BRPI0717263A2

BRPI0717263A2 - polinucleotìdeo isolado, cassete de expressão recombinante, célula hospedeira, planta transgênica, produto e métodos para modular o tamanho de órgão em plantas, a planta inteira ou a planta inteira ou o tamanho de órgão durante estresse de seca

Info

Publication number: BRPI0717263A2
Application number: BRPI0717263-0A
Authority: BR
Inventors: Mei Guo; Carl Simmons; Shoba Sivasankar; Mary Rupe
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2006-09-25
Filing date: 2007-09-24
Publication date: 2012-11-06
Also published as: WO2008039709A2; WO2008039709A3; EP2082048A2; MX2009003248A; CL2007002749A1; CN101589147A; US9024141B2; AR062955A1; US7847158B2; US20110035844A1; US20080078004A1; CA2664546A1

Abstract

POLINUCLEOTìDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA, PLANTA TRANSGêNICA, PRODUTO E MéTODOS PARA MODULAR O TAMANHO DE óRGãO EM PLANTAS, A PLANTA INTEIRA OU A PLANTA INTEIRA OU O TRAMANHO DE óRGãO DURANTE ESTRESSE DE SECA. A presente invenção provê polinucleotídeos e polipeptídeos relacionados da família de genes zmERECTA. A invenção provê sequências de ácido nucléico para os genes zmERECTA. zmERECTA é responsável por controlar o crescimento vegetal. tamanho de órgão e produção em plantas agrícolas.

Description

POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CASSETE DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, PLANTA TRANSGÊNICA, PRODUTO E MÉTODOS PARA MODULAR O TAMANHO DE ÓRGÃO EM PLANTAS, A PLANTA INTEIRA OU A PLANTA INTEIRA OU O TAMANHO DE ÓRGÃO DURANTE ESTRESSE DE SECA

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere de modo geral ao campo da biologia molecular.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A domesticação de várias plantas foi correlacionada com aumentos dramáticos de produtividade. A maior parte da variação fenotípica presente em populações naturais é contínua e é afetada pela influência de múltiplos genes. A identificação de genes específicos responsáveis por diferenças dramáticas de produtividade, em plantas domesticadas, se tornou um importante foco da pesquisa agrícola.

Em Arabidopsis, foi demonstrado que o gene ERECTA controle crescimento de órgãos e desenvolvimento floral através da promoção da proliferação celular (Shpak, et al. , (2003) Plant Cell 15:1095-1110; Development (2004) 131:1491- 501). 0 gene ERECTA de Arabidopsis afeta o desenvolvimento da inflorescência, e controla o crescimento de órgãos através da promoção da proliferação celular. Plantas transgênicas de Arabidopsis que super expressam ectopicamente o gene ERECTA apresentam melhora na eficiência de transpiração vegetal e tolerância à seca através da alteração de densidade de estômato, expansão de células epidérmicas, proliferação de células do mesofilo e contato célula-célula. 0 gene ERECTA codifica uma quinase semelhante a receptor com repetições ricas em leucina (leucine-rich repeat receptor-like kinase - LRR-RLK) e pode controlar crescimento vegetal/tamanho de órgão e acúmulo de biomassa. Além disso, Masle Gilmore e Farquhar, Nature (2005) 436:866, indicam que o gene ERECTA de Arabidopsis é responsável pela eficiência de transformação de plantas. Em adição aos efeitos variados, já é conhecida pelo efeito na arquitetura de plantas. Existem implicações na agricultura, especialmente na área de tolerância à seca e desempenho agrícola.

ERECTA está associado com aumento de crescimento. 0 gene ERECTA pode encontrar uso no controle de tamanho de plantas inteiras, ou órgãos específicos em milho ou outras plantas de cultivo. 0 uso potencial desse gene é através da sua super expressão para aumentar o acúmulo de biomassa, direcionando sua expressão para tecidos específicos usando promotores tecido-específicos para melhor crescimento de raiz, crescimento acelerado de plântula para rápido fechamento de dossel, folha maior, tamanho aumento da espiga, embrião melhorado, crescimento do endosperma para obter maiores grãos e manipular o conteúdo de óleos, proteínas ou amido dos grãos, etc. Alterando a taxa de crescimento dos estigmas (cabelo) da flor feminina seria possível manipular a sincronização ou intervalo antese e crescimento do cabelo (anthesis and silking interval - ASI), o que pode melhorar a tolerância a estresse. Outra aplicação potencial está no melhoramento da transformação e regeneração de plantas de cultivo a partir de cultura in vitro. A expressão desse gene poderia ser controlada para aumentar a taxa de proliferação celular e a taxa de crescimento de tecido cultivado. ERECTA também poderia ser usado para manipular o gene para reduzir o tamanho de órgãos tal como o tamanho do pendão através da diminuição da expressão em tecidos específicos. Os genes ERECTA podem ser úteis no aumento da tolerância à seca através do melhoramento da eficiência de transpiração em milho e outras plantas de cultivo. Explorando a variação natural alélica desse gene, ele pode ser usado no melhoramento do cultivo ou de transgênicos através da identificação de haplótipos de alelos que são associados com os fenótipos de tolerância a estresse de plantas de endocruzamento. 0 gene está mapeado em uma localização cromossomal em proximidade com QTLs (quantitative trait Ioci - Ioci de traço quantitativo) de seca, sugerindo possíveis variantes de alelos tolerantes.

A presente invenção inclui a identificação de genes ERECTA putativos em milho, ZmERECTA AeB (SEQ ID NOS: 5 e 7) que são relacionados com os gene ERECTA de Arabidopsis (SEQ ID NOS: 1 e 3) . O ortólogo apresentando a maior similaridade ao ERECTA de Arabidopsis (SEQ ID NO: 1), é ZmERECTA (SEQ ID NO: 5). A expressão é associada com tecidos reprodutivos imaturos, e é encontrada principalmente no meristema de inflorescência e no meristema apical do caule e, a um nível menor, em outros tecidos relacionados com meristemas. Plantas transgênicas expressando ZmERECTA A (SEQ ID NO: 5) são esperadas a mostrar um impacto positivo no acúmulo de biomassa e na taxa do crescimento da planta de milho, assim como um aumento no tamanho de órgãos. Plantas transgênicas expressando ZmERECTA são também esperados a apresentar tolerância à seca melhorada. Esses genes de milho irão encontrar utilidade no melhoramento de traços agrícolas em milho (e outras plantas de cultivo).

A presente invenção também inclui a identificação de genes ERECTA em outras espécies de plantas. A família gênica de arroz é representada por 2 membros. Quatro seqüências gênicas foram também encontradas em soja (Glycine max) e 3 genes em Sorghum bicolor. Dois membros da família gênica ERECTA em Arabidopsis são revelados nesse documento.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para controlar o crescimento da planta e tamanho de órgãos para aumento de produtividade em uma planta são providos. As composições incluem seqüências ERECTA de milho, soja, Arabidopsis, arroz e sorgo. Composições da invenção consistem em seqüências de aminoácidos e seqüência nucleotídicas selecionadas a partir de SEQ ID NOS: 5-8 assim como variantes e fragmentos destas.

Polinucleotídeos codificando as seqüências ERECTA são providos em construções de DNA para expressão em uma planta de interesse. Cassetes de expressão, plantas, células vegetais, partes de plantas, e sementes contendo as seqüências da invenção são adicionalmente providos. Em concretizações específicas, o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor constitutivo.

Métodos para modular o nível de uma seqüência ERECTA em uma planta ou parte de planta são providos. Os métodos consistem em introduzir em uma planta ou parte de planta um polinucleotídeo heterólogo contendo uma seqüência ERECTA da invenção. 0 nível do polipeptídeo ERECTA pode ser aumentado ou diminuído. Tal método pode ser usado para aumentar a produtividade em plantas; em uma concretização, o método é usado para aumentar a produtividade de grãos em cereais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Expressão MPSS de ZmERECTA-A em três estágios do meristema de inflorescência da espiga (MIE) e meristema apical do caule (MAC), de B73, Mol7, B73xMol7 híbrido Fl, e Mol7xB73 híbrido Fl (MG 6006. 42, 44). 0 gene é altamente expresso no meristema de inflorescência da espiga, e a um nível ligeiramente menor no meristema apical do caule.

Figura 2: Alinhamento de seqüências ERECTA de milho, Arabidopsis, arroz, sorgo e soja apresentando seqüência consenso e regiões conservadas.

Figura 3: A expressão do gene ERECTA A (SEQ ID NO: 3) é preferencial de meristema e espiga imatura, com expressão em múltiplos tecidos como detalhado.

Figura 4: Dendograma apresentando a relação entre seqüências ERECTA de Arabidopsis, milho, soja, sorgo e arroz. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Ao não ser se definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse documento possuem o mesmo significado do que comumente entendido por alguém de habilidade básica na arte a qual essa invenção pertence. Ao não ser se mencionado o contrário, as técnicas empregadas ou contempladas nesse documento são metodologias padrão bem conhecidas de alguém de habilidade básica na arte. Os materiais, métodos e exemplos são somente ilustrativos e não limitantes. 0 seguinte é apresentado por meio de ilustração e não tem como intuito limitar o escopo da invenção.

As presentes invenções agora serão descritas mais detalhadamente daqui em diante com referência às figuras acompanhantes, no qual algumas, porém não todas as incorporações da invenção são mostradas. De fato, essas invenções podem ser incorporadas de diferentes formas e não devem ser interpretadas como limitadas às incorporações publicadas nesse documento; ao invés, essas incorporações são providas de modo que essa revelação irá satisfazer requerimentos legais aplicáveis. Números se referem a elementos ao longo desse documento.

Muitas modificações e outras incorporações das invenções publicadas nesse documento irão vir à mente de alguém com habilidade na arte a qual essas invenções pertencem com o benefício dos ensinamentos apresentados na presente descrição e figuras associados. Portanto, é para ser entendido que as invenções não são para ser limitadas às específicas concretizações reveladas e que modificações e outras concretizações tem como intuito serem incluídas dentro do escopo das reivindicações anexadas. Apesar de termos específicos serem empregados nesse documento, eles são usados em um senso genérico e descritivo somente e não para propósitos de limitação.

A prática da presente invenção irá empregar, a não ser quando indicada o contrário, técnicas convencionais de botânica, microbiologia, cultura de tecidos, biologia molecular, química, bioquímica e técnica de DNA recombinante, que estão dentro da habilidade da arte. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Veja, ex., Langenheim e Thimann, (1982) Botany: Plant Biology and Its Relation To Human Affairs John Wiley; Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants (1984) vol. 1, Vasil, ed. ; Stanier, et al. , (1986) The Microbial World 5a ed. , Prentice- Hall; Dhringra e Sinclair, (1985) Basic Plant Pathology Methods, CRC Press; Maniatis, et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, vols. I e II, (1985) Glover, ed. ; Oligonucleotide Synthesis, (1985) Gait, ed.; Nucleic Acid Hybridization, (1984) Hames e Higgins, eds. ; e a série Methods In Enzymology, Colowick e Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA, EUA.

Unidades, prefixos, e símbolos podem ser denotados em suas formas internacionais (SI) aceitas. A não ser quando indicado o contrário, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para direita na orientação 5 '-3'; seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino-carboxi, respectivamente. Variações numéricas são inclusivas dos números definindo a variação. Aminoácidos podem ser referidos nesse documento pelos seus comumente conhecidos símbolos de três letras ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Nucleotídeos, de mesmo modo, podem ser referidos pelos seus códigos de única letra comumente aceitos. Os termos definidos abaixo são mais bem definidos por referência à especificação como um todo.

Na descrição da presente invenção, os termos seguintes serão empregados, e têm como intuito ser definido com indicado abaixo.

Por "micróbio" entende-se qualquer microorganismo (incluindo tanto microorganismos eucarióticos quanto procarióticos), tais como fungos, leveduras, bactérias, actinomicetos, algas e protozoa, assim como estruturas unicelulares.

Por "amplificado" entende-se a construção de múltiplas cópias de ácido nucléico ou múltiplas cópias complementares à seqüência de ácido nucléico usando pelo menos uma das seqüências de ácido nucléico como um molde. Sistemas de amplificação incluem sistema da reação da polimerase em cadeia (PCR), sistema da reação da ligase em cadeia (LCR), amplificação baseada em seqüência de ácido nucléico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontário), sistemas da replicase Q-Beta, sistema amplificação baseado na transcrição (TAS), e amplificação por deslocação de fita (SDA). Veja, ex., Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, (1993) Persing et al. , eds., American Society for Microbiology, Washington, DC, EUA. O produto de amplificação é chamado de amplicon.

O termo "variantes conservativamente modificadas" se aplica a tanto seqüências de aminoácidos quanto a de ácidos nucléicos. A respeito de seqüências particulares de ácidos nucléicos, variantes conservativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucléicos que codificam variantes idênticas ou conservativamente modificadas de seqüências de aminoácidos. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codificam qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Logo, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado por qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácidos nucléicos são "variações silenciosas" e representam uma espécie de variação conservativamente modificada. Toda seqüência de ácido nucléico nesse documento que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucléico. Alguém com habilidade básica irá reconhecer que cada códon em um ácido nucléico (com exceção de AUG, que é comumente o único códon para a metionina; uma exceção é Micrococcus rubens, no qual GTG é o códon para a metionina (Ishizuka, et al. , (1993) J. Gen. Microbiol. 139:425-32) pode ser modificado para gerar uma molécula funcionalmente idêntica. De acordo, cada variação silenciosa de um ácido nucléico, que codifica um polipeptídeo da presente invenção, está implícito para cada seqüência polipeptidica descrita e incorporada nesse documento por referência.

Em relação a seqüências de aminoácidos, alguém com habilidade irá reconhecer que substituições individuais, deleções ou adições em um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, ou seqüência de proteína que altera, adiciona ou exclui um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na seqüência codificada é uma "variante conservativamente modificada" quando a alteração resulta na substituição de um aminoácido por outro quimicamente similar. Logo, qualquer número de aminoácidos selecionados a partir do grupo de números inteiros consistindo de 1 a 15 pode ser então alterado. Logo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 7 ou 10 alterações podem ser feitas. Variantes conservativamente modificadas provêm tipicamente atividade biológica similar a da seqüência polipeptidica não modificada da qual elas são derivadas. Por exemplo, especificidade de substrato, atividade enzimática, ou ligação ligante/receptor é geralmente pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, preferencialmente 60-90% da obtida pela proteína nativa para seu substrato nativo. Tabelas de substituições conservativas provendo aminoácidos similares são bem conhecidos na arte.

Os seguintes seis grupos contêm, cada, aminoácidos que são substituições conservativas um para o outro:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (Μ), Valina (V) ; e

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Υ), Triptofano (W).

Veja também, Creighton, Proteinsl (1984) W.H. Freeman & Co.

Como usado nesse documento, "consistindo essencialmente de" significa a inclusão de seqüências adicionais em um objeto polinucleotídico onde seqüências adicionais não hibridizam seletivamente, sob condições de hibridização estringentes, com o mesmo cDNA que o polinucleotídeo e onde as condições de hibridização incluem uma etapa de lavagem em SSC O,IX e sulfato dodecil de sódio 0,1% a 65°C.

Por "codificando" ou "codificado", a respeito de um ácido nucléico especificado, entende-se contendo a informação para tradução em uma proteína específica. Um ácido nucléico codificando uma proteína pode conter seqüências não traduzidas (ex., íntrons) dentro de regiões traduzidas do ácido nucléico, ou pode não conter tais seqüências não traduzidas intermitentes (ex., como em um cDNA) . A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Tipicamente, a seqüência de aminoácido é codificada pelo ácido nucléico usando o código genético "universal". Porém, variantes do código universal, tal como é presente em algumas plantas, animais e mitocôndria de fungos, na bactéria Mycoplasma capricolum (Yamao, et al. , (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:2306- 9), ou no ciliado Macronucleus, pode ser usado quando o ácido nucléico for expresso usando esses organismos. Quando o ácido nucléico é preparado ou alterado sinteticamente, uma vantagem pode ser tirada de preferências de códons conhecidas do hospedeiro no qual o ácido nucléico irá ser expresso. Por exemplo, apesar de seqüências de ácido nucléico da presente invenção poderem ser expressas tanto em espécies de plantas monocotiledôneas como em dicotiledôneas, seqüências podem ser modificadas devido às preferências de códons específicos e preferências de conteúdo GC de plantas monocotiledôneas ou plantas dicotiledôneas, uma vez que essas preferências foram mostradas como diferentes (Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-98 e incorporada nesse documento como referência). Logo, o códon preferencial de milho para um aminoácido particular pode ser derivado de seqüências gênicas conhecidas de milho. 0 uso de códons de milho para 28 genes de plantas de milho é listado na Tabela 4 de Murray, et al. , supra.

Como usado nesse documento, "heterólogo" em referência a um ácido nucléico é um ácido nucléico que origina de uma espécie exógena, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente da qual o gene estrutural foi derivado ou, se de mesma espécie, um ou ambos são substancialmente modificados a partir de sua forma original. Uma proteína heteróloga pode originar a partir de uma espécie exógena ou, se de mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma original através de intervenção humana deliberada. Por "célula hospedeira" entende-se uma célula, que contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão. Células hospedeiras podem ser células procarióticas tal como E. coli, ou células eucarióticas tais como células de levedura, inseto, planta, anfíbio, ou mamífero. Preferencialmente, células hospedeiras são células de planta monocotiledônea ou dicotiledônea, incluindo, porém não limitado a, milho, sorgo, girassol, soja, trigo, alfafa, arroz, algodão, canola, cevada, painço, e tomate. Uma célula hospedeira de monocotiledônea preferencial é a célula hospedeira de milho.

O termo "complexo de hibridização" inclui referência a estrutura de duplex de ácido nucléico formada por duas seqüências de ácido nucléico simples fita seletivamente hibridizada uma com a outra.

O termo "introduzido" no contexto de inserir um ácido nucléico em uma célula, significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui referência à incorporação de um ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica onde o ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula (ex., cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial) , convertido em um replicon autônomo, ou transientemente expresso (ex., mRNA transfectado).

Os termos "isolado" se referem ao material, tais como um ácido nucléico ou proteína, que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com ele como encontrado em seu ambiente natural. O material isolado opcionalmente contém material não encontrado com o material no seu ambiente natural. Ácidos nucléicos que são "isolados", como definido nesse documento, são também referidos como ácidos nucléicos "heterólogos". A não ser se afirmado o contrário, o termo "ácido nucléico ERECTA" significa um ácido nucléico contendo um polinucleotídeo ("polinucleotídeo ERECTA") codificando um polipeptídeo ERECTA.

Como usado nesse documento, "ácido nucléico" inclui referência a um polímero de deoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos tanto na forma simples fita quanto na forma dupla fita, e a não ser se limitado o contrário, engloba análogos conhecidos apresentando a natureza essencial de nucleotídeos naturais no que eles hibridizam com ácidos nucléicos simples fita de maneira similar aos nucleotídeos naturais (ex., ácidos nucléicos peptídicos).

Por "biblioteca de ácido nucléico" entende-se uma coleção de moléculas de DNA ou RNA isolados, que consiste e representa substancialmente a fração completa transcrita de um genoma de um organismo especificado. A construção de bibliotecas exemplares de ácidos nucléicos, tais como bibliotecas genômicas e de cDNA, é ensinada em referências padrão de biologia molecular tais como Berger e Kimmel, Guide To Molecular Cloning Technigues, da série Methods In Enzymology, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987); Sambrook, et al. , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. , vols. 1-3; e Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel, et al. , eds, Current Protocols, uma iniciativa conjunta de Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc. (Suplemento de 1994) .

Como usado nesse documento, "operacionalmente ligado" inclui referências a uma ligação funcional entre uma primeira seqüência, tal como um promotor e uma segunda seqüência, onde a seqüência promotora inicia e medeia a transcrição da seqüência de DNA correspondendo à segunda seqüência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as seqüências de ácido nucléico sendo ligadas são contíguas e, onde necessário ligar duas regiões codificantes de proteínas, contíguas e na mesma fase de leitura.

Como usado nesse documento, o termo "planta" inclui referência à planta inteira, órgãos de planta (ex., folhas, caules, raízes, etc.), sementes e células vegetais e prole das mesmas. Célula vegetal, como usada nesse documento inclui, sem limitação, culturas de suspensão de sementes, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, broto, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrósporos. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos da invenção é geralmente tão ampla quanto à classe de plantas superiores suscetíveis a técnicas de transformação, incluindo tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, incluindo espécies dos gêneros: Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsieum, Datura, Hyoscyamus, Lyeopersieon, Nieotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinumf Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cueumis, Browaalia, Glyeine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Seeale, Allium, e Tritieum. Uma planta particularmente preferida é Zea mays.

Como usado nesse documento, "produtividade" inclui referência a alqueires por acre de grãos de uma planta de cultivo na hora da colheita, como ajustado para hidratação de grãos (tipicamente 15%). Hidratação de grãos é medida no grão na hora da colheita. 0 teste ajustado para peso de grãos é determinado ser o peso em libras por alqueire, ajustado pelo nível de hidratação do grão na hora da colheita.

Como usado nesse documento, "polinucleotídeo" inclui referência a deoxirribopolinucleotídeo, ribopolinucleotídeo, ou análogos destes que apresentam a natureza essencial de um ribonucleotídeo natural no que eles hibridizam, sob condições de hibridização estringentes, como substancialmente a mesma seqüência nucleotídica do que os nucleotídeos encontrados na natureza e/ou permitir tradução no(s) mesmo (s) aminoácido (s) do que o(s) nucleotídeo (s) que ocorre(m) na natureza. Um polinucleotídeo pode ser completo ou uma subseqüência de um gene nativo ou heterólogo estrutural ou regulatório. A não ser quando indicado o contrário, o termo inclui referência à seqüência especificada assim como à seqüência complementar a esta. Logo, DNAs ou RNAs com o esqueleto modificado para obter estabilidade ou por outras razões são "polinucleotídeos" do modo como o termo é intencionado nesse documento. Além disso, DNAs ou RNAs contendo bases não usuais, tal como inosina, ou bases modificadas, tal como bases tritiladas, para citar apenas dois exemplos, são polinucleotídeos do modo como o termo é usado nesse documento. Será apreciado que uma grande variedade de modificações foram feitas em DNA e RNA que servem vários propósitos úteis conhecidos daqueles com habilidade na arte. 0 termo polinucleotídeo como é empregado nesse documento engloba tais formas de polinucleotídeos modificadas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células incluindo inter alia, células simples e complexas.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo", e "proteína" são usados intercambiavelmente nesse documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido correspondente que ocorre na natureza, assim como a polímeros de aminoácidos que ocorrem na natureza.

Como usado nesse documento, "promotor" inclui referência a uma região de DNA acima do início de transcrição e envolvida no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor de planta" é um promotor capaz de iniciar transcrição em células vegetais. Promotores de planta exemplares incluem, porém não se limita a, aqueles que são obtidos de plantas, vírus de planta, e bactéria que contém genes expressos em células vegetais tais como Agrobacterium ou Rhizobium. Exemplos são promotores que preferencialmente iniciam transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, xilema, traqueídeos, ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferencial de tecido". Um promotor específico de um "tipo de célula" primariamente direciona a expressão em certos tipos celulares em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" ou "regulável" é um promotor que é controlado por condições ambientais. Exemplos de condições ambientais que podem afetar transcrição através de promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou presença de luz. Outro tipo de promotor é um promotor regulado durante o desenvolvimento, por exemplo, um promotor que direciona a expressão durante o desenvolvimento do pólen. Promotores preferenciais de tecido, específico de um tipo de célula, regulados durante o desenvolvimento, e induzíveis constituem uma classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais.

O termo "polipeptídeo ERECTA" se refere a um ou mais seqüências de aminoácidos. O termo é também inclusivo de fragmentos, variantes, homólogos, alelos ou precursores (ex., pré-proproteínas ou proproteínas) destas. Uma "proteína ERECTA" consiste de um polipeptídeo ERECTA. A não ser se afirmado o contrário, o termo "ácido nucléico ERECTA" significa um ácido nucléico consistindo um polinucleotídeo ("polinucleotídeo ERECTA") codificando um polipeptideo ERECTA.

Como usado nesse documento, "recombinante" inclui referência a uma célula ou vetor que foi modificada pela introdução de um ácido nucléico heterólogo ou que a célula é derivada de uma célula então modificada. Logo, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados em forma idêntica dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou que expressa genes nativos que são expressos de maneira anormal, têm a expressão reduzida ou não são expressos como um resultado de intervenção humana deliberada. 0 termo "recombinante" como usado nesse documento não engloba a alteração da célula ou vetor por eventos que ocorrem naturalmente (ex., mutação espontânea, transformação/transdução/transposição natural) tais como aqueles que ocorrem sem intervenção humana deliberada.

Como usado nesse documento, um "cassete de expressão recombinante" é uma construção de ácido nucléico, gerada recombinantemente ou sinteticamente, com uma série de elementos de ácido nucléico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucléico particular em uma célula alvo. 0 cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastidial, vírus, ou fragmento de ácido nucléico. Tipicamente, a porção que contém o cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, dentre outras seqüências, um ácido nucléico a ser transcrito, e um promotor. O termo "resíduo" ou "resíduo de aminoácido" ou "aminoácido" são usados intercambiavelmente nesse documento para se referir a um aminoácido que é incorporado em uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo (coletivamente, "proteína"). O aminoácido pode ser um aminoácido que ocorre na natureza e, a não ser se limitado o contrário, pode englobar análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de uma maneira similar a dos aminoácidos que ocorrem na natureza.

0 termo "hibridiza seletivamente" inclui referência à hibridização, sob condições de hibridização estringentes, de uma seqüência de ácido nucléico com uma seqüência alvo especificada de ácido nucléico a um nível detectavelmente maior (ex. , pelo menos 2 vezes acima do ruído) que sua hibridização com seqüências não alvo de ácido nucléico e com a exclusão substancial de ácidos nucléicos não alvo. Seqüências que hibridizam seletivamente apresentam por volta de, pelo menos, 40% de identidade de seqüência, preferencialmente 60-90% de identidade de seqüência, e ainda mais preferencialmente 100% de identidade de seqüência (ex., complementar) uma com a outra.

Os termos " condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" incluem referência a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar com sua seqüência alvo, a um nível detectavelmente maior que outras seqüências (ex., pelo menos duas vezes acima do ruído). Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Através do controle da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, seqüências alvo podem ser identificadas que podem ser até 100% complementares à sonda (sondagem homóloga). Alternativamente, condições estringentes podem ser ajustadas de modo a permitir alguns não pareamentos em seqüências, uma vez que graus menores de similaridade são detectados (sondagem heteróloga). De maneira ótima, a sonda possui aproximadamente 500 nucleotídeos de comprimento, porém pode variar enormemente em comprimento de menos que 500 nucleotídeos até o comprimento completo de uma seqüência alvo.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor que por volta de 1,5 M de íon de Na, tipicamente na concentração íon Na de cerca de 0,01 a 10M (ou outros sais) empH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos, por volta de 30°C para sondas curtas (ex., de 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos por volta de 60°C para sondas longas (ex., maior que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida ou Denhardt. Condições exemplares de baixa estringência incluem hibridização com uma solução tampão de 3 0 a 3 5% de formamida, NaCl 1 M, SDS (sulfato doedecil de sódio) 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC IX a 2X (SSC 20X - NaCl 3,0 M/ citrato trissódico 0,3 M) de 50 a 55°C. Condições exemplares de estringência moderada incluem hibridização e, formamida 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC 0,5X a IX de 55 a 60°C. Condições exemplares de alta estringência incluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em SSC O,IX de 60 a 65°C. Especificidade é tipicamente a função das lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da solução final de lavagem. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem., (1984) 138:267-84: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente pareada. Tm é reduzida em por volta de 1°C para cada 1% de não pareamento; logo, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com seqüências de identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são buscadas, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas a ser por volta de 50C abaixo do ponto termal de desnaturação (Tm) para a seqüência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. Porém, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4°C abaixo do ponto termal de desnaturação (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C abaixo do ponto termal de desnaturação (Tm) ; condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 2 O0C abaixo do ponto termal de desnaturação (Tm) . Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e Tm desejada, aqueles com habilidades básicas irão entender que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são descritas de maneira inerente. Se o desejado grau de resultados de não pareamento em uma Tm for de menos que 450C (solução aquosa) ou 320C (solução de formamida) é preferível que a concentração de SSC seja aumentada de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extensivo sobre a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Technigues In Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, Nova Iorque (1993); e Current Protocols In Molecular Biology, capítulo 2, Ausubel, et al. , eds, Greene Publishing e Wiley- Interscience, Nova Iorque (1995) . A não ser se afirmado o contrário, na presente aplicação, alta estringência é definido como hibridização em SSC 4X, Denhardt 5X (5 g de Ficol, 5 g de polivinilpirrolidona, 5 g de albumina de soro bovino em 500ml de água), 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmão fervido, e 25 mM de fosfato de Na a 65°C, e uma lavagem em SSC 0,1X SSC, SDS 0,1% a 65°C.

Como usado aqui, "planta transgênica" inclui referência a uma planta que contém em seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é estavelmente integrado no genoma de modo que o polinucleotídeo é passado para as gerações sucessivas. 0 polinucleotídeo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão recombinante. "Transgênico(a)" é usado nesse documento para incluir qualquer célula, linhagem de célula, calo, tecido, parte de planta ou planta, o genótipo do qual foi alterado pela presença de ácido nucléico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados como aqueles criados através de cruzamento sexuado ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. 0 termo "transgênico(a)" como usado nesse documento não engloba a alteração do genoma (cromossomal ou extra-cromossomal) através de métodos de criação de plantas convencionais ou através de eventos que ocorrem naturalmente tais como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não-recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não-recombinante, ou mutação espontânea.

Como usado nesse documento, "vetor" inclui referência a um ácido nucléico usado na transfecção de uma célula hospedeira no qual pode ser inserido um polinucleotídeo. Vetores são geralmente replicons. Vetores de expressão permitem transcrição de um ácido nucléico neles inserido.

Os seguintes termos são usados para descrever as relações de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicos ou polinucleotídeos ou polipeptídeos: (a) "seqüência de referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de seqüência", (d) "porcentagem de identidade de seqüência", e (e) "identidade substancial".

Como usado nesse documento, "seqüência de referência" é uma definida seqüência usada como base para comparação de seqüências. Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto ou a íntegra de uma seqüência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA completo ou seqüência gênica, ou o cDNA completo ou seqüência gênica.

Como usado nesse documento, "janela de comparação" significa a inclusão de referência a um segmento contíguo e especificado de uma seqüência polinucleotídica, onde a seqüência polinucleotídica pode ser comparada a uma seqüência de referência e onde a porção da seqüência polinucleotídica na janela de comparação pode conter adições ou deleções (ex., "gaps") comparados com a seqüência de referência (que não contém adições ou deleções) para alinhamento ótimo de duas seqüências. Geralmente, a janela de comparação é de pelo menos 2 0 nucleotídeos contíguos de comprimento, e, opcionalmente, pode ser 30, 40, 50, 100, ou mais. Aqueles com habilidades na arte entendem que para evitar uma alta similaridade com uma seqüência de referência devido à inclusão de "gaps" na seqüência polinucleotídica, uma penalidade de "gap" é tipicamente introduzida e é subtraída do número de pareamentos.

Métodos de alinhamento de seqüências nucleotídicas e de aminoácidos para comparação são bem conhecidas na arte. O algoritmo de homologia local (BESTFIT) de Smith e Waterman, (1981) Adv. Appl. Math 2:482, pode conduzir alinhamento ótimo de seqüências para comparação; pelo algoritmo de alinhamento de homologia (GAP) de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53; pelo método de busca por similaridade (Tfasta e Fasta) de Pearson e Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444; pelas implementações computadorizadas desses algoritmos, incluindo, porém não limitado a: CLUSTAL no programa PC/Gene da Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote de programas de computadores da Wisconsin Genetics, Versão 8 (disponível pelo Genetics Computer Group (GCG® programs (Accelrys, Inc., San Diego, CA).). O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp, (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al. , (1992) Computer Applications in the Bioscienees 8:155- 65, and Pearson, et al. , (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. 0 programa preferido para uso de alinhamento ótimo global de múltiplas seqüências é PileUp (Feng e Doolittle, (1987) J. Mol. Evol., 25:351-60 que é similar ao método descrito por Higgins e Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 e incorporado nesse documento por referência) . A família BLAST de programas que podem ser usados para buscas de similaridade de banco de dados inclui: BLASTN para iscas de seqüências nucleotídicas contra banco de dados de seqüências nucleotídicas; BLASTX para iscas de seqüências nucleotídicas contra banco de dados de seqüências de proteínas; BLASTP para iscas de seqüências de proteínas contra banco de dados de seqüências de proteínas; TBLASTN para iscas de seqüências de proteínas contra banco de dados de seqüências nucleotídicas; e TBLASTX para iscas de seqüências nucleotídicas contra banco de dados de seqüências nucleotídicas. Veja, CURRENT PR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY, Capítulo 19, Ausubel, et al., eds., Greene Publishing & Wiley-Interscience, Nova Iorque (1995). GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch, supra, para encontrar o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de pareamentos e minimiza o número de "gaps". GAP considera todos os possíveis alinhamentos e posições de "gaps" e cria o alinhamento com o maior número de bases pareadas e o menor número de "gaps". Isso permite a provisão de uma penalidade de criação de "gap" e uma penalidade de extensão de "gap" em unidades de bases pareadas. GAP precisa levar vantagem do número de pareamentos de penalidade de criação de "gap" para cada "gap" que ele insere. Se uma penalidade de extensão de "gap" maior que zero é escolhida, GAP tem que, em adição, levar vantagem sobre cada "gap" inserido pelo comprimento do "gap" vezes a penalidade de extensão de "gap". Valores padrão de penalidade de criação de "gap" e de extensão de "gap" na Versão 10 do pacote de programas de computador da Wisconsin Genetics são 8 e 2, respectivamente. As penalidade de criação de "gap" e de extensão de "gap" podem ser expressas com um número inteiro selecionado a partir do grupo de números inteiros consistindo de 0 a 100. Logo, por exemplo, as penalidades de criação de "gap" e extensão de "gap" podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou maior.

GAP apresenta um membro da família de melhores alinhamentos. Podem existir muitos membros dessa família, porém nenhum outro membro possui melhor qualidade. GAP apresenta quatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade, Razão, Identidade, e Similaridade. A Qualidade é a métrica maximizada com o intuito de alinhar as seqüências. Razão é a Qualidade dividida pelo número de bases em segmentos menores. Percentagem de Identidade é a percentagem de símbolos que de fato paream. Porcentagem de Similaridade é a porcentagem de símbolos que são similares. Símbolos que estão alinhados com "gaps" são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior que ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação usada na versão 10 do pacote de programas GCG Winconsin Genetics é BLOSUM62 (veja Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915) .

A não ser quando afirmado o contrário, valores de identidade/similaridade de seqüência providos nesse documento se referem ao valor obtido usando o programa BLAST 2.0 usando parâmetros padrão (Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402).

Aqueles com habilidades básicas na arte irão entender que buscas com o BLAST assumem que proteínas podem ser modeladas como seqüências aleatórias. Porém, várias proteínas reais contém regiões de seqüências não aleatórias que podem ser traços homopoliméricos, repetições curtas ou regiões enriquecidas em um ou mais aminoácidos. Tais regiões de baixa complexidade podem ser alinhadas entre proteínas não relacionadas mesmo que outras regiões da proteína sejam inteiramente dissimilar. Um número de programas de filtro de baixa complexidade pode ser empregado para reduzir tais alinhamentos de baixa complexidade. Por exemplo, os filtros de baixa complexidade SEG (Wooten e Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) e XNU (Claverie e States, (1993) Comput. Chem. 17:191-201) podem ser empregados sozinhos ou em combinação.

Como usado aqui, "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências ácido nucléico ou polipeptídicas faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para máxima correspondência em uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de seqüência é usada em referência a proteínas, é reconhecido que posições de resíduos que não são idênticos geralmente diferem em substituições conservativas de aminoácidos, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (ex., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando seqüências diferem em substituições conservativas, a porcentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa das substituições. Seqüências que diferem em tais substituições conservativas são tidas a apresentar "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos daqueles com habilidade na arte. Tipicamente, envolve pontuar uma substituição conservativa com um não pareamento parcial ao invés de completo, conseqüentemente aumentando a porcentagem de identidade de seqüência. Logo, por exemplo, onde um aminoácido idêntico recebe uma pontuação de 1 e uma substituição não conservativa recebe uma pontuação de zero, uma substituição conservativa recebe uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservativas é calculada, ex. , de acordo com o algoritmo de Meyers e Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sei. 4:11-17, ex., como implementada no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, CA).

Como usado aqui, "porcentagem de seqüência de identidade" significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências alinhadas de maneira ótima em uma janela de comparação, onde a porção da seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode conter adições ou deleção (ex., "gaps") comparado a seqüência de referência (que não contém adições e deleções) para alinhamento ótimo de duas seqüências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições em que resíduos de ácido nucléico ou aminoácido idênticos ocorre em ambas as seqüências para gerar um número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para gerar a porcentagem de identidade de seqüência.

O termo "identidade substancial" de seqüências polinucleotídicas significa que um polinucleotídeo contém uma seqüência que apresenta entre 50-100% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 50% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 60% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 7 0% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 80% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 90% de identidade de seqüência, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de seqüência, comparado com uma seqüência de referência usando um dos programas de alinhamento descritos usando parâmetros padrão. Alguém com habilidade irá reconhecer que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar identidade correspondente de proteínas codificadas por duas seqüências nucleotídicas por se levando em conta a degeneração de códons, similaridade de aminoácidos, posicionamento da fase de leitura e similares. Identidade substancial de seqüências de aminoácidos para esses propósitos normalmente significa identidade de seqüência entre 55-100%, preferencialmente pelo menos 55%, preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%.

Outra indicação que seqüências nucleotídicas são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam uma com a outra sob condições estringentes. A degeneração do código genético permite que muitas substituições de nucleotídeos que levam à variedade na seqüência nucleotídica codifiquem para o mesmo aminoácido, portanto é possível que a seqüência de DNA possa codificar um mesmo polipeptídeo mas não hibridizar uma com a outra sob condições estringentes. Isso pode ocorrer, ex. , quando uma cópia de um ácido nucléico é criado usando a degeneração máxima de códons permitida pelo código genético. Uma indicação que duas seqüências de ácido nucléico são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo, que o primeiro ácido nucléico codifica, é imunologicamente reativo cruzadamente com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico. Os termos "identidade substancial" no contexto de um peptideo indica que um peptídeo contém uma seqüência com entre 55-100% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 55%, preferencialmente 60%, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, e ainda mais preferencialmente 90% ou 95% de identidade de seqüência em relação à seqüência de referência ao longo de um janela de comparação especificada. Preferencialmente, um alinhamento ótimo é conduzido usando um algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, supra. Uma indicação de que duas seqüências peptídicas são substancialmente idênticas é quando um peptídeo é imunologicamente reativo com anticorpos obtidos contra o segundo peptídeo. Logo, um peptídeo é substancialmente idêntico a um segundo peptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferirem apenas por uma substituição conservativa. Em adição, um peptídeo pode ser substancialmente idêntico a um segundo peptídeo quando eles diferem em uma mudança não-conservativa se o epítopo que o anticorpo reconhece é substancialmente idêntico. Peptídeos que são "substancialmente similares" apresentam seqüências que, notado acima exceto pelas posições de resíduos, como não são idênticas, podem diferir em mudanças conservativas de aminoácidos.

A invenção revela polinucleotídeos e polipeptídeos ERECTA. Os nucleotídeos e proteínas novos da invenção apresentam um padrão de expressão que indica que eles desempenham um papel importante no desenvolvimento vegetal. Os polinucleotídeos são expressos em vários tecidos vegetais. Os polinucleotídeos e polipeptídeos logo provêm uma oportunidade de manipulação do desenvolvimento vegetal para alterar desenvolvimento de sementes e tecido vegetativo, o tempo de ocorrência de tais eventos ou composição. Isso pode ser usado para criar uma planta 5 estéril, uma planta que não produz sementes ou uma planta com composição de endosperma alterado.

Tabela 1: Identificação de Seqüência

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Ácidos Nucléicos

A presente invenção provém, inter alia, ácidos nucléicos isolados de RNA, DNA, e análogos e/ou quimeras destes, contendo um polinucleotídeo ERECTA. A presente invenção também inclui polinucleotideos otimizados para expressão em diferentes organismos. Por exemplo, para expressão de um polinucleotídeo em uma planta de milho, a seqüência pode ser alterada de modo a levar em conta preferências de códons específicos e para alterar o conteúdo GC de acordo com Murray, et al, supra. O uso de códons em milho para 2 8 genes de plantas de milho está listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra.

Os ácidos nucléicos ERECTA da presente invenção contêm polinucleotideos ERECTA isolados que são inclusivos de:

(a) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo ERECTA e conservativamente modificado e variantes

polimórficas deste;

(b) um polinucleotídeo apresentando pelo menos 70% de identidade de seqüência com os polinucleotideos de (a) ou (b) ;

(c) seqüências complementares de polinucleotideos de (a) ou (b) .

Construção de Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser obtidos usando (a) métodos recombinantes convencionais, (b) técnicas sintéticas, ou combinações destes. Em algumas concretizações, os polinucleotideos da presente invenção serão clonados, amplificados, ou construídos de outro modo a partir de fungo ou bactéria. Os ácidos nucléicos podem convenientemente conter seqüências em adição a um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio múltiplo de clonagem contendo um ou mais sítios de endonucleases de restrição pode ser inserido no ácido nucléico de modo a auxiliar no isolamento do polinucleotídeo. Também, seqüências traduzíveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo traduzido da presente invenção. Por exemplo, uma seqüência marcadora hexa-histidina provê um meio conveniente de purificar as proteínas da presente invenção. 0 ácido nucléico da presente invenção - excluindo a seqüência polinucleotídica - é opcionalmente um vetor, um adaptador, ou "linker" para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. Seqüências adicionais podem ser adicionadas a tais seqüências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função em clonagem e/ou expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo, ou para melhorar a introdução do polinucleotídeo dentro de uma célula. Tipicamente, o comprimento de um ácido nucléico da presente invenção menos o comprimento do seu polinucleotídeo da presente invenção é menor que2 0 kilobases de pares, muitas vezes menor que 15 kb, e freqüentemente menor que 10 kb. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e "linkers" são bem conhecidos na arte. Ácidos nucléicos exemplares inclui tais vetores como: M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWEl5, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI e II, pOPRSVI CAT, pOPl3 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pOG44, pOG45, pFRTpGAL, pNEOβGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSlox, e lambda MOSElox. Vetores opcionais para a presente invenção incluem, porém não se limitam a, lambda ZAP II, e pGEX. Para uma descrição de vários ácidos nucléicos veja, ex., Stratagene Cloning Systems, Catálogos 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); e, Amersham Life Sciences, Inc, Catálogo '97 (Arlington Heights, IL).

Métodos Sintéticos para Construção de Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem também serem preparados por síntese química direta através de métodos tais como o método fosfotriéster de Narang, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90-9; o método fosfodiéster de Brown, et al. , (1979) Meth. Enzymol. 68:109-51; o método de dietilfosforamidito de Beaucage, et al. , (1981) Tetra. Letts. 22(20):1859-62; o método da fase sólida do fosforamidito triéster descrito por Beaucage, et al. , supra, ex. , usando um sintetizador automático, ex. , como descrito em Needham-VanDevanter, et al. , (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68; e, o método de suporte sólido da Patente Norte - Americana Número 4.458.066. Síntese química geralmente produz um oligonucleotídeo simples fita. Eles pode ser convertido em DNA dupla fita por hibridização com uma seqüência complementar ou por polimerização com uma DNA polimerase usando uma fita simples como molde. Alguém com habilidade irá reconhecer que enquanto a síntese química de DNA é limitada a seqüências de por volta de 100 bases, seqüências mais longas podem ser obtidas através da ligação de seqüências menores.

UTRs e Preferência de Códon

Em geral, a eficiência de tradução foi encontrada a ser regulada por elementos de seqüência s especificas na região 5' não codificante ou não traduzida (5' UTR) do RNA. Motivos de seqüência positivos incluem seqüências consenso de iniciação traducional (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res .15:8125) e a estrutura 5<G> 7 metil GpppG wcap" de RNA (Drummond, et al., (1985) Nueleic Aeids Res. 13:7375). Elementos negativos incluem estrutura intramoleculares estáveis de "stem-loop" no 5' UTR (Muesing, et al. , (1987) Cell 48:691) e seqüências AUG ou fases abertas de leitura curtas precedidas por um AUG apropriado no 5' UTR (Kozak, supra, Rao, et al. , (1988) Mol. and Cell. Biol. 8:284). De acordo, a presente invenção provê regiões 5' e/ou 3' UTR para modulação da tradução de seqüências codificantes heterólogas.

Adicionalmente, os segmentos codificantes de polipeptídeos dos polinucleotídeos da presente invenção podem ser modificados para alterar códons de acordo com a preferência do organismo. Essa alteração pode ser empregada para alterar a eficiência traducional e/ou otimizar a seqüência codificante para expressão em um desejado hospedeiro ou para otimizar os códons utilizados de uma seqüência heteróloga para expressão em milho. Os códons usados nas regiões codificantes dos polinucleotídeos da presente invenção podem ser analisados estatisticamente usando pacotes de programas de computador disponíveis tal como "Codon Preference" disponível pelo University of Wisconsin Genetics Computer Group. Veja, Devereaux, et al. , (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395; ou MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Logo, a presente invenção provê uma freqüência de uso de códons característica de pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção. O número de polinucleotídeos (3 nucleotídeos por aminoácido) que podem ser usados para determinar a freqüência de uso de códons pode ser qualquer número inteiro de 3 ao número de polinucleotídeos da presente invenção como provido nesse documento. Opcionalmente, os polinucleotídeos serão seqüências completas. Um número exemplar de seqüências para análise estatística pode ser pelo menos 1, 5, 10, 20, 50 ou 100.

Embaralhamento de Seqüências

A presente invenção provê métodos para embaralhamento de seqüências usando polinucleotídeos da presente invenção, e composições resultantes destes. Embaralhamento de seqüências é descrito na publicação WO de número 97/20078. Veja também, Zhang, et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-9; e Zhao, et al., (1998) Nature Bioteeh 16:258- 61. Geralmente, embaralhamento de seqüências provê um meio para gerar bibliotecas de polinucleotídeos apresentando uma característica desejada, que podem ser selecionadas ou varridas. Bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de seqüências polinucleotídicas relacionadas, que contêm regiões de seqüências, que possuem identidade substancial de seqüência e podem ser recombinadas de maneira homóloga in vitro ou in vivo. A população de polinucleotídeos recombinados por seqüência contém uma subpopulação de polinucleotídeos que possui características desejadas ou vantajosas e que podem ser selecionadas através de seleção apropriada ou método de varredura. As características podem ser qualquer propriedade ou atributo capaz de ser selecionado ou detectado em um sistema de varredura, e pode incluir propriedades de: uma proteína codificada, um elemento transcricional, uma seqüência controlando transcrição, processamento de RNA, estabilidade de RNA, conformação da cromatina, tradução, ou outra propriedade de expressão de um gene ou transgene, um elemento replicativo, um elemento de ligação de proteína, ou similar, tal como qualquer característica selecionada que confira uma propriedade que possa ser selecionada ou detectada. Em algumas incorporações, a característica selecionada pode ser uma Km e/ou Kcat alterada em relação à proteína selvagem como provido nesse documento. Em outras incorporações, uma proteína ou polinucleotídeo gerados por embaralhamento de seqüências irá apresentar uma afinidade de ligação de ligante maior que o polinucleotídeo selvagem não embaralhado. Ainda em outras incorporações, uma proteína ou polinucleotídeo gerado por embaralhamento de seqüências irá apresentar um pH ótimo alterado quando comparado ao polinucleotídeo selvagem não embaralhado. 0 aumento em tais propriedades pode ser pelo menos 110%, 120%, 130%, 140% ou maior que 15 0% do valor selvagem. Cassetes Recombinantes de Expressão

A presente invenção adicionalmente prove cassetes recombinantes de expressão contendo um ácido nucléico da presente invenção. Uma seqüência de ácido nucléico contendo um polinucleotídeo da presente invenção, por exemplo um cDNA ou uma seqüência genômica codificando um polipeptídeo suficientemente comprido para codificar uma proteína ativa da presente invenção, pode ser usada para construir um cassete recombinante de expressão que pode ser introduzido na célula hospedeira desejada. Um cassete recombinante de expressão irá tipicamente conter um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a seqüências regulatórias de iniciação transcricional que irão direcionar a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira de intenção, tal como tecidos de uma planta transformada.

Por exemplo, vetores de expressão em plantas podem incluir (1) um gene de planta clonado sob o controle transcricional de seqüências 5' e 3' regulatórias e (2) um marcador de seleção dominante. Tais vetores de expressão em plantas podem também conter, se desejado, uma região regulatória promotora (ex., uma conferindo expressão induzível ou constitutiva, regulada ambientalmente ou durante o desenvolvimento, ou específica/seletiva de célula ou tecido) , um sítio de início de transcrição, um sítio de ligação de ribossomo, um sinal de processamento de RNA, um sítio de terminação de transcrição, e/ou um sinal de poliadenilação. Um fragmento promotor de planta pode ser empregado que irá direcionar a expressão de um polinucleotideo da presente invenção em todos os tecidos de uma planta regenerada. Tais promotores são referidos nesse documento como promotores "constitutivos" e são ativos sob a maioria das condições ambientais e estágios de desenvolvimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores constitutivos inclui os promotores 1'- ou 2'- derivados do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, os promotores Smas, o promotor da álcool cinamil desidrogenase (Patente Norte-Americana Número5.683.439), o promotor Nos, o promotor da rubisco, o promotor GRPl-8, o promotor 3 5S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) , como descrito em Odell, et al. , (1985) Nature 313:810-2; actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-89); pEMU (Last, et al. , (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8); MAS (Velten, et al. , (19 84) EMBO J. 3:2723-30); e histona H3 de milho (Lepetit, et al. , (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-85; e Atanassvoa, et al. , (1992) Plant Journal 2(3):291-300); promotor ALS, como descrito no Pedido PCT Número WO 96/30530; GOS2 (Patente Norte-Americana 6.504.083) e outras regiões de iniciação da transcrição de vários genes de plantas conhecidos por aqueles de habilidade. Para a presente invenção, ubiquitina é o promotor preferido para expressão em plantas monocotiledôneas.

Alternativamente, o promotor de plantas pode direcionar expressão de um polinucleotideo da presente invenção em um tecido específico ou pode estar sob controle ambiental ou durante o desenvolvimento mais preciso. Tais promotores são referidos nesse documento como promotores "induzíveis" (Rabl7, RAD29). Condições ambientais que podem afetar a transcrição através de promotores induzíveis incluem ataque de patógenos, condições anaeróbicas, ou a presença de luz. Exemplos de promotores induzíveis são o promotor Adhl que é induzível por hipoxia ou estresse de frio, o promotor Hsp70 que é induzível por estresse de calor, e o promotor PPDK que é induzível por luz.

Exemplos de promotores sob controle durante o desenvolvimento incluem promotores que iniciam transcrição somente, ou preferencialmente, em certos tecidos tais como folhas, raízes, frutos, sementes ou flores. A operação de um promotor pode também variar dependendo de sua localização no genoma. Logo, um promotor induzível pode se tornar completamente ou parcialmente constitutivo em certas localizações.

Se expressão do polipeptídeo é desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região codificante do polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada de uma variedades de genes de plantas, ou do T-DNA. A seqüência da extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes da nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene de plantas, ou menos preferencialmente, qualquer outro gene eucariótico. Exemplos de tais elementos regulatórios incluem, porém não se limitam a, regiões de terminação 3' e/ou de poliadenilação tais como as do gene da nopalina sintase (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, et al. , (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); o gene do inibidor de proteinase II (PINII) de batata (Keil, et al. , (1986) Nucleie Aeids Res. 14:5641-50; e An, et al., (1989) Plant Cell 1:115-22); e o gene CaMV 19S (Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-72).

Uma seqüência intrônica pode ser adicionada à região 5' não traduzida ou à seqüência codificante da seqüência codificante parcial para aumentar a quantidade de mensageiro maduro que acumula no citosol. A inclusão de um íntron que pode ser removido por "splicing" na unidade de transcrição em construções de expressão em tanto em planta como em animal mostrou aumentar a expressão gênica dos niveis de tanto mRNA quanto de proteína em até 1000 vezes (Buchman and Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis, et al. , (1987) Genes Dev. 1:1183-200). Tais aumento da expressão gênica mediado por íntron é tipicamente maior quando o íntron é colocado perto da extremidade 5' da unidade transcricional. 0 uso dos íntrons de milho íntron 1, 2, e 6 de Adhl-S, o íntron Bronze-I são conhecidos na arte. Veja de maneira geral, The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling & Walbot, eds., Springer, Nova Iorque (1994).

Seqüências sinais de plantas, incluindo, porém não limitado a, peptídeo sinal codificando seqüências DNA/RNA que endereçam proteínas para a matriz extracelular da célula vegetal (Dratewka-Kos, et al. , (1989) J. Biol. Chem. 264:4896-900), tal como o gene de extensão de Nieotiana plumbagini folia (DeLoose, et al., (1991) Gene 99:95-100); peptídeos sinal que endereçam proteínas para o vacúolo, tais como o gene da esporamina de batata doce (Matsuka, et al. , (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:834) e o gene da lectina de cevada (Wilkins, et al., (1990) Plant Cell,2:301-13); peptídeos sinal que levam proteínas a serem secretadas, tais como o de PRIb (Lind, et al. , (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53) ou o da alfa amilase de cevada (BAA) (Rahmatullah, et al. , (1989) Plant Mol. Biol. 12:119, e incorporado nesse documento por referência), ou peptídeos sinal que endereçam proteínas para os plastídeos tal como o do enoil-Acp redutase de colza (Verwaert, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26:189-202) são úteis na invenção. A seqüência sinal da alfa amilase de cevada fusionada com o polinucleotídeo ERECTA é a construção preferida para a expressão em milho para a presente invenção.

O vetor contendo seqüências de um polinucleotídeo da presente invenção irá tipicamente conter um gene marcador que confere um fenótipo passível de seleção em células vegetais. Usualmente, o gene marcador de seleção irá codificar resistência a antibiótico, com genes apropriados incluindo genes codificando resistência ao antibiótico espectinomicina (ex., o gene aada), o gene da estreptomicina fosfotransferase (SPT) codificando resistência a estreptomicina, o gene da neomicina fosfotransferase (NPTII) codificando resistência a canamicina ou geneticina, o gene da higromicina fosfotransferase (HPT) codificando resistência a higromicina, genes codificando resistência a herbicidas que agem na inibição da ação da acetolacto- sintase (ALS), em particular os herbicidas do tipo sulfoniluréias (ex., o gene da acetolacto-sintase (ALS) contendo mutações levando a tal resistência, em particular as mutações S4 e/ou Hra), genes codificando resistência a herbicidas que agem na inibição da ação da glutamina sintase, tal como fosfinotricina ou basta (ex., o gene bar), ou outros genes conhecidos na arte. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, e o gene ALS codifica resistência ao herbicida clorsulfuron.

Vetores típicos úteis para a expressão de genes em vegetais superiores são bem conhecidos na arte e incluem vetores derivados do plasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers, et al. , (1987) Meth. Enzymol. 153:253-77. Esses vetores são vetores integradores de planta uma vez que, na transformação, os vetores integram uma porção do DNA do vetor no genoma da planta hospedeira. Vetores de A. tumefaciens exemplares úteis nesse documento são plasmídeos pKYLX6 e pKYLX7 de Schardl, et al. , (1987) Gene 61:1-11, e Berger et al. , (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:8402-6. Outro vetor útil nesse documento é o plasmídeo pBI101.2 que está disponível pela CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto, CA).

Expressão de Proteínas em Células Hospedeiras

Usando os ácidos nucléicos da presente invenção, alguém pode expressar uma proteína da presente invenção em uma célula recombinantemente engenheirada tais como células de bactéria, levedura, inseto, mamífero, ou preferencialmente, de planta. As células produzem a proteína em uma condição não natural (ex., quantidade, composição, localização, e/ou tempo), porque elas foram geneticamente alteradas por intervenção humana com esse intuito.

É esperado que aqueles com habilidade na arte tenham conhecimento de vários sistemas de expressão disponíveis para a expressão de um ácido nucléico codificando uma proteína da presente invenção. Nenhuma tentativa em descrever em detalhes os vários métodos conhecidos para a expressão de proteínas em procariotos ou eucariotos será feita.

Em resumo breve, a expressão de ácidos nucléicos isolados codificando uma proteína da presente invenção irá tipicamente ser alcançada através da ligação operacional, por exemplo, do DNA ou cDNA a um promotor (que é ou constitutivo ou induzível) , seguido pela incorporação em um vetor de expressão. Os vetores podem ser apropriados para replicação e integração em ou procariotos ou eucariotos. Vetores de expressão típicos contém terminadores de transcrição e tradução, seqüências iniciadoras, e promotores úteis para a regulação da expressão do DNA codificando uma proteína da presente invenção. Para obter um alto nível de expressão de um gene clonado, é desejado construir vetores de expressão que contêm , no mínimo, um promotor forte, tal como ubiquitina, para direcionar a transcrição, um sítio de ligação de ribossomo para iniciação da tradução, e um terminador de transcrição/tradução. Promotores constitutivos são classificados como providos para uma variação de expressão constitutiva. Logo, alguns são promotores constitutivos fracos, e outros são promotores constitutivos fortes. Geralmente, por "promotor fraco" entende-se um promotor que dirige a expressão de uma seqüência codificante em um nível baixo. Por "nível baixo" entende-se níveis de por volta de 1/10.000 transcritos a por volta de 1/100.000 transcritos a por volta de 1/500.000 transcritos. Por outro lado, um "promotor forte" dirige a expressão de uma seqüência codificante em um "nível alto", ou por volta de1/10 transcritos a por volta de 1/100 transcritos a por volta de 1/1.000 transcritos.

Alguém com habilidade irá reconhecer que modificações podem ser feitas em uma proteína da presente invenção sem diminuir sua atividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão, ou incorporação da molécula alvo em uma proteína de fusão. Tais modificações são bem conhecidas àqueles com habilidade na arte e incluem, por exemplo, uma metionina adicionada no amino-terminal para prover um sítio de iniciação, ou aminoácidos adicionais (ex., poli His) colocados em qualquer um dos términos (amino ou carboxi) para criar sítios de restrição convenientemente colocados ou códons de terminação ou seqüências de purificação.

Expressão em Procariotos

Células procariotas podem ser usadas como hospedeiros para expressão. Procariotos mais freqüentemente são representados por várias cepas de E. coli; porém, outras cepas microbianas também podem ser usadas. Seqüências de controle procarióticas comumente usadas que são definidas nesse documento incluem promotores para iniciação da transcrição, opcionalmente junto com um operador, com seqüências de ligação de ribossomos, incluem promotores comumente usados tais como o da beta lactamase (penicilinase) e o sistema de promotor lactose (Iac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), o sistema de promotor triptofano (trp) (Goeddel, et al. , (1980) Nucleic Acids Res.8:4057) e o promotor derivado de lambda PLeo sítio de ligação ao ribossomo do N-gene (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128). A inclusão de marcadores de seleção em vetores de DNA transfectados em E. coli também são úteis. Exemplos de tais marcadores incluem genes que especificam resistência a ampicilina, tetraciclina, ou cloramfenicol.

O vetor é selecionado para permitir a introdução do

gene de interesse na célula hospedeira apropriada. Vetores bacterianos são tipicamente de origem plasmidial ou de fagos. Células bacterianas apropriadas são infectadas com partículas de vetores de fagos ou transfectadas com o DNA do vetor de fago. Se um vetor plasmidial é usado, as células bacterianas são transfectadas com o DNA do vetor plasmidial. Sistemas de expressão para expressar uma proteína da presente invenção estão disponíveis usando Baeillus sp. e Salmonella (Paiva, et al. , (1983) Gene 22:229-35; Mosbach, et al., (1983) Nature 302:543-5). O vetor plasmidial pGEX-4T-l da Pharmacia é o vetor de expressão em E. coli preferido para a presente invenção. Expressão em Eucariotos

Uma variedade de sistemas de expressão em eucariotos tais como levedura, linhagens de células de insetos, células vegetais ou de mamíferos, são conhecidos daqueles com habilidade na arte. Como explicado brevemente abaixo, a presente invenção pode ser expressa nesses sistemas eucarióticos. Em algumas concretizações, células vegetais transformadas/transfectadas, como discutido infra, são empregadas como sistemas de expressão para produção de proteínas da presente invenção.

Síntese de proteínas heterólogas em levedura é bem conhecida. Sherman, et al. , (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory é um trabalho bem conhecido que descreve os vários métodos disponíveis para produzir proteínas em levedura. Duas leveduras muito usadas para a produção de proteínas eucarióticas são Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Vetores, cepas, e protocolos para expressão em Saccharomyees e Piehia são conhecidas na arte e disponível através de distribuidores comerciais (ex. , Invitrogen). Vetores apropriados usualmente apresentam seqüências de controle de expressão, tal como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou álcool desidrogenase, e uma origem de replicação, seqüências de terminação e similares, como desejado.

Uma proteína da presente invenção, uma vez expressa, pode ser isolada de levedura através da Iise das células e aplicação de técnicas padrão de isolamento de proteína aos lisados ou precipitados. 0 monitoramento de processos de purificação pode ser alcançado através do uso de técnicas de Western Blot ou ensaios radioimune de outras técnicas padrão de ensaios imunes.

As seqüências codificando proteínas da presente invenção podem também ser ligadas a vários vetores de expressão para uso em culturas de células transfectantes de origem, por exemplo, animal (mamífero ou inseto) ou vegetal. Sistemas de células de mamíferos freqüentemente serão em forma de monocamadas de células apesar de suspensão de células de mamíferos também poderem ser usadas. Um número de linhagens de célula do hospedeiro apropriadas capazes de expressar proteínas intactas foram desenvolvidas na arte, e incluem as linhagens de células HEK293, BHK21, e CHO. Vetores de expressão para essas células podem incluir seqüências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor (ex., o promotor CMV, o promotor HSV tk ou promotor pgk (fosfoglicerato quinase)) , um intensificador (Queen, et al. , (1986) Immunol. Rev. 89:49), e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação de ribossomos, sítios de "splicing" de RNA, sítios de poliadenilação (ex., um sítio de adição de poli A "SV40 large T Ag"), e seqüências terminadoras de transcrição. Outras células animais úteis para a produção de proteínas da presente invenção estão disponíveis, por exemplo, no American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7a ed. , 1992).

Vetores apropriados para expressar proteínas da presente invenção em células de insetos são usualmente derivadas do baculovírus SF9. Linhagens de células de insetos apropriadas incluem larva de mosquito, bicho-da- seda, mariposa, e linhagens de células de Drosophila tal como uma linhagem de células Schneider (veja, ex. , Schneider, (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-65).

Já em levedura, quando células hospedeiras de animais e vegetais superiores são empregadas, seqüências de poliadenilação ou de terminação da transcrição são tipicamente integradas no vetor. Um exemplo de uma seqüência terminadora é a seqüência de poliadenilação do gene do hormônio de crescimento bovino. Seqüências para que o wSplicing" do transcrito ocorra corretamente também podem ser incluídas. Um exemplo de uma seqüência de "splicing" é o íntron VPl de SV40 (Sprague, et al. , (1983) J. Virol.45:773-81). Adicionalmente, seqüências de genes para controle da replicação em uma célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor tal como aquelas encontrada nos vetores do tipo do vírus papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector," in DNA Cloning: A Practical Approach, vol. II, Glover, ed. , IRL Press, Arlington, VA, pp. 213-38 (1985)).

Em adição, o gene para ERECTA colocado no vetor de expressão em plantas apropriado pode ser usado para transformar células de plantas. 0 polipeptídeo pode então ser isolado de calo vegetal ou células transformadas podem ser usadas para regenerar plantas transgênicas. Tais plantas transgênicas podem ser coletadas, e tecidos apropriados (sementes ou folhas, por exemplo) podem ser submetidas a técnicas de extração de proteínas em larga escala e de purificação.

Métodos de Transformação de Plantas

Vários métodos para introduzir genes exógenos em plantas são conhecidos e podem ser usados para inserir um polinucleotídeo ERECTA em uma planta hospedeira, incluindo protocolos de transformação biológica e física de plantas. Veja, ex. , Miki, et al. , "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants," in Methods In Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993). Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira, e incluem métodos de transfecção química tal como fosfato de cálcio, transferência gênica mediada por microorganismo tal como Agrobacterium (Horsch, et al., (1985) Science 227:1229-31), eletroporação, micro- injeção, e bombardeamento de partículas.

Cassetes de expressão e vetores e métodos de cultura in vitro para transformação de célula ou tecido vegetal e regeneração de plantas são conhecidos e disponível. Veja, ex., Gruber, et al. , "Vectors for Plant Transformation," in Methods In Plant Molecular Biology and Biotechnology, supra, pp. 89-119.

Os polinucleotídeos ou polipeptídeos isolados podem ser introduzidos na planta por uma ou mais técnicas tipicamente usadas para direta transferência para dentro das células. Tais protocolos podem variar dependendo do tipo de organismo, célula, planta ou célula de planta, ex., monocotiledônea ou dicotiledônea, que será alvo da modificação gênica. Métodos apropriados para transformar células vegetais incluem micro-injeção (Crossway, et al. , (1986) Biotechniques 4:32 0-334; e Patente Norte-Americana 6.300.543), eletroporação (Riggs, et al. , (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606), transferência gênica direta (Paszkowski, et al. , (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração de partículas de balística (veja, por exemplo, Sanford, et al. , Patente Norte Americana 4.945.050; WO 91/10725; e McCabe, et al. , (1988) Biotechnology 6:923-926) . Veja também, Tomes, et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment. pp.197-213 em Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods eds. 0. L. Gamborg & G.C. Phillips. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Nova Iorque, 1995; Patente Morte-Americana5.736.369 (meristema) ; Weissinger, et al. , (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al. , (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou, et al. , (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); Datta, et al. , (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al. , (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein, et al. , (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); WO91/10725 (milho); Klein, et al., (1988) Plant Physiol.91:440 -444 (milho); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839; and Gordon-Kamm, et al. , (1990) Plant Cell 2:603-618 (milho); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebier, et al. , (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet, et al. , (1985) In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman, et al. , pp. 197-209. Longman, NY (pólen); Kaeppler, et al. , (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; e Kaeppler, et al. , (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por fio); Upatente dos Estados Unidos Número 5.693.512 (sonicação); D1Halluin, et al. , (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255; e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al. , (1996) Nature Biotech. 14:745-750; transformação de milho mediada por Agrobacterium (Patente Norte-Americana 5.981.840); métodos com fio de carburo de silício (Frame, et al. , (1994) Plant J. 6:941-948); métodos à laser (Guo, et al., (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicação (Bao, et al., (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer e Finer (2000) Lett Appl Microbiol. 30:406-10; Amoah, et al., (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos com polietileno glicol (Krens, et al. , (1982) Nature 296-.Ί2-ΊΊ); células de protoplasto de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser transformadas por eletroporação (Fromm, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824-5828) e micro- injeção (Crossway, et al. , (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179- 185) ; todos os quais estão incorporados nesse documento por referência.

Transformação mediada por Agrobacterium

O método mais utilizado para introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema natural de transformação da Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias de solo patogênica de plantas que geneticamente transformam células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis por transformação genética de plantas. Veja, ex. , Kado, (1991) Crit. Rev. Plant Sei. 10:1. Descrições dos sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência gênica mediada por Agrobacterium são providas em Gruber, et al. , supra; Miki, et al., supra; e Moloney, et al. , (1989) Plant Cell Reports 8:238.

Similarmente, o gene pode ser inserido na região do T-DNA de um plasmídeo Ti ou Ri derivado de A. tumefaciens ou A. rhizogenes, respectivamente. Logo, cassetes de expressão podem ser construídos como acima, usando esses plasmídeos. Muitas seqüências de controle são conhecida que quando acopladas a uma seqüência codificante heteróloga e transformada em um organismo hospedeiro apresentam fidelidade na expressão do gene no que diz respeito à especificidade de tecido/órgão da seqüência codificante original. Veja, ex., Benfey e Chua, (1989) Science 244:174- 81. Seqüência de controle particularmente apropriadas para uso nesses plasmídeos são promotores de expressão constitutiva específica de folha do gene nas várias plantas alvos. Outras seqüências de controle úteis incluem um promotor e terminador do gene da nopalina sintase (NOS). 0 promotor e terminador NOS estão presentes no plasmídeo pARC2, disponível através da American Type Culture Collection e designado ATCC 67238. Se tal sistema é usado, os genes de virulência (vir) ou do plasmídeo Ti ou do plasmídeo Ri têm que também estar presentes, juntamente com a porção do T-DNA, ou via um sistema binário onde o gene vir está presente em um vetor separado. Tais sistemas, vetores para uso nestes, e métodos de transformação de células de plantas são descritos na Patente Norte- Americana 4.658.082; no Pedido de Patente Norte- Americana Número 913.914, depositada em Is de outubro de 1986, como referenciada na Patente Norte- Americana Número 5.2 62.3 06, publicada em 16 de novembro de 1993; e Simpson, et al. , (1986) Plant Mol. Biol. 6:403-15 (também referenciada na patente '306); todos incorporados por referência na sua íntegra.

Uma vez construídos, esses plasmídeos podem ser colocados em A. rhizogenes ou A. tumefaciens e esses vetores usados para transformar células de espécies de plantas que são normalmente suscetíveis à infecção por Fusarium ou Alternaria. Várias outras plantas transgênicas são também contempladas pela presente invenção incluindo porém não limitado a soja, milho, sorgo, alfafa, arroz, trevo, repolho, banana, café, aipo, tabaco, caupi, algodão, melão e pimenta. A seleção de A. tumefaciens ou A. rhizogenes vai depender da planta que está sendo transformada. Em geral, A. tumefaciens é o organismo preferido para transformação. A maioria das plantas dicotiledôneas, algumas gimnospermas, e poucas plantas monocotiledôneas (ex., certos membros de Liliales e Arales) são suscetíveis à infecção por A. tumefaciens. A. rhizogenes também possui uma grande variedade de hospedeiros, englobando a maioria das dicotiledôneas e algumas gimnospermas, que incluem membros de Leguminosae, Compositae, e Chenopodiaceae. Plantas monocotiledôneas podem ser agora transformadas com algum sucesso. O Pedido de Patente Europeu Número 604 6 62 Al revela um método para transformação de monocotiledôneas usando Agrobacterium. 0 Pedido de Patente Europeu Número 672 752 Al revela um método para transformar monocotiledôneas com Agrobacterium usando o escutelo de embriões imaturos. Ishida, et al. , discute um método para transformar milho através da exposição de embriões imaturos à A. tumefaciens (Nature Biotechnology 14:745-50 (1996)).

Uma vez transformadas, essas células podem ser usadas para regenerar plantas transgênicas. Por exemplo, plantas inteiras podem ser infectadas com esses vetores através de dano na planta seguido de introdução do vetor no sítio de dano. Qualquer parte da planta pode ser danificada, incluindo folhas, caules e raízes. Alternativamente, tecido vegetal, na forma de um explante, tais como tecido cotiledonar ou discos foliares, podem ser inoculados com esses vetores e cultivados sob condições que promovem regeneração vegetal. Raízes ou brotos transformados pela inoculação de tecido vegetal com A. rhizogenes ou A. tumefaciens, contendo o gene codificando a enzima de degradação fumonisina podem ser usados com uma fonte de tecido vegetal para regenerar plantas transgênicas resistentes a fumonisina por via de embriogênese somática ou organogênese. Exemplos de tais métodos para regenerar tecido vegetal está revelado em Shahin, (1985) Theor. Appl. Genet. 69:235-40; Patente Norte- Americana Número 4.658.082; Simpson, et al. , supra; e Pedidos de Patente Norte- Americana Números 913.913 e 913.914, ambos depositados em I2 de outubro de 1986, como referenciada na Patente Norte- Americana Número 5.262.306, publicada em 16 de novembro de .1993, as revelações completas destes estão incorporadas nesse documento por referência.

Transferência Gênica Direta Apesar do fato de que a variedade de hospedeiros para

transformação mediada por Agrobacterium ser grande, algumas espécies principais de cereais de plantio e gimnospermas têm geralmente sido recalcitantes a esse modo de transferência gênica, mesmo que ainda alguma sucesso tenha sido recentemente obtido em arroz (Hiei, et al. , (1994) The Plant Journal 6:271-82). Vários métodos de transformação de plantas, coletivamente referidos como transferência gênica direta, vêm sendo desenvolvidos como uma alternativa à transformação mediada por Agrobacterium.

Um método de transformação de plantas geralmente aplicado é a transformação mediada por micro-projétil, onde o DNA é colocado na superfície de micro-projéteis medindo por volta de 1 a 4 μπι. 0 vetor de expressão é introduzido em tecidos vegetais com o aparelho de biobalística que acelera os micro-projéteis a velocidades de 3 00 a 600 m/s que são suficientes para penetrar as paredes celulares e membranas da planta (Sanford, et al., (1987) Part. Sei. Technol. 5:27; Sanford, (1988) Trends Bioteeh 6:299; Sanford, (1990) Physiol. Plant 79:206; e Klein, et al., (1992) Biotechnology10:268).

Outro método físico de colocar o DNA dentro da planta é a sonicação das células alvo como descrito em Zang, et al. , (1991) BioTeehnology 9:996. Alternativamente, fusões de esferoplasto ou lipossomos têm sido usados para introduzir vetores de expressão em plantas. Veja, ex. , Deshayes, et al., (1985) EMBO J. 4:2731; e Christou, et al. , (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3962. A obtenção direta de DNA pelos protoplastos usando precipitação com CaCl2, álcool polivinil, ou poli-L-ornitina também foi reportado. Veja, ex., Hain, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161; e Draper, et al. , (1982) Plant Cell Physiol. 23:451.

Eletroporação de protoplastos e células inteiras e tecidos também foi descrita. Veja, ex. , Donn, et al. , in Abstracts of the VIIth Int Ί. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC1 A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-505; e Spencer, et al. , (1994) Plant Mol. Biol. 24:51-61.

Aumento da Atividade e/ou Níveis de um Polipeptideo ERECTA

Métodos são providos para aumentar a atividade e/ou níveis do polipeptídeo ERECTA da invenção. Um aumento nos níveis e/ou atividade do polipeptídeo ERECTA da invenção pode ser obtido através da provisão à planta de um polipeptídeo ERECTA. 0 polipeptídeo ERECTA pode ser provido através da introdução da seqüência de aminoácidos contendo o polipeptídeo ERECTA na planta, introduzindo na planta uma seqüência nucleotídica codificando um polipeptídeo ERECTA ou, alternativamente, pela modificação de um lócus genômico codificando o polipeptídeo ERECTA da invenção.

Como discutido em outra seção desse documento, vários métodos são conhecidos na arte por prover um polipeptídeo a uma planta, incluindo, porém não limitado a, introdução direta do polipeptídeo na planta, introduzindo na planta (transientemente ou de maneira estável) um construção polinucleotídica codificando um polipeptídeo apresentando atividade regulatória de crescimento vegetal. Também é reconhecido que métodos da invenção podem empregar um polinucleotídeo que não é capaz de direcionar, na planta transformada, a expressão de uma proteína ou RNA. Logo, os níveis e/ou atividade de um polipeptídeo ERECTA podem ser aumentados pela alteração do gene codificando o polipeptídeo ERECTA ou seu promotor. Veja, ex. , Kmiec, Patente Norte- Americana Niimero 5.565.350; Zarling, et al. , PCT/US93/03868. Portanto, plantas mutagenisadas que carregam mutações em genes ERECTA, onde as mutações aumentam a expressão do gene ERECTA ou aumentam o crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos do polipeptídeo codificado ERECTA são providas.

Redução da Atividade e/ou Níveis de um Polipeptídeo ERECTA

Métodos são providos para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo ERECTA da invenção através da transformação uma célula vegetal com um cassete de expressão que expressa um polinucleotídeo que inibe a expressão de um polipeptídeo ERECTA. 0 polinucleotídeo pode inibir a expressão do polipeptídeo diretamente, através da prevenção da tradução do RNA mensageiro ERECTA, ou indiretamente, por codificar um polipeptídeo que inibe a transcrição ou tradução de um gene ERECTA codificando um polipeptídeo ERECTA. Métodos para inibir ou eliminar a expressão de um gene em uma planta são bem conhecidos na arte, e qualquer um desses métodos pode ser usado na presente invenção para inibir a expressão de um polipeptídeo ERECTA.

De acordo com a presente invenção, a expressão de um polipeptídeo ERECTA é inibida se os níveis da proteína ERECTA são menores que 70% dos níveis do mesmo polipeptídeo ERECTA em uma planta que não foi geneticamente modificada ou mutagenisada para inibir a expressão desse polipeptídeo ERECTA. Em concretizações particulares da invenção, os níveis de proteína do polipeptídeo ERECTA em uma planta modificada de acordo com a invenção são menores que 60%, menores que 50%, menores que 40%, menores que 3 0%, menores que 2 0%, menores que 10%, menores que 5% ou menores que 2% dos níveis de proteína do mesmo polipeptídeo ERECTA em uma planta que não é um mutante ou que não foi geneticamente modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo ERECTA. Os níveis de expressão do polipeptídeo ERECTA podem ser medidos diretamente, por exemplo, através de ensaio para medir os níveis do polipeptídeo ERECTA expresso em uma célula vegetal ou planta, ou indiretamente, por exemplo, pela medição do crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos do polipeptídeo ERECTA na célula vegetal ou planta, ou pela medição da biomassa na planta. Métodos para desempenhar tais ensaios são descritos em outra seção desse documento.

Em outras concretizações da invenção, a atividade dos polipeptídeos ERECTA é reduzida ou eliminada pela transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão contendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo que inibe a atividade de um polipeptídeo ERECTA. 0 crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos de um polipeptídeo ERECTA é inibido de acordo com a presente invenção se o crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos do polipeptídeo ERECTA for menor que 7 0% do crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos do mesmo polipeptídeo ERECTA em uma planta que não foi modificada para inibir o crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos daquele polipeptídeo ERECTA. Em concretizações particulares da invenção, o crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos do polipeptídeo ERECTA em uma planta modificada de acordo com a invenção é de menos que 60%, menos que 5 0%, menos que 4 0%, menos que 3 0%, menos que 20%, menos que 10%, ou menos que 5% do crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos do mesmo polipeptídeo ERECTA em uma planta que não foi modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo ERECTA. O crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos de um polipeptídeo ERECTA é "eliminada" de acordo com a invenção quando ele não é detectado pelos métodos descritos em outra seção desse documento. Métodos para determinar o crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos de um polipeptídeo ERECTA são descritas em outra seção desse documento.

Em outras concretizações, a atividade de um polipeptídeo ERECTA pode ser reduzida ou eliminada pela disrupção do gene codificando o polipeptídeo ERECTA. A invenção engloba plantas mutagenisadas que carregam mutações em genes ERECTA, onde essas mutações reduzem a expressão do gene ERECTA ou inibem o crescimento vegetal e/ou atividade de desenvolvimento de órgãos do polipeptídeo ERECTA codificado.

Logo, muitos métodos podem ser usados para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo ERECTA. Em adição, mais de um método pode ser usado para reduzir a atividade de um único polipeptídeo ERECTA. Exemplos não limitantes de métodos de redução ou eliminação da expressão de polipeptídeos ERECTA são dados abaixo.

1. Métodos Baseados em Polinucleotídeos:

Em algumas incorporações da presente invenção, uma planta é transformada com um cassete de expressão que é capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de um polipeptídeo ERECTA da invenção. 0 termo "expressão" como usado aqui se refere à biossíntese de um produto gênico, incluindo a transcrição e/ou tradução do dito produto gênico. Por exemplo, para propósitos da presente invenção, um cassete de expressão capaz de expressar um polinucleotídeo que inibe a expressão de pelo menos um polipeptídeo ERECTA é um cassete de expressão capaz de produzir uma molécula de RNA que inibe a transcrição e/ou tradução de pelo menos um polipeptídeo ERECTA da invenção. A "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo de uma molécula de DNA se refere a transcrição e tradução da seqüência codificante para produzir a proteína ou polipeptídeo, enquanto a "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptídeo a partir de uma molécula de RNA se refere à tradução da seqüência codificante de RNA para produzir a proteína ou polipeptídeo.

Exemplos de polinucleotídeos que inibem a expressão de

um polipeptídeo ERECTA são dados abaixo.

i. Supressão/Co-supressão por Sense

Em algumas concretizações da invenção, inibição da expressão de um polipeptídeo ERECTA pode ser obtida através da supressão ou co-supressão por sense. Para co-supressão, um cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA correspondendo a todo ou parte de um RNA mensageiro codificando um polipeptídeo ERECTA na orientação "sense" . A super expressão de uma molécula de RNA pode resultar na redução da expressão do gene nativo. De acordo, múltiplas linhagens de planta transformadas como o cassete de expressão de co-supressão são analisadas para identificar aquelas que apresentam a maior inibição da expressão do polipeptídeo ERECTA.

O polinucleotídeo usado para co-supressão pode corresponder a toda ou parte da seqüência codificando o polipeptídeo ERECTA, toda ou parte a região 5' e/ou 3' não traduzida de um transcrito de um polipeptídeo ERECTA, ou toda ou parte da seqüência codificante e regiões não traduzidas de um transcrito codificando um polipeptídeo ERECTA. Em algumas concretizações onde o polinucleotídeo contém toda ou parte da região codificante do polipeptídeo ERECTA, o cassete de expressão é desenhado para eliminar o códon de iniciação do polinucleotideo de modo que nenhum produto protéico será traduzido.

Co-supressão pode ser usada para inibir a expressão de genes de planta para produzir plantas apresentando níveis indetectáveis de proteínas codificadas por esses genes. Veja, por exemplo, Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417- 1432. Co-supressão também pode ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Veja, por exemplo, Patente Norte- Americana Número 5.942.657. Métodos para uso da co-supressão para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos em Flavell, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3490-3496; Jorgensen, et al. , (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen e Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, et al. , (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, et al. , (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu, et al., (2003) Phytochemistry 63:753-763; e Patentes Norte- Americana Números 5.034.323, 5.283.184 e 5.942.657; cada um incorporado nesse documento por referência. A eficiência da co-supressão pode ser aumentada pela inclusão de uma região poli-dT no cassete de expressão em uma posição 3' a seqüência sense e 5' do sinal de poliadenilação. Veja, Publicação da Patente Norte- Americana Número 20020048814, incorporado aqui por referência. Tipicamente, tal seqüência nucleotídica apresenta substancial identidade de seqüência com a seqüência do transcrito do gene endógeno, otimamente maior que por volta de 65%, mais otimamente maior que por volta de 85%, ainda mais otimamente maior que por volta de 95%. Veja, Patentes Norte- Americana Número 5.283.184 e 5.034.323; incorporados nesse documento por referência.

ii. Supressão por Anti-sense

Em algumas concretizações da invenção, inibição da expressão do polipeptídeo pode ser obtido pela supressão por anti-sense. Para supressão por anti-sense, o cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte do RNA mensageiro codificando um polipeptídeo ERECTA. Super expressão da molécula de RNA anti-sense pode resultar na redução da expressão do gene nativo. De acordo, múltiplas linhagens de plantas transformadas com o cassete de expressão de supressão por anti-sense são analisadas para identificar aquelas que apresentam a maior inibição da expressão do polipeptídeo ERECTA.

O polinucleotídeo para uso na supressão por anti-sense pode corresponder a todo ou parte do complemento da seqüência que codifica o polipeptídeo ERECTA, todo ou parte do complemento da região 5' e/ou 3' não traduzida do transcrito ERECTA, ou todo ou parte do complemento de tanto da seqüência codificante quanto das regiões não traduzidas de um transcrito codificando o polipeptídeo ERECTA. Em adição, o polinucleotídeo anti-sense pode ser completamente complementar (ex., 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) ou parcialmente complementar (ex., menos que 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) à seqüência alvo. Supressão por anti-sense pode ser usado para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Veja, por exemplo, Patente Norte- Americana Número 5.942.657. Além disso, porções de nucleotídeos anti-senso podem ser usadas na disrupção da expressão do gene alvo. Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300, 400, 450, 500, 550 ou mais podem ser usadas. Métodos para usar a supressão por anti-sense para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu, et al. , (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e Patentes Norte- Americana Números 5.759.829 e 5.942.657, cada uma incorporada nesse documento por referência. Eficiência da supressão por anti-sense pode ser aumentada pela inclusão de uma região poli-dT no cassete de expressão em posição 3' da seqüência anti-sense e 5' do sinal de poliadenilação. Veja, Publicação da Patente dos Estados Unido Número 20020048814, incorporada nesse documento por referência.

iii. RNA Dupla Fita Interferência Em algumas incorporações da invenção, inibição da expressão de um polinucleotídeo ERECTA pode ser obtida através de RNA dupla fita (dsRNA) interferência. Para dsRNA interferência, uma molécula sense de RNA como a descrita acima para co-supressão e uma molécula anti-sense de RNA que é completamente ou parcialmente complementar à molécula sense de RNA são expressas na mesma célula, resultando na inibição da expressão do RNA mensageiro endógeno correspondente.

Expressão de moléculas sense e anti-sense pode ser obtida pelo desenho do cassete de expressão de modo a conter tanto uma seqüência sense quanto uma seqüência anti-sense. Alternativamente, cassetes de expressão separados podem ser usados para as seqüências sense e anti-sense. Múltiplas linhagens de plantas transformadas com cassete de expressão de dsRNA interferência ou cassetes de expressão são então analisadas para identificar plantas que apresentam a maior inibição da expressão do polipeptideo ERECTA. Métodos para uso de dsRNA interferência para inibir a expressão de genes endógenos de planta são descritos em Waterhouse, et al. , (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13959-13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, e WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, e WO 00/49035; cada um incorporados nesse documento por referência.

iv. RNA em Forma de Grampo Interferência e KNA em

Forma de Grampo Contendo íntron Interferência

Em algumas cpncretizações da invenção, a inibição da expressão de um polipeptideo ERECTA pode ser obtida através de RNA em forma de grampo (hpRNA) interferência ou RNA em forma de grampo contendo íntron (ihpRNA) interferência. Esses métodos são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos. Veja, Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 e as referências citadas nele.

Para hpRNA interferência, o cassete de expressão é desenhado para expressar uma molécula de RNA que hibridiza com ela mesma de modo a formar uma estrutura em forma de grampo que contém um região simples fita de volta e uma haste com bases pareadas. A região de haste com bases pareadas contém uma seqüência sense correspondendo a todo ou parte do RNA mensageiro do gene cuja expressão deve ser inibida, e uma seqüência anti-sense que é completamente ou parcialmente complementar à seqüência sense. Logo, a região de haste com bases pareadas da molécula geralmente determina a especificidade da RNA interferência. Moléculas hpRNA são altamente eficientes em inibir a expressão dos genes endógenos, e a RNA interferência que elas induzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas. Veja, por exemplo, Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al. , (2002) Plant Physiol.129:17231731; e Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-3 8. Métodos para uso da hpRNA interferência para inibir ou silenciar a expressão de genes são descritos, por exemplo, em Chuang e Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini, et al. , BMC Biotechnology3:7, e Publicação de Patente dos Estados Unido Número20030175965; cada um incorporada nesse documento por referência. Um ensaio transiente de eficiência de construções de hpRNA para silenciar a expressão gênica in vivo foi descrito por Panstruga, et al. , (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporado aqui por referência.

Para ihpRNA, as moléculas interferentes apresentam a mesma estrutura geral do hpRNA, porém a molécula de RNA adicionalmente contém um íntron que é capaz de ser excisado por "splicing" na célula na qual o ihpRNA é expresso. 0 uso de um íntron minimiza o tamanho da volta na molécula de RNA em forma de grampo seguido do "splicing", e isso aumenta a eficiência da interferência. Veja, por exemplo, Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320. De fato, Smith, et al. , demonstram uma supressão de 100% da expressão do gene endógeno usando uma interferência mediada por ihpRNA. Métodos de uso de ihpRNA interferência para inibir a expressão de genes endógenos de plantas são descritos, por exemplo, Smith, et al. , (2000) Nature 407:319-320; Wesley, et al., (2001) Plant J. 27:581-590; Wang e Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse e Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell e Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, e Publicação de Patentes dos Estados Unido Número 20030180945, cada uma incorporada nesse documento por referência.

O cassete de expressão para hpRNA interferência pode também ser desenhado de modo que a seqüência sense e a seqüência anti-sense não correspondem a um RNA endógeno. Nessa concretização, a seqüência sense e anti-sense flanqueiam uma seqüência de volta que contém uma seqüência nucleotídica correspondendo a todo ou parte do RNA mensageiro do gene alvo. Logo, é a região de volta que determina a especificidade da RNA interferência. Veja, por exemplo, WO 02/009 04, incorporado nesse documento por referência.

v. Interferência Mediada por Amplicon

Cassetes de expressão de amplicon contém uma seqüência derivada de vírus vegetal que contém todo ou parte de um gene alvo, porém geralmente não todos os genes do vírus nativo. As seqüências virais presentes no produto de transcrição do cassete de expressão permitem que o produto de transcrição dirija sua própria replicação. Os transcritos produzidos pelo amplicon podem ser sense ou anti-sense relativo à seqüência alvo (ex., o RNA mensageiro para o polipeptídeo ERECTA). Métodos de uso de amplicons para inibir a expressão de genes endógenos de plantas são descritos, por exemplo, em Angell e Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angell e Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, e Patente dos Estados Unido Número 6.64 6.805, cada um incorporado nesse documento por referência.

vi. Ribozimas

Em algumas incorporações, o polinucleotídeo expresso pelo cassete de expressão da invenção é RNA catalítico ou possui atividade de ribozima específica para o RNA mensageiro do polipeptídeo ERECTA. Logo, o polinucleotídeo causa a degradação do RNA mensageiro endógeno, resultando na redução de expressão do polipeptídeo ERECTA. Esse método é descrito, por exemplo, na Patente Norte-Americana Número 4.987.071, incorporada nesse documento por referência.

vii. Pequeno RNA Interferente ou Micro RNA Em algumas incorporações da invenção, inibição da expressão de um polipeptídeo ERECTA pode ser obtida por RNA interferência através da expressão de um gene codificando um micro RNA (miRNA) . miRNAs são agentes regulatórios consistindo de por volta de 22 ribonucleotídeos. miRNA são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos. Veja, por exemplo, Javier, et al. , (2 003) Nature425: 257-263, incorporado nesse documento por referência.

Para miRNA interferência, o cassete de expressão é desenhado de modo a expressar uma molécula de RNA que é modelada em um gene miRNA endógeno. O gene miRNA codifica um RNA que forma uma estrutura em forma de grampo contendo uma seqüência de 22 nucleotídeos que é complementar a outro gene endógeno (seqüência alvo). Para supressão da expressão de ERECTA, a seqüência nucleotídica de 22 nucleotídeos é selecionada a partir de uma seqüência do transcrito de ERECTA e contém 22 nucleotídeos da dita seqüência ERECTA na orientação sense e 21 nucleotídeos de uma seqüência anti- sense correspondente que é complementar à seqüência sense. Moléculas de miRNA são altamente eficientes na inibição da expressão de genes endógenos, e a RNA interferência que elas induzem são herdadas pelas gerações subseqüentes de plantas.

.2. Inibição da Expressão Gênica Baseada em Polipeptídeo

Em uma concretização, o polinucleotídeo codifica uma proteína dedo-de-zinco que se liga a um gene codificando um polipeptídeo ERECTA resultando na redução da expressão do gene. Em incorporações particulares, a proteína dedo-de- zinco se liga a uma região regulatória de um gene ERECTA. Em outras concretizaçõe, a proteína dedo-de-zinco se liga a um RNA mensageiro codificando um polipeptídeo ERECTA e previne sua tradução. Métodos de seleção de sítios alvos de proteínas dedo-de-zinco foram descritas, por exemplo, na Patente Norte-Americana 6.453.242 e métodos para uso de proteínas dedo-de-zinco para inibir a expressão de genes em plantas são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente dos Estados Unidos Número 20030037355; cada uma incorporada nesse documento por referência.

3. Inibição da Atividade da Proteína Baseada em Polipeptideo

Em algumas concretizações da invenção, o polinucleotídeo codifica um anticorpo que se liga a pelo menos um polipeptídeo ERECTA e reduz a atividade regulatória do crescimento vegetal do polipeptídeo ERECTA. Em outra concretização, a ligação do anticorpo resulta em renovação aumentada do complexo anticorpo-ERECTA através de mecanismos de controle de qualidade da célula. A expressão de anticorpos nas células vegetais e a inibição de vias moleculares através da expressão e ligação de anticorpos a proteínas nas células vegetais são bem conhecidas na arte. Veja, por exemplo, Conrad e Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, incorporado nesse documento por referência.

4. Disrupção Gênica

Em algumas concretizações da presente invenção, a atividade de um polipeptídeo ERECTA é reduzida ou eliminada pela disrupção do gene codificando o polipeptídeo ERECTA. 0 gene codificando o polipeptídeo ERECTA pode sofrer disrupção através de qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, em uma concretização, o gene sofre disrupção através de transposon "tagging". Em outra concretização, o gene sofre disrupção através de mutagênese de plantas usando mutagênese aleatória ou direcionada, e selecionando as plantas que apresentam atividade regulatória de crescimento vegetal reduzida.

i. Transposon "Tagging"

Em uma concretização da invenção, transposon "tagging" é usado para reduzir ou eliminar a atividade ERECTA de um ou mais polipeptídeos ERECTA. Transposon "tagging" consiste da inserção de um transposon em um gene ERECTA endógeno para reduzir ou eliminar a expressão do polipeptideo ERECTA. Por "gene ERECTA" entende-se o gene que codifica um polipeptideo ERECTA de acordo com a invenção.

Nessa concretização, a expressão de um ou mais polipeptídeos ERECTA é reduzida ou eliminada pela inserção de um transposon dentro de uma região regulatório ou região codificante do gene codificando o polipeptideo ERECTA. Um transposon que está dentro de um éxon, íntron, seqüência 5' ou 3' não traduzida, um promotor, ou qualquer outra seqüência regulatória de um gene ERECTA pode ser usada para reduzir ou eliminar a expressão e/ou atividade do polipeptideo ERECTA codificado.

Métodos de transposon "tagging" de genes específicos em plantas são bem conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Maes, et al., (1999) Trends Plant Sei. 4:90-96; Dharmapuri e Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-214; Phogat, et al., (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, et al., (2000) Nucleie Aeids Res. 28:94-96;

Fitzmaurice, et al., (1999) Geneties 153:1919-1928). Em adição, o processo TUSC para selecionar inserções Mu em genes selecionados foi descrita em Bensen, et al. , (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al. , (1996) Science 274:1537-1540; e Patente dos Estados Unidos Número 5.962.764; cada um incorporado nesse documento por referência.

ii. Plantas Mutantes com Atividade Reduzida Métodos adicionais para diminuir ou eliminar a expressão de genes endógenos em plantas são também conhecidos na arte e podem ser similarmente aplicados à presente invenção. Esses métodos incluem outras formas de mutagênese, tais como mutagênese induzida por etil metanosulfonato, mutagênese de deleção, e mutagênese de deleção por nêutron usado em um senso de genética reversa (com PCR) para identificar linhagens de plantas nas quais o gene endógeno foi deletado. Para exemplos desses métodos veja, Ohshima, et al. , (1998) Virology 243:472-481; Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874; e Quesada, et al. , (2000) Genetics 154:421-436; cada um incorporado nesse documento por referência. Em adição, um método rápido e automatizável para fazer uma varredura de mutações quimicamente induzidas, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) , usando um HPLC desnaturante ou digestão com endonucleases seletivas de produtos de PCR selecionados é também aplicável à presente invenção. Veja, McCallum, et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457, incorporada nesse documento por referência.

Mutações que causam impacto na expressão gênica ou interferem com a função (atividade regulatória do crescimento vegetal) da proteína codificada são bem conhecidos na arte. Mutações insercionais em éxons de genes usualmente resultam em mutantes nulos. Mutações em resíduos conservados são particularmente efetivas na inibição da atividade regulatória do crescimento vegetal da proteína codificada. Resíduos conservados de polipeptídeos ERECTA apropriados para mutagênese com o objetivo de eliminar a atividade regulatória do crescimento vegetal foram descritos. Tais mutantes podem ser isolados de acordo com procedimentos bem conhecidos, e mutações em diferentes Ioci ERECTA podem ser introduzidas em um único indivíduo por cruzamento genético. Veja, por exemplo, Gruis, et al. , (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

Em outra incorporação dessa invenção, mutantes dominantes podem ser usados para disparar silenciamento de RNA devido a inversão e recombinação gênica de um lócus gênico duplicado. Veja, por exemplo, Kusaba, et al. , (2003) Plant Cell 15:1455-1467.

A invenção engloba métodos adicionais para redução ou eliminação da atividade de um ou mais polipeptídeos ERECTA. Exemplos de outros métodos para alterar ou mutar uma seqüência nucleotídica genômica são bem conhecidos na arte e incluem, porém não se limitam a, o uso de vetores de RNA:DNA, vetores mutacionais de RNA:DNA, vetores de reparo de RNA:DNA, oligonucleotídeos de duplex misto, oligonucleotídeos auto-complementares de RNA:DNA, e oligonucleobases recombinogênicas. Tais vetores e métodos de uso são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Patentes Norte Americanas Números 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; e 5.871.984; cada uma incorporada nesse documento por referência. Veja também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham, et al. , (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8774-8778; cada uma incorporada nesse documento por referência.

iii. Modulação da atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãos

Em métodos específicos, os níveis e/ou atividade do crescimento tecido específico em uma planta são aumentados através do aumento dos níveis ou atividade do polipeptídeo ERECTA na planta. Métodos para aumentar os níveis e/ou atividade dos polipeptídeos ERECTA em uma planta são discutidos em outra seção desse documento. De maneira breve, tais métodos consistem em prover um polipeptídeo ERECTA da invenção e conseqüentemente aumentando os níveis e/ou atividade do polipeptídeo ERECTA. Em outras concretizações, uma seqüência nucleotídica codificando um polipeptídeo ERECTA pode ser provida através da introdução na planta de um polinucleotídeo contendo uma seqüência ERECTA da invenção, expressando a seqüência ERECTA, aumentando a atividade do polipeptídeo ERECTA, e conseqüentemente aumentando o número de células de tecido na planta ou parte da planta. Em outras concretizações, a construção de nucleotídeo ERECTA introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

Em outros métodos, o número de células e biomassa de um tecido vegetal é aumentado pelo aumento dos níveis e/ou atividade do polipeptídeo ERECTA na planta. Tais métodos são revelados em detalhe em outra seção desse documento. Em um desses métodos, uma seqüência nucleotidica ERECTA é introduzida na planta e a expressão da dita seqüência nucleotidica ERECTA diminui a atividade do polipeptídeo ERECTA, e conseqüentemente aumenta o crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãos na planta ou parte da planta. Em outras concretizações, a construção nucleotidicas ERECTA na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

Como discutido acima, alguém com habilidade irá reconhecer o promotor apropriado para uso na modulação dos níveis/atividade de um polinucleotídeo e polipeptídeo de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãos na planta. Promotores exemplares para essa concretização foram revelados em outra seção desse documento.

De acordo, a presente invenção adicionalmente provê plantas apresentando um crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãos modificado quando comparado com o crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãos de um tecido vegetal controle. Em uma concretização, a planta da invenção apresenta níveis/atividade aumentados do polipeptídeo ERECTA da invenção e logo apresenta um crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãos aumentado no tecido vegetal. Em outras concretizações, a planta da invenção apresenta níveis diminuídos ou eliminados do polipeptídeo ERECTA da invenção e logo apresenta um crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgãos diminuído no tecido vegetal. Em outras concretizações, tais plantas incorporaram estavelmente no seu genoma uma molécula de ácido nucléico contendo uma seqüência nucleotídica ERECTA da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão na célula vegetal.

iv. Modulação do Desenvolvimento Radicular

Métodos para modulação do desenvolvimento radicular em uma planta são providos. Por "modulação do desenvolvimento radicular" entende-se qualquer alteração no desenvolvimento da raiz da planta quando comparada a uma planta controle. Tais alterações no desenvolvimento radicular incluem, porém não se limitam a, alterações na taxa de crescimento da raiz primária, peso fresco da raiz, extensão da formação de raízes laterais e adventícias, o sistema vascular, desenvolvimento do meristema, ou expansão radial.

Métodos para modular o desenvolvimento radicular em uma planta são providos. Os métodos consistem na modulação dos níveis e/ou atividade do polipeptídeo ERECTA na planta. Em um método, uma seqüência ERECTA da invenção é provida à planta. Em outro método, a seqüência nucleotídica ERECTA é provida pela introdução na planta de um polinucleotídeo contendo uma seqüência nucleotídica ERECTA da invenção, expressando a seqüência ERECTA, e conseqüentemente modificando o desenvolvimento radicular. Em ainda outros métodos, a construção nucleotídica ERECTA é introduzida estavelmente no genoma da planta.

Em outros métodos, o desenvolvimento radicular é modulado pela alteração dos níveis ou atividade do polipeptídeo ERECTA na planta. Um aumento de atividade ERECTA pode resultar em pelo menos uma ou mais das seguintes alterações no desenvolvimento radicular, incluindo, porém não limitado a, meristemas radiculares maiores, aumento no crescimento radicular, expansão radial aumentada, sistema vascular melhorado, aumento da ramificação radicular, mais raízes adventícias, e/ou aumento do peso fresco da raiz quando comparados a uma planta controle.

Como usado nesse documento, "crescimento radicular" engloba todos os aspectos de crescimento das diferentes partes que compõe o sistema radicular em diferentes estágios do seu desenvolvimento em tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. É para ser entendido que crescimento radicular aumentado pode resultar do crescimento aumentado de uma ou mais de suas partes incluindo a raiz primária, raízes laterais, raízes adventícia, etc.

Métodos para medir tais alterações de desenvolvimento no sistema radicular são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Pedido de Patente Norte Americano Número 20030074698 e Werner, et al., (2001) PNAS 18:10487-10492, ambos incorporados nesse documento por referência.

Como discutido acima, alguém com habilidade irá reconhecer o promotor apropriado para uso na modulação do desenvolvimento radicular na planta. Promotores exemplares para essa incorporação incluem promotores constitutivos e promotores com expressão preferencial em raízes. Promotores exemplares com expressão preferencial em raízes são revelados em outra seção desse documento.

O estímulo do crescimento radicular e aumento da massa radicular através do aumento da atividade e/ou níveis do polipeptídeo ERECTA também encontra uso na melhora da sustentação de uma planta. 0 termo "resistência à fixação" ou "sustentação" se refere à habilidade de uma planta de se fixar ao solo. Para plantas com um hábito ereto ou semi- ereto, esse termo também se refere à habilidade de manter uma posição em pé sob condições ambientais adversas. Esse traço se refere ao tamanho, profundidade e morfologia do sistema radicular. Em adição, estímulo de crescimento radicular e aumento de massa radicular através do aumento dos níveis e/ou atividade do polipeptídeo ERECTA também encontra uso na promoção da propagação in vitro de explantes.

Além disso, maior produção de biomassa radicular devido a níveis e/ou atividade aumentados da atividade de ERECTA possui um efeito direto na produtividade e um efeito indireto na produção de compostos produzidos por células radiculares ou células radiculares transgênicas ou culturas de células das ditas células radiculares transgênicas. Um exemplo de um composto interessante produzido em culturas radiculares é a shiconina, a produtividade da qual pode ser vantajosamente aumentada pelos ditos métodos.

De acordo, a presente invenção adicionalmente provê plantas apresentando desenvolvimento radicular modulado quando comparado ao desenvolvimento radicular de uma planta controle. Em algumas concretizações, a planta da invenção apresenta níveis/atividade aumentados do polipeptídeo ERECTA da invenção e apresenta crescimento radicular e/ou biomassa radicular aumentados. Em outras concretizações, tais plantas apresentam estavelmente integradas em seu genoma uma molécula de ácido nucléico contendo uma seqüência nucleotídica ERECTA da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige expressão na célula vegetal.

v. Modulação do Desenvolvimento de Broto e Folha

Métodos também são providos para modulação do desenvolvimento de broto e folha em uma planta. Por "modulação do desenvolvimento de broto e folha" entende-se qualquer alteração no desenvolvimento do broto e/ou folha da planta. Tais alterações no broto e/ou folha incluem, porém não se limitam a, alterações no meristema apical do caule, em número de folhas, tamanho de folha, vasculatura da folha e caule, comprimento de entrenó, e senescência de folha. Como usado nesse documento, "desenvolvimento de folha" e "desenvolvimento de broto" engloba todos os aspectos de crescimento das diferentes partes que constituem o sistema foliar e o sistema de broto, respectivamente, em diferentes estágios do seu desenvolvimento, tanto em plantas monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas. Métodos para medir tais alterações do desenvolvimento no sistema de broto e foliar são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Werner, et al., (2001) PNAS 98:10487-10492 e Pedido de patente Norte Americano Número 20030074698, cada um incorporado nesse documento por referência. O método para modulação de desenvolvimento de broto e/ou folha em uma planta consiste em modular a atividade e/ou níveis de um polipeptídeo ERECTA da invenção. Em uma concretização, uma seqüência ERECTA da invenção é provida.

Em outras concretizações, a seqüência nucleotídica ERECTA pode ser provida pela introdução na planta de um polinucleotídeo contendo uma seqüência nucleotídica ERECTA da invenção, expressando a seqüência ERECTA, e conseqüentemente modificando o desenvolvimento de broto e/ou folha. Em outras concretizações, a construção nucleotídica ERECTA introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

Em concretizações específicas, o desenvolvimento de broto e/ou folha é modulado pela diminuição dos níveis e/ou atividade do polipeptídeo ERECTA na planta. Uma diminuição da atividade ERECTA pode resultar em pelo menos uma ou mais das seguintes alterações no desenvolvimento de broto e/ou folha, incluindo, porém não limitado a, redução do número de folhas, redução da superfície foliar, redução da vasculatura, entrenós mais curtos e crescimento reduzido, e senescência de folhas retardada quando comparados a uma planta controle.

Como discutido acima, alguém com habilidade irá reconhecer o promotor apropriado para uso na modulação do desenvolvimento de broto e folha na planta. Promotores exemplares para essa concretização incluem promotores constitutivos, promotores com expressão preferencial em brotos, promotores com expressão preferencial em meristema do caule, e promotores com expressão preferencial em folhas. Promotores exemplares são revelados em outra seção desse documento.

A diminuição da atividade e/ou níveis ERECTA em uma

planta resulta em entrenós mais curtos e crescimento retardado. Logo, os métodos da invenção encontram uso na produção de plantas anãs. Em adição, como discutido acima, a modulação da atividade ERECTA na planta modula tanto crescimento radicular quanto de broto. Logo, a presente invenção adicionalmente provê métodos para alterar a razão raiz/broto. Desenvolvimento de broto ou folha pode adicionalmente ser modulado através da diminuição dos níveis e/ou atividade do polipeptídeo ERECTA na planta.

De acordo, a presente invenção adicionalmente provê plantas apresentando desenvolvimento de broto e/ou folha modulado quando comparado a uma planta controle. Em algumas concretizações, a planta da invenção apresenta níveis/atividade aumentados do polipeptídeo ERECTA da invenção, alterando o desenvolvimento de broto e/ou folha. Tais alterações incluem, porém não se limitam a, aumento do numero de folha, aumento da superfície da folha, aumento da vasculatura, longos entrenós e aumento da estatura da planta, assim como alterações em senescência de folhas, quando comparadas a uma planta controle. Em outras concretizações, a planta da invenção apresenta níveis/atividade do polipeptídeo ERECTA da invenção diminuídos. vi Modulação do Desenvolvimento do Tecido Reprodutivo

Métodos para modulação do desenvolvimento do tecido reprodutivo são providos. Em uma concretização, métodos são providos para modular o desenvolvimento floral em uma planta. Por "modulação do desenvolvimento floral" entende-se qualquer alteração em uma estrutura do tecido reprodutivo de uma planta comparada a uma planta controle na qual a atividade ou níveis do polipeptídeo ERECTA não foi modulada. "Modulação do desenvolvimento floral" adicionalmente inclui qualquer alteração no tempo do desenvolvimento do tecido reprodutivo de uma planta (ex., atraso ou adiantamento do desenvolvimento floral) quando comparado a uma planta controle na qual a atividade ou níveis do polipeptídeo ERECTA não foi modulado. Alterações macroscópicas podem incluir mudanças em tamanho, formato, número, ou localização de órgãos reprodutivos, o período de tempo do desenvolvimento no qual essas estruturas se formam, ou a habilidade de manter ou proceder pelo processo floral em tempos de estresse ambiental. Alterações microscópicas podem incluir mudanças nos tipos ou formatos de células que constituem os órgãos reprodutivos.

O método para modulação de desenvolvimento floral em uma planta consiste em modular a atividade ERECTA em uma planta. Em uma concretização, uma seqüência ERECTA da invenção é provida. Uma seqüência nucleotídica ERECTA pode ser provida pela introdução na planta de um polinucleotídeo contendo uma seqüência nucleotídica ERECTA da invenção, expressando a seqüência ERECTA, e conseqüentemente modificando o desenvolvimento floral. Em outras concretizações, a construção nucleotídica ERECTA introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

Em métodos específicos, o desenvolvimento floral é modulado pela diminuição dos níveis ou atividade do polipeptídeo ERECTA na planta. Uma diminuição da atividade ERECTA pode resultar em pelo menos uma ou mais das seguintes alterações no desenvolvimento floral, incluindo, porém não limitado a, retardo do florescimento, redução do número de flores, esterilidade masculina parcial, e redução da produção de sementes quando comparados a uma planta controle. Indução de florescimento atrasado ou inibição da floração podem ser usados para aumentar a produtividade de hortaliças tal como alfafa. Métodos para medir tais alterações de desenvolvimento floral são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Mouradov, et al. , (2002) The Plant Cell S111-S13 0, incorporados nesse documento por referência.

Como discutido acima, alguém com habilidade irá reconhecer o promotor apropriado para uso na modulação do desenvolvimento floral da planta. Promotores exemplares para essa concretização incluem promotores constitutivos, promotores induzíveis, promotores com expressão preferencial em brotos, e promotores com expressão preferencial em inflorescência.

Em outros métodos, o desenvolvimento floral é modulado pelo aumento dos níveis e/ou atividade da seqüência ERECTA da invenção. Tais métodos podem consistir na introdução de uma seqüência nucleotídica ERECTA na planta e no aumento da atividade do polinucleotídeo ERECTA. Em outros métodos, a construção nucleotídica ERECTA introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta. 0 aumento da expressão da seqüência ERECTA da invenção pode modular o desenvolvimento floral durante períodos de estresse. Tais métodos são descritos em outra seção desse documento. De acordo, a presente invenção adicionalmente provê plantas apresentando desenvolvimento floral modulado quando comparado com o desenvolvimento floral de uma planta controle. Composições incluem plantas apresentando níveis/atividade aumentados do polipeptídeo ERECTA da invenção e apresentando um desenvolvimento floral alterado. Composições também incluem plantas apresentando níveis/atividade aumentados do polipeptídeo ERECTA da invenção onde a planta mantém ou prossegue pelo processo de floração em tempos de estresse.

Métodos também são providos para o uso de seqüências ERECTA da invenção para aumentar tamanho e/ou peso de semente. 0 método consiste no aumento da atividade de seqüências ERECTA em uma planta ou parte de planta, tal como semente. Um aumento no tamanho e/ou peso da semente consiste em um tamanho ou peso de semente aumentado e/ou no aumento em tamanho ou peso de uma ou mais partes da semente incluindo, por exemplo, o embrião, endosperma, casca da semente, aleurona, ou cotilédone.

Como discutido acima, alguém com habilidade irá reconhecer o promotor apropriado para uso na aumento do tamanho e/ou peso da semente. Promotores exemplares para essa incorporação incluem promotores constitutivos, promotores induziveis, promotores com expressão preferencial em sementes, promotores com expressão preferencial em embriões, e promotores com expressão preferencial em endosperma.

O método para diminuição do tamanho e/ou peso da semente em uma planta consiste na diminuição da atividade ERECTA na planta. Em uma concretização, a seqüência nucleotidica ERECTA pode ser provida pela introdução na planta de um polinucleotídeo contendo uma seqüência nucleotidica ERECTA da invenção, expressando a seqüência ERECTA, e conseqüentemente diminuindo o peso e/ou tamanho da semente. Em outras concretizações, a construção nucleotidica ERECTA introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

É adicionalmente reconhecido que o aumento do tamanho e/ou peso da semente também pode ser acompanhado de um aumento na velocidade de crescimento das plântulas ou um aumento no vigor juvenil. Como usado nesse documento, o termo "vigor juvenil" se refere à habilidade de uma planta de crescer rapidamente durante o desenvolvimento juvenil, e se refere ao estabelecimento bem sucedido, após germinação, de um sistema radicular bem desenvolvido e de um aparato fotossintético bem desenvolvido. Em adição, um aumento em tamanho e/ou peso de semente pode também resultar em um aumento na produtividade da planta quando comparado a um controle. De acordo, a presente invenção adicionalmente prove plantas apresentando um peso e/ou tamanho de semente aumentados quando comparado a uma planta controle. Em outras concretizações, plantas apresentando um vigor e produtividade aumentados também são providas. Em algumas concretizações, a planta da invenção apresenta níveis/atividade aumentados do polipeptídeo ERECTA da invenção e apresenta peso e/ou tamanho de semente aumentados. Em outras concretizações, tais plantas apresentam estavelmente integradas em seu genoma uma molécula de ácido nucléico contendo uma seqüência nucIeotIdica ERECTA da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige expressão na célula vegetal.

vil. Método de Uso para promotores polinucleotídicos

ERECTA

Os polinucleotídeos contendo os promotores ERECTA revelados na presente invenção, assim como variantes e fragmentos destes, são úteis na manipulação genética de qualquer célula hospedeira, preferencialmente célula vegetal, quando montados com uma construção de DNA de modo que a seqüência promotora está operacionalmente ligada a uma seqüência nucleotídica contendo um polinucleotídeo de interesse. Desse modo, os polinucleotídeos do promotor ERECTA da invenção são providos em cassetes de expressão juntamente com uma seqüência polinucleotídica de interesse para expressão na célula hospedeira de interesse. Como discutido no Exemplo 2 abaixo, as seqüências do promotor ERECTA da invenção são expressos em uma variedade de tecidos e, logo, as seqüências promotoras podem encontrar uso na regulação temporal e/ou espacial da expressão de polinucleotídeos de interesse.

Regiões promotoras híbridas sintéticas são conhecidas na arte. Tais regiões contêm elementos promotores de um polinucleotídeo operacionalmente ligado ao elemento promotor de outro polinucleotídeo. Em uma incorporação da invenção, a expressão de seqüência heteróloga é controlada por um promotor híbrido sintético contendo seqüências promotoras ERECTA da invenção, ou uma variante ou fragmento destas, operacionalmente ligado a elemento(s) promotor(es) de um promotor heterólogo. Elementos promotores que são envolvidos no sistema de defesa de plantas foram identificados e podem ser usados para gerar um promotor sintético. Veja, por exemplo, Rushton, et al., (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1:311-315. Alternativamente, uma seqüência promotora sintética ERECTA pode conter duplicações de elementos promotores encontrados nas seqüências promotoras ERECTA.

É reconhecido que a seqüência promotora da invenção pode ser usada com suas seqüências codificantes ERECTA nativas. Uma construção de DNA contendo um promotor ERECTA operacionalmente ligado com seus gene ERECTA nativo pode ser usado para transformar qualquer planta de interesse para obter uma mudança fenotípica desejada, tais como modular o número de células, modular o desenvolvimento radicular, de broto, de folha, floral, e embriônico, tolerância ao estresse, e qualquer outro fenótipo descrito em outra seção desse documento. As seqüências nucleotídicas promotoras e métodos revelados nesse documento são úteis na regulação da expressão de qualquer seqüência nucleotídica heteróloga em uma planta hospedeira com o intuito de variar o fenótipo de uma planta. Várias mudanças em fenótipo são de interesse incluindo a modificação da composição de ácidos graxos em uma planta, alterando o conteúdo de aminoácidos de uma planta, alterando o mecanismo de defesa contra patógeno de uma planta, e similares. Esses resultados podem ser alcançados através da provisão da expressão de produtos heterólogos ou aumento da expressão de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem ser alcançados através da provisão de uma expressão reduzida de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou cofatores na planta. Essas mudanças resultam em uma mudança no fenótipo da planta transformada.

Genes de interesse são o reflexo dos mercados comerciais e interesses daqueles envolvidos no desenvolvimento da planta de cultivo. Plantas de cultivo e mercados de interesse mudam, e com a abertura de mercados mundiais por países em desenvolvimento, novas plantas de cultivo e tecnologias irão também emergir. Em adição, com o aumento do nosso entendimento sobre traços agrícolas e características tais como produtividade e heterose, a escolha de genes para transformação irá mudar de acordo. Categorias gerais de genes de interesse incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informação, tal como os dedos-de-zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tal como as quinases, e aqueles envolvidos em manutenção, tal como as proteínas de choque térmico "heat shock". Categorias mais específicas de transgenes, por exemplo, incluem genes codificando importantes traços agrícolas, de resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicida, esterilidade, característica de grãos, e produtos comerciais. Genes de interesse incluem, geralmente, aqueles envolvidos em óleo, amido, carboidrato, ou metabolismo de nutriente assim como aqueles afetando tamanho do grão, deposição de açúcar, e similares.

Em certas concretizações, as seqüências de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser usadas em combinação com outras seqüências polinucleotídicas de interesse com o intuito de criar plantas com um fenótipo 15 desejado. As combinações geradas podem incluir múltiplas cópias de qualquer um ou mais dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser combinados com qualquer genes ou combinações de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de 20 traços desejados, incluindo, porém não limitado a, traços desejáveis para alimentação animal tal como genes para alto teor de óleos (ex., Patente Norte-Americana Número 6.232.529); aminoácidos balanceados (ex., hordotioninas (Patentes Norte-Americanas Números 5.990.389; 5.885.801; 25 5.885.802; e 5.703.409); cevada com alto teor de lisina (Williamson, et al. , (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122); e proteínas com alto teor de metionina (Pedersen, et al. , (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359; e Musumura, et al., (1989) Plant 30 Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (ex. , proteínas de armazenamento modificadas (Pedido de Patente Norte-Americano Número de Série 10/053.410, depositado em7 de novembro de 2001); e tiredoxinas (Pedido de Patente Norte-Americano Número de Série 10/005.429, depositado em 3 de dezembro de 2001)), as revelações dos quais estão incorporados nesse documento por referência. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser combinados com traços desejáveis para resistência a insetos, doenças ou herbicida (ex., proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes Norte-Americanas Números 5.366.892;5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser, et al. , (1986) Gene 48:109); Iectinas (Van Damme, et al. , (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de detoxificação de fumonosina (Patente Norte-Americana Número 5.792.931); genes de avirulência e resistência a doenças (Jones, et al. , (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science262:1432; Mindrinos, et al. , (1994) Cell 78:1089); mutantes da acetolacto-sintase (ALS) que leva a resistência s herbicida tais como as mutações S4 e/ou Hra; inibidores da glutamina sintase tais como fosfonotricina ou basta (ex. , gene bar); e resistência a glifosato (gene EPSPS)); e traços desejáveis para processamento ou produtos processados tais como alto teor de óleo (ex. , Patente Norte-Americana Número 6.232.529); óleos modificados (ex. genes de desnaturase de ácidos graxos (Patente Norte-Americana Número5.952.544; WO 94/11516)); amido modificado (ex., ADPG pirofosforilases (AGPase), sintases de amido (SS), enzimas ramificadoras de amido (SBE) e enzimas desramificadora de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (ex., Patente Norte-Americana Número 5.602.321; beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase, e acetoacetil-CoA redutase (Schubert, et al. , (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) que facilitam a expressão de polihidroxialcanoatos (PHAs)), as revelações dos quais estão incorporados nesse documento por referência. Alguém poderia também combinar os polinucleotideos da presente invenção com polinucleotídeos afetando traços agrícolas tais como esterilidade masculina (ex. , veja, Patente Norte-Americana Número 5.583.210), vigor do talo, tempo de floração, ou traços de tecnologia de transformação tais como regulação do ciclo celular ou "gene targeting" (ex., WO 99/61619, WO 00/17364, e WO 99/25821); as revelações das quais estão incorporadas nesse documento por referência.

Em uma concretização, seqüências de interesse melhoram o crescimento vegetal e/ou a produtividade da planta de cultivo. Por exemplo, seqüências de interesse incluem genes de importância agrícola que resultam em sistemas melhorados de raízes primárias ou laterais. Tais genes incluem, porém não se limitam a, transportadores de nutrientes/água e indutores de crescimento. Exemplos de tais genes incluem, porém não se limitam a, H+-ATPase de membrana plasmática de milho (MHA2) (Frias, et al. , (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKTl, um componente do aparato de obtenção de potássio em Arabidopsis, (Spalding, et al. , (1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que ativam o ciclo de divisão celular nas células apicais da raiz (Cheng, et al. , (1995) Plant Physiol 108:881); genes da glutamina sintase de milho (Sukanya, et al., (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) e hemoglobina (Duff, et al. , (1997) J. Biol. Chem 27:16749- 16752, Arredondo-Peter, et al. , (1997) . Plant Physiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter, et al. , (1997) Plant Physiol 114:493-500 e referências citadas nestes). A seqüência de interesse também pode ser útil na expressão de seqüências nucleotidicas anti-sense dos genes que afeta negativamente o desenvolvimento radicular.

Traços adicionais, importantes agricolamente tais como conteúdo de óleo, amido, e proteína podem ser geneticamente modificados em adição do uso de métodos de cultivo tradicionais. Modificações incluem aumento do conteúdo de ácido oléico, óleos saturados e insaturados, aumento dos níveis de lisina e enxofre, provendo aminoácidos essenciais, e também modificação do amido. Modificações de proteínas hordotionina são descritas nas Patentes Norte-Americanas Números 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 e 5.990.389, incorporados nesse documento por referência. Outro exemplo é a proteína de semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina de soja 2S descrita na Patente Norte Americana Número 5.850.016 e o inibidor da quimotripsina de cevada, descrita em Williamson, et al. , (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, as revelações das quais estão incorporadas nesse documento por referência.

Derivativos de seqüências codificantes podem ser obtidos através de mutagênese sítio-dirigida para aumentar os níveis de aminoácidos pré-selecionados no polipeptídeo codificado. Por exemplo, o gene codificando o polipeptídeo de alto teor de lisina em cevada (BHL) é derivado do inibidor de quimotripsina de cevada, Pedido de Patente Norte-Americano Número de Série 08/740.682, depositada em 1° de novembro de 1996, e WO 98/20133, as revelações dos quais estão incorporados nesse documento por referência. Outras proteínas incluem proteínas de plantas ricas em metionina tais como as de semente de girassol (Lilley, et al. , (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502; incorporado nesse documento por referência); milho (Pedersen, et al. , (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359; ambos incorporados nesse documento por referência); e arroz (Musumura, et al. , (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporado aqui por referência). Outros genes agrícolas importantes codificam látex, Floury 2, fatores de crescimento, fatores de armazenamento em sementes, e fatores transcricionais.

Genes de resistência a insetos podem codificar resistência a pestes que causam grandes perdas de produtividade tais como vaquinha, lagarta-rosca, broca européia do milho, e similares. Tais genes incluem, por exemplo, os genes das proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes Norte-Americanas Números 5.3 66.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser, et al., (1986) Gene 48:109); e similares.

Genes codificando traços de resistência a doenças incluem genes de detoxificação, tal como o contra a fumonosina (Patente Norte - Americana 5.792.931); genes de avirulência (avr) e resistência a doenças (R) (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al. , (1993) Science262:1432; e Mindrinos, et al. , (1994) Cell 78:1089); e similares.

Traços de resistência a herbicidas podem incluir genes codificando resistência a herbicidas que agem na inibição da ação da acetolacto-sintase (ALS), em particular os herbicidas do tipo sulfoniluréia (ex., gene da acetolacto- sintase (ALS) contendo mutações levando a tal resistência, em particular as mutações S4 e/ou Hra), genes codificando resistência a herbicidas que agem na inibição da ação da glutamina sintase, tais como fosfonotricina ou basta (ex. , gene bar), ou tais outros genes conhecidos na arte. 0 gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptll codifica resistência ao antibiótico canamicina e geneticina, e os mutantes do gene ALS codificam resistência ao herbicida clorsulfuron.

Genes de esterilidade podem também serem codificados em

um cassete de expressão e provêm uma alternativa à emasculação física. Exemplos de genes usados para tal propósito incluem genes preferenciais de tecido masculino e genes com fenótipos de esterilidade masculina, tal como QM, descrito na Patente Norte-Americana Número 5.583.210. Outros genes incluem quinases e aqueles codificando compostos tóxicos ao desenvolvimento do gametófito masculino ou feminino. A qualidade do grão é reflexo de traços tais como níveis e tipos de óleos, saturados e insaturados, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais, e níveis de celulose. Em milho, proteínas hordotionina modificadas são descritas nas Patentes Norte-Americanas Números 5.703.049,5.885.801, 5.885.802 e 5.990.389.

Traços comerciais também podem ser codificados por um gene ou genes que levam ao aumento de, por exemplo, amido para produção de etanol, ou prove expressão de proteínas. Outro uso comercial importante de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos tais como descritos na Patente Norte-Americana Número 5.602.321. Genes tais como β-cetotiolase, PHBase (polihidroxiburirato sintase), e acetoacetil-CoA redutase (veja, Schubert, et al. , (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão de polihidroxialcanoatos (PHAs).

Produtos exógenos incluem enzimas e produtos de plantas assim como aqueles de outras fontes incluindo procariotos e outros eucariotos. Tais produtos incluem enzimas, cofatores, hormônios, e similares. Os níveis de proteínas, particularmente proteínas modificadas apresentando distribuição de aminoácidos melhorada para melhorar o valor nutricional da planta, podem ser aumentados. Isso é alcançado pela expressão de tais proteínas apresentando conteúdo de aminoácidos melhorado.

Essa invenção pode ser melhor entendida através da referência dos seguintes exemplos não limitantes. Será apreciado por aqueles com habilidade na arte que outras cpncretizações da invenção podem ser praticadas sem afastar-se do espírito e escopo da invenção como revelado e reivindicado nesse documento.

EXEMPLOS

Exemplo 1 Isolamento de seqüências ERECTA

Uma rotina para identificar todos os membros de uma família gênica foi empregada para buscar genes ERECTA de interesse. Um conjunto diverso de todos os membros conhecidos da família gênica na forma de seqüências protéicas foi preparado. Esse dado inclui seqüências de outras espécies. Essas espécies foram confrontadas contra um conjunto de dados patenteado de seqüências de milho e um conjunto não redundante de seqüências homólogas ("overlapping hits") é identificadas. Separadamente, uma outra busca usando seqüências nucleotídicas de quaisquer genes de interesse é feita contra o banco de dados e um conjunto não redundante de todas as seqüências homólogas é obtido. O conjunto de proteínas homólogas é então comparado com os nucleotídeos homólogos. Se a família gênica está completa, todas as proteínas homólogas estarão contidas no conjunto de nucleotídeos homólogos. A família gênica ERECTA consiste de 2 genes em Arabidopsis, 2 genes em arroz, 3 genes em sorgo e 4 genes em soja. Uma representação de dendograma da inter-relação das proteínas codificadas por esses genes é provido na Figura 4. Exemplo 2 Análise de Seqüências ERECTA

Os polipeptídeos ZmERECTA da presente invenção possuem características comuns com genes ERECTA de uma variedade de espécies de planta. A relação entre genes, regiões conservadas e seqüência consenso de múltiplas espécies de plantas é apresentada em um alinhamento, veja Figura 2.

Exemplo 3 Transformação e Regeneração de Plantas Transgênicas

Embriões imaturos de milho de plantas doadoras da casa-de-vegetação são bombardeadas com um plasmídeo contendo a seqüência ZmERECTA operacionalmente ligada ao promotor induzível por seca RABl7 (Vilardell, et al. , (1990) Plant Mol Biol 14:423-432) e ao gene de marcador de seleção PAT, que confere resistência ao herbicida Bialafos. Alternativamente, o gene do marcador de seleção é provido em um plasmídeo separado. Transformação é desempenhada como descrito a seguir. Receitas de meios seguem abaixo.

Preparação do Tecido Alvo:

As espigas são debulhadas e a superfície dos grãos é esterilizadas em alvejante Clorox 30% com 0,5% de Micro detergente por 2 0 minutos, e lavado duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são excisados e posicionados com o lado do eixo do embrião para baixo (lado do escutelo para cima) , 25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e então alinhados dentro da zona alvo de 2,5 cm em preparação para o bombardeamento. Preparação do DNA:

Um vetor plasmidial contendo a seqüência ERECTA operacionalmente ligada a um promotor ubiquitina é preparado. Esse DNA plasmidial contendo um marcador de seleção PAT é precipitado em esferas de tungstênio de 1,1 um (diâmetro médio) usando procedimento de precipitação com CaCl2 como se segue:100 μΐ de partículas preparadas de tungstênio em água10 μΐ (1 ug) de DNA em tampão Tris EDTA (1 ug de DNA total)

.100 μΐ de CaCl2 2,5 M .10 μΐ de espermidina 0,1 M

Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensão de partículas de tungstênio, enquanto mantidas em um vórtex de multitubos. A mistura final é sonicada brevemente e permitida a incubação sob constante agitação por vórtex por10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido é removido, os precipitados são lavados com 500 ml de etanol 100%, e centrifugado por 30 segundos. Novamente o líquido é removido, e 105 μΐ de etanol 100% é adicionado ao precipitado final de partículas de tungstênio. Para bombardeamento com pistola de partícula, as partículas de tungstênio/DNA são brevemente sonicadas e 10 μΐ são aplicados no centro de cada macrocarreador e deixados secar por aproximadamente 2 minutos antes do bombardeamento. Tratamento da Pistola de Partícula:

As placas de amostra são bombardeadas em nível #4 com pistola de partícula #HE34-1 ou #HE34-2. Todas as amostras recebem um único disparo a 650 PSI, com um total de dez alíquotas tiradas de cada tudo de partículas/DNA preparadas.

Tratamento Subseqüente:

Seguindo o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 56OY por 2 dias, então transferidos para meio seletivo 560R contendo 3 mg/litro de Bialafos, e subcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, clones de calos resistentes à seleção são transferidos para meio 288J para iniciar a regeneração vegetal. Seguindo a maturação do embrião somático (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para meio para germinação e transferidos para a sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7-10 dias depois, plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio 272V livre de hormônio em tubos por 7-10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. Plantas são então transferidas para insertos em bandejas (equivalentes da potes de 2,5 polegadas) contendo solo de plantio e são crescidas por 1 semana em câmara de crescimento, subseqüentemente crescida por 1-2 semanas adicionais em casa-de-vegetação, então transferidas para potes de 1,6 galões e crescidas até maturidade. Plantas são monitoradas e classificadas para tolerância à seca aumentada. Ensaios para medir tolerância à seca melhorada são rotina na arte e incluem, por exemplo, aumento da produtividade de grãos sob condições de seca quando comparada com plantas controle de milho sob condições ambientais idênticas. Alternativamente, as plantas transformadas podem ser monitoradas para a modulação do desenvolvimento do meristema (ex., um decréscimo na formação de espiculas na espiga). Veja, por exemplo, Bruce, et al. , (2002) Journal of Experimental Botany 53:1-13.

Bombardeamento e Meio de Cultura:

Meio de bombardeamento (560Y) consiste de 4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura de 10 vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 120,0 g/l sacarose, 1,0 mg/l de 2,4-D, e 2,88 g/l de L-prolina (volume completado com H2O D-I seguindo ajuste para pH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/l de Gelrite (adicionado após o volume ter sido completado com H2O D-I); e 8,5 mg/l de nitrato de prata (adicionado após esterilização do meio e resfriamento à temperatura ambiente). Meio de seleção (560R) consiste de 4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura de vitaminas de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l sacarose, e 2,0 mg/l de 2,4-D (volume completado com H2O D-I seguindo ajuste para pH 5,8 com KOH) ; 3,0 g/1 de Gelrite (adicionado após o volume ter sido completado com H2O D-I); e 0,85 mg/l de nitrato de prata e 3,0 mg/l de bialafos (ambos adicionados após esterilização do meio e resfriamento à temperatura ambiente).

Meio de regeneração vegetal (288J) consiste de 4,3 g/l de sais de MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l da solução estoque de vitaminas de MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCL, 0,10 g/l de piridoxina HCL, e 0,40 g/l de glicina volume completado com H2O D-I refinado) (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarose, e 1,0 ml/l de ácido abscisico 0,1 mM (volume completado com H2O D-I refinado após ajuste para pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite (adicionado após o volume ter sido completados com H2O D-I) ; e 1,0 mg/l de ácido indolacético e 3,0 mg/l de bialafos (adicionado após esterilização do meio e resfriamento a 60°C) . Meio livre de hormônio (272V) consiste de 4,3 g/l de sais de MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l da solução estoque de vitaminas de MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCL, 0,10 g/l de piridoxina HCL, e 0,40 g/l de glicina volume completado com H2O D-I refinado), 0,1 g/l de mio-inositol, e 40,0 g/l de sacarose (volume completado com H2O D-I refinado após ajuste para pH 5,6); e 6 g/l bacto-ágar (adicionado após o volume ter sido completado com H2O D-I refinado), esterilizado e resfriado a 60°C.

Exemplo 4 Transformação mediada por Agrobacterium

Para transformação de milho mediada por Agrobacterium com uma seqüência anti-sense da seqüência ZmERECTA da presente invenção, preferencialmente, o método de Zhao é empregado (Patente Norte-Americana Número 5.981.840, e Publicação de Patente PCT número W098/32326; os conteúdos das quais são incorporados nesse documento por referência). Resumindo de maneira breve, embriões imaturos são isolados de milho e embriões colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium, onde a bactéria é capaz de transferir a seqüência ERECTA a pelo menos uma célula de pelo menos um embrião imaturo (etapa 1: etapa de infecção). Nessa etapa os embriões imaturos são preferencialmente imergidos em uma suspensão de Agrobacterium para a iniciação da inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempo com a Agrobacterium (etapa 2: etapa de co-cultivo).

Preferencialmente os embriões imaturos são cultivados em meio sólido seguindo a etapa de infecção. Seguindo esse período de co-cultivo uma etapa opcional de "descanso" é contemplada. Na etapa de descanso, os embriões são incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido para inibir o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transformantes de planta (etapa 3: etapa de descanso). Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados em meio sólido. Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, porém sem um agente seletivo, para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de descanso para as células infectadas. A seguir, embriões inoculados são cultivados em meio contendo um agente seletivo e um calo crescente transformado é recuperado (etapa 4: etapa de seleção).

Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo de células transformadas. O calo é então regenerado em plantas (etapa 5: etapa de regeneração), e preferencialmente, calos crescidos em meio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerar as plantas. Plantas são monitoradas e classificadas para modulação do desenvolvimento do meristema. Por exemplo, alterações de tamanho e aparência dos meristemas do caule e floral e/ou aumento da produtividade de folhas, flores, e/ou frutos. Exemplo 5 Super Expressão de ZmERECTA afeta taxa de crescimento vegetal, desenvolvimento da inflorescência, tamanho de órgão, e tolerância à seca.

O gene ZmERECTA é expresso no meristema apical do caule e meristemas específicos de espiga onde divisão celular ativa (Figura 1) . A função do gene é associada com proliferação celular. Nós estamos testando a função do gene ZmERECTA através da sua super expressão sob um promotor constitutivo. Plantas transgênicas e plantas irmãs não transgênicas serão produzidas e comparadas para os efeitos do transgene. Plantas transgênicas expressando o transgene serão confirmadas por RT-PCR específico para o transgene. O gene ZmERECTA é esperado a impactar a taxa de crescimento vegetal. Comparado às irmãs negativas para o transgene, plantas transgênicas positivas são esperadas a apresentar taxa de crescimento aumentada, tamanho de planta e órgãos aumentados, e acúmulo de biomassa aumentado.

O gene ERECTA é mostrado para controlar desenvolvimento floral em Arabidopsis. O gene ZmERECTA é naturalmente expresso preferencialmente no meristema de espiga de milho, e, a níveis ligeiramente menores, no meristema apical do caule como mostrado na Figura 1. Plantas transgênicas super expressando o gene ZmERECTA são esperadas a apresentar impacto no desenvolvimento da inflorescência. Comparadas às irmãs não transgênicas, plantas transgênicas são esperadas a apresentar crescimento da espiga e dos grãos aumentado, e um aumento na produtividade final de grãos. O gene ERECTA regula a eficiência de transpiração em Arabidopsis e impacta a tolerância à seca. Essa função do gene ZmERECTA é testada em plantas transgênicas através de sua super expressão com um promotor constitutivo ou um induzível por estresse. Plantas transgênicas e suas irmãs não transgênicas serão submetidas ao tratamento de estresse de seca para testar sua tolerância através da medição do crescimento vegetal, acúmulo de biomassa, e produtividade sob ambientes estressados. Plantas transgênicas são esperadas a apresentar tolerância à seca aumentada por afetar a eficiência de transpiração e aumentar o crescimento vegetal e produtividade de grãos sob condições de crescimento na presença ou ausência de estresse.

Exemplo 6 Transformação do Embrião de Soja

Embriões de soja são bombardeados com um plasmídeo contendo uma seqüência ERECTA operacionalmente ligada a um promotor ubiquitina como a seguir. Para induzir embriões somáticos, cotilédones de 3-5 mm em comprimento, dissecados de sementes imaturas com a superfície esterilizada da cultivar de soja A2872, são cultivados na luz ou escuro a 260C em um meio com ágar apropriado por seis a dez semanas. Embriões somáticos produzindo embriões secundários são então excisados e colocados em um meio líquido apropriado. Após repetidas seleções por aglomerados de embriões somáticos de estágio globular inicial que multiplicaram, as suspensões são mantidas como descrita abaixo.

Culturas de suspensão embriogênica de soja podem ser mantidas em 3 5 ml de meio líquido em um agitador de rotação, 150 rpm, a 260C com lâmpadas fluorescentes em um fotoperíodo de 16:8 horas dia/noite. Culturas são subcultivadas a cada duas semanas através da inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 3 5 ml de meio líquido.

Culturas de suspensão embriogênica de soja podem então ser transformadas pelo método do bombardeamento com pistola de partículas (Klein, et al., (1987) Nature (Londres) 327:70-73; Patente Norte-Americana Número 4.945.050). Um instrumento da Du Pont, o Biolistic PDS1000/HE, pode ser usado para essas transformações.

Um gene marcador de seleção que pode ser usado para facilitar a transformação de soja é um transgene composto do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812), o gene higromicina fosfotransferase do plasmídeo pJR225 (de E. coli; Gritz, et al., (1983) Gene 25:179-188), e a região 3' do gene da nopalina sintase do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. 0 cassete de expressão contendo uma seqüência sense ERECTA operacionalmente ligado ao promotor ubiquitina pode ser isolado como um fragmento de restrição. Esse fragmento pode então ser inserido em um sítio único de restrição do vetor carregando o gene marcador.

Para 5 0 μl de 60mg/ml de uma suspensão de partículas de ouro 1 μl é adicionado (em ordem) : 5 μl de DNA (1 ug/μl) , 20 μl de espermidina (0,1 Μ) , e 50 μl de CaCl2 (2,5 Μ) . A preparação de partículas é então agitada por três minutos, centrifugada em micro-centrífuga por 10 segundos e o supernadante é removido. As partículas cobertas de DNA são então lavadas uma vez em 400 μΐ de etanol 70% e ressuspendidas em 40 μΐ de etanol anidro. A suspensão de DNA/partículas pode ser sonicada três vezes por um segundo cada. Cinco microlitros de partículas de ouro cobertas de DNA são então aplicadas em cada disco carreador macro.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura de suspensão de duas semanas é colocada em uma placa de petri de 60x15 mm vazia e o líquido residual é removido do tecido com um pipeta. Para cada experimento de transformação, aproximadamente 5-10 placas de tecido são normalmente bombardeadas. A pressão de ruptura da membrana é ajustada para 7,58MPa (1100 psi), e a câmara é evacuada até atingir um vácuo de 0,7112m (28 polegadas) de mercúrio. O tecido é colocado a aproximadamente 0,0889m (3,5 polegadas) da tela de retenção e é bombardeado três vezes. Seguindo bombardeamento, o tecido pode ser dividido na metade e colocado de volta ao líquido e cultivada como descrito acima.

Cinco a sete dias após bombardeamento, o meio líquido pode ser trocado por meio fresco, e onze a doze dia após bombardeamento, por meio fresco contendo 50 mg/ml de higromicina. Esse meio seletivo pode ser trocado semanalmente. Sete a oito semanas após bombardeamento, tecido verde, transformado pode ser observado crescendo de aglomerados embriogênicos não transformados e necróticos. Tecido verde isolado é removido e inoculado em frascos individuais para gerar novas, propagadas clonalmente, culturas de suspensão embriogênica transformadas. Cada nova linhagem pode ser tratada como um evento independente de transformação. Essas suspensões pode então ser subcultivadas e mantidas como aglomerados de embriões imaturos ou regenerados em plantas inteiras por maturação e germinação de embriões somáticos individuais.

Exemplo 7 Transformação de Tecido Meristemático de Girassol

Tecidos meristemáticos de girassol são transformados com um cassete de expressão contendo uma seqüência ERECTA operacionalmente ligada a um promotor ubiquitina como se segue (veja também, Patente Européia Número EP 0 486233, incorporada nesse documento por referência, e Malone-Schoneberg, et al. , (1994) Plant Science 103:199- 207) . Sementes madura de girassol (Helianthus annuus L.) são debulhadas usando uma debulhadora de trigo. Superfícies de sementes são esterilizadas por 3 0 minutos em uma solução 20% do alvejante Clorox® com a adição de duas gotas de Tween 20 para 50 ml de solução. As sementes são lavadas duas vezes com água destilada estéril.

Explantes de eixo embriônico quebrados são preparados através de uma modificação de procedimentos descritos por Schrammeijer, et al., (Schrammeijer, et al., (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Sementes são embebidas em água destilada por 60 minutos seguindo o procedimento de esterilização de superfície. Os cotilédones de cada semente são então quebrados, produzindo uma fratura no plano do eixo embriônico. Seguindo a excisão da ponta da raiz, os explantes são cortados em dois longitudinalmente entre os primórdios foliares. As duas metades são posicionadas, com a superfície cortada para cima, em meio GBA consistindo de elementos minerais de Murashige e Skoog (Murashige, et al. , (19 62) Physiol. Plant., 15:473-497), adições de vitaminas de Shepard (Shepard (1980) em Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota)), 40 mg/l de sulfato de adenina,30 g/l de sacarose, 0,5 mg/l de 6-benzil-aminopurina (BAP) ,0,25 mg/l de ácido indol-3-acético (IAA) , 0,1 mg/l de ácido giberélico (GA3), pH 5,6, e 8 g/l de Fitoágar.

Os explantes são submetidos a bombardeamento com micro-projéteis antes do tratamento com Agrobacterium (Bidney, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Trinta a quarenta explantes são posicionados em um círculo no centro de uma placa de 6 0 X 2 0 mm para esse tratamento. Aproximadamente 4,7 mg de micro-projéteis de tungstênio de1,8 mm são ressuspendidos em 25 ml de tampão TE estéril (10 mM de Tris HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0) e alíquotas de 1,5 ml são usadas por bombardeamento. Cada placa é bombardeada duas vezes através de uma tela de nytex de150 mm posicionada 2 cm acima das amostras em um equipamento de aceleração de partículas PDS 1000®.

Cepa EHA105 desarmada de Agrobacterium tumefaciens é

usada em todos os experimentos de transformação. Um vetor plasmidial binário contendo o cassete de expressão que contém o gene ERECTA operacionalmente ligado ao promotor ubiquitina é introduzido na cepa EHAl05 de Agrobacterium via método de congelamento-descongelamento (wfreeze-thawing") como descrito por Holsters, et al. , (1978) Mol. Gen. Genet.163:181-187. Esse plasmídeo adicionalmente contém um gene marcador de seleção por canamicina (ex., nptll). Bactérias para experimentos de transformação de plantas são crescidas durante a noite (28°C e agitação contínua a 100 RPM) em meio líquido YEP (10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de Bactopeptona, e 5 g/l de NaCl, pH 7,0) com os antibióticos apropriados requeridos para a manutenção da cepa bacteriana e do plasmídeo binário. A suspensão é usada quando uma D06oo de por volta de 0,4 a 0,8 é alcançada. As células de Agrobacterium são precipitadas e ressuspendidas a uma D06oo final de 0,5 em um meio de inoculação consistindo de MES12,5 mM pH 5,7, 1 g/l de NH4Cl, e 0,3 g/l de MgSO4.

Explantes recém-bombardeados são colocados em uma

suspensão de Agrobacterium, misturados, e deixados em descanso por 3 0 minutos. Os explantes são então transferidos para um meio GBA e co-cultivados, com a superfície cortada para cima, a 260C com dias de 18 horas de luz. Após três dias de co-cultivo, os explantes são transferidos para 374B (meio GBA sem reguladores de crescimento e um nível reduzido de sacarose de 1%) suplementado com 250 mg/l de cefotaxima e50 mg/l de sulfato de canamicina. Os explantes são cultivados por duas a cinco semanas em seleção e então transferidos para meio 374B fresco sem canamicina por uma ou duas semanas de desenvolvimento continuado. Explantes com áreas de crescimento em diferenciação, resistente a antibiótico que não produziu brotos apropriados para excisão são transferidos para meio GBA contendo 250 mg/l de cefotaxima por um segundo tratamento de fitohormônio de 3 dias. Amostras de folhas brotos verdes, resistentes a canamicina são testados para a presença de NPTII por ELISA e para a presença da expressão do transgene através do ensaio de modulação em desenvolvimento do meristema (ex. , uma alteração do tamanho e aparência dos meristemas do caule e floral).

Brotos positivos para NPTII são enxertados em cavalo de girassol híbrido 6440 da Pioneer® crescido in vitro. Sementes com a superfície esterilizada são germinadas em meio 48-0 (sais de Murashige e Skoog meia força, 0,5% de sacarose, 0.3% de gelrite, pH 5,6) e crescidas sob condições descritas para cultura de explante. A porção de cima da plântula é removida, um corte vertical de 1 cm do hipocótilo é feito, e o broto transformado é inserido no corte. A área inteira é envolvida com parafilme para segurar o broto. As plantas enxertadas podem ser transferidas para o solo após uma semana de cultura in vitro. Enxertos no solo são mantidos sob condições de alta umidade seguido de uma aclimatização lenta para o ambiente de casa-de-vegetação. Setores transformados de plantas To (geração parental)

maturando na casa-de-vegetação são identificados por ELISA para NPTII e/ou por análise da atividade de ERECTA dos extratos de folha enquanto sementes transgênicas coletadas de plantas T0 positivas para NPTII são identificadas através de análises de atividade ERECTA de pequenas porções de cotilédones de semente seca.

Um protocolo alternativo de transformação de girassol permite a recuperação de prole transgênica sem o uso de pressão de seleção química. Sementes são debulhadas e suas superfícies são esterilizadas por 20 minutos em uma solução2 0% do alvejante Clorox® com a adição de duas e três gotas de Tween 2 0 por 100 ml de solução, e então lavada três vezes com água destilada. Sementes esterilizadas são embebidas no escuro a 260C por 2 0 horas em papel de filtro umedecida com água. Os cotilédones e ponta radicular são removidos, e os explantes de meristema são cultivados em 374E (meio GBA consistindo de sais de MS, vitaminas Shepard, 40 mg/l de sulfato de adenina, 3% de sacarose, 0,5 mg/l de 6-BAP, 0,25 mg/l de IAA, 0,1 mg/l de GA, e 0.8% de Fitoágar em pH 5,6) por 2 4 horas no escuro. As folhas primárias são removidas para expor o meristema apical, por volta de 40 explantes são posicionados com o domo apical virado para cima em um círculo de 2 cm no centro do 3 74M (meio GBA com 1,2% de Fitoágar), e então cultivado no meio por 24 horas no escuro.

Aproximadamente 18,8 mg de partículas de tungstênio de1,8 um são ressuspendidas em 150 μΐ de etanol absoluto. Após sonicação, 8 μΐ dessa ressuspensão são aplicados no centro da superfície do macro-carreador. Cada placa é bombardeada duas vezes com discos de ruptura de 4,48MPa (650 psi) na primeira prateleira com pistola de hélio em vácuo 2 6 mm de Hg.

O plasmídeo de interesse é introduzido em cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens via método de congelamento- descongelamento como descrito previamente. O precipitado de bactéria crescida durante a noite a 280C em um meio líquido YEP (10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de Bactopeptona, e 5 g/l de NaCl, pH 7,0) na presença de 5 0 ug/l de canamicina é ressuspendida em um meio de inoculação (12,5 mM de 2-mM 2-(N-morfolino) ácido etanesulfônico, MES, 1 g/l de NH4Cl e 0,3 g/l de MgSO4 em pH 5,7) para alcançar uma concentração final de 4,0 em DO 600. Explantes bombardeados por partículas são transferidos para meio GBA (374E) , e uma gotícula de suspensão de bactéria é colocada diretamente no topo do meristema. Os explantes são co-cultivados no meio por 4 dias, e depois são transferidos para meio 374C (GBA com 1% de sacarose e sem BAP, IAA, GA3 e suplementado com 250 ug/ml de cefotaxima). As plântulas são cultivadas em meio por volta de duas semanas sob condições de incubação de dias de 16 horas de luz a 26°C.

Explantes (por volta de 2 cm de comprimento) por duas semanas de cultura em meio 374C são analisados para a modulação no desenvolvimento do meristema (ex., uma alteração de tamanho e aparência dos meristemas do caule e floral). Após explantes positivos (ex., uma mudança na expressão de ERECTA) são identificados, aqueles brotos que não exibirem uma alteração na atividade ERECTA são descartados, e cada explante positivo é subdividido em explantes nodais. Um explante nodal contém pelo menos um nó potencial. Os segmentos nodais são cultivados em meio GBA por três a quatro dias para promover a formação de botões auxiliares de cada nó. Depois, eles são transferidos para meio 374C e permitidos a se desenvolver por quatro semanas adicionais. Botões em desenvolvimento são separados e cultivados por quatro semanas adicionais em meio 374C. Amostras de folhas reunidas de cada novo broto recuperado são novamente analisados através de ensaio de atividade de proteína apropriado. Nessa hora, os brotos positivos recuperados de um único nó irá geralmente ser enriquecido no setor transgênico detectado no ensaio inicial antes da cultura nodal.

Brotos recuperados positivos para expressão alterada de ERECTA são enxertados em cavalo de girassol híbrido 6440 da Pioneer® crescido in vitro. Os cavalos são preparados da seguinte maneira. Sementes são debulhadas e suas superfícies são esterilizadas por 2 0 minutos em uma solução 2 0% do alvejante Clorox® com a adição de duas e três gotas de Tween 20 por 100 ml de solução, e então lavada três vezes com água destilada. Sementes com a superfície esterilizada são germinadas em papel de filtro umedecido com água por três dias, então elas são transferidas para meio 48-0 (sais de Murashige e Skoog meia força, 0,5% de sacarose, 0.3% de gelrite, pH 5,6) e crescidas a 260C no escuro por três dias, então incubada em condições de cultura de dias de 16 horas de luz. A porção de cima da plantula é removida, um corte vertical de 1 cm do hipocótilo é feito, e o broto transformado é inserido no corte em V. A área cortada é envolvida com parafilme. Após uma semana de cultura em meio, as plantas são transferidas para o solo. Nas primeiras duas semanas, elas são mantidas sob condições de alta umidade seguido para aclimatizar para o ambiente de casa-de- vegetação. Exemplo 8 Protocolo para Medição de Desempenho Vegetativo de Milho Sob Estresse de Seca

Genes conferindo tolerância à seca no milho transgênico pode ser identificado em técnicas relacionadas FAST-corn (veja, Patente Norte-Americana Número 10/367.417) em um modo de larga escala usando condições de crescimento, tratamento de estresse e métodos de diagnóstico identificados.

Tratamento e Materiais: Dois grupos de tratamento são usados, um bem irrigado

(controle), um estressado por seca.

Material vegetal consiste de plântulas transgênicas de milho em estágio Tl.

Detalhes do Tratamento:

0 estresse será imposto de 10 a 14 dias após semeadura ou 7 dias após transplante, e será mantido até estágio de crescimento do cabelo. Potes serão molhados por um sistema automatizado com ajuste de tempo para prover irrigação de 25 a 50% de capacidade de campo durante o período inteiro de tratamento de estresse de seca. Esse estresse deve permitir a identificação do impacto no crescimento vegetativo assim como no intervalo de antese-crescimento do cabelo.

Mistura de Plantio: Uma mistura de 1/3 Turface MVP (Profile Products LLC, IL, EUA) , 1/3 areia e 1/3 SB300 Universal (Sun Gro Horticulture, WA, EUA) é sugerida. 0 SB3 00 Universal pode ser substituído por Fafard Superfine Germinating Mix (Conrad Fafard, Inc., MA, EUA). Também, a proporção de areia na mistura pode ser reduzida. Logo, a mistura de plantio final pode ser 3/8 (37.5%) de turface,3/8 (37.5%) de Fafard e 1/4 (25%) de areia.

Determinação da Capacidade de Campo: Determinar o peso da mistura de solo (wl) a ser usado em um pote S200 (menos o peso do pote) . 0 solo pode ser seco a IOO0C para peso constante antes de determinar o wl (Eu não faço isso se todos os componentes da mistura de solo já estão secas). Molhe o solo no pote até saturação completa e permita que toda a água gravitacional seja escorrida. Determine o peso do solo (w2) depois de toda água gravitacional ter sido jorrada (menos o peso do pote). Capacidade de campo é o peso da água que permaneceu no solo obtido através da subtração w2-wl. Tecnicamente, ela é escrita como uma percentagem de peso de solo seco em forno. Para nossos propósitos, w2-wl é suficiente.

Tratamento de Estresse: Durante a parte inicial do crescimento vegetal (10 a 21 dias após semeadura), mantenha o controle bem irrigado com uma irrigação diária de 75% da capacidade de campo e o tratamento de estresse de seca com uma irrigação diária de 2 5% da capacidade de campo, ambos providos como dosagem diária às 10 da manhã. Com o crescimento das plantas, aumente a irrigação diária do controle bem irrigado para capacidade total de campo e o tratamento de estresse de seca para 50% da capacidade de campo. Esse aumento é baseado nas medições de peso em potes representativos para determinar a extensão da retirada de água pela planta ao longo de seu crescimento. Solução de Nutriente: Uso de uma solução modificada de Hoagland em diluição de 1/16 com água da bica para irrigação. Prepare 2OL de solução modificada de Hoagland com a seguinte receita:

<table>table see original document page 120</column></row><table>

Prepare IL de solução IOX de Micronutriente usando a seguinte receita:

<table>table see original document page 120</column></row><table>

Use fertilizante de categoria KN03.

Nota: é útil adicionar metade de uma colher de chá de Osmocote (NPK 15:9:12) ao pote na hora do transplante ou após a planta ter emergido (The Scotts Miracle-Gro Company, OH, EUA).

Plantas de Borda: É crítico ter um corredor de plantas de borda nas bancadas das pontas adjacentes às paredes de vidro da casa-de-vegetação ou causas adjacentes potenciais de variabilidade de micro-ambientes tais como um ventilador.

Automatização: Pode ser feita usando tubos de PVC com furos para suprir água a potes sistematicamente posicionados usando um equipamento contendo um sifão. O horário da irrigação pode ser programado usando sistema de programação de horário.

Análise Estatística: Dados serão incorporados em

Spotfire (Spotfire, Inc., MA, EUA) eventualmente para teste ANOVA dentro de cada leva de seca, usando um desenho de bloco fatorial aleatório (com médias de eventos ou construção e tratamento de estresse como fatores).

Réplicas: 8 a 10 plantas individuais por tratamento por evento.

Tamanho do pote: S2 00

Observações:

(1) Medições LemnaTec três vezes por semana ao longo do crescimento para capturar a taxa de crescimento vegetal. (LemnaTec GmbH, Wurselen, Alemanha)

(2) Determinações de coloração de folha três vezes por semana ao longo do período de estresse usando o Lemnatec.

(3) Fluorescência de clorofila registrada como PhiPSII duas vezes por semana, começando às 11 da manhã usando o instrumento Hansatech FMS2. Início das medições no dia 0 do tratamento de estresse até o fim do experimento e registre as medições na folha mais jovem e mais expandida. (Hansatech Instruments, Norfolk, Inglaterra).

(4) Registro das datas de crescimento de pendões (flor masculina) e do cabelo (flor feminina) em plantas individuais, e computação do Invertalo Antese e Crescimento do Cabelo (Anthesis Silking Interval - ASI) . Os dados de ASI computados são obtidos pela determinação de diferença entre os dias de grau de crescimento da dispersão do pólen e do crescimento do cabelo. 0 tempo de dispersão é o dia que a primeira dispersão é observada, onde a primeira dispersão é definida como se pelo menos uma antera tenha dispersado o pólen. 0 tempo de crescimento do cabelo é o dia quando o primeiro cabelo é observado, onde o primeiro cabelo é definido como pelo menos um milímetro de cabelo emergido.

Exemplo 9 Expressão de ERECTA e associação com a tolerância à seca e desempenho agrícola.

Um conjunto de proteínas quinases foi identificado baseado em (1) informação publicada sobre ortólogos que é indicativo de um papel na percepção de estresse ou tolerância e (2) estudos de perfil por nós desempenhados indicativos de expressão gênica relacionada ao estresse. Eles incluem genes de sistema de sinalização de dois componentes, e gene que foram identificados baseados no seu padrão de expressão relacionado com estresse - incluindo ERECTA-A. ERECTA-A

Informações fundamentais: ERECTA é uma quinase do tipo receptor com repetições ricas em leucina (LRR-RLK) que tem implicações para agricultura, especialmente nas áreas de tolerância à seca e desempenho agrícola. Em Arabidopsis, esse gene é conhecido por contribuir para a eficiência de transpiração de plantas através de mecanismos incluindo densidade de estômatos, expansão de células da epiderme, proliferação de células do mesófilo e contato célula a célula. 0 gene também é conhecido por influenciar o desenvolvimento da inflorescência. Nenhum ensaio de atividade quinásica foi reportado para a proteína.

Informação sobre a seqüência: Um CDS completo foi clonado. 0 gene se localiza na posição bin 6.04, em proximidade dos QTLs de seca conhecidos. A expressão do gene é preferencial de meristema e espiga imatura, com expressão em múltiplos tecidos como descrito na Figura 3.

Exemplo 10 Variantes de Seqüências ERECTA

A. Seqüências Nucleotídicas Variantes de ERECTA Que Não Alteram a Seqüência Codificada de Aminoácidos

As seqüências nucleotídicas ERECTA são usadas para gerar seqüências nucleotídicas variantes apresentando seqüências nucleotídicas de fase aberta de leitura com por volta de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e 95% de identidade de seqüência nucleotídica quando comparada à seqüência nucleotídica da ORF de início inalterado da correspondente SEQ ID NO. Essas variantes funcionais são geradas usando uma tabela padrão de códons. Enquanto a seqüência nucleotídica das variantes são alteradas, a seqüência de aminoácidos codificada pela fase aberta de leitura não muda.

B. Seqüências de Aminoácidos Variantes dos Polipeptldeos ERECTA

Seqüências variantes de aminoácidos dos polipeptídeos ERECTA são gerados. Nesse exemplo, um aminoácido é alterado. Especificamente, as fases abertas de leitura são revistas para determinar a alteração de aminoácido apropriada. A seleção do aminoácido a ser mudado é feita através da consulta do alinhamento de proteínas (com os outros ortólogos e outros membros da família gênica de outras espécies) . Um aminoácido é selecionado que não é julgado estar sob alta pressão de seleção (não altamente conservado) e que é facilmente substituído por um aminoácido com características químicas similares (ex., cadeia lateral funcional similar) . Usando o alinhamento de proteínas publicado na Figura 2, um aminoácido apropriado pode ser mudado. Uma vez que o aminoácido alvo é identificado, o procedimento descrito na seção C seguinte é adotado. Variantes apresentando por volta de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, e 95% de identidade de seqüência nucléica são geradas usando esse método.

C. Seqüências de Aminoácidos Variantes Adicionais de Polipeptídeos ERECTA

Nesse exemplo, seqüências artificias de proteínas são criadas apresentando 80%, 85%, 9 0% e 95% de identidade relativa à seqüência protéica de referência. Essa última empreitada requer a identificação de regiões conservadas e variantes no alinhamento publicado na Figura 2 e então aplicar de maneira sensata a tabela de substituições de aminoácidos. Essas partes serão discutidas em mais detalhes abaixo.

De modo geral, a determinação de quais seqüências de aminoácidos deve ser mudada é feita baseada nas regiões conservadas dentre a proteína ERECTA ou dentre outros polipeptídeos ERECTA. Baseado no alinhamento de seqüência, as várias regiões do polipetídeo ERECTA que podem potencialmente ser alteradas são representadas em letras minúsculas, enquanto as regiões conservadas estão representadas por letras maiúsculas. É reconhecido que substituições conservativas podem ser feitas nas regiões conservadas abaixo sem alterar a função. Em adição, alguém com habilidade irá entender que variantes funcionais da seqüência ERECTA da invenção pode ter pequenas alterações não conservadas de aminoácidos no domínio conservado.

Seqüências protéicas artificiais são então criadas que são diferentes da original nos intervalos de 80-85%, 85-90%,90-95% e 95-100% de identidade. O meio-termo desses intervalos é buscado, com latitude liberal de mais ou menos1%, por exemplo. As substituições de aminoácidos serão feitas por um sistema Perl padrão. A tabela de substituição é provida abaixo na Tabela 2 . Tabela 2. Tabela de Substituição <table>table see original document page 126</column></row><table>

Primeiro, qualquer aminoácidos conservados na proteína que não devem ser alterados são identificados e "marcados" para serem isolados da substituição. A metionina iniciadora será, lógico, adicionada automaticamente a essa lista. Depois, as modificações são feitas.

H, C, e P não são modificadas em nenhuma circunstância. As modificações irão ocorrer com a leucina primeiramente, varrendo do N-terminal para C-terminal. Após leucina, outros aminoácidos sucessivamente de acordo com a lista até o alvo desejado ser alcançado. Substituições de numero ínterim "ínterim number" podem ser feitas de modo a não causar reversão de mudanças. A lista é numerada de 1-17, então comece com quantas modificações de isoleucinas forem necessárias antes da leucina, e sucessivamente até a metionina. É óbvio que muitos aminoácidos não irão, desse modo, precisar serem alterados. L, I e V irão envolver uma substituição 50:50 das duas substituições ótimas alternativas.

As seqüências de aminoácidos variantes são escritas como produto final. O sistema Perl é usado para calcular a porcentagem de identidades. Usando esse procedimento, variantes de polipeptídeos ERECTA são gerados apresentando por volta de 80%, 85%, 90%, e 95% de identidade de aminoácidos com a seqüência nucleotídica da ORF com início inalterado das SEQ ID NOS: 27-39.

Exemplo 11 Plantas Transgênicas expressando ZmERECTA A demonstram crescimento aumentado

Plantas transgências super expressando o gene ZmERECTA A foram avaliadas no campo. Eventos transgênicos positivos e seu controle nulo foram caracterizados para traços relacionados ao crescimento da planta e de órgãos. No início da temporada de crescimento, plantas transgências positivas apresentaram crescimento aumentado, especificamente uma taxa de crescimento mais rápida. Plantas transgências atingiram o estágio floral aproximadamente dois dias antes do controle não transgênico. Plantas transgênicas também apresentam uma fronde maior, que está associada com o aumento do tamanho da folha. Tanto o comprimento quanto a largura da folha são aumentadas, contribuindo para um aumento siginficativo da área foliar das plantas transgênicas. Aumento de área foliar de até 3 4% foi observado em comparação com o controle não transgênico. Os efeitos do transgene ZmERECTA A na taxa de crescimento e tamanho de órgãos é consistente com seu papel previsto no controle de tamanho de planta e órgãos, e promoção da proliferação celular (Shpak, E.D., et al. , Plant Cell (2003) 15:1095-1110; Development (2004) 131:1491-501). Esses dados suportam a noção que ZmERECTA A pode encontrar uso no controle de tamanho de uma planta inteira, ou de órgãos específicos de milho ou outras plantas de cultivo.

Dados foram coletados medindo a densidade de estômatos (contagem de estômatos por mm2) . Baseado nas 3 áreas por folha e 2 folhas (plantas) por evento, foi observado que a densidade de estômato das plantas transgênicas positivas diminui em todos os cinco eventos quando comparada com o controle negativo. A redução variou entre 5-22% quando comparada com o controle negativo transgênico. O efeito do transgene na densidade de estômatos é consistente com o papel desse gene em Arabidopsis, onde o gene foi mostrado a reduzir a densidade de estômatos e melhorar a eficiência de transpiração, e portanto, aumentar a tolerância à seca (Masle, Gilmore e Farquhar, (2005) Nature 436:866). A consistência do efeito do transgene na densidade de estômatos em milho aumenta seu potencial para conferir tolerância à seca em espécies de plantas de cultivo.

O crescimento de tricoma foliar foi afetado nas plantas transgências positivas, de modo que as transgênicas positivas apresentam mais tricomas ou tricomas mais densamente populosos. Como medido em vários eventos, um aumento do crescimento de tricomas de até 2 8% foi observado. O crescimento de tricoma é tido como associado com a tolerância à seca e resistência a insetos da planta pela provisão de hidro-repelência e propriedade reflectivas à folha e barreiras físicas e químicas à alimentação por insetos (Esau, K. (1977) Anatomy of Seed Plants, Ed. 2) . Tais efeitos fenotípicos do transgênico ERECTA poderia levar ao impacto na tolerância à seca e resitência a insetos.

Todas publicações e pedidos de patentes nessa especificação são indicativos do nível de habilidade básica na arte a qual essa invenção pertence. Todas publicações e pedidos de patentes são incorporadas nesse documento por referência na mesma medida que se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado por referência.

A invenção foi descrita com referência a várias incorporações e técnicas específicas e preferidas. Porém, deve ser entendido que muitas variações e modificações podem ser feitas permanecendo dentro do espirito e escopo da invenção.

Claims

1. Polinucleotídeo isolado caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste em: a. polinucleotídeo tendo pelo menos 7 0% de identidade de seqüência, determinada pelo algoritmo GAP sob parâmetros padrão, com o comprimento total da seqüência de um polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 17, 19,21, 23 e 25; em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que age como modificador de tamanho de órgão; b. polinucleotídeo codificando um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26; c. polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25; e d. polinucleotídeo que é complementar ao polinucleotídeo de (a) , (b) ou (c) .

2. Cassete de expressão recombinante, caracterizado por compreender o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado, na orientação sense ou anti-sense, a um promotor.

3. Célula hospedeira caracterizada por conter o cassete de expressão de acordo com a reivindicação 2.

4. Planta transgênica caracterizada por conter o cassete de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 2.

5. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que dita planta é uma monocotiledônea.

6. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que dita planta é uma dicotiledônea.

7. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que dita planta é selecionada do grupo consistindo em: milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, painço, amendoim e cacau.

8. Semente transgênica caracterizada por ser da planta transgênica de acordo com a reivindicação 4.

9. Método para modular o tamanho de órgão em plantas, caracterizado por compreender: a. introduzir em uma célula vegetal um cassete de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 operacionalmente ligado a um promotor; e b. cultivar a planta sob condições de crescimento celular vegetal; em que o tamanho de órgão na planta citada é modulado.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal é de uma planta selecionada do grupo consistindo em: milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, painço, amendoim e cacau.

11. Método para modular a planta inteira ou o tamanho de órgão em uma planta, caracterizado por compreender: a. introduzir em uma célula vegetal um cassete de expressão recombinante compreendendo o polinucleotideo de acordo com a reivindicação 1 operacionalmente ligado a um promotor; b. cultivar a célula vegetal sob condições de crescimento celular vegetal; e c. regenerar uma planta da célula vegetal citada; em que o tamanho de órgão na planta citada é modulado.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo em: milho, soja, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada, painço, amendoim e cacau.

13. Produto caracterizado por ser derivado do método de processamento de tecidos vegetais transgênicos expressando um polinucleotideo isolado codificando um gene ERECTA, o método compreendendo: a. transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante compreendendo um polinucleotideo tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência com o comprimento total da seqüência de um polinucleotideo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25, operacionalmente ligado a um promotor; e b. cultivar a célula vegetal transformada sob condições de crescimento celular vegetal; em que o crescimento na referida célula vegetal transformada é modulado; c. cultivar a célula vegetal sob condições de formação de planta para expressar o polinucleotideo no tecido vegetal; e d. processar o tecido vegetal para obter um produto.

14. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo também codifica um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, -8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26.

15. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

16. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo em: milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfafa, algodão, arroz, cevada e painço.

17. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que melhora a dureza do caule de uma planta através da superexpressão do polinucleotídeo.

18. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que aumenta a produção pelo aumento da biomassa.

19. Produto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é um constituinte de etanol.

20. Método para modular a planta inteira ou o tamanho de órgão em uma planta durante estresse de seca, caracterizado por compreender: a. introduzir em uma célula vegetal um cassete de expressão recombinante compreendendo o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1 operacionalmente ligado a um promotor; b. cultivar a célula vegetal sob condições de crescimento celular vegetal; e regenerar uma planta da célula vegetal citada sob condições de estresse de seca; em que o crescimento vegetativo na planta citada é modulado.