BRPI0717282A2

BRPI0717282A2 - Novos antígenos e anticorpos associados ao adenocarcinoma ductal pancreático

Info

Publication number: BRPI0717282A2
Application number: BRPI0717282-6A
Authority: BR
Inventors: Novelli Francesco; Tomaino Barbara; Cappello Paola
Original assignee: Ribovax Biotechnologies Sa
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2013-10-15
Also published as: NO20091662L; KR20090094227A; EP2069395B1; PT2069395E; US8071721B2; ES2381304T3; CA2664841A1; PL2069395T3; NZ576409A; US20100028907A1; JP2010505104A; ATE542831T1; IL197868A; IL197868A0; CN101578295B; EP2069395A1; DK2069395T3; WO2008037792A1; IL218442A0; CN101578295A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "NOVOS ANTÍGENOS E ANTICORPOS ASSOCIADOS AO ADENOC ARCINOMA DUCTAL PANCREÁTICO".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere a novos meios para o diagnóstico e tratamento dos cânceres humanos, especialmente os de origem pancreática.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O Adenocarcinoma Ductal Pancreático (PDA) é

o câncer pancreático mais freqüente e a quarta causa de morte por câncer nos Estados Unidos e na Europa. A maioria dos pacientes morre dentro de 12 meses, sendo que apenas 2% sobrevivem cinco anos após o diagnóstico. A pancreactomia continua sendo a base do controle e quimioterapia do PDA, mas oferece pouquíssimo benefício em termos de sobrevivência (Laheru D and Jaffee M, 2005; KleefJ e col., 2006).

Apesar das melhorias no tratamento médico e cirúrgico (inclusive o uso de anticorpos monoclonais, vacinas e quimioterapia), ainda há poucos marcadores pouco confiáveis para o diagnóstico precoce do PDA. O marcador sorológico mais utilizado para o diagnóstico do câncer pancreático é o antígeno do grupo sangüíneo Lewis sialilado CA19-9, mas seu uso está direcionado principalmente à monitoração da resposta à terapia, em vez do diagnóstico do PDA. De fato, esse antígeno também pode estar presente a concentrações elevadas no soro dos pacientes afetados por doenças pancreáticas benignas (como a pancreatite crônica ou obstrução biliar), gerando falsos positivos, e não pode ser usado em todos os casos, pois não é expresso de forma alguma em 5 a 10% da população (Okusaka T e col., 2006).

É por essas razões que biomarcadores

alternativos estão sob avaliação para uso no diagnóstico do PDA, com o objetivo de limitar procedimentos invasivos, como biópsias e avaliação histopatológica (Bouvet M, 2004; Brand R, 2001; Goggins M, 2005; Leung T e col, 2005), e para avaliar fármacos candidatos (Cohen S and Meropol N, 2002; Jimeno A and Hidalgo M, 2006).

Várias tecnologias foram empregadas recentemente para a identificação de biomarcadores candidatos ao PDA usando análise em grande escala da expressão protéica (seja baseado no RNA ou nos níveis de proteínas). Em particular, foram utilizadas tecnologias proteômicas para detectar antígenos que provocam uma resposta humoral no soro dos pacientes com PDA por meio da comparação das proteínas que são resolvidas pela eletroforese em gel bidimensional (2-DE), reconhecidas pelos anticorpos séricos dos pacientes com câncer e identificadas usando Espectrometria de Massa (Gorg A e col., 2004; Graham D e col., 2005). Variantes dessa abordagem para separação, seleção e caracterização protéica foram descritas sob diferentes nomes na literatura, tal como SERPA (Klade C e col., 2001), PROTEOMEX (Lichtenfels R e col., 2003) ou SPEAR (Unwin R e col., 2003). A hipótese de trabalho comum a essas metodologias é que, ao caracterizar o repertório de células B contra antígenos expressos especificamente por cânceres (o chamado imunoma humano do câncer), seria possível definir alvos específicos que estão envolvidos na imunovigilância e imunoedição do câncer, e entender os mecanismos que levam à proliferação descontrolada das células e à metástase (Drake C e col., 2006; Dunn G e col., 2004). Foi sugerido que a imunoterapia seria uma

abordagem valiosa para o tratamento do câncer pancreático (Laheru D and Jaffee M, 2005). De fato, foram geradas listas de proteínas específicas ao PDA candidatas com base em sua expressão elevada no nível do RNA (WO 04/55519), ou de uma análise proteômica em grande escala das amostras séricas e /ou amostras pancreáticas (Bhattacharyya S e col., 2004; Cao D e col, 2005; Cecconi D e col, 2003; Chen R e col, 2005; Gronborg M e col, 2006; Honda K e col., 2005; Koomen J e col., 2005; Rodriguez J e col., 2005; Shen J e col., 2004, Rosty C and Goggins M, 2005; Sinha P e col., 1999; Yu Y e col., 2005). As proteínas candidatas para diagnóstico do PDA no soro são o gama Fibrinogênio (Bloomston M e col., 2006), a proteína DEAD-Box 48 (Xia Q e col., 2005), MIC-I (Koopmann e col., 2004), a proteína relacionada ao PTH (Bouvet M e col., 2001), e a calreticulina (Hong S e col., 2004). No entanto, ainda são necessários biomarcadores confiáveis para a detecção precoce do PDA e sua diferenciação das outras patologias ou cânceres pancreáticos.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção se baseia na observação de

que o soro dos pacientes com PDA, comparado ao soro dos indivíduos saudáveis ou dos indivíduos afetados por outras patologias, contém anticorpos direcionados contra proteínas específicas que são expressas em uma linhagem celular originada dos cânceres pancreáticas. A presença dessas proteínas foi confirmada usando anticorpos purificados específicos para tais proteínas em extratos obtidos de tecidos pancreáticos normais e com PDA.

O objeto principal da presente invenção são novas isoformas associadas ao PDA da alfa-enolase humana (ENOA) que são fosforiladas em pelo menos 3 posições que também foram determinadas em uma das novas isoformas da alfa- enolase.

Outro objetivo da invenção são anticorpos ligando-se a essas isoformas fosforiladas da ENOA e distinguindo-as das outras isoformas da ENOA Os anticorpos podem ser em qualquer formato apropriado, tais como anticorpos monoclonais (em particular, anticorpos monoclonais humanos) e fragmentos de anticorpos. As proteínas que foram definidas como

associadas ao PDA na Invenção e os anticorpos que as ligam (bem como quaisquer outros meios específicos para detecção destas), podem ser utilizadas nos métodos para diagnóstico do PDA, bem como para identificar agentes para o tratamento do PDA. Em particular, a detecção baseada em anticorpos das isoformas fosforiladas da ENOA associadas ao PDA em amostras biológicas (tais como soros ou biópsias) obtidas de um paciente podem ser usadas em métodos para o diagnóstico do PDA, para avaliar a progressão da doença, ou para avaliar os efeitos dos fármacos para tratamento do PDA.

Outros objetivos da presente invenção são kits para o diagnóstico do PDA, para avaliar a progressão da doença, ou para avaliar os efeitos dos fármacos para tratamento do PDA, os kits compreendendo ao menos uma das proteínas associadas ao PDA da invenção e/ou os anticorpos ligando eles.

Outros objetivos da Invenção, inclusive os relacionados à definição e ao uso de anticorpos anti-alfa-enolase específicos no diagnóstico e no tratamento do câncer pancreático, são apresentados na descrição a seguir.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática do método SERPA aplicado para caracterização dos antígenos de proteína associados ao PDA e anticorpos usando células CF-PAC-I (células tumorais) e soro de pacientes com PDA (tumor) ou doadores controle (saudáveis).

Figura 2: (A) gel 2-DE preparado usando um extrato protéico da linhagem celular CF-PAC-I como um ensaio para detecção da expressão protéica associada ao PDA. As proteínas no extrato celular foram separadas no gel de acordo com seu peso molecular e pi e reveladas usando coloração com prata. A posição dos pontos presentes no Western Blot com soro com PDA, e não com soro controle, é indicada (o nome da proteína específica correspondendo a cada número é listado na Tabela I). (B) Histogramas representando a porcentagem do soro de pacientes (cujo número em cada grupo é indicado como n) que estão afetados pela pancreatite crônica (CP) ou pelo PDA em diferentes estágios (II, III, IV) que contêm anticorpos reconhecendo as proteínas associadas ao PDA indicadas. O nome completo das proteínas correspondendo aos acrônimos é indicado na Tabela I.

Figura 3: Alinhamento das seqüências de proteínas da alfa-enolase humana (ENOA; SWISSPROT Ace. No. P06733; SEQ ID NO: 1) e da gama enolase humana (ENOG SWISSPROT Ace. No. P09104; SEQ ID NO: 2) (os aminoácidos que são idênticos nas duas proteínas são indicados com ":", enquanto que os que são apenas conservados são indicados com "."). As seqüências dos peptídeos que foram identificados pela Espectrometria de Massa nos pontos do gel 2-DE e usadas para atribuir isoformas da ENOA a tais pontos são sublinhados.

Figura 4: Posição dos sítios de fosforilação (negrito, sublinhado) na seqüência de proteínas da alfa-enolase humana (ENOA) que são prognosticados por diferentes algoritmos e/ou identificados experimentalmente (letras minúsculas abaixo da seqüência de proteínas; vide a legenda para obter referências). Os peptídeos identificados na ENOA como sendo fosforilados na isoforma 3 da ENOA são marcados com uma caixa de linha normal. Os peptídeos identificados como não sendo fosforilados na isoforma 3 da ENOA são marcados com uma caixa de linha tracejada.

Figura 5: (A) Detecção de seis isoformas da alfa-enolase (ENOA 1, 2, 3, 4, 5, 6) por diferentes meios. A posição da ENOA 1/2, e 3 é indicada com as setas brancas. (B) Detecção das seis isoformas da alfa-enolase (1, 2, 3, 4, 5, 6) nos extratos protéicos de um tecido pancreático normal ou de um tecido pancreático de um paciente com PDA que foram transferidos sobre uma membrana e então testados por Western Blot, usando anti-ENOA como anticorpo primário. As posições das isoformas da ENOA Vi são indicadas com as setas brancas. Como controle da quantidade de proteína carregada no gel e transferida sobre a membrana, a membrana foi sondada com anticorpo anti-actina humana policlonal de coelho (diluição 1:10000; Sigma Chemical Co.). Figura 6: Detecção das seis isoformas da alfa-

enolase (ponto 1, 2, 3, 4, 5, 6) em extratos de células CF-PAC-I por géis 2-DE e Western Blot, usando (como anticorpo primário) um grupo de soros de pacientes com PDA com ou sem pré- adsorção com alfa-enolase humana recombinante (+rENOA ou - rENOA). Como alternativa, a membrana foi pré-tratada com uma fosfatase (+λΡΡΑ8Ε) antes de realizar o Western Blot, usando (como anticorpo primário) um grupo de soros de pacientes com PDA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA

INVENÇÃO

O uso combinado de tecnologias bioquímicas e

proteômicas pode permitir a identificação e a avaliação das proteínas individuais presentes em amostras biológicas relacionadas a doenças. No presente caso, esse tipo de análise foi inicialmente direcionado a um câncer (PDA) e utilizava duas fontes de moléculas associadas à doença: uma linhagem celular (CF-PAC-I) derivada do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (PDA) humano e soros obtidos de um grande grupo de pacientes com PDA, possivelmente contendo anticorpos associados à oncogenese e/ou progressão do PDA. O perfil das proteínas imunoreativas detectadas

nos extratos de CF-PAC-I pela análise Western blot desses soros foi comparado com o obtido usando soros de diferentes populações controle (indivíduos saudáveis, pacientes com tumores diferentes do PDA, pacientes com pancreatite crônica) a fim de estabelecer anticorpos candidatos associados ao PDA e antígenos relacionados no proteoma da CF-PAC-I (Fig. 1). Foi verificado que anticorpos para um número restrito de proteínas, tendo atividades biológicas conhecidas distintas (inclusive enzimas metabólicas e proteínas citoesqueléticas) estavam seletivamente presentes no soro dos pacientes com PDA, indicando que essas proteínas estão associadas ao PDA e induzem uma resposta de anticorpo in vivo nos pacientes com PDA, e não nos indivíduos saudáveis ou nos pacientes com outro câncer além do PDA.

As proteínas e anticorpos que foram definidos como associados ao PDA na Invenção (e quaisquer outros meios específicos para detecção dos mesmos) podem ser utilizados nos métodos para diagnóstico do PDA, bem como para identificar agentes para o tratamento do PDA.

O quadro de proteínas humanas associadas ao PDA (compreendendo a alfa-enolase, triosefosfato isomerase deidrogenase retinal-1, glicose-6-fosfato-l-deidrogenase, fator de alongamento Tu e isocitrato deidrogenase, queratina tipo I citoesquelética 10, Cofilina 1; Fig. 2B e Tabela I) foi definido, usando as tecnologias 2-DE e Espectrometria de Massa para separação e análise protéica, como os antígenos para os anticorpos especificamente presentes no soro com PDA. Além do mais, anticorpos purificados contra esses antígenos confirmaram sua expressão diferencial, e, portanto, a utilidade de qualquer meio baseado em proteína para sua detecção (inclusive soro, anticorpos total ou parcialmente purificados, preparações de anticorpos policlonais e peptídeos) para o diagnóstico precoce do PDA e para avaliar a progressão desse câncer nos pacientes.

Essas proteínas podem ser usadas, cada uma separadamente ou em combinação, como biomarcadores para o diagnóstico precoce do PDA e para avaliar a progressão desse câncer nos pacientes. Dentre esses biomarcadores, ENOA 1/2 (isoforma 1 e isoforma 2 da alfa-enolase) e COFl (Cofilina 1), conforme identificado por meio do 2-DE e do Western blot, parecem ser os antígenos de proteína associados ao PDA mais confiáveis.

Como mostrado nos exemplos, anticorpos ligando-se a tais antígenos associados ao PDA podem ser usados para os escopos listados acima. Dessa forma, métodos compreendendo a detecção de tais antígenos e/ou anticorpos em uma amostra biológica (tais como soro, biópsias ou extratos protéicos de células/tecidos) permitem o diagnóstico precoce do PDA e a avaliação da progressão do PDA em pacientes.

A caracterização dos antígenos associados ao PDA, exceto em um caso descrito abaixo, não foi estendida para a definição de qualquer modificação pós-traducional nas proteínas associadas ao PDA. Os dados indicam que qualquer anticorpo ou peptídeo ligando-se especificamente tanto em um epítopo comum a todas as isoformas de um dado antígeno (como os anticorpos purificados utilizados para a Tabela I, coluna à direita) quanto apenas à(s) isoforma(s) contendo a modificação pós-traducional associada ao PDA (como as que estão presentes no soro dos pacientes com PDA e medidas durante a progressão do PDA; vide a Fig. 2B) pode ser utilizado para estabelecer um diagnóstico e progressão do PDA.

Dado o interesse em oferecer novos compostos terapêuticos para tratamento do PDA, os métodos compreendendo a detecção de antígenos e anticorpos associados ao PDA (bem como de suas propriedades de ligação) em amostras biológicas também podem ser usados para avaliar os fármacos candidatos para tratamento do PDA. Essa abordagem pode ser aplicada em ensaios em que a presença das proteínas associadas ao PDA e/ou anticorpos pode ser comparada, como apresentado nos exemplos com isoformas da ENOA (ENOA 1/2).

Modificações nessas propriedades, que podem ser estabelecidas usando as tecnologias bioquímicas e proteômicas descritas nos exemplos e na literatura, e que seguem a exposição a um composto candidato, podem ser uma indicação da via biológica que leva à oncogênese e metástase do PDA. Por exemplo, é possível verificar a atividade específica do PDA de um composto detectando o desaparecimento de anticorpos primários contra os antígenos associados ao PDA no soro de pacientes ou modelos animais, bem como a redução no número de pontos pelo Western blot nos extratos celulares usando anticorpos específicos ao antígeno.

Os compostos candidatos podem ser direcionados a qualquer alvo terapêutico do PDA em potencial, inclusive os que são definidos na Invenção como proteínas associadas ao PDA (tal como COFl ou ENOA 1/2). Por exemplo, os compostos podem ser na forma de anticorpos que os ligam (em geral ou apenas isoformas específicas), ou de pequenas molécula alterando sua expressão ou modificação pós-traducional pela modulação da atividade das enzimas que os modificam. Além do mais, foi descoberto que os anticorpos ligando-se à alfa-enolase humana, tal como um anticorpo monoclonal murino, inibem o crescimento in vitro e a proliferação das linhagens celulares transformadas de origem pancreática apresentando seis isoformas da alfa-enolase (isto é, incluindo ENOA 1/2, conforme detectado usando o soro dos pacientes com PDA no Western Blot). Esse efeito inibitório sobre o crescimento in vitro e a proliferação foi observado também para uma linhagem celular transformada de origem não pancreática apresentando tais seis isoformas da alfa- enolase, mas não na que apresenta apenas três dessas isoformas não-fosforiladas (Exemplo 3; Fig. 5B; Tabela IV), indicando a possibilidade de utilizar anticorpos anti-ENOA para o tratamento do PDA.

Tais propriedades terapêuticas possíveis podem então ser avaliadas em qualquer um dos ensaios de proliferação para células pancreáticas fazendo o uso de linhagens celulares ou modelos animais e já testados para verificar o efeito de diferentes compostos, tais como peptídeos, peptídeos análogos e moléculas pequenas afetando a transdução de sinal (Baker C e col, 2002; Bauer T e col., 2005; Bruns C e col., 2000; Lee L e col., 2002; Levitzki A and Mishani E, 2006; Qin Y e col., 1995; Yezhelyev M e col., 2004; Rubio-Viqueira B e col., 2006). Além do mais, a possibilidade de utilizar combinações de compostos almejando diferentes alvos moleculares para o tratamento mais eficientes dos cânceres pancreáticos foi demonstrada. Por exemplo, a administração de um reagente quimioterapêutico junto com inibidores de quinases específicas para receptores da membrana celular proporcionou a inibição do crescimento do câncer pancreático humano experimental e prolongamento significativo da sobrevivência em um modelo animal (Yokoi N e col., 2005). Como alternativa, foi descrito que, quando dois ou mais anticorpos direcionados a um alvo viral ou humano são combinados em uma composição farmacêutica, a composição resultante pode apresentar uma eficácia terapêutica e/ou diagnostica aperfeiçoada não somente devido a um efeito aditivo, mas também a um efeito sinérgico (Longtenberg T, 2007).

Uma composição farmacêutica compreendendo anticorpos contra as proteínas associadas ao PDA (tal como ENOA 1/2) pode ser administrada para fim terapêutico e de diagnóstico em humanos. Assim, os métodos para o tratamento ou diagnóstico do PDA podem compreender a administração de composições farmacêuticas compreendendo anticorpos contra as proteínas associadas ao PDA (tal como ENOA 1/2).

As composições podem incluir excipientes farmacêuticos comuns e podem ser administradas em dosagens únicas ou múltiplas e/ou usando dispositivos apropriados, por diferentes vias: intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, mucosal, em materiais de matriz não-biodegradável ou usando sistemas de distribuição de fármaco particulado. Em particular, a composição deverá permitir a administração eficaz ao pâncreas, ou a quaisquer outros tecidos em que as proteínas associadas ao PDA podem estar presentes. Uma composição farmacêutica deve fornecer uma quantidade eficaz, do ponto de vista terapêutico ou profilático, do composto ao paciente, que permita ao composto exercer sua atividade por um período de tempo suficiente. O efeito desejado é o de melhorar o estado de saúde do paciente com PDA pelo controle do crescimento e proliferação do PDA, e pela redução de pelo menos algumas das manifestações clínicas do PDA. Por exemplo, a composição deve ser administrada em uma quantidade eficaz de cerca de 0,005 a cerca de 50 mg/kg/peso corporal, dependendo da via de administração e do estado de saúde do indivíduo.

No caso de composições tendo usos diagnósticos, o composto deve ser detectado usando tecnologias já consagradas nos laboratórios clínicos e de pesquisa para detecção de vírus em amostras biológicas (por exemplo, ELISA ou outros ensaios serológicos), ou, quando administradas a um paciente ín vivo, pelo menos 1, 2, 5, 10, 24 ou mais horas após a administração. A detecção das proteínas e/ou anticorpos associados ao PDA pode ser realizada usando as proteínas associada ao PDA e/ou os anticorpos da invenção, após ou em combinação com os meios e procedimentos que foram estabelecidos para o diagnóstico do PDA.

O desenvolvimento e uso clínico para a terapia e/ou diagnóstico do PDA deve ser baseado na caracterização da farmacocinética e na farmacodinâmica do anticorpo (Lobo E e col., 2004), nos dados de segurança clínica e pré-clínica (Tabrizi M and Riskos L, 2007), e na conformidade com as exigências internacionais para a produção e controle de qualidade de anticorpos monoclonais para uso diagnóstico terapêutico e in vivo em humanos (Harris R e col. 2004).

Os kits para diagnóstico do PDA em um paciente podem compreender uma ou mais das proteínas associadas ao PDA e/ou anticorpos definidos acima, e qualquer outro composto que possibilite sua detecção, como definido na presente Invenção. Esses kits podem compreender antígenos marcados/não-marcados, anticorpos ou substratos que são modificados após a interação com tal antígeno (por exemplo, no caso daqueles identificados como tendo atividades enzimáticas).

Dentre os alvos da resposta humoral ao PDA, é de particular interesse a descoberta de que novas isoformas fosforiladas da alfa-enolase são reconhecidas pelo soro com PDA. As novas isoformas da alfa-enolase humana (ENOA) são fosforilada em pelo menos três posições, e um total de sete sítios de fosforilação foi identificado (Fig. 4). A importância dessa descoberta é corroborada pela detecção específica de duas isoformas da ENOA altamente fosforiladas (ENOA 1/2) usando soros obtidos de pacientes com PDA ou em tecidos pancreáticos obtidos de pacientes com PDA (Fig. 2B, 5 e 6; Tabela I e II). Os pacientes com PDA apresentam anticorpos que se ligam especificamente às isoformas de ENOA altamente fosforiladas da Invenção. Os exemplos mostram que, ainda que várias posições na seqüência da ENOA possam ser fosforiladas, uma combinação precisa de resíduos de Treonina, Serina e Tirosina é realmente fosforilada, em ambas as linhagens celulares e tecidos com PDA, e detectada pelos anticorpos humanos produzidos pelos pacientes com PDA. Em particular, a fosforilação na Treonina 55, Tirosina 57, Tirosina 200, Tirosina 236, Treonina 237, Tirosina 257 e Serina 419 está presente na isoforma 3 da ENOA, que apresenta, como a ENOA 1/2, um perfil de fosforilação protéica que é alterado pelos tratamentos com fosfatases. Mudanças similares na fosforilação protéica podem ser usadas para diagnóstico do PDA e para avaliar a progressão da doença usando amostras biológicas obtidas de um paciente.

Em alternativa às isoformas completas 1/2 de ENOA, pode ser útil gerar peptídeos únicos derivados da ENOA, seqüências protéicas compreendendo os mesmos, ou bibliotecas e combinações destes, que apresentam os mesmos resíduos fosforilados de ENOA 1/2, tal como as identificadas na Figura 4 (vide as seqüências marcadas com caixas). Métodos para gerar e utilizar tais proteínas e peptídeos fosforilados são revelados na literatura (Conrads T e col, 2002; US5763164; WO 97/30097).

O número e efeito das modificações pós- traducionais nas isoformas da alfa-enolase (em particular ENOA 1/2) podem ser adicionalmente confirmados por tecnologias conhecidas (Kalume D e col., 2003; Machida K e col., 2003; Mann M e col., 2002; Rush J e col., 2005; Molina H e col., 2007; Schmelzle K e White F, 2006; Wu J e col., 2005) em amostras controle e associadas ao PDA. Fosforilações e/ou modificações adicionais conhecida para a ENOA (Tabela III) podem estar presentes na ENOA 1/2 e são relevantes para a antigenicidade e a atividade biológica dessas isoformas, bem como para sua detecção por anticorpos específicos à isoforma. A modificação pós-traducional associada a estágios/tipos específicos de doenças pode ser detectada por vários meios, inclusive análise direta de proteína ou anticorpos distinguindo isoformas tendo modificações específicas, como mostrado para outras proteínas (Edberg D e col., 2005; Mandell J, 2003).

Os anticorpos, em particular, os anticorpos monoclonais, que são definidos por meio de sua ligação às isoformas das proteínas diferencialmente expressas em extratos protéicos com PDA/sem PDA por 2-DE e Western Blot podem ser usados no tratamento de cânceres com perfil similar no 2-DE e Western Blot. Sendo assim, os anticorpos ligando-se à alfa- enolase (em geral, ou as isoformas fosforiladas especificar em particular) podem ser usados na preparação de composições farmacêuticas para tratamento do PDA e em métodos para o tratamento dos pacientes com PDA, ou de pacientes com câncer que apresentam um perfil de expressão similar para alfa-enolase (isto é, expressando novas isoformas da alfa-enolase humana da Invenção que são fosforiladas em pelo menos 3 posições). Os anticorpos podem ser usados para a detecção

ou tratamento de cânceres (tal como PDA) que são caracterizados pela presença no soro dos pacientes das isoformas fosforiladas da alfa-enolase. Esses anticorpos podem ser gerados pela aplicação de qualquer uma das tecnologias conhecidas para identificação, caracterização e produção do anticorpo de interesse diagnóstico ou terapêutico (Jain M e col., 2007; Laffly E and Sodoyer R, 2005). O anticorpo pode ser gerado em qualquer formato de proteína para anticorpos funcionais, como anticorpos completos (tal como um anticorpo monoclonal, em particular um anticorpo monoclonal humano ou humanizado), fragmentos de anticorpos, proteínas de ligação a antígeno, e outras proteínas de fusão e peptídeos baseados em anticorpos criados por engenharia genética, que são descritas na literatura sob nomes diferentes, tal como Scfv (fragmento de cadeia única variável), Fab (heterodímero de cadeia pesada/leve variável), diacorpo, cadeias leves ou pesadas isoladas, peptacorpos ou anticorpos biespecíficos.

Os anticorpos da invenção podem ser aperfeiçoados com a conjugação (usando ligantes químicos ou polímeros) ou a fusão com um agente terapêutico, estabilizante, marcador ou diagnóstico. Exemplos desses agentes são a molécula de marcação detectável (por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma toxina, um átomo de metal, um composto quimioluminscente, um composto bioluminscente, biotina, um substrato enzimático ou uma enzima) que pode ser ligada. A atividade específica ao ENOA também pode ser aperfeiçoada pela fusão com outra proteína terapêutica, tal como uma proteína ou um polímero que altera o metabolismo e/ou a estabilidade em aplicações terapêuticas ou de diagnóstico. Meios para escolher e projetar grupamentos de proteínas, ligantes e peptídeos de ligação apropriados, bem como métodos e estratégias para a construção, purificação, detecção e uso das proteínas de fusão são apresentados na literatura (Nilsson e col., 1997; "Applications Of Chimeric Genes And Hybrid Proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000; WO 01/77137) e geralmente estão disponíveis em laboratórios clínicos e de pesquisa. Por exemplo, a proteína de fusão pode conter

seqüências reconhecidas por anticorpos comerciais (inclusive

f

marcadores, como poliistidina, FLAG, c-Myc ou marcas HA) que podem facilitar a identificação in vivo e/ou in vitro da proteína de fusão, ou sua purificação. Outras seqüências de proteínas podem ser facilmente identificadas por análise de fluorescência direta (como no caso da Proteína Fluorescente Verde) ou por substratos ou enzimas específicas (usando, por exemplo, sítios proteolíticos).

Os anticorpos reconhecendo as seqüências de proteínas específicas ao PDA (tal como ENOA 1/2), ou quaisquer outras seqüências de proteínas derivadas de tal anticorpo, podem ser expressos como uma proteína recombinante usando tais vetores para transformar as células hospedeiras apropriadas, que podem ser células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas e devem permitir a segregação da proteína recombinante desejada. Métodos para produzir tais proteínas incluem cultivas células hospedeiras transformadas com os vetores de expressão compreendendo suas seqüências de codificação sob condições adequadas à expressão protéica e recuperando a proteína da cultura de células hospedeiras. Os vetores para expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas são descritos em livros e artigos sobre como clonar e produzir proteínas recombinantes, inclusive títulos na série "A Practical Approach" publicada pela Oxford Univ. Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems'", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001). seqüências de proteínas adicionais podem ser adicionadas em conexão com o formato de anticorpo desejado (Scfv, FAb, fragmento de anticorpo, anticorpo totalmente humano, etc.) ou com a inserção, substituição ou eliminação de um ou mais aminoácidos internos. Essas tecnologias também podem ser usadas para caracterização e otimização estrutural e funcional adicional das propriedades terapêuticas das proteínas em geral, e dos anticorpos em particular (Kim S e col., 2005).

A invenção será agora descrita por meio dos seguintes Exemplos, que não devem ser interpretados de forma alguma como limitações à presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Detecção dos antígenos humorais associados ao PDA no proteoma da linhagem celular CP- PAC-I

Materiais & métodos

Soro Humano Amostras de soro foram isoladas do sangue venoso com o consentimento informado dos pacientes e doadores saudáveis e a aprovação dos Comitês Éticos das instituições clínicas. As amostras foram estocadas a -80°C até o uso.

O soro foi obtido de 70 pacientes com PDA (31

homens, 39 mulheres; idades na faixa de 32 a 86 anos; idade média + Desvio Padrão: 67+11) e agrupado em diferentes estágios clínicos de acordo com a classificação normalmente usada (Faria S e col., 2004) e com a classificação UICC (Union International Contre Le Câncer) como segue: 17 no estágio II (sem metástase, moderadamente diferenciado), 17 no estágio III (sem metástase, fracamente diferenciado) e 36 no estágio IV (metástase distante, não diferenciado).

A reatividade desses soros foi comparada com a de 40 indivíduos saudáveis que foram usados como controles sem um histórico anterior de câncer ou doença autoimune (14 homens, 26 mulheres; idades na faixa de 55 a 77 anos; idade média + Desvio Padrão: 70+7). Além disso, a reatividade desses soros foi comparada com a de 30 pacientes com câncer sem PDA (9 pacientes com carcinoma hepatocelular, 12 com câncer de mama, 8 com câncer de cólon e 1 com câncer de ovário; 11 homens, 19 mulheres; idades na faixa de 44 a 79 anos; idade média + Desvio Padrão 66+10) e 15 pacientes com pancreatite crônica (9 homens, 6 mulheres, idades na faixa de 49 a 76 anos; idade média + Desvio Padrão: 59+8). A idade e a distribuição de sexos entre os diferentes grupos de pacientes que forneceram soro não apresentou diferenças significantes do ponto de vista estatístico, conforme avaliado pelo teste-T de Student bilateral não- emparelhado. Apenas no grupo de pancreatite crônica, a distribuição de idade (mas não de sexo) desses dois grupos foi significativamente diferente, uma vez que essa doença ocorre geralmente numa idade menor (por volta dos 44 anos em média) do que o PDA.

Linhagens celulares e preparação dos extratos

celulares.

Células (IO7) da linhagem celular CF-PAC-I (ECACC Ref. no. 91112501), derivadas de um Adenocarcinoma Ductal Pancreático (Schoumacher R e col., 1990) foram colhidas e lavadas com Solução Salina Equilibrada de Hank (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). Os precipitados foram liofilizados durante a noite e estocados a 80°C. Os precipitados foram suspensos novamente em 200 μΐ de tampão de reidratação [uréia 5 M, tiouréia 2 M, CHAPS a 4% p/v (Sigma Chemical Co.), tampão IPG a 2% v/v 3-10 NL (GE Healthcare Bio- Sciences, Uppsala, Suécia), 80 mM DTT (Sigma Chemical Co.)]. A concentração protéica foi medida com o ensaio de Bradford (Bio-Rad Laboratories).

Eletroforese em gel bidimensional (2-DE) Cem μg do extrato protéico da linhagem celular

CF-PAC-I foram carregados em reidratação em gel sobre tiras de IPG de 7 cm (pH 3-10 NL), para géis analíticos e preparativos. A focalização isoelétrica (IEF) foi realizada em um sistema de unidade IEF IPGphor (GE Healthcare Bio-Sciences) com gradiente de tensão elétrica de até 5000 V para um total de 16.000 Vh. Antes do SDS-PAGE, as tiras de IPF foram equilibradas por minutos com uma solução do tampão Tris/HCl (50 mM/ pH 8,8) uréia (6 M), glicerol (30% v/v), SD (2% p/v) e DTT (2% p/v), então por 5 minutos adicionais no mesmo tampão contendo iodoacetamida (2,5% p/v) e Bromofenol Azul em vez de DTT. Para a segunda dimensão, tiras de 7 cm foram corridas em géis pré-fabricados NuP AGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Zoom® pequenos (Invitrogen, Hroningen, Países Baixos) usando o sistema Novex X-Cell II™ Mini-cell (Invitrogen) a 200V constantes e transferidas para uma membrana de nitrocelulose ECL Hybond (GE Healthcare Bio-Sciences) usando o Módulo de Blot Novex X-Cell II™ (Invitrogen) ou coradas com prata para análise de espectrometria de massa (Shevchenko A e col., 1996).

Os valores ρ/ das manchas de proteínas foram estimados a partir de sua posição no gel 2-DE com gráficos de gradiente de pH fornecidos pela GE Healthcare Bio-Sciences. O peso molecular das proteínas foi calculado por comparação com a migração dos padrões Pré-corados SeeBlue Plus2 (Invitrogen) de peso molecular conhecido. As imagens do gel 2-DE foram obtidas com o "ImageScanner" (GE Healthcare Bio-Sciences) e gravadas no formato TIFF com o software "ImageMaster Labscan Ver 3.00" (GE Healthcare Bio-Sciences). Análise Western blot

As membranas foram incubadas por 15 horas a 4°C com um tampão de bloqueio consistindo de TBS contendo leite em pó desnatado a 5% e então incubadas 4 horas com soro (diluição de trabalho de 1:200 em TBS contendo 0,05% Tween 20 e leite em pó desnatado a 5%). Após a lavagem, as membranas foram incubadas com o anticorpo anti-imunoglobulina G humana de coelho (IgG) conjugado à peroxidase de raiz-forte (HRP) (Santa Cruz Biotechnology) a uma diluição de 1:1000 por 90 minutos à temperatura ambiente.

Como alternativa, para a análise Western Blot usando anticorpos primários purificados, as membranas de nitrocelulose manchadas a partir de géis 2-DE foram sondadas com diluição de 1:1000 de anticorpos, tanto de origem de camundongos [tais como os anticorpos monoclonais anti-enolase 19/128 (um subclone do clone 19/12 caracterizado em Moscato S e col., 2000), anti-triosefosfatoisomerase 1 (Abnova Corporation), anti-Queratina 10 (Chemicon International), fator anti- alongamento tu (Abnova Corporation)] quanto de origem de coelhos [tais como os anticorpos policlonais anti-aldeído deidrogenase 1 (Chemicon International), anti-glicose-6-fosfatol- deidrogenase (Bethyl laboratories), anti-isocitrato deidrogenase (Biogenesis Ltd) e anti-cofilina 1 (Cell Signaling) por 1 hora a 25° C. Em seguida, as membranas foram incubadas por 1 hora com o anticorpo de cabra conjugado ao HRP secundário específico, tanto anti-IgG de camundongo quanto anti-IgG de coelho (Santa Cruz Biotechnology), segundo as instruções do fabricante.

A análise Western blot dos tecidos pancreáticos foi realizada usando um total de 30 a 50 mg de tecido fresco congelado que havia sido homogeneizado (UltraTurrax básico Tl8) em gelo em tampão de Iise 400 μΐ contendo 50mM TRIS/HC1 pH 7,4, 150mM NaCl, 1% NP40, 1% Triton X-100, ImM DTT, 10 μΙ/mL de coquetéis inibitórios, ImM PMSF (ali Sigma Chemical Co.) e 10 μΙ/mL mistura de nuclease (GE Healthcare Bio-Sciences). Após a sonicação com um sonicador de ultra-som (Hielscher UP200S, 3 χ 40 segundos, amplitude 40 %, ciclo 0,5), a mistura foi centrifugada (13.000 rpm/min a 4°C por minutos). Vinte μg de extrato protéico, contidos no sobrenadante e medidos com o ensaio Bradford (Bio-Rad Laboratories), foram corridos em um gel pronto Bis-Tris a 4-12% NuP AGE® No vex® pequeno (Invitrogen), e transferidos para uma membrana de nitrocelulose, como descrito acima.

A imunodetecção foi realizada por ECL (Quimiluminescência Aperfeiçoada, GE Healthcare Bio-Sciences) e seguida por auto-radiografia em hiperfilme (GE Healthcare Bio- Sciences). As imagens dos filmes revelados foram obtidas com o "ImageScanner" (GE Healthcare Bio-Sciences), gravadas no formato TIFF com o software "ImageMaster Labscan Ver 3.00" (GE Healthcare Bio-Sciences) e analisadas usando o software Image Master 2D Elite version 3.1 (GE Healthcare Bio-Sciences). Identificação Protéica por Espectrometria de

Massa (MS)

Para a análise MS, os pontos de interesse foram removidas dos géis 2-DE preparativos e analisadas pela Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz/Tempo de Vôo (MALDI-TOF) e, quando necessário, por Ionização por Pulverização de Elétrons (ESI).

As proteínas foram descoradas durante a noite com uma solução de bicarbonato de amônio 25 mM e 50% acetonitrilo e então digeridas em gel com tripsina (Promega, Madison, WI, EUA), conforme descrito anteriormente (Hellman U e col., 1995). Para MALDI- TOF MS, 0,5 μί de cada mistura de peptídeos foi aplicado a um disco alvo e deixado secar ao ar. Subseqüentemente, 0,5 μί de solução matriz (ácido a-cyano-4 hidroxicinâmico a 1% p/v em acetonitrilo a 30%, TFA a 0,1 %) foi aplicado à amostra seca e novamente deixada secar. Os espectros foram obtidos usando um espectrômetro Bruker Reflex III MALDI-TOF. A interpretação dos espectros MS dos digestos protéicos foi realizada por "peptide mass fingerprinting" (PMF) usando o software MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu; Chamrad D e col., 2004).

Para os experimentos MS/MS, a mistura de peptídeos tríptica foi dessalinizada e concentrada em dispositivos ZipTicI8 (Millipore). Após a eluição com metanol a 60% mais ácido fórmico a 1%, 4,5 μΐ, da mistura de peptídeos tríptica foram introduzidos em um capilar de borossilicato revestido a ouro (Proxeon Biosystems) e analisados em um espectrômetro de massa de armadilha iônica LCQ Thermo (ThermoFinnigan) equipado com um dispositivo nano ESI. A tensão capilar foi estabelecida em 46 V e a tensão de pulverização em 1,8 kV. Os sinais mais estáveis do espectro de massa de varredura completa foram capturados e fragmentados por dissociação induzida por colisão de baixa energia (CID), com a energia de colisão normalizada variando de 22 a 24%.

Algumas proteínas também foram identificadas por LC-MS/MS usando um espectrômetro de massa de armadilha iônica LCQ DECA XP Plus (ThermoFinnigan) equipado com uma fonte de íons ESI. As separações cromatográficas seguidas por um analisador MS foram corridas em uma coluna C18 Luna, 150 χ 2,0 mm (Phenomenex), usando um instrumento "Surveyor" (autoamostrador e bomba) (ThermoFinnigan) com um volume de injeção de 10 μι e uma taxa de fluxo de 200 μΐ/min.

Para toda a análise dos dados MS/MS, utilizou- se o software Bioworks 3,0 (ThermoFinnigan), a as seqüências resultantes foram comparadas com as seqüências das proteínas humanas presentes nas bases de dados EBI usando o software FASTA (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/; Johnson R e col., 2005).

Análise Estatística

Todas as estatísticas foram calculadas usando o Software GraphPad Prism. Os dados são apresentados como média + SEM (erro padrão da média). Um teste-t desemparelhado bilateral foi utilizado para avaliar a significância da expressão protéica diferente entre os tecidos pancreáticos normais e com PDA. Um valor de P bilateral de < 0,05 foi considerado significativo do ponto de vista estatístico.

Resultados

O proteoma da linhagem celular CF-PAC-1,

geralmente usado como modelo para a expressão protéica e proliferação celular associadas ao PDA (Bouvet M e col, 2001; Szepeshazi K e col., 2005), foi usado para identificar a presença de proteínas e anticorpos que estão associados ao PDA usando o soro de pacientes com PDA como fonte de anticorpos primários.

Os extratos protéicos dessa linhagem celular foram analisados por 2-DE, definindo um mapa bidimensional representativo por coloração com prata. Essa abordagem permite separar as proteínas contidas nesse extrato como "pontos" que podem ser categorizadas de acordo com sua intensidade e posição no gel 2-DE, e para qual quantidade o peso molecular e pi das proteínas pode ser determinado aproximadamente.

Os géis 2-DE foram transferidos para uma membrana de modo a serem analisados por Western blot usando um quadro de soros tanto de pacientes com PDA quanto de pacientes sem PDA (inclusive pacientes saudáveis, pacientes afetados por outros cânceres e pacientes afetados por pancreatite crônica). A comparação entre os diferentes mapas de pontos (e entre a imagem de coloração com prata e a imagem do Western Blot correspondente dos géis 2-DE) leva à identificação dos pontos associadas ao PDA que podem ser adicionalmente caracterizadas, por exemplo, por análise de Espectrometria de Massa dos fragmentos de proteína extraídos de tais pontos usando enzimas que digerem proteínas de maneira controlada (Fig. 1).

Usando essa abordagem, dez pontos foram selecionados e adicionalmente caracterizados como sendo reconhecidas unicamente pelos anticorpos séricos de pacientes com PDA (Fig. 2A). A análise foi restrita a anticorpos da IgG humana, uma vez que o anticorpo secundário que foi utilizado é específico para esse isótipo. Os dez pontos foram removidos dos géis preparativos e analisados por MALDI-TOF MS para identificar a quais proteínas humanas eles correspondem. Usando essa abordagem, nove proteínas diferentes foram identificadas como antígenos associados ao PDA. Dois pares de pontos correspondiam a isoformas da mesma proteína e um ponto continha seqüências pertencendo a duas proteínas diferentes não separadas suficientemente por 2-DE. Todos esses pontos estavam ausentes ou quase indetectáveis no Western Blot realizado usando o soro controle. Os anticorpos primários ligando-se a uma ou mais das proteínas nesses pontos foram identificados em uma porcentagem significativa dos soros obtidos de pacientes com PDA (Tabela I).

Dentre essas proteínas antigênicas associadas ao PDA, pode-se fazer uma distinção entre duas categorias de proteínas, de acordo com o tipo das atividades biológicas para o qual elas são identificadas na literatura. Um primeiro grupo de proteínas compreende enzimas metabólicas: alfa-enolase (presente em dois pontos, cada um correspondendo a uma isoforma específica), triosefosfato isomerase (presente em dois pontos, cada um correspondente a uma isoforma específica), deidrogenase retinal-1, glicose-6-fosfato-l-deidrogenase, fator de alongamento Tu e isocitrato deidrogenase. Um segundo grupo de proteínas foi caracterizado em grande parte como proteínas citoesqueléticas: queratina tipo I citoesquelética 10, e Cofilina 1.

Além das descobertas obtidas usando células CF-PAC-I e soro humano, os extratos pancreáticos que foram obtidos de indivíduos saudáveis e com PDA foram comparados em Western Blot usando anticorpos purificados contra essas proteínas (e não soro humano) como anticorpo primário. Essa análise permite uma quantificação da quantidade total de uma proteína (e não restrita a uma isoforma), mas mostra que essas proteínas foram superexpressas, em várias proporções, nos tecidos pancreáticos obtidos das biópsias de pacientes com PDA (Tabela I).

O valor de diagnóstico dessas proteínas (e da presença de anticorpos específicos conta elas no soro com PDA) foi adicionalmente avaliado fazendo-se a distinção da presença dos pontos para cada proteína entre o soro com PDA obtido de pacientes agrupados de acordo com o estágio da doença, e usando o soro de pacientes com pancreatite crônica como controles.

A análise Western blot mostrou que a presença e a quantidade de autoanticorpos contra as diferentes proteína não é distribuída uniformemente entre os pacientes em diferentes estágios do PDA (Fig. 2B). Os autoanticorpos contra a maioria das proteínas estavam ausentes no soro controle, ao passo que a freqüência do soro com PDA contendo as mesmas aumenta ligeiramente nos pacientes no estágio II da PDA para a maioria das proteínas (abaixo de 25%) com a exceção notável da ENOA 1/2. Essas freqüências no perfil da produção de autoanticorpos é confirmada nos estágios mais avançados, onde, novamente, os autoanticorpos contra as isoformas da alfa-enolase são os mais interessantes, dado o constante aumento na freqüência no PDA de estágio III e de estágio IV.

Conclusões

Uma abordagem baseada em sorológico que combinou a definição do perfil de expressão 2-DE combinado de uma linhagem celular de tumor pancreático humano CF-PAC-1) e a análise Western Blot (usando, como anticorpos primários, a IgG humana no soro de pacientes com PDA) permitiu a identificação de um número restrito de proteínas humanas e de suas isoformas contra as quais os pacientes com PDA produzem uma resposta humoral específica. Com apenas uma exceção (ALIAI), a expressão dessas proteínas foi supraregulada nas biópsias com PDA.

Além do mais, a produção de anticorpos contra essas proteínas associadas ao PDA parece, pelo menos para certos antígenos, aumentar significativamente nos estágios avançados da doença. Esses resultados demonstram como as abordagens sorológicas são adequadas à identificação de possíveis marcadores para diagnóstico precoce do PDA que são, neste caso, em grande parte intracelulares. O mecanismo pelo qual o sistema imunológico reage às proteínas intracelulares não está claro, mas pode ser dependente do ambiente único criado pelo tumor, que pode alterar a localização das enzimas intracelulares nas células tumorais.

A Cofilina 1 (COFl) desempenha uma função na remodelagem da actina, na motilidade e no câncer como uma enzima de despolimerização da actina envolvida na formação do invadopódio (Yamaguchi H e col, 2005) e talvez seja necessária para a direcionalidade da células tumorais em resposta à estimulação do fator de crescimento ou quimiotático (Mouneimne Ge col., 2004). A superexpressão de COFl foi anteriormente observada em associação com modelos animais de PDA (Cecconi D e col., 2003; Sinha P e col, 1999).

A alfa-enolase é uma enzima metabólica altamente conservada tendo diversas propriedades, sendo detectada em diferentes contextos (Pancholi V, 2001; Piast M e col., 2005; Terrier B e col., 2007). Ela pode ser expressa na superfície celular como um receptor de plasminogênio (Lopez- Alemany R e col., 2003) e reconhecida por células B, possivelmente agindo como um ativador de células B (Babu J e col., 2002). Duas isoformas foram detectadas no adenocarcinoma pancreático, mas sem descrever suas propriedades moleculares em termos de modificações pós-traducionais (Shen J e col., 2004).

Autoanticorpos contra a alfa-enolase, existindo como uma única isoforma ou múltiplas isoformas (ma sem evidencia da expressão específica das isoformas fosforiladas da ENOA) foram identificados em muitos modelos biológicos e de doenças diferentes, tal como na retinopatia associada ao câncer (Adamus G e col., 1998; Adamus G e col, 1996), no câncer de pulmão de células não-pequenas e em outros cânceres não pancreáticos (WO 07/072219; US20070172487: He P e col., 2007), na cirrose biliar (Akisawa N e col., 1997), encefalopatias (Fujii A e col., 2005), e doenças autoimunes (Ballot E e col., 2003; Bogdanos D e col., 2004; Gitlits V e col., 2001). As propriedades da alfa-enolase e dos anticorpos ou autoanticorpos específicos da alfa-enolase foram estudadas usando a exibição de fago (Arza B e col., 1997; Kemp E e col., 2002) ou peptídeos (Adamus G e col., 1998; Sato N e col., 2000; Walter M e col., 1995; FujiiAe col, 2005).

Os presentes resultados demonstra que as isoformas específicas da alfa-enolase e os anticorpos para detecção das mesmas são uma ferramenta particularmente útil para o diagnóstico do PDA, dada a freqüência e a produção específica dos autoanticorpos contra duas isoformas específicas dessa proteína (ENOA 1/2) no soro de pacientes com PDA (Tabela I e Fig. 2B). Os anticorpos podem ser específicos para um epítopo comum a todas ou grande parte das isoformas (como os anticorpos purificados utilizados no experimento) ou um epítopo que distingue as isoformas associadas ao PDA das outras (como os que estão presentes no soro com PDA). Além do mais, a progressão do PDA do estágio II para o IV é caracterizada por aumento extremamente significativo da produção de autoanticorpos contra a ENOA 1/2, indicando uma correlação direta com o tamanho do tumor e a capacidade de crescimento.

Uma análise mais detalhada de tais isoformas é importante não apenas para estabelecer o valor preditivo dos autoanticorpos para diagnóstico do PDA, mas também para ter um entendimento mais profundo dos mecanismos moleculares que os ligam ao PDA e possibilitar abordagens terapêuticas contra esse câncer.

Exemplo 2; Análise das isoformas da Alfa- Enolase detectadas por autoanticorpos em células CF-PAC-I

Materiais & métodos

Análise MS

Os pontos foram removidos de géis 2-DE preparativos e analisados pela Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz/Tempo de Vôo (MALDI-TOF) As proteínas foram descoradas durante a noite com uma solução de bicarbonato de amônio 0,025 mol/L e acetonitrilo a 50% e então digeridas em gel com tripsina (Promega, Madison, WI), conforme descrito anteriormente (Hellman U e col., 1995). Para MALDI- TOF MS, 0,5 μί de cada mistura de peptídeos foi aplicado a um disco alvo e deixado secar ao ar. Subseqüentemente, 0,5 μΐ. de solução matriz (ácido a-cyano-4 hidroxicinâmico a 1% p/v em acetonitrilo a 30%, TFA a 0,1%) foi aplicado à amostra seca e novamente deixada secar. Os espectros foram obtidos usando um espectrômetro Bruker Reflex III MALDI-TOF (Bremen, Alemanha). A interpretação dos espectros MS dos digestos protéicos foi realizada por "peptide mass fingerprinting" (PMF) usando o software MS-Fit.

Análise de fosforilação

A análise da seqüência de proteínas da alfa- enolase humana foi realizada usando o seguinte software disponível na Internet: NetPhos [ http://www.cbs.dtu.dk/services/; (Blom N e col., 1999)], NetPhosK [http://www.cbs.dtu.dk/serviccs/; (Blom N e col., 2004)], dbPTM [ http://dbPTM.mbc .nctu.cdu.tw/; (Lee T e col., 2006)], PPSP [ (Xue Y e col., 2006)], and GPS [http://bioinformatics.lcd- ustc.org/gps_web/predict.php ; (Xue Y e col., 2005)].

O tratamento com fosfatase foi realizado usando λ PPase (New England Bio Iabs Inc.) como descrito (Yamagata A e col., 2002) com as seguintes modificações. Célula CF-PAC-I precipitadas (30 χ IO6) foram novamente suspensas por 15 horas em 1 mL de tampão de Iise (1% p/v NP-40, 1% p/v SDS, 50 mM Tris pH 7,6, e 150 mM NaCl coquetel inibidor da protease). O lisado (120 μΐ, correspondendo a 2 mg de proteína) foi levado a um volume final de 1240 μΐ com água deionizada, e depois 20 μΐ de solução de MnC12 20 mM e 20 μΐ de tampão λPPase foram adicionados. Após cada adição, a solução foi misturada suavemente. A mistura foi dividida em alíquotas, e 600 unidades de λ Ppase foram adicionadas a uma alíquota. Após a mistura, as alíquotas foram incubadas por 15 horas a 30°C. As proteínas foram acetona e clorofórmio precipitados e usados para análise 2- DE (vide o Exemplo 1).

A detecção baseada em corante das fosfoproteínas foi realizada em géis 2-DE usando o corante de fluorescência da fosfoproteína ProQ (Molecular Probes) e com corante Sypro Ruby (Bio-Rad) para detecção das proteínas totais, como descrito pela instrução do Fabricante e na literatura (Wu J e col, 2005). Resumidamente, após a 2-DE, a coloração com Pro-Q foi realizada primeiramente misturando os géis em metanol a 50%/Ácido acético a 10% por 30 min. O gel foi então lavado com água destilada e sujeito à coloração com fosfoproteína Pro-Q Diamond por 4 horas. A descoloração foi realizada com lavagens sucessivas de acetato de sódio 50 mM, pH 4,0 contendo acetonitrilo a 20% antes da coloração com o corante de fluorescência Sypro Ruby (Durante a noite).

Análise da expressão das isoformas da ENOA em tecidos pancreáticos de biópsias

Os tecidos pancreáticos obtidos de biópsias tanto de indivíduos saudáveis quanto de pacientes com PDA (Estágio II) foram homogeneizados (Tl8 basic UltraTurrax, IKA) em gelo, em tampão de Iise 400 μι contendo 5 mol/L uréia, 2 mol/L tiouréia, 4% p/v CHAPS, 2% v/v tampão IPG não-linear pH 3-10, 0,08 mol/L ditiotreitol (DTT), 10 nL/mL mistura de nuclease e um vestígio de Azul de Bromofenol. Após a sonicação com um sonicador de ultra-som (Hielscher UP200S, 3 χ 40 s, amplitude 40 %, ciclo 0,5 Hielscher Ultrasonics GmbH), a mistura foi centrifugada (13.000 rpm, 30 minutos a 4°C) com a solução de proteína contida no sobrenadante.

A concentração protéica foi medida com o ensaio de Bradford. Trinta μg do extrato protéico foi corrido em um gel pronto NuP AGE® Novex® 4-12% Bis-Tris pequeno, transferido para uma membrana de nitrocelulose, incubado durante a noite a 4°C com o anticorpo monoclonal anti-alfa- enolase 19/128 (Moscato S e col, 2000) e revelado em Western Blot, como descrito no Exemplo 1.

Produção da ENOA recombinante marcada com Histidina (rENOA).

A proteína recombinante foi purificada a partir de células de E. coli transfectadas com um plasmídeo codificando a seqüência da ENOA humana (faltando apenas os primeiros nove aminoácidos) fusionada a uma marca de Histidina. Resumidamente, as células bacterianas foram colhidas de uma cultura de 1 litro por centrifugação e os precipitados foram novamente suspensos em 20 mL de Tampão de Ligação Nativo (NBB, fosfato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 500 mM, pH 7,8) com a adição de lisozima (100 μg/mL) e sarcosil 0,7%. A suspensão foi levemente agitada por 15 minutos a 4°C. O lisado celular foi sonicado em gelo com pulsos de 40 segundos sob alta intensidade. O lisado foi centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos a 4°C para precipitar a fração insolúvel, que foi novamente suspensa em 10 mL de tampão de Iise de guanidínio (cloridrato de guanidina 6M, fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, pH 7,8), enriquecido com inibidores da protease, por 10 minutos à temperatura ambiente. O lisado foi adicionado à coluna equilibrada (coluna de agarose Ni-NTA, Invitrogen) para permitir a ligação à resina durante 30 minutos a 4°C usando rotação moderada. A resina foi lavada duas vezes com NBB e duas vezes com tampão de Lavagem Nativo (NWB; NBB ao pH 6,0) em seguida. A eluição foi realizada com 10 mL de tampão de eluição de imidazol (350 mM pH=Produção de ENOA recombinante marcada com Histidina (rENOA). As frações eluídas foram dialisadas em água estéril, e então liofilizadas e novamente suspensas em solução tamponada de fosfato de Dulbecco estéril e isenta de pirógeno (DPBS, Sigma). As alíquotas foram estocadas a -20°C. O nível de endotoxinas foi menor do que 0,03 EU/mL no ensaio "Limulus Amebocyte Lysate" (Pyrogent; BioWhittaker).

Análise da expressão das isoformas de ENOA em CF-PAC-I usando soro dos pacientes e Western Blot

Géis 2-DE CF-PACl foram eletrotransferidos para uma membrana de nitrocelulose Hybond ECL (GE Healthcare) como descrito acima. Após o bloqueio por 1 h com TBS contendo leite em pó desnatado a 5%, os blots foram incubados com um grupo de três soros de pacientes com ENOA 1/2+ (diluídos em 1:100 em TBS) em diferentes condições. Em uma série de experimentos, o grupo de soros foi primeiro incubado por 15 horas a 4°C em um agitador com 20 μg/mL de alfa-enolase recombinante (rENOA) antes de realizar a incubação com a membrana. Em outra série de experimentos a membrana foi primeiro incubada com 2 mL de PBS contendo 600 unidades de λPPase, 40 μι de solução de MnC 12 20 mM e 40 μι de tampão λΡΡ38β por 15 horas a 30°C. As membranas foram bloqueadas novamente por 1 hora, lavadas três vezes durante 15 minutos com TTBS e incubadas com um grupo de soros (diluição de 1:100).

A ligação dos anticorpos nos soros às isoformas da ENOA foi revelada usando anticorpos anti-humanos marcados no Western Blot, como descrito no Exemplo 1. Como um controle da quantidade de ENOA imobilizada, a membrana foi novamente sondada com os anticorpos monoclonais murinos anti-enolase

o

19/12° (vide o exemplo 1).

Resultados

Após demonstrar que duas isoformas da alfa- enolase humana são especificamente detectados pelos anticorpos nos soros dos pacientes com PDA, os aspectos que caracterizam tais isoformas (e qualquer outra isoforma dessa proteína que esteja presente nas células CF-PAC-1) foram realizados usando diferentes abordagens.

A comparação do Western blot obtido usando o anticorpo purificado contra alfa-enolase ou o soro de diferentes pacientes com PDA, a coloração dos géis 2-DE com prata e a análise de Espectrometria de Massa mostraram que 4 pontos adicionais, correspondendo a isoformas adicionais da alfa-enolase não associadas ao PDA, estavam presentes nos géis 2-DE, tendo peso molecular similar, mas valores de pi experimentais inferiores à ENOA 1/2 (Tabela II). Essas evidências foram obtidas usando extratos de células CF-PAC-I ou MiaPaCa-2 na análise do gel 2- DE.

Os peptídeos obtidos de tais pontos eram idênticos aos fragmentos da ENOA (e claramente distintos da gama-enolase humana altamente similar; Fig. 3), confirmando a evidência do Western blot de que os pontos devem corresponder a isoformas da ENO, em que apenas a ENOA1/2 está associada ao PDA. As modificações pós-traducionais são aspectos que geralmente diferem de uma isoforma para outra. A análise preliminar pareceu excluir a glicosilação (dada as alterações limitadas no peso molecular) e indicou modificações na fosforilação (dada a redução de pi).

A seqüência da alfa-enolase humana contém vários resíduos de Tirosina, Serina e Treonina que são alvos em potencial para a fosforilação por diferentes quinases. Essa hipótese foi testada expondo o extrato protéico a uma fosfatase amplamente ativa antes da separação em 2-DE para verificar se houve alguma alteração na intensidade dos pontos detectados usando um anticorpo independente da fosforilação, como apresentado na literatura para outras proteínas (Kumar Y e col., 2004). De fato, a intensidade dos pontos de ENOA correspondendo às isoformas mais ácidas (isto é, a ENOA 1/2 associada ao PDA e a isoforma 3 da ENOA; Tabela II) foi claramente reduzida nos extratos de células CF-PAC-I pré- tratados com fosfatase. Além do mais, a análise de Espectrometria de Massa da isoforma 3 da ENOA (mais abundante que a ENOA 1/2) mostrou que os resíduos 55, 57, 200, 236, 237, 257 e 419 são fosforilados nessa isoforma (Fig. 4).

Relatórios anteriores sobre a fosforilação in vivo ou in vitro da alfa-enolase (Cooper J e col, 1984; Eigenbrodt E e col, 1983; Marcus K e col, 2000; Rush J e col, 2005; Stasyk T e col., 2005; Molina H e col., 2007) falharam em indicar, em geral, que pelo menos três resíduos específicos podem ser fosforilados simultaneamente, e, em particular, os resíduos 55, 57, 200, 236, 237, 257 e 419 podem ser encontrados fosforilados nas isoformas da ENOA. Além do mais, a combinação dos resíduos fosforilados na isoforma 3 da ENOA dificilmente podia ser prevista usando uma análise baseada em software da seqüência de proteínas da ENOA, uma vez que há um grande número de sítios candidatos para a fosforilação (Fig. 4). Não podemos esquecer que a isoforma 3 da ENOA pode ter sítios de fosforilação adicionais detectados nesse estágio da análise de Espectrometria de Massa, mas a ENOA 1/2 deve conter resíduos modificados pós- traducionalmente (mais provavelmente fosforilados também, devido ao valor de pi e às descobertas obtidas usando a fosfatase) que os caracterizam a partir da isoforma 3 da ENOA. Particularmente, mais de um dos peptídeos obtidos da isoforma 3 da ENOA, para os quais o estado de fosforilação foi determinado e que contêm sítios de fosforilação candidatos, não apresentam tal modificação. Por exemplo, a Tirosina 44 identificada especificamente na literatura como sendo fosforilada em uma linhagem de células T leucêmicas estabelecida (Rush J e col., 2005) não foi encontrada fosforilada na isoforma 3 da ENOA. De maneira similar, o resíduo 57 que foi identificado como fosforilado em combinação com o resíduo 63 (Molina H e col., 2007) e não com o resíduo 55, como na isoforma 3 da ENOA (Fig. 4).

Uma análise adicional da fosforilação nas isoformas da ENOA detectadas usando tanto soro com PDA quanto anticorpos específicos à ENOA foi realizada comparando- se as imagens obtidas no Western Blot com as obtidas usando corantes corando as proteínas totais no gel 2-DE (coloração com prata ou Sypro Ruby) ou específicas para as fosfoproteínas (Pro-Q Diamond). Essa análise confirmou que apenas a ENOA 1/2 e 3 são fosforiladas nas células CF-PAC-I (Fig. 5A; Tabela II).

A expressão da ENOA também foi testada por Western Blot em tecidos obtidos de pacientes PDA tratados cirurgicamente (Estágio II; n=7) e tecidos pancreáticos normais (n = 1) usando um anticorpo anti-enolase ligando-se a um epítopo específico comum a todas as seis isoformas que são detectadas no soro dos pacientes com PDA. Em seis das setes biópsias com PDA, todas as seis isoformas da ENOA foram detectadas. Em contrapartida, no tecido pancreático normal, apenas quatro isoformas (ENOA 3, 4, 5 e 6) foram claramente detectáveis (Fig. 5B). Dessa forma, pode-se concluir que não apenas os pacientes com PDA produzem anticorpos contra a ENOA 1/2, mas também as isoformas que são superexpressas significativamente nos tecidos pancreáticos com PDA.

A reatividade do soro dos pacientes com PDA contra a ENOA fosforilada foi adicionalmente investigada usando extratos de células CF-PAC-I em 2-DE e Western blot com o intuito de entender se esta reatividade está especificamente direcionada a seus epítopos fosforilados. Uma vez que o soro dos pacientes com PDA reagiu a todas as seis isoformas, eles podem conter anticorpos que reagem tanto a epítopos fosforilados quanto não fosforilados.

Em uma primeira série de experimentos, os

soros foram pré-incubados com a ENOA recombinante humana, que não contém resíduos fosforilados, para verificar se a exposição aos antígenos da ENOA altera a capacidade do soro em reconhecer as isoformas da ENOA na linhagem celular pancreática de referência. De fato, as duas análises Western Blot DE reveleram que a ENOA não-fosforilada reduziu acentuadamente a reatividade apenas às isoformas 3, 4, 5 e 6, sem afetar a reatividade às isoformas 1/2 da ENOA. Essa evidência foi adicionalmente confirmada em outra série de experimentos, em que a membrana foi pré-incubada com uma fosfatase (^PPase) para confirmar que o soro dos pacientes contém anticorpos que reagem especificamente às isoformas 1/2 da ENOA fosforilada. Na ausência da λPPase, os soros reconheceram todas as isoformas da ENOA, ao passo que o tratamento com λPPase reduziu notadamente a reatividade do soro à ENOA 1/2 (Fig. 6).

Uma vez que a mAb anti-ENOA detectou igualmente todas as isoformas nas membranas tratadas ou não- tratadas (dados não apresentados), esses dados demonstram que os anticorpos nos soros dos pacientes com PDA reagem especificamente às isoformas da ENOA 1/2 fosforilada.

Conclusões

Usando diferentes abordagens proteômicas, várias isoformas da ENOA e anticorpos contra as mesmas foram identificados (Adamus G e col, 1998; Adamus G e col., 1996; Akisawa N e col., 1997; Ballot E e col., 2003; Bryborn M e col., 2005; Lubec G e col., 2003; O1Dwyer D e col., 2002). No entanto, esses relatórios não fornecem uma demonstração clara de uma associação entre os estados e posições de fosforilação para a produção de autoanticorpos contra isoformas específicas durante a progressão do PDA.

Outros artigos relatam alterações na intensidade e/ou no número de pontos de alfa-enolase que são detectadas, por exemplo, usando o soro de pacientes no Western Blot de géis 2- DE, associado ao tratamento das células específicas (Baty J e col., 2005; Bottalico L e col., 1993; Kanamoto T e col., 2002) ou doenças (Byrjalsen I e col., 1999; Clauser K e col., 1995; Nakanishi T e col., 2006; Tanaka Y e col., 2006; US20070172487), indicando que isso pode ser devido a modificações pós-traducionais, tal como fosforilação.

Em outros relatórios, a alfa-enolase humana é indicada como uma das várias proteínas superexpressas em amostras de PDA analisadas por géis 2-DE e confirmadas no nível do RNAm e da imunocitoquímica, mas não há menção quanto às fosforilações específicas que caracterizam as isoformas da alfa-enolase associada ao PDA (W004/55548; Shen J e col, 2004; Nakanishi T e col, 2006; Mikuriya K e col, 2007). Dentre o grande número de modificações pós-

traducionais detectadas na alfa-enolase (Tabela III), a fosforilação foi detectada tanto in vivo quanto in vitro em literaturas antigas (Cooper J e col., 1984; Coussens P e col., 1985; Eigenbrodt E e col., 1983; Golden A e col., 1986). Mais recentemente, duas isoformas fosforiladas da alfa-enolase foram detectadas usando géis 2D, um anticorpo anti-fosfotirosina de camundongo comercial (clone 4G10, cod. 05-321; Biomol) e Espectrometria de Massa em plaquetas humanas (Marcus K e col., 2000). Uma variante única fosforilada da alfa-enolase foi detectada nas células tratadas com TGFbetal (linhagem celular MCF-7) usando géis 2D, radiomarcação e Espectrometria de Massa (Stasyk T e col., 2005) ou em células MIAPaCa (uma linhagem celular do câncer pancreático), onde a fosforilação da enolase é reduzida após o tratamento com flavonóides (Lee L e col., 2002). Além do mais, dois sítios de fosforilação localizados nos resíduos Tirosina (44 e 286; Rush J e col., 2005) ou nos resíduos Tirosina e Serina (57 e 63; Molina Hecol., 2007).

No entanto, nenhum desses documentos associou o PDA à fosforilação adicional das isoformas da alfa- enolase já fosforiladas em pelo menos três posições, e aos anticorpos que se ligam a elas.

Exemplo 3: Efeitos dos Anticorpos ligando-se à Alfa-Enolase sobre o Crescimento e a Proliferação das Linhagens Celulares Transformadas Expressando Isoformas fosforiladas da Alfa-enolase.

Materiais & métodos

Ensaio para Proliferação das Linhagens

Celulares

O ensaio in vitro da proliferação celular foi realizado com as linhagens celulares indicadas semeando 2-10 χ 103 células/poço em microplacas de 96 poços em meio de cultura celular completo (RPMI-1640 com Soro Fetal Bovino a 10%) com ou sem o anticorpo monoclonal anti-alfa-enolase 72/1 (Moscato S e col, 2000) ou o anticorpo monoclonal de controle associado ao isótipo IgGl de camundongo (R&D Systems) usado como controle negativo.

Após 44 ou 68 horas, 20 μΐ de solução de metil tetrazólio (MTT; 5mg/mL) foram adicionados a cada poço por 4 horas adicionais a 37°C. O meio foi eliminado e as células foram dissolvidas com DMSO. As placas foram lidas no espectrofotômetro a 540 nanômetros. Resultados

Os efeitos de um anticorpo anti-alfa-enolase sobre o crescimento de linhagens celulares apresentando perfil diferente da expressão de alfa-enolase, conforme determinado por 2-DE e Western Blot, foram testados medindo-se a incorporação de MTT, um composto que é incorporado em células viáveis e se correlaciona com o crescimento, metabolismo e proliferação das células ativas.

Usando um ensaio colorimétrico baseado em MTT, uma inibição significativa da proliferação celular é obtida nas linhagens celulares transformadas que expressam todas as seis isoformas, independente de sua origem pancreática ou não- pancreática. Usando um anticorpo monoclonal de controle associado ao isótipo IgGl ou uma linhagem celular não expressando as três isoformas da ENOA fosforilada, o efeito é mínimo (Tabela IV).

Sendo assim, os anticorpos anti-alfa-enolase são capazes de inibir (ao menos parcialmente) o crescimento e a proliferação de linhagens celulares tendo o perfil de fosforilação específico da alfa-enolase detectada em amostras biológicas associadas ao PDA (tais como soros ou tecidos de biópsias).

Conclusões

Ainda que seja geralmente considerada uma proteína citoplasmática, a alfa-enolase pode ser expressa como uma proteína biologicamente ativa na superfície celular (Arza B e col, 1997; Bergman A e col., 1997; Moscato S e col. 2000; Lopez- Alemany R e col., 2003), bem como um fator solúvel (Babu J e col., 2002; Demir A e col., 2005).

Os dados in vitro mostram que o crescimento das linhagens celulares transformadas é desacelerado pela ligação dos anticorpos ao epítopos presentes nas isoformas da alfa- enolase expressas no espaço extracelular (como um receptor da superfície celular e/ou como uma proteína solúvel), somente se as linhagens celulares expressarem isoformas fosforiladas da alfa- enolase.

Dessa forma, um anticorpo monoclonal que se

liga especificamente a células apresentando isoformas fosforiladas da alfa-enolase pode inibir a proliferação das linhagens celulares transformadas. Esse mecanismo para controle da proliferação celular parece estar presente não apenas no PDA,

mas em outras formas de cânceres apresentando tais aspectos moleculares, e pode ser almejado por anticorpos monoclonais apropriados para aplicações terapêuticas relacionada ao câncer, tal como a preparação de medicamentos para tratamento do PDA e métodos para o diagnóstico e tratamento de pacientes com PDA.

Tabela I. Proteínas reconhecidas pelo Soro dos

Pacientes com PDA como Antígenos

Análise 2-DE, Western Blot e Espectrometria de Massa dos extratos de células CF-PAC-I Western Blot dos extratos pancreáticosb Descrição (Lócus SWISSPROT, Pontos distint OS Pontos que são reconhecidos pelos soros de Norm al PDA (valor Pf SWISSPROT, N2 de Acesso) OS (No.)a Pacientes saudáveis (%) Paciente sem PDA (%) Pacientes com PDA (%) Alfa-enolase (ENOA HUM AN, P06733) 2 (No. 1 e 2) 0/40 (0%) 0/30 (0%) 41/70 (58%) 13,5± 0,2 33±7 Triosefosfato isomerase 2 (No. 0/40 0/30 16/70 15,5± 28±3 (TPIS HUMA Ν, P60174) 3 e 4) (0%) (0%) (23%) 0,6 Queratina, tipo I citoesquelético 10 P136645) 1 (No. 5) 0/40 (0%) 0/30 (0%) 15/70 (21%) 3,5±0, 6 33±4 (<0,00 5) Deidrogenase retinal 1 (ALIAI HU MAN, 1 (No. 6) 0/40 (%) 0/30 (0%) 14/70 (20%) 21,2± 0,6 18±1 (=0,05 ) P00352) Glicose-6- fosfato-1- deidrogenase (G6PD HUM AN, P11413 1 (No. 7) 0/40 (0%) 0/30 (0%) 9/70 (13%) 0,6±0, 06 17,5±5 (< 0,05) Fator de alongamento Tu (EFTU HUM 1 (No. 8) 0/40 (0%) 0/30 (0%) 8/70 (11%) 2±0,6 32±9 (< 0,05) AN, P49411) Isocitrato 28±8 (<0,05 ) deidrogenase (IDHC HUM 1 (No. 9) 0/40 (0%) 0/30 (0%) 9/70 (10%) 3±0,6 AN, 075874) Transgelina-2 (TAGL2 HU MAN, Id (No. 10) 0/40 (0%) 0/30 (0%) 19/70 (27%) ND ND P37802) Cofilina 1 (COF1 HUM AN, P23528) 9±0,6 42±5 (< 0,005)

ND: Não determinado

a Detectadas por coloração com prata e Western Blot nos géis 2-DE como específicas ao PDA (vide a posição dos números de ponto correspondentes na Fig. 1B)

O Western blot foi realizado com anticorpos específicos para cada proteína. A intensidade das linhas reativas é expressa como unidades arbitrárias de intensidade de linha normalizada (média dos três experimentos ± SEM).

c A significância estatística da intensidade de linha normalizada das proteínas selecionadas foi avaliada usando o teste t bilateral emparelhado.

d As proteínas ficam colocalizadas no mesmo

ponto.

Tabela II. Identificação das isoformas da

ENOA reconhecidas pelo soro dos pacientes com PDA

2-DE e Espectrometria de Massa 2-DE e Análise de fosforilação Pontuação Intensidade dos Ponto de Peso Mol (kDa)a Pf para Correspond ência de pontos no Western blot (% da intensidade total) ENOA No. Peptideos0 (Cobertura de seqüência, %) Nenhum a λ PPase 600U λ PPase 1 49,2 6,16 290(18%) 8,5% 0% 2 49,0 6,30 365 (24%) 10,9% 1,9% 3 48,9 6,58 595 (39%) 15,1% 6,2% 4 48,9 6,80 1007 (60%) 48,9 7,26 1127 (65%) 65,5% 91,9% 6 48,8 7,60 449 (27%)

Análise LC-MS/MS

a O valor para a alfa-enolase humana modificada não-pós-traducionalmente é 47 kD

O valor para a alfa-enolase humana modificada não-pós-traducionalmente é 7,0

0 A soma das pontuações de íons de todos os peptídeos não duplicados

Tabela III: Literatura Selecionada Descrevendo Modificações Pós-Traducionais da Alfa-Enolase além da Fosforilação

Modificação Referência Acetilação Iwabata H e col., 2005 Citrulinação Kinloch A e col., 2005 D-Asp Takata T e col., 2006 modificação 4-hidroxinonenal Kapphahn R e col., 2006 Nitração Casoni F e col., 2005; Kanski J e col., 2005; Shin S e col., 2004 Oxidação Butterfield e col., 2006; Castegna A e col., 2002; Ishii T e Uchida K, 2004; Perluigi M e col., 2005 Tirosilação Avram D e col., 2004

Tabela IV: Resultados do Ensaio de Proliferação in vitro

Inibição do crescimento celular (%) Isoformas da ENOA (conforme detectadas pelo 2-DE e Western Blot) Linhagem Celular - Origem -N. de Depósito - Referências anti- ENOA 48 horas IgG de Control e 48 horas 1 2 3 4 5 6 BxPC-3 -PDA fracamente diferenciado - ECACC N. 93129816 - Tan M e col., 1986 37% 0% + + + + + + CF-PAC-I -PDA diferenciado - ECACC N. 91112501 Schoumache r e col., 1990 29% 0%) + + + + + + Mia-Pa-Ca- 2 - PDA não- diferenciado - ECACC N. 85062806 - Yunis A e col., 1977 38% 0% + + + + + + U937 - Linhagem celular do linfoma - ECACC N. 85011440 - Fischer D e col1980 38% 5% + + + + + + MCF-7 Adenocarcin oma de mama - ECACC N. 86012803 - Soule H e col., 1973 15% (2%) 0% (0%) - - - + + +

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<120> NOVOS ANTÍGENOS E ANTICORPOS ASSOCIADOS AO ADENOCARCINOMA DUCTAL PANCREÁTICO

<130> PAF05_aenolvar_WO

<150> EP 06121552.1 <151> 2006-09-29

<150> EP 06126726.6 <151> 2006-12-20

<160> 2

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 434

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Ile Leu Lys Ile His Ala Arg Glu Ile Phe Asp Ser Arg Gly 10 15

Asn Pro Thr vai Glu vai Asp Leu Phe Thr Ser Lys Gly Leu Phe Arg 25 30

Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu 40 45

Ala Leu Glu

Leu Arg Asp Asn Asp Lys Thr Arg Tyr Met Gly Lys Gly vai ser Lys 50 55 60

Ala vai Glu His lie Asn Lys Thr Ile Ala Pro Ala Leu Val Ser Lys 65 70 75 80

Lys Leu Asn vai

Thr 85

Glu Gln Glu Lys

lie 90

Asp Lys Leu Met

lie 95

Glu

Met Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 HO

Gly vai Ser Leu Ala vai Cys Lys Ala Gly Ala Val Glu Lys Gly Val 115 120 125

Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Asp Leu Ala Gly Asn Ser Glu Val Ile 130 135 140

Leu Pro vai Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly ser His Ala Gly 150

155

160

Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro vai Gly Ala Ala 165 170 175

Asn Phe Arg Glu Ala Met Arg Ile Gly Ala Glu Val Tyr His Asn Leu 180 185 190

Lys Asn Val Ile Lys Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn vai Gly 195 200 205

Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Lys Glu Gly Leu 210 215 220

Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Gly Lys Ala Gly Tyr Thr Asp Lys Val 225 230 235 240

vai Ile Gly Met Asp vai Ala Ala Ser Glu Phe Phe Arg Ser Gly Lys 245 250 255

Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Asp Asp Pro Ser Arg Tyr Ile Ser 260 265 270

Pro Asp Gln Leu Ala Asp Leu Tyr Lys Ser Phe Ile Lys Asp Tyr Pro 275 280 285

Val Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Gly Ala Trp 290 295 300

Gln Lys Phe Thr Ala Ser Ala Gly Ile Gln vai Val Gly Asp Asp Leu 305 310 315 320

Thr vai Thr Asn Pro Lys Arg Ile Ala Lys Ala Val Asn Glu Lys Ser 325 330 335

Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys vai Asn Gln Ile Gly Ser vai Thr Glu 340 345 350

Ser Leu Gln Ala Cys Lys Leu Ala Gln Ala Asn Gly Trp Gly Val Met 355 360 365

Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu 370 375 380

vai Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg 385 390 395 400

Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu 3

410

415

Leu Gly Ser Lys Ala Lys Phe Ala Gly Arg Asn Phe Arg Asn Pro Leu 420 425 430

Ala Lys

<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Ile Glu Lys Ile Trp Ala Arg Glu Ile Leu Asp Ser Arg Gly 10 15

Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Tyr Thr Ala Lys Gly Leu Phe Arg 25 30

Ala Ala vai Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly lie Tyr Glu Ala Leu Glu 40 45

Leu Arg Asp Gly Asp Lys Gln Arg Tyr Leu Gly Lys Gly vai Leu Lys 50 55 60

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Gly Leu Ser Val Val Glu Gln Glu Lys Leu Asp Asn Leu Met Leu Glu 85 90 95

Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110

Gly vai ser Leu Ala vai Cys Lys Ala Gly Ala Ala Glu Arg Glu Leu 115 120 125

Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Gln Leu Ala Gly Asn Ser Asp Leu Ile 130 135 140

Leu Pro vai Pro Ala Phe Asn vai Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly 145 150 155 160

Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Glu 165 170 175

Ser Phe Arg Asp Ala Met Arg Leu Gly Ala Glu vai Tyr His Thr Leu 180 185 190 Lys Gly vai Ile Lys Asp Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn Val Gly 195 200 205

Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn ser Glu Ala Leu

210 215 220

Glu Leu Val Lys Glu Ala Ile Asp Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Ile

225 230 235 240

vai lie Gly Met Asp vai Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Arg Asp Gly Lys 245 250 255

Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Thr Asp Pro Ser Arg Tyr Ile Thr 260 265 270

Gly Asp Gln Leu Gly Ala Leu Tyr Gln Asp Phe Val Arg Asp Tyr Pro 275 280 285

vai vai Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Ala Ala Trp

290 295 300

Ser Lys Phe Thr Ala Asn vai Gly Ile Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu 305 310 315 320

Thr vai Thr Asn Pro Lys Arg Ile Glu Arg Ala Val Glu Glu Lys Ala 325 330 335

Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser vai Thr Glu 340 345 350

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vai Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu 370 375 380

Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg 385 390 395 400

Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Met Arg Ile Glu Glu Glu 405 410 415

Leu Gly Asp Glu Ala Arg Phe Ala Gly His Asn Phe Arg Asn Pro Ser 420 425 430

vai Leu

Claims

1. Isoforma da alfa-enolase humana, caracterizada por ser fosforilada em pelo menos 3 posições.

2. Isoformas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que as 3 posições são escolhidas dentre Treonina 55, Tirosina 57, Tirosina 200, Tirosina 236, Treonina 237, Tirosina 257 e Serina 419.

3. Anticorpo, caracterizado por ligar-se especificamente a uma isoforma da alfa-enolase de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação3, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal ou um fragmento de anticorpo.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por ser fusionado ou conjugadao a uma molécula de marcação detectável.

6. Uso de uma isoforma da anti-alfa-enolase, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou de um anticorpo que se liga a uma isoforma da anti-alfa-enolase de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser para o diagnóstico do Adenocarcinoma Ductal Pancreático.

7. Métodos para o diagnóstico do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (PDA), caracterizados por compreender a detecção de uma isoforma da anti-alfa-enolase, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, e/ou a detecção de um anticorpo que se liga a uma isoforma da anti-alfa-enolase de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

8. Kits para o diagnóstico do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (PDA), caracterizados por compreender uma isoforma da anti-alfa-enolase, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, e/ou um anticorpo que se liga a uma isoforma da anti-alfa- enolase de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

9. Uso de um anticorpo anti-alfa-enolase, caracterizado por ser para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento do Adenocarcinoma Ductal Pancreático.

10. Composição farmacêutica para o tratamento do Adenocarcinoma Ductal Pancreático, caracterizada por compreender um anticorpo anti-alfa-enolase.