BRPI0718561B1 - dispositivo e método para detectar ácidos nucleicos em uma amostra - Google Patents

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Steinmetzer Katrin
Kaiser Thomas
Ullrich Thomas
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Abstract

dispositivo, e, método. um dispositivo compreendendo um substrato rígido, um elemento de cobertura flexível pelo menos parcialmente cobrindo o substrato, uma primeira estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e adaptada para liberar conteúdo de um ou mais células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo as moléculas alvo, uma segunda estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e compreendendo pelo menos um membro de ligação adaptado para capturar as moléculas alvo e para determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade das moléculas alvo, uma rede microfluídica interconectando pelo menos a primeira estrutura e a segunda estrutura, e um membro atuador adaptado para realizar um fluxo de fluido entre a primeira estrutura e a segunda estrutura pela compressão do elemento de cobertura flexível contra o substrato, para seletivamente fechar uma parte da rede microfluídica.

Description

“DISPOSITIVO E MÉTODO PARA DETECTAR ÁCIDOS NUCLEICOS EM UMA AMOSTRA”
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
Este pedido reivindica prioridade para o Pedido U.S. No. 60/951,364, depositado em 23 de julho de 2007 e Pedido U.S. No. 60/856.782, depositado em 6 de novembro de 2006, cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a ensaios, por exemplo, a ensaios para polinucleotídeos.
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido é relacionado com a continuação U.S. do Pedido de Patente Internacional PCT/EP2005/004923, depositado em 6 de maio de 2005, que designa os Estados Unidos e reivindica prioridade para o Pedido de Patente Alemão DE 10 2004 022 263, depositado em 6 de maio de 2004, a continuação U.S. tendo o No. de série US 11/593.021, intitulado Method and Device for the Detection of Molecular Interactions e sendo depositado em 6 de novembro de 2006, cada um destes pedidos sendo por este meio incorporado aqui por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A presença de um patógeno em uma amostra biológica pode ser determinada ensaiando-se a amostra quanto a um polinucleotídeo associado com a presença do patógeno. Bactérias, mofo e vírus são exemplos de patógenos que podem ser determinados com base em um ensaio para polinucleotídeos associados.
A EP 0 637 999 descreve dispositivos para amplificar um polinucleotídeos pré-selecionado em uma amostra, conduzindo-se uma reação de polimerização de polinucleotídeo. Os dispositivos incluem um substrato microfabricado para definir um orifício de entrada de amostra e um sistema de fluxo de mesoscala, que se estende do orifício de entrada. O sistema de fluxo
Petição 870190046911, de 20/05/2019, pág. 14/26 de mesoscala inclui uma câmara de reação de polimerização de polinucleotídeo em comunicação fluida com o orifício de entrada, que é provida com reagentes necessários para polimerização e amplificação de um polinucleotídeo pré-selecionado. Os dispositivos podem ser utilizados para implementar uma reação de cadeia de polimerase (PCR) na câmara de reação (câmara PCR). A câmara PCR é provida com o polinucleotídeo amostra, polimerase, trifosfatos de nucleosídeo, iniciadores e outros reagentes necessários para a reação de cadeia de polimerase, e o dispositivo é provido com meios para termicamente controlar a temperatura do conteúdo da câmara de reação em uma temperatura controlada para deibridizar polinucleotídeo de filamento duplo, para anelar os iniciadores e para polimerizar e ampliar o polinucleotídeo.
Entretanto, pode ser difícil coordenar apropriadamente várias tarefas de dispositivos microfluídicos convencionais.
SUMÁRIO
Pode haver uma necessidade de um dispositivo e um método possibilitando análise de amostra de uma maneira simples.
Em um aspecto, um dispositivo inclui um substrato rígido, um elemento de cobertura flexível pelo menos parcialmente cobrindo o substrato, uma primeira estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e adaptada para liberar conteúdo de uma ou mais células, esporos ou vírus, os conteúdos incluindo as moléculas alvo (pressão reduzida, um tampão seco na estrutura ou câmara ou poço), uma segunda estrutura (que pode diferir da primeira estrutura) formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e incluindo pelo menos um membro de ligação adaptado para capturar as moléculas alvo e para determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade das moléculas alvo, uma rede microfluídica interconectando pelo menos a primeira estrutura e a segunda estrutura e um membro atuador adaptado para realizar um fluxo de fluido entre a primeira estrutura e a segunda estrutura, pelo pressionamento do elemento de cobertura flexível contra o substrato, para seletivamente fechar uma parte da rede microfluídica.
Em outro aspecto, um dispositivo inclui uma estrutura adaptada para acomodar líquidos, em que a estrutura inclui pelo menos um membro de ligação e fica em comunicação fluida com uma rede microfluídica, e uma unidade de controle adaptada para controlar um fluxo de fluido através da rede microfluídica, de tal maneira que as moléculas alvo são capturadas em pelo menos um membro de ligação, adaptada para controlar uma ampliação das moléculas alvo na estrutura e adaptada para controlar a detecção de compostos indicativos da presença e/ou quantidade das moléculas alvo e capturados no pelo menos um membro de ligação.
Em outro aspecto, um método inclui acomodar líquidos em uma estrutura incluindo pelo menos um membro de ligação e ficando em comunicação fluida com uma rede microfluídica, controlar um fluxo de fluido através da rede microfluídica de tal maneira que as moléculas alvo são capturadas em pelo menos um membro de ligação, amplificar as moléculas alvo na estrutura e detectar compostos indicativos da presença e/ou quantidade das moléculas alvo e capturados no pelo menos um membro de ligação.
Em outro aspecto, um dispositivo inclui uma estrutura adaptada para acomodar líquidos, em que a estrutura inclui um primeiro membro de ligação, adaptado para capturar um primeiro composto e inclui um segundo membro de ligação (que pode diferir do primeiro membro de ligação), adaptado para capturar um segundo composto (que pode diferir do primeiro composto), indicativo da presença e/ou quantidade do primeiro composto.
Em outro aspecto, um dispositivo pode ser provido em que uma amostra é guiada, sob o controle de uma unidade de controle, através de um dispositivo microfluídico de tal maneira de modo a realizar uma tarefa de análise predefinida. No dispositivo, um poço central/estrutura central (que pode também se indicado como segundo poço ou segunda estrutura) pode ser provido, que pode realizar diversos ou todos os procedimentos de acoplamento de fase sólida necessários durante a análise. Na estrutura (que pode ser indicada como um poço central) pode ser possível capturar moléculas alvo de uma amostra (para fins de purificação ou separação), para ampliar moléculas alvo (por exemplo, por reação de cadeia de polimerase, PCR) e para realizar um (por exemplo, óptico) procedimento de detecção que permita derivar informação referente à presença/ausência ou mesmo à quantidade de moléculas alvo.
Portanto, um sistema de análise bioquímica poderoso e totalmente automático pode ser provido, que pode permitir deduzir, de uma maneira rápida e precisa e sem a exigência de muito potencial humano, um resultado bioquímico ou médico. Por exemplo, com tal dispositivo pode ser possível detectar ácidos nucleicos associados com uma infecção por HIV em uma amostra de sangue integral de um paciente, em uma maneira qualitativa ou quantitativa.
Em seguida, outras formas de realização exemplares dos dispositivos e métodos serão explicadas. Os compostos sendo detectados no poço central podem ser as moléculas alvo. Para esta finalidade, o poço central pode ser provido com membros de ligação específicos (por exemplo, membros de ligação que diferem de outros membros de ligação necessários para capturar as moléculas alvo). As moléculas alvo podem ser ligadas aos membros de ligação. As moléculas alvo podem ser, por exemplo, ácidos nucleicos originando-se de vírus livres e de vírus associados com célula, tais como HIV incluindo RNA originando-se de vírus livres, RNA originando-se de vírus associados com célula, DNA proviral, DNA viral transcrito inverso (isto é, os “intermediários” da replicação viral) e transcritos derivados de DNA proviral (isto é, moléculas de RNA obtidas por transcrição do genoma de DNA de hospedeiro).
Altemativamente, podem ser providos compostos específicos, tais como compostos repórter, que podem ligar-se, por exemplo, a um produto PCR, a RNA ou a DNA. Em tal cenário, os compostos repórteres podem ser os compostos que são detectados, desse modo permitindo indiretamente deduzir informação referente à presença e/ou quantidade de moléculas alvo de uma amostra.
O pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado para capturar as moléculas alvo. Por exemplo, o pelo menos um membro de ligação pode incluir contas rotuladas capazes de capturar complexos incluindo moléculas alvo, tais como ácidos nucleicos virais totais.
O pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado para capturar compostos indicativos da presença e/ou quantidade das moléculas alvo. Assim, não somente as moléculas alvo individuais separadas podem ser detectadas diretamente, porém é também possível detectar moléculas alvo indiretamente, por exemplo, detectando-se os compostos repórteres capturados em um membro de ligação.
O pelo menos um membro de ligação pode incluir um primeiro membro de ligação adaptado para capturar as moléculas alvo e pode incluir um segundo membro de ligação (que pode diferir do primeiro membro de ligação) adaptado para capturar os compostos repórteres indicativos da presença e/ou quantidade das moléculas alvo. Portanto, duas diferentes espécies de compostos podem ser providas, uma especificamente para capturar as moléculas alvo após lisagem, p. ex., moléculas de captura incluindo uma parte de ligação específica de uma região de um polinucleotídeo alvo e um grupo âncora; a outra para fins de detecção, p. ex., compostos repórteres capazes de formar complexos com o polinucleotídeo alvo, onde a formação de complexos com o polinucleotídeo alvo inibe a captura do composto repórter pelo segundo membro de ligação. Em outras palavras, a captura pode ser funcionalmente desacoplada da detecção. Por exemplo, o primeiro membro de ligação podem ser contas sendo configuradas para ligar complexos incluindo uma molécula de captura e uma molécula alvo, p. ex., pela ligação de um grupo âncora da molécula de captura, enquanto que o segundo membro de ligação pode ser uma superfície do poço central, capaz de capturar compostos repórter. A superfície do poço central sendo o segundo membro de ligação pode incluir um ou mais diferentes moléculas de captura específicas repórteres, cada uma capaz de capturar um composto repórter na superfície.
A estrutura, isto é, o membro central em que os vários procedimentos de acoplamento de fase sólida ocorrem, pode ser um poço. Um “poço” pode ser uma endentação ou um rebaixo formado em um substrato e provendo uma câmara de amostra em que vários procedimentos de análise podem ser realizados. Um tal poço pode ser uma estrutura ou pote cilíndrico tendo um volume da ordem de microlitros ou mililitros.
A rede microfluídica pode incluir um canal ou uma pluralidade de canais interconectados. Um “canal” pode indicar uma estrutura fluídica (por exemplo, uma estrutura essencialmente monodimensional) tendo um comprimento que é significativamente maior do que uma largura e uma altura, desse modo provendo um trajeto ao longo do qual líquidos podem ser transportados. Um único canal pode ser provido ou diversos canais podem ser interconectados para formar um sistema de canais. Tal sistema de canais pode permitir que um líquido escoe de um canal para outro canal em bifurcações de tal sistema. Um ou mais poços podem ser integrados em tal sistema de canais.
Além de uma estrutura como descrito acima, p. ex., a estrutura “central”, a rede microfluídica pode incluir pelo menos uma estrutura adicional. Em outras palavras, além dos canais e do poço central, outros membros microfluídicos podem ser providos, tais como outros canais e/ou outros poços. Portanto, um sistema complexo de poços e canais pode ser provido.
Pelo menos uma estrutura adicional (tal como uma estrutura de lise ou um poço de lise) pode ser adaptada para liberar conteúdo de uma ou mais células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo as moléculas alvo. Assim, uma tal estrutura pode ser indicada como uma câmara de lise em que compostos biológicos tais como células são forçados para liberar seu conteúdo para subsequente análise. Uma câmara de lise pode incluir uma estrutura incluindo agentes bioquímicos realizando tais tarefas para liberar o conteúdo, desse modo provendo uma amostra modificada para ser transportada para o poço central. Para este fim, a câmara de lise pode incluir um reagente de lise, por exemplo, sais caotrópicos ou um reagente incluindo um ou mais detergentes que desintegram as membranas celulares e/ou capsídeos virais. Altemativamente ou em adição, a estrutura adicional, p. ex., a câmara de lise, pode ser adaptada para aquecer a amostra a fim de destruir as membranas celulares e/ou capsídeos virais (p ex., empregando ou incluindo uma unidade de controle de temperatura e/ou unidade de regulação de temperatura como descrito abaixo).
A pelo menos uma estrutura adicional pode também incluir sondas de captura capazes de formar complexos com as moléculas alvo. Portanto, pode ser possível lisar uma amostra na presença de moléculas de captura com grupos âncora.
Pelo menos uma estrutura adicional (tal como um poço incluindo reagentes PCR) pode incluir pelo menos uma substância promovendo ampliação das moléculas alvo. Em outras palavras, um outro poço pode ser provido que inclua agentes bioquímicos necessários para promover a ampliação. Embora os agentes PCR possam ser incluídos na estrutura adicional, o procedimento de ampliação PCR atual pode ser realizado em outra posição, tal como no poço central. Como será explicado abaixo mais detalhadamente, pode ser vantajoso em algumas circunstâncias transportar a amostra do poço central através do poço incluindo o poço de substâncias de ampliação de volta para o poço centra novamente, para evitar perda de material de amostra. As substâncias promovendo a amplificação podem ser substâncias necessárias para PCR (tais como enzima, iniciador, tampão etc.) e são descritas em detalhe abaixo.
A pelo menos uma estrutura adicional pode também ser um poço. Portanto, uma pluralidade de poços conectados pela rede microfluídica pode ser provida. Entretanto, pode também ser possível realizar a lise e/ou prover material de ampliação em outras estruturas que não os poços, por exemplo, em canais.
O dispositivo pode incluir um substrato, sobre o qual e/ou dentro do qual a(s) estrutura(s) podem ser formadas. Portanto, os componentes acomodando fluido do dispositivo podem ser monoliticamente integrados no substrato. Altemativamente, estrutura(s) podem ser formadas em um substrato, por exemplo, impressas ou manchadas. Exemplos de materiais de um substrato rígido que pode apropriadamente cooperar com um elemento de cobertura flexível são policarbonato, polipropileno, PET, PMMA, polietileno, vidro acrílico, PU, PEEK, PVC, vidro e similares.
Particularmente, o substrato pode ser rígido, permitindo que coopere com um elemento de cobertura flexível, pelo menos parcialmente cobrindo o substrato em uma maneira muito eficiente. Particularmente, o elemento de cobertura flexível pode cobrir o substrato rígido e um atuador pode comprimir o elemento de cobertura contra o substrato, para seletivamente fechar os canais (para realizar funções de válvula ou similar).
De acordo com uma forma de realização exemplificativa, o substrato pode ter uma primeira superfície e uma segunda superfície oposta à primeira superfície. A estrutura pode ser provida sobre e/ou dentro da primeira superfície (pressão atmosférica uma primeira superfície principal) do substrato. Uma estrutura adicional pode ser provida sobre e/ou dentro da segunda superfície (particularmente uma segunda superfície principal) do substrato. Uma estrutura de conexão fluídica pode ser provida, particularmente um furo atravessante penetrando no substrato e/ou um sulco em uma parte de superfície do substrato conectando a primeira superfície com a segunda superfície. Tal estrutura de conexão fluídica pode ser disposta entre a primeira e a segunda superfície e pode ser configurada para prover uma comunicação fluida da estrutura com a estrutura adicional. Em tal forma de realização, o substrato pode ser processado em duas superfícies principais opostas, para desse modo formar estruturas microfluídicas. Estas estruturas podem ser conectadas pela estrutura de conexão, que pode incluir canais formados ao longo de uma superfície do substrato ou diretamente indo através do substrato. Portanto, um dispositivo pode ser provido em que ambas as partes de superfície principal do substrato podem ser usadas para prover tarefas de transporte de líquido. Opcionalmente, tal substrato pode ser coberto em um ou ambos os lados com um elemento de cobertura (particularmente flexível), desse modo permitindo controlar o fluxo de fluido através de estruturas fluídicas em ambas as superfícies eficientemente, por exemplo, por atuadores atuando sobre partes flexíveis de uma ou ambas as superfícies principais. Assim, um substrato central pode ser provido tendo estruturas fluídicas em ambos os lados. Particularmente, isto pode permitir a manufatura de um cartucho formado por três camadas, a saber, o substrato e dois elementos de cobertura pelo menos parcialmente flexíveis. Tal estrutural de três camadas pode ter um elemento de base (por exemplo, flexível) e um elemento de cobertura (por exemplo, flexível) intercalando uma camada intermediária (por exemplo, sendo rígida) acomodando as estruturas microfluídicas. O elemento de base e/ou ou elemento de cobertura pode(m) cobrir o substrato central inteiramente ou somente parcialmente, por exemplo, em posições em que uma função de cobertura é desejada como uma base para um controle baseado no atuador (vide, por exemplo, Fig. 21).
Além do substrato, o dispositivo pode incluir pelo menos um outro substrato, em que uma estrutura adicional pode ser provida e/ou no outro substrato. O substrato e o outro substrato podem ser adaptados para ser conectáveis, engastáveis, montáveis ou instaláveis reversível ou separavelmente entre si, de tal maneira que a estrutura e a estrutura adicional podem ser trazidas em comunicação fluida em um estado operacional em que o substrato é conectado, engastado, montado ou instalado com o outro substrato. Em tal forma de realização, uma construção modular pode ser provida em que um dispositivo pode ser formado combinando-se diversos módulos, que podem ser flexivelmente conectados entre si. Um correspondente cartucho pode ser formado por conjunto de construção modular, em que cada um dos módulos pode ter as seguintes propriedades e pode ser usado em combinação com outros módulos cooperativamente formados:
- inclui uma câmara tendo pelo menos duas conexões fluidas;
- a câmara inclui um componente rígido e um componente elástico;
- pelo menos uma conexão fluida pode ser fechável pelo movimento do componente elástico e uma mistura do conteúdo da câmara pode ser realizada.
O pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado de modo que uma pluralidade de procedimentos de acoplamento de fase sólida, durante uma análise das moléculas alvo, ocorre no pelo menos um membro de ligação. A expressão “procedimento de acoplamento de fase sólida” pode particularmente incluir qualquer espécie de ancoragem e hibridização etc., em uma funcionalização/membro de ligação. Neste contexto, o “membro de ligação ou membro de suporte” pode incluir qualquer substância, superfície ou funcionalização sendo configurada para ligar-se a um grupo âncora de moléculas de captura e/ou uma superfície sendo configurada para capturar polinucleotídeos. Os procedimentos de acoplamento de fase sólida pode incluir qualquer procedimento em que as moléculas a serem analisadas ou detectadas são especificamente ligadas a uma superfície sólida, isto é, são ligadas não em uma solução, mas em uma superfície sólida.
O pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado de modo que todos os procedimentos de acoplamento de fase sólida durante uma análise das moléculas alvo ocorram no pelo menos um membro de ligação. Em outras palavras, em tal forma de realização, não ocorrem procedimentos de acoplamento de fase sólida em outro poço exceto na poço/estrutura central. Isto pode permitir realizar todos os procedimentos de acoplamento de fase sólida em um único poço, permitindo um dispositivo miniatura e de elevado desempenho. O pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado de modo que exatamente dois procedimentos de acoplamento de fase sólida durante uma análise das moléculas alvo ocorram no pelo menos um membro de ligação. Estes dois procedimentos de acoplamento de fase sólida podem relacionar-se com as moléculas alvo de captura de uma amostra de multicomponentes e detectarem compostos indicativos da presença ou ausência ou da quantidade de moléculas alvo. Na forma de realização descrita, estes dois procedimentos são realizados em um único poço, permitindo sinergicamente utilizar provisões do poço para ambas tais tarefas. A combinação de tais duas tarefas em um poço pode manter os trajetos de líquido curtos, manter o dispositivo pequeno e manter o tempo de análise curto.
Em algumas formas de realização, o pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado de modo que exatamente três procedimentos de acoplamento de fase sólida durante uma análise das moléculas alvo ocorram no pelo menos um membro de ligação. Estes três procedimentos de acoplamento de fase sólida podem relacionar-se com as moléculas alvo de captura de uma amostra de múltiplos componentes, capturando ácidos nucleicos resultantes da transcrição inversa dos ácidos nucleicos alvo e a detecção de compostos indicativos da presença ou ausência ou da quantidade de moléculas alvo. Na forma de realização descrita, estes três procedimentos são realizados em um único poço, permitindo sinergicamente utilizarem-se provisões do poço para tais tarefas. A combinação de tais três tarefas em um poço pode manter os trajetos de fluxo de líquido curtos, manter o dispositivo pequeno e manter o tempo de análise curto.
Altemativamente, o pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado de modo que exatamente um procedimento de acoplamento de fase sólida durante uma análise das moléculas alvo da mesma amostra ocorra no pelo menos um membro de ligação. Tal forma de realização pode ser particularmente vantajosa, quando a inteira análise ou experimento bioquímico somente inclui um único procedimento de acoplamento de fase sólida, por exemplo, é somente previsto para purificação de amostra, não para detecção.
Pelo menos uma parte do dispositivo localizado adjacente ao pelo menos um membro de ligação pode ser transparente para radiação eletromagnética em uma faixa de comprimentos de onda entre cerca de 1 nm e cerca de 10 pm para, desse modo, permitir uma radiação eletromagnética baseada em detecção dos compostos indicativos da presença e/ou quantidade das moléculas alvo e capturados no pelo menos um membro de ligação. Em tais formas de realização, particularmente uma parte do substrato próxima ao poço central pode ser transparente para radiação eletromagnética usada para fins de detecção, particularmente para radiação eletromagnética nos comprimentos de onda próximo do infravermelho, ópticos e/ou ultravioletas. Assim, pode ser possível realizar a detecção com base na radiação eletromagnética (por exemplo, uma detecção baseada em fluorescência) no poço central. Quando a parte do dispositivo localizado adjacente ao pelo menos um membro de ligação é transparente para radiação eletromagnética em uma faixa de comprimentos de onda entre cerca de 400 nm e cerca de 800 nm, uma detecção óptica dos compostos é possibilitada.
O dispositivo pode incluir ou pode ser conectável com uma unidade de manipulação de temperatura, adaptada para manipular uma temperatura de líquidos localizados na estrutura. Tal unidade de manipulação de temperatura pode incluir um elemento de aquecimento e/ou esfriamento, que permita trazer uma amostra para uma temperatura específica ou conduzir um padrão ou sequência de temperatura específico.
A unidade de manipulação de temperatura pode ser adaptada para manipular uma temperatura de líquidos localizados na estrutura de acordo com uma sequência de temperatura para realizar uma reação de cadeia de polimerase (PCR). Tal reação de cadeia de polimerase pode requerer ciclos de temperatura de, por exemplo, cerca de 95 °C, cerca de 55 °C e cerca de 72 °C. Esta sequência pode ser realizada por intervalos de tempo predefinidos específicos e pode ser repetida por um número predefinido de ciclos.
O pelo menos um membro de ligação pode ser configurado para ligar um grupo âncora de uma molécula de captura. Particularmente, o pelo menos um membro de ligação pode ser configurado para capturar polinucleotídeos.
O pelo menos um membro de ligação pode incluir pelo menos um do grupo consistindo de moléculas de captura (p. ex., moléculas de captura específicas de repórter)), moléculas de captura dispostas sobre partículas (por exemplo, sobre contas), moléculas de captura dispostas sobre uma superfície porosa da estrutura (por exemplo, uma estrutura vítrea porosa) e um ou mais diferentes moléculas de captura (p. ex., moléculas de captura específicas de repórter, dispostas em diferentes locais com respeito a uma superfície da estrutura (por exemplo, diferentes espécies de moléculas de captura sendo imobilizadas em uma maneira semelhante a formação dentro do poço, por exemplo, no contexto de um ensaio competitivo)). Em algumas formas de realização, o pelo menos um membro de ligação também inclui moléculas de captura para capturar um grupo âncora tal como biotina.
A estrutura pode ter um volume em uma faixa entre cerca de 1 pL e cerca de 1 ml, particularmente em uma faixa entre cerca de 20 μΐ e cerca de 300 μΐ. Por exemplo, um poço tendo um volume de cerca de 100 μΐ pode ser provido.
O substrato pode ter um sulco configurado para receber uma cânula para suprir líquidos ao dispositivo. Em tal forma de realização, pode ser muito fácil para o usuário manipular o dispositivo, uma vez que a cânula para suprimento de amostra simplesmente tem que ser colocada no sulco a ser trazido apropriado acordo e cooperação com o sistema de canais microfluídicos, desse modo permitindo uma fácil análise que pode ser realizada mesmo por usuários que não são especificamente habilitados ou treinados.
O substrato pode ter uma parte de janela adjacente à estrutura e ser transparente para radiação eletromagnética em uma faixa de comprimentos de onda entre cerca de 1 nm e cerca de 10 pm (isto é, próxima à radiação infravermelha, óptica ou ultravioleta), particularmente em uma faixa de comprimentos de onda entre essencialmente 400 nm e essencialmente 800 nm (isto é, particularmente para radiação óptica), para desse modo permitir uma detecção baseada Em resposta a: de um menisco de um líquido escoando através (mais precisamente alcançando) a estrutura ou a rede micro fluí dica. Em tal forma de realização, uma parte de janela opticamente transparente do substrato pode ser detectada por um detector de radiação. Quando um menisco de um fluido bombeado através da rede microfluídica ou da estrutura passa pela parte de janela, as propriedades de transmissão através da parte de janela podem mudar abruptamente de uma maneira característica, desse modo gerando um sinal em um detector de radiação indicando que o menisco alcançou um local específico no dispositivo. Este sinal pode ser útil para fins de acionamento ou como um sinal de controle para atuadores, porque o movimento cooperativo dos atuadores e/ou o controle das unidades de manipulação de temperatura pode ser trazido em apropriada conformidade com a presente posição de uma amostra sendo bombeada através do dispositivo. Por exemplo, procedendo-se assim, pode ser detectado que um volume predefinido de água ou tampão foi bombeado para dentro do dispositivo, quando ocorre um extravasamento.
Pelo menos um do grupo consistindo da estrutura e da estrutura adicional pode incluir duas aberturas de fluido. Tais aberturas de fluido podem ser uma entrada de fluido e uma saída de fluido.
O elemento de cobertura pode ser um elemento de cobertura flexível. Particularmente em cooperação com um substrato rígido, o elemento de cobertura e o substrato podem formar canais tridimensionalmente vedados, que podem ser apropriadamente controlados pelos atuadores atuando sobre o elemento de cobertura. Quando o elemento de cobertura é pelo menos parcialmente deformável em uma posição específica sob a influência de uma força externa, pode ser possível seletivamente capacitar ou incapacitar um fluxo de líquidos pela abertura ou fechamento da estrutura ou da rede microfluídica. Além disto, um transporte de líquidos ao longo da estrutura é possível com tal elemento de cobertura.
Particularmente, quando um membro atuador é provido e adaptado para ser atuado para deformar o elemento de cobertura, um laboratório-sobre-chip de elevado desempenho pode ser provido que tem funções integradas de mistura, bombeamento e/ou válvula.
Qualquer uma das estruturas pode incluir uma ou mais substâncias que são biológica, bioquímica e/ou quimicamente ativas. Portanto, quando tais substâncias, que podem incluir moléculas de captura, moléculas de captura específicas de repórter, marcadores detectáveis, reagentes de lise e reagentes PCR, estão presentes nos poços em forma secada, particularmente em forma liofilizada, é possível prover-se um dispositivo que um usuário simplesmente tenha que encher com líquidos (tais como água, tampões e amostra) para realizar uma análise totalmente automática. Quando os necessários componentes bioquímicos são providos nos diferentes poços, um usuário pode simplesmente começar um experimento com base em uma sequência armazenada na unidade de controle e pode prover água ou tampões para diferentes câmaras de entrada. O resto será realizado pelo dispositivo totalmente automático.
O canal pode ter uma largura (que é uma dimensão em um plano de superfície do substrato e perpendicular a uma direção de fluxo de fluido) em uma faixa entre cerca de 50 pm e cerca de 1 mm, particularmente em uma faixa entre cerca de 100 pm e cerca de 300 pm. Por exemplo, uma largura de canal pode ser de cerca de 200 pm. Uma altura (que é uma dimensão em uma direção perpendicular a um plano de superfície do substrato e perpendicular a uma direção de fluxo de fluido) de canal pode ser em uma faixa entre cerca de 20 pm e cerca de 300 pm, particularmente em uma faixa entre cerca de 50 pm e cerca de 200 pm. Por exemplo, uma altura de canal pode ser de cerca de 100 pm. Ao contrário disto, um comprimento de canal pode ser muito maior do que a largura e a altura, por exemplo, pode ser maior do que 1 mm, particularmente pode ser maior do que 1 cm ou pode mesmo ser de diversos centímetros.
A estrutura pode incluir um material adaptado como um meio de transporte para líquidos. Por exemplo, o material pode incluir pelo menos um do grupo consistindo de um material sólido, um material gel, um material líquido e uma combinação deles. Portanto, a estrutura pode ser um rebaixo ou pode ser formada por material servindo como um veículo para líquidos.
O elemento de cobertura pode incluir uma membrana flexível ou uma vedação flexível. Tal membrana flexível ou vedação flexível pode ser feita de materiais tais como látex, desse modo possibilitando que o elemento de cobertura seja flexivelmente deformado sob a influência de uma força mecânica (por exemplo, gerada por um membro atuador).
O dispositivo pode incluir um membro atuador adaptado para ser atuado para deformar o elemento de cobertura para desse modo controlar uma propriedade de fluxo de fluido de líquidos da estrutura e/ou da rede microfluídica. Tal membro atuador pode ficar sob o controle da unidade de controle e pode ter uma pluralidade de pinos ou estênceis cooperantes, atuando sobre o elemento de cobertura flexível, para desse modo seletivamente abrir ou fecha os canais, temporariamente reduzir o volume de um canal ou poço para fins de bombeio ou mistura etc.
O membro atuador pode particularmente ser adaptado para controlar uma propriedade de fluxo de fluido de líquidos ao longo de uma parte reta do canal. Quando um fluido flui ao longo de um canal reto, um membro atuador perpendicularmente arranjado pode eficientemente incapacitar o fluxo de fluido quando este canal é fechado em uma parte específica.
O membro atuador pode ser adaptado para funcionar como uma válvula, como um misturador de fluido e/ou como uma bomba de fluido.
Mais particularmente, o membro atuador pode incluir uma pluralidade de elementos atuadores, adaptados para serem cooperativamente atuados para deformar o elemento de cobertura, para desse modo controlar a propriedade de fluxo de fluido de líquidos de acordo com um esquema de fluxo de fluido definido pela unidade de controle. Portanto, quando o usuário selecionou um experimento ou ensaio específico, que envolva o transporte de fluidos e amostras através de vários canais, a unidade de controle simplesmente controla os estênceis individuais do membro atuador para prover tal compressão reversível do elemento de cobertura flexível, para desse modo realizar totalmente automático o ensaio.
A unidade de controle pode ser adaptada para controlar o membro atuador para deformar o elemento de cobertura, de tal maneira que as moléculas alvo que são capturadas no pelo menos um membro de ligação, que as moléculas alvo que são amplificadas na estrutura e que os compostos indicativos da presença e/ou ausência das moléculas alvo e capturadas no pelo menos um membro de ligação são detectadas. Assim, a unidade de controle pode ser o regulador central do dispositivo harmonizando a função dos vários componentes.
O membro atuador pode incluir um ou mais pinos configurados para serem alternados, p. ex., movidos altemativamente nas direções para a frente e para trás. Movendo-se um pino em uma direção para a frente, um canal pode ser fechado pressionando-se o elemento de cobertura flexível em direção ao substrato neste canal. Quando o pino é movido para trás, o canal pode ser aberto novamente para permitir um fluxo de fluido. Em algumas formas de realização, o um ou mais pinos podem ter uma ponta pelo menos parcialmente elástica.
O membro atuador pode ainda ser provido para ser móvel em uma direção perpendicular a uma superfície principal do substrato. Altemando-se em uma direção que é perpendicular ao substrato planar, uma abertura e fechamento eficientes podem ser tomados possíveis. Particularmente, o membro atuador pode ser provido movelmente para seletivamente fechar pelo menos uma parte da estrutura para impossibilitar o transporte de líquidos através da estrutura. Em outro modo de operação, o membro atuador pode ser movido para seletivamente abrir pelo menos uma parte da estrutura para possibilitar o transporte de líquidos através da estrutura.
O membro atuador pode ser adaptado para alternar perpendicular a uma superfície principal do substrato, para seletivamente possibilitar ou impossibilitar o fluxo de fluido de líquidos através da estrutura. O uso de atuadores altemantes pode permitir possibilitar ou impossibilitar reversível ou seletivamente fluxos de fluido, permitindo a uma operação muito flexível do dispositivo e permitindo o uso do dispositivo múltiplas vezes (ao contrário de abordagens em que os canais são fechados irreversivelmente para realizar uma função de válvula de uma direção).
O membro atuador pode ser adaptado para alternar em uma direção perpendicular a uma superfície principal do substrato, para bombear líquidos através da estrutura. Portanto, é possível que o membro atuador controle um volume ou altura da estrutura. O membro atuador pode também seletivamente fechar a estrutura. O fechamento de uma estrutura pode ser realizado no contexto de uma função de válvula, de uma função de mistura ou de uma função de bombeamento. Entretanto, é também possível utilizar-se tal atuador durante uma fase de detecção, uma vez que seja possível comprimir a estrutura e/ou membros de ligação para fins de detecção, para aumentar a concentração local das moléculas alvo a serem detectadas e/ou para remover sinais de segundo plano. Isto pode permitir o aumento da precisão.
Uma unidade acionadora pode ser provida para mecanicamente acionar o membro atuador, em que a unidade acionadora pode ser controlável pela unidade de controle. Tal unidade acionadora pode incluir um mecanismo acionador pneumático, um mecanismo acionador hidráulico ou um mecanismo acionador eletromagnético.
O pelo menos um membro de ligação pode incluir um meio tridimensional, por exemplo, partículas, contas ou uma matriz porosa. O meio tridimensional pode ser disposto e configurado para ser reversivelmente compressível pelo movimento do membro atuador. Tomando-se esta medida, uma detecção muito precisa pode ser possível porque a concentração local das moléculas a serem detectadas pode ser seletivamente aumentada comprimindo-se o meio tridimensional (tal como contas) tendo ligado nele compostos ou complexos indicativos da presença ou da quantidade das moléculas alvo.
O dispositivo pode ser adaptado como um dispositivo de ensaio biossensor, um cartucho microfluídico ou um laboratório-sobre-chip. Portanto, em uma pequena escala, várias funções bioquímicas podem ser combinadas para realizar um inteiro experimento bioquímico.
Um sensor de temperatura pode ser provido e adaptado para medir a temperatura dos líquidos transportados através do dispositivo. O sensor de temperatura pode ser integrado em um substrato para desse modo detectar a temperatura dos líquidos fluindo através da rede microfluídica. Altemativamente, o sensor de temperatura pode ser disposto no membro atuador, por exemplo, em uma ponta de um atuador semelhante a estêncil, de modo que o atuador, quando pressionando o elemento de cobertura contra o substrato, possa simultaneamente medir a temperatura local do fluido.
O dispositivo pode incluir uma unidade de manipulação de temperatura adaptada para manipular a temperatura de líquidos e, preferivelmente, disposto no membro atuador. Tal unidade de manipulação de temperatura pode também ser integrado dentro do substrato, por exemplo, na forma de fios de aquecimento integrados no substrato e amostra de aquecimento dentro do poço. Altemativamente, tal unidade de manipulação de temperatura pode ser um dispositivo externo tal como uma fonte de radiação eletromagnética externa, em que a radiação eletromagnética (por exemplo, de um leiser) pode ser dirigida sobre um poço, resultando em um aquecimento do fluido dentro do poço, usando-se a radiação eletromagnética como uma fonte de energia. Ainda altemativamente, a unidade de manipulação de temperatura pode não incluir ou não somente um elemento de aquecimento, porém também um elemento de esfriamento. Para tal forma de realização, um resfriador Peltier pode ser implementado com baixo esforço.
Uma unidade de manipulação de temperatura pode ser provida e adaptada para manipular uma temperatura de líquidos, em que a unidade de manipulação de temperatura pode incluir um primeiro elemento de aquecimento e um segundo elemento de aquecimento, a estrutura sendo disposta entre o primeiro elemento de aquecimento e o segundo elemento de aquecimento. Provendo-se duas tais placas de aquecimento, uma sendo uma placa contínua e a outra sendo uma placa anular, um aquecimento pode ser realizado sem impossibilitar o dispositivo de ser operado com um detector baseado em uma radiação eletromagnética, uma vez que um rebaixo da placa anular pode permitir que a radiação eletromagnética seja dirigida sobre o poço central e possa permitir que radiação de fluorescência seja detectada através do rebaixo e do segundo elemento de aquecimento.
Uma unidade de regulação de temperatura pode ser provida e adaptada para regular a temperatura de líquidos da estrutura. Tal entidade de regulação pode incluir a medição da temperatura real e, com base nesta medição, o desempenho de um elemento de aquecimento e/ou esfriamento, para desse modo ajustar a temperatura a um valor desejado.
Uma unidade de detecção pode ser provida e adaptada para detectar, na estrutura, compostos indicativos da presença e/ou quantidade das moléculas alvo e capturadas no pelo menos um membro de ligação. Tal unidade de detecção pode incluir uma unidade de detecção óptica, particularmente uma unidade de detecção de fluorescência.
O substrato e o elemento de cobertura podem ser componentes separados que são conectados entre si. Altemativamente, o substrato e o elemento de cobertura podem ser produzidos de diferentes materiais.
Uma unidade de transporte pode ser provida e adaptada para transportar líquidos através da estrutura e/ou da rede microfluídica. Tal unidade de transporte pode incluir uma bomba, particularmente uma do grupo consistindo de uma bomba de ar comprimido, uma bomba hidráulica, uma bomba peristáltica e uma bomba a vácuo. Além disso, o dispositivo pode ser adaptado de tal maneira, durante o uso normal, que a força gravitacional promove o fluxo de fluidos através do dispositivo de uma maneira desejada.
Portanto, na ausência de atividade de uma unidade de transporte, os líquidos podem diretamente fluir em uma direção desejada. Entretanto, quando a unidade de transporte for ligada, a influência da unidade de transporte pode ser maior do que a influência da gravitação, desse modo permitindo iniciar seletivamente o fluxo de fluido em uma direção contra a força gravitacional. Portanto, a combinação de gravidade e uma unidade de transporte especial pode ser altamente vantajosa e pode permitir uma operação de economia de energia.
A unidade de transporte pode ser adaptada para transportar líquidos acionando-se uma bolha de gás na estrutura e/ou na rede microfluídica. Movendo-se uma bolha de gás através do dispositivo, o transporte dos líquidos através do dispositivo pode ser suportado ou promovido.
Pelo menos um filtro, particularmente pelo menos uma frita, pode ser disposto na estrutura (isto é, em uma entrada e/ou uma saída do poço central) e pode ser adaptado para evitar que o pelo menos um membro de ligação (por exemplo, contas) disposto na estrutura seja lavado da estrutura. Sob a influência de um fluxo de fluido, uma força mecânica pode atuar sobre as contas ou outros membros de ligação da estrutura. Entretanto, quando uma frita, isto é um elemento de filtro poroso, que pode ser produzido de um material de sinterização, é provido em uma entrada e/ou saída da estrutura, pode ser evitado com segurança que as contas sejam retiradas com lavagem da câmara central. A frita pode ser provida com um formato anular, para permitir que seja inserida dentro de um sulco anular correspondentemente conformado no dispositivo.
O pelo menos um membro de ligação pode incluir uma funcionalização de superfície. A expressão “fimcionalização de superfície” pode indicar o fato de que a superfície é processada em uma tal maneira a fim de realizar uma função de ligação específica. Em uma tal forma de realização, o membro de ligação pode ser parte de ou acoplado a ou ligado na superfície do poço.
O substrato e o elemento de cobertura podem ficar em contato direto entre si. Altemativamente, o substrato pode ser livre de um contato direto com o elemento de cobertura. Várias realizações geométricas são possíveis.
Uma parte do substrato localizado adjacente à estrutura pode ser transparente para radiação eletromagnética em uma faixa de comprimentos de onda entre cerca de 400 nm e cerca de 800 nm, para desse modo permitir uma detecção óptica na estrutura. Portanto, pode ser usada luz visível para fins de detecção. Tal detecção pode ser realizada com base na absorção de luz, reflexão de luz ou geração de fluorescência, por exemplo, usando-se rótulos de fluorescência ligados a moléculas ou complexos a serem detectados.
O pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado de modo que pelo menos dois procedimentos de acoplamento de fase sólida, durante uma análise das moléculas alvo, ocorram em exatamente um do pelo menos um membro de ligação. Em outras palavras, o mesmo membro de ligação pode ser usado para múltiplos procedimentos de acoplamento de fase sólida. Por exemplo, contas com grupos ligados podem ser usadas para capturar moléculas alvo fora da amostra e podem ser usadas mais tarde para capturar compostos tais como moléculas alvo ampliadas e rotuladas, como uma base para uma subsequente detecção.
Altemativamente, o pelo menos um membro de ligação pode ser adaptado de modo que pelo menos dois procedimentos de acoplamento de fase sólida, durante uma análise das moléculas alvo, ocorra em diferentes dos pelo menos um membro de ligação. Em tal configuração, por exemplo, moléculas de captura de uma amostra por um lado e componentes de detecção indicativos das moléculas alvo por outro lado podem ser capturados usando-se duas diferentes espécies de membros de ligação. Por exemplo, contas podem ser providas para capturar as moléculas alvo fora da amostra. Por outro lado, as moléculas de captura, p.ex., moléculas de captura específicas de repórter imobilizadas no poço podem ser usadas no contexto de um ensaio competitivo para capturar os componentes indicativos da presença ou quantidade de moléculas alvo na amostra, p. ex., compostos repórter.
Em outro aspecto, um método inclui formar complexos, cada um incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura, em que cada molécula de captura incluir uma parte de ligação específica de uma região do ácido nucleico alvo e um grupo âncora; contatar os complexos com um membro de ligação, o membro de ligação sendo configurado para ligar-se ao grupo âncora da molécula de captura para ligar os complexos ao membro de ligação; submeter um ou mais ácidos nucléicos alvo a uma ampliação; capturar os ácidos nucléicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação; e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucléicos alvo capturados.
O um ou mais ácidos nucléicos alvo podem ser ácidos nucléicos de filamento único ou filamento duplo.
O método pode ainda incluir submeter os ácidos nucléicos alvo a transcrição inversa antes de submeter um ou mais ácidos nucléicos alvo a ampliação.
O método pode ainda incluir liberar os ácidos nucléicos alvo ampliados capturados do membro de ligação e repetir as etapas de submeter um ou mais ácidos nucléicos alvo a ampliação e capturar o ácido nucleico alvo ampliado com respeito ao membro de ligação. Em tal forma de realização, o ciclo de liberar os ácidos nucléicos alvo ampliados capturados do membro de ligação e repetir as etapas de submeter um ou mais ácidos nucléicos alvo à ampliação e capturar os ácidos nucléicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação pode ser realizado pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes.
Um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode ser determinado após pelo menos um ciclo, p. ex., após cada ciclo de liberar os ácidos nucleicos alvo ampliados capturados do membro de ligação e repetir as etapas de submeter um ou mais ácidos nucleicos alvo à ampliação e capturar os ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação.
O membro de ligação pode incluir uma ou mais moléculas de captura capazes de capturar os ácidos nucleicos alvo. Em tal forma de realização, os ácidos nucleicos alvo são capturados com respeito ao membro de ligação pela uma ou mais moléculas de captura. O membro de ligação pode ainda incluir partículas.
A etapa de formar complexos, incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura, pode ser realizada espacialmente separada da etapa de contatar os complexos com um membro de ligação.
O método pode ainda incluir rotular os ácidos nucleicos alvo. Os ácidos nucleicos alvo podem ser rotulados pela adição de um ou mais marcadores detectáveis, p. ex., antes de ou durante submeter um ou mais ácidos nucleicos alvo a ampliação e/ou antes de capturar os ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação. O um ou mais marcadores detectáveis podem ser marcadores fluorescentes.
Determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode incluir monitoramento dependente do tempo do um ou mais valores indicativos obtidos.
O método pode ainda incluir prover o um ou mais ácidos nucleicos alvo antes de formar complexos, cada um incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura. A etapa de prover um ou mais ácidos nucleicos alvo pode incluir liberar os ácidos nucleicos alvo do material biológico. Em tal forma de realização, o material biológico pode ser selecionado do grupo consistindo de uma ou mais células procarióticas, uma ou mais células eucarióticas, um ou mais eritrócitos e uma ou mais partículas virais, bem como suas misturas. A liberação dos ácidos nucléicos alvo do material biológico pode ainda incluir contatar o material biológico com um reagente de lise.
Prover o um ou mais ácidos nucléicos alvo pode incluir prover uma amostra incluindo o um ou mais ácidos nucléicos alvo em que a amostra pode ser selecionada do grupo consistindo de sangue integral, plasma, soro, urina, escarro, saliva e fluido cerebrospinhal.
Prover o um ou mais ácidos nucléicos alvo pode ser realizado espacialmente separado das etapas de contatar complexos, cada uma incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura, submeter o um ou mais ácidos nucléicos alvo a ampliação, capturar os ácidos nucléicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácidos nucléicos alvo capturados.
O método pode ainda incluir separar o um ou mais ácidos nucléicos alvo de material concomitante.
Em uma outra forma de realização, o método de acordo com esta forma de realização exemplar é realizado em um dispositivo como descrito acima. Por exemplo, o método pode ser realizado em um dispositivo incluindo um substrato rígido; um elemento de cobertura flexível pelo menos parcialmente cobrindo o substrato; uma primeira estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e adaptada para liberar conteúdo de um ou mais células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo moléculas alvo tais como ácidos nucléicos alvo; uma segunda estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e incluindo pelo menos um membro de ligação adaptado para capturar as moléculas alvo e para detectar um valor indicativo da presença e/ou quantidade das moléculas alvo; uma rede microfluídica interconectando pelo menos a primeira estrutura e a segunda estrutura; e uma unidade atuadora adaptada para realizar um fluxo de fluido entre a primeira estrutura e a segunda estrutura por pressionamento do elemento de cobertura flexível contra o substrato, para seletivamente fechar uma parte da rede microfluídica. Além disso, o método pode ser realizado em um dispositivo incluindo uma estrutura adaptada para acomodar líquidos, em que a estrutura inclui pelo menos um membro de ligação e fica em comunicação fluida com uma rede microfluídica; e uma unidade de controle adaptada para controlar um fluxo de fluido através da rede microfluídica, de tal maneira que as moléculas alvo tais como ácidos nucleicos alvo são capturadas no pelo menos um membro de ligação, adaptadas para controlar uma ampliação das moléculas alvo da estrutura e adaptadas para controlar a detecção de compostos capturados no pelo menos um membro de ligação.
O dispositivo pode incluir uma primeira estrutura adaptada para acomodar líquidos. Em tal forma de realização, os complexos podem incluir um ácido nucléico alvo e uma molécula de captura é formada na primeira estrutura.
Além disso, o dispositivo pode incluir uma segunda estrutura configurada para detectar um ou mais ácidos nucleicos alvo e incluindo um elemento de cobertura cobrindo o segundo poço e uma unidade atuadora adaptada para ser atuada para deformar o elemento de cobertura. Em tal forma de realização, determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode ser realizado na segunda estrutura.
Além disso, submeter um ou mais ácidos nucleicos alvo a ampliação e/ou capturar os ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito a um membro de ligação pode também ser realizado na segunda estrutura.
Determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode ser realizado com o atuador atuado, para deformar o elemento de cobertura. O elemento de cobertura pode ser deformado de tal maneira que o volume do poço de detecção é reduzido.
Em tai forma de realização, o volume do segundo poço pode ser reaumentado após determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados.
De acordo com outra forma de realização exemplar da invenção, é provido um método incluindo: prover uma quantidade de um composto repórter; um primeiro membro de ligação sendo configurado para ligar um grupo âncora de uma molécula de captura; um segundo membro de ligação, capaz de capturar o composto repórter; uma quantidade de um ácido nucleico alvo capaz de formar complexos com o composto repórter; a formação de complexos com um composto repórter inibindo a captura do composto repórter pelo segundo membro de ligação; e quantidade de moléculas de captura em que cada molécula de captura inclui uma parte de ligação específica para uma região dos ácidos nucleicos alvo e um grupo âncora; formar complexos, cada um incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura; contatar os complexos com o primeiro membro de ligação para ligar os complexos ao primeiro membro de ligação; liberar pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo do primeiro membro de ligação; formar complexos de um subconjunto da quantidade de um composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo; capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação; e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
O composto repórter pode incluir um ou mais rótulos detectáveis. O um ou mais rótulos detectáveis podem ser rótulos fluorescentes. Além disso, os compostos repórter podem ser oligonucleotídeos.
O método pode ainda incluir determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo com base no valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
O método pode ainda incluir liberar o subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter do segundo membro de ligação após a etapa de determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação; formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo; capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não no complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação; e determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação. Em tal forma de realização, as etapas de liberar, formar complexos, capturar e determinar podem ser realizadas N vezes adicionais, em que N é um inteiro maior do que ou igual a 1, p. ex., N > 5, N > 10 ou N > 20.
Além disso, a etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e a etapa de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação podem ser realizadas concomitantemente.
O método pode ainda incluir submeter o ácido nucleico alvo a ampliação. Em tal forma de realização, a ampliação do ácido nucleico alvo pode ser iniciada antes da etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo.
O valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação pode ser determinado antes das etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e da captura de um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação estar em equilíbrio químico. Particularmente, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação pode ser determinado 1 segundo a 120 segundos após iniciar as etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação.
O método pode ainda incluir submeter os ácidos nucleicos alvo a transcrição inversa antes de submetê-los a ampliação.
O segundo membro de ligação pode incluir uma ou mais diferentes moléculas de captura específicas de repórter sendo capazes de capturar um composto repórter no segundo membro de ligação. As moléculas de captura podem ser oligonucleotídeos. As diferentes moléculas de captura específicas de repórter podem ser dispostas em diferentes locais com respeito ao segundo membro de ligação. Além disso, os composto repórter podem ser capturados no segundo membro de ligação pela formação de complexos com as moléculas de captura específicas de repórter. Pelo menos uma parte de um sítio de interação do composto repórter sendo capaz de formar um complexo com um ácido nucleico alvo pode também ser capaz de formar um complexo com uma molécula de captura específica de repórter. As moléculas de captura específicas de repórter e o ácido nucleico alvo podem competir para formar um complexo com o composto repórter.
A ampliação pode incluir uma etapa de desnaturar ácidos nucleicos de filamento duplo. Os ácidos nucleicos de filamento duplo podem incluir complexos de composto repórter com ácidos nucleicos alvo, complexos de compostos repórter com moléculas de captura específicas de repórter, duplos filamentos de composto repórter e duplos filamentos de ácidos nucleicos alvo.
A ampliação pode ainda incluir uma etapa de anelar as moléculas iniciadoras em ácidos nucleicos alvo. Nesta forma de realização, a etapa de anelar pode ser realizada simultaneamente com a etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e/ou a etapa de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de câmara de reação não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação.
A ampliação pode ser uma ampliação cíclica, p. ex., uma PCR. Realizar a PCR pode incluir utilizar uma polimerase tendo atividade de exonuclease. A ampliação cíclica pode incluir pelo menos 10 ciclos ou pelo menos 20 ciclos.
O valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação pode ser determinado após pelo menos um ciclo, p. ex., após cada ciclo da ampliação cíclica. Além disso, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo pode ser determinado cada vez após determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
Determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação pode incluir monitoramento dependente do tempo do valor indicativo.
Além disso, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo pode ser determinado com base em uma curva de calibração correlacionando o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter com um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo.
O método pode também ser realizado em um dispositivo como descrito acima. Por exemplo, o método pode ser realizado em um dispositivo incluindo um substrato rígido; um elemento de cobertura flexível pelo menos parcialmente cobrindo o substrato; uma primeira estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e adaptada para liberar conteúdo de um ou mais células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo ácidos nucleicos alvo; uma segunda estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e incluindo pelo menos um membro de ligação adaptado para capturar os ácidos nucleicos alvo e para determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo; uma rede microfluídica interconectando pelo menos a primeira estrutura e a segunda estrutura; e uma unidade atuadora para realizar um fluxo de fluido entre a primeira estrutura e a segunda estrutura pela compressão do elemento de cobertura flexível contra o substrato, para seletivamente fechar uma parte da rede microfluídica. O método pode também ser realizado em um dispositivo, incluindo uma estrutura adaptada para acomodar líquidos, em que a estrutura inclui pelo menos um membro de ligação e fica em comunicação fluida com uma rede microfluídica; e uma unidade de controle adaptada para controlar um fluxo de fluido através da rede microfluídica de tal maneira que os ácidos nucleicos alvo são capturados no pelo menos um membro de ligação, adaptado para controlar uma ampliação das moléculas alvo na estrutura e adaptado para controlar a detecção de compostos capturados no pelo menos um membro de ligação.
O dispositivo pode ainda incluir uma primeira estrutura adaptada para acomodar líquidos. Em tal forma de realização, a etapa de formar complexos incluindo um ácido nucléico alvo e uma molécula de captura é realizada na primeira estrutura.
O dispositivo pode ainda incluir uma segunda estrutura adaptada para acomodar líquidos e o primeiro, opcionalmente, o segundo membro de ligação podem ser providos na segunda estrutura. Em tal forma de realização, formar complexos incluindo um ácido nucléico alvo e uma molécula de captura; contar os complexos com o primeiro membro de ligação para ligar os complexos com o primeiro membro de ligação; liberar pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucléico alvo do primeiro membro de ligação; formar complexos de um subconjunto da quantidade de um câmara de reação com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucléico alvo; capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucléico alvo no segundo membro de ligação; e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação é realizado na segunda estrutura, p. ex., o poço central.
Prover o um ou mais ácidos nucleicos alvo pode incluir prover uma amostra incluindo o um ou mais ácidos nucleicos alvo. A amostra pode ser uma amostra líquida tendo um volume de 1 μΐ a 50 μΐ. Além disso, a amostra pode ser uma amostra de sangue integral líquido.
Em outro aspecto, um método inclui ampliar pelo menos um polinucleotídeo alvo para formar amplicons de duplo filamento, contatar os amplicons com uma superfície configurada para seletivamente ligar os amplicons e com os amplicons ligados na superfície por um grupo âncora, opticamente determinar a presença dos amplicons. O método pode ainda incluir liberar os amplicons da superfície após a etapa de opticamente detectar, submeter os amplicons liberados a pelo menos mais um ciclo de ampliação, contatar os amplicons resultantes com a superfície e com os amplicons ligados á superfície pelo grupo âncora, opticamente determinar a presença dos amplicons. O método pode ainda incluir realizar as etapas de liberar, submeter, contatar e opticamente determinar um número N vezes adicionais, onde N é um inteiro maior do que ou igual a 1. Particularmente, N > 5, mais particularmente N > 10 e ainda mais particularmente N > 20.
O método pode ainda incluir, antes da etapa de ampliar, prover os polinucleotídeos alvo, formar complexos, cada um incluindo um polinucleotídeo alvo liberado de um patógeno e pelo menos uma moléculas de captura, cada moléculas de captura incluindo uma parte de ligação específica de uma região do polinucleotídeo alvo e um grupo âncora, e contatar os complexos com a superfície, a superfície sendo configurada para não seletivamente ligar o grupo âncora da moléculas de captura para não seletivamente ligar os complexos e a superfície. Em tal método, prover os polinucleotídeos pode incluir liberar conteúdo de uma ou mais células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo os polinucleotídeos alvo. A etapa de liberar pode incluir contatar uma amostra incluindo a uma ou mais células, esporos ou vírus com um reagente de lise e as moléculas de captura. A etapa de contatar a amostra com o reagente de lise e moléculas de captura pode incluir contatar a amostra como reagente de lise e moléculas de captura em forma liofílizada.
Em tal método, a etapa de prover os polinucleotídeos alvo pode incluir prover materiais concomitantes e o método pode ainda incluir separar os complexos ligados em superfície e os materiais concomitantes. Em tal método, os materiais concomitantes pode incluir conteúdo de pelo menos uma célula, esporo ou vírus de que os polinucleotídeos foram liberados. A superfície pode ser uma superfície de uma partícula.
Em ainda outro aspecto, um método inclui prover um ou mais polinucleotídeos alvo, formar complexos, cada um incluindo um polinucleotídeo alvo e pelo menos uma molécula de captura, cada molécula de captura incluindo uma parte de ligação específica de uma região do polinucleotídeo alvo e um grupo âncora, e contatar os complexos com uma superfície, a superfície sendo configurada para não seletivamente ligar o grupo âncora da molécula de captura para não seletivamente ligar os complexos e a superfície. Em tal método, a etapa de prover pode incluir liberar o conteúdo de uma ou mais células, esporos ou vírus e o conteúdo incluindo os polinucleotídeos. O método pode ainda incluir separar os complexos ligados na superfície e outros conteúdos liberados pela uma ou mais células, esporos ou vírus.
Em outro aspecto, um método inclui formar uma composição de matéria incluindo uma quantidade de um composto repórter, um membro de ligação capaz de capturar o composto repórter e uma quantidade de um ácido nucleico alvo capaz de formar complexos com o composto repórter, a formação de complexos com o composto repórter inibindo a capturar do composto repórter pelo membro de ligação; formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo; capturar subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com uma ácido nucleico alvo no membro de ligação; e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação.
Em outras palavras, o método pode incluir permitir que um subconjunto da quantidade de composto repórter formem um complexo com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e permitir que um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo seja capturado no membro de ligação.
O método pode ser realizado em um dispositivo selecionado do grupo consistindo de um dispositivo de ensaio biossensor, um cartucho microfluídico e um laboratório-sobre-chip.
Em algumas formas de realização, o método inclui ainda determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo baseado no veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação. A determinação do valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação pode incluir monitoramento dependente do tempo do valor indicativo. Em formas de realização específicas, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo é determinado baseado em uma curva de calibração correlacionando o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter com o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo.
Em outras formas de realização, o método inclui ainda liberar o subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter do membro de ligação após as etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo, capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com o ácido nucleico alvo no membro de ligação e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação.
As etapas de liberar, formar complexos, capturar e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo podem ser realizadas um número de N vezes adicionais, em que N é um inteiro maior do que ou igual a 1. Em formas de realização específicas, N é > 5, > 10 ou > 20.
O método pode ainda incluir, antes da etapa de formar complexos: capturar pelo menos um subconjunto da quantidade de composto repórter no membro de ligação; determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação; e liberar os compostos repórter capturadores do membro de ligação.
Em algumas formas de realização, a etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e a etapa de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no membro de ligação são realizadas concomitantemente.
Em outras formas de realização, o método inclui submeter o ácido nucleico alvo a ampliação. A ampliação do ácido nucleico alvo pode ser iniciada antes da etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo.
O valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação pode ser determinado antes da formação de complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e a captura de um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no membro de ligação estão em equilíbrio químico. Em algumas formas de realização, o valor indicativo é determinado 1 segundo a 120 segundos após iniciar as etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e de captura de um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no membro de ligação.
Os composto repórter podem incluir um ou mais rótulos detectáveis. Em formas de realização específicas, o um ou mais rótulos detectáveis são rótulos fluorescentes. Em outras formas de realização específicas, os composto repórter são oligonucleotídeos.
Em outras formas de realização, o método inclui ainda submeter os ácidos nucleicos alvo a transcrição inversa antes de submetê-los a ampliação.
Em outra forma de realização, a etapa de formar uma composição de matéria inclui formar uma composição de matéria incluindo uma quantidade de um primeiro composto repórter, uma quantidade de um primeiro ácido nucleico alvo capaz de formar complexos com o primeiro composto repórter, a formação de complexos com o primeiro composto repórter inibindo a captura do primeiro composto repórter pelo membro de ligação, uma quantidade de um segundo composto repórter, e uma quantidade de um segundo ácido nucleico alvo, capaz de formar complexos com o segundo composto repórter, a formação de complexos com o segundo composto repórter inibindo a captura do segundo composto repórter pelo membro de ligação.
O membro de ligação usado no método pode incluir uma ou mais diferentes moléculas de captura sendo capazes de capturar um composto repórter no membro de ligação. As moléculas de captura podem também ser indicadas como moléculas de captura específicas de repórter. Em formas de realização específicas, as moléculas de captura são oligonucleotídeos. As diferentes moléculas de captura podem também ser dispostas em diferentes locais com respeito ao membro de ligação.
Os composto repórter podem ser capturados no membro de ligação pela formação de complexos com as moléculas de captura. Em formas de realização específicas, pelo menos uma parte de um sítio de interação do composto repórter sendo capaz de formar um complexo com um ácido nucleico alvo é também capaz de formar um complexo com uma molécula de captura. Em outras formas de realização específicas, as moléculas de captura e o ácido nucleico alvo competem para formar um complexo com o composto repórter.
Em outras forma de realização, a ampliação inclui uma etapa de desnaturar ácidos nucleicos de duplo filamento. Os ácidos nucleicos de duplo filamento podem incluir complexos de compostos repórter com ácidos nucleicos alvo, complexos de compostos repórter com moléculas de captura, duplos filamentos de compostos repórter e duplos filamentos de ácidos nucleicos alvo.
A ampliação pode também incluir uma etapa de anelar as moléculas iniciadoras em ácidos nucleicos alvo. A etapa de anelar pode ser realizada concomitantemente com a etapa de formar complexos de um subconjunto das quantidades de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucléico alvo e/ou com a etapa de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucléico alvo no membro de ligação.
A ampliação pode ser uma ampliação cíclica. Em formas de realização específicas, a ampliação cíclica é uma PCR. A amplificação cíclica pode incluir pelo menos 10 ou pelo menos 20 ciclos. Em outras forma de realização, realizar a PCR inclui utilizar uma polimerase tendo atividade exonuclease.
O valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação pode ser determinado após pelo menos um ciclo da amplificação cíclica. Em formas de realização específicas, este valor é determinado após cada ciclo da ampliação cíclica. Em outras forma de realização, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucléico alvo é determinado cada vez após determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação.
Um dispositivo pode ser provido que é configurado para realizar qualquer um dos métodos acima descritos.
Outros aspectos, objetivos e vantagens serão evidentes pela descrição abaixo, os desenhos e as reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A ilustração dos desenhos é esquemática. Em diferentes desenhos, elementos similares ou idênticos são providos com os mesmos sinais de referência.
A Figura la é um fluxograma de um método de ensaio de polinucleotídeo.
A Figura 2B é uma vista de um sistema de detecção útil na realização do método da Figura la.
A Figura 1c é uma vista do sistema de detecção da Figura 1b, com o sistema de detecção sendo mostrado em um estado acionado para realizar a etapa de detecção do método da Figura la.
A Figura Id mostra uma ligação de amplicon em uma partícula.
A Figura le mostra uma ligação de amplicon em uma partícula.
A Figura 2 ilustra um dispositivo de ensaio para uso no sistema de detecção das Figs. 1b e 1c.
A Figura 3 é o dispositivo de ensaio da Figura 2 mostrado com um atuador de estêncil para operar o dispositivo.
A Figura 4 mostra os resultados (curvas de produto RT-PCR e eletroforese gel) dos ensaios realizados com tampão de lise fresco ou liofilizado, em que o tampão de lise pode ser armazenado como pelota liofilizada sem perda de função.
A Figura 5 mostra o efeito da quantidade de lama de estreptavidina sefarose usada para capturar um oligonucleotídeo (isto é, RNA HIV) de uma mistura de lise de sangue, em que os resultados dos ensaios realizados com 200 μΐ, 100 μΐ ou 50 ml de lama de estreptavidina sefarose revelam que a capacidade de ligação de 50 μΐ de lama é suficiente para capturar substancialmente todas as moléculas de RNA.
A Figura 6 mostra o efeito da quantidade de lama de estreptavidina sefarose usada para capturar um oligonucleotídeo (isto é, RNA HIV) de uma mistura de lise-sangue, em que os resultados dos ensaios realizados com 10 μΐ e 7 μΐ de lama de estreptavidina sefarose revelam que a capacidade de ligação de 10 μΐ de lama é suficiente para capturar substancialmente todas as moléculas de RNA.
A Figura 7 mostra o efeito do tempo de incubação para a formação de complexo (isto é, hibridização) entre o polinucleotídeo a ser analisado e as sondas de captura, em que uma quantidade substancial de polinucleotídeo não é recuperada após 2 minutos de tempo de incubação, enquanto após 10 minutos de incubação nenhum RNA pode ser detectado no sobrenadante.
A Figura 8 mostra o efeito do tempo de incubação para a formação de complexo (isto é, hibridização) entre o polinucleotídeo a ser analisado e as sondas de captura.
A Figura 9 mostra o efeito do tempo de incubação para a etapa de captura (isto é, ligação dos grupos âncora de biotina dos complexos às partículas de estreptavidina sefarose), em que é mostrado que 5 minutos de tempo de incubação são suficientes para capturar todas as moléculas de polinucleotídeo (isto é, nenhuma molécula de RNA é detectada no sobrenadante).
A Fig. 10 mostra os resultados (curvas de produto RT-PCR) dos ensaios realizados com partículas de estreptavidina sefarose liofilizadas após armazenagem de diversas horas ou sete dias, em que as partículas de estreptavidina sefarose podem ser liofilizadas e reconstituídas sem perda de função.
A Fig. 11 mostra os resultados (curvas produto RT-PCR) dos ensaios realizados com tampões de lavagem frescos ou liofilizados, em que os tampões de lavagem podem ser liofilizados e reconstituídos sem perda de função.
A Fig. 12 mostra os resultados (curvas produto RT-PCR e eletroforese de gel) de testes realizados para mostrar a compatibilidade das partículas de estreptavidina sefarose com RT-PCR, em que 10 μΐ de lama de partículas de estreptavidina sefarose podem ser aplicados a uma ampliação
RT-PCR sem perda de eficiência de ampliação.
A Fig. 13 mostra a especificidade do ensaio de acordo com uma forma de realização exemplar, em que os resultados (curvas produto RTPCR eletroforese de gel) mostram que RNA-HIV não se liga especificamente (isto é, na ausência de sondas de captura) às partículas de estreptavidina sefarose, nem qualquer RNA de células sanguíneas humanas, que é também liberado durante a etapa de lise, é capturado/ampliado.
A Fig. 14 mostra imagens fluorescentes da detecção de amplicons em partículas de estreptavidina sefarose, em que amplicons rotulados com biotina foram capturados nas partículas de estreptavidina sefarose e visualizados após hibridização de uma sonda fluorescentemente rotulada no amplicon capturado.
A Fig. 15 ilustra que a eletroforese gel de agarose mostra que os polinucleotídeos (isto é, RNA-HIV) capturados nas partículas de estreptavidina sefarose podem ser usados diretamente como um padrão para a ampliação sem mais etapas de processamento (isto é, eluição, diluição ou concentração).
A Fig. 16 mostra as respectivas imagens fluorescentes de partículas de estreptavidina sefarose, em que mais partículas de estreptavidina sefarose fluorescentes são detectadas na sonda positiva, em comparação com a sonda negativa.
A Fig. 17 ilustra esquematicamente um dispositivo.
A Fig. 18 ilustra um lado frontal de um dispositivo.
A Fig. 19 ilustra um lado detrás do dispositivo da Figura 18.
A Fig. 20 ilustra uma vista em planta de um dispositivo.
A Fig. 21 ilustra uma vista em seção transversal de um dispositivo.
A Fig. 22 ilustra esquematicamente um método competitivo para a detecção de polinucleotídeos.
A Fig. 23 mostra os resultados de um ensaio competitivo para determinar a quantidade de DNA de poliovirus humano 1 em uma amostra.
A Fig. 24 mostra o princípio bem como os resultados de um ensaio competitivo baseado em formação para determinar a quantidade de produto gag HIV/PCR env em uma amostra.
A Fig. 25 ilustra diferentes etapas durante o ensaio mostrado na Figura 24.
A Fig. 26 ilustra esquematicamente o método competitivo para a detecção de polinucleotídeos.
A Fig. 27 mostra os resultados de um ensaio competitivo para determinar a quantidade de HIV subtipo B e HIV subtipo O2 em uma amostra.
A Fig. 28 mostra os resultados de um ensaio competitivo para determinar diferentes quantidades de HIV subtipo B em uma amostra. DESCRIÇÃO DETALHADA
Análise de amostras biológicas podem incluir determinar se um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, um DNA, RNA, mRNA ou rRNA) estão presentes na amostra. Por exemplo, pode-se analisar uma amostra para determinar se um polinucleotídeo indicativo da presença de um patógeno particular está presente.
Em uma forma de realização, um método para a análise inclui formar complexos, cada um incluindo um ácido nucléico alvo e uma molécula de captura, em que cada molécula de captura inclui uma parte de ligação específica para uma região do ácido nucléico alvo e um grupo âncora; contatar os complexos com um membro de ligação, o membro de ligação sendo configurado para ligar o grupo âncora da moléculas de captura para ligar os complexos do membro de ligação; submeter um ou mais ácidos nucleicos alvo a uma ampliação; capturar os ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação; e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados.
A expressão ácido nucleico alvo pode referir-se a uma molécula de ácido nucleico que pode ser detectada pelo método (isto é, ácidos nucléicos alvo que são capazes de formar complexos com uma molécula de captura; vide abaixo). Exemplos de tais moléculas de ácido nucleico incluem ácidos nucléicos naturalmente ocorrentes, tais como acido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), bem como ácidos nucléicos artificialmente projetados, p. ex., análogos de ácido nucleico, tais como, inter alia, ácidos nucléicos peptídicos (PNA) ou ácidos nucléicos travados (LNA), que são quimicamente sintetizados ou gerados por meio de tecnologia genética recombinante (vide, por exemplo, Sambrook J. et al. (1989) Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, que é incorporado por referência em sua totalidade). Exemplos específicos de ácidos nucléicos naturalmente ocorrentes incluem sequências de DNA tais como moléculas de DNA ou cDNA genômicas, bem como sequências de RNA, tais como moléculas de hnRNA, mRNA ou rRNA ou suas sequências de ácido nucleico complementares inversas. Tais ácidos nucléicos podem ser de qualquer comprimento e podem ser moléculas de filamento único ou filamento duplo. Tipicamente, os ácidos nucléicos alvo têm 10 a 10.000 nucleotídeos de comprimento, p. ex., 20 a 20000 nucleotídeos, 30 a 1000 nucleotídeos ou 50 a 500 nucleotídeos. Como aqui usado, o termo “nucleotídeo” é para ser entendido como referindo-se a tanto ribonucleotídeos como desoxirribonucleotídeos (isto é, moléculas de RNA e DNA).
O ácido nucleico alvo pode ser um ácido nucleico associado com infecções virais. Um ácido nucleico associado com infecções virais indica qualquer molécula de ácido nucleico de origem viral (isto é, cuja sequência de nucleotídeo é idêntica ou complementar a uma correspondente sequência dentro do genoma do vírus) que esteja presente em uma amostra de líquido a ser analisado, que tenha sido infectada por uma ou mais espécies de vírus. Os vírus infectando o hospedeiro, de que a amostra líquida é obtida, pode ser um vírus de DNA (isto é, um vírus tendo um genoma de DNA) ou um vírus de RNA (isto é, um vírus tendo um genoma de RNA) (recapitulado, p. ex., em: Büchen-Osmond, C. (2003). Taxonomy and Classification of Viruses. Em: Manual of Clinical Microbiology, 8a. ed., vol. 2, p. 1217-1226, ASM Press, Washington DC, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Exemplos de vírus de DNA incluem, inter alia, as famílias de Papovaviridae (p. ex., papilomavírus), Adenoviridae (p. ex., adenovirus) e Herpesviridae (p. ex., vírus Epistein-Barr, citomegalovírus). Exemplos de vírus de RNA incluem, inter alia, as famílias de Picomaviridae (p. ex., polivírus, ronovírus), Flaviviridae (p. ex., vírus da hepatite C), Filoviridae (p. ex., vírus Marburg, ebolavirus) e Retroviridae (p. ex., vívus da imunodeficiência humana (EHV)). Em algumas formas de realização, os ácidos nucléicos a serem detectados são associados com infecções causadas por membros do Retroviridae, particularmente eles são associados com infecções por HIV. O termo “HIV”, como aqui usado, refere-se tanto a espécie HIV-1 como HIV-2 e a quaisquer subtipos derivados delas.
Uma vez que muitos vírus de DNA bem como o Retroviridae (notavelmente a replicação dos Retroviridae geralmente requer transcrição inversa do genoma do vírus de RNA dentro do DNA) podem integrar sua informação genética dentro do genoma da célula hospedeira na forma de um pró-vírus latente, a expressão “ácidos nucléicos associados com infecções virais” não somente se refere a ácidos nucléicos originando-se de vírus livres e de associados com célula, mas também inclui moléculas de DNA provirais sendo integradas dentro do genoma do hospedeiro, moléculas de DNA viral transcritas inversas (isto é, os “intermediários” da replicação viral) e os transcritos derivados de DNA proviral (isto é, moléculas obtidas por transcrição do genoma de DNA hospedeiro).
Tipicamente, os ácidos nucléicos alvo não são submetidos ao método em forma isolado, porém em forma de uma amostra que é suspeita de incluir uma ou mais espécies de ácidos nucleicos alvo. A expressão “uma ou mais espécies” refere-se a um ou mais diferentes tipos de ácidos nucleicos, tais como moléculas tendo diferentes sequências de ácido nucleico e/ou moléculas descendentes de diversas origens (p. ex., ácidos nucleicos derivados de diferentes patógenos infectando uma célula hospedeira).
O termo amostra refere-se a qualquer líquido que for para ser analisado e que seja suspeito de incluir uma ou mais espécies de ácidos nucleicos alvo a serem detectados. Assim, uma amostra pode incluir preparações de ácidos nucleicos purificadas, dissolvidas em água ou um tampão adequado (p. ex., Tris/EDTA), bem como várias amostras biológicas. Exemplos de amostras líquidas que podem ser analisadas usando-se a invenção incluem, inter alia, soluções químicas orgânicas e inorgânicas, água de beber, águas servidas, fluidos corporais humanos e não-humanos, tais como sangue integral, plasma, soro, urina, escarro, saliva ou fluido cerebrospinhal, extratos celulares de animais, plantas ou culturas de tecido, suspensões de células procarióticas e eucarióticas e similares.
Sangue integral pode referir-se a sangue com todos seus constituintes. Em outras palavras, sangue integral inclui tanto células sanguíneas tais como eritrócitos, leucócitos e trombócitos e plasma sanguíneo em que as células sanguíneas são suspensas.
A amostra pode ainda incluir um ou mais agentes adicionais, tais como diluentes, solventes ou tampões, que podem resultar de uma purificação opcional e/ou processamento da amostra antes de submetê-la ao método. Entretanto, em algumas formas de realização, a amostra analisada é uma amostra não tratada, tal como uma amostra de sangue integral não tratada. O termo não tratado pode indicar que, após coletar a amostra (p. ex., por retirada de sangue de um paciente) e antes de submetê-la ao método não mais processamento de amostra (p. ex., métodos de fracionamento, secagem/reconstituição ou similar) ocorre.
O volume da amostra de fluido a ser analisado pode ser na faixa de 1 μΐ a 50 μΐ, tipicamente na faixa de 1 μΐ a 45 μΐ ou 1 μΐ a 40 μΐ ou 1 μΐ a 30 μΐ ou 1 μΐ a 25 μΐ ou 1 μΐ a 20 μΐ ou 1 μΐ a 15 μΐ. Em formas de realização particulares, o volume da amostra fluida é na faixa de 1 μΐ a 10 μΐ. Amostras de sangue integral podem ser analisadas usando-se volumes excedendo 50 μΐ também.
Uma molécula de captura refere-se a uma molécula que mostra um comportamento de ligação e/ou reatividade característica específicos, que tomam-na adequada para a formação de complexos com um ácido nucléico alvo. Os ácidos nucleicos são tipicamente usados como moléculas de captura. Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser usados como moléculas de captura incluem ácidos nucleicos naturalmente ocorrentes, tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), bem como análogos de ácido nucléico, tais como inter alia ácidos nucleicos de peptídeo (PNA) ou ácidos nucleicos travados (LNA). Exemplos específicos de ácidos nucleicos naturalmente ocorrentes incluem sequências de DNA tais como moléculas de DNA ou cDNA genômicos, bem como sequências de RNA tais como moléculas de hnRNA, mRNA ou rRNA ou suas sequências de ácido nucléico complementares inversas. Tais ácidos nucleicos podem ser de qualquer comprimento e podem ser moléculas de filamento único ou de duplo filamento. Tipicamente, as moléculas de captura de ácido nucléico são oligonucleotídeos de filamento único tendo um comprimento de 10 a 150 nucleotídeos, p. ex., de 20 a 100 nucleotídeos ou 30 a 70 nucleotídeos. Em formas de realização específicas, as moléculas de captura podem ser usadas como iniciadores em uma PCR, a fim de amplificar qualquer ácido nucléico alvo de interesse estando presente em uma dada amostra de fluido.
Em algumas formas de realização, as moléculas de captura podem incluir pelo menos uma região de sequência específica (isto é, a parte de ligação referida acima), que é complementar a uma região de sequência de um ácido nucleico alvo (p. ex., ácido nucleico associado com uma infecção viral), assim permitindo pareamento de base entre as moléculas de captura e o ácido nucleico a ser detectado. Tipicamente, a região de ligação específica é pelo menos de 20 nucleotídeos de comprimento, pelo menos 30 nucleotídeos ou pelo menos 40 nucleotídeos. Particularmente, a sequência de nucleotídeo da região de ligação das moléculas de captura é complementar à correspondente sequência de nucleotídeo do ácido nucleico alvo.
As moléculas de captura podem ser providas (p. ex., em forma liofilizada ou secada) em uma ou mais da pelo menos uma estrutura adaptada para acomodar líquidos do dispositivo como descrito acima antes da introdução da amostra de fluido a ser analisada. Altemativamente, as moléculas de captura podem ser introduzidas dentro do dispositivo juntamente com a amostra (p. ex., concomitantemente) ou após a amostra já ter sido introduzida.
Uma ou mais espécies de moléculas de captura podem ser empregadas. Em outras palavras, um ou mais diferentes tipos de moléculas de captura, tais como uma ou mais moléculas de ácido nucleico tendo diferentes sequências de nucleotídeo, podem ser usadas. Mais do que uma espécie de molécula de captura concomitantemente usadas podem também ser referidas como “biblioteca”. Tais bibliotecas incluem pelo menos duas diferentes moléculas, porém podem também incluir muitas mais diferentes moléculas, p. ex., pelo menos 5 diferentes espécies, pelo menos 10 diferentes espécies, pelo menos 30 diferentes espécies e assim em diante. As bibliotecas podem também estar presentes em forma de elementos de formação ou qualquer outro arranjo espacial.
Em algumas formas de realização, a análise realizada no dispositivo inclui ainda contatar os complexos incluindo um ácido nucleico alvo a ser detectado e uma molécula de captura com um membro de ligação do dispositivo, o membro de ligação sendo configurado para ligar o grupo âncora da molécula de captura a fim de ligar os complexos no membro de ligação.
As expressões membro de ligação ou membro de suporte referem-se a qualquer matriz a que as moléculas de captura (e assim também quaisquer complexos incluindo tais moléculas de captura) podem ser acopladas via o grupo âncora das moléculas de captura por interações covalentes ou não-covalentes. Exemplos de tais matrizes incluem, inter alia, os substratos de elementos de formação ou partículas sintéticas, tais como contas magnéticas (p. ex., contas de poliestirol paramagnético, também conhecidas como Dynabeads®) e contas de látex, bem como superfícies porosas, tais como CPG e similares. Dependendo do tipo de molécula de captura, do tipo de grupo âncora e da aplicação pretendida, em cada caso uma grande variedade de ligações é possível. Por exemplo, no caso de o grupo âncora das moléculas de captura puder ser um componente de biotina, que possa ser acoplado a um grupo avidina ou estreptavidina sendo ligado ao membro de ligação. Altemativamente, as moléculas de captura podem incluir uma extensão de resíduos de adenosina (p. ex., 10 resíduos de adenosina) que interagirão com uma correspondente extensão dos resíduos de timidina ligados ao membro de ligação. Reagentes de acoplamento específicos incluindo grupos âncora são comercialmente disponíveis de diferentes provedores e bem estabelecidos na arte (vide, por exemplo, Sambrook, J. et al., supra; Ausubel, F.M. et al., supra e Lottspeich, F., e Zorbas H., supra).
O membro de ligação pode ser provido em uma ou mais das estruturas do dispositivo antes da introdução da amostra de fluido a ser analisada. O membro de ligação pode ser provido na mesma estrutura que as moléculas de captura ou em pelo menos uma diferente estrutura. Tipicamente, a etapa de formar complexos de moléculas de captura com ácidos nucleicos alvo é realizada espacialmente separada da etapa de contatar os complexos com o membro de ligação, isto é, em diferentes estruturas ou poços ou câmaras de reação do dispositivo. Por exemplo, a etapa de formar complexos de moléculas de captura com ácidos nucleicos alvo pode ser realizada em um poço de lise e a etapa de contatar os complexos com o membro de ligação pode ser realizada em um poço central, representado, por exemplo, na Fig. 17. Em tais formas de realização, as moléculas de captura e o membro de ligação são usualmente providos em diferentes estruturas, adaptadas para acomodar líquidos. Em vez de prover o membro de ligação no dispositivo antes da adição da amostra, o membro de ligação pode ser introduzido dentro do dispositivo juntamente com a amostra (isto é, concomitantemente) ou após a amostra já ter sido introduzida.
Em formas de realização particulares, o método inclui ainda submeter o ácido nucleico alvo a ampliação, isto é, aumentar sua quantidade presente na amostra antes de submeter a mesma à análise adicional a fim de facilitar mais a detecção. Tipicamente, a ampliação do ácido nucleico alvo é conseguida por meio de uma ampliação cíclica. A ampliação cíclica pode incluir qualquer número de ciclos de ampliação que seja igual ou maior do que dois. Usualmente, a reação de ampliação cíclica inclui pelo menos 10 ou pelo menos 20 ciclos.
Uma ampliação cíclica exemplar é uma reação de cadeia de polimerase (PCR). PCR é um método padrão estabelecido em biologia molecular, que é descrito em detalhe, p. ex., em Sambrook et al., supra; e em Ausubel, F.M. et al., supra. Tipicamente, a PCR é usada para a ampliação de moléculas de DNA de duplo filamento empregando-se uma polimerase de DNA termostável. Em algumas formas de realização, a DNA polimerase usada na ampliação cíclica tem atividade de exonuclease, particularmente atividade de exonuclease 5’ —> 3’. Exemplos de tais DNA polimerases incluem, inter alia, Taq DNA polimerase ou Tth DNA polimerase (que são comercialmente disponíveis de múltiplos provedores).
Quando o ácido nucléico alvo for uma molécula de RNA, o ácido nucléico alvo pode ser submetido a transcrição inversa (isto é, para produzir uma molécula de DNA de uma correspondente molécula de RNA) antes de submetê-lo a ampliação. A transcrição inversa é outro método padrão em biologia molecular e também descrito, p. ex., em Sambrook et al., supra; e em Ausubel, F.M. et al., supra.
Para ampliação de ácido nucléico, o dispositivo pode incluir uma ou mais unidades de controle de temperatura e/ou unidades de regulação de temperatura para controlar e/ou regular a temperatura dentro da câmara de reação. Tal unidade de controle de temperatura e/ou unidade de regulação de temperatura pode incluir um ou mais elementos de aquecimento e/ou de esfriamento separados, que possam diretamente contatar uma ou mais câmaras de reação do dispositivo. Tipicamente, o um ou mais elementos de aquecimento e/ou esfriamento são produzidos de um material condutivo de calor. Exemplos de tais materiais condutivos de calor incluem, inter alia, silício, materiais cerâmicos como cerâmica de óxido de alumínio e/ou metais como aço de alto grau, alumínio, cobre ou latão. Uma descrição exemplar de uma unidade de controle de temperatura e/ou unidade de regulação de temperatura adequadas pode também ser encontrada no Pedido de Patente Internacional No. WO 01/02094, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Por exemplo, o controle/regulagem da temperatura dentro de uma estrutura adaptada para acomodar líquidos podem também ser conseguidos utilizando-se um corpo de câmara produzido de um material eletricamente condutivo. O corpo de câmara pode ser um corpo sólido circundando pelo menos parcialmente a pelo menos uma estrutura ou câmara de reação do dispositivo. A estrutura pode ser, pelo menos em parte, um componente integral do corpo de câmara (isto é, produzido do mesmo material que o corpo de câmara). Exemplos de materiais eletricamente condutivos incluem materiais sintéticos eletricamente condutivos, tais como poliamida com 5 a 30 % de fibras de carbono, policarbonato com 5 a 30 % de fibras de carbono, poliamida com 2 a 20 % de fibras de aço inoxidável e sulfeto de polifenileno com 5 a 40 % de fibras de carbono. Além disso, o corpo de câmara pode ser projetado para incluir dilatações e diminuições, o que permite aquecimento específico da câmara de reação ou das correspondentes superfícies.
A medição da temperatura da estrutura pode ser realizada por vários métodos bem estabelecidos na arte, por exemplo, utilizando-se sensores de resistência integrada, sensores semi-condutores, sensores de guia de onda de luz, corantes policromáticos ou cristais líquidos. Além disso, a temperaturas na câmara de reação pode ser determinada utilizando-se um sensor de temperatura integrado dentro do corpo de câmara, um pirômetro ou um sensor infravermelho ou medindo-se a alteração dependente de temperatura de parâmetros tais como o índice de refração na superfície em que a detecção ocorre ou o valor do pH da amostra, por exemplo, medindo-se a alteração de cor de um indicador sensível a pH.
Usualmente, a ampliação tal como uma PCR inclui três etapas básicas - desnaturação, anelação dos iniciadores e extensão dos iniciadores que são iterativamente realizadas em uma maneira cíclica. Entretanto, a ampliação pode ainda incluir uma etapa de desnaturação inicial antes da primeira ampliação “verdadeira” e/ou uma etapa de extensão final após completamento do ciclo de ampliação final, respectivamente. Em algumas formas de realização, a ampliação do ácido nucleico alvo inclui (pelo menos) uma etapa de desnaturar ácidos nucleicos de duplo filamento e/ou uma etapa combinada de anelar e estender as moléculas iniciadoras nos ácidos nucleicos alvo (isto é, “PCR de duas etapas”.
Tipicamente, a etapa de desnaturação envolve o aquecimento da amostra a ser analisada a uma temperatura de 95 - 95 °C, tipicamente por
0,5 segundos a 5 minutos, assim resultando na dissociação de filamento dos padrões de ácido nucléico de duplo filamento. Submeter uma amostra a ser analisada a tal etapa de desnaturação resulta em (isto é, permite) a desnaturação simultânea dos ácidos nucleicos de duplo filamento da amostra, incluindo ácidos nucleicos alvo de duplo filamento e complexos de moléculas de captura com ácidos nucleicos alvo (ligados ao membro de ligação), os últimos resultando na liberação dos ácidos nucleicos alvo pelo membro de ligação.
Tipicamente, a etapa de anelar envolve a esfriamento da amostra a ser analisada a uma temperatura de 40 - 65 °C, tipicamente por 1 segundo a 5 minutos, para permitir a associação (isto é, a hibridização/pareamento de base) das moléculas iniciadoras com os filamentos de padrão de ácido nucléico desnaturado. A temperatura de reação empregada depende das propriedades químicas e/ou físicas das moléculas iniciadoras a serem aneladas, tais como sua composição de sequência de nucleotídeos, temperatura de fusão, sua tendência para dobra intra-molecular (p. ex., a formação de estruturas em grampo de cabelo ou curvas de duplo filamento) e similares. Dentro de algumas formas de realização, submeter uma amostra a ser analisada a tal etapa de anelação resulta em (isto é, permite) reassociação de moléculas alvo de duplo filamento e na formação de complexos de ácidos nucleicos alvo com moléculas de captura, as últimas resultando na captura ou recaptura dos ácidos nucleicos alvo no membro de ligação. Assim, em algumas formas de realização, a etapa de anelar é realizada concomitantemente com a etapa de capturar ácidos nucleicos alvo no membro de ligação, pela formação de complexos com as moléculas de captura.
Finalmente, uma etapa de extensão típica envolve a extensão das moléculas iniciadoras hibridizadas para produzir cópias de comprimento total dos filamentos de padrão de DNA por uma DNA polimerase. O comprimento do fragmento de DNA ampliado é determinado pelas terminações 5’ dos pares de iniciadores empregados. Tipicamente, a etapa de alongamento é realizada em uma temperatura de 70 - 72 °C por 1 segundo a 10 minutos. Dentro de algumas formas de realização, submeter uma amostra a ser analisada a tal etapa de extensão pode resultar na replicação dos ácidos nucléicos alvo a serem analisados permitindo-se que os complexos de um iniciador com um ácido nucleico alvo, que tenha sido formado durante a etapa de anelação, sejam estendidos para gerar fragmentos de ácido nucleico ampliado de duplo filamento, opcionalmente tendo incorporado um marcador detectável, que subsequentemente pode ser detectado.
Em formas de realização específicas, o método inclui ainda capturar os ácidos nucléicos alvo que foram ampliados, tipicamente submetendo a amostra a ser analisada a PCR, com respeito ao membro de ligação (isto é, imobilizando os ácidos nucléicos alvo sobre ele). Como já descrito acima, os ácidos nucléicos alvo podem ser capturados com respeito ao membro de ligação, formando-se complexos com as moléculas de captura que estão ainda acopladas ao membro de ligação via o grupo âncora.
O método pode ainda incluir liberar os ácidos nucléicos alvo ampliados do membro de ligação e repetir as etapas de submeter um ou mais ácidos nucléicos alvo a ampliação e capturar o ácido nucleico alvo ampliado com respeito ao membro de ligação. Liberação pode incluir a separação ou desligamento dos ácidos nucléicos alvo do membro de ligação. Isto pode ser realizado, por exemplo, enzimaticamente via a divagem de quaisquer ligações covalentes ou em casos em que os ácidos nucléicos alvo são ligados ao membro de ligação por moléculas de captura de ácido nucleico via pareamento de base complementar, aumentando-se a temperatura da estrutura em que o ensaio é realizado, assim resultando em separação do filamento de ácido nucleico (isto é, desnaturação).
Em tal forma de realização, o ciclo de liberar os ácidos nucleicos alvo ampliados capturados do membro de ligação e repetir as etapas de submeter um ou mais ácidos nucleicos alvo a ampliação e captura dos ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação pode ser realizado pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes ou pelo menos 100 vezes. A etapa de determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode ser realizada após pelo menos um ciclo, p. ex., após cada ciclo de liberação dos ácidos nucleicos alvo ampliados capturados do membro de ligação e repetir as etapas de submeter um ou mais ácidos nucleicos alvo a ampliação e captura dos ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação.
A etapa de formar complexos, cada um incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura, em que a molécula de captura inclui uma parte de ligação específica de uma região do ácido nucleico alvo e um grupo âncora pode ser realizada espacialmente separada da etapa de contatar os complexos com um membro de ligação, o membro de ligação sendo configurado para ligar o grupo âncora da molécula de captura para ligar os complexos do membro de ligação. Em tal forma de realização, o método é realizado em um dispositivo que inclui pelo menos duas estruturas adaptadas para acomodar líquidos. As pelo menos duas estruturas podem ficar em comunicação fluida, p. ex., com uma rede microfluídica. Por exemplo, o método pode ser realizado no dispositivo 500 como ilustrado nas Figuras 18 e 19. Cada um dos complexos, incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura, pode ser formado na primeira estrutura 502. O complexo pode então ser transferido para a segunda estrutura 512, em que os complexos são contatados com um membro de ligação como descrito acima, que é configurado para ligar-se a um grupo âncora da molécula de captura.
Determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode incluir a detecção/determinação de parâmetros tais como condutividade elétrica, potencial redox, absorção óptica, intensidade da fluorescência ou bioluminescência, que permitem medições qualitativas e/ou quantitativas dos ácidos nucleicos alvo capturados (ou recapturados) no membro de ligação. Somente um destes parâmetros pode ser determinado porém é também possível determinar mais do que um parâmetro (p. ex., condutividade elétrica e a intensidade de um sinal de fluorescência causado por um rótulo adequado), concomitante ou consecutivamente.
Para realizar a reação de detecção, os ácidos nucleicos alvo podem ser rotulados com um ou mais rótulos detectáveis. Um rótulo detectável pode ser qualquer composto ou componente que inclua uma ou mais substâncias ou enzimas químicas apropriadas, que direta ou indiretamente gerem um composto ou sinal detectável em uma reação química, física ou enzimática. Tal rótulo pode assim ser necessário para ou facilitará a detecção do composto repórter de interesse ao ser capaz de formar interações com dito composto repórter. Como aqui usado, o termo é para ser entendido incluir tanto rótulos detectáveis como tais (também referidos como “marcadores”) como também quaisquer compostos acoplados a um ou mais de tais marcadores detectáveis. Além disso, os componentes interferindo com a geração de um sinal detectável por um rótulo (p. ex., um extintor “sequestrando” as emissões que resultaram da excitação do fluoróforo, contanto que o extintor e o fluoróforo estejam em estreita proximidade entre si) podem também pertencer aos rótulos detectáveis. Os rótulos detectáveis podem ser incorporados ou ligados aos ácidos nucleicos alvo, p. ex., na forma de ribonucleotídeos, desoxinucleotídeos ou didesoxinucleotídeos modificados e/ou rotulados.
A rotulação pode ser conseguida por métodos bem conhecidos na arte (vide, por exemplo, Sambrook, J. et ah, supra; e Lottspeich, F., and Zorbas H., supra). Os rótulos podem ser selecionados de, inter alia, rótulos fluorescentes, rótulos enzimáticos, rótulos coloridos, rótulos cromogênicos, rótulos luminescentes, rótulos radioativos, haptenos, biotina, complexos metálicos, metais e ouro coloidal. Todos esses tipos de rótulos são bem estabelecidos na arte. Um exemplo de uma reação física que é mediada por tais rótulos é a emissão de fluorescência ou fosforescência na irradiação ou excitação ou a emissão de raios-x quando utilizando-se um rótulo radioativo. A fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase e βlactamase são exemplos de rótulos enzimáticos, que catalisam a formação de produtos de reação cromogênicos. Em formas de realização específicas, os rótulos detectáveis são rótulos fluorescentes. Numerosos rótulos fluorescentes são bem estabelecidos na arte e comercialmente disponíveis por diferentes fornecedores (vide, por exemplo, The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10a. ed. (2006), Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA, que é incorporado por referência em sua totalidade).
Para detectar tais rótulos, um sistema de detecção pode ser usado que é adequado para determinar valores indicativos da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado em um membro de suporte. O sistema de detecção pode ser conectado ao dispositivo 500. Tipicamente, o sistema de detecção é posicionado oposto a um da estrutura 512, opcionalmente oposto a uma região de superfície particular, onde a detecção ocorre. A seleção de um sistema de detecção adequado depende de diversos parâmetros, tais como o tipo de rótulos usados para detecção ou a espécie de análise realizada. Vários sistemas de detecção óptica e não óptica são bem estabelecidos na arte. Uma descrição geral dos sistemas de detecção que podem ser usados com o método pode ser encontrada, p. ex., em Lottspeich, F. e Zorbas H. supra.
Tipicamente, o sistema de detecção é um sistema de detecção óptica. Em algumas formas de realização, realizar o método envolve simples sistemas de detecção, que podem ser baseados na medição de parâmetros tais como fluorescência, absorção óptica, transferência de ressonância e similares.
Em outras formas de realização, os sistemas de detecção são baseados na comparação das intensidades de fluorescência de ácidos nucleicos espectralmente excitados, rotulados com fluoróforos. A fluorescência é a capacidade de moléculas particulares emitirem sua própria luz quando excitadas por luz de um comprimento de onda particular, resultando em um comportamento de absorção e emissão característico. Em particular, a detecção quantitativa de sinais de fluorescência é realizada por meio de métodos modificados de microscopia de fluorescência (para recapitulação, vide, p. ex., Lichtman, J.W., e Conchello, J.A. (2005) Nature Methods 2, 910-919; Zimmermann, T. (2005) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95, 245-265, que é incorporado por referência em sua totalidade). Desse modo, os sinais resultantes da absorção de luz e emissão de luz, respectivamente, são separados por um ou mais filtros e/ou dicróitos e convertidos em imagem em detectores adequados. Análise de dados é realizada por meio de processamento de imagem digital. O processamento de imagem digital pode ser conseguido com diversos pacotes de software bem conhecidos na arte (tais como Mathematica Digital Image Processing, ΕΙΚΟΝΑ, ou Image-PRO). Outro software adequado para tais propósitos é o Iconoclust software (Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Alemanha).
Sistemas de detecção adequados podem ser baseados em métodos clássicos para medir um sinal fluorescente, tal como epifluorescência ou microscopia de fluorescência de campo escuro (recapitulado, p. ex., em: Lakowicz, J.R. (1999) Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2a ed., Plenum Publishing Corp., NY, que é incorporado por referência em sua totalidade).
Outro sistema de detecção óptica que pode ser usado é microscopia de fluorescência confocal, em que o objeto é iluminado no plano focal da lente via uma fonte de luz pontual. Importantemente, a fonte de luz pontual e detector de luz objeto e pontual são localizados em planos opticamente conjugados. Exemplos de tais sistemas confocais são descritos em detalhes, por exemplo, em Diaspro, A. (2002) Confocal and 2-photon microscopy; Foundations, Applications and Advances, Wiley-Liss, Hobroken, NJ, que é incorporado por referência em sua totalidade. O sistema óptico de fluorescência é usualmente um microscópio de fluorescência sem um autofoco, por exemplo, um microscópio de fluorescência tendo um foco fixo.
Outros métodos de detecção de fluorescência que podem também ser usados incluem, inter alia, microscopia de fluorescência interna total (vide, p. ex., Axelrod, D. (1999) Surface fluorescence microscopy with evanescent illumination, em: Lacey, A. (ed.) Light Microscopy in Biology, Oxford University Press, New York, 399-423), fluorescence lifetime imaging microscopy (vide, por exemplo, Dowling, K. et al. (1999) J. Mod. Optics 46, 199-209), fluorescence resonance energy transfer (FRET; vide, por exemplo, Periasamy, A. (2001) J. Biomed. Optics 6, 287-291), bioluminescence resonance energy transfer (BRET; see, e.g., Wilson, T., and Hastings, J.W. (1998) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 197-230), e fluorescence correlation spectroscopy (vide, p. ex., Hess, S. T. et al. (2002) Biochemistry 41, 697705); cada um dos acima sendo incorporado por referência em sua totalidade.
Em formas de realização específicas, a detecção é realizada usando-se FRET ou BRET, que são baseados na respectiva formação de pares extintores de fluorescência ou bioluminescência. O uso de FRET é também descrito, p. ex., emLiu, B. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102, 589593; and Szollosi, J. et al. (2002) J. Biotechnol. 82, 251-266. O uso de BRET é detalhado, por exemplo, em Prinz, A. et al. (2006) Chembiochem. 1, 10071012; and Xu, Y. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 151-156; cada um dos acima sendo incorporado por referência em sua totalidade.
Determinar um ou mais valores indicativos da presença e/ou quantidade dos ácidos nucléicos alvo capturados pode incluir monitoramento dependente do tempo do um ou mais valores indicativos obtidos (isto é, a realização repetida da etapa de determinação/detecção e monitoramento do curso do valor indicativo em relação ao tempo).
A etapa de prover os ácidos nucleicos alvo pode incluir liberar os ácidos nucleicos alvo de material biológico incluído na amostra. Para este fim, a amostra pode ser aquecida a fim de destruir as membranas celulares e/ou capsídeos virais (p. ex., empregando-se uma unidade de controle de temperatura e/ou unidade de regulação de temperatura como descrito abaixo). Em algumas formas de realização, esta etapa de liberação inclui contatar a amostra de fluido com um reagente de lise, por exemplo, um reagente incluindo um ou mais detergentes que desintegram as membranas celulares e/ou capsídeos virais. Tais reagentes de lise são bem conhecidos na arte (vide, por exemplo, Sambrook, J. et al. (1989) Molecular, Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e comercialmente disponíveis em muitos fornecedores.
O método pode ainda incluir separar o um ou mais ácidos nucleicos alvo do material concomitante.
O fornecimento dos ácidos nucleicos alvo pode ser realizado espacialmente separado das etapas de contatar os complexos, cada um incluindo um ácido nucléico alvo e uma molécula de captura com o membro de ligação, submeter os ácidos nucleicos alvo a ampliação, capturar os ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação e determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados. P. ex., os ácidos nucleicos alvo podem ser providos na mesma estrutura 502 em que cada um dos complexos incluindo um ácido nucléico alvo e uma molécula de captura são formados.
Em uma outra forma de realização, o método é realizado em um dispositivo como descrito acima. Por exemplo, o dispositivo pode incluir um primeiro poço 502 e cada um dos complexos incluindo um ácido nucléico alvo e uma molécula de captura é formado no primeiro poço 502. Além disso, o dispositivo pode incluir um segundo poço 512 e determinação de um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode ser realizada no segundo poço 512, configurado para detectar um ou mais ácidos nucleicos alvo. O segundo poço 512 pode incluir um elemento de cobertura cobrindo o segundo poço e uma unidade atuadora adaptada para ser acionada para deformar o elemento de cobertura. Além disso, a submissão de um ou mais ácidos nucleicos alvo a ampliação e/ou recaptura dos ácidos nucleicos alvo ampliados com respeito ao membro de ligação pode também ser realizada no segundo poço 512.
A determinação de um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados pode ser realizada com o atuador acionado para deformar o elemento de cobertura. Em tal forma de realização, o elemento de cobertura pode ser deformado de tal maneira que o volume do poço de detecção 512 é reduzido. Além disso, o volume do segundo poço pode ser reaumentado após a determinação do valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo capturados.
De acordo com uma outra forma de realização, é provido um método incluindo
a) prover uma quantidade de composto repórter; um primeiro membro de ligação sendo configurado para ligar um grupo âncora de uma molécula de captura; um segundo membro de ligação capaz de capturar o composto repórter; uma quantidade de um ácido nucleico alvo capaz de formar complexos com o composto repórter; a formação dos complexos com um composto repórter inibindo a captura do composto repórter pelo segundo membro de ligação; uma quantidade das moléculas de captura em que cada molécula de captura inclui uma parte de ligação específica de uma região dos ácidos nucleicos alvo e um grupo âncora;
b) formar complexos, cada um incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura;
c) contatar os complexos com o primeiro membro de ligação para ligar os complexos ao primeiro membro de ligação;
d) liberar pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo do primeiro membro de ligação;
e) formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo;
f) capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação; e
g) determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
Uma molécula repórter ou composto repórter pode ser qualquer molécula que seja capaz de formar complexos com um ou mais ácidos nucleicos alvo e que possa ser capturada em um membro de suporte, p. ex., o segundo membro de ligação, em que a formação de complexos com os ácidos nucleicos alvo inibe a captura do composto repórter no membro de suporte, p. ex., o segundo membro de ligação. A expressão “capaz(es) de formar complexos” pode referir-se a qualquer interação entre uma molécula repórter e um ácido nucleico alvo. Em outras palavras, o termo indica a ligação das moléculas alvo entre si, que pode ser realizada via uma região de ligação ou diferentes regiões de ligação incluídas na molécula repórter que medeia a interação com o alvo (tal como via pareamento de base WatsonCrick entre sequências de nucleotídeos complementares). Tipicamente, a interação é reversível. Analogamente, ser capturada em um membro de suporte ou ser capturada no segundo membro de ligação inclui qualquer interação direta ou indireta (por exemplo, via moléculas de captura; vide abaixo) de uma molécula repórter com um dado membro de suporte. Esta interação é geralmente reversível também.
Em geral, as moléculas repórter podem ser moléculas de ácido nucleico (isto é, moléculas de RNA ou DNA como descrito acima) tendo um comprimento de 10 a 100 nucleotídeos, por exemplo, 15 a 50 nucleotídeos, 15 a 40 nucleotídeos ou 20 a 30 nucleotídeos. Usualmente, as moléculas repórter são moléculas de ácido nucleico de duplo filamento (isto é, oligonucleotídeos). O composto repórter é configurado de modo que a ligação de tal molécula repórter em um ácido nucleico alvo a ser detectado inibe a captura da molécula repórter no segundo membro de ligação. As moléculas repórter de ácido nucleico podem incluir pelo menos uma região de ligação específica (aqui também referida como “sítio de interação”) que não é somente capaz de interagir com o ácido nucleico alvo (p. ex., por ligação a uma região de sequência pelo menos parcialmente complementar do ácido nucleico alvo, assim permitindo, p. ex., que pareamento de base WatsonCrick entre a molécula repórter e o ácido nucleico alvo seja detectado), mas também de ser capturada no segundo membro de ligação. Tipicamente, a região de ligação específica, incluída na molécula repórter, tem pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento, p. ex., pelo menos 15 nucleotídeos, pelo menos 18 nucleotídeos ou pelo menos 22 nucleotídeos. Em formas de realização particulares, a sequência de nucleotídeo da parte de ligação das moléculas repórter é complementar à correspondente sequência de nucleotídeo do ácido nucleico alvo.
Uma ou mais espécies de moléculas repórter pode(m) ser empregada(s); em outras palavras, um ou mais diferentes tipos de moléculas repórter, tais como uma ou mais moléculas de ácido nucleico, tendo diferentes sequências de nucleotídeo, pode(m) ser usado.
Um primeiro membro de ligação pode ser um membro de ligação como descrito acima. Por exemplo, um primeiro membro de ligação pode referir-se a qualquer matriz sólida a que as moléculas de captura e, assim também quaisquer complexos incluindo tais moléculas de captura, podem ser acoplados via o grupo âncora das moléculas de captura por interações covalentes ou não-covalentes. Exemplos de tais matrizes incluem, inter alia, partículas sintéticas tais como contas magnéticas (p, ex., contas de poliestirol paramagnéticas, também conhecidas como Dynabeads®) e contas de látex.
Um segundo membro de ligação pode ser um membro de ligação como descrito acima. Por exemplo, um segundo membro de ligação refere-se a qualquer matriz sólida, em que as moléculas repórter podem ser capturadas diretamente (p. ex., via um grupo âncora incluído na molécula repórter) ou em uma maneira indireta via uma ou mais espécies de moléculas de captura específicas de repórter, capazes de capturar uma molécula repórter no segundo membro de ligação por interações covalentes ou não-covalentes. Exemplos de segundos membros de ligação que podem ser usados incluem, inter alia, os substratos de elementos de formação (p. ex., lâminas de microscópio, pastilhas ou materiais cerâmicos).
Uma molécula de captura específica de repórter pode ser qualquer molécula sendo incluída no (p. ex., aquela fixada ou imobilizada no) segundo membro de ligação, que mostre um comportamento de ligação específico e/ou uma reatividade característica, que tome-a adequada para a formação de complexos com uma molécula repórter (isto é, a ligação à molécula repórter). Os ácidos nucleicos são tipicamente usados como moléculas de captura. Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser usados como moléculas de captura específicas de repórter incluem ácidos nucleicos ocorrendo naturalmente, tais como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), bem como análogos de ácido nucléico, tais como, inter alia, ácidos nucleicos de peptídeo (PNA) ou ácidos nucleicos travados (LNA). Exemplos específicos de ácidos nucleicos naturalmente ocorrentes incluem sequências de DNA, tais como moléculas de DNA ou cDNA genômico, bem como sequências de RNA, tais como moléculas de hnRNA, mRNA ou rRNA ou suas sequências de ácido nucleico complementares inversas. Tais ácidos nucleicos podem ser de qualquer comprimento e podem ser moléculas de filamento único ou de duplo filamento. Tipicamente, as moléculas de captura específicas de repórter são oligonucleotídeos de filamento único, tendo um comprimento de 10 a 100 nucleotídeos, p. ex., de 15 a 50 nucleotídeos, p. ex., de 15 a 50 nucleotídeos ou 20 a 30 nucleotídeos.
As moléculas de captura específicas de repórter podem incluir pelo menos uma região de sequência específica (isto é, a região de ligação), que é configurada para ligar uma molécula repórter, por exemplo, para interagir com uma região de sequência complementar de uma molécula repórter via pareamento de bases entre as moléculas de captura específicas de repórter e o ácido nucleico a ser detectado. Tipicamente, a região de ligação específica tem pelo menos 12 nucleotídeos de comprimento, p. ex., pelo menos 15 nucleotídeos, pelo menos 18 nucleotídeos ou pelo menos 22 nucleotídeos. Em formas de realização particulares, a sequência de nucleotídeo da região de ligação das moléculas de captura específicas de repórter é complementar à sequência de nucleotídeo correspondente da molécula repórter.
Em algumas formas de realização, pelo menos uma parte de um sítio de interação do composto repórter sendo capaz de formar um complexo com um ácido nucleico alvo é também capaz de formar um complexo com uma molécula de captura específica de repórter. Em outras palavras, as moléculas de captura específicas de repórter e os ácidos nucleicos alvo competem para formar um complexo com o composto repórter, isto é, as respectivas regiões de ligação incluídas nas moléculas de captura específicas de repórter e os ácidos nucleicos alvo reconhecem a(s) mesma(s) ou pelo menos sequência(s) correspondentes similares de uma molécula repórter. O termo “sequências similares”, como usado aqui, indica sequências que diferem somente em uma ou mais desigualdades de nucleotídeo (isto é, pares não complementares de nucleotídeos) ou em um ou mais de adição, inserção ou deleção de nucleotídeo único (isto é, resíduos de nucleotídeos adicionais ou faltantes). Assim, as respectivas regiões de ligação incluídas na moléculas de captura específicas de repórter e nos ácidos nucleicos alvo são pelo menos parcialmente idênticas. A expressão “parcialmente idêntica” como aqui usada indica sequências diferindo somente em um ou mais nucleotídeos únicos, como descrito acima, ou sequências tendo sítio de ligação sobrepondo-se, isto é, sequências compartilhando uma sequência de nucleotídeos comum, porém diferem em pelo menos uma outra parte da região de sequência. Entretanto, é também possível que as respectivas regiões de ligação incluídas nas moléculas de captura específicas de repórter e nos ácidos nucleicos alvo reconheçam diferentes sequências não-sobrepondo-se (p. ex., adjacentes) de uma molécula repórter, porém a ligação da molécula de captura específica de repórter ou do ácido nucleico alvo na molécula repórter estericamente interfere com a ligação da outra.
Uma ou mais espécies de moléculas de captura específicas de repórter pode(m) ser empregada(s); em outras palavras, um ou mais diferentes tipos de moléculas de captura específicas de repórter, tais como uma ou mais moléculas de ácido nucleico tendo diferentes sequências de nucleotídeo podem ser usados. Mais do que um espécie de molécula de captura específica de repórter concomitantemente usada são também referidas como biblioteca. Tais bibliotecas incluem pelo menos duas mas podem incluir muitas mais diferentes moléculas, p. ex., pelo menos 10 diferentes espécies, pelo menos 20 diferentes espécies, pelo menos 50 diferentes espécies e assim em diante. As bibliotecas podem também ser dispostas em diferentes locais com respeito ao segundo membro de ligação. Por exemplo, elas podem estar presentes na forma de formações ou qualquer outro arranjo espacial.
Uma formação (ou microformação) pode ser um arranjo espacial definido (leiaute) de moléculas de captura tais como moléculas de captura específicas de repórter em um membro de ligação, p. ex., o segundo membro de ligação (também referido como substrato), em que a posição de cada molécula da formação é determinada separadamente. Tipicamente, a microformação inclui sítios definidos ou regiões predeterminadas (também chamadas elementos ou pontos de formação), que podem ser dispostas em um padrão particular, onde cada elemento de formação tipicamente inclui somente uma espécie de moléculas de captura. O arranjo das moléculas de captura, tais como moléculas de captura específicas de repórter do suporte, p. ex., o segundo membro de ligação, pode ser gerado por meio de interações covalente ou não-covalente. Entretanto, as moléculas de captura podem também ser diretamente imobilizadas dentro da câmara de reação de um dispositivo usado para realizar o método (vide abaixo).
Tipicamente, os ácidos nucleicos alvo não são sujeitos ao método em forma isolada, porém em forma de uma amostra que é suspeita de incluir uma ou mais espécies de ácidos nucleicos alvo, isto é, um ou mais diferentes tipos de ácidos nucleicos, tais como moléculas tendo diferentes sequências de nucleotídeo e/ou moléculas descendendo de diferentes origens (p. ex., ácidos nucleicos derivados de diferentes patógenos infectando uma célula hospedeira).
Em algumas formas de realização, o método inclui ainda determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo com base no valor indicativo da presença e/ou quantidade do composto repórter capturado no segundo membro de ligação. Isto é, a presença e/ou quantidade do um ou mais ácidos nucleicos alvo presentes em uma amostra particular podem ser calculadas com base na diferença entre a presença e/ou quantidade do composto repórter estando presente antes da formação dos complexos de ácido nucleico alvo/molécula repórter e a quantidade de composto repórter sendo capturado no segundo membro de ligação, após dita formação de complexo.
Para realizar a reação de detecção, o composto repórter pode incluir um ou mais rótulos detectáveis acima. Em formas de realização específicas, os rótulos detectáveis são rótulos fluorescentes. Numerosos rótulos fluorescentes são bem estabelecidos na arte e comercialmente disponíveis de diferentes fornecedores (vide, por exemplo, The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10a. ed. (2006), Molecular Probes, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA).
Para detectar tais rótulos, o dispositivo usado para realizar ο método pode ainda incluir um sistema de detecção adequado para determinar valores indicativos da presença e/ou quantidade do composto repórter capturado no segundo membro de ligação. P. ex., um sistema de detecção adequado para determinar os valores indicativos da presença e/ou quantidade de ácidos nucleicos alvo capturados em um membro de ligação como descrito acima pode ser usado. Em algumas formas de realização, o método inclui ainda liberar o subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter do segundo membro de ligação após as etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo, capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação e determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade do composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
Em outras forma de realização, as etapas de liberar, formar complexos, capturar e determinar são repetidas N vezes adicionais, onde N é um inteiro maior do que ou igual 1. Em outras palavras, o método é realizado em uma maneira cíclica. Em formas de realização específicas, o inteiro N é > 5, > 10 ou > 20.
Além disso, a etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e a etapa de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação podem ser realizadas concomitantemente.
Em formas de realização particulares, o método inclui ainda submeter os ácidos nucleicos alvo a ampliação, isto é, aumentar sua quantidade presente na amostra antes de submeter os mesmos a mais análise, a fim de facilitar mais detecção. Tipicamente, a ampliação de ácido nucleico alvo é conseguida por meio de uma ampliação cíclica. A ampliação cíclica pode incluir qualquer número de ciclos de ampliação que seja igual ou maior do que dois. Usualmente, a reação de ampliação cíclica inclui pelo menos 10 ou pelo menos 20 ciclos.
Uma ampliação cíclica exemplar é uma reação de cadeia de polimerase (PCR) como descrito acima. Tipicamente, a PCR é usada para ampliação de moléculas de DNA de duplo filamento, empregando-se uma DNA polimerase termostável. Em algumas formas de realização, a DNA polimerase usada na ampliação cíclica tem atividade de exonuclease, particularmente atividade de exonuclease 5'—>3'. Exemplos de tais DNA polimerases incluem, inter alia, Taq DNA polimerase ou Tth DNA polimerase (que são comercialmente disponíveis de múltiplos fornecedores). Por meio desta atividade de exonuclease 5’ —> 3’, a DNA polimerase pode nucleoliticamente atacar os términos rotulados 5’ das moléculas repórter que são ligadas aos ácidos nucleicos alvo, resultando em uma degradação progressiva de tais moléculas repórter. Como resultado, a quantidade de composto repórter que é capturada no segundo membro de ligação adicionalmente diminui durante cada ciclo de reação de ampliação. Opcionalmente, a DNA polimerase empregada pode também exibir atividade de exonuclease 3'—>5' (atividade de leitura de prova”) para remover um nucleotídeo incorreto que tenha sido adicionado ao filamento de DNA nascente em uma particular posição de sequência. Exemplos de tais DNA polimerases tendo ambas atividades de exonuclease incluem inter alia DNA polimerase Pwo e DNA polimerase Pfü (ambas as enzimas são também comercialmente disponíveis em vários fornecedores).
Se o ácido nucléico alvo for uma molécula de RNA, o método pode ainda incluir submeter o ácido nucléico alvo a transcrição inversa, como descrito acima, antes de submetê-lo a ampliação.
A ampliação do ácido nucléico alvo pode ser iniciada antes da etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucléico alvo. Isto é, o ácido nucléico alvo é submetido a ampliação, enquanto permitindo que os compostos repórter formem um complexo com um ácido nucléico alvo, e compostos repórter não em complexo com um ácido nucléico alvo a ser recapturado no segundo membro de ligação.
Para ampliação de ácido nucléico, um dispositivo 500, como ilustrado nas Figuras 18 e 19, pode ser usado para realizar o método que pode ainda incluir uma ou mais unidades de controle de temperatura e/ou unidades de regulação de temperatura como descrito acima, para controlar e/ou regular a temperatura dentro da estrutura ou câmara de reação, p. ex., o poço central 502. A medição da temperatura dentro da câmara de reação pode ser realizada como descrito acima.
A detecção/determinação de um valor indicativo da presença e/ou quantidade dos ácidos nucleicos alvo podem ser realizadas somente uma vez ou mais do que uma vez durante o ensaio realizado. No caso, mais do que uma etapa de detecção, durante um único ensaio, é realizada, em algumas formas de realização o valor médio dos resultados obtidos pode ser calculado. Os dados obtidos em um ou mais ciclos de detecção podem ser analisados e matematicamente processados usando-se apropriado software de computador conhecido por pessoas hábeis na arte, a fim de determinar inter alia a presença, o comprimento ou a sequência de um ou mais ácidos nucleicos alvo e/ou calcular sua quantidade.
Em algumas formas de realização, particularmente se o composto repórter estiver em excesso de ácido nucleico alvo, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação é determinado antes da formação dos complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e a captura de um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação ficam em equilíbrio químico. Por exemplo, a etapa de determinação/detecção é realizada durante a etapa de anelação de uma reação de ampliação. Entretanto, é também possível realizar a reação de determinação/detecção após completamento da etapa de anelação (isto é, durante ou após completamento da etapa de alongamento).
Em uma outra forma de realização, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação é determinado 1 segundo a 120 segundos (p. ex., 1,5, 10, 15, 20, 30, 60 ou 120 s) após iniciar as etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo e de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação.
Em outras formas de realização, o valor indicativo da presença e/ou quantidade do composto repórter capturado no segundo membro de ligação é determinado após pelo menos um ciclo da ampliação cíclica incluindo as etapas de desnaturação, anelação e alongamento, p. ex., durante ou após término da etapa de anelação. Em formas de realização específicas, dito valor é determinado após cada ciclo da ampliação cíclica. Em outras formas de realização específicas, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo ácido nucleico alvo é determinado cada vez após determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
Em algumas formas de realização, determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação inclui monitoramento dependente do tempo do valor indicativo (isto é, da realização repetida da etapa de determinação/detecção monitoramento do curso do valor indicativo durante o tempo).
Em outras forma de realização, o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo é determinado com base em uma curva de calibração correlacionando o valor indicativo da presença e/ou quantidade de câmara de reação com o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo.
O método pode ser realizado em um dispositivo como descrito acima, incluindo uma estrutura adaptada para acomodar líquidos, em que a estrutura inclui pelo menos um membro de ligação e fica em comunicação fluida com uma rede microfluídica; e uma unidade de controle, adaptada para controlar um fluxo de fluido através da rede microfluídica, de tal maneira que as moléculas alvo são capturadas no pelo menos um membro de ligação, adaptado para controlar uma ampliação das moléculas alvo da estrutura e adaptado para controlar a detecção dos compostos capturados no pelo menos um membro de ligação. Por exemplo, o método pode ser realizado em um dispositivo incluindo um substrato rígido; um elemento de cobertura flexível pelo menos parcialmente cobrindo o substrato; uma primeira estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e adaptada para liberar conteúdo de uma ou mais células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo moléculas alvo; uma segunda estrutura formada no substrato, adaptada para acomodar líquidos e incluindo pelo menos um membro de ligação adaptado para capturar as moléculas alvo e para determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de moléculas alvo; uma rede microfluídica interconectando pelo menos a primeira estrutura e a segunda estrutura; e uma unidade atuadora adaptada para efetuar um fluxo de fluido entre a primeira estrutura e a segunda estrutura, pela compressão do elemento de cobertura flexível contra o substrato, para seletivamente fechar uma parte da rede microfluídica.
P. ex., um dispositivo 500 pode ser usado que inclui um primeiro poço 502. Em tal forma de realização, a etapa de formar complexos, cada um incluindo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura, é realizada no primeiro poço.
O dispositivo 500 pode incluir um segundo poço 512. Em tal forma de realização, o primeiro membro de ligação e o segundo membro de ligação são providos no segundo poço e as etapas de contatar os complexos com o primeiro membro de ligação para ligar os complexos ao primeiro membro de ligação; liberar pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo do primeiro membro de ligação; formar complexos de um subconjunto da quantidade de um composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo; capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no segundo membro de ligação; e a determinação de um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação é realizada no segundo poço.
De acordo com outra forma de realização exemplar da invenção, o método inclui:
- formar uma composição de matéria incluindo:
uma quantidade de um composto repórter, um membro de ligação capaz de ligar-se ao composto repórter, e
uma quantidade de um ácido nucléico alvo capaz de ligar-se ao composto repórter, a ligação do ácido nucléico alvo ao composto repórter inibindo a ligação do composto repórter ao membro de ligação;
- ligar um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucléico alvo;
- ligar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucléico alvo no membro de ligação; e
- determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter ligado ao membro de ligação.
Em uma primeira etapa, o método pode incluir formar uma composição de matéria incluindo uma quantidade de um composto repórter, um membro de ligação e uma quantidade de um nucleotídeo alvo. A expressão “formar uma composição”, como aqui usada, indica qualquer combinação ou mistura dos componentes descritos acima. Isto pode ser conseguido introduzindo-se os componentes simultânea, consecutiva ou separadamente dentro de uma ou mais câmaras de reação de um dispositivo analítico adequado para realizar o método. Altemativamente, é também possível misturar os componentes individuais antes de introduzir a mistura dentro do dispositivo.
Como já descrito acima, o método pode também ser realizado com mais do que um composto repórter e mais do que um nucleotídeo alvo. Assim, em algumas formas de realização, a etapa de formar uma composição de matéria inclui formar uma composição de matéria incluindo:
- uma quantidade de um primeiro composto repórter,
- uma quantidade de um primeiro ácido nucléico alvo capaz de formar complexos com o primeiro composto repórter, a formação de complexos com o primeiro composto repórter inibindo a capturar do primeiro composto repórter pelo membro de ligação,
- uma quantidade de um segundo composto repórter e
- uma quantidade de um segundo ácido nucleico alvo capaz de formar complexos com o segundo composto repórter, a formação de complexos com o segundo composto repórter inibindo a captura do segundo composto repórter pelo membro de ligação.
O dispositivo pode ser qualquer instrumentação adequada para ensaiar amostras por meio do método. Dispositivos típicos para uso no método são descritos aqui. Formas de realização exemplares de tal dispositivo são ilustradas nas Figuras 17 a 19. Outros dispositivos adequados para realizar o método são descritos no pedido de patente europeu EP 06 122 695 e no Pedido de Patente Internacional No. WO 2007/051861, cada um dos quais é por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
Em algumas formas de realização, a câmara de reação pode incluir duas ou mais subcâmaras. Isto pode ser conseguido provendo-se a primeira superfície e/ou a segunda superfície com uma ou mais divisões ou cavidades, que servem como paredes laterais entre as duas ou mais subcâmaras.
Em uma outra forma de realização, um dispositivo usado no método inclui mais do que uma câmara de reação, a fim de realizar múltiplos ensaios de uma amostra em paralelo ou realizar diferentes etapas de um ensaio em uma maneira serial em diferentes câmaras de reação. Para este fim, as câmaras de reação podem ficar em comunicação fluida entre si. A comunicação fluida inclui qualquer interconexão entre as câmaras de reação individuais, direta ou indiretamente via um meio adicional, tal como uma passagem de introdução de amostra comum, unidade de enchimento, unidade de processamento ou similar. Entretanto, como aqui usado, o termo não necessariamente significa que, após introduzir uma amostra, as câmaras de reação estão em permanente comunicação fluida entre si. E também possível que as câmaras de reação fiquem em comunicação fluida transitória, por exemplo, conseguida por válvulas unidirecionais ou bidirecionais nas conexões entre as câmaras de reação.
Após formar a composição de matéria, o método pode incluir a etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um sangue circulatório da quantidade de ácido nucleico alvo. Em outras palavras, as moléculas repórter podem ser permitidas ligarem-se aos ácidos nucleicos alvo, por exemplo, formando moléculas de ácido nucleico de duplo filamento, via pareamento de base de sequências de nucleotídeo complementares do composto repórter e do ácido nucleico alvo, respectivamente. O fato de que um subconjunto da quantidade de composto repórter formar complexos com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo presente indica que a concentração total de moléculas repórter presentes no início do ensaio pode exceder a concentração total de ácidos nucleicos alvo presentes.
Subsequentemente, a quantidade remanescente de composto repórter que não está em complexo com um ácido nucleico alvo pode ser capturada (isto é, ligada) no membro de ligação via a uma ou mais regiões de ligação incluídas na molécula repórter descrita acima (diretamente ou ligando-se nas moléculas de captura sendo ligadas ao membro de ligação). Uma vez que a formação de complexos dos ácidos nucleicos alvo com as moléculas repórter inibe a captura da molécula repórter no membro de ligação, a formação de complexos de ácido nucleico alvo/molécula repórter diminui a quantidade de moléculas repórter que podem ser capturadas no membro de ligação quando comparada com a quantidade estando presente antes de realizar a etapa de formar complexos de ácido nucleico alvo/molécula repórter.
Finalmente, o método pode incluir determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação. Determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado na ligação inclui a detecção/determinação de parâmetros tais como condutividade elétrica, potencial redox, absorção óptica, intensidade de fluorescência, ou bioluminescência que permite medições qualitativas e/ou quantitativas das moléculas repórter capturadas (ou recapturadas) no membro de ligação. Somente um destes parâmetros pode ser determinado, porém é também possível determinar mais do que um parâmetro (p. ex., condutividade elétrica e a intensidade de um sinal de fluorescência causado por um rótulo adequado), concomitante ou consecutivamente.
Para realizar a reação de detecção, o composto repórter pode incluir um ou mais rótulos detectáveis como descrito acima, p. ex., rótulos fluorescentes. Os rótulos detectáveis podem ser incorporados ou ligados às moléculas repórter, p. ex., na forma de ribonucleotídeos, desoxinucleotídeos ou didesoxinucleotídeos modificados e/ou rotulados.
Para detectar tais rótulos, o dispositivo usado para realizar o método pode ainda incluir um sistema de detecção como descrito acima, adequado para determinar valores indicativos da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado em um membro de ligação, p. ex., um sistema de detecção óptica. O sistema de detecção pode ser conectado à câmara de reação, opcionalmente oposto a uma região de superfície particular, onde a detecção ocorre.
Em algumas formas de realização, o método inclui ainda liberar o subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter do membro de ligação após as etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucléico alvo, capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucléico alvo no membro de ligação e determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação. O termo “liberação” ou “liberar”, como aqui usado, indica a separação ou desligamento das moléculas repórter do membro de ligação. Isto pode ser conseguido, por exemplo, enzimaticamente, via a clivagem de quaisquer ligações covalentes ou em casos em que as molécula repórter de ácido nucleico são ligadas ao membro de ligação pelas moléculas de captura de ácido nucleico, via pareamento de base complementar, aumentando-se a temperatura na câmara de reação em que o ensaio é realizado, assim resultando em separação de filamento de ácido nucleico (isto é, desnaturação).
Em outras formas de realização, as etapas de liberar, formar complexos, capturar e determinar são repetidas N vezes adicionais, em que N é um inteiro maior do que ou igual a 1. Em outras palavras, o método é realizado em uma maneira cíclica. Em formas de realização específica, o inteiro é > 5, > 10 ou > 20.
Em algumas formas de realização, antes da etapa de formar complexos, o método inclui ainda capturar pelo menos um subconjunto da quantidade de composto repórter no membro de ligação, determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação; e liberar compostos repórter capturados do membro de ligação. Assim, realizando-se estas etapas adicionais possibilita-se a determinação da quantidade de composto repórter inicialmente presente, antes de permitir a formação de complexos entre o composto repórter e o ácido nucleico alvo. Comparar o valor obtido com aquele determinado após captura do subconjunto de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo no membro de ligação provê uma medida para a presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo presente em uma amostra.
Em formas de realização particulares, o método inclui ainda submeter o ácido nucleico alvo a ampliação, isto é, aumentar sua quantidade presente na amostra antes de submetê-lo à análise adicional, a fim de facilitar mais detecção. Tipicamente, a ampliação do ácido nucleico alvo é conseguida por meio de uma ampliação cíclica. A ampliação cíclica pode incluir qualquer número de ciclos de amplificação que é igual ou maior do que dois. Usualmente, a reação de ampliação cíclica inclui pelo menos 10 ou pelo menos 20 ciclos. Uma ampliação cíclica exemplar é uma reação de cadeia de polimerase (PCR) como descrito acima.
A detecção/determinação de um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácidos nucleicos alvo pode ser realizada somente uma vez ou mais do que uma vez durante o ensaio realizado. Caso mais do que uma etapa de detecção durante um único ensaio seja realizada, o valor médio dos resultados obtidos é calculado. Os dados obtidos em um ou mais ciclos de detecção podem ser analisados e matematicamente processados usando-se apropriado software de computador pelas pessoas hábeis na arte, a fim de determinar inter alia a presença, o comprimento ou a sequência de um ou mais ácidos nucleicos alvo e/ou calcular sua quantidade.
Com referência à Fig. Ia, o método 100 para determinação de alvos moleculares inclui uma etapa de lise 102 (para lisar uma amostra, por exemplo, sangue integral, na presença de moléculas de captura com grupos âncora), uma etapa de formação de complexo 110 (para formar um complexo de ácidos nucleicos de HIV e sondas de captura com grupos âncora, por exemplo, hibridização), uma etapa de captura 114 (para capturar complexos em uma matriz sólida, via grupos âncora), uma etapa de lavagem 118 (para remover todo material não ligado, por exemplo, ácidos nucleicos, proteínas, contaminantes de baixo peso molecular etc.), uma etapa de ampliação 120 (para ampliar e rotular ácidos nucleicos capturados) e uma etapa de detecção 126 (para detectar amplicons). De acordo com o método 100, polinucleotídeos são liberados de um ou mais patógenos alvo de uma amostra. Os polinucleotídeos liberados que são associados com os patógenos alvo são capturados em uma superfície. Os polinucleotídeos capturados são separados de materiais concomitantes (por exemplo, inibidores de ampliação) da amostra. Os polinucleotídeos capturados separados são ampliados para formar amplicons. A presença dos polinucleotídeos é determinada detectando-se os amplicons. Em razão de os polinucleotídeos ampliados serem associados com os patógenos alvo, a presença e/ou identidade do um ou mais patógenos alvo podem ser determinadas (por exemplo, qualitativa e/ou quantitativamente). Em uma forma de realização exemplar, o método 100 inclui a determinação de carga viral baseada em uma determinação de um ou mais vírus presentes em uma amostra de sangue. Em seguida, várias etapas do método 100 serão examinadas.
Na etapa de lise 102, os polinucleotídeos 106 são liberados dos patógenos presentes em uma amostra de sangue 104. Os polinucleotídeos podem ser liberados dos patógenos alvo como desejado (por exemplo, térmica, química, mecanicamente ou por combinação deles). Em uma forma de realização exemplar, os polinucleotídeos são liberados combinando-se a amostra 104 com um líquido de lise que inclui materiais que lisam os patógenos da amostra. Exemplos de líquidos capazes de lisar patógenos são encontrados em Boom R., Sol CJ. , Salimans M.M., Jansen CL. , Wertheimvan Dillen P.M., van der Noordaa J., Rapid And Simple Method For Purification Of Nucleic Acids, J. Clin. Microbiol. Março de 1990; 28(3):495 503, que é incorporado aqui por referência.
Um líquido de lise exemplar inclui um ou mais de um desnaturante (por exemplo, tiocianato de guanidina (GuSCN) (por exemplo, cerca de 4,57M)), um tampão de pH (por exemplo, Tris-HCl (por exemplo, pH 6,4, 45 mM), um quelador (por exemplo, EDTA 20 mM) e um detergente (por exemplo, Triton X-100 1,2% (p/v) e/ou saponina (por exemplo, 0,2 %)), um sal (por exemplo, MgCl2 (por exemplo, 75 mM) e/ou ZnCl2 (por exemplo, 1 mM)).
A etapa de lise 102 tipicamente inclui formar uma mistura incluindo polinucleotídeo liberados 106, concomitantes de amostra 104 (por exemplo, componentes celulares, inibidores de ampliação, proteínas e outros materiais) e moléculas de captura 108i. Cada molécula de captura 108i inclui uma parte de ligação de polinucleotídeo 109i e um grupo âncora biotina 111. Cada parte de ligação de polinucleotídeo 109i é uma sequência de polinucleotídeo complementar a (por exemplo, específica para) uma diferente região de polinucleotídeo 106. Por exemplo, a molécula de captura 108a inclui uma parte de ligação 109a complementar a uma região alvo 113 de polinucleotídeo 106 e molécula de captura 108b inclui uma parte de ligação 109b, complementar a uma diferente região alvo 115 de polinucleotídeo 106. Tipicamente, pelo menos uma (por exemplo, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais) de diferentes moléculas de captura são usadas para cada polinucleotídeo a ser determinado.
Em algumas formas de realização, os polinucleotídeos 106 são liberados dos patógenos alvo na presença de moléculas de captura 108i. Isto pode ser conseguido, por exemplo, essencialmente simultaneamente combinando-se a amostra 104 com as moléculas de captura 108i e lisando-se os componentes líquidos. A amostra 104 pode ser combinada com as moléculas de captura 108i e os componentes da lise líquida podem ser combinados com as moléculas de captura 108i e lisando-se os componentes líquidos em um estado líquido ou em um estado seco (por exemplo, liofilizado).
Em formas de realização alternativas, os polinucleotídeos são liberados dos patógenos da amostra 104 e a mistura resultante é combinada com as moléculas de captura 108i. Por exemplo, a amostra 104 e os componentes líquidos de lise excluindo as moléculas de captura 108i podem ser combinados e permitidos incubar por um período de tempo antes de combinar a mistura incubada com as moléculas de captura 108i.
Em uma forma de realização exemplar, os polinucleotídeos
106 são RNA-HIV e as partes de ligação 109i das moléculas de captura 108i são complementares a suas regiões.
Voltando à etapa de formação de complexo 110, uma ou mais moléculas de captura 108i combinam com (por exemplo, hibridizam com) o polinucleotídeo 106 para formar um complexo 112. A etapa de formação de completo 110 pode ser realizada, por exemplo, permitindo-se que os polinucleotídeos liberados 106 incubem por um período de tempo, na presença de moléculas de captura 108i, suficiente para formar complexos 112. Em algumas formas de realização, o período de incubação é pelo menos de cerca de 60 segundos (por exemplo, pelo menos cerca de 120 segundos, pelo menos cerca de 360 segundos). Em algumas formas de realização, o período de incubação é de cerca de 600 segundos ou menos (por exemplo, cerca de 480 segundos ou menos, cerca de 420 segundos ou menos). Em uma forma de realização exemplar, o período de incubação é de cerca de 5 minutos.
Para cada polinucleotídeo a ser determinado, a concentração total de moléculas de captura 108i é tipicamente suficiente para capturar a maior parte (por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 75%, pelo menos 90%, essencialmente todo) do polinucleotídeo nos complexos 112. Em algumas formas de realização, a concentração de cada uma ou mais das (por exemplo, a maior parte das ou todas as) moléculas de captura 108i é de pelo menos cerca de 0,1 μΜ (por exemplo, pelo menos cerca de 0. 25 μΜ, pelo menos cerca de 0,5 μΜ). A concentração em cada uma ou mais das (por exemplo, a maior parte ou todas as) moléculas de captura é tipicamente de cerca de 2 μΜ ou menos (por exemplo, cerca de 1,5 μΜ ou menos, cerca de 1 μΜ ou menos). Em uma forma de realização exemplar, a concentração de cada uma ou mais das (por exemplo, a maior parte das ou todas as) moléculas de captura é de cerca de 0,625 μΜ.
Voltando para a etapa de captura 114, os complexos 112 e as partículas de captura 117 são combinadas para formar complexos de captura
119. Cada complexo de captura 119 inclui um ou mais complexos 112 e uma partícula de captura 117. Os complexos 112 são tipicamente ligados não seletivamente à partícula 117. Cada partícula de captura 117 inclui uma superfície de captura de estreptavidina 116. As partículas de captura 117 capturam cada complexo 112 por interação entre um ou mais grupos âncora de biotina 112 de moléculas de captura 108i e superfície de captura de estreptavidina 116. Partículas de captura exemplares 117 incluem contas de estreptavidina sefarose (Amersham) tendo um diâmetro de cerca de 35 pm pré-lavadas com diH2O, para remover etanol. Aproximadamente 10.000 a 20.000 contas são usadas por ensaio, correspondendo a uma capacidade de ligação de cerca de 3 nmol de biotina por 10 pl de sangue integral.
Tipicamente, a etapa de captura 114 é iniciada após incubar a amostra 104 com polinucleotídeos 106 e capturar as moléculas 108i por um tempo suficiente para formar complexos 112. Por exemplo, a amostra 104 pode ser incubada na presença do líquido de lise e de moléculas de captura 108i antes de combinar a mistura resultante com as partículas de captura 117.
Tipicamente, a concentração total das moléculas de captura 108i e partículas 117 é suficiente para quantitativamente capturar cada um ou mais dos polinucleotídeos selecionados 106, associados com cada um ou mais dos patógenos alvo da amostra 104. Assim, para cada polinucleotídeo 106 a ser determinado, substancialmente todo (por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97,5% ou essencialmente todo) o polinucleotídeo é capturado pelas moléculas de captura 108i e partículas 117.
Voltando para a etapa de lavagem 118, os complexos de captura 119 são separados do material concomitante (por exemplo, ácidos nucléicos, proteínas, componentes celulares, reagentes de lise e similares) não capturados pelas partículas 117. Em algumas formas de realização, os complexos de captura 119 são filtrados usando-se um filtro com poros bastante pequenos para evitar passagem dos complexos 119, porém bastante grandes para permitir passagem de material não capturado pelas partículas 117.
Os complexos de captura 119 podem ser lavados com um líquido de lavagem para aumentar a separação do material concomitante. Em algumas formas de realização, dois ou mais diferentes líquidos de lavagem são usados. Em algumas formas de realização, um primeiro líquido de lavagem contém um detergente para remover substâncias de baixo peso molecular, proteínas e outros componentes celulares aderindo às partículas via interação hidrofóbica e um segundo líquido de lavagem remove o detergente que poderia de outro modo interferir com o subsequente processo de ampliação. Um primeiro líquido de lavagem exemplar inclui 0,15 M LiCl, 0,1% SDS (uma vez que SDS é um inibidor PCR, ele pode ser removido antes de um procedimento PCR), 10 mM Tris-HCl pH 8,0 e 1 mM EDTA). Um segundo líquido de lavagem exemplar inclui 0,15 M LiCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Líquidos de lavagem adequados são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20040215011 Al, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
Voltando para a etapa de ampliação 120, os polinucleotídeos 106 são ampliados usando-se sondas 122. Tipicamente, a ampliação é uma ampliação PCR. Em uma forma de realização exemplar, os polinucleotídeos 106 são RNA e a ampliação é PCR-RT. Em algumas formas de realização, o patógeno é HIV.
Com referência à Fig. Id, em algumas formas de realização, a etapa de ampliação 120 produz amplicons 130. Sob condições de hibridização (por exemplo, temperaturas), os amplicons 130 são capturados pelas moléculas de sonda de captura imobilizadas 108a, 108b e 108c na superfície da estreptavidina 116 das partículas 117. Os amplicons são rotulados via um agente de rotulação fluorescente 125, incluindo um rótulo óptico 124 (por exemplo, um rótulo fluorescente) e uma parte de polinucleotídeo 129 complementar a uma região do amplicom 130.
Com referência à Fig. le, em uma forma de realização alternativa, cada sonda 122 inclui um rótulo óptico 124 (por exemplo, um rótulo fluorescente). Outras sondas 108j incluem uma parte de polinucleotídeos 109j complementar a uma região do amplicon 130 e também contêm um grupo âncora biotina 111. As moléculas sonda 108j são capturadas na superfície da estreptavidina 116 das partículas 117. A etapa de ampliação 124 produz diretamente amplicons rotulados 130, cada um incluindo um rótulo 124. Os amplicons 130 são capturados pelas moléculas sonda imobilizadas 108j sobre a superfície da estreptavidina 116 das partículas 117. As partes de ligação 109j das sondas 108j podem ser as mesmas que as ou diferentes das sondas 108i usadas na etapa de captura 114. As sondas 108j e/ou contas 117 podem ser combinadas com os polinucleotídeos 106 juntamente com outros componentes usados para realizar a etapa de ampliação 120.
Na etapa de detecção 126, os amplicons 130 são detectados (por exemplo, por detecção de rótulos 111 fluorescentes). A etapa de detecção 126 pode ser realizada com os amplicons 130 capturados na superfície de estreptavidina 116 das partículas 117. A etapa de detecção 126 pode ser realizada sem primeiro combinar amplicons com um líquido livre de sondas 122. Por exemplo, a etapa de detecção 126 pode ser realizada com amplicons capturados 130, presentes entre as primeira e segunda superfícies, após reduzir uma distância das superfícies. Uma forma de realização deste método para realizar a etapa de detecção 126 é examinado em seguida com respeito à Fig. 1b e Fig. 1c.
Com referência à Fig. lb e Fig. 1c, um sistema 200 para realizar pelo menos uma etapa de detecção 126 do método 100 inclui um cartucho microfluídico 202, um sistema de detecção 210, um atuador estêncil 212 e um processador 218, em comunicação com o sistema de detecção 210 e o atuador 212.
Ο cartucho 202 inclui um primeiro substrato 206 e um segundo substrato 208, que juntos definem uma câmara de detecção 204. O primeiro substrato 206 é tipicamente opticamente transmissivo (por exemplo, transparente) com respeito a um comprimento de onda de luz útil para excitar e detectar a fluorescência dos rótulos 124 dos amplicons 130. O primeiro substrato 206 pode ser formado de, por exemplo, um polímero, vidro ou sílica. O segundo substrato 208 é formado de um material elástico ou flexível (por exemplo, um polímero elastomérico). O primeiro substrato 206 é geralmente menos flexível do que o segundo substrato 208.
O atuador 212 inclui um estêncil 214 e um impulsor de estêncil 236, configurado para acionar o estêncil para o e afastando-se do segundo substrato 208. O impulsor de estêncil 236 pode ser atuado, por exemplo, por ar comprimido, eletroímãs, atuação piezelétrica ou outra adequada. Como misto na Fig. 1c, quando acionado em direção a uma parede 238 do segundo substrato 208, o estêncil 212 reduz a distância “d” entre a parede interna 232 do primeiro substrato 206 e uma parede interna 234 do segundo substrato 208. No estado de distância reduzida da Fig. 1c, pelo menos algumas partículas de captura 117 com amplicons capturados 130 permanecem entre as superfícies 232, 234. Ao contrário, muito do líquido circundando as partículas 117 é deslocado de entre as superfícies 232, 234.
O sistema de detecção 210 é configurado para detectar a presença de amplicons 130 com o cartucho 202 no estado de distância reduzida da Fig. 1c. O sistema de detecção 210 inclui uma fonte de luz 246 (por exemplo, um leiser), um detector de formação de imagem 240 e um sistema óptico 242. Em uso, a fonte de luz 246 ilumina o material presente entre as superfícies internas 232, 234 dos substratos 206, 208. A fluorescência 250 emitida pelos rótulos 124 dos amplicons 130 é detectada. A fluorescência detectada 250 é indicativa da presença dos amplicons 130. O processador 218 recebe um sinal do sistema de detecção 210, indicativo da fluorescência detectada. O processador 218 pode determinar a presença dos amplicons 130 e, portanto, a presença dos correspondentes patógenos da amostra 104.
Em geral, o líquido remanescente entre as superfícies internas 232, 234 emite fluorescência de fundo 252 não associada com a presença de amplicons 130. A intensidade da fluorescência de fundo 252 é geralmente proporcional à quantidade de líquido remanescente entre as superfícies internas 232, 234. A intensidade da fluorescência de rótulo 250 dos rótulos 124 dos amplicons 130, entretanto, é espacialmente localizada nas vizinhanças das partículas 117. O detector de formação de imagem 240 recebe e detecta tanto a fluorescência de rótulo 250 como a fluorescência de fundo 252. Entretanto, em razão do deslocamento do líquido de entre as superfícies internas 232, 234 no estado de distância reduzida da Fig. 1c, o sinal para ruído da fluorescência de rótulo 252 relativa à fluorescência de fundo 250 é mais elevado do que no estado não reduzido da Fig. 1b.
Uma forma de realização exemplar do método 100 pode ser realizada como segue. Entre cerca de 5 e 10 μΐ de sangue capilar (por exemplo, ponta do dedo, lóbulo da orelha) são obtidos de um indivíduo. A amostra de sangue é combinada com cerca de 90 pL de um tampão de lise incluindo componentes de lisagem e moléculas de captura 108i. A mistura resultante é incubada com agitação por cerca de 5 minutos a 21 °C. A mistura incubada é combinada com uma quantidade de partículas 117 equivalente a cerca de 10 μΐ de lama, correspondendo a uma capacidade de ligação de 3 nmol de biotina, isto é, as partículas são compradas como uma lama de partículas em 20% de etanol). A mistura com partículas é incubada com agitação por cerca de 5 minutos a 21 °C. Após incubação, o sobrenadante é removido pelo sistema atuador de estêncil 350 para operar o cartucho 300. As partículas são lavadas com um primeiro tampão de lavagem (por exemplo, 3 vezes com volume de 50 μΐ cada vez) e então com um segundo tampão de lavagem (por exemplo, 3 vezes com 50 μΐ cada vez). Após lavar, o sobrenadante é removido. As partículas lavadas são combinadas com um meio de ampliação e submetidas a ampliação PCR-qRT para detecção (por exemplo, quantificação) dos polinucleotídeos capturados 106.
Com referência à Fig. 14, a fluorescência dos amplicons 130 é detectada (por exemplo, usando-se o modo de distância reduzida de um instrumento, tal como aquele mostrado na Fig. lb e Fig. 1c). Os amplicons 130 podem ser detectados após cada um dos múltiplos diferentes ciclos de aquecimento e esfriamento da ampliação. Desta maneira, o acúmulo de concentração de amplicons pode ser seguida no tempo. Os amplicons são tipicamente detectados enquanto ligados às partículas 117.
Embora o método 100 tenha sido descrito como incluindo a etapa de liberar polinucleotídeos dos patógenos, o método 100 pode incluir outras etapas para prover polinucleotídeos. Em algumas formas de realização, os polinucleotídeos são liberados das células não-patogênicas (por exemplo, planta, humano, animal ou similar). Em algumas formas de realização, os polinucleotídeos são produtos de uma análise de expressão genética. Em algumas formas de realização, os polinucleotídeos são providos sem requererem uma etapa de liberação e/ou como polinucleotídeos já liberados de uma célula ou outro amostra biológica.
Em seguida, uma forma de realização de um sistema de ensaio e um cartucho microfluídico serão examinados tipicamente capazes de realizar a maior parte das (por exemplo, todas) as etapas do método 100.
Com referência à Fig. 2, um cartucho microfluídico 300 inclui um primeiro substrato 301, um segundo substrato 303 e uma rede micro fluí dica 305. Os primeiro e segundo substratos 301, 303 podem ter propriedades similares àquelas descritas para os substratos 206, 208 do cartucho 202.
A rede microfluídica 305 é configurada para receber uma amostra e vários materiais reagentes, permitindo que as operações sejam realizadas nestes materiais (por exemplo, mistura, transporte e incubação) e para facilitar a detecção de amplicons indicativos da presença de um ou mais patógenos alvo.
A rede microfluídica 305 inclui uma entrada de amostra 302, conectada por um canal 304 a uma câmara de lise 306, que é conectada por um canal 308 e uma junção 307 a uma câmara de detecção 332; uma primeira entrada de líquido 310 é conectada por um canal 312 a uma primeira câmara de reagente 314, que é conectada por um canal 316 à junção 307; uma segunda entrada de líquido 318 é conectada por um canal 319 a uma segunda câmara reagente 320, que é conectada por um canal 322 à junção 307; e uma terceira entrada de líquido 324 é conectada por um canal 326 a uma câmara de reagente de rotulação de ampliação 328, que é conectada por um canal 330 à junção 307. A junção 307 é conectada a uma câmara de refugo 334 via um canal de refugo 336. A câmara de detecção 332 é conectada à câmara de refugo 334 via um canal de refugo 340, que inclui um filtro dimensionado para evitar passagem de partículas 317, porém permitir passagem de material não capturado, como descrito na etapa de lavagem 118 do método 100.
Tipicamente, as câmaras de reagente 306, 314, 320, 328 incluem reagentes liofilizados (por exemplo, como pelotas) usados para realizar as etapas descritas para o método 100. Em uso, um líquido (por exemplo, água, tampão, solvente aquoso ou outro líquido) é introduzido na entrada correspondente a uma câmara. O líquido solubiliza os reagentes liofílizados para formar um líquido. Em uma forma de realização exemplar, a câmara de lise 306 inclui reagentes solubilizados, para facilitar a lise de patógenos alvo e moléculas de captura 308i correspondendo a polinucleotídeos dos patógenos. Tipicamente, os reagentes liofílizados da câmara 306 são solubilizados pela amostra (por exemplo, uma amostra de sangue integral) sozinhos ou em combinação com líquido adicionado. Em uma forma de realização exemplar, a câmara 314 inclui reagentes liofilizados para formar um líquido de lavagem (por exemplo, um primeiro líquido de lavagem (tampão)), quando combinados com um líquido introduzido na entrada 310. Em uma forma de realização exemplar, a câmara 320 inclui reagentes liofilizados para formar um líquido de lavagem (por exemplo, um segundo líquido de lavagem (tampão)) quando combinados com um líquido introduzido na entrada 318. Em uma forma de realização exemplar, a câmara 328 inclui reagentes liofilizados para formar uma mistura de ampliação (por exemplo, um segundo líquido de lavagem (tampão)) quando combinados com um líquido introduzido na entrada 324.
Antes do uso do dispositivo 300, as partículas 116 são tipicamente dispostas dentro da rede 305 a jusante da câmara 306. Por exemplo, as partículas 116 podem ser dispostas dentro da câmara de detecção 332 antes do uso. As partículas 116 podem ser lavadas com líquidos das câmaras 306, 314, 320, 328 por atuação apropriada de estênceis como examinado em seguida.
Com referência à Fig. 3, o cartucho micro fluí dico 300 é mostrado em combinação com um sistema atuador de estêncil 350 para operar o cartucho 300. O sistema atuador 300 inclui uma base atuadora 352 e múltiplos estênceis 354i. Cada estêncil 354i é acionado por um correspondente impulsor de estêncil similar ao impulsor de estêncil 236. Em uso o cartucho 300 é posicionado com o substrato flexível 303 voltado para a base de atuador 352 e estênceis 354i. Cada estêncil 354i corresponde espacialmente a um diferente local de rede microfluídica 305. Por exemplo, o estêncil 354d corresponde ao canal de refugo 336. Quando acionado, o estêncil 354d comprime o substrato 303 sobrepondo-se ao canal 336, desse modo obstruindo o canal 336 e evitando a passagem de fluido ao longo dele.
Assim, a propriedade flexível do segundo substrato 303 ou elemento de cobertura assegura que ele possa ser deformado em uma maneira reversível quando um estêncil 354i exerce uma força mecânica sobre uma parte dedicada do segundo substrato flexível 303. Em outras palavras, se uma ação de válvula reversível for desejada, a deformação do segundo substrato 303 é reversível ao ponto de que, quando a força aplicada pelo estêncil 354i for removido, o segundo substrato 303 retoma para sua posição original, de modo que o fluido pode novamente passar ao longo de um correspondente canal 336.
Ao contrário disto, a propriedade rígida do primeiro substrato 301 refere-se ao fato de o material do primeiro substrato 301 ser configurado de tal maneira que, no exercício de uma força por um estêncil 354i sobre o primeiro substrato 301, não ocorrer nenhuma deformação do primeiro substrato 301, o que podería ter uma influência sobre a função da válvula. Consequentemente, o segundo substrato 303 fornece flexibilidade, enquanto que o primeiro substrato 301 fornece estabilidade.
Outros estênceis correspondem similarmente a outros canais da rede 305. Os estênceis 354a, 354c correspondem, respectivamente, ao canal de refugo 340 e junção 307. A atuação dos estênceis 354a, 354c veda a câmara de detecção 332, permitindo que múltiplos ciclos de aquecimento e esfriamento sejam realizados sem significativa perda de líquido neles. O filtro 341 permite que as partículas 116 dentro da câmara 332 sejam lavadas com líquidos das câmaras 306, 314, 320, 328, sem perda das partículas. Ainda outros estênceis respectivamente correspondem às câmara 306, 314, 320, 328 e 332. A atuação repetitiva destes estênceis pode ser usada para agitar material (por exemplo, líquido) dentro das câmaras, para facilitar a mistura (por exemplo, de amostras e reagentes). A atuação sequencial dos estênceis ao longo de um canal pode ser usada para mover líquidos ao longo do canal. O conteúdo da câmara pode ser esvaziado, por exemplo, pela atuação dos respectivos estênceis operando a montante, a jusante e na câmara.
Em uma forma de realização, o substrato é suficientemente reversível pelo fato de, nas atuações e remoções repetidas do estêncil (p. ex., pelo menos dez atuações e remoções, ou pelo menos cinquenta atuações e remoções), o substrato retoma para sua posição original, de modo que a parte de uma rede micro fluí dica subjacente a um estêncil particular pode ser repetidamente obstruída e reaberta.
O cartucho 300 pode ser operado como segue. Uma quantidade (por exemplo, entre cerca de 5 - 10 μΐ) de amostra (por exemplo, sangue integral) e uma quantidade opcional (por exemplo, entre cerca de 5 e 50 μΐ) de líquido (por exemplo, água) são introduzidas na câmara na câmara 306, rede 305, via entrada 302. Uma quantidade de líquido (por exemplo, entre cerca de 20 e 200 μΐ) é introduzida nas câmaras 314, 320, 328 via correspondentes entradas. A amostra e líquido opcional respectivamente introduzidos ressolubilizam reagentes liofilizados presentes nas câmaras 306, 314, 320, 328. Estênceis correspondentes a cada câmara são acionados para agitar a mistura de reagente líquida nela, para facilitar a mistura. Dentro da câmara de lise 306, o tampão de lise libera polinucleotídeos 106 de patógenos (por exemplo, como na etapa de lise 102). Os polinucleotídeos liberados combinam com as moléculas de captura 108i para formar complexos 112 (por exemplo, como na etapa de formação de complexo 110).
A mistura de lisagem da câmara 306 é movida para a câmara de detecção 332 e combinada com as partículas 116 e incubada para formar complexos de captura 119 (por exemplo, como na etapa de captura 114). A mistura dentro da câmara 332 pode ser agitada, por exemplo, usando-se um estêncil. No final da incubação da etapa de captura 114, líquido/sobrenadante é removido da câmara de detecção 332 para a câmara de refugo 334 com o sistema atuador de estêncil 350 para operar o cartucho 300.
Após remoção do líquido/sobrenadante da câmara de refugo 332, o líquido de lavagem das câmaras 314, 320 é movido através da câmara 332 para separar concomitantes dos complexos 119 (por exemplo, como na etapa de lavagem 118). A câmara 332 pode ser agitada via estêncil 354b durante a lavagem.
Após separar os concomitantes dos complexos 119 dentro da câmara 332, os reagentes de ampliação da câmara 328 são movidos para a câmara de detecção 332 e o conteúdo resultante é submetido a múltiplos ciclos PCR (por exemplo, como na etapa de ampliação 120).
Após cada um dos um ou mais ciclos de ampliação, o estêncil 354b é acionado para reduzir a distância entre as superfícies internas opostas da câmara de detecção 332. Os complexos 119, se presentes, permanecem presos entre as superfícies internas, enquanto outro conteúdo é relativamente deslocado como examinado com respeito ao dispositivo 20 da Fig. 1c. A detecção é tipicamente realizada usando-se um sistema de detecção de fluorescência (por exemplo, como descrito para o dispositivo 200). A detecção é tipicamente realizada com amplicons 130 dos complexos 112 no estado hibridizado e ligados às partículas 117 como complexos 119 (por exemplo, como na etapa de detecção 126). Após cada ciclo, a população de amplicons 130 aumenta. A intensidade de fluorescência resultante dos complexos de captura 119 aumente correspondentemente. O aumento da intensidade de fluorescência com o número de ciclos pode ser monitorada para determinar o ciclo limiar em que os amplicons 130 podem ser quantizados. Em razão de os polinucleotídeos 106 serem capturados quantitativamente (por exemplo, como na etapa de captura 114), a detecção quantitativa dos amplicons 130 permite que a quantidade de polinucleotídeos 106 presentes na amostra seja determinada quantitativamente. Assim, por exemplo, onde os patógenos for um vírus (por exemplo, HIV), a carga viral dentro da amostra (por exemplo, sangue integral) pode ser determinada.
O cartucho 300 pode ainda incluir uma formação incluindo múltiplos polinucleotídeos imobilizados, cada um correspondendo a uma sequência de polinucleotídeos de um diferente subtipo de patógeno. Após a etapa de detecção 126, a hibridização de amplicons 130 é realizada para determinar o subtipo de patógeno. Em uma forma de realização exemplar, a formação inclui polinucleotídeos configurados para determinar um subtipo de HIV.
Embora a operação do cartucho 300 tenha sido descrita como incluindo a adição de reagentes líquidos, os reagentes líquidos podem ser armazenados no cartucho como em pacotes de ampola e liberados durante o uso.
Outros exemplos de sistemas adequados para opticamente determinar a presença de rótulo 124 são descritos em cada uma dos seguintes pedidos: a continuação U.S. do Pedido de Patente Internacional No. PCI7EP2005/004923, depositado em 6 de janeiro de 2005, que nomeia os Estados Unidos e reivindica prioridade para o Pedido de Patente Alemã DE 10 1004 022 263, depositado em 6 de janeiro de 2004, a continuação U.S. tendo o no. de série US 11/593.021 e sendo depositado em 6 de novembro de 2006, cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.
Em seguida, com referência à Fig. 4 à Fig. 16, várias etapas durante um procedimento de análise de acordo com uma forma de realização exemplar será explicada.
A FIG. 4 ilustra uma câmara de lise.
A FIG. 5 à FIG. 10 ilustram a captura de complexos de RNA sobre uma matriz sólida.
A FIG. 11 ilustra a lavagem.
A FIG. 12 e FIG. 13 ilustram ampliação.
A FIG. 14 à FIG. 16 ilustram detecção.
A FIG. 17a ilustra um sistema exemplar 400 para realizar pelo menos as etapas de capturar alvos de uma amostra, ampliação do alvo e detecção de um ou mais valores indicativos da presença do alvo na amostra.
A FIG. 17b ilustra um sistema exemplar 400 para realizar pelo menos as etapas de capturar alvos de uma amostra, ampliação do alvo e detecção de um ou mais valores indicativos da presença do alvo na amostra em estado operado.
A FIG. 17c ilustra uma forma de realização exemplar para a unidade de válvula 435 representada nas FIGS. 17a e 17b.
A FIG. 17d ilustra uma forma de realização exemplar para a válvula 2 representada na FIG. 17c.
Com referência às FIGS. 17a e b, o sistema exemplar 400 inclui um cartucho microfluídico 401, um sistema de detecção 455, um sistema para aquecer pelo menos um par do cartucho 451, membros atuadores 441 - 444 e atuadores 437 - 440, uma unidade de válvula 435, um compressor 431, um reservatório de líquido 461 e um processador 471.
O cartucho 401 inclui um substrato 402 e um primeiro elemento de cobertura 403 que, juntos, definem um primeiro e um segundo poço 408 e 407. O primeiro elemento de cobertura 403 é pelo menos parcialmente flexível para permitir que o elemento de cobertura seja reversivelmente pressionado contra o substrato 402. O cartucho ainda inclui um segundo elemento de cobertura que define, junto com o substrato 402, canais 410, 411, 412. Em algumas formas de realização, o segundo elemento de cobertura é também pelo menos parcialmente flexível. Os canais e poços são interconectados por furos 413, 414, 415, 416 para formar uma rede microfluídica.
Em várias formas de realização, o substrato 402 pode ser qualquer corpo físico feito de qualquer material adequado, tal como plásticos, vidro, metal ou um semicondutor. Ele pode ser qualquer superfície essencialmente planar (isto é, bidimensional) ou não-planar (isto é, tridimensional). Um exemplo para tal objeto tridimensional é um corpo físico tendo uma cavidade ou poço incluindo uma câmara de reação (em que uma reação biológica, química ou bioquímica pode ocorrer), incluindo trajetos fluídicos (como canais).
O primeiro poço 408, que pode também ser indicado como um poço de lise, é adaptado para acomodar fluidos e para liberar conteúdos de células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo moléculas alvo a serem analisadas pelo sistema 400. Por exemplo, o primeiro poço 408 pode ser adaptado para liberar conteúdo de células, esporos ou vírus pela inclusão de reagentes de lisagem 409 como descrito acima. Os reagentes de lisagem 409 podem ser providos em forma seca.
Um segundo poço 407, que também pode ser indicado como um poço central, é adaptado para acomodar fluidos e inclui partículas 406 como primeiro membros de ligação, as partículas adaptadas para capturar alvo em complexo com moléculas de captura e, opcionalmente, um segundo membro de ligação 417 adaptado para capturar moléculas repórter. O segundo poço 407 inclui ainda elementos de filtro 405 para evitar a passagem das partículas 406, porém para permitir a passagem de gases, líquidos e substâncias dissolvidas nos líquidos. Os poços 407 e 408 são interconectados pelo canal 411 via furos atravessantes 415 e 414.
Mais geralmente, os primeiro e segundo poços 408, 407 podem ser qualquer estrutura, isto é, qualquer entidade física que possa servir como um veículo para receber amostras ou substâncias. Particularmente, tais estruturas podem incluir rebaixo tais como sulcos, poços ou canais, ou podem também cobrir um material em que substâncias possam ser acomodadas e através do qual as substâncias possam ser movidas, tais como géis.
Em várias formas de realização, os membros de ligação incluem um componente que é configurado para ligar moléculas tendo uma configuração específica. Tais membros de ligação pode ou não ser moléculas imobilizadas em uma superfície. Uma capacidade de ligação pode também resultar diretamente de uma configuração de superfície (por exemplo, uma estrutura de superfície porosa). E também possível que os membros de ligação sejam providos como ou em elementos tridimensionais, tais como contas ou um suporte poroso. A superfície de tal elemento tridimensional ou outras moléculas ligadas à superfície do elemento tridimensional, p. ex., partículas, podem então servir como membros de ligação. Diferentes membros de ligação sendo sensíveis a diferentes moléculas podem também ser dispostos (por exemplo, em uma maneira semelhante a matriz) em uma superfície de uma estrutura. Exemplos de membros de ligação são descritos acima com respeito aos vários métodos aqui descritos.
Os volumes do poço de lise 408 e do poço central 407 podem ser de 100 μΐ. Em uma forma de realização exemplar, a largura dos canais 410 - 412 é de 200 pm e uma altura dos canais 410 - 412 é de 100 pm.
Em várias formas de realização, tal rede microfluídica pode incluir um ou mais canais e/ou poços, que podem ser interconectados entre si. Por exemplo, os vários canais de tal rede microfluídica podem ser bifurcados ou ramificados para desse modo permitir o transporte de líquidos através da rede microfluídica ao longo de predefinidos trajetos (não mostrados).
O sistema 400 também inclui um sistema atuador incluindo membros atuadores 441, 442, 443, 444 acionados por atuadores pneumáticos 437, 438, 439, 440, uma unidade de válvula 435, um compressor 431 e um reservatório para ar comprimido 433. O compressor 431 pode constantemente ajustar uma pressão definida no reservatório para ar comprimido 433.
Cada um dos membros atuadores 441, 442, 443, 444 é acionado por um correspondente atuador. Em uso, o cartucho 401 é posicionado com o pelo menos um elemento de cobertura parcialmente flexível 403 faceando os atuadores e membros atuadores. Cada membro atuador corresponde espacialmente a um diferente local de rede microfluídica do cartucho 401. Por exemplo, o membro atuador 442 corresponde ao furo 414, conduzindo ao poço 407 via o canal 411 e furo 415. Quando acionado, o membro atuador 442 comprime a pelo menos uma cobertura parcialmente flexível 403, sobrepondo-se ao furo 414, desse modo obstruindo o furo 414 e evitando a passagem de fluido através dele. Outros membros atuadores correspondem similarmente a outras estruturas. P. ex., os membros atuadores 443 e 444 respectivamente correspondem aos furos 415e416. A atuação dos membros atuadores 415, 416 veda o segundo poço 407, permitindo, p. ex., que múltiplos ciclos de aquecimento e esfriamento sejam realizados sem significativa perda de líquido neles.
Para atuação exemplar do membro atuador 442, a unidade de controle remete um sinal para a unidade de válvula. A unidade de válvula abre a conexão pneumática 436 para o atuador 438, desse modo aplicando uma pressão ao atuador 438. Assim, o membro atuador 442 move-se para fora e comprime a cobertura pelo menos parcialmente flexível 403 sobrepondo-se ao furo 414. Para liberar o membro atuador, a unidade de controle remete um sinal respectivo para a unidade de válvula. A unidade de válvula fecha a conexão pneumática conduzindo ao atuador 438, desse modo movendo de volta o membro atuador 442 e liberando a cobertura pelo menos parcialmente flexível 403 sobrepondo-se ao furo 414.
O membro atuador pode ser adaptado para elasticamente deformar a primeira cobertura flexível 403, para realizar várias tarefas. Por exemplo, como descrito acima, o membro atuador 442 é adaptado para comprimir a cobertura pelo menos parcialmente flexível 403 sobrepondo-se ao furo 414, desse modo obstruindo o furo 414 e evitando a passagem de fluido ao longo dele, enquanto o membro atuador 441 é adaptado para mover um líquido dentro do poço 408 repetidamente pressionando e liberando a primeira cobertura flexível sobrepondo-se ao poço 408.
Em uma forma de realização, um membro atuador pode ser um elemento que é capaz de ser movido para seletivamente abrir ou fechar elementos individuais das estruturas da rede microfluídica por forças mecânicas. Por exemplo, um tal membro atuador pode ser um pino ou um estêncil que pode ser prensado contra um elemento de cobertura flexível para pressionar o último sobre uma superfície do substrato, desse modo seletivamente abrindo ou fechando os canais.
Em algumas formas de realização, a ponta do membro atuador 441, 442, 443, 444 é feita de um material elástico, tal como silicone, goma ou similar. O diâmetro dos membros atuadores 442, 443 e 444 podem ser 1,5 vezes o diâmetro dos furos 414, 415 e 416. Um diâmetro típico para os furos 414, 415 e 416 é de 0,5 mm.
Como descrito acima, uma unidade de válvula pneumática 435 é provida que é acoplada nos atuadores 437 — 440. A unidade de válvula 435 recebe sinais de acionamento de uma unidade de controle 471. Assim, a unidade de controle 471 controla a operação dos membros atuadores 441 — 444.
A unidade de controle 471, tal como um microprocessador, é provida e adaptada para controlar uma análise de uma amostra fluídica, de tal maneira que as moléculas alvo das amostras fluídicas são capturadas nos membros de ligação 406. A unidade de controle 471 controla ainda uma ampliação das moléculas alvo no poço central 407. Além disso, a unidade de controle 471 controla uma detecção de compostos indicativa da presença e/ou quantidade das moléculas alvo e capturados nos membros de ligação 417. Todos os procedimentos de acoplamento de fase sólida durante uma análise das moléculas alvo ocorrem nos membros de ligação 406 do poço central 407. Particularmente, não ocorrem procedimentos de acoplamento de fase sólida no poço de lise 408.
Em uma forma de realização, uma unidade de controle pode ser um componente eletrônico que é capaz de controlar a função de um ou mais de outros componentes do dispositivo e que pode particularmente coordenar a função dos componentes individuais. Na unidade de controle, um código ou um algoritmo pode ser armazenado ou pode ser definido pelo
100 usuário em software, em hardware ou em forma híbrida (isto é, incluindo componentes de software e hardware), de uma maneira a ser capaz de realizar uma análise, experimento ou ensaio específico. Particularmente, tal unidade de controle pode incluir um processador tendo capacidade de processamento (opcionalmente tendo também capacidade de armazenagem) e sendo configurado para realizar um protocolo experimental específico. Particularmente, tal unidade de controle pode ser um microprocessador ou uma CPU (unidade de processamento central).
A temperatura dos fluidos no poço central 407 pode ser manipulada por uma unidade de manipulação de temperatura, incluindo esfriador pneumático 453, sensor de temperatura (não mostrado) e uma placa de aquecimento 451 disposta nas vizinhanças de uma superfície superior do substrato 402 e uma segunda placa de aquecimento anular 451, tendo um rebaixo central 459 para permitir uma detecção óptica de moléculas no poço central 407. Em algumas formas de realização, as placas de aquecimento incluem um sensor de temperatura para ajustar a temperatura das placas de aquecimento e/ou do segundo poço. A unidade de controle 471 pode controlar a distribuição da temperatura das placas 451, para desse modo manipular a temperatura dos líquidos na estrutura central 407 (por exemplo, de acordo com uma sequência de temperatura para realizar uma reação de cadeia de polimerase, para ampliar as moléculas alvo durante a análise). Particularmente, a unidade de manipulação de temperatura 451 tem a capacidade de elevar a temperatura dos líquidos localizados no poço central 407 até 95 °C.
Entre o substrato 402 e o elemento de cobertura 404, uma interface de fluido 418 é provida, permitindo inserir líquidos tais como água ou tampões ou gases, tais como ar, dentro do sistema microfluídico, via o canal 410 e furo 413. Outra interface 482 pode ser provida que permite a inserção de uma amostra 481 dentro do sistema microfluídico.
101
Em algumas formas de realização, o substrato 402 e, pelo menos parcialmente, opticamente transparente para desse modo permitir uma detecção baseada em radiação óptica dos componentes do poço central 407, como será explicado a seguir.
Um sistema detector 455, incluindo uma fonte de luz (não mostrada), tal como um diodo leiser, é adaptado para gerar um feixe de radiação eletromagnética colidindo através do rebaixo 459 do segundo elemento de aquecimento 451 dentro da câmara central 407. Na presença de marcadores fluorescentes desta câmara 407, um feixe de luz eletromagnética secundário é gerado que pode propagar-se através do rebaixo 459 do segundo elemento de aquecimento 451 e pode ser detectado por um detector (não mostrado) dentro do sistema detector 455, tal como um fotodiodo. Um sinal de detecção do sistema detector 455, indicativo da concentração das moléculas alvo, pode ser provido para a unidade de controle 471 para mais processamento via a interface de unidade de controle 456. Assim, como pode ser depreendido pela Fig. 17, a unidade de controle 471 também coordena a função do sistema de detecção 455.
Em algumas formas de realização, durante a detecção um atuador de detecção 457 comprime o poço central para reduzir a distância entre os elementos de cobertura flexíveis 403 e 404 ou entre os elementos de cobertura flexíveis 403 e 404 e o substrato 402, desse modo removendo líquido incluindo material que não se ligou a um dos membros de ligação 406 ou 417 da zona de detecção.
Um suprimento de líquido 461 é provido para bombear líquidos, tais como água ou tampões, através da rede microfluídica formada pelos poços 408, 407 pelos furos atravessantes 413, 414, 415, 416 e pelos canais 410, 411, 412.
O transporte de líquidos através do dispositivo 400 pode também ser realizado sugando-se o líquido por uma pressão negativa (não
102 mostrada). Um sensor óptico 464 pode ser provido para controlar o nível de fluido na câmara 408, como explicado a seguir. Se o poço 408 for para ser enchido com líquido do suprimento de líquido 461, a unidade de controle 471 envia um sinal de concordância para a unidade de válvula 435 via interface 446. A unidade de válvula abre uma válvula para aplicar pressão no suprimento de líquido 461 via a conexão pneumática 463, desse modo pressionando líquido do suprimento de líquido 461 para dentro do poço 408 via conexão de líquido 462, canal 410 e furo 413.
Quando o sensor óptico 464 detecta um sinal indicativo da presença do líquido dentro do poço 408, o sensor remete um sinal para a unidade de controle 471 via a interface 465. A unidade de controle 471 então remete um sinal para a unidade de válvula 435. A unidade de válvula fecha a válvula, desse modo parando a pressão sobre o suprimento de líquido 461, desse modo parando o movimento do líquido para fora do poço 408.
Outros sensores ópticos podem se providos para controlar os níveis de líquido em outras estruturas, tais como canais (410, 411, 412, sensores não mostrados) ou poços (407, sensores não mostrados).
Em várias formas de realização, a amostra 481 pode incluir qualquer substância sólida, líquida ou gasosa ou uma combinação delas. Por exemplo, a substância pode ser um líquido ou suspensão, além disso particularmente uma substância biológica (tal como sangue, particularmente sangue integral). Tal substância pode incluir proteínas, polipeptídeos, ácidos nucleicos, lipídeos, carboidratos, vírus, bactérias etc. Em formas de realização, uma amostra é uma composição de matéria, possivelmente incluindo um alvo.
Como pode ser admitido pela Fig. 17, a unidade de controle 471 também controla a bomba 431 via interface 447. Um reservatório 433 para ar comprimido pode ser provido, a fim de harmonizar o procedimento de bombeamento com o desempenho dos atuadores 437 - 440 do esfriador
103 pneumático 453 e com o atuador de detecção 457.
O sistema 400 inclui ainda uma unidade de interface de usuário 472, que pode também ser indicada como um dispositivo de entrada/saída. Via a unidade de interface do usuário 472, um usuário pode definir a realização de um experimento pelo sistema 400. Em outras palavras, a interface do usuário 472 pode possibilitar que um usuário programe o sistema 400, a fim de realizar um ensaio específico. Tal interface de usuário 472 pode incluir uma interface de usuário gráfica (GUI) tendo uma unidade display tal como um LCD, um dispositivo de plasma ou tubo de raios catódicos. Além disso, elementos de entrada podem ser providos na interface do usuário 472, tal como um teclado, joystick, botões, um trackball ou mesmo um microfone de um sistema de reconhecimento de voz. A interface do usuário 472 é conectada à unidade de controle via uma conexão de dados.
Com referência às figs. 17c e d, em algumas formas de realização a unidade de válvula 435 consiste de um número (n) de válvulas simples (2). Cada válvula é feita de um rotor (2.1) incluindo os canais (2.3) e um estator (2.2) ambos montados e fixados com 4 molas para aplicar uma pressão constante. Cada válvula tem 4 furos (a, b, c, d), a sendo conectado com a ventilação, b) sendo conectado com o compressor, c) sendo conectado com o atuador pneumático e d) sendo conectado ao sítio de ventilação do atuador.
O veículo (3) conectado a um parafuso de esfera (4) que é colocado dentro do tubo. Uma fenda dentro do tubo (6) possibilita que o veículo mova-se. O movimento de rotação do eixo motriz (5) resultará em um movimento do parafuso de esfera e do veículo conectado na direção-x. Isso possibilita o movimento do veículo para a posição de cada válvula (2). O veículo travará dentro do rotor (2.1). Um movimento de 90° do tubo (6) resultará em um movimento de 90° do veículo (3) e rotor (2.1). O rotor e as cavidades do disco de rotor abrirão e fecharão as conexões de válvula (a,b e
104 c,d; d,a e b,c).
A seguir, com referência à Fig. 18 e Fig. 19, um dispositivo 500, de acordo com outra forma de realização exemplar, será explicado. A Fig. 18 mostra uma vista frontal e a Fig. 19 mostra uma vista traseira do dispositivo 500. O dispositivo 500 inclui um sulco 501, formado em um substrato 402, para inserir uma cânula (não mostrada), via a qual uma amostra pode ser fornecida ao dispositivo 500. Uma câmara de lise 502 é provida em que materiais necessários para lisagem podem ser armazenados em uma forma seca. Um poço central 512 serve para realizar todos os procedimentos de acoplamento de fase sólida requeridos para operar o dispositivo 500. Poços adicionais 504, 506, 508 e 510 são providos em que várias outras substâncias são providas em forma seca e que podem servir para procedimentos de lavagem, um procedimento PCR etc. Uma câmara de refugo 514 é provida como um poço em que líquidos podem ser transportados, que não são mais necessários para análise.
Embora não mostrado na Fig. 18 e Fig. 19, um material absorvente líquido pode ser provido na câmara de refugo 514, que pode absorver fluidos penetrando na câmara de refugo 514. Tomando-se esta medida, contracorrente indesejada de líquidos da câmara de refugo 514 para dentro de outras partes do dispositivo 500 pode ser evitada com segurança para, desse modo, impedir qualquer contaminação. Por exemplo, polímeros dilatáveis (que podem também ser usados em fraldas) podem ser empregados para tal finalidade.
Como pode ser entendido particularmente pela Fig. 18, uma pluralidade de orifícios de conexão de fluido 520, 524, 521, 525, 540, 542, 544, 545, 548, 578, 580, 558, 562, 564, 560, 561, 552, 550, 516, 554, 530, 528, 532 e 526 são providos conectando vários dos canais, o que será explicado a seguir.
Como pode ser entendido pela Fig. 19, orifícios de conexão de
105 fluido adicionais 541, 560, 566, 519, 512 são mostrados. Alem disso, uma pluralidade de canais 538, 522, 518, 527, 529, 536, 572, 574, 576, 539, 562, 570, 546, 556, 568 e 534 é prevista para conectar vários orifícios de conexão 520, 524, 521, 525, 540, 542, 544, 545, 548, 578, 580, 558, 562, 564, 560, 561, 552, 550, 516, 554, 530, 528, 532, 526, 541, 560, 566, 519 e poços 502, 504, 506, 508, 510 e 512. Além disto, um orifício de entrada de fluido 593 é mostrado, via o qual fluidos tais como água podem ser injetados dentro do dispositivo 500. Via um orifício de saída de fluido 594, o fluido (tal como ar removido para reduzir a pressão) pode ser removido do dispositivo 500. Um outro orifício de entrada/saída de fluido 597 é mostrado também.
Uma primeira parte de janela 598, acessível por uma barreira de luz, e uma segunda parte de janela 599, acessível por uma barreira de luz, são mostradas, que podem servir para detectar opticamente quando um menisco de uma coluna de fluido dentro do dispositivo 500 passa pelas partes de janela transparentes 598, 599 relacionadas com as barreiras de luz. Quando uma das barreiras de luz detecta que uma das câmaras correspondendo às partes de janela 598, 599 está cheia com um líquido ou extravasa, isto pode ser detectado opticamente e pode ser vir para gerar uma sinal de controle para controlar uma unidade de controle (não mostrada na Fig. 18 e Fig. 19) para controlar a operação do dispositivo 500 correspondentemente.
Quando uma primeira parte de uma cânula é inserida dentro do sulco 501, uma segunda parte da cânula pode ser inserida em um paciente para retirar uma amostra de sangue e para diretamente injetar a amostra de sangue integral no dispositivo 500.
Embora não mostrado na Fig. 18 e Fig. 19, qualquer um dos orifícios de conexão 520, 524, 521, 525, 540, 542, 544, 545, 548, 578, 580, 558, 562, 564, 560, 561, 552, 550, 516, 554, 530, 528, 532, 526, 541, 560, 566, 519 pode ser coberto por um membro flexível, que pode ser comprimido por um pino atuador (não mostrado na Fig. 18 e Fig. 19), de modo que os
106 pinos podem servir para seletivamente abrir ou fechar qualquer orifício individual dos orifícios de conexão de fluido 520, 524, 521, 525, 540, 542, 544, 545, 548, 578, 580, 558, 562, 564, 560, 561, 552, 550, 516, 554, 530, 528, 532, 526, 541, 560, 566, 519, assim cumprindo uma função de válvula.
Embora não mostrado nas Figs. 18 e Fig. 19, qualquer um dos poços 502, 504, 506, 508, 510 e 512 pode ser coberto por um membro flexível, que pode ser comprimido por um pino atuador (não mostrado na Fig. 18 e Fig. 19), de modo que os pinos podem servir para seletivamente pressionar sobre os poços 502,504, 506, 508, 510 e 512, assim servindo como misturadores ou bombas.
Como poder entendido pela Fig. 18, um componente 587 formando o poço central 512 é um membro plástico moldado, que pode ser inserido nos sulcos 585, 583 do substrato 402. Este membro plástico 587 pode ser padronizado ou estruturado por ambos os lados, de modo que os componentes 590, 591, 578, 548, 580, 558 etc. sejam formados.
A seguir, um ensaio realizado no dispositivo 500, particularmente baseado no poço central 512, será explicado que pode permitir realizar uma determinação de carga de HIV em uma maneira rápida, por exemplo, em menos do que uma hora.
Dentro da câmara central 512, são providas contas. Estas contas podem ser configuradas para capturar moléculas alvo (por exemplo, RNA HIV) de uma amostra previamente lisada. P. ex., as contas podem ser configuradas para ligar um grupo âncora de uma molécula de captura para ligar complexos incluindo um polinucleotídeo alvo e a molécula de captura, em que a molécula de captura inclui uma parte de ligação específica para uma região do polinucleotídeo alvo e do grupo âncora.
O numeral de referência 541 indica uma conexão a ar pressurizado (vide seta na Fig. 19), de modo que o ar pressurizado passa através dos elementos 538, 518, 516 e penetra no poço 502. Assim, é possível
107 esvaziar o poço 502 por bombeio, empregando-se ar pressurizado. No caso de que uma amostra de sangue suprida via o sulco 501 seja diluída com água, tal água pode ser suprida via orifício de entrada de fluido 593.
Em uma forma de realização, uma amostra de sangue integral (ou qualquer outra amostra) pode ser transportada dentro do poço 502, por exemplo, para lisagem. Sangue pode ser embebido dentro do dispositivo 500 comprimindo-se primeiro a câmara, aplicando-se o sangue a um capilar, o capilar em contato com a câmara de lisagem 502, em seguida liberando-se a câmara de lisagem 502, desse modo embebendo-se o sangue dentro do dispositivo 500.
Para esta finalidade, os correspondentes agentes de lisagem como descrito abaixo são providos em forma seca no poço de lise 502. O poço de lise pode ainda incluir as moléculas de captura, cada uma incluindo um grupo âncora e uma parte de ligação específica para uma região do polinucleotídeo alvo. A amostra que agora pode incluir complexos, cada um incluindo um polinucleotídeo alvo e uma molécula de captura, pode então ser transportada via componentes 554, 556 (via ar pressurizado) para o componente 558. Neste cenário, o componente 552 é fechado por um correspondente atuador. Via componentes 558, 580, a amostra pode ser transportada para dentro do poço central 512. Para esta finalidade, os sulcos 591, 590 do poço central 512 podem ser equipados com filtros, tais como fritas (não mostradas na Fig. 18 e Fig. 19), evitando que as contas do poço central 502 sejam removidas deste poço 502 sob a influência da força de corrente dos fluidos. Assim, via o filtro ou frita dentro dos sulcos 591, 590, a amostra lisada pode ser transportada via componente 576 para dentro do poço central 512.
No poço central 512, um primeiro membro de ligação, tais como contas ou uma funcionalização de superfície pode ser provido, de modo que os alvos ou complexos incluindo um polinucleotídeo alvo e uma molécula
108 de captura possam ligar-se em estruturas de captura sólidas da câmara central 512. Uma incubação pode ser realizada a fim de que as contas apropriadamente misturem-se com o material amostra.
Uma corrente de ar pressiona o líquido (isto é, componentes não capturados da amostra lisada) do poço central 512, via componentes 558, 560, 561, para dentro do refugo 514. Assim, muitos dos componentes amostra que não foram capturados pelas contas no poço central 512 são transportados para dentro da câmara de refugo 514. Assim, somente alvos permanecem no poço central 512 e o resto da amostra de sangue integral fica agora no refugo 514. Assim, o poço central 512 aloja agora as contas junto com os complexos incluindo sondas e alvos de captura.
Subsequentemente, o poço central 512 pode ser lavado, em que os componentes para tampão de lavagem providos em uma maneira sólida em um poço de lavagem 504 são usados para produzir um tampão de lavagem. Tal procedimento de lavagem pode ser vantajosa, uma vez que, após o procedimento de captura, algumas impurezas podem ainda estar presentes na câmara 502, particularmente quando uma amostra de sangue integral é usada ou a amostra é suprida via uma cânula inserida dentro do sulco 501.
O líquido de lavagem pode ser bombeado, sob a influência de pressão pneumática, via os componentes 541, 540, 542, 546, 548, 578, 591, 574, 512.
Como já indicado acima, um tampão de lavagem é preparado no poço de lavagem 504. No poço de lavagem 504, sais para tal tampão de lavagem pode estar presente em forma seca. Para preparar o tampão de lavagem, água pode ser transportada do componente 566 via componentes 564, 562, 570, 552 (enquanto o componente 554 é fechado), 527 (componentes 532, 525, 530 são fechados), de modo que água é suprida ao componente 521 (aberto). Agua pode ser bombeada no poço de lavagem 504 até uma janela transparente, acoplada ao componente 520, seja enchida com
109 água, que pode ser detectada detectando-se um menisco passando pela barreira de luz adjacente à janela transparente próxima do componente 520. No recebimento de um sinal de detecção correspondente, o suprimento de água pode ser terminado.
Um atuador (não mostrado) pode então alternar ascendente e descendentemente para comprimir um elemento de cobertura flexível cobrindo o poço de lavagem 504 para realizar mistura para dissolver os sais providos ali.
Os canais enchidos com água podem então ser esvaziados por um correspondente controle das várias válvulas e suprindo-se ar pressurizado, de modo que a água possa ser bombeada dentro da câmara de refugo 514.
O tampão de lavagem preparado dentro do poço de lavagem 504 pode então ser comprimido para dentro do poço central 512, de modo que um procedimento de lavagem pode ser realizado no poço central 512. Após esta lavagem, a solução de lavagem pode ser bombeada na câmara de refugo 514.
Em seguida, uma transcrição inversa pode ser realizada para converter RNA em um correspondente DNA. Tal procedimento é especificamente necessário no caso da detecção de Retrovirus, tal como HIV, e pode ser dispensável em outros casos, por exemplo, quando vírus de DNA são detectados. Para realizar tal transcrição inversa, os componentes requeridos para transcrição inversa, tais como um iniciador, uma enzima e um tampão, podem ser bombeados de um poço de transcrição inversa 508 para dentro do poço central 512.
Opcionalmente, os componentes do poço de transcrição inversa 508 podem também incluir outro conjunto de mais moléculas de captura que podem ter a capacidade específica de capturar moléculas de DNA no poço central 512 produzidas durante transcrição inversa.
Uma vez que, após a transcrição inversa, o DNA alvo não
110 permanece nas contas da câmara 512, o transporte da solução para dentro do recipiente de refugo 514 reduziría a quantidade de amostra. Para esta finalidade, a amostra é agora bombeada do poço central 512 para dentro do poço de PCR 510 e pode dissolver os sais de PCR dentro desta amostra, em que o tampão de PCR dentro do poço PCR 510 pode incluir polimerase, moléculas repórter capazes de formar complexos com o polinucleotídeo alvo, iniciador e/ou tampão. Altemativamente, o tampão de transcrição inversa contém moléculas de captura direcionadas para os filamentos de DNA sintetizados e a captura destes filamentos ocorre da mesma maneira como a captura inicial de ácidos nucleicos HIV. Após isto, a amostra pode ser bombeada de volta para dentro do poço central 512.
Entretanto, a ampliação PCR real é então realizada no poço central 512. Para esta finalidade, uma PCR é realizada no poço central 512 realizando-se um ciclo de temperatura, isto é, repetindo-se, p. ex., 40 vezes um procedimento com 5s a 95 °C 10 s a 60 °C. Em outra forma de realização, um ciclo de temperatura incluindo 3 ou mais diferentes temperaturas, p. ex., incluindo 30 ciclos de 20s a 95 °C, 30 s a 55 °C e 30 segundos a 72 °C, pode ser realizado. Entretanto, outros protocolos de ciclagem PCR podem também ser realizados na câmara central.
Em algumas formas de realização, para ajustar a temperatura no poço central 512, duas placas de aquecimento podem ser providas acima e abaixo do poço central 512. Em outra forma de realização, um dos dois poços de aquecimento pode ser contínuo e o outro pode ter um rebaixo para permitir uma subsequente detecção óptica. Em algumas formas de realização, durante a ampliação a detecção pode ocorrer como descrito acima.
P. ex., em uma primeira forma de realização, um ensaio competitivo de moléculas de captura pode ser realizado no poço central 512. Assim, nesta forma de realização, um primeiro membro de ligação, tal como contas, é usado para capturar os complexos, cada um incluindo uma molécula
111 alvo e uma molécula de captura e um segundo membro de ligação, incluindo uma formação de moléculas de captura específicas de repórter, imobilizadas no poço central 512, é usado para detecção. O ensaio competitivo inclui formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo, a formação destes complexos inibindo a captura do composto repórter pela formação de moléculas de captura específicas de repórter, imobilizadas no poço central 512. As moléculas de captura específicas de repórter, imobilizadas no poço central 512, são capazes de capturar pelo menos um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um primeiro navio alvo. Ao prover uma formação de diferentes espécies de moléculas de captura específicas de repórter dentro do poço 512 para detecção, é possível distinguir entre diferentes tipos do vírus HI, por exemplo, HIV tipo 1 e HIV tipo 2 e pode mesmo ser possível distinguir entre diferentes subtipos do vírus HI.
Em uma segunda forma de realização, é possível usar o mesmo membro de ligação, p. ex., contas, que já foram usadas para o procedimento de captura também para a detecção. Nesta forma de realização, um oligonucleotídeo de captura sendo ligado às contas via um grupo âncora pode hibridizar com um complexo de DNA alvo ampliado, que pode ele próprio incluir um rótulo de fluorescência.
Os compostos repórter capturados ou as moléculas alvo capturadas podem ser detectadas por uma detecção óptica, por exemplo, usando-se rótulo de fluorescência como descrito acima. Particularmente, um sistema óptico tendo uma fonte de luz (não mostrada) e um detector de luz (não mostrado) pode ser operado de uma maneira a fim de medir a dependência de tempo do sinal durante a PCR, o que permite derivar a carga viral do HIV. Em outras palavras, a dependência de tempo do sinal de fluorescência pode ser adquirida e avaliada.
112
A seguir, com referência à Fig. 20, um dispositivo 600, de acordo com uma forma de realização exemplar, será explicado.
A forma de realização da Fig. 20 é similar às formas de realização da Fig. 18, 19, de modo que componentes correspondentes são indicados com os mesmos numerais de referência. Para fins de simplicidade e clareza, os canais e orifícios de fluido não são indicados com numerais de referência na Fig. 20. Para explicação correspondente, referência é feita às Fig. 18 e Fig. 19.
A Fig. 20 mostra uma parte de janela 602 relacionada com o poço 504 e uma parte de janela 604 relacionada com o poço 506, para possibilitar que uma detecção de menisco e, portanto, uma detecção de extravasamento, como uma base para determinar os sinais de controle para controlar atuadores atuando nos poços 504, 506 e atuando nos vários orifícios de comunicação de fluido.
A direção do vetor de gravidade g é indicado para mostrar em que posição o dispositivo 600 pode ser operado em algumas formas de realização. Nestas formas de realização, a operação do dispositivo 600 é baseada em uma combinação da força gravitacional e forças de transporte de líquido providas via uma conexão de ar pressurizado 606 e uma conexão de suprimento de água 608. Além disso, uma conexão de ventilação 610 e uma conexão de ventilação 612 são providas para ventilar as correspondentes estruturas fluídicas.
A Fig. 20 mostra esquematicamente uma parte 613 que pode ser, como uma alternativa à solução integral da Fig. 20, provida como um módulo separado, que pode ser combinado com outros módulos para formar um dispositivo definido pelo usuário em que os vários módulos são montados juntos.
A seguir, com referência à Fig. 21, um dispositivo 700, de acordo com outra forma de realização exemplar, será explicado.
113
O dispositivo 700 inclui um substrato rígido 704 em que um primeiro furo atravessante 709 e um segundo furo atravessante 707 são formados. Em uma primeira superfície principal do substrato 704, um primeiro poço 720 e um segundo poço 708 são formados. Em uma superfície principal oposta do substrato 704, um canal 706 é formado. O canal 706 fica em comunicação fluida com os poços 720,708, via os furos atravessantes 709,
707, respectivamente.
Em uma superfície superior do substrato rígido 704, um primeiro elemento de cobertura flexível 708 é formado e aderido ao substrato rígido 704. Em uma superfície inferior do substrato 704, um segundo elemento de cobertura 705 é formado e laminado no substrato rígido 704.
Como pode ser entendido pela Fig. 21, um primeiro membro atuador 701 e um segundo membro atuador 702 são providos, o primeiro membro atuador 701 sendo adaptado para pressionar em uma primeira parte do elemento de cobertura 720, para seletivamente fechar o canal de furo atravessante 709 ou o inteiro poço 720. Em uma maneira correspondente, o segundo elemento de aquecimento 702 pode seletivamente abrir ou fechar o poço 708 e/ou o furo atravessante 707. Assim, o fluxo de um canal atravessante de fluido 706, para dentro de um ou ambos dos poços 720 ou
708, pode ser controlado.
A Fig. 22 representa uma ilustração esquemática de um ensaio competitivo exemplar de acordo com a presente invenção. Uma molécula repórter de ácido nucleico rotulada (mostrada como uma linha sinuosa cinza) é ligada via uma molécula de captura de ácido nucleico (mostrada como uma linha sinuosa preta) em um membro de ligação (aqui exemplificado como uma conta). O ácido nucleico alvo a ser detectado está presente na amostra em forma de duplo filamento (os dois filamentos são mostrados como linhas sinuosas cinza claro/pretas). Submetendo-se a amostra a uma etapa de desnaturação (de uma reação de amplificação cíclica) permite-se que os
114 filamentos do ácido nucleico alvo se dissocie e a molécula repórter seja liberada do membro de ligação. Durante a subsequente etapa de anelação, um subconjunto da quantidade de molécula repórter é permitido formar complexos com pelo menos um subconjunto da quantidade de ácido nucleico alvo, em que a formação dos complexos de ácido nucleico alvo/molécula repórter inibe a capacidade da molécula repórter de ser capturada no membro de ligação, devido a uma competição da moléculas de captura e do alvo de ácido nucleico para ligarem-se à molécula repórter. O subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo é permitido ser recapturado no membro de ligação. Neste estágio, um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no membro de ligação e baseado nele, um valor indicativo da presença e/ou quantidade do ácido nucleico alvo é determinado detectando-se um sinal gerado pelo rótulo incluído na molécula receptora. Consequente ou concomitantemente à etapa de anelar, a etapa de extensão da reação de ampliação é realizada. Em seguida, a amostra pode ser submetida a outro ciclo de ampliação.
A Fig. 23 mostra os resultados de um ensaio competitivo exemplar de acordo com a presente invenção, para determinar a quantidade de DNA de poliovirus 1 (designado “EV” para “DNA de enterovirus”) em uma amostra, em comparação com um ensaio Taq-man padrão, realizado com o mesmo alvo. Duas amostras, cada uma contendo 104 cópias de DNA, foram analisadas em paralelo: a primeira amostra (“sonda” de rótulo no diagrama) foi submetida a ampliação PCR usando-se um analisador PCR rotativo de tempo real Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Sciences, Sydney, Austrália), de acordo com instruções dos fabricantes. O iniciador PCR empregado resultou na ampliação de um fragmento de DNA de 150 pb. A detecção do fragmento foi realizada por meio de uma sonda chamada Taqman®, incluindo um rótulo de 6-carbóxi-fluoresceína (FAM) em seu término 5’ e um rótulo de 6
115 carboxitetrametilrodamina-succinimidiléster (TAMRA) em seu término 3’, respectivamente (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). No total, 50 ciclos PCR foram realizados. A segunda amostra (“ensaio competitivo”) adicionalmente incluiu uma molécula repórter tendo a mesma sequência de nucleotídeo que a sonda Taqman®, porém inclui um rótulo carbocianina CY3 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) em seu término 3’, em vez de rótulos FAM/TAMRA e foi ampliada usando-se um dispositivo de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Os sinais de fluorescência obtidos detectados durante a ampliação são mostrados no diagrama.
A Fig. 24 ilustra o princípio e mostra os resultados de um ensaio competitivo baseado em formação exemplificative, de acordo com a presente invenção, para determinar a quantidade de um produto PCR HIV gag/env em uma amostra. A Fig. 24A esquematicamente ilustra o princípio do ensaio (cf. também Fig. 22). Inicialmente, nenhum produto PCR ampliado, isto é, ácido nucleico alvo, está presente. As moléculas repórter de ácido nucleico rotuladas fluorescente são ligadas às sondas específicas de repórter, capturadas no substrato de uma formação. Se nenhum produto PCR for produzido, a quantidade de moléculas repórter hibridizando nas sondas específicas de repórter, permanece constante após cada ciclo da reação de ampliação e, assim, o sinal de fluorescência permanece constante após cada ciclo da reação de ampliação e, assim, o sinal de fluorescência determinado permanece constante também. Se um produto PCR for sintetizado, a quantidade de molécula repórter hibridizando nas sondas específicas de repórter diminui após cada ciclo PCR e, como resultado, o sinal de fluorescência determinado diminui correspondentemente. A Fig. 24B mostra os resultados de um ensaio competitivo baseado em formação, para determinar a quantidade de um produto PCR gag/env HIV1 151 pb. Diferentes quantidades de fragmento (correspondendo a I04-106 cópias), juntamente com uma molécula repórter (“anti_cdso29_5’CY3”) incluindo em
116 seu término 5’ um rótulo de carbocianina CY3 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), foram submetidas a 36 ciclos de ampliação PCR. Dois diferentes tipos de moléculas sonda - uma não específica (“ara_54986_NH2”) e uma específica de repórter (“cdso29_NH2”) - foram capturadas em um substrato de formação em um arranjo como mostrado na Fig. 25A e dispostas dentro da câmara de reação do dispositivo de ensaio empregado. Os valores CT (“limiar”; isto é, uma medida para o início da fase de ampliação exponencial, onde o aumento da fluorescência e, assim, a quantidade ocorre de uma maneira similar) foram determinados usando-se o software Iconoclust (Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Alemanha) e plotados versus as respectivas concentrações de DNA empregadas para gerar uma curva de calibração (FIG. 24C). Em todas as amostras, empregando a sonda específica de receptor, foi observada uma diminuição progressiva na intensidade de fluorescência, à medida que o número de ciclos PCR aumentava. Ao contrário, na amostra empregando a sonda não específica nenhuma fluorescência foi observada (FIG. 24B).
A FIG. 25 representa a formação empregada no ensaio mostrado na Fig. 24 em diferentes estágios da ampliação PCR. O arranjo das diferentes manchas do substrato de formação é esquematicamente ilustrado na Fig. 25A. Os círculos pretos indicam sinais (quatro amostras paralelas) em que a sonda específica (cf. Fig. 24) foi usada para capturar as moléculas repórter, enquanto os círculos brancos referem-se a manchas (quatro amostras paralelas) em que a sonda não específica foi usada para capturar as moléculas repórter. Os círculos cinza representam controles positivos, onde o rótulo de fluorescência foi manchado no substrato de formação. A Fig. 25B mostra fotografias da formação (correspondendo a 105 cópias-amostras de DNA na Fig. 24B) que foram tiradas após os ciclos de ampliação 1, 12, 18 e 21, respectivamente. Nas amostras capturadas na formação, via as moléculas de sonda específicas, uma diminuição na intensidade do sinal de fluorescência
117 pode ser observada durante o curso da ampliação PCR.
As Figs. 26A-D representam uma ilustração esquemática de uma forma de realização exemplar do método competitivo para a detecção de polinucleotídeos de acordo com a presente invenção. Como mostrado na Fig. 26A, inicialmente nenhum produto PCR ampliado, isto é, ácido nucleico alvo, está presente. As moléculas repórter de ácido nucleico rotuladas (mostradas como uma linha sinuosa preta e indicada como repórter específico de alvo/sonda) são ligadas às sondas específicas de repórter, capturadas no substrato de uma formação. O sinal corresponde àquele das moléculas de controle internas rotuladas (mostradas como linha sinuosa cinza claro), que são ligadas a sondas específicas de controle internas, capturadas no substrato de uma formação. Como mostrado na Fig. 26B, se a PCR penetrar na fase exponencial inicial, as moléculas repórter não somente ligam-se às sondas específicas de repórter capturadas no substrato, porém também ligam-se à região específica de repórter do produto PCR. Assim, se um produto PCR for sintetizado, a quantidade de molécula repórter hibridizando nas sondas específicas de repórter, capturadas no substrato, diminui e, como resultado, o sinal determinado diminui correspondentemente. O sinal diminui significativamente quando a PCR está na fase exponencial (vide Fig. 26D). O sinal nas sondas específicas de repórter, capturadas no substrato, permanece baixo quando a PCR alcança a fase platô (vide Fig. 26D).
A Fig. 27 mostra os resultados de uma forma de realização exemplificativa do ensaio competitivo de acordo com a presente invenção, para determinar a quantidade de HIV subtipo B e HIV subtipo 02 em uma amostra. No experimento subjazendo a Fig. 27A, somente HIV subtipo B estava presente na amostra. Pode ser visto que o sinal correspondendo a uma molécula repórter de ácido nucleico rotulada, específica de HIV subtipo O2 (HIV sub O2) permanece constante, enquanto que o sinal correspondendo a uma molécula repórter de ácido nucleico rotulada específica para HIV subtipo
118
B (HIV subtipo B) diminui significativamente após cerca de 13 ciclos da PCR (cf. Fig. 26). No experimento subjazendo a Fig. 27B, somente o HIV subtipo O2 estava presente na amostra. Pode ser visto que o sinal correspondendo a uma molécula repórter de ácido nucleico rotulada específica HIV subtipo b (HIV sub B) permanece constante, enquanto que o sinal correspondendo a uma molécula repórter de ácido nucleico rotulada específica para HIV subtipo O2 (HIV sub O2) diminui significativamente após 25 ciclos da PCR (cf. Fig. 26).
A Fig. 28 mostra os resultados de uma forma de realização exemplar do ensaio competitivo de acordo com a presente invenção, para determinar diferentes quantidades de HIV subtipo B em uma amostra. Se 106 cópias de HIV estiverem presentes na amostra, o sinal correspondendo a uma molécula repórter de ácido nucleico rotulada específica de HIV subtipo B (HIV sub B) diminui significativamente após cerca de 13 ciclos da PCR (vide Figura 28A). Se somente 104 cópias de HIV estiverem presentes na amostra, o sinal correspondendo a uma molécula repórter de ácido nucleico rotulada, específica para HIV subtipo B (HIV sub B) diminui significativamente após 19 ciclos da PCR (vide Fig. 28B). É evidente pela Figura 28 que a quantidade de ciclos PCR necessários antes de uma diminuição no sinal sendo detectável permite conclusões quanto a que quantidade de ácido nucleico alvo presente na amostra a ser analisada.
A invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos, que são unicamente para fms de ilustração de formas de realização específicas desta invenção e não para ser interpretados como limitação do escopo da invenção de forma alguma.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Ensaio competitivo para determinar o DNA de poliovirus 1 humano
O princípio do ensaio competitivo realizado é
119 esquematicamente mostrado na Fig. 22. O DNA de isolado de poliovirus 1 humano TCDC01-862 (acesso ao GenBank número AF538843) clonado dentro de um vetor de expressão adequado (pCR®1.2-TOPO®, Contech, Inc. Paio Alto, CA, USA) foi usado como um gabarito de DNA (aqui também designado DNA de “EV” (enterovirus)).
Duas amostras, cada um contendo 104 cópias de DNA foram analisadas em paralelo: a primeira amostra foi submetida a ampliação PCR usando-se um analisador PCR rotativo em tempo real Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Sciences, Sydney, Austrália) de acordo com instruções dos fabricantes.
A segunda amostra adicionalmente incluiu uma molécula repórter tendo a mesma sequência de nucleotídeo que a sonda Taqman®, porém inclui um rótulo de carbocianina CY3 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) em seu término 3’ em vez de rótulos FAM/TAMRA e foi ampliada usando-se diretamente em uma câmara de reação de um dispositivo de ensaio, em que a formação foi dispostas na superfície de base aquecí vel.
Os seguintes iniciadores de PCR foram usados:
Iniciador PCR para diante:
pr_for_EV_02: 5'-CAAACCAGTGATTGGCCTGTCGTAACG-3' (correspondendo às posições de nucleotídeo 492-518 de AF538843) iniciador PCR inverso:
pr rev EV 01 : 5'-TTCACCGGATGGCCAATCCAATTCG-3' (correspondendo às posições de nucleotídeo 617-641 de AF538843)
Isso, a PCR resultou na ampliação de um fragmento de DNA de 150 pb. As amostras de PCR continham 200 nM (concentração final) de cada um dos iniciadores PCR, bem como de EnzymMix® e o tampão de reação do kit Ultrasense RT-PCR (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA,
120
USA), de acordo com instruções dos fabricantes.
Além disso, para detectar o fragmento de PCR ampliado usando-se o analisador de PCR rotativo de tempo real Rotor-Gene 6000, a amostra PCR concordante continha 100 nM (concentração final) de uma sonda chamada Taqman® duplamente rotulada, incluindo um rótulo carbóxifluoresceína (FAM) em seu término 5’ (isto é, o fluoróforo) e um rótulo 6carbóxi-tetrametil-rodamina-succinimidiléster (TAMRA) em seu término 3’ (isto é, o extintor), respectivamente (ambos os rótulos foram comprados da Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). A sonda teve a seguinte sequência:
HPEV2 001: FAM-5'-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3'TAMRA (correspondendo às posições de nucleotídeo 536-561 of AF538843)
Para realizar a análise competitiva, a amostra de PCR continha ainda 20 nM (concentração final) de um molécula repórter tendo a mesma sequência, porém um diferente rótulo do da sonda Taqman®, isto é, um rótulo carbocianina CY3 em seu término 3’ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA):
EV2 02CY3: 5'-ACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT-3’-CY3 (correspondendo às posições de nucleotídeo 536-561 de AF538843)
PCR de tempo real foi realizada de acordo com o seguinte perfil de temperatura: 2 minutos a 94 °C e, subsequentemente, 50 ciclos de 5 segundos a 94 °C, 30 segundos a 62 °C e 30 segundos a 72 °C.
Sinais de fluorescência PCR para ambas as reações são mostrados na Fig. 23.
Exemplo 2: Ensaio competitivo baseado em formação para determinar DNA gag/env HIV 1
121
O princípio do ensaio competitivo realizado é esquematicamente mostrado na FIG. 24A. O DNA de uma construção de fusão gag/env HIV1 sintética (número de acesso EMBL A06258), clonado dentro de sítio de restrição de endonuclease EcoRI do vetor de expressão pCR®2.1-TOPO® (Clontech, Inc. Paio Alto, CA, USA) foi usado como um gabarito de DNA.
Além disso, os seguintes iniciadores de PCR foram usados: iniciador PCR para diante:
cdia: 5'-TGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3' (correspondendo às posições de nucleotídeo 214-232 de A06258)
Iniciador PCR inverso:
edis: 5'-ATCAAGCAGCCATGCAAATGTT-3' (correspondendo às posições de nucleotídeo 384-405 de A06258)
Assim, a PCR resultou na ampliação de um fragmento de DNA de 151 pb, tendo a seguinte sequência: 5'-ATC AAG CAG CCA TGC AAA TGT TAA AAG AGA CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA GAT TGC ATC CAG TCC ATG GAG GGC CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA TAG CAG GAA CTA CTA GTA CCC TTC A-3'.
A PCR foi realizada diretamente na câmara de reação do dispositivo de ensaio, em que a formação foi disposta na superfície de base aquecível. As amostras PCR continham 200 nM (concentração final) cada um dos iniciadores PCR, bem como EnzymMix® e o tampão de reação do Ultrasense RT-PCR Kit (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). Para gerar uma curva de calibração, diferentes quantidades de gabarito de DNA (em 1 μΐ) foram usados, correspondendo a 0, 104, 105 e 106 cópias de DNA (cada uma realizada em quadruplicata).
122
Para realizar a análise competitiva, a amostra de PCR continha ainda 10 nM (concentração final) de uma molécula repórter tendo um rótulo de carbocianina CY3 em seu término 5’ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA): anti_cdso29_5'CY3: CYS-3'-TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT GGT-3' (complementar à molécula de sonda cdso29_NH2 descrita abaixo) PCR foi realizada de acordo com o seguinte perfil de temperatura: 30 segundos a 95 °C e subsequentemente 36 ciclos de 5 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C e 30 segundos a 72 °C.
A interação da molécula repórter com os dois tipos de sondas foi determinada em cada ciclo no final da etapa de anelação usando-se um sistema de detecção óptica posicionado oposto à superfície de topo do dispositivo de ensaio e o pacote de software Iconoclust (Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Alemanha). O tempo de exposição durante a aquisição de dados foi de 2,5 s.
Dois diferentes tipos de moléculas de sonda foram capturados no substrato de formação em um arranjo como mostrado na Fig. 25A. Rótulos fluorescentes sozinhos foram usados como controles positivos. As seguintes sondas foram empregadas;
sonda não específica:
ara_54986_NH2: 5'-ACCAGCTTTGAACCCAACAC-3' sonda específica de receptor:
cdso29_NH2: 5’ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGA-3'
Os valores CT (“limiares”), como uma medida para o início da fase de ampliação exponencial, onde o aumento de fluorescência e, assim,, a quantidade de DNA, ocorre em uma maneira linear, foram determinados usando-se o software Iconoclust (Clondiag Chip Technologies GmbH, Jena, Alemanha) e plotados versus as respectivas concentrações de DNA empregadas para gerar uma curva de calibração (Fig. 24C). Os valores CT
123 médios determinados foram como segue: 22,0 nas 104 cópias-amostras de DNA; 18,5 NAS 105 cópias-amostras de DNA; e 15,0 nas 106 cópiasamostras DNA.
Em todas as amostras empregando a sonda específica de receptor, foi observada uma diminuição progressiva na intensidade de fluorescência à medida que o número de ciclos PCR aumentava (Fig. 24B).
O arranjo das diferentes manchas no substrato de formação é esquematicamente ilustrado na Fig. 25A. Os círculos pretos indicam manchas (quatro amostras paralelas) em que a sonda específica (cf. Fig. 24) foi usada para capturar as moléculas repórter, enquanto que os círculos brancos referem-se a manchas (quatro amostras paralelas) em que a sonda não específica foi usada para capturar moléculas repórter. Os círculos cinza representam controles positivos, enquanto o rótulo fluorescente foi manchado no substrato de formação.
A Fig. 25B mostra fotografias da formação (correspondendo a 105 cópias-amostras de DNA na Fig. 24B) que foram tiradas após os ciclos de amplificação 1, 12, 18 e 21, respectivamente. Nas amostras capturadas na formação via as moléculas de sonda específicas uma diminuição progressiva na intensidade do sinal de fluorescência pode ser observada durante o curso da ampliação PCR que, por sua vez, corresponde a um aumento concomitante da quantidade de produto PCR ampliado que pode ser quantificado por comparação com uma curva de calibração correspondente.
Deve ser citado que o termo “incluindo” não exclui outros elementos ou aspectos e o “um” ou “uma” não exclui uma pluralidade. Também elementos descritos em associação com diferentes formas de realização podem ser combinados.
Deve ser também citado que os sinais de referência das reivindicações não devem ser interpretados como limitantes do escopo das reivindicações.

Claims (36)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Dispositivo (401), caracterizado pelo fato de compreender (a) um substrato rígido (402);
    (b) um elemento de cobertura flexível (403) cobrindo o substrato parcialmente ou integralmente;
    (c) uma primeira estrutura (408) formada dentro do substrato, adaptada para acomodar líquidos e adaptada para liberar conteúdo de uma ou mais células, esporos ou vírus, o conteúdo incluindo moléculas alvo;
    (d) uma segunda estrutura (407) formada dentro do substrato, adaptada para acomodar líquidos e compreendendo um membro de ligação, em que o membro de ligação compreende um primeiro membro de ligação adaptado para separar as moléculas alvo do material concomitante através da captura das moléculas alvo (406) e um segundo membro de ligação adaptado para capturar compostos repórter indicativos da presença e/ou quantidade das moléculas alvo (417);
    (e) uma rede microfluídica interconectando a primeira estrutura e a segunda estrutura;
    (f) uma unidade atuadora adaptada para efetuar um fluxo de fluido entre a primeira estrutura e a segunda estrutura pela compressão do elemento de cobertura flexível contra o substrato, para seletivamente fechar uma parte da rede microfluídica.
  2. 2. Dispositivo (401) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender um substrato (402), em que o substrato (402) tem uma primeira superfície e uma segunda superfície oposta à primeira superfície;
    em que a estrutura é provida sobre e/ou dentro da primeira superfície do substrato;
    compreendendo uma estrutura adicional provida sobre e/ou dentro da segunda superfície do substrato;
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    2 / 10 compreendendo uma estrutura de conexão disposta entre as primeira e segunda superfícies e configurada para prover uma comunicação fluida da estrutura com a estrutura adicional
  3. 3. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de compreender, adicionalmente, um filtro (405), particularmente uma frita, disposto na estrutura e adaptado para evitar que o membro de ligação, particularmente contas, dispostos na estrutura, sejam removidos da estrutura.
  4. 4. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do membro de ligação compreender um ou mais do grupo consistindo de moléculas de captura dispostas sobre uma superfície da estrutura, moléculas de captura dispostas em partículas, moléculas de captura disposta em uma superfície porosa da estrutura e uma ou mais diferentes moléculas de captura dispostas em diferentes locais com respeito a uma superfície da estrutura.
  5. 5. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a estrutura tem um volume em uma faixa de 1 pl a 1 ml, particularmente em uma faixa de 20 pl a 300 pl.
  6. 6. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato do substrato (402) ter uma parte de janela adjacente à estrutura e sendo transparente para radiação eletromagnética em uma faixa de comprimentos de onda de 1 nm a 10 pm, particularmente em uma faixa de comprimentos de onda de 400 nm a 800 nm, para desse modo permitir uma detecção baseada em radiação eletromagnética de um menisco de um líquido fluindo através da estrutura ou da rede microfluídica.
  7. 7. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato do elemento de cobertura (403)
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    3 / 10 ser configurado para ser parcialmente ou totalmente deformável de uma maneira a transportar líquidos ao longo da estrutura ou ao longo da rede microfluídica.
  8. 8. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a estrutura compreende uma ou mais substâncias sendo biológica, bioquímica e/ou quimicamente ativas, em que a uma ou mais substâncias compreende uma ou mais do grupo consistindo em moléculas de captura, marcadores detectáveis e reagentes.
  9. 9. Dispositivo (401) de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais substâncias estão presentes em forma seca, particularmente em forma liofilizada.
  10. 10. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma unidade atuadora, adaptada para ser atuada para deformar o elemento de cobertura para desse modo controlar uma propriedade de fluxo de fluido de líquidos na estrutura e/ou na rede microfluídica.
  11. 11. Dispositivo (401) de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a unidade atuadora compreende uma pluralidade de elementos atuadores (441, 442, 443 e 444), adaptados para serem cooperativamente atuados para deformar o elemento de cobertura (403), para desse modo controlar a propriedade de fluxo de fluido de líquidos, de acordo com um esquema de fluxo de fluido definido pela unidade de controle (471).
  12. 12. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a unidade atuadora compreende um pino configurado para ser alternado e/ou em que a unidade atuadora é adaptada para alternar perpendicularmente a uma superfície principal do substrato, para seletivamente possibilitar ou impossibilitar o fluxo de fluido de líquidos através da estrutura e/ou em que a unidade
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    4 / 10 atuadora é adaptada para alternar perpendicular a uma superfície principal do substrato, para bombear líquidos através da estrutura e/ou em que a unidade atuadora é adaptada para controlar um volume ou uma altura da estrutura e/ou em que a unidade atuadora é adaptada para seletivamente fechar a estrutura.
  13. 13. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma unidade acionadora (437, 438, 439 e 440), adaptada para mecanicamente acionar a unidade atuadora, a unidade acionadora sendo controlável pela unidade de controle (471), e em que a unidade acionadora (437, 438, 439 e 440) compreende um ou mais do grupo consistindo de um mecanismo acionador pneumático, um mecanismo acionador hidráulico e um mecanismo acionador eletromagnético.
  14. 14. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o membro de ligação compreende um meio tridimensional, em que o meio tridimensional é selecionado de um ou mais do grupo consistindo de partículas e uma matriz porosa.
  15. 15. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender um sensor de temperatura adaptado para medir a temperatura de líquidos e/ou compreender uma unidade de manipulação de temperatura adaptada para manipular a temperatura de líquidos.
  16. 16. Dispositivo (401) de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a unidade de manipulação de temperatura é adaptada para manipular uma temperatura de líquidos localizados na estrutura, de acordo com uma sequência de temperatura para realizar uma reação de cadeia de polimerase e/ou em que a unidade de manipulação de temperatura é adaptada para elevar a temperatura de líquidos localizados dentro da estrutura até 95 oC e/ou em que a unidade de manipulação de
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    5 / 10 temperatura compreende um ou mais do grupo consistindo de elemento de aquecimento e um elemento de esfriamento e/ou em que a unidade de manipulação de temperatura compreende um primeiro elemento de aquecimento e um segundo elemento de aquecimento, em que a estrutura é disposta entre o primeiro elemento de aquecimento e o segundo elemento de aquecimento.
  17. 17. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma unidade de detecção (455), particularmente uma unidade de detecção de fluorescência, adaptada para detectar, na estrutura, compostos capturados no membro de ligação.
  18. 18. Dispositivo (401) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma unidade de transporte, adaptada para transportar líquidos através da estrutura e/ou da rede microfluídica, em que a unidade de transporte compreende uma bomba, particularmente uma do grupo consistindo de uma bomba de ar comprimido, uma bomba hidráulica, uma bomba peristáltica e uma bomba a vácuo.
  19. 19. Método, caracterizado pelo fato de compreender (a) prover:
    uma quantidade de um composto repórter;
    um primeiro membro de ligação sendo configurado para ligarse a um grupo âncora de uma molécula de captura;
    um segundo membro de ligação capaz de capturar o composto repórter;
    uma quantidade de um ácido nucleico alvo capaz de formar complexos com o composto repórter, a formação dos complexos com o composto repórter inibindo a captura do composto repórter pelo segundo membro de ligação; e
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    6 / 10 uma quantidade de moléculas de captura, em que cada molécula de captura compreende uma porção de ligação específica para uma região do ácido nucleico alvo e um grupo âncora;
    (b) formar complexos, cada um compreendendo um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura;
    (c) contatar os complexos com o primeiro membro de ligação para ligar um subconjunto ou todos os complexos ao primeiro membro de ligação;
    (d) liberar um subconjunto ou toda a quantidade de ácido nucleico alvo do primeiro membro de ligação;
    (e) formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com um subconjunto ou toda a quantidade de ácido nucleico alvo;
    (f) capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação; e (g) determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de um composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender ainda:
    determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo, com base no valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação e/ou compreender ainda:
    liberar o subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter do segundo membro de ligação, após a etapa de determinar um valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação;
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    7 / 10 formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com um subconjunto ou toda a quantidade de ácido nucleico alvo;
    capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação; e determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação.
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de compreender ainda realizar as etapas de liberar, formar complexos, capturar e determinar um número de vezes adicionais N, em que N é um inteiro maior do que ou igual a 1 ou N > 5 ou N > 10 ou N >
    20.
  22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato da etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com um subconjunto ou toda a quantidade de ácido nucleico alvo e a etapa de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação serem realizadas concomitantemente.
  23. 23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o valor indicativo da presença e/ou quantidade do composto repórter capturado no segundo membro de ligação é determinado antes da formação dos complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com um subconjunto ou toda a quantidade do ácido nucleico alvo e a captura de um subconjunto remanescente da quantidade do composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação estar em equilíbrio químico, e/ou em que o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação é
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    8 / 10 determinado 1 segundo a 120 segundos após iniciarem-se as etapas de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com um subconjunto ou toda a quantidade de ácido nucleico alvo e de captura de um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação.
  24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de um composto repórter compreender um ou mais rótulos detectáveis, em que o um ou mais rótulos detectáveis são rótulos fluorescentes.
  25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que os compostos repórter são oligonucleotídeo s.
  26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 25, caracterizado pelo fato de que o segundo membro de ligação compreende uma ou mais diferentes moléculas de captura específicas de repórter, sendo capazes de capturar um composto repórter no segundo membro de ligação, em que as moléculas de captura específicas de repórter são oligonucleotídeos, e/ou em que as diferentes moléculas de captura específicas de repórter são dispostas em diferentes locais com respeito ao segundo membro de ligação e/ou em que os compostos repórter são capturados no segundo membro de ligação pela formação de complexos com as moléculas de captura específicas de repórter e/ou em que uma parte ou todo um sítio de interação do composto repórter sendo capaz de formar um complexo com um ácido nucleico alvo é também capaz de formar um complexo com uma molécula de captura específica de repórter e/ou em que as moléculas de captura específicas de repórter e do ácido nucleico alvo competem para formar um complexo com o composto repórter.
  27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 26, caracterizado pelo fato de compreender ainda submeter os ácidos
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    9 / 10 nucléicos alvo à ampliação.
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a ampliação compreende uma etapa de anelar moléculas de iniciador em ácidos nucleicos alvo, em que a etapa de anelar é realizada concomitantemente com a etapa de formar complexos de um subconjunto da quantidade de composto repórter com um subconjunto ou toda a quantidade de ácido nucleico e/ou a etapa de capturar um subconjunto remanescente da quantidade de composto repórter não em complexo com um ácido nucleico alvo do segundo membro de ligação.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que a ampliação é uma ampliação cíclica.
  30. 30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a ampliação cíclica é uma PCR e/ou em que a ampliação cíclica compreende 10 ciclos ou 20 ciclos e/ou em que o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação é determinada após um ciclo do ciclo de ampliação e/ou em que o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação é determinada após cada ciclo da ampliação cíclica.
  31. 31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que realizar a PCR compreende utilizar uma polimerase tendo atividade exonuclease.
  32. 32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato do valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo ser determinado cada vez após determinar o valor indicativo da presença e/ou quantidade de composto repórter capturado no segundo membro de ligação e/ou em que o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo é determinado com base em uma curva de calibração correlacionando o valor indicativo da presença e/ou
    Petição 870190101870, de 10/10/2019, pág. 17/19
    10 / 10 quantidade de composto repórter com o valor indicativo da presença e/ou quantidade de ácido nucleico alvo.
  33. 33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo fato de compreender ainda submeter os ácidos nucleicos alvo a transcrição reversa antes de submetê-los a ampliação.
  34. 34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 33, caracterizado pelo fato de ser realizado em um dispositivo (401) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o dispositivo (401) compreende uma primeira estrutura (408) adaptada para acomodar líquidos e em que cada etapa de formar complexos compreende um ácido nucleico alvo e uma molécula de captura, em que cada molécula de captura compreende uma parte de ligação específica para uma região do ácido nucleico alvo e um grupo âncora ser realizado na primeira estrutura (408) e/ou em que o dispositivo compreende uma segunda estrutura (407) adaptada para acomodar líquidos e em que o primeiro membro de ligação (406) é disposto na segunda estrutura (407).
  35. 35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o segundo membro de ligação (417) é provido na segunda estrutura (407).
  36. 36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 35, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de fluido tendo um volume de 1 pl a 50 pl e/ou é uma amostra de sangue integral fluida.
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Free format text: RETIFICA-SE O PARECER DE DEFERIMENTO NOTIFICADO NA RPI 2561 DE 04/02/2020, POR TER SIDO EFETUADO COM INCORRECOES.

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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 14/04/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/11/2007, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO