BRPI0718566A2

BRPI0718566A2 - Peptídeo, análogo do mesmo, composição farmacêutica, usos de um análogo de peptídeo, e de uma molécula de ácido nucléico, de um vetor de expressão, ou de uma célula hospedeira, molécula de ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir o análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (glp-2), e, kit terapêutico.

Info

Publication number: BRPI0718566A2
Application number: BRPI0718566-9A
Authority: BR
Inventors: Bjarne Due Larsen; Yvette Miata Petersen
Original assignee: Zealand Pharma As
Priority date: 2006-11-08
Filing date: 2007-11-08
Publication date: 2014-03-11
Also published as: NZ597554A; MX2009004701A; EP2051995B1; EA023886B1; CN101573376B; US8642727B2; EA200900667A1; US20120004392A1; NZ576260A; HK1136310A1; UA102506C2; CN101573376A; AU2007319066B2; US20140154214A1; IL198127A0; KR20090089308A; EP2051995A1; US10092648B2; KR101527233B1; CA2669806A1

Description

“PEPTÍDEO, ANÁLOGO DO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USOS DE UM ANÁLOGO DE PEPTÍDEO, E DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, DE UM VETOR DE EXPRESSÃO, OU DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR O ANÁLOGO DE PEPTÍDEO-2 TIPO- GLUCAGON (GLP-2) E PARA TRATAR UM DISTÚRBIO, KIT TERAPÊUTICO, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a análogos de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2) seletivo e seu uso médico, por exemplo na profilaxia ou tratamento de distúrbios relacionados ao estômago e aos intestinos e para melhorar os efeitos colaterais gastrintestinais associados da quimioterapia e/ou da terapia de radiação.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O GLP-2 é um peptídeo de 33 aminoácidos derivado do processamento pós-translacional específico do pró-glucagon nas células L enteroendócrinas dos intestinos e nas regiões específicas do tronco cerebral. Ele é secretado simultaneamente junto com o peptídeo-1 tipo-glucagon (GLP- 1), oxintomodulina e glicentina, em resposta à ingestão nutriente.

O GLP-2 induz o crescimento significativo do epitélio mucoso do intestino delgado através do estímulo da proliferação das células tronco nas criptas e na inibição da apoptose sobre a vilosidade (Drucker et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996, 93: 7911-7916). O GLP-2 também tem efeitos de crescimento sobre o cólon. O GLP-2 também inibe o esvaziamento gástrico e a secreção do ácido gástrico (Wojdemann et al. J Clin Endocrinol Metab. 1999, 84: 2513-2517), intensifica a função da barreira intestinal (Benjamin et al. Gut. 2000, 47: 112-119.), estimula o transporte da hexose intestinal através da regulação positiva dos transcarreadores da glicose (Cheeseman, Am J Physiol. 1997, Rl 965-1971) e aumenta o fluxo sanguíneo intestinal (Guan et al. Gastroenterology. 2003, 125, 136-147).

O GLP-2 se liga a um único receptor acoplado à proteína G pertencente à classe II da família da secretina de glucagon. O receptor de 5 GLP-2 é expresso no intestino delgado, no cólon e no estômago, sítios que são conhecidos como sendo responsivos ao GLP-2 (Yusta et al. Gastroenterology. 2000, 119: 744-755). Entretanto, a célula alvo para estimulação do receptor de GLP-2 no trato gastrintestinal permanece obscura e os mediadores intracelulares de jusante acoplados ao receptor de GLP-2 são 10 deficientemente entendidos.

Os efeitos específicos e benéficos demonstrados do GLP-2 no intestino delgado têm levantado muito interesse quanto ao uso do GLP-2 no tratamento da doença ou lesão intestinais (Sinclair e Drucker, Physiology 2005: 357-365). Além disso, o GLP-2 tem sido apresentado para prevenir ou 15 reduzir o dano epitelial mucoso em um amplo número de modelos pré- clínicos de lesão intestinal, incluindo a enterite induzida pela quimioterapia, a lesão de reperfusão de isquemia, a colite induzida pelo sulfato de dextrano e modelos genéticos da doença inflamatória intestinal (Sinclair e Drucker Physiology 2005: 357-365).

Além disso, a expressão do mRNA de GLP-2R no estômago

(Yusta et al., 2000) junto com a observação de que o GLP-2 reduz a motilidade gástrica e a secreção ácida gástrica (Meler et al., 2006) provêm ampla evidência de que o estômago é, ou direta ou indiretamente, responsivo ao GLP-2. Não obstante, o uso do GLP-2 ou dos análogos do GLP-2 nas 25 condições caracterizadas pelo dano ao revestimento gástrico não foi ainda explorado.

O GLP-2 é secretado como um peptídeo de 33 aminoácidos com a seguinte seqüência H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met- Asn-Thr-Ile-Leu- Asp- Asn-Leu-Ala- Ala- Arg- Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile- Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH. Ele é rapidamente clivado à Alanina (A) na posição 2 do término de NH2 ao GLP-2 humano inativo (3 a 33) pela enzima DPP IV. Esta rápida degradação enzimática do GLP-2(1 a 33), além da depuração renal, resulta em uma meia-vida de cerca de 7 minutos para o 5 peptídeo (Tavares et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278: E134-E139, 2000).

Na U.S. 5.994.500 (Drucker et al.) são descritos antagonistas do GLP-2 e seus efeitos sobre o crescimento do tecido gastrintestinal. Sugere- se que os antagonistas sejam formulados como produtos farmacêuticos a 10 serem usados no tratamento da hiperplasia ou para induzir a hipoplasia. Na U.S. 5.994.500, a estrutura do GLP-2 de mamífero foi alterada por mutações, tais como substituições e deleções.

As U.S. 6.184.208, U.S. 5.789.379 e U.S. 6.184.201 apresentam análogos de GLP-2 e seus usos médicos. Estes análogos são todos obtidos por substituições e/ou deleções do GLP-2 humano.

DaCambra et al. (Biochemistry 2000, 39, 8888-8894) descreve os determinantes estruturais para a atividade do GLP-2. Exemplos de tais determinantes são Phe6 e Thr5, os quais são referidos como cruciais para a ligação e a ativação do receptor de GLP-2.

Na WO 97/39031, o análogo de GLP-2, [Gly2]GLP-2, é

apresentado. Aqui, a alanina na posição 2 foi substituída por glicina para tomar o peptídeo resistente à clivagem de DPP IV. A substituição da alanina demonstra aumentar a estabilidade e a potência do peptídeo. O pedido de patente descreve como o análogo do GLP-2 pode ser usado contra doenças 25 associadas com a inflamação e a destruição da mucosa epitelial intestinal. Estas incluem a ressecção massiva do intestino delgado, a doença inflamatória intestinal, a enterite induzida pela quimioterapia e/ou pela radiação, e a lesão isquêmica.

A WO 02/066511 descreve análogos de GLP-2 tendo uma meia-vida prolongada in vivo, e seu uso como drogas no tratamento dos distúrbios gastrintestinais, tais como as doenças inflamatórias intestinais.

A WO 01/41779 descreve o uso de h[Gly2]GLP-2 como um pré-tratamento para inibir a apoptose induzida pela quimioterapia e promover a sobrevivência das células epiteliais do intestino delgado.

Todas as referências aqui citadas são expressamente incorporadas como referência em sua totalidade.

O uso do GLP-2 ou dos análogos do GLP-2 no tratamento de várias doenças tem sido proposto por muitos cientistas. Entretanto, existe ainda a necessidade de análogos de GLP-2 melhorados e seletivos do intestino delgado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Amplamente, a presente invenção diz respeito a análogos de GLP-2 que compreendem uma ou mais substituições em comparação com o 15 GLP-2 do tipo selvagem, e que podem ter a propriedade de um intestino delgado aumentado versus seletividade do cólon, uma atividade biológica in vivo melhorada e/ou estabilidade química melhorada, por exemplo como avaliado nos ensaios de estabilidade in vitro. Mais particularmente, os análogos do GLP-2 preferidos da presente invenção compreendem 20 substituições não conservativas em uma ou mais das posições 8, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 20, 21, 24 e/ou 28 da seqüência de GLP-2 do tipo selvagem, opcionalmente em combinação com outras substituições conservativas ou não conservativas na posição 2 (como mencionado na introdução) e uma ou mais das posições 3, 5, 7 e 10, e/ou uma substituição ou deleção de um ou mais 25 aminoácidos correspondentes às posições 31 a 33 da seqüência de GLP-2 do tipo selvagem e, opcionalmente, a adição de uma seqüência de peptídeos estabilizadoras N-terminal ou C-terminal. Além disso, os análogos de GLP-2 da invenção podem compreender substituições conservativas de um ou mais aminoácidos correspondentes às posições 9, 14 e 15. Assim como fornecendo análogos de GLP-2 que podem ter estabilidade química e/ou atividade biológica melhoradas, a presente invenção também diz respeito ao fornecimento de compostos que têm crescimento intestinal preferencial promovendo atividade no intestino delgado em comparação com o cólon e vice-versa, em particular pela inclusão de modificação em uma ou mais posições Asnl 1 e/ou Asnl6 e/ou Arg20 e/ou Asn24 e/ou Gln 28 do GLP-2 do tipo selvagem.

Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece um análogo de GLP-2 que é representado pela Fórmula geral I:

R1-Z1 -His-X2-X3 -Gly-X5 -X6-X7-X8-X9-XIO-X11-X12-X13 - X14-X15 -X16-X17-X18-X19-X20-X21 -Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X2 8-Thr- Lys-X31-X32-X33-Z2-R2

em que:

R1 é hidrogênio, alquila Cm (por exemplo metila), acetila, formila, benzoila ou trifluoroacetila;

X2 é Gly, Ala ou Sar;

X3 é Glu ou Asp;

X5 é Ser ou Thr;

X6 é Phe ou Pro ou uma substituição conservativa;

X7 é Ser ou Thr;

X8 é Asp ou Ser ou uma substituição conservativa;

X9 é Glu ou Asp ou uma substituição conservativa;

XlO é Met, Leu, Nle ou um aminoácido de substituição de Met oxidativamente estável;

Xll é Yl;

Xl2 é Thr ou Lys ou uma substituição conservativa;

Xl3 é He, Glu ou Gln ou uma substituição conservativa;

Xl4 é Leu, Met ou Nle ou uma substituição conservativa;

Xl 5 é Asp ou Glu ou uma substituição conservativa; Χ16 é Y2;

Xl7 é Leu ou Glu ou uma substituição conservativa;

Xl8 é Ala ou Aib ou uma substituição não conservativa;

Xl9 é Ala ou Thr ou uma substituição conservativa;

X20 é Y3;

X21 é Asp ou Ile ou uma substituição conservativa;

X24 é Y4;

X28 é Y5;

X31 é Pro, Ile ou deletado;

X32 é Thr ou deletado;

X33 é Asp, Asn ou deletado;

R2 é NH2 ou OH;

em que

Z1 e Z2 são independentemente ausentes ou uma seqüência de 15 peptídeos de 1 a 10 unidades de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met Om; e o perfil de hidrofaticidade (HPP) dos resíduos XlI, Xl6, X20, X24, X28 de fórmula I calculados como HPP = Σ hpixn + hpixi6 + Iipix2O + hpiX24 + hpiX28 é > -10 20 em que

Yi, Y2, Y4 e Y5 podem individualmente ser selecionados do grupo consistindo de Asn, Asp, Glu, Gin, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Vai, Met ou Phe; e

Y3 pode ser selecionado do grupo consistindo de Asn, Asp, Glu, Gin, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Vai, Met ou Phe;

com a condição de que, quando X20 seja Arg, então Xll será Ser, Xl6 será Ala, X24 será Ala, X28 será Ala e Z2 será Lys, ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis.

Em uma forma de realização, a invenção compreende um análogo de peptídeo 2 tipo-glucagon (GLP-2) como descrito acima, em que HPP é > -4.

Em uma outra forma de realização, a invenção compreende um análogo de peptídeo 2 tipo-glucagon (GLP-2) como descrito acima, em que HPP é > 0.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um análogo de GLP-2 que é representado pela Fórmula geral II:

R1-Z1-His-X2-X3 -Gly-X5 -X6-X7-X8-X9-XI O-Xl I-X12-X13- X14-X15 -X16-X17-Ala-X 19-X20-X21 -Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X2 8-Thr- Ly s-X31-X3 2-X3 3 -Z2-R2

em que:

R1 é hidrogênio, alquila Ci_4 (por exemplo metila), acetila, formila, benzoila ou trifluoroacetila;

X2 é Gly, Ala ou Sar X3 é Glu ou Asp

X5 é Ser ou Thr X6 é Phe ou Pro X7 é Ser ou Thr X8 é Asp ou Ser X9 é Glu ou Asp

Xl 1 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou

Val

X12éThrouLys

Xl3 é Ile, Glu ou Gln Xl4 é Leu, Met ou Nle Xl5 é Asp ou Glu

Xl6 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou Val

Xl 7 é Leu ou Glu Xl 8 é Ala ou Aib X19 é Ala ou Thr

X20 é Asn, Arg, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe Ser, Thr ou

Val

X21 é Asp ou Ile

X24 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou

Val

X28 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou

Val

X31 é Pro, Ile ou deletado X32 é Thr ou deletado X33 é Asp, Asn ou deletado R2 é NH2 ou OH;

Z1 e Z2 são independentemente ausentes ou uma seqüência de peptídeos de 1 a 10 unidades de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met e Om;

ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis

com a condição de que, quando X20 seja Arg, então Xll será Ser, Xl6 será Ala, X24 será Ala, X28 será Ala e Z2 será Lys.

Em uma forma de realização, a invenção compreende um análogo de GLP-2 como descrito acima, em que Xl 1 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val

Xl6 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val X20 é Ala, Gly, He, Leu, Phe Ser, Thr ou Val X24 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val X28 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val Em outra forma de realização, a invenção compreende um análogo de GLP-2 como descrito acima, em que Xl 1 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val Xl6 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val 5 X20 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val

X24 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val X28 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val

Em ainda outra forma de realização, a invenção compreende um análogo do GLP-2 como descrito acima, em que o análogo do GLP-2 tem pelo menos 60 % de identidade de seqüência de aminoácidos para o GLP-2 do tipo selvagem (1 a 33) e tem a atividade biológica de causar um aumento na massa intestinal in vivo.

Em uma outra forma de realização, a invenção compreende um análogo de GLP-2 com mais do que uma das substituições (isto é, mais do 15 que a substituição relativa à seqüência do tipo selvagem dada acima) nas posições XlI, Xl6, X20, X24 e/ou X28 e/ou uma ou mais das referidas substituições em combinação com uma ou mais substituições nas posições X3,X5,X7 e/ou Xl0.

Em ainda outra forma de realização, a invenção compreende 20 um análogo de GLP-2com substituições na posição XlO em Leu, Nle ou um aminoácido de substituição de Met oxidativamente estável, tal como Met(O) ou Met(O)2. Assim, adicional ou alternativamente às substituições já mencionadas, o análogo de GLP-2 pode ter Leu, Nle, ou um aminoácido de substituição de Met oxidativamente estável, tal como Met(O) ou Met(O)2 na 25 posição X10.

Em algumas formas de realização da presente invenção, o análogo de GLP-2 tem pelo menos 60 % de identidade de seqüência de aminoácidos para o GLP-2 do tipo selvagem (1 a 33) tendo a seqüência apresentada nos fundamentos do pedido, mais preferivelmente pelo menos 63 % de identidade de seqüência, mais preferível pelo menos 66 % de identidade de seqüência, e ainda mais preferível pelo menos 69 % de identidade de seqüência.

“Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos” com respeito a seqüências de polipeptídeos de GLP-2 é definido como o percentual de resíduos de aminoácido em uma seqüência candidata, que são idênticos aos resíduos de aminoácido na seqüência de GLP-2 do tipo selvagem, após o alinhamento das seqüências e a introdução dos intervalos, se necessário, para se obter o percentual máximo de identidade de seqüência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüência. O alinhamento das seqüências pode ser realizado pela pessoa versada com o uso de técnicas bem conhecidas na prática, por exemplo com o uso de programa publicamente disponível tal como o BLAST, BLAST2 ou programa de Alinhamento. Ver:

Altschul et al. (Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/RE ADME.html) ou Pearson et al. (Genomics, 46, 24, 36, 1997) e

http://molbiol.soton.ac.uk/compute/align.html para o programa

Align.

Os percentuais das identidades de seqüência aqui usadas e de acordo com a presente invenção, são determinados com o uso destes programas com seus parâmetros básicos. Mais geralmente, a pessoa habilitada pode facilmente determinar parâmetros apropriados para determinar 25 alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se obter o alinhamento máximo através do comprimento completo das seqüências que estejam sendo comparadas.

Em outra forma de realização da presente invenção, o análogo de GLP-2 como descrito acima compreende mais do que uma das substituições (isto é, mais do que uma substituição em relação à seqüência do tipo selvagem dada acima) nas posições X3, X5, X7, Xl 1, X16, X20, X24, X28, X31, X32 e/ou X33.

Em ainda outra forma de realização da presente invenção, o 5 análogo de GLP-2 como descrito acima compreende uma ou mais substituições selecionadas de Xll, Xl6, X20, X24, X28 isto é Ile, Ala, Leu, Phe ou Vai; e os resíduos de aminoácidos nas posições X31, X32 e X33 são opcionalmente deletados; ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis.

Em ainda outra forma de realização da presente invenção, o

análogo de GLP-2 como descrito acima compreende uma substituição (isto é, uma substituição relativa à seqüência do tipo selvagem dada acima) em uma ou mais das posições Xl 1, X16, X20, X24 e/ou X28.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o análogo de GLP-2 como descrito acima é apresentado na Tabela 1 ou na Tabela 2 deste relatório, ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o análogo de GLP-2 é definido pela fórmula geral III:

Rl-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-X11-Thr-Ile-

Leu-Xl 5-X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr- Lys-Ile-Thr-Asp-NH2;

em que

R1 é hidrogênio, alquila Cm (Por exemplo metila), acetila, formila, benzoila ou trifluoroacetila

X8 é Asp ou Ser, preferivelmente Asp;

Xl 1 é Ser, Ala, Glu, Lys ou Asn;

Xl5 é Glu ou Asp, preferivelmente Glu;

Xl6 é Ser, Ala ou Glu; Χ20 é Ser, Ala ou Glu;

X24 é Ser, Ala ou Glu; e

X28 é Ser, Ala, Gln ou Glu;

ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis dos

mesmos.

Compostos interessantes da invenção (fórmula I) são descritos na seguinte tabela, em que referidos compostos podem ser modificados no término N como descrito quanto a Rl na fórmula III e incluindo um sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

ZP2263 His-Gly-Giu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ser-ThMIe-Leu-GIu-Ser-Leu-AIa- Aia-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-I Ie-Thr-Asp-N Hj ZP2264 His-Gly-Glu-Gily-Ser-Rhe-Ser-Mp-Giu-Leii-AJa-Thr-Ue-Ley-GIu-Ate-Leu-AIa' Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Tip-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-IIe-Thr-Asp-NH2 ZP226Ô Hte-Gly-Glu-Gíy-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Gtu-Thr-iie-Leu-G Iu-Glu-Leu-Ata- Ala-Glu-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ite-GIu-Thr-Lys-IIe-Thr-Asp-NH2 ZP2267 His^Gly^3Iu-G Iy-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ser-Thr-Iie-Le u-Glu-Ser-Leu-Ala- AJa-AIa-Asp-Phe-He-Afa-T rp-Leu-lie-Aia~Thr~Lys4ie-Th P-Asp-NH2 ZP226B Hfe^iy-®u^iiy*Ser-Phe-Ser-Mp-Glu-Leu-Ala-Thr4feHLeu-GÍui-Ata-L«J-Ala' Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Iie-Ser-Thr-Lys-IIe-Thr-Asp-NHz ZPTim Hfs-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Lys-Thr-Ile-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala- Ala-Ala-Asp-Phe-ile-Glu-Tfp-Leu-lié-GIn-Thr-Lys-i Ie-Thr-Asp-NHi ZP2270 Hts-Gíy^3lu^3fy-Ser-Phe-Ser-A5p-Glu-LeuN-fhr-Í!fr-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala-A!a- Ser-Asp-Phe-Ife-Ser-Trp-Leu-IIe-Ser-Thr-Lys-He-Thr-Asp-NH2 ZP2272 His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ite-Leu-Glu-Ser-Leu-Ala- Ala-Ala-Asp-Phe-Ite-Ser-T rp-Leu-l Ie-Aia-Thr-Lys-I Íe-Thr-As p-N H2 ZP2242 H^Gív^^u-Gly-Se^Phe-èer-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-lle-Leu-Asp-Aia-Leu-Aiá- Ala-Afg-Asp-Phe-Ile-AJa-Trp-Leu-IIeTAla-Thr-Lys-I Ie-Thr-Asp-Lys-OH Outros compostos da invenção são apresentados na Tabela 1

abaixo.

A presente invenção fornece compostos que têm atividade promotora do crescimento preferencial no intestino delgado em comparação com o cólon. Em particular, as experiências aqui descritas 15 mostram que certas substituições nas posições Xll e/ou X16 e/ou Asn20 e/ou X24 e/ou X28 do GLP-2 do tipo selvagem fornecem um aumento preferencial do peso do intestino delgado quando administradas para testar animais em comparação com o aumento na massa do cólon. Estas descobertas significam que os compostos exemplificados podem ser úteis para tratar de condições em que seja vantajoso ter um efeito de promoção do crescimento aumentado no intestino pequeno, enquanto se tenha um 5 efeito inferior sobre o cólon ou em condições em que o intestino delgado seja danificado e o cólon, intacto.

Assim sendo, os compostos que são preferidos por causarem o crescimento do intestino delgado tipicamente compreendem uma ou mais substituições (isto é, relativamente à seqüência do tipo selvagem dada acima) 10 nas posições 11, 16, 20, 24 e/ou X28 do GLP-2 do tipo selvagem. Tais compostos podem seletivamente causar o crescimento do intestino delgado ao invés do cólon. Eles podem, portanto, ser usados para condições que afetem ou sejam relacionadas ao intestino delgado.

Preferivelmente, tais compostos deletivos em relação ao 15 intestino delgado compreendem substituições (isto é, relativas à seqüência do tipo selvagem dada acima) em mais do que uma das posições Xl I, X16, X20, X24 e/ou X28. Assim, os compostos seletivos quanto ao intestino delgado podem compreender mais do que uma das substituições em que Xll seja Ser, X16 seja Ala, X20, X24 seja Ala, X28 seja Ala, X31 seja Ile, X32 seja Thr e 20 X33 seja Asp. Os resíduos de aminoácidos nas posições X31, X32 e X33 podem opcionalmente ser deletados.

Nos compostos deletivos quanto ao intestino delgado, cada um dentre Xl I, Xl6, X20, X24 e X28 pode independentemente ser Ala, Ser, Gly ou Thr.

Por exemplo, cada um de Xl I e Xl6 pode independentemente

ser Ala ou Ser, e X20, X24 e X28 podem independentemente ser Ala, Ser, Gly ou Thr.

Por exemplo, Xl I e Xl6 podem ser, ambos, Ala, e X20, X24 e X28 podem ser, independentemente, Ala, Ser, Gly ou Thr. Por exemplo, Xll e X16 podem ser, ambos, Ala e X20, X24 e X28, podendo todos independentemente ser Ala ou Ser.

Observar-se-á que outras combinações de resíduos que se situem fora destes critérios gerais podem também fornecer seletividade do intestino delgado.

Combinações preferidas dos resíduos nas posições XlI, Xl6, X20, X24 e X28 incluem

Ser/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Ala/Ala/Ser, Ser/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ala/Ser/Ala;

Ala/Ala/Ser/Ala/Ala; Ser/Ala/Ala/Ala/Ala; Ser/Ala/Arg/Ala/Ala; Ala/Ser/Ala/Ser/Ala;Ala/Ala/Ala/Ala/Ala.

Compostos exemplificados que de preferência estimulam o crescimento epitelial no intestino delgado, incluem ZP2264, ZP2268, ZP2242, ZP2272, ZP2411, ZP2380, ZP2384, ZP2398, ZP2417, ZP2423, ZP2385, ZP2399, ZP2418, ZP2381, ZP2420 e ZP2397.

A invenção também se estende aos compostos tendo atividade de promoção do crescimento preferencial no estômago, em comparação com o cólon. Eles podem, portanto, ser usados para condições que afetem ou se relacionem com o estômago.

Preferivelmente, tais compostos seletivos em relação ao

estômago compreendem substituições (isto é, em relação à seqüência do tipo selvagem dada acima) em mais do que uma das posições Xl I, X16, X20, X24 e/ou X28. Os resíduos de aminoácidos nas posições X31, X32 e X33 podem opcionalmente ser deletados.

Por exemplo, nos compostos seletivos ao estômato,

Xll pode ser Leu, Phe ou Lys.

Xl6 pode ser Leu, Phe ou Lys.

X20 pode ser Ala ou Ser.

X24 pode ser Ala, Ser ou Lys. Χ28 pode ser Ala, Ser ou Lys.

Por exemplo, Xll e Xl6 podem, independentemente, ser Leu ou Phe, X24 e X28 podem, independentemente, ser Lys ou Ser, e X20 pode ser Ser.

Por exemplo, Xll e Xl6 podem, independentemente, ser Leu ou Phe, X20, X24 e X28 podem ser Ser.

Observar-se-á que outras combinações de resíduos que se situem fora destes critérios gerais podem também fornecer seletividade estomacal.

Combinações preferidas de resíduos nas posições Xl I, Xl6, X20, X24 e X28 incluem Lys/Lys/Lys/Lys/Lys; Phe/Phe/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ala/Ala/Ala; e Leu/Leu/Ser/Ser/Ser.

Exemplos de compostos que preferivelmente estimulem o crescimento epitelial no estômago incluem ZP2400, ZP2412, ZP2396, ZP2395, ZP2394 e ZP2401.

Preferivelmente, o análogo de GLP-2 mantém uma pureza observada de pelo menos 70 % em relação à pureza inicial em pelo menos um dos testes de degradação descritos no Exemplo 7 abaixo. Adicional ou alternativamente, ele pode manter uma pureza observada de pelo menos 60 % em relação à pureza inicial em uma solução de HCl 0,1 M após 12 dias. Adicional ou alternativamente, ele pode manter uma pureza observada de pelo menos 70 % em relação à pureza inicial em uma solução de NH4HCO3 0,1 M após 6 dias.

Outro aspecto da presente invenção diz respeito aos análogos de GLP-2 como descrito acima, tendo pelo menos uma EC50 de 1 nM, e assim são definidos como agonistas de GLP-2. Os presentes compostos foram analisados como descrito no Exemplo 9. Na Figura 5, a EC50 de ZP2264 é mostrada como um exemplo de um agonista de GLP-2.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição compreendendo um análogo de GLP-2 como aqui definido, ou um seu sal ou derivado, em mistura com um carreador. Nas formas de realização preferidas, a composição é uma composição farmaceuticamente aceitável e o carreador é um carreador farmaceuticamente aceitável. O 5 análogo de peptídeo de GLP-2 pode ser um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável do análogo de GLP-2.

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito ao uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)como aqui definido, como uma composição farmacêutica que seja formulada como um líquido adequado para administração por injeção ou por infusão, ou que seja formulada para causar liberação lenta do referido análogo de GLP-2.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um análogo de GLP-2 como definido neste relatório, ou um sal deste, para uso em terapia.

A presente invenção ainda fornece o uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)como descrito acima, para a preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção de um distúrbio relacionado ao estômago ou ao intestino.

Em uma forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito ao uso de um análogo de GLP-2, ou a um seu sal ou derivado, para a 20 preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção de distúrbios relacionados ao estômato ou ao intestino, tais como o tratamento de recém- nascidos com a função intestinal comprometida, osteoporose e condições mediadas pela DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV). Como exemplo, os distúrbios relacionados ao estômago e aos intestinos incluem úlceras, a síndrome de 25 Zollinger-Ellison, gastrite, distúrbios da digestão, síndromes de má absorção, síndrome de intestino curto, síndrome do beco-sem-saída, doença inflamatória intestinal (doença de Crohns e colite ulcerativa), espru celíaco (por exemplo, surgindo da enteropatia induzida pelo glúten ou doença celíaca), espru tropical, espru hipogamaglobulinêmico, enterite, síndrome do intestino irritável associada com diarréia, dano do intestino delgado e síndrome de intestino curto.

Em outra forma de realização preferida, a presente invenção diz respeito ao uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)como descrito acima, em que o referido distúrbio relacionado ao estômago e ao intestino é a enterite de radiação, a enterite infecciosa ou pós-infecciosa, ou o dano do intestino delgado devido a agentes quimioterápicos tóxicos ou outros.

A presente invenção ainda proporciona o uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)como aqui definido, para a preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção de um efeito colateral do tratamento de quimioterapia ou de radiação.

O referido efeito colateral da quimioterapia e/ou da radiação é a diarréia, a câimbra abdominal, o vômito ou o dano estrutural e funcional do epitélio intestinal resultante do tratamento de quimioterapia.

A presente invenção ainda proporciona o uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)como definido neste relatório, para a preparação de uma droga para o tratamento de recém-nascidos, osteoporose ou condições mediadas pela DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV).

A invenção também fornece um kit terapêutico contendo uma droga de quimioterapia do câncer e um análogo de GLP-2 da presente invenção, cada um opcionalmente em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável. Os dois agentes terapêuticos podem ser embalados separadamente (por exemplo, em frascos separados) para administração separada, ou podem ser fornecidos na mesma composição. Assim, a invenção ainda fornece uma composição farmacêutica contendo uma droga de quimioterapia do câncer e um análogo de GLP-2 da presente invenção, em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

Para pacientes que tenham neoplasia mucosa gastrintestinal, ou um risco aumentado de neoplasia mucosa gastrintestinal, pode ser desejável selecionar uip compostos de modo a reduzir ou abrogar o risco de efeitos colaterais reduzidos tais como o estímulo ou agravamento da neoplasia mucosa gastrintestinal. Por exemplo, quando da seleção de um composto para 5 tratar de um paciente com neoplasia do cólon (quer benigna ou maligna), ou em risco de desenvolver a neoplasia do cólon, pode ser mais apropriado selecionar um composto que seja seletivo quanto ao intestino delgado sobre o cólon do que um composto não seletivo ou um composto que seja seletivo quanto ao cólon sobre o intestino delgado.

Em outros aspectos, a presente invenção fornece o uso dos

análogo de GLP-2 para a preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção da desnutrição, por exemplo condições tais como a caquexia e a anorexia da síndrome debilitante.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico codificando um análogo de GLP-2 como aqui definido.

Em outros aspectos, a presente invenção fornece um vetor de expressão compreendendo a seqüência de ácido nucléico acima, opcionalmente em combinação com seqüência para dirigir sua expressão, e 20 células hospedeiras transformadas com os vetores de expressão. Preferivelmente as células hospedeiras são capazes de expressar e secretar o análogo de GLP-2. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir o análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2), o método compreendendo cultivar as células hospedeiras sob condições 25 adequadas para expressar o análogo de GLP-2 e purificar o análogo de GLP-2 assim produzido.

A invenção ainda fornece um ácido nucléico da invenção, um vetor de expressão da invenção, ou uma célula hospedeira capaz de expressar e secretar um análogo de GLP-2 da invenção, para uso em terapia. Será entendido que o ácido nucléico, o vetor de expressão e as células hospedeiras podem ser usados para o tratamento de qualquer dos distúrbios aqui descritos que possam ser tratados com os próprios análogos de GLP-2. As referências a uma composição terapêutica contendo um análogo de GLP-2 da invenção, ou 5 a administração de um análogo de GLP-2 da invenção, devem, portanto, ser interpretadas de modo a incluir a administração de um ácido nucléico, vetor de expressão ou célula hospedeira da invenção, exceto quando o contexto o requeira de outra forma.

Em uma forma de realização, a presente invenção diz respeito 10 ao uso de uma molécula de ácido nucléico, um vetor de expressão, ou uma célula hospedeira como aqui definidos, na preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção de um distúrbio relacionado ao estômato e ao intestino, ou para o tratamento e/ou prevenção de um efeito colateral do tratamento de quimioterapia ou de radiação, ou para o tratamento de recém- 15 nascidos, osteoporose ou condições mediadas pela DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV).

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de um distúrbio relacionado ao estômago e aos intestinos, em um paciente em necessidade deste tratamento, mediante administração de uma 20 quantidade eficaz de um ácido nucléico, vetor de expressão ou célula hospedeira da invenção. Exemplos de distúrbios relacionados ao estômago ou aos intestinos são fornecidos acima.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir um efeito colateral da quimioterapia ou da terapia de radiação em um paciente em necessidade destas, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um ácido nucléico, vetor de expressão ou célula hospedeira da invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento ou de prevenção da desnutrição, por exemplo condições tais como a caquexia e a anorexia da síndrome debilitante, em um paciente em sua necessidade, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um ácido nucléico, um vetor de expressão ou uma célula hospedeira da invenção.

As formas de realização da presente invenção serão agora

descritas em mais detalhes por meio de exemplo, e não de limitação, com referência às figuras que acompanham este relatório descritivo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Mudança na massa do intestino delgado relativa, versus controles de veículos em seguida à administração do composto de referência [Gly2]GLP-2 e os compostos ZP2264, ZP2266 a ZP2268 (800 nmol/kg, uma vez por dia por 3 dias). A massa do intestino delgado relativa é mostrada como 100 % nos animais veículos.

*: P < 0,05, vs. veículo, $: P < 0,05 vs. tratados por

[Gly 2] GLP-2

Figura 2. Mudança na massa do intestino delgado relativa, versus controles de veículos em seguida à administração do composto de referência [Gly2]GLP-2 e os compostos ZP2264, ZP2269 e ZP2272 e (800 nmol/kg, uma vez por dia durante 3 dias). A massa do intestino delgado relativa é mostrada como 100 % nos animais veículos.

*: P < 0,05, vs. veículo, $: P < 0,05 vs. tratados por

[Gly 2] GLP-2

Figura 3. Mudança na relação da massa do intestino delgado/cólon versus animais tratados com [Gly2] GLP-2 em seguida à administração dos compostos ZP2264, ZP2266 a ZP2268 (800 nmol/kg, uma vez por dia por 3 dias). A massa do intestino delgado (SI) relativa é mostrada como 100 % nos animais veículos.

*: P < 0,05, vs. tratados por [Gly2]GLP-2

Figura 4. Mudança na relação da massa do intestino delgado, versus os animais tratados com [Gly2]GLP-2 em seguida à administração dos compostos ZP2242, ZP2269, ZP-2272 e ZP-2271 (800 nmol/kg, uma vez por dia durante 3 dias). A massa do intestino delgado (SI) relativa é mostrada como 100 % nos animais tratados com [Gly2]GLP-2.

Figura 5. Triagem in vitro do ZP2264 quanto ao agonismo no receptor de GLP-2 recombinantemente expresso em células BHK-2. A IC50 do ZP2264 foi de 3,55E-12, bem dentro da faixa definida para os agonistas.

Figura 6. índice da sensibilidade do intestino delgado/cólon dos compostos ZP seletivos para o intestino delgado.

Figura 7. índice da sensibilidade do estômago/cólon dos compostos ZP seletivos para o estômago.

Figura 8. índice da sensibilidade do intestino delgado/cólon dos compostos ZP não seletivos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A menos que de outra forma especificado, as seguintes definições são fornecidas quanto a termos específicos, os quais são usados na descrição escrita acima.

Em todo o relatório descritivo e nas reivindicações, os códigos convencionais de uma letra e de três letras para os aminoácidos naturais são usados, assim como os códigos de três letras geralmente aceitos para outros α-aminoácidos, tais como a sarcosina (Sar), a norleucina (Nle) e o ácido α-aminoisobutírico (Aib). Todos os resíduos de aminoácidos nos peptídeos da invenção são preferivelmente do configuração L. Entretanto, os aminoácidos da configuração D também podem estar presentes.

Como aqui usado, “substituição conservativa” significa que um resíduo de aminoácido pertencente a uma certa posição da seqüência de peptídeos de GLP-2 humano nativo foram trocados por um resíduo de aminoácido pertencente ao mesmo grupo (I, II, III, IV, V, 1, 2, 3) como definido na seguinte tabela:

I II III IV V A N H M F S D R L Y T E K I W P Q V G C 1 2 3 A G H V S R L T K I C D P Y E F N W Q M Uma substituição “não conservativa” como aqui usada significa qualquer outra substituição por um aminoácido não protéico (Sar, Nle, Aib) ou substituição por um aminoácido que não pertença ao mesmo grupo.

Para descrever o perfil hidrofático resultante de um lado de uma hélice a, escolhemos os índices de hidropatia (hpix) para os aminoácidos individuais descritos por Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. (1982) 157, 105-132. Na presente invenção a hélice de interesse é delineada pelas posições de aminoácidos Xl 1-X16-X20-X24-X28.

O índice de hidropatia (HPI) dos aminoácidos individuais é descrito com o uso do índice de hidropatia HPI introduzido e definido por Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. (1982) 157, 105-132. Os valores do HPI para os aminoácidos individuais são Aminoácido índice de hpi

I 4,5 V 4,2 L 3,8 F 2,8 C 2,5 M 1,9 10

A 1,8 G 0,4 T 0,7 W 0,9 S 0,8 Y 1,3 P 1,6 H 3,2 E 3,5 Q 3,5 D 3,5 N 3,5 K 3,9 R 4,5 O perfil de hidrofaticidade (HPP) resultante dos resíduos Xl 1,

Xl6, X20, X24, X28 de fórmula I, calculado como HPP = Σ hpixn + hpixi6 + Iipix20 + Iipix24 + Iipix28

HPP >-10 HPP >-4

HPP > 0

Yi, Y2, Y4 e Y5 podem individualmente ser selecionados do grupo: Asn, Asp, Glu, Gin, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Vai, Met ou Phe.

Y3 pode ser selecionado do grupo: Asn, Asp, Glu, Gin, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Vai, Met ou Phe.

Para um composto seletivo do intestino delgado, dentro dos critérios globais de que HPP > -10, -4 ou 0, pode ser desejável que HPI para as posições 11 e 16 devem independentemente ser -0,8 < HPI < 3,8, por exemplo -0,8 < HPI < 2,8, tal como HPI - 1,8. Quanto às posições 20, 24 e 28, pode ser desejável que o HPI deve ser independentemente -0,8 < HPI20,24,28 ^ 1,8, por exemplo -0,8 < HP!20,24,28 — 1·^» tal como HP 120,24,28 = -0,8.

Assim, os resíduos em cada uma das posições Xn, Xi6, X20, X24 e X2S podem ser independentemente Ala, Ser, Gly ou Thr.

Por exemplo, cada um de Xn e Xi6 pode independentemente ser Ala ou Ser, e X20, X24 e X28 podem ser Ala, Ser, Gly ou Thr.

Por exemplo Xn e Xi6 podem ser Ala, e X20, X24 e X28 podem ser Ala, Ser, Gly ou Thr.

Combinações preferidas nas posições Xn, Xi6, X20, X24 e X28

podem incluir Ala/Ala/Ala/Ser/Ser, Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Thr/Ser/Ser e Ala/Ala/Gly/Ser/Ser.

Para um composto seletivo ao estômago, dentro dos critérios globais de que HPP > -10, -4 ou 0, pode ser desejável que HPI para as

posições 11 e 16 deva independentemente ser de -3,9 < HPIiij6 < 3,8. Por exemplo ΗΡΙη,ΐό pode ser 2,8 < HPIii i6 < 3,8, ou HPIiij6 pode ser -3,9.

Para as posições 20, 24 e 28, pode ser desejável que HPI deva independentemente ser de -3.9 < HPl2o,24,28 ^ 1,8. Por exemplo, HPI20,24,28 pode ser -0,8 < HPI20)24;28 < 1,8, ou HPI20j24,28 pode ser -3,9.

Assim, o resíduo na posição Xll pode ser Leu, Phe ou Lys.

O resíduo na posição Xl6 pode ser Leu, Ser, Phe, Lys ou Thr.

O resíduo na posição X20 pode ser Ala, Ser, Leu, Gly ou Thr.

O resíduo na posição X24 pode ser Ala, Ser, Lys, Glu, Gly ou

Thr.

O resíduo na posição X28 pode ser Ala, Ser, Lys, Gin, Gly ou

Thr.

Por exemplo, Xll e Xl6 podem ser independentemente Leu ou Phe, X24 e X28 podem independentemente ser Ala ou Ser.

Os compostos preferidos da presente invenção têm pelo menos uma atividade biológica de GLP-2, em particular em causar o crescimento dos intestinos ou do estômago. Isto pode ser avaliado em ensaios in vivo, por exemplo como descrito nos exemplos, em que a massa do intestino, ou uma sua porção, é determinada após um animal de teste tenha sido tratado ou exposto a um análogo de GLP-2.

Os análogos de GLP-2 da presente invenção têm uma ou mais substituições, deleções, inversões ou adições de aminoácidos, em comparação com o GLP-2 nativo e como definido acima. Esta definição também inclui os termos sinônimos miméticos de GLP-2 e/ou agonistas de GLP-2. Além disso, o análogo da presente invenção pode adicionalmente ter modificação química de um ou mais de seus grupos laterais de aminoácidos, átomos de carbono-a, grupo de amino terminal, ou grupo de ácido carboxílico terminal. Uma modificação química inclui, porém sem limitar, a adição de componentes químicos, a criação de novas ligações, e a remoção de componentes químicos. As modificações nos grupos laterais de aminoácidos, sem limitação, acilação dos grupos ε-amino da lisina, N-alquilação da arginina, histidina ou lisina, alquilação dos grupos de ácido glutâmico ou carboxílico aspártico, e desamidação da glutamina ou da asparagina. As modificações do amino terminal incluem, sem limitação, as modificações de desamino, alquila N- inferior, alquila N-di-inferior, e N-acila. As modificações do grupo carbóxi terminal incluem, sem limitação, as modificações de amida, alquilamina inferior, dialquilamida, e alquiléster inferior. Preferivelmente aqui a alquila inferior é a alquila CpC4. Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminais, podem ser protegidos por grupos protetores conhecidos do químico de peptídeos normalmente habilitado. O carbono-α de um aminoácido pode ser mono- ou di-metilado.

Quando presente, aminoácido de substituição Met oxidativamente estável significa aquele que é selecionado dentre o grupo consistindo de Met(O) (sulfóxido de metionina), Met(O)2 (sulfona de metionina), Vai, Ile, Asn, Glx (Glu ou Gin), Tyr, Phe, Trp e, preferivelmente, Leu, Nle, Ala, Ser e Gly.

Deve ficar entendido que os peptídeos da invenção podem também ser fornecidos na forma de um sal ou outro derivado. Os sais incluem sais farmaceuticamente aceitáveis tais como os sais de adição de ácido e os sais básicos. Exemplos de sais de adição de ácido incluem os sais de cloridreto, os sais de citrato e os sais de acetato. Exemplos de sais básicos incluem sais em que o cátion é selecionado dos metais alcalinos, tais como o sódio e o potássio, os metais alcalino-terrosos, tais como o cálcio, e íons de amônio tN(R3)3(R4)j em que R3 e R4 independentemente designa alquila Ci_6 opcionalmente substituída, alquenila C2-e opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída, ou heteroarila opcionalmente substituída. Outros exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 17â edição. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 e edições mais recentes, e na Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology.

Outros derivados dos análogos de GLP-2 da invenção incluem

2+ 2+

os complexos de coordenação com íons de metais tais como Mn e Zn , ésteres tais como os ésteres hidrolisáveis in vivo, ácidos ou bases livres, hidratos, pró-drogas ou lipídeos. Os ésteres podem ser formados entre os grupos de hidroxila ou ácido carboxílico presentes no composto, e um parceiro de reação apropriado de ácido carboxílico ou álcool, usando-se práticas bem conhecidas na técnica. Derivados que, como pró-drogas dos compostos, são convertíveis in vivo ou in vitro em um dos compostos precursores. Tipicamente, pelo menos uma das atividades biológicas do composto será reduzida na forma de pró-droga do composto, e pode ser ativada pela conversão do pró-droga para liberar o composto ou um seu metabólito. Exemplos de pró-drogas incluem o uso de grupos de proteção que possam ser removidos in situ liberando composto ativo, ou servir para inibir a depuração da droga in vivo.

Quando presentes, Z1 e Z2, cada um independentemente, representam uma seqüência de peptídeos de 3 a 20 ou de 4 a 20 resíduos de aminoácido, por exemplo na faixa de 4 a 15, mais preferível na faixa de 4 a 10, em particular na faixa de 4 a 7 resíduos de aminoácido, por exemplo de 4, 5, 6 ou 7 resíduos de aminoácido, tal como 6 resíduos de aminoácido. Cada um dos resíduos de aminoácido nas seqüências Z de peptídeos pode ser independentemente selecionado de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met, Om. Preferivelmente, os resíduos de aminoácido são selecionados de Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Om e Met, bem como aminoácidos que se situam dentro da fórmula I como definida na WO 01/04156, por exemplo, Dbu (ácido 2,4-diaminobutírico) ou Dpr (ácido 2,3-diaminopropanóico), mais preferível de Glu, Lys e Met, especialmente Lys. Os aminoácidos acima mencionados podem ter ou configuração D ou L, mas preferivelmente os aminoácidos acima mencionados têm uma configuração L. Seqüências Z particularmente preferidas são seqüências de quatro, cinco ou seis resíduos de lisina consecutivos, e particularmente seis resíduos de lisina consecutivos. Exemplos de seqüências Z são apresentados na WO 01/04156.

Em certas formas de realização, Z1 se acha ausente. Em tais

•y

casos, Z pode estar ou presente ou ausente.

Análogos de GLP-2 tendo pelo menos uma EC50 de 1 nM são definidos como agonistas de GLP-2.

A presente invenção inclui os seguintes peptídeos ainda descritos na seção experimental abaixo.

Compostos particularmente preferidos da presente invenção incluem os compostos ZP2264, ZP2267. ZP2268 e ZP2270.

ESTUDOS DA ESTABILIDADE

A pessoa habilitada será capaz de projetar métodos apropriados (por exemplo, métodos quantitativos) para a detecção de produtos de degradação dos análogo de GLP-2, por exemplo com base naqueles descritos abaixo. A degradação pode ocorrer como oxidação, hidrólise e desamidação, dependendo da identidade e da posição dos aminoácidos em qualquer análogo de GLP-2 dado, e de condições como pH, solução e temperatura. Os compostos podem ser classificados de acordo com a estabilidade química, quando os compostos são incubados em condições sob pressão (isto é, condições prováveis de causar a degradação) e subsequentemente analisados quanto ao conteúdo de peptídeo permanecer intacto. Além disso, o conhecimento obtido acerca dos produtos de degradação principais obtidos em condições sob pressão será importante para qualquer desenvolvimento do método analítico posterior.

ENSAIOS QUANTITATIVOS PARA DETECTAR ANÁLOGOS DE GLP

A pessoa habilitada será capaz de projetar métodos (por exemplo, métodos quantitativos) para a detecção de análogos de GLP-2 nos ambientes ou soluções complexas (por exemplo, plasma, urina, homogeneizados teciduais, homogeneizados celulares, saliva ou similares) para pesquisar a absorção, distribuição, metabolismo e excreção dos análogos de GLP após a administração a mamíferos, ou como parte dos estudos funcionais de sistemas celulares in vitro.

Em uma forma de realização, um ensaio quantitativo pode basear-se nos anticorpos originados contra os análogos de GLP ou seus fragmentos. Os anticorpos obtidos dos animais imunizados podem ser usados para os ensaios quantitativos. Em um exemplo, um ELISA direto de sanduíche pode ser preparado com o uso de um primeiro anticorpo com afinidade de uma parte da molécula imobilizada em uma placa de múltiplos reservatórios. A amostra é então aplicada aos reservatórios e o análogo de GLP é capturado pelo primeiro anticorpo. O análogo de GLP capturado é então reconhecido por um segundo anticorpo com afinidade para outra parte do análogo do GLP. O segundo anticorpo pode ser rotulado com uma enzima (peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina ou beta-galactosidase) ou um radioisótopo. A quantidade de análogo de GLP capturado pode então ser detectado pela adição de um substrato colorimétrico ou contagem direta de radioemissão ou por cintilação. Alternativamente, a quantidade de análogo de GLP capturado pode ser detectada indiretamente pela adição de um anticorpo rotulado com afinidade para o segundo anticorpo. A concentração na amostra pode ser estimada da resposta obtida de uma curva padrão externa contendo quantidades conhecidas do análogo de GLP. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para preparar um imunoensaio competitivo direto, em que um anticorpo específico para o análogo de GLP é imobilizado sobre uma placa de múltiplos reservatórios e a amostra é incubada nos reservatórios com uma concentração fixada pré-definida do análogo de GLP rotulado. O rótulo pode ser uma enzima, um fluoróforo, um radioisótopo ou biotina, e detectado com o uso, por exemplo, de substratos (por exemplo colorimétricos, fluorométricos ou quimioluminescentes) específicos para as enzimas, cintilação ou avidina ligadas a uma enzima, seguido pela detecção como descrito acima. A quantidade de análogo de GLP rotulado pode ser detectada por um método apropriado e a concentração do análogo de GLP presente na amostra derivada da resposta obtida de uma curva padrão externa, como descrito acima.

Em outra forma de realização, um ensaio quantitativo pode basear-se na metodologia de espectroscopia de massa em tandem de cromatografia líquida. Em uma tal configuração, a resposta de um fragmento específico para o análogo de GLP a ser estudado é monitorada após a fragmentação do composto precursor induzido por colisão com um gás inerte (He ou Ar). Antes da fragmentação, os componentes da amostra podem ser separados por cromatografia de fase reversa ou a amostra pode ser injetada diretamente no espectrômetro de massa. Se adequado, a amostra pode ser submetida a pré-tratamento (isto é, a adição dos inibidores da protease, a precipitação protéica, a extração de fase sólida, a extração de imunoafmidade, etc.). A concentração do análogo de GLP presente na amostra derivada da resposta obtida de uma curva padrão externa como descrito acima, 5 potencialmente após a correção da resposta com o uso de um padrão interno semelhante ao análogo de GLP a ser estudado.

GERAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS

Os anticorpos específicos contra os análogos de GLP ou seus fragmentos podem ser induzidos nos mamíferos e purificados do soro. Os 10 análogos ou fragmentos do GLP podem ou ser usados diretamente com um adjuvante para imunizar coelhos, camundongos ou outros mamíferos, ou os análogos do GLP ou seus fragmentos podem ser quimicamente ligados a uma molécula carreadora (isto é, hemocianina de lapa buraco de fechadura, ovalbumina, albumina, etc.) e injetados com um adjuvante. As injeções 15 podem ser repetidas com intervalos de 2 a 4 semanas por períodos prolongados para melhorar a afinidade e a seletividade dos anticorpos. Os anticorpos policlonais podem ser colhidos diretamente do soro. Para se obter os anticorpos monoclonais, as células B isoladas de animais imunizados, preferivelmente camundongos, devem ser fundidas com células tumorais para 20 formar anticorpos produtores de hibridomas. A triagem e a seleção dos clones e anticorpos apropriados podem ser realizadas com o uso ou de análogos de GLP imobilizados ou de seus peptídeos, seguido pela detecção com anticorpos rotulados. Alternativamente, a triagem e a seleção devem basear-se nos anticorpos imobilizados, seguidas pela detecção com análogos de GLP 25 rotulados ou seus fragmentos. Em todos os casos, o rótulo deve ser um radioisótopo, uma enzima, um fluoróforo ou biotina, e detectado com o uso, por exemplo, de substratos (por exemplo, colorimétrico, fluorométrico ou quimioluminescente) específicos para as enzimas, cintilação ou avidina ligadas a uma enzima, seguido por detecção conforme descrito. SÍNTESE DOS ANÁLOGOS DE GLP-2 É preferível sintetizar os análogos da invenção por meio da síntese de peptídeo de fase sólida ou fase líquida. Neste contexto, referência é feita à WO 98/11125 e, entre muitos outros, Fields, G. B. et al., 2002, “Principies and practice of solid-phase peptide synthesis”. Em: Synthetic Peptides (2â Edição) e os Exemplos nele incluídos.

Assim, os análogos de GLP-2 podem ser sintetizados de várias maneiras, incluindo, por exemplo, um método que compreende:

(a) sintetizar o peptídeo por meio da síntese de peptídeo de fase sólida ou de fase líquida e recuperar o peptídeos sintético assim obtido; ou

(b) quando o peptídeo seja constituído por aminoácidos de ocorrência natural, expressar uma construção de ácido nucléico que codifique o peptídeo em uma célula hospedeira e recuperar o produto de expressão da cultura de célula hospedeira; ou

(c) quando o peptídeo seja constituído por aminoácidos de ocorrência natural, efetuar a expressão in vitro livre de células de uma construção de ácido nucléico que codifique o peptídeo e recuperar o produto de expressão; ou

uma combinação dos métodos de (a), (b) e (c) para se obter fragmentos do peptídeo, subsequentemente ligando os fragmentos para se obter o peptídeo, e recuperar o peptídeo.

Assim, quanto a alguns análogos da invenção, pode ser vantajoso explorar as técnicas de engenharia genética. Este pode ser o caso quando o peptídeo seja suficientemente grande (ou produzido como uma construção de fusão) e quando o peptídeo apenas inclua aminoácidos de ocorrência natural que possam ser transladados do RNA em organismos vivos.

Com a finalidade da tecnologia de genes recombinantes, os fragmentos de ácido nucléico codificando os peptídeos da invenção são produtos químicos importantes. Consequentemente, um outro aspecto da presente invenção fornece uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico codificando um análogo de GLP-2 da invenção, em que o peptídeo preferivelmente consiste de aminoácidos de ocorrência natural. Os fragmentos de ácido nucléico da invenção são ou fragmentos de DNA ou de RNA.

Os fragmentos de ácido nucléico da invenção serão normalmente introduzidos em vetores adequados para formar vetores de clonagem ou de expressão carregando os fragmentos de ácido nucléico da invenção; tais novos vetores fazem também parte da invenção. Detalhes concernentes à construção destes vetores da invenção serão examinados no contexto das células transformadas e dos microorganismos abaixo. Os vetores podem, dependendo da finalidade e do tipo de aplicação, estar na forma de plasmídeos, fagos, cosmídeos, minocromossomas, ou vírus, mas também o DNA desprotegido que seja apenas expresso transientemente em certas células é um vetor importante. Os vetores de clonagem e de expressão preferidos (vetores plasmídeos) da invenção são capazes de replicação autônoma, por esse meio permitindo altos números de cópias com a finalidade de expressão de alto nível ou replicação de alto nível para clonagem subsequente.

O esquema geral de um vetor da invenção compreende os seguintes aspectos na direção 5’—>3’ e na articulação operável: um promotor para conduzir a expressão do fragmento de ácido nucléico da invenção, opcionalmente uma seqüência de ácido nucléico codificando um peptídeo condutor possibilitando a secreção (para a fase extracelular ou, quando aplicável, para o periplasma) ou de um peptídeo condutor para uso múltiplo, por exemplo a secreção combinada, o rótulo de purificação e o ajuste enzimático para corrigir o peptídeo ou para integração na membrana do fragmento de polipeptídeo, o fragmento de ácido nucléico codificando o peptídeo da invenção e, opcionalmente, uma seqüência de ácido nucléico codificando um terminador. Quando operando com vetores de expressão em cepas produtores ou linhagens celulares, é, para os fins da estabilidade 5 genética da célula transformada, preferível que o vetor, quando introduzido em uma célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira.

Os vetores da invenção são usados para transformar células hospedeiras para produzir o peptídeo modificado da invenção. Tais células transformadas, que também constituem parte da invenção, podem ser células 10 cultivadas ou linhagens celulares usadas para a propagação dos fragmentos de ácido nucléico e vetores da invenção, ou usadas para a produção recombinante dos peptídeos da invenção.

Células transformadas preferidas da invenção são microorganismos tais como bactérias [tais como as espécies Escherichia (por exemplo E. coli), Bacillus (por exemplo Bacillus subtillis), Salmonella ou Mycobacterium (preferivelmente não patogênicos, por exemplo M. bovis BCG)], leveduras (tais como Saccharomyces cerevisiae) e protozoários. Alternativamente, as células transformadas são derivadas de um organismo multicelular, isto é, podem ser células füngieas, uma célula de inseto, uma célula de planta ou uma célula de mamífero. Igualmente as células derivadas de um ser humano são interessantes, conforme o exame das linhagens celulares e vetores abaixo. Para os fins de clonagem e/ou expressão otimizada, é preferível que a célula transformada seja capaz de replicar o fragmento de ácido nucléico da invenção. As células expressando o fragmento nucléico são formas de realização úteis preferidas da invenção; elas podem ser usadas para a preparação em pequena escala ou em larga escala dos peptídeos da invenção.

Quando da produção do peptídeo da invenção por meio das células transformadas, é conveniente, embora distante de essencial, que o produto de expressão seja ou removido no meio de cultura ou carregado sobre a superfície da célula transformada.

Quando uma célula produtora eficaz tenha sido identificada, é preferível, com base nela, estabelecer uma linhagem celular estável que 5 carregue o vetor da invenção e que expresse o fragmento de ácido nucléico codificando o peptídeo. Preferivelmente, esta linhagem celular estável secreta ou carrega o peptídeo da invenção, dessa forma facilitando a sua purificação.

Em geral, os vetores plasmídeos contendo replicon e seqüências de controle, que são derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira, são usados em conexão com as hospedeiras. O vetor comumente carrega um sítio de replicação, bem como marcando seqüências, que são capazes de prover seleção fenotípica nas células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformado com o uso de pBR322 (mas numerosos outros plasmídeos úteis existem), um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli (ver, por exemplo, Bolivar et al., 1977). O plasmídeo pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e à tetraciclina e assim proporciona meios fáceis para identificar as células transformadas. O plasmídeo pBR ou outro plasmídeo ou fago microbiano devem também conter, ou ser modificados para conter promotores, os quais podem ser usados pelo microorganismo procariótico para expressão.

Esses promotores mais comumente usados na construção de DNA recombinante procariótica incluem a β-lactamase (penicilinase) e os sistemas promotores de lactose (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) e um sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et 25 al., 1979; EP O 036 776 A). Embora estes sejam os mais comumente usados, outros promotores microbianos foram descobertos e utilizados, e detalhes concernentes às suas seqüências de nucleotídeos foram publicados, permitindo que um técnico habilitado possa ligá-los funcionalmente com vetores plasmídeos (Siebwenlist et al., 1980). Além dos procariotas, micróbios eucarióticos, tais como as culturas de levedura, podem também ser usados, e também aqui o promotor deve ser capaz de conduzir a expressão. Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura de padeiro comum, é o mais comumente usado entre os microorganismos eucarióticos, não obstante várias outras cepas achem-se comumente disponíveis. Para a expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, é comumente usado (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Este plasmídeo já contém o gene trpl que provê um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura carecendo da capacidade de crescer em triptofano, por exemplo ATCC n2 44076 ou PEP4-1 (Jones, 1977). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura então provê um ambiente eficaz para detectar a transformação pelo crescimento na ausência de triptofano.

Seqüências promotoras adequadas nos vetores de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato cinase (Hitzman et al., 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicocinase. Na construção de plasmídeos de expressão adequados, as seqüências de terminação associadas com estes genes são também ligadas no vetor de expressão 3’ da seqüência desejada a ser expressa para prover poliadenilação do mRNA e terminação.

Outros promotores que têm a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são a região promotora para a desidrogenase 2 alcoólica, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradantes associadas com o metabolismo do nitrogênio, e a gliceraldeído-3 - fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose. Qualquer vetor plasmídeo contendo um promotor compatível com a levedura, origem de replicação e seqüências de terminação, é adequado.

Além dos microorganismos, as culturas de células derivadas de organismos multicelulares podem também ser usadas como hospedeiras. Em princípio, qualquer de tal cultura celular é praticável, quer de cultura de vertebrado ou de invertebrado. Entretanto, o interesse tem sido maior nas células de vertebrados, e a propagação do vertebrado na cultura (cultura tecidual) tem se tomado um procedimento de rotina nos anos recentes (Tissue Culture, 1973). Exemplos de tais linhagens de células hospedeiras úteis são as células VERO e HeLa, as linhagens de células de ovário de hamster chinês (CHO), e as células W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera frugiperda (SF) (comercialmente disponíveis como sistemas de expressão completa de, entre outras, Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. e da Invitrogen), a linhagem celular D. melanogaster S2 disponível da Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Países Baixos, e as linhagens de células MDCK.

Os vetores de expressão para tais células comumente incluem (se necessário) uma origem de replicação, um promotor localizado na frente do gene a ser expresso, junto com quaisquer sítios de ligação de ribossoma necessário, sítios de enlace de RNA, sítio de poliadenilação, e seqüências terminadoras transcricionais.

Para uso em células de mamíferos, as funções de controle nos vetores de expressão são frequentemente providas por material viral. Por exemplo, os promotores comumente usados são derivados de polioma, 25 Adenovírus 2, e mais frequentemente do Vírus Símio 40 (SV40). Os promotores prematuros e tardios do vírus SV40 são particularmente úteis porque ambos são facilmente obtidos do vírus como um fragmento, o qual também contém a origem viral de replicação do SV40 (Fiers et al., 1978). Fragmentos de SV40 menores ou maiores podem também ser usados, contanto que seja incluída a seqüência de aproximadamente 250 pares de base estendendo-se do sítio HindIII em direção ao sítio BgII localizado na origem viral de replicação. Além disso, é também possível, e com a frequência desejável, utilizar o promotor ou as seqüências de controle normalmente associadas com a seqüência de genes desejada, contanto que tais seqüências de controle sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

Uma origem de replicação pode ser fornecida ou pela construção do vetor para incluir uma origem exógena, tal como podendo ser derivada de SV40, ou outra viral (por exemplo Polioma, Adeno, VSV, BPV) ou podendo ser provida pelo mecanismo de replicação cromossômica da célula hospedeira. Se o vetor for integrado no cromossoma da célula hospedeira, este último é frequentemente suficiente.

De modo a se obter produções satisfatórias em um processo de produção recombinante, pode ser vantajoso preparar os análogos como proteínas de fusão, ou por fundir-se o peptídeo a um parceiro de fusão que possa servir como um rótulo de afinidade (para facilidade de purificação) e/ou por se ter repetições múltiplas do peptídeo. Estes métodos requerem a presença de um sítio de clivagem adequado para uma peptidase, mas a pessoa versada saberá como adaptar as construções genéticas subjacentes.

Após a preparação recombinante, os peptídeos da invenção podem ser purificados por métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo a cromatografia de múltiplas etapas (troca de íons, exclusão de tamanho e técnicas cromatográficas de afinidade).

Alternativamente, os peptídeos compreendidos de aminoácidos de ocorrência natural podem ser preparados in vitro em sistemas livres de células. Isto é especialmente conveniente nos casos em que os peptídeos possam ser tóxicos para as células hospedeiras putativas. Assim, a presente invenção também considera o uso de translação/expressão in vitro livre de células a fim de preparar os peptídeos da invenção. Neste contexto, referência é feita a kits de translação in vitro comercialmente disponíveis, materiais e documentação técnica, por exemplo, da Ambion Inc., 2130 Woodward, Austin, TX 78744-1832, USA.

Finalmente, os métodos disponíveis podem naturalmente ser combinados de modo a preparar, por exemplo, análogos semissintéticos. Em uma tal configuração, os fragmentos de peptídeos são preparados com o uso de pelo menos 2 etapas ou métodos separados, seguido pela ligação dos fragmentos para se obter o produto peptídico final.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO

Os análogos de GLP-2 da presente invenção, ou seus sais ou derivados, podem ser formulados como composições farmacêuticas preparadas para armazenagem ou administração, e que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo de GLP-2 da presente invenção, ou um seu sal ou derivado, em um carreador farmaceuticamente aceitável.

A quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção dependerá da via de administração, do tipo de mamífero que esteja sendo tratado, e das características físicas do mamífero específico sendo considerado. Estes fatores e seu relacionamento para determinar esta quantidade, são bem conhecidos dos técnicos habilitados nas artes médicas. Esta quantidade e o método de administração podem ser adaptados para se obter eficácia ótima de modo a liberar o peptídeo ao intestino grosso, mas dependerá de fatores tais como o peso, a dieta, a medicação simultânea e outros fatores, bem conhecidos daqueles versados nas artes médicas.

Acha-se dentro da invenção prover uma composição farmacêutica, em que o análogo de GLP-2, ou um seu sal, esteja presente em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir distúrbios relacionados ao estômago e aos intestinos.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção, tendo um componente acídico, podem ser formados com o uso de bases orgânicas e inorgânicas. Sais adequados formados com bases incluem os sais de metais, tais como os sais de metais alcalinos ou de metais alcalino- terrosos, por exemplo os sais de sódio, potássio ou magnésio; os sais de amônia e os sais de amina orgânica, tais como aqueles formados com morfolina, tiomorfolina, piperidina, pirrolidina, uma mono-, di- ou trialquilamina inferior (por exemplo, etil-terc-butil-, dietil-, diisopropil-, tietil- , tributil- ou dimetilpropilamina), ou uma mono-, di- ou tri-hidróxi alquilamina inferior (por exemplo, mono-, di- ou trietanolamina). Os sais internos também podem ser formados. De forma semelhante, quando um composto da presente invenção contenha um componente básico, os sais podem ser formados com o uso de ácidos orgânicos e inorgânicos. Por exemplo, os sais podem ser formados dos seguintes ácidos: acético, propiônico, láctico, cítrico, tartárico, succínico, fumárico, maléico, malônico, mandélico, málico, ftálico, clorídrico, bromídrico, fosfórico, nítrico, sulfurico, metanossulfônico, naftalenossulfônico, benzenossulfônico, toluenossulfônico e canforsulfônico, bem como outros ácidos farmaceuticamente aceitáveis conhecidos. Os sais de adição de ácido de amino podem também ser formados com aminoácidos tais com a lisina, a glicina ou a fenilalanina.

Como é evidente a uma pessoa versada na arte médica, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” dos peptídeos ou das composições farmacêuticas da presente invenção variará dependendo da idade, do peso e da espécie do mamífero tratado, dos compostos particulares empregados, do modo específico de administração e dos efeitos desejados, e da indicação terapêutica. Tendo em vista que estes fatores e seu relacionamento para determinar esta quantidade são bem conhecidos nas ciências médicas, a determinação dos níveis de dosagem terapeuticamente eficaz, a quantidade necessária para se alcançar o resultado desejado de prevenir e/ou tratar das doenças relacionadas aos intestinos e ao estômago aqui descritas, bem como outras indicações aqui apresentadas, situar-se-ão dentro do âmbito da pessoa habilitada.

Como aqui usado, “uma quantidade terapeuticamente eficaz” é aquela que reduz os sintomas de uma dada condição ou patologia e, de preferência, que normaliza as respostas fisiológicas em um indivíduo com a condição ou patologia. A redução dos sintomas ou a normalização das respostas fisiológicas podem ser determinadas com o uso de métodos de rotina na técnica, e podem variar com uma dada condição ou patologia. Em um aspecto, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais análogos de GLP-2 ou composição farmacêutica compreendendo o um ou mais análogos de GLP-2, é uma quantidade que restaura um parâmetro fisiológico mensurável substancialmente ao mesmo valor (preferivelmente até dentro de + 30 %, mais preferível até dentro de +20 %, e ainda mais preferível até dentro de 10 % do valor) do parâmetro em um indivíduo sem a condição ou a patologia.

Em uma forma de realização da invenção, a administração dos compostos ou composição farmacêutica da presente invenção é iniciada em níveis de dosagem inferiores, com os níveis de dosagem sendo aumentados, até que o efeito desejado de prevenir/tratar da indicação médica pertinente, tal como as doenças relacionadas aos intestinos e ao estômago, seja alcançado. Isto deve definir uma quantidade terapeuticamente eficaz. Quanto aos peptídeos da presente invenção, sozinhos ou como parte de uma composição farmacêutica, tais doses podem situar-se entre cerca de 0,01 mg/kg e 100 mg/kg de peso corporal, tal como entre cerca de 0,01 mg/kg e 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo entre IOe 100 μg/kg de peso corporal.

Para uso terapêutico, o análogo de GLP-2 escolhido é formulado com um carreador que seja farmaceuticamente aceitável e seja apropriado para liberar o peptídeo pela via de administração escolhida. Para os fins da presente invenção, as vias parenterais periféricas incluem as vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Certos compostos usados na presente invenção podem também ser receptivos à administração pelas vias oral, retal, nasal ou respiratória inferior. Estas são as assim chamadas vias não parenterais. A presente composição farmacêutica 5 compreende um análogo de GLP-2 da invenção, ou um seu sal ou derivado, e um carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados são aqueles usados convencionalmente com drogas à base de peptídeos, tais como diluentes, excipientes e outros. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na 10 técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Por exemplo, solução salina estéril e solução salina tamponada de fosfato em pH levemente acídico ou fisiológico, podem ser usadas. Os agentes de tamponamento do pH podem ser fosfato, citrato, acetato, 15 tris/hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido N-tris(hidroximetil)metil-3- aminopropanossulfônico (TAPS), bicarbonato de amônio, dietanolamina, histidina, que é um tampão preferido, arginina, lisina ou acetato, ou misturas destes. As faixas de tampão preferidas são de pH 4 a 8, pH 6,5 a 8, mais preferível pH 7 a 7,5. Preservativos, tais como os para, meta e orto-cresol, 20 metil- e propilparabeno, fenol, álcool benzílico, benzoato de sódio, ácido benzóico, benzoato de benzila, ácido sórbico, ácido propanóico, ésteres de ácido p-hidroxibenzóico, podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Estabilizadores, prevenindo a oxidação, a desamidação, a isomerização, a racemização, a ciclização, a hidrólise peptídica, tais como, por exemplo, o 25 ácido ascórbico, metionina, triptofano, EDTA, asparagina, lisina, arginina, glutamina e glicina, podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Estabilizadores, prevenindo a agregação, a fibrilação e a precipitação, tais como o dodecil sulfato de sódio, o polietileno glicol, a carboximetil celulose, a ciclodextrina podem ser providos na composição farmacêutica. Modificadores orgânicos para solubilização ou prevenção da agregação, tais como etanol, ácido acético ou acetato e seus sais, podem ser providos na composição farmacêutica. Os produtores da isotonicidade, tais como sais, por exemplo o cloreto de sódio ou os carboidratos mais preferidos, por exemplo a dextrose, o manitol, lactose, trealose, sacarose ou misturas destes, podem ser providos na composição farmacêutica.

Detergentes, tais como o Tween 20, Tween 80, SDS, Poloxâmeros, por exemplo o Pluronic F-68, o Pluronic F-127, podem ser providos na composição farmacêutica. Corantes e outros agentes aromatizantes podem ser providos na composição farmacêutica. Em outra forma de realização, um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável do análogo de peptídeo de GLP-2 é considerado. Agentes de suspensão podem ser usados. Modificadores orgânicos, tais como etanol, butanol terciário, 2-propanol, etanol, glicerol, polietileno glicol podem ser providos na formulação farmacêutica para liofilização de um produto liofilizado. Agentes de massa e produtores da isotonicidade, tais como um sal, por exemplo o cloreto de sódio,

carboidratos, por exemplo a dextrose, o manitol, lactose, trealose, sacarose ou misturas destes, aminoácidos, por exemplo glicina, glutamato ou excipientes tais como a cisteína, lecitina ou albumina de soro humano, ou misturas destes, podem ser providos na composição farmacêutica para liofilização.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas e usadas como tabletes, cápsulas ou elixires para administração oral; supositórios para administração retal; soluções preferivelmente estéreis ou pó ou suspensões estéreis para administração injetável; etc. A dose e o método de administração podem ser configurados para se obter eficácia ótima, porém dependerão de fatores tais como o peso, a dieta, a medicação simultânea e outros fatores, os quais aqueles versados nas artes médicas identificarão.

Quando a administração deva ser parenteral, tal como a intravenosa e a subcutânea, por exemplo em uma base diária, as composições farmacêuticas podem ser preparadas nas formas convencionais, ou como 5 soluções aquosas ou suspensões; liofilizadas, formas sólidas adequadas para reconstituição imediatamente antes do uso, ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões.

Diluentes para reconstituição do produto liofilizado podem ser um tampão adequado da lista acima, água, solução salina, dextrose, manitol, 10 lactose, trealose, sacarose, lecitina, albumina, glutamato de sódio, cloridreto de cisteína; ou água para injeção com adição de detergentes, tais como Tween 20, Tween 80, poloxâmeros, por exemplo pluronic F-68 ou pluronic F-127, polietileno glicol, e/ou com a adição de preservativos tais como para-, meta- e orto-cresol, metil- e propilparabeno, fenol, álcool benzílico, benzoato de 15 sódio, ácido benzóico, benzoato de benzila, ácido sórbico, ácido propanóico, ésteres de ácido p-hidroxibenzóico, e/ou com a adição de um modificador orgânico tal como etanol, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico ou seus sais.

Além disso, se desejável, as composições farmacêuticas injetáveis podem conter quantidades secundárias de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes, ou agentes de tamponamento do pH. As preparações intensificadoras da absorção (por exemplo, lipossomas, detergentes e ácidos orgânicos) podem ser utilizadas.

Em uma forma de realização da invenção, os compostos são 25 formulados para administração por infusão, por exemplo quando usadas como suplementos nutritivos líquidos para pacientes na terapia de nutrição parenteral total (por exemplo recém-nascidos, ou pacientes que estejam sofrendo de caquexia ou anorexia), ou por injeção, por exemplo por via subcutânea, intraperitoneal ou intravenosa, e são consequentemente utilizados como soluções aquosas na forma estéril e livre de pirogênio e, opcionalmente, tamponados a pH fisiologicamente tolerável, por exemplo um pH levemente acídico ou fisiológico. A formulação para administração intramuscular pode ser baseada em soluções ou suspensões em óleo de plantas, por exemplo óleo 5 de canola, óleo de milho ou óleo de soja. Estas formulações à base de óleo podem ser estabilizadas por antioxidantes, por exemplo BHA (hidroxianisol butilado) e BHT (hidroxitolueno butilado).

Assim, os presentes compostos peptídicos podem ser administrados em um veículo, tal como água destilada ou em solução salina, 10 solução salina tamponada de fosfato, soluções de dextrose a 5 %, ou óleos. A solubilidade do análogo de GLP-2 pode ser intensificada, se desejável, pela incorporação de um intensificador da solubilidade, tal como detergentes e emulsificadores.

O carreador aquoso ou veículo podem ser suplementados para uso como injetáveis com uma quantidade de gelatina que serve para depositar o análogo de GLP-2 no, ou próximo do, sítio de injeção, para sua lenta liberação ao sítio de ação desejado. Agentes de gelação alternativos, tais como o ácido hialurônico, podem também ser úteis como agentes de depósito.

Em uma forma de realização da presente invenção, a formulação compreende:

a. histidina-L dissolvida em água para se obter concentrações finais de 0,5 mM a 300 mM, preferivelmente de 3 a 200 mM, o mais preferível de 10 a 100 mM;

b. manitol para se obter até 350 mM, preferivelmente de 30 a 300 mM, o mais preferível de 100 mM a 230 mM; e

c. ácido acético para se obter até 200 mM, preferivelmente de 0,05 a 100 mM, o mais preferível de 0,5 a 50 mM em solução.

Quantidade apropriada do composto terapêutico é adicionada para se obter concentrações de 1 a 100 mg/ml, preferivelmente de 5 a 50 mg/ml, o mais preferível de 10 a 30 mg/ml.

Os pH são ajustados até o pH final de 4 a 8, preferivelmente de

6,5 a 7,5, o mais preferível de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada até o peso limite, filtrada de forma estéril e dispensada em alíquotas apropriadas em frascos para uso farmacêutico. A formulação é ainda processada de acordo com um produto líquido ou com um produto liofilizado.

Em outra forma de realização da presente invenção, a formulação compreende:

a. Histidina-L dissolvida em água para se obter as concentrações finais de 0,5 mM a 300 mM, preferivelmente de 3 a 200 mM, o

mais preferível de 20 a 100 mM de histidina-L.

b. Arginina-L para se obter até 200 mM, preferivelmente de 0,5 a 100 mM, o mais preferível de 5 a 50 mM;

c. manitol para se obter até 350 mM, preferivelmente de 30 a 300 mM, o mais preferível de 100 mM a 230 mM; e

d. ácido acético para se obter até 200 mM, preferivelmente de 0,05 a 100 mM, o mais preferível de 0,5 a 50 mM, em solução.

A quantidade apropriada de composto terapêutico é adicionada até se obter concentrações de 1 a 100 mg/ml, preferivelmente de 5 a 50 mg/ml, o mais preferível de 10 a 30 mg/ml.

Os pH são ajustados a pH final de 4 a 8, preferivelmente de 6,5 a 7,5, o mais preferível de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada ao peso limite, filtrada de forma estéril e dispensada em alíquotas apropriadas em frascos para uso farmacêutico. A formulação é ainda processada de acordo com um produto líquido ou um produto liofilizado.

Em ainda outra forma de realização da presente invenção, a formulação compreende:

a. Histidina-L dissolvida em água para se obter concentrações finais de até 200 mM, preferivelmente de 3 a 100 mM, o mais preferível de 5 a 50 mM de histidina-L;

a. Histidina-L dissolvida em água para se obter concentrações finais de 0,5 a 300 mM, preferivelmente de 3 a 200 mM, o mais preferível de

20 a 100 mM de histidina-L;

d. ácido acético para se obter até 200 mM, preferivelmente de

0,05 a 100 mM, o mais preferível de 0,5 a 50 mM em solução.

A quantidade apropriada de composto terapêutico é adicionada até se obter concentrações de 1 a 100 mg/ml, preferivelmente de 5 a 50 mg/ml, o mais preferível de 10 a 30 mg/ml. Os pH são ajustados a pH final de 4 a 8, preferivelmente de 6,5 a 7,5, o mais preferível de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada ao peso limite, filtrada de forma estéril e dispensada em alíquotas apropriadas em frascos para uso farmacêutico. A formulação é ainda processada de acordo com um produto líquido ou um produto liofilizado.

a. Histidina-L dissolvida em água para se obter concentrações finais de até 200 mM, preferivelmente de 3 a 100 mM, o mais preferível de 5

a 50 mM de histidina-L;

d. ácido acético para se obter até 200 mM, preferivelmente de

0,05 a 100 mM, o mais preferível de 0,5 a 50 mM em solução.

Os pH são ajustados a pH final de 4 a 8, preferivelmente de 6,5

a 7,5, o mais preferível de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada ao peso limite, filtrada de forma estéril e dispensada em alíquotas apropriadas em frascos para uso farmacêutico. A formulação é ainda processada de acordo com um produto líquido ou um produto liofilizado.

Em ainda outra forma de realização da presente invenção, a

formulação compreende:

a. N-acetato dissolvido em água para se obter concentrações finais de até 200 mM, preferivelmente de 0,5 a 100 mM, o mais preferível de 5 a 50 mM de histidina-L; b. manitol para se obter até 350 mM, preferivelmente de 30 a 300 mM, o mais preferível de 100 mM a 230 mM.

Os análogos de GLP-2 da invenção podem também ser formulados como um dispositivo de implantação de liberação lenta para administração prolongada e sustentada do análogo de peptídeo de GLP-2. Tais formulações de liberação sustentada podem ser apresentadas na forma de um emplastro posicionado externamente sobre o corpo. Exemplos de formulações de liberação sustentada incluem compósitos de polímeros biocompatíveis, tais como o poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co- glicólico), metilcelulose, ácido hialurônico, ácido siálico, silicato, colágeno, lipossomas e outros. As formulações de liberação sustentada podem ser de interesse particular quando seja desejável prover uma concentração local elevada de um análogo de GLP-2 da invenção.

O análogo de GLP-2 pode ser utilizado na forma de um frasco ou ampola enchidos de forma estéril, contendo uma quantidade intestinotrófica do peptídeo, ou em dose unitária ou em quantidades de múltiplas doses. O frasco ou a ampola podem conter o análogo de GLP-2 e o carreador desejado, como uma formulação pronta para administração. Alternativamente, o frasco ou a ampola podem conter o peptídeo de GLP-2 em uma forma, tal como uma forma liofilizada, adequada para reconstituição em um carreador adequado, tal como água estéril ou solução salina tamponada de fosfato.

Como uma alternativa para formulações injetáveis, o análogo de GLP-2 pode ser formulado para administração por outras vias. As formas de dosagem oral, tais como tabletes, cápsulas etc., podem ser formuladas de 5 acordo com a prática farmacêutica padrão. De acordo com a presente invenção o análogo de GLP-2 é administrado para tratar de indivíduos que possam beneficiar-se do crescimento do tecido do intestino delgado.

As formas de dosagem nasal podem ser formuladas com a adição de intensificadores, tais como o quitosan, ou detergentes tais como o Tween 20, o Tween 80, Poloxâmeros, por exemplo o Pluronic F68, o Pluronic F-127; Brij 35, Brij 72, Cremophor EL.

Os compostos peptídicos da presente invenção podem ser usados isoladamente, ou em combinação com compostos que tenham um efeito antiinflamatório. Sem que se esteja ligado à teoria, imagina-se que tal tratamento de combinação possa reforçar os efeitos benéficos do tratamento dos presentes análogos peptídicos.

A dosagem e o regime terapêuticos mais apropriados para tratamento do paciente variará, naturalmente, com a doença ou a condição a ser tratada, e de acordo com o peso do paciente e de outros parâmetros. Sem 20 que se deseja estar ligados por qualquer teoria particular, espera-se que as doses, na faixa de μg/kg, e a duração ou a frequência de tratamento mais curtas ou mais longas, possam produzir resultados terapeuticamente úteis, tais como um aumento estatisticamente significativo, particularmente na massa do intestino delgado. Em alguns casos, o regime terapêutico pode incluir a 25 administração de doses de manutenção apropriadas para prevenir a regressão do tecido que ocorre em seguida à interrupção do tratamento inicial. Os volumes da dosagem e o regime da dosagem mais apropriados para uso humano podem ser orientados pelos resultados obtidos pela presente invenção, e podem ser confirmados em testes clínicos apropriadamente projetados.

Uma dosagem e protocolo de tratamento eficazes podem ser determinado por meios convencionais, iniciando-se com uma dose baixa em animais de laboratório e depois aumentando-se a dosagem ao mesmo tempo 5 em que se monitora os efeitos, e sistematicamente variando o regime de dosagem também. Numerosos fatores podem ser levados em consideração por um clínico quando da determinação de uma dosagem ótima para um dado paciente. Essas considerações são conhecidas da pessoa habilitada.

Uma dose humana de um peptídeo de GLP-2 de acordo com a invenção pode, em uma forma de realização, ser de cerca de 10 μg/kg de peso corporal/dia a cerca de 10 mg/kg/dia, preferivelmente de cerca de 50 μg/kg/dia a cerca de 5 mg/kg/dia, e o mais preferível cerca de 100 μg/kg/dia a

1 mg/kg/dia.

CONDIÇÕES MÉDICAS Os peptídeos da presente invenção são úteis como um agente

farmacêutico para prevenir ou tratar de um indivíduo que esteja sofrendo de distúrbios gastrintestinais, incluindo o trato gastrintestinal superior do esôfago, mediante administração de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou um sal deste, como aqui descrito. Os distúrbios relacionados ao 20 estômago e aos intestinos incluem úlceras de qualquer etiologia (por exemplo, úlceras pépticas, Síndrome de Zollinger-Ellison, úlceras induzidas por drogas, úlceras relacionadas a infecções ou outros patógenos), distúrbios da digestão, síndromes de má absorção, síndrome do intestino delgado, síndrome do beco- sem-saída, doença inflamatória intestinal (doença de Crohns e colite 25 ulcerativa), espru celíaco (por exemplo, surgindo da enteropatia induzida pelo glúten ou doença celíaca), espru tropical, espru hipogamaglobulinêmico, enterite, e mucosite e diarréia induzidas pela quimioterapia e/ou hemoterapia de radiação.

Para pacientes tendo neoplasia mucosa gastrintestinal, ou um risco aumentado de neoplasia mucosa gastrintestinal, pode ser desejável selecionar um composto de modo a reduzir ou abrogar o risco de efeitos colaterais reduzidos tais como o estímulo ou agravamento da neoplasia mucosa gastrintestinal. Por exemplo, quando da seleção de um composto para 5 tratar de um paciente com neoplasia do cólon (quer benigna quer maligna), ou em risco de desenvolver a neoplasia do cólon, pode ser mais apropriado selecionar um composto que seja seletivo quanto ao intestino delgado sobre o cólon do que um composto não seletivo ou um composto que seja seletivo quanto ao cólon sobre o intestino delgado.

Como mencionado acima em geral, os indivíduos que devem

beneficiar-se da massa do intestino delgado aumentada e da conseqüente e/ou manutenção da estrutura e função da mucosa do intestino delgado normal, são candidatos para tratamento com os presentes análogos de GLP-2. Condições particulares que podem ser tratadas com o análogo de GLP-2 incluem as 15 várias formas de espru, incluindo o espru celíaco que resulta de uma reação tóxica à alfa-gliadina do calor e pode ser um resultado da enteropatia induzida pelo glúten ou doença celíaca, e é marcado por uma perda significativa da vilosidade do intestino delgado; o espru tropical que resulta da infecção e é marcado pelo achatamento parcial da vilosidade; o espru 20 hipogamaglobulinêmico que é observado comumente em pacientes com imunodeficiência variável comum ou hipogamaglobulinemia e é marcado pelo decréscimo significativo na altura da vilosidade. A eficácia terapêutica do tratamento do análogo de GLP-2 pode ser monitorada pela biópsia entérica para examinar a morfologia da vilosidade, mediante avaliação bioquímica da 25 absorção nutriente, mediante determinação não invasiva da permeabilidade intestinal, pelo ganho de peso do paciente, ou pela melhora dos sintomas associados com estas condições.

Os análogos de GLP-2 da presente invenção podem ser úteis como agentes farmacêuticos para prevenir ou tratar de distúrbios relacionados ao estômago, incluindo úlceras de qualquer etiologia (por exemplo, úlceras pépticas, Síndrome de Zollinger-Ellison, úlceras induzidas pela droga, úlceras relacionadas a infecções ou outros patógenos).

Outras condições que podem ser tratadas com os análogos de GLP-2 da invenção, ou para as quais os análogos de GLP-2 podem ser úteis profilaticamente, incluem, além da enterite de radiação acima mencionada, enterite infecciosa ou pós-infecciosa, e dano do intestino delgado por causa de agentes quimioterápicos do câncer ou tóxicos.

Os análogos de GLP-2 também podem ser usados para o tratamento da desnutrição, por exemplo a caquexia e a anorexia.

Uma forma de realização particular da invenção diz respeito ao uso dos peptídeos presentes para a prevenção e/ou o tratamento de dano e disfunção intestinais. As células tronco da mucosa do intestino delgado são particularmente suscetíveis aos efeitos citotóxicos da quimioterapia por causa da sua rápida velocidade de proliferação (Keefe et al., Gut 2000; 47: 632- 637). A administração dos presentes agonistas de peptídeo de GLP-2 pode intensificar o efeito trófico nas criptas intestinais e rapidamente provê novas células para substituir o epitélio intestinal danificado em seguida à quimioterapia e/ou à terapia de radiação. O objetivo final alcançado pela administração dos presentes peptídeos é reduzir a morbidez relacionada ao dano gastrintestinal de pacientes sendo submetidos a tratamento de quimioterapia enquanto aumenta a tolerância à quimioterapia mais agressiva, a quimioterapia de radiação e de combinação e as terapias de radiação. O tratamento profilático ou terapêutico concomitante pode ser proporcionado de acordo com a presente invenção, a pacientes sendo submetidos ou em vias de serem submetidos, à terapia de radiação.

A mucosite gastrintestinal após a quimioterapia anticâncer é um problema crescente que é essencialmente não tratável uma vez estabelecido, não obstante ele gradualmente se remita. Estudos conduzidos com as drogas 5-FU e irinotecan comumente usados do câncer citostático têm demonstrado que a quimioterapia eficaz com estas drogas afeta predominantemente a integridade estrutural e a função do intestino delgado, enquanto o cólon é menos sensível e principalmente responde com a 5 formação de muco aumentada (Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. 18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J Int Med Res. 31(1): 6-16, 2003).

Os novos análogos de GLP-2 da presente invenção podem ser úteis na prevenção e/ou tratamento da lesão gastrintestinal e dos efeitos colaterais dos agentes quimioterápicos. A aplicação terapêutica 10 potencialmente importante pode ser feita aos agentes quimioterápicos correntemente usados, tais como, sem limitar: 5-FU, Altretamina, Bleomicina, Bussulfan, Capecitabina, Carboplatina, Carmustina, Clorambucil, Cisplatina, Cladribina, Crisantaspase, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, 15 Etoposide, Fludarrabina, Fluorouracil, Gemcitabina, Hidroxicarbamida, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecan, Doxorrubicina lipossômica, Leucovorin, Lomustina, Melfalan, Mercaptopurina, Mesna, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Paclitaxel, Pemétrexed, Pentostatina, Procarbazina, Raltitrexed, Estreptozocina, Tegafiir-uracil, Temozolomida, 20 Tiotepa, Tioguanina/Tioguanina, Topotecan, Treossulfan, Vimblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, Bleomicina, Bussulfan, Capecitabina, Carboplatina, Carmustina, Clorambucil, Cisplatina, Cladribina, Crisantaspase, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxorrubicina, Epirrubicina, Etoposide, Fludarabina, 25 Gemcitabina, Hidroxicarbamida, Idarrubicina, Ifosfamida, Irinotecan, Doxorrubicina Lipossômica, Leucovorina, Lomustina, MelfaIan, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Paclitaxel, Pemetrexed, Pentostatina, Procarbazina, Raltitrexed, Estreptozocina, Tegafur-uracil, Temozolomida, Tiotepa, Tioguanina/Tioguanina, Topotecan, Treossulfan, Vimblastina, Vincristina, Vindesina e Vinorelbina.

É previsto que os presentes peptídeos podem ser empregados em um método de tratar recém-nascidos pela administração de uma 5 quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou um sal deste. As complicações com a alimentação dos recém-nascidos por causa da falta de desenvolvimento dos intestinos, podem ser superadas pelo uso dos presentes agonistas de peptídeos.

Em outra forma de realização, a invenção descreve um método de tratar de condições mediadas pela DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV) mediante administração a um paciente em sua necessidade de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou um sal deste. Tais doenças incluem condições nas quais a enzima DPP-IV é superexpressa.

A composição farmacêutica pode, em uma forma de realização, ser formulada de modo a causar a lenta liberação do referido análogo de GLP-2, ou um sal ou derivado deste, como descrito acima.

É considerado que os presentes peptídeos podem ser empregados em um método de tratar recém-nascidos pela administração de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou um sal deste. As 20 complicações com a alimentação dos recém-nascidos por causa da falta de desenvolvimento dos intestinos pode ser superada mediante o uso dos presentes agonistas peptídicos.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar os aspectos preferidos da invenção, e não se pretende limitem o escopo da invenção. SÍNTESE GERAL DE PEPTÍDEOS Aparelho e estratégia sintética

Os peptídeos foram sintetizados às bateladas em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para filtragem com o uso de 9-fluoroenilmetilóxicarbonila (Fmoc) como grupo de proteção de N-a- amino e grupos de proteção comuns adequados para funcionalidades de cadeia lateral.

Solventes

O solvente DMF (Ν,Ν-dimetilformamida, Riedel de-Hãen, Alemanha) foi purificado pela passagem através de uma coluna adensada com uma forte resina de troca de cátions (Ácido forte Lewatit S 100 MB/H, Bayer AG Leverkusen, Alemanha) e analisado quanto a aminas livres antes do uso pela adição de 3,4-diidro-3-hidróxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH) dando origem a uma cor amarela (ânion Dhbt-O-) se aminas livres estiverem presentes. O solvente DCM (diclorometano, graduação analítica, Riedel de- Hãen, Alemanha) foi usado diretamente sem purificação. Acetonitrila (graduação de HPLC, Lab-Scan, Dublin Irlanda) foi usada diretamente sem purificação.

Aminoácidos

Os aminoácidos protegidos por Fmoc foram comprados da Advanced ChemTech (ACT) nas formas protegidas de cadeia lateral adequadas.

Reagentes de acoplamento

0 reagente de acoplamento diisopropilcarbodiimida (DIC) foi comprado da Riedel de-Hãen, Alemanha.

Suportes sólidos

Os peptídeos foram sintetizados em 0,22 a 0,31 mmol/g de resinas TentaGel S. TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc (Rapp polymere, Alemanha) foram usados nos casos em que um peptídeo amidado C-terminal era preferido, enquanto TentaGel S PHB, TentaGel S PHB Lys(Boc)Fmoc foram usados quando um ácido carboxílico livre C- terminal era preferido.

Catalisadores e outros reagentes

Diisopropiletilamina (DIEA) foi comprada da Aldrich, Alemanha, piperidina e piridina foram compradas da Riedel-de Hãen, Frankfurt, Alemanha. Etanditiol foi comprado da Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemanha. 3,4-diidro-3-hidróxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH), Ι- ΙΟ hidroxibenzotriazol (HOBt) (HOAt) foram comprados da Fluka, Suíça. Anidrido acético foi obtido da Fluka.

Procedimentos de acoplamento

Os aminoácidos foram acoplados como ésteres HObt ou HOAt gerados in situ produzidos de aminoácidos N-a-protegido apropriados e HObt 15 ou HOAt por meio de DIC em DMF. As acilações foram conferidas pelo teste da ninidrina realizado em 80 0C de modo a prevenir a desproteção de Fmoc durante o teste (Larsen, B. D. e Holm, A., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 1-9).

Desproteção do grupo de proteção Ν-α-amino (Fmoc).

A desproteção do grupo Fmoc foi realizada mediante

tratamento com 20 % de piperidina em DMF (1 x 5 e 1 x 10 minutos), seguido por lavagem com DMF (5x15 ml, 5 minutos cada) até que nenhuma cor amarela pudesse ser detectada após a adição do Dhbt-OH ao DMF drenado.

Acoplamento dos ésteres HOBt

3 equivalentes de aminoácido protegido de Ν-α-amino foram dissolvidos em DMF junto com 3 equivalentes de HObt e 3 equivalentes de DIC, e depois adicionados à resina. Clivagem do peptídeo da resina com ácido

Peptídeos foram clivados das resinas mediante tratamento com ácido trifluoroacético a 95 % (TFA, Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemanha)- água v/v ou com 95 % de TFA-água e 5 % de etanoditiol v/v na temperatura 5 ambiente por 2 horas. As resinas filtradas foram lavadas com 95 % de TFA- água e os filtrados e as lavagens foram evaporadas sob pressão reduzida. O resíduo foi lavado com éter e secados por congelamento do ácido acético- água. O produto bruto secado por congelamento foi analisado por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e identificado por IO espectrometria de massa (MS).

Síntese peptídica em bateladas sobre resina TentaGel (PEG-PS).

A resina TentaGel (1 g, 0,23-0,24 mmol/g) foi colocada em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno, para filtração. A resina foi intumescida em DMF (15 ml) e tratada com 20 % 15 de piperidina em DMF a fim de remover o grupo Fmoc inicial ou sobre o ligador TentaGel S RAM ou sobre o primeiro aminoácido sobre a resina TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc. A resina foi drenada e lavada com DMF até que nenhuma cor amarela pudesse ser detectada após a adição de Dhbt-OH ao DMF drenado. Os aminoácidos de acordo com a seqüência 20 foram acoplados como ésteres de HObt protegido de Fmoc pré-formado (3 equivalentes) como descrito acima. Os acoplamentos prosseguiram por 2 horas, a menos que de outra forma especificado. A resina foi drenada e lavada com DMF (5 x 15 ml, 5 minutos cada) de modo a remover o reagente em excesso. Todas as acilações foram conferidas pelo teste da 25 ninidrina como descrito acima. Após a síntese completada, a resina de peptídeo foi lavada com DMF (3x15 ml, 5 minutos cada), DCM (3x15 ml, 1 minuto cada) e finalmente éter dietílico (3x15 ml, 1 minuto cada), e secada no vácuo. O peptídeo foi clivado da resina como descrito anteriormente e o produto de peptídeo bruto foi analisado e purificado como descrito abaixo.

Condições da HPLC

A análise de HPLC gradiente foi feita com o uso de um sistema de HPLC Hewlett Packard HP 1100 consistindo de uma Bomba 5 Quaternária HP 1100, um Autoamostrador HP 1100, um Termostato de Coluna HP 1100 e um Detector de Comprimentos de Onda Múltiplos HP 1100. Hewlett Packard Chemstation para programa LC (rev. A.06.01) foi usado para controle de instrumentos e aquisição de dados. O seguinte sistema de colunas e de tampão de HPLC foi usado:

Coluna: VYDAC 238TP5415, C-18, 5 mm, 300 Â 150 x 4,6 mm.

Tampões: A: 0,1 % de TFA em MQV; B: 0,085 % de TFA, 10 % de MQV, 90 % de MeCN.

Gradiente: 0 a 1,5 min. 0 % de B

1,5 a 25 min 50 % de B 25 a 30 min 100% de B

30 a 35 min 100 % de B 35 a 40 min 0 % de B Fluxo 1, ml/min, temperatura do forno de 40 °C, detecção de UV: 1 = 215 nm.

Purificação de HPLC do peptídeo bruto

Os produtos de peptídeo bruto foram purificados PerSeptive Biosystems VISION Workstation. O programa VISION 3.0 foi usado para controlar o instrumento e a aquisição de dados. A seguinte coluna e sistema de tampão de HPLC foi usado:

Coluna: Kromasil KR 100 À, 10 mm C-8, 250 x 50,8 mm.

Sistema de tampão: Tampões: A: 0,1 % de TFA em MQV; B: 0,085 % de TFA, 10 % de MQV, 90 % de MeCN.

Gradiente:0 a 37 minutos, 0 a 40 % de B

Fluxo de 35 ml/minuto, detecção de UV: 1 = 215 nm e 280 nm. Espectroscopia de massa

Os peptídeos foram dissolvidos em metanol de supergradiente (Labscan, Dublin, Irlanda), água milli-Q (Millipore, Bedford, MA) e ácido fórmico (Merck, Damstadt, Alemanha) (50:50:0,1 v/v/v) para dar 5 concentrações entre I e 10 mg/ml. As soluções peptídicas (20 ml) foram analisadas em modo de polaridade positiva por ESI-TOF-MS com o uso de um espectrômetro de massa LCT (Micromass, Manchester, Reino Unido) precisão de ± 0,1 m/z.

Procedimento sintético geral Em todas as sínteses, a resina TentaGel-S-Ram (1 g, 0,22 a

0,31 mmol/g) foi colocada em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para a filtração. A resina foi intumescida em DMF (15 ml), e tratada com 20 % de piperidina em DMF para garantir a presença de grupos amino não protonados na resina. A resina foi drenada e lavada com DMF até que nenhuma cor amarela pudesse ser detectada após a adição de Dhbt-OH ao DMF drenado. Os aminoácidos de acordo com a seqüência foram acoplados como ésteres de HOBt protegidos de Fmoc pré-formados (3 eq.) como descrito acima. Os acoplamentos prosseguiram por 2 horas, a menos que de outra forma especificado. A resina foi drenada e lavada com DMF (5x15 ml, 5 minutos cada) de modo a remover o reagente em excesso. Todas as acilações foram conferidas pelo teste da ninidrina realizado em 80 °C. Após completada a síntese, a resina de peptídeo foi lavada com DMF (3x15 ml, 5 minutos cada), DCM (3 x 15 ml, 1 minuto cada) e finalmente éter dietílico (3 x 15 ml, 1 minuto cada) e secada in vacuo. O peptídeo foi então clivado da resina como descrito acima e secado por congelamento.

Após a purificação com o uso de HPLC preparativo como descrito acima, o produto peptídico foi coletado e a identidade do peptídeo foi confirmada por ES-MS. Este procedimento foi usado para a síntese de todos os peptídeos exemplificados mais abaixo. Compostos Sintetizados

Com o uso das técnicas acima, os compostos 1809 a 1861 e o composto de referência 1559 (H-[Gly2]hGLP-2-OH) foram sintetizados com o uso dos métodos descritos acima (Tabela 1). TABELA 1 COMPOSTOS SINTETIZADOS ZPn2 Seqüência Peso Peso % de Rendimento/ Molecular Molecular pureza g da resina isotópico isotópico mg (g/mol) (g/mol) calculado encontrado 2264 H-HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLIATKITD-NH2 3487,79 3487,5 93 21 2266 H-HGEGSFSDELETILEELAAEDFIEWLIETKITD-NH2 3777,81 3777,1 88 38 2267 H-HGEGSFSDELSTILESLAAADFIAWLIATKITD-NH2 3519,78 3519,5 96 30 2268 H-HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITD-NH2 3535,77 3535,68, 91 17 2269 H-HGEGSFSDELKTILESLAAADFIEWLIOTKITD-NH2 3675,87 3675,4 94 34 2272 H-HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITD-NH2 3519,78 3519,6 91 20 2263 H-HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITD-NH2 3567,76 3567,3 62 16 2270 H-HGEGSFSDELNTILESLAASDFISWLISTKITD-NH2 3594,77 3594,5 74 28 2242 H-HGEGSFSSELSTILD ALAARDFiAWLIATKITDK-OH 3675,19 3675,9 88 87 2378 H-HGEGSFSDELETILEELAAEDFIEWLIETKITDKKKKKK-NH2 4546,38 4546,50 93 73,4 2379 H-HGEGSFSDELKTILESLAAADFIEWLIQTKITDKKKKKK-N H2 4444,44 4444,13 96 24,9 2380 H-HGEGSFSDELSTILESLAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 4336,33 4336,75 96 40,6 2381 H-HGEGSFSDELATILEALAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 4304,34 4304,50 97 38,5 2382 H-HGEGSFSDELNTILESLAASDFIS WLISTKITDKKKKKK-NI r 12 4363,34 4363,55 94 12,9 2383 H-HGEGSF SDELNTILESLAARDFIS WLISTKITDKKKKKK-NH2 4432,41 4432,60 96 16,8 2384 H-HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLISTKITDKKKKKK-NH2 4272,35 4272,40 98 27,3 2385 H-HGEGSFSDELSTILEALAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 4320,34 4320,50 95 40,5 2386 H-HGEGSFSDELATILESLAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 4320,à4 4320,75 89 65,3 2394 H-HGEGSFSDELLTILELLAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 4388,44 4389,13 90- 23,2 2395 H-H GEGSFSDELKTILEKL AAKDFIK WLIKTKITDKKKKKK-NH2 4541,65 4541,61 96 32 2396 H-HGEGSFSDELFTILEFLAASDFISWLISTKITDKKKKKK-NH2 4456,75 4456,40 93 21,5 2397 H-HGEGSFSDELATILEALAAADFIAWLISTKITD-NH2 3503,88 3503,78 92 73,5 2398, H-HGEGSFSDELSTILEALAASDFISWLISTKITD-NH2 3551,77 3552,00 89 23,5 2399 H-HGEGSFSDELATILESLAASDFISWLISTKITD-NH2 3551,77 3551,75 80 45,6 2400 H-HGEGSFSDELLTILELLAASDFISWLISTKITD-NH2 3619,87 3620,50 84 6,8 2401 H-HGEGSFSDELFTILEFLAASDFISWLISTKITD-NH2 3687,83 3688,00 75 11,9 2402 H-HGEGSFSDELATILEALAA ADFLA WLIATKITDKKKKKK-NH2 4256,36 4256,88 97 29,9 2403 H-HGEGSFSDELSTILESLAAADFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2 4288,35 4288,63 93 48,4 2404 H-HGEGSFSDELSTILEALAAADFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2 4272,35 4272,63 92 28,5 2411 H-HGEGSFSDELATILEALAAADFISWLIATKITDKKKKKK-NH2 4272,35 4272,88 93 35,5 2412 H-HGEGSFSDELLTILELLAAADFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2 4340,45 4341,13 88 58,7 2413 · H-HGEGSFSDELATILESLAAADFISWLIATKITDKKKKKK-NH2 4288,35 4288,88 95 52,3 2414 H-HGEGSFSDELATILESLAAADFIAWLIATKITD-NH2 3503,78 3504,25 91 49,5 2415 H-HGEGSFSDELATILESLAAADFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2 4272,35 4272,88 98 43,25 2416 H-HGEGSFSDELLTILELLAALDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2 4382,50 4383,00 88 26,5 2417 H-HGEGSFSDELATILEALAASDFIAWLIATKITD-NH2 3503,78 3504,10 98 58,8 2418 H-HGEGSFSDELATILEALAAADFISWLIATKITD-NH2 3503,78 3504,00 97 83,3 2420 H-HGEGSFSDELSTILEALAAADFIAWLIATKITD-NH2 3503,78 3504,63 94 62,2 2423 H-HGEGSFSDELATILEALAASDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2 4272,35 4273,50 93 27,2 2424 H-HGEGSFSDELLTILELLAALDFILWLILTKITDKKKKKK-NH2 4466,59 - 4467,00 78 29 EXEMPLO I

SÍNTESE PO COMPOSTO 2264

H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile- Leu-Glu-Ala-Leu-Ala-Ala-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys- Ile-Thr-Asp-NH2 em TentaGel S RAM.

TentaGel S RAM seco (0,2 mmol/g, 1 g) foi colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para filtração, e tratado como descrito sob “síntese peptídica em bateladas sobre resina TentaGel” até terminar o acoplamento da Histidina N-terminal. Todos os 10 acoplamentos prosseguiram durante a noite. As acilações foram conferidas como anteriormente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N-terminal, o peptídeo foi clivado da resina como descrito acima. Após a purificação com o uso de HPLC preparativa como anteriormente descrito, 413 mg do produto peptídico foram coletados com uma pureza 15 melhor do que 93 % e a identidade do peptídeo foi confirmada por MS (encontrado M 3488,13, calculado M 3487,79).

EXEMPLO 2

SÍNTESE DO COMPOSTO 2268

H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile- Leu-Glu- Ala-Leu- Ala- Ala-Ser-Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile- Thr-Asp-NH2 em TentaGel S RAM.

TentaGel S RAM seco (0,2 mmol/g, 1 g) foi colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para filtração, e tratado como descrito sob “síntese peptídica em bateladas sobre resina 25 TentaGel” até terminar o acoplamento da Histidina N-terminal. Todos os acoplamentos prosseguiram durante a noite. As acilações foram conferidas como anteriormente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N-terminal, o peptídeo foi clivado da resina como descrito acima. Após a purificação com o uso de HPLC preparativa como anteriormente descrito, 132 mg do produto peptídico foram coletados com uma pureza melhor do que 91 % e a identidade do peptídeo foi confirmada por MS (encontrado M 3535,88, calculado M 3535,77).

EXEMPLO 3 SÍNTESE DO COMPOSTO 2264 (Lvs6)

H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile- Leu-Glu-Ala-Leu- Ala- Ala- Ala- Asp-Phe-Ile- Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys- Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 em TentaGel S RAM-Lys(Boc)- Fmoc.

TentaGel S RAM- Lys(Boc)-Fmoc seco (0,24 mmol/g, 1 g) foi

colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para filtração, e tratado como descrito sob “síntese peptídica em bateladas sobre resina TentaGel” até terminar o acoplamento da Histidina N-terminal. Todos os acoplamentos prosseguiram durante a noite. As acilações foram 15 conferidas como anteriormente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N-terminal, o peptídeo foi clivado da resina como descrito acima. Após a purificação com o uso de HPLC preparativa como anteriormente descrito, o produto peptídico foi coletado com uma pureza melhor do que 90 % e a identidade do peptídeo foi confirmada por MS 20 (encontrado M 4256,40, calculado M 4256,36).

EXEMPLO 4

SÍNTESE DO COMPOSTO 2268(Lvs6).

H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile- Leu-Glu- Ala-Leu- Ala- Ala-Ser- Asp-Phe-Ile-Ser-Trp-Leu-Ile-Ser-Thr-Lys-Ile- Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 em TentaGel S RAM-Lys(Boc)- Fmoc.

TentaGel S RAM Lys(Boc)-Fmoc seco (0,24 mmol/g, 1 g) foi colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para filtração, e tratado como descrito sob “síntese peptídica em bateladas sobre resina TentaGel” até terminar o acoplamento da Histidina N-terminal. Todos os acoplamentos prosseguiram durante a noite. As acilações foram conferidas como anteriormente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N-terminal, o peptídeo foi clivado da resina como 5 descrito acima. Após a purificação com o uso de HPLC preparativa como anteriormente descrito, o produto peptídico foi coletado com uma pureza melhor do que 90 % e a identidade do peptídeo foi confirmada por MS (encontrado M 4304,10, calculado M 4304,34).

EXEMPLO 5

SÍNTESE DO COMPOSTO 2264A (SAL DE ACETATO)

Troca de contraíons do trifluoroacetato por acetato do Composto 2264.

O produto peptídico sintético purificado do composto 2264 é isolado como um sal de trifluoroacetato, por causa da presença do ácido trifluoroacético (0,1 % v/v) nos tampões de EPLC usados para a purificação do produto peptídico sintético bruto.

De modo a trocar o contraíon do trifluroacetato por acetato, uma solução do peptídeo foi passada através de uma coluna adensada com resina de troca de íons de base forte no acetato (Dowex 1x8). O composto 20 2264T é dissolvido em água. A solução é passada através de uma coluna contendo resina de troca de íons de base forte sobre o acetato (Dowex 1x8; capacidade 1,33 meq/ml de resina). A resina é então lavada com água e o eluato é coletado e liofilizado, resultando no sal de acetato com uma pureza melhor do que 90 %.

EXEMPLO 6

SÍNTESE DO COMPOSTO 2264 C (SAL DE CLORETO)

Troca de contraíons do trifluoroacetato (Tfa)) por cloreto (C1-) do Composto 2264.

O composto 2264T foi dissolvido em ácido clorídrico 0,1M e a solução resultante foi liofilizada. O remanescente foi dissolvido em água e liofilizado novamente, resultando no sal de cloreto com uma pureza melhor do que 90 %.

Outros compostos seletivos do análogo de GLP-2 são listados

na Tabela 2. TABELA 2 LISTA DE COMPOSTOS SELETIVOS DD ANÁLOGO DF. Γ.Γ.Ρ-7

Composto 1 2 1 A 5 « 7 β 9 1í Ili 1 H Q E. Q S F S D £ t A 2 H Q 6 G S P 5* & a l· L 3 H G & O 9 F & D £ L F 4 Il G E G S F 8 D E L V S H <3 E' Q S F B O E L I H G £ ü S P S D B t L 7 H O E B S F S ü E L f, 6 H <3 i H -5 1» £ B E L V a K G E Qi P F S 0 e L F H Q E Q E F S D £ L Λ M H O E Q E F & D E L l «. H Q S Q 3 F S D a L 1 13 M G E Q 5 F S D Slí t V U H Q E □ S F S O E t F IS H α E Q S F £ O I L A te H Q ε Q 5 Ei S £1 lí L A 1? H G E G S F S D E L A IB H S E G S F S P E U A H G E S S F S P E L A H Q & Q S P S D E L A ?1 H G E Q -S F S 0 £ L A 22 K Q E G S F S O I L £ 23 H α E ϋ- S I* 3 0 I i Λ U H G Ê α S P 3 O ε 1 S H Q Ê. <3 S F S O E L A a® H S E 0: S F ε 0 B L 2Ϊ H C E O S- F S D E I, A a H Ç i » F S D É L S 12 η 14 IS 1« 17 1ί IS JO 21 W 23 24 T I L Β. A U A A A 0 F ; A τ I L & L L A A L Q F 1 L T 1 L % F L A A F D F i F T a L E V U A A. V & F I V T L € t L A A I Ü- P I 1 t I 1. 1 ί L A A S α P I S τ I L E I I A A 3 0 P I 5 TT I L U V Il A A S P F I S T I L E P I A A ü P F ! S T E . L E A L • A A Q D F i; O T E L E L I A A Q- D F â T 8 L e I L A A α D F E G T ( L Β. V I A A o D F I O T I I ε F L A A B □ F I O T 1 L E A L A A G P P S S T 1 L ε A L A. A A P P í A T I ε A L A A A D F $ T I t £ A Iu A A S & F I A T I ί ε A L A A A D F I 8 t 1: L ε A L A A S D F I S T Ϊ L ε A I A A 3 D F I A ΐ. 1 L S S SL A A a P F I 9 T 1 L B E aí A A A D F 6 A T ( L E A L ! A A A O F I A T 1 L E S L A A 5 O F I A τ L E S t A A A D F I A T 1 L E a L A A A D f. I S T I L E A L Λ A S D F J A 28 28 ai S3 25 30 31 -32 » W L I A T K I T P W L I L T K -I T □ W L ί Ψ T K I τ 0 W (, Ü V T I T B W «. { I Ϊ κ. t Γ G W I E S Ϊ K ί T D W I I S T κ. I T D W I I 9 T K I T 0 W I I S Γ K 1 T ύ W 1 I Q T K 1 T Q W L 1 9 T K ] T Q W L I C T K I T 0 W L I α T K 1 T D Vf L I β T K I T D W L ! S T K I T D W L I S Γ K I T D W L I A T K 1 T & W L ί A Γ ' Κ: * t α W L ί S T K t τ D IV U I λ T K I T O W L I § r K I T D W L i S T Κ, I T 0 W L i A T K * T ί) W L I A T η ί T 0 Vf L I A T K I T Q W U I A T K 1 T & W L I A T K I T O W I t A T K ί T B HM

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lsssis S-SSfcSSSs; EXEMPLO 7

TESTES PA ESTABILIDADE QUÍMICA RELATIVA

Os compostos, como listados na Tabela 3, foram dissolvidos em HCl 0,1 M a uma concentração nominal de 0,5 mM. As amostras foram 5 incubadas por 7 dias em 40 0C no escuro e depois foram diluídas a uma concentração nominal de 0,2 mg/ml e analisadas por RP-HPLC para a recuperação do pico principal, e por LC-MS para confirmação da identidade pela massa do pico principal.

Os compostos foram analisados em uma concentração nominal 10 de 0,2 mg/ml por RP-HPLC e LC-MS em uma coluna Phenomenex Gemini C18, 3 μπι, 110 Â, 3 x 150 mm com a fase móvel de 0,1 % de TFA em MQW e em MeCN desenvolvendo-se em etapas de 25 % a 48 % de MeCN durante 39 minutos. A velocidade do fluxo foi de 0,400 ml/minuto. A temperatura do forno da coluna foi de 50 °C, a temperatura do autoamostrador foi de 4 0C e a 15 detecção de UV foi medida em 220 nm.

Os resultados para a recuperação da pureza são listados na

Tabela 3.

TABELA 3

RECUPERAÇÃO DA PUREZA QUANTO AO COMPOSTO ZP

ZPn2 Recuperação (%) 2242 87 2263 95 2264 * 2266 73 2267 * 2268 * 2269 39 2270 52 2272 * * Eluído na fase de lavagem em RP-HPLC analítico. Dados

repetidos mostrados no Exemplo 7 por um método de RP-HPLC analítico modificado.

Quatro compostos (ZP2264, ZP2267, ZP2268 e ZP2272) foram eluídos mais tarde na fase de lavagem por este método analítico, e uma experiência foi repetida com estes quatro compostos por um método modificado, como descrito a seguir.

EXEMPLO 8

TESTES DE ESTABILIDADE QUÍMICA RELATIVA Os compostos listados na Tabela 4 foram dissolvidos em HCl

0,1 M a uma concentração nominal de 0,25 mM. As amostras foram incubadas 2 dias em 40 0C no escuro e depois diluídas a uma concentração nominal de 0,2 mg/ml, e analisadas por RP-HPLC quanto à recuperação do pico principal. Os compostos foram analisados em uma concentração nominal 10 de 0,2 mg/ml por RP-HPLC e LC-MS em uma coluna Phenomenex Gemini C18, 3 μηι, 110 Â, 3 x 150 mm com a fase móvel de 0,1 % de TFA em MQW e em MeCN desenvolvendo-se em etapas de 25 % a 80 % de MeCN durante 39 minutos. A velocidade do fluxo foi de 0,400 ml/minuto. A temperatura do forno da coluna foi de 50 °C, a temperatura do autoamostrador foi de 4 0C e a 15 detecção de UV foi medida em 220 nm.

Os resultados para a recuperação da pureza são listados na

Tabela 4.

TABELA 4

RECUPERAÇÃO DA PUREZA QUANTO AO COMPOSTO ZP

ZPn2 Recuperação (%) 1846 95 2264 61 2267 61 2268 62 2272 61 EXEMPLO 9

TRIAGEM IN VITRO DOS ANÁLOGOS DO GLP-2 QUANTO AO AGONISMO NO RECEPTOR DE GLP-2 RECOMBINANTEMENTE

EXPRESSO NAS CÉLULAS BHK-21*)

A triagem foi feita com o uso de células BHK21 transientemente transfectadas com o receptor de GLP-2 e a construção do gene repórter da CRE-luciferase. As curvas de resposta de dose e os valores da EC50 foram determinados com o uso de sete concentrações de 10 fM a 10 nM e pontos em triplicata para cada concentração. O peptídeo de controle foi usado em todas as placas de teste.

*) O teste foi realizado por AMRI em Budapeste, Hungria. MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e células usadas:

Frascos de cultura de Tecido Nunc ou Greiner

Placas de Petri TC de 10 cm Nunc ou Greiner (Nunc 172931)

Placas de 96 reservatórios Nunc ou Greiner para placas filhas

(Nunc 167008)

Células BHK-21 (Cl3)

Placas de 96 reservatórios brancos (PerkinElmer 6005680). Placas de reservatórios profundos para diluições (Nunc 278752)

Glasgow MEM (Sigma G5154)

DMEM livre de vermelho de fenol (Invitrogen/Gibco 31053-

028)

Soro fetal de bezerro (FCS, Invitrogen/Gibco Zealand batch) Aminoácidos não essenciais (100x) (Invitrogen/Gibco 11140-

035)

Glutamina 200 mM (100x) (Invitrogen/Gibco 25030-024) Penicilina/Estreptomicina (100x) (Invitrogen/Gibco 15140-

122)

Piruvato de sódio (100x) (Invitrogen/Gibco 11360-039)

D-PBS (Invitrogen/Gibco 14190-094)

Ix solução de Tripsina-EDTA (Invitrogen/Gibco 25300-054) Opti-MEM (Invitrogen/Gibco 31985-047)

Lipofectamina 2000 (Invitrogen 11668-027) CRE-vetor Iuc (Zealand batch) vetor hGLP2R (Zealand batch)

10 % (p/v) de BSA estéril em DMEM (Sigma 05488)

IBMX 10 mM (200x) em DMEM (Sigma 15879)

Kit LucLite (Perkin Elmer 6016911)

Topseal-A (Perkin Elmer 6005185)

Meios e tampões

Meio de crescimento para células BHK-21(C13):

Glasgow MEM + glutamina 2 mM (1:100) + 10 % de FCS + 1 % de NEAA + 1 % de Pen/Strep + piruvato de sódio 1 mM (1:100)

Meio de Transfecção livre de antibióticos para células BHK-2HC13):

Glasgow MEM + glutamina 2 mM (1:100) + 1 % de NEAA +

1 % de piruvato de sódio 1 mM (1:100)

Meio de Pós-Transfecção para células BHK-2HC13):

Glasgow MEM + glutamina 2 mM (1:100) + 0,2 % de FCS + 1

% de NEAA + 1 % de Pen/Strep + piruvato de sódio 1 mM (1:100)

Solução de revestimento:

D-PBS + 1 % de BSA Tampão de dissolução de peptídeo:

D-PBS + 0,1 % de BSA

Tampão de estimulação:

DMEM livre de vermelho de fenol + glutamina 2 mM (1:100) + IBMX 50 μΜ + 0,3 % de BSA

PROTOCOLO PARA TRIAGEM DE PEPTÍDEOS NAS CÉLULAS BHK21 (Cl3) TRANSFECTADAS

Células BHK-21 são semeadas em placas de Petri TC de 10 cm e cultivadas até 70 a 80 % de confluência. Subsequentemente, o meio é trocado por meio de transfecção livre de soro. DNA (7,5 μg de vetor receptor hGLP2 e 7,5 μg de CRE - vetor de luciferase) e Lipofectamina 2000 são diluídos em OptiMEM, combinado, e adicionado às células após 20 a 30 minutos. As células são incubadas na incubadora em 37 °C, 5 % de CO2 por 4 horas, tripsinizadas, e semeadas novamente em 35.000 células por reservatório em placas de 96 reservatórios. As células são incubadas durante a 5 noite em meio de crescimento completo de modo a possibilitar a expressão dos transgenes. Todas as placas usadas para a preparação das soluções do análogo de GLP-2 diluído são pré-revestidas com BSA 1 % em solução salina tamponada de fosfato por 2 horas, e secadas durante a noite. Os análogos de GLP-2 são dissolvidos em PBS/0,1 % de BSA a 250 μΜ e diluídos em duas 10 etapas até 10 μΜ e 100 nM, respectivamente, em meio de vermelho de fenol e livre de soro contendo inibidor da fosfodiesterase e 0,3 % de BSA (tampão de estimulação). Depois disso, os análogos de GLP-2 são diluídos em série no mesmo tampão de estimulação para produzir concentrações de 10 nM a 10 fM. A atividade de linha de referência é controlada com apenas tampão de 15 estimulação. Estas soluções são pré-aquecidas a 37 0C por 30 minutos. As células são lavadas com tampão de estimulação pré-aquecidas (37 0C), e incubadas com 100 μΐ das diluições peptídicas pré-aquecidas e controladas por 5 horas em 37 °C, 5 % de CO2. O substrato da enzima LucLite/tampão de Iise é preparado pouco antes do final da incubação. 100 μΐ de substrato de 20 LucLife são adicionados a cada reservatório, e a emissão de luz é contada em um contador adequado (por exemplo, Wallac VictorII). Os valores da EC50 são derivados dos dados brutos mediante ajuste com uma equação logística de quatro parâmetros (Microcal Origin 5.0 ou GraphPad 4).

Os resultados são listados na Tabela 5.

TABELA 5

TRIAGEM DOS ANÁLOGOS DO GLP-2 NAS CÉLULAS BHK21

EXPRESSANDO O RECEPTOR DE GLP-2

ZPID 2263 2264 2266 2267 2268 2269 2270 2272 2242

pEC50 10,84 11,5 9,253 10,87 11,21 10,04 10,23 11,27 12,41 SEM 0,1929 0,2419 0,2272 0,3139 0,2239 0,09546 0,1449 0,1668 0,1971 CONCLUSÃO: O resultado claramente indica que todos os compostos analisados são agonistas do GLP-2 EXEMPLO 10

TESTE IN VIVO. ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO INTESTINAL 5 COMO DETERMINADO EM CAMUNDONGOS C57BL MACHOS

A capacidade dos presentes compostos (ZP2264, ZP2266, ZP2267, ZP2268, ZP2242, ZP2269, ZP2270, ZP2272 e ZP2242) para estimular seletivamente a massa do intestino delgado, em relação à massa do cólon, foi determinada em camundongos C57BL machos. Grupos individuais 10 (n = 6 a 10) de camundongos receberam 800 nmol/kg de cada compostos, s.c., uma vez por dia por três dias consecutivos. Para fins de comparação, outros grupos de animais receberam ou uma dose equimolar de [Gly2]GLP-2 (ZP1559) ou veículo (solução salina tamponada de fosfato, pH 7,4) no mesmo regime de dosagem. Vinte e quatro horas após a última dose do composto ter 15 sido aplicada, os camundongos foram sacrificados e o intestino delgado (do piloro até o ceco) e o cólon (intestino distai ao ceco) foi esvaziado e pesado.Para corrigir leves diferenças no peso do corpo (BW), as massas do órgão do intestino delgado (SI) e do cólon foram expressas em relação ao BW. O composto de referência não seletivo [Gly2]GLP-2 tem sido relatado 20 estimular o crescimento gastrintestinal no esôfago, no estômago, no intestino delgado e no cólon, e avaliar diferenças no padrão de crescimento induzido pelos compostos, e o índice de sensibilidade do intestino delgado-cólon do composto X foi calculado como:

(SI/Cólon)x/(SI/Cólon)(Giy2)GLP-2 0//°

Os compostos com uma sensibilidade do intestino delgado-

cólon maior ou igual a 1,10, foram considerados relativamente seletivos para o intestino delgado. TABELA 6 LISTA PO ÍNDICE DE SENSIBILIDADE DO INTESTINO DELGADO-CÓLON DOS COMPOSTOS DE TESTE. EM RELAÇÃO AO COMPOSTO DE REFERÊNCIA FGlv21GLP-2. NT INDICA “NÃO TESTADO”. *: P < 0,05, vs [Gly2]GLP-2

Intestino delgado cólon

Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Indíoe de Sensibilidade

Composto de Referência

[Gly2]GLP-2 HGDUSFSDEMN T I L DNLAARDF I NWL I QTKI TD OH 1.00 ±0,02

índice de seiuibiiidade do inte*tiiio delgado

ZPZ264 HGEGSFSDEL A T I LEALAAADFI AWLI A. TKl TD NH2 1.15 ±0,03*

ZP2268 HGEGSFSD EL Ã T i L D N L Ã Ã R D F I S WL I S T K I T D NH2 1.10±0.03*

-J

Os TABELA 7 EFEITO DOS COMPOSTOS DE TESTE SOBRE A MASSA DO INTESTINO DELGADO E DO CÓLON. EM RELAÇÃO AO COMPOSTO DE REFERÊNCIA rGlv21GLP-2. NT INDICA ttNAO TESTADO”.

*: P <0,05, vs [Gly2]GLP-2

Posição 1 2 3 4 5 6 7 a 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 St (% vs. Cólon [Gly2]GLP-2 [Gly2JGLP-2 H G D G S F S D E M N T I L D N L A A R D F I N W L I Q T K I T D OH 100 ±1 100 ±2 ZP2263 H G E G S F S D E L S T I L E 3 L A A S D F I S W L I S T K I T D NH2 NT NT ZP2264 H G E G S F S D E L A T I L E A L A A A D F I A. W L I A T K I T D NH2 126 ±3* 109 i3* 2P2266 H G E G S F S D E L E T I L E E L A A E D F I E W L I E T K I T D NH2 95 ±1 101 ±2 ZP2267 H G E G S F S D E L S T I L D N L A A R D F I A W L I A T K I T D NH2 108 ±2 109 ±4 ZP226B H G E G S F S D E L A T I L D N L A A R □ F I S W L I S T K I T 0 NH2 124 i 3* 112 ±4* ΖΡ22Θ9 H G E G 8 F S D E L K T I L D N L A A R D F I E W L I Q T K I T D NH2 97 ±2 95 ±3 ZP2270 H G E G S F S D E L N T I L D N L A A R D F I S W L I S r K I T D NH2 NT NT ZP2272 H G E G S F S D E L A T I L D N L A A R D F I S W L I A T K I T D NH2 118±2 105 ±6 ZP2242 H G E G 8 F S S E L S T I L D A L A A R D F I A W L I A T K I T D K OH 111 ±2 107 ±3 Resultados

Os efeitos dos compostos de teste de acordo com a invenção foram determinados com base na capacidade dos peptídeos de seletivamente aumentar a massa do intestino delgado, em relação à massa do cólon. Nas Figuras 1 e 2 em relação à massa do intestino delgado vs. veículo, os controles em seguida à administração do composto de referência, [Gly2]GLP-

2 e ZP2264, ZP2266, ZP2267, ZP2268, ZP2242, ZP2269 e ZP2272, são apresentados. Nas Figuras 3 e 4, o efeito dos compostos de teste sobre a relação da massa do intestino delgado para a massa do cólon, vs. aquele do composto de referência, [Gly2]GLP-2, é mostrado. A relação da massa do intestino delgado para a massa do cólon, nos animais que receberam [Gly2]GLP-2, foi padronizada como 100 %. Os compostos de teste que foram seletivos quanto ao intestino delgado, com base no índice de sensibilidade calculado do intestino delgado-cólon, vs. aquele do composto de referência, [Gly2]GLP-2, são apresentados na Tabela 6. Nos animais que receberam [Gly2]GLP-2, o índice de sensibilidade do intestino delgado-cólon é padronizado em 1. O efeito dos compostos de teste sobre a massa do intestino delgado e do cólon, em relação ao composto de referência [Gly2]GLP-2 é apresentado na Tabela 7. Nos animais que receberam [Gly2]GLP-2, a massa do intestino delgado e do cólon foi padronizada como 100 %.

EXEMPLO 11

TESTE IN VIVO. ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO INTESTINAL DETERMINADA EM CAMUNDONGOS C57BL MACHOS.

A capacidade de outros compostos de estimularem 25 seletivamente a massa do intestino delgado, em relação à massa do cólon, foi determinada em camundongos C57BL machos. Um protocolo semelhante foi usado para aquela descrita acima no Exemplo 10, exceto que 200 nmol/kg de cada composto foram administrados por dia. Assim, grupos individuais (n = 6 a 10) de camundongos receberam 200 nmol/kg de cada composto, s.c., uma vez por dia, por três dias consecutivos. Outros grupos de animais receberam ou uma dose equimolar de [Gly2]GLP-2 (composto de referência) ou veículo (solução salina tamponada de fosfato, pH 7,4; controles negativos) no mesmo regime de dosagem. Vinte e quatro horas após a última dose do composto, os 5 camundongos foram sacrificados e o estômago, o intestino delgado e o cólon foram esvaziados e pesados.

Como mostrado na Figura 6, os compostos ZP2380, ZP2381 , ZP2384, ZP2385, ZP2397, ZP2398, ZP2399, ZP2411, ZP2417, ZP2418, ZP2420, ZP2423, de acordo com a invenção, têm a capacidade de aumentar IO seletivamente a massa do intestino delgado, em relação à massa do cólon. EXEMPLO 12

TESTE IN VIVO. ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DO ESTÔMAGO. DETERMINADO EM CAMUNDONGOS C57BL MACHOS Os efeitos dos compostos de teste de acordo com a invenção foram determinados com base na capacidade dos peptídeos de seletivamente aumentar a massa do estômago, em relação ao veículo de controle. A capacidade dos compostos presentes (ZP2395, ZP2396, ZP2400, ZP2412, ZP2394 e ZP2401) para estimular seletivamente a massa do estômago, em relação à massa do cólon, foi determinada em camundongos C57BL machos. Grupos individuais (n = 6 a 10) de camundongos receberam 200 nmol/kg de cada composto, s.c., uma vez por dia por três dias consecutivos. Para fins de comparação, outros grupos de animais receberam ou uma dose equimolar de [Gly2] GLP-2 ou de veículo (solução salina tamponada de fosfato, pH 7,4) no mesmo regime de dosagem. Vinte e quatro horas após a última dose do composto ter sido dada, os camundongos foram sacrificados e o estômago e o intestino delgado (do piloro à junção ileocecal) foram esvaziados e pesados. Para corrigir quanto à leve diferença no peso do corpo (BW), a massa orgânica do estômago é apresentada em relação do BW. Na Figura 7 é mostrado que os compostos ZP2395, ZP2396, ZP2400, ZP2412, ZP2414, ΖΡ2416, ΖΡ2394 e ΖΡ2401 têm a capacidade de aumentar seletivamente a massa do estômago em relação à massa do cólon.

O composto de referência [Gly2]GLP-2 não foi relatado como estimulando a massa estomacal, enquanto vários dos compostos ZP 5 aumentaram a massa estomacal em relação ao peso do corpo (Figura 7). Para avaliar o padrão diferencial de crescimento induzido pelos compostos ZP, em comparação com [Gly2]GLP-2, sobre o estômago, o índice de sensibilidade do estômago - cólon do composto X foi calculado como:

(Estômago\Cólon)x/Estômago/(Cólon)[Giy2]GLP-2 %

Os compostos com uma sensibilidade de estômago/cólon

maior ou igual a 1,05 foram considerados relativamente seletivos quanto ao estômago.

Os compostos ZP2267, ZP2386, ZP2404, ZP2413, ZP1415, ZP2402, ZP2403, ZP2382, ZP2266, ZP2378, ZP2414, ZP2416, ZP2424, ZP2379, ZP2269 são não seletivos quanto ao intestino delgado, o cólon ou o estômago (Figura 8).

A TABELA 8 APRESENTA UM RESUMO DOS DADOS OBTIDOS NOS EXEMPLOS 10 A 12.

TABELA 8 RESUMO DOS DADOS

Comparado a 1559 em % ZPno SIBW Cólon Sto-BW índice de índice de BW sensibilidade sensibilidade Si/Cólon Estômago/Cólon 2267 108.5 109.4 85.9 0.99 0.79 2386 113 111 95 1.02 0.86 2404 114 115 103 0.99 0.90 2402 110 113 102 0.97 0.90 2413 116 117 108 0.99 0.92 2415 106 406 100 1.00 0.94 2403 110 109 107 1.01 0.98 2382 103 106 101 0.97 0.95 2266 95.3 100.6 93.6 0.95 0.93 2378 91 97 94 0.94 0.97 2414 105 106 110 0.99 1.04 2424 86 98 91 0.88 0.93 Peptídeos não específicos 2416 89 92 96 0.97 1.04 2379 88 97 99 0.91 1.02 2269 97.4 94.7 99.8 1.03 1.05 2400 106 106 111 1.00 1.05 Peptídeos específicos do estômago 2412 94 99 106 0.95 1.07 2396 104 102 117 1.02 1.15 2395 98 97 113 1.01 1.16 2394 105 96 109 1.09 1.14 2401 98 88 107 1.11 1.22 2242 111.7 106.6 99.6 1.05 0.93 Específico do intestino delgado 2411 117 111 106 1.05 0.95 2380 108 102 98 1.06 0.96 2384 128 118 100 1.08 0.85 2268 123.6 112.5 87.4 1.10 0.78 2398 108 97 102 1.11 1.05 2420 112 101 90 1.11 0.89 2417 119 106 90 1.12 0.85 2272 118.1 104.7 96 1.13 0.92 2423 123 109 94 1.13 0.86 2264 125.7 109.5 87 1.15 0.79 2385 110 95 93 1.16 0.98 2399 119 103 115 1.16 1.12 2418 117 100 91 1.17 0.91 2381 123 104 92 1.18 0.88 2397 122 101 109 1.21 1.08 2263 NT NT NT 2270 NT NT NT 2383 NT NT NT * NT: Não Testado

ESPECIFICIDADE DO RECEPTOR DO GLP-2

Os mecanismos pelos quais os substratos parecem alcançar especificidade biológica em direção a um dado receptor envolve várias interações entre o substrato e o receptor, com base nas interações de ligação de hidrogênio, hidrofóbicas, eletrostáticas etc.

Durante nossos estudos do Relacionamento de Estrutura- Atividade, pareceu que os resíduos nas posições 11, 16, 20, 24 e 28 na seqüência de GLP-2 acham-se profundamente envolvidos no reconhecimento e ligação ao receptor do GLP-2. Assim, a alteração do padrão de aminoácidos destas posições particulares divide os análogos de GLP-2 em três diferentes grupos: peptídeos do intestino delgado, do estômago e não específicos.

A especificidade do receptor dos análogos de GLP-2 foi observada depender da hidrofobicidade e do potencial de ligação de hidrogênio dos aminoácidos nas posições 11, 16, 20, 24 e 28.

EXEMPLO 13

EFEITO PO HPI SOBRE A ESPECIFICIDADE DO INTESTINO DELGADO

Na Tabela 9, os dados do HPI é são apresentados quanto aos

peptídeos de GLP-2 que são específicos para o intestino delgado de acordo com o índice de sensibilidade de Si/Cólon.

TABELA 9

ANÁLOGOS DO GLP-2 ESPECÍFICO DO INTESTINO DELGADO - PERFIL DE HIDROFATICIDADE (ΉΡΡ)

Comparado com 1559 em % Seqüência HPI ZP SI-BW Cólon-Bw Sto-BW índice de índice de 11 16 20 24 28 11 16 20 24 28 HPP no sensibilidade sensibilidade Si/Cólon Estômago/ Cólon 2242 111.7 106.6 99.6 1.05 0.93 S A R A A -0.8 1.8 -4.5 1.8 1.8 0.1 2411 117 111 106 1.05 0.95 A A A S A 1.8 1.8 1.8 -0.8 1.8 6.4 2380 108 102 98 1.06 0 96 S S S S S -0.8 -0.8 -0.8 -0.8 -0.8 -4 2384 128 118 100 1.08 0.85 A A A A S 1.8 1.8 1.8 1.8 -0.8 6.4 2268 123.6 112.5 87.4 1.10 0.78 A A S S S 1.8 1.8 -0.8 -0.8 -0.8 1.2 2398 108 97 102 111 1 05 S A S S S -0.8 1.8 -0.8 -0.8 -0.8 -1.4 2420 112 101 90 1.11 0.89 S A A A A -0.8 1.8 1.8 1.8 1.8 6.4 2417 119 106 90 112 0.85 A A S A A 1.8 1.8 -0.8 1.8 1.8 6.4 2272 118.1 104.7 96 1.13 0.92 A S A S A 1.8 -0.8 1.8 -0.8 1.8 3.8 2423 123 109 94 1.13 0.86 A A S A A 1.8 1.8 -0.8 1.8 1.8 6.4 2264 125.7 109.5 87 1.15 0.79 A A A A A 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 9 2385 110 95 93 1.16 0.98 S A S S S -0.8 1.8 0.8 -0.8 -0.8 -1.4 2399 119 103 115 116 1.12 A S S S S 1.8 -0.8 -0.8 -0.8 1.8 6.4 2418 117 100 91 1.17 0.91 A A A S A 1.8 1.8 1.8 -0.8 1.8 6.4 2381 123 104 92 1.18 0 88 A A S S S 1.8 1.8 -0.8 -0.8 -0.8 1.2 2397 122 101 109 1.21 1.08 A A A A S 1.8 1.8 1.8 1.8 -0.8 6.4 Os dados mostram que o intervalo de HPI para as posições individuais 11, 16, 20, 24 e 28 quanto aos análogos do GLP-2 específicos do intestino delgado devem, independentemente, para as posições 11 e 16, ser de pelo menos -0,8 < HPI < 3,8 ou, preferivelmente, -0,8 < HPI < 2,8 ou, mais preferível, HPI = 1,8.

Quanto às posições 20, 24 e 28, o intervalo de HPI deve,

quanto às posições individuais, independentemente, ser de pelo menos -0,8 < HP!20,24,28 ^1,8 ou, preferivelmente, -0,8 < HPI2O ^ 1,8 e, mais preferível, HPI- 24,28 = -0,8.

Os padrões de substituição de amino possíveis para os peptídeos seletivos do intestino delgado de acordo com os intervalos de HPI, são apresentados na Tabela 10.

TABELA 10

ANÁLOGOS DE GLP-2 ESPECÍFICOS DO INTESTINO DELGADO - PERFIL DE HIDROFATICIDADE (HPP)

Análogos de GLP-2 específicos do intestino delgado HPP 11 16 20 24 28 HPP Preferido A A A A A S S S S S G G G G G T T T T T -4-9 mais A A A A A Preferido S S S S S G G G T T T -4 -9 O mais A A A A A Preferido S S S 1,2 -9 Assim, cada um dentre XlI, X16, X20, X24 e X28 pode ser

independentemente Ala, Ser, Gly ou Thr. Em particular, cada um dentre Xl 1 e Xl6 pode independentemente ser Ala ou Ser, e X20, X24 e X28 podem ser independentemente Ala, Ser, Gly ou Thr. Por exemplo, Xl I e Xl6 podem ser ambos Ala, e X20, X24 e X28 podem independentemente ser Ala, Ser, Gly ou Thr. EXEMPLO 14

EFEITO PO HPI SOBRE A ESPECIFICIDADE DO ESTÔMAGO

Na Tabela 11, os dados do HPI são apresentados para os peptídeos de GLP-2 que são específicos do estômago de acordo com os índices de sensibilidade SI do Estômago.

TABELA 11

ANÁLOGOS PE GLP-2 ESPECÍFICOS PO ESTÔMAGO - PERFIL PE HIPROFATICIPAPE (HPP)__

Comparado com 1559 em % Sec uência B [PI ZP SI- Cólon- Estômago índice de índice de 11 16 20 24 28 11 16 20 24 28 HPP no BW Bw BW Sensibilidade sensibilidade Si/Co Estômago/ Cólon 2400 106 106 111 1.00 1.05 L L S S S 3.8 3.8 0.8 0.8 0.8 5.2 2412 94 99 106 0.95 1.07 L L A A A 3.8 3.8 1.8 1.8 1.8 13 2396 104 102 117 1.02 1.15 F F S S S 2.8 2.8 0.8 0.8 0.8 3.2 2395 98 97 113 1.01 1.16 K K K K K 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 19.5 2394 105 96 109 1.09 1.14 L L S S S 3.8 3.8 0.8 0.8 0.8 5.2 2401 98 88 107 1.11 1.22 F F S S S 2.8 2.8 0.8 0.8 0.8 3.2 Os dados mostram que o intervalo de HPI para as posições

IO individuais 11, 16, 20, 24 e 28 quanto aos análogos do GLP-2 específicos do estômago devem, independentemente, para as posições 11 e 16, ser de pelo menos -3,9 < HPIiu6 ^ 3,8 ou, preferivelmente, 2,8 < HPIiu6 ^ 3,8 ou HPIiii6 = -3,9

e para as posições 20, 24 e 28, o HPI deve independentemente ser de pelo menos -3,9 < HPI20,24,28 ^ 1,8 ou preferivelmente -0,8 < HPI20,24,28

< 1,8 ou HPI20,24,28= "3,9.

Os padrões possíveis de substituições de amino de acordo com os intervalos do HPI são apresentados na Tabela 12. TABELA 12

PADRÕES POSSÍVEIS DE SUBSTITUIÇÕES DE AMINO

Análogos de GLP-2 específicos do intestino delgado HPI 11 16 20 24 28 HPP Preferido L L A A A F F S S S K K K K 13-(-16.4) mais L L Preferido F F S S S 5.2-3.2 Assim, para os compostos específicos do estômago Xll pode ser Leu, Phe ou Lys.

Xl 6 pode ser Leu, Phe ou Lys.

X20 pode ser Ala ou Ser.

X24 pode ser Ala, Ser ou Lys.

X28 pode ser Ala, Ser ou Lys.

Por exemplo, Xll e Xl6 podem independentemente ser Leu ou Phe, e X20, X24 e X28 podem ser Ser.

EFEITO DO POTENCIAL DE LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO (HBP) SOBRE A ESPECIFICIDADE DO RECEPTOR

Como mencionado anteriormente, a especificidade do receptor dos análogos de GLP-2 foi também observada ser governada pelo potencial de ligação de hidrogênio das posições acima 11, 16, 20, 24 e 28.

O potencial de ligação de hidrogênio (HBP) foi introduzido e definido quanto aos aminoácidos individuais por W. D. Stein, “The movement of molecules across cell membranes”; Academic Press N.Y. 1967, pp 65-125, e proporciona a capacidade de uma dada cadeia lateral de aminoácidos de produzir ligações de hidrogênio.

O HBP para os aminoácidos individuais são dados na Tabela 13.

TABELA 13 HBP PARA OS AMINOÁCIDOS INDIVIDUAIS

Aminoácido HBP Leu L 0 Ala A 0 Cys C 0 Gly G 0 Ile I 0 Met M 0 Phe F 0 Pro P 0 Val V 0 His H 1 Trp W 1 Lys K 2 Ser S 2 Thr T 2 Tyr Y 2 Arg R 3 Asn N 3 Asp D 3 Gln Q 3 Glu E 3 EXEMPLO 15

EFEITO DO POTENCIAL DE LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO (HBP) NA ESPECIFICIDADE DO ESTÔMAGO Exemplos de análogos específicos do estômago são

apresentados na Tabela 14.

TABELA 14

ANÁLOGOS PEPTÍDICOS DE GLP-2 ESPECÍFICOS DO ESTÔMAGO

Comparado com 1559 em % Seqüência HPI ZP no SI-BW Cólon- Estômago índice de índice de 11 16 20 24 28 11 16 20 24 28 ΣΗΒΡ Bw BW Sensibilidade sensibilidade Si/Co Estômago/ Cólon 2400 106 106 111 1.00 1.05 L L S S S 0 0 2 2 2 6 2412 94 99 106 0.95 1.07 L L A A A 0 0 0 0 0 0 2396 104 102 117 1.02 1.15 F F S S S 0 0 2 2 2 6 2395 98 97 113 1.01 1.16 K K K K K 2 2 2 2 2 10 2394 105 96 109 1.09 1.14 L L S S S 0 0 2 2 2 6 2401 98 88 107 1.11 1.22 F F S S S 0 0 2 2 2 6 0-2 0-2 0-2 0-2 0-2 0-10 De acordo com a tabela, os intervalos de HBP para as posições

individuais 11, 16, 20, 24 e 28 para os análogos de GLP-2 específicos do estômago devem, independentemente para todas as posições, ser pelo menos

< HBPi í, 16,20,24,28 ^ 2. De acordo com os intervalos de HBP, os padrões possíveis de substituições de aminoácidos são apresentados na Tabela 15. TABELA 15

PADRÕES POSSÍVEIS DE SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS

Análogos de GLP-2 es pecíficos do intestino delgado HPP 11 16 20 24 28 Preferido L L A A A F F S S S K K K K HBP 0-2 0-2 0-2 0-2 0-2 mais L L K K Preferido F F S S S HBP 0 0 2 2 2 Os mais L L S S S preferidos F F HBP 0 0 2 2 2 Análogos preferidos específicos do estômago são os análogos de GLP-2 com intervalos de HBP para as posições 11 e 16 de HBPj U6 = Oe para as posições 20, 24 e 28 de independentemente 0 < HBP20,24,28 ^ 2.

Certos análogos de GLP-2 específicos do estômago são como

segue:

Xll pode ser Leu, Phe ou Lys.

Xl6 pode ser Leu, Phe ou Lys.

X20 pode ser Ala ou Ser.

X24 pode ser Ala, Ser ou Lys.

X28 pode ser Ala, Ser ou Lys.

Por exemplo, Xll e Xl6 podem ser independentemente Leu ou Phe5 X24 e X28 podem independentemente ser Lys ou Ser, e X20 pode ser Ser.

EXEMPLO 16

EFEITO DO POTENCIAL DE LIGAÇÃO DE HIDROGÊNIO (HBP) SOBRE A ESPECIFICIDADE DO INTESTINO DELGADO

Os análogos de GLP-2 específicos do intestino delgado foi também observado ser governado pelos parâmetros como o potencial de ligação de hidrogênio das posições particulares acima mencionadas 11, 16,

20, 24 e 28. O HBP pra os aminoácidos individuais são dados na Tabela 16. TABELA 16

Comparado com 1559 em % Sec uência Wl ZP SI- Cólon- Sto- índice de índice de 11 16 20 24 28 11 16 20 24 28 ΣΗΒΡ no BW Bw BW Sensibilidade sensibilidade Si/Co Estômago/ Cólon 2242 111.7 106.6 99.6 1.05 0.93 S A R A A 2 0 3 0 0 5 2411 117 111 106 1.05 0.95 A A A S A 0 0 0 2 0 2 2380 108 102 98 1.06 0.96 S S S S S 2 2 2 2 2 10 2384 128 118 100 1.08 0.85 A A A A S 0 0 0 0 2 2 2268 123.6 112.5 87.4 1.10 0.78 A A S S S 0 0 2 2 2 6 2398 108 97 102 1.11 1.05 S A S S S 2 0 2 2 2 8 2420 112 101 90 1.11 0.89 S A A A A 2 0 0 0 0 2 2417 119 106 90 1.12 0.85 A A S A A 0 2 0 2 0 2 2272 118.1 104.7 96 1.13 0.92 A S A S A 0 0 2 0 0 4 2423 123 109 94 1.13 0.86 A A S A A 0 0 0 0 0 2 2264 125.7 109.5 87 1.15 0.79 A A A A A 2 0 2 2 2 0 2385 110 95 93 1.16 0.98 S A S S S 0 2 2 2 2 8 2399 119 103 115 1.16 1.12 A S S S S 0 2 2 2 2 8 2418 117 100 91 1.17 0.91 A A A S A 0 0 0 2 0 2 2381 123 104 92 1.18 0.88 A A S S S 0 0 2 2 2 6 2397 122 101 109 1.21 1.08 A A A A S 0 0 0 0 2 2 0-2 0-2 0-3 0-2 0-2 0-11 De acordo com a tabela, os intervalos do HBP para as posições

individuais 11, 16, 20, 24 e 28 para os análogos de GLP-2 específicos do intestino delgado devem, independentemente para todas as posições, ser pelo menos 0 < HBPiu6,20,24,28 ^ 2.

Os análogos preferidos têm o intervalo de HBP para as

posições 11 e 16 HBPnjI6 = 0 e as posições 20, 24 e 28 têm independentemente o intervalo de HBP de 0 < HBP20,24,28 ^ 2.

Análogos de GLP-2 mais preferidos apresentando especificidade do intestino delgado são peptídeos com um intervalo de HBP para as posições 11 e 16 de HBPi i;i6 = 0, HBP20 = 0 a 2, e HBP24,28 — 2. Certos padrões de substituição são assim apresentados na Tabela 17.

TABELA 17

PEPTÍDEOS DE ESPECIFICIDADE DO INTESTINO DELGADO

Análogos de GLP-2 específicos do intestino delgado HPP 11 16 20 24 28 Preferido A A A A A S S S S S G G G G G T T T T T HBP 0-2 0-2 0-2 0-2 0-2 mais A A A A A Preferido S S S S S G G G T T T HBP 0-2 0-2 0-2 0-2 0-2 Os mais A A A A A preferidos S S S G G G T T T HBP 0 0 0-2 0-2 0-2 Assim sendo, nos compostos seletivos do intestino delgado,

cada um dentre Xl I, Xl6, X20, X24 e X28 pode independentemente ser Ala, Ser, Gly ou Thr. Por exemplo, cada um dentre Xll e Xl6 pode independentemente ser Ala ou Ser, e X20, X24 e X28 podem independentemente ser Ala, Ser, Gly ou Thr. Por exemplo, Xl I e Xl6 podem 10 ser, ambos, Ala, e X20, X24 e X28 podem independentemente ser Ala, Ser, Gly ou Thr.

Embora a invenção tenha sido descrita em combinação com as formas de realização de exemplo descritas acima, muitas modificações e variações equivalentes serão evidentes àqueles habilitados na técnica quando 15 da interpretação deste relatório descritivo. Consequentemente, as formas de realização de exemplo da invenção apresentadas são consideradas como sendo ilustrativas, e não limitativas. Várias modificações das formas de realização descritas podem ser feitas sem que se afaste do espírito e do escopo da invenção. Todos os documentos aqui citados são expressamente 20 incorporados como referência.

Claims

1. Peptídeo 2 tipo-glucagon (GLP-2), caracterizado pelo fato de que é representado pela Fórmula geral I: R1 -Zl-His-Xl-XS-Gly-XS -X6-X7-X8-X9-XIO-X Il-X 12-X13- Xl 4-X15-X16-X17-X18-XÍ9-X20-X21 -Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ue-X28-Thr- Ly s-X31-X32-X33-Z2-R2 em que: R1 é hidrogênio, alquila Cm (Por exemplo metila), acetila, formila, benzoila ou trifluoroacetila; X2 é Gly5 Ala ou Sar; X3 é Glu ou Asp; X5 é Ser ou Thr; X6 é Phe ou Pro ou uma substituição conservativa; X7 é Ser ou Thr; X8 é Asp ou Ser ou uma substituição conservativa; X9 é Glu ou Asp ou uma substituição conservativa; XlO é Met, Leu, Nle ou um aminoácido de substituição de Met oxidativamente estável; Xll é Yl; Xl2 é Thr ou Lys ou uma substituição conservativa; Xl3 é He, Glu ou Gln ou uma substituição conservativa; Xl4 é Leu, Met ou Nle ou uma substituição conservativa; Xl5 é Asp ou Glu ou uma substituição conservativa; X16 é Y2; Xl7 é Leu ou Glu ou uma substituição conservativa; Xl8 é Ala ou Aib ou uma substituição não conservativa; Xl9 é Ala ou Thr ou uma substituição conservativa; X20 é Y3; X21 é Asp ou Ile ou uma substituição conservativa; Χ24 é Y4; X28 é Y5; X31 é Pro, Ue ou deletado; X32 é Thr ou deletado; X33 é Asp, Asn ou deletado; R2 é NH2 ou OH; em que Z1 e Z2 são independentemente ausentes ou uma seqüência de peptídeos de I a 10 unidades de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met Om; e o perfil de hidrofaticidade (HPP) dos resíduos XlI, Xl6, X20, X24, X28 de fórmula I calculados como HPP = Σ hpixn + hpixi6 + Iipix20 + hpiX24 + hpiX28 é > -10 em que Yi, Y2, Y4 e Y5 podem individualmente ser selecionados do grupo consistindo de Asn, Asp, Glu, Gin, Lys, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Vai, Met ou Phe; e Y3 pode ser selecionado do grupo consistindo de Asn, Asp, Glu, Gin, His, Arg, Ala, Ser, Thr, Pro, Gly, Leu, Ile, Vai, Met ou Phe; com a condição de que, quando X20 seja Arg, então Xl 1 será Ser, Xl6 será Ala, X24 será Ala, X28 será Ala e Z2 será Lys, ou um seu sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis.

2. Análogo de peptídeo 2 tipo-glucagon (GLP-2) como definido na reivindicação 1. caracterizado pelo fato de que o HPP é > -4.

3. Análogo de peptídeo 2 tipo-glucagon (GLP-2) como definido na reivindicação 1. caracterizado pelo fato de que HPPI > 0.

4. Análogo de peptídeo 2 tipo-glucagon (GLP-2), caracterizado pelo fato de ser representado pela Fórmula geral II: R1-Z1 -His-X2-X3 -Gly-X5 -X6-X7-X8-X9-X IO-Xll-Xl 2-X13 - Χ14-Χ15 -X16-Χ17 -Ala-X 19-Χ20-Χ21 -Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr- Lys-X31-X32-X33-Z2-R2 em que: R1 é hidrogênio, alquila Ομ (por exemplo metila), acetila, formila, benzoila ou trifluoroacetila; X2 é Gly5 Ala ou Sar X3 é Glu ou Asp X5 é Ser ou Thr X6 é Phe ou Pro X7 é Ser ou Thr X8 é Asp ou Ser X9 é Glu ou Asp XlO é Met, Leu, Nle ou um aminoácido de substituição de Met oxidativamente estável; Xl 1 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou Val Xl2 é Thr ou Lys Xl 3 é Ile, Glu ou Gln Xl4 é Leu, Met ou Nle X15éAspouGlu Xl6 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou Val Xl7 é Leu ou Glu Xl8 é Ala ou Aib X19 é AlaouThr X20 é Asn, Arg, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe Ser, Thr ou Val X21 é Asp ou Ile X24 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou Val Χ28 é Asn, Ala, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe Ser, Thr ou Val X31 é Pro, Ile ou deletado X32 é Thr ou deletado X33 é Asp, Asn ou deletado R2 é NH2 ou OH; Z1 e Z2 são independentemente ausentes ou uma seqüência de peptídeos de I a 10 unidades de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gin, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met e Om; ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis do mesmo com a condição de que, quando X20 seja Arg, então Xl 1 será Ser, Xl 6 será Ala, X24 será Ala, X28 será Ala e Z2 será Lys.

5. Peptídeo 2 tipo-glucagon GLP (GLP-2) de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que: Xl 1 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val Xl6 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val X20 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val X24 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val X28 é Ala, Gly, Ile, Leu, Phe Ser, Thr ou Val

6. Peptídeo 2 tipo-glucagon GLP (GLP-2) de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Xl 1 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val Xl6 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val X20 é Ala, He, Leu, Phe ou Val X24 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val X28 é Ala, Ile, Leu, Phe ou Val

7. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos 60 % de identidade de seqüência de aminoácidos ao GLP-2 do tipo selvagem (1 a 33) e tem a atividade biológica de causar um aumento na massa intestinal in vivo.

8. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende mais do que uma das substituições nas posições XlI, Xl6, X20, X24 e/ou X28 e/ou uma ou mais das referidas substituições em combinação com uma ou mais substituições nas posições X3, X5, X7 e/ou X10.

9. Análogo de GLP-2 de acordo com as reivindicações 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que as referidas substituições na posição XlO é Leu, Nle, ou um aminoácido de substituição Met oxidativamente estável, tal como Met(O) ou Met(O)2.

10. Análogo de GLP-2, caracterizado pelo fato de ser definido pela fórmula geral III: Rl-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-X8-Glu-Leu-Xl I-Thr-Ile- Leu-X 15 -X16-Leu-Ala-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X2 8-Thr- Lys-Ile-Thr-Asp-NH2; em que R1 é hidrogênio, alquila C1.4 (por exemplo metila), acetila, formila, benzoila ou trifluoroacetila X8 é Asp ou Ser, preferivelmente Asp; Xl 1 é Ser, Ala, Glu, Lys ou Asn; Xl 5 é Glu ou Asp, preferivelmente Glu; Xl6 é Ser, Ala ou Glu; X20 é Ser, Ala ou Glu; X24 é Ser, Ala ou Glu; e X28 é Ser, Ala, Gln ou Glu; ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

11. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é apresentado na Tabela 1 e na Tabela 2 neste relatório descritivo, ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

12. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é:2263HGEGSFSDELSTILESLAASDFIS wlistkitd-nh2 2264hgegsfsdelatileal AAADFiA Wliatkitd-NH2 2266HGEGSFSDELETILEELAAEDFIE WlieTKITD-NH2 2267HGEGSFSDELSTILESLAAADFIA WliaTKITD-NH2 2268HGEGSFSDELATILEAL aasdfis wlistkitd-nh2 2269hgegsfsdelktileslaaadfie wliqtkitd-nh2 2270HGEGSFSDELNTILESLAASDFISWLISTKITD-NH2 2272HGEGSFSDELATILESLAAADFIS Wliatkitd-NH2 2242HGEGSFSSELSTILDAL AARDFIA WLIATKITDK-OH

13. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende mais do que uma das substituições nas posições X3, X5, X7, Xl I, Xl6, X20, X24, X28, X31, X32 e/ou X33.

14. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais das substituições selecionadas de Xl I, X16, X20, X24, X28, isto é Ile, Ala, Leu, Phe ou Vai; e os resíduos de aminoácidos nas posições X31, X32 e X33 são opcionalmente deletados; ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

15. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que possui uma substituição em uma ou mais das posições Xl I, X16, X20, X24 e/ou X28.

16. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 1, a reivindicação 4 ou a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que cada um dentre Xl I, Xl6, X20, X24 e X28 é independentemente selecionado de Ala, Ser, Gly e Thr, e em que o análogo tem atividade de promoção do crescimento preferencial para o intestino delgado, sobre o cólon.

17. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que cada um dentre Xll e X16 é independentemente selecionado de Ala e Ser, e X20, 24 e 28 são independentemente selecionados de Ala, Ser, Gly e Thr.

18. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que Xll e Xl6 são ambos Ala, e X20, X24 e X28 são independentemente selecionados de Ala, Ser, Gly e Thr.

19. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que Xl I e Xl6 são ambos Ala, e X20, X24 e X28 são independentemente selecionados de Ala e Ser.

20. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende uma das seguintes combinações de resíduos nas posições Xl 1, X16, X20, X24 e X28: Ser/Ser/Ser/Ser/Ser; Ala/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Ala/Ala/Ser, Ser/Ala/Ser/Ser/Ser, Ala/Ala/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ser/Ala/Ala; Ser/Ala/Ala/Ala/Ala; Ser/Ala/Arg/Ala/Ala; Ala/Ser/Ala/Ser/Ala; Ala/Ala/Ala/Ala/Ala.

21. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser ZP2264, ZP2268, ZP2242, ZP2272, ZP2411, ZP2380, ZP2384, ZP2398, ZP2417, ZP2423, ZP2385, ZP2399, ZP2418, ZP2381, ZP2420 e ZP2397.

22. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 1, reivindicação 4 ou reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: Xl 1 é selecionado de Leu, Phe e Lys; Xl6 é selecionado de Leu, Phe e Lys; Χ20 é selecionado de Ala, Ser, Leu, Gly e Thr; X24 é selecionado de Ala e Ser; X28 é selecionado de Ala, Ser ou Lys; e em que o análogo tem atividade de promoção do crescimento preferencial no estômago, em comparação com o cólon.

23. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que Xll e Xl6 são independentemente selecionados de Leu e Phe, X24 e X28 são independentemente selecionados de Lys e Ser, e X20 é Ser.

24. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que Xll e Xl6 são independentemente selecionados de Leu e Phe, e X20, X24 e X28 são Ser.

25. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende uma das seguintes combinações de resíduos nas posições Xl I, Xl6, X20, X24 e X28: Lys/Lys/Lys/Lys/Lys; Phe/Phe/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Ser/Ser/Ser; Leu/Leu/Al a/A 1 a/Al a.

26. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que é ZP2400, ZP2412, ZP2396, ZP2394, ZP2401 ou ZP2395.

27. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os intervalos de HBP para as posições individuais 11, 16, 20, 24 e 28 para os análogos de GLP-2 específicos do intestino delgado, devem, independentemente quanto a todas as posições, ser de pelo menos 0 < HBP11j16j20j24,28 ^ 2.

28. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o intervalo de HBP para as posições 11 e 16 é HBPnjl6 = 0, e as posições 20, 24 e 28 têm independentemente o intervalo de HBP de 0 ^ HBP2Q,24,28 — 2.

29. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que os intervalos de HBP para as posições individuais 11, 16, 20, 24 e 28 quanto aos análogos de GLP-2 específicos do estômago, devem, independentemente para todas as posições, ser de pelo menos 0 < HBP11,16,20,24,28 ^ 2.

30. Análogo de GLP-2 de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que os intervalos de HBP para as posições 11 e 16 de HBPii5I6 = Oe para as posições 20, 24 e 28 independentemente de 0 < HBP20,24,28 ^ 2.

31. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, ou um seu sal ou derivado, em mistura com um carreador.

33. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o análogo de GLP-2 é um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável.

34. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação32 ou a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que é formulada como um líquido adequado para administração por injeção ou por infusão, ou de que é formulada para produzir liberação lenta do referido análogo de GLP-2.

35. Uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção de um distúrbio relacionado ao estômago e aos intestinos.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e aos intestinos é constituído de úlceras, síndrome de Zollinger-Ellison, distúrbios da digestão, síndromes de má absorção, síndrome do intestino curto, síndrome do beco-sem-saída, doença inflamatória intestinal, espru celíaco (por exemplo, surgindo da enteropatia induzida pelo glúten ou doença celíaca), espru tropical, espru hipogamaglobulinêmico, enterite, enterite regional (doença de Crohn), colite ulcerativa, dano do intestino delgado ou síndrome de intestino curto.

37. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e ao intestino é enterite de radiação, enterite infecciosa ou pós-infecciosa, ou dano do intestino delgado devido a agentes tóxicos ou a outros agentes quimioterápicos.

38. Uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção de um efeito colateral do tratamento de quimioterapia ou de radiação.

39. Uso de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o efeito colateral da quimioterapia é diarréia, câimbra abdominal, vômito ou dano estrutural e funcional do epitélio intestinal resultante do tratamento de quimioterapia.

40. Uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga para o tratamento de condições mediadas pela osteoporose ou DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV) de recém- nascidos.

41. Uso de um análogo de peptídeo-2 tipo-glucagon (GLP-2)de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma droga para o tratamento e/ou a prevenção de uma condição envolvendo a desnutrição.

42. Uso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a condição envolvendo desnutrição é caquexia ou anorexia.

43. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de ácido nucléico codificando um análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26.

44. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de ácido nucléico como definida na reivindicação 40, em combinação com as seqüências de controle para sua expressão dirigida.

45. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser transformada com o vetor de expressão como definido na reivindicação 34.

46. Método para produzir o análogo de peptídeo-2 tipo- glucagon (GLP-2) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar as células hospedeiras como definidas na reivindicação 41, sob condições adequadas para expressar o análogo de GLP-2 e purificar o análogo de GLP-2 assim produzido.

47. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação43, um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 44, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 41, caracterizados pelo fato de serem para uso em terapia.

48. Uso de uma molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 43, de um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 40, ou de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma droga para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio relacionado ao estômago e ao intestino, ou para o tratamento e/ou prevenção de um efeito colateral do tratamento de quimioterapia ou de radiação, ou para o tratamento de condições mediadas pela osteoporose ou DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV) de recém-nascidos.

49. Método para tratar um distúrbio do estômago e dos intestinos em um paciente em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 43, um vetor de expressão como definido na reivindicação 44, ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação 45.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e aos intestinos é constituído de úlceras, síndrome de Zollinger-Ellison, distúrbios da digestão, síndromes de má absorção, síndrome de intestino curto, síndrome do beco- sem-saída, doença inflamatória intestinal, espru celíaco (por exemplo surgindo da enteropatia induzida pelo glúten ou doença celíaca), espru tropical, espru hipogamaglobulinêmico, enterite, enterite regional (doença de Crohn), colite ulcerativa, dano do intestino delgado e síndrome de intestino curto.

51. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e aos intestinos é a enterite de radiação, a enterite infecciosa ou pós-infecciosa, ou o dano do intestino delgado devido a agentes tóxicos ou outros agentes quimioterápicos.

52. Método de tratar ou prevenir um efeito colateral da quimioterapia ou da terapia de radiação a um paciente em necessidade deste tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 43, um vetor de expressão como definido na reivindicação 44, ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação 45.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o efeito colateral da quimioterapia é diarréia, câimbra abdominal, o vômito ou o dano estrutural e funcional do epitélio intestinal resultante do tratamento de quimioterapia.

54. Método para tratar um distúrbio de recém-nascidos, obesidade, osteoporose ou condições mediadas pela DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV) em um paciente em necessidade deste tratamento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 43, um vetor de expressão como definido na reivindicação 44, ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação 45.

55. Kit terapêutico, caracterizado pelo fato de que compreende uma droga de quimioterapia do câncer e um análogo de GLP-2 como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 43, um vetor de expressão como definido na reivindicação 44, ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação 45, cada um opcionalmente em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

56. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma droga de quimioterapia do câncer e um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 43, um vetor de expressão como definido na reivindicação 44, ou uma célula hospedeira como definida na reivindicação 45 em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.