BRPI0718641A2 - Método para melhora do rendimento de processos de conversão de celulose - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA MELHORA DO RENDIMENTO DE PROCESSOS DE CONVERSÃO DE CELULOSE".
1. DECLARAÇÃO DOS DIREITOS DA INVENÇÃO FEITA SOB PESQUISA E DESENVOLVIMENTO FEDERALMENTE PATROCINADOS
Porções do presente trabalho foram financiadas pelo Subcontra- to N0 ZCO-0-30017-01 com o National Renewable Energy Laboratory sob o Prime Contract N0 DE-AC36-99G010337 com o U.S. Department of Energy. Desta maneira, o Governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos na invenção.
2. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
O presente pedido reivindica benefício e prioridade do Pedido Provisório U.S. N0 de Série 60/858.579 intitulado "Method for Improving Yield of Cellulose Conversion Process", depositado em 13 de novembro, 2006, incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.
3. CAMPO
O presente ensinamento refere-se a métodos para melhora do rendimento de açúcares desejáveis na conversão enzimática de materiais celulósicos. 4. ANTECEDENTES
A produção de açúcares a partir de materiais celulósicos é co- nhecida há algum tempo, como o são as subsequentes fermentação e desti- lação desses açúcares em etanol. Muito do desenvolvimento da técnica an- terior aconteceu perto da Segunda Guerra Mundial quando combustíveis estavam muito valorizados em países tal como Alemanha, Japão e União Soviética. Esses primeiros processos eram principalmente direcionados à hidrólise ácida, mas eram muito complexos em sua engenharia e projeto e eram muito sensíveis a variações pequenas em variáveis de processo, tal como temperatura, pressão e concentrações de ácido. Uma discussão com- preensiva desses primeiros processos é apresentada em "Production of Su- gars From Wood Using High-Pressure Hydrogen Chloride", Biotechnology and Bioengineering1 Volume XXV, em 2757-2773 (1983). O fornecimento abundante de petróleo no período da Segunda Guerra Mundial até os anos 70 deixou mais lenta a pesquisa de conversão de metanol. No entanto, devido à crise do petróleo de 1973, pesquisadores aumentaram seus esforços para desenvolver processos para a utilização de madeira e subprodutos agriculturais para a produção de etanol como uma fonte de energia alternativa. Esta pesquisa foi especialmente importante pa- ra desenvolvimento de etanol como um aditivo de gasolina para reduzir a dependência dos Estados Unidos da produção de petróleo estrangeiro, para aumentar a taxa de octano de combustíveis e para reduzir os poluentes de exaustão como uma medida ambiental.
Concomitantemente com a "crise do petróleo", como ficou co- nhecida, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos promulgou regulamentações requerendo a redução de aditivos de chumbo em um es- forço de reduzir a poluição do ar. Na medida em que etanol é virtualmente uma substituição de chumbo, algumas refinarias selecionaram etanol como o substituto, especialmente uma vez que ele pode ser facilmente introduzido na operação de uma refinaria sem investimento de equipamento de capital caro.
Em adição à melhora dos processos de sacarificação de gás em alta pressão e alta temperatura desenvolvidos décadas atrás, pesquisa atual se direciona principalmente a processos de conversão enzimática. Esses processos empregam enzimas de uma variedade de organismos, tal como fungos, levedura e bactérias mesofílicos e termofílicòs, que degradam a ce- lulose em açúcares fermeritáveis. Ainda permanece incerteza com esses processos e sua habilidade em ser ampliado para comercialização bem co- mo suas taxas ineficientes de produção de etanol.
Celulose e hemicelulose são os materiais de planta mais abun- dantes produzidos através de fotossíntese. Elas podem ser degradadas para uso como uma fonte de energia por vários microorganismos, incluindo bacté- rias, levedura e fungos, que produzem enzimas extracelulares capazes de hidrólise do substrato polimérico em açúcares monoméricos (Aro e outros, 2001). Organismos são freqüentemente restritivos com relação a quais açú- cares eles usam e isto dita quais açúcares são melhor produzidos durante conversão. Conforme os limites de recursos não-renováveis se aproximam, o potencial de celulose em se tornar um recurso de energia renovável princi- pal é enorme (Krishna e outros, 2001). A utilização eficaz de celulose em processos biológicos é uma abordagem para superar o déficit de alimentos, rações e combustíveis (Ohmiya e outros, 1997).
Celulases são enzimas que hidrolisam celulose (ligações beta- 1,4-glucagon ou beta D-glicosídicas) resultando na formação de glicose, ce- lobiose, celooligossacarídeo e similar. Celulases têm sido tradicionalmente divididas em três classes principais: endoglucanases (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanase ou celobioidrolases (EC 3.2.1.91) ("CBH") e beta-glicosidases ([beta]-D-glicosídeo glicoidrolase; EC 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles e outros, 1987 e Shulein, 1988). Endoglucanases agem principalmente nas partes amorfas da fibra de celulose, enquanto celobioidrolases são também capa- zes de degradar celulose cristalina.
Celulases foram também mostradas ser úteis em degradação de biomassa de celulose em etanol (onde a celulase degrada celulose para gli- cose e levedura ou outros micróbios fermentam mais a glicose em etanol), no tratamento de polpa mecânico (Pere e outros, 1996), para uso como um aditivo alimentar (WO 91/04673) e em moagem a úmido de grão. Sacarifiea- ção e fermentação separadas é um processo com o que celulose presente em biomassa, por exemplo, resto de milho, é convertida em glicose e subse- qüentemente linhagens de levedura convertem glicose em etanol. Sacarifi- cações e fermentação simultâneas é um processo com o que celulose pre- sente em biomassa, por exemplo, resto de milho, é convertida em glicose e, ao mesmo tempo e no mesmo reator, linhagens de levedura convertem gli- cose em etanol. Produção de etanol a partir de fontes prontamente disponí- veis de celulose provê uma fonte de combustível renovável, estável.
Celulases são conhecidas ser produzidas por um grande número de bactérias, levedura e fungos. Certos fungos produzem um sistema celula- se completo (isto é, uma celulase integral) capaz de degradar formas crista- linas de celulose. A fim de eficientemente converter celulose cristalina em glicose o sistema de celuiase completo compreendendo componentes de cada uma das classificações CBH, EG e BG é requerido, com componentes isolados menos eficazes em hidrólise de celulose cristalina (Filho e outros, 1996). Em particular, a combinação de celulases tipo EG e celulases tipo CBH interage para degradar mais eficientemente celulose do que qualquer enzima usada sozinha (Wood, 1985; Baker e outros, 1994; e Nieves e ou- tros, 1995).
Adicionalmente, celulases são conhecidas na técnica ser úteis no tratamento de têxteis para os propósitos de aumento da habilidade de limpeza de composições detergente, para uso como um agente de amoleci- mento, para melhora do toque e aparência de tecidos de algodão e similar (Kumar e outros, 1997). Composições detergente contendo celuiase com performance de limpeza melhorada (Patente U.S. N0 4.435.307; Pedidos GB N0S 2.095.275 e 2.094.826) e para uso no tratamento de tecido para melho- rar o toque e a aparência do têxtil (Patentes U.S. N0S 5.648.263, 5.691.178 e 5.776.757 e Pedido GB N0 1.358.599) foram descritas.
Então, celulases produzidas em fungos e bactérias têm recebido atenção significante. Em particular, fermentação de Trichoderma spp. (por exemplo, Trichoderma Iongibrachiatum ou Trichoderma reesei) foi mostrada produzir um sistema de celuiase completo capaz de degradar formas crista- linas de celulose. Com os anos, produção de Triehoderma eellulase tem sido melhorada através de mutagêriese, avaliação, seleção e desenvolvimento clássicos de condições de fermentação econômicas "de grande escala, alta- mente refinadas. Embora o sistema de celuiase multicomponente de Trieho- derma spp. seja capaz de hidrolisar celulose em glicose, há celulases de outros microorganismos, em particular linhagens bacterianas, com proprie- dades diferentes para hidrólise de celulose eficiente, e seria vantajoso ex- pressar essas proteínas em um fungo filamentoso para produção de celuiase em escala industrial. No entanto, os resultados de muitos estudos demons- tram que o rendimento de enzimas bacterianas a partir de fungos filamento- sos é baixo (Jeeves e outros, 1991).
Açúcares solúveis, tal como glicose e celobiose, têm uma multi- ί> plicidade de usos em indústria para a produção de agentes químicos e pro- dutos biológicos. A otimização de hidrólise de celulose permite o uso de quantidades menores de enzima e eficácia de custo aperfeiçoada para a produção de açúcares solúveis. Apesar do desenvolvimento de várias abor- dagens, permanece a necessidade na técnica de melhora do rendimento de açúcares solúveis obtidos a partir de materiais celulósicos. 5. SUMÁRIO
Os presentes ensinamentos proveem métodos para aumento do rendimento de açúcares solúveis a partir da sacarificação enzimática de ma- teriais de partida celulósicos através da incubação de um substrato celulósi- co ou um substrato celulósico pré-tratado com uma celulase em uma tempe- ratura na ou por volta da temperatura de desnaturação térmica da celulase. Os presentes ensinamentos também proveem métodos para aumento do rendimento de glicose a partir da sacarificação enzimática de materiais de partida celulósicos através da incubação de substrato celulósico ou um subs- trato celulósico pré-tratado com uma celulase em uma temperatura na ou por volta da temperatura de desnaturação térmica da celulase.
São também providos métodos para conversão de um material celulósico em glicose através da combinação de um material celulósico com uma celulase incubando a combinação de material celulósico e celulase em uma temperatura maior do que cerca de 38°C para causar uma reação de hidrólise para converter pelo menos 20% do dito material celulósico em açú- cares solúveis, onde a fração de glicose é pelo menos 0,75 com relação aos açúcares solúveis. O presente ensinamento também provê métodos para conversão de um material celulósico em celobiose através da combinação de um material celulósico com mistura de enzima compreendendo uma en- doglucanase 1, incubação da combinação de material celulósico e celulase causa uma reação de hidrólise para converter até 50% do material celulósico em açúcares solúveis, onde fração de glicose é menos do que cerca de 0,5 com relação aos ditos açúcares solúveis.
As celulases podem ser celulases integrais, misturas de celula- ses ou combinações das mesmas produzidas por microorganismos dos gê- neros Aspergillus, Trichodcrns, Fusarium, Chrysosporium, Penicillium, Hu- micola, Neurospora ou formas sexuais alternativas dos mesmos tal como Emericella e Hypocrea (vide Kuhls e outros, 1996). De preferência, espécies tal como Acidothermus cellulolyticus, Thermobifiea fusca, Humieola grisea e Triehoderma reesei podem ser usadas.
Essas e outras características dos presentes ensinamentos são providas aqui.
6. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
O versado na técnica vai compreender que os desenhos são para propósitos de ilustração apenas e não pretendem limitar o escopo dos presentes ensinamentos de modo algum.
As figuras 1A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 3,3 mg/g de celulase in- tegral de Triehoderma reesei superexpressando beta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados).
As FIGURAS 2A-B mostram a conversão de resto de milho tra- tado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 12 mg/g de celulase integral de Triehoderma reesei superexpressando beta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados). As figuras 3A-B mostram a conversão de resto de milho tratado
com ácido diluído em açúcares solúveis através de 18 mg/g de celulase in- tegral de Triehoderma reesei superexpressanco beta-glicosidase 1, 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados).
As figuras 4A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 20 mg/g de celulase in- tegral de Triehoderma reesei superexpressando beta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados).
As figuras 5A-B mosvram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 20 mg/g de celulase ín- tegral de Trichoderma reesei superexpressando beta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (sirnòüics fechados).
As figuras 6A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 12 mg/g de celulase in- tegral de Trichoderma reesei, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados).
As figuras 7A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 12 mg/g de celulase in- tegral de Trichoderma reesei expressando a proteína de fusão CBH1-E1, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados).
As figuras 8A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 15 mg/g de mistura de uma enzima ou de EG1 e CBH1 de T. reesei (quadrados) ou E1 e CBH1 de H. grisea (círculos) a 38°C (símbolos abertos) e 65°C (símbolos fechados).
As figuras 9A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 15 mg/g de mistura de uma enzima ou de EG1, CBH1 de T. reesei e CBH2 de T. reesei (quadra- dos) ou E1, CBHI de H. grisea e CBH2 de T. reesei (círculos) a 38°C (sím- bolos abertos) e 65°C (símbolos fechados).
As figuras 10A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 15 mg/g de mistura de uma enzima ou de EG1, CBH1 de T. reesei (quadrados) e E3 ou E1 de T. fusca, CBH1 de H. grisea e E3 de T. fusca (círculos) a 38°C (símbolos aber- tos) e 65°C (símbolos fechados).
As Figuras 11A-F mostram a conversão de resto de milho trata- do com ácido diluído em açúcares solúveis através de uma linhagem de Tri- choderma reesei a 53°C (símbolos fechados) e 59°C (símbolos abertos). Figuras 12A-F. A conversão de resto de milho tratado com ácido
diluído em açúcares solúveis através de uma celulase integral de Trichoder- ma reesei expressando uma pro:eína de fusão CBH1-E1, a 53°C (símbolos fechados) e 59°C (símbolos abertos). 7. DESCRIÇÃO DETALHADA DE VÁRIAS MODALIDADES A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e
científicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente compre- endido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Singleton e outros, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a ED., John Wiley and Sons, Nova York (1994) e Hale & Marham1 THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIO- LOGY, Harper Perenniai1 N.Y. (1991) proveem um versado na técnica com um dicionário geral de muitos dos termos usados na presente invenção. Em- bora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles des- critos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos. Faixas numéricas são inclusi- vas dos números definindo a faixa. Deve ser compreendido que a presente invenção não é limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares descritos, uma vez que esses podem variar.
Os cabeçalhos providos aqui não são limitações dos vários as- pectos ou modalidades da invenção que podem ser logrados por referência ao relatório como um todo. Deste modo, os termos definidos imediatamente abaixo são mais integralmente definidos com referência ao relatório como um todo.
O termo "celulase" refere-se a uma categoria de enzimas capa- zes de hidrólise de polímeros de celulose (ligações beta-1,4-glicano ou beta D-glicosídicas) em oligômeros de celo-oligossacarídeo mais curtos, celobio- se e/ou glicose.
O termo "exo-celobioidrolase" (CBH) refere-se a um grupo de enzimas celulase classificadas como EC 3.2.1.91. Essas enzimas são tam- bém conhecidas como exoglucanases ou celobioidrolases. Enzimas CBH hidrolisam celobiose da extremidade de redução ou não-redução de celulo- se. Em geral, uma enzima do tipo CBHI de preferência hidrolisa celobiose da extremidade de redução de ceiulose e uma enzima tipo CBHII de preferência hidrolisa a extremidade de não-redução de celulose.
O termo "atividade de celobioidrolase" é definido aqui como uma atividade de 1,4-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) que catalisa a hi- drólise de ligações 1,4-betfc-D-glicosidicas em celulose, celotetriose ou qual- quer polímero contendo glicose beta-1,4-ligada, liberação de celobiose das extremidades cia cadeia Para propósitos da presente invenção, atividade de celobioidrolase pode ser determinada através da liberação de açúcar de re- dução solúvel em água de uma celulose conforme medido através do méto- do PHBAH de Lever e outros, 1972, Anal. Biocham. 47:273-279. Uma distin- ção entre o modo de ataque de exoglucanase de uma celobioidrolase e o modo de ataque de endoglucanase pode ser feita através de uma medição similar de liberação de açúcar de redução de celulose substituída tal como carboximetilcelulose ou hidroxietil celulose (Ghose, 1987, Pure & Appl. Chem. 59:257-268). Uma celobioidrolase verdadeira terá uma razão muito alta de atividade em celulose não-substituída versus substituída (Bailey e outros, 1993, BiotechnoL Appl. Biochern. 17:65-76).
O termo "endoglucanase" (EG) refere-se a um grupo de enzimas celulases classificado como EC 3.2.14. Uma enzima EG hidrolisa ligações beta-1,4-glicosídicas internas da celulose. O termo "endoglucanase" é defi- nido aqui como uma endo-1 4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. N0 3.2.1.4) que catalisa endoidrólise de ligações 1,4-beta-D- glicosídicas em celulose, derivados de celulose (por exemplo, carboxi metil celulose, liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos tal como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal e outro material de planta contendo componentes celulósicos. Para propósitos da presente invenção, atividade de endoglucanase pode ser determinada usando hidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59:257-268.
O termo "beta-gíicosidase" é definido aqúi como uma glicoidrola- se de beta-D-glicosídeo (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de celobiose com a liberação de beta-D-glicose. Para propósitos da presente invenção, atividade de beta-glicosidase pode ser medida através de métodos conheci- dos na técnica, porexemolo, HPLC.
"Atividade celuloliíica" compreende atividade de exoglucanase, atividade de endoglucanase ou ambos os tipos de atividade de enzima, bem como atividade de beta-gücosidaüe.
Muitos micróbios produzem enzimas que hidrolisam celulose, incluindo as bactérias Acidcthermus,, Thermobifida, Bacillus e Cellulomonas; Streptomyces, levedura tal ccrno uma Candida, Kluyveromyces, Pichia, Sae- charomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia e fungos Aeremonium, As- pergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusa- rium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neu- rospora, Paeciiomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Toiypocladium ou Trichoderma, ou formas sexuais alternativas dos mesmos tal como Emericella e Hypocrea (Vide Kuhls e ou- tros, 1996).
Uma composição de "ocorrência não-natural" compreende aque- Ias composições produzidas através de: (1) combinação de enzimas celulolí- ticas componentes ou em uma razão de ocorrência natural ou de ocorrência não-natural, isto é, razão alterada; ou (2) modificação de um organismo para superexpressar ou subexpressar uma ou mais enzima celulolíticas; ou (3) modificação de um organismo de modo que pelo menos uma enzima celulo- lítica seja deletada ou (4) modificação de um organismo para expressar uma enzima celulolítica componente heteróloga. As enzimas celulolíticas compo- nentes podem ser providas como polipeptídios isolados antes da combina- ção para formar a composição de ocorrência não-natural.
Foi constatado, em parte, que temperatura de sacarificação alta ambos aumenta o rendimento de glicose de materiais celulósicos e também resulta em conversão geral aperfeiçoada de celulose de modo que a fração de glicose no produto de conversão é aumentada em temperaturas de incu- bação maiores.
Os presentes ensinamentos proveem métodos para aumento do rendimento de açúcares solúveis a partir da sacarificação enzimática de ma- teriais de partida celulósicos através da incubação de um substrato celulósi- co ou um substrato ceiuiosico pre-tratado com uma celulase em uma tempe- ratura na ou acima da temperatura de desnaturação térmica da celulase. Os presentes ensinamentos proveem ainda métodos para aumento do rendi- mento de glicose a partir da sacarificação enzimática de materiais de partida celulósicos através da incubação de um substrato ceiulósico ou um substrato celulósico pré-tratacio oo m uma ceíulase em uma temperatura na ou acima da temperatura de desnaturação térmica da celulase. Nos métodos da presente descrição, o material celulósico pode ser qualquer material contendo celulose. O material celulósico pode incluir, mas não é limitado a, celulose, hemicelulose e materiais lignocelulósicos.
Em algumas modalidades, os materiais celulósicos incluem, mas não estão limitados a, biomassa, material herbáceo, resíduos agriculturais, resíduos florestais, esgoto sólido, papel de refugo e resíduos de polpa e papel. Em algumas modalidades, o material celulósico inclui madeira, polpa de madei- ra, lama de fabricação de papel, correntes de refugo de polpa de papel, tá- bua compacta, resto de milho, fibra de milho, arroz, refugo de processamen- to de papel e polpa, plantas de madeira e herbáceas, polpa de fruta, polpa vegetal, pedra-pomes, grãos de destiladores, gramas, cascas de arroz, ba- gaço de cana-de-açúcar, algodão, juta, cânhamo, linho, bambu, sisal, abacá, palha, sabugos de milho, grãos de destiladores, folhas, palha de trigo, palha de coco, algas, grama switchgrass e misturas dos mesmos (vide, por exem- plo, Wiselogel e outros, 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles, E. Wy- man, editor), pp. 105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50:3-16; Lynd, 1990, Applied Bioehemistry and Bio- technology 24/25: 695-719; Mosier e outros, 1999, Recent Progress in Bio- eonversion of Lignocellulosicsi em Advanees in Bioehemieal Enginee- ring/Bioteehnology, T. Scheper1 managing editor, Volume 65, pp. 23-40, S- pringer-Verlag, Nova Iorque).
O material celulósico pode ser usado como é ou pode ser sub- metido a pré-tratamento usando métodos conhecidos na técnica. Tais pré- tratamentos incluem pré-tratamentos químico, físico e biológico. Por exem- plo, técnicas de pré-tratamento físico podem incluir, sem limitação, vários tipos de moagem. trituração. explosão fumegante/com vapor, irradiação e hidrotermólise. Técnicas de pré-tratamento químico podem incluir sem limi- tação ácido diluído, alcalina, solvente orgânico, amônia, dióxido de enxofre, dióxido de carbono e hidrotermólise de pH controlado. Técnicas de pré- tratamento biológico podem inclui'· sem Lmitação aplicação de microorga- nismos de solubilizaçf.o de Iicsnra O pré-tratamento pode acontecer de vá- rios minutos a várias horas, ta! corno de a partir de cerca de 1 hora a cerca de 120.
Em uma modalidade, o pré-tratamento pode ser através de tem- peratura elevada e a adição ou de ácido diluído, ácido concentrado ou solu- ção alcalina diluída. A solução de pré-tratamento pode ser adicionada por um tempo suficiente para pelo menos parcialmente hidrolisar os componen- tes de hemicelulose e então neutralizada.
Em algumas modalidades, o pré-tratamento é selecionado de um grupo consistindo em explosão com vapor, esmagamento, moagem, hi- drólise ácida e combinações dos mesmos.
A celulase é reagida com o material celulósico em cerca de 25°C, cerca de 30°C, cerca de 35°C, cerca de 40°C, cerca de 45°C, cerca de 50°C, cerca de 55°C, cerca de 60°C, cerca de 65°C, cerca de 70°C, cerca de 75°C, cerca de 80°C, cerca de 85°C, cerca de 90°C, cerca de 95°C, cerca de 100°C. Em algumas modalidades as enzimas são reagidas com substrato na ou mais ou menos na temperatura de desnaturação térmica da celulase. O pH pode variar de a partir de cerca de pH 5, cerca de pH 5,5, cerca de pH 6, cerca de pH 6,5, cerca de pH 7, cerca de pH 7,5, cerca de pH 8,0 a cerca de pH 8,5. Em geral, a faixa de pH será de a partir de cerca de pH 4,5 a cerca de pH 9. Incubação da celulase sob essas condições resulta em liberação de quantidades substanciais do açúcar solúvel a partir do material celulósico. Por quantidade substancial entende-se pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de açúcar solúvel sendo açúcar dispo- nível.
O tratamento com celulase pode acontecer a partir de vários mi-
nutos a várias horas, tal como de a partir de cerca de 0,1 hora a cerca de 120 horas, de preferência cerca de 120 horas a cerca de 72 horas, com mais preferência cerca de 24 horas a 48 horas.
A quantidade de ceiuléise é urna função da(s) enzima(s) aplica- da(s) e do tempo de reação e condições ciados. De preferência, a(s) celula- se(s) podem ser dosadas em uma cuantidade total de a partir de cerca de 2 - 40 mg/g de materiai c^ulòsico. Nos métodos dr presente descrição, a celulase pode ser celula- se integral, urna celulase integra! suplementada com uma ou mais atividades de enzima e misturas de ceiulase. Em algumas modalidades, a celulase po- de ser uma preparação de celulase integral. Conforme aqui usado, a expres- são "preparação de celulase integral" refere-se a composições contendo ambas as celulases de ocorrência natural e de ocorrência não-natural. Uma composição de "ocorrência natural" é uma produzida por uma fonte de ocor- rência natural e que compreende um ou mais componentes tipo celobioidro- lase, um ou mais tipo endoglucanase e um ou mais beta-glicosidase onde
cada um desses componentes é encontrado na razão produzida pela fonte. Uma composição de ocorrência natural é uma que é produzida por um orga- nismo não-modificado com relação a enzimas celulolíticas de modo que a razão das enzimas componentes é inalterada daquelas produzidas pelo or- ganismo nativo.
Em geral, as celulases podem incluir, mas não estão limitadas a:
(i) endoglucanases (EG) ou 1,4-p-cl-glicano-4-glicanoidrolases (EC 3.2.1.4),
(ii) exoglicanases, incluindo 1,4-p-d-glicano glicanoidrolases (também co- nhecidas como celodextrinases) (EC3.2.1.74) e 1,4-3-d-glicano celobioidro- Iases (exo-clobioidrolases, CSH) (EC 3.2.1.91) e (iii) β-glicosidase (BG) ou
β-glicosídeo glicoidroiases (EC 3.2.1 21).
Na presente descrição, a celulase pode ser de qualquer micro- organismo que seja útil para a hidróüse de um material celulósico. Em algu- mas modalidades, a celulase é urna celulase integral de fungos filamento- sos. "Fungos filamentosos" inciuem todas as formas filamentosas da subdi-
visão Eumycota e Oomycota.
Em algumas modalidades, a celulase é uma espécie Acrmoni- um, Aspergillus, Emencella. Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Scytalkliurn, Tniavaiia. Toiypocladium ou Trichoderma, celulase integral.
Em algumas modalidades, a celulase é uma celulase integral de
Aspergillus aculeaius, Aspergiiius awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niduian. As^ergiHus niger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto, celuiase é unia ceíuiase integral cie Fusarium bactridioides, Fusarium eerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusariurn grarninum, Fusarium heterosporum, Fusarium ne- gundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusa- rium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusa- rium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ou Fusari- um venenatum. Ern outro aspecto, a celuiase é uma celuiase integral de Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Scytalidium thermophilum ou Thielavia ter- restris. Em outro aspecto, a celuiase é uma Triehoderma harzianum, Trieho- derma koningii, Triehoderma longibraehiatum, Triehoderma reesei, por e- xemplo, RL-P37 (Sheir-Neiss e outros, Appl. Mierobioi. Bioteehnology, 20 (1984) pp. 46-53; Montenecourt1 B.S., Can., 1-20, 1987), QM9414 (ATCC N0 26921), NRRL 15709, ATCC 13601, 56764, 56466, 56767 ou Triehoderma viride, por exemplo, ATCC 32098 e 32086, celuiase integral.
Em algumas modalidades, a celuiase é uma celuiase integral RutC30 de Triehoderma reesei, que está disponível da American Type Cultu- re Collection como Trichoderma reesei ATCC 56765.
Na presente descrição, a células pode ser de qualquer método de cultivo de microorganismo conhecido na técnica resultando na expressão de enzimas capazes de hidrólise de um material celulósico. Fermentação pode incluir cultivo com frasco agitado, fermentação em pequena ou grande escala, tal como contínua, em batelada ou fed-bateh, ou fermentações em estado sólido em laboratório ou ferrnentadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitem que a celuiase seja expressa ou isolada.
Em geral· o microorganismo é cultivado em um meio de cultura celular adequado para produção de enzimas capazes de hidrólise de um material celulósico. O culíi/c acontece em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbcno e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na lécrica. Meios de cultura, faixas de tempera- tura e outras condições adequadas para crescimento e produção de celuiase são conhecidos na técnica. Corne iri exemplo não-!imitante, a faixa de tem- peratura normal para a produção de celulases através de Trichoderma ree- sei é 24°C a 28°C.
Certos fungos produzem sistemas de celulase complexo que incluem exo-celobioidrolases ou celulases tipo CBH, endoglucanases ou ce- lulases tipo EG e beta-glicosidases ou celulares tipo BG (Schulein, 1988). No entanto, algumas vezes esses sistemas não têm celulases tipo CBH, por exemplo, celulases bacterianas também tipicamente incluem poucas ou quaisquer celulases tipo CBH. Ainda, foi mostrado que os componentes EG e os componentes CBH interagem sinergisticamente para mais eficiente- mente degradar celulose. Vide, por exemplo, Wood, 1985. Os componentes diferentes, isto é, as várias endoglucanases e as várias exocelobioidrolases em um sistema de celulase multicomponente ou completo geralmente têm propriedades diferentes, tal como ponto isoelétrico, peso molecular, grau de glicosilação, especificidade de substrato e padrões de ação enzimática.
Em algumas modalidades, a celulase é usada como é produzida através de fermentação sem nenhuma ou com mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, uma vez celulases sendo secretadas por uma cé- lula no meio de cultura celuiar, o meio de cultura celular contendo as celula- ses pode ser usado. Em algumas modalidades, a preparação de celulase integral compreende os teores nãc,-.'racionados de material de fermentação, incluindo meio de cultura celular, enzimas extracelulares e células. Alternati- vamente, a preparação de celulase integra! pode serprocessada através de qualquer método convencionai, por exemplo, através de precipitação, centri- fugação, afinidade, filtragem oj qualquer outro método conhecido na técnica. Em algumas modalidades, a preoaração de celulase integral pode ser con- centrada, por exemplo, e então UMada sem purificação adicional. Em algu- mas modalidades a preparação ca celulase integral compreende agentes químicos que dinf nuern a viab/.idade celular ou matam as células. Em algu- mas modalidades, as células são isadas ou permeabilizadas usando méto- dos conhecidos na técnica.
Urna celdasa conter,-do -Jma Quantidade grande de celobioidro- Iase e/ou beta-glicosidase encontra utilidade em produção de etanol. Etanol deste processo pode ser usado mais como um aumentador de octano ou diretamente como um combustível rio lugar de gasolina que é vantajoso por- que o etanol como uma fonte de combustível é mais ambientalmente amigá- vel do que produtos derivados do petróleo. É conhecido que o uso de etanol vai melhorar a qualidade do ar e possivelmente reduzir os níveis de ozônio e poluição locais. Além disso, utilização de etanol no lugar de gasolina pode ser de importância estratégica em abrandar o impacto de mudanças repenti- nas em suprimentos de energia não-renovável e petroquímicos. Etanol pode ser produzido através de processos de sacarifica-
ção e fermentação a partir de biomassa celulósica tal como árvores, plantas herbáceas, esgoto público e resíduos agriculturais e florestais. No entanto, a razão de enzimas celulases individuais dentro de uma mistura de celulase de ocorrência natural produzida por um micróbio pode não ser a mais efici- ente para conversão rápida de celulose em biomassa em glicose. É conhe- cido que endoglucanases agern para produzir novas extremidades de cadeia de celulose que são em si substratos para a ação de celobioidrolases e en- tão melhoram a eficiência de hidróiise por todo o sistema de celulase inte- gral. Deste modo, o uso de atividade de celobioidrolase alta ou otimizada pode melhorar muito a produção de etanol.
Etanol pode ser produzido através de degradação enzimática de biomassa e conversão dos sacarídeos liberados em etanol. Este tipo de eta- nol é freqüentemente referido como bioetanol ou biocombustível. Ele pode ser usado como um aditivo ou extorisor de combustível em misturas de me- nos do que 1% e até 100% (um substituto de combustível).
Conversão de celulose grande pode ser conseguida em tempe- raturas maiores usando os poíipeptídios CBH descritos, por exemplo, em uma das Publicações cie Patente US US20050054039, US20050037459, US20060205042, U32 0050040619,,1 e US20060218671. Métodos de su- perexpressão de bsta-glicoáidase são conhecidos na técnica. Vide, por e- xemplo, US 6.022.725. v'íde íambé n, por exemplo, US20050214920.
Ern algum.-s modalicaies, a celulase é uma proteína de fusão de exo-celobioidrolase, exemplos adequados incluem CBH1 e endoglucana- se de Acidothermus celluloiyticus ou endoglucanase de Thermobifida fusca, CBH1 e endoglucanase Acidothermus celiulolyticus e particularmente uma endoglucanase de Acidctherrius csllulolyticus E1 ou GH74 (vide, por exem- pio, Publicação de Patente US N0 20C60057672).
Em algumas modalidades, a mistura de celulase compreende uma celulase selecionada de Endoglucanase de Trichoderma reesei (EG1), celobioidrolase de Triehodemia reesei 1 (CBH1) e celobioidrolase de Tricho- derma reesei (CBH2), celobioidrolase de Humieola grisea (CBH1) e endo- glucanase de Acidothermus celiulolyticus El (E1), exocelulase de Thermo- monospera fusca E3 e combinações dos mesmos.
Os métodos da presente invenção podem ser usados na produ- ção de monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos como agentes químicos, matérias-primas de fermentação para microorganismo e indutores para a produção de proteínas, produtos orgânicos, agentes químicos e com- bustíveis, plásticos e outros produtos ou intermediários. Em particular, o va- lor de resíduos de processamento (grão de destiladores secos, grãos gastos de fermentação, bagaço da cana-de-açúcar, etc) pode ser aumentado atra- vés de solubilização parcial ou completa de celulose ou hemicelulose. Em adição a etanol, alguns agentes químicos que podem ser produzidos a partir de celulose e hemicelulose incluem acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (por exemplo, ácido láctico). 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol, furfuraL poliidroxialcanoatos, ácido cís, cis-mucônico, ração animal e xilose.
O presente ensinamento provê ainda métodos para conversão
de um material celulósico em glicose compreendendo combinar um material celulósico com uma celuiase, incubaçâo da dita combinação de material ce- lulósico e celulase, causar uma reação de hidrólise para converter material celulósico err, açúcares solúveis, jncle os ditos açúcares solúveis compre- endem glicose e celobiose e a fração de glicose é pelo menos 0,75 com re- lação aos ditos açúcares solúveis.
O presenÍA- snsir.arnôíito provê ainda métodos para conversão de um material celulósico em celobiose compreendendo combinar um mate- rial celulósico com urna mistura de ceiulase compreendendo uma endoglu- canase 1. Em algumas modalidades, a endoglucanase 1 pode compreender uma endoglucanase de Aciclothermus cellulolyticus, incluindo aquelas descri- tas nas Pat. U.S. N0S 5.538.655 e 6.013.860 e Publicações de Pedido de Patente N0S 2003/0109011, 2006/0023715, 20060057672.
Em algumas modalidades, os métodos da presente descrição compreendem ainda e etapa de determinação da quantidade de glicose ou açúcares solúveis.
São também providos métodos de conversão de um material celulósico em glicose compreendendo as etapas de combinar um material celulósico com uma ceiulase de modo que a combinação resultante de mate- rial celulósico e ceiulase tem 1% a cerca de 30% de celulose em peso; e incubação da dita combinação de material celulósico e ceiulase em uma temperatura maior do que cerca de 38°C a cerca de 100°C por cerca de 0,1 hora a cerca de 96 horas em um pH cie a partir de cerca de 4 a cerca de 9 causa uma reação de nidrólise para converter pelo menos 20% do dito mate- rial celulósico em açúcares solúveis, onde os ditos açúcares solúveis com- preendem glicose e celobiose, e a fração de glicose é pelo menos 0,75 com relação aos ditos açúcares solúveis.
São providos aqui métodos de conversão de um material celuló- sico em celobiose compreendendo as etapas de combinação de um material celulósico com uma mistura de ceiulase compreendéndo uma endoglucana- se 1 de modo que a combinação resultante de material celulósico e mistura de ceiulase tem 1% a cerca de 30% de celulose em peso; e incubação da dita combinação de material celulósico e ceiulase em uma temperatura de menos do que cerca de IOO0C a cerca de 25°C por cerca de 0,1 hora a cer- ca de 96 horas em um ρH de a p^rcir de cerca de 4 a cerca de 9 para causar uma reação da Ndrclisa para ,Xjnverter até f:0% do dito material celulósico em açúcares solúveis, onds os ditos açúcares solúveis compreendem glico- se e celobiose e a vraçíio cie c-lsoose é menos do que cerca de 0,5 com rela- ção aos ditos açúcares soíú^Is. A presente invenção é descrita em mais detalhes nos exemplos que seguem que não pretendem de modo algum limitar o escopo da inven- ção conforme reivindicado. As Figuras anexas pretendem ser consideradas como partes integrais da especificação e descrição da invenção. Todas as referências citadas são aqui especificamente incorporadas a título de refe- rência para tudo que é descrito aqui.
Aspectos dos presentes ensinamentos podem ser ainda com- preendidos à luz dos exemplos que seguem, que não devem ser considera- dos como Iimitantes do escopo dos presentes ensinamentos. Será aparente àqueles versados na técnica que muitas modificações, ambos a materiais e métodos, podem ser praticadas sem se afastar dos presentes ensinamentos. 7. EXEMPLOS
Conversão de celulose foi avaliada através de técnicas conheci- das no campo. Vide, por exemplo, Baker e outros, Appl. Biochem. Biotech- no|. 70-72:395-403 (1998) e conforme descrito abaixo. Cento e cinqüenta microlitros de substrato por cavidade foram carregados em uma placa de microtitulação (MTP) de 96 cavidades de fundo plano usando uma pipeta de repetição. Vinte microtitros de solução de enzima apropriadamente diluída foram adicionados em cima. As placas foram cobertas com seladores de placa de alumínio e postas en incubadoras em qualquer temperatura de tes- te, com agitação, pelos tempos especificados. A reação foi terminada atra- vés da adição de 100 μΙ de Glicina 100 mM pH 10 a cada cavidade. Com mistura completa, os seus teores foram filtrados através de uma placa de filtro de 96 cavidades Millipore (0,45 um, PES). O filtrado foi diluído em uma placa contendo 100 pL de Glicina 10 mM pH 10 e a quantidade de açúcares solúveis produzida medida através úe HPLC. As HPLCs Agilent 1100 séries eram todas equipadas com uma coluna de de-ashing/guard (Biorad N0 125- 0118) e uma coluna de carboidrato baseada em chumbo Aminex (Aminex HPX-87P). A fase móvel era água com uma taxa de fluxo de 0,6 ml/min. Resto de milho pré-tf atado (PCS) - Resto de milho foi pré-tratado
com 2% p/p de H3SC4 οοηίοπτιβ deôci.to em Schell, D. e outros, J. Appl. Bi- ochem. Biotechno!. 105:St)-ü6 (2000) e seguido por lavagens múltiplas com água deionizada para obler um pH cie 4,5. Acetato de sódio foi adicionado para fazer urna concentração fins! de 50 mM e a solução foi titulada para pH 5,0. A concentração de celulase nzι mistura de reação era aproximadamente 7%.
Usando as celulases que seguem: celulase integral de Trieho-
derma reesei superexpressando beía-glícosidase 1 (WC - BGL1) (vide, por exemplo, Patente U.S. N0 6.022.725), celulase integral de Trichoderma ree- sei expressando uma proteína de fusão CBH1-E1 (WC - CBH1-E1) (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N0 20060057672), Endoglucanase de Trichoderma reesei 1 (EGi)1 celobioidrolase 1 de Trichoderma reesei (C- BH1) e celobioidrolase 2 de Trichoderma reesei (CBH2), celobioidrolase 1 de Humieola grisea (CBH1) e endoglucanase E1 de Aeidothermus eellulolytieus (E1), exocelulase E3 de Thermomonospera fusca 3. A quantidade de enzima foi provida em miligramas por grama de celulose. Os resultados são resumi- dos nas Figuras 1-12. A ordenada representa a fração de glicose com rela- ção ao açúcar tota! (base peso/peso). Por exemplo, nas figuras 1-10, (A) a ordenada representa a duração de tempo de conversão e nas figuras 1-10, (B) a abscissa representa a conversão de açúcar solúvel total que é obser- vada (cada tempo de incubação não é explicitamente marcado, mas um úl- timo tempo de incubação é indicado por conversão maior).
As figuras IAB mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em àcucares solúveis através de 3,3 mg/g de celulase in- tegral de Triehoderma reesei superexpressando bèrta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados). Celulase integral de T. ree- sei com níveis de β-glicosidase elevados converte resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração nraior de glicose a 53°C do que a 38°C.
As figo/as 2A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açCcares solúveis através de 12 mg/g de celulase in- tegral de Trichodermti reesei superexpressando beta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (s'inb3bs fechados). Celulase integral de T. ree- sei com níveis de β-glieosidase elevados converte resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração rr.aiur de glicose a 533C do que 38°C. As figuras 3A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 18 mg/g de celulase in- tegral de Trichoderma mesd super expressando beta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados). Celulase integral de T. ree- 5 sei com níveis de β-glicosidase elevados converte resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração maior de glicose a 53°C do que a 38°C.
As figuras 4A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 20 mg/g de celulase integral de Tri- choderma reesei superexpressanclo beta-glicosidase 1 a 38°C (símbolos 10 abertos) e 53°C (símbolos fechados). Celulase integral de T. reesei com ní- veis de β-glicosidase elevados converte resto de milho pré-tratado com áci- do em uma fração maior de g'icose a 53°C do que a 38°C.
As FIGURAS 5A-B mostram a conversão de resto de milho tra- tado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 25 mg/g de celulase 15 integral de Trichoderma reesei superexpressando beta-glicosidase, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados). Celulase integral de T. ree- sei com níveis de β-glicosioase elevados converte resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração maior de glicose a 53°C do que a 38°C.
As figuras 6A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 12 mg/g de celulase in- tegral de Trichoderma reesei, a 38CC (símbolos abertos) e 53°C (símbolos fechados). Celulase integral de T. reesei converte resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração maior de clicose a 53°C dóque a 38°C.
As figuras 7A-B mosvram a conversão de resto de milho tratado 25 com ácido diluído em açúcares solúveis através de 12 mg/g de celulase in- tegral de Trichoderma reesei expressando uma proteína de fusão CBH1, a 38°C (símbolos abertos) e 53°C (símboios fechados). Celulase integral de T. reesei converte resto de rniího pré-i, atado com ácido em uma fração maior de glicose a 53;C do que a 'WC.
As figuras SA-B nusTíir:, c, conversão de resto de milho tratado
com ácido diluído er>. açúc.ê..\% solúveis axravés de 15 mg/g de uma mistura de celulase composta o j d=· EGi cie T reesei e CBH1 de T. reesei (quadra- dos) ou E1 e CBH l úe H. grísea (círculos) a 38°C (símbolos abertos) e 65°C (símbolos fechados). Misturas de celulase contendo E1 convertem resto de milho pré-tratado com ácido ern urna fração maior de celobiose do que mis- turas contendo EG1.
5 As figuras 9A-B mostram a conversão de resto de milho tratado
com ácido diluído em açúcares solúveis através de 15 mg/g de uma mistura de celulase composta ou de EG1, CBH1 de T. reesei e CBH2 de T. reesei (quadrados) ou E1, CBH1 de H. gnsea e CBH2 de T. reesei (círculos) a 38°C (símbolos abertos) e 65°C (símbolos fechados). Misturas de celulase con- 10 tendo E1 convertem resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração maior de celobiose do aue misturas; contendo EG1.
As figuras 10A-B mostram a conversão de resto de milho tratado com ácido diluído em açúcares solúveis através de 15 mg/g de uma mistura de celulase composta ou da EGIj C3H1 de T. reesei e E3 de T. fusca (qua- 15 drados) ou E1, CBH1 de H, gnsea s E3 de T. fusca (círculos) a 38°C (símbo- los abertos) e 65°C (símbolos fechados). Misturas de celulase contendo E1 convertem resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração maior de celobiose do que misturas contendo EG1.
As Figuras 11A-F mosíram a conversão de resto de milho trata- 20 do com ácido em açúcares solúveis airavés de celulase integral de Tricho- derma reesei a 53°C (símbolos -echados) e 59'C (símbolos abertos) por 1 dia (A e B), 2 dias (C e D) e 3 dias (E e F). A ordenada representa a fração de glicose com relação ao açúcar totai (base peso/peso) (A, B e E). A abs- cissa representa a dose de enzims; usada (B, D e E). A abscissa representa 25 a conversão de açúcar soiúveí total que é observada (cada dose não é expli- citamente marcada, mas urna dsse maior é indicada por conversão maior). Celulase integrai de 7. reesei co.iveste resto de milho pré-tratado com ácido em uma fração maior ae glicose em temperaturas altas.
As Figuras IiiA--F mos:iarn a conversão de resto de milho trata- do com ácido em açúcares solúveis através de uma celulase integral de Tri- choderma Γθθόθ! 0ApÍ0S-.>£: 'idü ,.rv-c, proteína de fusão CBH1-E1, a 53°C (símbolos fechados) a 591C (sí/ni oiws abertos) por (A e B) 1, (C e D) 2 e (E e F) 3 dias. A ordenada representa a fração de glicose com relação ao açú- car total (base peso/peso) (A, C e E). A abscissa representa a dose de en- zima usada (B, D e F). a. abscissa representa a conversão de açúcar solúvel total que é observada (cada dose não é explicitamente marcada, mas uma 5 dose maior é indicada por conversão naior). Celulase integral de T. reesei converte resto de milho pré-tratado cditi ácido em uma fração maior de gli- cose em temperaturas altas.
É compreendido que os e>emplos e modalidades descritos aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações ou mu- 10 danças à sua Iuz serão sugeridas a pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas no espírito e limites cio presente pedido e escopo das reivindi- cações apensas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente cita- dos aqui são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.
Claims (21)
1. Método para conversão de um material celulósico em glicose compreendendo as etapas de: combinação de um material celulósico com uma celulase de mo- do que a combinação resultante de material celulósico e celulase tem 1% a cerca de 30% de celulase em peso; e incubação da dita combinação de material celulósico e celulase em uma temperatura maior do que cerca de 38°C a cerca de 100°C por cer- ca de 0,1 hora a cerca de 96 horas em um pH de a partir de cerca de 4 a cerca de 9 para causar uma reação de hidróüse para converter pelo menos20% do dito material celulósico em açúcares solúveis, onde os ditos açúcares solúveis compreendem glicose e celobi- ose, e a fração de glicose é pelo menos 0,75 relativo aos ditos açúcares so- lúveis.
2. Método de acordo corn a reivindicação 1, onde o material ce- lulósico selecionado do grupo consistindo em culturas de bioenergia, resí- duos agriculturais, esgoto público, refugo sólido industrial, refugo de jardim, madeira, refugo florestal, grama switchgrass, papel de refugo, lama de fabri- cação de papel, grão de miiho, sabugos de milho, cascas de milho, restos de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, palha de arroz, bagaço de cana- de-açúcar, sorgo, soja, árvores, grama switchgrass, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz e gramas.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo pré-tratamento do dito material celulósico.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, onde o dito pré- tratamento é selecionado de um grupo consistindo em explosão de vapor, esmagamento, moagem, hidrólise ácida e combinações dos mesmos.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a- inda determinação tía auantidade ce glicose.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a- inda determinação ds quantidade ce açúcares solúveis.
7. ivleioC'0 n <3 rtíivinc!Íc?.oãG ι, unoe a quantidade de celulase é cerca de 2 - 40 ?r,g/g ti a naterial celulósico.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a dita celulase compreende uma celulase integral.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, onde a dita celulase integral é uma celulase integral de Trichoderma reesei.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, onde a dita Tricho- derma reesei expressa uma enzima recombinante.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, onde a dita enzi- ma recombinante é uma beta-glicosidase.
12. Método de conversão de um material celulósico em celobio- se compreendendo as etapas de: combinação de um matéria! celulósico com uma mistura de celu- lase compreendendo uma endoglucanase 1 de modo que a combinação re- sultante de material celulósico e rrrsiura de celulase tem 1% a cerca de 30% de celulose em peso; e incubação da dita combinação de material celulósico e celulase em uma temperatura de menos do que cerca de 100°C a cerca de 25°C por cerca de 0,1 hora a cerca de 96 horas em um pH de a partir de cerca de 4 a cerca de 9 para causar uma reação de hidrólise para converter até 50% do dito material celulósico em açúcares solúveis, onde os ditos açúcares solú- veis compreendem glicose e celobiose e a fração de glicose é menos do que cerca de 0,5 relativo aos ditos açúcares solúveis.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, onde o material celulósico selecionado do grupo consistindo em culturas de bioenergia, resí- duos agriculturais, esgoto púbiico, refugo sólido industrial, refugo de jardim, madeira, refugo florestal grama sv/itchgrass, papel de refugo, lama de fabri- cação de papel, grão cie milho, sabugos de milho, cascas de milho, restos de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, palha de arroz, bagaço de cana- de-açúcar, sorgo, soja, érvoies, grama switchgrass, feno, cevada, palha de cevada, palha cie arroz a gramas.
14. Método de acoroo co.r a reivindicação 12, compreendendo pré-tratamento do dito matéria! celulósico.
15. Método c!3 ficcrdo com a reivindicação 14, onde o dito pré- tratamento é selecionado de (rn grupo consistindo em expiosão com vapor, esmagamento, rnoagem, hiclróüse ácida e combinações dos mesmos.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda determinação da quantidade de glicose.
17. Método de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda determinação da quantidade de açúcares solúveis.
18. Método de acordo com a reivindicação 12, onde a quantida- de da dita mistura de celulase é cerca de 2 mg - 40 mg/g de material celuló- sico.
19. Método de acordo com a reivindicação 13, onde a dita mistu- ra de celulase compreende ainda uma celobioidrolase 1.
20. Método de acordo com a reivindicação 13, onde a dita mistu- ra de celulase compreende ainda urra celobioidrolase 2.
21. Método de acordo corn a reivindicação 13, onde a dita mistu- ra de celulase compreende ainaa Thermomonospera fusca E3.
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