BRPI0718577A2

BRPI0718577A2 - Ácido hialurônico reticulado e processo de preparação deste

Info

Publication number: BRPI0718577A2
Application number: BRPI0718577-4A
Authority: BR
Inventors: Jerome Asius; Nicolas Riviere; Benedicte Asius
Original assignee: Stiefel Laboratories
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2007-10-25
Publication date: 2014-03-11
Also published as: AU2007316520B2; KR20090109084A; CA2668650C; RU2009120214A; FR2908415A1; JP5389661B2; MX2009004969A; CN101611063B; CA2668650A1; FR2908415B1; CN101611063A; EP2094736A1; WO2008056069A1; US20090263447A1; KR101478849B1; RU2456299C2; JP2010509425A; AU2007316520A1

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para “ÁCIDO HIALURÔNICO RETICULADO E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DESTE”.

Esta invenção se refere a um novo ácido hialurônico reticulado, bem como ao processo para preparação deste e a usos deste, em especial a usos cosméticos.

O ácido hialurônico é um polissacarídeo consistindo de unidades de ácido D-glucurônico e unidades de N- acetil-D-glucosamina, que é particularmente conhecido por ser usado na cirurgia de reparo ou cirurgia ocular, ou então na área estética como um produto para preencher rugas. Na última aplicação, em particular, o ácido hialurônico é preferido aos demais produtos de preenchimento devido a sua biocompatibilidade e a suas propriedades físico-químicas. No entanto, ele tem a desvantagem de se degradar rapidamente, dessa forma exigindo injeções repetidas. A fim de solucionar essa desvantagem, foram propostos vários processos para reticular o ácido hialurônico, com o objetivo de toma-lo menos sensível a vários fatores de degradação, tais como ataques enzimáticos e/ou bacterianos, temperatura e radicais livres, e, portanto, de melhorar sua resistência à degradação in vivo e, conseqüentemente, sua duração de ação. Esses processos envolvem, em particular, a eterificação, esterificação ou imidação das funções hidroxila e/ou ácido do ácido hialurônico natural.

No entanto, os processos da técnica anterior para reticulação do ácido hialurônico, em particular por amidação, apresentam a desvantagem de produzirem derivados do ácido hialurônico difíceis de se formular e injetar por seringa em um meio aquoso e/ou insuficientemente resistentes aos fatores de degradação, em particular após a esterilização do produto.

Isso é verdadeiro para o ácido hialurônico

insolúvel em água preparado de acordo com o pedido US 2001/0393369 por reação, em um meio ácido, do ácido hialurônico com um agente ativador, tal como l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e um nucleófilo, que ío pode ser uma polilisina.

De fato, supõe-se que, a um pH igual ou inferior a 7, a reação de amidação esperada compita com uma reação de esterificação intramolecular que resulta na auto-reticulação do álcool primário carregado pelo ácido hialurônico no éster de ácido 15 hialurônico ativado. Tal reação parasita é em particular refletida por um aumento considerável na viscosidade (solidificação) e na opacificação da mistura de reação, que está, portanto, na forma de uma mistura heterogênea de água e polímero insolúvel. Toma-se então impossível formular o ácido hialurônico obtido.

Além disso, o pedido EP-I 535 952 revela um

revestimento consistindo de ácido hialurônico reticulado formado in situ reagindo uma polilisina com ácido hialurônico na presença de EDC e NHS a um pH variando de 2 a 9, e de preferência, de 4 a 7,5. O item provido de tal revestimento pode ser, em particular, 25 uma prótese a ser utilizada em cirurgia estética. Esse documento não revela o ácido hialurônico reticulado precipitado em um solvente orgânico de modo a estar disponível na forma seca e ser, dessa forma, capaz de ser formulado como um hidrogel extemporaneamente.

Além do mais, a patente US-6,630,457 descreve um ácido hialurônico modificado preparado pela reação de uma amina primária em um ácido hialurônico ativado por uma carbodiimida, tal como EDC, e um derivado de N- hidroxisulfosuccinimida, tal como NHS, a um pH variando de 7,0 a 8,5. O composto obtido pode ser reticulado sob condições fisiológicas, por exemplo, com glutaraldeído, de modo a obter um hidrogel que permanece sensível a glicosidases e se degrada substancialmente inteiramente em menos de 50 horas. Essas cinéticas de degradação são compatíveis com o uso sob consideração como um vetor para células e fatores de crescimento, mas não são adequadas para uso como um material de enchimento na cirurgia estética, por exemplo.

Por fim, o pedido WO 2006/021644 descreve um processo para preparação do ácido hialurônico reticulado pela ativação do ácido hialurônico com um agente de acoplamento, tal 20 como EDC, e um catalisador, tal como NHS, seguido de uma reação com um polipeptídeo, tal como dilisina, a um pH variando de 4 a 10, isto é, de 4 a 6. O pH pode ser opcionalmente aumentado, ao término da reação, até um valor variando de 6 a 7, de modo a aumentar o rendimento da extração durante a fase de 25 precipitação. Dessa forma, ou a reticulação é realizada em um meio ácido, que é então opcionalmente neutralizado, ou é realizada em um meio básico, sem modificação subseqüente do pH.

0 titular descobriu que o uso de um pH ácido durante a fase de reação nem sempre é favorável à reação de 5 amidação e pode, como indicado acima, resultar em reações parasitas, em particular reações de esterificação intramolecular, capazes de afetar as propriedades físico-químicas do produto obtido.

Portanto, persiste a necessidade de propor um ío ácido hialurônico reticulado que possa ser obtido na forma seca, e então rapidamente reformulado em um meio aquoso de modo a formar um hidrogel com propriedades físico-químicas apropriadas, refletidas, em particular, por um módulo elástico G e um ângulo de perda delta menor do que 30, o referido hidrogel podendo por si mesmo ser sujeito a um tratamento térmico, em particular um tratamento de esterilização, para que possa ser usado na fabricação de um implante, por si mesmo suficientemente estável em relação aos vários fatores de degradação, como ataques enzimáticos e/ou bacterianos, temperatura e radicais livres, de modo a não se ressorver completamente in vivo em menos de 4 meses.

Agora, o titular descobriu, totalmente por acaso, que o pH da precipitação, em um solvente orgânico, do ácido hialurônico reticulado com um polipeptídeo, determina suas propriedades reológicas e sua sensibilidade contra fatores de degradação, como a temperatura, radicais livres e enzimas, tais como hialuronidases. Após muitos experimentos, o titular identificou subseqüentemente as condições ideais de precipitação para obter um ácido hialurônico reticulado relativamente insensível à degradação térmica, isto é, conservando suas 5 propriedades reológicas após a resolubilização do composto precipitado e a esterilização. Logo, é como se o ácido hialurônico reticulado, uma vez reformulado, conservasse uma “memória” de sua organização molecular no momento da precipitação. Além do mais, foi demonstrado que essa disposição molecular também 10 afetou a capacidade de resolubilização do polímero.

Sem necessariamente se limitar a essa teoria, supõe-se que o processo mencionado acima tome possível densificar e solidificar a rede macromolecular do ácido hialurônico, não apenas através de ligações covalentes com o 15 agente de reticulação, mas também por meio de interações iônicas e/ou ligações de hidrogênio que se desenvolvem no momento da precipitação.

Portanto, a presente invenção tem por objetivo um ácido hialurônico reticulado que possa ser obtido de acordo com um processo que inclui:

ativar o ácido hialurônico usando um agente de acoplamento e um agente de acoplamento auxiliar de modo a obter um ácido hialurônico ativado,

reagir o referido ácido hialurônico ativado com um agente de reticulação compreendendo pelo menos 50% em peso de oligopeptídeo ou polipeptídeo, em um meio de reação ajustado para um pH variando de 8 a 12, de modo a obter um ácido hialurônico reticulado,

ajustar o pH do meio de reação para um valor variando de 5 a 7,

- precipitar o ácido hialurônico reticulado em

um solvente orgânico para obter fibras de ácido hialurônico reticulado, e

opcionalmente, secar as fibras de ácido hialurônico reticulado assim obtidas.

O ácido hialurônico reticulado obtido de acordo

com a invenção é hidrossolúvel. Essa expressão quer dizer que Ig das referidas fibras desidratadas obtidas conforme descrito acima se desagregam dentro de poucos minutos e são completamente solubilizadas em um litro de solução salina após algumas horas sem agitação.

O ácido hialurônico usado no processo acima é geralmente utilizado no estado natural, isto é, como naturalmente presente em um organismo vivo ou excretado pelas bactérias quando produzido por fermentação bacteriana. Geralmente, ele 20 tem, portanto, uma massa molecular variando de 500.000 a 7.000.000 Daltons e é normalmente usado na forma de um sal de sódio.

O ácido hialurônico é ativado antes da reticulação, usando um agente de acoplamento e um agente de acoplamento auxiliar. Exemplos de agentes de acoplamento incluem carbodiimidas hidrossolúveis, como l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), l-etil-3-(3- trimetilaminopropil) carbodiimida (ETC) e l-ciclohexil-3-(2- 5 morfolinoetil) carbodiimida (CMC), bem como sais e misturas dos mesmos. A EDC é preferencialmente utilizada nesta invenção.

Exemplos de agentes de acoplamento auxiliares incluem N-hidroxisuccinimida (NHS), N-hidroxibenzotriazol 10 (HOBt), 3,4-diidro-3-hidroxi-4-oxo-l,2,3-benzotriazol (HOOBt), l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HAt) e N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) e misturas dos mesmos. Sem se limitar à escolha da NHS, esta é preferencialmente usada nesta invenção.

O papel do agente e do agente de acoplamento auxiliar é ilustrado no Exemplo 1 daqui em diante.

De acordo com a invenção, a razão molar do agente de acoplamento para as unidades de ácido carboxílico do ácido hialurônico está preferencialmente entre 2% e 200%, mais preferencialmente entre 5% e 100%.

Além disso, a razão molar do agente de

acoplamento auxiliar para o agente de acoplamento está vantajosamente entre 1:1 e 3:1, de preferência entre 1,5:1 e 2,5:1, sem a isto se limitar, e mais preferencialmente, é igual a 2.

A reação para ativar o ácido hialurônico com o agente de acoplamento pode ser realizada a um pH variando, por exemplo, de 3 a 6, de preferência de 4 a 5. A concentração do ácido hialurônico no meio de reação está, por exemplo, entre 0,1% e 5% em peso, por exemplo, entre 0,1% e 1% em peso, sem a isto se limitar.

O agente de reticulação compreende pelo menos 5 50% em peso, e vantajosamente consiste de um oligopeptídeo ou polipeptídeo que pode ser um homo- ou co-polipeptídeo aleatório, em bloco, segmentado, enxertado ou em estrela. O agente de reticulação é geralmente um sal, e em particular um cloridrato ou opcionalmente um bromidrato, ou particularmente um ío trifluoracetato.

Exemplos de polipeptídeos que podem ser usados na presente invenção incluem homo- e copolímeros de lisina, histidina e/ou arginina, em particular polilisinas contendo pelo menos duas, ou até mesmo pelo menos cinco unidades de 15 lisina, tal como dilisina, polihistidinas e poliargininas, sem se limitar a essa lista. Esses aminoácidos podem ser na forma D e/ou na forma L. A dilisina e seus sais, e também seus derivados, são preferidos para uso nesta invenção.

De acordo com a invenção, o número de funções amina do polipeptídeo envolvido representa de 1% a 100%, de preferência de 10% a 50%, do número de funções ácido carboxílico do ácido hialurônico envolvido.

Em uma primeira variante preferida da invenção, o agente de acoplamento é usado em quantidade estequiométrica em relação às funções amina do agente de reticulação. Dessa forma, ao término da primeira etapa do processo de acordo com a invenção, a quantidade de funções ácido carboxílico ativadas do ácido hialurônico é igual à quantidade de funções amina que serão adicionadas na segunda etapa.

Em uma segunda variante da invenção, o agente

de acoplamento é usado em quantidade estequiométrica em relação às funções ácido carboxílico do ácido hialurônico. Neste caso, ao término da primeira etapa do processo de acordo com a invenção, todas as funções ácido carboxílico do ácido hialurônico 10 são ativadas e a quantidade de agente de reticulação usada na segunda etapa pode, por exemplo, ser menor do que 30%, de preferência menor do que 10%, ou até mesmo aproximadamente 5% (pelo número de mols do agente de reticulação para o número de mols de funções ácido carboxílico).

A reação de reticulação é geralmente realizada

sob condições de temperatura e duração totalmente convencionais aos versados na técnica, por exemplo, a uma temperatura de 0 a 45 °C, de preferência 5 a 25 0C por 1 a 10 h, de preferência 1 a 6 h. A fim de promover a formação de ligações amina, o pH da 20 reação varia entre 8 e 12, e de preferência, entre 8 e 10 (sem a isto se limitar). O referido pH pode ser ajustado usando qualquer base, de preferência uma base fracamente nucleofílica, por exemplo, uma amina, tal como diisopropiletilamina (DIEA).

Essa reação é normalmente realizada em um solvente, tal como uma solução aquosa de cloreto de sódio. A concentração do ácido hialurônico no meio de reação está, por exemplo, entre 0,01% e 5% em peso, por exemplo, entre 0,1% e 1% em peso, sem a isto se limitar.

Após a reação, o pH do meio de reação é ajustado para um valor variando de 5 a 7, e de preferência de 5,5 a

7, usando qualquer ácido, tal como ácido clorídrico, antes de o ácido hialurônico reticulado obtido ser precipitado. A etapa de precipitação é realizada em um solvente orgânico, tal como etanol, isopropanol, éter ou acetona, ou misturas dos mesmos, por 10 exemplo, o etanol sendo preferido na presente invenção. O solvente é vantajosamente usado em quantidades que representam de 5 a 20 vezes, por exemplo, aproximadamente 10 vezes o volume do meio de reação.

Uma etapa opcional de secagem é então preferencialmente realizada de modo a obter uma forma desidratada do ácido hialurônico reticulado, cuja manipulação e estocagem são mais fáceis. A estocagem pode ser realizada, em particular, sob condições de frio negativo.

A matéria da invenção é também o processo para produzir um ácido hialurônico reticulado, como descrito acima.

Esse processo também pode compreender outras etapas além das mencionadas explicitamente, e em particular uma etapa de misturar o referido ácido hialurônico reticulado desidratado com um solvente aquoso, tal como uma solução de cloreto de sódio, uma solução salina ou uma solução tamponada injetável (em particular uma solução salina tamponada de fosfato), de modo a formar um hidrogel. A concentração de ácido hialurônico no referido hidrogel pode variar de 1% a 4%, e de preferência de 1,5% a 3% em peso/volume.

A invenção, portanto, tem por objetivo tal

hidrogel, contendo um ácido hialurônico reticulado conforme descrito acima, em um solvente aquoso.

O hidrogel assim obtido, após a esterilização, por exemplo, a 118 a 130°C por 2 a 30 minutos, de acordo com a ío invenção, possui um módulo elástico G’ de pelo menos 100 e, por exemplo, variando entre 200 e 600 Pa, sem a isto se limitar, e uma variação do módulo elástico de menos de 30%, e de preferência, de menos de 20%, após aquecimento a 93°C por 1 hora. Ele também tem vantajosamente um módulo viscoso G” variando de 50 a 200 Pa; um ângulo de perda □ [=Inv tan (G”/G’)] variando de 15 a 35° e uma viscosidade □ variando de 1000 a 3000 Pa.s. A medição do módulo elástico, do módulo viscoso e do ângulo de perda pode ser realizada da seguinte maneira: o hidrogel é tratado com uma geometria de cone-placa de 4 cm, 4o, a uma temperatura de 25°C. Ele é submetido a um teste viscoelástico não destrutivo a

I Hz, com uma deformação imposta de 1%. A medição do módulo elástico é realizada usando um reômetro AR 1000 da empresa TA Instruments. O mesmo aparelho pode ser usado para medir a viscosidade usando um gradiente de cisalhamento de 5.IO'2 seg’1. Portanto, a invenção também tem por objetivo um hidrogel esterilizado contendo ácido hialurônico reticulado com um agente de reticulação contendo pelo menos 50% em peso de oligopeptídeo ou polipeptídeo, caracterizado por exibir uma 5 variação em seu módulo elástico de menos de 30% após aquecimento a 93 0C por 1 hora.

Esse hidrogel é vantajosamente utilizado na fabricação de implantes.

Tais implantes podem, em particular, ser ío injetados por via subcutânea (hipodermicamente) ou intradérmica no tecido fibroso.

Eles podem conter, além do hidrogel mencionado acima, um fluido vetorial compreendendo pelo menos um polissacarídeo, por exemplo, pelo menos um derivado 15 da celulose, tal como carboximetilcelulose, e/ou pelo menos um glicosaminoglicano, tal como um hialuronato de sódio, e/ou partículas de um material biocompatível, bioreabsorvível, tal como ácido polilático (PLA), ácido poliglicólico (PGA), ácidos poli(lático-co-glicólicos) (PLGA), fosfato de tricálcio (TCP) ou 20 hidroxiapatita (HAP), e misturas dos mesmos.

Exemplos de tais minerais de implantes contendo os mesmos são descritos em particular no pedido WO 2004/069090.

Os implantes de acordo com a invenção são bioreabsorvíeis, no sentido de que eles são capazes de se degradar no organismo em 6 a 18 meses. Em particular, eles podem ser usados para:

suplementar uma cavidade ou órgão deficiente em ácido hialurônico (geralmente na dermatologia, na medicina estética ou em tratamentos ortopédicos);

- reconstituir um volume efundido durante

intervenções cirúrgicas (geralmente na cirurgia ocular), ou

aplicação tópica sobre a derme normal ou danificada (geralmente na cosmetologia e na dermatologia).

O implante mencionado acima é particularmente adequado para uso no preenchimento de rugas faciais e linhas finas e/ou cicatrizes do corpo humano.

Portanto, a presente invenção também tem por objetivo o uso do ácido hialurônico reticulado como descrito acima para a fabricação de implantes injetáveis a serem usados na 15 cirurgia estética e/ou de reparo, ou na fabricação de produtos de preenchimento, em particular produtos para preenchimento de rugas, linhas finas, cicatrizes ou depressões da pele, tais como lipodistrofias.

De agora em diante, a presente invenção é ilustrada em detalhes pelos exemplos não limitantes a seguir.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Síntese do ácido hialurônico reticulado com um polipeptídeo de acordo com a invenção

1. Esquema de reação O esquema de reação seguido pode ser ilustrado

da seguinte maneira (tomando a dilisina como exemplo): OH

J-1 NHCfXH.,

OH

Ácido Hialurônico Ácido hialurônico reticulado A reação de reticulação (esquema 1) consiste de

um acoplamento de peptídeo duplo entre as funções ácido carboxílico das duas cadeias de ácido hialurônico e as funções amina da dilisina. Os reagentes de acoplamento utilizados são a 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e a N-hidroxisuccinimida (NHS).

nucleofílico pela função ácido carboxílico do ácido hialurônico na função carbodiimida do agente de acoplamento EDC. A O- aciluréia resultante é então substituída por NHS para formar um éster ativado mais estável (produção de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)uréia). De fato, a O-aciluréia pode se

O mecanismo da reação de acoplamento pode

ser ilustrado da seguinte maneira:

10

HA = ácido hialurônico

A primeira etapa consiste de um ataque reagrupar em N-aciluréia inerte em um meio aquoso ligeiramente ácido e durante longos tempos de reação. A última etapa consiste do ataque nucleofílico por uma das funções amina da dilisinaa (de preferência terminal, estericamente favorecida) no éster ativado de modo a formar uma ligação amina com a liberação da NHS.

2. Protocolo

Ia etapa: fase de intumescimento 3 g de cloreto de sódio são adicionados sucessivamente a 300 mL de água milliQ em um reator de vidro de 500 mL. Após dissolver o cloreto de sódio em um sonicador, 2 g de ácido hialurônico (HTL Sarl, lote No. PH 1016, Mw = 2,6x106 Daltons, daqui em diante chamado de HA) são introduzidos no reator contendo a solução salina, desfiando cuidadosamente as fibras de HA o quanto possível manualmente. Após agitar o meio heterogêneo com uma espátula por 1 minuto, o reator é colocado a 4°C por 15 h sem agitação e coberto com folha de alumínio para proteger o meio de reação.

2a etapa: fase de reticulação A mistura de reação é removida do refrigerador e então agitada à temperatura ambiente (18 a 25°C) por 10 minutos (visualmente, a solução deve estar completamente clara e homogênea, com alguma viscosidade, como mel líquido).

A agitação é do tipo mecânico com um agitador em Teflon em forma de meia-lua. A velocidade de rotação é de 60 rpm. Em seguida, uma solução de 464 mg (4,03 mmol) N-hidroxisuccinimida (ACROS, 98% de pureza, daqui em diante chamada de NHS) em 5 mL de água milliQ é preparada em um tubo de hemólise, e então misturada em vórtice de modo a 5 dissolver toda a NHS. Essa solução é adicionada gota a gota ao meio de reação a uma taxa de 5 mL/min.

A mistura é deixada sob agitação por 5 minutos, e então 313 mg (2,02 mmol) de solução de cloridrato de N-(3- dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (Sigma-Aldrich, ref. 10 03450-5G, daqui em diante chamada de EDC) em 4 mL de água milliQ. A dissolução é realizada com um vórtice e então a adição gota a gota é realizada a uma taxa de 5 mL/min.

A mistura é deixada sob agitação por 30 minutos, e então a solução aquosa de dilisina é adicionada ao 15 meio de reação a uma taxa de 1 mL/min. A referida solução é preparada dissolvendo, em 1 mL de água milliq, sob vórtice, 233 mg (0,67 mmol) de cloridrato de dilisina (fornecedor BACHEM, ref. G2675), e então 1302 μΐ (10,08 mmol) de diisopropiletilamina (fornecedor ACROS ref. 115225000, daqui 20 em diante chamado de DIEA), a parte inteira em um tubo de hemólise. Essa mistura apresenta duas fases distintas formando

r

uma emulsão reversível após agitação vigorosa. E feita uma tentativa de misturar o máximo de emulsão possível enquanto é adicionada ao meio de reação. O pH do meio de reação deve estar entre 8,5 e 10,5.

A parte inteira é deixada em agitação por 3 h. 3a etapa: fase de purificação Após a agitação ter parado, o pH da solução é ajustado antes da precipitação com IM de HCl de modo a reduzir o pH a 5,7.

Um reator de um litro equipado com um

agitador mecânico e uma haste de agitação em forma de ancinho é então preparado. 420 mL de etanol a 95° são despejados no referido reator, e a agitação mecânica é ativada a altíssima velocidade (aproximadamente 1000 rpm).

42 mL da mistura de reação contendo o

hialuronato reticulado são então aspirados usando uma seringa de 50 mL, e então introduzidos continuamente, como uma lâmina, para dentro do reator. A solução deve ser clara, incolor e bastante viscosa.

Assim que a adição estiver completa, a agitação

é mantida por outros dois minutos. A haste de agitação é então removida do reator e o polímero obtido é então desenovelado em uma frita de porosidade II, usando um par de pinças. O polímero é rapidamente seco em garrafa térmica por um período máximo de 20 15 segundos, e então deixado secar em um dessecador sob vácuo pelo período mínimo de 12 horas.

O produto final deve ser completamente branco. 4a etapa: fase de reformulação De modo a preparar 10 mL de gel a 2,4%, 240 mg de polímero reticulado seco são introduzidos em uma seringa em polipropileno convencional equipada com uma tampa (na saída da seringa). IOmL de solução tamponada ** são então adicionados ao sólido, e a parte inteira é então deixada intumescer a 4°C por 12 a 15 horas.

Após remover a seringa do refrigerador, o 5 produto é agitado rapidamente usando um agitador mecânico, a uma velocidade de 1000 rpm. A haste de agitação usada é uma espátula de laboratório em forma de colher em aço inoxidável. O tempo de agitação é de aproximadamente 5 minutos para esse produto, mas pode variar de acordo com a viscosidade. O gel final ío deve ser incolor e completamente homogêneo.

Exemplo 2: Teste de degradação e

persistência

Princípio:

Um especialista foi chamado para realizar testes de degradação acelerados que prevêem a resistência de um polímero a vários fatores de degradação in vivo (consulte em particular a FR 2861 734).

Neste exemplo, um desses testes foi realizado e consistia em medir as características reológicas dos produtos 20 reticulados esterilizados anteriormente, e então submetidos a uma fase de aquecimento a 930C por uma hora. A perda de porcentagem do módulo elástico (G’) durante o aquecimento é então calculada. Quanto menor essa porcentagem, mais resistência o produto apresenta ao aquecimentOo, e mais ele é 25 considerado como capaz de resistir a outros fatores de degradação. Esse teste é, portanto, preditivo em termos da taxa de degradação in vivo do ácido hialurônico reticulado, e, portanto, da duração do preenchimento das rugas que podem ser obtidas.

Produtos testados:

Todos os produtos testados são produtos

estéreis.

Vários produtos comercialmente disponíveis foram testados, junto com:

Produto 1, que era o ácido hialurônico obtido conforme descrito no Exemplo 1, e ío - Produto 2, que era o ácido hialurônico

obtido conforme descrito no Exemplo 1, com a exceção de que 45 mol% EDC; 90 mol% NHS, e 15 mol% dilisina, em relação ao número de mols das unidades de COOH do ácido hialurônico, e uma razão DIEA/NHS de 2,22, foram utilizados.

Resultados:

A Tabela 1 abaixo apresenta os resultados obtidos para vários ácidos hialurônicos reticulados testados.

Tabela 1

Teste de degradação do ácido hialurônico

reticulado

Amostras estéreis TO Tl após IHOO a 93°C % de perda Módulo elástico Angulo de Módulo elástico Angulo de (G’) perda (G’) perda PERLANE" 500 8,5 360 8,4 28% JUVEDERM® 30HV® 63,5 22 43,5 25 31% ESTHELIS Basic® 89 25 43 27 52% Produto 1 262 26 224 30 14% Produto 2 206 25 199 30 3% Nota-se, pe a tabela, que os ácidos hialurônicos modificados de acordo com a invenção apresentam uma queda menor em seus módulos elásticos do que os ácidos hialurônicos reticulados comercialmente disponíveis, o que demonstra que eles são mais resistentes aos fatores de degradação.

Exemplo 3: Influência do pH de precipitação As propriedades físico-químicas dos ácidos hialurônicos reticulados sintetizados substancialmente como descrito no Exemplo 1, e precipitado a vários pHs em etanol, ío foram comparadas. Os parâmetros dos processos para sintetizar tais compostos são apresentados na Tabela 2 abaixo:

Tabela 2

Parâmetros para sintetização dos ácidos hialurônicos reticulados

Produto %EDC % de dilisina Razão pH de precipitação DIE ATNH S Produto 40% 80% 13,33% 2,5 5,7 Produto A 40% 80% 13,33% 2,5 9,0 Produto B 40% 80% 13,33% 2,5 4,0 Produto 3 100% 200% 5% 2,0 5,7 Produto C 100% 200% 5% 2,0 4,0 Produto 4 45% 90% 15% 2,22 5,20 Produto D 45% 90% 15% 2,22 4,0 * relativo ao número de mols de funções ácido

carboxílico do ácido hialurônico. As propriedades físico-químicas dos produtos acima foram avaliadas, uma vez reformuladas como descrito no Exemplo 1, antes e após uma hora despendida em uma incubadora a 90°C. Mais especificamente, a viscosidade do hidrogel foi 5 avaliada e seu módulo elástico foi medido. Os resultados são apresentados na Tabela 3 a seguir:

Foram utilizadas classes de 1 a 5, o que representa uma pontuação de sumarização levando em conta a elasticidade e viscosidade do gel. Quanto mais elástico for ío considerado o gel, maior a pontuação. Inversamente, um gel não- homogêneo e/ou fluido recebeu uma pontuação baixa.

Tabela 3

Propriedades físico-químicas dos ácidos

hialurônicos reticulados

Produto Aparência do hidrogel (TO) G’ Aparência do hidrogel G5 % de (TO) (T60) (T60) perda G’ Produto 1 Claro, ligeiramente granular 262 Claro, elástico (Classe 5) 224 14% (Classe 5) Produto A Quase não viscoelástico --- (Classe 2) Produto B Claro, viscoso (Classe 4) Claro (Classe 3) --- Produto 3 Muito claro (Classe 5) 296 Muito claro (Classe 5) 215 27% Produto C Muito claro (Classe 5) --- Muito claro (Classe 2) --- --- Produto 4 Claro, ligeiramente granular 206 Claro, elástico (Classe 5) 199 % (Classe 5) Produto D Muito claro, viscoelástico --- Quase não viscoelástico --- --- (Classe 5) (Classe 2) Nota-se, pela tabela, que os ácidos hialurônicos

reticulados precipitados ao pH básico, embora fáceis de reformular como hidrogéis, não constituem hidrogéis adequados a um produto aplicado ao preenchimento de rugas. Supõe-se que tal fenômeno se deva ao desenvolvimento insuficiente das ligações iônicas durante a precipitação. Além do mais, os ácidos hialurônicos reticulados precipitados a um pH muito ácido formam hidrogéis com boa viscoelasticidade (contanto que possam ser reformulados, o que nem sempre é possível), mas que se 5 degradam claramente quando colocados na incubadora e, portanto, serão sensíveis aos fatores de degradação endógenos.

De fato, parece que apenas um pH de precipitação variando de 5 a 7 toma possível formular facilmente um hidrogel homogêneo com uma viscoelasticidade bastante 10 satisfatória que não é substancialmente reduzida após um teste de degradação. Isso confirma que, dentro dessa faixa de pH, a malha macromolecular formada pelas ligações eletrostáticas e covalentes é ideal para aplicação como um material de preenchimento.

Claims

1. - Ácido hialurônico reticulado que pode ser obtido de acordo com um processo caracterizado por compreender: - a ativação do ácido hialurônico usando um agente de acoplamento e um agente de acoplamento auxiliar de modo a obter um ácido hialurônico ativado, - a reação do referido ácido hialurônico ativado com um agente de reticulação compreendendo pelo menos 50% em peso de oligopeptídeo ou polipeptídeo, em um meio de reação ajustado para um pH variando de 8 a 12, de modo a obter um ácido hialurônico reticulado, - o ajuste do pH do meio de reação para um valor que varia de 5 a 7, - a precipitação do ácido hialurônico reticulado em um solvente orgânico para obter fibras de ácido hialurônico reticulado, e - opcionalmente, a secagem das fibras de ácido hialurônico reticulado assim obtidas.

2. - Ácido hialurônico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de acoplamento é escolhido dentre: l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), l-etil-3-(3-trimetilaminopropil) carbodiimida (ETC) e l-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil) carbodiimida (CMC), bem como sais e misturas dos mesmos.

3. - Acido hialurônico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de acoplamento auxiliar é escolhido dentre: N-hidroxisuccinimida (NHS), N-hidroxibenzotriazol (HOBt), 3,4-diidro-3-hidroxi-4- oxo-l,2,3-benzotriazol (HOOBt), l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HAt) e N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) e misturas dos mesmos.

4. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a razão molar do agente de acoplamento para as unidades de ácido carboxílico do ácido hialurônico está entre 5% e 100% sem a isso se limitar.

5. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a razão molar do agente de acoplamento auxiliar para o agente de acoplamento está entre 1:1 e 3:1 sem a isso se limitar.

6. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a reação para ativação do ácido hialurônico com o agente de acoplamento é realizada a um pH variando de 3 a 6.

7. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um homo- ou copolímero de lisina.

8. - Ácido hialurônico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o homopolímero de lisina é dilisina.

9. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente de acoplamento é usado em uma quantidade estequiométrica em relação às funções amina do agente de reticulação. F

10. - Acido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente de acoplamento é usado em uma quantidade estequiométrica em relação às funções ácido carboxílico do ácido hialurônico.

11. - Acido hialurônico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade de agente de reticulação usada na segunda etapa é menor do que 30% por número de mols do agente de reticulação em relação ao número de mols das funções ácido carboxílico.

12. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 11, caracterizado pelo fato de que a reação de reticulação é realizada a um pH variando de 8 a 10.

13. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o pH de precipitação varia de 5 a 7.

14. - Ácido hialurônico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é etanol ou isopropanol.

15. - Processo para produzir um ácido hialurônico reticulado, caracterizado por ser conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. - Hidrogel, caracterizado por conter um ácido hialurônico reticulado, conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em um solvente aquoso.

17. - Hidrogel esterilizado contendo ácido hialurônico reticulado com um agente de reticulação contendo pelo menos 50% em peso de oligopeptídeo ou polipeptídeo, caracterizado por exibir uma variação em seu módulo elástico de menos de 30% após aquecimento a 93°C por 1 hora.

18. - Uso do ácido hialurônico reticulado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para a fabricação de implantes injetáveis para uso na cirurgia estética e/ou de reparo, ou para a fabricação de produtos de preenchimento, em especial para preencher rugas, linhas finas, cicatrizes ou depressões de pele.