BRPI0717628A2 - Aditivo de ração para aves e mamíferos, ração, e, método para criar aves ou mamíferos - Google Patents
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Description
"ADITIVO DE RAÇÃO PARA AVES E MAMÍFEROS, RAÇÃO, E, MÉTODO PARA CRIAR AVES OU MAMÍFEROS" [Campo Técnico]
A presente invenção refere-se aos aditivos de ração e às rações contendo glicolipídeos, e aos métodos de criação de aves e mamíferos usando os mesmos. [Técnica Anterior]
Doenças infecciosas de animais de criação diminuem o peso dos animais de criação e causam vários sintomas, resultando em um decréscimo significativo em um valor comercial do animal de criação. Por exemplo, Staphylococcus aureus é uma bactéria que causa: mastite, tumor subcutâneo, e piemia de vaca, ovelha, e cabra; exantema de cavalo; artrite, dermatite, e septicemia de porcos e galinhas. Entrementes, Streptococcus suis é uma bactéria que causa meningite, septicemia, endocardite, e artrite de porco, enquanto que Streptoeoecus bovis é uma bactéria que causa distensão abdominal de vaca.
O fato de que a adição de uma quantidade pequena de um antibiótico em uma ração para animal de criação promove o crescimento de animal de criação foi descoberto em 1940's, e desde então, adição de um antibiótico em uma ração para animal de criação tem sido amplamente realizada para promover o crescimento de animal de criação ou para prevenir uma doença. É considerado que um antibiótico tem capacidades para prevenir infecção de uma bactéria patogênica em animal de criação, melhora o metabolismo, e suprime a amplificação de uma bactéria entérica nociva, resultando na prevenção de uma doença e na promoção de crescimento, mas os detalhes permanecem desconhecidos. Entrementes, adição de um antibiótico em uma ração pode espalhar o antibiótico no ambiente natural, e aparência de bactéria resistente a antibiótico tem se tornado um problema enorme na indústria de animais de criação. Por exemplo, tem sido relatado que uma típica bactéria resistente a antibiótico, MRSA (,Staphylococcus aureus resistente a meticilina) foi descoberta em animal de criação tal como cavalo.
Sob tais circunstâncias, em anos recentes, adição de um antibiótico em uma ração é pesadamente regulada. Por exemplo, na Europa, rações contendo antibióticos foram totalmente banidos em 2006, e em Japão, o número de antibióticos que pode ser usado está gradualmente decrescendo. Além disso, fabricantes demandam alternativas aos antibióticos para solucionar os problemas acima mencionados. Por causa de tal movimento de alternativas aos antibióticos,
tem havido algumas tentativas para usar polipeptídeos tal como nisina produzida por bactérias do ácido lático e iturina produzida por bactérias Bacillus. Entrementes, ésteres de sacarose, que são glicolipídeos a serem adicionados em café enlatado ou semelhantes como emulsificadores, que são esperados em ter atividades antibióticas para bactérias Bacillus, são adicionados à ração.
Um animal ruminante tal como vaca ou ovelha vive por um produto de fermentação obtido por digestão/fermentação de uma ração usando um microorganismo no rume. Portanto, geração de metano do rume acarreta perda da eficiência energética da ração. Além disso, metano é um gás de efeito estufa que afeta o aquecimento global, portanto, é importante reduzir a geração de metano no rume de um animal ruminante.
Uma bactéria produtora de metano em um rume produz metano pela redução de dióxido de carbono usando hidrogênio. A taxa de contribuição do metano para o aquecimento global é a segunda mais alta depois do dióxido de carbono, e metano liberado de animais ruminantes totaliza 15 a 20% da liberação de metanol total.
Ionóforos tal como um antibiótico monensina são amplamente usados em rações para animais ruminantes. Monensina tem um efeito de seletivamente suprimir microorganismos em um rume, resultando em redução na geração de metano e na promoção da geração de ácido propiônico. Ácido propiônico tem uma eficiência de geração de ATP alta comparado com os outros ácidos graxos voláteis, portanto, a promoção da geração de ácido propiônico melhora a eficiência da ração.
De tais circunstâncias, tem sido desejado desenvolver uma alternativa para monensina ou semelhante a ser adicionada em rações para animais ruminantes. Com o propósito de obter a alternativa, estudos têm sido feitos sobre um óleo de extração de planta (Documento de Não-Patente 1), uma vacina de anti-bactéria produtora de ácido lático (Documento de Não- Patente 2),anticorpo de ovo de galinha anti-bactéria produtora de ácido lático (Documento de Não-Patente 3), etc. Contudo, aquelas tecnologias têm problemas, por exemplo, o efeito não está estabilizado e registro de rações contendo estes materiais não é aceito. Portanto, aquelas tecnologias não têm sido postas em uso prático.
Por outro lado, glicolipídeos representados pelos lipídeos de manosil-eritritol (MEL) e ramnolipídeos (RL) têm várias propriedades tais como atividades tensoativas e são usados para vários propósitos como descritos abaixo. Por exemplo, são conhecidos uma tecnologia nova para melhorar as eficiências de transdução de gene usando um lipossomo contendo MEL (Documento de Patente 1), um método de inibir a formação de um lipossomo contendo um gene de resistência à droga ou semelhante usando MEL para diminuir a geração de uma bactéria resistente à droga ou semelhante (Documento de Patente 2), uma tecnologia usando MEL como um ingrediente ativo de um agente antiinflamatório e um agente antialérgico (Documento de Patente 3), etc. Em adição, são conhecidos uma tecnologia para melhorar a propriedade de absorção de água de uma fibra natural usando ramnolipídeos (Documento de Patente 4), uma tecnologia para separar um composto orgânico nocivo útil de um produto não tratado contendo o composto orgânico nocivo útil usando ramnolipídeos (Documento de Patente 5), uma tecnologia para prevenir a agregação e a coalescência de gelo pela preparação de pasta de gelo para transporte termicamente regulado de densidade alta usando ramnolipídeos (Documento de Patente 6), etc. Notar que, alguns relatórios sobre propriedades antibióticas de MEL e ramnolipídeos têm sido preparados (Documentos de Não-Patente 4 e 5), mas propriedades antibióticas para bactérias causadoras de doenças infecciosas de animais de criação não têm sido estudadas, e não há exemplo de aplicações de MEL e de ramnolipídeos na indústria de animais de criação. [Documento de Patente 1 ] JP 2006-174727 A
[Documento de Patente 2] JP 2006-158387 A [Documento de Patente 3] JP 2005-68015 A [Documento de Patente 4] JP 2002-105854 A [Documento de Patente 5] JP 2001-327803 A [Documento de Patente 6]JP2001-131538A
[Documento de Não-Patente 1] Benchaar et al., Can.J.Anim.Sci. 86, 91-96(2006)
[Documento de Não-Patente 2] Shu et al., FEMS Immunuology & Medicai Microbiology, 26(2), 153-158(1999) [Documento de Não-Patente 3] DiLorenzo et al., J.Anim.Sci.,
84,2178-2185(2006)
[Documento de Não-Patente 4] Fat.Sci.Technol., 91, 363-366,
1989
[Documento de Não-Patente 5] Biotechnol., 29, 91-96, 1993 [Revelação da Invenção]
Um objetivo da presente invenção é proporcionar um meio seguro e fácil para prevenir ou tratar doenças de aves e mamíferos, em particular, animais de criação. Em particular, um objetivo da presente invenção é prevenir ou tratar uma doença infecciosa causada por uma bactéria Gram-positiva.
Outro objetivo da presente invenção é melhorar a fermentação no rume de um animal ruminante, para contribuir para a supressão da geração de gases de efeito estufa, e para aumentar a eficiência da ração.
Os inventores da presente invenção têm feito estudos
extensivos para alcançar os objetivos mencionados acima, e como um resultado, os inventores têm verificado que glicolipídeos tais como lipídeos de manosil-eritritol (MEL) e ramnolipídeos têm atividades antibióticas para bactérias Gram-positivas que causam doenças infecciosas em animais de criação, finalizando assim a presente invenção. Além disso, os inventores têm verificado que glicolipídeos tais como lipídeos de manosil-eritritol (MEL) e ramnolipídeos suprimem a geração de metano e promovem a geração de ácido propiônico no rume, finalizando assim a presente invenção.
Isto é, a presente invenção é como segue: (1) um aditivo de ração para aves e mamíferos compreendendo
lipídeos de manosil-eritritol e/ou ramnolipídeos;
(2) o aditivo de ração de acordo com o Item (1), que é para animais de criação;
(3) o aditivo de ração de acordo com o Item (2), sendo que o animal de criação é galinha, porco, ou vaca;
(4) o aditivo de ração de acordo com o Item (1), sendo que é para um animal ruminante;
(5) o aditivo de ração de acordo com qualquer um dos Itens (1) a (4), sendo que os lipídeos de manosil-eritritol são obtidos de levedura
pertencendo ao gênero Pseudozyma·,
(6) o aditivo de ração de acordo com qualquer um dos Itens (1) to (5), sendo que os ramnolipídeos são obtidos de uma bactéria pertencendo ao gênero Pseudomonas;
(7) o aditivo de ração de acordo com qualquer um dos Itens (1) to (6), que é para a prevenção ou o tratamento de uma doença; (8) o aditivo de ração de acordo com o Item (7), sendo que a doença é uma doença infecciosa causada por uma bactéria Gram-positiva;
(9) o aditivo de ração de acordo com o Item (8), no qual a bactéria Gram-positiva é uma bactéria pertencendo ao gênero Staphylococcus ou Streptococcus;
(10) o aditivo de ração de acordo com o Item (9), sendo que a bactéria Gram-positiva é Staphyloeoeeus aureus, Staphyloeoeeus epidermidis, Streptocoeeus suis, ou Streptoeoeeus bovis;
(11) uma ração compreendendo o aditivo de ração de acordo com qualquer um dos Itens (1) a (10); e
(12) um método para criar aves ou mamíferos, compreendendo dar a ração de acordo com o Item (11) às aves ou aos mamíferos. [Descrição Breve dos Desenhos]
Figs. 1 mostra efeitos de RL e MEL sobre quantidades de geração de gás e composições em um rume.
Figs. 2 mostra os efeitos de RL e MEL sobre concentrações e taxas de ácidos graxos voláteis. [Melhores Modos para Realizar a Invenção]
Um aditivo de ração da presente invenção é caracterizado pelo fato de compreender lipídeos de manosil-eritritol (MEL) e/ou ramnolipídeos (RL).
MEL é um dos biotensoativos do tipo glicolipídeo e tem uma estrutura incluindo manose, eritritol, e um ácido graxo, e é representado pela seguinte fórmula geral (1). Em fórmula geral (1), R1 e R2 são cada um independentemente 12
grupos acila alifáticos tendo 3 a 25 átomos de carbono. Em particular, ReR são preferivelmente cada um independentemente grupos acila alifáticos tendo a 14 átomos de carbono. Em particular, R1 e R2 são preferivelmente cada um independentemente grupos acila tendo 5 a 13 átomos de carbono. Aqueles grupos acila alifáticos podem ser lineares ou ramificados, e podem estar saturados ou insaturados. Por outro lado, um de R3 e R4 é um grupo acetila e o outro é hidrogênio, ou ambos R3 e R4 são grupos acetila.
MEL onde ambos R3 e R4 são grupos acetila é chamado de MEL-A, MEL onde R3 é hidrogênio e R4 é um grupo acetila é chamado de MEL-B, e MEL onde R3 é um grupo acetila e R4 é hidrogênio é chamado de MEL-C.
Entrementes, um aditivo de ração da presente invenção pode compreender um tipo de MEL ou tipos plurais de MEL.
MEL a ser usado na presente invenção pode ser obtido pela cultura de um microorganismo tal como um fungo, em particular, levedura. Por exemplo, podem ser usadas leveduras pertencendo aos gêneros Pseudozyma, Candida, e Kurtzmanomyces. Em adição, Shizonella melanogramma pode ser usada. Daquelas, levedura pertencendo ao gênero Pseudozyma é preferivelmente usada. Exemplos de leveduras pertencendo ao gênero Pseudozyma incluem Pseudozyma aphidis e Pseudozyma antarctica. Especificamente, podem ser usadas Pseudozyma aphidis cepa NBRC 10182, 10
15
Pseudozyma antarctica cepa NBRC 10260, e Pseudozyma Antarctica cepa NBRC 10736, por exemplo.
Cepa NBRC 10182, cepa NBRC 10260, e cepa NBRC 10736 estão registradas no departamento de NITE Biological Resource Center (NBRC) em National Institute of Technology and Evaluation.
Entrementes, o MEL pode ser sintetizado ou pode ser um produto comercialmente disponível.
Ramnolipídeo é um dos biotensoativos do tipo glicolipídeo e tem uma estrutura incluindo ramnose e um ácido graxo. Embora ramnolipídeos a serem usados na presente invenção não sejam particularmente limitados, ele pode ter a estrutura representada pela seguinte fórmula geral (2) ou fórmula geral (3).
-CHCH2COOCHCH2COOR5
I I
(çh2)6 (9^2)0
CHr
CH-
20
OH R6
Fórmula geral (2)
Em fórmula geral (2), R5 representa um átomo de hidrogênio, - CH2-[CH(OH)]m-CH2(OH), -(XO)nH, ou um grupo alquila, alquenila, acila alifática tendo 1 a 36 átomos de carbono. Em fórmula geral (2), os grupos alquila e alquenila podem ser lineares ou ramificados, e o grupo acila alifática pode ser linear ou ramificado, e pode estar saturado ou insaturado. Entrementes, m é um número inteiro de 0 a 8, e X representa pelo menos um de etileno, propileno, e butileno, e η é um número inteiro de 1 a 1.000. R e um átomo de hidrogênio ou um grupo 2-decenoíla. R5 e R6 são independentes Em fórmula geral (3), R7 representa um átomo de hidrogênio, - CH2-[CH(OH)]m-CH2(OH), -(XO)nH5 ou um grupo alquila, alquenila, acila alifática tendo 1 a 36 átomos de carbono. Em fórmula geral (3), os grupos alquila e alquenila podem ser lineares ou ramificados, e o grupo acila alifática pode ser linear ou ramificado, e pode estar saturado ou insaturado. Entrementes, m é um número inteiro de O a 8, e X representa pelo menos um de etileno, propileno, e butileno, e η é um número inteiro de 1 a 1.000. R8 é um átomo de hidrogênio ou um grupo 2-decenoíla. R7 e R8 são independentes um do outro.
Entrementes, um aditivo de ração da presente invenção pode compreender um tipo de ramnolipídeo ou tipos plurais de ramnolipídeos.
Ramnolipídeos a serem usados na presente invenção podem ser obtidos por cultura de uma bactéria. Por exemplo, podem ser usadas bactérias pertencendo aos gêneros Pseudomonas e Burkholderia. Daquelas, bactérias pertencendo ao gênero Pseudomonas são preferivelmente usadas. Exemplos das bactérias pertencendo ao gênero Pseudomonas incluem Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas chlororaphis, e Pseudomonas sp.podem ser utilizadas. Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Burkholderia incluem Burkholderia pseudomalle. Daquelas, Pseudomonas aeruginosa é particularmente utilizada. Especificamente, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa cepa NBRC 3924, Pseudomonas sp. cepa DSM 2874, etc. podem ser usadas. Cepa NBRC 3924 está registrada no departamento de NITE Biological Resource Center (NBRC) in National Institute of Technology and Evaluation.
Cepa DSM 2874 está registrada em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ).
Entrementes, os ramnolipídeos podem ser sintetizados ou podem ser um produto comercialmente disponível.
Os MEL e ramnolipídeos podem ser produzidos usando os microorganismos acima mencionados pelo seguinte método:
MEL pode ser produzido por: seleção de um material adequado para uma bactéria a ser usada a partir de óleos e gorduras naturais, ácidos graxos, alcoóis, cetonas, hidrocarbonetos, n-alcanos, etc.; e cultura da bactéria em uma temperatura de cultura geralmente usada para cultura da bactéria. Os óleos e gorduras naturais são materiais preferíveis, e por exemplo, óleo de feijão-soja, óleo de girassol, óleo de coro, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de palmeira, etc. podem ser usados, e daqueles, óleo de feijão-soja é particularmente preferivelmente usado.
Por outro lado, ramnolipídeos pode ser produzidos por: seleção de um material adequado para uma bactéria a ser usada a partir de óleos e gorduras naturais, ácidos graxos, alcoóis, cetonas, hidrocarbonetos, n-alcanos, açúcares, etc.; e cultura da bactéria em uma temperatura de cultura geralmente usada para cultura da bactéria. Um tal método, por exemplo, o método descrito em JP 10-75796 A pode ser usado.
Em cada caso, o método de cultura não é particularmente limitado, e seus exemplos incluem um método de cultura líquida e um método de cultura sólida por cultura estática, cultura agitada recíproca, cultura agitada rotativa, cultura em fermentador de jarro.
Produção de MEL usando levedura pertencendo ao gênero Pseudozyma pode se realizada pela adição de um óleo ou uma gordura natural tal como óleo de feijão-soja em um meio geralmente usado para cultura de levedura pertencendo ao gênero Pseudozyma e cultura da bactéria a de 20°C a 35°C.
Produção de ramnolipídeos usando uma bactéria pertencendo ao gênero Pseudomonas pode ser realizada pela adição de um óleo ou uma gordura natural tal como óleo de feijão-soja, um açúcar tal como glicose, e um álcool tal como etanol em um meio geralmente usado para cultura de uma bactéria pertencendo ao gênero Pseudomonas e cultura da bactéria a de 20°C a 40°C.
Na produção de MEL e/ou ramnolipídeos usando um
microorganismo, pode ser usado um produto purificado de MEL e/ou ramnolipídeos obtido por purificação do produto de cultura, ou uma fração contendo MEL e/ou ramnolipídeos obtida por centrifugação de um produto de cultura. Entrementes, um produto de cultura pode ser usado como tal, e por exemplo, um produto obtido por secagem / pulverização de uma solução de cultura ou um produto de cultura sólida pode ser usado.
Um aditivo de ração da presente invenção pode conter qualquer um de ou ambos MEL e ramnolipídeos. Embora o teor de MEL e/ou ramnolipídeos não seja particularmente limitado, do ponto de vista de obtenção de um efeito suficiente, é preferivelmente 10 ppm em massa ou maior, mais preferivelmente 1% em massa ou maior.
Em adição, um aditivo de ração da presente invenção pode adicionalmente conter não apenas MEL e/ou ramnolipídeos mas também um componente arbitrário tal como um componente efetivo para prevenção ou tratamento de doenças de aves ou mamíferos, um componente efetivo para promoção de crescimento de animais ruminantes, um componente suplementar de nutrição, ou um componente para aumentar a preservação de estabilidade. Exemplos de componente arbitrário incluem: agentes celulares viáveis de Enterococciy Bacilliy e Bifidobaeteria; enzimas tais como amilase e lipase; vitaminas tais como ácido L-ascórbico, cloreto de colina, inositol, e ácido fólico; minerais tais como cloreto de potássio, citrato férrico, óxido de magnésio, e fosfato e aminoácidos tais como cloridrato de DL-alanina, de DL-metionina, e de L-lisina; ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido lático, ácido acético, e seus sais; antioxidantes tais como etoxiquina e dibutil-hidróxi-tolueno; fungicidas tal como propionato de cálcio; aglutinantes tal como CMC, caseína sódica, e poli(acrilato de sódio); emulsificadores tais como éster de glicerina - ácido graxo; pigmentos tais como astaxantina e cantaxantina; e aromatizantes tais como vários ésteres, éteres, e cetonas. A forma de dosagem de um aditivo de ração da presente
invenção não é particularmente limitada, e o aditivo de ração pode ter qualquer forma tal como pó, líquido, ou tablete. Um aditivo de ração da presente invenção pode ser produzido por: misturação de MEL e/ou ramnolipídeos, e um componente opcional, se necessário; e formulação da mistura.
Entrementes, MEL e ramnolipídeos mostram atividades antibióticas para bactérias que causam doenças de aves ou mamíferos, portanto, um aditivo de ração da presente invenção pode ser usado para prevenir ou tratar aquelas doenças de aves ou mamíferos causadas pelas bactérias.
Um aditivo de ração da presente invenção pode ser preferivelmente usado para prevenir ou tratar, em particular, uma doença infecciosa causada por uma bactéria Gram-positiva.
Exemplos de bactérias Gram-positivas incluem bactérias pertencendo aos gêneros de Micrococcus, Staphylocoeeus, Streptococcus, Planoeoceus, Stomatoeoeeus, Enteroeoeeus, Peptoeoecus,
PeptoStreptoeoeeus, Ruminoeoceus, Leueonostoe, Pedioeoeeus, Aerococcus, Gemella, Coproeoeeus, Sareina, Bacillus, Clostridium, LactoBacillus, Listeria, Erysipelothrix, Corynebaeterium, Rhodoeoeeus, Propionibacterium, Eubacterium, Actinomyces, Bifidobaeterium, Mycobacterium, Noeardía, e Dermatophilus.
O aditivo de ração da presente invenção pode ser adequadamente usado para prevenção e tratamento de doença induzida por bactérias pertencendo ao gêneros de Staphyloeoeeus e Streptoeoecus, e, especificamente, por Staphyloeoeeus aureus, Staphyloeoeeus epidermidis, Streptoeoecus suis, Streptoeoecus bovis e semelhantes.
Uma ração para aves ou mamíferos pode ser obtida por misturação de um aditivo de ração da presente invenção com outro componente de ração a ser usado em rações para aves ou mamíferos, rações para animais de companhia, suplementos para animais de companhia (daqui em diante, chamados de ração). O tipo e os componentes da ração não são particularmente limitados. Entrementes, o componente arbitrário mencionado acima que pode ser adicionado em um aditivo de ração pode ser adicionado em uma ração da presente invenção. Em adição, uma ração da presente invenção pode ser usado como uma ração a ser usada para prevenir ou tratar doenças de aves ou mamíferos.
O teor de MEL e/ou ramnolipídeos em uma ração da presente invenção não é particularmente limitado, é apropriadamente ajustado dependendo da espécie de um animal alvo, da condição física, do tipo de uma ração, do componente de ração, da idade, do sexo, do peso, etc. O teor de MEL e/ou ramnolipídeos é preferivelmente de 1 a 10.000 ppm em massa, mais preferivelmente 10 a 10.000 ppm em massa, muito mais preferivelmente IOal .000 ppm em massa por massa seca.
Uma ração da presente invenção pode ser produzida pela adição de um aditivo de ração em um componente de ração como tal e misturação dos componentes. Neste procedimento, no caso do uso de aditivo de ração em pó ou um aditivo de ração sólido, a forma do aditivo de ração pode ser modificada em um líquido ou gel com o propósito de misturar facilmente os componentes. Neste caso, água; óleos de planta tais como óleo de feijão-soja, um óleo de colza, um óleo de milho; um óleo líquido de animal; ou componentes poliméricos solúveis em água tais como poli(vinil- álcool), poli(vinil-pirrolidona), ou poli(ácido acrílico) podem ser usados como veículo líquido. Entrementes, com o propósito de manter uniformidade de MEL e/ou ramnolipídeos em uma ração, é preferível incorporar ácido algínico, alginato de sódio, goma xantana, caseína sódica, goma arábica, goma guar, ou um polissacarídeo solúvel em água tal como polissacarídeo de semente de tamarindo.
As espécies de animais que comem uma ração da presente invenção são aves ou mamíferos. A ração pode ser usada para animais de criação ou animais de companhia tais como cães e gatos, por exemplo. Daqueles, a ração é preferivelmente usada para criar animais de criação, em particular, galinhas, porcos, ou vacas. A ração é preferivelmente usada para criar animais ruminantes. Por exemplo, a ração é preferivelmente usada para criar vaca, cabra, e ovelha. A quantidade de ração a ser dada pode ser apropriadamente ajustada dependendo da espécie, do peso, da idade, do seco, da condição física do animal, do componente de ração, etc.
O método de dar uma ração e o método para criar um animal podem ser métodos geralmente usados dependendo da espécie do animal. [Exemplos]
[I] Avaliação das atividade antibióticas <1> Produção de MEL (1) Cultura de levedura Pseudozyma (Pré-cultura)
ml de meio de dextrose de batata foram adicionados em um tubo de ensaio, e uma tampa de silicone foi inserida no mesmo. O tubo foi esterilizado em um autoclave, e Pseudozyma aphidis cepa NBRC 10182 foi inoculada, seguido por agitação a 30°C por 24 horas. (Cultura principal)
50 ml de um meio contendo água íon-trocada, 8% de óleo de feijão-soja, 0,2% de NaNO3, 0,02% de KH2PO4, 0,02% de MgS04-7H20, e 0,1% de extrato de levedo foram adicionados em um frasco Erlenmeyer de 500-ml, e uma tampa de silicone foi inserida no mesmo, seguido por esterilização em um autoclave. A solução de pré-cultura de NBRC 10182 mencionada acima foi adicionada no mesmo, e agitação de cultura foi realizada a 30°C/220 rpm por 7 dias. (2) Extração/purificação de MEL (Extração)
50 ml da solução obtida na cultura principal foram dispensados para dentro de um funil de separação, e extração foi realizada duas vezes com uma quantidade igual de acetato de etila. As camadas de acetato de etila foram combinadas, e o solvente foi destilado. Depois, o resíduo foi dissolvido em 25 ml de metanol e lavado duas vezes com 50 ml de hexano, e metanol foi destilado, para deste modo dar um produto purificado bruto de MEL (pureza 69%, determinada pela reação de antrona descrita abaixo). (Purificação)
1 g do produto purificado bruto mencionado acima foi dissolvido em uma quantidade pequena de clorofórmio, e fracionamento foi realizado usando uma coluna de gel de sílica. 500 ml de clorofórmio, 500 ml de clorofórmio / acetato de etila = 4/1, 500 ml de acetona, e 500 ml de metanol foram seqüencialmente passados através da coluna para realizar o fracionamento.
As frações resultantes foram reveladas por cromatografia em camada fina (solvente de revelação CHCl3/MeOH/água = 65/15/2), e frações tendo os valores de Rf do MEL respectivo descritos no seguinte documento 1) (Rf = 0,52, 0,58, 0,63, 0,77) foram selecionadas e combinadas, para deste modo dar uma amostra padrão. 1) Agric. Biol. Chem., 54(1) 31-36, 1990 (Determinação de pureza: reação de antrona)
O produto purificado bruto diluído para uma concentração apropriada com acetato de etila foi adicionado em um tubo de ensaio, e o solvente foi destilado. No tubo de ensaio foram adicionados 5 ml de um reagente de antrona (0,2% de antrona em ácido sulfurico 75%), e a mistura foi permitida reagir em água fervente por 10 minutos, seguido pela medição de uma absorbância a 620 nm. A pureza do produto purificado bruto foi calculada por comparação da absorbância com aquela da amostra padrão. <2> Produção de ramnolipídeos
(1) Cultura de bactéria Pseudomonas (Pré-cultura)
ml de meio de peptona foram adicionados em um tubo de ensaio, e uma tampa de silicone foi inserida no mesmo. O tubo foi esterilizado em um autoclave, e Pseudomonas aeruginosa NBRC 3924 foi inoculada, seguido por agitação de cultura a 30°C por 24 horas. (Cultura principal)
50 ml de um meio contendo água íon-trocada m, 0,2% de CaCO3, 0,05% de K2HPO4, 0,05% de MgS04-7H20, 0,5% de extrato de levedo, e 0,5% de farinha de soja foram adicionados em um frasco Erlenmeyer de 500-ml, e uma tampa de silicone foi inserida no mesmo, seguido por esterilização em um autoclave. No frasco foram adicionados 1 ml de etanol esterilizado por filtração e a solução de pré-cultura de NBRC 3924 mencionada acima, e 0,75 ml de etanol esterilizado por filtração foi adicionado a cada dois dias, seguido por agitação da cultura a 28°C/220 rpm por 8 dias.
(2) Extração/purificação de ramnolipídeos (Extração)
50 ml da solução de cultura obtidos da cultura principal foram dispensados para dentro de um funil de separação, e extração foi realizada duas vezes com metanol/clorofórmio = 1/1. Camadas orgânicas foram combinadas, e o solvente foi destilado, para deste modo dar um produto purificado bruto de ramnolipídeos (pureza de 55%, determinada pela reação de antrona descrita abaixo). (Purificação)
450 ml da solução de cultura obtidos da cultura principal mencionada acima foram ajustados para pH 3, e as células bacterianas foram removidas por centrifugação. O sobrenadante foi passado através de uma coluna cheia com TSK gel DEAE-TOYOPEARL 650 M e previamente tratada com tampão Tris-HCl 0,5 M (pH 9,0), e a coluna foi lavada com tampão Tris-HCl 0,5 M (pH 9,0). Então, tampão Tris-HCl 0,5 M (pH 9,0) com NaCl com concentração de 0 a 0,4 M foi passado através da coluna em uma maneira em gradiente a 2,3 ml/min para eluir e fracionar ramnolipídeos capturados no gel.
As frações respectivas foram reveladas por cromatografia em camada fina (solvente de revelação CHCl3/MeOH/água = 65/25/4), e frações tendo valores de Rf de ramnolipídeos (Rf = 0,32, 0,52) descritos no seguinte documento 2) foram selecionados, seguido por extração com metanol/clorofórmio = 1/1. As frações foram combinadas, e o solvente foi destilado, para deste modo dar uma amostra padrão. 2) Biotechnology Letters, 54(12) 1213-1215, 1997 (Determinação de pureza: reação de antrona)
O produto purificado bruto diluído para uma concentração apropriada com metanol foi adicionado em um tubo de ensaio, e o solvente foi destilado. No tubo de ensaio foram adicionados 5 ml de um reagente de antrona (0,2% de antrona em ácido sulfurico 75%), e a mistura foi permitida reagir em água fervente por 10 minutos, seguido pela medição de uma absorbância a 620 nm. A pureza do produto purificado bruto foi calculada por comparação da absorbância com aquela da amostra padrão. <3> Avaliação de atividades antibióticas
Concentrações inibitórias mínimas (MICs) de cada uma das bactérias mostradas em Tabela 1 foram medidas para os MEL e ramnolipídeos pelos seguintes procedimentos.
As bactérias mencionadas acima foram pré-cultivadas em um meio de bouillon para determinação de sensibilidade (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.). As concentrações de bactérias nas soluções de pré-cultura foram ajustadas para cerca de 1,0 χ IO5 a IO6 CFU/ml com solução salina fisiológica, e as bactérias foram inoculadas para dentro do meio de medição. Como o meio de medição, um meio para medição de sensibilidade (NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) foi usado para Staphylococcus aureus, Staphyloeoceus epidermidis, e Baeillus subtilis, e um meio de ágar-sangue a (meio de infusão cardíaca: NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD., sangue desfibrinado estéril de ovelha: Kohjin Bio Co. Ltd.) foi usado para Streptoeoceus suis e Streptoeoeeus bovis. Cultura foi realizada a 37°C por cerca de 20 horas sob condições aeróbicas para Staphyloeoceus aureus, Staphyloeoceus epidermidis, e Bacillus subtilis ou sob condições de 5% de CO2 para Streptoeoeeus suis e Streptoeoeeus bovis. Após completitude da cultura, as MICs foram medidas.
O produto purificado bruto de MEL obtido em seção <1> (pureza de 69%) foi usado como MEL, e o produto purificado bruto de ramnolipídeo obtido em seção <2> (pureza de 55%) foi usado como ramnolipídeos. Entrementes, para propósito de comparação, MICs de éster de sacarose (manodecanoato de sacarose: manufaturado por SIGMA-ALDRICH Japan K.K.), manose (manufaturada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), e ramnose (manufaturada por SIGMA-ALDRICH Japan K.K.) foram medidas.
Os resultados são mostrados em Tabela 1. Tabela 1
Bactéria MEL Ramnolipídeos Ester de sacarose Manose Ramnose Staphylococcus aureus 50 12,5 >1600 >1600 >1600 Staphyloeoecus epidermidis 25 12,5 >1600 >1600 >1600 Streptoeoecus suis 50 50 800 >1600 >1600 Streptoeoecus bovis 50 12,5 800 >1600 >1600 Bacillus subtilis 12,5 6,25 400 >1600 >1600
Foi verificado que os MEL e ramnolipídeos têm atividades antibióticas para as bactérias Staphylococcus, Streptoeoecus, e Bacillus várias vezes ou dúzia de vezes mais altas do que a atividade antibiótica de manodecanoato de sacarose que é um glicolipídeo. Por outro lado, foi verificado que manose e ramnose que são componentes de um glicolipídeo não têm atividades antibióticas.
Portanto, se aves ou mamíferos são alimentados com MEL e/ou ramnolipídeos, doenças causadas pelas bactérias mencionadas acima serão evitadas ou tratadas.
[II] Avaliação de quantidades de geração de gás e de ácido graxo volátil. <1> Produção de lipídeos de manosil-eritritol (MEL) (1) Cultura de levedura Pseudozyma (Pré-cultura)
10 ml de meio de dextrose de batata foram adicionados em um
tubo de ensaio, e uma tampa de silicone foi inserida no mesmo. O tubo foi esterilizado em um autoclave, e Pseudozyma aphidis NBRC 10182 foi inoculada, seguido por agitação da cultura a 30°C por 24 horas. (Cultura principal)
50 ml de um meio contendo água íon-trocada, 8% de óleo de
feijão-soja, 0,2% de NaNO3, 0,02% de KH2PO4, 0,02% de MgS04-7H20, e 0,1% de extrato de levedo foram adicionados em um frasco Erlenmeyer de 500-ml, e uma tampa de silicone foi inserida no mesmo, seguido por esterilização em um autoclave. A solução de pré-cultura de NBRC 10182 mencionada acima foi adicionada no mesmo, e agitação da cultura foi realizada a 30°C/220 rpm por 10 dias. (2) Purificação de MEL (Purificação)
50 ml da solução de cultura mencionada acima foram ajustados para pH 3 com HCl 1 N, e o sobrenadante foi removido por centrifugação. 50 ml de água pura foram adicionados nos precipitados, e centrifugação foi realizada de novo para recuperar os precipitados. Os precipitados foram dissolvidos em 10 ml de MeOH, e 10 ml de hexano foram depois adicionados para lavar os precipitados (três vezes). Então, 10 ml de água foram adicionados na solução de MeOH após lavagem, e MEL foram extraídos com 10 ml de clorofórmio da solução (três vezes). As camadas de clorofórmio foram combinadas, e o solvente foi destilado, para deste modo dar um produto purificado bruto. Foi verificado que a pureza foi 90% pela reação com antrona. (Amostra padrão)
1 g do produto bruto acima mencionado foi dissolvido em uma quantidade pequena de clorofórmio, e fracionamento foi realizado usando uma coluna de gel de sílica. 500 ml de clorofórmio, 500 ml de clorofórmio / acetato de etila = 4/1, 500 ml de acetona, e 500 ml de metanol foram seqüencialmente passados através da coluna para realizar o fracionamento.
As frações respectivas foram reveladas por cromatografia em camada fina (solvente de revelação CHCl3/MeOH/água = 65/25/4), e frações tendo valores de Rf descritos em Agric. Biol. Chem., 54(1), 31-36, 1990) (valores de Rf de MEL respectivo, Rf = 0,52, 0,58, 0,63, 0,77) foram selecionadas e combinadas, para deste modo dar uma amostra padrão. (Determinação de pureza: reação de antrona)
Produto parcialmente diluído para uma concentração apropriada com acetato de etila foi adicionado em um tubo de ensaio, e o solvente foi destilado. No tubo de ensaio foram adicionados 5 ml de um reagente de antrona (0,2% de antrona em ácido sulfurico 75%), e a mistura foi permitida reagir em água fervente por 10 minutos, seguido pela medição de uma absorbância a 620 nm. A pureza do produto purificado bruto foi calculada por comparação da absorbância com aquela da amostra padrão. <2> Ramnolipídeos (RL)
Biotensoativo BFL (ramnolipídeos) manufaturado por Bio Future Ltd. foi seco e usado.
<3> Efeito de ramnolipídeos (RL) e de lipídeos de manosil-eritritol (MEL) sobre geração de gás e geração de ácido graxo volátil em rume
(1) Amostra
Os ramnolipídeos (RL) e lipídeos de manosil-eritritol (MEL) acima mencionados foram usados para um teste. Como um inóculo de cultura, foi usado um fluido de rume (filtrado através de quatro camadas de gaze) colhido de uma vaca Holstein (equipada com uma cânula de rume) de Experiment Farm, Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University. O inóculo foi diluído 2 vezes com saliva artificial de McDougal (pH 6,8) e foi usado.
(2) Cultura
Cultura foi realizada em soluções de cultura de teste com teor de RL de 500 μg/ml e com teor de MEL de 500 μg/ml. 0,05 g de cada um de RL e MEL foi dissolvido em 1 ml de etanol, e 100 μΐ de cada solução foram adicionados em um tubo de Hungate. As soluções foram permitidas repousarem por várias horas para volatilizar etanol. Nos tubos foram adicionados 0,15 g de amido de milho, 0,025 g de ração em pó misturado, e 0,025 g de pó seco de gramínea Orchard como substratos de cultura. O fluido de rume diluído acima mencionado foi adicionado em uma quantidade de 10 ml, e tampas de borracha butílica e tampas plásticas rosqueadas foram inseridas nos tubos enquanto gás nitrogênio era fornecido aos espaços confinantes dos mesmos, seguido por cultura anaeróbica em um banho de água(37°C, 18 horas). Nenhum reagente (apenas etanol: grupo de controle), RL (grupo L), ou MEL (grupo MEL ) foi adicionado em cada uma das soluções de cultura, e a cultura foi realizada quatro vezes.
(3) Análise
Metano, hidrogênio, e dióxido de carbono foram analisados por cromatografia gasosa com TCD. As composições e concentrações de ácidos graxos voláteis (VFA) totais foram medidas por cromatografia gasosa com FID.
(4) Resultados
(i) Geração de gás
Foi verificado que as quantidades de gás total por 18 horas após início da cultura diminuíram em ambos os casos do grupo RL e do grupo MEL (diminuíram em 51% e 48%, respectivamente). Em particular, diminuições em quantidades de metano foram significativamente altas, e as quantidades de metano do grupo RL e do grupo MEL foram diminuídas em 96% e 99%, respectivamente, o que revelou que quase toda a geração de metano desapareceu. Foi verificado que as quantidades de dióxido de carbono do grupo RL diminuíram em 37% e 35%, respectivamente. Foi verificado que as taxas de metano para o gás total do grupo RL e do grupo MEL diminuíram em 2,1% e 0,3%, respectivamente, comparado com o grupo de controle (23,7%). Os resultados são mostrados em Tabela 2 e Fig. 1.
Tabela 2
Itens de análise Teste Cont. RL500 MEL500 Quantidade de geração de gás (ml) Total 5,86 ±1,51 a 2,86+0,22 b 3,04±0,39 b CH4 1,39 ±0,58 a 0,06±0,02 b 0,01 ±0,00 C CO2 4,46 ±0,93 a 2,79 ±0,22 b 2,92±0,37 b H2 0,01 ±0,00 a 0,01 ±0,00 a 0,12+0,02 b Taxa relativa de gás (%) CH4 23,7 ±5,9 a 2,1 ±0,5 b 0,3±0,1 C CO2 76,1 ±5,9 a 97,6±0,5 C 96,0±0,3 b H2 0,16 ±0,03 a 0,28±0,01 b 3,77±0,27 C
a, b, c: Há diferenças significativas entre símbolos diferentes. Há uma diferença significativa entre b e c similar àquela entre a e b. Itálico: Há uma diferença significativa comparada com controle. 10
15
(ii) Geração de ácido graxo volátil (VFA)
As concentrações de VFA totais não foram afetadas pelos tratamentos, mas o padrão de produção de VFA para cada caso foi drasticamente alterado. Isto é, foi verificado que as concentrações de ácido acético, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, e ácido isovalérico foi significativamente diminuída pela adição de RL e MEL. Por outro lado, foi verificado que a concentração de ácido propiônico significativamente aumentou (aumentada em 85% (grupo RL) e em 53% (grupo MEL)). Foi verificado que as taxas molares dos ácidos respectivos aumentaram no caso de ácido propiônico (de 25,8% para 46,7% e 41,1%) ou diminuíram nos casos de ácido acético e ácido butírico (de 60,9% a 49,7% e 53,.4%, e de 10,6% a 2,0% e 5,0%, respectivamente), em todas as diferenças foram significativas. Em particular, a taxa de ácido propiônico aumentou para um nível mais alto do que aquele no rume geral. Os resultados são mostrados em Tabela 3 e Fig. 2. Tabela 3
Itens de análise Cont. RL500 MEL500 Concentração de VFA (mM/dl) Total 7,37±0,65 3,06±0,34 7,61 ±0,68 Acido acético 4,79±0,36 a 4,00 ±0,12 b 4,05 ±0,20 b Acido propiônico 2,04±0,23 a 3,77 ±0,24 b 3,13 ±0,38 b Acido isobutírico 0,09±0,01 a 0,11±0,12 a 0 b Aeido butírico 0,83±0,05 a 0,27 ±0,01 c 0,38 ±0,06 b Acido isovalérico 0,12±0,02 a 0,01 ±0,03 b 0,04 ±0,04 b Acido valérico 0 0 0 Taxa molar de VFA (%) Acido acético 60,9±0,8 a 49,7 ±0,7 b 53,4 ±2,2 b Acido propiônico 25,8±1,7 a 46,7 ±1,2 C 41,1 ±1,4 b Acido butírico 10,6 ±0,8 a 2,0 ±1,8 C 5,0 ±0,4 b
a, b, c: Há diferenças significativas entre símbolos diferentes. Há uma diferença significativa entre b e c similar àquela entre a e b. Itálico: Há uma diferença significativa comparada com controle.
[Aplicabilidade Industrial]
Se o aditivo de ração da presente invenção é misturado na ração e dado a aves ou mamíferos, doenças podem ser evitadas ou tratadas. Especificamente, a ração da presente invenção pode prevenir ou tratar uma doença infecciosa causada por uma bactéria Gram-positiva. A ração contendo o aditivo de ração da presente invenção pode ser adequadamente usada para criar animais de criação tais como galinhas, porcos, e vacas. Em adição, o aditivo de ração da presente invenção tem biodegradabilidade alta e é muito seguro para seres vivos e ambiente.
Entrementes, se o aditivo de ração da presente invenção é misturado na ração e dado a animais ruminantes, é possível suprimir a geração de metano e promover a geração de ácido propiônico, resultando em promoção de crescimento dos animais ruminantes e melhoria da eficiência de ração. A ração contendo o aditivo de ração da presente invenção pode ser adequadamente usada para criar animais ruminantes tais como vaca, cabra, e ovelha. Em adição, o aditivo de ração da presente invenção tem biodegradabilidade alta e é muito seguro para seres vivos e ambiente.
Claims (12)
1. Aditivo de ração para aves e mamíferos, caracterizado pelo fato de compreender lipídeos de manosil-eritritol e/ou ramnolipídeos.
2. Aditivo de ração de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para animais de criação.
3. Aditivo de ração de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o animal de criação é uma galinha, um porco, ou uma vaca.
4. Aditivo de ração de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para um animal ruminante.
5. Aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os lipídeos de manosil- eritritol são obtidos de levedura pertencendo ao gênero Pseudozyma.
6. Aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os ramnolipídeos são obtidos de uma bactéria pertencendo ao gênero Pseudomonas.
7. Aditivo de ração de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a prevenção ou o tratamento de uma doença.
8. Aditivo de ração de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença infecciosa causada por uma bactéria Gram-positiva.
9. Aditivo de ração de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a bactéria Gram-positiva é uma bactéria pertencendo ao gênero Staphylococcus ou Streptococcus.
10. Aditivo de ração de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a bactéria Gram-positiva é Staphyloeoecus aureus, Staphyloeoecus epidermidis, Streptoeoeeus suis, ou Streptococcus bovis.
11. Ração, caracterizada pelo fato de compreender o aditivo de ração como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
12. Método para criar aves ou mamíferos, caracterizado pelo fato de que compreender dar a ração como definida na reivindicação 11 a aves ou mamíferos.
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