BRPI0717393A2

BRPI0717393A2 - Método para detectar a presença de uma molécula alvo luminescente em uma amostra, aparelho para preparar um ensaio, sistema de detecção óptica, e, kit para realizar um ensaio

Info

Publication number: BRPI0717393A2
Application number: BRPI0717393-8A
Authority: BR
Inventors: M. J. W. Van Herpen Maarten; J. W. Klunder Derk; R. Stapert Hendrik
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics N.V.
Priority date: 2006-10-24
Filing date: 2007-10-19
Publication date: 2013-10-15
Also published as: RU2009119452A; US20180074047A1; ATE493654T1; US10670589B2; RU2446402C2; CN101548186A; JP2010507796A; DE602007011651D1; US20100197515A1; EP2076773A1; WO2008050274A1; US10101321B2; EP2076773B1

Description

"MÉTODO PARA DETECTAR A PRESENÇA DE UMA MOLÉCULA ALVO LUMINESCENTE EM UMA AMOSTRA, APARELHO PARA PREPARAR UM ENSAIO, SISTEMA DE DETECÇÃO ÓPTICA, E, KIT PARA REALIZAR UM ENSAIO" CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a um método para detectar a presença de uma molécula alvo em uma amostra e, em particular, a um método incluindo contactar a amostra com um substrato, o substrato subseqüentemente sendo lavado em uma etapa de lavagem. Além disso, a invenção refere-se a um aparelho para preparar um ensaio, a um sistema de detecção óptica para detectar uma molécula alvo em um ensaio, a um substrato produzido de acordo com o método e a um kit para realizar um ensaio. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os métodos de detecção para moléculas biológicas particulares (biomolécula) são diversos e muitas diferentes abordagens são presentemente disponíveis à pessoa hábil. A detecção de moléculas biológicas específicas tem uma faixa de importantes aplicações práticas, incluindo identificação genética para fins diagnósticos.

Em geral, a detecção de espécime biológico (o "alvo") tal como polinucleotídeos, DNA, RNA, células e anticorpos pode especialmente ser realizada em uma formação, por exemplo, uma chamada bioformação (ou microformação), após o que as correspondentes moléculas de sonda são ligadas em vários sítios da formação. Os exemplos de sonda alvo incluem: DNA/RNA-oligonucleotídeo, anticorpo-antígeno, anticorpo-célula/proteína, hormônio-receptor hormônio etc. Quando o alvo é ligado ou hibridizado em uma correspondente molécula de sonda, a detecção da biomolécula alvo pode ser realizada por uma variedade de métodos ópticos, eletrônicos e mesmo micromecânicos.

Uma técnica comumente usada para detecção de uma ligação molecular em bioformações é a detecção óptica de alvos rotulados fluorescentemente, também conhecidos como um "rótulo'"' ou "marcador". Em geral, um rótulo pode ser qualquer agente que seja detectável com respeito a sua distribuição física e/ou à intensidade do sinal de saída que ele produz. Os agentes fluorescentes são largamente usados, porém alternativas incluem agentes fosforescentes, agentes eletroluminescentes, agentes quimioluminescentes, agentes bioluminescentes etc.

Em geral, um problema de detecção de luminescência refere-se à separação da luz luminescente com baixa intensidade da luz não- luminescente iluminando, geralmente com alta intensidade. A confiabilidade da detecção da luminescência, portanto, depende muito das características ópticas dos filtros espectrais que são usados no processo de separação. A função do filtro espectral pode incluir duas etapas: um primeiro filtro (chamado o 'filtro de excitação') preferivelmente transmite os raios com um comprimento de onda sobrepondo-se ao espectro de excitação do rótulo e bloqueia todos os raios com um comprimento de onda que está dentro do espectro da janela de detecção. Um segundo filtro (chamado 'filtro emissor' ou 'filtro de detecção") preferivelmente bloqueia toda a luz da iluminação e transmite somente os raios luminescentes. A atenuação (poder de bloqueio de um conjunto de filtro típico é melhor do que ΙΟ-6. Para este fim, podem também ser consideradas as propriedades ópticas do substrato.

A US 2005/0048571 descreve um substrato para reduzir a auto-fluorescência com relação à detecção óptica de bioformações. Na descrição, uma camada porosa do substrato é tingida com um agente colorante. Uma desvantagem do tingimento do substrato é entretanto que ele torna o substrato mais dispendioso e pode limitar o número de diferentes tipos de substratos que podem ser usados.

Observou-se que meios aperfeiçoados para detecção de luminescência seriam benéficos e, em conseqüência, planejou a presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção procura prover um meio aperfeiçoado de manipular detecção de luminescência, tal como com relação à realização de um bioensaio e, preferivelmente, a invenção alivia, mitiga ou elimina um ou mais das desvantagens acima ou outras, sozinha ou em qualquer combinação.

A invenção é definida pelas reivindicações independentes. As reivindicações dependentes definem formas de realização vantajosas.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é provido um método para detectar a presença de uma molécula alvo em uma amostra.

As moléculas alvo podem ser biomoléculas conjugadas com

fluoróforos.

A radiação é tipicamente radiação eletromagnética na faixa visível ou quase-visível, na faixa infravermelha (IR) ou na ultravioleta (UV).

No contexto da presente invenção, os termos "fluorescência" e "fosforescência" são para ser entendidos em um amplo sentido como a luz emitida resultante de um processo em que a luz foi absorvida em um certo comprimento de onda por uma molécula ou átomo e, subseqüentemente, emitida no mesmo ou outro comprimento de onda após o tempo de vida da molécula/átomo em questão. A luz emitida é com freqüência no espectro de luz visível (VIS), espectro UV e espectro IR, mas não precisa ser limitada a eles.

Em uma forma de realização, as moléculas alvo são detectadas irradiando-se o substrato com um feixe de radiação e, subseqüentemente, detectando-se o feixe de luminescência resultante do substrato, isto é, a luminescência das moléculas alvo. A parte de luminescência da radiação detectada pode ser fotoluminescência e, em particular, fluorescência ou fosforescência. O substrato para imobilizar as moléculas de sonda pode ser uma bioformação arranjada para análise de alvos biológicos. Tipicamente, a bioformação pode compreender uma pluralidade de lugares em que as moléculas alvo são imobilizadas. Neste contexto, um lugar é para ser entendido como uma área tendo uma certa extensão. O lugar pode ter uma configuração 2D ou 3D. A bioformação pode compreender uma pastilha de silício, uma placa de vidro, uma membrana porosa, tal como um náilon, nitrocelulose etc.

As propriedades ópticas dos substratos usados para imobilizar as moléculas de sonda podem ser tais que os substratos têm uma muito elevada reflexibilidade. A quantidade de dispersão depende, inter alia, da diferença entre o índice de refração do ar e o substrato. Devido à elevada reflexibilidade, a radiação incidente pode ter problemas para penetrar no substrato, que reduz o grau de radiação incidente que é capaz de excitar os fluoróforos que se ligaram ao substrato, especialmente dentro do substrato. Além disso, devido à elevada reflexibilidade, uma grande parte da luz refletida pode, em algumas configurações, ser refletida em direção ao detector.

A invenção é particularmente mas não exclusivamente vantajosa para reduzir a reflexibilidade do substrato. Utilizando-se um fluido substancialmente correspondente em índice durante uma etapa de lavagem, a reflexibilidade do substrato pode ser grandemente reduzida. Além disso, a quantidade de luz penetrando no substrato será aumentada, resultando em uma melhoria na relação da radiação incidente para a radiação de luminescência.

Em uma forma de realização vantajosa, o índice refrativo do fluido de lavagem está dentro da faixa do índice refrativo do substrato mais/menos 10%. Em princípio, é vantajoso obter-se uma correspondência tão boa quanto possível dos índices refrativos, entretanto uma capacidade de substituição pode ser vantajosa pelo menos em situações em que um tipo específico de fluido de lavagem é requerido para dada sonda e/ou moléculas alvo e/ou substrato. A correspondência do índice refrativo do fluido de lavagem em relação ao índice refrativo do substrato pode ser melhor do que mais/menos 8%, mais/menos 6%, mais/menos 4%, mais/menos 2%.

Em uma forma de realização vantajosa, o fluido de lavagem é uma solução aquosa de açúcar (sacarose) em água, onde a percentagem em peso do açúcar é entre 50% a 80%. As soluções aquosas de sacarose pode ser vantajosa, uma vez que muitos conjugados de fluoróforo dissolvem-se facilmente em tal fluido.

As formas de realização da invenção podem vantajosamente ser aplicadas com um substrato poroso, uma vez que uma elevada reflexão do substrato pode ser mesmo mais problemática para os substratos porosos, devido à dispersão dos poros.

Em uma forma de realização do método de acordo com a presente invenção, as moléculas alvo são biomoléculas conjugadas com fluoróforos.

Em uma forma de realização do método de acordo com a presente invenção, o substrato é um bioensaio preparado com moléculas de sonda e as moléculas alvo quimicamente ligam-se às moléculas de sonda presentes no substrato. Em várias formas de realização vantajosas, filtros de passagem de radiação, espelhos e possíveis outros componentes ópticos podem ser introduzidos no trajeto do feixe, da fonte de radiação ao detector.

Por exemplo, as moléculas alvo são detectadas irradiando-se o substrato com um feixe de radiação e, subseqüentemente, detectando-se o feixe resultante do substrato.

O feixe resultante pode ser transmitido através do substrato ou refletido do substrato.

Em uma forma de realização, um primeiro filtro de passagem de radiação (2) é introduzido no trajeto do feixe entre a fonte de radiação (36) e o substrato (3, 30 - 32).

Em uma forma de realização, um segundo filtro de passagem de radiação (4) é introduzido no trajeto do feixe entre o substrato (3, 30 — 32) e o detector (35).

Em uma forma de realização, o trajeto do feixe compreende ainda um espelho dicróico (5).

O método da presente invenção pode vantajosamente ser pelo menos parcialmente automatizado, p. ex., implementando-se o método em um aparelho ou um sistema de detecção de acordo com outros aspectos da invenção.

Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um aparelho para preparar um ensaio.

Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a um sistema de detecção óptica para detectar uma molécula alvo em um ensaio.

O segundo e terceiro aspectos da presente invenção podem prover um aparelho e um sistema de detecção para detectar a presença e, opcionalmente, quantidade de um ou mais alvos biológicos, isto é, moléculas alvo de uma amostra. O sistema pode detectar alvos que incluem mas não são limitados a polinucleotídeos, DNA, RNA, células e anticorpos. Os sistemas de detecção biológica são com freqüência altamente complicados e a presente invenção é vantajosa em prover sistemas com uma elevada confiabilidade dos dados coletados.

Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a um substrato produzido de acordo com o método do primeiro aspecto.

Em um quinto aspecto, a invenção refere-se a um kit para realizar um ensaio.

Em geral, vários aspectos da invenção podem ser combinados e acoplados em qualquer maneira possível dentro do escopo da invenção. Estes e outros aspectos, características e/ou vantagens da invenção serão evidentes pelas e elucidados com referência às formas de realização descritas a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS As formas de realização da invenção serão descritas, somente

como exemplo, com referência aos desenhos, em que

A Fig. 1 ilustra esquematicamente duas formas de realização gerais da instalação óptica;

A Fig. 2 ilustra características espectrais para a instalação da Fig. 1B, junto com os espectros do corante Cy5;

A Fig. 3 ilustra uma forma de realização de um método para detectar a presença de uma molécula alvo em uma amostra;

A Fig. 4 mostra um gráfico do índice de refração, n, das soluções de sacarose aquosa, em função da percentagem em peso, p. DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

Em pesquisa biológica e diagnósticos médicos, muitos biomarcadores são detectados com o auxílio de um rótulo fluorescente fixado. O aparelho geralmente usado é um scanner fluorescente ou microscópio, porém para aplicações específicas equipamento dedicado é produzido com base nos mesmos princípios de detecção.

Em uma forma de realização geral da presente invenção, uma instalação óptica é usada onde pelo menos dois filtros espectrais são aplicados. A Fig. 1 esquematicamente ilustra duas formas de realização gerais. A Fig. IA mostra uma ilustração esquemática de um dispositivo de detecção de fluorescência em um modo de transmissão, em que o feixe resultante é transmitido através do substrato, enquanto que a Fig. IB mostra uma ilustração esquemática de um dispositivo de detecção de fluorescência em um modo de reflexão, em que o feixe resultante é refletido do substrato. Na Fig. IA e IB um feixe de luz IA, IB é emitido em direção a um substrato 3. A fim de separar a forma de feixe de luz fluorescente resultante, os filtros espectrais de luz não-fluorescente são aplicados.

A função do filtro espectral consiste de duas etapas: um primeiro filtro de radiação 2 (chamado o 'filtro de excitação') sendo introduzido no trajeto do feixe entre a fonte de radiação (luz) e o substrato. O filtro de excitação preferivelmente transmite os raios com um comprimento de onda sobrepondo-se com o espectro de excitação do rótulo e bloqueia todos os raios com um comprimento de onda que esteja dentro do espectro da janela de detecção. Um segundo filtro de radiação 4 (chamado o 'filtro emissor' ou, alternativamente, um 'filtro de detecção') é introduzido no trajeto do feixe, o filtro emissor preferivelmente bloqueia ou pelo menos substancialmente suprime a luz de iluminação e transmite somente os raios fluorescentes. A atenuação (potência de bloqueio) de um conjunto de filtro típico é melhor do que IO'6.

Na Fig. IB um divisor de feixe 5 é além disso aplicado, o divisor de feixe podendo, por exemplo, ser aplicado em uma situação em que o substrato não é transparente. Em uma forma de realização alternativa, um espelho dicróico pode ser aplicado em vez de um divisor de feixe, um espelho dicróico reflete a luz de excitação abaixo de um certo comprimento de onda e transmite luz acima deste comprimento de onda. Um espelho dicróico, portanto, pode também atuar como um filtro emissor 4, um filtro emissor separado pode ainda ser usado para desempenho aumentado, porém não pode ser necessário.

Em uma forma de realização, o substrato pode ser iluminado por numerosos LEDs de alta potência, tais como 2 a 10 LEDs vermelhos, uma instalação de campo escuro podendo ser aplicada. A luz resultante sendo detectada por uma câmera CCD (não mostrada) com o filtro emissor montado em frente da câmera. Como um exemplo de um fluoróforo, o corante Cy5 pode ser usado. O substrato 3 pode ser preparado em qualquer maneira adequada de preparar um substrato, tal como um substrato de bioformação para uso em um bioensaio. Uma método de ensaio de formação típico envolve imobilizar as moléculas de sonda em distintos locais do substrato. Uma solução contendo moléculas alvo que se ligam com as sondas fixadas é colocada em contato com as sondas ligadas sob condições suficientes para promover a ligação dos alvos da solução nas sondas complementares sobre o substrato, para formar um complexo de ligação que é ligado à superfície do substrato. A bioformação pode ter uma dimensão na faixa micrométrica ou mesmo na faixa milimétrica. O número de diferentes locais com distintas

características de hibridização do bioensaio pode variar de em torno de 1 a

2 6 1000 por mm nas formações atuais e mesmo mais elevado, p. ex., até 10

locais por mm2. Dentro de um local da formação, moléculas de sonda

tipicamente idênticas são imobilizadas.

A Fig. 2 ilustra uma forma de realização de possíveis

características espectrais envolvidas para a instalação da Fig. 1B, junto com

os espectros do corante Cy5. A Fig. 2 é gerada pelo uso do aplicativo on-line

Curv-o-matic, acessível pelo Omega Optical website

(www.omegafilters.com). A Fig. 2 mostra a transmissão, T, em percentagem

em função do comprimento de onda, λ, em nanômetros dos espectros

envolvidos, para o conjunto de filtro Omega XFl 10-2.

A Fig. 2 mostra o espectro de excitação 20 de Cy5 tendo um pico de excitação a 649 nm junto com o correspondente espectro de emissão 21 tendo um pico de emissão a 670 nm. A diferença entre comprimento de onda de iluminação e comprimento de onda de fluorescência, por fóton, é chamada "Stokes shift". O Stokes shift de Cy5 é 21 nm.

O filtro de excitação é um filtro de excitação Omega 630AF50 exibindo o espectro indicado por 22 (largura de banda 50 nm, centro a 630 nm). O filtro emissor é um filtro emissor Omega 695AF55, exibindo o espectro indicado por 23 (largura de banda 55 nm, centro a 695 nm). O espelho dicróico é escolhido de modo que o espectro do espelho, como indicado por 24, seja tal que reflita a luz incidente no comprimento de onda da radiação de excitação, enquanto que transmite a resultante luz mudada em Stoke. O conjunto de filtro específico e o espelho dicróico são providos como um exemplo e podem não necessariamente ser aplicados em todas as formas de realização. Por exemplo, como mencionado com relação à Fig. 1B, um filtro emissor pode ser dispensado quando usando-se um espelho dicróico.

A Tabela 1 mostra os resultados de um experimento, em que as propriedades ópticas foram medidas de substratos de Náilon porosos (Nytran N e Nytran SPC) 3. O experimento foi realizado irradiando-se o substrato no comprimento de onda incidente de 650 nm e subseqüentemente detectando-se o feixe resultante do substrato. Dois tipos de experimentos foram realizados, um com um substrato seco e um que foi exposto a água em uma etapa de lavagem.

Tabela 1

Nytran N Umido Seco Transmitância 31,1 % 4,2 % Refletância 68,7 % 95,3 % Absorvência 0,1 % 0,5 % Nytran SPC Transmitância 33,8 % 5,3 % Refletância 65,4 % 94,4 % Absorvência 0,8 % 0,4 %

Como pode ser visto na Tabela 1, o substrato tem uma muito elevada reflexividade, especialmente quando seco. A causa desta elevada reflexividade é dispersão devida à elevada porosidade do substrato. O grau de dispersão depende da diferença entre o índice refrativo do ar o substrato. Comparado com o ar, o índice de água é muito mais perto do índice do substrato. Esta é a razão pela qual um substrato úmido tem uma mais baixa reflexão do que um substrato seco. De acordo com a presente invenção, um fluido substancialmente correspondendo em índice é aplicado durante a etapa de lavagem do ensaio e, desse modo, a reflexividade do substrato pode ser grandemente reduzida, até um valor típico de 5 % de refletividade.

A melhoria da intensidade de excitação pode ser pelo menos um fator de 3, em comparação com a água como o fluido de lavagem, porém pode ser tão elevado quanto 20, em comparação com um substrato seco.

A melhoria da relação de excitação e radiação de fluorescência pode ser de pelo menos 14, em comparação com a água, e pode ser tão elevada quanto 19, em comparação com um substrato seco.

A Fig. 3 ilustra uma forma de realização de um método para detectar a presença de uma molécula alvo em uma amostra de acordo com a presente invenção, onde uma bioformação é preparada usando-se como uma etapa de lavagem. A Fig. 3A a 3C ilustra pelo menos algumas das etapas envolvidas.

Nas etapas anteriores à etapa da Fig. 3A, um fluido de amostra foi preparado com biomoléculas conjugadas com fluoróforos. Na etapa 37 da Fig. 3A, a amostra 6 é contactada com o substrato 30 escoando-se o fluido amostra através do substrato 30, fazendo com que as biomoléculas alvo com fluoróforos fixem-se a locais de ligação específicos do substrato. Deve ser entendido que as moléculas alvo podem ser contactadas com o substrato em maneiras alternativas, p. ex., pela aplicação de deposição de gota a partir de jatos pulsantes ou por outros meios adequados.

Durante as etapas de preparação nem todos os fluoróforos podem ser esperados ligarem-se a uma molécula de sonda. Isto significa que, além dos fluoróforos que se ligaram ao substrato 30, há também fluoróforos não ligados, que não são fixados ao substrato, porém estão ainda presentes. Uma etapa de lavagem 38 é aplicada para remover ou pelo menos diluir quaisquer conjugados-fluoróforo não ligados, deixando somente conjugados- fluoróforos atrás do substrato, como ilustrado na Fig. 3B. Durante esta etapa uma líquido de lavagem 7 é prensado através do substrato 31. Na presente invenção, o líquido de lavagem 7 é escolhido de modo que tenha o índice refrativo do fluido de lavagem substancialmente correspondente ao índice de refração do substrato 31.

A Fig. 3 C ilustra uma etapa de detecção 39, a fim de detectar a presença dos resultantes complexos de ligação no substrato, a etapa de detecção tendo sido descrita com relação à Fig 1. Em razão de um fluido de substancialmente correspondência de índice ter sido usado durante a etapa de lavagem (Fig. 3B), a reflexividade do substrato 32 foi reduzida consideravelmente, melhorando a sensibilidade da etapa de detecção. A detecção é tipicamente aplicada em continuação direta da etapa de lavagem, de modo que o substrato é ainda úmido.

Em diferentes formas de realização da presente invenção, diferentes fluidos de correspondência de índice podem ser usados. Em uma forma de realização, um óleo pode ser usado como um exemplo de um óleo adequado; Zeiss Immersol 518F, com η = 1518 a 23°C pode ser usado. Em outras formas de realização, soluções aquosas de materiais densos podem ser aplicadas. Em uma forma de realização específica, uma solução aquosa de açúcar é usada. Pode ser vantajoso utilizar-se uma solução de 60% a 70% de açúcar (sacarose etc.), desse modo obtendo-se um índice refrativo de 1,45 (vide Fig. 4 ilustrando o índice refrativo, n, de soluções aquosas de sacarose, em função da percentagem em peso, p). Soluções aquosas de sacarose podem um fluido de correspondência de índice preferido, porque os conjugados- fíuoróforo dissolvem-se facilmente em tal fluido, tornando o fluido adequado para tanto a etapa de lavagem como para etapa de detecção.

Deve ser entendido que em forma de realização alternativa, etapas de lavagem adicionais podem ser aplicadas. Tais etapas de lavagem adicionais podem ser aplicadas com diferentes dos mesmos fluidos de lavagem, na situação em que diferentes fluidos de lavagem são usados para diferentes etapas de lavagem, pelo menos a última etapa de lavagem sendo conduzida usando-se um fluido de lavagem sendo substancialmente correspondente em índice refrativo com o substrato.

As etapas da Fig. 3 e possíveis etapas adicionais podem ser realizadas, possivelmente em uma maneira automatizada ou semi- automatizada, em um aparelho para preparar um ensaio e/ou um sistema de detecção óptica. Tais aparelhos e sistemas podem incluir uma unidade de manipulação 33 para receber um substrato e uma unidade de lavagem 34 para realizar uma etapa de lavagem no substrato. A unidade de manipulação e a unidade de lavagem podem ser corporificada na mesma unidade ou a amostra pode ser movida entre unidades. As formas de realização dos sistemas de detecção óptica também compreendem uma fonte de radiação 36, tal como um ou mais diodos leiser e um detector de radiação 35, tal como um CCD.

Kits para uso em ensaios de detecção de alvo são também providos. Os kits pelo menos incluem um fluido de lavagem, o fluido de lavagem sendo substancialmente correspondente em índice a um substrato, e instruções para utilizar o fluido de lavagem. Os kits podem ainda incluir um ou mais componentes adicionais a serem usados quando realizando um ensaio de detecção alvo, tal como um ou mais substratos, reagentes de preparação de amostra, tampões, rótulos etc. As instruções para uso podem ser providas em formato de papel, ser registradas em um meio de gravação adequado, ser providas na forma de instruções de como acessar as instruções via uma fonte remota, p. ex., a Internet etc.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com relação a formas de realização especificadas, não se pretende que seja limitada à forma específica exposta aqui. Sem dúvida, o escopo da presente invenção é limitado somente pelas reivindicações anexas. Nas reivindicações o termo "compreendendo" não exclui a presença de outros elementos ou etapas. Adicionalmente, embora aspectos individuais possam ser incluídos em diferentes reivindicações, estes podem possivelmente ser vantajosamente combinados e a inclusão de diferentes reivindicações não implica em que uma combinação de aspectos não seja exeqüível e/ou vantajosa. Além disso, referências singulares não excluem uma pluralidade. Assim, referências a "um", "uma", "primeiro(a)", "segundo(a)" etc. não exclui uma pluralidade. Além disso, sinais de referência nas reivindicações não serão interpretados como limitando o escopo.

Claims

1. Método para detectar a presença de uma molécula alvo luminescente em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender: (a) contactar a amostra (37) com um substrato tendo imobilizado sobre ele moléculas de sonda que especificamente ligam-se à molécula alvo luminescente; (b) lavar o substrato (38) em uma etapa de lavagem por um fluido de lavagem, a fim de remover ou diluir moléculas alvo luminescentes não ligadas; (c) detectar a presença de complexos de ligação resultantes (39) no substrato, para determinar se a molécula alvo luminescente está presente na amostra: em que a presença das moléculas alvo luminescentes é detectada por detectar a luminescência das moléculas alvo, e o fluido de lavagem é substancialmente correspondente em índice refrativo ao substrato.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o índice refrativo do fluido de lavagem estar dentro da faixa do índice refrativo do substrato mais 10% do índice refrativo do substrato menos 10%.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o fluido de lavagem ser uma solução aquosa de açúcar em água, onde a percentagem em peso do açúcar é entre 50% a 80%.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda pelo menos uma etapa de lavagem adicional antes da etapa de lavagem (b).

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o substrato ser um substrato poroso.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as moléculas alvo luminescentes ligarem-se quimicamente às moléculas de sonda presentes no substrato.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a molécula alvo luminescente é uma molécula alvo fluorescente.

8. Aparelho para preparar um ensaio, caracterizado pelo fato de compreender: - uma unidade de manipulação (33) para receber um substrato tendo imobilizado sobre ele moléculas de sonda que especificamente se ligam a uma molécula alvo luminescente, e para contactar uma amostra com o substrato (3, 30-32); - uma unidade de lavagem (35) para realizar uma etapa de lavagem no substrato, usando-se um fluido de lavagem, a fim de remover ou diluir as moléculas alvo luminescentes não ligadas, o fluido de lavagem sendo substancialmente correspondente em índice refrativo ao substrato.

9. Sistema de detecção óptica para detectar uma molécula alvo luminescente em um ensaio usando o método como definido na reivindicação1, caracterizado pelo fato de compreender: - uma unidade de manipulação (33) para receber um substrato tendo imobilizado sobre ele moléculas de sonda que especificamente se ligam a uma molécula alvo luminescente e para contactar uma amostra com o substrato; - uma unidade de lavagem (34) para realizar uma etapa de lavagem no substrato, usando-se um fluido de lavagem, a fim de remover ou diluir moléculas alvo luminescentes não ligadas, o fluido de lavagem sendo substancialmente correspondente em índice refrativo ao substrato; - uma fonte de radiação para irradiar o substrato com um feixe de irradiação; - um detector (35, 36) arranjado para detectar um feixe de luminescência do substrato resultando da irradiação do substrato, e que o detector é para detectar a presença dos complexos de ligação resultantes no substrato, para determinar se a molécula alvo luminescente está presente na amostra.

10. Kit para realizar um ensaio, caracterizado pelo fato de compreender: - um fluido de lavagem, o fluido de lavagem sendo substancialmente correspondente em índice a um substrato; - um rótulo luminescente arranjado para formar junto com um alvo uma molécula alvo luminescente; - instruções para utilizar o fluido de lavagem em um método como definido na reivindicação 1.

11. Kit de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o rótulo luminescente é um rótulo fluorescente.