BRPI0717431A2 - Composições e métodos de diagnóstico e tratamento do câncer - Google Patents

Description

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DO CÂN- CER”

Descrição da invenção

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito ao campo da oncologia e fornece novas composi- ções e métodos de diagnóstico e tratamento do câncer. A presente invenção fornece anti- corpos contra um marcador de células tronco cancerosas para o diagnóstico e tratamento de tumores sólidos.

Fundamentos da Invenção

O câncer é uma das principais causas de morte no mundo desenvolvido, com mais de um milhão de pessoas diagnosticadas com câncer e 500.000 mortes por ano nos Esta- dos Unidos sozinhos. Globalmente, estima-se que mais de 1 em cada 3 pessoas irão de- senvolver algum tipo de câncer durante a sua vida. Há mais de 200 tipos diferentes de cân- cer, quatro dos quais - mama, pulmão, cólon e próstata - representam mais de metade dos novos casos (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26).

O câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres, com uma estimativa 12% das mulheres em risco de desenvolver a doença durante a sua vida. Embora as taxas de mortalidade tenham diminuído devido à detecção e à melhoria tratamentos anteriores, o câncer de mama continua a ser uma das principais causas de morte em mulheres de meia- idade, o câncer de mama metastásico e ainda é uma doença incurável. Na apresentação, a maioria dos pacientes com câncer de mama metastásico têm apenas um ou dois sistemas orgânicos afetados, mas à medida que a doença progride, múltiplos sítios se tornam usual- mente envolvidos. As localizações mais comuns de envolvimento metastásico são recorrên- cias Iocorregionais na pele e tecidos moles da parede torácica, assim como nas áreas das axilas e supraclaviculares. O local mais comum para metástase remota é o osso (30 - 40% das metástases remotas), seguido pelos pulmões e fígado. E, embora apenas cerca de 1- 5% das mulheres com câncer de mama recém diagnosticado tenham metástase remota no momento do diagnóstico, aproximadamente 50% dos pacientes com doença local eventual- mente têm recaída com metástase no prazo de cinco anos. Atualmente, a sobrevida média proveniente de manifestação de metástases remotas é de cerca de três anos.

Os atuais métodos de diagnóstico e de escalada do câncer de mama incluem o sis- tema tumor-nodo-metástase (TNM) que se baseia no tamanho do tumor, presença de tumor dos gânglios linfáticos, e na presença de metástases remotas (American Joint Committee on Cancer: AJCC Cancer Staging Manual. Philadelphia, Pa.: Lippincott-Raven Publishers, 5th ed., 1997, pp 171-180; Harris, J R: “Staging of breast carcinoma” in Harris, J. R., Hellman, S.,' Henderson, I. C, Kinne D. W. (eds.): Breast Diseases. Philadelphia, Lippincott, 1991). Estes parâmetros são utilizados para proporcionar um prognóstico e selecionar uma terapia adequada. O aspecto morfológico do tumor também pode ser avaliado, mas devido ao fato de que tumores com aparência histopatológica semelhante podem apresentar significativa variabilidade clínica, esta abordagem tem sérias limitações. Finalmente ensaios para mar- cadores da superfície celular podem ser usados para dividir certos tipos de tumores em sub- 5 classes. Por exemplo, um fator considerado no prognóstico e tratamento do câncer de ma- ma é a presença do receptor estrogênio (ER) na medida que cânceres da mama ER- positivos normalmente respondem mais facilmente às terapias hormonais, como o tamoxife- no ou inibidores da aromatase que os tumores ER-negativos. No entanto, estas análises, embora úteis, são apenas parcialmente preditivas do comportamento clínico dos tumores 10 mamários, e há muita diversidade fenotípica presente em cânceres da mama que as atuais ferramentas diagnosticas não conseguem detectar e atuais terapias para tratar a falham.

O câncer de próstata é o câncer mais comum em homens no mundo desenvolvido, representando um valor estimado de 33% de todos os novos casos de câncer os E.U.A., sendo a segunda causa mais freqüente de morte (Jemal et al., 2003, CA Cancer J. Clin. 15 53:5-26). Desde a introdução da análise do antígeno prostático específico (PSA) no sangue, a detecção precoce do câncer de próstata tem melhorado drasticamente as taxas de sobre- vida; a taxa de sobrevida de cinco anos para pacientes com cânceres de próstata em está- gio local e regional no momento do diagnóstico está próxima dos 100%. Ainda mais de 50% dos pacientes irão eventualmente desenvolver doença metastática ou localmente avançadas . 20 (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16).

Atualmente a prostatectomia radical e a radioterapia fornecem tratamento curativo para a maioria dos tumores localizados da próstata. No entanto, são muito limitadas as op- ções terapêuticas para casos avançados. Para doença metastática, ablação androgênio com agonista do hormônio liberador do hormônio Iuteinizante (LHRH), isoladamente ou em 25 combinação com anti-andrógenos é o tratamento padrão. No entanto, apesar do bloqueio androgênico máximo, a doença evolui com a maioria desenvolvendo doença andrógeno- independente. Atualmente não existe um tratamento uniforme aceite para câncer de próstata refratário a hormônio, e regimes quimioterápicos são comumente usados (Muthuramalingam et al., 2004, Clin. Oncol. 16:505-16; Trojan et al., 2005, Anticancer Res. 25: 551-61).

30 O câncer colorretal é o terceiro câncer mais comum e a quarta causa mais freqüen-

te de morte por câncer no mundo inteiro (Weitz et al., 2005, Lancet 365:153-65). Cerca de 5- 10% de todos os cânceres colorretais são hereditários com uma das principais formas sendo polipose adenomatosa familiar (FAP), uma doença hereditária autossômica dominante na qual cerca de 80% dos indivíduos afetados contêm uma mutação germinativa no gene poly- 35 posis coli adenomatoso (APC). Os carcinomas colorretais invadem localmente por cresci- mento circunferencial e em qualquer parte por espalhamento linfático, hetatogenono, trans- peritoneal, e perineural. O sítio mais comum do envolvimento extralinfático é o fígado, com os pulmões sendo o órgão extra-abdominal mais frequentemente afetado. Outros locais de disseminação hematogênica incluem os ossos, rins, glândulas adrenais e cérebro.

O atual sistema de escalada de câncer colorretal é baseado no grau de penetração do tumor através da parede intestinal e da presença ou ausência de envolvimento nodal.

5 Este sistema de escalada é definido pelas três classificações principais de Duke: doença A de Duke está confinada a camada submucosa do cólon ou reto; doença B de Duke tem tu- mores que invadem através da musculatura própria e podem penetrar na parede do cólon ou reto, e doença C de Duke inclui qualquer grau de invasão da parede intestinal com me- tástase Iinfonodal regional. Embora a resseção cirúrgica seja altamente eficaz para câncer 10 colorretal em fase inicial, oferecendo taxas de cura de 95% em pacientes da doença A de Duke, a taxa é reduzida para 75% em pacientes B de Duke e a presença de Iinfonodos posi- tivos na doença C de Duke prediz uma probabilidade 60% de reincidência no prazo de cinco anos. Tratamento de doentes C de Duke com um ciclo de quimioterapia pós-operatória re- duz a taxa de recorrência para 40% a 50%, e é agora o padrão de atendimento para esses 15 pacientes.

O câncer de pulmão é o câncer mais comum em todo o mundo, o terceiro câncer mais comumente diagnosticado nos Estados Unidos, e de longe a mais freqüente causa de morte por câncer (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166: 1166-96; Jemal et al., 2003, CA Cancer J. CHN. 53:5-26). O tabagismo é responsável por um número estimado . 20 de acreditavam 87% de todas as neoplasias pulmonares tornando-a a doença mais mortífe- ra evitável. O câncer de pulmão é dividido em dois grandes tipos, que representam mais de 90% de todas as neoplasias pulmonares: câncer de pulmão de células pequenas (CPPC) e câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC). CPPC representa de 15 a 20% dos casos e se caracteriza por sua origem nas grandes vias respiratórias centrais e composição 25 histológica de folhas de células pequenas com pouco citoplasma. CPPC é mais agressivo do que CPNPC, crescendo rapidamente e fazendo metástase cedo. CPNPC representa 80 a 85% de todos os casos e é subdividido em três grandes subtipos com base na histologia: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas (carcinoma epidermóide) e carcinoma indiferenciado de células grandes.

30 O câncer de pulmão tipicamente se apresenta tardio em seu curso e, assim, tem

uma sobrevida média de apenas 6-12 meses após o diagnóstico e taxa de sobrevida global de 5 anos de apenas 5% a 10%. Embora cirurgia ofereça a melhor chance de cura, apenas uma pequena fração dos pacientes com câncer de pulmão são elegíveis com a maioria con- tando com quimioterapia e radioterapia. Apesar das tentativas de manipular o tempo e a 35 intensidade dessas doses terapêuticas, as taxas de sobrevida aumentaram pouco nos últi- mos 15 anos (Spiro et al., 2002, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166:1166-96).

Estes quatro cânceres, assim como muitos outros, apresentam-se como tumores sólidos que são compostos de populações heterogêneas de células. Por exemplo, cânceres da mama são uma mistura de células normais e células cancerosas, incluindo as células mesenquimais (estromais), as células inflamatórias e células endoteliais. Vários modelos diferentes de câncer fornecem explicações para a presença dessa heterogeneidade. Um modelo, o modelo clássico de câncer, sustenta que distintas populações de células cancero- sas possuem todas a capacidade de se proliferar e da surgimento a um novo tumor. No mo- delo clássico, a heterogeneidade de células tumorais resulta de fatores ambientais, bem como mutações em curso no seio células cancerosas, resultando em uma população diver- sificada de células tumorigênicas. Este modelo se baseia na ideia de que todas as popula- ções de células tumorais têm algum grau de potencial tumorigênico. (Pandis et al., 1998, Genes Chromosomes & Cancer 12:122-129; Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer Res. 57:1597- 1604; Bonsing et al., 1993, Cancer 71:382-391; Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes

& Cancer 82: 173-183; Beerman H et al., 1991, Citometry 12:147-54; Aubele Werner M & M1 1999, Analyt. Cell. Caminho. 19:53; Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60:3884).

Um modelo alternativo para a heterogeneidade das células tumorais deriva do im- pacto das células tronco no desenvolvimento tumoral. De acordo com este modelo, o câncer surge a partir de desregulação dos mecanismos que controlam desenvolvimento e manu- tenção do tecido normal. (Beachy et al., 2004, Nature 432:324). Durante o desenvolvimento normal dos animais, a maioria ou todas as células de tecidos normais são obtidas a partir de precursores, chamados de células tronco (Morrison et al., 1997, Cell 88:287-98; Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9: 216-21; Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.

11:35-71). As células tronco são células que: (1) possuem uma vasta capacidade proliferati- va; 2) são capazes de divisão celular assimétrica para gerar um ou mais tipos de progênie com reduzida proliferativas e/ou potencial de desenvolvimento, e (3) são capazes de divi- sões celulares simétricas para a auto-renovação ou auto-manutenção. O exemplo mais bem estudado de removação de célula adulta pela diferenciação de células tronco hematopoiéti- cas é o sistema onde precursores desenvolvimentistas imaturos (células tronco hematopoé- ticas e as progenitoras) respondem aos sinais moleculares para formar os diversos tipos de células sanguíneas e linfóides. Outras células, incluindo células do intestino, sistema dutal mamário, e da pele são constantemente alimentadas a partir de uma pequena população de células em cada tecido, e estudos recentes sugerem que a maioria dos outros tecidos adul- tos também abrigam células tronco, incluindo o cérebro. Tumores derivados de uma “célula tronco de tumor sólido” (ou “células tronco cancerosas” de um tumor sólido) em seguida ex- perimentam desenvolvimento caótico através de ambas as rodadas simétricas e assimétri- cas das divisões celulares. Neste modelo de células tronco, os tumores sólidos contêm um distinto e limitado (possivelmente até mesmo raro) subconjunto de células que partilham as propriedades das “células tronco” normais, pelo fato de que proliferam extensivamente e eficientemente tanto para dar lugar a adicionais células tronco de tumor sólido (auto- renovação) e a maioria das células tumorais de um tumor sólido que careça de potencial tumorigênico. Com efeito, as mutações dentro de uma população de células tronco de mais idade pode dar início a formação de células tronco cancerosas que estão subjacentes ao crescimento e manutenção de tumores e cuja presença contribui para o fracasso das atuais abordagens terapêuticas.

A natureza das células tronco do câncer foi primeiramente revelada no câncer de sangue, leucemia mielóide aguda (LMA) (Lapidot et al., 1994, Nature 17:645-8). Mais recen- temente foi demonstrado que tumores malignos de mama e de cólon humanos similarmente abrigam uma pequena, distinta população de células tronco cancerosas enriquecidas quanto a capacidade de formar tumores em camundongos immunodeficientes. Uma população de linhagem celular ESA +, CD44+, CD24-/low, em tumores da mama foi descoberta ser 50 vezes mais enriquecida quanto a células tumorigênicas em comparação com células tumo- rais não fracionadas (Al-Hajj et al., 2003, Proc Nat Acad. SCL 100 :3983-8). Do mesmo mo- do, a subpopulação de ESA+, CD44+ em tumores colorretais foi descoberta incluir exclusi- vamente células tumorigênicas, e a adição de CD166 a esse perfil foi capaz de enriquecer ainda mais quanto às células tronco do câncer de cólon (CoCSC) (Dalerba et al. 2007 Proc Nat Acad 7 Sd 104: 10158-63). A capacidade de prospectivamente isolar as células cance- rosas tumorigênicas tem permitido a investigação de rotas biológicas críticas que subjazem tumorigenicidade nestas células e, portanto, tornam promissor o desenvolvimento de melho- res testes diagnósticos e terapêutica para pacientes com câncer. A invenção está direciona- da para esse propósito.

Sumário

São providos anticorpos que especificamente se ligam a um epítopo ligando 4 tipo Delta humano (DLL4) formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e domínio DSL humano (SEQ ID NO: 26 ), onde o anticorpo influencia o crescimento tumoral. Também é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente revelação e um veículo farmaceuticamente aceitável. É também fornecido um método de tratamento de câncer que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo DLL4 da presente revelação.

Os objetivos adicionais e vantagens da invenção serão estabelecidos em parte, na descrição que se segue e, em parte, serão evidentes a partir da descrição, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetivos e as vantagens da invenção serão atingi- dos e conseguidos por meio dos elementos e combinações particularmente assinalados nas reivindicações anexas. É para ser entendido que tanto a descrição geral apresentada até agora e a descrição detalhada apresentada a seguir são apenas representativas e explana- tória, não sendo restrições para a invenção de acordo com o reivindicado. Os desenhos a- nexos, os quais são aqui incorporados e constituem uma parte dessa especificação, ilustram as diversas modalidades da invenção e, juntamente com a descrição, servem para explanar os princípios da invenção. Na especificação nas reivindicações anexas, as formas singula- res “um”, “uma”, e “o” incluem a referência plural, a menos que o contexto claramente indi- que o contrário.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: Ligações específicas de anticorpos anti-DLL4 21M18 a proteína DLL4 de superfície celular natural. Células HEK 293 co-transfectadas com DLL4 de comprimento completo e GFP foram incubadas com anticorpos anti-DLL4 e ordenadas por FACS. Anti- 10 corpos anti-DLL4 21M14 e 21M18 mostram ligações específicas às células que expressam DLL4 como revelado pela relação linear entre a ligação anticorpo DLL4 e a expressão de GFP.

Figura 2: anticorpos DLL4 bloqueiam a interação de DLL4 humano com o receptor Notch. A) células HEK 293 expressando DLL4 foram incubadas com proteína Notch-Fc ou 15 controle-Fc na presença de anticorpos DLL4 ou controle. A alta intensidade de fluorescência indica a presença de ligação Notch e DLL4 na presença de um anticorpo controle (linha 2) e anticorpos anti-DLL4 21M12 (linha 5). Baixa intensidade de fluorescência indica a ausência de interações Notch e DLL4 na ausência de Notch (linha 1) e a ruptura de interações Notch e DLL4 em presença de anticorpos anti-DLL4 21M18 (linha 3) e 21M14 (linha 4). B) células 20 HEK 293 expressando Notchl, foram incubadas com um ou outro de DLL4-Fc humano ou murino. A ligação foi detectada por anti-Fc marcado por fluorescência e analisado por VACS, com intensidade de alta fluorescência indicativo da ligação entre DLL4 e células que expressam Incisura I. 21M18 bloqueia a ligação de DLL4 humano (quadrados cinza), mas não DLL4 murinos (círculos negros) ao receptor Notch.

Figura 3: Mapeamento de Epítopo de Anticorpos Anti-DLL4. A) proteínas de fusão

com apagamentos abrigados do domínio extracelular de DLL4 humanos foram incubadas em um teste ELISA com anticorpos anti-DLL4 21M14 e 21M18. não foi detectada ligação acima da linha de referência em presença de proteínas de fusão contendo entre aminoáci- dos 1 a 154 (aa 1-96, barra branca com pontos pretos, aa 1-154, barra preta com pontos 30 brancos). Em contrapartida, ligações foram detectadas entre anticorpos anti-DLL4 e todas as proteínas de fusão contendo entre aminoácidos 1 a 127, incluindo o domínio DSL, de DLL4 (aa 1-217, barra com listras horizontais; aa 1-251, com barra com listras horizontais; aa 1-283, barra hachurada; aa 1-323, barra cinza com pontos brancos). B) Western blots revelam expressão de proteínas de apagamento do C-terminal de DLL4 humano (h-DLL4) e 35 proteínas quiméricas de fusão DLL4 murino-humano (anti-hFc; topo). As proteínas de fusão DLL4 incluem um ou mais dos domínios 1 a 6, em que domínios 1 e 2 são aminoácidos N- terminais 1 a 154; domínio 3 é o domínio DSL de aminoácidos 155-217; e domínios 4, 5 e 6 são cada um, um domínio FEG como ilustrado graficamente em C. Anticorpos 21M18 reco- nhecem proteína h-DLL4 apenas na presença de aminoácidos 1-217 (hDLL4 dom 1-3). Em contraste com a proteína humana, proteínas de fusão que compreende aminoácidos DLL4 murinos (m-DLL4) 1-217 (dom1-3) não são reconhecidos pelo 21M18 (m-DLL4 dom1-3: h- 5 DLL4dom4-6). Já as proteínas de fusão que compreende aminoácidos h-DLL4 1-154 (doml- 2), na presença de dom3 murinos são reconhecidas por 21M18 (h-DLL4 dom1-2: m- DLL4dom3-6). C) Um resumo esquemático de ligação de dados de B é mostrado. A estrutu- ra do domínio de DLL4 é mostrada no topo com as proteínas de fusão DLL4 enumeradas e apresentadas esquematicamente no lado esquerdo com a proteína humana representada 10 pelo cinza claro e proteína de camundongo representada por cinza escuro. 21M18 Iigante a cada fragmento DLL4 é indicada por um “+” versus um D) análise ELISA de 21M18 Iigan- te fragmentos de proteína DLL4 contendo substituição de correspondentes resíduos murinos para resíduos humanos em posições selecionadas. 21M18 exibe ligação defeituosa aos fragmentos de proteína DLL4 com substituições em aminoácidos 68, 69, e 71 (substituição 15 de valina, valina e prolina), ou em aminoácidos 142 e 144 (substituição de Iisina e alanina). E) análise ELISA da ligação de anticorpos 21M18 e 21M21 para fragmentos de proteína DLL4 contendo a correspondente substituição de resíduos murinos para resíduos humanos em posições selecionadas dentro do domínio DSL. O anticorpo 21M21 exibe ligação defei- tuosa para fragmentos de proteína DLL4 contendo substituições aminoácidos em aminoáci- . 20 dos 161 e 162 (substituição de treonina e serina). Como 21M21 não prejudica a função DLL4 nos ensaios de sinalização (ver Figura 6), isso demonstra que nem todos os anticor- pos que se ligam à região DSL impactam a função DLL4.

Figura 4: Seqüência de alinhamento da região variável de cadeia pesada. A) Anti- corpo 21M18 murino parental (m-21M18-Vh, topo) da seqüência (m-21M18-Vh, topo) huma- 25 na expressou seqüência de quadro operativo (h-EST-quadro operativo, média) e a seqüên- cia da região variável de cadeia pesada 21M18 humanizada (21M18 - H7, em baixo) são mostrados com resíduos aminoácidos conservados sombreados em preto. As três CDRs são marcadas mostrando retenção das seqüências parentais murino no anticorpo 21M18 humanizado. O resíduo cisteína na posição Kabat 52a na CDR2 foi alterada para um resí- 30 duo serina e valina, sem perda da ligação específica a DII4 em 21M18 H7 e 21M18H9, res- pectivamente. As substituições dentro da região da quadro operativo mostrada em 4A são numeradas 1-6 com as correspondentes posições Kabat na cadeia Vh 16, 20, 27, 28, 38, 48. B) Seqüência anticorpo 21M18 murino parental (m-21M18-Vh, topo), seqüência linha germi- nal humana Vh (h-germinal-Vh, meio), e a seqüência da região variável de cadeia pesada 35 21M18 humanizada (21M18 - H2, fundo) são mostrados com resíduos aminoácidos conser- vados sombreados em preto. As três CDRs são marcadas mostrando retenção das seqüên- cias murinos parentais no anticorpo 21M18 humanizado. O resíduo cisteína Kabat na posi- ção 52a na CDR2 foi alterada para uma serina e valina um resíduo, sem perda de especifi- cidade Iigante para D114 em 21M18 H7 e 21M18 H9, respectivamente. Os cinco retidos mu- rinos resíduos dentro do quadro região variável da cadeia pesada de todas as variantes são numerados 1-5 Kabat em suas respectivas posições 20, 28, 38, 48 e 69.

Figura 5: Seqüência de alinhamento da região variável de cadeia leve. Seqüência

anticorpo 21M18 murino parental (m-21M18-VK, topo), seqüência linha genética humana (h- VK linha genética, em baixo), e seqüência da região variável de cadeia leve 21M18 humani- zada (21M18 - L2, meio) são mostrados com resíduos aminoácidos conservados sombreado em preto. As três CDRs são marcadas mostrando retenção das seqüências murinos paren- 10 tais no anticorpo 21M18 humanizado. Os dois resíduos murinos retidos dentro da região do quadro operativo variável são numeradas 1-2 em suas correspondentes posições Kabat 22 e 36.

Figura 6: Anticorpos DLL4 bloqueiam Sinalização da Incisura. Células HeLa co- transfectadas com vetores mensageiros Hesl-Luc e Renilla Iuciferase foram incubados com proteína DLL4-Fc na presença ou ausência de anticorpos anti-DLL4. Os níveis diminuídos de Iuciferase demonstram perda da ativação da rota Incisura DLL4 pelos anticorpos 21M14 e 21M18.

Figura 7: anticorpos DLL4 Modulam a Expressão de Genes de Incisura Alvo em Tumores de Cólon. A) Tumores de cólon C8 tratados com anticorpos anti-DLL4 21M18 ou 20 PBS (controle) foram isolados e a expressão de HES1 e ATOH1 determinada por RT-PCR quantitativo. A expressão gênica relativa (eixo y) em comparação às células controle trata- das mostra que o tratamento com anticorpos anti-DLL4 diminuiu expressão de HES1 e au- mentou a expressão de ATOH-1. B) Relação da Expressão relativa (eixo y) em colônias de células tumorais de cólon OMP-C11 depletadas em linhagem camundongo é mostrada. Co- 25 lônias C11 recobertas com células 3T3 que superexpressam DLL4 (3T3+DLL4) apresenta- ram um aumento na proporção da expressão HES1/AT0H1 comparado células de cólon so- brepostas com células 3T3 (3T3) ou não expostas ao recobrimento celular (Controle). Este aumento na relação de expressão HES1/ATOH1 foi eliminou pela incubação com 10 ug / mL anticorpos 21M18 (21M18) ou 5 uM-inibidor secretase dbz (5 uM GSI).

Figura 8: Anticorpos DLL4 Reduzem o crescimento tumoral. Camundongos

NOD/SCID foram injetados com células UM-C4 dissociadas e tratados com anti-anticorpos DLL4 21M18 (n = 5) ou PBS (n = 10). O tratamento com anticorpos 21M18 (diamantes) re- duziu o crescimento tumoral, a partir do dia 23, e até 54% de redução foi observada por vol- ta do dia 48, em comparação com controles injetados com PBS (quadrados pretos).

Figura 9: O tratamento com anticorpos DLL4 Reduz o Número de Células Tumorais

Proliferativas in Vivo. Tumores de cólon C8 tratados com anticorpos anti-DLL4 21M18 ou controle Ab foram isoladas. A imunocitoquímica com um anticorpo contra Ki67 mostrou uma redução no número de células proliferativas em tumores tratados com 21M18 em compara- ção ao controle.

Figura 10: O tratamento com anticorpos DLL4, em combinação com Fluorouracil (5- FU) reduz o crescimento tumoral. Camundongos NOD/SCID foram injetados com células 5 UM-C4 dissociadas e tratados com anti-anticorpos DLL4 ou PBS na presença ou ausência de 5-FU. A) O tratamento com anticorpos 21M18, em combinação com 5-FU (círculos, linha tracejada) reduziu o crescimento tumoral 46 dias após a injeção de células tumorais em um maior grau do que um ou outro tratamento com 5-FU (triângulo, linha sólida) ou anticorpos 21M18 ( diamantes, linha pontilhada) isoladamente e em maior grau do que controles injeta- 10 dos com PBS (quadrados, linha sólida). O volume tumoral em mm3 está indicado no eixo y. B) Marcações de medições de tumor no dia 46 de cada animal individualmente. Cada ponto representa um animal. O tratamento com anticorpos 21M18 ou 5-FU cada reduziu o tama- nho do tumor (mm3) em comparação ao controle. Além disso, a combinação do tratamento com anticorpos 21M18 e 5-FU tinham um efeito aditivo, reduzindo o tamanho do tumor a 1/5 15 do tamanho do controle.

Figura 11:0 tratamento com anticorpos DLL4 em associação com anticorpos anti- EGFR Reduz o crescimento tumoral. Camundongos NOD/SCDD foram injetados com célu- las UM-C4 dissociadas e tratados com anti-anticorpos DLL4 ou PBS na presença ou ausên- cia de anticorpos anti-EGFR. Marcações das medições do tumor no dia 46 de cada animal . 20 são mostradas. Cada ponto representa um animal. O tratamento com anticorpos 21M18 ou anticorpos anti-EGFR cada reduziu o tamanho do tumor (mm3) em comparação ao controle. Além disso, a combinação do tratamento com 21M18 e anticorpos anti-EGFR teve um efeito aditivo, reduzindo o tamanho do tumor, para menos de 1/5 do tamanho do controle.

Figura 12: Anti-DLL4 mab 21M18 e irinotecano Atuam Sinergicamente para inibir o 25 crescimento do Tumor de Cólon. Camundongos NOD/SCID foram injetados com células C8 dissociadas e tratados com anticorpos anti-DLL4 ou anticorpos controle na presença ou au- sência de irinotecano. A) O tratamento com anticorpos 21M18 murinos (círculos) ou irinote- cano (triângulos) isoladamente cada reduziu o volume tumoral (eixo y mm3) comparado aos animais tratados com controle (quadrados pretos). No entanto, a combinação do tratamento 30 com irinotecano e 21M18 (triângulos invertidos) teve um efeito sinérgico, eliminando comple- tamente o crescimento tumoral por até 55 dias pós-injeção de células. B) O tratamento com 21M18 humanizado (h21M18) em associação com irinotecano (irtcn) (círculos) tem eficácia semelhante como 21M18 murinos (m21M18) (triângulos) em comparação com o anticorpo (quadrados pretos), ou controle anticorpo com irinotecano (triângulos).

35 Figura 13: Tratamento com Combinação de Anti-DLL4 21M18 e irinotecano Impede

o Re-Crescimento de Tumor de Cólon. Camundongos NOD/SCID foram injetados com célu- las C8 dissociadas e tratados com irinotecano ou irinotecano em combinação com anticor- pos anti-DLL4 21M18 (η = 10 por grupo). A) O tratamento com irinotecano sozinho abrandou o crescimento do tumor de cólon, mas o crescimento continuou após a cessação do trata- mento no dia 56 (* seta) em todos menos dois dos animais tratados. B) Em contrapartida, o tratamento com uma combinação de irinotecano e anticorpos anti-DLL4 21M18 eliminou 5 crescimento do tumor de cólon tanto durante o tratamento e durante um período de até cin- co semanas após a cessação do tratamento no dia 56 em todos os dez animais tratados. Cada linha representa a curva de crescimento do próprio animal.

Figura 14: Tratamento de Combinação de Anti-DLL4 21M18 e irinotecano inibe o crescimento de tumores de cólon estabelecidos de modo mais eficaz que o tratamento por 10 terapia simples. Camundongos NOD/SCID foram injetados com células C8 dissociadas e tratados com anticorpos anti-DLL4 ou anticorpos controle na presença ou ausência de Irino- tecano. O tratamento com anticorpos 21M18 (diamantes) ou irinotecano (triângulos) isola- damente cada um reduziu o volume tumoral (eixo y mm3) comparado aos animais tratados com controle (quadrados pretos). No entanto, a combinação do tratamento com 21M18 plus 15 irinotecano (triângulos invertidos) inibiu o crescimento tumoral mais eficazmente do que um ou outro de 21M18 ou irinotecano em tratamento sozinho.

Figura 15: Tumores tratados com anticorpos anti-DLL4 Apresentam reduzidos nú- meros de células tumorigênicas. Camundongos imunocomprometidos (n = 10 por grupo) foram injetados com doses decrescentes de células tumorais provenientes do experimento 20 apresentado na Figura 14, que tinham sido tratadas com um ou outro de anticorpo controle, irinotecano mais anticorpo controle, Anticorpos DLL4 21M18 sozinho, ou uma combinação de por si só, ou uma combinação de Anticorpos DLL4 21M18 e irinotecano (combinação). A) Os resultados do tumor se assumem no dia 81. Volume tumoral (mm3) foi marcado em gráfi- co comparado ao número de células tumorais humanas injetadas: 900, 300, 100 e 50 para 25 cada grupo de tratamento. O número de animais com tumores detectáveis nos dez animais injetados para cada dose de célula tumoral é registrada abaixo do gráfico do volume tumoral para cada dose de célula com células tumorais tratadas com controle à esquerda (círculos cheios), células tumorais tratadas com anticorpo anti-DLL4 21M18 segundo à esquerda (quadrados vazados), células tumoraistratadas com Irinotecan segunda à direita (triângulos 30 cheios), e células tumorais tradadas com Combinação à direita (círculos vazados). B) A fre- quência de células tronco no dia 81 foi calculada. A proporção de células tronco cancerosas (eixo y) de controle tratado (à esquerda) provenientes de células tumorais tratadas controle (esquerda) comparado com tratadas com anti-DLL4 (segunda a partir de da esquereda), somente tratadas com Irinotecan (segunda a partir de da direita), e tratadas por Combinação 35 (direita) é marcada com o intervalo de 95% de confiança. O grupo tratado com anti-DLL4 tem uma diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (*) e o grupo por combinação é significativamente diferente versus tanto os grupos controle (*) e irinote- cano sozinho (**). Figura 16: Tratamento de Combinação Anti-DLL4 21M18 e irinotecan Retarda Reci- diva do Tumor. Camundongos imunocomprometidos foram injetados com células C8 disso- ciadas e tumores estabelecidos de aproximadamente 150 mm3 foram tratados com uma combinação de irinotecano (45 mg/kg, administrada duas vezes por semana) com um ou outro de anticorpos anti-DLL4 21M18 anticardiolipina ou controle de 32 dias após o trata- mento que irinotecano foi interrompida. O tratamento com o anticorpo ou o controlo ou 21M18 continuou. Recorrência de tumores pelo volume tumoral (eixo y) foi retardda em ani- mais tratados com 21M18 (triângulos) quando comparado ao grupo controle (círculos).

Figura 17: Tratamento de Combinação Anti-DLL4 21M18 e irinotecano Retarda Re- cidiva Tumoral. Os animais provenientes do experimento mostrado na Figura 16 são mos- trados. O volume total do tumor (eixo y) de cada animal é apresentado 47 dias apapós o término do tratamento por irinotecan.

Figura 18. Combinação anti-DLL4 21M18 e anti-VEGF reduz o crescimento tumoral. Células tumorais C17 foram implantadas e tratamento foi iniciado dois dias mais tarde, com um ou outro de anticorpo controle (quadrados pretos, linha sólida), 21M18 (triângulos, linha tracejada), anti-VEGF (diamantes, éolid linha), ou a combinação de ambos anticorpos (círcu- los, linhas pontilhadas). Cada anticorpo foi dosado em 10 mg/kg, administrada duas vezes por semana e havia 10 animais por grupo. Ambos os 21M18 e anti-VEGF reduziu o cresci- mento tumoral e a combinação foi mais eficaz do que um ou outro anticorpo único.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES

O termo “anticorpos” é utilizado para significar uma molécula imunoglobulina que reconhece e liga-se a um alvo específico, como uma proteína, polipeptídeos, peptídeos, carboidratos, polinucleotídeo, lipídeo, ou combinações dos anteriores, pelo menos, através de um sítio de reconhecimento de antígeno na região variável da molécula imunoglobulina. Em certas modalidades, anticorpos da presente invenção incluem anticorpos antagonistas que especificamente se ligam a uma proteína marcadora de células tronco cancerosas e interferem com, por exemplo, ligação ao ligando, dimerização do receptor, expressão de uma proteína marcadora de células tronco cancerosas e/ou sinalização mais adiante de uma proteína marcadora de células tronco cancerosas. Em certas modalidades, os anticorpos revelados incluem agonistas anticorpos que especificamente se ligam a um proteína marca- dora de células tronco cancerosas e promovem, por exemplo, ligação o ligando, dimerização receptor, e/ou de sinalização por proteína marcadora de células tronco cancerosas. Em cer- tas modalidades, os anticorpos revelados não interferem ou promovem a atividade biológica de uma proteína marcadora de células tronco cancerosas mas inibe o crescimento tumoral, por exemplo, por meio de internalização de anticorpos e/ou o reconhecimento por parte da sistema imunológico. Conforme utilizado aqui, o termo “anticorpos” engloba anticorpos poli- clonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, fragmentos anticorpo (como Fab1 Fab ', F (ab') 2, e fragmentos Fv), mutantes Fv de cadeia única (scFv, anticorpos multiespecíficos tais como anticorpos biespecíficos produzidos a partir de pelo menos dois anticorpos intac- tos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, proteínas de fu- 5 são que compreende uma porção de determinação de antígeno de um anticorpo, e qualquer outra molécula imunoglobulina modificada que compreende um sítio de reconhecimento an- tígeno, desde que os anticorpos apresentem as desejadas atividades biologicas. Um anti- corpo pode ser de qualquer das cinco principais classes de imunoglobulinas: IgA, IGD, IgE, IgG, e IgM1 ou subclasses (Isotipos) (por exemplo, IgGI5 lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2), 10 com base na identidade da sua constante de cadeia pesada domínios referidos como alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respectivamente. As diferentes classes de imunoglobulinas têm diferentes e bem conhecidas estruturas subunidades e configurações tridimensionais. Os anticorpos podem ser nus ou conjugados com outras moléculas, como toxinas, radioisóto- pos, etc.

Conforme utilizado aqui, o termo “fragmentos anticorpo” se refere a uma porção de

um anticorpo intacta e remete para as regiões variáveis determinantes antigênicos de uma anticorpo intacto. Exemplos incluem fragmentos de anticorpos, mas não estão limitados a Fab, Fab ', F (ab') 2, e fragmentos Fv, linear anticorpos, anticorpos de cadeia única, e anti- corpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

Um “anticorpo Fv” se refere ao mínimo fragmento anticorpo que contém um reco-

nhecimento completo do antígeno e sítio Iigante ao antígeno como duas cadeias, em que um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve formam um dímero não covalen- te, ou uma cadeia única (scFV), em que um domínio variável de cadeia pesada e um de ca- deia leve estão ligados de modo covalente por meio de um Iigador peptídeo flexível tal que 25 as duas cadeias se associam numa estrutura dimérica similar. Nessa configuração, as regi- ões determinantes de complementaridade (CDRs) de cada um domínio variável interage para definir a especificidade antígeno-ligante do dímero Fv. Alternativamente um único do- mínio variável (ou metade de um Fv) pode ser usado para reconhecer e se ligar antígeno, embora geralmente com menor afinidade.

Um “anticorpo monoclonal” como usado aqui se refere a população anticorpo ho-

mogênea envolvida no reconhecimento altamente específico e ligação de um único determi- nante antigênico, ou epítopo. Isto está em contraste com anticorpos policlonais que normal- mente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes antigênicos. O termo “anticorpos monoclonais” abrange tanto anticorpos monoclonais intactos e de com- 35 primento completo bem como fragmentos anticorpo (como Fab, Fab ', F (ab1) 2, Fv), única cadeia (scFv) mutantes, proteínas de fusão que compreendem uma parcela anticorpo, e qualquer outra molécula imunoglobulina modificada que compreende um sítio de reconhe- cimento antígeno. Além disso, “anticorpos monoclonais” se refere a esses anticorpos feita em qualquer número de maneiras, incluindo mas não limitados a hibridomas, seleção Fago, expressão recombinante, e animais transgênicos.

Conforme utilizado aqui, o termo “anticorpo humanizado” se refere a formas de an- ticorpos não-humanos (por exemplo murina) que são específicas cadeias imunoglobulina, imunoglobulinas quiméricas, ou fragmentos desses que contenham seqüências não huma- nas mínimas. Normalmente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas em que os resíduos provenientes das regiões de determinação da complementaridade (CDRs), contidos na região de determinação antígeno (hipervariável ou região) da região variável de uma cadeia ou cadeias anticorpo estão substituídos por resíduos provenientes da CDR de espécies não humanas(por exemplo, rato, rato, coelho, hamster), que tenham a desejada especificidade, afinidade, e capacidade. Em alguns casos, resíduos da região da quadro operativo de cadeia variável (FR) de uma imunoglobulina humana são substituídas com os correspondentes resíduos em um anticorpo de uma espécie não-humanos que tem a dese- jada especificidade, afinidade, e capacidade. O anticorpo humanizado ainda pode ser modi- ficado pela substituição de outros resíduos, ou na região da quadro operativo variável e/ou substituídos dentro do resíduos não-humanos para aperfeiçoar e otimizar a especificidade dos anticorpos, afinidade, e/ou capacidade. Em geral, o anticorpo humanizado irá compre- ender substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente duas ou três ou qua- tro, domínios variáveis contendo a totalidade ou substancialmente a totalidade das regiões CDR que correspondam à imunoglobulina não-humanana enquanto que a totalidade ou substancialmente a totalidade das regiões FR são aquelas de ua seqüência imunoglobulina humana de consenso. O anticorpo humanizado pode também compreender pelo menos uma parte de uma região ou domínio constante da imunoglobulina (Fe), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Exemplos de métodos utilizados para gerar anticorpos hu- manizados são descritos na Patente U.S. No. 5.225.539.

O termo “anticorpos humanos”, como utilizado neste documento significa um anti- corpo produzido por um humano ou um anticorpo com uma seqüência de aminoácidos cor- respondente a um anticorpo produzido por um humano feitas utilizando qualquer técnica 30 conhecida na arte. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de comprimento completo, fragmentos desses, e/ou anticorpos que compreende pelo menos um polipeptídeo humano de cadeia leve e/ou de cadeai pesada tal como, por exemplo, um anticorpo que compreende polipeptídeos de cadeia leve murino e de cadeia pesada huma- na.

“Anticorpos híbridos” são moléculas imunoglobulina cujos pares de cadeias leves e

pesadas provenientes de anticorpos com diferentes regiões determinantes antigênicas são montadas juntas tal que dois diferentes epítopos ou dois diferentes antígenos podem ser reconhecidos e unidos pelo tetrâmero resultante.

O termo “anticorpos quiméricos” se refere aos anticorpos em que a seqüência de aminoácidos da molécula da imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. Normal- mente, a região variável de ambas as cadeias leves e pesadas corresponde à região variá- 5 vel de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, etc), com a desejada especificidade, afinidade, e capacidade enquanto as regiões constantes são homólogas às seqüências nos anticorpos derivados de um outro (usualmen- te humano) para evitar eliciar uma resposta imuno naquela espécie.

O termo “epítopo” ou “determinante antigênico” são utilizados alternadamente a se- 10 guir e se referem àquela porção do antígeno capaz de ser reconhecida e, especificamente ligada por um anticorpo específico. Quando o antígeno é um polipeptídeo, epítopos podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos e aminoácidos não contíguos justapostos pela multiplicação terciária de uma proteína. Epítopos formados a partir de aminoácidos con- tíguos são tipicamente mantidos quando da desnaturação protéica, enquanto que epítopos 15 formados por multiplicação terciária são tipicamente perdidos quando da desnaturação da proteína. Um epítopo inclui normalmente, pelo menos, 3 e, mais geralmente, pelo menos, 5 ou 8 a 10 aminoácido numa conformação espacial única.

A competição entre os anticorpos é determinada por um ensaio em que a imuno- globulina específica sob teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum. Inúmeros tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto e indireto de fase sólida (RIA), radioimunoensaio enzimá- tico direto e indireto de fase sólidas (EIA), ensaio de competição “sanduíche” (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)); fase sólida direta biotina-avidina AIA (ver Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)); ensaio “sanduíche” marcado de fase sólida direta (ver Harlow e Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Press (1988)); fase sólida directo rótulo RIA usando 1-125 etiqueta (ver Morel et al. Molec. Immunol. 25 (1) :7-15 (1988 )); EIA biotina-avidina fase sólida direta (Cheung et al., Virology 176:546 - 552 (1990)); e RIA marcada direta (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77- 82 (1990)). Tipicamente, esse tipo de análise envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células munidos de um destes, uma imunoglobulina marcada teste e uma referência marcada imunoglobulina. Inibição competitiva é medida através da deter- minação da quantidade de marcação ligado à superfície sólida ou células em presença da imunoglobulina de teste. Geralmente a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Anticorpos identificados pela análise da concorrência (anticorpos competitivos) incluem anti- corpos ligantes ao mesmo epítopo como o anticorpo de referência e anticorpos ligantes a um epítopo adjacente são suficientemente próximos ao epítopo ligado pelo anticorpo de re- ferência para a ocorrência do impedimento estérico. Normalmente, quando um anticorpo competitivo está presente em excesso, ele irá inibir a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50 ou 75%.

Que um anticorpo “seletivamente se liga” ou “se liga especificamente” significa que o anticorpo reage ou se associa com maior frequência, mais rapidamente, com maior dura- ção, com maior afinidade, ou com uma combinação dos acima a um epítopo do que com substâncias alternativas , incluindo as proteínas independentes. “Seletivamente se liga” ou “se liga especificamente” significa, por exemplo, que um anticorpo se liga a uma proteína com um KD de pelo menos cerca de 0,1 mM, mas mais usualmente de pelo menos 1 μΜ. “Se liga seletivamente” ou “se liga especificamente” significa em alguns momentos que um anticorpo se liga a uma proteína em momentos com um KD de pelo menos cerca de 0,1 μΜ ou melhor, e em outros momentos, de pelo menos, cerca de 0,01 μΜ ou melhor. Devido à identidade de seqüência entre proteínas homólogas em diferentes espécies, a ligação espe- cífica pode incluir um anticorpo que reconhece uma proteína marcadora de célula tronco cancerosa em mais que uma espécie.

Conforme utilizado aqui, os termos “ligação não específica” e “ligação de base” quando usado em referência à interacção de um anticorpo e de uma proteína ou peptídeo se referem a uma interação que não é dependente da presença de uma estrutura específica (ou seja, o anticorpo é Iigante para proteínas em geral, que uma estrutura particular, como um epítopo).

Os termos “isolados” ou “purificado” se referem ao material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham em seu estado natural. Pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de quími- ca analítica como a eletroforese em gel poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta efici- ência. Uma proteína (por exemplo, um anticorpo) ou do ácido nucléico da presente revela- ção que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purifi- cada. Em particular, um isolado do ácido nucléico é separada a partir de quadros de leitura abertos que naturalmente flanqueiam o gene e codifica outras que a proteína codificada pelo gene. Um anticorpo isolado é separado das outras proteínas não imunoglobulinas e de ou- tras proteínas imunoglobulina com diferente especificidade antígeno-ligante. Também pode significar que o ácido nucléico ou proteína tem, pelo menos em algumas modalidades, pure- za de pelo menos 80%, em algumas modalidades pelo menos 85% de pureza, em algumas modalidades pelo menos 90% de pureza, em algumas modalidades pelo menos 95% puro e, em algumas modalidades pelo menos 99% puro.

Conforme utilizado aqui, os termos “câncer” e “cancerígeno” se referem ou descre- vem a cond fisiológica em mamíferos em que uma população de células são caracterizadas por crescimento celular sub-regulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, Blastoma, sarcoma, e leucemia. Mais particular exemplos desses cânceres incluem câncer de células escamosas câncer, câncer de células pequenas do pulmão, câncer de células não pequenas do pulmão, adenocarcinoma do pulmão, carcino- ma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma , câncer do colo do útero, ovário, câncer hepático, câncer 5 da bexiga, Hepatoma, câncer de mama, cólon, câncer colorretal, endométrio ou uterino, car- cinoma de glândulas salivares, câncer renal, câncer hepático, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireóide, carcinoma hepático e vários tipos de cânceres de cabeça e pes- coço.

Os termos “distúrbio proliferativo” e “doença proliferativa” se referem a distúrbios re- Iacionados com a proliferação celular anormal, como o câncer.

“Tumor” e “neoplasia”, como utilizado neste documento se referem a qualquer mas- sa de tecido que resulte no crescimento ou proliferação excessiva de células, quer benignas (não cancerosas) ou malignas (câncer), incluindo as lesões pré-cancerosas.

“Metástase”, como utilizado neste documento se refere ao processo pelo qual um 15 câncer se espalha ou se transfere de um sítio de origem para outras regiões do corpo com o desenvolvimento de uma lesão cancerosa similar no novo local. Uma célula “metastásica” ou “metastatisante” é uma célula que perde contatos adesivos com as células vizinhas e migra através da corrente sanguínea ou Iinfa a partir do sítio principal da doença para invadir estruturas corporais vizinhas.

Os termos “células tronco cancerosas”, “células tronco tumorais”, ou “tumor sólido

de células tronco” são utilizados alternadamente a seguir e se referem a uma população de células de um tumor sólido que: (1) possuem uma vasta capacidade proliferativa; 2 ) são capazes de divisão celular assimétrica para gerar um ou mais tipos diferenciados de progê- nie com reduzida proliferativa ou potencial de desenvolvimento, e (3) são capazes de divi- 25 sões celulares simétricas para a auto-renovação ou auto-manutenção. Estas propriedades de “células tronco cancerosas”, “células tronco tumorais” ou “célula tronco de tumor sólido” conferem a essas células tronco cancerosas a capacidade de formar tumores palpáveis a- pós transplante em uma série de ratos imunocomprometidos, em comparação com a maioria das células tumorais que falham em formar tumores. Células tronco cancerosas experimen- 30 tam auto-renovação versus diferenciação em um modo caótico pra formar tumores com tios de células anormais que podem se alterar com o passar do tempo à medida que as muta- ções ocorrem. Célula tronco de tumor sólido diferem da “linhagem tronco cancerosa” provi- das pela Patente U.S. No. No. 6004528. Nessa patente, o “linhagem tronco cancerosa” é definida como um tipo de célula progenitora de crescimento lento que tem propriamente 35 poucas mutações por meio das quais experimenta divisões celulares simétricas preferivel- mente que assimétricas como um resultado das alterações tumorigênicas que ocorrem no ambiente das células. Essa hipótese de “linhagem tronco cancerosa”, portanto, propõe que células tumorais altamente mutadas proliferam rapidamente surgindo amplamente como um resultado de um ambiente anormal, que induz as células tronco relativamente normais a se acumulares e em seguida experimentar mutações que induz a elas a se tornarem células tumorais. A Patente U.S. No. 6004528 propõe que um tal modelo pode ser utilizado para melhorar o diagnóstico de câncer. O modelo célula tronco de tumor sólido é fundamental- mente diferente do modelo "linhagem tronco cancerosa" e como resultado exibe utilitários não oferecidos pelo modelo "linhagem tronco cancerosa". Primeiro, as células tronco de tu- mor sólido não são "poupadas mutacionalmente". A "linhagem de célula tronco cancerosa mutacionalmente poupada" descrito pela Patente U.S. No. No. 6004528 pode ser considera- da uma lesão pré-cancerosa, embora as células tronco de tumor sólido sejam células cance- rosas que podem propriamente conter mutações que sejam responsáveis pela tumorigênese começando pela fase pré até o câncer em estágio terminal. Isto é, célula tronco de tumor sólido ( "células tronco cancerosas") seriam incluídas entre as células mutantes que são altamente distintas da "linhagem tronco cancerosa" na Patente U.S. No. No. 6004528. Em segundo lugar, as mutações genéticas que levam ao câncer podem ser em grande parte intrínseca dentro da célula tronco de tumor sólido, bem como sendo ambiental. O modelo célula tronco de tumor sólido prevê que as células tronco isoladas tumor sólido possam dar surgimento a tumores adicionais quando do transplante (explicando assim a metástase), enquanto o modelo "linhagem tronco cancerosa" poderia predizer que "linhagens tronco cancerosas" não seriam capazes de dar margem ao surgimento de um novo tumor uma vez que foi seus ambientes anormais que era tumorigênico. Com efeito, a capacidade de trans- plantar células tronco de tumor sólido humano fenotipicamente isoladas, dissociadas, para ratos (num ambiente que é muito diferente do ambiente tumoral normal) onde elas ainda formam novos tumores diferencia a presente invenção do modelo "linhagem tronco cancero- sa". Terceiro, célula tronco de tumor sólido provável de dividir tanto simétrica e assimétrica, de tal forma que a divisão celular simétrica não é uma propriedade obrigatória. Quarta, célu- la tronco de tumor sólido podem se dividir rápida ou lentamente, dependendo de muitas va- riáveis, de tal forma que uma lenta taxa de proliferação não é uma característica definidora.

Os termos "célula cancerosa", "células tumorais" e gramaticais equivalentes referem ao total da população de células derivadas de um tumor ou uma lesão pré-cancerosa, inclu- indo ambas células tumorigênicas, as quais compreendem a maior parte da população de células tumorais, e células tronco tumorigênicas (células tronco cancerosas).

Conforme utilizado aqui "tumorigênico" se refere às características funcionais de um célula tronco de tumor sólido, incluindo as propriedades de auto-renovação (que dão origem a células tronco cancerosas tumorigênicas) e proliferação para gerar todas as outras células tumorais (dando origem a diferenciadas e, portanto, células tumorais não tumorigênicas), que permitem as células tronco de tumor sólido a formar um tumor. Conforme utilizado aqui, os termos "marcador(s) de câncer em células tronco", "marcador de células tronco cancerosas (s)", "marcador de células tronco tumorais (s)", ou "marcador(s) de células tronco de tumor sólido" se referem a um gene ou genes ou uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo expressa pelo gene ou genes cujo nível de expressão, isoladamente ou em combinação com outros genes, está correlacionado com a presença de células cancerosas tumorigênicas comparada aos células não tumorigênicas. A correlação pode relacionar-se tanto a um aumento ou diminuição da expressão do gene (por exemplo, aumento ou diminuição dos níveis de mRNA ou do peptídeo codificado pelo gene).

Conforme utilizado aqui, os termos "biópsia" ou "tecido de biópsia" se referem a uma amostra de tecido ou um fluido que é retirado de um indivíduo com o objetivo de deter- minar se a amostra contém tecido canceroso. Em algumas modalidades, biópsia de tecidos ou fluidos é obtida porque um indivíduo é suspeito de ter câncer, e a biópsia de tecidos ou fluidos é então examinada quanto a presença ou ausência de câncer.

Conforme utilizado aqui, o termo "indivíduo" se refere a qualquer animal (por exem- pio, um mamífero), incluindo, mas não se limitando aos seres humanos, primatas não- humanos, roedores, e similares, que seja o recebedor de uma tratamento particular. Nor- malmente, os termos "indivíduo" e "paciente" são utilizados alternadamente aqui em referên- cia a um indivíduo humano.

"Farmaceuticamente aceitável" se refere a aprovar ou aprovável por uma agência , 20 reguladora do governo federal ou um estado, ou incluídas na Farmacopéia Norte Americana geralmente reconhecidos ou outras Farmacopéia para uso em animais, incluindo os seres humanos.

"Sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal de um composto que é farma- ceuticamente aceitável e que possui a desejada atividade farmacológica do composto origi- nal.

"Excipiente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável" se refere a um exci- piente, transportador ou adjuvante que pode ser administrado a um indivíduo, juntamente com pelo menos um anticorpo da presente revelação, e que não destrói a sua atividade far- macológica e é não tóxico quando administrado em doses suficientes para fornecer uma quantidade terapêutica do composto.

"Veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um diluente, adjuvante, excipien- te, ou o veículo com o qual pelo menos um anticorpo da presente revelação é administrado.

"Prodroga" se refere a um derivado de um composto terapeuticamente eficaz que exige uma transformação dentro do corpo para produzir o composto terapeuticamente efi- caz. Prodrogas podem ser farmacologicamente inativas até convertidas ao composto origi- nal terapeuticamente eficaz.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um anticorpo, polipeptídeo, polinucleotídeo, molécula orgânica pequena, ou de outras drogas eficaz para "tratar" uma doença ou enfermidade em um indivíduo ou mamífero. No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento pode reduzir o número de células cancerosas, reduzir o tamanho do tumor; inibir ou parar a infiltração da célula cance- rosa em órgãos periféricos, incluindo, por exemplo, a disseminação do câncer em tecido mole e osso; inibir e impedir metástase do tumor; inibir e impedir o crescimento tumoral; ali- viar de certa forma um ou mais dos sintomas associados ao câncer, a redução da morbida- de e da mortalidade, melhorar a qualidade de vida, ou uma combinação desses efeitos. Na medida em que a droga impede o crescimento e/ou existentes mata células cancerosas, pode ser referido como citostáticos e/ou citotóxicos.

Conforme utilizado aqui, "proporcionar um diagnóstico" ou "informação diagnostica" se refere a qualquer informação, incluindo por exemplo a presença de células tronco cance- rosas, que é útil para determinar se um paciente tem uma doença ou condição e/ou em classificar a doença ou condição fenotípica em uma categoria ou qualquer categoria ter sig- nificado no que diz respeito ao prognóstico ou a probabilidade da resposta ao tratamento (ou do tratamento em geral ou de qualquer tratamento especial) da doença ou condição. Do mesmo modo, o diagnóstico se refere a prestar qualquer tipo de informações de diagnóstico, incluindo, mas não se limitando a, se um indivíduo é susceptível de ter uma condição (tais como um tumor), se um indivíduo do tumor inclui células tronco cancerosas, as informações relacionadas com a natureza ou classificação de um tumor, por exemplo, um alto risco tumor ou um tumor de baixo risco, as informações relacionadas ao prognóstico e/ou informação útil em selecionando um tratamento apropriado. Seleção de tratamento pode incluir a escolha de um determinado agente quimioterápico ou outra modalidade terapêutica como a cirurgia ou radioterapia ou de uma escolha sobre a se evitar ou aplicar a terapia. Conforme utilizado aqui, os termos "proporcionar um prognóstico", "informação de

prognóstico", ou "informação preditiva" se referem à prestação de informação, incluindo por exemplo a presença de células tronco cancerosas em um tumor do indivíduo, quanto ao impacto da presença de câncer (por exemplo, como determinado pelos métodos diagnósti- cos da presente invenção) na saúde futura de um indivíduo (por exemplo, esperada morbi- dade e mortalidade, a probabilidade de contrair câncer, e o risco de metástases).

Termos como "tratando" ou "tratamento" ou "tratar" ou "alívio" ou "aliviar" se referem a ambos 1) medidas terapêuticas que curam, desaceleram, diminuem os sintomas, e/ou travam a progressão de uma cond ou distúrbio patológico diagnosticado e 2) medidas profi- láticas ou preventivas que impeçam e/ou retardem o desenvolvimento de uma condição ou transtorno patológico objetivado. Assim, aqueles que necessitam de tratamento incluem a- queles que já apresentam o distúrbio; aqueles propensos a ter o transtorno, e aqueles nos quais a doença deve ser evitada. Um indivíduo é "tratado" de modo bem sucedido de acordo com os métodos da presente invenção, se o paciente apresenta um ou mais dos seguintes elementos: uma redução do número de ou ausência completa de células cancerosas; uma redução no tamanho do tumor; inibição ou ausência de infiltração de células de câncer em órgãos periféricos, incluindo, por exemplo, a disseminação do câncer em tecido mole e os- so; inibição ou uma ausência de metástase do tumor; inibição ou uma ausência de cresci- mento tumoral; alívio de um ou mais sintomas associados com o câncer específico; reduzida morbidade e da mortalidade, melhoria na qualidade de vida, ou alguma combinação de efei- tos.

Conforme utilizado aqui, os termos "polinucleotídeo" ou "ácidos nucléicos" se refe- rem a um polímero composto de uma multiplicidade de unidades nucleotídeo (ribonucleotí- deo ou desoxiribonucleotídeo ou variantes estruturais relacionadas) ligados através ligações fosfodiéster, incluindo mas não limitados a, o ADN ou RNA. O termo engloba qualquer dos análogos base conhecidos de ADN e RNA, que incluem, mas não estão limitados a, 4 acetil- citosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5- carboxihidroxilmetil) uracil, 5-fluorouracil, 5 bromouracil, 5-carboximetilaminometil 2 tiouracil, 5-carboximetilaminometiluracil, diidrouracil, inosina, N6 isopentenyladenina, 1 metiladenina, 1-metilpseudouracil, 1 metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2 metiladenina, 2 metilguanina, 3-metilcitosina, 5 metilcitosina, N6 metiladenina, 7 metilguanina, 5 metilami- nometiluracil, 5-metoxiaminometil 2-tiouracil, beta D mannosilqueosina, 5 'metoxicarbonyl- metiluracil, 5 rnetoxiuracil, 2 metiltio N6 isopentenyladenina, uracil 5 oxiacetic ácido METILESTER, uracil 5 oxiacetic ácido, oxibutoxosina, pseudouracil, queosina, 2 tiocitosina, 5-metil-2 tiouracil, 2-tiouracil, 4 tiouracil, 5-metiluracil, N-uracil ácido 5-oxiacético metiléster, uracil ácido 5 oxiacético, ácido pseudouracil, queosina, 2-tiocitosina, e 2,6 diaminopurina.

A expressão "condições rigorosas de hibridização" se refere a condições em que uma sonda irá hibridizar a sua subsequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucléicos, mas a nenhuma outras seqüências. Condições rigorosas são dependentes da seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Seqüências mais longas hi- bridizam especificamente em altas temperaturas. Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Bio- Iogy —Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Geralmente, as condições severas são selecionados serem de cerca de 5-10 0C mais baixo que o ponto térmico de derretimento (Tm) para a se- qüência específica num definido pH de força iônica. A Tm é a temperatura (sob a definida força iônica, pH, e concentração nucléica) em que 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à seqüência alvvo em equilíbrio (como as seqüências alvo estão presentes em excesso, na Tm, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio). Condições rigorosas tam- bém podem ser alcançados com a adição de agentes desestabilizadores, como formamida. Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes a base de referência, preferivelmente 10 vezes a base de referência de hibridização. Condições rigorosas de hibridização podem ser as seguintes: 50% formamida, 5 χ SSC1 e 1% SDS1 incubação a 42 °C, ou 5 χ SSC1 1% SDS1 incubação a 65 °C, com lavagem em 0,2 χ SSC1 e 0,1% SDS a 65 °C.

O termo "gene" se refere a uma seqüência ácido nucléico (por exemplo, ADN), que inclui seqüências codificadoras necessárias para a produção de um polipeptídeo, precursor, ou ARN (por exemplo, rRNA, tRNA). O polipeptídeo pode ser codificado por uma seqüência codificadora de comprimento total ou por qualquer parte do seqüência codificadora contanto que a atividade desejada ou propriedades funcionais (por exemplo, atividade enzimática, ligação ao ligando, transdução de sinal, imunogenicidade, etc) de comprimento completo ou fragmento sejam mantidas. O termo também abrange a região codificadora de um gene es- trutural e as seqüências localizadas adjacente à região codificadora, em ambas as termina- ções 5' e 3' para uma distância de cerca de 1 KB ou mais em cada extremo tal que o gene corresponda ao comprimento do mRNA de comprimento completo. Seqüências localizadas em 5' da região codificadora e presentes no mRNA são referidos como seqüências 1 não traduzidas. Seqüências localizadas em 3' ou mais adiante da região codificadora e presen- tes no mRNA são referidas como seqüências 3' não traduzidas. O termo "gene" abrange ambas as formas cADN e genômica de um gene. Um clone ou forma genômica de um gene contém a região codificadora interrompida com seqüências não codificadoras denominadas "introns" ou "regiões intervenientes" ou "seqüências intervenientes" Introns são segmentos de um gene que são transcritos no RNA nuclear (hnRNA); introns podem conter elementos regulatórios tais como potencíadores. Introns são removidos ou "amarrados" a partir do transcrito nuclear ou primário; introns portanto estão ausentes no transcrito RNA mensageiro (mRNA). O mRNA funciona durante a tradução para especificar a seqüência ou ordem de aminoácidos em um polipeptídeo nascente. Adicionalmente a conter introns, as formas ge- nomicas de um gene podem incluir também seqüências situadas em ambas as terminações 5' e 3' das seqüências que estão presentes no transcrito RNA. Estas seqüências são referi- dos como "acompanhamento" seqüências ou regiões "flanqueadoras" (estas seqüências flanqueadoras em 5' ou 3' em relação às seqüências não traduzidas presentes no transcrito mRNA). A região flanqueadora 5' pode conter seqüências regulatórias tais como promotores e potencializadores que controlem ou influenciem a transcrição do gene. A região flanquea- dora 3' pode conter seqüências que direcionam a terminação da transcrição, clivagem pós- transcricional e poliadenilação. O termo "recombinante" quando usado com referência a uma célula, ácidos nucléi-

cos, proteínas ou vetor indica que a célula, ácidos nucléicos, proteínas ou vetor foi modifica- da pela introdução de um ácido nucléico ou proteína heteróloga, a alteração do um ácido nucléico ou proteínas naturais, ou que a célula é derivada de uma célula para modificadas. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma natural (não recombinante) da célula ou expressam genes naturais que são superexpressados ou de outro modo anormalmente expressados tal como, por exemplo, expresso como fragmentos não naturalmente ocorrentes ou variantes emendadas. Pelo ter- mo "ácido nucléico recombinante" é significado aqui ácido nucléico, originalmente formado in vitro, em geral, pela manipulação de ácido nucléico, por exemplo, usando polimerases e endonucleases, numa forma não normalmente encontrada na natureza. Desse modo, a liga- ção operativa de diferentes seqüências é conseguida. Assim, um ácido nucléico isolado, em uma forma linear, ou um vetor de expressão formado in vitro pela ligação de moléculas ADN que não são normalmente unidas, são ambos considerados recombinantes para os propósi- tos dessa invenção. É entendido que uma vez um ácido nucléico recombinante seja produ- zido e introduzido dentro de uma célula ou organismo hospedeiro, ele irá replicar de modo não recombinante, isto é, usando o maquinário celular in vivo da célula hospedeira preferen- temente que manipulações in vitro; entretanto, tais ácidos nucléicos, uma vez produzidos de forma recombinante, embora posteriormente replicados de forma não recombinante, são ainda considerados recombinantes, para efeitos da invenção. Do mesmo modo, uma "prote- ína recombinante" é uma proteína recombinante feita utilizando técnicas, ou seja, através da expressão de uma recombinação de ácidos nucléicos como demonstrado acima. Conforme utilizado aqui, o termo "gene heterólogo" se refere a um gene que não

está em seu ambiente natural. Por exemplo, um gene heterólogo inclui um gene de uma espécie introduzida em outra espécie. Um gene heterólogo também inclui um gene natural de um organismo que tenha sido modificado de alguma forma (por exemplo, mutantes, adi- cionado em múltiplas cópias, ligados à seqüências regulatórias não naturais, etc.) Genes heterólogos são distinguidos dos genes endógenos pelo fato de que as seqüências genéti- cas heterólogas estão tipicamente unidas a seqüências ADN que não se encontram natu- ralmente associadas com as seqüências genéticas no cromossomo ou estejam associadas com partes do cromossomo não encontradas na natureza (por exemplo, genes expressos em Ioci onde o gene não é normalmente expresso). Conforme utilizado aqui, o termo "vetor" é usado em referência às moléculas de á-

cidos nucléicos que tranferem segmento(s) ADN de uma célula para outra. O termo "veículo" é por vezes utilizado permutavelmente com "vetor". Vetores são freqüentemente derivados de plasmídeos, bacteriófagos, ou vírus vegetais ou animais.

"Ligadura" se refere ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre frag- mentos de ácidos nucléicos de dupla fita. A menos que de outro modo provido, a ligação pode ser conseguida mediante utilizar tampões e condições com 10 unidades de T4 ADN Iigase ("ligase") por 0,5 ug de quantidades aproximadamente equimolares dos fragmentos ADN a serem ligados, ada. Ligadura de ácidos nucléicos pode servir para ligar duas proteí- nas juntas em quadro para produzir uma proteína única, ou proteína de fusão.

Conforme utilizado aqui, o termo "expressão genética" se refere ao processo de conversão de informações genéticas codificadas em um gene no RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, ou snRNA) através da "transcrição" do gene (por exemplo, através a ação en- zimática de uma RNA polimerase), a para genes codificadores de proteína na proteína atra- vés da "tradução" do mRNA. Expressão gênica pode ser regulada em diversas fases do pro- cesso. "Regulação para cima" ou "ativação" se refere à regulação que aumenta a produção de produtos de expressão gênica (por exemplo, o RNA ou proteínas), enquanto o "regulação para baixo" ou "repressão" se refere a regulação que diminui a produção. Moléculas (por exemplo, fatores de transcrição) que estão envolvidas na regulação para cima ou regulação para baixo são muitas vezes chamadas de "ativadores" e "repressores", respectivamente.

Os termos "polipeptídeo," peptídeo "," proteína ", e "fragmento proteína" são utiliza- dos alternadamente aqui para se referir a um polímero de resíduos aminoácidos. As condi- ções são aplicáveis a polímeros aminoácidos em que um ou mais resíduos aminoácidos é um mimético químico artificial de um correspondente aminoácido naturalmente ocorrente, bem como a polímeros aminoácidos naturalmente ocorrentes e polímeros aminoácidos não naturalmente ocorrentes.

O termo "aminoácidos" se refere a aminoácidos naturalmente ocorrentes e sintéti- cos, bem como a aminoácidos análogos e aminoácidos miméticos que funcionam de modo similar aos aminoácidos naturalmente ocorrentes. Os aminoácidos naturalmente ocorrentes são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, gama-carboxíglutamato, e O- phosphoserina. Análogos aminoácidos se refere compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente, por exemplo, um alfa de car- bono que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Es- ses análogos podem ter grupos R modificados (por exemplo, norleucina), ou cadeias estru- turais peptídeo modificada, mas mantêm a mesma estrutura química basica como um ami- noácido naturalmente ocorrente. Miméticos aminoácidos se refere compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de forma similar a um aminoácido naturalmente ocorrente.

"Variantes modificadas de modo conservativo" se aplica a ambas as seqüências de aminoácidos e de ácidos nucléicos. "variantes aminoácido" se refere a seqüências de ami- noácidos. No que diz respeito a determinadas seqüências de ácidos nucléicos, variantes modificadas de modo conservativo se refere aos ácidos nucléicos que codificam aminoáci- dos idênticas ou essencialmente idênticas, ou quando o ácido nucléico não codifica uma seqüência de aminoácidos, a seqüências essencialmente idênticas ou associadas (por e- xemplo, naturalmente contíguas). Devido à degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticas codificam a maior prte das proteínas. Por exemplo, os códons GCA1 GCC1 GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina.

Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para um outro dos correspondentes códons descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Essas variações de ácidos nucléicos são "variações silentes" as quais constitu- em espécies de variações modificadas de modo conservativo. Cada seqüência aqui ácido nucléico que codifica um polipeptídeo silenciosa também descreve variações do ácido nu- cléico. Aquele usualmente versado na técnica irá reconhecer que, em certos contextos cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metioni- na, e TGG, que é normalmente o único códon de triptofano) podem ser modificados para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Assim, variações silentes de um ácido nu- cléico que codifica um polipeptídeo implicam numa seqüência descrita no que diz respeito à expressão produto, mas não no que diz respeito às seqüências sonda vigentes. Como para as seqüências aminoácidos, aqueles usualmente versados na técnica irão reconhecer que substituições individuais, supressões ou aditamentos a um ácido nucléico, peptídeo, polipep- tídeo, ou proteína seqüência que modifica, acrescenta ou suprime um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos codificadas no seqüência é uma "variante modi- . 20 ficada de modo conservativo" incluindo onde a alteração resulta na substituição de um ami- noácido com um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituições conserva- tivas que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na arte. Tais variantes conservativamente modificadas são aditivas e não excluem as variantes poli- mórficas, interespécies homólogas, e alelos da invenção. Substituições tipicamente conser- vativas incluem: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Usina (K); 5) Isoleucina (I), Ieucina (L) 5 Me- tionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) serina (S) , Treo- nina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

O termo "epítopo etiquetado" como utilizado neste documento se refere a um poli- peptídeo quimérico que compreende proteína marcadora de células tronco cancerosas, ou uma seqüência domínio ou parte dele, fundidas a um "etiqueta epítopo". A etiqueta epítopo polipeptídeo compreende resíduos aminoácidos suficientes para proporcionar um epítopo de reconhecimento por um anticorpo, sendo ainda suficientemente curto para não interferir com a atividade do proteína marcadora de célula tronco cancerosa. Adequadas etiquetas epítopo têm, geralmente, pelo menos seis resíduos aminoácidos, normalmente entre cerca de 8 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos e, algumas vezes, entre cerca de 10 para cerca de 20 resíduos. Etiquetas epítopo comumente usadas incluem Fc, HA, His, e etiquetas FLAG. A presente invenção fornece composições e métodos para estudar, diagnosticar, caracterizar, e tratar câncer. Em particular, a presente invenção fornece anticorpos contra o marcadores de células tronco de tumor sólido e métodos de utilização desses anticorpos para inibir o crescimento tumoral e tratamento do câncer em pacientes humanos. Em certas modalidades, anticorpos da presente invenção incluem anticorpos antagonistas que especi- ficamente se ligam a uma proteína marcadora de células tronco cancerosa e interferem com, por exemplo, ligação ao ligando, dimerização do receptor, expressão de uma proteína mar- cadora de células tronco cancerosas e/ou sinalização de proteína marcadora de células tronco cancerosas. Em certas modalidades, os anticorpos revelados não interferem com ou promovem a atividade biológica de uma proteína marcadora de células tronco cancerosas mas inibem o crescimento do tumor mediante, por exemplo, internalização e/ou reconheci- mento por parte do sistema imunitário. Em certas modalidades, os anticorpos especifica- mente reconhecem mais de uma proteína marcadora de células tronco de tumor sólido.

É provido um anticorpo isolado que especificamente se liga a um epítopo DLL4 hu- mano formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano (SEQ ID NO: 26), onde o anticorpo influencia crescimento de um tumor. Em certas modalidades o anticorpo monoclonal é um anticorpo. Em certas modalidades o anti- corpo é um anticorpo quimérico. Em certas modalidades o anticorpo é um anticorpo humani- zado. Em certas modalidades o anticorpo humano é um anticorpo. Além disso é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo da presente revelação e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Além disso é fornecido um método de tratamento de câncer que compreende admi- nistrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou uma composição farma- cêutica da presente revelação. Em certas modalidades o anticorpo é conjugado com uma fração citotóxica. Em certas modalidades o método ainda compreende administrar pelo me- nos um agente terapêutico mais adequado para proceder combinação terapêutica. Em cer- tas modalidades as células tumorais são escolhidas a partir de um tumor da mama, tumor de cólon, tumor pulmonar, tumor da próstata, tumor pancreático, e um tumor de cabeça e pescoço.

Como os tecidos de onde são originários, tumores sólidos consistem de uma popu-

lação heterogênea de células. O fato da maioria destas células serem carentes de tumorige- nicidade sugere que o desenvolvimento e a manutenção dos tumores também depende de uma pequena população de células tronco (ou seja, células cancerosas tumorigênicas), com a capacidade de proliferar e dar margem de forma eficiente a outros tumores de células tronco (auto-renovação) e à maioria das células tumorais mais diferenciadas que careçam de potencial tumorigênico (ou seja, células cancerosas não tumorigênicas). O conceito de células tronco cancerosas foi introduzido pela primeira vez logo após a descoberta de célu- Ias tronco hematopoiéticas (HSC) e foi criado experimentalmente em leucemia mielóide a- guda (LMA) (Park et al., 1971, J. Natl. Câncer Inst. 46:411 - 22; Lapidot et al., 1994, Nature 367:645-8; Bonnet & Dick, 1997, Nat. Med. 3:730-7; Hope et al., 2004, Nat. Immunol. 5:738- 43). As células tronco provenientes de tumores sólidos têm sido mais recentemente isoladas com base em sua expressão de um padrão único de receptores da superfície celular e sobre a avaliação de suas propriedades de auto-renovação e proliferação em cultura e em mode- los animais de xenoenxerto. Uma população SCE + CD44 + CD24-/baixa linhagem superior a 50 vezes enriquecida para a capacidade de formar tumores em relação a células tumorais não fracionadas foi descoberto (Al-Hajj et al., 2003, Proc. Nat'1. Acad. Scl 100: 3983-8). A capacidade de isolar células tronco cancerosas tumorigênicas a partir da maior parte das células tumorais não tumorigênicas, levou à identificação de marcadores de células tronco cancerosas, genes com expressão diferencial em células tronco cancerosas comparadas as células tumorais não tumorigênicas ou de epitélio mamário normal, usando análises de mi- croarranjo. A presente invenção emprega o conhecimento destes marcadores de células tronco cancerosas identificadas para o diagnóstico e tratamento do câncer.

O marcador de células tronco cancerosases da presente invenção se referem DLL4 humano, ligando receptor Notch. A rota de sinalização Notch é um dos diversos retuladores críticos da form do padrão embriônico, manutenção do tecido pós-embriônico, e biologia da célula tronco. Mais especificamente, a sinalização Notch está envolvida no processo de ini- bição lateral entre mortes de células adjacentes e desempenha um papel importante na de- terminação do destino da célula durante divisões celulares assimétricas, s celulares. A sina- lização Notch desregulada está associada com numerosos cânceres humanos onde ele po- de alterar o destino desenvolvimental das células tumorais para mante-las em um estado indiferenciado e proliferativo (Brennan e Brown, 2003, Breast Câncer Res. 5:69). Assim a carcinogênese pode prosseguir mediante usurpar mecanismos que controlam o desenvolvi- mento normal e reparo tecidual por meio das populações de células tronco (Beachy et al., 2004, Nature 432:324).

O receptor Notch foi identificado pela primeira vez em mutantes Drosophila. A ha- ploinsuficiência de Notch Drosophila resulta em incisuras nas margens de ala enquanto que a perda da função produz um fenótipo "neurogênico" letal embriônico onde as células da epiderme comutam ao tecido neural (Moohr, 1919, Genet. 4:252; Poulson, 1937, PNAS 23:133; Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271). O receptor Notch é um receptor transmembra- na de passagem única que contém numerosas repetições de fatores de crescimento epi- dérmico tipo-(EGF) em dupla e repetições Notch/LINHAGEM-12 ricas em cisteína dentro de um amplo domínio extracelular (Wharton et al., 1985, Cell 43:567; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094; comentado no Artavanis # et al., 1999, Science 284:770). Quatro proteínas Notch de mamífero foram identificadas (NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, e NOTCH4), e muta- ções nestes receptores resultam invariavelmente em desenvolvimento de anormalidades e

patologias humanas incluindo vários cânceres, como descrito em detalhes abaixo (Gridley,

1997, Mol. Cell Neurosci 9. : 103; Joutel & Tournier-Lasserve, 1998, Semin. CeIIDev. Biol. 9:619-25).

O receptor Notch é ativado por um único passe transmembrana Iigantes da família Delta, Serrilhada, Lag-2 (DSL). Os conhecidos Iigandos Notch em mamíferos, tipo Delta- Ilike 1 (DII1), tipo Delta-3 (DII3), tipo Delta-4 (DII4), Jagged 1 e Jagged 2, são caracterizados por um domínio DSL e repetições tipo EGF em dupla dentro o domínio extracelular. O domí- nio extracelular do receptor Notch interage com aquele dos seus ligantes, tipicamente em células adjacentes, resultando em duas clivagens proteolíticas do Notch, uma clivagem ex- tracelular mediada por uma ADAM protease e uma clivagem no seio do domínio da trans- membrana mediado pela gama secretase. Este última clivagem gera o domínio intracelular Notch (NICD). O NICD então adentra ao núcleo onde ele ativa o CBF1. Supressor da família Hairless [Su(H)], Lag-2 (CSL) de fatores de transcrição como os principais efetores de per- curso para aumentar a transcrição dos fatores de transcrição helicóide-laço-helicóide da família Hairy e Enhancer of Split [E(spl)] (Artavanis et al., 1999, Science 284:770; Brennan e Brown, 2003, Breast Câncer Res. 5:69; Iso et al„ 2003, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23:543). Rotas intracelulares alternativas que envolvem a proteína citoplásmica Deltex iden- tificada na Drosophila podem também existir em mamíferos (Martinez et al., 2002, Curr. O- pin. Genet. Dev. 12:524-33), e essa rota Deltex-dependente pode atuar para suprimir a ex- pressão de genes alvos Wnt (Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710; Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85).

Células tronco hematopoiéticas (HSCs) são as mais bem entendidas células tronco no organismo, e sinalização Notch está implicada tanto em sua manutenção normal, bem como na transformação leucêmica (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res 10. :69-73). HSCs são uma população rara de células que residem em um nicho estromal no interior da medula óssea adulta. Essas células são caracterizadas tanto por um único perfil da expres- são gênica, bem como uma capacidade de continuamente dar origem a células progenitoras mais diferenciadas para reconstituir o sistema hematopoiético como um todo. A ativação constitutiva da sinalização Notchl em HSCs e células progenitoras estabelece linhagens celulares imortalizadas que geram ambas as células linfóides e mielóides in vitro e em en- saios de reconstituição de longa duração (Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278 - 81) , e a presença de Jagged 1 aumenta a enxertia de populações de células de medula óssea humana enriquecidas para as HSCs (Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72). Mais recentemente, a sinalização Notch tem se demonstrado nas HSCs in vivo e demons- trou estar envolvida na inibição da diferenciação de HSC. Além disso, sinalização Notch pa- rece ser necessária para a auto-renovação da HSC Wnt-mediada (Duncan et al., 2005, Nat. lmmunol. 6:314).

A rota de sinalização Notch também desempenha um papel central na manutenção de células neurais e está implicada tanto na sua manutenção normal, assim como em cân- ceres cerebrais (Kopper & Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73; Purow et al., 2005, Câncer Res. 65:2353-63; Hallahan et al., 2004, Câncer Res. 64:7794-800). As células tronco neurais dão origem a todos os neurônios e células gliais no sistema nervoso de mamíferos durante o desenvolvimento, e mais recentemente, foram identificados no cérebro adulto (Gage, 2000, Science 287:1433-8). Ratos deficientes para Notch 1; os genes alvo Notch Hes1, 3, e 5; e um regulador da sinalização Notch presenilinl (PSL) mostram diminuição do número de células tronco embrionárias neurais. Além disso, as células tronco adultas neu- rais são reduzidos no cérebro de camundongos PS1 heterozigoto (Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93; Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58). A redução de células tron- co neuronais parece resultar da sua diferenciação prematura em neurônios (Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131 :5539-50) sugerindo que a sinalização Notch regula a diferenciação de células tronco neurais e a auto-renovação.

A sinalização Notch está implicada em um número de cânceres humanos. O gene NOTCH1 em seres humanos foi identificado pela primeira vez em um subconjunto de célu- las T de leucemia linfoblástica aguda como um Iocus translocado resultando em ativação da rota Notch (Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61). A ativação constitutiva da sinalização Not- ch 1 nas células-T em modelos camundongo gera de modo similar Iinfoma de células T, su- gerindo um papel causai (Robey et al., 1996, Cell 87:483-92; Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91; Yan et al., 2001, Blood 98:3793 - 9; Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337- 48). Recentemente mutações pontuais de NOTCH1, inserções e supressões anormais da sinalização NOTCH1 têm sido descobertas estarem freqüentemente presentes em ambos lilnfoma/leucemia linfoblástica aguda de célula-T em crianças e adultos (Pear & Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11: 416-33).

A freqüente inserção do rato tumor mamário vírus em ambos os locais de Notehl e Notch4 em tumores mamários e os resultantes fragmentos proteína Notchl ativados impli- cou primeiramente na sinalização Notch em câncer de mama (Gallahan & Callahan, 1987, J. Virol 61: 66 -74; Brennan & Brown, 2003, Breast Câncer Res. 5:69; Politi et al., 2004, Semin. Câncer Biol. 14:341 -7). Outros estudos em camundongos transgênicos têm confirmado um papel para Noteh na ramificação dutal durante o desenvolvimento da glândula mamária normal, e uma forma constitutivamente ativa de Notch4 em células epiteliais de mamíferos inibe a diferenciacao epitelial e resulta em tumorigênese (Jhappan et al., 1992, Genes & Dev.. 6:345-5; Gallahan et al., 1996, Câncer Res. 56:1775-85; Smith et al., 1995, Cell Grow- th Differ. 6:563 - 77; Soriano et al., 2000, Int. J. Câncer 86:652-9; Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol 196:204-17; Politi et al., 2004, Semin. Câncer Biol. 14: 341-7). Atualmente, as evi- dências de um papel para Notch em câncer de mama em humanos está limitada à expres- são de receptores Notch em carcinoms de mama e a correlacao deles com a resposta clíni- ca (Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86; Parr et al . de 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779- 86). Além disso, a superexpressão do rota Notch tem sido observada em cânceres cervicais (Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8)carcinomas de células renais (Rae et al., 2000, Int. J. Câncer 88:726-32), carcinomas de células epidermóides de cabeça e pescoço (Lee- thanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4), câncer endometrial (Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9), e neuroblastomas (van Limpt et al., 2000, med. Pediatr. Oncol. 35:554-8) indicativos de um papel potencial para Notch no desenvolvimento de uma série de neoplasi- as. Curiosamente, a sinalização Notch pode desempenhar um papel na manutenção do es- tado indiferenciado de células neoplásicas Apc-mutantes de cólon (van Es & Clevers, 2005, Trends Mol. Med. 11 :496-502).

A rota Noteh também está envolvida em vários aspectos do desenvolvimento vas- cular, incluindo proliferação, migração, diferenciação da musculatura lisa, angiogênese e diferenciação artério-venosa (Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23:543). Por exemplo, mutações homozíguas nulas em Notch-1/4 e Jagged-1, bem como perda de hete- rozigose D114 resulta em graves, porém, variáveis defeitos no desenvolvimento arterial e vascularização do saco vitelino. Além disso, embriões hipomórficos a Notch-2 e deficientes a DII1 apresentam hemorragia que possivelmente resulta do fraco desenvolvimento de estru- turas vasculares (Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54; Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52; Xue et al., 1999, Hum. Mel Genet. 8:723-30; Hrabe de Angelis et al., 1997, Na- ture 386:717-21; McCright et al., 2001, Dev 128. :491-502). Em humanos, mutações no JAGGED1 estão associadas com síndrome de Alagille, um problema de desenvolvimento que inclui defeitos vasculares, e as mutações em NOTCH3 são responsáveis por uma de- mência vascular hereditária (CADASIL) em que a homeostase do vaso é defeituosa (Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10).

A identificação de DLL4, como expressa em células tronco câncer de mama em comparação ao normal epitélio sugeriu objetivar a rota Notch para eliminar não só a maioria das células cancerosas não tumorigênicas, mas também as células tumorigênicas respon- sáveis pela formação e recorrência de tumores sólidos. Além disso, devido ao papel proemi- nente da angiogênese na formação e manutenção do tumor, ter por alvo a rota Notch atra- vés anticorpos contra DLL4 também pode efetivamente inibir a angiogênese, privando um câncer de nutrientes e contribuindo para a sua eliminação.

Assim, a presente invenção fornece um marcador de células tronco cancerosas, a expressão das quais pode ser analisada para diagnosticar ou montorar uma doença associ- ada com o câncer. Em algumas modalidades, a expressão de um marcador de células tron- co cancerosas é determinada pela expressão polinucleotídeo tal como, por exemplo, mRNA que codifica o marcador de células tronco cancerosas. O polinucleotídeo pode ser detectado e quantificado por qualquer meio de uma série de meios bem conhecidos por aqueles usu- almente versados na técnica. Em algumas modalidades, o mRNA que codifica um marcador de células tronco cancerosas é detectado por hibridização in situ a partir de seções de teci- do, por exemplo, uma biópsia no paciente. Em algumas modalidades, o RNA é isolado a partir de um tecido e detectado, por exemplo, Northern blot, RT-PCR quantitativa, ou micro- arranjos. Por exemplo, o RNA total pode ser extraído de uma amostra tecidual e iniciadores que especificamente hibridizam e amplificam um marcador de células tronco cancerosas pode ser utilizado para detectar a expressão de um polinucleotídeo marcador de células tronco cancerosas utilizando RT-PCR.

Em certas modalidades, a expressão de um marcador de células tronco cancerosas pode ser determinada pela detecção do polipeptídeo correspondente. O polipeptídeo pode ser detectado e quantificado por qualquer de um número de meios bem conhecidos por a- queles usualmente versados na técnica. Em algumas modalidades, um polipeptídeo marca- dor de células tronco cancerosas é detectado utilizando métodos bioquímicos analíticos, como, por exemplo, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alta perfor- mance (HPLC) ou cromatografia camada delgada (TLC). O polipeptídeo isolado também pode ser sequenciado de acordo com as técnicas padrão. Em algumas modalidades, a pro- teína marcadora de células tronco cancerosas é detectada com anticorpos levantados con- tra a proteína, utilizando, por exemplo, imunofluorescência ou imunohistoquímica em seções de tecido. Alternativamente anticorpos contra um marcador de células tronco cancerosas pode detectar expressão utilizando, por exemplo, ELISA, FACS, Western blot, imunoprecipi- tação ou microarranjos de proteínas. Por exemplo, células tronco cancerosas podem ser isoladas a partir da biópsia de um paciente e a expressão de uma proteína marcadora de células tronco cancerosas detectada com anticorpos marcados com material fluorescente utilizando FACS. Em outro método, as células que expressam um marcador células tronco cancerosas podem ser detectadas in vivo utilizando anticorpos marcados em um típico sis- tema de imagem. Por exemplo, os anticorpos marcados com isótopos paramagnéticos po- dem ser usados para imageamento por ressonância magnética (MRI). Em algumas modalidades da presente invenção, um teste diagnóstico compreende

determinar a expressão ou não de um marcador de células tronco cancerosas nas células tumorais, utilizando, por exemplo, imuno-histoquímica, hibridização in situ, ou RT-PCR. Em outras modalidades, um teste diagnóstico compreende determinar expressão dos níveis de um marcador de células tronco cancerosas utilizando, por exemplo, RT-PCR quantitativo. Em algumas modalidades, um teste diagnóstico compreende determinar uma maior expres- são dos níveis de um marcador de células tronco cancerosas, em comparação com um teci- do de controle, tais como, por exemplo, epitélio normal. 20

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A detecção da expressão de um marcador de células tronco cancerosaspodem en- tão ser utilizadas para proporcionar um prognóstico e selecionar uma terapia. Um prognósti- co pode ser baseado em qualquer expressão de risco conhecida que um marcador de célu- las tronco cancerosas indique. Além disso, a detecção de um marcador de células tronco cancerosas pode ser usada para selecionar uma terapêutica adequada, incluindo, por e- xemplo, o tratamento com anticorpos contra a detectada proteína do marcador das células tronco cancerosas. Em certas modalidades, o anticorpo se liga especificamente ao domínio

extracelular de proteína marcadora de células tronco cancerosas tais como o ligando de receptor Notch, DLL4.

No contexto da presente invenção, um anticorpo adequado é um agente que pode ter um ou mais dos seguintes efeitos, por exemplo: interferir com a expressão de um marca- dor de células tronco cancerosas; interferir com ativação de uma rota de transdução do sinal de célula tronco cancerosa mediante, por exemplo, inibir estericamente as intercoes entre um marcador de célula tronco cancerosa e seu ligando, receptor ou co-receptores, atuando como um ligando ou promovendo a ligação de um ligando endógeno; ou se ligar a um mar- cador de célula tronco cancerosa e inibir a proliferação da célula tumoral.

Em certas modalidades, anticorpos contra um marcador de células tronco cancero- sas atuam extracelularmente para modular a função de uma proteína marcadora de células tronco cancerosas. Em algumas modalidades, a ligação extracelular de um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas pode inibir a sinalização da proteína marcadora de células tronco cancerosa, por exemplo, inibindo a ativação intrínseca (por exemplo ativi- dade quinase), de um marcador de células tronco cancerosas e/ou mediante inibir esterica- mente a interação, por exemplo, células tronco cancerosas de um marcador com o seu Ii- gante, com seu receptor, com um co-receptor, ou com a matriz extracelular. Em algumas modalidades, a ligação extracelular de um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas pode regular para baixo a expressão na superfície da célula de um marcador de células tronco cancerosas, como, por exemplo, pela internalização de uma proteína marca- dora de células tronco cancerosas ou reduzindo a traficação de um marcador de células tronco cancerosas. Em algumas modalidades, a ligação extracelular de um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas pode promover a sinalização de proteína marca- dora de células tronco cancerosas, por exemplo, atuando como um ligando de atração ou aumentando a ligação ao ligando.

Em certas modalidades, anticorpos contra um marcador de células tronco cancero- sas se ligam a uma proteína marcadora de células tronco cancerosas e têm um ou mais dos seguintes efeitos: inibe a proliferação de células tumorais, desencadeiam a morte celular das células tumorais, promovem a diferenciação das células tumorais num tipo de célula menos tumorigênico, ou impedem a metástase de células tumorais. Em certas modalidades, anticorpos contra um marcador de células tronco cancerosas desencadeiam a morte celular através de um conjugado toxina, agente quimioterápico, radioisótopos, ou outro tal agente. Por exemplo, um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas está conjuga- do a uma toxina que é ativado nas células tumorais que expressam o marcador de células tronco cancerosas por internalização da proteína.

Em certas modalidades, anticorpos contra um marcador de células tronco cancero- sas mediam a morte celular de células que expressam a proteína marcadora de célula tron- co cancerosa através citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). ADCC en- volve Iise celular por células efetoras que reconhecem a porção Fc de um anticorpo. Muitos linfócitos, monócitos, tecido macrófagos, granulócitos e eosinófilos, por exemplo, têm recep- tores Fc e podem mediar citólise (Dillman, 1994, J. CHN. Oncol. 12:1497).

Em certas modalidades, anticorpos contra um marcador de células tronco cancero- sas desencadeiam a morte celular de uma célula que expressa proteína marcadora de célu- las tronco cancerosas pela ativação da citotoxicidade dependente do complemento (CDC). CDC envolve ligação do complemento serico à parte Fc dos anticorpos e uma subseqüente ativação da cascata protéica do complemento, resultando em dano membrana celular e e- ventual morte celular. A atividade biológica dos anticorpos é conhecida por ser determinada, em grande medida, pelos domínios constantes ou região Fc da molécula do anticorpo (Ua- nanue e Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams & Wilkins, p. 218 (1984)). Anticorpos de diferentes classes e subclasses diferem a este respeito, tal como os anticorpos da mesma subclasse, mas a partir de diferentes espécies. Dos anticorpos huma- nos, IgM é a mais eficiente classe de anticorpos para ligar complemento, seguido por IgGI, lgG3, lgG2 e lgG4 que parecem bastante deficientes em ativar a cascata complementária (Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497; Jefferis et al., 1998, lmmunol. Rev. 163:59 - 76). De acordo com a presente invenção, os anticorpos daquelas classes que possuem a desejada atividade biológica são preparados.

A capacidade de qualquer anticorpo específico contra uma célula tronco cancerosa para mediar a Iise da célula alvo por ativação complementar e/ou ADCC pode ser analisada. As células de interesse são cultivadas e marcadas in vitro; o anticorpo é adicionado à cultura celular em combinação com um ou outro do complemento sérico ou células imunitárias que podem ser ativadas pelos complexos antígeno-anticorpo. A citólise das células-alvo é detec- tada, por exemplo, pela liberação do rótulo das células lisadas. De fato, os anticorpos po- dem ser classificados usando o soro do próprio paciente como uma fonte de células com- plementarias e/ou imunitárias. O anticorpo que é capaz de ativar complemento ou mediar ADCC no teste in vitro pode então ser utilizado terapeuticamente naquele paciente em parti- cular.

Em certas modalidades, anticorpos contra um marcador de células tronco cancero- sas podem desencadear a morte celular inibindo a angiogênese. Angiogênese é o processo pelo qual os novos vasos sangüíneos se formam a partir de vasos pré-existente sendo um processo fundamental necessário para o crescimento normal, por exemplo, durante o de- senvolvimento embrionário, na cicatrização de feridas, e em resposta a ovulação. Cresci- mento de tumor sólido maior do que 1-2 mm2 também requer angiogênese para fornecer nutrientes e oxigênio sem o qual células tumorais morrem. Em certas modalidades, um anti- corpo contra um marcador de células tronco cancerosas tem por alvo células vasculares que expressam marcadores de células tronco cancerosas, incluindo, por exemplo, células endo- teliais, células musculares lisas, ou componentes da matriz extracelular necessária para montagem vascular. Em certas modalidades, um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas inibe a sinalização do fator de crescimento exigida pelo recrutamento de células vascular, montagem, manutenção, ou sobrevivência.

Os anticorpos contra um marcador de células tronco cancerosas encontram utiliza- ção em métodos de diagnóstico e terapêutico aqui descritos. Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são usados para detectar a expressão de proteína marca- dora de células tronco cancerosas em amostras biológicas, tais como, por exemplo, um bi- ópsia de tecido do paciente, derrame pleural, ou amostra de sangue. Biópsias teciduais po- dem ser seccionadas e a proteína detectada utilizando, por exemplo, imunofluorescência ou imuno-histoquímica. Além disso, células individuais provenientes de uma amostra podem ser isoladas, e a expressão da proteína detectada em células vivas ou fixadas por análise FACS. Em certas modalidades, os anticorpos podem ser usados em arranjos protéicos para detectar a expressão de um marcador de células tronco cancerosas, por exemplo, nas célu- las tumorais, em Iisados celulares, ou em outras amostras de proteínas. Em certas modali- dades, os anticorpos da presente invenção são usados para inibir o crescimento de células tumorais, mediante contatar os anticorpos com células tumorais in vitro de células em ensai- os in vitro baseados em células, modelos animais in vivo, etc. Em certas modalidades, os anticorpos são utilizados para tratar câncer em um paciente mediante administrar uma quan- tidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo contra um marcador de células tronco can- cerosas.

Os anticorpos da invenção podem ser preparadas por quaisquer meios convencio-

nais conhecidos na arte. Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser preparados median- te imunizar um animal (por exemplo, um coelho, camundongo, rato, burro, etc) mediante múltiplas injeções por via subcutânea ou intraperitoneal do antígeno pertinente (um fragmen- to de peptídeo purificado, proteína recombinante de comprimento completo, proteína de fu- são, etc.) opcionalmente conjugado com hemocianina keyhole Iimpet (KLH), albumina séri- ca, etc., diluída em salino estéril e combinada com um adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund completo ou incompleto) para formar uma emulsão estável. O anticorpo policlonal é então recuperado a partir de sangue, ascites e semelhantes, de um animal assim imunizado. O sangue coletado é coagulado, e o soro decantado, clarificado por centrifugação, e ensaia- do quanto a titulação do anticorpo. Os anticorpos policlonais podem ser purificados a partir de soro ou ascites de acordo com métodos padrão na arte, incluindo cromatografia de afini- dade, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, diálise, etc.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos hibridomas, tais como os descritos por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. Usando o método hibri- domas, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro adequado é imunizado como descrito acima para eliciar a produção pelos linfócitos de anticorpos que irão especificamen- te se ligar a um antígeno imunizante. Linfócitos também podem ser imunizados in vitro. Após a imunização, os linfócitos são isolados e fundidos com uma adequada linhagem celular mieloma, utilizando, por exemplo, polietileno glicol, para formar células de hibridomas que podem ser então selecionadas em separado dos não fundidos linfócitos e células mieloma. Hibridomas que produzem anticorpos monoclonais dirigidos especificamente contra um an- tígeno escolhido, conforme determinado por imunoprecipitação, immunoblotting, ou por um ensaio Iigantes in vitro (por exemplo, radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoabsorvente arti- culado por enzima (ELISA)) pode então ser propagado ou cultivado in vitro utilizando méto- dos normalizados (Goding, os anticorpos monoclonais: Principies and Practice, Academic Press, 1986) ou in vivo como tumores ascites em um animal. Os anticorpos monoclonais podem então ser purificados a partir de meio de cultura ou fluidos ascites de anticorpos poli- clonais, como descrito acima.

Alternativamente anticorpos monoclonais também podem ser produzidos utilizando métodos ADN recombinante tal como descrito na Patente U.S. No. 4.816.567. Os polinu- cleotídeos que codificam um anticorpo monoclonal são isolados a partir de células-B madu- ras ou hibridomas de células, tal como mediante RT-PCR utilizando iniciadores oligonucleo- tídeos que amplificam especificamente os genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo, e sua seqüência é determinada através de procedimentos convencionais. Os isolados polinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves são então clonados em adequados vetores de expressão, os quais quando transfectados em células hospedeiras, como células de E. coli, células COS de símios, células ovarianas de hamster chinês (CHO), ou células mieloma que de outro modo não produzem proteína imunoglobulina, os anticor- pos monoclonais são gerados pelas células hospedeiras. Além disso, os anticorpos mono- clonais recombinantes ou fragmentos da mesma espécie desejada pode ser isolado a partir de bibliotecas de exibição de Fagos que expressem os CDRs das espécies desejadas, tal como descrito (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature1 352:624-628, e Marks etal., 1991, J. Mol Biol, 222:581-597).

0(s) polinucleotídeo (s) que codifica um anticorpo monoclonal pode ser também modificado em uma série de diferentes maneiras usando tecnologia de ADN recombinante para gerar anticorpos alternativos. Em algumas modalidades, os domínios constantes de cadeias leves e pesadas de, por exemplo, um anticorpo monoclonal de camundongo pode ser substituído 1) para aquelas regiões de, por exemplo, um anticorpo humano para gerar um anticorpo quimérico ou 2) para um polipeptídeo não-imunoglobulina para gerar um anti- corpo de fusão. Em algumas modalidades, as regiões constantes são truncadas ou removi- das para gerar o desejado fragmento de anticorpo de um anticorpo monoclonal. A mutagê- nese de alta densidade ou sítio-direcionada da região variável pode ser usada para otimizar especificidade, afinidade, etc., de um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades da presente invenção, o anticorpo monoclonal contra um

marcador de células tronco cancerosas é um anticorpo humanizado. Anticorpos humaniza- dos são anticorpos que contêm seqüências mínimas de anticorpos não humanos (por e- xemplo, murino) dentro das regiões variáveis. Esses anticorpos são utilizados terapeutica- mente para reduzir a antigenicidade e respostas HAMA (anticorpos humanos anti- camundongo) quando administrados a um indivíduo humano. Na prática, os anticorpos hu- manizados são tipicamente anticorpos humanos com um mínimo ou sem seqüências não- humanas. Um anticorpo humano é um anticorpo produzido por um humano ou um anticorpo com uma seqüência de aminoácidos correspondente a um anticorpo produzido por um hu- mano.

Anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando diversas técnicas conhe-

cidas na arte. Um anticorpo pode ser humanizado, substituindo os CDRs de um anticorpo humano com os de um anticorpo não-humano (por exemplo, rato, rato, coelho, hamster, etc), com a desejada especificidade, afinidade, e capacidade de seguir os métodos de (Jo- nes et al., 1986, Nature, 321 :522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verho- eyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). O anticorpo humanizado ainda pode ser modifi- cado pela substituição de outros resíduos, quer na quadro operativo variável humana e/ou dentro dos resíduos não-humanos substituídos para aperfeiçoar e otimizar a especificidade, afinidade e/ou capacidade do anticorpo.

A escolha de domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve humanos a serem u- sados na produção de anticorpos humanizados pode ser importante para reduzir a antigeni- cidade. De acordo com o método "best-fit", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é confrontada contra a biblioteca completa de seqüências aminoácidos de domí- nio variável humanas conhecidas. Assim, em certas modalidades, a seqüência aminoácido humana que é a mais homóloga àquela do anticorpo de roedor a partir da qual os CDRs são tomados é usada como a região do quadro operativo humano (FR) para o anticorpo humani- zado (Sims et al., 1993, J. Immunol, 151: 2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol, 196: 901). Outro método usa um determinado FR derivado da seqüência consenso de todos os anti- corpos humanos de um determinado subgrupo de cadeias leves ou pesadas e pode ser utili- zado para diversos diferentes anticorpos humanizados (Carter et al., 1992, PNAS1 89; 4285; Presta et al . de 1993, J. Immunol, 151: 2623). Em certas modalidades, uma combinação de métodos é usada para escolher o FR variável humana para usar na produção de anticorpos humanizados.

É ainda entendido que os anticorpos (por exemplo, roedores), a serem humaniza- dos devem manter alta afinidade quanto ao antígeno, bem como outras propriedades bioló- gicas favoráveis. Para atingir esta meta, anticorpos humanizados podem ser preparados por um processo de análise da seqüência progenitora proveniente do anticorpo de roedor a ser humanizada e as diversas seqüências humanizantes candidatas. Modelos imunoglobulina tridimensionais são disponíveis e familiares por aqueles usualmente versados na técnica. Programas de computador podem ser utilizados para ilustrar e apresentar as prováveis es- truturas conformacionais tridimensionais das seqüências anticorpo candidatas prováveis. A utilização de tais modelos permite a análise do provável papel dos resíduos na função do anticorpo a ser humanizado, ou seja, a capacidade do anticorpo candidato a se ligar ao seu antígeno. Desta forma, resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir dos anti- corpos parentais ao anticorpo humanizado recebedor tal que as desejadas características do anticorpo sejam conseguidas. Em geral, os resíduos nos CDRs da região de determina- ção antígeno (ou hiperregião variável) são mantidas a partir do anticorpo parental (por e- . 20 xemplo, o anticorpo de roedor com as desejadas propriedades antígeno-ligantes) no anti- corpo humanizado para ligação ao antígeno. Em certas modalidades, pelo menos, um resí- duo adicional contido na FR variável é mantido proveniente do anticorpo parental no anticor- po humanizado. Em certas modalidades, até seis resíduos adicionais contidos na variável FR são mantidos provenientes do anticorpo parental no anticorpo humanizado. Aminoácidos das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas maduras de imu-

noglobulinas são designados Hx e Lx, respectivamente, onde χ é um número que designa a posição de um aminoácido, de acordo com o regime de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1987, 1991. Kabat lista muitas seqüências aminoácidos para anticorpos para cada subgrupo, e enumera os aminoácidos mais comumente ocorrentes para cada posição do resíduo naquele subgrupo para gerar uma seqüência de consenso. Kabat utiliza um método de atribuição de um núme- ro de resíduo para cada aminoácido em uma seqüência listada, e esse método para consig- nar números de resíduo tem se tornado padrão nesse âmbito. O esquema de Kabat é possí- vel de ser estendido a outros anticorpos não inclusos nesse compêndio mediante alinha- mento do anticorpo em questão com uma das seqüências de consenso em Kabat mediante referência aos aminoácidos conservados. A utilização do sistema de numeração Kabat fa- cilmente identifica aminoácidos em posições equivalentes nos diferentes anticorpos. Por exemplo, um aminoácido na posição L50 de um anticorpo humano ocupa a posição equiva- lente a um aminoácido L50 posição de um anticorpo camundongo. Além disso, quaisquer duas seqüências de anticorpos podem ser exclusivamente alinhadas, por exemplo, para determinar o percentual de identidade, utilizando o sistema de numeração Kabat tal que ca- da aminoácido em uma seqüência anticorpo esteja alinhado com o aminoácido na outra se- qüência que tenha o mesmo número Kabat. Após o alinhamento, se uma região anticorpo de um indivíduo (por exemplo, a região variável madura completa de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a porcen- tagem de identidade de seqüências entre as revestimentos anticorpos do indivíduo e de re- ferência é o número de posicoes ocupadas pelo mesmo aminoácido tanto na região do indi- víduo e de referência dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com espaços não contados, multipliado por 200 para converter para porcentagem.

O Exemplo 1 abaixo descreve a produção de representativos anticorpor anti-DLL4 humanizados que se ligam especificamente a DLL4 humana, um marcador de células tronco cancerosas da presente revelação (21M18 H9L2, ATCC depósito No. PTA-8427 e 21M18 H7L2, ATCC depósito No. PTA-8425, depositado em 10 de maio de 2007; (American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 E.U.A.)). Em certas modalidades, os anticorpos humanizados compreendem regiões de determinação de antígeno não humano derivadas de anticorpo monoclonao murino 21M18. Especificamente, . 20 em certas modalidades, um ou CDRs mais de cadeia pesada provenientes do anticorpo de roedor parental, CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; ou SEQ ID NO: 4, que variam na posição 52a de Kabat), e CDR3 (SEQ ID NO: 5) são mantidos no anti- corpo 21M18 humanizado. Em certas modalidades, um ou mais dos CDRs de cadeia leve proveniente do anticorpo de roedor parental, CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10), e CDR3 (SEQ ID NO: 11), são mantidos no anticorpo 21M18 humanizado. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados adicionalmente compreendem pelo menos uma FR substituição dentro da região variável humana de cadeia pesada ou leve.

Em certas modalidades, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado que especificamente se liga a um epítopo DLL4 humanos formado por uma combinação da regi- ão N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano (SEQ ID NO: 26), em que o anticorpo influencia o crescimento de um tumor. Em certas modalidades, o anticorpo huma- nizado é um anticorpo IgG intacto. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado é um anticorpo lgG2 intacto. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado é um fragmento de anticorpo. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado é um fragmento Fab. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado da presente invenção compreende

uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma região de determinação de antígeno não humano e uma região do quadro operativo variável humano. Em certas modalidades, a região de determinação de antígeno não humano compreende regiões de determinação da complementaridade (CDRs) de origem roedores. Em certas modalidades, a região de determinação de antígeno não humano compreende CDRs provenientes de um anticorpo camundongo. Em certas modalidades, os CDRs de roedores derivam de anticorpo monoclonal 21M18, onde 21M18 compreende uma região variável de cadeia pesada desig- nada SEQ ID NO: 6. Em determinadas modalidades, o anticorpo humanizado compreende uma região Vh que compreende uma seqüência de aminoácidos de (a) CDR1 (SEQ ID NO: 1), CDR2 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3; ou SEQ ID NO: 4), e CDR3 (SEQ ID NO: 5) ou (b) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, a região do quadro operativo variável de cadeia pesada

humana compreende seqüências humanas expressas. Em certas modalidades, pelo menos, um resíduo na região do quadro operativo variável humano está substituído. Em certas mo- dalidades, pelo menos, um resíduo na região do quadro operativo variável de cadeia pesada humana está em uma posição selecionada a partir do grupo constituído por 16, 20, 27, 28, 38 e 48 baseiam-se no sistema de numeração Kabat. Em certas modalidades, as posições 16, 20, 27, 28, 38, e 48 estão substituídas com base no sistema de numeração Kabat. Em certas modalidades, pelo menos, um resíduo na região do quadro operativo variável humano está substituído com um resíduo que ocupa a correspondente posição em um anticorpo que compreende a região na região do quadro operativo variável humano está substituída por um resíduo que ocupa a posição correspondente em um anticorpo que compreende a região de determinação de antígeno não humano.

Em certas modalidades, a região do quadro operativo variável de cadeia pesada humana compreende IGH(V)I-18. Em certas modalidades, pelo menos, um resíduo na regi- ão do quadro operativo variável humano está substituído. Em certas modalidades, pelo me- nos, um resíduo na região do quadro operativo variável de cadeia pesada humana está em uma posição selecionada a partir do grupo que compreende 20H, 28H, 38H, 48h, e 69H com base no sistema de numeração de Kabat. Em certas modalidades, as posições 20H, 28H, 38H, 48h, e 69H estão substituídas com base no sistema de numeração Kabat. Em certas modalidades, pelo menos, um resíduo na região do quadro operativo variável humano está substituída por um resíduo que ocupa a posição correspondente em um anticorpo que com- preende a região de determinação de antígeno não humano.

Em certas modalidades, o anticorpo humanizado da presente invenção compreende uma cadeia leve variável (VL) que compreende uma região de determinação de antígeno não humano e uma região do quadro operativo variável humano. Em certas modalidades, a região de determinação de antígeno não humano compreende CDRs de roedor origem. Em certas modalidades, a região de determinação de antígeno não humano compreende CDRs de um anticorpo camundongo. Em certas modalidades, os CDRs derivam de anticorpo mo- noclonal 21Μ18, em que 21M18 compreende uma região Vl designada SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, a região Vl compreende uma seqüência aminoácido de (a) CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10), e CDR3 (NO SEQ LD: 11) ou (b) SEQ ID NO : 12.

Em certas modalidades, a região do quadro operativo variável de cadeia leve hu- mana compreende IGK (V) 4-1. Em certas modalidades, pelo menos, um resíduo na região do quadro operativo variável de cadeia leve humana está substituído. Em certas modalida- des, pelo menos, um resíduo na região do quadro operativo variável humano está em uma posição selecionada a partir do grupo que compreende 22L e 36L com base no sistema de numeração de Kabat. Em certas modalidades, as posições 22L e 36L estão substituídos com base no sistema de numeração de Kabat. Em certas modalidades, pelo menos, um resíduo proveniente da região do quadro operativo variável humano está substituída por um resíduo que ocupa a posição correspondente em um anticorpo que compreende a região de determinação de antígeno não humano.

Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção é um anticorpo que compete com o anticorpo 21M18 quanto a específica ligação a DLL4 humana, onde o anti- corpo 21M18 compreende: (a) uma cadeia pesada com uma região variável designada SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8 e (b) uma cadeia leve com uma região variável designada SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado é um anticorpo ou um anticorpo humano. Em certas modalidades, o anticorpo humanizado que se liga especificamente a um

epítopo DLL4 humano formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e domínio DSL humano (SEQ ID NO: 26), onde o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 12. Em algumas moda- lidades, a região variável de cadeia pesada tem pelo menos 95% de identidade de seqüên- cia para SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve tem pelo menos 95% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 12. Em algumas modali- dades, a região variável de cadeia pesada tem pelo menos 99% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve tem pelo menos 99% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 12.

Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma isolada molécula de poli- nucleotídeo que codifica um anticorpo humanizado que se liga especificamente a um epíto- po DLL4 humano formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano ( SEQ ID NO: 26), onde o anticorpo compreende uma região Vh que compreende uma região de determinação de antígeno não humano que codifica CDR1 (SEQ ID NO: 1); CDR2 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou seja, SEQ ID NO: 4); e CDR3 (SEQ ID NO: 5) e uma região do quadro operativo variável humano que codifica IGH(V) 1- 18. Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma isolada molécula de polinu- cleotídeo que codifica um anticorpo humanizado que se liga especificamente a um epítopo DLL4 humano formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano (SEQ ID NO : 26), onde a molécula de polinucleotídeo é seleciona- da a partir do grupo que compreende: (a) uma molécula de polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8 e (b) uma molé- cula polinucleotídeo que se hibridiza ao complemento da molécula de polinucleotídeo de acordo com (a) sob rigorosas condições de hibridização. Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma isolada molécula de polinucleotídeo que codifica um anticorpo huma- nizado que se liga especificamente a um epítopo DLL4 humano formado por uma combina- ção da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano (SEQ ID NO : 26), onde a molécula de polinucleotídeo é selecionada a partir do grupo constituído por (a) SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 15 e (b) uma molécula de polinucleotídeo que se hibridiza ao complemento da molécula de polinucleotídeo, de acordo com (a), sob rigorosas condições de hibridização.

Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma isolada molécula de poli- nucleotídeo que codifica um anticorpo humanizado que se liga especificamente a um epíto- po DLL4 humano formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano ( SEQ ID NO: 26), onde o onde o anticorpo compreende uma região VL que compreende uma região de determinação de antígeno não humano que codifica CDR1 (SEQ ID NO: 9); CDR2 (SEQ ID NO: 10); e CDR3 (SEQ ID NO: 11) e uma região do quadro operativo variável humano que compreende IGK(V) 4-1. Em certas modalidades, a presente invenção fornece uma isolada molécula de polinucleotídeo que codifica um anti- corpo humanizado que se liga especificamente a um epítopo DLL4 humano formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano (SEQ ID NO : 26), onde a molécula de polinucleotídeo é selecionada a partir do grupo que com- preende: (a) uma molécula polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 e (b) uma molécula de polinucleotídeo que se hibridiza ao complemento da molécula polinucleotídeo acordo a (a), sob rigorosas condições de hibridização. Em certas modalida- des, a presente invenção fornece uma isolada molécula de polinucleotídeo que codifica um anticorpo humanizado que se liga especificamente a um epítopo DLL4 humano formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL humano (SEQ ID NO: 26), onde a molécula de polinucleotídeo é selecionada a partir do grupo constituído por (a) SEQ ID NO: 16 e (b) uma molécula de polinucleotídeo que se hibridiza ao comple- mento da molécula de polinucleotídeo, de acordo com (a), sob rigorosas condições de hibri- dização. Em certas modalidades é provido um vetor de expressão que compreende uma iso- lada molécula de polinucleotídeo da presente invenção. Em certas modalidades é provida uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão que compreende uma isola- da molécula de polinucleotídeo da presente invenção.

Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de

câncer em um paciente que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um anticorpo humanizado da presente revelação. Em certas modalida- des, o câncer compreende o câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer pancreático, câncer de próstata, ou câncer de cabeça e pescoço. Em certas modalidades, a presente invenção fornece um kit composto por um reci-

piente e uma composição nele contida, onde a composição compreende um anticorpo hu- manizado da presente revelação, e ainda inclui uma bula indicativa de que a composição pode ser usada para tratar câncer.

Além disso, anticorpos totalmente humanos podem ser preparados diretamente uti- Iizando diversas técnicas conhecidas na arte. Linfócitos B humanos imortalizados imuniza- dos in vitro ou isolados a partir de um indivíduo imunizado que produzem um anticorpo diri- gido contra um antígeno alvo podem ser gerados (ver, por exemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Terás, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (l):86-95; and U.S. Patent 5,750,373). Além disso, os anticorpos humanos podem ser selecionados a partir de uma biblioteca Fago, onde essa biblioteca Fago expressa anticor- pos humanos (Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314; Sheets et al., 1998, Proc. Nat1I. Acad. SCL, 95:6157-6162; Hoogenboom e Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381; Marks et al., 1991, J. Biol Mol, 222:581). Anticorpos humanos também podem ser produzidos em camundongos transgênicos contendo sítios de imunoglobulina humana que são capazes quando da imunização de produzir o repertorio completo de anticorpos humanos na ausên- cia da produção de imunoglobulina endógena. Esta abordagem é descrita na Patentes U.S. No. 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 e 5661016.

Esta invenção também engloba anticorpos biespecíficos que especificamente reco- nhecem um marcador de células tronco cancerosas. Anticorpos biespecíficos são anticorpos que são capazes de especificamente reconhecer e se ligar a pelo menos dois diferentes epítopos. Os diferentes epítopos podem estar contidos numa mesma molécula (por exem- plo, o mesmo polipeptídeo marcador de células tronco cancerosas) ou em diferentes molé- culas de tal ordem que ambos, por exemplo, os anticorpos podem especificamente reconhe- cer e associar um marcador células tronco cancerosas, bem como, por exemplo, 1) uma molécula efetora em um leucócito, tal como um receptor de células T (CD3, por exemplo) ou receptor Fc (por exemplo, CD64, CD32, CDL ou 6) ou 2) um agente citotóxico, como descri- to em detalhes abaixo. Anticorpos biespecíficos podem ser anticorpos intactos ou fragmen- tos de anticorpos.

Representativos anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes, pelo menos um dos quais se origina de um polipeptídeo da invenção. Em alternativa, um braço anti anti-gênico de uma molécula imunoglobulina pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula desencadeante em um leucócitos, como uma molécula recepto- ra de célula-T (por exemplo, CD2, CD3, CD28, ou B7) ou receptores Fc para IgG1 de modo a enfocar mecanismos de defesa para a célula que expressa o antígeno específico. Anticor- pos biespecíficos também podem ser utilizados para orientar agentes citotóxicos para as células que expressam um determinado antígeno. Estes anticorpos possuem um braço antí- geno-ligante e um braço que se liga um agente citotóxico ou um radionuclido quelante, como EOTUBE, DPTA, DOTA, ou TETA. Técnicas para produzir anticorpos biespecíficos são co- muns na arte (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539, Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121: 120; Traunecker et al, 1991, EMSOJ. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Im- munol. 148:1547-1553; Gruberetal., 1994, J. Immunol. 152:5368; e U. S. Patent 5731, 168). Anticorpos com mais de duas valências estão também contemplados. Por exemplo, anticor- pos triespecíficos podem ser preparados (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).

Em certas modalidades se provê um fragmento de anticorpo para, por exemplo, aumentar a penetração tumoral. Diversas técnicas são conhecidas para a produção de fragmentos anticorpos: Tradicionalmente, esses fragmentos são derivados através da diges- tão proteolítica de anticorpos intactos (por exemplo Morimoto et al., 1993, Journal of Bio- chemical and Biophysical Methods 24:107-117, Brennan et al. 1985, Science, 229:81). Em certas modalidades, os fragmentos anticorpos são produzidos de forma recombinante. Fragmentos anticorpos Fab, Fv e Fv podem ser todos expressos e secretados a partir de E.coli o outras células hospedeiras, permitindo desse modo a produção de grandes quanti- dades desses fragmentos. Tais fragmentos anticorpos podem ser também isolados a partir das bibliotecas Fago anticorpo como descrito na Patente U.S. No. 5641870, por exemplo, e podem ser monoespecífico ou bispecíficos. Outras técnicas para a produção de fragmentos anticorpos serão evidentes por aqueles usualmente versados na técnica. De acordo com a presente invenção, as técnicas podem ser adaptadas para a pro-

dução de anticorpos de cadeia única específicos para um polipeptídeo da invenção (ver Pa- tente U.S. No. No. 4946778). Além disso, os métodos podem ser adaptados para a constru- ção de bibliotecas de expressão Fab (HUSE, et al., Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir uma rápida e efetiva identificação dos fragmentos Fab monoclonal com a desejada especificidade para o ligando DLL4 ao receptor Notch, ou seus derivados, fragmentos ou homólogos. Fragmentos anticorpos que contenham os idiotipos a um polipeptídeo da inven- ção podem ser produzidos por técnicas conhecidas na arte que incluem, mas não estão Iimi- tadas a: um fragmento F (ab') 2 produzido pela digestão pepsina de uma molécula anticor- po, (b) um fragmento Fab gerado através da redução das pontes dissulfeto de um fragmento F(ab')2, um fragmento Fab gerado pelo tratamento da molécula anticorpo com papaína e um agente redutor, e (d) fragmentos Fv.

Pode ainda ser desejável, especialmente no caso fragmentos de anticorpos, modifi-

car um anticorpo, a fim de aumentar a sua meia-vida sérica. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela incorporação de um epítopo Iigante de receptor de salvamento no fragmento anticorpo pela mutação da apropriada região no fragmento anticorpo ou pela incorporação do epítopo em uma etiqueta peptídeo que é em seguida fundida ao fragmento anticorpo em uma ou outra extremidade ou na parte intermediária (por exemplo, por ADN ou síntese pép- tica).

Anticorpos heterocongjugados também estão dentro do âmbito da presente inven- ção. Anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos unidos de modo cova- lente. Tais anticorpos são propostos, por exemplo, para apontar as células imuno para as células indesejadas (Patente U.S. No. 4676980). É contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na síntese química protéica, incluindo as que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas utilizando uma reação de troca dissulfeto ou pela formação de uma ligação tioéter. Exem- plos de reagentes adequados para este efeito incluem iminotiolato e metil-4- mercaptobutimidato.

Para efeitos da presente invenção, deve ser notado que anticorpos modificados po- dem incluir qualquer tipo de região variável que proporcione quanto a associação do anti- corpo com o polipeptídeo de DLL4 humano. Neste contexto, a região variável pode incluir ou ser proveniente de qualquer tipo de mamífero que possa ser induzido a montar uma respos- ta humoral e gerar imunoglobulinas contra o desejado anticorpo associado ao tumor. Como tal, a região variável dos anticorpos modificados pode ser, por exemplo, de origem humana, murina, primata não humano (por exemplo, macacos cynomolgus, macaco, etc.) ou lupina. Em algumas modalidades, ecursos humanos, murinos, primatas não-humanos (por exem- plo, macacos cynomolgus, macaques, etc) ou tremoço origem. Em algumas modalidades as regiões tanto variáveis e constantes das imunoglobulinas modificadas são humanas. Em outras regiões das modalidades as regiões variáveis dos anticorpos compatíveis (usualmen- te derivados de uma fonte não humana) podem ser produzidas ou especificamente modela- das para melhorar as propriedades lígantes ou reducir a imunogenicídade da molécula. Nes- te contexto, regiões variáveis úteis na presente invenção podem ser humanizadas ou de outro modo alteradas através da inclusão de seqüências aminoácidos importadas.

Os domínios variáveis tanto das cadeias pesadas e leve são alterados mediante pe- lo menos substituição parcial de um ou mais CDRs e, se necessário, pela substituição parei- al da região do quadro operativo e alteração da seqüência. Embora os CDRs possam ser derivados de um anticorpo da mesma classe ou ainda subclasse como o anticorpo a partir do qual as regiões do quadro operativo são derivadas, é vislumbrado que osa CDRs serão derivados a partir de um anticorpo de classe difte e preferivelmente a partir de um anticorpo proveniente de uma espécie diferente. Pode não ser necessário substituir todos os CDRs com os CDRs completos da região variável doadora para transferir a capacidade antígeno- Iigante de um domínio variável para um outro. Pelo contrário, pode ser apenas necessário transferir aqueles resíduos que sejam necessários para manter a atividade do sítio antígeno- ligante. Em função da explanação apresentada nas Patentes U.S. No. 5585089, 5693761 e 5693762, estará no contexto daqueles usualmente versados na técnica realizar experimen- tação rotineira ou método de tentativa e erro para a obtenção de um anticorpo funcionai com reduzida imunogenicidade.

Alterações à região variável não condizentes, aqueles qualificados na arte irão a - preciar que os anticorpos modificados da presente invenção compreenderão anticorpos, seus fragmentos imunorreativos, em que pelo menos uma fração de um ou mais dos domí- nios de região constante foram suprimidos ou de outro modo alterados de modo a propor- cionar as desejadas características bioquímicas tal como aumentada localização no tumor ou reduzida meia-vida sérica quando comparado com um anticorpo de aproximadamente a mesma imunogenicidade compreendendo uma região constante natural ou inalterada. Em algumas modalidades, a região constante dos anticorpos modificados irá compreender uma região constante humana. Modificações para a região constante compatível com esta inven- ção compreende aditamentos, supressões ou substituições de uma ou mais aminoácidos, em um ou mais domínios. Ou seja, os anticorpos modificados divulgados neste documento podem incluir alterações ou modificações para um ou mais dos três domínios constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) e/ou para a domínio constante de cadeia leve (CL). Em algumas modalidades da invenção as regiões constantes modificadas em que um ou mais domínios são parcialmente ou inteiramente suprimidos são contemplados. Em algumas mo- dalidades, os anticorpos modificados irão compreender construtos de domínio suprimido ou variantes em que o domínio CH2 completo foi removido (ACH2). Em algumas modalidades, o omitido domínio de região constante será substituído por um separador aminoácido curto (por exemplo, 10 resíduos) que proporcione parte da flexibilidade molecular tipicamente con- ferida pela região constante ausente.

Além de sua configuração, é sabido que a região constante media diversas funções efetoras. Por exemplo, a ligação do componente C1 do complementodo aos anticorpos ativa o sistema complementar. A ativação do complemento é importante na opsonização e Iise de patógenos celulares. A ativação do complemento também estimula a resposta inflamatória e pode também estar envolvida na hipersensibilidade autoimune. Além disso, os anticorpos se ligam às células através da região Fc1 com um sítio receptor Fc na região Fc do anticorpo Iigante a um receptor Fc (FcR) numa célula. Existe um número de receptores Fc que são específicos para diferentes classes de anticorpo, incluindo IgG (receptores gama), IgE (re- ceptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores um). A ligação dos anticorpos aos re- ceptores Fc nas superfícies celulares desencadeia uma série de importantes e diversas res- postas biológicas incluindo o engolimento e a destruição de partículas anticorpo-revestidas, liberação de imuno-complexos, Iise de células-alvos pelas células assassinas (chamada citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente, ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle da produção de imunoglobulina. Embora diversos receptores Fc e sítios receptores tenham sido estudados até um certo nível, existe ainda muito desconhecimento acerca de seu posicionamento, estrutura e funcionamento.

Embora não limitando o escopo da presente invenção, acredita-se que os anticor- pos que compreendem regiões constantes modificadas conforme descrito aqui proporcio- nam alteradas funções efetoras as quais, por sua vez, influenciam o perfil biológico do anti- corpo administrado. Por exemplo, a eliminação ou inativação (através de mutações pontuais ou por outros meios), de um domínio de região constante pode reduzir a ligação do receptor Fc do anticorpo modificado aumentando desse modo a localização do tumor. Em outros ca- sos, pode ser que modificações da região constante consistentes com essa invenção, mode- rem a ligação complementar e, desse modo, reduza a meia-vida sérica e associação não específica de uma citotoxina conjugada. Ainda outras modificações da região constante po- dem ser usadas para eliminar ligações dissulfeto ou frações oligossacarídeos que permitam quanto a aprimorada localização devido à aumentada especificidade do antígeno ou flexibili- dade do anticorpo. De modo similar, as modificações da região constnate de acordo com essa invenção podem facilmente ser produzidas usando conhecidas técnicas bioquímicas ou moleculares bem inseridas no conhecimento daqueles usualmente versados na técnica.

Será notado que anticorpos modificados podem ser produzidos para fundir o domí- nio CH3 diretamente à região de articulação dos respectivos anticorpos modificados. Em outros construtos pode ser desejável fornecer um separador peptídeo entre a região de arti- culação e os modificados domínios CH2 e/ou CH3. Por exemplo, construtos compatíveis podem ser expressos onde o domínio CH2 tenham sido apagados e o restante domínio CH3 (modificado ou não modificado) está unido a região de articulação com um separador de 5/20 aminoácidos. Tal separador pode ser adicionado, por exemplo, para garantir que os elementos regulatórios do domínio constante se mantenham livres ou acessíveis ou que aquela região de articulação permaneça flexível. Todavia, deverá ser notado que os separa- dores aminoácidos pode, em alguns casos, se provarem ser imunogênicos e eliciar uma resposta imuno indesejável contra o construto. Conseqüentemente, qualquer separador a- crescentado ao construto. Assim, qualquer separador que seja adicionado ao construto pode ser relativamente não imunogênico ou ainda omitido por completo, se as desejadas qualida- des bioquímicas dos anticorpos modificados possam ser mantidas.

Além da supressão de todos os domínios de regiões constantes, será apreciado que os anticorpos da presente invenção podem ser providos pela supressão parcial ou subs- tituição de alguns ou até mesmo um único aminoácido. Por exemplo, a mutação de um úni- co aminoácido em áreas selecionadas do Domínio CH2 pode ser suficiente para reduzir substancialmente ligação Fc e assim aumentar a localização tumoral. Do mesmo modo, po- de ser desejável simplesmente apagar aquela parte de um ou mais domínios de região constante que controla a função efetora (por exemplo, ligação CLQ complementar) a ser modulada. Tais supressões parciais das regiões constantes podem melhrar as característi- cas selecionadas do anticorpo (meia-vida sérica) ao mesmo tempo em que deixando outras funções desejáveis associadas com o domínio da região constante do indivíduo intactas. Além disso, como mencionou anteriormente, as regiões constantes do anticorpo revelado podem sr modificada através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos que melhora o perfil do construto resultante. Nesse respeito pode ser possível romper a ativida- de provida por um sítio Iigante conservado (ligação Fc), enquanto que substancialmente mantendo a configuração e o perfil imunogênico do anticorpo modificado. Certas modalida- des podem incluir a adição de um ou mais aminoácidos à região constante para melhorar as características desejáveis, tais como função efetora ou prever por mais citotoxina ou anexa- ção carboidrato. Nessas modalidades pode ser desejável inserir ou replicar específicas se- qüências derivadas dos domínios de região constante.

A presente invenção adicionalmente abrange variantes e equivalentes que são substancialmente homólogos aos anticorpos quiméricos, humanizados e humanos, ou frag- mentos anticorpos desses provenientes, apresentados aqui. Estes podem conter, por exem- pio, mutações de substituição conservativa, isto é, substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos semelhantes. Por exemplo, substituição conservadora refere à substituição de um aminoácido com um outro dentro da mesma classe geral como, por exemplo, um áci- do amino com um outro aminoácido de caráter ácido, um aminoácido de caráter básico com um outro aminoácido básico ou um aminoácido neutro por outro aminoácido de caráter neu- tro. O que é pretendido por uma substituição aminoácido conservadora é bem conhecido na arte.

A invenção também pertence à immunoconjugados que compreende um anticorpo conjugado a um agente citotóxico. Agentes citotóxicos incluem agentes quimioterapêuticos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, uma toxina enzimaticamente de fonte bacteriana, fúngica, vegetal, ou animal), isótopos radioativos (ou seja, um radioconju- gado), etc., agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais I no geração de tais imuno- conjugados incluem, por exemplo, metotrexato, adriamicin, doxorrubicina, melfalano, mito- micina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes de intercalação. ou outros agentes. Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não Iigantes da toxina difteria, caceia A de exotoxina, cadeia A ricina, cadeia A modecina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, prote- ínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor momordica charantia, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelolin, restrictocin, phenomycin, e- nomycin, e o tricothecenes. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser conjugados com radioisótopos, como 90Y, 1251, 1311, 1231, "1 IN, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re e 188Re usando qualquer um de uma série de bem conhecidos quelantes ou marcação direta. Em outros, a divulgação pode incluir composições anticorpos associada à droga, prodrogas ou Iinfocinas como o interferon. Conjugados do anticorpo e agente citotó- xico são feitos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento proteína-bifuncional como a N-succinimidil-3-(2-piridiiditiol) propionato (SPDP), iminotiolane (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como HCI adipimidato de dimetilamônio), ésteres ativos (como suberato de disuccinimidila), aldeídos (como glutareldeído), bis-azido compostos (tais como bis(p-azidobenzoilil) hexanodiamina), bís-diazônio derivados (como o bis-(p- diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato), e compos- tos flúor bis-ativos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Conjugados de anticorpos e de uma pequena molécula um ou mais toxinas, tais como um caliqueamicina, maytansinoids, um trichothene, e CC1065, e os derivados destas toxinas que têm atividade toxina, também podem ser utilizados. Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser modificados com- plexada com outras imunologicamente ativo Iigantes (por exemplo, anticorpos ou fragmentos do mesmo) em que a molécula resultante liga-se tanto à célula neoplásica e célula efetora, tal como uma célula-T.

Independentemente de quantas quantidades úteis sejam obtidas, os anticorpos da

presente invenção podem ser usados em qualquer um de uma série de conjugado (isto é, um immunoconjugado) ou não conjugada formas. Alternativamente, os anticorpos da pre- sente invenção podem ser usados numa forma não conjugada ou forma "nua" para intuir os mecanismos de defesas naturais do indivíduo, incluindo citotoxicidade dependente do com- plemento (CDC) e de toxicidade celular anticorpo dependente (ADCC) para eliminar as célu- las malignas. A seleção de qual anticorpo conjugado ou não conjugado utilizar varia depen- dendo do tipo e do estágio do câncer, uso do tratamento adjunto (por exemplo, quimiotera- pia ou radiação externa) e condição do paciente. Será apreciado por aqueles usualmente versados na técnica que é possível realizar facilmente uma tal seleção em vista das técnicas aqui apresentadas.

Os anticorpos da presente invenção podem ser analisados para ligação imunoes- pecífica por qualquer método conhecido na arte. Os imunoensaios que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, sistemas ensaio competitivos e não competitivos que utilizam técnicas tais como análises BIAcore1 análises FACS1 imunocitoquímica, Western Blots, radioimunoensaios, ELISA imunoensaios "sanduíche", ensios de imunoprecipitação, reações precipitina, reações precipitida por difusão em gel, ensaios de imunodifusao, ensai- os de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunoradiométricos, imuno- ensaios fluorescentes e imunoensais de proteína A. Esses ensaios são rotineiros e bem co- nhecidos na arte (ver, por exemplo, Ausubel et al, eds, 1994, no atual Protocolos Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, que é incorporada por referência aqui na sua totalidade).

Em algumas modalidades, a imunoespecificidade de um anticorpo contra um mar-

cador de células tronco cancerosas é determinado pelo método Elisa. Um teste ELISA com- preende preparar antígeno, revestir as cavas de uma placa de microtitulação com 96 cavas com antígeno, adicionando o anticorpo contra um marcador ce células tronco cancerosas conjugado a um composto detectável tal como um substrato enzimático (por exemplo, hor- seradish peroxidase ou fosfatase alcalina), para a cava, incubar por um período de tempo e detectar a presença do antígeno. Em algumas modalidades, o anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas não está conjugado a um composto detectável, mas em lugar disso a um segundo anticorpo conjugado que reconhece o anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas é adicionado à cava. Em algumas modalidades, em lugar de re- vestir a cava com o antígeno, o anticorpo contra o marcador de células tronco cancerosas pode ser revestido à cava e um segundo anticorpo conjugado a um composto detectável pode ser acrescentado em seguida da adição do antígeno à cava revestida. Aqueles usual- mente versados na técnica terão os conhecimentos de como os parâmetros podem ser mo- dificados para aumentar o sinal detectado bem como outras variações de ELISAs conheci- das na arte (ver e.g. Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1).

A afinidade Iigante de um anticorpo a um antígeno marcador de células tronco can- cerosas e a taxa de dissociação da interação antígeno-anticorpo pode ser determinada atra- vés de ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio competitivo é um radioi- munoensaio que compreende a incubação do antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 125I), ou fragmento ou variante dele, com o anticorpo de interesse, na presença de quantidades crescentes de antígeno marcadas seguido pela detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade dos anticorpos contra um marcador de células tronco cancerosas as taxas de dissociação da ligação pode ser determinada a partir dos dados por análise de marcação Scatchard. Em algumas modalidades, a análise cinética BIAcore é utilizada para determinar a ligação dentro e fora das taxas de anticorpos contra um marcador de células tronco cancerosas. A análise cinética BIAcore cinética compreende analisar a ligação e dis- sociação de anticorpos a partir de chips com antígenos marcadores de células tronco cance- rosas imobilizados em sua superfície.

Em certas modalidades, a invenção engloba polinucleotídeos isolados que codifi- cam um polipeptídeo que compreende um anticorpo ou fragmento, contra DLL4 humanos. Assim, o termo "polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo" engloba um polinucleotídeo que inclui apenas seqüências codificadoras para o polipeptídeo, bem como um polinucleotí- deo que inclui codificação adicional e/ou seqüências não codificadoras. Os polinucleotídeos da invenção podem estar na forma de RNA, ou sob a forma de ADN. ADN inclui cADN, ADN genômico, e sintéticos de ADN, e pode ser de dupla fita ou de fita única, e se de fita única pode ser de fita codificadora e fita não codificadora (anti-sentido).

A presente invenção diz respeito a novas variantes dos descritos até o momento polinucleotídeos codificadores, por exemplo, de fragmentos análogos, e derivados. A varian- te do polinucleotídeo pode ser uma variante alélica naturalmente ocorrente do polinucleotí- deo ou uma variante não naturalmente ocorrente do polinucleotídeo. Em certas modalida- des, o polinucleotídeo pode ter uma seqüência codificadora que é uma variante alélica natu- ralmente ocorrente da seqüência codificadora dos polipeptídeos revelados. Como é conhe- cido na arte, uma variante alélica é uma forma alternativa de uma seqüência polinucleotídeo que possui, por exemplo, uma substituição, supressão, ou adição de um ou mais nucleotí- deos, os quais não alteram substancialmente a função do polipeptídeo codificado.

Em certas modalidades os polinucleotídeos compreendem uma seqüência codifica- dora para o polipeptídeo maduro fundido no mesmo quadro de leitura a um polinucleotídeo que ajuda, por exemplo, na expressão e secreção de um polipeptídeo proveniente de uma célula hospedeira (por exemplo, uma seqüência que funciona como uma seqüência líder que funciona como uma seqüência secretória para controlar o transporte de um polipeptídeo proveniente da célula). O polipeptídeo que possui uma seqüência líder é uma pré-proteína e pode ter a seqüência líder clivada pela célula hospedeira para formar a forma madura do polipeptídeo. Os polinucleotídeos podem ser também codificadores para uma pré-proteína que é a proteína madura mais resíduos aminoácidos 5' adicionais. Uma proteína madura possuindo uma pro-sequência é uma forma inativa da proteína. Uma vez a pro-sequência seja clivada uma proteína madura ativa permanece.

Em certas modalidades os polinucleotídeos compreendem a seqüência codificadora para o polipeptídeo maduro fundido no mesmo quadro de leitura a uma seqüência marcado- ra que permite, por exemplo, a purificação do polipeptídeo codificado. Por exemplo, a se- qüência marcadora pode ser uma etiqueta hexa-histidina fornecida por um vetor pQE-9 para prover quanto a purificação do polipeptídeo maduro fundido ao marcador no caso de um hospedeiro bacteriano, ou a seqüência marcadora pode ser uma etiqueta hemagglutiina (HA) derivada da proteína hemagglutinína influenza quando um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-7) é usado.

Em certas modalidades, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucléico isoladas, com uma seqüência nucleotídica, pelo menos, 80% idênticas, pelo menos 85% idênticas, pelo menos, 90% idênticas, pelo menos 95% idênticas, e em algumas modalida- des, pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende um anticorpo ou fragmento dele, contra DLL4 humano.

Por um polinucleotídeo que tem uma seqüência nucleotídica, pelo menos, por e- xemplo, 95% "idêntica" a uma seqüência nucleotídica referência é pretendido que a seqüên- cia nucleotídica do polinucleotídeo seja idêntica à seqüência de referência, exceto se a se- quência polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleotídeos da seqüência nucleotídica de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo possuindo uma seqüência nucleotídica pelo menos 95% idêntica a uma seqüência nucleotí- dica de referência, até 5% dos nucleotídeos na seqüência de referência podem ser suprimi- dos ou substituídos por um outro nucleotídeo, ou um número máximo de nucleotídeos, até 5% do total de nucleotídeos na seqüência de referência pode ser inserida na referência se- qüência. Estas mutações da seqüência de referência podem ocorrer nas posições amino- ou carbóxi-terminais, intercaladas ou individualmente em meio aos nucleotídeos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência.

Como uma questão prática, se uma determinada molécula do ácido nucléico é pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85% idêntica, pelo menos, 90% idêntica, e em algumas modalidades, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98 %, ou seja, 99% idêntica a uma seqüência de referência pode ser determinada de modo convencional usando programas conhecidos na prática computacional tal como o programa BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Ciência Dri- ve, Madison, Wl 53711 ). Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre as duas seqüências. Ao utilizar Bestfit ou qualquer outro programa de ali- nhamento de seqüência para determinar se uma determinada seqüência é, por exemplo, 95% idêntica a uma seqüência de referência, de acordo com a presente invenção, os parâ- metros são estabelecidos de tal ordem que o percentual de identidade é calculado ao longo do comprimento total do seqüência nucleotídica de referência e que as lacunas na homolo- gia de até 5% do número total de nucleotídeos na seqüência de referência são permitidos.

As variantes polinucleotídeos podem incluir alterações nas regiões de codificação, regiões não codificadoras, ou ambos. Em algumas modalidades as variantes polinucleotí- deos conter alterações que produzem substituições silenciosas, acréscimos ou supressões, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipeptídeo codificado. Em algumas modalidades, variantes nucleotídicas são produzidas pelas substituições silentes devido à degeneração do código genético. Variantes polinucleotídeos podem ser produzidas por uma variedade de razões como, por exemplo, para otimizar a expressão códon para um hospe- deiro particular (mudar códons em mRNA humano para aqueles preferidos por um hospedei- ro bacteriano tal como E.coli).

Os polipeptídeo da presente invenção podem ser polipeptídeos recombinantes, po-

lipeptídeos naturais ou polipeptídeos sintéticos que compreendem um anticorpo ou seu fragmento, contra DLL4 humanos. Será reconhecido na arte que algumas seqüências de aminoácidos a invenção podem ser variadas, sem efeito significativo da estrutura ou função da proteína. Assim, a invenção também inclui variações do polipeptídeos que revelam subs- tancial atividade ou que incluem regiões de um anticorpo ou seu fragmento, contra ptoyríns FLL4 humana. Tais mutantes incluem supressões, inserções, inversões, repetições, e subs- tituições tipo.

O polipeptídeos e análogos podem ser ainda modificados para conter frações quí- micas adicionais que não são normalmente parte da proteína. Essas moléculas derivadas podem melhorar a solubilidade, a semi-vida biológica ou a absorção das proteínas. As molé- culas também pode reduzir ou eliminar quaisquer efeitos colaterais desejáveis das proteínas e afins. Uma panorâmica para as moléculas podem ser encontradas no in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES5 20th ed„ Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

Os polipeptídeos isolados aqui descritos podem ser produzidos através de qualquer método adequado conhecido na arte. Esses métodos variam desde método sintéticos de proteína direta par construir uma seqüência ADN que codifica as seqüências polipeptídeos isoladas e expressar aquelas seqüências em um adequado hospedeiro transformado. Em algumas modalidades, uma seqüência de ADN é construída usando tecnologia recombinan- te para isolar ou sintetizar uma seqüência de ADN que codifica uma proteína tipo natural de interesse. Opcionalmente, a seqüência pode ser mutagenizada por mutagênese sítio- específicas para proporcionar seus análogos funcionais. Ver, por exemplo, Zoeller et al., Proc. Nat 7. Acad. Sei. E.U.A. 81:5662-5066 (1984) e Patente U.S. No. No. 4588585.

Em algumas modalidades uma seqüência de ADN codifica um polipeptídeo de inte- resse seria construída por síntese química utilizando um oligonucleotídeo sintetizador. Tais oligonucleotídeos podem ser concebidos com base na seqüência de aminoácidos do poli- peptídeo desejado e selecionar aqueles códons que sejam favoráveis na célula hospedeira nos quais o polipeptídeo recombinante de interesse será produzido. Métodos padrões po- dem ser aplicados para sintetizar uma seqüência polinucleotídeo isolada que codifica um polipeptídeo isolado de interesse. Por exemplo, uma seqüência completa de aminoácidos pode ser utilizada para construir um gene retro-traduzido. Além disso, um oligômero ADN contendo uma seqüência nucleotídica que codifica quanto ao particular "polipeptídeo isolado pode ser sintetizada. Por exemplo, diversos oligonucleotídeos pequenos que codificam por- ções do desejado polipeptídeo podem ser sintetizados e em seguida ligados. Os oligonucle- otídeos individuais contêm tipicamente apensos 5' e 3' para a montagem complementária.

Uma vez montados (por síntese, mutagênese sítio-dirigida ou outro método), as se- qüências polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo particular isolado de interesse se- rão inseridas dentro de um vetor de expressão e operativamente ligado a uma seqüência de controle de expressão apropriada para a expressão da proteína num hospedeiro desejado. A apropriada montagem pode ser confirmada pelo sequenciamento nucleotídeo, mapea- mento por restrição e expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um adequado hospedeiro. Como é bem conhecido na arte, a fim de obter elevados níveis de expressão de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene precisa estar operativamente ligado às seqüências de expressão transcricional e tradutivas que sejam funcionais no hospedeiro da expressão escolhida.

Vetores de expressão recombinantes são utilizados para amplificar e expressar ADN que codificam fusões de polipeptídeo marcador de células tronco cancerosas. Vetores de expressão recombinantes são construtos ADN replicáveis que possuem fragmentos ADN sintétidos ou cADN-derivados que codificam replicáveis ADN construtos que têm sintéticas ou cADN derivados de fragmentos de ADN que codifica uma fusão de polipeptídeo marca- dor de células tronco cancerosas ou um análogo bioequivalente operativamente ligado a elementos regulatórios transcricionais ou tradutivos derivados de genes mamíferos, microbi- anos, virais ou de insetos. Uma unidade transcricional geralmente compreende um conjunto de (1) um elemento ou elementos genéticos que tenham um papel regulador na expressão gênica, por exemplo, promotores transcricionais ou potenciadores, (2) uma seqüência estru- tural ou codificação que é transcrita para mRNA e traduzidos em proteínas, e (3) apropria- das seqüências de iniciação e terminação de transcrição e tradução, como descrito em deta- lhes adiante. Tais elementos podem incluir uma seqüência operadora para controlar a trans- crição. A capacidade de replicar em um hospedeiro, usualmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes pode ser adicionalmente incorporado. Regiões ADN estão operativamente ligadas quando elas estão funcionalmente relacionadas entre si. Por exemplo, o ADN de um peptídeo sinalizador (líder secretor)está operativamente ligado ao ADN para um polipeptídeo se ele é expresso como um precursor que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor é operativamen- te ligado a uma seqüência codificadora se ele controla a transcrição da seqüência; ou um sítio Iigante a ribossoma está operativamente ligado a uma seqüência codificadora se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. No geral, operativamente ligado significa contí- guo e, no caso de lideres secretantes, significa contíguo e em quadro de leitura. Elementos estruturais pretendidos para uso em sistemas de expressão de levedura incluem uma se- qüência líder que capacita secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hos- pedeira. Alternativamente, onde proteína recombinante é expressa sem uma seqüência líder ou de transporte, ela pode incluir um resíduo metionina N-terminal. Esse resíduo pode op- cionalmente ser em seguida clivado a partir da proteína recombinante expressa para pro- porcionar um produto final.

A escolha da seqüência de controle e vetor de expressão dependerá da escolha do

hospedeiro. Uma grande variedade de combinações expressão hospedeiro/vetor podem ser empregadas. Vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exem- plo, vetores que compreendem seqüências de controle de expressão de SV40, papiloma vírus bovino, adenovírus, e citomegalovírus. Vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos, tais como plasmídeos de Escherichia coli, incluindo PCR 1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de uma maior gama de hospedeiros, como M13 e fagos filamentosos de ADN de fita única.

Células hospedeiras adequadas para a expressão de uma proteína marcadora de células tronco cancerosas incluem procariotes, leveduras, insetos ou células eucarióticas superiores sob o controle de adequados promotores. Procariotes incluem organismos gram- negativos ou gram-positivos, por exemplo, E.coli, ou bacilli. Células eucarióticas superiores incluem linhagens celulares estabelecidas de origem mamífero como descrito adiante. Sis- temas de tradução livre de células podem ser também empregados. A apropriada clonagem e vetores de expressão para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, levedura e de mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vetors: A Laboratory Manual, El- sevier, NY, 1985), a informação pertinente é aqui incorporada por referência.

Diversos sistemas de cultura celular de mamíferos ou insetos são também empre- gados de modo vantajoso para expressar proteína recombinante. Expressão de proteínas recombinantes em células de mamíferos pode ser realizada, porque essas proteínas geral- mente são corretamente multiplicadas, devidamente adaptadas e completamente funcionais. Exemplos de adequadas linhagens de células de mamíferos incluem as linhagens COS-7 de células renais de macaco, descritos por Gluzman (Cell 23:175, 1981), e outras linhagens de células capazes de expressar um vetor adequado, incluindo, por exemplo, L células, C127, 3T3, ovário hamster chinês (CHO), HeLa e linhagens de células BHK. Vetores de expressão de mamíferos podem incluir elementos não transcritos tal como uma origem de replicação, um promotor adequado e aprimorador ligado ao gene a ser expresso, e outras seqüências não transcritas flanqueadoras 5' ou 3', tal como sítios Iigantes ribossomas necessários, um sítio de poliadenilação, doador de junção, e sítios aceptores, e seqüências de terminação transcricional. Sistemas baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de insetos são pesquisadas por Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado pode ser purificada, de acordo com qualquer método adequado. Tais métodos padrão incluem cromatografia (por exemplo, troca iônica, cromatografia em coluna de afinidade e dimensional), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra norma técnica de purificação de proteínas. Etiquetas de afinidade tais como domínios Iigantes hexaistidina, maltose, seqüência de co- bertura influenza e glutationa-S-transferase podem ser anexadas à proteína para permitir fácil purificação pela passagem sobre uma apropriada coluna de afinidade. As proteínas isoladas podem ser também caracterizadas fisicamente usando tais técnicas como proteóli- se, ressonância magnética nuclear e cristalografia de raios-S.

Por exemplo, sobrenadantes de sistemas que secretam proteína recombinante em meios de cultura podem ser primeiramente concentrados utilizando um filtro de concentra- ção de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Ami- con ou Millipore Pellicon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma adequada matriz de purificação. Alternativamente, uma resina trocadora de ânions po- de ser empregada, por exemplo, uma matriz ou substrato possuindo grupos apensos de dietilaminoetil (DEAE). As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextram, celulose ou outros tipos comumente empregados em purificação por proteínas. Em alternativa, uma eta- pa de troca catiônica pode ser empregada. Adequadoos trocadores catiônicos incluem di- versas matrizes insolúveis que compreendem SULFOPROPYL ou grupos carboximetila. Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alta performance de fase re- versa (RP-HPLC) empregando meio hidrofóbico RP-HPLC, por exemplo, sílica gel com a- pensos metil alifáticos ou outros grupos, pode ser empregada para purificar ainda mais uma composição proteína-Fc de células troncos cancerosas. Parte ou a totalidade das etapas de purificação, em diversas combinações, podem ser também empregadas para proporcionar uma proteína homogênea recombinante.

Proteína recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada, por e- xemplo, mediante extremidade inicial a partir de aglomerados de células, seguido por uma ou mais etapas de concentração, salgagem, troca iônica aquosa ou cromatografia de exclu- são dimensional. A cromatografia líquida de alta performance (HPLC) pode ser empregada para a etapa de purificação final. Células microbianas empregadas na expressão de uma proteína recombinante podem ser rompidas através de qualquer método conveniente, inclu- indo ciclos de congelamento descongelamento, sonicação, ruptura mecânica, ou uso de agentes de Iise celular.

A presente invenção fornece métodos para inibir o crescimento de células tumori- gênicas que expressam um marcador de células tronco cancerosas utilizando os anticorpos contra um marcador de células tronco cancerosas aqui descrito. Em certas modalidades, o método de inibir o crescimento de células tumorigênicas que expressam um marcador de células tronco cancerosas compreende contatar a célula com um anticorpo contra um mar- cador de células tronco cancerosas in vitro. Por exemplo, uma linhagem de célula imortali- zada ou uma linhagem de célula cancerosa que expressa um marcador de células tronco cancerosas é cultivado em meio ao qual é acrescentado um anticorpo contra o expresso marcador de células tronco cancerosa para inibir o crescimento celular. Em algumas moda- lidades, células tumorais que compreendem células tronco tumorais são isoladas a partir de uma amostra paciente, como, por exemplo, uma biópsia tecidual, derrame pleural, ou amos- tras de sangue e cultivadas em meio ao qual é acrescentado um anticorpo contra um mar- cador de células tronco cancerosas para inibir crescimento celular.

Em algumas modalidades, o método de inibir o crescimento de células tumorigêni- cas que expressam um marcador de células tronco cancerosas compreende contatar a célu- la com um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas in vivo. Em certas modalidades, o contato de uma célula tumorigênica com um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas é realizado em um modelo animal. Por exemplo, xenotrans- plantes expressando um marcador de células tronco cancerosas são cultivados em camun- dongos imunocomprometidos (por exemplo, camundongos NOD/SCID) que são administra- dos a um anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas para inibir o cresci- mento tumoral. Em algumas modalidades, células tronco cancerosas que expressam um marcador células tronco cancerosas são isolados a partir de uma amostra paciente, como, por exemplo, um biópsia tecidual, derrame pleural, ou sangue e injetado em camundongos imunocomprometidos que são então administradas a um anticorpo contra o marcador de células tronco cancerosas para inibir o crescimento de células tumorais. Em algumas moda- lidades, o anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas é administrado ao mesmo tempo ou pouco depois da introdução de células tumorigênicas ao animal para im- pedir o crescimento tumoral. Em algumas modalidades, o anticorpo contra um marcador de células tronco cancerosas é administrado como uma terapêutica após a células tumorigêni- cas terem crescido a um tamanho especificado.

A presente invenção prevê ainda composições farmacêuticas que compreende an- ticorpos que têm por alvo um marcador de células tronco cancerosas. Estas composições encontram uso farmacêutico na inibição do crescimento de células tumorais e tratamento do câncer em pacientes humanos.

Formulações são preparadas para o armazenamento e utilização mediante combi- nar um anticorpo purificado da presente invenção, com um veículo farmaceuticamente acei- tável (por exemplo: portador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). Adequados veículos farmaceuticamente aceitáveis in- cluem, mas não estão limitados a, tampões não tóxicos, como fosfato, citrato, e outros áci- dos orgânicos; sais, como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metio- nina; conservantes (cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (por exemplo, inferiores a cerca de 10 resíduos de aminoácidos); proteínas como a albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofíli- cos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; carboidratos, como monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelatantes tais como EDTA; açúcares como a sacarose, manitol, sorbitol e trealose; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos proteína-Zn) e não-iónicos, como Tween ou de polietileno glicol (PEG).

A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em qual- quer número de formas de tratamento local ou sistêmica. Administração pode ser tópica (tais como a mucosa vaginal e retal, incluindo o parto), como bandagens transdérmicas, poma- das, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e em pó; pulmonares (por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis , inclusive através do nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), por via oral ou parenteral, incluindo intravenosa, intra, subcutânea, intraperitoneal ou injeção intramuscular ou infusão, ou intra- craniana (por exemplo, intratecal ou intraventricular) administração.

A formulação terapêutica pode estar em forma de dose unitária. Tais formulações incluem comprimidos, pastilhas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões em água ou meios não aquosos, ou supositórios por via oral, parenteral, retal ou de administração ou de administração por inalação. Nas composições sólidas, como comprimidos o principal in- grediente ativo é misturado com um veículo farmacêutico. Ingredientes convencionais de tabletagem incluem amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estea- rato de magnésio, fosfato bicálcico ou gomas, e outros diluentes (por exemplo, água) para formar uma composição pré-formu sólida contendo uma mistura homogênea de um compos- to da presente invenção, ou um seu sal não tóxico farmaceuticamente aceitável. A composi- ção de pré-formulação sólida e, então, dividida em formas de dosagem unitária do tipo des- crito acima. Os comprimidos, pílulas, etc., da nova composição pode ser revestida ou não de forma a proporcionar uma forma de dosagem que ofereça a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode incluir uma composição interna coberta por um elemento externo. Além disso, os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração e permite ao componente interno passar intacto através do estômago ou ser retardado em sua liberação. Uma variedade de materiais podem ser utilizados para estas camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais, incluem um número de ácidos poliméricos e misturas de materiais poliméricos, com materiais tais como goma laca, álcool cetílico e acetato de celulose.

Formulações farmacêuticas incluem anticorpos da presente invenção complexada com Iipossomas (Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sd. E.U.A. 82:3688; Hwang1 et al., 1980, Proc. Natl. Acad. SCL E.U.A. 77:4030; e E.U. Patent 4485045 e 4544545). Liposso- mas com um melhor tempo de circulação são divulgadas na Patente U.S. No. 5.013.556. Alguns Iipossomas podem ser gerados pela evaporação em fase reversa com uma compo- sição lipídica que compreende fosfatidilcolina, colesterol e phosphatidiletanolamina PEG- derivada (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através tamanhos de poros definidos para produzir Iipossomas com o desejado diâmetro.

Os anticorpos também podem ser enredados em microcápsulas. Tais microcápsu- Ias são preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfa- cial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli- (metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de aplicação de fármaco coloidal (por e- xemplo, lipossomas, albumina microesferas, microemulsões, nano-partículas e nanocápsu- las) ou em macroemulsões como descrito em Remington1 The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Além disso, preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Adequa- dos exemplos de preparações de liberação prolongada incluir semipermeável matrizes de sólidos hidrofóbicos polímeros contendo o anticorpo, que matrizes são moldados em forma de artigos (por exemplo, filmes, ou microcápsulas). Exemplos de matrizes de liberação pro- longada incluir poliésteres, tais como hidrogéis de poli (2-hidroxietil-metacrilato) ou po- li(álcool vinílico), polilactidas (Patente U.S. No. 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, acetato de vinil-etileno não degradável, copolímeros de ácido glicólico- ácido lático degradáveis, tais como o LUPRON Depot TM (microesferas injetáveis compos- tas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), isobutirato acetato de sacarose, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Em algumas modalidades, o tratamento envolve a administração combinada de um anticorpo da presente invenção e de um agente quimioterápico ou coquetel de múltiplos di- ferentes agentes quimioterápicos. O tratamento com um anticorpo pode ocorrer antes, em simultâneo com, ou após a administração de quimioterapias. Quimioterapias contempladas pela invenção incluem substâncias químicas ou medicamentos que são conhecidos na arte e estão comercialmente disponíveis, tais como a doxorrubicina, 5-Fluorouracil, citosina ara- binosídeo (Ara-C "), Ciclofosfamida, Tiotepa, busulfan, Citoxin, Taxol, Metotrexato , Cisplati- na, melfalano, vinblastina e carboplatina. Administração combinada podem incluir a co- administração, quer em uma única formulação farmacêutica ou com formulações distintas, consecutivos ou administração, em qualquer ordem, mas geralmente dentro de um período de tempo tal que todos os agentes possam exercer suas atividades biológicas simultanea- mente. Preparação e programações de dosagem para esses agentes quimioterápicos po- dem ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou empiricamente conforme determinado pelo médico qualificado. Preparação e programações de dosagem para esses quimioterapia também são descritas na Quimioterapia Serviço Ed., Perry MC, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).

Em certas modalidades da invenção, o tratamento envolve a administração combi- nada de um anticorpo da presente invenção e um segundo agente terapêutico. Conforme utilizado aqui, "um segundo agente terapêutico" inclui, mas não está limitado a, agente qui- mioterápico, radioterapia, citocinas e anticorpos contra outros antígenos tumorais associa- dos.

Em outro modalidades, o tratamento envolve a administração combinada de um an- ticorpo da presente invenção e radioterapia. O tratamento com o anticorpo pode ocorrer an- tes, em simultâneo com, ou após a administração de radioterapia. Qualquer programações de dosagem para esses radioterapia pode ser usada como determinado pelo médico qualifi- cado.

Em outras modalidades, o tratamento pode envolver a administração combinada de anticorpos da presente invenção, com outros anticorpos contra adicionais antígenos associ- ados ao tumor, incluindo, mas não limitados a, os anticorpos que se ligam ao receptor EGF (EGFR) (Erbitux ®), ao receptor erbB2 (HER2) (Herceptin ®), e ao fator de crescimento en- dotelial vascular (VEGF) (Avastin ®). Além disso, o tratamento pode incluir administração de uma ou mais citocinas, pode ser acompanhado por remoção cirúrgica das células cancero- sas ou de qualquer outra terapia considerada necessária por um médico. Para o tratamento da doença, a dose adequada de um anticorpo da presente in-

venção depende do tipo de doença a ser tratada, a gravidade e o curso da doença, a res- posta da doença, se o anticorpo é administrado para fins terapêuticos ou de prevenção, tra- tamento anterior, a história clínica do paciente, e assim por diante todos, a critério do médi- co. O anticorpo pode ser administrado no momento ou numa série de tratamentos com a duração de vários dias a vários meses, ou até a cura ser efetuada ou um estado de diminui- ção da doença ser alcançado (por exemplo, redução no tamanho do tumor). A programação ótima de dosagem pode ser calculada a partir das medições de acumulação da droga no corpo do paciente e irá variar dependendo da potência relativa de anticorpos individuais. O médico assistente pode facilmente determinar as dosagens ótimas, metodologias de dosa- gem e taxas de repetição. Em geral, a posologia é de 0,01 mg a 100 mg/kg de peso corpo- ral, e pode ser administrada uma vez ou mais diárias, semanais, mensais ou anuais. O mé- dico pode avaliar as taxas de repetição da dosagem com base nos tempos de residência medidos e concentrações do fármaco em fluidos corporais ou tecidos.

A presente invenção fornece kits que compreendem os anticorpos descritos neste documento e que podem ser usados para executar os métodos descritos a seguir. Em cer- tas modalidades, um kit compreende pelo menos um anticorpo purificado contra um marca- dor de células tronco cancerosas em um ou mais recipientes. Em algumas modalidades, os kits contêm todos os componentes necessários e/ou suficientes para executar um ensaio de detecção, incluindo todos os controles, condutas para a realização dos ensaios, e qualquer software para a análises e apresentação dos resultados. Um perito na matéria irá facilmente reconhecer que os anticorpos revelados pela presente invenção podem ser facilmente in- corporados em um dos formatos estabelecidos de kit que são bem conhecidas na arte.

Modalidades da presente revelação podem ser ainda definidas por referência a e- xemplos apresentados a seguir, que descrevem em detalhes a preparação de anticorpos da presente revelação e métodos para a utilização de anticorpos da presente revelação. Será evidente para aqueles qualificados na arte que muitas modificações, tanto para materiais e métodos, podem ser praticados sem se afastar do âmbito de aplicação da presente revela- ção. Onde possível, as mesmas referências numéricas serão usadas no transcurso dos de- senhos para referir a partes iguais ou semelhantes. Conforme utilizado aqui e nas reivindi- cações anexas, as formas ingulares de "um", "ou" e "o" incluem referências plurais a menos que o contexto claramente mencione o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um anticorpo" inclui uma pluralidade de tais anticorpos ou um ou mais anticorpos e seus equiva- lentes para aqueles usualmente versados na arte. Além disso, todos os números exprimem quantidades dos ingredientes, condições reacionais, pureza e polipeptídeo polinucleotídeo comprimentos, e assim por diante, utilizado na especificação, são modificadas pela expres- são "cerca de", salvo indicação em contrário. Assim, os parâmetros numéricos estabelecidos nas especificações e reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas da presente invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de anticorpos monoclonais e humanizada DLL4

Produção do Antíqeno

Um fragmento polipeptídeo recombinante do domínio extracelular do DLL4 humano foi gerado como um antígeno para produção de anticorpos. Tecnologia padrão de ADN re- combinante foi utilizada para isolar um polinucleotídeo que codifica aminoácidos 1-522 de DLL4 (SEQ ID NO: 25). Este polinucleotídeo foi ligado N-terminai em quadro a um ou outro a um ou outro de Fc-tag ou histidina-tag humano e clonada em um vetor de transferência plasmidial para expressão baculovírus mediada em células de inseto. Protocolos padrões de transfecção, infectação e de cultura celular foram utilizados para produzir células recombi- nantes de insetos expressando o correspondente polipeptídeo DLL4 (O1ReiIIey et al., Bacu- lovírus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)).

A clivagem da seqüência sinalizadora endógena de DLL4 humano foi aproximada usando software de previsão de clivagem Signal P3.0, todavia o real ponto de clivagem in vivo pode diferir de uns poucos aminoácidos em uma ou outra direção. A clivagem preedita de DLL4 está entre aminoácidos 1 e 26, desse modo a proteína de antígeno DLL4 inclui cer- ca de 27 aminoácidos ao longo do aminoácido 522. A proteína do antígeno foi purificada a partir de células inseto condicionadas em meio usando cromatografia de afinidade Proteína A e Ni++-quelato. Proteína antígeno purificada foi então dialisada contra PBS (pH = 7), con- centrada até cerca de 1 mg/mL, e filtrada em estéril na preparação para a imunização.

Imunização

Camundongos (n = 3) foram imunizados com antígeno proteína DLL4s purificado (Antibody Solutions; Mountain View1 CA), utilizando técnicas convencionais. O sangue de cada camundongo foi classificado proximadamente 70 dias após a imunização inicial para o reconhecimento antigênico utilizando análise ELISA e FACS (descrito em detalhes abaixo). Os dois animais com os maiores títulos de anticorpos foram selecionados para intensifica- ção final anticorpo cujas células renais foram isoladas para a produção de hibridoma. As células hibridomas foram plaqueadas em uma célula por cava em placas de 96 cavas, e o sobrenadante proveniente de cada cava classificado por ELISA e FACS aqueadas em 1 células por poço em 96 pratos bem, e o sobrenadante de cada poço selecionados através de análise ELISA e FACS contra proteína antígeno. Diversos hibridomas com alto título anti- corpo foram selecionados e ampliados em escala em frasco de cultura estático. Os anticor- pos foram purificados a partir dos sobrenadantes hibridoma usando cromatografia agarose de proteína A ou proteína G. Os anticorpos monoclonaís purificados foram novamente testa- dos por FACS e são isotipados para selecionar quanto a anticorpos IgG e IgM. Análise FACS

Para selecionar anticorpos monoclonais produzidos por clones hibridomas que re- conhecem proteína DLL4 natural de superfície de célula, a análise FACs foi usada. Células HEK293 foram co-transfectadas com vetores de expressão que codificam um clone de DLL4 e o marcador de transfecção GFP. Vinte e quatro horas a quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram coletadas em suspensão e incubadas em gelo com anticorpos anti-DLL4 ou IgG controle para detectar a ligação ao anticorpo de base. As células foram lavadas e os anticorpos primários detectados com anticorpos secundários anti-camundongo conjugado a um cromóforo referência. As células marcadas foram então ordenadas por- FACS para identificar anticorpos anti-DLL4 que especificamente reconhecem a expressão da superfície celular de proteína DLL4 natural da superfície da célula. Anticorpos monoclo- nais 21M14 e 21M18 reconheceram DLL4 sobre células transfectadas (Fig. 1). Anticorpo 21M18 murino foi depositado com American Tissue Culture Collection (No. X).

A capacidade de anticorpos dirigidos para DLL4 em interferir com a interação entre DLL4 e Notch foi em seguida determinada através de citometria de fluxo. Células HEK 293 transduzidas de modo estável com DLL4 cADN foram incubadas com proteína Notchl- EGFIO-15-Fc Fc ou controle na presença de anticorpos anti-DLL4 ou controle. A ligação de proteínas de fusão Fc às células expressando DLL4 foi detectada pelo anticorpo PE- conjugado goat anti-Fc e citometria de fluxo. A capacidade de anticorpos anti-DLL4 inibir a ligação de Notch a DLL4 foi desse modo determinada por uma redução na intensidade da fluorescência. Como mostrado na Figura 2A, a inibição da ligação Notch foi observada com anticorpos 21M14 murino e 21M18, mas não em 21M12. Alem disso, 21M18 murino especi- ficamente liga DLL4 humano não murino, e bloqueia a ligação de DLL4 humano mas não ligação DLL4 murino a células que expressam Notchl (Fig. 2B). Estes dados indicam que 21M18 em experimentos de xenoenxertos têm por alvo DLL4 humano expressos nas células tumorais e não DLL4 murino expressas na vasculatura.

Mapeamento do Epítopo

Para identificar anticorpos que reconhecem regiões específicas do domínio extrace-

Iular DLL4, foi realizado mapeamento do epítopo. Vetores plasmídicos de expressão mamí- fero compreendendo um promotor CMV mais acima dos polinucleotídeos que codificam uma serie abrigada de fragmentos de supressão do domínio extracelular de DLL4 fundida a pro- teína Fc foram gerados usando tecnologia padrão de ADN recombinante. Construtos adicio- nais que codificaram fragmentos de DLL4 que foram quimera DLL4 humano e de camun- dongo fundidos a proteína Fc foram também gerados usando tecnologia padrão de ADN recombinante. Séries adicionais de proteínas de fusão DLL4-fc foram expressas em células HEK293 transfectadas de modo transiente a partir das quais meio condicionado foi coletado 24 a 48 horas pós-transfecção para ELISA. Fragmentos da proteína de fusão DLL4 foram capturados em placas revestidas com anticorpos anti-humano Fe. Os anticorpos anti-DLL4 foram em seguida deixados a interagir com os fragmentos DLL4 e a ligação foi medida pela subsequente incubação cm conjugado HRP anticorpo anti-camundongo e a detecção da atividade HRP (Figura 3A). como mostrado na Figura 3, anticorpos monoclonais murinos 21M14 e 21M18 reconhecem o epítopo contido nos aminoácidos 1-217 de DLL4. Essa regi- ão contém aminoácidos 1-217 de DLL4. Esta região contém um motivo denominado "DSL (Delta/Serrate/lag-2)" domínio presente em diversos Iigandos Notch (Tax et al., 1994, Nature 368:150-4). Além disso, anti-DLL4 MAbs foram examinados quanto a ligação a fragmentos de proteínas de fusão DLL4 por análise a específica ligação humano de 21M18 a DLL4 em aminoácidos 1-154 em presença de um domínio DSL presente em aminoácidos 155-217. Isso demonstra uma importância anteriormente não apreciada dessa seqüência N-terminal para a função DLL4. Esse trabalho está resumido na forma esquemática (Fig. 3C), com liga- ção 21M18 ou falta de ligação denotado por um "+" ou "-", respectivamente. A ligação do 21M18 foi ainda caracterizada através de análise de ligação do 21M18 a uma série de frag- mentos proteína DLL4 (DLL4dom1-6), contendo específicas substituições aminoácidos tro- cando específicos substituições trocando s aminoácidos DLL4 humano aos correspondentes aminoácidos murinos. Estas proteínas de fusão foram selecionadas para ligação a 21M18 por ELISA. Diversas posiçõe foram identificadas como importantes para ligação 21M18 con- forme mostrado (Fig. 3D). 21M18 exibe prejudicada ligação para fragmentos de proteína DLL4 com substituições em aminoácidos 68, 69, e 71 (a substituição de valina, valina e pro- lina), ou em aminoácidos 142 e 144 (substituição da Iisina e alanina). Em contrapartida um distinto anticorpo 21M21 se liga a um epítopo contido dentro da região DSL (Figura 3E), mas este anticorpo não impacta a função DLL4 como mostrado na figura 6, demonstrando que a ligação a DSL não prever um anticorpo funcional.

Anticorpos Quiméricos

Após a identificação de anticorpos monoclonais que especificamente reconhecem DLL4, esses anticorpos são modificados para superar a imuno resposta de anticorpos hu- manos anti-camundongo (HAMA) quando anticorpo de roedores são utilizados como agen- tes terapêuticos. Em certas modalidades, as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo monoclonal selecionado são isoladas por RT-PCR a partir de células hibri- doma e ligados em quadro às regiões constantes de cadeia pesada IgGI e de cadeia leve kappa, respectivamente, em vetores de expressão mamífero. Alternativamente um vetor de expressão humano Ig tal como TCAE 5.3 é usado que contém os genes da região constante de cadeia pesada IgGI e de cadeia leve kappa do mesmo plasmídeo (Preston et al., 1998, Infection & Immunity 66:4137-42). Vetores de expressão que codificam quiméricos de cadeia pesada e de cadeia leve são então co-transfectados em células ovarianas de hamster chi- nês (CHO) para a produção de anticorpos quimiericos. A imunoreatividade e afinidade dos anticorpos quiméricos são comparados a anticorpos parentais murinos por ELISA e FACS.

Anticorpos humanizados

Em certas modalidades, anticorpos humanizados contra DLL4 são gerados. Os domínios variáveis do anticorpo monoclonal murino 21M18 foi isolado e seqüenciado a partir da linhagem hibridomas utilizando degenerar PCR essencialmente como descrito em Lar- rick, JM, et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 1250 e Jones, S.T. & Bendig, M.M., 1991, Bio / Technology 9: 88. Regiões de quadros operativos variáveis de cadeia pe- sada e cadeia leve prováveis de serem estruturalmente similares às seqüências aminoácido de anticorpo 21M18 parental são então escolhidas como as regiões de quadro operativo humano para humanização. Para identificar as regiões de quadro operativo humano candi- dato, as seqüências protéicas previstas codificadas pelos domínios variáveis Vh e Vl murino de 21M18 são comparados com seqüências anticorpos humanos codificadas pelo expresso cADN humano usando pesquisas BLAST para a seqüência humana depositada no Gen- Bank. Usando este método, as expressas seqüências cADN humanas (por exemplo, Gen- Bank AY393019, DC295533) são selecionadas para posterior análise na concepção de um quadro operativo de cadeia pesada.

As diferenças aminoácidos entre cadeias pesadas candidatas de quadro operativo humanizado e a cadeia pesada do anticorpo monoclonal 21M18 murino são avaliados quan- to a provável importância, e um julgamento feito de modo a saber como cada diferença na posição contribui para a apropriada multiplicação do anticorpo 21M18. Esta análise é dire- cionada pela avaliação das estruturas cristalinas solucionadas de outros fragmentos anticor- po (por exemplo, a estrutura da fab 2E8 conforme descrito em Trakhanov et al, Acta Crystal- Iogr D Biol Crystallogr1 1999, 55:122-28). Estruturas são modeladas utilizando software de computador, incluindo Jmol, rápido PDB3 e Pymol. É levado em conta o potencial impacto de um aminoácido numa dada posição nempacotamento do quadro operativo β-folha, a inte- ração entre os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve, o grau de exposição solvente da cadeia lateral aminoácido, e a probabilidade de que um aminoácido possa im- pactar o posicionamento dos laços CDR. A partir desta análise, cinco cadeias Vh candidatas fundidas em quadro à região constante de lgG2 humano são quimicamente sintetizadas. As cadeias pesadas candidatas compreendem: i) um quadro operativo funcional humano con- tendo substituições selecionadas inseridas na região do quadro operativo sintético com base na análise do provável impacto na função de ligação 21M18 e ii) os CDRs do anticorpo 21M18 murino (SEQ ID NOS.: 1, 2, e 5).

Do mesmo modo, as diferenças aminoácidos entre uma selecionada caeia leve de quadro operativo humano IGK(V)4-1 e a cadeia leve 21M18 do anticorpo monoclonal murino parental são identificadas, e um julgamento é então feito de modo a saber se cada diferença na posição contribui para a apropriada multiplicação do anticorpo 21M18. A partir dessa análise, cinco cadeias Vl candidatas são quimicamente sintetizadas. A primeira cadeia leve candidata compreende: i) um quadro operativo humano IGK(V)4-1 completo e ii) CDRs de anticorpo 21M18 murino parental (SEQ ID Nos.: 9, 10 e 11). As quatro cadeias leves candi- datas adicionais compreendem: i) a região do quadro operativo IGK(V)I-4 humano com um aumentado número de resíduos 21M18 murino retidos na região do quadro operativo e ii) os CDRs do anticorpo 21M18 murino parental (SEQ ID NOs.: 9, 10 e 11).

A funcionalidade de cada variante candidata de cadeia pesada e leve humanizadas é testada por co-transfecção em células mamíferos. Cada uma das cinco cadeias pesadas 21M18 humanizadas candidatas descritas acima é co-transfectada com cADN cadeia leve 21M18 murino em células HEK293, e meio condicionado é ensaiado quanto a atividade Ii- gante ao antígeno DLL4 por ELISA. A variante de cadeia pesada 21M18 que apresenta a ligação mais robusta é selecionada. Esta variante - "21M18 H2" - contém, adicionalmente aos CDRs murinos, substituições nas 6 posições de quadro operativo contidos no quadro operativo Vh, posições Kabat 16, 20, 27, 28, 38 e 48 (Fig. 4A). A cadeia pesada humanizada 21M18 H2 é então cotransfectada com cada uma das cinco cadeias leves candidatas huma- nizadas em células HEK293, e o meio condicionado é novamente ensaiado quanto à ligação antígeno por ELISA. Uma variante de cadeia leve única é descoberta apresentar melhor ligação que as outras candidatas - "21M18 L2" - mantendo resíduos murinos nas posições Kabat 22 e 36 (Fig. 5).

Em seguida, o resíduo cisteína isolado CDR2 H2 (SEQ ID NO: 2) é alterado. Espe- cificamente, duas variantes de cadeia pesada H2 são sintetizadas com o resíduo cisteína na posição 52a Kabat modificado para uma serina (variante H7; SEQ ID NO: 3) ou uma valina (variante H9; SEQ ID NO: 4) de resíduos. Essas cadeias pesadas são co-transfectadas em células HEK293 com L2, e o meio condicionado novamente ensaiado. Ambas as variantes (21M18 H7L2 e 21M18 H9L2) demonstram específicas ligações antígeno específico ELISA. Assim CDR2 de cadeia pesada 21M18 compreende SEQ ID NOs.: 2, 3, ou 4, em que o re- síduo na posição 52a Kabat compreende uma cisteína, serina, valina ou resíduo. Em certas modalidades, anticorpos humanizados contra DLL4 foram gerados. Os

domínios variáveis do anticorpo monoclonal 21M18 murino foram isolados e seqüenciados a partir da linhagem hibridoma usando degenerar PCR essencialmente como descrito em Lar- rick, JM, et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 1250 e Jones, S.T. & Bendig1 M.M., 1991, Bio / Technology 9: 88. Regiões variáveis de quadros operativos de cadeia pe- sada e de cadeia leve humano muito similar às seqüências aminoácidos anticorpo 21M18 parental foram então escolhidas como as regiões de quadro operativo humano para huma- nização. Para identificaras mais similares regiões de quadro operativo humano, as preditas seqüências de proteína codificadas pelos domínios variáveis VH e VL murino 21M18 foram comparados com domínios variáveis Ig codificados pelo genoma humano utilizando pesqui- , 20 sas BLAST de seqüência de genoma humano depositada no GenBank. Usando este méto- do, IGH (V) 1-18 foi escolhido como o região do quadro operativo de cadeia pesada humana e IGK (V) 4-1 foi escolhido como a região do quadro operativo de cadeia leve humana.

As diferenças aminoácidos entre a selecionada cadeia pesada de quadro operativo humano IGH(V)I-18 aminoácido selecionado humano e a cadeia pesada de anticorpo mo- noclonal murino 21M18 foram identificadas, e um julgamento foi então feito de modo a saber se cada diferença na posição contribuía para a apropriada multiplicação do anticorpo 21M18. Esta análise foi orientada pela análise de estruturas cristalinas resolvidas de outros fragmentos anticorpos (por exemplo, a estrutura da fab 2E8 conforme descrito no Trakhanov et al, Acta Biol Crystallogr Ctystallogr D, 1999, 55:122-28). As estruturas foram modeladas utilizando software de computador, incluindo Jmol, rápido APO, e Pymol. Foi tomado em consideração o potencial impacto de um aminoácido em uma determinada posição sobre o empacotamento do quadro operativo /Molha, a interação entre domínios variáveis de cadeia pesada e leve, o grau de exposição solvente da cadeia lateral aminoácido, e o probabilidade que um aminoácido teria de impacto sobre o posicionamento dos laços CDR. A partir desta análise, cinco cadeias VH candidatas fundidas em quadro à região constante lgG2 humano foram quimicamente sintetisadas. A primeira cadeia pesada candidata compreendia: i) um quadro operativo IGH (V) 1/18 humano completo e íi) os CDRs de anticorpo 21M18 murino parental (SEQ ID NOs.: 1, 2 e 5). As quatro cadeias pesadas candidatas adicionais compre- endiam: i) a região do quadro operativo IGH(V)1-18 humano com um crescente número de resíduos 21M18 murino retidos na região do quadro operativo e ii) os CDRs de anticorpo 21M18 murino parental (SEQ ID NOs.: 1, 2 e 5).

Do mesmo modo, as diferenças aminoácidos entre a selecionada cadeia leve

IGK(V)4-1 e a cadeia leve do anticorpo monoclonal murino 21M18 parental foram identifica- das, e um julgamento foi então realizado para saber como cada diferença na posição contri- buía para a apropriada multiplicação do anticorpo 21M18. A partir desta análise, cinco ca- deias VL candidatas foram quimicamente sintetizadas. A primeira cadeia leve candidata composta por: i) um quadro operativo IGK(V)4-1 humano completo e ii) os CDRs de anticor- po 21M18 murino parental (SEQ ID η 9, 10 e 11). Os quatro candidatos mais cadeias le- ves incluíam: i) o IGK (V) 4-1 humanos quadro região com um número crescente de resí- duos 21M18 murinos retidos na região do quadro operativo e ii) os CDRs de anticorpo 21M18 murino parental (SEQ ID η 0 s: 9, 10 e 11). A funcionalidade de cada cadeia leve e pesada humanizada variante candidata foi

testada pela co-transfecção em células de mamíferos. Cada uma das cinco candidatas ca- deia pesada 21M18 humanizadas descritas acima foi co-transfectada com o cADN de ca- deia leve 21M18 murino em células HEK293, e o meio condicionado foi em seguida ensaia- do quanto a atividade Iigante ao antígeno DLL4 por ELISA. A variante cadeia pesada 21M18 que apresenta a ligação mais robusta foi selecionada. Essa variante - "21M18 H2" - conti- nham, além dos CDRs murinos, resíduos murinos em cinco posições do quadro operativo, posições Kabat 20, 28, 38, 48 e 69 (Fig. 4). A cadeia pesada humanizada 21M18 H2 pesada foi então co-transfectada com cada uma das cinco cadeias leves humanizadas candidatas em células HEK293, e o meio condicionado foi novamente ensaiado quanto a ligação antí- geno por ELISA. Uma única cadeia leve variante foi descoberta apresentar melhor ligação que as outras candidatas - "21M18 L2" - mantendo resíduos murinos nas Posições Kabat 22 e 36 (Fig. 5).

Em seguida, o isolado resíduo cisteína CDR2 H2 (SEQ ID NO: 2), foi alterado. Es- pecificamente, duas variantes de cadeia pesada H2 foram sintetizadas com o resíduo cisteí- na na posição 52a Kabat modificada para uma serina (variante H7; SEQ ID NO: 3) ou uma valina (variante H9; SEQ ID NO: 4) de resíduos. Estas cadeias pesadas foram co- transfectadas em HEK293 células com L2, e o meio condicionado foi novamente ensaiado. Ambas as variantes (21M18 H7L2 e 21M18 H9L2) demonstraram ligação antígeno específi- ca por ELISA. Assim CDR2 de cadeia pesada 21M18 compreende SEQ ID NO: 2, 3 ou 4, em que o resíduo em Kabat posição 52a compreende uma cisteína, serina, valina ou resí- duo.

Os anticorpos 21M18 humanizados foram então ainda caracterizados. Especifica- mente, a afinidade de ligação anticorpo 21M18 humanizado purificado por cromatografia de proteína A foi determinada usando Biacore. A afinidade foi determinada ser de aproximada- mente 0,33 nM para a variante H2L2 de 21M18.

Os anticorpos 21M18 humanizados foram depositados com ATCC (21M18 H9L2, ATCC depósito não. PTA-8427 e 21M18 H7L2, ATCC depósito No. PTA-8425, depositado em 10 maio, 2007).

Anticorpos humanos

Em algumas modalidades, anticorpos humanos que especificamente reconhecem o domínio extracelular de DLL4 são isolados usando tecnologia de exibição fago. Uma biblio- teca de anticorpos sintéticos contendo domínios variáveis de anticorpo humano é classifica- da quanto ao reconhecimento específico e de alta afinidade do antígeno DLL4 descrito aci- ma. Cassetes CDR na biblioteca são especificamente trocados por meio de sítios únicos de restrição de flanqueamento para a otimização do anticorpo. Regiões variadas humanas oti- mizadas são então clonadas num vetor de expressão Ig contendo cadeia pesada IgGI hu- mano e cadeia leve kappa para a expressão de anticorpos humanos em células CHO de mamífero.

Exemplo 2: Ensaios in vitro para avaliar anticorpos contra DLL4

Este exemplo descreve in vitro representativos para testar a atividade dos anticor- pos produzidos contra DLL4 em proliferação celular, ativação da rota Notch, e citotoxicidade. Ensaio de Proliferação

A expressão de DLL4 por meio de diferentes linhagens de células cancerosas é quantificada usando análise Taqman. Linhagens de células identificadas como expressando DLL4 são plaqueadas numa densidade de 104 células por cava em microplacas de cultura de tecido de 96 cavas e permitiu espalhar por 24 horas. Posteriormente as células são culti- vadas por mais 12 horas em DMEM fresco com 2% FCS ponto no qual anticorpos anti-DLL4 versus anticorpos controle são acrescentados ao meio de cultura em presença de 10 μίτιοΙ/ί BrdU. Após etiquetagem BrdU1 o meio de cultura é removido, e as células fixadas na tempe- ratura ambiente por 30 minutos em etanol e reagidas por 90 minutos com anticorpo mono- clonal anti-BrdU peroxidase-conjugado (clone BMG 6H8, fragmentos Fab). O substrato é desenvolvido em uma solução contendo tetrametilbenzidina e interrompido após 15 minutos com 25 μί. de 1 mol/L H2SO4. A reação colorimétrica é medida com uma placa leitora ELISA automática utilizando um filtro de 450 nm (UV Microplate Reader; Bio-Rad Laboratories, Ri- chmond, CA). Todos os experimentos são realizados em triplicata. A capacidade de anticor- pos anti-DLL4 para inibir a proliferação celular comparada aos anticorpos controle é deter- minada.

Ensaio de Ativação da Rota

Em certas modalidades, a capacidade dos anticorpos contra DLL4 bloquear a ativa- ção do rota de sinalização Notch é determinada in vitro. Células HeLa cultivadas em meio DMEM suplementado com antibióticos e 10% FCS foram co-transfectadas com 1) vetor mensageiro Hesl-Luc contendo o promotor Hesl a montante de um gene mensageiro Fire- fly Iuciferase para medir o nível de sinalização Npteh (Jarriault et al., 1995, Nature 377:355- 8), em resposta ao ligando DLL4 e 2) um mensageiro Renilla Iuciferase (Promega, Madison, Wl), como um controle interno para a eficiência da transfecção. Células transfectadas foram então adicionadas a placas de cultura recobertas de um dia para o outro com 10 mg / mL DLL4-proteína Fc. Anticorpos para DLL4 em seguida foram adicionados ao meio da cultura de células. Quarenta e oito horas após a transfecção, os níveis de Iuciferase foram medidos por um kit dual de ensaio Iuciferase (Promega, Madison, Wl) com a atividade Firefly Iucifera- se normalizada para atividade Renilla luciferase. A capacidade de anticorpos para inibir a ativação da rota Notch DLL4-induzida foi assim determinada. A inibição da ativação DLL4 da ativação da rota Notch foi observada com anticorpos anti-DLL4 murino 21M14 e 21M18 (Fi- gura 6). Em contraste, anticorpo anti-DLL4 21M21 não inibe a ligação Notch (Figura 6) a despeito da ligação ao domínio DSL de DLL4 (Figura 3E).

Em certas modalidades, a capacidade de anticorpos anti-DLL4 para modular a ati- vação do gene a jusante foi determinada. Células tumorais de cólon C8 provenientes de animais tratados com anticorpos 21M18 murino (descrito em detalhes adiante) foram isola- das e a expressão dos genes de rota Notch HES1 e ATOH-1 foi determinada por RT-PCR. O RNA total dos tecidos tumorais foi isolado com o kit RNeasy Fibrous Tissue (Qiagen, Va- lencia, CA), de acordo com instruções do fabricante. A quantidade de amostras RNA foi de- terminada pela relação de 260nm/280nm. A integridade do RNA foi determinada mediante correr uma alíquota da amostra RNA num gel agarose desnaturado manchado com brometo de etídium (EtBr). A relação de 28s para 18s rRNA no gel foi visualizado usando câmera FIuorChem aplicada com o software AphaEasa FC. Amostras RNA foram eluídas em água livre de RNase e armazenadas a -80 °C. A RT-PCR em tempo real foi feita com uma sonda não extensível fluorescente dupla contendo 3'-TAMRA FAM (6-carboxifluoresceína) e um corante mensageiro 3-TAMRA (6-carboxi-tetrametilrhodamina). Cem microgramas de RNA total foi utilizado para a PCR em tempo real em um volume final de 25 uL contendo trans- criptase reversa, IX Tagman tampão (Applied Biosystems, Foster City, CA) e a mistura inici- adores/sonda. As reações foram realizadas em um ABI 7900 HT Fast Real Time PCR Sys- tem (Applied Biosystems, Foster City, CA): 30 min a 480C, 10 min a 95 ° C e 40 ciclos de 15 segundos a 95 0C e em 1 min 60 °C. Os resultados foram analisados usando o software SDS2.3 (Applied Biosystems). Todos os conjuntos iniciadores sonda foram obtidos a partir Applied Biosystems (Foster City, CA). O nível de expressão de genes alvo foram normaliza- dos ao nível da expressão do gene doméstico Gus B e expressos em quantidade relativa. O tratamento com anticorpos anti-DLL4 21M18 murino reduziu a expressão de HES1 e aumen- tou a expressão de ATOH-1 como comparado aos tumores tratados com controle (Fig. 7A).

Em algumas modalidades, células tumorais OMP-C11 esvaziadas de linhagem ca- mundongo foram estabelecidas usando condições de cultura conhecidas para manter célu- las tumorigênicas in vitro. Estas colônias de células tumorais foram cobertas com células 3T3 sem (3T3) ou incluindo DLL4 humano (CLL4) superexpressada na superfície da célula, na presença ou ausência de 10 mg/mL 21M18 murinos ou 5 μΜ inibidor gama-secretase (GSI, ou seja, DBZ). Uma não sobreposição controle foi também incluída. Embora as células 3T3-DLL4 induzissem HES1 e reprimissem a expressão gênica de ATOH1 (mostrado como a relação de HES1:ATOH1), um ou outro de 21M18 ou GSI sozinhos inibiram alterações genéticas no alvo Notch DLL4-induzidas.

Ensaio de Citotoxicidade Complemento-Dependente

Em certas modalidades, linhagens de células cancerosas expressando DLL4 ou cé- lulas tronco cancerosas isoladas a partir de uma amostra paciente passageada como um xenoenxerto em camundongos imunocomprometidos (como descrito em detalhes abaixo) são utilizadas para medir a citotoxicidade complemento-dependente (CDC) mediada por um anticorpo contra DLL4. As células são suspensas em 200 μΙ_ de meio de cultura RPMI 1640 suplementado com antibióticos e de 5% FBS em 106 células/mL. As células suspensas são em seguida misturadas com 200 μΙ_ de soro ou soro termo-inativado com anticorpos contra DLL4 ou anticorpos controle em triplicata. As misturas de células são incubadas por 1 a 4 horas a 37 0C em 5% CO2. As células tratadas são em seguida coletadas, ressuspensas em 100 μΙ_ de FITC-marcada anexin V diluído em meio de cultura e incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos. Cem microlitros de uma solução iodeto de propídio (25 mg / RNL) diluído em HbSS é adicionado e incubado por 5 minutos em temperatura ambiente. As célu- las são coletadas, ressuspensas em meio de cultura e analisados por citometria de fluxo. Citometria de fluxo de células FITC manchadas oferece contagem total de células, e a ab- sorção de iodeto de propídio pelas células mortas como uma porcentagem do total de núme- ros de celular é utilizado para medir a morte celular, na presença de soro e anticorpos contra DLL4 comparado ao soro termo-inativado e anticorpos controle. A capacidade de anticorpos anti-DLL4 mediar a citotoxicidade complemento-dependente é assim determinado. Ensaio da Citotoxicidade Celular Anticorpo-Dependente

Em certas modalidades, linhagens de células cancerosas que expressam DLL4 ou células tronco cancerosas isoladas a partir de uma amostra de pacientes passageadas co- mo um xenoenxerto em camundongos imunocomprometidos (como descrito em detalhes abaixo) são utilizados para medir a citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) me- diada por um anticorpo contra DLL4. As células são suspensas em 200 μί de meio de cultu- ra RPMI 1640 livre de fenol vermelho suplementado com antibióticos e 5% FBS a 106 célu- las/mL. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são isoladas a partir de san- gue periférico heparinizado por centrifugação com gradiente de densidade Ficol-Paque para uso como células efetoras. As células alvos (T) são em seguida misturadas com células efe- toras PBMC (E) em relações E/T de 25:1, 10:1 e 5:1 em placa de 96 cavas em presença de pelo menos um anticorpo DLL4 ou um anticorpo controle. Os controles incluem incubação das células alvos sozinhas e células efetoras sozinhas em presença do anticorpo. Misturas de células são incubadas por 1 a 6 horas a 37 0C em 5% CO2. Lactato desidrogenase libe- rada (LDH)1 uma enzima citosólica estável liberada quando da Iise da célula, é em seguida mensurada através de um ensaio colorimétrico (CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity As- say; Promega; Madison, Wl). Os dados de absorbância a 490 nm são coletados com um leitor de placa de 96 cavas e base referencial corrigida. A porcentagem da citotoxicidade específica é calculado com a fórmula: % citotoxicidade = 100 χ (liberação experimental LDH - liberação LDH espontânea efetora - liberação LDH espontânea alvo)/(Liberação LDH ma- ximal alvo - liberação LDH espontânea efetora). A capacidade dos anticorpos contra DLL4 para mediar citotoxicidade celular anticorpo-dependente é desse modo determinada. Exemplo 3: Prevenção in vivo do Crescimento do Tumor usando anticorpos anti-

DLL4

Este exemplo descreve a utilização de anticorpos anti-DLL4 para impedir o cresci- mento tumoral em um modelo xenoenxerto modelo. Em certas modalidades, células tumo- rais de uma amostra paciente (biópsia de tumor sólido ou derrame pleural), que foram pas- sageadas como xenoenxerto em camundongos são preparadas para a repassagem em a- nimais experimentais. O tecido tumoral é removido sob condições estéreis, cortado em pe- quenas peças, picados completamente usando lâminas estéreis, e suspensões de células únicas são obtidas por digestão enzimática e ruptura mecânica. Especificamente, as células de derrame pleural ou as peças tumorais resultantes são misturadas com colagenase Ill ultrapura em meio de cultura (200-250 unidades de colagenase por mL) e incubadas a 37 0C por 1-4 horas com pipetagem para cima e para baixo através de uma de pipeta de 10 mL a cada 15-20 minutos. As células digeridas são filtradas através de uma malha nylon 40 M, lavados com solução salina tamponada Hank's (HbSS) contendo 2% de soro de novilho ter- mo-inativado (HICS) e 25mm HEPES (pH 7,4). As células tumorais dissociadas são então injetadas por via subcutânea nos blocos gordurosos mamários de camundongos NOD/SCID para eliciar o crescimento tumoral.

Em certas modalidades, células tumorais dissociadas são primeiramente classifica- das na forma de células tumorigênicas e não tumorigênicas com base nos marcadores da superfície da célula antes da injeção nos animais experimentais. Especificamente, células tumorais dissociadas, como descrito acima são lavadas duas vezes com solução salina tamponada com Hepes (HbSS) contendo 2% de soro de novilho termo-inativado (HICS) e ressuspensas em 106 células por 100 μί. Os anticorpos são adicionados e as células incu- badas por 20 minutos no gelo seguido de duas lavagens com HbSS / 2% HICS. Os anticor- pos incluem anti-SEC (Miltenyi Biotec1 Auburn1 CA), anti-CD44, anti-CD24 e marcadores de linhagem anti-CD2, CD3-, -CD10, CDL-6, CDL-8, -CD31, -CD64, e -CD140b (coletivamente referidos como Lin; BD Biosciences, San Jose, CA). Os anticorpos são diretamente conju- gado com fluorocromos positiva ou negativamente para selecionar células que expressam esses marcadores. Células de camundongos são eliminadas através da seleção contra célu- las H2Kd+ e células CD45+ murinas e as células mortas são eliminadas usando o corante de viabilidade DAPI. A citometria de fluxo é realizada em um FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA). Perfis de espalhamento lateral e de espalhamento para frente são usados para eliminar agrupamentos de células. Isolados de células tumorigênicas ESA +, CD44 +, CD24-/low, Lin- são então injetadas por via subcutânea em camundongos NOD / SCID para eliciar o crescimento tumoral.

Em certas modalidades, anticorpos anti-DLL4 foram analisados quanto a sua capa- cidade de reduzir o crescimento da células tumorais cólon UM-C4. Células UM-C4 dissocia- das (10.000 por animal) foram injetados por via subcutânea na região do flanco direito em camundongos NOD / SCID de 6-8 semanas de idade. No dia seguinte após a injeção de células tumorais, os animais foram injetados intraperitoneal (ip), com 10 mg / kg anticorpos 21M18 murinos anti-DLL4 (n = 5) ou PBS (n = 10) duas vezes por semana durante o período do experimento. O crescimento tumoral foi monitorado semanalmente até o crescimento ser detectado, ponto após o qual o crescimento tumoral foi medido duas vezes por semana para um total de 8 semanas. O tratamento com anticorpo 21M18 reduziu o crescimento tumoral em 54% em comparação com controles injetados com PBS (Fig. 8).

A capacidade de anticorpos anti-DLL4 de afetar a proliferação in vivo foi então de- terminada. Tumores de cólon C8 de animais tratados com anticorpos 21M18 murinos ou anticorpos controle foram isolados e expressão de Ki67, um marcador de proliferação celu- lar, determinado por imunocitoquímica. Especificamente, tumores encaixados em parafina, fixados em formalina foram cortados em seções de 4-um de espessura. As seções foram desparafinizadas em xileno e reidratados em água destilada. Imunoanálise histoquímica foi realizada de acordo com métodos normalizados. Resumidamente, seções foram imersas em tampão citrato (pH 6) em um banho de água durante 20 minutos na câmara de descozimen- to para obter antígenos. As lâminas foram resfriadas por cerca de 45 minutos e lavadas em PBS. As seções foram incubadas com peróxido de hidrogênio (Sigma-AIdrich, St Louis, MO), durante 10 minutos à temperatura ambiente para remover peroxidase endógena antes da adição do anticorpo primário. O rabbit anti-humano Ki67 (Vetor Laboratories Inc., Burlin- game, CA), a 1: 50 de diluição em tampão horse de diluição (1% do NHS, 1% BSA, 0,1% Tx-100, 0,05% em PBS NaN3) foi adicionado a cada seção e incubadas por 1 hora ou uma noite a 4 ° C. As lâminas foram lavadas 3 vezes em lavagem tampão (gelatina 10%, Tx-100 10%, em PBS) por 5 minutos cada. O anticorpo secundário anti-rabbit conjugado com solu- ção HRP (lmmpress Rabbit anti-pré-diluídos, Vetor Laboratories Inc., Burlingame, CA) foi adicionado às lâminas e incubação por 30 minutos. Após uma extensa lavagem em tampão de lavagem, vetor Nova Red (Vetor Laboratories Inc., Burlingame, CA) foi adicionado. As lâminas foram lavadas com água, contra-manchadas com hematoxilina e montadas com o suporte de montagem permanente (Vectamount, Vetor Laboratories Inc., Burlingame, CA). O tratamento com anti-anticorpos 21M18 DLL4 murinos reduziu o número de células que ex- pressam Ki67 em comparação com o tratamento tumores (Fig. 9).

Exemplo 4: Prevenção in Vivo e Tratamento do crescimento tumoral Utilizando An- ticorpos Anti-DLL4 em terapia de combinação com Fluorouracila

Em certas modalidades, anticorpos anti-DLL4 foram analisados em combinação com quimioterapia para reduzir a capacidade de crescimento de células tumorais de cólon UM-C4 in vivo. Células UM-C4 dissociadas (10.000 por animal) foram injetadas por via sub- cutânea na região do flanco direito em camundongos NOD/SCID com 6-8 semanas de ida- de. No dia após a injeção das células tumorais, os animais foram injetados intraperitoneal (ip) com 10 ING / kg anticorpos anti-DLL4 21M18 murinos ou PBS duas vezes por semana durante o período do experimento, com ou sem tratamento concomitante com o agente de quimioterapia anti-metabolito fluorouracila (5-FU) administrada uma vez por semana. O crescimento tumoral foi monitorada semanalmente até o crescimento foi detectado, após o que o crescimento tumoral foi medido duas vezes por semana para um total de 8 semanas. O tratamento com anticorpos anti-DLL4 21M18 murinos, em combinação com 5-FU reduziu o crescimento tumoral em um maior grau do que qualquer tratamento isolado (Fig. 10). Anticorpos DLL-4 ou em combinação com Anticorpos EGFR VEGF Em certas modalidades, anticorpos anti-DLL4 foram testados em combinação com anticorpos receptor anti-EGF (EGFR) anticorpos quanto a capacidade para influenciar a fre- qüência de ocorrência do tumor in vivo. Células UM-4 dissociadas (10.000 por animal) foram injetados por via subcutânea na região do flanco direito em camundongos NIOD/SCID de 6- 8 semanas de idade. No dia após a injeção de células tumorais, os animais (n = 10) foram injetados intraperitoneal (ip) com 10 mg / kg de anticorpos anti-DLL4 21M18 murinos, anti- corpos anti-EGFR, uma combinação de anti-DLL4 e anticorpos anti-EGFR, ou PBS. Os tu- mores foram detectados em todos os animais tratados com anti-DLL4 ou anticorpos anti- EGFR e 9 de cada 10 animais controle. Em contraste, apenas 2 dos 10 animais tratados com uma combinação de anti-DLL4 e anticorpos anti-EGFR tinham tumores detectáveis vá- rias semanas após o tratamento (Fig. 11). Além disso, o tratamento com anticorpos anti- DLL4 21M18 murinos em associação com anticorpos anti-EGFR reduziu a freqüência de tumorigênese versus um ou outro tratamento isoladamente (Fig. 11).

Em certas modalidades, anticorpos anti-DLL4 foram testados em combinação com anticorpos de receptor anti-EGF (EGFR) para influenciar a freqüência de ocorrência do tu- mor in vivo. Células tumorais C17 foram implantadas em camundongos (n = 10 por grupo) e o tratamento foi iniciado dois dias mais tarde, com qualquer anticorpo controle, 21M18 muri- nos de anticorpos anti-VEGF, ou a combinação de ambos os anticorpos. Cada anticorpo foi dosado em 10 mg / kg, administrada duas vezes por semana. Ambos os 21M18 e anti-VEGF reduziu o crescimento tumoral, e a combinação foi mais eficaz do que qualquer anticorpo isoladamente (Fig. 18).

Anticorpos DLL-4 em associação com Irinotecano

Em certas modalidades, anticorpos anti-DLL4 foram testados em associação com o irinotecano quimioterápico. Em algumas modalidades, células tumorais OMP-C8 dissociadas (10000 por animal) foram injetados por via subcutânea na região do flanco direito em ca- mundongos NIOD/SCID de 6-8 semanas de idade. No dia após a injeção de células tumo- rais, os animais foram injetados intraperitoneal (ip) com 10 mg / kg de anticorpos anti-DLL4 21M18 murinos ou anticorpos contra duas vezes por semana durante o período do experi- mento, com ou sem tratamento concomitante com o agente de quimioterapia irinotecano administrado uma vez por semana, uma dosagem de 7,5 mg / kg. O crescimento tumoral foi monitorado semanalmente até o crescimento ser detectado, após o que o crescimento tumo- ral foi medido duas vezes por semana. O tratamento com anticorpos anti-DLL4 21M18 em associação com irinotecano reduziu o crescimento tumoral em um maior grau do que qual- quer tratamento isolado (Fig. 12A). E, embora o crescimento tumoral fosse acelerado ou continuado na maioria dos animais após a cessação do tratamento semanal com 7,5 mg / kg de irinotecano isoladamente, a combinação de 10 mg / kg, duas vezes por semana, anti- DLL4 21M18 e 7,5 mg / kg semanalmente irinotecano impediu novos crescimentos do tumor de cólon após a cessação do tratamento no dia 56 por mais de cinco semanas (Fig. 13). Em certas modalidades, anticorpos anti-DLL4 21M18 H7L2 humanizados foram tes-

tados em combinação com Irinotecano. Em algumas modalidades, células tumorais C8 dis- sociadas (10000 por animal) foram injetadas por via subcutânea na região do flanco direito em camundongos NIOD/SCID de 6-8 semanas de idade. No dia após a injeção de células tumorais, os animais foram injetados intraperitoneal (ip), com 10 mg / kg anticorpos anti- DLL4 21M18 humanizados, anticorpos 21M18 murinos, ou anticorpos controle duas vezes por semana durante o período do experimento, com ou sem tratamento concomitante com o agente de quimioterapia irinotecano administrado uma vez por semana, uma dosagem de 7,5 mg / kg. O crescimento tumoral foi monitorado semanalmente até o crescimento ser de- tectado, após o que o crescimento tumoral foi medido duas vezes por semana. O tratamento com anticorpos anti-DLL4 21M18 humanizados em associação com irinotecano demonstrou eficácia semelhante contra o crescimento tumoral como 21M18 murinos (Fig. 12B).

Em algumas modalidades, combinação anti-DLL4 21M18 murinos e tratamento iri- notecano foi utilizado para o tratamento de tumores de cólon estabelecidos. Células C8 dis- sociadas (10.000 por animal) foram injetadas por via subcutânea na região do flanco direito em camundongos NIOD/SCID de 6-8 semanas de idade. Quando as células injetadas pro- duziram tumores de aproximadamente 60 mm3, o tratamento foi iniciado. Os animais foram injetados intraperitoneal (ip) com 10 mg / kg de anticorpos anti-DLL4 21M18 murinos ou um controle duas vezes por semana durante o período do experimento, com ou sem tratamento concomitante com a agente de quimioterapia irinotecano administrado uma vez por semana, numa dose de 7,5 mg / kg. O tratamento com anticorpos anti-DLL4 murino 21M18 em asso- ciação com irinotecano reduziu o crescimento de tumores de cólon estabelecidos um maior grau do que qualquer tratamento isolado (Fig-14).

Em algumas modalidades, seguido pela terapia combinada anticorpo tratamento re- tardou a recidiva tumoral. Células C8 dissociadas (10.000 por animal) foram injetadas por via subcutânea na região do flanco direito em camundongos NIOD/SCID de 6-8 semanas de idade. Quando as células injetadas produziram tumores de aproximadamente 150 mm3, o tratamento foi iniciado. Os animais foram administrados intraperitoneal (ip) 10 mg / kg anti- corpos anti-DLL4 murino 21M18 ou anticorpos controle duas vezes por semana em associa- ção com irinotecano em 7,5 mg / kg uma vez por semana para um total de 32 dias. O trata- mento combinado foi então interrompido e foram tratados com anticorpos DLL4 21M18 ou anticorpos controle para o restante do experimento. O tratamento com anticorpos anti-DLL4 21M18 em seguida da terapia de combinação retardou significativamente a recorrência do crescimento tumoral comparado aos animais tratados com controle (Fig. 16). Volumes tumo- rais individuais são também mostrados aos 47 dias após o término do tratamento com Irino- tecano (Fig. 17). A redução da freqüência das células tronco cancerosas pelo anticorpo DLL4 é melhorada pelo Irinotecano Em certas modalidades, a capacidade de anticorpos anti-DLL4 21M18 isoladamen-

te ou em associação com irinotecano em reduzir a freqüência de células tronco cancerosas foi determinada utilizando uma análise por diluição limitante. Tumores de cólon C8 de ca- mundongos tratados com um ou outro de anticorpo controle ou anticorpo DLL4 21M18 muri- no, irinotecano, ou anticorpo DLL4 21M18 murino em associação com irinotecano, como descrito acima foram isoladas, após 38 dias de tratamento. Tumores isolados (n = 3 por gru- po experimental) foram tratados como descrito abaixo. Os tumores foram retirados, e pica- dos com uma lâmina estéril. Para obter suspensões de célula única, uma solução de diges- tão contendo colagenase/Hialuronidase:Dispase (1:1:8 de 10X) em meio MEBM (Cambrex, East Rutherford, NJ) com uma diluição 1:100 de DNAseI (Worthington, Lakewood, NJ) foi misturada com a suspensão de tumor e incubada durante 1 hora a 37 °C. As células foram centrifugadas e ressuspensas em 1 mL de meio de ACK (0,15 m NH4CI1 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA em água destilada) em gelo por 2 minutos para remover os glóbulos verme- lhos. Células foram centrifugadas e ressuspensas em uma concentração de 1x10 células/mL em tampão FACS e então incubados com anticorpos camundongo biotinilados (a-mouse CD45-biotina 1:200 de diluição e de rato α-camundongo H2Kd-biotina diluição de 1:100, Bio- Legend, San Diego, CA) em gelo por 30 minutos, seguida de adição de microesferas mag- néticas de estrepavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) para remover as células de camundon- go. As células humanas restantes na suspensão foram recolhidas, contadas e diluídas para a concentração desejada para utilização posterior. Diluições seriadas de células humanas foram, então, re-injetadas em camundongos imunossuprimidos. Especificamente, camun- dongos foram injetados com 900, 300, 100, ou 50 células tumorais humanas isoladas na região do flanco direito (n = 10 por grupo). Volume tumoral foi avaliado duas vezes por se- mana.

Ao término do estudo no dia 81, a porcentagem de ratos com tumores detectáveis foi diminuída em todos os grupos injetados com células tumorais tratadas com anticorpo DLL4 21M18 tratados e ainda diminuiu nas células tumorais tratadas com DLL4 21M18- irinotecano, em comparação com aqueles tratados com um ou outro de controle ou irinote- cano sozinhos (Fig. 15A). Usando estas freqüências na geração de tumores, as freqüências das células tronco foi calculada com base em estatística Poisson estatísticas fornecidas pelo software L-Calc ™ (download a partir de http://www. Stemcell. Com/search/default. Asp). Resumidamente, com base na distribuição estatística de Poisson, existe exatamente uma célula tronco em meio ao número conhecido de células injetadas se 37% dos animais não conseguem desenvolver tumores. Tratamento dos tumores com irinotecano sozinhos au- mentou o número de células tronco cancerosas de 1:93 em tumores tratados com controle para 1:82. Em contraste, os anticorpos anti-DLL4 reduziram a freqüência células tronco can- cerosas de 1:93 em tumores tratados com controle para 1:238 em tumores tratados com anticorpo DLL4 e de 1:573, em células tumorais tratadas com a com DLL4 21M18- irinotecano tratados células tumorais (Fig. 15B). Exemplo 5: Tratamento in vivo de Tumores Utilizando Anticorpos Anti-DLL4

Este exemplo descreve o uso de anti-Anticorpo DLL4 21M18 humanizado para o tratamento de câncer em um modelo xenoenxerto. Em certas modalidades, células tumorais de uma amostra paciente (biópsia de tumor sólido ou derrame pleural), que foi passageada como um xenoenxerto em camundongos são preparados para o repasse em animais expe- rimentais. Tecido tumoral é removido, cortado em pedaços pequenos, picados completa- mente usando lâminas estéreis, e as suspensões de célula única obtidas por digestão enzi- mática e ruptura mecânica. Células tumorais dissociadas são então injetadas por via subcu- tânea, seja em blocos gordurosos mamários, para tumores de mama, ou nos flancos, para tumores não mamários, de camundongos NOD/SCID para suscitar o crescimento tumoral. Alternativamente, células tumorigênicas ESA +, CD44 +, CD24-/low, Lin- são isoladas, como descrito em detalhes acima e injetadas.

Após a injeção de células tumorais, os animais são monitorados quanto ao cresci- mento tumoral. Após os tumores atingirem uma dimensão média de aproximadamente 100 mm3, se inicia o tratamento com anticorpo. Cada animal recebe 100 mg Anticorpo DLL4 21M18s humanizados ou anticorpos controle i.p. duas a cinco vezes por semana para um total de 6 semanas. Tamanho do tumor é avaliado duas vezes por semana durante essas 6 semanas. A capacidade de anticorpos DLL4 humanizados de impedir o crescimento tumoral ou ainda para reduzir o tamanho do tumor em comparação ao anticorpos controle é assim determinada.

Ao final do tratamento com anticorpo, os tumores são colhidos para análise posteri-

or. Em algumas modalidades uma porção do tumor é analisada por imunofluorescência para avaliar a penetração do anticorpo no tumor e a resposta do tumor. Uma porção de caca tu- mor colhido proveniente de camundongos tratados com anticorpo anti-DLL4 e tratado com anticorpo controle é congelado fresco em nitrogênio líquido, embutido em O.C.T., e cortado em um criostático como seções de 10 μίτι por sobre lâminas de vidro. Em algumas modali- dades, uma porção de cada tumor é embutido em parafina e fixado em formalina, e cortado em um microtome como seção de 10 μΐη por sobre lâminas de vidro. As seções são pós- fixadas e incubadas com anticorpos marcados com cromóforo que especificamente reco- nhecem anticorpos injetados para detectar receptor anti-DLI4 ou anticorpos controle presen- tes na biópsia do tumor. Além disso, anticorpos que detectam diferentes tumores e tipos de células recrutadas em tumores tais como, por exemplo, anticorpos anti-VE caderina (CD144) ou anti-PECAM-1 (CD31) para detectar células endoteliais vasculares, anticorpos anlfa-actin anti-musculatura lisa para detectar células da musculatura lisa vascular, anticorpos anti-Ki67 para detectar células proliferativas, ensaios TUNEL para detectar células corantes, anticor- pos de fragmento Notch de domínio anti-intracelular (ICD) para detectar sinalização Notch podem ser usados para avaliar os efeitos do tratamento anticorpo em, por exemplo, angio- gênese, crescimento do tumor e morfologia do tumor.

Em certas modalidades, o efeito do tratamento com anticorpo anti-DLL4 humaniza- do na expressão genética da célula tumoral é também avaliado. O RNA total é extraído de uma porção de cada tumor colhido proveniente de camundongos tratados com anticorpo DLL4 e anticorpo controle e usado para RT-PCR quantitativo. Os níveis de expressão DLL4, receptores Notch, componentes da rota de sinalização Notch, bem como a adição de mar- cador de células tronco cancerosases previamente identificados (por exemplo: CD44) são analisados em relação ao gene doméstico GAPDH como um controle interno. Alterações na expressão gênica de células tumorais quando do tratamento por anticorpo DLL4 são desse modo determinadas.

Além disso, o efeito do tratamento anti-anticorpo DLL4 acerca da presença de célu- Ias tronco cancerosas de um tumor é avaliado. Amostras de tumor provenientes de camun- dongos tratados com DLL4 versus anticorpo controle são cortadas em pedaços pequenos, picados completamente usando lâminas estéreis, e suspensões de célula única obtidas por digestão enzimática e ruptura mecânica. Células tumorais dissociadas FACS são então ana- lisadas por análise da presença de células tronco cancerosas tumorigênicas com base na expressão do marcador da superfície celular SEC +, CD44 +, CD24-/low, Lin-, tal como des- crito em detalhes acima.

A tumorigenicidade de células isoladas com base na expressão de SEC +, CD44 +, CD24-/low, Lin- em seguida ao tratamento por anticorpo anti-DLL4 pode ser avaliado. Célu- las tronco cancerosas SEC +, CD44 +, CD24-/low, Lin- isoladas a partir de camundongos tratados com anticorpo DLL4 versus anticorpo controle são re-injetadas subcutaneamente em blocos gordurosos mamários de camundongos NOD/SCID. A tumorigenicidade das célu- las tronco cancerosas com base no número de células injetadas necessárias para a forma- ção consistente do tumor é então determinada. Exemplo 6: Tratamento do Câncer Humano Usando anticorpos anti-DLL4 humanizados

Este exemplo descreve métodos para o tratamento de câncer utilizando anticorpos humanizados contra DLL4 para ter por alvo tumores compreendendo células tronco cance- rosas e/ou células tumorais em que receptor Notch ou a expressão de ligando ao receptor Notch foi detectada. A presença da expressão de marcador de células tronco cancerosas pode ser primeiramente determinada a partir da biópsia de um tumor, células tumorais de uma biópsia de um paciente diagnosticado com câncer são removidas sob condições esté- reis. Em algumas modalidades a biópsia do tecido é congelada fresca em nitrogênio líquido, embutidas em O.C.T., e cortada em um criostático como seções de 10 μητι por sobre lâminas de vidro. Em algumas modalidades, uma porção de cada tumor é embutido em parafina e fixado em formalina, e cortado em um microtome como seção de 10 μίτι por sobre lâminas de vidro. As seções são incubadas com anticorpos contra DLL4 para detectar a expressão da proteína.

A presença de células tronco cancerosas pode ser também determinada, amostras de biópsia tecidual são cortadas em pedaços pequenos, picados completamente usando lâminas estéreis, e as células sujeitas a digestão enzimática e ruptura mecânica para obter uma suspensão de célula única. Células tumorais dissociadas são então incubadas com anticorpos anti-ESA, CD44-, CD24-,-Lin, e -DLL4 para detectar células tronco cancerosas, bem como a presença de células tronco tumorais ESA +, CD44 +, CD24-/low, Lin-, DLL4 + é determinada por citometria de fluxo, tal como descrito em detalhes acima.

Pacientes cancerosos cujos tumores são diagnosticados como expressando um re- ceptor Notch ou ligando ao receptor Notch são tratadas com anticorpor anti-DLL4 humani- zados. Em certas modalidades, anticorpor anti-DLL4 humanizados gerados conforme descri- 3

O ac,ma puriflcados . formulados ^m um refcu|o ^ farmaoeutjcamente aceit.

ve Em algumas modalidades, os pacientes são tratados oom o anticorpos DLL4 pelo me-

Sio TJΓ Ρ°Γ mâS' POf Pe'° ™n0S 10 SemanaS' Em a'9Umas - Paoien.es

o ta ados oom o antros DLL4 pelo menos uma vez por semana por pelo menos cerca

112 TTs' adminiStraÇa° d° an,iCMP° d^ - farmaceuticamente a ,Tdll4 ■ Γ* m0da"dadeS· ^ de 2 a de 100 de um anticorpo To mL de 6 Tnistrad0' ^ a,9U™S m°dalidadeS' en're dS 5 até — de 40

conl t ηΓ Τ anti"DLU ' admlniS,rad0· ° 3η,*0ΓΡ0 - antes,

"um C°m' °U 3Ρ08 re9imeS Padr6eS de radi0teraP''= » ^rapia u-

rZZZ TTnte qUiml0teráPi0°' ,a' °0m0 o*31""*' ou

tado em uma ^ m°"i,0rad°S "" ** — -

a nllc Γ08'3 an,i-,Um0ral' P°r """**'· ~ -««-o tumoral, redução

Te e i V°S ' me"°r eXPreSSe° d° an,i9e"° 'Um0ra'· *»

de " U ,ΓΟη;° cancerosa^ « — de avaliação do prognóstico da doença.

dos na ΓηΓ ^ * ^ ^ Para ^eles cimente versa-

evL a ■ Ie T COnSidera?ÕeS ^ eSPe0mCaÇâ° 6 da *

representattvoT "" 3 ^^ 6 eXemP'°S — Ί>— como

zi~com:reai escop°e espíri,°da invença° send°

dos aqui são r^ Γ ^ " " * Pedid- d* P~ cita-

dos aqu, sao incorporadas por referência, na sua totalidade nessa revelação Seqüência SEQ ID NO.: 1 (cadeia pesada CDR1) TAYYIH

SEQ ID NO.: 2 (cadeia pesada CDR2, H2)

YIS CYNGATNYNQKFKG

SEQ ID NO.: 3 (cadeia pesada CDR2 H7) YISSYNGATSYKQKPKQ SEQ ID NO.: 4 (cadeia pesada CDR2 H9) YISVYNGATNYMQKFKQ SEQ ID NO.: 5 (cadeia pesada CDR3) RDYDYDVGMDY

SEQ ID NO.: 6 (região variável de cadeia pesada, H2)

Ovqlvqsgaevkkpqasvkisckasgysptayyihwvkqapg qgbbwioyiscywqatt^ynqkfkqrvt pttdts

ts t a ymb lrs lrs ddtavy ycard ydyd vgmd ywgqgtlvtvs s

SEQ ID NO.: 7 (região variável de cadeia pesada, H7)

qvqlvqsgaevkkpgasvkisckasgys FTAYY IHWVKQAiGQGiiBWIGYI ss yngatnymqkfkgrvtfttdts

TSTAYMELilS IiRSDDTAVYYCARD YD YDVGHD YWGQQTLVTVSS

SEQ ID NO.: 8 (região variável de cadeia pesada, H9)

qvqlvqsgae\rkkpgasvkisckasgysftayyihwvkqapgqglewigyisvykgatmynqkfkgrvtfttdts ts tayme lrs lrsddtavyycardydydvgmdywgqgtlvtvss

SEQ ID NO.: 9 (cadeia leve CDR1) RASE SVDNYGIS FMK SEQ ID NO.: 10 (cadeia leve CDR2)

AASNQGS SEQ ID NO.: 11 (cadeia leve CDR3) QQSKEVPWTFGG

SEQ ID NO.: 12 (região variável de cadeia leve)

Ditotqspdslavslgeratiscrasestonygisphkwpqqkpgqppkll1Iyaasnqgsgvpdrfsgsgsgtdf

tltisslqaedvavyycqqs ke vpwtfoggtkveik

SEQ ID NO.: 13 (seqüência nucleotídeo de cadeia pesada, H2. região variável)

atggactggacctggagcatcctgttcctggtggctgctgctacaggagctcactcccaggttcagctggtgcaa tctggagctgaggtgaaüaagcctg gggct agcgtgaagatcagctgcaaggctagcggatactcctttacagct

tactacatccactgggtgaagcaggcccctggacaagggctggagtggatcggatatatcagctgttacaacgga gctacaaactacaaccagaagttcaagggcagggtcaccttcacaacagacacaagcacaagc^cagcctacatg gagctgaggagcctgagaagcmacgac^cagccgtgtáctactgtgctagggactacgactacgacgtggggatg gactactgoggccaaggaaccctogtcaccotcagctca

SEQ ID NO.: 14 (seqüência nucleotídeo de cadeia pesada, H7, região variável) atggactggacctg(^gcatcctgttcctgqtggctgctgctacaggaqctcactcccaggttcagctggtgcac3 tctggagctgaggtgaagaagcctggggctagcgtgaagatcagctgcaaggctagcggatactcctttacagct

tactacatccactgggtgaagcaggcccctggacaagggctggagtgg^tcggatatatovgctcctacaacgga gctac^aactacaaccagaagttcaagggcagggtcaccttcacaacagacacaagcacaagcacaqcctacaxg

gagctgaggagccrroagaagcgacgacacagccgtgtactactgtgctagggactacxsacracgacgtggggatg

gactactggggccaaggaaccctggtcaccgtcagctca SEQ ID NO.: 15 (seqüência nucleotídeo de cadeia pesada, H9)

atggactggacctggagcatcctgttcctggtggcrrgctgctacaggagctcactcccaggttcagctggtgcag TCTaGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCTAGCGTG aagatcag ct gcaaggctagcggatactcctttacagct tactacatccactgggtgaagcaggcccctggacaagggctggagtggatcggatatatcaacgtctacaacgga gctacaaactacaaccagaagttcaagggcagggtcaccttcacaacagac^caagcãcaagcacagcctacatg gagctgaggagcctgagaagcgacgacacagccgtgtactactgtgctagggactacgactacgacgtggggatg

gactact ggggccaaggaaccctqc3tcaccc3tcagctca SEQ ID NO.: 16 (seqüência nucleotídeo de cadeia leve)

ATGGTGCTCC^GACCCAGGTCTTCATTTCCCTGCTGCrrCTGGATCAGCGGAGCCTACGGGGACATCGTGATGACC CAGTCCCCTGACTCCCTGGCTGTGTCC CTGGG CGAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAATCCGTCGAT

aattatggcatttcctttatgaagtggttccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacgctgca

tccaaccaagggtccggggtccctgacaggttcrceggcagcgggtccgg^

AGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCTGTCTATTACTGTCAGCAAAGCAAGGAGGTGCCTTGGACATTCGGAGGAGGG ACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCCCCCTCCGTC^tcatcttcccccccago^atgagcagctgaaa AGCGGCACTGCCAGCGTGGTaTGCCTGCTaAATAACTTCTATCCCCC5GGAGGCCAAAGT<3CAGTGGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAAAGCGGCAACTCCCAGGAGAGCGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACCCTGAGCAAAQCCGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTG AGCAGCCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGOGGCGAGTGTTGA

SEQ ID NO.: 17 (seqüência nucleotídeo de cadeia pesada CDR1) A CAG C TTAC TACA TC CAC

SEQ ID NO.: 18 (seqüência nucleotídeo de cadeia pesada CDR2, H2) ATATCAGCnX?rTÃCAACGGAGCTACAAACTACAA.CCAGAAGTTCAAGG<3C

SEQ ID NO.: 19 (seqüência nucleotídeo de cadeia pesada CDR2, H7) ATATCAGCTCCTACAACGGAGCTACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGC

SEQ ID NO.: 20 (seqüência nucleotídeo de cadeia leve CDR2, H9) ATATCAGCGTCTACAACGGAGCTÂCAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGC SEQ ID NO.: 21 (seqüência nucleotídeo de cadeia pesada CDR3) AGGGACTACGACTACGACGTGGGGATGGACTAC SEQ ID NO.: 22 (seqüência nucleotídeo de cadeia leve CDR1) AGAGCCAGCGAATCCGTCGATAATTATGGCATTTCCTTTATGAAG

SEQ ID NO.: 23 (seqüência nucleotídeo de cadeia leve CDR2) GCTGCATCCAACCAAGGGTCC

SEQ ID NO.: 24 (seqüência nucleotídeo de cadeia leve CDR3) CAG CAAAG CAAGGAGGTGCCTTGGACATTCGG AGGA SEQ ID NO.: 25 (Antígeno DLL4 Humano) maaasrsasgwallllvalwqqraagsgvfqlqlqefixergvlasgrpcepgcrtffrvclkhfqa

v vspgpc1tgtvstpvlgtosf avrddssgggrnplqlpfnftwpgt fsliiea whapgddlrp ealppd aliskl^iqgslavgqíwlldeqtstll-kxrysyrvicsdnyygdncsrlckkrndhfghyvcqpdgn lsclpgwtgeycc^piclsgcheqngycskp aeclc rpgwqg rjxheciphngcrhgtcstp wqctcd egwgglfcdqdlnycthhspcicngatcsnsgqrsytctcrpgytgvdcelelsecdsnpcrnggsck dqedgyiiclcppgyyglhcehstlscadspcfnggscrernqgahryacecpphftgsncekkvdrcts npcanggqclnrgpsraicrcrpgfigtccelhvsdcarnpcahggtciidlenglmctcpagfsgrjic evrtsidacasspcfnratcytdlstdtfvcncpygfvgsrcefpvg

SEQ ID NO.: 26 (Domínio DSL DLL4 Humano)

wlldeqtstltrlrysyrvicsdnyygdncsrj^

SEQ ID NO.: 27 (Região N-terminal DLL4-Humano)

maaasrsasgwallllvalwqqraagsgvfqlqlqefinergvlasgrpcepgcrtffrvclkhfqa

v vspgpctfgtystp vlgtn sfa vrddssgggrnplqlpfnftwpgtfsliie a wh apgddlrpealppd aliskiaiqg sla vgqn

Claims (63)

1. Anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo DLL4 humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende aminoácidos dentro da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27), onde o anticorpo influencia o crescimento de um tumor que compreende células tronco cancerosas.

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano é formado por uma combinação da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL DLL4 humano (SEQ ID NO: 26).

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano adicionalmente compreende aminoácidos dentro de DSL DLL4 humano (SEQ ID NO: 26).

4. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano compreende aminoácidos 66-73 (QAWSPGP) da região N- terminal DLL4 humano.

5. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano compreende aminoácidos V68, V69, e P71 da região N- terminal DLL4 humano.

6. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano compreende aminoácidos 139-146 (LISKIAIQ) da região N- terminal DLL4 humano.

7. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano compreende aminoácidos K142 e A 144 da região N- terminal DLL4 humano.

8. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano compreende aminoácidos 66-73 (QAWSPGP) e 139-146 (LISKIAIQ) da região N-terminal DLL4 humano.

9. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano compreende aminoácidos V68, V69, P71, KL 42, K1 e 44 da região N-terminal DLL4 humano.

10. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a influência é uma redução do volume tumoral.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico.

13. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano.

15. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que é um anticorpo IgG.

16. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o IgG é lgG2.

17. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que é um fragmento anticorpo.

18. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento anticorpo é um fragmento Fab.

19. Anticorpo isolado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: i. uma região variável de cadeia pesada que compreende seqüências aminoácidos CDR, CDR1 (SEQ ID NO: 1); CDR2 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou seja, SEQ ID NO: 4); e CDR3 (SEQ ID NO: 5) e ii. uma região variável de cadeia leve que compreende seqüências aminoácidos CDR, CDR1 (SEQ ID NO: 9); CDR2 (SEQ ID NO: 10); e CDR3 (SEQ ID NO: 11).

20. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que é produzido através de hibridoma depositado com ATCC em 28 de setembro de 2007, e possuindo depósito ATCC No._.

21. Anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que compete para ligação específica a DLL4 humano com um anticorpo produzido por hibridoma depositado com ATCC em 28 de setembro de 2007 e possuindo depósito ATCC No._.

22. Anticorpo humanizado, que se liga especificamente a um epítopo DLL4 humano que compreende aminoácidos dentro região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27), CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região de determi- nação de antígeno não humano e uma região do quadro operativo variável de cadeia pesa- da humana, e (ii) uma região variável de cadeia leve que compreende uma região de determina- ção de antígeno não humano e uma região do quadro operativo variável de cadeia leve hu- mana.

23. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO 35 pelo fato de que o epítopo DLL4 humano é formado por uma combinação da região N- terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27) e DSL DLL4 humano (SEQ ID NO: 26).

24. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o epítopo DLL4 humano adicionalmente compreende aminoácidos dentro de DSL DLL4 humano (SEQ DD NÃO: 26).

25. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um resíduo na região do quadro operativo variável de cadeia pesada humana está substituído.

26. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma substituição é uma substituição de um resíduo que ocu- pa a posição correspondente em um anticorpo que compreende a região de determinação de antígeno não humano.

27. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que cinco ou seis resíduos na região do quadro operativo variável de cadeia pesada humana estão substituídos.

28. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma substituição na região do quadro operativo variável hu- mano está em uma posição selecionada do grupo constituído por 16h, 20H, 27H, 28H, 38H, e 48h com base no sistema de numeração Kabat.

29. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma substituição na região do quadro operativo variável hu- mano está em uma posição selecionada do grupo constituído por 20H, 28H, 38H, 48h, e 69H com base no sistema de numeração de Kabat.

30. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que as posições 16h, 20H, 27H, 28H, 38H, e 48h estão substituídas com base no sistema de numeração de Kabat.

31. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que as posições 20H, 28H, 38H, 48h, e 69H estão substituídas com base no sistema de numeração de Kabat.

32. Anticorpo humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a31, CARACTERIZADO pelo fato de que a região de determinação de antígeno não humano de cadeia pesada compreende aminoácidos de CDR, CDR1 (SEQ ID NO: 1); CDR2 (SEQ 30 ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4); e CDR3 (SEQ ID NO: 5).

33. Anticorpo humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a31, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um resíduo na região do quadro opera- tivo variável de cadeia leve humana está substituído.

34. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma substituição é uma substituição de um resíduo que ocu- pa a posição correspondente em um anticorpo que compreende a região de determinação de antígeno não humano.

35. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que dois resíduos humanos na região do quadro operativo variável de cadeia leve humana estão substituídos.

36. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um resíduo na região do quadro operativo variável humano está em uma posição selecionada a partir do grupo que compreende 22L e 36L com base no sistema de numeração de Kabat.

37. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que as posições 22L e 36L estão substituídas com base no sistema de numera- ção Kabat

38. Anticorpo humanizado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a região de determinação do antígeno não humano de cadeia leve compreende CDR1 (SEQ ID NO: 9); CDR2 (SEQ ID NO: 10); e CDR3 (SEQ ID NO: 11).

39. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8.

40. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 12.

41. Anticorpo humanizado, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8 e a região variável de cadeia leve compreende SEQ ID NO: 12.

42. Anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo DLL4 humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende aminoácidos dentro da região N-terminal DLL4 humano (SEQ ID NO: 27), onde o anticorpo inibe a ligação DLL4 a um receptor de Notch.

43. Anticorpo, CARACTERIZADO pelo fato de que compete por ligação específica a DLL4 humano com um anticorpo codificado pelo plasmídeo depositado com ATCC (depó- sito ATCC No. PTA-8427 ou PTA-8425).

44. Anticorpo humanizado, CARACTERIZADO pelo fato de que é codificado pelo plasmídeo depositado com ATCC No. PTA-8427 ou PTA-8425.

45. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: i. um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, e ii. um veículo farmaceuticamente aceitável.

46. Vetor polinucleotídeo isolado, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44.

47. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais vetores polinucleotídeo que codifica um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44.

48. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

49. Uso de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamen- to de câncer.

50. Uso de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que a utilização compreende administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido anticorpo em combinação com um segundo agente terapêutico.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo e o segundo agente terapêutico são dados em simultâneo ou seqüencialmente.

52. Uso de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um agente quimioterápico.

53. Uso de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente quimioterápico é Fluorouracila ou irinotecano.

54. Uso de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo terapêutico.

55. Uso de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo é um anticorpo terapêutico anti-EGF receptor ou um anticorpo anti-VEGF anticor- po.

56. Uso de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo agente terapêutico é radioterapia.

57. Método de diagnóstico de câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compre- ende contatar um paciente com uma amostra de acordo com qualquer anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, e diagnosticar câncer com base no posicio- namento da expressão de DLL4 expressão na amostra do paciente.

58. Método de fabricação de anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: i. transformar células hospedeiras com um vetor ou vetores de expressão polinucle- otídeo que codifica o anticorpo; ii. cultivar as células hospedeiras sob condições que permitam a expressão do anti- corpo; e iii. purificar o anticorpo do meio de cultura.

59. Linhagem celular transformada, CARACTERIZADA pelo fato de que expressa anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 44.

60. Hibridoma, CARACTERIZADO pelo fato de que secreta anticorpo 21M18 depo- sitado com ATCC em 28 de setembro de 2007 e que possui depósito ATCC No._.

61. Plasmideo1 CARACTERIZADO pelo fato de que codifica H9L2 21M18 (depósito ATCC No. PTA-8427) ou H7L2 21M18 (depósito ATCC No. PTA-8425).

62. Método de produzir anticorpos H9L2 21M18 ou anticorpo H7L2 21M18, CARACTERIZADO pelo fato de que é pelo cultivo células transfectadas com os plasmídeos depositados com ATCC No. PTA-8427 ou PTA-8425.

63. Kit compreendendo um recipiente e uma composição nele contida, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, e adicionalmente compreende uma bula indi- cando que a composição pode ser usada para tratar o câncer.