutâmico GAA, GAG F Phe Fenilalanina UUC, UUU G Gly Glicina GGA, GGC, GGG, GGU H His Histidina CAC1 CAU I Ile Isoleucina AUA, AUC, AUU K Lys Lisina AAA1AAG L Leu Leucina UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU M Met Metionina AUG N Asn Asparagina AAC1 AAU P Pro Prolina CCA, CCC, CCG, CCU Q Gln Glutamina CAA, CAG R Arg Arginina AGA, AGG1 CGA1 CGC, CGG, CGU S Ser Serina AGC, AGU, UCA, UCC1 UCG, UCU T Thr Treonina ACA, ACC1 ACG, ACU V Val Valina GUA1 GUC1 GUG, GUU W Trp Triptofano UGG Y Tyr Tirosina UAC, UAU
Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO
ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção pode incluir uma ou mais substituições, deleções ou adi- ções de aminoácidos, de mutações naturais ou de manipulação humana, como especificado neste pedido. Tais seqüências ou outras que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não são limitadas às seguintes seqüências apresentadas na Tabela 3, como ainda descrito nas Figuras 1 a 42 do Pedido de Patente Provisional U. S. 60/507.349, arquivado em 30/09/2003, inteiramente incorporado por referência neste pedido, corres- pondendo às Figuras 1 a 41 do Pedido PCT U.S. N0 04/19783, arquivado em 17 de junho de 2004, inteiramente incorporado neste pedido por referência, com correspondente SEQ ID NoS:31 a 72. Estas Figuras referidas 1 a 42 (SEQ ID NoS:31 a 72), ou Figuras 1 a 41 do PCT US04/19783, mostram e- xemplos de seqüências da região variável/constante da cadeia pesada/leve, estruturas/subdomínios e substituições, porções das quais podem ser usa- das nas proteínas derivadas de Ig da presente invenção, como ensinado neste pedido. 4
co <
_ι
LU
CQ <
H-
REGIÕES FR4 81-125 80-124 81-100 80-102 81-101 83-108 81-132 80-125 80-91 CO CD LO 74-92 74-91 74-85 68-79 66-77 75-95 73-98 l 74-99 73-99 73-107 74-93 73-98 73-98 73-94 73-95 76-88 75-101 | CDR3 o 00 O) Ν o 00 O) Ν o 00 CM OO o co O) <j> Ν ■t N 00 CO Ν CO Ν co LO CO Tt -1 ZL CO N ZL ZL CO N ZL ZL ZL ZL LO N FR3 48-79 47-78 48-79 47-78 47-79 50-81 48-79 47-78 47-78 42-73 | 41-72 41-72 41-72 35-66 33-64 42-73 40-71 41-72 40-71 40-71 41-72 40-71 40-71 40-71 40-71 41-74 40-73 CDR2 Ν Tt CD Tt Ν Ti- co Tj- co Tt O) TJ- 47 CD Tt CD Tt 5 o Tt § o Tt CM 00 T— Tj- O) OO o Tt S OO Oi CO o Tt Oi CO O) 00 Oi OO Oi co o t Oi CO FR2 CD ^r CO 00 32-45 co t CO CO 32-45 LO T CM CO OO t IO CO CD t CO CO 32-45 LO t CM CO o T CD CM 25-39 25-39 25-39 19-33 17-31 26-40 24-38 25-39 24-38 1 24-38 24-39 24-38 24-38 24-38 24-38 | 24-39 24-38 CDR1 CM CO cõ CM CO cõ cõ CM co cõ δ LO CM Tj- CM Tj- CM Tj- CM co CO LO CM CO CM Tt CM CO CM 00 CM CO CM co CM CO CM CO CM 00 CM CO CM CO CM FR1 1-31 1-30 1-31 1-30 1-30 1-33 1-31 1-30 1-30 Tt CM 1-23 1-23 1-23 1-17 1-15 1-24 1-22 1-23 1-22 1-22 1-22 1-22 1-22 1-22 1-22 1-22 1-22 Ç < T \ m CM Tt CM o O CM O δ 801 CM CO LO CM δ CO σ> CM Ci δ LO 00 <y> N- ZZ LO oi 00 OÍ Oi σ> Oi Oi ZOI- co CD 00 Oi 00 Oi % LO Oi 00 CO δ Sl > Vh2 Vh3a Vh3b Vh3c Vh4 LO -C > Vh6 Vh7 t ""5 CO 1S κηονοί CM O > O C y κηονο3 co .Ω ZX co co JO CO O CO <D CO C^i co Jd Tt LO CD Região variá- vel da cadeia pesada Região variá- vel da cadeia leve SEQ ID N0 cõ CM CO 00 CO Tt CO IO CO CD CO CO 00 CO σ> 00 o Tt 5 CM CO Tj- 5 LO Tt co n- Tt 00 Tt Oi Tt o LO δ CM LO 00 LO LO LO CD LO N LO : (continuação) REGIÕES I I FR4 73-89 73-89 81-91 73-87 REGIÕES | CH3 I 223-354 210-340 268-384 211-318 224-339 220-326 271-377 221-327 218-323 I CDR3 ZL _IL_ o 00 ZL CH2 I 122-222 109-209 160-267 104-210 114-223 111-219 161-270 111-220 105-217 I FR3 40-71 40-71 40-79 40-71 articulação 4 I 146-160 CDR2 ot CO ot CO OT CO OT CO Articulação 3 I 131-145 [ FR2 24-38 24-38 24-38 24-38 Articulação 2 | 136-159 | 116-130 Ql Q O CO CM co CM co CM CO CM Articulação 1 | 103-121 103-108 | | 102-135 Π 99-113 99-110 i 99-115 99-110 FR1 1-22 1-22 1-22 1-22 CH1 | 1-102 1-102 1-101 | 1-103 1-98 1-98 1-98 1-98 1-104 ONW σ> CO σ> CO OT 00 ONW CO o S S CO OT OT CO CO co CM CO N- N CO N CM CO co N N O N- O N OT O 5 S I Q .O) LU OT δ O) CM O OT CO O OT "ί- Ο OT OT S _OT o OT Região cons- tante da ca- deia pesada Região cons- tante da ca- deia leve TABELA 3 SEQ ID N0 CO ιο σ> IO o co δ SEQ ID N0 CM CO CO CO S IO CO co co 67 00 co OT CO O ZL Naturalmente, diversas substituições de aminoácido que um ver- sado faria depende de muitos fatores, incluindo os descritos acima. Em ge- ral, o número de substituições, inserções ou deleções de aminoácidos de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO não será mais de 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 aminoácidos, tal como 1 a 30 ou qualquer faixa ou valor nesses, como especificado neste pedido.
A descrição seguinte dos componentes de um corpo mimético de núcleo de articulação da EPO da presente invenção é baseada no uso da fórmula I da presente invenção,
((V(m)-P(n)-L(o)-H(p)-CH2(q)-CH3(r))(s),
onde V é pelo menos uma porção de uma região variável N-terminal de uma imunoglobulina, P é pelo menos um peptídeo bioativo, L é pelo menos um polipeptídeo ligador, H é pelo menos uma porção de pelo menos uma região de articulação da imunoglobulina, CH2 é pelo menos uma porção de uma imunoglobulina da região constante CH2, CH3 é pelo menos uma porção de uma imunoglobulina da região constante CH3, o m, n, o, p, q, r e s são inde- pendentemente um número inteiro entre 0, 1 ou 2 e 10, mimetizando tipos diferentes de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, mas não limitados a IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgD, IgE, e similares, ou qualquer sub- classe das mesmas, ou qualquer combinação das mesmas.
Nos corpos miméticos do núcleo de articulação da presente in- venção, a opcional porção V do N-terminal pode compreender 1 a 20 amino- ácidos de pelo menos uma região da estrutura variável da cadeia pesada 1 (FR1), por exemplo, como apresentado nas figuras 1 a 9 (SEQ ID NoS:31 a 39) ou pelo menos uma região variável LC, por exemplo, como apresentado nas Figuras 10 a 31 (SEQ ID NoS:40 a 61), do Pedido de Patente Provisional U. S. 60/507.349, arquivado em 30/09/2003, inteiramente incorporado por referência neste pedido, correspondente às Figuras 1 a 41 do Pedido PCT N0 US04/19783, arquivado em 17 de junho de 2004, inteiramente incorpora- do neste pedido por referência, incluindo substituições, deleções ou inser- ções como apresentados nestas figuras, como aquelas das figuras preferen- ciais 5, 6, e 8. Também preferenciais são seqüências variáveis que compre- endem a seqüência Q-X-Q.
A porção P pode compreender pelo menos um peptídeo tera-
pêutico qualquer como conhecido na técnica ou descrito neste pedido, tal como, mas não limitada aos apresentados na Tabela 1, SEQ ID NoS:1 a 30, ou como conhecido na técnica, ou qualquer combinação ou seqüência con- senso das mesmas, ou qualquer proteína de fusão das mesmas. A seqüência Iigadora opcional pode ser qualquer peptídeo Iiga-
dor adequado como conhecido na técnica. A seqüência preferencial inclui qualquer combinação de G e S, por exemplo, X1-X2-X3-X4-Xn, onde X pode ser G ou S, e η pode ser 5 a 30. Os exemplos não-limitantes incluem GS, GGGS, GSGGGS, GSGGGSGG, e similares. Na presente invenção, a porção CH1 não é usada e um número
variável de aminoácidos a partir do N-terminal da região de articulação são deletados, por exemplo, como referido nas Figuras 1 a 42 de Pedido de Pa- tente Provisional U. S. 60/507.349, arquivado em 30/09/2003, inteiramente incorporado por referência neste pedido, correspondente as Figuras 1 a 41 do Pedido PCT N0 US04/19783, arquivado em 17 de junho de 2004, inteira- mente incorporado neste pedido por referência, e na Tabela 3. O número variável de aminoácidos usados para a porção do corpo mimético do núcleo de articulação da presente invenção inclui, mas não é limitado a, a deleção de qualquer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, ou 1 a 3, 2 a 5, 2 a 7, 2 a 8, 3 a 9, 4 a 10, 5 a 9, 5 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 2 a 30, 20 a 40, a 50, ou qualquer faixa ou valor nesses, dos aminoácidos N-terminais de pelo menos uma região de articulação, por exemplo, como apresentado nas Figuras 32 a 40 de Pedido de Patente Provisional U. S. 60/507.349, arquivado em 30/09/2003, inteiramente incorporado por referên- cia neste pedido, correspondente às Figuras 1 a 41 do Pedido PCT N0 US04/19783, arquivado em 17 de junho de 2004, inteiramente incorporado neste pedido por referência, ou na Tabela 3 acima, por exemplo, mas não limitado a, deleção de algum dos aminoácidos 99 a 101 a 105 a 157 dos aminoácidos 99 a 105, 99 a 108, 99 a 111, 99 a 112, 99 a 113, 99 a 114, 99 a 115, 99 a 119, 99 a 125, 99 a 128, 99 a 134, 99 a 140, 99 a 143, 99 a 149, 99 a 155 e 99 a 158 das Figuras 32 a 40 de Pedido de Patente Provisional U. S. 60/507.349, arquivado em 30/09/2003, inteiramente incorporado por referência neste pedido, correspondente às Figuras 1 a 41 do Pedido PCT N0 US04/19783, arquivado em 17 de junho de 2004, inteiramente incorpora- do neste pedido por referência, correspondente a SEQ ID NoS:62 a 70, inclu- indo as substituições, inserções ou deleções descritas nas Figuras 32 a 40 de Pedido de Patente Provisional U. S. 60/507.349, arquivado em 30/09/2003, inteiramente incorporado por referência neste pedido, corres- pondente às Figuras 1 a 41 do Pedido PCT N0 US04/19783, arquivado em 17 de junho de 2004, inteiramente incorporado neste pedido por referência. Em modalidades preferenciais, regiões de núcleo de articulação da presente invenção incluem uma deleção do N-terminal da região de articulação para fornecer uma região de núcleo de articulação que inclui até uma deleção mas não incluindo um resíduo Cys ou até uma mas não incluindo uma se- quência Cys-Pro-Xaa-Cys. Em modalidade preferencial adicional, tais se- qüências de núcleo de articulação usadas em um corpo mimético do núcleo de articulação da presente invenção incluem aminoácidos 109 a 113 ou 112 a 113 (SEQ ID N°:66) (IgGI); 105-110 ou 109-110 (SEQ ID N°:67) (lgG2); 111 a 160, 114 a 160, 120 a 160, 126 a 160, 129 a 160, 135 a 160, 141 a 160, 144 a 160, 150 a 160, 156 a 160 e 159 a 160 (SEQ ID N°:68) (lgG3); ou 106 a 110 ou 109 a 110 (SEQ ID N°:69) (lgG4).
A seqüência CH2, CH3 e CH4 opcional podem ser qualquer se- qüência humana adequada ou compatível com a humana, por exemplo, co- mo apresentado nas Figuras 1 a 42 de Pedido de Patente Provisional U. S. 60/507.349, arquivado em 30/09/2003, inteiramente incorporado por referên- cia neste pedido, correspondente às Figuras 1 a 41 do Pedido PCT N0 US04/19783, arquivado em 17 de junho de 2004, inteiramente incorporado neste pedido por referência, e Tabela 3, ou como conhecido na técnica, ou qualquer combinação ou seqüência consenso das mesmas, ou qualquer pro- teína de fusão das mesmas.
Aminoácidos em um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especifi- cada ou variante da presente invenção que são essenciais para a função podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, tal como muta- gênese sítio dirigida ou mutagênese de varredura de alanina (por exemplo, Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081- 1085 (1989)). O último procedimento introduz mutações em alaninas únicas em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadas para a atividade biológica, tal como, mas não limitadas à atividade relacionada a pelo menos uma proteína, como especificado neste pedido ou como conhecido na técnica. Sítios que são críticos para o núcleo de articula- ção do corpo mimético da EPO mimético ou outro agonista do receptor da EPO ou a porção especificada ou variantes de ligação também podem ser identificados pela análise estrutural, tal como cristalização, ressonância magnética nuclear ou marcação por fotoafinidade (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) e de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)). Corpos miméticos ou porções especificadas ou variantes da pre-
sente invenção podem compreender como porção P da Fórmula (I), mas não são limitados a, pelo menos uma porção, seqüência ou combinação selecio- nada de 3 a todos de pelo menos uma de SEQ ID NoS:1 a 30. Variantes não- Iimitantes que podem potencializar ou manter pelo menos uma das ativida- des listadas acima incluem, mas não são limitadas a, qualquer dos polipeptí- deos acima mencionados, compreendendo ainda pelo menos uma mutação correspondente a pelo menos uma substituição, inserção ou deleção que não afeta significativamente as atividades ou funções biológicas adequadas do dito corpo mimético do núcleo de articulação do EPO mimético ou outro agonista do receptor da EPO.
Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante pode ainda compreender opcionalmente pelo menos uma porção funcional de pelo menos um polipeptídeo como porção P da Fórmula (I), pelo menos uma de 90 a 100% de SEQ ID NoS:1 a 30. Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO pode ainda compreender opcionalmente uma seqüência de aminoácidos da por- ção P da Fórmula (I), selecionado de uma ou mais de SEQ ID NoS:1 a 30.
Em uma modalidade, a seqüência de aminoácidos P1 ou porção dos mesmos tem identidade de aproximadamente 90 a 100% (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nesses) à se- quência de aminoácidos correspondente da porção correspondente de pelo menos um de SEQ ID NoS:1 a 30. Preferencialmente, de 90 a 100% de iden- tidade de aminoácidos (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nesses) é determinada usando um algoritmo compu- tacional adequado, como conhecido na técnica. Corpos miméticos ou porções especificadas ou variantes da pre-
sente invenção podem compreender qualquer número de resíduos de ami- noácido contíguos de um corpos miméticos de núcleo de articulação miméti- ca da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção, em que aquele número é selecionado a partir do grupo de números inteiros compostos de 10 a 100% do número de resí- duos contíguos em um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO . Opcionalmente, esta subse- quência de aminoácidos contíguos é pelo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou mais aminoácidos no tamanho, ou qualquer faixa ou valor nesses. Além disso, o número de tais subsequências pode ser qualquer número inteiro selecionado a partir do grupo composto de 1 a 20, tais como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, ou mais.
Como aqueles versados apreciarão, a presente invenção inclui pelo menos um corpo mimético do núcleo de articulação mimética da EPO biologicamente ativo ou outro agonista do receptor da EPO ou porção espe- cificada ou variante da presente invenção. Corpos miméticos ou porções especificadas ou variantes biologicamente ativos têm uma atividade especí- fica pelo menos 20%, 30%, ou 40%, e preferencialmente pelo menos 50%, 60%, ou 70%, e o mais preferencialmente pelo menos 80%, 90%, ou 95% a 1000% daquela da nativa (não-sintética), endógena ou relacionada proteína inserida ou fusionada conhecida ou porção especificada ou variante. Méto- dos de análise e medidas de quantificação da atividade enzimática e especi- ficidade do substrato são bem conhecidos àqueles versados na técnica. humanos e fragmentos de ligação ao ligante, como descrito nes-
te pedido, que são modificados pela ligação covalente de uma porção orgâ- nica. Tal modificação pode produzir um corpo mimético de núcleo de articu- lação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou fragmento de ligação ao ligante com propriedades farmacocinéticas melhoradas (por exemplo, aumento na meia-vida sérica in vivo). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico linear ou ramificado, grupo ácido graxo, ou grupo éster de ácido graxo. Em determinadas modalidades, o grupo polimé- rico hidrofílico pode ter um peso molecular de aproximadamente 800 a apro- ximadamente 120.000 Dáltons e pode ser um polialcano glicol (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG)), polímero de carboidrato, polímero de aminoácido ou polivinil pirrolidona, e ácido graxo ou grupo éster de ácido graxo podem compreender de aproximadamente oito a aproxima- damente quarenta átomos de carbono.
Os corpos miméticos modificados e os fragmentos de ligação ao ligante da invenção podem compreender uma ou mais porções orgânicas que são covalentemente ligadas, diretamente ou indiretamente, ao corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante. Cada porção orgânica que é ligada a um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou fragmento de ligação ao ligante da invenção pode ser independentemente um grupo polimérico hidrofílico, um grupo ácido graxo ou um grupo éster de ácido graxo. Como usado neste pe- dido, o termo "ácido graxo" abrange ácidos monocarboxílicos e ácidos dicar- boxílicos . Um "grupo polimérico hidrofílico," como o termo é usado neste pedido, refere-se a um polímero orgânico que é mais solúvel na água do que em octano. Por exemplo, polilisina é mais solúvel na água do que em octa- no. Dessa forma, um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO modificado pela ligação covalen- te de polilisina é abrangido pela invenção. Polímeros hidrofílicos adequados para modificação dos corpos miméticos da invenção podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometóxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e similares), carboidratos (por exemplo, dextrana, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e similares), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato e similares), polialcanos óxidos (por exemplo, óxido de polieti- leno, óxido de polipropileno e similares) e polivinil pirrolidona. Preferencial- mente, o polímero hidrofílico que modifica o corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO da in- venção tem um peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamen- te 150.000 Dáltons como uma entidade molecular separada. Por exemplo, PEG2500, PEG5000, PEG7500. PEG9000, PEG10000, PEG12500, PEG-15000, e PEG2o,ooo, em que o subscrito é o peso molecular médio do polímero em Dál- tons, podem ser usados.
O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído com um a aproximadamente seis grupos alquilas, grupos de ácidos graxos ou ésteres de ácidos graxos. Polímeros hidrofílicos que são substituídos com um grupo ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser preparado através do emprego de métodos adequados. Por exemplo, um polímero compreendendo um gru- po amina pode ser ligado a um carboxilato de ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com Ν,Ν-carbonil dii- midazol) ou um ácido graxo ou éster de ácido graxo podem ser ligados a um grupo hidroxila de um polímero.
Ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para modifi- cação de corpos miméticos da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Ácidos graxos que são ade- quados para modificação de corpos miméticos da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n- octadecanoato (Ci8, estearato), n-eicosanoato (C2o, araquidato), n- docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), cis-A9-octadecanoato (Ci8, oleato), todo eis -Δ5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20. araquidonato), ácido octanedioico, ácido tetradecanedioico, ácido octa- decanedioico, ácido docosanedioico, e similares. Os ésteres de ácidos gra- xos adequados incluem monoésteres de ácidos dicarboxílicos que compre- endem um grupo alquila menor linear ou ramificado. O grupo alquila menor pode compreender de um a aproximadamente doze, preferencialmente um a aproximadamente seis átomos de carbono.
Os corpos miméticos humanos modificados e os fragmentos de ligação ao Iigante podem ser preparados usando métodos adequados, tais como através da reação com um ou mais agentes de modificação. Um "a- gente de modificação" como o termo é usado neste pedido, refere-se a um grupo orgânico adequado (por exemplo, polímero hidrofílico, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreende um grupo de ativação. Um "grupo de ativação" é uma porção química ou grupo funcional que, sob condições apropriadas, pode reagir com um segundo grupo químico que por meio disso forma uma ligação covalente entre o agente de modificação e o segundo grupo químico. Por exemplo, grupos de ativação aminorreativos incluem grupos eletrofílicos, tais como tosilato, mesilato, halogênios (cloro, bromo, flúor, iodo), ésteres de N-hidroxisuccinimidil (NHS), e similares. Grupos de ativação que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodo- acetil, acrilolil, piridil dissulfetos, ácido 5-tiol-2-nitrobenzoico tiol (TNB-tiol), e similares. Um grupo funcional aldeído pode ser ligado a moléculas contendo amina ou hidrazida, e um grupo azida pode reagir com um grupo fosforoso trivalente para formar ligações fosforamidato ou fosforimida. Métodos ade- quados para introduzir grupos de ativação em moléculas são conhecidos na técnica (vide por exemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, A- cademic Press: San Diego, CA (1996)). Um grupo de ativação pode ser liga- do diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo), ou através de uma porção Iigadora1 por exem- plo, um grupo divalente CrCi2 em que um ou mais átomos de carbono po- dem ser substituídos por um heteroátomo, tal como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. Porções Iigadoras adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-H- e -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2- O-CH-NH-. Agentes de modificação que compreendem uma porção Iigadora podem ser produzidos, por exemplo, através da reação de um mono-Boc- alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc-diamino- hexano) com ácido graxo na presença do 1-etil-3-carbodi-imida (3- dimetilaminopropil) (EDC) para formar uma ligação de amida entre amina livre e carboxilato de ácido graxo. O grupo de proteção Boc pode ser remo- vido do produto através do tratamento com o ácido trifluoroacético (TFA) pa- ra expor um amina primária que pode ser ligada a outro carboxilato como descrito, ou pode ser reagida com o anidrido maleico e o produto resultante ciclizado para produzir um derivado maleimido ativado de ácido graxo. (Vide, por exemplo, Thompson, et al., WO 92/16221, ensinamentos completos dos quais são incorporados neste pedido por referência).
Os corpos miméticos modificados da invenção podem ser pro- duzidos através da reação de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou fragmento de ligação ao Iigante com um agente de modificação. Por exemplo, as porções orgânicas podem ser ligadas ao corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO de uma maneira não-sítio específica através do emprego um agente de modificação aminor- reativo, por exemplo, um éster NHS de PEG. Corpos miméticos humanos modificados ou fragmentos de ligação ao Iigante também podem ser prepa- rados através da redução das ligações dissulfeto (por exemplo, ligações in- tracadeia dissulfeto) de um corpo mimético de núcleo de articulação miméti- ca da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou fragmento de ligação ao ligante. O núcleo de articulação de corpo mimético da EPO mimético re- duzido ou outro agonista do receptor da EPO ou fragmento de ligação ao Iigante então pode ser reagido com um agente de modificação tiol-reativo para produzir o núcleo de articulação de corpo mimético da EPO mimético ou outro agonista do receptor da EPO da invenção. Corpos miméticos hu- manos modificados e fragmentos de ligação ao Iigante compreendendo uma porção orgânica que é ligada a sítios específicos de um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção podem ser preparados usando métodos adequados, tais como proteólise reversa (Fisch et al, Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et ah, Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al. Protein ScL 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al, Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al, Biote- chnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), e os métodos descritos em Herman- son, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).
Composições de Corpos Miméticos de Núcleo de Articulação Mimética da EPO ou Outros Agonistas de Receptor da EPO
A presente invenção também fornece pelo menos um corpo mi- mético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do re- ceptor da EPO ou porção especificada ou composição de variante compre- endendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais corpos miméticos ou porções especificadas ou variantes dos mesmos, como descritos neste pe- dido e/ou como conhecido na técnica que são fornecidos em uma composi- ção, mistura ou forma que não ocorrem naturalmente. Tais percentagens de composição são em peso, volume, concentração, molaridade, ou molalidade como soluções líquidas secas, misturas, suspensão, emulsões ou coloides, como conhecido na técnica ou como descrito neste pedido.
Tais composições podem compreender 0,00001 a 99,9999 por cento em peso, volume, concentração, molaridade, ou molalidade como Ii- quido, gás, ou soluções secas, misturas, suspensão, emulsões ou coloides, como conhecido na técnica ou como descrito neste pedido, em qualquer fai- xa ou valor nesses, tal como mas não limitadas a 0,00001, 0,00003, 0,00005, 0,00009, 0,0001, 0,0003, 0,0005, 0,0009, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1.6, 1.7, 1.8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9%. Tais composições da presente invenção dessa forma incluídas, mas não são limitadas a 0,00001 a 100 mg/ml e/ou 0,00001 a 100 mg/g. A composição pode ainda compreender opcionalmente uma
quantidade eficaz de pelo menos um composto ou proteína selecionada de pelo menos um fármaco anti-infeccioso, um fármaco para sistema cardio- vascular (CV), um fármaco para sistema nervoso central (CNS), um fármaco para sistema nervoso autônomo (ANS), um fármaco para trato respiratório, um fármaco para trato gastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fár- maco para fluido ou equilíbrio eletrolítico, um fármaco hematológico, um an- tineoplásico, um fármaco imunomodulador, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutricional ou similares. Tais fárma- cos são bem conhecidos na técnica, incluindo formulações, indicações, do- sagem e administração para cada uma apresentada neste pedido (vide., por exemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shan- non, Wilson, Stang, Prentice-Hall, lnc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcothe- rapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, cada um inteiramente incorporado neste pedido por referência).
Corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou composições de variantes da presente invenção pode compreender ainda pelo menos qualquer um dos auxiliares adequados, tais como, mas não limitados a, dilu- ente, ligante, estabilizador, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou similar. Auxiliares farmaceuticamente aceitáveis são preferen- ciais. Exemplos não-limitantes, e métodos de preparação de tais soluções estéreis são bem conhecidos na técnica, tais como, mas limitados a, Genna- ro, Ed., Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publi- shing Co. (Easton, PA) 1990. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser costumeiramente selecionados que são adequados para o modo de ad- ministração, estabilidade e/ou solubilidade da composição de corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO também conhecidos na técnica ou como descrito neste pedido.
Excipientes farmacêuticos e aditivos úteis na presente composi- ção incluem, mas não são limitados a proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídios, e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra-, e oligossacarídeos; açúcares derivados, tais como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e similares; e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em com- binação, compreendendo somente ou em combinação de 1 a 99,99% em peso ou volume. Exemplos de excipientes proteicos incluem albumina séri- ca, tal como albumina sérica humana (HSA), albumina recombinante huma- na (rHA), gelatina, caseína, e similares. Aminoácidos /corpos miméticos de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou componentes de variantes representativos, que também podem funcionar em uma capacidade de tamponamento, inclui alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame, e similares. Um aminoácido preferencial é glicina.
Excipientes de carboidrato adequados para uso na invenção in- cluem, por exemplo, monossacarídeos, tais como frutose, maltose, galacto- se, glicose, D-manose, sorbose, e similares; dissacarídeos, tais como Iacto- se, sacarose, trehalose, celobiose, e similares; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranas, amidos, e similares; e aldi- tóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glicitol), mioino- sitol e similares. Excipientes de carboidrato preferenciais para uso na pre- sente invenção são manitol, trehalose, e rafinose.
Composições de corpo mimético de núcleo de articulação mimé- tica da EPO ou outros agonistas do receptor da EPO também podem incluir um tampão ou um agente de ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado de um ácido orgânico ou base. Os tampões representativos inclu- em sais ácidos orgânicos, tais como sais do ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acé- tico, ou ácido ftálico; tampões Tris, hidrocloreto de trometamina, ou fosfato. Tampões preferenciais para uso nas presentes composições são sais ácidos orgânicos, tais como citrato.
Adicionalmente, as composições corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou por- ção especificada ou variante da invenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos, tais como polivinilpirrolidonas, ficóis (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-p- ciclodextrina), polietileno glicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicro- bianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensoativos (por e- xemplo, polissorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídios (por exemplo, fosfolipídios, ácidos graxos), esteroides (por exemplo, colesterol), e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).
Estes excipientes adicionais farmacêuticos conhecidos e/ou adi- tivos adequados para uso nas composições de corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outros agonistas do receptor da EPO de acordo com a invenção são conhecidos na técnica, por exemplo, como lista- do em "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19^ ed., Williams & Williams, (1995), and in the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medi- cal Economics, Montvale, NJ (1998), as revelações das quais são inteira- mente incorporadas neste pedido por referência. Veículos preferenciais ou materiais excipientes são carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos. Formulações
Como observado acima, a invenção fornece formulações está-
veis, que podem incluir preferencialmente um tampão adequado com salina ou um sal escolhido, bem como soluções e formulações conservadas opcio- nais que contêm um conservante bem como formulações conservadas mul- tiuso adequadas para uso farmacêutico ou veterinário, compreendendo pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Formulações conservadas contêm pelo menos um conservante conhecido ou opcionalmente seleciona- do do grupo composto de pelo menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, benzil álcool, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexahidrato), alquilparabe- no (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, de-hidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Qualquer concentração ou mistura adequadas po- dem ser usadas como conhecido na técnica, tal como 0,001 a 5%, ou qual- quer faixa ou valor nesses, tal como, mas não limitados a 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, ou qualquer faixa ou valor nesses. Exemplos não-limitantes não incluem conservante, m-cresol 0,1 a 2% (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), benzil álcool 0,1 a 3% (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), timerosal 0,001 a 0,5% (por exemplo, 0,005, 0,01), fenol 0,001 a 2,0% (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), alquilparabeno(s) 0,0005 a 1,0% (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), e si- milares.
Como observado acima, a invenção fornece um artigo de fabri- cação, compreendendo material empacotado e pelo menos um frasco com- preendendo uma solução de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou por- ção especificada ou variante com conservantes e/ou tampões prescritos, opcionalmente em um diluente aquoso, em que o dito material empacotado compreende uma marca que indica que tal solução pode ser realizada du- rante o período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas ou maior. A invenção compreende ainda um artigo de fabrica- ção, compreendendo material empacotado, um primeiro frasco compreen- dendo Iiofilizado de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especifi- cada ou variante, e um segundo frasco compreendendo um diluente aquoso do tampão prescrito ou conservante, em que o dito material empacotado compreende uma marca que instrui um paciente para reconstituir pelo me- nos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante no diluente aquoso para formar uma solução que pode ser considerada durante o perío- do de vinte e quatro horas ou maior.
Pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação miméti- ca da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante usada conforme a presente invenção pode ser produzido por meios de recombinação, incluindo preparações de células de mamífero ou transgê- nicos, ou pode ser purificado a partir de outras fontes biológicas, como des- crito neste pedido ou como conhecido na técnica.
A faixa de quantidades de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante no produto da presente invenção inclui quantidades produzidas após reconstituição, se em um sistema úmi- do/seco, concentrações de aproximadamente 1,0 pg/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, embora concentrações menores ou maiores sejam operacionais e são dependentes do veículo de entrega desejado, por exemplo, formula- ções de solução será diferente no adesivo transdérmico, pulmonar, transmu- cosa, ou métodos de microbomba ou osmóticos.
Preferencialmente, o diluente aquoso opcionalmente ainda com- preende um conservante farmaceuticamente aceitável. Conservantes prefe- rendais incluem os selecionados do grupo composto de fenol, m-cresol, p- cresol, o-cresol, clorocresol, benzil álcool, alquilparabeno (metila, etila, propi- la, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, de- hidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos. A concentração do conservante usado na formulação é uma concentração suficiente para produzir um efeito antimicrobiano. Tais concentrações são dependentes do conservante selecionado e são prontamente determinadas pelo versado.
Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tam-
pões, antioxidantes, potencializadores de conservantes, podem ser opcio- nalmente e preferencialmente adicionados ao diluente. Um agente de isoto- nicidade, tal como glicerina, é comumente usado em concentrações conhe- cidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é preferencialmente adicionado para fornecer o controle melhorado de pH. As formulações podem cobrir uma larga faixa de pH, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximada- mente pH 10, e faixas preferenciais de aproximadamente pH 5 a aproxima- damente pH 9, e uma mais preferencial faixa de aproximadamente 6,0 a a- proximadamente 8,0. Preferencialmente, as formulações da presente inven- ção têm pH entre aproximadamente 6,8 e aproximadamente 7,8. Tampões preferenciais incluem tampões fosfato, o mais preferencialmente fosfato de sódio, particularmente salina de fosfato tamponado (PBS).
Outros aditivos, tais como uns solubilizadores farmaceuticamen- te aceitáveis como Tween 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polio- xietileno (20) mono-oleato de sorbitano), Pluronic F68 (blocos de copolíme- ros polioxietileno polioxipropileno), e PEG (polietileno glicol) ou tensoativos não-iônicos, tais como polissorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184 ou 188, Pluronic ® polilas, outro bloco de co-polímero, e quelantes, tal como EDTA e EGTA podem ser opcionalmente adicionados às formulações ou composi- ções para reduzir a agregação. Estes aditivos são especialmente úteis se uma bomba ou recipiente plástico é usado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável diminui a propensão à proteína para agregar-se. As formulações da presente invenção podem ser preparadas
através de um processo compreendendo a mistura de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante e um conservante sele- cionado do grupo composto de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocre- sol, benzil álcool, alquilparabeno, (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, de-hidroacetato de sódio e timerosal ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Mistura de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante e conservante em um diluente aquoso é realizado usando dissolução conven- cional e procedimentos de mistura. Para preparar uma formulação adequa- da, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante na solução tampão é combinada com o conservante desejado em uma solução tampão em quantidades sufi- cientes para fornecer a proteína e conservante nas concentrações deseja- das. Variações deste processo seriam reconhecidas por um versado na téc- nica ordinária. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adiciona- dos, se os aditivos adicionais são usados, a temperatura e pH no qual a for- mulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e meios de administração usados. As formulações reivindicadas podem ser fornecidas a pacientes
como soluções límpidas ou como frascos duplos compreendendo um frasco de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética da EPO Iiofilizado ou outro agonista do receptor da EPO ou porção especificada ou variante que é reconstituído com um segundo frasco contendo água, um conservante e/ou excipiente, preferencialmente um tampão fosfato e/ou sali- na e um sal escolhido, em um diluente aquoso. Um frasco de solução único ou frasco duplo que requer reconstituição podem ser reutilizados múltiplas vezes e podem ser suficientes para ciclos únicos ou múltiplos do tratamento do paciente e dessa forma podem fornecer um regime de tratamento mais adequado do que atualmente disponível.
Os presentes artigos de fabricação reivindicados que são úteis para a administração durante o período de imediatamente a vinte e quatro horas ou maiores. Consequentemente, os artigos reivindicados presente- mente da fabricação oferecem vantagens significantes para o paciente. For- mulações da invenção podem ser opcionalmente ser estocadas seguramen- te a temperaturas de aproximadamente 2 a aproximadamente 40°C e con- servar atividade biologicamente da proteína por períodos de tempo exten- sos, assim, permitindo uma marca no pacote indicando que a solução pode ser realizada e/ou usada durante o período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ou 96 horas ou mais. Se o diluente conservado for usado, tal marca pode incluir o uso até pelo menos de 1 a 12 meses, meio, um e meio, e/ou dois anos.
As soluções de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante na invenção podem ser preparadas através de um processo compreendendo a mistura de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante em um diluente aquoso. A mistura é realizada usando dissolução convencional e procedimentos de mistura. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante em água ou tampão é combinada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e opcionalmente um conservante ou tampão nas concentrações desejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por um versado na técnica ordinária. Por exemplo, a ordem em que os componentes são adicionados, se aditivos adicionais são usados, a temperatura e pH no qual a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.
Os produtos reivindicados podem ser fornecidos a pacientes como soluções límpidas ou como frascos duplos compreendendo um frasco de Iiofilizado de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especifi- cada ou variante que é reconstituído com um segundo frasco que contém o diluente aquoso. Um frasco de solução único ou frasco duplo que requer re- constituição podem ser reutilizados múltiplas vezes e podem ser suficientes para ciclos únicos ou múltiplos do tratamento do paciente e dessa forma po- dem fornecer um regime de tratamento mais adequado do que atualmente disponível.
Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente a
pacientes através do fornecimento a farmácias, clínicas, ou outras tais insti- tuições e instalações, soluções límpidas ou frascos duplos compreendendo um frasco de Iiofilizado de pelo menos um corpo mimético de núcleo de arti- culação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante que é reconstituída com um segundo frasco con- tendo o diluente aquoso. A solução límpida neste caso pode ser de até um litro ou mesmo maior em tamanho, fornecendo um grande reservatório do qual porções menores de pelo menos um corpo mimético de núcleo de arti- culação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou solução de variantes podem ser recuperadas uma ou múlti- plas vezes por transferência em frascos menores e fornecidas através de farmácia ou clínica aos seus clientes e/ou pacientes.
Dispositivos reconhecidos compreendendo estes sistemas de frasco único incluem dispositivos injetores em caneta de frascos únicos ou duplos para entrega de uma solução de fármaco para uso na presente in- venção, bem como compreendendo opcionalmente ainda um sistema de frasco duplo que inclui aqueles sistemas injetores em caneta para reconstitu- ição de um fármaco Iiofilizado em um cartucho para a entrega da solução de fármaco, também conhecida na técnica. Tais como os descritos em Patentes U.S. 6.203.530, 5.026.349, 5.567.160, 5.954.738, 5.879.327, 5.599.302, 6.015.438, 6.461.333, 6.517.517, 6.077.247, 6.099.504, 6.428.528, 6.387.078, 5.868.711, 5.960.797, 5.176.643, 5.271.744, 5.405.362, 5.451.210, 5.137.516, 5.176.643, 5.300.030, 5.295.965, 5.425.715, 5.478.316, 5.575.777, 5.599.309, 5.681.291, 5.709.662, 5.779.677, 5.913.843, 5.843.036, 5.957.897, 6.428.528, 6.086.562, 6.099.503, 6.221.044, 6.270.479, 6.258.068, 6.391.003, 6.280.421, 6.045.534, 6.371.939, 6.090.078, 5.267.963, 5.487.732, 5.425.715, 6.575.939, 6.565.540, 6.159.181. 6.179.812, 6.544.234, 6.572.581, 6.676.630, 6.083.197, 6.203.530, 6.270.479, 6.371.939, 5.575.777, 6.090.078, 6.743.199, 6.589.210, 6.689.093, 6.783.509, 6.645.170, 6.641.554, 6.796.967, 6.645.181, 6.641.565, 6.575.939, 6.569.115, 6.673.049, 6.641.560, 6.569.124, 6.699.220, 6.638.256, 6.607.508, 6.607.510, 6.776.777, 6.767.336, 6.595.962, 6.740.062, 6.565.553, 6.746.429, 6.569.123, 6.595.957, 6.770.056, que são inteiramente incorporados neste pedido por referência.
Os produtos então reivindicados incluem o material empacotado. O material empacotado fornece, além da informação necessária pelas agên- cias reguladoras, as condições sob as quais o produto pode ser usado. O material empacotado da presente invenção fornece instruções ao paciente para reconstituição de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articula- ção mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção es- pecificada ou variante no diluente aquoso para formar uma solução e para uso da solução durante o período de 2 a 24 horas ou mais para os dois fras- cos, produto úmido/seco. Para o frasco único, produto de solução, a marca indica que tal solução pode ser usada durante o período de 2 a 24 horas ou mais. Os produtos então reivindicados são úteis para uso de produto farma- cêutico humano.
As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende a mistura de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante e um tampão selecionado, prefe- rencialmente um tampão fosfato contendo salina ou um sal escolhido. Mistu- ra de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou vari- ante e tampão em um diluente aquoso é realizado usando dissolução con- vencional e procedimentos de mistura. Para preparar uma formulação ade- quada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um corpo mi- mético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do re- ceptor de EPO ou porção especificada ou variante em água ou tampão é combinada com o agente de tamponamento desejado em água em quanti- dades suficientes para fornecer a proteína e tampão nas concentrações de- sejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por um versado na técnica ordinária. Por exemplo, a ordem em que os componentes são adi- cionados, se os aditivos adicionais são usados, a temperatura e pH no qual a formulação é preparada, todos os fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.
As formulações estáveis ou conservadas reivindicadas podem ser fornecidas a pacientes como soluções límpidas ou como frascos duplos compreendendo um frasco de Iiofilizado de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante que é reconstituída com um segun- do frasco que contém um conservante ou tampão e excipientes em um dilu- ente aquoso. Um frasco de solução único ou duplo que requer reconstituição podem ser reutilizados múltiplas vezes e podem ser suficientes para ciclos únicos ou múltiplos do tratamento do paciente e dessa forma fornecem um regime de tratamento mais adequado do que atualmente disponível.
Pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação miméti- ca de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante nas formulações estáveis ou conservadas ou soluções descritas neste pedido, podem ser administradas a um paciente conforme a presente invenção via vários métodos de entrega incluindo injeção SC ou IM; trans- dérmica, pulmonar, transmucosa, implante, bomba osmótica, cartucho, mi- crobomba, ou outros meios apreciados pelo versado, como bem conhecido na técnica.
Aplicações Terapêuticas
A presente invenção de corpos miméticos também fornece um método para modulação ou tratamento de distúrbios relacionadas à intole- rância à glicose e/ou anemia relacionada à doença renal, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente.
A presente invenção também fornece um método para modula- ção ou tratamento de distúrbios relacionadas à intolerância à glicose e/ou anemia relacionada à doença renal ou condição relacionada à célula san- güínea, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente, em que a dita anemia ou condição relacionada célula sangüínea é associada com pelo menos um incluindo, mas não limitado a, pelo menos uma doença imune relacionada, doença cardiovascular, contagiosa, doença maligna e/ou neuro- lógica. Tal método pode compreender opcionalmente a administração de uma quantidade eficaz de pelo menos uma composição ou composição far- macêutica compreendendo pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia.
Qualquer método da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Tal método pode compreender opcionalmente, além disso, co-administração ou em combina- ção com terapia para tratar tais doenças imunes, em que a dita administra- ção de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO, porção especificada ou variante do mesmo, compreende ainda a administração, antes concorrentemente, e/ou após, pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, mas não limitado a um anticorpo ou fragmento de TNF, um receptor ou fragmento de TNF solúvel, proteínas de fusão dos mesmos, ou uma pequena molécula antagonista de TNF), um antirreumático, um rela- xante muscular, um narcótico, um fármaco anti-inflamatório não-esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (por exemplo, aminoglico- sídeo, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenem, cefa- losporina, uma fluorquinolona, uma macrolida, uma penicilina, uma sulfona- mida, uma tetraciclina, outro antimicrobiano), um antipsoriático, um corticos- teroide, um esteroide anabólico, um agente relacionado a diabetes, um mi- neral, um nutricional, um agente tireoidiano, uma vitamina, um hormônio re- lacionado ao cálcio, um antidiarreico, um antitussígeno, um antiemético, um antiúlcera, um laxante, um anticoagulante, uma eritropoieitina (por exemplo, epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargra- mostim (GM-CSF, Leukine), uma imunização, uma imunoglobulina, um imu- nossupressor (por exemplo, basiliximabe, ciclosporina, daclizumabe), um hormônio de crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modula- dor de receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente alquilante, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um medicamento radio- farmacêutico, um antidepressivo, agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, uma medicação para asma, um agonista beta, um esteroide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, um cromolina, uma epinefrina ou análogo, dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonísta de citocina. Dosagens adequadas são bem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nc' Edition, Apple- ton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada referência das quais são inteiramente incorporadas neste pedi- do por referência.
Como usado neste pedido, um "anticorpo de fator de necrose tumoral", "anticorpo de TNF", "anticorpo de TNFa", ou fragmento e similares reduz, bloqueia, inibe, elimina ou interfere com a atividade TNFa in vitro, in situ e/ou preferencialmente in vivo. Por exemplo, um anticorpo humano TNF adequado da presente invenção pode ligar-se a TNF e inclui anticorpos anti- TNF, fragmentos ligação a antígeno dos mesmos, e domínios ou mutantes especificados dos mesmos que se ligam especificamente a TNFa. Um anti- corpo ou fragmento TNF adequado também pode reduzir, bloquear, eliminar, interferir, prevenir e/ou inibir a síntese de RNA, DNA ou a síntese de proteí- na TNF, liberação de TNF, sinalização do receptor de TNF, clivagem de TNF de membrana, atividade de TNF, produção e/ou síntese de TNF. Tipicamente, tratamento de condições patológicas é efetuado através de administração de uma quantidade ou dosagem eficaz de pelo menos uma composição do corpo mimético de núcleo de articulação miméti- ca de EPO ou outro agonista do receptor de EPO que total, na média, uma faixa de pelo menos aproximadamente 0,001 a 500 miligramas de pelo me- nos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante/quilograma do paciente por dose, e preferencialmente de pelo menos aproximadamente 0,01 a 100 miligramas de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante/quilograma do paciente por administração única ou múltipla, depen- dendo da atividade específica do contido na composição. Alternativamente, a concentração sérica eficaz pode compreender 0,001 a 5000 pg/ml de con- centração sérica por administração única ou múltipla. Dosagens adequadas são conhecidas por médicos e dependerão, naturalmente, do estado da do- ença particular, atividade específica da composição que é administrada, e o paciente particular sofrendo tratamento. Em alguns exemplos, para alcançar a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessário fornecer administra- ção repetida, isto é, repetidas administrações individuais de uma dose parti- cular controlada ou medida, onde as administrações individuais são repeti- das até que a dose diária desejada ou efeito seja alcançado.
Doses preferenciais podem incluir opcionalmente 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, e/ou 30 mg/kg/administração, ou qualquer faixa, valor ou fração das mesmas, ou para atingir uma concentração sérica de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, e/ou 5000 pg/ml de concentração sérica por administra- ção única ou múltipla, ou qualquer faixa, valorou fração das mesmas.
Alternativamente, a dosagem administrada pode variar depen-
dendo de fatores conhecidos, tais como as características farmacodinâmicas do agente particular, e seu modo e via da administração; idade, saúde, e peso do recipiente; natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento concorrente, freqüência do tratamento, e o efeito desejado. Normalmente uma dosagem do ingrediente ativo pode ser a aproximadamente de 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Ordinariamente de 0,1 a 50, e preferencialmente 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administra- ção ou na forma de liberação sustentada é eficaz para obter resultados de- sejados.
Como um exemplo não-limitante, tratamento de humanos ou
animais pode ser fornecido como uma dosagem única ou periódica de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção de 0,01 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um dos dias 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou alternativamente, pelo menos uma das semanas 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, ou qualquer combina- ção das mesmas, usando doses únicas, infusão ou repetidas.
As formas de dosagem (composição) adequadas para a admi- nistração interna geralmente contêm de aproximadamente 0,0001 miligra- mas a aproximadamente 500 miligramas do ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nestas composições farmacêuticas, o ingrediente ativo estará presente ordinariamente em uma quantidade de aproximadamente 0,5 a 95% em peso baseado no peso total da composição. Para a administração parenteral, corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante pode ser formulado como uma solução, sus- pensão, emulsão ou pó Iiofilizado em associação, ou fornecido separada- mente, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos é água, salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e albumina sérica humana a 5%. Lipossomas e veículos não-aquosos, tais como óleos fixados também podem ser usados. O veículo ou pó Iiofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservan- tes). A formulação é esterilizada por técnicas conhecidas ou adequadas.
Veículos farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de Remington1S Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de refe- rência-padrão neste campo. Administração Terapêutica
Muitos modos conhecidos e desenvolvidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuti- camente eficazes de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articula- ção mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção es- pecificada ou variante de acordo com a presente invenção. Enquanto a ad- ministração pulmonar é usada na descrição seguinte, outros modos de ad- ministração podem ser usados de acordo com a presente invenção com re- sultados adequados.
Um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO da presente invenção pode ser entre- gue em um veículo, como uma solução, emulsão, coloide, ou suspensão, ou como um pó, usando algum de uma variedade de dispositivos e métodos adequados para a administração através de inalação ou outros modos des- critos neste pedido ou conhecido na técnica. Formulações Parenterais e Administração
Formulações da administração parenteral podem conter como excipientes comuns, água estéril ou salina, polialquileno glicóis, tal como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e simila- res. Suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser preparadas através do uso de um emulsificador ou umidificador apropriado e um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Agentes da injeção po- dem ser um agente de diluição não-oralmente administrável não-tóxico, tal como solução aquosa ou uma solução injetável estéril ou suspensão em um solvente. Como veículo ou solvente usável, água, solução de Ringer, salina isotônica, etc. são permitidos; como um solvente ordinário, solvente de sus- pensão ou óleo não-volátil, estéril pode ser usado. Com estes objetivos, qualquer espécie de óleo não-volátil e ácido graxo pode ser usada, incluindo óleos gordurosos naturais ou sintéticos ou semissintéticos ou ácidos graxos; mono- ou di- ou triglicerídeos naturais ou sintéticos ou semissintéticos. A administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, mas não é limita- da a, meios convencionais das injeções, um dispositivo de gás pressurizado sem injeção de agulha como descrito na Patente U.S. N0 5.851.198, e um dispositivo perfurante de raio laser como descrito na Patente U.S. N0 5.839.446 inteiramente incorporado neste pedido por referência. Entrega Alternativa
A invenção ainda relaciona-se à administração de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação de EPO mimético ou outro ago- nista do receptor de EPO ou a porção especificada ou a variante por meios parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, bolus, vaginal, retal, bo- cal, sublingual, intranasal, ou transdérmicos. Composições de corpo miméti- co de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante podem ser preparadas para uso por administração parenteral (subcutâneo, intramuscular ou intravenoso) particularmente na forma de soluções líquidas ou suspensões; para uso em administração vaginal ou retal particularmente em formas semissólidas, tais como natas e supositórios; para administração bucal ou sublingual, particu- Iarmente na forma de pastilhas ou cápsulas; ou intranasalmente particular- mente na forma de pó, gotas nasais ou aerossóis ou agentes exatos; ou par- ticularmente transdermicamente na forma de um gel, unguento, loção, sus- pensão ou sistema de entrega de adesivo com potencializadores químicos, tais como dimetil sulfóxido para modificar a estrutura da pele ou aumentar a concentração de fármaco no adesivo transdérmico (Junginger, et al. em "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Mareei Dek- ker, Inc. New York 1994, inteiramente incorporado neste pedido por referên- cia), ou com agentes oxidantes que permitem à aplicação de formulações que contêm proteína e peptídeos para a pele (WO 98/53847), ou aplicações de campos elétricos para criar vias de transporte transientes, tais como ele- troporação, ou para aumento da mobilidade de fármacos carregadas através da pele, tais como iontoforese, ou aplicação de ultrassom, tais como sonofo- rese (Patente U.S. Nos 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações e patentes acima mencionadas são inteiramente incorporadas neste pedido por refe- rência).
Administração Pulmonar/Nasal Para a administração pulmonar, preferencialmente pelo menos
uma composição de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou vari- ante é entregue em um tamanho de partícula eficaz para atingir as vias aé- reas inferiores do pulmão ou seios. De acordo com a invenção, pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro ago- nista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante pode ser en- tregue por qualquer de vários dispositivos de inalações ou nasais conheci- dos na técnica pela administração de um agente terapêutico. Estes dispositi- vos capazes de deposição formulações aerossolisadas na cavidade do seio ou nos alvéolos do paciente incluem inaladores de dose medida, nebulizado- res, geradores de pó secos, pulverizadores, e similares. Outros dispositivos adequados para direcionamento da administração pulmonar ou nasal de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante também são conhe- cidos na técnica. Todos tais dispositivos podem usar formulações adequa- das para a administração da dispersão de corpo mimético de núcleo de arti- culação de EPO mimético ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou a variante em um aerossol. Tais aerossóis podem ser com- preendidos por qualquer solução (tanto aquosa como não aquosa) ou partí- culas sólidas. Inaladores de dose medida como inalador de dose medida Ventolin®, tipicamente usa um gás propulsor e necessita de acionamento durante a inspiração (Vide, por exemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Os inaladores de pó secos como Turbuhaler® (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Dis- kus® (Glaxo), inalador Spiros® (Dura), dispositivos vendidos por Inhale The- rapeutics, e o inalador de pó Spinhaler® (Fisons), usam o acionamento da respiração de uma mistura de pó (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale1 WO 94/06498 Fi- sons, inteiramente incorporado neste pedido por referência). Nebulizadores como AERx® Aradigm, nebulizador Ultraopen ® (Mallinckrodt), e o nebuliza- dor Acorn II® (Marquest Medicai Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), as referências acima mencionadas inteiramente incorporadas neste pedido por referência, produzem aerossóis a partir de soluções, en- quanto os inaladores de dose medida, inaladores de pó secos, etc. geram pequenos aerossóis de partícula. Estes exemplos específicos de dispositivos de inalação comercialmente disponíveis são destinados para ser representa- tivos de dispositivos específicos adequados para a prática desta invenção, e não são destinados como limitação do alcance da invenção. Preferencial- mente, uma composição compreendendo pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante é entregue por um inalador de pó seco ou um pulverizador. Há várias características desejáveis de um disposi- tivo de inalação para administração de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante da presente invenção. Por exemplo, a entrega pelo dispositivo de inalação é vantajosamente fiável, reprodutível, e exata. O dispositivo de inalação pode entregar opcionalmente pequenas partículas secas, por exemplo, menos de aproximadamente 10 pm, prefe- rencialmente aproximadamente 1 a 5 pm, para boa respirabilidade.
Administração de Composições de corpos miméticos de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante como um pulverizador
Uma composição proteica de pulverização incluindo um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante pode ser produzida for- çando uma suspensão ou solução de pelo menos um corpo mimético de nú- cleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante através de um bocal sob pressão. O ta- manho e configuração do bocal, a pressão aplicada, e taxa de alimentação líquida podem ser escolhidos para atingir a produção desejada e tamanho de partícula. Um eletropulverizador pode ser produzido, por exemplo, por um campo elétrico com relação à alimentação do bocal ou um tubo capilar. Van- tajosamente, as partículas de pelo menos uma composição proteica de cor- po mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante entregue por um pulve- rizador têm um tamanho de partícula de menos de aproximadamente 10 pm, preferencialmente na faixa de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, e o mais preferencialmente aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.
Formulações de pelo menos uma composição proteica de corpo
mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante adequada para o uso com um pulverizador tipicamente incluem composição proteica de corpo mi- mético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do re- ceptor de EPO ou porção especificada ou variante em uma solução aquosa em uma concentração de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de pelo menos uma composição proteica de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante por ml da solução. A formulação pode incluir agentes, tais como um excipiente, um tampão, um agente isotônico, um con- servante, um tensoativo, e, preferencialmente, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou agente para estabilização da composição pro- teica de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína de volume, ou um carboidrato. Proteínas de volume útil na formulação da composição de proteínas de cor- po mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante inclui albumina, prota- mina, ou similares. Carboidratos típicos úteis na formulação da composição de proteínas de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante incluem sacarose, manitol, lactose, trehalose, glicose, ou similares. Formula- ção de composição proteica de corpo mimético de núcleo de articulação mi- mética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especifica- da ou variante também pode incluir um tensoativo, que pode reduzir ou pre- venir a agregação induzida pela superfície da composição proteica de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante causada pela atomiza- ção da solução na formação de um aerossol. Vários tensoativos convencio- nais podem ser empregados, tais como ésteres de ácido graxo de polioxieti- Ieno e alcoóis, e ésteres de ácido graxo de polioxietileno de sorbitol. Quanti- dades estarão geralmente na faixa entre 0,001 e 14% em peso da formula- ção. Tensoativos especialmente preferenciais com objetivos desta invenção são polioxietileno sorbitano mono-oleato, polissorbato 80, polissorbato 20, ou similares. Agentes adicionais conhecidos na técnica pela formulação de uma proteína, tais como corpos miméticos, ou porções especificadas ou varian- tes, também podem estar incluídos na formulação.
Administração de composições de corpos miméticos de núcleo de articula- ção mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção es- pecificada ou variante por um Nebulizador
Composição proteica de corpo mimético de núcleo de articula- ção mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção es- pecificada ou variante pode ser administrado por um nebulizador, tal como jato nebulizador ou um nebulizador ultrassônico. Tipicamente, em um jato nebulizador, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar de alta velocidade por um orifício. Como o gás expande-se além do bocal, uma região de baixa pressão é criada, que puxa uma solução de composição pro- teica de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante por um tu- bo capilar unido a um reservatório líquido. A corrente líquida do tubo capilar é cisalhada em filamentos instáveis e gotículas quando saem do tubo, criam o aerossol. Uma faixa de configurações, taxas de fluxo, e tipos de aleta po- dem ser empregados para atingir as características de realização desejadas de um dado jato nebulizador. Em um nebulizador ultrassônico, a energia elé- trica de alta freqüência é usada para criar energia mecânica vibracional, tipi- camente empregando um transdutor piezoelétrico. Esta energia é transmitida à formulação da composição proteica de corpos miméticos de núcleo de arti- culação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante diretamente ou através de um fluido de união, cri- ando um aerossol incluindo composição proteica de corpo mimético de nú- cleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante. Vantajosamente, as partículas da com- posição proteica de corpos miméticos de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou vari- ante entregue por um nebulizador tem um tamanho menor de partícula que aproximadamente 10 pm, preferencialmente na faixa de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 μιτι, e o mais preferencialmente aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm. Formulações de pelo menos um corpo mimético de núcleo de
articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante adequadas para uso com um nebulizador, jato ou ultrassônico, tipicamente inclui composição proteica de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante em uma solução aquosa em uma concentração de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de pelo menos uma proteína de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante por ml da solução. A formulação pode incluir agentes, tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo, e, preferencialmente, zinco. A formulação também pode incluir um excipiente ou agente para estabilização de pelo menos uma composição proteica de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante, tal como um tampão, um agente redutor, uma proteína de volume, ou um car- boidrato. Proteínas de volume útil na formulação de pelo menos uma com- posição de proteínas de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante inclui albumina, protamina, ou similares. Carboidratos típicos úteis na formulação de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especifi- cada ou variante incluem sacarose, manitol, lactose, trehalose, glicose, ou similares. Pelo menos uma formulação de corpo mimético de núcleo de arti- culação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante também pode incluir um tensoativo, que pode reduzir ou prevenir a agregação induzida pela superfície de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante causada pela atomi- zação da solução na formação de um aerossol. Vários tensoativos conven- cionais podem ser empregados, tais como ésteres de ácido graxo de polioxi- etileno e alcoóis, e ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbital. Quanti- dades estarão na faixa geralmente entre 0,001 e 4% em peso da formula- ção. Tensoativos especialmente preferenciais para os objetivos desta inven- ção são polioxietileno sorbitano mono-oleato, polissorbato 80, polissorbato 20, ou similares. Agentes adicionais conhecidos na técnica pela formulação de uma proteína, tais como pelo menos uma proteína de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante também podem ser incluídos na formulação. Administração de composições de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especifi- cada ou variante por um Inalador de Dose Medida
Em um inalador de dose medida (MDI), um propelente, pelo me- nos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante, e quais- quer excipientes ou outros aditivos são contidos em uma lata como uma mis- tura incluindo um gás comprimido liqüefeito. O acionamento da válvula de medição lança a mistura como um aerossol, preferencialmente contendo partículas na faixa de tamanho de menos de aproximadamente 10 pm, pre- ferencialmente aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm, e mais preferencialmente aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm. O ta- manho de partícula de aerossol desejado pode ser obtido empregando uma formulação de composição proteica de corpo mimético de núcleo de articula- ção mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção es- pecificada variante produzida por vários métodos conhecidos àqueles versa- dos na técnica, incluindo cisalhamento do jato, secagem por pulverização, condensação de ponto crítico, ou similares. Os inaladores de dose medida preferenciais incluem os fabricados pela 3M ou Glaxo e emprego de um pro- pelente hidrofluorocarbono.
Formulações de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante para uso com um dispositivo de inalador de dose medida incluirão geralmente um pó finamente dividido que contém pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante como uma suspensão em um meio não-aquoso, por exemplo, suspenso em um propelente com a ajuda de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado com esta finalidade, tal como clorofluoro- carbono, um hidroclorofluorocarbono, um hidrofluorocarbono, ou um hidro- carboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetra- fluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluroalcano-227), ou similares. Preferencialmente o propelen- te é um hidrofluorocarbono. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante como uma suspensão no propelente, proteger o agente ativo contra a de- gradação química, e similares. Tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitano, Iecitina de soja, ácido oleico, ou similares. Em alguns casos os aerossóis de solução são preferenciais usando solventes, tais como etanol. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, tal como proteína também pode ser incluída na formulação.
Um versado na técnica ordinária reconhecerá que os métodos da invenção atual podem ser atingidos pela administração pulmonar de pelo menos composições de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variantes via dispositivos não descritos neste pedido. Formulações Mucosais e Administração
Para a absorção através de superfícies mucosas, composições e métodos de administração de pelo menos um corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou por- ção especificada ou variante inclui uma emulsão compreendendo uma plura- lidade de partículas de submícron, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo, e uma fase contínua aquosa, que promove a absorção através das superfícies mucosas pela realização de mucoadesão das partí- culas de emulsão (Patente U.S. Nos 5.514.670). As superfícies mucosas a- dequadas para aplicação de emulsões da presente invenção podem incluir vias de administração corneana, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vagi- nal, pulmonar, estomacal, intestinal, e retal. Formulações para administração vaginal ou retal, por exemplo, supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquilenoglicóis, vaselina, manteiga de cacau, e similares. Formulações para administração intranasal podem ser sólidas e conter como excipientes, por exemplo, Iactose ou podem ser soluções aquosas ou oleo- sas de gotículas nasais. Para administração bucal, os excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pregelinatado, e similares (Patente U.S. N0 5.849.695). Formulações Orais e Administração
As formulações orais dependem da co-administração de adju- vantes (por exemplo, resorcinois e tensoativos não-iônicos, tais como polio- xietileno-oleil éter e n-hexadecilpolietileno éter) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como a co-administração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancreática, di- isopropilfluorofosfato (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzimática. O composto constituinte ativo da forma de dosagem de tipo sólido da adminis- tração oral pode ser misturado com pelo menos um aditivo, incluindo saca- rose, lactose, celulose, manitol, trehalose, rafinose, maltitol, dextrana, ami- dos, ágar, arginatos, quitinas, quitosanas, pectina, goma tragacanta, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semis- sintético, e glicerídeo. Estas formas de dosagem também podem conter ou- tro tipo(s) de aditivos, por exemplo, agente de diluição inativo, lubrificante, tal como estearato de magnésio, parabeno, agente conservante, tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxidante, tal como cisteína, de- sintegrante, ligador, espessante, agente de tamponamento, agente adoçan- te, agente aromatizante, agente perfumante, etc.
Pastilhas e pílulas podem ainda ser processadas em prepara- ções entéricas revestidas. As preparações líquidas para a administração oral incluem emulsão, xarope, elixir, suspensão e preparações de solução ad- missíveis para uso médico. Estas preparações podem conter agentes de diluição inativos ordinariamente usados no dito campo, por exemplo, água. Lipossomas também foram descritos como sistemas de entrega de fármaco para insulina e heparina (Patente U.S. N0 4.239.754). Mais recentemente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos misturados (proteinoi- des) foram usadas para entregar farmacêuticos (Patente U.S. N0 4.925.673). Além disso, compostos de veículo descritos em Patente U.S. N0 5.879.681 e Patente U.S. N0 5.5.871.753 são usados para entregar agentes biologica- mente ativos por via oral são conhecidos na técnica. Formulações Transdérmicas e Administração
Para a administração transdérmica, pelo menos um corpo mimé- tico de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante é encapsulado em um dispositi- vo de entrega, tal como um Iipossoma ou nanopartículas poliméricas, micro- partícula, microcápsula, ou microesferas (mencionado coletivamente como micropartículas a menos que de outra maneira afirmada). Diversos dispositi- vos adequados são conhecidos, incluindo micropartículas feitas de políme- ros sintéticos, tais como ácidos poli-hidróxi, tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico e co-polímeros dos mesmos, poliortoésteres, polianidridos, e polifosfazenos, e polímeros naturais, tais como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos, e combina- ções dos mesmos (Patente U.S. N0 5.814.599). Administração Prolongada e Formulações Pode ser às vezes desejável entregar os compostos da presente
invenção ao indivíduo por períodos de tempo prolongados, por exemplo, du- rante períodos de uma semana a um ano de uma administração única. Vá- rias formas de liberações lentas, armazenamento ou dosagem de implante podem ser utilizadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não-tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que tem um grau baixo de solubilidade em fluidos corporais, por exemplo, (a) um sal de adição ácida com um ácido polibásico, tais como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamoico, ácido algínico, áci- do poliglutâmico, naftaleno, ácidos mono- ou dissulfônicos, ácido poligalactu- rônico, e similares; (b) um sal com cátion metálico polivalente, tais como zin- co, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e similares, ou com cátion orgânico formado de, por exemplo, Ν,Ν'-dibenzil- etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b) por exem- plo um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, os compostos da presente invenção ou, preferencialmente, um sal relativamente insolúvel, tal como aqueles apenas descritos, podem ser formulados em um gel, por exemplo, um gel de monoestearato de alumínio com, por exemplo óleo de sésamo, adequado para injeção. Sais particularmente preferenciais são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato, e similares. Outro tipo de formula- ção de liberação lenta por injeção conteria o composto ou sal dispersado por encapsulamento em um polímero de degradação lenta, não-tóxico, não- antigênico, tal como um polímero de ácido poliglicólico / ácido poliláctico, por exemplo, como descrito em Patente U.S. N0 3.773.919. Os compostos ou, preferencialmente, sais relativamente insolúveis, tais como os descritos aci- ma também podem ser formulados em péletes da matriz de colesterol silás- ticas, particularmente para uso em animais. Formulações de liberação lenta, armazenamento e implante adicionais, por exemplo, os Iipossomas de gás ou líquidos são conhecidos na literatura (Patente U.S. N0 5.770.222 and "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed„ Mareei Dekker, Inc., N.Y., 1978).
Tendo descrito geralmente a invenção, a mesma será mais pron- tamente entendida por referência aos seguintes exemplos, que são forneci- dos através de ilustração e não são destinados como limitação. Exemplo 1: Clonagem e Expressão de um corpo mimético de núcleo de arti- culação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO em Células de Mamífero
Um típico vetor de expressão em mamífero contém pelo menos
um elemento promotor, que medeia a iniciação da transcrição de mRNA, seqüência de codificação do corpo mimético de núcleo de articulação mimé- tica de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante, e sinalização requerida para a terminação da transcrição e poli- adenilação do transcrito. Elementos adicionais incluem potencializadores, seqüências de Kozak e seqüências íntervenientes flanqueadas por sítios doadores e aceitadores de sítios para splicing de RNA. Transcrição altamen- te eficiente pode ser realizada com promotores precoces e tardios de SV40, as repetições terminais longas (LTRS) de Retrovírus, por exemplo, RSV, HTLVI, HIVI e o promotor precursor do citomegalovírus (CMV). Contudo, elementos celulares também podem ser usados (por exemplo, promotor da actina humana). Vetores de expressão adequados para uso na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vetores, tais como pIRESIneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, or pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) ou pcDNA3.1 /Hygro (+/-) (Invitrogen), PS- VL and PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) e pBC12MI (ATCC 67109). Células hospedeiras de mamífero que podem ser usadas incluem Hela humana 293, células H9 e Jurkat, células de camundongo NIH3T3 e C127, COS 1, COS 7 e CV 1, célu- las de codorna QC1-3, células de camundongo L e células de ovário de hamster chinês (CHO). Alternativamente, o gene pode ser expresso em linhagens celu-
lares estáveis que contêm o gene integrado em um cromossomo. A co- transfecção com um marcador selecionável, tal como dhfr, gpt, neomicina, ou higromicina permite a identificação e isolamento das células transfecta- das.
O gene transfectado também pode ser amplificado para expres-
sar grandes quantidades do corpo mimético de núcleo de articulação de EPO mimético codificado ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante. O marcador DHFR (di-hidrofolato redutase) é útil para desenvolver linhagens celulares que transportam várias centenas ou até vários milhares de cópias do gene de interesse. Outro marcador de sele- ção útil é a enzima glutamina sintase (GS) (Murphy, et al., Biochem. J. 227:277-279 (1991); Bebbington, et al., Bio/Tecnology 10:169-175 (1992)). Usando estes marcadores, as células de mamífero são cultivadas em meio seletivo e as células com maior resistência são selecionadas. Estas Iinha- gens celulares contêm o gene(s) amplificado integrado em um cromossomo. Células de ovário de hamster chinês (CHO) e NSO muitas vezes são usadas para produção de corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variantes.
Os vetores de expressão de pC1 e pC4 contêm promotor forte (LTR) do Vírus de Sarcoma Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) mais um fragmento do CMV-potencializador (Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). Sítios múltiplos de clonagem, por exemplo, com os sí- tios de clivagem das enzimas de restrição BamHI, Xbal e Asp7l8, facilitam a clonagem do gene de interesse. Os vetores contêm, em adição, íntron 3', a poliadenilação e a sinalização de terminação do gene pré-pró-insulina de rato.
Clonagem e Expressão em células CHO
O vetor pC4 é usado para a expressão de corpo mimético de núcleo de articulação mimétíca de EPO ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante. O plasmídeo pC4 é um derivado do plasmídeo pSV2-dhfr (Número de acesso ATCC 37146). O plasmídeo con- tém o gene DHFR de camundongo sob controle do promotor precursor SV40 . Células de ovário de hamster chinês ou outras com falta de atividade di- hidrofolato que são transfectadas com estes plasmídeos podem ser selecio- nadas pelo cultivo das células em um meio seletivo (por exemplo, alpha mi- nus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com o agen- te quimioterápico metotrexato. A amplificação dos genes DHFR em células resistentes a metotrexato (MTX) foi bem documentado (vide, por exemplo, F. W. Alt, et al„ J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin and C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); and M. J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Células cultivadas em concentra- ções crescentes de MTX desenvolvem resistência ao fármaco através da superprodução da enzima alvo, DHFR, como resultado da amplificação do gene DHFR. Se um segundo gene for ligado ao gene DHFR, é normalmente co-amplificado e superexpresso. É conhecido na técnica que esta aborda- gem pode ser usada para desenvolver linhagens celulares que transportam mais de 1.000 cópias do gene(s) amplificado. Posteriormente, quando o me- totrexato é retirado, as linhagens celulares são obtidas que contêm o gene amplificado integrado em um ou mais cromossomo(s) da célula hospedeira.
O plasmídeo pC4 contém para expressar o gene de interesse o promotor forte da repetição terminal longa (LTR) do Vírus de Sarcoma Rous (Cullen, et al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) mais um fragmento isola- do do potencializador do primeiro gene imediato de citomegalovírus humano (CMV) (Boshart, et al., Cell 41:521-530 (1985)). Ajusante do promotor estão BamHI1 Xbal, e sítios de clivagem das enzima de restrição Asp718 que per- mitem a integração dos genes. Atrás destes sítios de clonagem o plasmídeo contém os íntron 3' e o sítio de poliadenilação do gene pré-pró-insulina de rato. Outros promotores de alta eficiência também podem ser usados para expressão, por exemplo, o promotor da b-actina humana, os promotores precursores ou tardios deSV40 ou repetições terminais longas de outros re- trovírus, por exemplo, HIV e HTLVI. Os sistemas de expressão gênica Clon- tech's Tet-Off e Tet-On e sistemas similares pode ser usados para expressar a EPO de um modo regulado em células de mamífero (M. Gossen, and H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547-5551 (1992)). Para poliadenila- ção do mRNA, outras sinalizações, por exemplo, do hormônio de crescimen- to humano ou genes da globina podem ser usados também. As linhagens celulares estáveis que transportam um gene de interesse integrado nos cro- mossomos também podem ser selecionadas na co-transfecção com um marcador selecionável, tal como gpt, G418 ou higromicina. É vantajoso usar mais de um marcador selecionável no começo, por exemplo, G418 mais me- totrexato.
O plasmídeo pC4 é digerido com enzimas de restrição e então defosforilado usando fosfatase intestinal de bezerro por procedimentos co- nhecidos na técnica. O vetor então é isolado em gel de agarose 1 %.
A seqüência de DNA que codifica o corpo mimético de núcleo de articulação de EPO mimético completo ou outro agonista do receptor de EPO ou porção especificada ou variante é usada, correspondente a HC e as regiões variáveis LC do corpo mimético de núcleo de articulação mimética de EPO ou outro agonista do receptor de EPO da presente invenção, de a- cordo com etapas conhecidas do método. O ácido nucleico isolado que codi- fica uma região constante humana adequada (isto é, regiões HC e LC) tam- bém é usado neste construto.
O DNA de codificação da região constante e variável isolado e o vetor defosforilado são então ligados com DNA Iigase T4. E. coli HB101 ou células Blue XL1 então são transformadas e as bactérias que contêm o fragmento inserido no plasmídeo pC4 são identificadas utilizando, por exem- pio, análise de enzima de restrição.
Células de ovário de hamster chinês (CHO) que não tem um ge- ne DHFR ativo são usadas para transfecção. 5 pg do plasmídeo de expres- são pC4 são co-transfectados com 0,5 pg do plasmídeo pSV2-neo usando lipofectina. O plasmídeo pSV2neo contém um marcador selecionável domi- nante, o neo gene de Tn5 que codifica uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos incluindo G418. As células são semeadas em alpha minus MEM suplementado com 1 pg /ml de G418. Depois de 2 dias, as célu- las são tripsinizadas e semeadas em placas de clonagem em hibridoma (Greiner, Germany) em alpha minus MEM suplementado com 10, 25, ou 50 ng/ml de metotrexato mais 1 pg/ml de G418. Depois de aproximadamente 10 a 14 dias os clones únicos são tripsinizados e então semeados em placas petri de 6 poços ou frascos de 10 ml usando concentrações diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Os clones cultiva- dos nas concentrações mais altas de metotrexato então são transferidos pa- ra novas placas de 6 poços que contêm concentrações maiores de metotre- xato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). O mesmo procedimento é repeti- do até que os clones sejam obtidos cultivados em uma concentração de 100 a 200 mM. A expressão do produto gênico desejado é analisada, por exem- pio, por SDS-PAGE e Western blot ou por análise de HPLC em fase reversa. Exemplo 2: Exemplo Não-limitante de um Corpo Mimético de Núcleo de Arti- culação Mimética de EPO da Invenção
Antecedente: EMP-1 (peptídeo mimético da EPO 1) é um peptí- deo de 20 aminoácidos sem homologia de seqüência à eritropoietina huma- na (HuEPO), mas com a capacidade (como um dímero) para ativar o recep- tor da EPO (Wrighton et al, 1996, Science, vol. 273, 458-463). Contudo, sua atividade relativamente baixa (10.000 a 100.000 vezes menor que HuEPO) e meia-vida curta (meia-vida ex vivo de 8 horas em soro a 50%, meia-vida in vivo desconhecida), comprometem sua utilidade como um terapêutico. Por isso, um caminho foi necessário para conferir no peptídeo uma meia-vida mais longa, sem perturbação, e possivelmente melhoria da sua potência. Para este fim, foram feitas várias tentativas para aumentar a atividade de EMP-1 pela estabilização da dimerização do peptídeo ou pela incorporação de peptídeo em estruturas maiores para aumentar a meia-vida. Wrighten et al. (1997, Nature Biotechnology, vol. 15, 1261-65) combinaram EMP-1 com biotina marcada com estreptavidina para estabilizar a dimerização. Viram um aumento de 100 vezes na atividade no ensaio de proliferação celular in vitro. Também usaram anticorpos antibiotina para estabilizar o dímero de peptí- deo, contudo somente um aumento de 10 vezes na atividade foi visto. Os mesmos autores prepararam uma forma dimérica quimicamente definida de EMP-1. Neste caso um aumento de 100 vezes na atividade foi visto in vivo. Outro grupo procurou melhorara atividade de EMP-1 através da ligação co- valente ao polietileno glicol (PEG) (Johnson et al., 1997, Chem. & Bio., vol. 4 (12), 939-50). Informaram um aumento na potência de até 1000 vezes, con- tudo foi encontrado que o construto era imunogênico em camundongos (os anticorpos foram dirigidos ao peptídeo) (Dana Johnson, Personal communi- cations). Kuai et al. (2000, J. Peptide Res., vol. 56, 59-62) inseriram o peptí- deo EMP-1 na seqüência do inibidor de ativação de plasminogênio 1, (PAI- 1). Foi pensado que a inserção de EMP-1 nesta estrutura estabilizaria a di- merização e aumentaria a meia-vida. No ensaio in vivo viu-se que a potência deste construto era significativamente maior, tal como mais de 2500 vezes maior do que EMP-1 sozinha. Deve observar-se que diferentes ensaios in vitro e modelos in vivo foram usados nestes estudos e as potências informa- das podem não ser comparáveis um com outro ou com resultados apresen- tados neste pedido.
Exemplo 3: Corpos Miméticos de Núcleo de Articulação Mimética de EPO da Presente Invenção
Um exemplo específico, não-limitante, desta invenção é o cons- truto de corpo mimético de núcleo de articulação-EMP onde V é o primeiro de vários aminoácidos N-terminais de anticorpo LC ou HC ocorrendo natu- ralmente, P é uma cópia única do peptídeo EMP-1 bioativo e L é uma repeti- ção seqüencial de Gly-Ser ou de Iigadores flexíveis Gly-Gly-Gly-Ser, H é uma região de núcleo de articulação e CH2 & CH3 são da subclasse isotípi- ca IgGI ou lgG4. É pensado que esta estrutura reprimirá o peptídeo EMP-1, mas permitirá a flexibilidade suficiente tal que a dimerização dos peptídeos como parte do homodímero reunido é estabilizado. Além disso, a atividade do corpo mimético de núcleo de articulação-EMP em um ensaio de prolifera- ção de célula in vitro é mais de 500 vezes maior do que o peptídeo EMP-1 e só substancialmente similar ao HuEPO recombinante (rHuEPO). Além disso, espera-se que a meia-vida deste construto será muitas vezes daquele de rHuEPO ou peptídeo EMP-1 sozinho e similar àquela de uma IgG. Consis- temente, camundongos normais tratados com o corpo mimético de núcleo de articulação-EMP alcançam um hematócrito máximo significativamente mais alto em comparação com camundongos tratados com rHuEPO, quando uni- dades de atividade iguais são dadas, e níveis elevados são mantidos duran- te um período mais longo. Este construto é eficientemente secretado a partir de células e parece ser propriamente multiplicado; superando problemas associados com a 1a geração de corpos miméticos. Além da estrutura básica descrita acima, as variantes com ca-
racterísticas biológicas potencialmente favoráveis são descritas. Estas inclu- em construtos que podem ter uma tendência reduzida de autoassociação, funções efetoras imunes reduzidas ou imunogenicidade reduzida. Outras modificações que conferem características desejadas, tais como a confor- mação melhorada do peptídeo biologicamente ativo, e transferência através da barreira hemato-encefálica são visadas. Variantes propostas e modifica- ções podem ser combinadas de qualquer maneira para produzir construtos com atividades desejadas.
Usando métodos de DNA recombinante, o peptídeo EMP-1 foi inserido em um vetor intermediário entre um peptídeo sinal de imunoglobuli- na e uma seqüência J humana. Isto foi feito usando oligonucleotídeos sinté- ticos complementares com fins compatíveis com os presentes sítios de res- trição no vetor. Estes oligonucleotídeos compreendendo seqüências codifi- cadoras para sítio peptidase sinalização de consenso (QIQ), o peptídeo EMP-1 (SEQ ID N°:2), e um Iigador flexível composto de GS ou de GGGS. Um fragmento de restrição que contém os elementos funcionais supracita- dos então foi transferido para um vetor de expressão. Este vetor continha promotor de imunoglobulina e potencializador anti-CD4, e a seqüência de codificação de uma seqüência de núcleo de articulação de IgGI humana, e uma porção de uma região de núcleo de articulação de IgGI, CPPCP (109 a 113 de SEQ ID N°:66, como mostrado na Figura 36C), uma região constante HC 2 (CH2) e região constante 3 (CH3) bem como os elementos necessá- rios para replicação do plasmídeo e seleção em bactérias e seleção para expressão estável em células de mamífero.
Este plasmídeo foi Iinearizado e introduzido na linhagem celular de mieloma de camundongo NSO através de eletroporação. As células resis- tentes foram selecionadas e que expressaram alto de corpo mimético de núcleo de articulação-EMP foram identificadas pelo ensaio de ELISA do so- brenadante de cultura. A purificação do construto de sobrenadante de cultu- ra celular foi realizada por cromatografia de afinidade por proteína A padrão. A passagem do produto purificado por SDS contendo géis de poliacrilamida tanto sob condições de desnaturação como de redução confirmou o tama- nho esperado do produto purificado. A identidade da proteína purificada foi ainda confirmada por espectrofotometria de massa e sequenciamento N- terminal.
As seqüências de aminoácido dos corpos miméticos de núcleo de articulação-EMP são mostradas abaixo. Os domínios funcionais são ano- tados acima da seqüência de codificação de peptídeo. As três seqüências consenso de peptídeo de sinalização de aminoácido eqüivale aos três pri- meiros aminoácidos de uma imunoglobulina ocorrendo naturalmente. Acredi- ta-se que estes aminoácidos contribuem para a remoção eficiente do peptí- deo de sinalização pela peptidase de sinal no retículo endoplasmático. Esta seqüência é imediatamente seguida pela codificação de seqüência EMP-1. Dois aminoácidos C-terminais da seqüência EMP-1 combinada com os seis seguintes aminoácidos formam um Iigador flexível caracterizado pela repeti- ção de Gly-Gly-Gly-Ser. Uma região de seqüência de junção humana (J) se segue. Acredita-se que a seqüência J fornecerá até mais flexibilidade para permitir ao regulador para o dímero EMP-1 assumir conformação própria, e permitir ao regulador para o dímero sobressair da estrutura globular da imu- noglobulina e penetrar na fenda entre dois receptores da EPO. A região de articulação HC também está incluída no construto imediatamente depois da região J. Há três cisteínas na região de articulação IgGI (destacada). A pri- meira iria se juntar normalmente à cadeia leve de imunoglobulina (LC) e as duas segundas participam em ligações intercadeias entre dois HCs. O resto da seqüência é composto de regiões CH2 & CH3, que constituem a maior parte da proteína. Uma das razões que se acredita que imunoglobulinas têm uma meia-vida sérica longa é a sua capacidade de ligar o FcRn que estende a meia-vida sérica pela devolução imunoglobulina pinocitosada de volta ao espaço extracelular. O sítio de ligação de FcRn fica sobreposto à junção das regiões CH2 e CH3 (Sheilds et al, 2001, J. Biol. Chem., vol. 276 (9), 6591- 6604).
A seqüência de peptídeo de corpo mimético de núcleo de articu- lação-EMP que mostra domínios funcionais importantes. V peptídeo ΕΜΡ-1 Ligador Articulação IqGi CH 2
1 QTQGGTYSCHFGFIiTWVCKPQGG GS CPPCP APELLGGP
IgGl CH2 -----------------------------------------------------
61SVFI.FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVXFNWYVDGVEVKNAKTKPREEQYNS
12 2 X YRWSVL TVLiIQDWLNGKEyKCKVSNKAL PAP XKKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL
IqGl CH3
18 3TKNQVSLTCI/V KGF Y PS Π T AVEWE SNGQPENrN Y KTiPPVLDSDG S FFL YS KLTVDKS RWQ
IyGl GH?
241 QG NVF3CS VMK BAL HNH Y TQ KS LS L SPGK (SEQ ID N0-82)
V peptídeo EMP-1 Ligador Articulação IqGl CH2 I QIQGGTYSCHFGPLIWVCKPOGG GGGS CPPCP APELLGGP
IgGl CH2 ------------------------------------------------------------------
SISVFLFPPKPKDTUíISRTPeVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
....------------------ν-™,--,,....™.,..---------------fg,;·. CH3
122T YRVVS VLTVLKQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQ VYTLPPSRDEL
TqGl CH-
183TKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENbO YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
IgGl GHi
241 QGNVF3CSVMHEALKNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N°:83)
V peptídeo EMP-1 Ligador Articulação IqGl CH2 1 Q1QGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GSGGGS CPPCP APELLGGP
IgGl CH2 ------------------------------------------------------
6 '·. SVFLFPPKPKDTLMiSRT PEVTCWVDVSHE OPEVrKFNwYVDGVE; VKNAKT KPREEQ YNS
------------------------------------„,„.... Tgr- CfJ 3
12 2 TYRVVS VLTVLHQDViLMGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRQEL
ZqG1 CK3
ie3TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWEStíGQ?ENKYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 241 QGNVFSCSVMHEALHNHYXQKSLSLSPGK (SEQ ID N°:84)
V Peptídeo EMP-1 Ligador Articulação CH2 IgGI
I. QIQGGΓYSCHFGPLTWYCKPQGG GS CPPCP A?EAAGGP
IgGl CH2 -----------------------------------------------------
SV FT.FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVF; VHKAKTKPRBEQYNiS
-------~-------------~------------------JgGJ CH3
1TYRVVS VTiTVIjHQDWLNGKE YKCKVS NKAL PAP T FKT T SKAKGQPrlS PQVYTLPPSRDiiL
; ηΎ'ί C K 3
133TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
IgG: CfU
?A\ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL5PGK (SEQ ID N°:85)
V Peptídeo EMP-1 Ligador Articulação CH2 IgGI
1 QIQGGTYSCHFGPLTWVGKPQGG GGGS GPPCP APSAAGGP
IqGI CH2 -----------------------------------------------------
61SV FI.FPPKPKDTLMI SRT PEVTCWVDVSHEÍIIPE VKFKK YVDGVE VHNAKT KPREEQ YN S
------------------------ TgOl CH?
122TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP CSKTI SKAKGQPFIBIPQVYTLPPSRDSL
IfJGl CK3
133TKKQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK.LTVDKSRWQ
iciGi CΗ3
241 QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N°:86)
V Peptídeo EMP-1 Ligador Articulação CH2 IgGI
i QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG GS CPPCP APEFLGGP
IqG 4 CH2 ------------------------------------------------
61 S VKLFPPK PKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQELPEVQFNWY VDGVtjVHNAKTKPREEQFNS
----------------------_-----------------------------------------------.--------I.:tC4 C:i3
j 21 i'YRVVSVLT VL KQÜWLNGKE YKCKVSNKGLPSS1EXTI SKAKGQPRKPQVYTLPPSQEEM
IgG4 CHj
183 TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESKGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFI.YSRLTVDKSRWQ
IqG4 CHj
7Λ1 EGtíVFSCSVMHSALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID N°:87)
V Peptídeo EMP-1 Ligador Articulação CH2 IgGI
1 QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGG C-S CPPCP APEAAGGP
IcG 4 CH2 ---------------------------------------
61 SVFLr PPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS
-----------------------------------------------CH3
121 TYRVVSVLTVLHQDWLKGKEYKCKVSKKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQREM
Iç;G4 C H3
183 T KNQVS LXCLVKGFYPS DIAVEWE SNGQ ΡΕΝΝΥΚΤΪΡ PVLDSDGS FFLYS RLT VDKSRWQ
:qG4 CH3
/41 EGNVFS CSVT^HF, ALHNH YTQKS LS LS LGK (SEQ ID N®:88)
V Peptídeo EMP-1 Ligador Articulação CH2 IgGI 1 QIQGGXYSCHFGPLTWVCKPQGG GGGS CPPCP APliAAGGP
IgG =5 CH2 ----------------------------------------
Si SVFLFPPKPKDTLMISRIPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEaFNS
1 Zl 'J/yHVVSVLTVLiiQDWLNGKSYKCKVSNKGLPSSlEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEiYl '
IgC'= Cti 3
183 tknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpeknykttppvldsdgsfflysrltvdksrkq 241 EGNVFSCSVMKSALHKHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID N°:89)
É bem conhecido que duas cadeias pesadas IgG são reunidas durante o processamento celular via ligações dissulfeto entre cisteínas loca- lizadas na região de articulação para formar um homodímero. É esperado que isto também ocorrerá entre os peptídeos modificados para formar o construto de corpo mimético de núcleo de articulação-EMP reunido. Além disso, espera-se que a ligação dissulfeto intracadeia entre as duas cisteínas no peptídeo EMP-1 também se formará. A estrutura esperada do corpo mi- mético de núcleo de articulação-EMP contém dois peptídeos EMP-1. O ar- ranjo espacial dos peptídeos no N-terminal junto com a flexibilidade de se- qüências contíguas deve permitir aos peptídeos formarem dímeros bioativos.
A atividade do corpo mimético de núcleo de articulação-EMP foi primeiro testada em ensaio de bioatividade in vitro. Para este ensaio, a li- nhagem celular dependente EPO UT-7/EPO, derivada de um paciente com leucemia megacarioblástica aguda, foi usada (Komatsu et al., 1993, Blood, vol. 82 (2), 456-464). Estas células sofrem morte celular programada de 48 a 72 horas após retirada de meio suplementados com rHuEPO. As células que foram incubadas na ausência de rHuEPO durante 24 horas podem ser sal- vas se tratadas com rHuEPO ou um agonista de EPOR. O corpo mimético de núcleo de articulação-EMP foi adicionado a células privadas de suprimen- to sem rHuEPO e a viabilidade celular foi determinada 48 horas depois do tratamento usando o composto MTS tetrazólio (CeIITiter 96 Aqueous One
Solution, Promega) que é metabolizado por células vivas para produzir um produto com uma absorbância que pode ser medida. Os resultados de um ensaio típico mostraram que a potência do corpo mimético de núcleo de arti- culação-EMP em uma base de molar para ser 500 vezes maior do que o peptídeo EMP-1 e 5 vezes menos do que rHuEPO. Além disso, estas mes- mas células foram estimuladas com corpo mimético de núcleo de articula- ção-EMP e padrões de fosforilação de tirosina visualizados pela corrida de Iisado celular em gel de poliacrilamida. O padrão exibido pelo corpo miméti- co de núcleo de articulação-EMP foi similar àquele de rHuEPO, indicando que o mecanismo pelo qual o corpo mimético de núcleo de articulação-EMP atua nessas células se parece com aquele de rHuEPO.
Estudos in vivo foram feitos em camundongos normais para comparar a meia-vida do corpo mimético de núcleo de articulação-EMP à- quela de rHuEPO e comparar seus efeitos sobre a eritropoiese. Quando os camundongos foram tratados igualmente, corpo mimético de núcleo de arti- culação-EMP deu uma resposta máxima mais alta e a resposta foi prolonga- da em comparação com rHuEPO.
As concentrações séricas tanto de rHuEPO como de corpo mi- mético de núcleo de articulação-EMP foram medidas por ELISA. A meia-vida aproximada dos corpos miméticos de núcleo de articulação EMP foi pelo menos várias vezes mais do que aquele de rHuEPO.
Foi mostrado que a mutação de dois resíduos Iisina (L), L234 & L235, na região de articulação IgGI inferior a alanina (A) eliminará a capaci- dade da imunoglobulina de mediar citotoxicidade dependente de comple- mento (CDC) e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (He- zereh et al., 2001, J. Virol., vol. 75 (24), 12161-68). Estudos preliminares mostraram que o corpo mimético de núcleo de articulação-EMP não medeia a Iise complementar de células que expressam o receptor da EPO. Isto pode ser devido ao baixo número de receptores que são encontrados em células de progenitor eritroide. Além disso, na expansão in vivo de progenitores eri- troides como evidenciado por aumentos significantes em hematócrito apoia a possível irrelevância funcional de funções efetoras imunes. Contudo, en- quanto nenhuma função efetora associada a efeitos foi observada, há ainda um interesse em introduzir estas mutações como uma etapa de precaução. Outra modificação que resultaria em uma redução na mediação
de funções efetoras imunes é a remoção do sítio de glicosilação anexo. Isto pode ser realizado pela mutação da asparagina na posição 297 (N297) à glutamina (Q). Modificações adicionais podem incluir opcionalmente a substi- tuição de treonina (T) com aminoácido alternativo para redução ou modifica- ção de O-glicosilação, por exemplo, é conhecido que T34 ou T47 com ver- sões A-glicosiladas da subclasse IgGI são mediadores pobres da função efetora imune (Jefferis et al. 1998, lmmol. Rev., vol. 163, 50-76).
Vantagens: o construto novo, corpo mimético de núcleo de articulação-EMP descrito acima oferece um modo alternativo de expor o peptídeo bioativo EMP-1. A atividade deste construto está na faixa de rHuEPO e a meia-vida in vivo é similar àquela de uma IgG. Além disso, as modificações propostas são esperadas, em combinação e além das características novas do corpo mimético de núcleo de articulação-EMP, potencializa a utilidade do construto de corpo mimético de núcleo de articulação-EMP.
EXEMPLO 4: Dados que Suportam o uso de Corpo Mimético de Articulação de EPO deletado no Tratamento de Intolerância à Glicose e/ou Anemia Relacionada à Doença Renal
Vantagens: o construto novo, EMP-NfusCGI descrito acima ofe- rece um modo alternativo de expor o peptídeo bioativo EMP-1. A atividade deste construto está na faixa de rHuEPO e a meia-vida in vivo é similar àquela de uma IgG. Além disso, as modificações propostas são esperadas, em combinação e além das características novas de EMP-NfusCGI, poten- cializar a utilidade do construto EMP-NfusCGI.
Contexto: diversos estudos clínicos indicam que os pacientes com doença renal em estágio final muitas vezes têm a resistência à insulina (Mak., 1996; Spaia et al., 2000; Tuzcu et al., 2004) que pode ser atribuída a toxinas urêmicas, anemia, ou hiperparatireoidismo secundário (Spaia et al., 2000). De maneira interessante, foi mostrado que o tratamento com EPO nestas populações de pacientes melhora a resistência à insulina com uma melhora concomitante em níveis de triglicerídeos, colesterol total e LDL no sangue (Mak., 1996; Spaia et al., 2000). Um grupo sugeriu que a melhora na sensibilidade à insulina poderia ser atribuída a própria EPO e não à correção da anemia (Spaia et al., 2000)
Recentemente, Thomas et al., (2005) publicaram um estudo on- de 722 pacientes foram triados para complicações diabéticas e para seus níveis de EPO. Destes pacientes, aproximadamente 23% tinham anemia. Os autores concluíram que a falha na produção da EPO em resposta ao declínio de níveis de hemoglobina é uma contribuição comum à anemia em pacien- tes com diabetes. Também concluíram que a falta da produção de EPO po- de contribuir para a doença renal diabética.
CNTO 530 é um mimético da EPO que incorpora um peptídeo mimético da EPO (EMP-1) a um domínio que inclui a porção Fc de um anti- corpo. EMP-1 não tem homologia de seqüência com EPO mas compete com EPO marcada com 125I para ligação ao receptor da EPO. CNTO 530 também induz a proliferação de células responsivas a EPO e estimula o mesmo pa- drão de fosforilação intracelular que a EPO. CNTO 530 diferencia-se da mo- lécula parental, CNTO 528, em que o peptídeo EMP-1 é enxertado a uma estrutura lgG4 (em vez de IgGI). A estrutura não tem do domínio V e tem articulação e regiões Iigadoras significativamente mais curta, em relação à CNTO 528. A articulação de CNTO 530 incorpora três mutações pontuais (Ala/Ala e S228P) que estão faltando nas moléculas parentais. Os respecti- vos papéis destas modificações devem reduzir o problema percebido da fun- ção efetora e estabilizar a molécula. A molécula resultante melhorou signifi- cativamente as características farmacocinéticas e farmacodinâmicas em ro- edores e macacos em comparação com CNTO 528. Consequentemente, a atividade in vivo sustentada de CNTO 530 fornece o potencial para melhorar propriedades em comparação com EPO e outros análogos de EPO.
Os dados da literatura sugerem que a intervenção com EPO po- deria ser benéfica para um grande número de pacientes diabéticos com a função renal em declínio. Os dados apresentaram aqui mostram que um mimético da EPO de longa duração, tal como CNTO 530, também pode ser benéfico para pacientes diabéticos com a função renal em declínio. Contudo, CNTO 530 tem a propriedade adicional de uma meia-vida bastante longa. Dosagem uma vez por mês com CNTO 530 seria um modo novo de trata- mento de pacientes diabéticos que sofrem de anemia. Referências
Mak RH, et al., J. Pediatrics, 129:97-104, 1996. Spaia S, et al., Nephron1 84:320-325, 2000. Thomas MC, et al., Arch, Int. Med., 165:466-469, 2005.
Tuzcu A, et al., Horm. Metab. Res., 36:716-720, 2004.
EXEMPLO 5: Corpo Mimético de EPO CNTO 530 Melhorou a Tolerância à Glicose Sete Dias Após Tratamento em camundongos db/db. Camundongos (db/db; n=7) foram jejuados durante a noite e a glicose san- güínea em jejum (FBG) foi medida. Os animais foram randomizados com base em FBG. Os camundongos foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) e glicose foi dada por via intraperitoneal (0,5 mg/g) dez minutos depois. A glicose sangüínea foi medida em vários tempos (10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos depois da glicose). Sete dias depois, o IPGTT foi repetido como descrito acima. Os dados mostrados na figura 1 sugerem que CNTO 530 tinha
muito pouco efeito sobre a tolerância à glicose no primeiro dia do estudo, mas um efeito bastante profundo sete dias depois de uma dose única.
Exemplo 6. CNTO 530 Melhorou Tolerância à Glicose Sete Dias Depois de Tratamento em camundongos DIO. O experimento descrito no Exemplo 1 foi repetido em camundongos DIO (dieta induzida para obesida- de) seguido pelo tratamento com CNTO 530 (0,3 mg/kg). Acredita-se que este modelo murino é mais representativo da doença humana uma vez que os camundongos ficaram diabéticos depois de serem alimentados com uma dieta altamente gorda (Purina TestDiet N0 58126 composto de gordura de 60,9% kcal e carboidratos de 20,8% kcal). Como descrito no Exemplo 1, um IPGTT foi feito no dia do tratamento e sete dias após o tratamento. Os pon- tos de tempo durante o IPGTT foram 15, 30, 60, 90, 120, 150, e 180 minutos após o desafio com glicose. Depois que o IPGTT foi concluído no dia 7, os camundongos foram sacrificados e o sangue total foi colhido (em EDTA) a- través de punção cardíaca para estudos de hematologia. A Figura 2 mostra que CNTO 530 melhorou a tolerância à glicose sete dias após o tratamento, mas não imediatamente (10 minutos) após o tratamento. A Figura 3 indica que os camundongos tratados com CNTO 530 tinham elevado a hemoglobi- na em relação aos animais controle. Descrição Detalhada:
Exemplo 7. Uma Dose Única de CNTO 530 Melhora a Tolerãn- cia à Glicose 7, 14, 21, e 28 Dias após o Tratamento. Camundongos (DIO; n=7) foram jejuados durante a noite e a glicose sangüínea em jejum (FBG) foi medida. Os animais foram randomizados com base em FBG. Os camun- dongos foram tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg) e gli- cose foi dada por via intraperitoneal (0,5 mg/g) dez minutos depois. A glicose sangüínea foi medida em vários tempos (10, 20, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos depois da glicose). Os IPGTTs foram repetidos 7, 14, 21, 28, e 35 dias após aquela dose única inicial. Os animais nos grupos tratados para 21, 28, e 35 dias foram sacrificados depois do IPGTT e sangue total foi coletado para medições de hematologia. Depois da hematologia, o sangue foi centri- fugado e o plasma foi coletado para medições de insulina.
Houve uma redução significante de depuração de glicose depois 14, 21, e 28 dias nos animais tratados com CNTO 530 em relação aos ani- mais controle (Figura 7). Os níveis de hemoglobina foram elevados nos ani- mais tratados depois de 21 e 28 dias (não testado antes). De maneira inte- ressante, os níveis de insulina foram significativamente reduzidos nos ani- mais tratados depois de 21 dias. Uma vez que os níveis de glicose foram muito menores 21 dias após o tratamento, não é surpreendente que os ní- veis de insulina fossem menores. Contudo, isto indica que o fenômeno ob- servado é verdadeiro e não um artefato da medição de glicose. Exemplo 8. Uma dose única de EPO Melhora a tolerância à gli-
cose 5 Dias Após o Tratamento. Camundongos (DIO; n=7) foram jejuados durante a noite e a glicose sangüínea em jejum (FBG) foi medida. Os ani- mais foram randomizados com base em FBG e foram tratados por via intra- venosa com EPO (0,03, 0,1, 0,3 mg/kg). IPGTT (como descrito acima) foi feito 5 dias após o tratamento. Os animais foram sacrificados depois do IPGTT e sangue total foi coletado para medições de hematologia.
Houve uma melhora modesta na tolerância à glicose nos ani- mais tratados com 0,03 e 0,3 mg/kg de EPO (Figura 7) embora nenhuma redução por meio estatisticamente significativo da glicose sangüínea em je- jum fosse observada. A Figura 8 mostra que a hemoglobina não foi significa- tivamente elevada mas reticulócitos foram significativamente aumentados de uma maneira dose dependente.
Exemplo 9. Uma dose única de Darbepoetina melhora a tolerân- cia à glicose 7 Dias Após o Tratamento. Camundongos (DIO; n=7) foram jejuados durante a noite e a glicose sangüínea em jejum (FBG) foi medida. Os animais foram randomizados com base em FBG e tratados por via intra- venosa com darbepoetina (0,01, 0,03, 0,1 mg/kg). Um IPGTT (como descrito acima) foi feito 7 dias após o tratamento. Os animais foram sacrificados de- pois do IPGTT e sangue total foi colhido para medições de hematologia.
Houve uma melhora dose dependente na tolerância à glicose nos animais tratados com darbe (Figura 9), e uma redução por meio estatis- ticamente significativo da glicose sangüínea em jejum foi observada (Figura 10). A Figura 11 mostra que a hemoglobina e reticulócitos estavam significa- tivamente elevados.
Exemplo 10. IPGTT em Camundongos Transgênicos com EPO. Os camundongos transgênicos (heterozigotos ou homozigotos) expressando EPO humana e camundongos C57BI6 (idade combinada com os transgêni- cos) foram jejuados durante a noite. A glicose sangüínea em jejum foi medi- da na manhã seguinte e aos camundongos foi dada glicose por via intraperi- toneal (1,0 mg/g). A glicose sangüínea foi medida em vários tempos (10, 20, minutos depois da glicose). A Figura 12 mostra que a glicose sangüínea em jejum foi significativamente menor nos animais transgênicos em relação aos controles. Além disso, a área sob a curva, durante o teste de tolerância à glicose foi profundamente melhorada nos animais transgênicos (Figura 13).
Exemplo 11. Uma dose única de CNTO 530 Melhora a Sensibili- dade à Insulina. Camundongos (DIO; n=7) foram jejuados durante a noite e a glicose sangüínea em jejum (FBG) foi medida. Os animais foram randomi- zados com base em FBG e tratados por via intravenosa com CNTO 530 (0,3 mg/kg). Quatorze dias após o tratamento, os camundongos foram jejuados durante a noite e o sangue foi colhido para medições de insulina e glicose. Os animais foram tratados por via intraperitoneal com glicose e sangue foi colhido para medições de glicose e insulina depois de 20 minutos.
A Figura 14 mostra que houve uma redução significativa níveis
de glicose e insulina imediatamente depois do jejum e 20 minutos depois do desafio com glicose. A análise de HOMA foi usada, e os animais tratados mostraram mais que uma redução de 10 vezes de HOMA, sugerindo que a sensibilidade à insulina foi melhorada (figura 15). Exemplo 12. Prospecção de Dados Clínicos Sumário:
O banco de dados de GE HeaIthcare1S Clinicai Data Services contém dados não-identificados, normalizados, longitudinais, nível dos paci- entes de Electronic Medicai Record de aproximadamente 4.000 médicos ba- seados nos EUA que estão em ambulatório usando o sistema GE Centricity EMR. Este banco de dados contém dados sobre >4,7M de vidas de pacien- tes. A média de acompanhamento de tempo é aproximadamente 3 anos. O banco de dados contém a informação sobre paciente, demográficas, históri- co médico, tipo de visita, observações clínicas (incluindo códigos de diag- nóstico), resultados de exames de laboratório e medicações prescritas. JNJ comprou uma licença deste conjunto de dados e o explorou para procurar resultados em parâmetros diabéticos em pacientes que tiveram prescrição da EPO para anemia.
O exercício de prospecção inicial indicou que o banco de dados CDS contém um total de 4.700.156 pacientes dos quais 4.331.836 são clas- sificados como pacientes ativos. A população foi ainda filtrada para identifi- car pacientes com medidas pré-EPO seguidas por medidas pós-EPO nas seguintes variáveis de interesse
- glicose sangüínea, em jejum
- Hemoglobina A1c como % de hemoglobina total
- Hemoglobina, sangue
- Hematócrito, sangue Os pacientes com até pelo menos 1 medição pré (até 60 dias prévios) e 1 pós (até 6 meses depois) tratamento de EPO foram considera- dos para a análise. O número de pacientes que se encontram neste critério variou em números por diferentes variáveis e fusos horários. Os pacientes que foram medicados come EPO e também tinham o valor médio de HbAIc de 6,0 ou maior foram considerados como diabéticos.
A Figura 16 mostra o efeito da EPO nos níveis de Hemoglobina do paciente. Como esperado, o nível de Hemoglobina aumenta firmemente durante um período de 3 meses depois da administração inicial da EPO an- tes de atingir um platô.
A Figura 17 mostra o efeito de EPO no nível de HbAIC dos pa- cientes. Os níveis de HbAIC caem por um valor médio de 0,5% no primeiro mês depois da administração de EPO e permanecem baixos durante dois meses subsequentes antes de voltar aos níveis originais. Comparando as Figuras 16 e 17 parece que o efeito de EPO em HbAIC é independente do seu impacto ao nível de Hemoglobina total uma vez que a Figura 16 mostra somente um aumento modesto na Hemoglobina no primeiro mês após da administração inicial da EPO.
A Figura 18 mostra uma redução na concentração de glicose sangüínea em jejum de aproximadamente 30 mg/dL após administração ini- cial de EPO alcançando um declínio máximo durante um período de 4 me- ses antes de reverter à faixa original. O declínio na glicose sangüínea em jejum parece ser mais sustentado e de duração mais longa em comparação com o declínio em HbAIC mostrado na Figura 17. A Figura 19 mostra o efeito do efeito da EPO nos níveis de
HbAIC como uma função da gravidade do diabetes de referência. A popula- ção diabética no banco de dados foi classificada em 4 níveis de referência de HbA1C: 6 a 7%, 7 a 8%, 8 a 9% e >9%. A figura mostra que o benefício anti-diabético da EPO (definido como a magnitude do declínio no nível HbA1C) parece ser maior na população que tem a maior gravidade de doen- ça (isto é, HbAIC referência >9%) resultando em aproximadamente 1,69% (10,18 a 8,49%) de declínio durante o primeiro mês. Em contraste do início com um nível mais moderado da doença (isto é, HbAIC referência = 8% a 9% e 7% a 8%) o efeito antidiabético foi também menor, 0,84% (8,35% a 7,51%) e 0,39% (7,38% a 6,99%), respectivamente. Não houve declínio observado na população em um nível de referência menor (6,0% a 7,0%).
Uma das desvantagens dos dados EMR tende a ser a observa-
ção ausente/incompleta ao longo de um curso de tempo. A fim de assegurar- nos que de fato estamos observando o termo mais longo de efeito terapêuti- co em diabetes, além disso, prospectamos o banco de dados para isolar somente aqueles pacientes tratados com a EPO para os quais temos de va- Iores de referência HbAIC presentes em períodos de 2 meses antes da administração inicial da EPO e que também têm valores de HbAIC em duas seções de tempo subsequentes (1 a 3 meses e 4 a 6 meses). Os resultados obtidos com estes conjuntos de dados longitudinais confirmam que as ob- servações relatadas na Figura 19. Para valores de HBA1C de referência >8 a magnitude do declínio de HbAIC foi 0,95% (9,41% a 8,46%) dentro dos 3 primeiros meses após a administração da EPO. O efeito platô sem declínio adicional observado no período dos 3 meses seguintes. Em um valor de re- ferência menor de HbAIC (7 a 8%) a quantidade do declínio nos primeiros 3 meses foi 0,46% (7,47% a 7,01%) seguido por mudança adicional não signi- ficante nos próximos 3 meses.
A análise usando pacientes longitudinais foi repetida para dados de glicose sangüínea em jejum depois da administração inicial da EPO. A Fi- gura 21 mostra o efeito sobre a glicose sangüínea em jejum em pacientes com valor de referência maiores que ou abaixo de 126 mg/dl_ (Nível de refe- rência em jejum de glicose sangüínea de 126 mg/dL foi usado como critério para diagnosticar pacientes de diabetes como sugerido pela American Diabe- tes Association (ADA). Os resultados mostram um declínio constante em valo- res de glicose sangüínea em jejum sobre o curso de tempo inteiro para paci- entes diabéticos (FBG>126 mg/dL) com média de 28 mg/dL (173 mg/dL a 145 mg/dL). Pacientes com valores de referência abaixo de 126 mg/dL não mos- tram declínio no nível de FBG. Em vez disso mostram um aumento leve no fim do curso de tempo equivalente a 5 mg/dL (102 mg/dL a 107 mg/dL). Os dados apresentados sugerem que os pacientes diabéticos podem ser tratados com um agonista do receptor da EPO para melhorar a sua glicose sangüínea em jejum e a sensibilidade à insulina. Os dados mos- trados nas Figuras 7 e 8 e Figuras 16 a 18 sugerem que um aumento na hemoglobina pode não ser necessário a fim de melhorar a tolerância à glico- se, sugerindo que pode ser possível usar uma dose baixa de uma ERA para tratar o diabetes sem aumentar os níveis de hemoglobina. Isto é significativo uma vez que se conhece que ERAS aumentam o risco de trombose a níveis significativamente elevados hemoglobina. Os dados clínicos também suge- rem que isto é possível. Os dados clínicos mostraram que uma dose de EPO que permitiu uma melhora modesta na hemoglobina (<1%) tinha melhoras significantes na glicose sangüínea em jejum e HbA1c. Vantagens: o uso de uma ERA como um terapêutico para tratamento da in- tolerância à glicose em pacientes diabéticos pode fornecer várias vantagens. Esta terapia pode fornecer um novo mecanismo de ação para
tratamento de diabetes.
Esta terapia pode levar ao tratamento duplo de anemia e diabe- tes.
Devido às melhoras na sensibilidade à insulina, uma melhora em lipídios (HDL, LDL1 TG) é também possível com um ERA.
O efeito sustentado sobre a hiperglicemia pode resultar em uma melhora significante em HbAIc e o retardo da perda de células da ilhota b em pacientes diabéticos.
A terapia atual para diabetes do tipo 2 necessita de pelo menos de dosagem diária. O tratamento desta população de pacientes com um ERA pode permitir uma dosagem menos freqüente e por isso aumentar a adaptação.
O uso de agonistas do receptor da EPO com meias-vidas exten- sas, tal como CNTO 530, como um terapêutico para tratar a anemia e a into- lerância á glicose em pacientes de doença renais pode fornecer várias van- tagens quanto a outros agonistas do receptor de EPO (ERAS). Espera-se que esta terapia seja útil para o tratamento duplo de anemia e diabetes. Es- pera-se que a meia-vida extensa de agonistas do receptor da EPO com meia-vida extensa, tal como CNTO 530, em comparação com outros ERAs seja útil para tratar a hiperglicemia em pacientes em falência renal diabética. Espera-se que o efeito sustentado sobre a hiperglicemia seja útil para tratar perda das células da ilhota β através de retardo ou redução deste processo. A meia-vida estendida de CNTO 530 resulta na dosagem menos freqüente em comparação com outros ERAs. A falta da homologia entre CNTO 530 e EPO reduz a possibilidade de PRCA nesta população de pacientes. O efeito de tolerância à glicose pode minimizar a exigência deste grupo de pacientes por fármacos adicionais para diabetes.
Será claro que a invenção pode ser praticada de outra maneira do que como particularmente descrito na descrição precedente e exemplos.
Numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima mencionados e, por isso, estão no escopo da presente invenção.

Claims (18)

1. Método para tratamento da intolerância à glicose em uma cé- lula, tecido, órgão ou animal, compreendendo contato ou administração de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz, à dita célula, teci- do, órgão ou animal, de pelo menos um agonista do receptor de eritropoieti- na (EPO).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito ago- nista do receptor de EPO é selecionado a partir de um agonista do receptor de EPO biológico e um composto agonista do receptor de EPO de molécula pequena.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito ago- nista do receptor de EPO biológico é selecionado a partir de um polipeptí- deo, um anticorpo e um polipeptídeo de fusão a anticorpo.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito poli- peptídeo é EPO ou um variante que ocorra naturalmente.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito poli- peptídeo compreende ainda pelo menos uma molécula de polietilenoglicol.
6. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito poli- peptídeo é um variante de EPO que não ocorre naturalmente.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a dita varia- ção de EPO que não ocorre naturalmente é darbepoetina alfa.
8. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito anti- corpo é um anticorpo agonista ao receptor de EPO ou à EPO.
9. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito poli- peptídeo é um mimético funcional de EPO.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o dito mi- mético funcional de EPO é pelo menos um selecionado a partir da SEQ ID NoS:1 a 39.
11. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito poli- peptídeo é hematida.
12. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o dito poli- peptídeo de fusão a anticorpo compreende pelo menos uma porção de uma seqüência da cadeia pesada do anticorpo e pelo menos um polipeptídeo agonista do receptor de EPO.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o dito po- lipeptídeo é um mimético funcional de EPO.
14. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a dita mo- lécula pequena é um composto químico que é um agonista do receptor de EPO.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a dita molécula pequena é selecionada a partir de FG-2216 e FG-4592.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a15, em que a dita quantidade eficaz é de 0,001 a 50 mg, e do dito agonista do receptor de EPO é de 0,000001 a 500 mg.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a15, em que o dito contato ou a dita administração é através de, pelo menos, um modo selecionado a partir do parenteral, subcutâneo, intramuscular, in- travenoso, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intra- cartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intra- ósseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostá- tico, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassi- novial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmico.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a15, compreendendo ainda administração, prévia, concorrentemente ou de- pois do dito (a) contato ou administração, pelo menos uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um composto ou po- lipeptídeo selecionado a partir de pelo menos um de uma marca ou apresen- tador detectável, um antagonista de TNF, um fármaco anti-infecção, um fár- maco para sistema cardiovascular (CV), um fármaco para sistema nervoso central (SNC), um fármaco para sistema nervoso autônomo (SNA), um fár- maco para trato respiratório, um fármaco para trato gastrointestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluido ou eletrólito, um fár- maco hematológico, um antineoplásico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um fármaco nutri- cional, uma citocina ou um antagonista de citocina.
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