BRPI0717977A2

BRPI0717977A2 - Alelos do gene rel de bactérias corineformes

Info

Publication number: BRPI0717977A2
Application number: BRPI0717977-4A
Authority: BR
Inventors: Brigitte Bathe; Caroline Kreutzer; Georg Thierbach
Original assignee: Evonik Degussa Gmbh
Priority date: 2006-10-17
Filing date: 2007-10-15
Publication date: 2013-11-12
Also published as: KR101337165B1; BRPI0717977B1; EP2061881A2; KR20090078354A; US8293514B2; US20100311147A1; WO2008046810A3; EP2061881B1; US7754446B2; DE102006048882A1; WO2008046810A2; US20090053794A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ALELOS DO GENE REL DE BACTÉRIAS CORINEFORMES".

O objeto da invenção são mutantes e alelos do gene rei de bac- térias corineformes que codificam variantes da pirofosfatocinase GTP (EC n° 2.7.6.5) e processos para a produção de aminoácidos, especialmente L- lisina, L-triptofano, L-prolina, L-valina, L-isoleucina e L-homosserina com o emprego de bactérias, que contêm esses alelos. Estado da técnica

Aminoácidos encontram aplicação na medicina humana, na in- dústria farmacêutica, na indústria alimentícia e de modo muito particular, na nutrição animal.

Sabe-se, que aminoácidos são produzidos através da fermenta- ção de cepas de bactérias corineformes, especialmente Corynebacterium glutamicum. Devido ao grande interesse, trabalha-se continuamente no a- perfeiçoamento dos processos de produção. Os aperfeiçoamentos dos pro- cessos podem referir-se às medidas técnicas de fermentação, tais como, por exemplo, mistura e abastecimento com oxigênio ou a composição dos meios nutrientes, tais como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fer- mentação ou o processamento para a forma do produto, por exemplo, atra- vés de cromatografia de troca de íons ou as propriedades de potência do próprio microrganismo.

Para melhorar as propriedades de potência desses microrga- nismos, são aplicados métodos da metagênese, seleção e seleção de mu- tantes. Dessa maneira, obtêm-se cepas, que são resistentes contra antime- tabólitos ou são autótrofos para metabólitos regulatoriamente importantes e que produzem aminoácidos. Um antimetabólito conhecido é o análogo da Iisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC).

Há alguns anos, também são utilizados métodos da técnica de DNA recombinante para o melhoramento da cepa de cepas de Corynebacte- rium produtoras de L-aminoácido, amplificando alguns genes da biossíntese do aminoácido e pesquisando o efeito sobre a produção do aminoácido.

O cromossoma de Corynebacterium glutamicum foi completa- mente sequenciado há algum tempo (Kalinowski e colaboradores, Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)). O cromossoma de Corynebacterium effici- ens também já foi sequenciado (Nishio e colaboradores, Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).

Especificações correspondentes de seqüências podem ser de- duzidas dos bancos de dados públicos. Bancos de dados adequados são, por exemplo, o banco de dados do European Molecular Biologies Laborato- ries (EMBL, Heidelberg, Alemanha ou Cambridge, Grã Bretanha), o banco de dados do National Centerfor Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EUA), o Swiss Institute of Bioinformatics (Swissport, Genebra, Suíça), a Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, EUA) e o DNA Data BankofJapan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japão).

Descrições resumidas para a genética, para o metabolismo e para o significado técnico de Corynebacterium são encontradas nos estudos de Ikeda, de Pfefferle e colaboradores e de Mueller e Huebner no livro "Mi- crobial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin, Alemanha editor: T. Scheper), na edição especial "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" do Journal of Biotechnology (volume 104 (1-3), 2003, editor: A. Pühler e T. Tau- ch) e no "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (editor: L. Eggeling e M. Bott1 CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, EUA, 2005).

A seqüência de nucleotídeo do gene rei que codifica a pirofosfa- tocinase GTP de Corynebacterium glutamicum está geralmente disponível, entre outros, no banco de dados o National Center for Biotechnology Infor- mation (NCBI) da National Library of Medicin (Bethesda, MD, EUA) sob o número de acesso AF038651. Além disso, ela pode ser deduzida do pedido de patente EP 1.108.790 como seqüência n° 1824.

Wehmeier e colaboradores (Microbiology 144, 1853-1862 (1998)) relata, entre outros, sobre pesquisas genéticas, microbiológicas e bioquímicas em um mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, que porta uma deleção no gene rei.

Para a melhor clareza, a seqüência de nucleotídeo do gene rei que codifica a pirofosfatocinase GTP do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum ("gene do tipo selvagem") de acordo com as especificações do banco de dados NCBI está representada na SEQ ID n°: 1 e a seqüência de aminoácidos da pirofosfatocinase GTP codificada dai resultante está repre- sentada na SEQ ID n° 2 ou 4. Na SEQ ID n° 3 indicam-se adicionalmente seqüências de nucleotídeos posicionadas a montante (upstream) e a jusante (downstream). A seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n° 2 ou 4 contém glicina na posição 262. A seqüência de aminoácidos do tipo selvagem pirofosfatocinase GTP publicada na EP 1.108.790 contém ácido L- glutâmico na posição 262. A seqüência de nucleotídeo do gene rei do tipo selvagem de acordo com a EP 1.108.790 está representada na SEQ ID n°:

21. A seqüência de aminoácidos codificada está representada na SEQ ID n°: 22.

Objetivo da Invenção

Os inventores (haben sich zur Aufgabe gestellt) para disponi- bilizar novas medidas para a produção melhorada de aminoácidos, especi- almente L-lisina, L-triptofano, L-prolina, L-valina, L-isoleucina e L- homosserina. Descrição da Invenção

O objeto da invenção são mutantes produzidos ou isolados de bactérias corineformes, que separam preferivelmente aminoácidos e os quais contêm um gene ou alelo, que codifica um polipeptídeo com atividade de pirofosfatocinase GTP, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos na qual, na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L- prolina. Prefere-se trocar L-prolina por L-leucina.

Nas bactérias corineformes, prefere-se o gênero Corynebacteri- um. No gênero Corynebacterium preferem-se as seguintes espécies: Corynebacterium efficiens (cepa do tipo DSM44549), Corynebacterium glutamicum (cepa do tipo ATCC13032), Corynebacterium thermoaminogenes (por exemplo, a cepa FERM BP-1539) e

Corynebacterium ammoniagenes (cepa do tipo ATCC6871), sendo que a espécie Corynebacterium glutamicum é preferida de modo mui- to particularmente preferido.

Alguns representantes da espécie Corynebacterium glutamicum

são conhecidos no estado da técnica também sob outras designações de espécie. Nesses incluem-se, por exemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium Iilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965,

Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium Iactofermentum ATCC13869, Brevibacterium divaricatum ATCC14020 e Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354. Do mesmo modo, o termo "Micrococcus glutamicus" é usado

para Corynebacterium glutamicum.

As cepas de bactérias corineformes utilizadas para as medidas da invenção, já possuem preferivelmente a capacidade de enriquecer o ami- noácido desejado na célula ou separá-lo no meio nutriente que o envolve e acumulá-lo. Para isso, utiliza-se a seguir também a expressão "produzir". As cepas de bactérias corineformes possuem especialmente a capacidade, de enriquecer ou acumular > (pelo menos) 0,25 g/l, > 0,5 g/l, > 1,0 g/l, >1,5 g/l, > 2,0 g/l, > 4 g/l ou > 10 g/l do aminoácido desejado em < (no máximo), 120 horas, < 96 horas, < 48 horas, < 36 horas, < 24 horas ou < 12 horas na célu- Ia ou no meio nutriente. Nesse caso, pode tratar-se de cepas, que foram produzidas através de mutagênese e seleção, através de técnicas de DNA recombinantes ou através de uma combinação dos dois métodos.

Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-Iisina são, por exemplo: Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) des-

crito na EP 0.358.940,

Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrito em Menkel e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 55 (3), 684-688 (1989)),

Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) descrito na EP 1.108.790,

Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 descrito na US

4.275.157 e

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP- 3304) descrito na US 5.250.423.

Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-triptofano são, por exemplo:

Corynebacterium glutamicum K76 (= Ferm BP-1847) descrito na US 5.563.052,

Corynebacterium glutamicum BPS13 (= Ferm BP-1777) descrito na US 5.605.818 e

Corynebaeterium glutamicum Ferm BP-3055 descrito na US

5.235.940.

Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-prolina são, por exemplo:

Brevibacterium Iactofermentum NRRL B-11421 descrito na US

4.224.409,

Brevibacterium flavum NRRL B-11422 descrito na US 4.224.409, Brevibacterium flavum FERM BP-2214 descrito na US

5.294.547,

Corynebacterium glutamicum NRRL B-11423 descrito na US

4.224.409,

Corynebacterium glutamicum ATCC 21157 descrito na US

4.444.885,

Corynebacterium glutamicum ATCC 21158 descrito na US

4.444.885,

Corynebacterium glutamicum ATCC 21159 descrito na US

4.444.885,

Corynebacterium glutamicum ATCC 21355 descrito na US 4.444.885 e Microbacterium ammoniaphilum NRRL B-11424 descrito na US

4.224.409.

Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-valina são, por exemplo:

Brevibacterium Iactofermentum FERM BP-1763 descrito na US

5.188.948,

Brevibacterium Iactofermentum FERM BP-3007 descrito na US

5.521.074,

Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 descrito na US

5.521.074 e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 descrito na US

5.188.948.

Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-isoleucina são, por exemplo:

Brevibacterium flavum FERM BP-760 descrito na US 4.656.135, Brevibacterium flavum FERM BP-2215 descrito na US 5.294.547

e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-758 descrito na US

4.656.135.

Representantes conhecidos de cepas de bactérias corineformes produtoras ou separadoras de L-homosserina são, por exemplo:

Micrococcus glutamicum ATCC 14296 descrito na US 3.189.526

e

Micrococcus glutamicum ATCC 14297 descrito na US 3.189.526. Especificações para a classificação taxonômica de cepas desse grupo de bactérias são encontradas, entre outros, em Seiler (Journal of Ge- neral Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bactéria, página 115-142. Em: Demain and Solomon (ed), Biology of Indus- trial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., Londres, Grã Bretanha), Kámpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl e colaboradores (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) e na US-A-5.250.434. Cepas com a designação "ATCC" dizem respeito à American Type Culture Collection (Manassas, VA1 EUA). Cepas com a designação "DSM" podem ser referidas pela Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha). Cepas com a designa- ção "NRRL" podem ser referidas pela Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, EUA). Cepas com a designação "FERM" podem ser referidas pelo National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japão).

Um gene é quimicamente um polinucleotídeo. Um outro termo deste é ácido nucléico. No estado da técnica, também são usadas outras designações, tais como "GTP difosfocinase", "guanosina 3',5'-polifosfato sin- tase" ou "stringent factor" para o polipeptídeo codificado pelo gene rei com atividade de pirofosfatocinase GTP (vide, por exemplo, o banco de dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) do Kanehisa Labora- tory, Bioinformatics Center, Institute for Chemical Research, Kyoto Univer- sity, Japão).

De acordo com a nomenclatura da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), este tem o número EC 2.7.6.5.

Este catalisa a reação:

ATP + GTP AMP + guanosina-3'-difosfato-5'-trifosfato, sendo que ao invés de GTP, o GDP também é usado como substrato.

Por aminoácidos proteinogênicos entendem-se geralmente os aminoácidos, que existem em proteínas naturais, isto é, em proteínas de microrganismos, plantas, animais e no homem. Por aminoácidos proteinogê- nicos no contexto com a presente invenção, contudo, entende-se o grupo dos L-aminoácidos, consistindo em ácido L-asparagínico, L-asparagina, L- treonina, L-serina, ácido L-glutâmico, L-glutamina, glicina, L-alanina, L- cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L- fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L-prolina e L-arginina. Nos L- aminoácidos inclui-se igualmente a L-homosserina. Os mutantes de acordo com a invenção, separam preferivelmen- te os aminoácidos proteinogênicos mencionados, especialmente L-lisina, L- triptofano, L-prolina, L-valina, L-isoleucina ou L-homosserina. O termo ami- noácidos compreende também seus sais, tais como, por exemplo, o mono- cloridrato de Iisina ou sulfato de Iisina no caso do aminoácido L-lisina.

Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias co- rineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com ativi- dade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID n°: 2, sendo que na posição 38 está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina. A troca de L-prolina por L-Ieucina é preferida.

Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias co- rineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com ativi- dade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição correspondente à posição 38 da seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°:2, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, preferivelmente, contudo, L-leucina, sendo que o gene compreende uma seqüência de nucle- otídeos, que é idêntica à seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, que é obtenível através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com o emprego de um par de primers, cujas seqüências de nucleotídeos com- preendem em cada caso pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, que são selecionados da seqüência de nucleotídeos entre a posição 1 e 750 da SEQ ID n°: 3 ou da SEQ ID n°: 7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre a posição 3800 e 3031 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7. Um exemplo de um par de primers adequado é mostrado na SEQ ID n°: 19 e SEQ ID n°: 20. Como material de partida (DNA "modelo"), prefere-se DNA cromossomal de bactérias corineformes, que foram especialmente tratadas com um muta- gene. Particularmente, prefere-se o DNA cromossomal do gênero Coryne- bacterium e de modo particularmente preferido, o da espécie Corynebacteri- um glutamicum.

Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias co- rineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com ativi- dade enzimática de pirofosfatocinase GTP1 que compreende uma seqüência de aminoácidos com um comprimento correspondente a 760 L-aminoácidos, sendo que um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, preferivelmente L-Ieucina, está contido na posição 38.

Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias co- rineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com ativi- dade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 19 a 57 da se- qüência de aminoácidos contém a seqüência de aminoácidos corresponden- te à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 6 ou 8. Preferivelmente, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado contém uma seqüência de aminoá- cidos correspondente à posição 9 a 107 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 9 a 207 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 9 a 407 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posi- ção 9 a 607 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 9 a 707 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 707 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 9 a 757 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 757 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 758 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 759 SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição, sendo que e- ventualmente o ácido L-glutâmico está contido na posição 262. De modo muito particularmente preferido, o comprimento do polipeptídeo codificado compreende 760 aminoácidos.

Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias co- rineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com ativi- dade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou na posição correspondente da seqüência de aminoácidos contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, dando-se preferência à troca por L-Ieucina e cuja seqüência de aminoácidos, além disso, é em pelo menos 90 %, preferivelmente em pelo menos 92 % e de modo muito particularmente preferido, pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particu- larmente preferido, em pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo me- nos 99 %, idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 6 ou SEQ ID n°: 8. Eventualmente, o ácido L-glutâmico está contido na posição 262 da SEQ ID n°: 6 ou SEQ ID n°: 8.

Além disso, o objeto da invenção são mutantes de bactérias co- rineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptideo com ativi- dade enzimática de pirofosfatocinase GTP1 que na posição 38 ou na posição correspondente da seqüência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, dando-se preferência à troca por L-Ieucina e cuja seqüência de nucleotídeos, além disso, é em pelo menos 90 %, preferivelmente em pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido, em pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, idêntica à seqüência de nucleotídeos da SEQ ID n°: 5. Eventualmente, a adenina está contida na posição 785.

Sabe-se, que trocas de aminoácidos conservativos modificam apenas insensivelmente a atividade enzimática. Em relação a isso, o alelo rei contido nos mutantes de acordo com a invenção, que codifica um poli- peptideo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, pode conter adicionalmente à seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n°: 6 ou SEQ ID n°: 8, uma (1) ou várias troca(s) de aminoácidos conservativo(s). Preferivelmente, o polipeptideo contém duas (2), no máximo, três (3), no máximo quatro (4) ou no máximo cinco (5) trocas de aminoácidos conserva- tivos. Eventualmente, o ácido L-glutâmico está contido na posição 262 da SEQ ID n°: 6 ou SEQ ID n°: 8.

No caso dos aminoácidos aromáticos fala-se de trocas conser- vativos, quando a fenilalanina, triptofano e tirosina são mutuamente troca- dos. No caso dos aminoácidos hidrófobos fala-se de trocas conservativas, quando a leucina, isoleucina e valina são mutuamente trocadas. No caso dos aminoácidos polares fala-se de trocas conservativas, quando a glutami- na e a asparagina são mutuamente trocadas. No caso dos aminoácidos bá- sicos fala-se de trocas conservativas, quando a arginina, Iisina e histidina são mutuamente trocados. No caso dos aminoácidos ácidos fala-se de tro- cas conservativas, quando o ácido asparagínico e o ácido glutâmico são mu- tuamente trocados. No caso dos aminoácidos contendo grupos hidroxila fala- se de trocas conservativas, quando a serina e treonina são mutuamente tro- cadas.

Com o trabalho na presente invenção, verificou-se pela compa- ração da seqüência de aminoácidos com o programa Clustal (Thompson e colaboradores, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)), que as se- qüências de aminoácidos da pirofosfatocinase GTP de várias bactérias, tais como, por exemplo, Escheriehia coli, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuber- culosis, Mycobacterium bovis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces aver- mitilis, Corynebacterium efficiens e Corynebacterium glutamicum contêm um motivo de seqüência consistindo na sucessão Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-lle- Thr/lle-His-Pro-Leu-Ala-Val, um motivo de seqüência consistindo na suces- são Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr e também um motivo de seqüência consistindo na sucessão Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val- His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg. As designações "Asp/GIu", "Thr/lle" e "Ala/Gly" significam, que "Asp ou Glu" ou 'Thr ou lie" ou "Ala ou Gly" estão contidos na posição correspondente.

Em relação a isso, preferem-se aqueles mutantes de bactérias corineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, o qual compreende pelo me- nos uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo Ser-Gly-Asp/GIu- Pro-Tyr-lle-Thr/lle-His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr- Val-Glu-Asp-ThreThr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-VaI-His-Thr-GIu-VaI-GIy-

His-Arg e na posição 38 ou na posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção de L-prolina, preferivelmente L-leucina.

O motivo da seqüência de aminoácidos Ser-Gly-Asp/Glu-Pro- Tyr-IIe-Thr/lIe-His-Pro-Leu-Ala-Val está contido, por exemplo, na SEQ ID n°: 2 ou 4 ou 6 ou 8 da posição 73 a 84. O motivo da seqüência de aminoácidos Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr está contido, por exemplo, na SEQ ID n°: 2 ou 4 ou 6 ou 8 da posição 100 a 110. O motivo da seqüên- cia de aminoácidos Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val- Gly-His-Arg está contido, por exemplo, na SEQ ID n°: 2 ou 4 ou 6 ou 8 da posição 437 a 452.

Finalmente, o objeto da invenção são mutantes de bactérias co- rineformes, que contêm um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com ativi- dade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 6 ou SEQ ID n°: 8, sendo que o ácido L- glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

Sabe-se, que através de enzimas de ação própria, as chamadas aminopeptidases, a metionina em posição terminal pode ser removida na síntese da proteína.

Pelo termo "de uma posição correspondente à posição 38 da seqüência de aminoácidos" ou "de uma posição comparável à posição 38 da seqüência de aminoácidos", entende-se o fato, de que através de inserção ou deleção de um códon que codifica um aminoácido na região N-terminal (em relação à posição 38 da SEQ ID n°: 6 ou 8) do polipeptídeo codificado, a especificação da posição e especificação do comprimento no caso de uma inserção é formalmente aumentada em uma unidade ou, no caso de uma deleção, reduzida em uma unidade. Por exemplo, através da deleção do có- don GAG que codifica o aminoácido ácido L-glutâmico na posição 4 da SEQ ID n°: 6 ou 8, a L-Ieucina retroceda da posição 38 para a posição 37. A es- pecificação de comprimento seria, então: 759 aminoácidos. Da mesma ma- neira, através de inserção ou deleção de um códon que codifica um aminoá- cido na região C-terminal (em relação à posição 38) do polipeptídeo codifi- cado, a especificação de comprimento no caso de uma inserção é formal- mente aumentada em uma unidade ou, no caso de uma deleção, reduzida em uma unidade. Essas posições comparáveis podem ser facilmente identi- ficadas através da comparação das seqüências de aminoácidos na forma de um "alinhamento", por exemplo, com auxílio de um programa Clustal ou do programa MAFFT.

Através dessas inserções e deleções, a atividade enzimática não é essencialmente afetada. "Essencialmente não afetada" significa, que a atividade enzimática das variantes mencionadas distingue-se no máximo em %, no máximo em 7,5 %, no máximo em 5 %, no máximo em 2,5 % ou no máximo em 1 % da atividade do polipeptídeo com a seqüência de aminoáci- dos da SEQ ID n°: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmen- te contido na posição 262. Em conformidade com isso, o objeto da invenção são também alelos rei, que codificam variantes de polipeptídeos da SEQ ID n°: 6 ou 8, que contêm uma ou mais inserção (ções) ou deleção (ções), sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262. Preferivel- mente, o polipeptídeo contém no máximo 5, no máximo 4, no máximo 3 ou no máximo 2 inserções ou deleções de aminoácidos.

Os motivos de seqüências Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-lle-Thr/lle- His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr e Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg mencio- nados acima, não são preferivelmente rasgados por essas inser- ções/deleções.

Para produzir mutantes de acordo com a invenção, é possível utilizar processos clássicos de metagênese in-vivo com populações de célu- las de bactérias corineformes com o emprego de substâncias mutagênicas, tais como, por exemplo, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), etilme- tanossulfonato (EMS), 5-bromouracila ou luz ultravioleta. Métodos de meta- gênese são descritos, por exemplo, no Manual of Methods for General Bac- teriology (Gernard e colaboradores (Eds.), American Society for Microbio- logy, Washington, DC, EUA, 1981) ou por Tosaka e colaboradores (Agricul- tural and Biological Chemistry 42 (4), 745-752 (1978)) ou por Konieek e co- laboradores (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)). Mutagêneses típicas com o emprego de MNNG compreendem concentrações de 50 a 500 mg/l ou também concentrações mais elevadas de a no máximo 1 g/l, um período de incubação de 1 a 30 minutos com um pH de 5,5 a 7,5. Nessas condições, o número das células capazes de viver é reduzido em uma fração de cerca de 50 % a 90 % ou cerca de 50 % a 99 % ou cerca de 50 % a 99,9 % ou mais.

Mutantes ou células são retiradas e multiplicadas da população celular submetida à mutagênese. Preferivelmente, em um outro estágio sua capacidade é pesquisada para, em uma cultura às bateladas (batch) com o emprego de um meio nutriente adequado, separar aminoácidos, preferivel- mente L-lisina, L-triptofano, L-prolina, L-valina, L-isoleucina ou L- homosserina. Meios nutrientes adequados e condições de teste são descri- tos, entre outros, na US 6.221.636, na US 5.840.551, na US 5.770.409, na US 5.605.818, na US 5.275.940 e na US 4.224.409. Com os empregos de instalações de robôs adequadas, tais como, por exemplo, descritas por Zimmermann e colaboradores (VDI Berichte n° 1841, VDI-Verlag, Düssel- dorf, Alemanha 2004, 439-443) ou Zimmermann (Chemie Ingenenieur Tech- nik 77 (4), 426-428 (2005)), é possível pesquisar inúmeros mutantes em pouco tempo. Em geral, são pesquisados no máximo 3.000, no máximo 10.000, no máximo 30.000 ou também no máximo 60.000 mutantes, eventu- almente também mais. Dessa maneira, são identificados mutantes, que em comparação com a cepa mãe ou cepa de partida não submetida à mutagê- nese, separam crescentemente aminoácidos para o meio nutriente ou para o interior da célula. Nesses incluem-se, por exemplo, aqueles mutantes, cuja secreção de aminoácido está aumentada em pelo menos 0,5 %.

Em seguida, o DNA é preparado ou isolado a partir dos mutan- tes e com auxílio da reação em cadeia de polimerase com o emprego de pares de primers, que permitem a amplificação do gene rei ou do alelo rei de acordo com a invenção ou da mutação de acordo com a invenção, na posi- ção 38, o polinucleotídeo correspondente é sintetizado. O DNA é preferivel- mente isolado daqueles mutantes, que separam aminoácidos de maneira aumentada.

Para isso, pares de primers desejados podem ser selecionados da seqüência de nucleotídeos posicionada a montante e a jusante da muta- ção de acordo com a invenção e da seqüência de nucleotídeos complemen- tar a essa. Nesse caso, um primer de um par de primers compreende prefe- rivelmente pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 21 ou pelo menos 24 nucleotídeos consecutivos selecionado da seqüência de nu- cleotídeos entre a posição 1 e 861 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7. O se- gundo primer correspondente de um par de primers compreende pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 21 ou pelo menos 24 nucleo- tídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos complemen- tar da posição 3800 e 865 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7. Caso se deseje a amplificação da região de codificação, então o par de primers é preferível- mente selecionado da seqüência de nucleotídeos entre a posição 1 e 750 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre a posição 3800 e 3031 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7.

Caso se deseje a amplificação de uma parte da região de codifi- cação, tal como representado, por exemplo, na SEQ ID n°: 11 e 13, então o par de primers é preferivelrnente selecionado da seqüência de nucleotídeos entre a posição 751 e 804 ou entre a posição 1 e 804 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre a posição 3030 e 922 ou 3800 e 922 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7. Um par de pri- mers adequado é, por exemplo, o par de primers rel_XL_A1 e rel_XL_E1 representado na SEQ ID n°: 19 e SEQ ID n°: 20. O primer pode ser munido, além disso, com pontos de reconhecimento para enzimas de restrição, com um grupo biotina ou outros acessórios, tais como são descritos no estado da técnica. O comprimento total do primer importa geralmente, no máximo, e 30, 40, 50 ou 60 nucleotídeos.

Para a produção de polinucleotídeos através da amplificação de seqüências selecionadas, tal como do alelo rei de acordo com a invenção, a partir de DNA previamente introduzido, por exemplo, cromossomal ("modelo de DNA") através da amplificação por meio de PCR, utilizam-se geralmente polimerases de DNA termoestáveis. Exemplos de tais polimerases de DNA são a polimerase TAQ de Thermus aquaticus, que é vendida, entre outros, pela Qiagen (Hilden, Alemanha), a polimerase Vent de Thermococcus Iitora- Iis1 que é vendida, entre outros, pela New England Biolabs (Frankfurt, Ale- manha) ou a polimerase Pfu de Pyrococcus furiosus, que é vendida, entre outros, pela Stratagene (La Jolla, EUA). É dada preferência, às polimerases com atividade "proof-reading". Atividade "proof-reading" significa, que essas polimerases estão em condição, de reconhecer nucleotídeos incorporados de forma errada e corrigir o erro através de nova polimerização (Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Ale- manha (1998)). Exemplos de polimerases com atividade "proof-reading" são a polimerase Vent e a polimerase Pfu.

As condições na preparação da reação são ajustadas de acordo com especificações do produtor. As polimerases são fornecidas pelo produ- tor, em geral, junto com o tampão usual, o qual normalmente apresenta con- centrações de 10 - 100 mM de tris/HCI e 6 - 55 mM de KCI em pH 7,5 - 9,3. O cloreto de magnésio é acrescentado em uma concentração de 0,5 - 10 mM, caso não esteja contido no tampão fornecido pelo produtor. Além disso, acrescentam-se trifosfatos de desoxinucleosídeo à preparação da reação em uma concentração de 0,1 - 16,6 mM. Os primers são previamente introduzi- dos na preparação da reação com uma concentração final de 0,1 - 3 μΜ e os DNA modelos no ótimo caso com 102 a 105 cópias. Também podem ser usadas 106 a 107 cópias. A polimerase correspondente é acrescentada à preparação da reação em uma quantidade de 2-5 unidades. Uma prepara- ção de reação típica tem um volume de 20-100 μΙ.

Como outros aditivos, podem ser acrescentados à reação a al- bumina de soro bovino Tween-20, gelatina, glicerina, formamida ou DMSO (Dieffenbach e Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA 1995).

Um decurso de PCR típico consiste em três diferentes estágios de temperatura, que se repetem sucessivamente. Em primeiro lugar, a rea- ção é iniciada com um aumento de temperatura para 92°C - 98°C por 4 a 10 minutos, para desnaturar o DNA previamente introduzido. Depois, seguem- se repetidamente primeiro um estágio para a desnaturação do DNA previa- mente introduzido de 10 - 60 segundos a aproximadamente 92-98°C, depois um estágio para ligar o primer ao DNA previamente introduzido de 10-60 segundos a uma determinada temperatura, dependente dos primers ("tem- peratura annealing"), que conforme a experiência, encontra-se em 50°C a 60°C e que pode ser individualmente calculada para cada par de primers. O técnico encontra informações exatas para esse fim em Rychlik e colaborado- res (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412. Em seguida, segue-se um estágio de síntese para o prolongamento dos primers previamente introduzi- dos ("extensão"), na melhor atividade respectivamente indicada para a poli- merase, normalmente dependendo da polimerase, na faixa de 73°C a 67°C, preferivelmente 72°C a 68°C. A duração desse estágio de extensão depende da eficiência da polimerase e comprimento do produto de PCR a ser amplifi- cado. Em um PCR típico, esse estágio dura 0,5 - 8 minutos, preferivelmente 2-4 minutos. Esses três estágios são repetidos 30 a 35 vezes, eventual- mente a 50 vezes. Um estágio de "extensão" definitivo de 4 - 10 minutos conclui a reação. Os polinucleotídeos produzidos dessa maneira, também são designados como amplificados; o termo fragmento de ácido nucléico também é comum.

O técnico encontra outras introduções e informações para PCR, por exemplo, no manual "PCR-Strategies" (lnnis, Felfand e Sninsky, Acade- mic Press, Inc., 1995), no manual de Diefenbach e Dveksler "PCR Primer - a Iaboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), no ma- nual de Gait "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, Grã Bretanha, 1984) e em Newton e Graham "PCR" (Spektrum Aka- demischer Verlag1 HeideIberg1AIemanha, 1994).

Em seguida, a seqüência de nucleotídeos é determinada, por exemplo, de acordo com o processo de ruptura de cadeia de Sanger e cola- boradores (Proceedings of the National Academies of Sciences, EUA, 74, 5463-5467 (1977)) com as modificações mencionadas por Zimmermann e colaboradores (Nucleic Acids Research 18, página 1067 (1990)) e o polipep- tídeo codificado por essa seqüência de nucleotídeos é analisado, especial- mente com respeito à seqüência de aminoácidos. Para isso, a seqüência de nucleotídeos é apresentada em um programa para a conversão da seqüên- cia de DNA para uma seqüência de aminoácidos. Programas adequados são, por exemplo, o programa "Patentin", que pode ser obtido no registro de patentes, por exemplo, no registro de patente norte americano (USPTO) ou o "Translate Tool", que está disponível no ExPASy Proteomics Server no World Wide Web (Gasteiger e colaboradores, Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003).

Dessa maneira, são identificados mutantes, cujos alelos rei codi- ficam polipeptídeos com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da seqüência de aminoácidos ou na posição correspondente ou comparável, contêm um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção 15

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de L-prolina. A troca preferida é por L-leucina.

Eventualmente determina-se todo o cromossoma dos mutantes. Nesse caso, é possível utilizar o método descrito por Margulies e colabora- dores (Nature, 437(7057): 376-380 (2005)) e Velicer e colaboradores (Pro- ceedings of the National Academy of Sciences, EUA, 103(21), 8107-8112 (2006)), que é conhecido na técnica pela palavra-chave "pyro-sequencing" e possibilita uma sequenciação rápida de genomas completos.

O objeto da invenção, em conseqüência disso, é um mutante de uma bactéria corineforme, caracterizado pelo fato de que este pode ser obti- do através dos seguintes estágios:

a) tratamento de uma bactéria corineforme, que possui a capaci- dade de separar aminoácidos, com um agente mutagênico,

b) isolamento e multiplicação do mutante produzido em a),

c) determinação preferida da capacidade do mutante de separar em um meio pelo menos 0,5 % mais aminoácido ou de enriquecer no interior da célula do que a bactéria corineforme utilizada em a),

d) preparação de ácido nucléico do mutante obtido em b),

e) produção de uma molécula de ácido nucléico (ou amplificado ou fragmento de ácido nucléico) com o uso da reação em cadeia de polime- rase, do ácido nucléico de d) e de um par de primers consistindo em um pri- meiro primer compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos se- lecionados da seqüência de nucleotídeos entre a posição 1 e 861, preferi- velmente 1 a 750 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7 e de um segundo primer compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos entre a posição 3800 e 865, preferivelmente 3800 e 3031 da SEQ ID n°: 3 ou 7,

f) determinação da seqüência de nucleotídeos da molécula de ácido nucléico obtida em e) e determinação da seqüência de aminoácidos codificada,

g) eventualmente comparação da seqüência de aminoácidos com SEQ ID n°: 6 ou 8 determinada em f), sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262 e

20 h) identificação de um mutante, que contém um polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo, que na posição 38 ou na posição comparável, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, preferivelmente L-Ieucina.

5 Os mutantes produzidos dessa maneira, contêm tipicamente

uma (1) cópia do alelo rei descrito.

Na SEQ ID n°: 5 é apresentada, por exemplo, a região de codifi- cação do alelo rei de um mutante de acordo com a invenção. A região de codificação do gene de tipo selvagem é representada como SEQ ID n°: 1. A 10 SEQ ID n°: 1 contém na posição 112 a nucleobase citosina, na posição 113 a nucleobase citosina e na posição 114, a nucleobase guanina. A SEQ ID n°: 1 contém, dessa maneira, da posição 112 a 114, o códon CCG que codifica o aminoácido L-prolina. A SEQ ID n°: 5 contém na posição 113 a nucleobase timina. Através dessa transição de citosina para timina, o códon CTG que 15 codifica o aminoácido L-Ieucina forma-se na posição 112 a 114.

Além disso, as seqüências de nucleotídeos representadas na SEQ ID n°: 5 ou 7 podem conter outras trocas de bases, que resultaram a- través do tratamento da mutagênese, contudo, não se exteriorizam em uma seqüência de aminoácidos modificada. Na técnica, tais mutações são desig- 20 nadas também mutações silenciosas ou neutras. Essas mutações silencio- sas já podem estar contidas também na bactéria corineforme utilizada para o tratamento da mutagênese.

As bactérias corineformes utilizadas para a mutagênese já pos- suem preferivelmente a capacidade, de separar o aminoácido desejado no meio nutriente/que o envolve ou caldo de fermentação ou enriquecer no inte- rior da célula.

Bactérias corineformes produtoras de L-Iisina possuem tipica- mente uma aspartato cinase resistente ao "feed back" ou dessensibilizada. Por "feed back" de aspartato cinases resistentes entendem-se aspartato ci- 30 nases (LysC), que em comparação com a forma selvagem, apresentam uma menor sensibilidade contra a inibição por misturas de Iisina e treonina ou misturas de AEC (aminoetilcisteína) e treonina ou Iisina sozinha ou AEC so- zinho. Os genes ou alelos que codificam essas aspartato cinases dessensi- bilizadas também são designados como alelos lysCFBR. No estado da técnica são descritos inúmeros alelos lysCFBR, que codificam variantes de aspartato cinases, que possuem trocas de aminoácido em comparação com a proteína 5 de tipo selvagem. A região de codificação do gene IysC de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum correspondente ao número de acesso AX756575 ou banco de dados NCBI está representada na SEQ ID n°: 9 e o polipeptídeo codificado por esse gene, na SEQ ID n°: 10.

As bactérias corineformes produtoras de L-Iisina utilizadas para as medidas da invenção, dispõem preferivelmente de um alelo IysC, que co- difica uma variante da aspartato cinase, que possui a seqüência de aminoá- cidos de SEQ ID n°: 10, sendo que essa compreende uma ou várias das tro- cas de aminoácidos selecionadas do grupo:

LysC A279T (troca de L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato cinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-treonina; vide a US 5.688.671 e números de acesso E06825, E06826, E08178 e I74588 a I74597),

LysC A279V (troca de L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato cinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-valina, vi- de JP 6-261766 e número de acesso E08179),

LysC L279Q (troca de L-Ieucina na posição 297 da proteína de aspartato cinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-glutamina; videa DE 102006026328),

LysC S301F (troca de L-serina na posição 301 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L- fenilalanina; vide a US 6.844.176 e número de acesso E08180),

LysC S301Y (troca de L-serina na posição 301 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-tirosina, vide Kalinowski e colaboradores (Molecular and General Genetics 224, 317- 324 (1990)) e número de acesso X57226),

LysC T308I (troca de L-treonina na posição 308 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-isoleucina; vide JP 6-261766 e número de acesso E08181)

LysC T311I (troca de L-treonina na posição 311 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-isoleucina; vide WO 00/63388 e US 6.893.848),

LysC S317A (troca de L-serina na posição 317 da proteína de

aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-alanina; vide a US 5.688.671 e número de acesso I74589),

LysC R320G (troca de L-arginina na posição 320 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por glicina; vide Jetten e colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) e número de acesso L27125),

LysC G345D (troca de glicina na posição 345 da proteína de as- partatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por ácido L- asparagínico; vide Jetten e colaboradores (Applied Microbiology and Biote- chnology 43, 76-82 (995)) e número de acesso L16848),

LysC T380I (troca de L-treonina na posição 380 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L-isoleucina; vide a WO 01/49854 e número de acesso AX192358) e

LysC S381F (troca de L-serina na posição 381 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por L- fenilalanina; vide a EP 0435132).

De modo particular, preferem-se o alelo lysCFBR IysC T311I (tro- ca de treonina na posição 311 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por isoleucina) e um alelo lysCFBR contendo pe- 25 Io menos uma troca selecionada do grupo A279T (troca de alanina na posi- ção 279 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por treonina), S381F (troca de serina na posição 381 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por fenilalanina) e S317A (troca de serina na posição 317 da proteína de aspartatocinase co- 30 dificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por alanina).

O alelo lysCFBR IysC T311I (troca de treonina na posição 311 da proteína de aspartatocinase codificada de acordo com a SEQ ID n°: 10 por isoleucina é muito particularmente preferido.

A cepa DSM 16833 (WO 06/063660) possui um alelo lysCFBR, que codifica uma proteína de aspartato cinase, que contém a troca de ami- noácido T311I.

A cepa NRRL B-11474 (US 4.275.157) possui um alelo lysCFBR,

que codifica uma proteína de aspartato cinase, que contém as trocas de a- minoácidos A279T e S381F.

De acordo com o modo e maneira descrito acima, partindo da cepa DSM 16833, foi isolado um mutante designado como DM1915, que na 10 posição 38 da seqüência de aminoácidos, contém um alelo rei, que codifica um polipeptídeo, no qual está contida L-leucina. A seqüência de nucleotí- deos da região de codificação do alelo rei do mutante DM1915 é representa- da como SEQ ID n°: 5 e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codifi- cado, como SEQ ID n°: 6 ou 8.

Além disso, é possível utilizar bactérias corineformes separado-

ras de L-lisina, que possuem propriedades, tais como são conhecidas do estado da técnica.

Bactérias corineformes produtoras de L-triptofano possuem tipi- camente uma antranilatossintase resistente ao "feed back" ou dessensibili- 20 zada. Por sintase de antranilato resistente ao "feed back" (TrpE) entendem- se sintases de antranilato, que em comparação com a forma selvagem, a- presentam uma sensibilidade em pelo menos 5 a 10 %, ou pelo menos 10 % a 15 % ou pelo menos 10 % a 20 % menor contra a inibição por triptofano ou 5-fluortriptofano (Matsui e colaboradores, Journal of Bacteriology 169 (11) : 25 5330 - 5332 (1987)) ou análogos semelhantes. Os genes ou alelos que codi- ficam as sintases de antranilato dessensibilizadas são designados também como alelos trpEFBR.

Exemplos desses mutantes ou alelos são descritos, por exem- plo, na US 6180373 e EP 0338474.

Bactérias corineformes produtoras de L-prolina possuem, entre

outros, uma γ-glutamilcinase (ProB), que na posição do aminoácido 149 ou posição comparável, apresenta um outro aminoácido proteinogênico como glicina, preferivelmente ácido L-asparagínico (WO 06066758).

Bactérias corineformes produtoras de L-valina possuem tipica- mente uma sintase de acetolactato resistente ao "feed back" ou dessensibili- zadas (Acetohydroxyacid Synthase; EC n°2.2.1.6).

Por sintase de acetolactato resistente ao "feed back" entende-se

uma sintase de acetolactato que, em comparação com a forma selvagem, apresenta uma sensibilidade menor contra a inibição por um ou vários dos aminoácidos selecionados do grupo L-valina, L-isoleucina e L-leucina, prefe- rivelmente L-valina.

A sintase de acetolactato (llvB, IIvN) de Corynebacterium consis-

te em uma chamada subunidade grande codificada pelo gene ilvB e em uma chamada subunidade pequena codificada pelo gene ilvN (Keihauer e colabo- radores, Journal of Bacteriology 175(17), 5595-5603 (1993)). Na WO 05/003357 e Elisakova e colaboradores (Applied and Environmental Microbi- 15 ology 71(1): 207-13 (2005) são relatadas variantes da subunidade IlvN, que conferem resistência à acetolactato sintase contra L-valina, L-isoleucina e L- leucina. Uma variante na posição 21 da seqüência de aminoácidos contém ácido L-asparagínico ao invés de L-isoleucina (IlvN 121 D) e na posição 22, L- fenilalanina ao invés de L-isoleucina (IlvN I22F). A segunda variante contém 20 na posição 20 da seqüência de aminoácidos, ácido L-asparagínico ao invés de glicina (IlvN G20D), na posição 21 da seqüência de aminoácidos, ácido L- asparagínico ao invés de L-isoleucina (IlvN 121 D) e na posição 22, L- fenilalanina ao invés de L-isoleucina (IlvN I22F).

Bactérias corineformes produtoras de L-isoleucina possuem tipi- camente uma desidratase de treonina resistente ao "feed back" ou dessen- sibilizada (= desaminase de treonina).

Por desidratase de treonina resistente ao "feed back" entende-se uma desidratase de treonina (EC n° 4.3.1.19), que em comparação com a forma selvagem, apresenta uma sensibilidade menor contra a inibição por L- isoleucina. Os genes ou alelos que codificam essa desidratase de treonina dessensibilizada também são designados como alelos ilvAFBR.

A região de codificação do gene ilvA de tipo selvagem de Cory- nebacterium glutamicum correspondente ao número de acesso L01508 e NC_006958 do banco de dados NCBI, está representa na SEQ ID n°: 17 e o polipeptídeo codificado por este gene, na SEQ ID n°: 18.

As variantes de desidratase de treonina descritas na US 6.107.063 e por Morbach e colaboradores (Applied and Environmental Mi- crobiology 61 (12), 4315-4320 (1995)), contêm uma ou várias das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo:

IIvA M199V (troca de L-metionina na posição 199 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID n°: 18 por L- valina; vide a US 6.107.063),

IIvA A257G (troca de L-alanina na posição 257 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID n°: 18 por L- arginina; vide a US 6.107.063),

IIvA H278R (troca de L-histidina da posição 278 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID n°: 18 por L- arginina; vide a US 6.107.063),

IIvA V323A (troca de L-valina na posição 323 da proteína de de- sidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID n°: 18 por L- alanina; vide Morbach e colaboradores),

IIvA L351S (troca de L-Ieucina na posição 351 da proteína de

desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID n°: 18 por L- serina; vide a US 6.107.063)

IIvA D378G (troca de ácido L-asparagínico na posição 378 da proteína de desidratase de treonina codificada de acordo com a SEQ ID n°: 18 por glicina; vide Morbach e colaboradores).

Os mutantes obtidos mostram uma separação ou produção mai- or do aminoácido desejado em um processo de fermentação em compara- ção com a cepa de partida ou cepa mãe utilizada.

Do mesmo modo, o objeto da invenção é um polinucleotídeo iso- lado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfato- cinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos pro- teinogênicos com exceção de L-prolina, sendo preferida a troca por L- leucina.

O polinucleotídeo de acordo com a invenção, pode ser isolado de um mutante de acordo com a invenção.

Além disso, para a mutagênese do gene rei é possível utilizar

métodos in-vitro. Quando são utilizados métodos in-vitro, os polinucleotídeos isolados, que contêm um gene rei de uma bactéria corineforme, preferivel- mente o gene de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito no estado da técnica, são submetidos a um tratamento mutagênico.

No caso dos polinucleotídeos isolado, pode tratar-se, por exem-

plo, de um DNA total isolado ou de DNA cromossomal ou também de ampli- ficados de um gene rei, que foram produzidos com auxílio da reação em ca- deia de polimerase (PCR). Tais amplificados também são designados como produtos PCR. Especificações para a amplificação de seqüência de DNA 15 com auxílio da reação em cadeia de polimerase são encontradas pelo técni- co, entre outros, no manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Grã Bretanha, 1984) e em Newton e Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994). Do mesmo modo, é possível, incorporar o gene rei a ser submetido à mutagê- 20 nese, inicialmente em um vetor, por exemplo, em um bacteriófago ou em um plasmídeo.

Métodos adequados para a mutagênese in-vitro são, entre ou- tros, o tratamento com hidroxilamina de acordo com Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for 25 Eseheriehia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), o emprego de oligonucleotídeos mutagênicos (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 e R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Muta- genesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) e o uso de uma reação 30 em cadeia de polimerase com o emprego de uma polimerase de DNA, que apresenta uma alta taxa de erros. Uma tal polimerase de DNA é, por exem- plo, a mutazima DNA polimerase (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, n° 600550) da Stratagene (LaJolla, CA, EUA).

Outras especificações e sinopses para a produção de mutações in-vivo ou in-vitro podem ser deduzidas do estado da técnica e compêndios de genética e biologia molecular conhecidos, tais como, por exemplo, do 5 compêndio de Knippers ("Moleculare Genetik", 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), do de Winnacker ("gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou do de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, 10 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 2, sendo que na posição 38 da seqüência de aminoácidos está contido um dos ami- noácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina. Prefere-se a troca por L-leucina. Ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262 da 15 SEQ IDn0: 2.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende uma seqüência de aminoácidos com um comprimen- to de 760 aminoácidos e em que na posição 38 está contido um dos L- 20 aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, preferivelmente L- leucina.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 19 a 57 da seqüência de aminoácidos contém a se- 25 quência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 6 ou 8. Preferivelmente, a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codifica- do contém uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 107 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 9 a 207 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posi- ção 9 a 407 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 9 a 607 da SEQ ID n°: 6 ou 8 30 ou posição 9 a 707 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 707 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 9 a 757 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 757 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 758 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou posição 2 a 759 da Tl SEQ ID n0: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente conti- do na posição 262. De modo muito particularmente preferido, o comprimento do polipeptídeo codificado compreende 760 aminoácidos.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da seqüência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou comparável, contém um dos aminoácidos proteinogêni- cos, com exceção de L-prolina, preferivelmente L-Ieucina e que compreende uma seqüência de nucleotídeos, que é idêntica à seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, que é obtenível através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com o emprego de um par de primers, cujas seqüências de nucleotídeos compreendem em cada caso pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, que são selecionados da seqüência de nucleotídeos entre a posição 1 e 861, preferivelmente entre a posição 1 e 750, da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre a posi- ção 3800 e 865, preferivelmente entre a posição 3800 e 3031, da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7. Um exemplo de um tal par de primers é representada na SEQ ID n°: 19 e SEQ ID n°:20. Como material de partida ("template"-DNA) prefere-se o DNA cromossomal de bactérias corineformes, que foram trata- dos especialmente com um agente mutagênico. Particularmente, prefere-se o DNA cromossomal do gênero Corynebacterium e de modo muito particu- larmente preferido, o da espécie Corynebacterium glutamicum.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que é hibridizado com uma seqüência de nucleotídeos complementar à SEQ 25 ID n°: 5 sob condições limitadas e codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da seqüência de aminoácidos ou de uma posição correspondente ou comparável, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, preferivelmen- te L-leucina.

Especificações para a hibridização de ácidos nucléicos ou poli-

nucleotídeos são encontrados pelo técnico, entre outros, no manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" da Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl e colaboradores (Internatio- nal Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). A hibridização realiza-se em condições restritas, isto é, formam-se apenas híbridos, nos quais a sonda, isto é, um polinucleotídeo compreendendo a seqüência de 5 nucleotídeos complementar à SEQ ID n°: 5 e a seqüência de células, isto é, os polinucleotídeos tratados com a sonda ou identificados, são idênticos em pelo menos 90 %. Sabe-se, que a limitação da hibridização inclusive o está- gio de lavagem é influenciada ou determinada pela variação da composição do tampão, da temperatura e da concentração de sal. Em geral, a reação de 10 hibridização é efetuada com restrição relativamente baixa em comparação com os estágios de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Grã Bretanha, 1996).

Para a reação de hibridização, por exemplo, pode ser utilizado um tampão correspondente ao tampão 5x SSC a uma temperatura de cerca de 50°C - 68°C. Nesse caso, as sondas também podem hibridizar com poli- nucleotídeos, que apresentam menos do que 90 % de identidade para a se- qüência de nucleotídeos da sonda utilizada. Tais híbridos são menos está- veis e são removidos através de lavagem em condições restritas. Isso pode ser obtido, por exemplo, através da redução da concentração de sal para 2x SSC e eventualmente, em seguida, 0,5x SSC (The DIG System User's Gui- de for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha, 1995), sendo ajustada uma temperatura de cerca de 50°C - 68°C, cerca de 52°C - 68°C, cerca de 54°C - 68°C, cerca de 56°C - 68°C, cerca de 58°C - 68°C, cerca de 60°C - 68°C, cerca de 62°C - 68°C, cerca de 64°C - 68°C, cerca de 66°C - 68°C. Faixas de temperatura de cerca de 64°C - 68°C ou cerca de 66°C - 68°C são preferidas. Eventualmente, é possível reduzir a concentração de sal a uma concentração correspondente a 0,2x SSC ou 0,1 x SSC. Eventualmente, o tampão SSC contém dodecilsulfato de sódio (SDS) em uma concentração de 0,1 %. Através de aumento escalonado da temperatura de hibridização em estágios de cerca de 1 - 2°C de 50°C para 68°C, podem ser isolados fragmentos de polinucleotídeos, que possuem pe- lo menos 90 % ou pelo menos 91 %, preferivelmente pelo menos 92 % ou pelo menos 93 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 95 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido, pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade para a seqüência ou se- qüência complementar da sonda utilizada e codificam um polipeptídeo com 5 atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, o qual contém a troca de a- minoácidos de acordo com a invenção. A seqüência de nucleotídeos do poli- nucleotídeo obtido dessa maneira é determinada com métodos conhecidos. Outras especificações para a hibridização são obteníveis no comércio na forma dos chamados kits (por exemplo, DIG Easy Hyb pela Roche Diagnos- 10 tics GmbH, Mannheim, Alemanha, catálogo n° 1603558). As seqüência de nucleotídeos obtidas dessa maneira codificam polipeptídeos com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que são pelo menos 90 %, preferivel- mente pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de mo- do muito particularmente preferido, pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % 15 ou pelo menos 99 % idênticos com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 6 ou SEQ ID n°: 8 e contêm a troca de aminoácidos de acordo com a in- venção, sendo que o ácido L-glutamínico está eventualmente contido na po- sição 262.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, 20 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, sendo dada preferência à troca por L-Ieucina e que compreende uma seqüência de aminoácidos, que além disso, é em pelo 25 menos 90 %, preferivelmente pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo menos 96 % e de modo muito particularmente preferido pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % idêntico à seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 6 ou SEQ ID n°: 8, sendo que o ácido L-glutâmico está even- tualmente contido na posição 262.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado,

que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, sendo dada preferência à troca por L-Ieucina e que compreende uma seqüência de nucleotídeos que, além disso, é em pelo menos 90 %, preferivelmente pelo menos 92 % ou pelo menos 94 % ou pelo 5 menos 96 % e de modo muito particularmente preferido pelo menos 97 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % idêntico à seqüência de nucleotídeos da SEQ ID n°: 5, sendo que a adenina está eventualmente contida na posi- ção 785.

Além disso, são preferidos aqueles polinucleotídeos isolados, 10 que codificam um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocina- se GTP, que na posição 38 da seqüência de aminoácidos ou em uma posi- ção correspondente ou comparável, contém um dos aminoácidos proteino- gênicos, com exceção da L-prolina, preferivelmente L-Ieucina e que contêm pelo menos um motivo de seqüência ou uma seqüência de aminoácidos se- 15 lecionada do grupo Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-lle-Thr/lle-His-Pro-Leu-Ala-Val, Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-AspThr e Thr-Pro-Val-Asp-Phe- Ala-Tyr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg.

As designações "Asp/Glu", "Thr/lle" e "Ala/Gly" significam, que "Asp ou Glu" ou "Thr ou lie" ou "Ala ou Gly"estão contidos na posição cor- respondente.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID n°: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262. 25 Eventualmente, o polipeptídeo codificado contém um (1) ou várias troca(s) de aminoácidos conservativas. Preferivelmente, o polipeptídeo contém duas (2), no máximo três (3), no máximo quatro (4) ou no máximo cinco (5) trocas de aminoácidos conservativas.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID n°: 6 ou 8 inclusive um (1) aminoácido. Esse prolongamento não importa em mais do que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ou 2 aminoácidos ou radicais de aminoácidos. Eventualmente o ácido L-glutâmico está contido na posição 262 da SEQ ID n°: 6 ou 8.

O objeto da invenção são, finalmente, também alelos rei, que 5 codificam variantes de polipeptídeo da SEQ ID n°: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262, que contêm uma ou várias inserções ou deleções. Preferivelmente, esses contêm no máximo 5, no máximo 4, no máximo 3 ou no máximo 2 inserções ou deleções de ami- noácidos. O motivo de seqüência Ser-Gly-Asp/Glu-Pro-Tyr-lle-Thr/lle-His- 10 Pro-Leu-Ala-Val e/ou Ala-Ala/Gly-Leu-Leu-His-Asp-Thr-Val-Glu-Asp-Thr e/ou Thr-Pro-Val-Asp-Phe-Ala-Thr-Ala-Val-His-Thr-Glu-Val-Gly-His-Arg preferi- velmente não é/são rasgados por tais inserções/deleções.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, que compreende a seqüência de nucleotídeos de acordo com a SEQ ID n°: 5 ou 7, sendo que a adenina está eventualmente contida na posição 785 da SEQ ID n°: 5 ou posição 1535 da SEQ ID n°: 7.

O objeto da invenção é, finalmente, um polinucleotídeo isolado contendo o alelo rei do mutante DM1915.

O objeto da invenção é, além disso, um polinucleotídeo isolado, 20 que compreende uma parte da região de codificação de um alelo rei de a- cordo com a invenção, sendo que o polinucleotídeo isolado compreende em cada caso a parte da região de codificação, que contém a troca de aminoá- cidos na posição 38 da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codifica- do.

De modo especial, está compreendido uma molécula de ácido

nucléico ou um fragmento de DNA, que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posi- ção 9 a 107 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo menos uma seqüência de 30 aminoácidos correspondente à posição 9 a 207 da SEQ ID n°: 2 ou que codi- fica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 407 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo menos uma seqüência de ami-

I noácidos correspondente à posição 9 a 607 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 707 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoá- cidos correspondente à posição 2 a 707 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pe- 5 Io menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 9 a 757 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 757 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo me- nos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 758 da SEQ ID n°: 2 ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos 10 correspondente à posição 2 a 759 da SEQ ID n°: 2, sendo que na posição correspondente a 38 da SEQ ID n°: 2, está contido um dos aminoácidos pro- teinogênicos, com exceção de L-prolina, preferivelmente L-leucina. O ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262 da SEQ ID n°: 2.

Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção, 15 que compreende um polinucleotídeo, que codifica pelo menos a seqüência de aminoácidos da posição 19 a 57 correspondente à SEQ ID n°: 2, sendo que na posição correspondente a 38 da seqüência de aminoácidos, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos (Xaa), com exceção de L- prolina, é mostrado a seguir:

gcc agg ctt gcc cgc age ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac cct gtg

Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro Val 20 25 30 35

ctg gat nnn ctg age cac cgg caa ttt cac cca cgc gcc gac gta Leu Asp Xaa Leu Leu Ser He His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala Asp Val 40 45 50

caa gtg ttg gaa cgt Gln Val Leu Glu Arg 55

Este está igualmente representadso como SEQ ID n°: 11. A se- quência de aminoácidos codificada por esse quadro de leitura está represen- tada como SEQ ID n°: 12. A posição 20 na SEQ ID n°: 12 corresponde à po- sição 38 da SEQ ID n°: 2, 4, 6 ou 8. Preferivelmente, moléculas de ácido nucléico, que codificam pe- lo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 107 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 207 da SEQ 5 ID n°: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 407 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 607 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 707 da SEQ ID n°:6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 2 a 707 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 9 a 757 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo 10 menos correspondente à posição 2 a 757 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo me- nos correspondente à posição 2 a 758 da SEQ ID n°: 6 ou 8 ou pelo menos correspondente à posição 2 a 759 da SEQ ID n°: 6 ou 8, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção compreendendo um polinucleotídeo, que codifica pelo menos uma seqüên- cia de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 6 ou 8, é mostrado a seguir:

gcc agg Ctt cgc age etc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac CCt gtg Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro Val 20 25 30 35 ctg gat ctg ctg age ate cac cgg caa ttt cac cca cgc gcc gac gta Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala Asp Val 40 45 50 caa gtg ttg gaa cgt Gln Val Leu Glu Arg 55

O quadro de leitura também está representado como SEQ ID n°: 13. A SEQ ID n°: 14 mostra a seqüência de aminoácidos codificada por este quadro de leitura. A posição 20 na SEQ ID n°: 14 corresponde à posição 38 da SEQ ID n°: 2, 4, 6 ou 8.

De modo muito particular, preferem-se moléculas de ácido nu- cléico, que compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeos cor- respondente à posição 805 a 921 da SEQ ID n°: 7 ou pelo menos uma se- qüência de nucleotídeos correspondente à posição 655 a 1071 da SEQ ID n°: 7 ou pelo menos uma seqüência de nucleotídeos correspondente à posi- ção 355 a 1371 da SEQ ID n°: 7 ou pelo menos uma seqüência de nucleotí- 5 deos correspondente à posição 55 a 2671 da SEQ ID n°: 7 ou pelo menos uma seqüência de nucleotídeos correspondente à posição 1 a 2725 da SEQ ID n°: 7, sendo que a adenina está eventualmente contida na posição 1535.

Os quadros de leitura de acordo com a invenção, tais como são mostrados, por exemplo, na SEQ ID n°: 11 e 13 como seqüência de nucleo- 10 tídeos e na SEQ ID n°: 12 e SEQ ID n°: 14 na forma da seqüência de ami- noácidos codificada, podem conter, além disso, uma ou mais mutações, que levam a uma ou mais trocas de aminoácidos conservativas. Preferivelmente, as mutações levam a no máximo 4 %, a no máximo 2 % ou a no máximo 1 % de trocas de aminoácidos conservativas. Além disso, os quadros de Ieitu- 15 ra de acordo com a invenção, podem conter uma ou mais mutações silen- ciosas. Preferivelmente, os quadros de leitura de acordo com a invenção, contêm no máximo 4 % e de modo particularmente preferido, no máximo 2 % a no máximo 1 % de mutações silenciosas.

Os polinucleotídeos isolados, de acordo com a invenção, podem ser utilizados para produzir cepas recombinantes de microrganismos que, em comparação com a cepa de partida ou cepa mãe, da melhor maneira, distribuem aminoácidos ao meio que os circunda ou se acumulam no interior da célula.

Um método difundido para a incorporação de mutações no gene 25 de bactérias corineformes é a troca de alelo, que também é conhecida pela designação "gene replacement". Neste processo, um fragmento de DNA, que contém a mutação interessante, é transferido para a cepa desejada de uma bactéria corineforme e a mutação é incorporada no cromossoma da cepa desejada através de pelo menos duas ocorrências de recombinação ou 30 ocorrências "cross over" ou a seqüência de um gene presente na respectiva cepa é trocada pela seqüência mutada.

Este método foi utilizado por Schwarzer e Pühler (Bi- o/Technology 9, 84-87 (1991) para incorporar um alelo IysA, o qual portou uma deleção e um alelo IysA1 o qual portou uma inserção, no cromossoma de C. glutamicum ao invés do gene de tipo selvagem. Este método foi utili- zado por Schãfer e colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994), para incorporar uma deleção no Operon hom-thrB de C. glutamicum. Este método foi utiliza- do por Nakagawa e colaboradores (EP 1108790) e Ohnishi e colaboradores (Applied Microbiology and Biotechnology 58 (2), 217-223 (2002), para incor- porar diferentes mutações partindo dos alelos isolados, para o cromossoma de C. glutamicum. Dessa maneira, Nakagawa e colaboradores conseguiram incorporar uma mutação designada como Va159Ala, no gene da desidroge- nase de homosserina (hom), uma mutação designada com Thr3111le no ge- ne da aspartato cinase (IysC ou ask), uma mutação designada com Pro458Ser no gene de piruvato-carboxilase (pyc) e uma mutação designada com Ala213Thr no gene da desidrogenase de glicose-6-fosfato (zwf) de ce- pas de C. glutamicum.

Para um processo de acordo com a invenção, pode ser utilizado um polinucleotídeo de acordo com a invenção, o qual compreende toda a região de codificação, tal como, por exemplo, mostrado na SEQ ID n° 5, ou o qual compreende uma parte da região de codificação, tal como, por exem- 20 pio, a seqüência de nucleotídeos, que codifica pelo menos a seqüência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 6 ou 8 e que são representadas como SEQ ID n° 11 e 13. A parte da região de codifica- ção correspondente à SEQ ID n° 11 e 13 compreende um comprimento de > 117 nucleobases. Preferem-se aquelas partes da SEQ ID n°: 7, que compre- 25 endem pelo menos a seqüência entre a posição 1071 e 655 ou pelo menos entre a posição 1371 e 355 e em conformidade com isso, possuem um com- primento de >407 ou > 1017 nucleobases.

Na SEQ ID n°: 15 é apresentado um exemplo de um polinucleo- tídeo de acordo com a invenção, que compreende uma parte da região de codificação.

O fragmento de DNA contendo a mutação interessante está pre- sente neste método, tipicamente em um vetor, especialmente em um pias- mídeo, que preferivelmente não é ou é apenas limitadamente replicado pela cepa a ser provida com a mutação. Como hospedeiro auxiliar ou intermediá- rio, no qual o vetor é replicável, utiliza-se geralmente uma bactérias do gêne- ro Escherichia1 preferivelmente da espécie Escherichia coli.

Exemplos de tais vetores de plasmídeos são os vetores pK*mob

e pK*mobsacB descritos por Schãfer e colaboradores (Gene 145, 69-73 (1994)), tais como, por exemplo, pK18mobsacB e os vetores descritos na WO 02/070685 e WO 03/014362. Esses são replicativos em Escherichia coli, mas não em bactérias corineformes. Vetores particularmente adequados são 10 aqueles, que contêm um gene de ação dominante condicionalmente negati- va, tal como, por exemplo, o gene sacB (gene de levansucrase), por exem- plo, de Bacillus ou o gene galK (gene galactose cinase), por exemplo, de Escherichia coli. (Por um gene de ação dominante condicionalmente negati- va entende-se um gene, que em determinadas condições é desvantajosa- 15 mente tóxico, por exemplo, para os hospedeiro, mas em outras condições não tem ações negativas sobre o hospedeiro portador do gene). Esses pos- sibilitam a seleção nas ocorrências de recombinação, nas quais o vetor é eliminado do cromossoma. Além disso, Nakamura e colaboradores (US-A- 6.303.383) descreveram um plasmídeo sensível à temperatura para bacté- 20 rias corineformes, que pode replicar meramente a temperaturas abaixo de 31°C.

Em seguida, o vetor é transferido para a bactéria corineforme através de conjugação, por exemplo, de acordo com o método de Schãfer (Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) ou transformação, por e- 25 xemplo, de acordo com o método de Dunican e Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) ou de acordo com o método de Thierbach e colaborado- res (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)). Eventual- mente, a transferência do DNA também pode ser obtida através de bombar- deamento de partículas.

Após recombinação homóloga por meio de uma primeira ocor-

rência "cross-over" que causa a integração e de uma segunda ocorrência "cross-over" adequada, que causa uma excisão no gene alvo ou na sequên- cia alvo, consegue-se a incorporação da mutação e obtém-se uma bactéria recombinante.

Para a identificação e caracterização das cepas obtidas, é pos- sível utilizar, entre outros, os métodos da hibridização Southern Blotting, da reação em cadeia de polimerase, da determinação de seqüências, o método da "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) (Lay e colaborado- res, Clinicai Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) ou métodos da enzimiologia.

Em conformidade com isso, um outro objeto da invenção é um processo para a produção de uma bactéria corineforme, na qual a) um polinucleotídeo de acordo com a invenção, é transferido

para uma bactéria corineforme,

b) o gene pirofosfatocinase GTP presente no cromossoma da bactéria corineforme, que codifica uma seqüência de aminoácidos com L- prolina na posição 38 ou em uma posição comparável da seqüência de ami-

noácidos, é trocado pelo polinucleotídeo de a), que codifica uma seqüência de aminoácidos, que na posição 38 ou em uma outra posição comparável da seqüência de aminoácidos, possui um outro L-aminoácido proteinogênico, preferivelmente L-Ieucina e

c) multiplicar a bactéria corineforme obtida de acordo com o es- tágio a) e b).

Dessa maneira, obtém-se uma bactéria corineforme recombinan- te, que ao invés do gene rei de tipo selvagem, contém (1) um alelo rei de acordo com a invenção.

Um outro processo de acordo com a invenção, para a produção de um microrganismo, consiste em que

a) um polinucleotídeo de acordo com a invenção, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, é trans- ferido para um microrganismo,

b) o polinucleotídeo é replicado no microrganismo e

c) o microrganismo obtido de acordo com o estágio a) e b) é

multiplicado.

Dessa maneira, obtém-se um microrganismo recombinante, o qual contém pelo menos (1) uma cópia ou várias cópias de um polinucleotí- deo de acordo com a invenção, que codifica uma pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 ou em uma posição comparável da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, sendo preferida a troca por L-leucina.

Outros objetos da invenção são, em conformidade com isso, hospedeiros ou células hospedeiras, preferivelmente microrganismos, de modo particularmente preferido, bactérias corineformes e bactérias do gêne- ro Escherichia, que contêm os polinucleotídeos de acordo com a invenção. 10 Do mesmo modo, o objeto da invenção são microrganismos, que foram pro- duzidos com o emprego dos polinucleotídeos isolados. Tais microrganismos ou bactérias são designados também como microrganismos recombinantes ou bactérias recombinantes. Da mesma maneira, os vetores, que contêm os polinucleotídeos de acordo com a invenção, são objeto da invenção. Final- 15 mente, os hospedeiros, que contêm esses vetores, são também objeto da invenção.

Da mesma maneira, os polinucleotídeos isolados de acordo com a invenção, podem ser utilizados para a obtenção de uma superexpressão dos polipeptídeos codificados por estes.

Por superexpressão entende-se geralmente um aumento da

concentração intracelular ou atividade de um ácido ribonucléico, de uma pro- teína ou de uma enzima. No caso da presente invenção, alelos rei ou polinu- cleotídeos superexprimidos são os que codificam pirofosfatocinases GTP, que na posição 38 da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado, 25 contêm um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, sendo preferida a troca por L-leucina. Sabe-se, que através de enzimas pró- prias do hospedeiro - as chamadas aminopeptidases - os aminoácidos N- terminais, especialmente a metionina N-terminal, podem ser dissociados do polipeptídeo formado. O aumento mencionado da concentração ou atividade 30 de um produto gênico pode ser obtido, por exemplo, pelo fato, de se aumen- tar o número de cópias dos polinucleotídeos correspondentes em pelo me- nos uma cópia. Um método amplamente divulgado para aumentar o número de cópias, consiste em incorporar o gene ou alelo correspondente em um vetor, preferivelmente um plasmídeo, que é replicado por uma bactéria corinefor- me. Vetores de plasmídeos adequados são, por exemplo, pZ1 (Menkel e 5 colaboradores, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) ou os vetores pSELF descritos por Tauch e colaboradores (Journal of Biote- chnology 99, 79-91 (2002)). O artigo da sinopse sobre o tema plasmídeos em Corynebacterium glutamicum está em Tauch e colaboradores (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Um outro método difundido para a obtenção de uma superex-

pressão é o processo da amplificação gênica cromossomal. Neste método, pelo menos uma cópia adicional do gene ou alelo interessante é introduzido no cromossoma de uma bactéria corineforme.

Em uma forma de concretização, tal como descrita, por exemplo, 15 por Reinscheid e colaboradores (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para o hom-thrB-operon, um plasmídeo não replicativo em C. glutamicum, o qual contém o gene interessante, é transferido para uma bactéria corineforme. Após recombinação homóloga de uma ocorrência "cross-over", a cepa resultante contém pelo menos duas cópias do respecti- 20 vo gene ou alelo.

Em uma outra forma de concretização, que é descrita na WO 03/040373 e US-2003-0219881-A1, uma ou várias cópia(s) do gene interes- sante é(são) introduzida(s) por meio de pelo menos duas ocorrências de re- combinação em um local desejado do cromossoma de C. glutamicum. Dessa 25 maneira, por exemplo, uma cópia do alelo IysC, que codifica uma L-Iisina de aspartato cinase insensível, é incorporada no gene gluB de C. glutamicum.

Em uma outra forma de concretização, que é descrita na WO 03/014330 e US 2004-0043458-A1, pelo menos uma outra cópia, preferivel- mente em disposição tandem em relação ao gene ou alelo já presente, do 30 gene interessante, é incorporada por meio de pelo menos duas ocorrências de recombinação, no local natural. Dessa maneira, por exemplo, obtém-se uma duplicação tandem de um alelo lysCFBR no local do gene IysC natural. Um outro método para a obtenção de uma superexpressão, con- siste em ligar o gene ou alelo correspondente de maneira funcional (operably linked) com um promotor ou um cassete de expressão. Promotores adequa- dos para o Corynebacterium glutamicum são descritos, por exemplo, no arti- 5 go da sinopse de Patek e colaboradores (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003). Da mesma maneira, é possível utilizar as variantes do pro- motor dapA descritas por Vasicova e colaboradores (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por exemplo, do promotor A25. Além disso, é pos- sível utilizar o promotor gap de Corynebacterium glutamicum (EP 06007373). 10 Finalmente, é possível utilizar os promotores T3, T7, SP6, M13, lac, tac e trc suficientemente conhecidos, descritos por Amann e colaboradores (Gene 69(2), 301-315 (1988)) e Amann e Brosius (Gene 40 (2-3) 183-190 (1985)). Um tal promotor pode ser introduzido, por exemplo, a montante do alelo rei, tipicamente no intervalo de aproximadamente 1 - 500 nucleotídeos do códon 15 de partida, de uma bactéria corineforme recombinante, a qual codifica uma proteína, que ao invés do aminoácido L-prolina naturalmente presente na posição 38, contém um outro aminoácido proteinogênico. Naturalmente, um tal promotor também pode ser introduzido a montante da região de codifica- ção do alelo rei de um mutante de acordo com a invenção. Além disso, é 20 possível, ligar um polinucleotídeos isolado de acordo com a invenção, que codifica uma variante da pirofosfatocinase GTP de acordo com a invenção, com um promotor e incorporar a unidade de expressão obtida no plasmídeo a ser replicado extracromossomaImente ou no cromossoma de uma bactéria corineforme.

Além disso, a região do promotor e regulação ou o ponto de li-

gação do ribossomo, que se encontra a montante do gene de estrutura, po- de ser mutada. Através de medidas para o prolongamento da durabilidade do mRNA, a expressão também melhora. Além disso, impedindo a degrada- ção da proteina enzimática, a atividade enzimática também é reforçada. Al- 30 ternativamente, além disso, obtém-se uma superexpressão do respectivo gene ou alelo através da modificação da composição do meio e condução da cultura. Através das medidas da superexpressão, a atividade ou concen- tração da proteína correspondente aumenta geralmente em pelo menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % ou 500 %, no máximo, em a 1000 % ou 2000 %, em relação à atividade ou concentração 5 da proteína no microrganismo de partida ou cepa mãe. Por um microrganis- mo de partida ou cepa mãe entende-se um microrganismo, no qual as medi- das da invenção são efetuadas.

A concentração da proteína pode ser determinada por meio da separação do gel da proteína mono e bidimensional e subsequente identifi- cação óptica da concentração de proteína com respectivo software de avali- ação no gel. Um método usual para a preparação dos géis de proteína nas bactérias corineformes e para a identificação das proteína, é o procedimento descrito por Hermann e colaboradores (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). Do mesmo modo, a concentração de proteína pode ser determinada através da hibridização de Western-Blot com um anticorpo específico para a proteína a ser detectada (Sambrook e colaboradores, Molecular cloning: a Iaboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989) e subsequente avaliação óptica com software correspon- dente para determinar a concentração (Lohaus und Meyer (1998) Biospek- trum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999)).

Em conformidade com isso, o objeto da invenção são processos para a superexpressão das pirofosfatocinases GTP de acordo com a inven- ção. Um processo para a superexpressão de acordo com a invenção, con- siste entre outros, no fato, de que o número de cópias de um polinucleotídeo 25 de acordo com a invenção, que codifica uma variante da pirofosfatocinase GTP, na qual, na posição 38 ou na posição correspondente da seqüência de aminoácidos codificada, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, aumenta em pelo menos uma (1) ou mais cópias. Um outro processo de acordo com a invenção, consiste em ligar um promo- 30 tor funcionalmente com o polinucleotídeo.

O objeto da invenção são, além disso, microrganismos, que a- presentam uma maior concentração ou atividade das variantes da pirofosfa- tocinase GTP de acordo com a invenção no interior de suas células.

Adicionalmente, para a melhor produção de L-aminoácidos, po- de ser vantajoso superexprimir vários genes nos mutantes de acordo com a invenção ou cepas recombinantes. Em geral, prefere-se utilizar genes endó- genos.

Por "genes endógenos" ou "seqüência de nucleotídeos endóge- nos" entendem-se os genes ou seqüências de nucleotídeos ou alelos pre- sentes na população de uma espécie.

Dessa maneira, para a preparação de L-Iisina um ou vários dos genes, selecionados do grupo

• um gene dapA que codifica uma sintase de dihidrodipicolinato (DapA, EC n° 4.2.1.52), tal como, por exemplo, o gene dapA do tipo selva- gem de Corynebacterium glutamicum descrito na EP 0.197.335,

• um gene IysA que codifica uma diaminopimelato descarboxila- se (LysA, EC n° 4.1.1.20), tal como, por exemplo, o gene IysA de Coryne-

bacterium glutamicum ATCC13869 descrito na US 6.090.597,

• um gene zwf que codifica uma glicose-6-fosfato desidrogenase (Zwf, EC n° 1.1.1.49), tal como, por exemplo, o gene zwf do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito na JP-A-09224661 e EP-A-

1108790,

• os alelos zwf de Corynebacterium glutamicum descritos na US- 2003-0175911-A1, que codificam uma proteína com atividade de glicose-6- fosfato desidrogenase, na qual, por exemplo, a L-alanina é substituída por L- treonina na posição 243 da seqüência de aminoácidos ou na qual o ácido L-

asparagínico é substituído por L-serina na posição 245,

• um gene pyc que codifica uma piruvato-carboxilase (Pyc, EC n° 6.4.1.1), tal como, por exemplo, o gene pyc do tipo selvagem de Coryne- bacterium glutamicum descrito na DE-A-198 31 609 e EP 1108790,

• o alelo pyc de Corynebacterium glutamicum descrito na EP 1.108.790, que codifica uma proteína com atividade de piruvato-carboxilase,

na qual a L-prolina é substituída por L-serina na posição 458 da seqüência de aminoácidos, • os alelos pyc de Corynebacterium glutamicum descritos na WO 02/31158 e especialmente EP 1325135B1, que codificam proteínas com ati- vidade de piruvato-carboxilase, que portam uma ou várias das trocas de a- minoácidos selecionadas do grupo L-valina na posição 1 substituída por L-

metionina, ácido L-glutâmico na posição 153 substituída por ácido L- asparagínico, L-alanina na posição 182 substituída por L-serina, L-alanina na posição 206 substituída por L-serina, L-histidina na posição 227 substituída por L-arginina, L-alanina na posição 455 substituída por glicina e ácido L- asparagínico na posição 1120 substituída por ácido L-glutâmico,

· um gene IysC que codifica uma aspartato cinase (LysC, EC n°

2.7.2.4), tal como, por exemplo, o gene IysC do tipo selvagem de Coryne- bacterium glutamicum descrito como SEQ ID n°: 281 na EP-A-1108790 (vide também o número de acesso AX120085 e 120365) e aquele descrito como SEQ ID n°: 25 na WO 01/00843 (vide o número de acesso AX063743),

· um alelo lysCFBR que codifica uma variante de aspartato cinase

resistente ao feed-back, especialmente correspondente à tabela 1,

• um gene IysE que codifica uma proteína lisina-export (LysE)1 tal como, por exemplo, o gene IysE do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum descrito na DE-A-195 48 222,

·ο gene aat que codifica uma aspartato-aminotransferase (Aat,

EC n° 2.6.1.1) (o gene aat de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 é descrito, por exemplo, por Kalinowski e colaboradores (Journal of Biotechno- Iogy 104 (1-3), 5-25 (2003); vide também o número de acesso NC_006958). Este é designado ali como gene aspB. Na US 6.004.773, o gene que codifica 25 uma aspartato aminotransferase é designado como aspC. Marienhagen e colaboradores (Journal of Bacteriology 187 (22), 7693-7646 (2005) designam o gene aat como gene aspT)),

• o gene zwal do tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum que codifica a proteína Zwal (US 6.632.644),

podem ser superexprimidos.

Além disso, para a produção de L-Iisina pode ser vantajoso, a- lém do emprego dos alelos do gene rei de acordo com a invenção, eventu- almente com simultânea superexpressão de pelo menos um dos genes sele- cionados do grupo de genes mencionados acima, enfraquecer ou desligar um ou vários dos genes endógenos, selecionados do grupo

• um gene pgi que codifica a glicose-6-fosfato-isomerase (Pgi, EC n° 5.3.1.9), tal como, por exemplo, o gene pgi de Corynebacterium glu- tamicum descrito na US 6.586.214 e US 6.465.238,

• um gene jom que codifica a homosserina-desidrogenase (Hom, EC n° 1.1.1.3), tal como, por exemplo, o gene hom de Corynebacterium glu- tamicum descrito na EP-A-0131171,

· um gene thrB que codifica uma homosserina-cinase (ThrB, EC

n° 2.7.1.39), tal como, por exemplo, o gene thrB de Corynebacterium gluta- micum descrito por Peoples e colaboradores (Molecular Microbiology 2 (1988) : 63-72)) e

• um gene pfkB que codifica uma fosfofruktocinase (PfkB, EC n° 2.7.1.56), tal como, por exemplo, o gene pfkB de Corynebacterium glutami- cum descrito na WO 01/00844 (seqüência n° 57),

• um gene mdh que codifica a malato-desidrogenase (Mdh, EC n° 1.1.1.37), tal como, por exemplo, descrito na WO 02/02778,

• um gene mqo que codifica a oxidoredutase de malato-quinona (Mqo, EC n° 1.1.99.16), tal como, por exemplo, descrito na US 7.094.106 e

PCT /EP2005/057216.

O termo "enfraquecimento" neste contexto, descreve a redução ou desligamento da atividade intracelular de uma ou várias enzimas (proteí- nas) em um microrganismo, que são codificadas pelo DNA correspondente, 25 utilizando, por exemplo, um promotor fraco ou utilizando um gene ou alelo, que codifica uma enzima correspondente com uma baixa atividade ou inati- vando o gene ou enzima (proteína) correspondente e combinando eventual- mente essas medidas.

Através das medidas do enfraquecimento, a atividade ou con- centração da proteína correspondente é geralmente reduzida para 0 a 75 %, 0 a 50 %, 0 a 25 %, 0 a 10 % ou 0 a 5 % da atividade ou concentração da proteína de tipo selvagem ou a atividade ou concentração da proteína no microrganismo de partida.

Como mutações para a produção de um enfraquecimento, to- mam-se em consideração as transições, transversões, inserções e deleções de pelo menos um (1) par de bases ou nucleotídeo. Em função do efeito da troca de aminoácidos provocada pela mutação sobre a atividade enzimática, fala-se de mutações de sentido incorreto ("missense mutations") ou muta- ções sem sentido ("nonsense mutations"). A mutação de sentido incorreto leva a uma troca de um aminoácido dado em uma proteína por um outro, sendo que se trata especialmente de uma troca de aminoácido não conser- vativa. Por esse meio, a capacidade operacional ou atividade da proteína é prejudicada e reduzida para um valor de 0 a 75 %, 0 a 50 %, 0 a 25 %, 0 a % ou 0 a 5 %. A mutação de sentido incorreto leva a um códon de termi- nação na região de codificação do gene e, com isso, a uma interrupção pre- matura da translação. Inserções ou deleções de pelo menos um par de ba- ses em um gene levam a mutações do quadro de leitura ("frame shift mutati- ons"), que levam a que aminoácidos falsos sejam incorporados ou a transla- ção seja prematuramente interrompida. Caso se forme um códon de termi- nação na região de codificação como conseqüência da mutação, então este leva também a uma interrupção prematura da translação. As medidas men- cionadas são preferivelmente efetuadas na parte 5'-terminal da região de codificação, o qual codifica o N-terminal do polipeptídeo. Designando o com- primento total de um polinucleotídeo (medido como número dos L- aminoácidos quimicamente ligados) com 100 %, então - no âmbito da pre- sente invenção - a parte da seqüência de aminoácidos que, calculada a par- tir do aminoácido de partida L-formil-metionina, contém 80 % dos L- aminoácidos seguintes, pertence ao N-terminal do polipeptídeo.

Outras especificações para a produção de tais mutações perten- cem ao estado da técnica e podem ser deduzidas de compêndios conheci- dos da genética e biologia molecular, tais como, por exemplo, do compêndio 30 de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a edição, Georg Thieme Verlag, Stutt- gart, Alemanha, 1995), do de Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlags- gesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou do de Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Outras medidas são des- critas no estado da técnica.

Um método para a redução visada da expressão gênica consiste em pôr o gene a ser enfraquecido sob o controle de um promotor induzível 5 através da adição de quantidades dosadas de IPTG (isopropil-P-D- tiogalactopiranosídeo), tal como, por exemplo, do promotor trc ou do promo- tor tac. Vetores adequados para esse fim são, por exemplo, o vetor de ex- pressão de Escherichia coli pXK99E (WO 0226787; apresentado de acordo com o contrato de Budapest em 31 de julho de 2001 em DH5alfa/pXK99E 10 como DSM14440 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkul- turen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha)) ou pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemanha (1997)), que possibilitam uma expressão dependente de IPTG do gene clonado no Corynebacterium glutamicum.

Este método foi utilizado, por exemplo, na patente WO 0226787

para e expressão regulada do gene deaD através da integração do vetor pXK99EdeaD no genoma de Corynebacterium glutamicum e de Simic e co- laboradores (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) para a expressão regulada do gene glyA através da integração do vetor pK18mobglyA' em Corynebacterium glutamicum.

Um outro método para a redução específica da expressão gêni- ca é a técnica anti-sentido, em que oligodesoxinucleotídeos curtos ou veto- res são levados para as células alvo para a síntese de RNA anti-sentido mais longo. O RNA anti-sentido pode ligar-se ali a fragmentos complementa- 25 res de mRNAs específicos e reduzir sua estabilidade ou bloquear a capaci- dade de translação. O técnico encontra um exemplo disso em Srivastava e colaboradores (Applied Environmental Microbiology 2000 outubro; 66 (10) : 4366-4371).

As bactérias corineformes isoladas obtidas através das medidas da invenção, mostram uma alta separação ou produção do aminoácido de- sejado em um processo de fermentação em comparação com a cepa de par- tida ou cepa mãe utilizada. Por bactérias isoladas entendem-se os mutantes isolados ou produzidos de acordo com a invenção e bactérias recombinantes, especial- mente bactérias corineformes, que contêm um alelo rei, que codifica uma pirofosfatocinase GTP, que contém a troca de aminoácidos descrita na posi- 5 ção 38 da seqüência de aminoácidos.

A capacidade das bactérias isoladas ou do processo de fermen- tação com o emprego das mesmas com respeito a um ou vários dos parâ- metros selecionados do grupo da concentração do produto (produto por vo- lume), do rendimento do produto (produto formado por fonte de carbono gas- 10 ta) e da formação do produto (produto formado por volume e tempo) ou tam- bém de outros parâmetros do processo e combinações dos mesmos, é re- duzida em pelo menos 0,5 %, pelo menos 1 %, pelo menos 1,5 % ou pelo menos 2 % em relação à cepa de partida ou cepa mãe ou o processo de fermentação com o emprego das mesmas.

As bactérias corineformes isoladas de acordo com a invenção,

podem ser cultivadas continuamente - tal como, por exemplo, descrito na PCT/EP2004/008882 - ou descontinuamente no processo em bateladas (cultivo em bateladas ou no fed batch (processo de adição) ou processo re- peated fed batch (processo de bateladas de adição repetidas) com a finali- 20 dade de produzir L-aminoácidos. No compêndio de Chmiel (Bioprozesstech- nik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stutt- gart, 1991)) ou no compêndio de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einri- chtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) está disponível um resumo de natureza geral sobre métodos de cultivo conhecidos.

O meio de cultura ou meio de fermentação a ser utilizado deve

satisfazer, de maneira adequada, às reivindicações das respectivas cepas. Descrições de meios de cultura de diversos microrganismos estão contidas no manual "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Soci- ety for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981). Os termos meio de cultu- 30 ra, meio de fermentação e meio nutriente ou meio podem ser mutuamente trocados.

Como fonte de carbono podem ser utilizados açúcar e carboidra- tos, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, me- laço, soluções contendo sacarose da produção de beterrabas ou cana-de- açúcar, amido, hidrolisado de amido e celulose, óleos e gorduras, tais como, por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e gordura de 5 coco, ácidos graxos, tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linólico, álcoois, tais como, por exemplo, glicerina, metanol e etanol e ácidos orgânicos, tal como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou como mistura.

Como fonte de nitrogênio podem ser utilizados compostos orgâ- 10 nicos contendo nitrogênio, tais como peptonas, extratos de levedura, extrato de carne, extrato de malte, água de fonte de milho, farinha de soja e uréia ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fos- fato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de ni- trogênio podem ser utilizadas individualmente ou como mistura.

Como fonte de fósforo, podem ser utilizados ácido fosfórico, di-

hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico ou os sais con- tendo sódio correspondentes.

Além disso, o meio de cultura deve conter sais, por exemplo, na forma de cloretos ou sulfatos de metais, tais como, por exemplo, sódio, po- 20 tássio, magnésio, cálcio e ferro, tal como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento. Finalmente, adicionalmente às substâncias mencionadas acima, podem ser utilizadas substâncias de crescimento essenciais, tais como aminoácidos, por exem- plo, homosserina e vitaminas, por exemplo, tiamina, biotina ou ácido panto- 25 tênico. Além disso, pré-estágios adequados do respectivo aminoácido po- dem ser acrescentados ao meio de cultura.

As substâncias usadas mencionadas podem ser acrescentadas

à cultura na forma de uma preparação única ou...........................................

(zugefüttert) de maneira adequada durante o cultivo.

Para o controle do pH da cultura são utilizados compostos bási-

cos, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amoníaco ou água amoniacal ou compostos ácidos, tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, de maneira adequada. Em geral, o pH é ajustado para um valor de 6,0 a 9,0, preferivelmente 6,5 a 8. Para o controle do desenvolvimento de espuma po- dem ser utilizados antiespumantes, tal como, por exemplo, éster poliglicólico de ácido graxo. Para a manutenção da estabilidade dos plasmídeos, podem ser acrescentadas substâncias de ação seletiva adequadas ao meio, tais como, por exemplo, antibióticos. Para manter as condições aeróbicas, oxi- gênio ou misturas gasosas contendo oxigênio, tal como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. 0 emprego de líquidos, que são enriquecidos com peróxido de hidrogênio, também é possível. Eventualmente, a fermen- tação é efetuada com superpressão, por exemplo, com uma pressão de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura encontra-se normalmente a 20°C a 45°C e preferivelmente a 25°C a 40°C. Nos processos às bateladas, o cultivo é prosseguido por tanto tempo, a se formar um máximo do aminoácido dese- jado. Este alvo é normalmente obtido dentro de 10 horas a 160 horas. Nos processos contínuos, são possíveis tempos de cultivo mais longos.

Meios de fermentação adequados são descritos, entre outros, na US 6.221.636, na US 5.840.551, na US 5.770.409, na US 5.605.818, na US 5.275.940, na US 4.275.157 e na US 4.224.409.

Métodos para a determinação de L-aminoácidos são conhecidos 20 do estado da técnica. A análise pode ser efetuada, por exemplo, tal como descrito por Spackman e colaboradores (Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190) através de cromatografia de troca de ânions com subsequente deriva- tização da ninidrina ou ela pode ser efetuada por meio de HPLC de fase re- versa, tal como descrito por Lindroth e colaboradores (Analytical Chemistry 25 (1979)51:1167-1174).

O objeto da invenção é, em conformidade com isso, um proces- so para a produção de um L-aminoácido, no qual

a) uma bactéria corineforme isolada fermenta em um meio ade- quado, sendo que a bactéria contém um gene que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, sendo que nas seqüên- cias de aminoácidos do polipeptídeo a L-prolina é substituída na posição 38 ou na posição correspondente por um outro aminoácido proteinogênico, pre- ferivelmente L-leucina e

b) o L-aminoácido acumula no caldo de fermentação ou nas cé- lulas da bactéria corineforme isolada.

A isso segue-se, em geral, a coleta (collecting) do L-aminoácido acumulado no meio nutriente ou no caldo de fermentação e/ou nas células das bactérias, para obter um produto sólido ou líquido.

Por um caldo de fermentação entende-se um meio de fermenta- ção, no qual um microrganismo foi cultivado por um determinado tempo e a uma determinada temperatura. O meio de fermentação ou o meio usado du- 10 rante a fermentação contém/contêm todas as substâncias ou componentes, que assegura um crescimento do microrganismo e uma formação do amino- ácido desejado.

No fim da fermentação, o caldo de fermentação formado contém, em conformidade com isso, a) a biomassa (massa celular) do microrganismo 15 formada em conseqüência do crescimento das células do microrganismo, b) o aminoácido desejado, formado no decorrer da fermentação, c) os subpro- dutos orgânicos formados no decorrer da fermentação e d) os componentes não gastos pela fermentação do/dos meio de fermentação/meios de fermen- tação usados ou das substâncias de aplicação, tais como, por exemplo, vi- 20 taminas, tais como biotina, aminoácidos, como homosserina ou sais, tal co- mo sulfato de magnésio.

Nos subprodutos orgânicos incluem-se substâncias, que são produzidas pelos microrganismos usados na fermentação, eventualmente além dos respectivos L-aminoácidos desejados e eventualmente separados. 25 Nestes incluem-se L-aminoácidos, que perfazem menos do que 30 %, 20 % ou 10 % em comparação com o aminoácido desejado. Nestes incluem-se, além disso, ácidos orgânicos, que portam um a três grupos carboxila, tais como, por exemplo, ácido acético, ácido lático, ácido cítrico, ácido málico ou ácido fumárico. Finalmente, incluem-se também açúcares, tal como, por e- 30 xemplo, trehalose.

Caldos de fermentação típicos adequados para fins industriais têm tipicamente um teor de aminoácido de 30 g/kg a 200 g/kg ou 40 g/kg a 175 g/kg ou 50 g/kg a 150 g/kg. O teor de biomassa (como biomassa seca) importa geralmente em 20 a 50 g/kg.

No caso do aminoácido L-lisina, são conhecidas essencialmente quatro diferentes formas de produção no estado da técnica.

Produtos contendo um grupo L-Iisina compreende soluções alca-

linas, aquosas, concentradas de L-Iisina purificada (EP-B-0534865). Um ou- tro grupo, tal como, por exemplo, descrito na US 6.340.486 e US 6.465.025, compreende concentrados aquosos, ácidos, contendo biomassa de caldos de fermentação contendo L-lisina. O grupo mais conhecido de produtos sóli- 10 dos compreende formas pulverizadas ou cristalinas de L-lisina purificada ou pura, que está tipicamente presente na forma de um sal, tal como, por e- xemplo, monocloridrato de L-lisina. Um outro grupo de formas de produto sólidas é descrito, por exemplo, na EP-B-0533039. A forma de produto ali descrita contém, além da lisina, a maior parte das substâncias de aplicação 15 usadas durante a produção fermentativa e não gasta e eventualmente a bi- omassa do microrganismo usado com uma proporção de >0 % -100 %.

No caso dos aminoácidos L-valina, L-isoleucina, L-prolina, L- triptofano e L-homosserina, conhecem-se no estado da técnica essencial- mente formas de produto, que contêm os respectivos aminoácidos em forma purificada ou pura (> 95 % em peso ou > 98 % em peso).

Em relação às várias formas de produto, conhecem-se os mais diferentes processos, nos quais o L-aminoácido é colhido, isolado ou purifi- cado do caldo de fermentação, para produzir o produto contendo L- aminoácido ou o L-aminoácido purificado.

Para produzir L-aminoácidos puros, sólidos, utilizam-se essenci-

almente métodos da cromatografia de troca de íons, eventualmente com o emprego de carvão ativo e métodos de cristalização. No caso da lisina, ob- tém-se, dessa maneira, a base correspondente ou um sal correspondente, tal como, por exemplo, o monocloridrato (Lys-HCI) ou o sulfato de lisina (Lys2-H2SO4).

No caso da lisina, a EP-B-0534865 descreve um processo para a produção de soluções de caldos de fermentação contendo L-lisina básica, aquosa. No processo ali descrito, a biomassa é separada do caldo de fer- mentação e rejeitada. Por meio de uma base, tal como, por exemplo, hidró- xido de sódio, potássio ou amônio, é ajustado um pH entre 9 a 11. Os com- ponentes minerais (sais inorgânicos) são separados através de cristalização 5 do caldo após a concentração e resfriamento e utilizados como adubo ou rejeitados.

Nos processos para a produção de lisina com o emprego das bactérias de acordo com a invenção, são utilizados também aqueles proces- sos, nos quais são obtidos produtos, que contêm componentes do caldo de fermentação. Esses são especialmente empregados como aditivos de ra- ções animais.

Dependendo das exigências, a biomassa pode ser total ou par- cialmente removida do caldo de fermentação através de métodos de separa- ção, tais como, por exemplo, da centrifugação, da filtração, da decantação 15 ou de uma combinação das mesmas ou ser totalmente deixada nesta. Even- tualmente, a biomassa ou o caldo de fermentação contendo a biomassa é inativada durante um estágio de processo adequado, por exemplo, através de tratamento térmico (aquecimento) ou através da adição de ácido.

Os componentes químicos da biomassa são, entre outros, o in- vólucro celular, por exemplo, o peptidoglicano e o arabinogalactano, a prote- ína ou polipeptídeo, por exemplo, o polipeptídeo pirofosfatocinase GTP, lipí- deos e fosfolipídeos e ácidos nucléicos (DNA e RNA), por exemplo, polinu- cleotídeos contendo a mutação de acordo com a invenção. Como conse- qüência das medidas de inativação e/ou dos outros estágios do processo (por exemplo, acidificação, secagem por atomização, granulação e outros), os ácidos nucléicos estão tipicamente presentes como fragmentos com um comprimento, entre outros, de > 40 - 60 bp, >60-80 bp, > 80- 100 bp, > 100 - 200 bp, > 200 - 300 bp, > 300 - 400 bp, > 400 - 500 bp, > 500 - 750 bp, > 750 - 1000 bp, > 1000 - 1250 bp, > 1250 - 1500 bp, > 1500 - 1750 bp, > 1750 - 2000 bp, > 2000 - 2500 bp, > 2500 - 3000 bp, > 3000 - 4000 bp, > 4000 - 5000 bp.

Em um modo operacional, a biomassa é totalmente ou quase totalmente removida, de maneira que não remanesce nenhum (0 %) ou no máximo, 30 %, no máximo 20 %, no máximo 10 %, no máximo 5 %, no má- ximo 1 % ou no máximo 0,1 % de biomassa no produto produzido. Em um outro modo operacional, a biomassa não é removida ou somente em propor- 5 ções insignificantes, de maneira que todos os (100 %) ou mais do que 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 99,9 % de biomassa remanescem no produto produzido. Em um processo de acordo com a invenção, consequentemente, a biomassa é removida em proporções de > 0 % a < 100 %.

Finalmente, o caldo de fermentação obtido após a fermentação 10 pode ser ajustado para um pH ácido antes ou após a remoção total ou parci- al da biomassa com um ácido inorgânico, tal como, por exemplo, ácido clorí- drico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico ou ácido orgânico, tal como, por e- xemplo, ácido propiônico (GB 1.439.728 ou EP 1.331.220). Do mesmo mo- do, é possível, acidificar o caldo de fermentação com a biomassa totalmente 15 contida (US 6.340.486 ou US 6.465.025). Finalmente, o caldo pode ser esta- bilizado também através da adição de bissulfito de sódio (NaHSO3, GB 1.439.728) ou com um outro sal, por exemplo, sal de amônio, de metal alca- lino ou de metal alcalino-terroso ou ácido sulfuroso.

Sólidos orgânicos ou inorgânicos eventualmente contidos no 20 caldo de fermentação são parcial ou totalmente removidos da separação da biomassa. Os subprodutos orgânicos dissolvidos no caldo de fermentação e os componentes dissolvidos não gastos do meio de fermentação (substân- cias de aplicação) permanecem pelo menos parcialmente (> 0 %), preferi- velmente em pelo menos 25 %, de modo particularmente preferido, em pelo 25 menos 50 % e de modo particularmente preferido, em pelo menos 75 % no produto. Eventualmente, esses também permanecem totalmente (100 %) ou quase totalmente, isto é, em > 95 % ou > 98 % no produto. Neste sentido, o termo "base de caldo de fermentação" significa, que um produto contém pelo menos uma parte dos componentes do caldo de fermentação.

Em seguida, retira-se a água do caldo com métodos conhecidos,

tais como, por exemplo, com auxílio de um evaporador rotativo, evaporador de camada fina, evaporador de película em queda, através de osmose inver- sa ou através de nanofiltração. Em seguida, esse caldo de fermentação con- centrado pode ser processado por métodos de liofilização, de secagem por atomização, de granulação por atomização ou por outros processos, tais como, por exemplo, são descritos na camada fluidizante circulante de acordo 5 com a PCT/EP2004/006655, para formar produtos escoáveis, especialmente para formar um produto finamente dividido ou preferivelmente granulado de grãos grossos. Eventualmente, isola-se um produto desejado do granulado obtido através de peneiração ou separação do pó.

Do mesmo modo, é possível secar diretamente o caldo de fer- mentação, isto é, sem prévia concentração, através de secagem por atomi- zação ou granulação por atomização.

Por "escoável" entendem-se pós, que escorrem de forma desim- pedida de uma série de recipientes de descarga de vidro com aberturas de descarga de diferente tamanho, pelo menos, de um recipiente com a abertu- ra de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Õle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

Com "finamente dividido" entende-se um pó com proporção pre- ponderante (> 50 %) com um tamanho de grão de 20 a 200 pm de diâmetro.

Com "grãos grossos" entende-se um produto com uma propor- ção preponderante (> 50 %) de um tamanho de grão de 200 a 200 pm de diâmetro.

A determinação do tamanho do grão pode ser efetuado com mé- todos da espectroscopia de difração a laser. Os métodos correspondentes são descritos no compêndio para a "Teilchengrõpenmessung in der Labor- praxis" de R. H. Müller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesells- 25 chaft Stuttgart (1996) ou no compêndio "Introduction to Particle Technology" de M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998).

O pó escoável, finamente dividido pode ser novamente converti- do para um produto de grãos grossos, bem escoável, armazenável e am- plamente livre de pó através de processos de compactação ou granulação adequados.

O termo "livre de pó" significa, que o produto contém meramente pequenas proporções (< 5 %) de tamanhos de grãos inferiores a 100 pm de diâmetro.

"Armazenável" no sentido desta invenção, significa um produto, que pode ser armazenado por pelo menos um (1) ano ou mais, preferivel- mente por pelo menos 1,5 anos ou mais, de modo particularmente preferido, por dois (2) anos ou mais em meio seco e refrigerado sem a ocorrência de uma perda essencial (< 5 %) do respectivo aminoácido.

Um outro objeto da invenção é, em conformidade com isso, um processo para a produção de um produto contendo L-aminoácido, preferi- velmente L-lisina ou L-triptofano, preferivelmente um aditivo de ração animal, de caldos de fermentação, caracterizado pelos estágios

a) cultivo e fermentação de uma bactéria corineforme que sepa- ra L-aminoácido, a qual contém pelo menos um alelo rei, que codifica um polipeptídeo com atividade de pirofosfatocinase GTP, que compreende uma seqüência de aminoácidos, na qual na posição 38 ou posição comparável,

está contido um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção de L-prolina, preferivelmente L-leucina, em um meio de fermentação,

b) remoção da biomassa formada durante a fermentação em uma quantidade de 0 a 100 % em peso e

c) secagem do caldo de fermentação obtido de acordo com a) e/ou b), para obter o produto na forma de pó ou granulado desejada,

sendo que eventualmente antes do estágio b) ou c) é acrescentado um ácido selecionado do grupo do ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico. Preferivelmente em seguida ao estágio a) ou b), remove-se a água do caldo de fermentação contendo L-aminoácido (concentração).

Um outro objeto da invenção é um processo para a produção de

um produto contendo sulfato de lisina, que é descrito em suas características na DE 102006016158 e no qual o caldo de fermentação obtido com o em- prego dos microrganismos de acordo com a invenção, a partir do qual a bi- omassa foi eventualmente total ou parcialmente separada, é transformado, 30 em que se efetua um processo, que compreende pelo menos os seguintes estágios:

a) diminuir o pH para 4,0 a 5,2, especialmente 4,9 a 5,1 através da adição de ácido sulfúrico e ajustar uma proporção molar de sulfato/L- Iisina de 0,85 a 1,2, preferivelmente 0,9 a 1,0, de modo particularmente pre- ferido, > 0,9 a < 0,95, no caldo, eventualmente através da adição de um ou- tro ou vários composto(s) contendo sulfato e b) concentrar a mistura obtida dessa maneira através de desi-

dratação e eventualmente granular, sendo que eventualmente antes do es- tágio a) é/são efetuada(s) uma ou as duas das seguintes medidas:

c) medição da proporção molar do sulfato/L-lisina para determi- nar a quantidade necessária de composto(s) contendo sulfato,

d) adição de um composto contendo sulfato selecionado do gru-

po do sulfato de amônio, hidrogenossulfato de amônio e ácido sulfúrico em proporções correspondentes.

Eventualmente, além disso, antes do estágio b) acrescenta-se um sal do ácido sulfuroso, preferivelmente hidrogenossulfato de metal alcali- 15 no, de modo particularmente preferido, hidrogenossulfato de sódio, em uma concentração de 0,01 a 0,5 % em peso, preferivelmente 0,1 a 0,3 % em pe- so, de modo particularmente preferido, de 0,1 a 0,2 % em peso, em relação ao caldo de fermentação.

Como compostos preferidos contendo sulfato no sentido dos es- tágios do processo mencionados acima, são especialmente mencionados o sulfato de amônio e/ou hidrogenossulfato de amônio ou misturas correspon- dente de amoníaco e ácido sulfúrico e o próprio ácido sulfúrico.

A proporção molar de sulfato/L-lisina V é calculada de acordo com a fórmula: V = 2 x [SO42'] I L-lisina]. Essa fórmula considera o fato, de 25 que o ânion SO42' é bivalente. Uma proporção V = 1 significa, que há uma Lys2 (SO4) estequiometricamente composta, enquanto em uma proporção de V = 0,9 é encontrado uma falta de 10 % de sulfato e em uma proporção de V = 1,1, um excesso de 10 % de sulfato.

A vantagem da granulação ou compactação é o uso de substân- cias auxiliares orgânicas ou inorgânicas usuais, ou veículos, tais como ami- do, gelatina, derivados de celulose ou substâncias similares, tais como são normalmente utilizados no processamento de alimentos ou forragem como adesivos, agentes de gelificação ou espessantes, ou de outras substâncias, tais como, por exemplo, ácidos silícicos, silicatos (EP 0743016A) ou esteara- tos.

Além disso, é vantajoso prover a superfície dos granulados obti- 5 dos com óleo, tal como está descrito na WO 04/054381. Como óleos podem ser utilizados óleos minerais, óleos vegetais ou misturas de óleos vegetais. Exemplos de tais óleos são óleo de soja, óleo de oliva, misturas de óleo de soja/lecitina. Da mesma maneira, também são adequados óleos de silicone, polietilenoglicóis ou hidroxietilcelulose. Através do tratamento das superfícies 10 com os óleos mencionados, obtém-se uma alta estabilidade à abrasão do produto e uma redução da proporção de poeira. O teor de óleo no produto importa em 0,02 a 2,0 % em peso, preferivelmente 0,02 a 1,0 % em peso e de modo muito particularmente preferido, 0,2 a 1,0 % em peso, em relação à quantidade total do aditivo de forragem.

É dada preferência aos produtos com uma proporção de > 97 %

em peso, de um tamanho de grão de 100 a 1800 pm ou com uma proporção de > 95 % em peso, de um tamanho de grão de 300 a 1800 pm de diâmetro. A proporção de poeira, isto é, partículas com um tamanho de grão <100 pm encontra-se preferivelmente em > 0 a 1 % em peso, de modo particularmen- te preferido, em no máximo 0,5 % em peso.

Mas alternativamente, o produto também pode ser absorvido em um veículo orgânico ou inorgânico conhecido e usual no processamento de forragens, tal como, por exemplo, ácidos silícicos, silicatos, cereais tritura- dos, farelos, farinhas, amidos, açúcares ou outros e/ou misturado com es- 25 pessantes ou adesivos usuais e estabilizado. Exemplos de aplicação e pro- cessos para este fim são descritos na literatura (Die Mühle + Mischfutterte- chnik 132 (1995) 49, página 817).

Finalmente, o produto também através de processos de revesti- mento ("coating") com formadores de película, tais como, por exemplo, car- bonatos de metais, ácidos silícicos, silicatos, alginatos, estearatos, amidos, borrachas e éteres de celulose, tal como descrito na DE-C-4100920, pode ser levado a um estado, no qual este é estável contra a digestão através dos estômagos de animais, especialmente estômago de ruminantes.

Para ajustar uma concentração de aminoácido desejada no pro- duto, conforme a exigência, o aminoácido correspondente pode ser acres- centado durante o processo na forma de um concentrado ou eventualmente 5 de uma substância amplamente pura ou seu sal, em forma líquida ou sólida. Esses podem ser acrescentados individualmente ou como misturas ao caldo de fermentação obtido ou concentrado ou também durante o processo de secagem ou granulação.

Um outro objeto da invenção é um processo para a produção de um produto sólido contendo lisina, tal como é descrito em suas característi- cas na US 20050220933 e que compreende o processamento do caldo de fermentação obtido com o emprego dos microrganismos de acordo com a invenção, nos seguintes estágios:

a) filtração do caldo de fermentação, preferivelmente com um filtro de membrana, de maneira que se obtém uma lama contendo biomassa

e um filtrado,

b) concentração do filtrado, preferivelmente de modo tal, que se obtém um teor sólido de 48 a 52 % em peso,

c) granulação do concentrado obtido no estágio b), preferivel- mente a uma temperatura de 50°C a 62°C e

d) revestimento do granulado obtido em c) com um ou vários dos agentes de revestimento (coating agent (s)).

Para o revestimento no estágio d), utilizam-se preferivelmente agentes de revestimento, que são selecionados do grupo, consistindo d1) na biomassa obtida no estágio a),

d2) em um composto contendo L-lisina, preferivelmente selecio- nado do grupo do cloridrato de L-lisina ou sulfato de L-lisina,

d3) em uma substância essencialmente livre de L-lisina com teor de L-lisina < 1 % em peso, preferivelmente < 0,5 % em peso, preferivelmente selecionada do grupo amido, carrageenano, agar, ácidos silícicos, silicatos, cereais triturados, farelos e farinhas e

d4) em uma substância hidrorrepelente, preferivelmente selecio- nada do grupo dos óleos, polietilenoglicóis e parafinas líquidas.

No caso da lisina, a proporção dos íons na produção de produ- tos contendo lisina é preferivelmente ajustada de modo tal, que a proporção de íons equivalente de acordo com a seguinte fórmula 2x[S042']+ [CI]-[NH4+HNa'HK+]-2x[Mg2+]-2x[Ca2+]/[L-Lys]

perfaz 0,68 a 0,95, preferivelmente 0,68 a 0,90, tal como descrito por Kushiki e colaboradores na US 20030152633 (nos "[ ]" são indicadas as concentra- ções molares).

No caso da lisina, o produto sólido à base de caldo de fermenta- 10 ção produzido dessa maneira, tem um teor de lisina (como base de lisina) de 10 % em peso a 70 % em peso ou 20 % em peso a 70 % em peso, preferi- velmente 30 % em peso a 70 % em peso e de modo muito particularmente preferido, de 40 a 70 % em peso, em relação à massa seca do produto. Do mesmo modo, são possíveis teores máximos de base de lisina de 71 % em 15 peso, 72 % em peso, 73 % em peso.

No caso de um aminoácido eletricamente neutro, tal como do L- triptofano, o produto sólido à base de caldo de fermentação produzido dessa maneira, tem um teor de aminoácido de pelo menos 5 % em peso, 10 % em peso, 20 % em peso, 30 % em peso e no máximo, 50 % em peso, 60 % em peso, 70 % em peso, 80 % em peso, 90 % em peso ou a 95 % em peso.

O teor de água do produto sólido perfaz a 5 % em peso, preferi- velmente a 4 % em peso e de modo particularmente preferido, menos do que 3 % em peso.

Portanto, o objeto da invenção é também um aditivo de forragem contendo L-lisina à base de caldo de fermentação, o qual apresenta as se- guintes características:

a) um teor de lisina (como base) de, pelo menos, 10 % em peso, a o máximo de 73 % em peso,

b) um teor de água de, no máximo, 5 % em peso e

c) um teor de biomassa correspondendo a pelo menos 0,1 % da

biomassa contida no caldo de fermentação, sendo que a biomassa eventu- almente inativada é formada a partir de bactérias corineformes de acordo com a invenção.

Portanto, o objeto da invenção é também um aditivo de forragem contendo L-triptofano à base de caldo de fermentação, o qual apresenta as seguintes características:

a) um teor de triptofano de, pelo menos, 5 % em peso a o máxi-

mo de 95 % em peso,

b) um teor de água de, no máximo, 5 % em peso e

c) um teor de biomassa correspondendo a pelo menos 0,1 % da biomassa contida no caldo de fermentação, sendo que a biomassa eventu-

almente inativada é formada a partir de bactérias corineformes de acordo com a invenção.

A cepa MH20-22B foi depositada em 28 de outubro de 2004 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) como DSM 16835.

O mutante Corynebacterium glutamicum DM1915 de acordo com

a invenção, que contém L-leucina na posição 38 da seqüência de aminoáci- dos do polipeptídeo rei, foi depositado em 15 de maio de 2006 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, A- lemanha) como DSM 18257.

A presente invenção é detalhadamente ilustrada abaixo, com

base em exemplos de concretização.

Exemplo 1

Mutagênese da cepa DM1797 produtora de L-lisina

A cepa Corynebacterium glutamicum DM 1797 foi utilizada como

cepa de partida para a mutagênese com N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). A cepa DM1797 é um mutante de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 resistente a aminoetilcisteína e depositada sob a designação DSM16833 na Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha).

A cepa DM1797 foi cultivada em 10 ml de LB-BouiIIon (Merck,

Darmstadt, Alemanha), que estavam contidos em um balão Erlenmeyer de 100 ml, por 24 horas a 33°C e 200 rotações por minuto, em um agitador de rotação do tipo Certomat BS-1 (B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemanha). Em seguida, a cultura foi centrifugada, o sedimento re-suspenso em 10 ml de uma solução de NaCI a 0,9 %, a suspensão obtida foi nova- mente centrifugada e o sedimento obtido retomado em 10 ml de solução de 5 NaCI a 0,9 %. 5 ml dessa suspensão de células foram tratados com 400 Mg/ml de MNNG por 15 minutos a 30°C e 200 rotações por minuto em um agitador (vide acima). Em seguida, a preparação de mutagênese foi centrifu- gada e o sedimento retomado em 10 ml de tiossulfato de Na a 2 % foi reto- mado em 0,9 % de tampão de NaCI (pH = 6,0). A seguir, a suspensão de 10 células na proporção de 1:1000, 1:10000 e 1:100000 foi diluída com de solu- ção de NaCI a 0,9 % e alíquotas foram plaqueadas em agar cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alemanha). Dessa maneira, foram isolados aproxima- damente 4500 mutantes.

Exemplo 2

Teste de capacidade dos mutantes da cepa DM1797

nutriente adequado para a produção de lisina e o teor de lisina foi determi- nado no sobrenadante da cultura.

de plaqueamento em agar de cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alema- nha) a 33°C por 24 horas. Partindo dessas culturas em placas de agar, uma pré-cultura cada foi inoculada (10 ml de meio no balão Erlenmeyer de 100 ml). Como meio para a pré-cultura foi utilizado o meio MM. A pré-cultura foi incubada a 33°C e 240 rotações por minuto por 24 horas em um agitador.

Desta pré-cultura foi inoculada uma cultura principal, de maneira que o OD inicial (660 nm) da cultura principal perfez 0,1 OD. Para a cultura principal, utilizou-se igualmente o meio MM.

Os mutantes obtidos no exemplo 1 foram cultivados em um meio

Para isso, inicialmente os clones foram multiplicados por meio

Meio MM

MOPS

glicose (autoclavada separadamente) Sais:

CSL

5 g/l 20 g/l 50 g/l (NH4)2SO4) 25 g/l KH2PO4 0,1 g/l MgSO4 * 7 H2O 1,0 g/l CaCI2 * 2 H2O 10 mg/l FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l MnSO4 * H2O 5,0 mg/l biotina (filtrada estéril) 0,3 mg/l tiamina * HCI (filtrada estéril) 0,2 mg/l CaCO3 25 g/l CSL (Corn Steep Liquor), MOPS (ácido morfolinopropanossulfô-

nico) e a solução salina foram ajustados para pH 7 com água amoniacal e autoclavados. Em seguida, acrescentaram-se as soluções de substrato e vitamina estéreis, bem como o CaCO3 autoclavado seco.

O cultivo foi efetuado em volumes de 10 ml, que estavam conti- dos em um balão Erlenmeyer de 100 ml com defletores. A temperatura per- fez 33°C, o número de rotações, 250 rotações por minuto e a umidade at- mosférica, 80 %.

Após 24 horas, a densidade óptica (OD) com um comprimento de onda de medição de 660 nm, foi determinada com o Biomek 1000 20 (Beckmann Instruments GmbH, Munique, Alemanha). A quantidade de lisina formada foi determinada com um analisador de aminoácido da Eppendorf- BioTronik (Hamburgo, Alemanha) por meio de cromatografia de troca de í- ons e derivatização de pós-coluna com detecção de ninidrina. Um mutante, que se distinguiu por uma alta formação de lisina, foi designado como 25 DM1915.

Tabela 1

cepa OD (660) Iisina-HCI

DM1797 9,3 2,2

DM1915 9,2 2,4

Exemplo 3

Sequenciamento do alelo rei do mutante DM1915

DNA cromossomal foi isolado a partir do clone DM1915 com o método de Eikmanns e colaboradores (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)). Um fragmento de DNA, o qual porta o gene rei ou alelo, foi amplifi- cado com auxílio da reação em cadeia de polimerase. Com base na seqüên- cia do gene rei conhecida para C. glutamicum (seqüência n° 1824 da EP 5 1108790), os seguintes oligonucleotídeos primer foram selecionados para PCR:

rel_XL_A1 (SEQ ID n°: 19);

5' gcqaattcta tcggatggaa catgaccg 3' rel_XL_A2 (SEQ ID n°: 20):

5' gcgaattcat gcggatgcca acaagatc 3'

Os primers apresentados foram sintetizados pela MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha) e a reação PCR foi efetuada de acordo com o méto- do PCR padrão de Innis e colaboradores (PCR Protocols. A Guide to Me- thods and Applications, 1990, Academic Press). Os primers possibilitam a 15 amplificação de um fragmento de DNA com comprimento de aproximada- mente 1,53 kb, o qual porta o gene rei ou alelo. Além disso, os primers con- têm a seqüência para um ponto de interseção da endonuclease de restrição EcoRI, que na sucessão de nucleotídeos representados acima está marcada por meio de sublinhados.

O fragmento de DNA amplificado com comprimento de aproxi-

madamente 1,53 kb, que porta o alelo rei da cepa DM 1915, foi identificado através de eletroforese em um gel de agarose a 0,8 %, isolado do gel e puri- ficado com métodos usuais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

A seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA amplificado 25 ou do produto PCR foi determinada pela Agowa (Berlin, Alemanha) através de sequenciação. A seqüência do produto PCR está representada na SEQ ID n°: 15. A seqüência da região de codificação está adicionalmente repre- sentada na SEQ ID n°: 5. A seqüência de aminoácidos da respectiva proteí- na pirofosfatocinase GTP resultante com auxílio do programa Patentin, está 30 representa na SEQ ID n°: 6.

Na posição 113 da seqüência de nucleotídeos da região de codi- ficação do alelo rei da cepa DM1915, encontra-se a base timina (SEQ ID η°:5). Na posição correspondente do gene de tipo selvagem encontra-se a base citosina (SEQ ID n°: 1).

Na posição 38 da seqüência de aminoácidos da proteína pirofos- fatocinase GTP da cepa DM1915 encontra-se o aminoácido Ieucina (SEQ ID n°: 6). O aminoácido prolina (SEQ ID n°: 2) encontra-se na posição corres- pondente da proteína de tipo selvagem.

O alelo rei, que contém a base timina na posição 113 da região de codificação e em conformidade com isso, codifica uma proteína pirofosfa- tocinase GTP, que na posição 38 da seqüência de aminoácidos contém o 10 aminoácido leucina, é designado, a seguir, como alelo rel_P38L. Na desig- nação "rel_P38L", P representa L-prolina, L representa L-leucina e 38 indica a posição da troca de aminoácidos (vide SEQ ID n°: 2 e 6).

O mutante Corynebacterium glutamicum DM1915, que contém L-leucina na posição 38 da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo rei, foi depositado em 15 de maio de 2006 na Deutschen Sammlung für Mikroorga- nismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemanha) como DSM 18257.

Exemplo 4

Troca do gene de tipo selvagem rei da cepa DM1797 pelo alelo rei P38L 4.1 Construção do vetor de troca pK18mobsacB rei P38L

O fragmento de DNA com comprimento de cerca de 1,53 kb pro- duzido por meio de PCR, descrito no exemplo 3, que porta o alelo rel_P38L, foi incorporado no cromossoma da cepa de C. glutamicum DM1797 descrita no exemplo 1, por meio de mutagênese de troca com auxílio do sistema 25 sacB descrito por Schãfer e colaboradores (Gene, 14, 69-73 (1994)). Esse sistema possibilita a produção ou a seleção de trocas de alelos, que se reali- za através de recombinação homóloga.

Para isso, o fragmento rel_P38L com tamanho de cerca de 1,53 kb, foi dissociado com a endonuclease de restrição EcoRI, identificado atra- vés de eletroforese em um gel de agarose a 0,8 % e em seguida, isolado do gel e purificado com os métodos usuais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qia- gen, Hilden). O vetor de clonagem pK18mobsac mobilizável foi digerido com a enzima de restrição EcoRI e as extremidades foram desfosforiladas com fos- fatase alcalina (fosfatase alcalina, Boehringer Mannheim, Alemanha). O ve- tor preparado dessa maneira foi misturado com o fragmento rel_P38L com 5 cerca de 1,53 kb e a preparação tratada com T4-DNA-ligase (Amersham- Pharmacia, Freiburg, Alemanha).

Em seguida, a cepa de E. coli S17-1 (Simon e colaboradores, Bio/Technology 1: 784-791, 1993) foi transformada com preparação de liga- ção (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, 10 Cold Spring Harbor, Nova York, 1989). A seleção das células portadoras de plasmídeo foi efetuada através do plaqueamento da preparação de trans- formação sobre agar LB (Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, Nova York, 1989), que foi suplementado com 25 mg/l de kanamicina.

O plasmídeo-DNA foi isolado de um transformante com auxílio

do kit QIAprep Spin Miniprep da Qiagen e através da dissociação de restri- ção foi examinado com a enzima Pstl e subsequente eletroforese de gel de agarose. O plasmídeo é mencionado pK18mobsacB_rel_P38L e está repre- sentado na figura 1.

4.2 Troca de alelos

O vetor pK18mobsacB_rel_P38L mencionado no exemplo 4.1, foi transferido através de conjugação, de acordo com um protocolo de Schãfer e colaboradores (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)), para a cepa C. glutamicum DM1797. O vetor não pode replicar independen- 25 temente no DM1797 e só permanece na célula, se ele estiver presente de forma integrada no cromossoma, como conseqüência de uma ocorrência de recombinação. A seleção de transconjugados, isto é, de clones com pK18mobsacB_rel_P38L integrado foi efetuada através de plaqueamento da preparação de conjugação sobre agar LB (Sambrook e colaboradores, Mole- 30 cular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, Nova York, 1989), que foi suplementado com 15 mg/l de kanamicina e 50 mg/l de ácido nalidixínico. Transconjugados resistentes à kanamicina foram riscados em placas de agar LB com 25 mg/l de kanamicina e incubados a 33°C por 24 horas. Para a seleção de mutantes, nos quais, como conseqüência de uma segunda ocorrência de recombinação, realizou-se a excisão do plasmídeo, os clones foram cultivados não seletivamente em meio líquido LB por 30 ho- 5 ras, em seguida, riscados sobre agar LB com 10 % de sucrose e incubados por 16 horas.

O plasmídeo pK18mobsacB_rel_P38L contém, do mesmo modo como o plasmídeo de partida pK18mobsacB, além do gene resistente à ka- namicina, uma cópia do gene sacB que codifica a levan-sucrase de Bacillus 10 subtilis. A expressão induzível através da sucrose leva à formação da levan- sucrase, que catalisa a síntese do produto Ievan tóxico para C. glutamicum. No agar LB com sucrose crescem, portanto, somente aqueles clones, nos quais o pK18mobsacB_rel_P38L integrado excisiu como conseqüência de uma segunda ocorrência de recombinação. Dependendo da condição da 15 segunda ocorrência de recombinação em relação ao local da mutação, a troca de alelos ou a incorporação da mutação é realizada na excisão ou uma cópia original permanece no cromossoma do hospedeiro.

Cerca de 40 a 50 colônias foram testadas para o fenótipo "cres- cimento na presença de sucrose" e "não crescimento na presença de kana- 20 micina". Em quatro colônias, que apresentaram o fenótipo "crescimento na presença de sucrose" e "não crescimento na presença de kanamicina", uma região do gene rei que sobretensiona a mutação P38L, partindo do primer de sequenciamento rel-2 (corresponde à seqüência de nucleotídeos posição 695-714 da seqüência de SEQ ID n°: 3 posicionada a montante do CDS do 25 gene rei), foi sequenciada pela Agowa (Berlin, Alemanha), para comprovar, que a mutação do alelo rel_P38L está presente no cromossoma. Para isso, o primer rel-2 utilizado foi sintetizado pela Agowa: rel-2:

5' ccg tca ttg tgg tca gag at 3'

Dessa maneira, foi identificado um clone, que contém a base

timina na posição 113 da região de codificação do gene rei e assim, possui o alelo rel_P38L. Este clone foi designado como cepa DM1797rel_P38L. Exemplo 6

Comparação da capacidade da cepa DM1797rel P38L com a cepa de parti- da DM1797

O teste de capacidade da cepa de C. glutamicum DM1797rel_P38L obtida no exemplo 5 foi efetuado tal como descrito no e- xemplo 2. O resultado do ensaio está representado na tabela 2.

Tabela 2

cepa OD (660 nm) Iisina-HCI g/l

DM1797 9,3 2,2

DM1797rel_P38L 9,2 2,5

Rápida descrição da figura:

Figura 1: Carta do plasmídeo pK18mobsacB rei P38L.

As abreviações e designações utilizadas têm o seguinte signifi-

cado. No caso da especificação dos números dos pares de bases trata-se de valores aproximados, que são obtidos no âmbito da capacidade de reprodu- ção de medições.

Kan: gene resistente à kanamicina EcoRI: ponto de interseção da enzima de restrição EcoRI Pstl: ponto de interseção da enzima de restrição Pstl rei: alelo rel_P38L sacB: gene sacB

RP4-mob: região mob com a origem de replicação para a transferência (oriT) oriV: origem de replicação V LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Evonik Degussa GmbH

<120> Alelos do gene rei de bactérias corineformes

<130> 200600725

<160> 22

<170> versão PatentIn 3.3

<210> 1

<211> 2283

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS

<222> (1)..(2280)

<223> gene rei de tipo selvagem

<220>

<221> misc_feature

<222> (785) .. (785)

<223> Guanina

<4 00> 1

atg agt ctg gag cgc aac aca caa aaa tct tcc atg ggt gtg cga age Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 15 10 15

atg tca gcc agg ctt gcc cgc age ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr

20 25 30

aac cct gtg ctg gat ccg ctg ctg age ate cac cgg caa ttt cac cca

Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser He His Arg Gln Phe His Pro

40 45

cgc gcc gac gta caa gtg ttg gaa cgt gea tat gac acc gcg gaa cgt

Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60

ctt cat gat ggt gtg att cga aaa tcg ggc gat ccg tat att acc cac

96

144

192

240 Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80

ccg ttg gct gtc gcc acc atc gcc gcg gaa atc ggc atg gac acc acc Pro Leu Ala Val Ala Thr He Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95

acg ctc gtc gca gcc ttg ttg cat gac acg gtg gaa gac acc gac tac Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110

tct ttg gac gat ctc acc cga gat ttc gga gaa gaa gtt gcc agg ctt Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125

gtc gac ggt gtc acc aag ctc gac aaa gtc gca cta ggt gct gcc gcg Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140

gag gcc gaa acg att cgc aaa atg atc gtc gcc atg age cag gac ccc Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160

cgc gtg ctg gtg att aaa gtg gcc gac cgt ttg cac aat atg cgc acc Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175

atg cgg ttc ctg ccg ccg gaa aag caa gct aaa aaa gca cgc caa acc Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190

ctt gaa gtg att gct cct ttg gca cac cgc ctg ggc atg gcc age gtg Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205

aaa tgg gaa ttg gaa gat cta tcc ttt gcc att ttg tac ccc aag aag Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220

tac gaa gag atc gtg cgt ctt gtt gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720 cgg tac ctc aaa gaa att att gat caa gtc acc ggt ggc ttg cgc gaa

Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu

245 250 255

aac aac atc gcg gca gga gtg ctt ggt cga cca aag cac tac tgg tct

5 Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser

260 265 270

atc tat caa aag atg atc gtt cgc ggt cgt gat ttt gac gat att ttt

Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe

275 280 285

gat ctt gtt ggc atc cgc atc ctg gta gac aac gtg aac aac tgt tac

Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr

290 295 300

gcc gcc atc ggt gtc gtg cac tcc ctg ttc aat gct ctg cct ggc cga

Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg

305 310 315 320

ttc aaa gac tat att tca gcc ccg cgc ttc ggt gtc tac caa tcc ctg

Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu

325 330 335

cac acc acc gtg atg gga cct ggc ggt aag cct ctg gaa gtt cag gca

His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala

340 345 350

cgt acc cac gac atg cac tac aac gcc gaa ttc ggc att gca gcg cac

Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His

355 360 365

tgg cga tac aaa gaa acc aaa ggc age cac agt ggc gag caa gcc gaa

Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu

370 375 380

gtg gat caa atg gcg tgg atg cgc caa ctt ctg gac tgg caa aaa gaa

Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu

385 390 395 400

gca gcc gac ccc aac gag ttc ctg gac age ctg cgc tac gat ctg act

Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Thr

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248 405 410 415

tcc aag cag atc ttc gtg ttc aca ccc aaa ggt gat gtg gtc aac ctg

Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn Leu 420 425 430

ccg gtg aac tcc acc ccg gtg gac ttc gcc tac gcg gtg cac acc gaa

Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu

435 440 445

gtg ggg cac cgc tgc atc ggc gcc aaa atc aac ggc aaa ctg gtc gct

Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460

ttg gaa acg aaa ctc aaa tcc ggc gat cgt gtt gaa gtc ttt acc tcc

Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480

aag gac caa aac gct ggc cca agt agg gga tgg caa gaa ttt gtt gtc

Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val

485 490 495

tca cct cgt gca aag gcc aag att cgc cag tgg ttt gcc aag gaa cga

Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510

cgc gaa gaa tac cta gaa gcc gga cgc gat gcg ctg gca gca gtt att Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile

515 520 525

cag cgt ggc ggc ctg cca atg cac cgc ttg ttc acc gcg tcc tcc atg Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540

aag acg gtg gca aca gag ctg cac tac cca gat gta gat gcg ctc tac

Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560 aca gcc atc ggc tcc ggt tct gta tct gcg caa cac gta gtc aac cgt Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg

565 570 575

ctc atg gct atc ttt ggt gac gaa gaa gat gcc gaa gac gca ttg gtt

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776 Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590

gca cgc acc cca ttc age gag ctg gtc aac tcc cgt gcc acc acg gaa Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605

age age acc ggc atc ctg gtc gaa ggc age cca gat gtc atg gct aag Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620

ctc gct aaa tgc tgt atg cca gtg cca gga gat gaa atc ttt gga ttc Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe 625 630 635 640

gtc acc cgt ggt ggc ggt gtc tcc gta cac cga aca gac tgc acg aat Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn 645 650 655

gtg gaa aag ctc aaa gaa gag cca gaa cgc att gtc tcc gtc tcc tgg Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp 660 665 670

gct tcg gaa ggt caa ggt tea gta ttc tct gcc aca ctg cag ctt gaa Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu 675 680 685

gca ctt gat cgc gca ggc ctg ctc ttt gag ctc acc cgc gta atc aac Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile Asn 690 695 700

gaa caa aag gtc tcc gtt acc gca atg aac tcc cat tgc tea gaa gac Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp 705 710 715 720

cgc gta gcc acc gtg cgc ttc acc ttt gcg gtc tct gac acc aag cag Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln 725 730 735

ttg gga tcc ctg atg aca cag ctg cgc aat gcc gaa gga gtg ttt gat Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750

1824

1872

1920

1968

2016

2064

2112

2160

2208

2256 gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc tag Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760

<210> 2 <211> 760

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<4 00> 2

Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser

1 5 10 15

Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30

Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45

Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60

Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80

Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95

Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110

Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125

Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160

Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175

Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190

2283 Leu Glu Val 195

Lys Trp Glu 210

Tyr Glu Glu 225

Arg Tyr Leu Asn Asn Ile

10

Ile Tyr Gln 275

Asp Leu Val 290

Ala Ala Ile 305

Phe Lys Asp His Thr Thr

20

Arg Thr His 355

Trp Arg Tyr 370

Val Asp Gln 385

Ala Ala Asp Ser Lys Gln

30

Pro Val Asn 435

Ile Ala Pro Leu

Leu Glu Asp Leu 215

Ile Val Arg Leu 230

Lys Glu Ile Ile 245

Ala Ala Gly Val 260

Lys Met Ile Val

Gly Ile Arg Ile 295

Gly Val Val His 310

Tyr Ile Ser Ala 325

Val Met Gly Pro 340

Asp Met His Tyr

Lys Glu Thr Lys 375

Met Ala Trp Met 390

Pro Asn Glu Phe 405

Ile Phe Val Phe 420

Ser Thr Pro Val

Ala His Arg Leu Gly 200

Ser Phe Ala Ile Leu 220

Val Ala Asp Arg Ala 235

Asp Gln Val Thr Gly 250

Leu Gly Arg Pro Lys 265

Arg Gly Arg Asp Phe 280

Leu Val Asp Asn Val 300

Ser Leu Phe Asn Ala 315

Pro Arg Phe Gly Val 330

Gly Gly Lys Pro Leu 345

Asn Ala Glu Phe Gly 360

Gly Ser His Ser Gly 380

Arg Gln Leu Leu Asp 395

Leu Asp Ser Leu Arg 410

Thr Pro Lys Gly Asp 425

Asp Phe Ala Tyr Ala 440

Met Ala Ser Val

205

Tyr Pro Lys Lys

Pro Ser Arg Asp 240

Gly Leu Arg Glu 255

His Tyr Trp Ser 270

Asp Asp Ile Phe 285

Asn Asn Cys Tyr

Leu Pro Gly Arg 320

Tyr Gln Ser Leu 335

Glu Val Gln Ala 350

Ile Ala Ala His 365

Glu Gln Ala Glu

Trp Gln Lys Glu 400

Tyr Asp Leu Thr 415

Val Val Asn Leu 430

Val His Thr Glu 445 Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460

Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480

Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val

485 490 495

Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510

Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525

Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540

Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560

Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg

565 570 575

Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590

Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605

Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620

Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe 625 630 635 640

Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn

645 650 655

Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp 660 665 670

Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu 675 680 685

Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile Asn 690 695 700 Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp

Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln

Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly

<210> 3

<211> 3800

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS

<222> (751) . . (3033)

<220>

<222> (1535)..(1535)

<223> Guanina

<4 00> 3

aggcgcaact gaagaacaat tgtgggctga agtcccatca attccactag cagcgcaacc 60

ccgagtgttt gtgatagatc gcacagtcgg taacgttgtt gttaatacag acctagccgg 120

tatcggatgg aacatgaccg ttggtccaga agtgaggaat aagtagtgag cgaacaagct 180

ctaagcacct tcgacagggc acgtgaggcc ctggacaaga aaacccgata tgtgcaggat 240

ttcccagaaa agggtgtgct ttttgaagac ctcaccccgg tgttgggcga tgcagaatca 300

tttgtggccg tggtggacgc catggctgaa gctgcagaaa aactgaatgc agaaatcatc 360

ggtggcttgg atgcgcgagg attcctcctc ggatctgctg tcgcttacaa actcggccta 420

ggtgtgctgg ctatccgcaa gaagggaaag ctccccccac ctgtggtgac ccaggagtat 480

gaacttgaat acggcactgc agcactcgag ctgcccagtg aaggaatcga cattgctggt 540

aaaaacatcg ttttgatcga cgatgtgctg gcaaccggcg gcaccttggg cgctgcacgt 600

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Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln I 5

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720

774

822

870

918

966

1014

1062

1110

1158

1206

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Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys

170 175 180

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Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala 185 190 195 200

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205 210 215

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gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac cgg tac ctc aaa gaa att att gat

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Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu

250 255 260

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Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg 265 270 275 280

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Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu

285 290 295

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Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro 315 320 325

1302

1350

1398

1446

1494

1542

1590

1638

1686

1734 10

cgc ttc ggt gtc tac caa tcc ctg cac acc acc gtg atg gga cct ggc Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly 330 335 34 0

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1782

1830

1878

1926

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2022

2070

2118

2166

2214

2262 490 495 500

cgc cag tgg ttt gcc aag gaa cga cgc gaa gaa tac cta gaa gcc gga

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505 510 515 520

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Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His

525 530 535

cgc ttg ttc acc gcg tcc tcc atg aag acg gtg gca aca gag ctg cac

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tct gcg caa cac gta gtc aac cgt ctc atg gct atc ttt ggt gac gaa

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585 590 595 600

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2310

2358

2406

2454

2502

2550

2598

2646

2694

2742

2790 Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val 665 670 675 680

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ttt gcg gtc tct gac acc aag cag ttg gga tcc ctg atg aca cag ctg Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu 730 735 740

cgc aat gcc gaa gga gtg ttt gat gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 745 750 755 760

tag aggcctttag attgtgaaaa agccttgggc ttcaaccacc gtgtgttgac

acggttttgg ggttggattt aacgctggaa attttactgc aatgaacgct ggaaagcagt agcgaaggtc aaaccagcgc tgaggacgcc aacgatgcca gtaataacga cgacgtaatc caaaatggtg tcagagtcaa tgtcagaaga tccgttggtg ctaccgtttc ttcttctacg gtgtcagcca cgtacacaac ctgtgctggt gcgacttctt cagcctgtgc aggaacggag atggaggttg ctgccattgc agcagctgtg ccgagtgcga cgaggggagt acgagaaaat agetteattg ctaaacccct taggtttaaa tattegaata cgaaagttac tttatgtgca ctttcaccat tgtgcaacta tatgtgcagg tcaaagctga tattttgcta agaaaagtgc aaagcgattc gagctgacgc gcagcccata tcgtcaaaaa atcctttgtg aatggtgatt cacaaaggat tagtcgcgta aggcggaaat tacttcagga aggaatccag cttggtactg aaggttaaaa tggtggttag tgcaccgatg actgctgtga tgatcttgat ccagttttcg atgttgtcag tgtcggaaga accgctggaa ggctcttcgc tggacgggtc ttcgttgaaa tcaaagttaa cgtaaacttc tgcttcaacg cctgcttcgt tcttggcaat gatettt <210> 4

<211> 760

2838

2886

2934

2982

3030

3083

3143

3203

3263

3323

3383

3443

3503

3563

3623

3683

3743

3800 <212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<4 00> 4

Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 1 5 10 15

Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30

Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45

Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60

Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80

Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95

Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110

Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125

Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160

Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175

Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190

Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205

Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220

Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235

Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg 245 250 255

Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp 260 265 270

Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile 275 280 285

Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys 290 295 300

Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly 305 310 315

Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser 325 330 335

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Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala 355 360 365

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Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys 385 390 395

Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu 405 410 415

Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn 420 425 430

Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr 435 440 445

Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val 450 455 460

Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr 465 470 475

Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val

240

Glu

Ser

Phe

Tyr

Arg

320

Leu

Ala

His

Glu

400

Thr

Leu

Glu

Ala

Ser

480

Val 485 490 495

Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys He Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu 500 505 510

Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val 515 520 525

Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser 530 535 540

Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu 545 550 555

Thr Ala He Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn

565 570 575

Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu 580 585 590

Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr 595 600 605

Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala 610 615 620

Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly 625 630 635

Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr

645 650 655

Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser 660 665 670

Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu 675 680 685

Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile 690 695 700

Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu 705 710 715

Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys

725 730 735

Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe

Arg

Ile

Met

Tyr

560

Arg

Val

Glu

Lys

Phe

640

Asn

Trp

Glu

Asn

Asp

720

Gln

Asp 740 745 750

Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760

<210> 5

<211> 2283

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (2280)

<223> alelo rei rei <220>

<221> mutação

<222> (113)..(113)

<223> C -> transição T <220>

<221> misc_feature

<222> (785)..(785)

<223> Guanina

<4 00> 5

atg agt ctg gag cgc aac aca caa aaa tct tcc atg ggt gtg cga age 48

Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 15 10 15

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50 55 60 ctt cat gat ggt gtg att cga aaa tcg ggc gat ccg tat att acc cac Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80

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85 90 95

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165 170 175

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210 215 220

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240

288

336

384

432

480

528

57 6

624

672

720 225 230 235 240

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cgt acc cac gac atg cac tac aac gcc gaa ttc ggc att gca gcg cac Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His 355 360 365

tgg cga tac aaa gaa acc aaa ggc age cac agt ggc gag caa gcc gaa Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu 370 375 380

gtg gat caa atg gcg tgg atg cgc caa ctt ctg gac tgg caa aaa gaa Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu 385 390 395 400

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768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

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405 410 415

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420 425 430

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met

530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

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1776

1824

1872

1920

1968

2016

2064

2112

2160

2208

2256 740 745 750

gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc tag

Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760

<210> 6

<211> 760

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<4 00> 6

Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 15 10 15

Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30

Asn Pro Val Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45

Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60

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85 90 95

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Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160

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165 170 175

Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr

2283 180 185 190

Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205

Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220

Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240

Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255

Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270

Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285

Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr 290 295 300

Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg 305 310 315 320

Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu 325 330 335

His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala 340 345 350

Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His 355 360 365

Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu 370 375 380

Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu 385 390 395 400

Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Thr 405 410 415

Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn Leu 420 425 430

Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu 435 440 445

Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val 450 455 460

Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr 465 470 475

Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val 485 490 495

Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu 500 505 510

Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val 515 520 525

Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser 530 535 540

Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu 545 550 555

Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn 565 570 575

Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu 580 585 590

Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr 595 600 605

Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala 610 615 620

Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly 625 630 635

Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr 645 650 655

Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser 660 665 670

Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu 675 680 685

Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile

Ala

Ser

480

Val

Arg

Ile

Met

Tyr

560

Arg

Val

Glu

Lys

Phe

640

Asn

Trp

Glu

Asn 690 695 700

Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp 7 05 710 715 720

Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln 725 730 735

Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750

Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760

<210> 7

<211> 3800

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (751) .. (3033)

<223> alelo rei

<220>

<221> mutation

<222> (863)..(863)

<223> C -> transição T

<220>

<221> misc_feature

<222> (1535) .. (1535)

<223> Guanina

<400> 7

aggcgcaact gaagaacaat tgtgggctga agtcccatca attccactag cagcgcaacc ccgagtgttt gtgatagatc gcacagtcgg taacgttgtt gttaatacag acctagccgg tatcggatgg aacatgaccg ttggtccaga agtgaggaat aagtagtgag cgaacaagct 30 ctaagcacct tcgacagggc acgtgaggcc ctggacaaga aaacccgata tgtgcaggat ttcccagaaa agggtgtgct ttttgaagac ctcaccccgg tgttgggcga tgcagaatca tttgtggccg tggtggacgc catggctgaa gctgcagaaa aactgaatgc agaaatcatc

60

120

180

240

300

360 ggtggcttgg atgcgcgagg attcctcctc ggatctgctg tcgcttacaa actcggccta ggtgtgctgg ctatccgcaa gaagggaaag ctccccccac ctgtggtgac ccaggagtat gaacttgaat acggcactgc agcactcgag ctgcccagtg aaggaatcga cattgctggt aaaaacatcg ttttgatcga cgatgtgctg gcaaccggcg gcaccttggg cgctgcacgt aaactaattg aatcgtgtga cggacatgtt tccggatatg ttcttgccat tgaggtccca ggcctcggcg gtagggataa tcttggtgat aggcccgtca ttgtggtcag agatcctcag tagaaggatc gaaagaaagg cggcaggaaa atg agt ctg gag cgc aac aca caa Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln I 5

IU aaa tct tcc atg ggt gtg cga age atg tea gcc agg ctt gcc cgc age Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser 15 20

ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac cct gtg ctg gat ctg ctg ctg Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro Val Leu Asp Leu Leu Leu 25 30 35 40

ttc gga gaa gaa gtt gcc agg ctt gtc gac ggt gtc acc aag ctc gac Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp

420

480

540

600

660

720

774

822

870

918

966

1014

1062

1110

1158 125 130 135

aaa gtc gca cta ggt gct gcc gcg gag gcc gaa acg att cgc aaa atg

Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met

140 145 150

atc gtc gcc atg age cag gac ccc cgc gtg ctg gtg att aaa gtg gcc

Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala

155 160 165

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Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys

170 175 180

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Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala

185 190 195 200

cac cgc ctg ggc atg gcc age gtg aaa tgg gaa ttg gaa gat cta tcc

His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser

205 210 215

ttt gcc att ttg tac ccc aag aag tac gaa gag atc gtg cgt ctt gtt

Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val

220 225 230

gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac cgg tac ctc aaa gaa att att gat Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp

235 240 245 caa gtc acc ggt ggc ttg cgc gaa aac aac atc gcg gca gga gtg ctt Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu

250 255 260

ggt cga cca aag cac tac tgg tct atc tat caa aag atg atc gtt cgc

Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg

265 270 275 280

ggt cgt gat ttt gac gat att ttt gat ctt gtt ggc atc cgc atc ctg

Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu

285 290 295

gta gac aac gtg aac aac tgt tac gcc gcc atc ggt gtc gtg cac tcc

1206

1254

1302

1350

1398

1446

1494

1542

1590

1638

1686 Val Asp Asn Val 300

ctg ttc aat gct Leu Phe Asn Ala 315

cgc ttc ggt gtc Arg Phe Gly Val 330

ggt aag cct ctg Gly Lys Pro Leu 345

gcc gaa ttc ggc Ala Glu Phe Gly

age cac agt ggc Ser His Ser Gly 380

caa ctt ctg gac Gln Leu Leu Asp 395

gac age ctg cgc Asp Ser Leu Arg 410

ccc aaa ggt gat Pro Lys Gly Asp 425

ttc gcc tac gcg Phe Ala Tyr Ala

aaa atc aac ggc Lys Ile Asn Gly 460

Asn Asn Cys Tyr Ala Ala 305

ctg cct ggc cga ttc aaa Leu Pro Gly Arg Phe Lys 320

tac caa tcc ctg cac acc Tyr Gln Ser Leu His Thr 335

gaa gtt cag gca cgt acc Glu Val Gln Ala Arg Thr 350

att gca gcg cac tgg cga Ile Ala Ala His Trp Arg 365 370

gag caa gcc gaa gtg gat Glu Gln Ala Glu Val Asp 385

tgg caa aaa gaa gca gcc Trp Gln Lys Glu Ala Ala 400

tac gat ctg act tcc aag Tyr Asp Leu Thr Ser Lys 415

gtg gtc aac ctg ccg gtg Val Val Asn Leu Pro Val 430

gtg cac acc gaa gtg ggg Val His Thr Glu Val Gly 445 450

aaa ctg gtc gct ttg gaa Lys Leu Val Ala Leu Glu 465

Ile Gly Val Val His Ser 310

gac tat att tea gcc ccg Asp Tyr Ile Ser Ala Pro 325

acc gtg atg gga cct ggc Thr Val Met Gly Pro Gly 340

cac gac atg cac tac aac His Asp Met His Tyr Asn 355 360

tac aaa gaa acc aaa ggc Tyr Lys Glu Thr Lys Gly 375

caa atg gcg tgg atg cgc Gln Met Ala Trp Met Arg 390

gac ccc aac gag ttc ctg Asp Pro Asn Glu Phe Leu 405

cag atc ttc gtg ttc aca Gln Ile Phe Val Phe Thr 420

aac tcc acc ccg gtg gac Asn Ser Thr Pro Val Asp 435 440

cac cgc tgc atc ggc gcc His Arg Cys Ile Gly Ala 455

acg aaa ctc aaa tcc ggc Thr Lys Leu Lys Ser Gly 470

1734

1782

1830

1878

1926

1974

2022

2070

2118

2166 gat cgt gtt gaa gtc ttt acc tcc aag gac caa aac gct ggc cca agt Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser 475 480 485

agg gga tgg caa gaa ttt gtt gtc tea cct cgt gca aag gcc aag att Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile 490 495 500

cgc cag tgg ttt gcc aag gaa cga cgc gaa gaa tac cta gaa gcc gga Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly 505 510 515 520

cgc gat gcg ctg gca gca gtt att cag cgt ggc ggc ctg cca atg cac Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His 525 530 535

cgc ttg ttc acc gcg tcc tcc atg aag acg gtg gca aca gag ctg cac Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His 540 545 550

tac cca gat gta gat gcg ctc tac aca gcc atc ggc tcc ggt tct gta Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val 555 560 565

tct gcg caa cac gta gtc aac cgt ctc atg gct atc ttt ggt gac gaa Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu 570 575 580

gaa gat gcc gaa gac gca ttg gtt gca cgc acc cca ttc age gag ctg Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu 585 590 595 600

gtc aac tcc cgt gcc acc acg gaa age age acc ggc atc ctg gtc gaa Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu 605 610 615

ggc age cca gat gtc atg gct aag ctc gct aaa tgc tgt atg cca gtg Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val 620 625 630

cca gga gat gaa atc ttt gga ttc gtc acc cgt ggt ggc ggt gtc tcc Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser

2214

2262

2310

2358

2406

2454

2502

2550

2598

2646

2694 635 640 645

gta cac cga aca gac tgc acg aat gtg gaa aag ctc aaa gaa gag cca Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro 650 655 660

gaa cgc att gtc tcc gtc tcc tgg gct tcg gaa ggt caa ggt tea gta Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val 665 670 675 680

tag aggcctttag attgtgaaaa agccttgggc ttcaaccacc gtgtgttgac acggttttgg ggttggattt aacgctggaa attttactgc aatgaacgct ggaaagcagt 25 agcgaaggtc aaaccagcgc tgaggacgcc aacgatgcca gtaataacga cgacgtaatc caaaatggtg tcagagtcaa tgtcagaaga tccgttggtg ctaccgtttc ttcttctacg gtgtcagcca cgtacacaac ctgtgctggt gcgacttctt cagcctgtgc aggaacggag atggaggttg ctgccattgc agcagctgtg ccgagtgcga cgaggggagt acgagaaaat agetteattg ctaaacccct taggtttaaa tattegaata cgaaagttac tttatgtgca 30 ctttcaccat tgtgcaacta tatgtgcagg tcaaagctga tattttgcta agaaaagtgc aaagcgattc gagctgacgc gcagcccata tcgtcaaaaa atcctttgtg aatggtgatt cacaaaggat tagtcgcgta aggcggaaat tacttcagga aggaatccag cttggtactg

2742

2790

2838

2886

2934

2982

3030

3083

3143

3203

3263

3323

3383

3443

3503

3563

3623 aaggttaaaa tggtggttag tgcaccgatg actgctgtga tgatcttgat ccagttttcg

atgttgtcag tgtcggaaga accgctggaa ggctcttcgc tggacgggtc ttcgttgaaa

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<210> 8

<211> 760

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser

1 5 10 15

Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30

Asn Pro Val Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45

Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60

Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80

Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95

Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110

Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125

Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160

Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175

Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190

3683

3743

3800 Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205

Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220

Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240

Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255

Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270

Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285

Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr 290 295 300

Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg 305 310 315 320

Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu 325 330 335

His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala 340 345 350

Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His 355 360 365

Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu 370 375 380

Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu 385 390 395 400

Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Thr 405 410 415

Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn Leu 420 425 430

Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu 435 440 445 Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460

Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480

Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val

485 490 495

Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510

Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525

Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540

Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560

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565 570 575

Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590

Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605

Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620

Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe 625 630 635 640

Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn

645 650 655

Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp 660 665 670

Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu 675 680 685

Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile Asn 690 695 700 Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp 705 710 715 720

Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln 725 730 735

Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750

Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760

<210> 9

<211> 1263

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1263)

<223> gene IysC de tipo selvagem

<4 00> 9

gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

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gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 40 45

gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60

gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80

96

144

192

240 gtc gcc atg gct att

Val Ala Met Ala Ile 85

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Gly Ser Gln Ala Gly 100

att gtt gat gtc act

Ile Val Asp Val Thr 115

aag atc tgc att gtt

Lys Ile Cys Ile Val 130

gat gtc acc acg ttg

Asp Val Thr Thr Leu

145

ttg gca gct gct ttg Leu Ala Ala Ala Leu 165

gac ggt gtg tat acc Asp Gly Val Tyr Thr 180

ctg gaa aag ctc age Leu Glu Lys Leu Ser 195

tcc aag att ttg gtg

Ser Lys Ile Leu Val 210

gtg cca ctt cgc gta Val Pro Leu Arg Val

225

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gag tcc ctt ggc gca gaa Glu Ser Leu Gly Ala Glu 90

gtg ctc acc acc gag cgc Val Leu Thr Thr Glu Arg 105

cca ggt cgt gtg cgt gaa Pro Gly Arg Val Arg Glu 120

gct ggt ttc cag ggt gtt Ala Gly Phe Gln Gly Val 135

ggt cgt ggt ggt tct gac Gly Arg Gly Gly Ser Asp 150 155

aac gct gat gtg tgt gag Asn Ala Asp Val Cys Glu 170

gct gac ccg cgc atc gtt Ala Asp Pro Arg Ile Val 185

ttc gaa gaa atg ctg gaa Phe Glu Glu Met Leu Glu 200

ctg cgc agt gtt gaa tac Leu Arg Ser Val Glu Tyr 215

cgc tcg tct tat agt aat Arg Ser Ser Tyr Ser Asn 230 235

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gcc caa tct ttc acg Ala Gln Ser Phe Thr 95

cac gga aac gca cgc His Gly Asn Ala Arg 110

gca ctc gat gag ggc Ala Leu Asp Glu Gly 125

aat aaa gaa acc cgc Asn Lys Glu Thr Arg 140

acc act gca gtt gcg Thr Thr Ala Val Ala 160

att tac tcg gac gtt Ile Tyr Ser Asp Val 175

cct aat gca cag aag Pro Asn Ala Gln Lys

190

ctt gct gct gtt ggc Leu Ala Ala Val Gly 205

gct cgt gca ttc aat Ala Arg Ala Phe Asn 220

gat ccc ggc act ttg Asp Pro Gly Thr Leu 240

gaa gca gtc ctt acc Glu Ala Val Leu Thr

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768 245 250 255

ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270

tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285

gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300

gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320

cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

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ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365

cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380

att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400

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405 410 415

gca ggc acc gga cgc

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1263 Ala Gly Thr Gly Arg 420

<210> 10 <211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<4 00> 10

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 15 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr 245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg 305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr 325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala 385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr 405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg 420

<210> 11

<211> 117

<212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (117)

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(60)

<223> η is a, c, g, ou t

<4 00> 11

gcc agg ctt gcc cgc age ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac cct 48 Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro 1 5 10 15 gtg ctg gat nnn ctg ctg age atc cac cgg caa ttt cac cca cgc gcc 96 Val Leu Asp Xaa Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala 20 25 30 gac gta caa gtg ttg gaa cgt 117 Asp Val Gln Val Leu Glu Arg 35

<210> 12 <211> 39

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature

<222> (20) .. (20)

<223> The 'Xaa' at location 20 stands for Lys, Asn, Arg, Ser, Thr,

He, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Vai, Gin, His, Leu, Tyr, Trp, Cys, or Phe .

<400> 12

Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro 15 10 15

Val Leu Asp Xaa Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala 10

15

20

25

30

20 25 30 Asp Val Gln Val Leu Glu Arg 35 <210> 13 <211> 117 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)··(117) <4 00> 13 gcc agg Ctt gcc cgc age ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac cct Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro 1 5 10 15 gtg ctg gat ctg ctg ctg age atc cac cgg caa ttt cac cca cgc gcc Val Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala 20 25 30 gac gta caa gtg ttg gaa cgt Asp Val Gln Val Leu Glu Arg 35 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <4 00> 14 Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro 1 5 10 15 Val Leu Asp Leu Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala 20 25 30 Asp Val Gln Val Leu Glu Arg 35 <210> 15 48

96

117 10

15

20

25

30

<211>

<212> <213> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220>

<221> <222> <223> <220>

<221>

<222>

<223>

<220>

<221>

<222>

<400>

gcgaattcta

aacaagctct

tgcaggattt

cagaatcatt

1530

DNA

Corynebacterium glutamicum

misc_feature (I) · ■ (2)

misc_structure (3) . . (8)

ponto de inserção de restrição EcoRI CDS

(639)..(1520)

mutação (751)..(751)

misc_feature (1423)..(1423)

Guanin

misc_structure (1523)..(1528)

ponto de inserção de restrição EcoRI

misc_feature (1529) . . (1530)

15

tcggatggaa catgaccgtt ggtccagaag tgaggaataa gtagtgagcg aagcaccttc gacagggcac gtgaggccct ggacaagaaa acccgatatg cccagaaaag ggtgtgcttt ttgaagacct caccccggtg ttgggcgatg tgtggccgtg gtggacgcca tggctgaagc tgcagaaaaa ctgaatgcag

60

120

180

240 aaatcatcgg tggcttggat gcgcgaggat tcctcctcgg atctgctgtc gcttacaaac tcggcctagg tgtgctggct atccgcaaga agggaaagct ccccccacct gtggtgaccc aggagtatga acttgaatac ggcactgcag cactcgagct gcccagtgaa ggaatcgaca ttgctggtaa aaacatcgtt ttgatcgacg atgtgctggc aaccggcggc accttgggcg ctgcacgtaa actaattgaa tcgtgtgacg gacatgtttc cggatatgtt cttgccattg aggtcccagg cctcggcggt agggataatc ttggtgatag gcccgtcatt gtggtcagag atcctcagta gaaggatcga aagaaaggcg gcaggaaa atg agt ctg gag cgc aac Met Ser Leu Glu Arg Asn I 5

aca caa aaa tct tcc atg ggt gtg cga age atg tea gcc agg ctt gcc Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser Met Ser Ala Arg Leu Ala 15 20

cgc age ctc aca gga aac cgc gtt cgc acc aac cct gtg ctg gat ctg Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr Asn Pro Val Leu Asp Leu 25 30 35

ctg ctg age atc cac cgg caa ttt cac cca cgc gcc gac gta caa gtg Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro Arg Ala Asp Val Gln Val 40 45 50

ttg gaa cgt gca tat gac acc gcg gaa cgt ctt cat gat ggt gtg att Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg Leu His Asp Gly Val Ile 55 60 65 70

cga aaa tcg ggc gat ccg tat att acc cac ccg ttg gct gtc gcc acc Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His Pro Leu Ala Val Ala Thr 75 80 85

atc gcc gcg gaa atc ggc atg gac acc acc acg ctc gtc gca gcc ttg Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr Thr Leu Val Ala Ala Leu 90 95 100

ttg cat gac acg gtg gaa gac acc gac tac tct ttg gac gat ctc acc Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr Ser Leu Asp Asp Leu Thr 105 110 115

cga gat ttc gga gaa gaa gtt gcc agg ctt gtc gac ggt gtc acc aag Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu Val Asp Gly Val Thr Lys

300

360

420

480

540

600

656

704

752

800

848

896

944

992

1040 120 125 130

ctc gac aaa gtc gca cta ggt gct gcc gcg gag gcc gaa acg att cgc Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala Glu Ala Glu Thr Ile Arg 135 140 145 150

aaa atg atc gtc gcc atg age cag gac ccc cgc gtg ctg gtg att aaa Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro Arg Val Leu Val Ile Lys 155 160 165

gtg gcc gac cgt ttg cac aat atg cgc acc atg cgg ttc ctg ccg ccg Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Met Arg Phe Leu Pro Pro 170 175 180

gaa aag caa gct aaa aaa gca cgc caa acc ctt gaa gtg att gct cct Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Val Ile Ala Pro 185 190 195

ttg gca cac cgc ctg ggc atg gcc age gtg aaa tgg gaa ttg gaa gat

Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val Lys Trp Glu Leu Glu Asp 200 205 210

cta tcc ttt gcc att ttg tac ccc aag aag tac gaa gag atc gtg cgt Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys Tyr Glu Glu Ile Val Arg 215 220 225 230

ctt gtt gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac cgg tac ctc aaa gaa att Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp Arg Tyr Leu Lys Glu Ile 235 240 245

att gat caa gtc acc ggt ggc ttg cgc gaa aac aac atc gcg gca gga Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu Asn Asn Ile Ala Ala Gly 250 255 260

gtg ctt ggt cga cca aag cac tac tgg tct atc tat caa aag atg atc Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser Ile Tyr Gln Lys Met Ile 265 270 275

gtt cgc ggt cgt gat ttt gac gat att ttt gat ctt gtt ggc atc cgc Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe Asp Leu Val Gly Ile Arg 280 285 290

atgaattcgc

1088

1136

1184

1232

1280

1328

1376

1424

1472

1520

1530 <210>

<211>

<212>

<213>

<4 00>

Met Ser Leu 1

Met Ser Ala

Asn Pro Val 35

Arg Ala Asp 50

Leu His Asp

65

Pro Leu Ala

Thr Leu Val

Ser Leu Asp 115

Val Asp Gly 130 Glu Ala Glu

145

Arg Val Leu Met Arg Phe Leu Glu Val

195

Lys Trp Glu

16

294

PRT

Corynebacterium

16

Glu Arg Asn Thr 5

Arg Leu Ala Arg

20

Leu Asp Leu Leu

Val Gln Val Leu 55

Gly Val Ile Arg 70

Val Ala Thr Ile 85

Ala Ala Leu Leu 100

Asp Leu Thr Arg

Val Thr Lys Leu 135

Thr Ile Arg Lys 150

Val Ile Lys Val 165

Leu Pro Pro Glu 180

Ile Ala Pro Leu Leu Glu Asp Leu

glutamicum

Gln Lys Ser Ser Met 10

Ser Leu Thr Gly Asn 25

Leu Ser Ile His Arg 40

Glu Arg Ala Tyr Asp 60

Lys Ser Gly Asp Pro 75

Ala Ala Glu Ile Gly

90

His Asp Thr Val Glu 105

Asp Phe Gly Glu Glu 120

Asp Lys Val Ala Leu 140

Met Ile Val Ala Met 155

Ala Asp Arg Leu His 170

Lys Gln Ala Lys Lys 185

Ala His Arg Leu Gly

200

Ser Phe Ala Ile Leu

Gly Val Arg Ser 15

Arg Val Arg Thr 30

Gln Phe His Pro 45

Thr Ala Glu Arg

Tyr Ile Thr His 80

Met Asp Thr Thr 95

Asp Thr Asp Tyr 110

Val Ala Arg Leu 125

Gly Ala Ala Ala

Ser Gln Asp Pro 160

Asn Met Arg Thr 175

Ala Arg Gln Thr 190

Met Ala Ser Val

205

Tyr Pro Lys Lys 210 215 220

Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240

Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255

Asn Asn Ile Ala Ala Gly Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270

Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285

Asp Leu Val Gly Ile Arg 290

<210> 17

<211> 1311

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> CDS

<222> (1) . . (1308)

<223> gene ilvA de tipo selvagem

<4 00> 17

atg agt gaa aca tac gtg tct gag aaa agt cca gga gtg atg gct age

Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser 15 10 15

gga gcg gag ctg att cgt gcc gcc gac att caa acg gcg cag gca cga

Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg

20 25 30

att tcc tcc gtc att gca cca act cca ttg cag tat tgc cct cgt ctt

Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu 35 40 45

tct gag gaa acc gga gcg gaa atc tac ctt aag cgt gag gat ctg cag

Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln 50 55 60

96

144

192 gat gtt cgt tcc tac aag atc cgc ggt gcg ctg aac tct gga gcg cag Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80

ctc acc caa gag cag cgc gat gca ggt atc gtt gcc gca tct gca ggt Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly

85 90 95

aac cat gcc cag ggc gtg gcc tat gtg tgc aag tcc ttg ggc gtt cag Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln 100 105 110

gga cgc atc tat gtt cct gtg cag act cca aag caa aag cgt gac cgc Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg 115 120 125

atc atg gtt cac ggc gga gag ttt gtc tcc ttg gtg gtc act ggc aat Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn 130 135 140

aac ttc gac gaa gca tcg gct gca gcg cat gaa gat gca gag cgc acc Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr 145 150 155 160

ggc gca acg ctg atc gag cct ttc gat gct cgc aac acc gtc atc ggt Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly

165 170 175

cag ggc acc gtg gct gct gag atc ttg tcg cag ctg act tcc atg ggc Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly 180 185 190

aag agt gca gat cac gtg atg gtt cca gtc ggc ggt ggc gga ctt ctt Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu 195 200 205

gca ggt gtg gtc age tac atg gct gat atg gca cct cgc act gcg atc Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile

210 215 220

gtt ggt atc gaa cca gcg gga gca gca tcc atg cag gct gca ttg cac Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720 225

aat ggt gga Asn Gly Gly

gca gca gtc Ala Ala Val

aac cag ggt Asn Gln Gly

275

act gag atg Thr Glu Met 290 gct ggc gcg

Ala Gly Ala

305

ggt tct gtc Gly Ser Val

cgt tat gcg Arg Tyr Ala

cac tac ttc His Tyr Phe

355

ttc ctg gaa Phe Leu Glu 370 tac ctc aag Tyr Leu Lys 385

cac ttg agt

230

cca atc act ttg gag Pro Ile Thr Leu Glu 245

aaa cgt gtc gga gat Lys Arg Val Gly Asp 260

cgc gtg cac atg atg Arg Val His Met Met 280

ctc gat ctt tac caa Leu Asp Leu Tyr Gln

295

ctg tct atc gct ggg Leu Ser Ile Ala Gly 310

gtg gtg tgc atc atc Val Val Cys Ile Ile 325

gaa atc gct gag cgc Glu Ile Ala Glu Arg 340

ttg gtg aac ttc ccg Leu Val Asn Phe Pro 360

gat atc ctg gga ccg Asp Ile Leu Gly Pro 375

cgc aac aac cgt gag Arg Asn Asn Arg Glu 390

gaa gca tea gga ttg

235

act gtt gat ccc ttt Thr Val Asp Pro Phe 250

ctc aac tac acc atc Leu Asn Tyr Thr Ile 265

age gcg acc gag ggc Ser Ala Thr Glu Gly 285

aac gaa ggc atc atc Asn Glu Gly Ile Ile 300

ttg aag gaa atg tcc Leu Lys Glu Met Ser 315

tct ggt ggc aac aac Ser Gly Gly Asn Asn 330

tcc ttg gtg cac cgc Ser Leu Val His Arg 345

caa aag cct ggt cag Gln Lys Pro Gly Gln 365

gat gat gac atc acg Asp Asp Asp Ile Thr 380

acc ggt act gcg ttg Thr Gly Thr Ala Leu 395

gat tct ttg ctg gaa

240

gtg gac ggc 7 68

Val Asp Gly 255

gtg gag aag 816

Val Glu Lys

270

gct gtg tgt 864

Ala Val Cys

gcg gag cct 912

Ala Glu Pro

ttt gca cct 960

Phe Ala Pro 320

gat gtg ctg 1008

Asp Val Leu 335

ggt ttg aag 1056

Gly Leu Lys

350

ttg cgt cac 1104

Leu Arg His

ctg ttt gag 1152

Leu Phe Glu

gtg ggt att 1200

Val Gly Ile 400

cgt atg gag 1248 His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu 405 410 415 gaa tcg gca att gat tcc cgt cgc CtC gag ccg ggc acc CCt gag tac Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr 420 425 430 gaa tac ttg acc taa Glu Tyr Leu Thr 435 <210> 18 <211> 436 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <4 00> 18 Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg 20 25 30 Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu 40 45

Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln 50 55 60

Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80

Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly 85 90 95

Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln 100 105 110

Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg 115 120 125

Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn 130 135 140

Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr 145 150 155 160

Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp Ala Arg Asn Thr Val Ile Gly 165 170 175

Gln Gly Thr Val Ala Ala Glu Ile Leu Ser Gln Leu Thr Ser Met Gly 180 185 190

Lys Ser Ala Asp His Val Met Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu Leu 195 200 205

Ala Gly Val Val Ser Tyr Met Ala Asp Met Ala Pro Arg Thr Ala Ile 210 215 220

Val Gly Ile Glu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Met Gln Ala Ala Leu His 225 230 235 240

Asn Gly Gly Pro Ile Thr Leu Glu Thr Val Asp Pro Phe Val Asp Gly 245 250 255

Ala Ala Val Lys Arg Val Gly Asp Leu Asn Tyr Thr Ile Val Glu Lys 260 265 270

Asn Gln Gly Arg Val His Met Met Ser Ala Thr Glu Gly Ala Val Cys 275 280 285

Thr Glu Met Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Glu Gly Ile Ile Ala Glu Pro 290 295 300

Ala Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro 305 310 315 320

Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu 325 330 335

Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys 340 345 350

His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His 355 360 365

Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu 370 375 380

Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile 385 390 395 400

His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu 405

410

415

Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg 420 Glu Tyr Leu Thr 435 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> Primer rel XL Al <220> <221> misc feature <222> (I)..(2) <220> <221> misc structure <222> (3) . . (8) <223> ponto de inserção de <4 00> 19 gcgaattcta tcggatggaa catgaccg <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer rel_XL_El <220> <221> misc feature <222> (1)..(2) <220> <221> misc structure <222> (3) . . (8) 425

430

28 10

15

20

25

30

<223> ponto de inserção de restrição EcoRI <4 00> 20 gcgaattcat gcggatgcca acaagatc <210> 21 <211> 2283 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(2280) <223> gene rei de tipo selvagem de acordo com a EP 1 108 790 <22 0> <221> misc feature <222> (785)..(785! ) <223> Adenina <4 00> 21 atg agt ctg gag cgc aac aca caa aaa tet tcc atg ggt gtg cga age Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser I 5 10 15 atg tca gcc agg ctt gcc cgc age CtC aca gga aac cgc gtt cgc acc Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30 aac cct gtg ctg gat ccg ctg ctg age ate cac cgg caa ttt cac cca Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Xle His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45 cgc gcc gac gta caa gtg ttg gaa cgt gea tat gac acc gcg gaa cgt Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60 ctt cat gat ggt gtg att cga aaa tcg ggc gat ccg tat att acc cac Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80 ccg ttg gct gtc gcc acc ate gcc gcg gaa ate ggc atg gac acc acc 28

96

144

192

240 Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr

85 90 95 acg ctc gtc gca gcc ttg ttg cat gac acg gtg gaa gac acc gac tac Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr

100 105 110

tct ttg gac gat ctc acc cga gat ttc gga gaa gaa gtt gcc agg ctt Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu

115 120 125 gtc gac ggt gtc acc aag ctc gac aaa gtc gca cta ggt gct gcc gcg Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala

130 135 140

gag gcc gaa acg att cgc aaa atg atc gtc gcc atg age cag gac ccc

Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro

145 150 155 160

cgc gtg ctg gtg att aaa gtg gcc gac cgt ttg cac aat atg cgc acc

Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr

165 170 175

atg cgg ttc ctg ccg ccg gaa aag caa gct aaa aaa gca cgc caa acc

Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr

180 185 190

ctt gaa gtg att gct cct ttg gca cac cgc ctg ggc atg gcc age gtg

Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val

195 200 205

aaa tgg gaa ttg gaa gat cta tcc ttt gcc att ttg tac ccc aag aag

Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys

210 215 220

tac gaa gag atc gtg cgt ctt gtt gcc gac cgc gcg ccc tct aga gac

Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp

225 230 235 240

cgg tac ctc aaa gaa att att gat caa gtc acc ggt ggc ttg cgc gaa

Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu

245 250 255

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768 aac aac atc gcg Asn Asn Ile Ala 260

atc tat caa aag Ile Tyr Gln Lys 275

gat ctt gtt ggc Asp Leu Val Gly 290

gcc gcc atc ggt Ala Ala Ile Gly 305

ttc aaa gac tat Phe Lys Asp Tyr

15

cac acc acc gtg His Thr Thr Val 340

cgt acc cac gac Arg Thr His Asp 355

tgg cga tac aaa Trp Arg Tyr Lys 370

gtg gat caa atg Val Asp Gln Met 385

gca gcc gac ccc Ala Ala Asp Pro

30

tcc aag cag atc Ser Lys Gln Ile

gca gaa gtg ctt ggt cga Ala Glu Val Leu Gly Arg 265

atg atc gtt cgc ggt cgt Met Ile Val Arg Gly Arg 280

atc cgc atc ctg gta gac Ile Arg Ile Leu Val Asp 295

gtc gtg cac tcc ctg ttc Val Val His Ser Leu Phe 310

att tca gcc ccg cgc ttc Ile Ser Ala Pro Arg Phe 325 330

atg gga cct ggc ggt aag Met Gly Pro Gly Gly Lys 345

atg cac tac aac gcc gaa Met His Tyr Asn Ala Glu 360

gaa acc aaa ggc age cac Glu Thr Lys Gly Ser His 375

gcg tgg atg cgc caa ctt Ala Trp Met Arg Gln Leu 390

aac gag ttc ctg gac age Asn Glu Phe Leu Asp Ser 405 410

ttc gtg ttc aca ccc aaa Phe Val Phe Thr Pro Lys

cca aag cac tac tgg tct Pro Lys His Tyr Trp Ser 270

gat ttt gac gat att ttt Asp Phe Asp Asp Ile Phe 285

aac gtg aac aac tgt tac Asn Val Asn Asn Cys Tyr 300

aat gct ctg cct ggc cga Asn Ala Leu Pro Gly Arg 315 320

ggt gtc tac caa tcc ctg Gly Val Tyr Gln Ser Leu 335

cct ctg gaa gtt cag gca Pro Leu Glu Val Gln Ala 350

ttc ggc att gca gcg cac Phe Gly Ile Ala Ala His 365

agt ggc gag caa gcc gaa Ser Gly Glu Gln Ala Glu 380

ctg gac tgg caa aaa gaa Leu Asp Trp Gln Lys Glu 395 400

ctg cgc tac gat ctg act Leu Arg Tyr Asp Leu Thr 415

ggt gat gtg gtc aac ctg Gly Asp Val Val Asn Leu

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296 420 425 430

ccg gtg aac tcc acc ccg gtg gac ttc gcc tac gcg gtg cac acc gaa Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu 435 440 445

gtg ggg cac cgc tgc atc ggc gcc aaa atc aac ggc aaa ctg gtc gct Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460

ttg gaa acg aaa ctc aaa tcc ggc gat cgt gtt gaa gtc ttt acc tcc Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480

aag gac caa aac gct ggc cca agt agg gga tgg caa gaa ttt gtt gtc Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val 485 490 495

tca cct cgt gca aag gcc aag att cgc cag tgg ttt gcc aag gaa cga Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510

cgc gaa gaa tac cta gaa gcc gga cgc gat gcg ctg gca gca gtt att Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525

aag acg gtg gca aca gag ctg cac tac cca gat gta gat gcg ctc tac Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560

aca gcc atc ggc tcc ggt tct gta tct gcg caa cac gta gtc aac cgt Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg 565 570 575

ctc atg gct atc ttt ggt gac gaa gaa gat gcc gaa gac gca ttg gtt Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590

gca cgc acc cca ttc age gag ctg gtc aac tcc cgt gcc acc acg gaa

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824 Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605

age age acc ggc atc ctg gtc gaa ggc age cca gat gtc atg gct aag

Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys

610 615 620

gtc acc cgt ggt ggc ggt gtc tcc gta cac cga aca gac tgc acg aat Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn

645 650 655

gct tcg gaa ggt caa ggt tca gta ttc tct gcc aca ctg cag ctt gaa Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu 675 680 685

gaa caa aag gtc tcc gtt acc gca atg aac tcc cat tgc tca gaa gac Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp 705 710 715 720

cgc gta gcc acc gtg cgc ttc acc ttt gcg gtc tct gac acc aag cag Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln

725 730 735

gtc tac cga gtg acc tcg ggt ggc tag Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760

1872

1920

1968

2016

2064

2112

2160

2208

2256

2283 <210> 22 <211> 760

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 22

Met Ser Leu Glu Arg Asn Thr Gln Lys Ser Ser Met Gly Val Arg Ser 15 10 15

Met Ser Ala Arg Leu Ala Arg Ser Leu Thr Gly Asn Arg Val Arg Thr 20 25 30

Asn Pro Val Leu Asp Pro Leu Leu Ser Ile His Arg Gln Phe His Pro 35 40 45

Arg Ala Asp Val Gln Val Leu Glu Arg Ala Tyr Asp Thr Ala Glu Arg 50 55 60

Leu His Asp Gly Val Ile Arg Lys Ser Gly Asp Pro Tyr Ile Thr His 65 70 75 80

Pro Leu Ala Val Ala Thr Ile Ala Ala Glu Ile Gly Met Asp Thr Thr 85 90 95

Thr Leu Val Ala Ala Leu Leu His Asp Thr Val Glu Asp Thr Asp Tyr 100 105 110

Ser Leu Asp Asp Leu Thr Arg Asp Phe Gly Glu Glu Val Ala Arg Leu 115 120 125

Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Asp Lys Val Ala Leu Gly Ala Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Glu Thr Ile Arg Lys Met Ile Val Ala Met Ser Gln Asp Pro 145 150 155 160

Arg Val Leu Val Ile Lys Val Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr 165 170 175

Met Arg Phe Leu Pro Pro Glu Lys Gln Ala Lys Lys Ala Arg Gln Thr 180 185 190

Leu Glu Val Ile Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Met Ala Ser Val 195 200 205

Lys Trp Glu Leu Glu Asp Leu Ser Phe Ala Ile Leu Tyr Pro Lys Lys 210 215 220

Tyr Glu Glu Ile Val Arg Leu Val Ala Asp Arg Ala Pro Ser Arg Asp 225 230 235 240

Arg Tyr Leu Lys Glu Ile Ile Asp Gln Val Thr Gly Gly Leu Arg Glu 245 250 255

Asn Asn Ile Ala Ala Glu Val Leu Gly Arg Pro Lys His Tyr Trp Ser 260 265 270

Ile Tyr Gln Lys Met Ile Val Arg Gly Arg Asp Phe Asp Asp Ile Phe 275 280 285

Asp Leu Val Gly Ile Arg Ile Leu Val Asp Asn Val Asn Asn Cys Tyr 290 295 300

Ala Ala Ile Gly Val Val His Ser Leu Phe Asn Ala Leu Pro Gly Arg 305 310 315 320

Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ala Pro Arg Phe Gly Val Tyr Gln Ser Leu 325 330 335

His Thr Thr Val Met Gly Pro Gly Gly Lys Pro Leu Glu Val Gln Ala 340 345 350

Arg Thr His Asp Met His Tyr Asn Ala Glu Phe Gly Ile Ala Ala His 355 360 365

Trp Arg Tyr Lys Glu Thr Lys Gly Ser His Ser Gly Glu Gln Ala Glu 370 375 380

Val Asp Gln Met Ala Trp Met Arg Gln Leu Leu Asp Trp Gln Lys Glu 385 390 395 400

Ala Ala Asp Pro Asn Glu Phe Leu Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Leu Thr 405 410 415

Ser Lys Gln Ile Phe Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Val Asn Leu 420 425 430

Pro Val Asn Ser Thr Pro Val Asp Phe Ala Tyr Ala Val His Thr Glu 435 440 445

Val Gly His Arg Cys Ile Gly Ala Lys Ile Asn Gly Lys Leu Val Ala 450 455 460

Leu Glu Thr Lys Leu Lys Ser Gly Asp Arg Val Glu Val Phe Thr Ser 465 470 475 480

Lys Asp Gln Asn Ala Gly Pro Ser Arg Gly Trp Gln Glu Phe Val Val 485 490 495

Ser Pro Arg Ala Lys Ala Lys Ile Arg Gln Trp Phe Ala Lys Glu Arg 500 505 510

Arg Glu Glu Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Asp Ala Leu Ala Ala Val Ile 515 520 525

Gln Arg Gly Gly Leu Pro Met His Arg Leu Phe Thr Ala Ser Ser Met 530 535 540

Lys Thr Val Ala Thr Glu Leu His Tyr Pro Asp Val Asp Ala Leu Tyr 545 550 555 560

Thr Ala Ile Gly Ser Gly Ser Val Ser Ala Gln His Val Val Asn Arg 565 570 575

Leu Met Ala Ile Phe Gly Asp Glu Glu Asp Ala Glu Asp Ala Leu Val 580 585 590

Ala Arg Thr Pro Phe Ser Glu Leu Val Asn Ser Arg Ala Thr Thr Glu 595 600 605

Ser Ser Thr Gly Ile Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Val Met Ala Lys 610 615 620

Leu Ala Lys Cys Cys Met Pro Val Pro Gly Asp Glu Ile Phe Gly Phe 625 630 635 640

Val Thr Arg Gly Gly Gly Val Ser Val His Arg Thr Asp Cys Thr Asn 645 650 655

Val Glu Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ile Val Ser Val Ser Trp

660 665 670

Ala Ser Glu Gly Gln Gly Ser Val Phe Ser Ala Thr Leu Gln Leu Glu

675 680 685 Ala Leu Asp Arg Ala Gly Leu Leu Phe Glu Leu Thr Arg Val Ile Asn

690 695 700

Glu Gln Lys Val Ser Val Thr Ala Met Asn Ser His Cys Ser Glu Asp

705 710 715 720

Arg Val Ala Thr Val Arg Phe Thr Phe Ala Val Ser Asp Thr Lys Gln 725 730 735

Leu Gly Ser Leu Met Thr Gln Leu Arg Asn Ala Glu Gly Val Phe Asp 740 745 750

Val Tyr Arg Val Thr Ser Gly Gly 755 760 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO- ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

dST™* 1 RECIB0 N0 CAS0 DE DEPÓSIT0

Kantstr 2 ORIGINAL, emitido por força da regra

33790 HafIeWestfaIen 'h '

CIONAL DE DEPOSITO identificada

I abaixo

IDENTIFICAÇAO DO MICROORGANISMO

Referência de identificação fornecida Número de acesso fornecido pela pelo DEPOSITANTE: AUTORIDADE INTERNACIONAL DE

DEPÓSITO:

1. DM1915 2. DSM 18257

II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA

O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por: ® uma descrição científica ® designação taxonômica proposta

(marca com um X quando aplicável)

RECIBO E ACEITAÇAO

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 15-05-2006 (data do depósito original)1_

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO

O microorganismo identificado acima (I) foi recebido pela presente Autoridade In- ternacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requeri- mento para conversão)

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO

Nome: DSMZ-DEUTSCHE Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o

SAMMLUNG VON MIK- poder de representação da Autoridade

ROORGAN1SMEN UND Internacional de Depósito ou de oficial(is) ZELLKULTUREN GmbH responsável(is):

Endereço: MascheroderWeg 1b D-38124 Braunschweig

Data: 2006-05-22

1

Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido. FORMATO INTERNACIONAL

Degussa AG Kantstr. 2

33790 Halle/Westfalen

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE

Emitido por força da regra 10.2 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DE- PÓSITO

__identificada abaixo

I. DEPOSITANTE II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANIS¬ MO Nome: Degussa AG Número de acesso fornecido pela Endereço: Kantstr. 2 AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DE¬ 33790 Halle/Westfalen PÓSITO DSM 18257 Data do depósito ou da transferência1: 15-05-2006 III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE A Viabilidade do microorganismo identificado acima (II) foi testado em 04-07-1997 2. Nessa data, o referido microorganismo foi (X )3 viável ( )3 inviável IV. CONDIÇÕES SOB AS QUAIS O TSTE DE VIABILIDADE É CONDUZIDA V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o MIKROORGANISMEN UND ZELLKUL- poder de representação da autoridade TUREN GmbH Internacional de Depósito ou de ofici- Endereço : Mascheroder Weg 1 b al(is) responsável(is) D-38124 Braunschweig Data: 22-05-2006 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência 2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade

mais recente.

3 Marcar com um X o campo aplicável

4 Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos

Formato DSMZ-BP/9 (única página) 0196

Claims

1. Mutantes isolados de bactérias corineformes, os quais contêm um gene, que codifica um polipeptídeo com atividade de pirofosfatocinase GTP1 caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma se- quência de aminoácidos, na qual, na posição 38 ou em uma posição corres- pondente ou comparável, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina.

2. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizados pelo fato de que no caso de bactérias corineformes trata-se de uma bactéria selecionada do grupo Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes e Cory- nebacterium aminogenes.

3. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 2, caracterizados pelo fato de que se trata de Corynebacterium gluta- micum.

4. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 1, 2 ou 3, caracterizados pelo fato de que se trata de bactérias que separam L-aminoácido.

5. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 4, caracterizados pelo fato de que se trata de bactérias que separam L-lisina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano ou L-homosserina.

6. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 1 a 5, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codificado con- tém L-Ieucina na posição 38 ou em uma posição comparável.

7. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 1 a 5, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codificado com- preende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 2, sendo que na posi- ção 38 está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina e sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

8. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 1 a 8, caracterizados pelo fato de que o gene compreende uma se- quência de nucleotídeos, que é idêntica à seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, que é obtenível através de uma reação em cadeia de poli- merase (PCR) com o emprego de DNA obtido de uma bactéria corineforme e com o emprego de um par de primers que consiste em um primeiro primer, compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, selecionados da seqüência de nucleotídeos entre a posição 1 e 750 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7 e em um segundo primer, compreendendo pelo menos 15 nucleotí- deos consecutivos, selecionados de uma seqüência de nucleotídeos com- plementar entre a posição 3800 e 3031 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7.

9. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 1 a 8, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codificado com- preende uma seqüência de aminoácidos com um comprimento correspon- dente a 760 L-aminoácidos.

10. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 1 a 6 ou 8 a 9, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codifi- cado da posição 19 a 57 da seqüência de aminoácidos contém a seqüência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 6.

11.Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 1 a 6 ou 8 a 10, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codi- ficado compreende uma seqüência de aminoácidos, que é pelo menos 90 % idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 6, sendo que o ácido L- glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

12.Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 1 a 6 ou 8 a 10, caracterizados pelo fato de que o gene compreende uma seqüência de nucleotídeos, que é pelo menos 90 % idêntica à seqüên- cia de nucleotídeos da SEQ ID n°: 5, sendo que a adenina está eventual- mente contida na posição 785.

13.Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 6, caracterizados pelo fato de que a proteína codificada compreende uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo a) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°: 6, b) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°: 6 in- clusive de uma ou várias troca(s) de aminoácido(s) conservativos e c) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°: 6 in- clusive de uma ou várias inserções ou deleções de aminoácidos, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

14. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 7, caracterizados pelo fato de que a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 2 contém L-Ieucina na posição 38.

15. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 14, caracterizados pelo fato de que o gene compreende a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID n°: 5 ou SEQ ID n°: 7, sendo que eventualmente a guanina da posição 785 da SEQ ID n°: 5 ou a guanina da posição 1535 da SEQ ID n°: 7 é substituída poradenina.

16. Mutantes de bactérias corineformes, caracterizados pelo fato de que esses são obteníveis pelos seguintes estágios: a) tratamento de uma bactéria corineforme, que possui a capaci- dade de separar aminoácidos, com um agente mutagênico, b) isolamento e multiplicação do mutante produzido em a), c) produção de ácido nucléico do mutante obtido em b), d) produção de uma molécula de ácido nucléico com o emprego da reação em cadeia de polimerase, do ácido nucléico de c) e de um par de primers consistindo em um primeiro primer compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, selecionados da seqüência de nucleotídeos entre a posição 1 e 861 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7 e em um segundo primer compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, selecionados da seqüência de nucleotídeos complementar entre a posição 3800 e 865 da SEQ ID n°: 3 ou 7, e) determinação da seqüência de nucleotídeos da molécula de ácido nucléico obtida em d) e determinação da seqüência de aminoácidos codificada, f) comparação eventual da seqüência de aminoácidos determi- nada em f) com a SEQ ID n°: 6, sendo que o ácido L-glutâmico está eventu- almente contido na posição 262 e g) identificação de um mutante, que contém um polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo, que na posição 38 ou posição comparável con- tém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina, prefe- rivelmente L-leucina.

17. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 16, caracterizados pelo fato de que em seguida ao estágio b) é se- lecionado um mutante, que possui a capacidade de separar pelo menos 0,5% mais L-aminoácido em um meio ou acumular no interior da célula do que a bactéria corineforme utilizada no estágio a) da reivindicação 17.

18. Um polinucleotídeo isolado, que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, que na posição 38 da seqüência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou compará- vel, contém um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina.

19. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que no caso do aminoácido proteinogênico trata- se de L-leucina.

20. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende a se- qüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 2, sendo que na posição 38 da se- 2 quência de aminoácidos está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina e sendo que o ácido L-glutâmico está eventual- mente contido na posição 262.

21. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende uma seqüência de aminoácidos com um comprimento de 760 aminoácidos.

22. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado da posição 19 a 57 da seqüência de aminoácidos contém a seqüência de aminoácidos corres- pondente à posição 19 a 57 da SEQ ID n°: 6.

23. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser idêntico à seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, que é obtenível através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com o emprego de DNA obtido de uma bactéria corine- forme e com o emprego de um par de primers que consiste em um primeiro primer, compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, selecio- nados da seqüência de nucleotídeos entre a posição 1 e 750 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7 e em um segundo primer, compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, selecionados da seqüência de nucleotídeos complementar entre a posição 3800 e 3031 da SEQ ID n°: 3 ou SEQ ID n°: 7.

24.Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de ser hibridizado com a seqüência de nucleotí- deos complementar à SEQ ID n°: 5 em condições restritas.

25.Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende uma seqüência de aminoácidos, que é pelo menos 90 % idêntica à sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID n°: 6, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

26.Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma se- qüência de nucleotídeos, que é pelo menos 90 % idêntica à seqüência de nucleotídeos da SEQ ID n°: 5, sendo que a adenina está eventualmente con- tida na posição 785.

27.Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a proteína codificada compreende uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo a) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID n°: 6, b) seqüência de aminoácidos SEQ ID n°: 6, inclusive de uma ou mais troca(s) de aminoácido(s) conservativas e c) seqüência de aminoácidos de acordo com SEQ ID n°: 6, in- clusive de uma ou mais inserções ou deleções de aminoácidos, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

28. Polinucleotídeo isolado de acordo com uma ou várias das reivindicações 20 ou 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codifi- cado compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID n°: 6, sendo que o ácido L-glutâmico está eventualmente contido na posição 262.

29. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos compreende a SEQ ID n°: 5, sendo que a adenina está eventualmente contida na posição 785.

30. Um polinucleotídeo isolado, que compreende uma molécula de ácido nucléico, que codifica pelo menos um quadro de leitura com uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 17 a 57 da SEQ ID n°: 2, sendo que na posição correspondente à posição 38 da SEQ ID n°: 2, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina.

31. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de codificar pelo menos um quadro de leitura com uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 19 a 57 da SEQ IDn0:6.

32. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos contém uma ou várias das trocas de aminoácidos conservativas, sendo que as trocas de a- minoácidos conservativas não se referem à posição 38.

33. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de conter uma ou várias mutações silenciosas.

34. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos a seqüência de nucleo- tídeos correspondente à posição 805 a 921 da SEQ ID n°: 7.

35. Processo para a produção de uma bactéria corineforme re- combinante, caracterizado pelo fato de que a) um polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 a 29 ou de acordo com a reivindicação 30 a 34 é transferido para uma bacté- ria corineforme, b) o gene pirofosfatocinase GTP presente no cromossoma da bactéria corineforme, que codifica uma seqüência de aminoácidos com L- prolina na posição 38, é trocado pelo polinucleotídeo de a), que codifica uma seqüência de aminoácidos, que possui um outro L-aminoácido proteinogêni- co na posição 38 ou em uma posição comparável e c) a bactéria corineforme obtida de acordo com o estágio a) e b) é multiplicada.

36. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de se utilizar o polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindica- ção 18 a 29.

37. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de se utilizar o polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindica- ção 30 a 34.

38. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que no caso do outro L-aminoácido na posição 38, trata-se de L- leucina.

39. Processo para a produção de um microrganismo recombi- nante, caracterizado pelo fato de que a) um polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 a 29 é transferido para um microrganismo, b) o polinucleotídeo isolado é replicado no microrganismo e c) o microrganismo obtido de acordo com o estágio a) e b) é multiplicado.

40. Um microrganismo recombinante, que contém o polinucleotí- deo isolado de acordo com a reivindicação 18 a 29 ou 30 a 34.

41. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que se trata de uma bactéria corineforme ou de uma bactéria do gênero Escherichia.

42. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que no caso da bactéria corineforme trata-se do gênero Corynebacterium.

43. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que no caso da bactéria do gênero Coryne- bacterium, trata-se da espécie Corynebacterium glutamicum.

44. Um vetor, que contém o polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 a 29 ou 30 a 34.

45. Um microrganismo recombinante, que contém o vetor de a- cordo com a reivindicação 44.

46. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação45, caracterizado pelo fato de que se trata de uma bactéria corineforme ou de uma bactérias do gênero Escherichia.

47. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que no caso da bactéria corineforme, trata-se do gênero Corynebacterium.

48. Microrganismo recombinante de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que no caso da bactéria do gênero Coryne- bacterium, trata-se da espécie Corynebacterium glutamicum.

49. Processo para a superexpressão de uma pirofosfatocinase GTP em um microrganismo, caracterizado pelo fato de se aumentar o núme- ro de cópias de um polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 18 a 29 em um microrganismo em pelo menos uma (1) cópia.

50. Processo para a superexpressão de uma pirofosfatocinase GTP em um microrganismo, caracterizado pelo fato de se ligar um promotor ou um cassete de expressão de forma funcional com um polinucleotídeo, que codifica um polipeptídeo com atividade de pirofosfatocinase GTP, no qual, na posição 38 ou em uma posição comparável da seqüência de ami- noácidos, está contido um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção de L-prolina.

51. Processo para a produção de um L-aminoácido, caracteriza- do pelo fato de que a) uma bactéria corineforme isolada é fermentada em um meio adequado, em que a bactéria contém pelo menos uma cópia de um gene que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática de pirofosfatocinase GTP, sendo que nas seqüências de aminoácidos do polipeptídeo a L-prolina da posição 38 ou de uma posição comparável é substituída por um outro aminoácido proteinogênico e b) o L-aminoácido enriquece no caldo de fermentação ou nas células da bactéria.

52. Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que no caso da bactéria corineforme isolada trata-se de um mu- tante de acordo com a reivindicação 1 a 17. 5

53. Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que no caso da bactéria corineforme isolada trata-se de uma bactéria corineforme recombinante, que contém um polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 19 a 37 ou foi produzida com o emprego des- te.

54. Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de se isolar ou acumular o L-aminoácido.

55. Processo de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de se purificar o L-aminoácido.

56. Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de se isolar ou acumular o L-aminoácido junto com componentes do caldo de fermentação e/ou da biomassa (> 0 a 100 %).

57. Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de a) remover a biomassa formada do caldo de fermentação obtido no estágio b) da reivindicação 51, em uma quantidade de 0 a 100 % e b) produzir a partir do caldo obtido no estágio a) um produto es- sencialmente seco e conformado através de um método selecionado do gru- po granulação, compactação, secagem por atomização e extrusão.

58. Processo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de se acrescentar ao caldo de fermentação antes ou após o estágio a), um ácido selecionado do grupo ácido sulfúrico, ácido clorídrico e ácido fosfórico.

59. Processo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de se remover água do caldo obtido antes ou depois no estágio a).

60. Processo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de se borrifar o produto conformado obtido no ou durante o estágio b) com um óleo.

61. Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de se efetuar os seguintes estágios: a) filtração do caldo de fermentação, preferivelmente com um filtro de membrana, de maneira que seja obtida uma lama contendo biomas- sa e um filtrado, b) concentração do filtrado, preferivelmente de forma tal, que seja obtido um teor sólido de 48 a 52 % em peso, c) granulação do concentrado obtido no estágio b), preferivel- mente a uma temperatura de 50°C a 62°C e d) revestimento do granulado obtido em c) com um ou vários dos agentes de revestimento (coating agent (s)).

62. Aditivo de ração contendo L-Iisina à base de caldo de fer- mentação, o qual apresenta as seguintes características: a) um teor de Iisina (como base) de, pelo menos, 10 % em peso, ao máximo e 73 % em peso, b) um teor de água de, no máximo, 5 % em peso e c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1 % da biomassa contida no caldo de fermentação, sendo que a biomassa eventu- almente inativada é formada de bactérias de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 17 ou 40 a 43 ou 45 a 48.

63. Aditivo de ração contendo L-triptofano à base de caldo de fermentação, que apresenta as seguintes características: a) um teor de triptofano de, pelo menos, 5 % em peso, b) um teor de água de, pelo menos, 5 % em peso e c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1 % da biomassa contida no caldo de fermentação, sendo que a biomassa eventu- almente inativada é formada de bactérias de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 a 17 ou 40 a 43 ou 45 a 48.