BRPI0718747A2 - Variantes meganuclease que clavam uma ou sequência alvo de dna a partir do gene hprt e usos das mesmas. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES MEGANUCLEASE QUE CLIVAM UMA OU SEQÜÊNCIA ALVO DE DNA A PARTIR DO GENE HPRT E USOS DAS MESMAS".

A presente invenção refere-se a uma variante de meganuclease que cliva uma seqüência alvo de DNA a partir do gene HPRT1 a um vetor que codifica a variante, a uma célula, um animal ou uma planta modificados pelo vetor e ao uso da dita variante de meganuclease e produtos derivados para engenharia de genoma e terapia de genoma.

Meganucleases são por definição endonucleases de seqüência específica com grandes sítios de clivagem (>14 bp) que distribuem quebras de duplo filamento de DNA (DSBs) em locais específicos em células vivas (Thierry and Dujon, NucIeicAcids Res., 1992, 20, 5625- 5631). Meganuclea- ses têm sido usadas para estimular recombinação homólogo na vizinhança de suas seqüências alvo em células e plantas cultivadas (Rouet et al , Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096-106; Choulika et al, Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968-73; Donoho et al, Mol. Cell. Biol, 1998, 18, 4070-8; Elliott et al, Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 93-101; Sargent et al, Mol. Cell. Biol, 1997, 17, 267-77; Puchta et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93, 5055-60; Chiurazzi et al, Plant Cell, 1996, 8, 2057-2066), tornando recombinação induzida por mega- nuclease um método eficiente e robusto para engenharia de genoma.

O uso de recombinação induzida por meganuclease tem sido muito limitado pelo repertório de meganucleases naturais, e a maior limita- ção da tecnologia atual é a exigência para a indução anterior de um sítio que cliva meganuclease no lócus de interesse. Assim, a fabricação de meganu- cleases artificiais com especificidades de substrato personalizadas está sob investigação intensa. Tais proteínas poderiam ser usadas para clivar se- qüências de cromossomo genuínas e abrir novas perspectivas para enge- nharia de genoma em uma ampla faixa de aplicações. Por exemplo, mega- nucleases poderia ser usada para nocautear genes endógenos ou nocautear seqüências exógenas no cromossoma. Isto pode ser também usado para correção de gene, e em princípio, para a correção de mutações ligadas a doenças monogênicas. Na natureza, meganucleases são essencialmente representadas por endonucleases residentes (HEs)1 uma família de endonucleases codifi- cada por elementos genéticos móveis, cuja função é iniciar quebra de duplo filamento de DNA (DSB)-induzindo eventos de recombinação em um pro- cesso referido como residente (Chevalier and Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-74; Kostriken et al, Cell; 1983, 35, 167-74; Jacquier and Du- jon, Cell, 1985, 41, 383-94). Milhares de HEs têm sido identificadas em bac- térias, eucariótes, e archea (Chevalier and Stoddard, pré-citado); entretanto, a probabilidade de encontrar um Sítio de clivagem de HE em um gene esco- Ihido é muito baixa.

Dada sua função biológica e suas propriedades de clivagem ex- cepcionais em termos de eficácia e especificidade, HEs proveem elevações ideais para derivar novas endonucleases para engenharia de genoma.

, HEs pertencem a quatro maiores famílias. A família LAGLI- DADG, nomeada após um motivo peptídico conservado envolvido no centro catalístico, é o mais amplo e o melhor grupo caracterizado (Chevalier and Stoddard, pré-citado). Sete estruturas são agora disponíveis. Eqnuanto mais proteínas desta família são monoméricas e exibem dois motivos LAGLI- DADG, umas poucas têm apenas um motivo, mas dimerizam para clivar se- quências alvo palindrômicas ou pseudopalindrômicas.

Embora o peptídeo LAGLIDADG seja apenas a região conser- vada entre membros da família, essas proteínas compartilham uma estrutura muito similar (Figura IA). O núcleo catalítico é flanqueado por dois Domínios de ligação por DNA com uma perfeita simetria de dobradura para homodí- meros tais como I-Crel (Chevalier et al, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312-6) e I- Msol (Chevalier et al J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-69), e com uma pseudos- simetria para monômeros tal como I-Scel (Moure et al, J. Mol. Biol, 2003, 334, 685-95), I-Dmol (Silva et al., J. Mol. Biol., 1999, 286, 1123-36) ou I-Anil (Bolduc et al., Genes Dev., 2003, 17, 2875-88). Ambos os monômeros ou ambos os domínios (para proteínas monoméricas) contribuem para o núcleo catalítico, organizado em torno de cátions divalentes. Logo acima do núcleo catalítico, os dois peptídeos LAGLIDADG têm também um papel importante na interface de dimerização. A ligação de DNA depende duas dobraduras ββαββ em formato de sela, estabelecendo nas duas maiores aberturas de DNA. A análise da Estrutura I-Crel ligada ao seu objetivo natural mostra que em cada monômero, oito resíduos (Y33, Q38, N30, K28, Q26, Q44, R68 e R70) estabelecem interação direta com sete bases nas posições ± 3, 4, 5, 6, 7, 9 e 10 (Jurica et al., Mol. Cell., 1998, 2, 469-76). Em adição, alguns resí- duos estabelecem contato mediado por água com muitas bases; por exem- plo S40, K28 e N30 com o par de base na posição +8 e -8 (Chevalier et al., 2003, pré-citado). Outros domínios podem ser encontrados, por exemplo, em inteínas tais como PI-P/wl (Ichiyanagi et al., J. Mol. Biol., 2000, 300, 889- 901) e Pl-Scel (Moure et al., Nat. Struct. Biol., 2002, 9, 764-70), cujo domínio de unir proteína está também envolvido na ligação de DNA.

A preparação de Hes artificiais de cadeia simples e quiméricas funcionais, por fusão do domínio I-Dmol N- termnal com um monômero I- CreI (Epinat.çt al, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-62; Chevalier et al, Mol. Cell., 2002, 10, 895- 905; Steuer et al, Chembiochem,, 2004, 5, 206-13; Pedidos PCT Internacionais WO 03/078619 e WO 2004/031346) demonstrou a plasticidade de Proteínas LAGLIDADG: diferentes monômeros ou domí- nios de núcleo poderiam ser fundidos em uma única proteína, para obter novas meganucleases clivando novas seqüências alvo (não-palindrômicas).

Além do mais, diferentes grupos usaram uma abordagem racio- nal para localmente alterar a especificidade de I-Crel (Seligman et al, Gene- tics, 1997, 147, 1653- 64; Sussman et al, J. Mol. Biol., 2004, 342, 31-41; Se- ligman et al, Nucleic Acids Res., publicado em 13 de setembro de 2006; Ar- nould et al, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458 e Pedidos PCT Internacionais WO 2006/097853 e WO 2006/097784), I-Scel (Doyon et al, J. Am. Chem. Soe, 2006, 128, 2477-2484), Pl-Scel (Gimble et al, J. Mol. Biol., 2003, 334, 993-1008) e I-Msol (Ashworth etal, Nature, 2006, 441, 656-659)

Milhares de derivados de I-Crel com especificidade alterada fo- ram arquitetados combinando a abordagem semirracional e Seleção de Alta Capacidade (HTS; Arnould et al (pré-citado); Pedidos PCT Internacionais WO 2006/097853 e WO 2006/097784); resíduos Q44, R68 e R70 ou Q44, R68, D75 e 177 de I-Crel foram mutagenizados e uma coleta de variantes com especificidade alterada nas posições ± 3 a 5 (5NNN DNA alvo) foram identificados por seleção.

Em seguida, duas variantes diferentes (Figura IB; direita superior e esquerda inferior) foram combinadas e montadas em uma endonuclease heterodimérica funcional (figura IB; dreita inferior) capaz de clivar um alvo quimérico resultante da fusão de uma metade diferente de cada seqüência alvo de DNA de variante (Figura IB; Arnould et al., pré-citado; Pedido PCT Internacional WO 2006/097854). De forma interessante, as novas proteínas mativeram dobraduras e estabilidade próprias, alta atividade, e uma especi- ficidade limitada.

Portanto, uma estratégia de duas etapas pode ser usada para personalisar a especificidade de meganuclease LAGLIDADG natural. A pri- meira etapa é para mutagenizar localmente uma meganuclease LAGLI- DADG natural tal como I-Crel e para identificar coletas de variante com es- pecificidade alterada por seleção. A segunda etapa é para prevalecer a mo- dularidade dessas proteínas, e usar uma abordagem de combinação para preparar novas meganucleases, que clivam o sítio de escolha (Figura IB). A geração de coleta de novas meganucleases, e a capacidade de combiná-las montando dois monômeros/domínios de núcleo diferentes consideravelmen- te enriquece o número de seqüências de DNA que podem ser alvejadas, mas não ainda saturadas todas as seqüências potenciais.

Para alcançar um grande número de seqüências, seria extre- mamente valoroso ser capaz de identificar subdomínios independentes qe poderiam ser combinados (Figura 1C).

Entretanto, uma abordagem de combinação é muito mais difícil de se aplicar dentro de um único monômero ou domínio do que entre mo- nômeros uma vez que a estrutura da interface de ligação é muito compacta e duas estruturas ββ diferentes que são responsáveis por virtualmente todas as interações específicas de base não constituírem subdomínios separados, mas são parte de uma única dobradura. Por exemplo, na parte interna das regiões de ligação de DNA de l-Crel, a trinca gtc é ligada por um resíduo da primeira estrutura (Q44), e dois resíduos da segunda estrutura (R68 e R70; ver Figura IB de Chevalier et al., 2003, pré-citado). Em adição, o impacto cumulativo de uma série de mutação poderia eventualmente romper a pró- pria dobradura.

No lugar desta falta de modularidade aparente no nível da estru-

tura, o inventor demonstrou que resíduos 28 a 40 e 44 a 77 de I-Crel formam dois subdomínios funcionais separáveis, capazes de ligar partes distintas de um meio sítio de endonuclease residente.

Montando dois subdomínios a partir de monômeros ou domínios de núcleo diferentes dentro do mesmo monômero, o inventor elaborou vari- antes de endonuclease residente (homodimérica) funcionais, que são capa- zes de clivar alvos quiméricos palindrômicos (Figura 1C). Além do mais, uma ampla abordagem de combinação é permitida montando quatro subdomínios diferentes para formar novas moléculas heterodiméricas que são capazes de clivar alvos quiméricos não-palindrômicos (Figura ID). Os diferentes subdo- mínios podem ser modificados separadamente para construir novas especi- ficidades de clivagem e combinar em uma variante de meganuclease (ho- modímero, heterodímero, molécula de cadeia simples) que é capaz de clivar um alvo a partir de um gene de interesse. O gene fosforibosiltransferase de hipoxantina (HPRT) é um gene

de cópia único localizado no Cromossoma X e assim presente em uma cópia (células XY) ou expressos a partir de apenas um alelo (células XX). Por e- xemplo, O gene do camundongo e do humano HPRTs estão disponíveis no banco de dados NCBI, sob o número de acesso NC_000086 e NC 000023, respectivamente. Ambos os genes têm 9 éxons (Figura 2) que são transcri- tos para um mRNA de bases 1289 (camundongo; número de acesso NM 013556) ou mRNA bases 1331 (humano; número de acesso NM_000194), contendo o ORF HPRT a partir das posições 88 a 744 (camundongo) ou 86 a 742 (humano). O mRNA do Hamster Chinês (Criteculus sp.) é uma se- quência de bases 1301 (número de acesso J00060.1) contendo o ORF H- PRT a partir das posições 91 a 747.

Fosforibosiltransferase de hipoxantina é uma enzima que catali- sa a conversão de 5-fosforribosil-1-pirofosfato e hipoxantina, guanina, ou 6- mercaptopurina para o 5'-mononucleotídeos e pirofosfato correspondentes. A enzima é importante na biossíntese da purina bem como na função do sis- tema nervoso central. Dada sua função biológica, o Gene HPRT é usado como um marcador selecionável para os exeperimentos que objetivam gene. Comparados a outros marcadores de seleção, HPRT tem a vantagem de ser ambos um marcardor de seleção positivo ou um negativo. Em adição, muta- ções no gene HPRT são associadas com a Síndrome de Lesch-Nyhan.

Gene alvo do HPRT de camundongo foi realizado primeiramente em células estaminais derivadas de embrião (ES) por Thomas, K.R. e M.R. Cappechi (Cell, 1987, 51, 503- 512). Entretanto, eficiências permanecem muito baixas (cerca de 10"7 de células transfectadas). A capacidade de gerar uma quebra de duplo filamento no lócus de HPRT provê um meio para signi- ficativamente melhorar a recombinação homólogo no lócus. Usando alvo de gene clássico, Donoho et al. (Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070-4078) introdu- ziu-se sítios de clivagem para a meganuclease 1-SceI no Gene HPRT de camundongo. Em uma segunda etapa, eles poderiam induzir alvo de gene em 1% das células por co-transformação com uma matriz de reparo e um vetor de expressão l-Scel. Assim, uma meganuclease artificial alvejando Lócus de HPRT

irá permitir inserções de gene eficiente (Figura 3A). A capacidade para inse- rir eficientemente genes nestes lócus tem a vantagem de permitir níveis de expressão reproduzíveis bem como linhas de tempo previsíveis para gerar inserções.

Adicionalmente, como foi descrito para camundogos (van der

Lugt et al. Gene, 1991, 105, 263-267; Selfridge et al, Somat. Cell. Mol. Ge- net, 1992, 18, 325- 336), HPRT pode ser usado como um marcador selecio- nável para experimentos que objetivam gene alvo.

O procedimento alvo de gene de recolocação dupla, que foi ori- ginalmente sugerido por Reid e cooperadores (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 4299-4303) é baseado em marcadores selecionáveis de HPRT (MaGIn et al., Gene, 1992, 122, 289- 296), para produzir camundongos com alterações de gene súbitas. Este procedimento é baseado no uso de minige- nes de fosforribosiltransferase de hipoxantina (HPRT) em células estaminais embriônicas deficientes de HPRT e a capacidade de selecionar ambos para e contra expressão HPRT.

Na primeira etapa, para inativar o alvo, uma região do lócus alvo

é recolocada com um minigene HPRT, com HAT (hipoxantina/aminopte- rin/timidina; (Littlefield J.W., Science, 1964, 145, 709-) seleção para expres- são de marcador HPRT. HAT é uma mistura de hipoxantina de sódio, ami- nopterin e timidina. Aminopterin é um potente antagonista de ácido fólico, que inibe reductase de di-hidrofolato bloqueando a nova síntese de nucleo- sídeo. Células podem apenas sobreviver em HAT se os percursos selvagens de purina e pirimidina forem ativos. Hipoxantina é o substrato para recurso selvagem de purina. Assim, mutantes de HPRT são incapazes de utilizar o percurso selvagem de purina e são sensitivos à seleção de HAT. Na segunda etapa alvo o minigene de HPRT é por si só recolo-

cado com uma região alterada do gene alvo para reconstituir o lócus, com seleção para perda de marcador HPRT usando o análogo de purina 6- tioguanina (6-TG).

Entretanto, isto exige que as células antes da introdução do marcador contenham um HPRT de gene inativo. Assim, uma meganuclease artificial alvejando o Gene HPRT poderia ser usada para inativar o Gene HPRT (Figura 3 A e B).

A Síndrome de Lesch-Nyhan é um distúrbio inerente trnasmitido como um carácter que é causado por uma deficiência de HPRT e caracteri- zado por hiperuricemia, incapacidade motora severa e comportamento auto- prejudicial. Uma coleta muito heterogênia de mutações associadas com a doença Lesch-Nyhan ou fenótipos clínicos menos severos com apenas al- gumas porções da síndrome completa, têm sido identificados. Estratégias de terapia gênica atuais são baseadas em uma abordagem complementar, em que uma cópia extra aleatoriamente inserida mas funcional do gene propor- ciona a função da cópia endógena mutada. Em contraste, recombinação in- duzida por meganuclease deveria permitir a correção precisa de mutações in situ (Figura 3C) e assim evitat o risco devido a transgenes inseridos aleatori- amente encontrados com abordagens de terapia atuais (Hacein-Bey-Abina et al, Science, 2003, 302, 415-419).

A forma mais precisa de corrigir um defeito genético é usar uma matriz de reparo com uma cópia não mutada do gene, resultando em uma revisão da mutação (Figura 3C). Entretanto, a eficiência da correção do gene diminui conforme a distância entre a mutação e o DBS cresce, com uma di- minuição de 5 vezes por 200 bp de distância. Portanto, uma dada meganu- clease pode ser usada para corrigir apenas mutações na vizinhança de seu alvo DNA. Uma alternativa, chamada "knock-in de éxon" é e mostrada na figura 3D. Neste caso, uma meganuclease que cliva na parte 5' do gene po- de ser usada para seqüências exônicas funcionais a jusante da mutação prejudicial. Embora este método coloque o transgene em sua localização regular, ele também resulta na duplicação de éxons, que impactam na longa faixa que permanece para ser avaliada. Em adição, elementos de atuação eis deveriam ser colocados naturalmente em uma íntrom a montante da cli- vagem, seu ambiente imediato seria modificado e sua função própria tam- bém seria explorada, este método tem uma vantagem tremenda: uma única meganuclease poderia ser usada para muitos pacientes diferentes.

O inventor indentificou uma série de alvos de DNA no gene H- PRT que poderiam ser clivados por Variantes I-Crel (Figuras 2 e 19). A a- bordagem de combinação descrita na figura 1D foi usada para montar quatro conjuntos de mutações em endonucleases residentes heterodiméricas com especificidade completamente construída, para clivar os alvos de DNA a par- tir do gene HPRT. Essas variantes I-Crel que são capazes de clivar um alvo de DNA genômico a partir do gene HPRT podem ser usadas para engenha- ria de genoma no Lócus de HPRT ("knock-out" e "knock-in") e para usar HPRT como um marcador selecionável para engenharia de genoma em qualquer lócus (Figura 3A e 3B).

Em adição, essas meganucleases poderiam ser usadas para re- parar as Mutações de HPRT associadas com a Sindrome de Lesch-Nyhan (Figura 3C e 3D). θ A invenção refere-se ao uso de uma variante I-Crel ou um deri- vado de cadeia simples para induzir uma modificação de local específico no gene HPRT, para finalidades não-terapêuticas, em que a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples tem pelo menos uma substituição em um dos dois subdomínios funcionais do domínio núcleo LAGLIDADG situado a partir das posições 26 a 40 e 44 a 77 de I-Crel1 e é capaz de clivar uma seqüência alvo de DNA selecionada a partir dos grupos consistindo nas seqüências SEQ ID NO: 1 a 14.

A atividade de clivagem da variante como definido na presente invenção pode ser medida por qualquer ensaio de clivagem, in vitro ou in vivo, bem-conhecido, tal como aqueles descritos no Pedido PCT Internacio- nal WO 2004/067736, Arnould et al. (J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458), Epi- nat et al. (Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962) e Chames et al. (Nucleic Acids Res., 2005, 33, el 78). Por exemplo, a atividade de clivagem da varian- te da invenção pode ser medida por um ensaio de recombinação de repeti- ção direta, em leveduras ou células de mamífero, usando um vetor de relató- rio. O vetor de relatório compreende duas cópias não-funcionais, truncadas de um gene de relatório (repetições diretas) e a seqüência alvo de DNA ge- nômica dentro da seqüência de intervenção, clonado em uma levedura ou um vetor de expressão de mamífero. Expressão da variante resulta em uma endonuclease funcional que é capaz de clivar a seqüência alvo de DNA ge- nômica. Esta clivagem induz recombinação homólogo entre as repetições diretas, resultando em um gene de relatório fncional, cuja expressão pode ser monitorada por ensaio apropriado.

Definições

- Resíduos de aminoácido em uma seqüência de polipeptídeo são designados aqui de acordo com o código de uma carta, em que, por e- xemplo, Q significa Gln ou Resíduo de glutamina, R significa Arg ou resíduo de Arginina e D significa Asp ou Resido de ácido aspártico.

- Nucleotídeos são designados como segue: código de uma car- ta é usado para designar a baede de um nucleosídeo: a é adenina, t é timi- na, c é citosina, egé guanina. Para os nucleotídeos degenerados, r repre- senta g ou a (nucleotídeos de purina), k representa g ou t, s representa g ou c, w representa a ou t, m representa a ou c, y representa t ou c (nucleotídeos de pirimisina), d representa g, a ou t, ν representa g, a ou c, b representa g, t ou c, h representa a, t ou c, e η representa g, a, t ou c.

- por "meganuclease". é pretendida uma endonuclease tendo uma seqüência alvo de DNA de filamento duplo de 14 a 40 pb. A meganu- clease é ou uma enzima dimérica, em que cada domínio é monômero ou uma enzima monomélica compreendendo os dois domínios em um único polipeptídeo.

- por "domínio de meganuclease" é pretandida a região que inte- rage com uma metade do alvo de DNA de uma meganuclease e é capaz de associar-se com outro domínio da mesma meganuclease que interage com outra metade do alvo de DNA para formar uma meganuclease funcional ca- paz de clivar o alvo de DNA.

- por "variante de meganuclease" ou "variante" é pretendida uma meganuclease obtida por recolocação de pelo menos um resíduo na se- qüência de aminoácido da meganuclease tipo selvagem (meganuclease na- tural) com um aminoácido diferente.

- por "variante funcional" é pretendida uma variante que é capaz de clivar uma seqüência alvo de DNA1 preferivelmente o alvo é um novo alvo que não é clivado pela meganuclease de origem. Por exemplo, tais variantes têm variações de aminoácido nas posições em contato com a seqüência al- vo de DNA ou interagindo direta ou indiretamente com o alvo de DNA.

- por "variante de meganuclease com nova especificidade" é pre- tendida uma variante tendo um padrão de diferentes alvos clivados a partir daquele da endonuclease residente de origem. Os termos "nova especifici- dade", "especificidade modificada", "nova especificidade de clivagem", "nova especificidade de substrato" que são equivalentes e usados indiferentemen- te, referem-se à especificidade da variante no que se refere aos nucleotí- deos da seqüência alvo de DNA.

- por "I-Crel" é pretendida o I-Crel tipo selvagem tendo a se- qüência SWISSPROT P05725 (SEQ ID NO: 143) ou código de acesso pdb 1g9y (SEQ ID NO: 144).

- por "domínio de núcleo LAGLIDADG" ou "domínio de núcleo" é pretendido "Domínio de núcleo de Endonuclease residente LAGLIDADG" que é a dobradura αιβιβ2α2β3β4α3 das endonucleases residentes da família LAGLIDADG, correspondente à seqüência de cerca de cem resíduos de a- minoácido. O domínio compreende quatro filamentos beta (P1, p2, ββ, β4) do- brados em uma folha beta que interage com uma metade do alvo de DNA. Este domínio é capaz de associar-se com outro Domínio de núcleo de En- donuclease residente LAGLIDADG que interage com uma metade do alvo de DNA para formar uma endonuclease funcional capaz de clivar o alvo de DNA. Por exemplo, no caso do I-Crel de endonuclease residente dimérica (163 aminoácidos), o Domínio de núcleo de Endonuclease residente LAGLI- DADG corresponde aos resíduos 6 a 94.

- por "meganuclease de cadeia simples" "meganuclease quimé- rica de cadeia simples", "endonuclease quimérica de cadeia simples", "deri- vado de meganuclease de cadeia simples", "derivado de meganuclease quimérica de cadeia simples" ou "derivado de cadeia simples" é pretendida uma meganuclease compreendendo dois Domínios de Endonuclease resi- dente LAGLIDADG ou domínios de núcleo ligados por um espaçador peptí- dico. A meganuclease de cadeia simples é capaz de clivar uma seqüência alvo de DNA quimérica compreendendo uma metade diferente de cada se- qüência alvo de meganuclease de origem.

- por "subdomínio" é pretendida a região de um domínio de nú- cleo de endonuclease redidente LAGLIDADG que interage com uma parte distinta de uma metade de sítio de alvo de DNA de endonuclease residente. Dois subdomínios diferentes se comportam independentemente e a mutação em um subdomínio não altera a ligação e a clivagem de propriedades de outro subdomínio. Portanto, dois subdomínios ligam parte distinta de uma metade de sítio de alvo de DNAde endonuclease residente.

- por "estrutura beta " é pretendido dois filamentos beta da folha beta antiparalela de um Domínio de núcleo de Endonuclease residente LA- GLIDADG (β-ιβ2 ou, β3β4) que são conectados por uma alça ou uma volta, - por "sítio de l-Crel" é pretendida uma seqüência de DNA de duplo filamento de 22 a 24 que é clivada por sítios l-Crel. I-Crel incluem o sítio residente I-Crel tipo selvagem (natural) não-palindrômico e as seqüên- cias palindrômicas derivadas tais como a seqüência 5 - L12C-11a-10a.9a-8a.7C. 6g-5t-4C.3g.2t-1 a+ic+2g+3a+4C+59+6t+7t+8t+9t+1 og+11 a+-i2 também chamada C1221 (SEQ ID NO :16; figura 10).

- por "alvo de DNA", "Seqüência alvo de DNA", "seqüência alvo", "sítio alvo", "alvo", "sítio"; "sítio de interesse"; "sítio de reconhecimento", "se- qüência de reconhecimento", "sítio de reconhecimento residente", "sítio resi- dente", "sítio de clivagem" é pretendida uma seqüência de polinucleosídeo não-palindrômica ou parcialmente palindrômica (pseudo-palindrômica) palin- drômica de duplo filamento de 20 a 24 bp que é reconhecida e clivada por uma Endonuclease residente LAGLIDADG tais como l-Crel, ou uma varian- te, ou uma meganuclease quimérica de cadeia simples derivada de l-Crel. Esses termos referem-se a uma localização de DNA distinta, preferivelmente uma localização genômica, em que uma quebra de duplo filamento (cliva- gem) é para ser induzida pela endonuclease. O alvo de DNA é definido pela seqüência 5' a 3' de um filamento do polinucleosídeo de duplo filamento, como indicado acima para C1221. A clivagem do alvo de DNA ocorre nos nucleotídeos nas posições +2 e -2, respectivamente para o filamento de sen- tindo e antissentido. A menos que de outra maneira indicado, a posição na qual a clivagem do alvo de DNA por uma variante de meganuclease I-Cre I ocorre, corresponde ao sítio de clivagem de HE no filamento de sentindo do alvo de DNA.

- por "meio sítio de alvo de DNA". "meio sítio de clivagem" ou "meio sítio" é pretendida a porção do alvo de DNA que é ligada por cada domínio de núcleo de Endonuclease residente LAGLIDADG.

- por "alvo DNA quimérico" ou "alvo de DNA híbrido" é pretendi- da a fusão de uma metade diferente de duas seqüências alvo de meganu- clease residente. Em adição, pelo menos uma metade do alvo pode com- preender a combinação de nucleotídeos que são ligados a pelo menos dois subdomínios separados (alvo de DNA combinado). - por "seqüência alvo de DNA a partir do gene HPRT" é preten- dida uma sequância de 20 a 24 bp de um gene HPRT que é reconhecido e clivado por uma variante de meganuclease.

- por "Gene HPRT" é pretendido o gene HPRT de um vertebra- do.

- por "vetor" é pretendida uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele foi ligado.

- por "homólogo" é pretendida uma seqüência com identidade suficiente para outra seqüência levar a uma recombinação homólogo entre seqüências, mais particularmente pelo menos 95% de identidade, preferi- velmente 97% de identidade e mais preferivelmente 99%.

- "identidade" refere-se à identidade de seqüência entre duas moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos. A identidade pode ser deter- minada comparando uma posição em cada seqüência que pode ser alinhada para finalidades de comparação. Quando uma posição na seqüência compa- rada está ocupada pela mesma base, em seguida as moléculas são idênti- cas naquelas posições. Um grau de similaridade ou identidade entre ácido nucleico ou seqüências de aminoácido é uma função do número de nucleo- tídeos idênticos ou de combinação nas posições compartilhadas pelas se- qüências de ácido nucleico. Vários algoritmos de alinhamento e/ou progra- mas podem ser usados para calcular a identidade entre duas seqüências, incluindo FASTA, ou BLAST que estão disponíveis como parte do pacote de análise da seqüência GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), e po- dem ser usadas com, por exemplo, parâmetross padrão.

- "indivíduo" inclui mamíferos, bem como outros vertebrados (por exemplo, pássaros, peixe e répteis). Os termos "mamífero" e "mamíferos", como usados aqui, referem-se a qualquer animal vertebrado, incluindo mo- notremos, marsupiais e de placenta, que amamentam seus filhotes e dão vida a vivíparos (eutharian ou mamíferos de placenta) ou ovíparos (metatha- rian ou mamíferos sem placenta). Exemplos de espécies de mamíferos in- cluem seres humanos e outros primatas (por exemplo, macacos, chimpan- zés), roedores (por exemplo, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia) e outros tais como, por exemplo: vacas, porcos e cavalos.

- por "mutação" é pretendida a substituição, deleção, inserção de uma ou mais nucleotídeos/aminoácidos em um polinucleosídeo (gene cD- NA,) ou uma seqüência de polipeptídeo. A mutação pode afetar a seqüência de código de um gene ou sua seqüência irregular. Ela pode também afetar a estrutura da seqüência genômica ou a estrutura/estabilidade do mRNA codi- ficado.

- "doença genética" refere-se a qualquer doença, parcial ou completamente, direta ou indiretamente, devido a uma anormalidade em um ou vários genes. A anormalidade pode ser uma mutação. A doença genética pode ser recessiva ou dominante.

Em uma modalidade preferida do uso de acordo com a presente invenção, as substituições no subdomínio situado a partir das posições 44 a 77 de I-Crel estão nas posições 44, 68, 70, 75 e/ou 77.

Em outra modalidades preferida do uso de acordo com a presen- te invenção, as substituições no subdomínio situado a partir das posições 26 a 40 de I-Crel estão nas posições 26, 28, 30, 32, 33, 38 e/ou 40.

Em outra modalidades preferida do uso de acordo com a presen- te invenção, a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples compreende a substituição de outros resíduos de aminoácido contactando a seqüência alvo de DNA ou interagindo com a estrutura principal de DNA com com as bases de nucleosídeo, diretamente ou via uma molécula de água; esses resíduos de interação I-Crel são bem-conhecidos na técnica.

Em outra modalidades preferida do uso de acordo com a presen- te invenção, a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples compreende uma ou mais substituições adcionais que melhoram a ligação e/ou atividade de clivagem da variante no que se refere ao alvo de DNA do gene HPRT como definido acima; essas substituições estão situadas na seqüência I-Crel inteira ou apenas na metade terminal C de I-Crel (posições 80 a 163)

Preferivelmente, as substituições adicionais estão na posição de I-Crel selecionadas a partir do grupo consistindo nas posições: 2, 9, 19, 42, 43, 54, 66, 69, 72, 81, 82, 86, 90, 92, 96, 100, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 113, 120, 125, 129, 130, 131, 132, 135, 136, 137, 140, 143, 151, 154, 155, 157, 158, 159, 161 e 162.

Mais preferivelmente a substituição está na mutação G19S ou G19A que aumenta a atividade de clivagem da variante I-Crel /derivados de cadeia simples. Ainda mais preferivelmente, a mutação é a mutação G19S que adicionalmente prejudica a formação de um homodímero funcional. A mutação G19S é vantajosamente introduzida em um ou dois monômeros de uma variante de heterodímeroe \-Cre\, de modo a obter uma meganuclease tendo atividade de clivagem melhorada e especificidade de clivagem melho- rada.

Em outra modalidade preferida do uso de acordo com a presente invenção, as substituições são recolocações dos aminoácidos iniciais nos aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo em: A, D, E, G, Η, K, Ν, P, Q, R, S, Τ, Y, C, V, L, W, M e I. Por exemplo:

- a Iisina (K) na posição 28 pode ser mutada em: R,

- a aspargina (N) na posição 30 pode ser mutada em: S, C, R, Y,

Q1DeT,

- a serina (S) na posição 32 pode ser mutada em: D, T, R, G e

W,

- a tirosina (Y) na posição 33 pode ser mutada em: Η, T, G, R, C,

Q1DeS,

- a glutamina (Q) na posição 38 pode ser mutada em: W, S, T, G, Ε, A, Y, C1 D e H

- a serina (S) na posição 40 pode ser mutada em: Q, A, T e R,

- a glutamina (Q) na posição 44 pode ser mutada em: Ν, T, R, K,

D, Y e A,

- a arginina (R) na posição 68 pode ser mutada em: K, Q, E, A,

Υ, Ν, H e T,

- a arginina (R) na posição 70 pode ser mutada em: S, Η, N e K,

- o ácido aspártico (D) na posição 75 pode ser mutado em: R, S, Ν, Υ, Ε, H e Q, e - a isoleucina (I) na posição 77 pode ser mutado em: T1 W, Υ, K, N1 R, H, D, F, E, Q e L.

Em adição, as variantes I-Crel como definido na presente inven- ção podem incluir um ou mais resíduos inseridos no terminal NH2 e/ou ter- minai COOH da seqüência l-Crel. Por exemplo, uma derivação (epítopo ou seqüência de poli-histina) é introduzida no terminal NH2 e/ou terminal CO- OH; a derivação é útil para a detecção e/ou a purificação da variante.

A variante I-Crel como definida na invenção pode ser um homo- dímero ou um heterodímero resultante da associação de um primeiro mo- nômero tendo pelo menos uma mutação nas posições 26 a 40 ou 44 a 77 de I-Crel e um segundo monômero que e I-Crel ou um variante l-Crel.

Em outra modalidades preferida do uso de acordo com a presen- te invenção, a variante I-Crel é um heterodímero, resultando da associação de um primeiro e um segundo monômero tendo diferentes mutações nas posições 26 a 40 e/ou 44 a 77 de l-Crel.

Em uma modalidade mais preferida, pelo menos um monômero tem pelo menos duas substituições, um em cada um dos dois subdomínios funcionais situado a partir das posições 26 a 40 e 44 a 77 de l-Crel.

Mais preferivelmente, o heterodímero consiste em um primeiro e um segundo monômero selecionado a partir dos seguintes pares de seqüên- cia: SEQ ID NO: 83 e 97, SEQ ID NO: 84 e 98, SEQ ID NO: 85 e 99, SEQ ID NO: 32 e 52, SEQ ID NO: 32 e 53, SEQ ID NO: 32 e 54, SEQ ID NO: 32 e

55, SEQ ID NO: 32 e 56, SEQ ID NO: 32 e 57, SEQ ID NO: 32 e 58, SEQ ID NO: 32 e 60, SEQ ID NO: 32 e 65, SEQ ID NO: 32 e 66, SEQ ID NO: 32 e

67, SEQ ID NO: 32 e 68, SEQ ID NO: 32 e 69, SEQ ID NO: 32 e 70, SEQ ID NO: 32 e 71, SEQ ID NO: 32 e 72, SEQ ID NO: 32 e 73, SEQ ID NO: 32 e 74, SEQ ID NO: 75 e 56, SEQ ID NO: 76 e 56, SEQ ID NO: 77 e 56, SEQ ID NO: 78 e 56, SEQ ID NO: 79 e 56, SEQ ID NO: 80 e 56, SEQ ID NO: 81 e

56, SEQ ID NO: 82 e 56, SEQ ID NO: 86 e 96, SEQ ID NO: 87 e 100, SEQ ID NO: 88 e 101, SEQ ID NO: 89 e 102, SEQ ID NO: 90 e 103, SEQ ID NO:

91 e 104, SEQ ID NO: 92 e 105, SEQ ID NO: 93 e 106, SEQ ID NO: 94 e 107, SEQ ID NO: 95 e 108, SEQ ID NO: 147 e 148. O derivado de cadeia simples da variante I-Crel como definido na presente invenção é uma proteína de fusão compreendendo dois monô- meros ou dois domínios de núcleo de uma Meganuclease LAGLIDADG ou uma combinação de ambos, em que pelo menos um monômero ou domínio de núcleo tem uma seqüência de variante I-Crel tendo pelo menos uma substituição nas posições 26 a 40 e/ou 44 a 77 de l-Crel, como definido aci- ma.

As seqüências alvo de DNA que são clivadas pela variante I-Crel ou derivado de cadeia simples estão situadas no ORF HPRT e essas se- qüências cobrem todo o ORF HPRT (Tabela I e figura 2). φ (θ

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CMI As seqüências alvo de DNA estão presentes no gene HPRT de pelo menos um mamífero (ser humano ou animal).

Por exemplo, as seqüências alvo SEQ ID NO: 6 e 12 estão pre- sentes pelo menos nos Genes HPRT de ser humano, camundongo e Hams- ter Chinês (Criteculus sp.).

As seqüências alvo SEQ ID NO: 7 e 9 estão presentes em pelo menos ambos os camundongo e Gene HPRT de Hamster Chinêss.

As seqüências alvo SEQ ID NO: 1 a 5, 8, 10, 11, 13 e 14 estão presentes pelo menos no Gene HPRT de Hamster Chinês.

Em adição, seqüências alvo tendo identidade de seqüência com os nucleotídeos na posição ±3a5e±8a10 das seqüências SEQ ID NO: 8 e 14 estão presentes pelo menos nos genes HPRT de ser humano e ca- mundongo. Seqüências alvo tendo identidade de seqüência com os nucleo- tídeos na posição ±3a5e±8a 10 das seqüências SEQ ID NO: 10 e 11 estão presentes pelo menos no Gene HPRT de camundongo (identidade de seqüência não é encontrada como o Gene HPRT de ser humano). A se- qüência alvo tendo identidade de seqüência com os nucleotídeos na posição ±3a5e±8a10da seqüência SEQ ID NO: 9 está presente pelo menos no gene HPRT de ser humano.

Portanto, as variantes I-Crel que clivam uma das seqüências al- vo de DNA SEQ ID NO: 6 e 12 são capazes de induzir uma modificação de sítio específico pelo menos no Gene HPRT de ser humano, camundongo e Hamster Chinês. Em adição, as variantes I-Crel que clivam a seqüências alvo de DNA SEQ ID NO: 9 são capazes de induzir uma modificação de sítio específico ambos no Gene HPRT de camundongo e Hamster Chinês, e para algumas delas, também no Gene HPRT de ser humano. As variantes I-Crel que clivam a seqüências alvo de DNA SEQ ID NO: 8 são capazes de induzir uma modificação de sítio específico no Hamster Chinês e para algumas de- las, também no Gene HPRT de camundongo e/ou ser humano; a posição da modificação no gene HPRT corresponde à posição do sítio de clivagem de DNA genômico (posição +2 no filamento de sentido do alvo de DNA genômi- co (isto é posições: 101 (Éxon 3), 16 (Éxon 8), 21 (Éxon 6), 150 (Éxon 3), respectivamente para as seqüências SEQ ID NO: 6, 12, 9 e 8).

As variantes I-Crel que clivam a seqüência alvo de DNA SEQ ID NO: 7 são capazes de induzir uma modificação de sítio específico pelo me- nos no Gene HPRT de camundongo e Hamster Chinês (mas não na posição correspondente no Gene HPRT de ser humano). Em adição, as variantes I- Crel que clivam a seqüências alvo de DNA SEQ ID NO: 10 e 11 são capazes de induzir uma modificação de sítio específico no Gene HPRT de Hamster Chinês e para algumas delas, também no Gene HPRT de camundongo (mas não na posição correspondente no gene HPRT de ser humano); a posição da modificação no gene HPRT corresponde às posições 106 (Éxon 3), 51 (Éxon 6) e 52 (Éxon 6), respectivamente.

As variantes I-Crel que clivam a seqüência alvo de DNA SEQ ID NO: 14 são capazes de induzir uma modificação de sítio específico no Gene HPRT de Hamster Chinês e para algumas delas, também no gene HPRT de ser humano (mas não na posição correspondente no gene HPRT de camun- dongo); a posição da modificação no gene HPRT corresponde à posição 68 (Éxon 9).

As variantes I-Crel que clivam uma das seqüências alvo de DNA SEQ ID NO: 1 a 5 e 13 são capazes de induzir uma modificação de sítio es- pecífico pelo menos no Gene HPRT de Hamster Chinês (mas não na posi- ção correspondente no gene HPRT de ser humano ou camundongo); a posi- ção da modificação no gene HPRT corresponde às posições -7 a partir do ATG (Éxon 1), 54 (Éxon 2), 93(Éxon 2), 29 (Éxon 3), 69(Éxon 3), 93(Éxon 9) e 21 (Éxon 9), respectivamente.

Exemplos de variantes heterodiméricas que clivam cada alvo de DNA são apresentados na tabela Il e Figura 19. Tabela II: Seqüência de variantes I-Crel heterodiméricas que clivam

tendo um alvo de DNA a partir do gene HPRT

Primeiro Monômero I-Crel (SEQ ID NO : 83, 84, 85, 32, 75 a 82, 147 86 a 95) Segundo Monômero I-Crel (SEQ ID NO: 97 a 99, 52 a 58, 60, 65 a 74, 56, 148, 96 e 100 a 108) AlVO 28 K30Q32 D33 Y38 Q40S44N68K70S75R77T 28K30N32S33G38C40S44Q68R70R75N77I 1 28K30D32S33R38Q40S44N68Q70S75S77V 28 K30 N 32 S33T38G40S44T68 R70S75 Y77T 2 28K30T32S33G38Q40S44Q68R70S75R77Y 28K30N32S33T38Q40R44N68E70S75R77K 3 28K30N32S33H38Q40S44Q68R70R75D77I 28K30N32T33H38Q40S44R68A70S75N77N 28K30S32S33Q38Q40S44R68Y70S75D77N 28K30N32T33H38Q40S44R68Y70S75D77N 28K30N32T33H38Q40S44R68Y70S75D77R 28K30N32S33T38Y40S44K68Y70S75E77V 28K30N32R33D38Q40S44K68Y70S75D77R 28K30N32S33S38D40S44K68Y70S75D77R 28K30N32S33Y38Q40S44R68Y70S75N77I 28R30N32S33S38Y40Q44R68A70S75N77N 28R30N32S33S38Y40Q44R68A70S75H77Y 4 28R30N32T33S38Y40Q44R68Y70S75N77N 140M 28K30N32T33H38H40S44Q68Y70S75D77R 28K30N32T33H38Q40S44K68Y70S75D77R 28K30N32T33H38Q40S44Q68N70S75H77R 28K30N32T33H38Q40S44Q68R70S75H77R 28K30N32T33H38Q40S44Q68H70S75H77H 28K30N32T33H38Q40S44Q68H70S75H77H 92R 28K30N32T33H38Q40S44K68Y70S75D77R 92R96R107R132V140A143A 28K30N32S33H38Q40S44Q66C68R70R75 D77I 137V155R162P 28K30N32S33T38Y40S44K68Y70S75E77V 9L28K30N32S33H38Q40S44Q68R70R75D7 71 100I108V154G155P161P 2Y28K30N32S33H38Q40S44Q68R70R75D 771 109V125A 28K30N32S33H38Q40S44Q68R70R75D77I 113S136S 2I28K30N32S33H38Q40S44Q68R70R75D7 71 81V86I110G131R135Q151A157V 28K30N32S33H38Q40S44Q68R70R71R75 D7711031129A130G 28K30N32S33H38Q40S44Q68R69V70R75 D77I 82R90R120V139R158M 28K30N32S33H38Q40S44Q54L68R70R75D 77I 86D10OR104M105A136S159R 28K30N32S33H38Q4042A43LS44Q68R70R 75D77I 28K30N32T33H38Q40S44R68Y70S72T75N 77N Tabela Il continuação

Primeiro Monômero I-Crel (SEQ ID NO : 83, 84, 85, 32, 75 a 82, 147 86 a 95) Segundo Monômero I-Crel (SEQ ID NO: 97 a 99, 52 a 58, 60, 65 a 74, 56, 148, 96 e100 a 108) Alvo 28K30N32T33Y38W40S44N68R70S75Y77I 28K30R32S33Y38E40S44Q68H70H75N77I 5 28K30N32S33T38Q40A44N68K70S75R77T 28K30N32S33H38T40S44N68R70N75N77I 6 28K30N32S33H38S40S44R68R70S75N77D 28K30N32S33G38Q40Q44Q68A70K75N77I 7 28K30N32S33G38T40S44N68K70S75H77F 28K30C32S33T38Q40S44Q68Y70S75R77Q 8 28K30K32S33R38Q40S44D68Y70S75S77R 28K30N32S33T38Q40Q44N68K70S75H77F 9 28K30N32S33T38Q40T44R68Y70S75E77Y 28K30N32S33R38T40S44R68T70S75N77N 10 28K30N32T33T38Q40S44Y68R70S75Y77V 28K30N32G33T38Q40S44N68Y70S75R77Y 11 28K30Y32T33C38Q40S44Q68R70S75D77K 28K30N32W33T38Q40S44Q68R70R75N77I 12 28K30N32S33H38G40S44N68R70S75Y77N 28K30N32S33T38A40S44Q68R70S75N77L 13 28K30N32S33Y38Q40S44A68R70S75Q77E 28K30N32S33C38Y40S44R68Y70S75D77I 14

A seqüência de cada variante é definida por seus resíduos de aminoácido nas posições indicadas. Por exemplo, a primeira variante hete- rodimérica da Tabela Il consiste em um primeiro monômero tendo K, Q, D, Y, Q, S1 N1 K1 S, R e T nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 e 77, respectivamente e um segundo monômero tendo Κ, N, S, G, C, S, Q, R, R, N, e I nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 e 77, respecti- vamente. As posições são indicadas para referência à seqüência I-Crel SWISSPROT P05725 ou código de acesso pdb Ig9y; I-Crel tem Κ, N, S, Y, Q, S, Q, R, R, D e I nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 e 77, respectivamente. As posições que não são indicadas não são mutados e assim correspondem à seqüência I-Crel tipo selvagem.

Em outra modalidades preferida do uso de acordo com a presen- te invenção, a Variante I-Crel ou derivado de cadeia simples são combina- dos com um constructo de DNA alvo compreendendo uma seqüência para ser introduzida flanqueados por seqüências que compartilham homologias com as regiões do gene HPRT que circundam o sítio de clivagem de DNA genômico da Variante I-Crel ou derivado de cadeia simples, como definido acima.

Preferivelmente, seqüência homólogas de pelo menos 50 bp, preferivelmente mais do que 100 bp e mais preferivelmente mais do que 200 bp são usados. De fato, homologias de DNA compartilhadas são localizadas nas regiões que flanqueiam a jusante e a montante o sítio da quebra e a se- qüência de DNA a ser introduzida deve ser localizada entre dois braços. A seqüência a ser introduzida compreende um gene de interesse exógeno ou uma seqüência para inativar ou deletar o Gene HPRT ou parte do mesmo.

Tais alterações de DNA cromossomiais podem ser usadas para preparar "knock-out" e knock-in de HPRT em animais em que o gene HPRT é inativado ("knock-out") e eventualmente recolocado com um gene de inte- resse exógeno (knock-in).

Consequentemente, tais alterações de DNA cromossomiais são também usadas para preparar linhagens celulares de vertebrados genetica- mente modificados (mamíferos incluindo ser humano) em que Gene HPRT endógeno é inativado e um transgene é eventualmente iserido no Lócus de HPRT. Em adição, seguinte a inativação do gene HPRT endógeno, HPRT pode ser usado como um marcador de seleção positivo (seleção para ex- pressão de marcador HPRT com HAT) em procedimentos alvo de gene adi- cionais em qualquer lócus dos cromossomas de animal/célula deficiente de HPRT.

A matéria objeto da presente invenção é também um método pa- ra preparar knock-in ou "knock-out" de HPRT em animal, compreendendo pelo menos a etapa de:

(a) introduzir em uma célula precursora pluripotente ou um em- brião de uma animal, uma variante I-Crel ou um derivado de cadeia simples, como definido acima, de modo a induzir uma clivagem de duplo filamento em um sítio de interesse do gene HPRT compreendendo um reconhecimento de DNA e sítio de clivagem da variante I-Crel ou um derivado de cadeia simples, simultânea ou consecutivamente,

(b) introduzir em uma célula precursora de animal ou embrião da etapa (a) um DNA alvo, em que o DNA alvo compreende (1) homologias de compartilhamento de DNA para a região ao redor do sítio de clivagem do HE e (2) DNA que conserta o sítio de interesse na recombinação entre o DNA alvo e o DNA cromossomial, de modo a gerar uma célula precursora de animal genomicamente modificada ou embrião tendo consertado o sítio de interesse por recombinação homólo- go,

(c) desenvolver a célula precursora animal genomicamente modificada pu embrião da etapa (b) em um animal quiméri- co, e

(d) derivar um animal transgênico a partir do animal quimérico da etapa (C).

Preferivelmente, a etapa (c) compreende a introdução da célula precursora genomicamente modificada na etapa (b) em blastócitos de modo a gerar animais quiméricos.

A matéria objeto da presente invenção é também um método pa- ra preparar um knock-in ou "knock-out" de HPRT em célula, compreendendo pelo menos a etapa de:

(a) introduzir em uma célula, uma Variante I-Crel ou derivado de cadeia simples, como definido acima, de modo a induzir uma clivagem de duplo filamento em um sítio de interesse do gene HPRT compreendendo um reconhecimento de DNA e um sítio de clivagem para a variante I-Crel ou deri- vado de cadeia simples, simultânea ou consecutivamente,

(b) introduzir na célula da etapa (a), um DNA alvo, em que o DNA alvo compreende (1) Homologias de compartilhamento de DNA para a região em volta do sítio de clivagem de HE e (2) DNA que conserta o sítio de interesse na recombinação entre o DNA alvo e o DNA cromossomial, de modo a gerar uma célula recombinante tendo consertado o sítio de inte- resse por recombinação homólogo,

(c) isolar a célula recombinante da etapa (b), por qualquer meio apropriado.

O DNA alvo é introduzido na célula sob condições apropriadas para introdução do DNA alvo no sítio de interesse.

Em uma modalidade preferida, o constructo de DNA alvo é inse- rido em um vetor. Alternativamente, o Gene HPRT pode ser inativado pelo conser- to da quebra de duplo filamento por junção de extremidade não-homóloga (Figura 3B).

A matéria objeto da presente invenção é também um método pa- ra preparar um an "knock-out" de HPRT em animal, compreendendo pelo menos a etapa de:

(a) introduzir em uma célula precursora pluripotente ou um em- brião de um animal, uma Variante I-Crel ou derivado de ca- deia simples, como definido acima, de modo a induzir uma clivagem de duplo filamento em um sítio de interesse do gene HPRT compreendendo um reconhecimento de DNA e um sítio de clivagem da variante I-Crel ou derivado de ca- deia simples, e desse modo gerar célula precursora geno- micamente modificada ou embrião tendo consertado a que- bra de duplo filamento por junção de extremidade não- homóloga,

(b) desenvolver a célula precursora animal genomicamente modificada ou embrião da etapa (a) em um animal quiméri- co, e

(c) derivar um animal transgênico a partir de um animal quimé- rico da etapa (b). Preferivelmente, a etapa (b) compreende a introdução da célula precursora genomicamente modifi- cada obtida na etapa (a), em blastócitos, de modo a gerar animais quiméricos.

A matéria objeto da presente invenção é também um método pa- ra preparar uma célula deficiente de HPRT, compreendendo pelo menos a etapa de:

(a) introduzir em uma célula, uma variante I-Crel ou derivado de cadeia simples, como definido acima, de modo a induzir uma clivagem de duplo filamento em um sítio de interesse do gene HPRT compreendendo um reconhecimento de DNA e um sítio de clivagem da variante I-Crel ou derivado de cadeia simples, e desse modo gerar célula deficiente de HPRT genomicamente modificada tendo consertado a que- bra de duplo filamento, por junção de extremidade não- homóloga, e

(b) isolar a célula deficiente de HPRT genomicamente modifi-

cada da etapa(a), por qualquer meio apropriado.

A célula que é modificada pode ser qualquer célula de interesse. Para preparar animais transgênicos/"knock-out", as células são células pre- cursoras pluripotentes tais como células estaminais derivadas de embrião (ES), que são bem-conhecidas na técnica. A variante I-Crel /derivado de ca- deia simples podem ser providos diretamente para as células ou através de um vetor de expressão compreendendo a seqüência de seqüência de poli- nucleosídeo que codifica a meganuclease e adequada para sua expressão na célula usada.

O animal é preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente

um roedor de laboratório (camundongos, ratos, porquinhos-da-índia), ou uma vaca, proco, cavalo ou cabra.

Em adição, a perda do gene HPRT endógeno nas células modi- ficadas pode ser usada selecionada usando a 6-tioguanina análoga de puri- na (6-TG).

Em outra modalidade preferida do uso de acordo com a presente invenção, a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples é codificada por um fragmento de polinucleotídeo. O polinucleosídeo pode modificar um mo- nômero de uma variante heterodimérica ou homodimérica, ou dois domí- nios/monômeros de uma endonuclease quimérica de cadeia simples.

Em uma modalidade mais preferida, o fragmento de polinucleo- sídeo é inserido em um vetor que é adequado para sua expressão nas célu- las usadas. O vector compreende vantajosamente um constructo de DNA alvo como definido acima. Preferivelmente, o vector compreende dois frag- mentos de polinucleotídeo diferentes, cada um codificando um dos monôme- ros de uma variante I-Cre heterodimérico, como definido acima.

Um vetor que pode ser usado na presente invenção inclui, mas não é limitado a, um vetor viral, um plasmídio, um vetor RNA ou uma molé- cula de RNA ou DNA circular ou linear que pode consistir em ácidos nuclei- cos cromossomiais, não-cromossomiais, semissintéticos ou sintéticos. Veto- res preferidos são aqueles capazes de replicação (vetor epissomal) e/ou ex- pressão de ácidos nucleicos aos quais eles são ligados (vetores de expres- são). Um grande número de vetores adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica e comercialmente disponíveis.

Vetores virais incluem retrovírus, adenovírus, parvovírus (por exemplo, vírus associados a adeno), coronavírus, vírus de RNA de filamento negativo tais como ortomixovírus (por exemplo, vírus da influenza), rabdoví- rus (por exemplo, vírus de estomatite da raiva e vesicular), paramixovírus (por exemplo, sarampo e Sendai), vírus de RNA de filamento positivo tais como picor-navírus e alfavírus, e vírus de DNA de filamento duplo incluindo adenovírus, herpesvírus (por exemplo, vírus da Herpes Simplex tipos 1 e 2, vírus Epstein-Barr, citomegalovírus), e poxvírus (por exemplo, vaccinia, fowl- pox e canarypox). Outros vírus incluem vírus Norwalk, togavírus, flavivírus, reovírus, papovavírus, hepadnavírus, e vírus da hepatite, por exemplo. E- xemplos de retrovírus incluem: avian leukosis-sarcoma, vírus de mamífero tipo C, tipo B, vírus tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivírus, spumavírus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Viro- logy, Third Edition1 Β. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

Vetores preferidos incluem vetores lentivirais, e particularmente vetores lentivirais de auto-inativação. Vetores podem compreender marcado- res selecionáveis, por exemplo: neomicina fosfotransferase, histidinol de- hidrogenase, di-hidrofolato reductase, higromicin fosfotransferase, timidina quinase do vírus do herpes simples, adenosina deaminase, glutamina snte- tase, e hipoxantina-guanina fosforribosil transferase para cultura de célula eucariótica; TRPI para S. cerevisiae; tetraciclina, rifampicin ou resitência à ampicilina em E. coli.

Preferivelmente os ditos vetores são vetores de expressão, em que a(s) seqüência(s) que codifica(m) a variante/derivado de cadeia simples da invenção é(são) colocada(s) sob controle de elementos de controle trans- cripcionais e traduzidos apropriados para permitir a produção ou síntese da variante. Portanto, o polinucleotídeo é compreendido em um cassete de ex- pressão. Mais particularmente, o vetor compreende uma origem de replica- ção operativamente ao polinucleotídeo de codificação, um sítio de ligação de ribossoma, um sítio de junção de RNA (quando o DNA genômico é usado), um sítio de poliadenilação e um sítio de terminação de transcrição. Ele tam- bém pode compreender um melhorador. A seleção do promotor dependerá da célula na qual o polipeptídeo é expresso. Preferivelmente, quando a vari- ante é um heterodímero, os dois polinucleotídeos que codificam cada um dos monômeros são incluídos em um vetor que é capaz de acionar a ex- pressão de ambos os polinucleotídeos, simultaneamente. Promotores ade- quados incluem promotores induzíveis e/ou específicos de tecido. Exemplos de promotores induzíveis são: promotor de metalotionina eucariótico que é induzido por níveis aumentados de metais pesados, promotor IacZ procarió- tico que é induzido em resposta a isopropil-p-D-tiogalacto-piranosida (IPTG) e promotor de choque térmico eucariótico que é induzido por temperatura aumentada. Exemplos de promotores específicos de tecido são creatina qui- nase do músculo esquelético, antígeno específico de próstata (PSA), a- antitripsin protease, proteínas A e B de tensoativo ser humano (SP), genes de proteína de soro de leite acídico e β-caseína.

O DNA alvo é introduzido na célula sob condições apropriadas para introdução do DNA alvo no sítio de interesse.

Para preparar células/animais de knock-in o DNA que conserta o sítio de interesse compreende a seqüência de um gene de interesse exóge- no, e eventualmente um marcador de seleção, tal como o gene HPRT.

Para preparar células/animais de "knock-out" o DNA que conser- ta o sítio de interesse compreende seqüências que inativam o gene de inte- resse endógeno.

A matéria objeto da presente invenção é também para o uso de uma variante I-Crel ou um derivado de cadeia simples como definido acima, para a preparação de um medicamento para prevenir, melhorar ou curar uma doença genética associada com uma mutação no gene HPRT em um indivíduo em necessidade do mesmo, o medicamento sendo administrado por qualquer meio ao indivíduo.

Neste caso, o uso da variante I-Crel ou um derivado de cadeia simples como definido acima, compreende pelo menos a etapa de (a) induzir em tecidos somáticos do indivíduo uma clivagem de duplo filamento em um sítio de interesse do gene HPRT compreendendo pelo menos um sítio de clivagem e um de interesse da variante, e (b) introduzir no indivíduo um DNA alvo, em que o DNA alvo compreende (1) Homologias de compartilhamento de DNA para a região em volta do sítio de clivagem de HE e (2) DNA que conserta o sítio de interesse na recombinação entre o DNA alvo e o DNA cromossomial. O DNA alvo é introduzido no indivíduo sob condições apro- priadas para introdução do DNA alvo no sítio de interesse.

De acordo com a presente invenção, a clivagem de duplo fila- mento é induzida, ou in toto por administração da meganuclease a um indi- víduo, ou ex vivo por introdução da meganuclease nas células somáticas removidas de um indivíduo e retornadas no indivíduo após modificação.

Em uma modalidade preferida do uso, a Variante I-Crel ou deri- vado de cadeia simples é combinada com um constructo de DNA alvo que compreende uma seqüência que repara uma mutação no gene HPRT flan- queado por seqüências que compartilham homologias com as regiões do gene HPRT que circundam o sítio de clivagem de DNA genômico da variante I-Crel ou derivado de cadeia simples, como definido acima.

Para corrigir o gene HPRT, a clivagem do gene ocorre na vizi- nhança da mutação, preferivelmente, dentro 500 bp da mutação (Figura 3C). O constructo alvo compreende um fragmento de gene HPRT que tem pelo menos 200 bp de seqüência homóloga flanqueando o sítio de clivagem de DNA genômico (matriz de reparo mínimo) para reparar a clivagem, e inclui a seqüência correta do gene HPRT para reparar a mutação (Figura 3C). Con- sequentemente, o constructo alvo para a correção do gene compreende ou consiste na matriz de reparo mínimo; é preferivelmente de 200 pb a 6000 pb, mais preferivelmente de 1000 pb a 2000 pb. Para restaurar um gene funcional (Figura 3D), a clivagem do ge- ne ocorre a montante da mutação. Preferivelmente a mutação é a primeira mutação conhecida na seqüência do gene, de modo que todas as mutações a jusante do gene podem ser corrigidas simultaneamente. O constructo alvo compreende os exões a jusante do sítio de clivagem de DNA genômico fun- didos no quadro (como no cDNA) e com um sítio de poliadenilação para pa- rar a transcrição em 3'. A seqüência a ser introduzida (constructo de knock- in de éxon) é flanqueada por seqüências de íntrons ou éxons em volta do sítio de clivagem de HE, de modo a permitir a transcrição do gene construído (gene Éxon knock-in) em um mRNA capaz de codificar para uma proteína funcional (Figura 3D). Por exemplo, o constructo de knock-in de éxon é flanqueado pelas seqüências a montante e a jusante.

Em outra modalidades preferida do dito uso, a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples é codificada por um vetor. Preferivelmente, o vetor compreende o constructo de DNA alvo, como definido acima.

Em outra modalidade preferida do uso, a doença genética é a Síndrome de Lesch Nyhan.

A matéria o da presente invenção é tembém uma composição caracterizada pelo fato de que ela compreende pelo menos uma variante I- Crel ou derivado de cadeia simples e/ou pelo menos um vetor de expressão que codifica a variante/molécula de cadeia simples, como definido acima, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade preferida da composição, ela compreende um constructo de DNA alvo que compreende uma seqüência que repara uma mutação no gene HPRT, flanqueado por seqüências que compartilham homologias com o sítio de clivagem de DNA genômico da variante, como definido acima. A seqüência que repara a mutação é ou um fragmento do gene com a seqüência correta ou um constructo de knock-in de éxon, como definido acima.

Preferivelmente, o constructo de DNA alvo é ou incluído em um vetor recombinante ou ele é incluído em um vetor de expressão compreen- dendo o polinucleosídeo(s) que codifica a variante/derivado de cadeia sim- pies, como definido na presente invenção.

A matéria objeto da presente invenção é também produtos con- tendo pelo menos uma variante I-Crel /derivado de cadeia simples ou um vetor de expressão que codifica a meganucleases, e um vetor incluindo um constructo alvo, como definido acima, como uma preparação combinada pa- ra uso simultâneo, separado ou seqüencial na prevenção ou tratamento ou de uma doença genética associada com uma mutação no gene HPRT.

A matéria objeto da presente invenção é também um método para prevenir, melhorar ou curar uma doença genética associada com uma mutação no gene HPRT em um indivíduo em necessidade do mesmo, o mé- todo compreendendo pelo menos a etapa de administrar ao indivíduo a composição como definido acima, por qualquer meio.

Para finalidades da terapia, a variante I-Crel /derivado de cadeia simples e um excipiente farmaceuticamente aceitável são administrados em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Tal uma combinação é dita ser combinada em uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente significante, se sua presença resulta em uma mudança significativa na fisiologia do recipiente. No presente contexto, um agente é fisiologicamente significativo se sua presença resulta em uma diminuição na severidade de um ou mais sintomas da doença alvejada e em uma correção de genoma da lesão ou anormalidade.

Em uma modalidade dos usos de acordo com a presente inven- ção, a variante I-Crel /derivado de cadeia simples é substancialmente não- imunogênica, isto é, produzir pouca ou nenhuma resposta imunológica ad- versa. Uma variedade de métodos para melhorar ou eliminar reações imuno- lógicas prejudiciais deste tipo pode ser usada de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferida, a variante l-Crel/derivado de cadeia simples e substancialmente livre de N-formil metionina. Outra forma de evitar reações imunológicas não desejadas é conjugar meganucleases para polietileno gli- col ("PEG") ou polipropileno glicol ("PPG") (preferivelmente de um peso mo- lecular médio (MW) de 500 a 20,000 dáltons). Conjugação com PEG ou PPG, como descrita por Davis et al. (US 4.179.337) por exemplo, pode pro- ver conjugados de endonuclease não imunogênicos, fisiologicamente ativos, solúveis em água com atividade antiviral. Métodos smilares também usando um copolímero de polietileno-polipropileno glicol são descritos em Saifer et al (US 5.006.333).

A variante I-Crel ou derivado de cadeia simples pode ser usada ou como um constructo/vetor de polipeptídeo ou como um polinucleosídeo que codifica o polipeptídeo. Ele é introduzido em células, in vitro, ex vivo ou in vivo, por qualquer meio conveniente bem-conhecido por aqueles versados na técnica, que são apropriados para o tipo de célula particular, sozinho ou em associação com pelo menos um veículo apropriado e/ou com o DNA al- vo. Uma vez em um célula, a meganuclease e se presente, o vetor compre- endendo DNA alvo e/ou ácido nucleico que codifica a meganuclease são importados ou translocados pela células do citoplasma para o sítio de ação no núcleo.

A variante I-Crel ou derivado de cadeia simples (polipeptídeo) pode ser vantajosamente associada com: lipossomas, polietilenoimina (PEI), e/ou peptídeos de translocação de membrana (Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Ford et al, Gene Ther., 2001, 8, 1-4 ; Wadia e Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52- 56); no caso posterior, a seqüência da variante I- Cre/derivado de cadeia simples é fundida com a seqüência de um peptídeo de translocação de membrana (proteína de fusão).

Vetores compreendendo DNA alvo e/ou ácido nucleico que codi- fica a meganuclease pode ser introduzido em uma célula por uma variedade de métodos (por exemplo, injeção, absorção direta, bombardeamento de projéteis, lipossomas, eletropuração). Meganucleases pode ser estável ou transientemente expressa em células usando vetores de expressão. Técni- cas de expressão em células eucarióticas são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. (Ver Current Protocols in Human Genetics: Chapter 12 "Vectors For Gene Therapy" & Chapter 13 "Delivery Systems for Gene The- rapy"). Opcionalmente, pode ser preferível incorporar um sinal de localização nuclear na proteína recombinante para assegurar que ele é expresso dentro do núcleo. A matéria objeto da presente invenção é também uma variante I- Crel/derivado de cadeia simples, um fragmento de polinucleotídeo que codi- fica a variante ou um derivado de cadeia simples, um vetor que compreende o fragmento de polinucleosídeo e/ou um constructo alvo de DNA, uma célula hospedeiro procariótica ou eucariótica e modificada por um polinucleotídeo ou um vetor como definido acima, preferivelmente um vetor de expressão.

A matéria objeto da presente invenção é também um animal transgênico não-humano ou uma planta transgênica, em que toda ou parte de sua célula é modificada por um polinucleotídeo ou um vetor como defini- do acima.

Como usado aqui, uma célula refere-se a uma célula procarióti- ca, tal como uma célula bacteriana, ou uma célula eucariótica, tal como uma célula de animal, planta ou levedura.

A variante I-Crel como definido na presente invenção é obtenível por um método para variantes I-Crel de construção capazes de clivar uma seqüência alvo de DNA genômica a partir de um gene de vertebrado, com- preendendo pelo menos as etapas de:

(a) construir uma primeira série de Variantes I-Crel tendo pelo menos uma substituição no primeiro subdomínio funcional do domínio núcleo LAGLIDADG situado a partir das posi- ções 26 a 40 de l-Crel,

(b) construir uma segunda série de Variantes I-Crel tendo pelo menos uma substituição em um segundo subdomínio fun- cional do domínio núcleo LAGLIDADG situado a partir das posições 44 a 77 de l-Crel,

(c) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da primeira série de etapa (a) que são capazes de clivar um sítio I-Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posições -10 a -8 do Sítio I-Crel foi recolocada com uma trinca de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em cag, art, cct, ttg, gac, atg, ttt, ttc, tgg, gtc, aag, gag e (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições +8 a +10 foi recolocado com a seqüência complementar reversa da trinca de nu- cleotídeo que é substituída na posição -10 a -8 do sítio I- Crel (isto é: ctg, aat, agg, caa, gtc, cat, aaa, gaa, cca, gac, ctt, e ctc, respectivamente),

selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da segunda série de etapa (b) que são capazes de clivar um sítio I-Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posições -5 a -3 do sítio I-Crel foi recolocada com uma trinca de nucle- otídeo selecionada a partir do grupo consistindo em: gac, taa, tca, gtg, gct, tgt, tgg, ctg, ttg, tag, e gag, e (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições +3 a +5 foi recolocada com a seqüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo que e substituída na posição -5 a -3 do sítio I-Crel (isto é: gtc, tta, tga, cac, age, aca, cca, cag, caa, cta e ctc, respec- tivamente),

selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da primeira série de etapa (a) que são capazes de clivar um sítio de I- Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posi- ções +8 a +10 do sítio I-Crel foi recolocada uma trinca de nucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em: cat, cga, tat, ggg, tac, taa, cag, gea, aca, gaa, tga, atg, e (i- i) a trinca de nucleotídeo nas posições -10 a -8 foi recolo- cado com a seqüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo que é substituído na posição +8 a +10 do sítio I-Crel (isto é: atg, tcg, ata, ccc, gta, tta, ctg, tgc, tgt, ttc, tca e cat, respectivamente),

selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da segunda série de etapa (b) que são capazes de clivar um sítio de I- Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posi- ções +3 a +5 do sítio I-Crel foi recolocada com a trinca de nucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em: tec, tat, gtg, gaa, tgg, tac, ttt, aca, age, gcg, tcc, act, caa e aag, e (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições -5 a -3 foi recolocada com a seqüência complementar reversa do qual é substituída na posição +3 a +5 do sítio I-Crel (isto é: gga, ata, cac, ttc, cca, gta, aaa, tgt, gct, cgc, gga, agt, ttg e ctt, respectivamente), (gi) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir das etapas (c) a (f) que são capazes de clivar um alvo DNA da se- qüência SEQ ID NO: 1 a 14. De acordo com uma primeira modalidade da invenção, a varian- te I-Crel é obtenível por um método compreendendo pelo menos as etapas (a) a (f) como definido acima, e as etapas adicionais de:

(ga) combinar variantes diferentes obtidas em qualquer uma das etapas (c) a (f) uma com a outra ou com l-Crel, para formar heterodímeros, e (h2> selecionar e/ou peneirar os heterodímeros a partir da eta- pa (g2) que são capazes de clivar o alvo de DNA da se- qüência SEQ ID NO: 1 a 14. De acordo com uma segunda modalidade da invenção, a varian- te I-Crel é obtenível por um método compreendendo pelo menos as etapas (a) a (f) como definido acima, e as etapas adicionais de:

(g3) combinar em uma variante única, as mutações nas posi- ções 26 a 40 e 44 a 77 de duas variantes a partir da etapa (c) e etapa (d), para obter uma nova variante I-Crel homo- dimérica que cliva uma seqüência em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posições -10 a -8 é idêntica à trinca de nucleotídeo que está presente nas posições -10 a -8 do al- vo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições +8 a +10 é idêntica à se- qüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo que está presente nas posições -10 a -8 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, (iii) a trinca de nucleotí- deo nas posições -5 a -3 é idêntico à trinca de nucleotídeo que está presente nas posições -5 a -3 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14 (iv) a trinca de nucleotídeo nas posições +3 a +5 é idêntica à seqüência complemen- tar reversa da trinca de nucleotídeo que está presente nas posições -5 a -3 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, e/ou, (h3) combinar em uma variante única, as mutações nas posi- ções 26 a 40 e 44 a 77 de duas variantes a partir da etapa (e) e etapa (f), para obter uma nova variante I-Crel homo- dimérica que cliva uma seqüência em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posições +3 a +5 é idêntica à trinca de nucleotídeo que está presente nas posições +3 a +5 do al- vo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições -5 a -3 é idêntica à seqüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo que está presente nas posições +3 a +5 do alvo de DNA da se- qüência SEQ ID NO: 1 a 14, (iii) a trinca de nucleotídeo nas posições +8 a +10 do sítio I-Crel foi recolocada com a trinca de nucleotídeo que está presente nas posições +8 a +10 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14 e (iv) a trinca de nucleotídeo nas posições -10 a -8 é idêntica à seqüência complementar reversa da trinca de nucleotí- deo nas posições +8 a +10 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, e

(13) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir das etapas (g3) ou (h3) que são capazes de clivar um alvo DNA da se- qüência SEQ ID NO: 1 a 14.

De acordo com uma modalidade da invenção, a variante I-Crel é obtenível por um método compreendendo pelo menos as etapas (a) a (f), a etapa (g3) e/ou a etapa (h3) como definido acima, e as etapas adicionais de:

(14) combinar as variantes obtidas na etapa (g3) com as varian- tes obtidas na etapa (h3), I-Crel ou as variantes obtidas na etapa (e) ou etapa (f), para formar heterodímeros, ou (i'4) combinar as variantes obtidas na etapa (h3) com I-Crel ou as variantes obtidas na etapa (c) ou etapa (d), para formar heterodímeros, e

(j4) selecionar e/ou peneirar os heterodímeros a partir da eta-

pa (i4) ou (i'4) que são capazes de clivar um alvo DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14. A seleção e/ou peneiração nas etapas (c), (d), (e), (f), (gi), (h2), (13) e (j4) pode ser realizada usando um ensaio de clivagem in vitro ou in vivo, como descrito no Pedido PCT Internacional WO 2004/067736, Epinat et al. (Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962), Chames et al. (Nucleic Acids Res., 2005, 33, el78), e Arnould et al. (J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458). Preferivelmente, etapas (c), (d), (e), (f), (gi), (h2>, (i3) e/ou (j4) são realizadas in vivo, sob condições onde a quebra de duplo filamento na seqüência alvo de DNA mutada que é gerada pela variante leva à ativação de um marcador de seleção positivo ou um gene de relatório, por reparo mediado por recom- binação da quebra de duplo filamento de DNA, como descrito no Pedido PCT Internacional WO 2004/067736, Epinat et al. (Nucleic Acids Res., 2003, 31 , 2952- 2962), Chames et al. (Nucleic Acids Res., 2005, 33, el 78), e Ar- nould et al. (J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458).

As etapas (a) e (b) podem compreender a introdução de muta- ções adicionais a fim de melhorar a ligação e/ou propriedades de clivagem dos mutantes, particularmente nas outras posições que estão em contato com a seqüência alvo de DNA ou que estão interagindo direta ou indireta- mente com o alvo de DNA. Essas etapas podem ser realizadas gerando bi- bliotecas de combinação como descrito no Pedido PCT Internacional WO 2004/067736 e Arnould et al. (J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458).

A combinação (intermolecular) das variantes na etapa (g2), (14), e (i'4) é realizada co-expressando, ou duas variantes diferentes a partir das etapas (c) e (d), (e) e (f), (g3) e (h3), (g3) e (e), (g3) e (f), (h3) e (c), (h3) e (d), ou uma variante a partir de qualquer uma das etapas (c) a (f), (g3) ou (h3) com l-Crel, de modo a permitir a formação de heterodímeros. Por exemplo, células hospedeiro podem ser modificadas a partir de um ou dois vetores de expressão recombinantes que codificam a variante(s). As células são, em seguida, cultivadas sob condições que permitem a expressão das variantes, de modo queheterodímeros são formados nas células hospedeiro, como descrito no Pedido PCT Internacional WO 2006/097854 e Arnould et al. (J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458).

A combinação (intramolecular) de mutações nas etapas (g3) e (h3) pode ser realizada amplificando fragentos de sobreposição que compre- endem cada um dos dois subdomínios por técnicas PCR de sobreposição bem-conhecidas.

Em adição, a etapa (g3) e/ou (h3) pode adicionalmente compre- ender a introdução de mutações aleatórias na variante toda ou em parte da variante, em particular a metade do terminal C da variante (posições 80 a 163). Isto pode ser realizado gerando bibliotecas de mutagenese aleatória em um grupo de variantes, de acordo com métodos de mutagenese padrão que são bem-conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis.

A matéria objeto da presente invenção é também uma variante I- Crel tendo mutações nas posições 26 a 40 e/ou 44 a 77 de I-Crel que é útil para construção das variantes capazes de clivar um alvo de DNA a partir do gene HPRT1 de acordo com a presente invenção. Em particular, a invenção engloba as variantes I-Crel como definido na etapa (c) a (f) do método para construção das Variantes l-Crel, como definido acima, incluindo as variantes da seqüência SEQ ID NO: 24 a 47 e 129 a 142. A invenção também engloba as variantes I-Crel como definido na etapa (g3) e (h3) do método para cons- trução das variantes l-Crel, como definido acima, incluindo as variantes da seqüência SEQ ID NO: 52 a 60.

Endonucleases quiméricas de cadeia simples capazes de clivar um alvo de DNA a partir do gene de interesse são derivadas a partir das va- riantes de acordo com a invenção por métodos bem-conhecidos na técnica (Epinat et al., Nucleic acids Res., 2003, 31, 2952-62; Chevalier et al., Mol. Cell., 2002, 10, 895-905; Steueret al., Chembiochem., 2004, 5, 206-13; Pe- didos PCT Internacionais WO 03/078619 e WO 2004/031346). Quaisquer de tais métodos podem ser aplicados para a construção de endonucleases quiméricas de cadeia simples derivadas a partir das variantes como definido na presente invenção.

Os fragmentos de polinucleosídeos tendo a seqüência do cons- tructo de DNA alvo ou a seqüência que codifica a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples como definido na presente invenção, podem ser prepara- dos por qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, eles são ampliados a partir do modelo de DNA, por reação de ca- deia de polimerase com iniciadores especídficos. Preferivelmente os códons dos cDNAs que codificam a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples são escolhidos em favor da expressão das proteínas no sitema de expres- são desejado.

A variante I-Crel ou derivado de cadeia simples como definido na presente invenção pode ser obtida e introduzida em uma célula hospedei- ro por técnicas de engenharia genétca e DNA recombinante bem-conhe- cidas.

A variante I-Crel ou derivado de cadeia simples como definido na presente invenção são produzidos expressando polipeptídeos como defi- nido acima; preferivelmente os polipeptídeos são expressos ou co-expressos (no caso da variante somente) em uma célula hospedeiro ou um ani- mal/planta transgênico modificados por um vetor de expressão ou dos veto- res de expressão (no caso da variante somente), sob condições adequadas para a expressão ou co-expressão dos polipeptídeos, e a variante ou deriva- do de cadeia simples é recuperada a partir da cultura de célula hospedeiro ou a partir do animal/planta transgênico.

A prática da presente invenção irá empregar, a menos que de outra maneira indicado, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recom- binante, e imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técni- cas são explicadas completamente na literatura. Ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son lnc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleoside Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; NucIeicAcid Hybridization (B. D. Harries & S. J. HigGIns eds. 1984); Transeription And Translation (B. D. Ha- mes & S. J. HigGIns eds. 1984); Culture OfAnimaI Cells (R. I. Freshney1 A- Ian R. Liss1 Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Praetieal Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Me- thods In ENZ YMOLOGY (J. Abelson and M. Simon1 eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker1 eds., Academic Press, London, 1987); Handbo- ok Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Black- well, eds., 1986); and Manipulating the mouse Embryo1 (Cold Spring Harbor Laboratory Press1 Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).

Em adição às características precedentes, a invenção adicio- nalmente compreende características que irão surgir a partir das descrições que se seguem, as quais referem-se a exemplos que ilustram as variantes de meganuclease I-Crel e seus usos de acordo com a invenção, bem como aos desenhos em anexo nos quais:

- figura 1 ilustra a estrutura modular de endonucleases residen- tes e abordagem de combinação para projetar meganucleases customiza- das. Uma estrutura tridimensional. A. da endonuclease residente I-Crel liga- da a seu alvo de DNA. O núcleo catalítico é cercado por duas dobraduras αββαββα formando uma interface de interação em formato de sela acima da abertura maior de DNA. B. Diferentes seqüências de ligação a partir da se- qüência alvo de I-Crel ( direita superior e esquerda inferior) podem ser com- binadas para obter heterodímeros ou moléculas de fusão de cadeia simples clivando alvos não-palindrômicos (direita inferior). C. A identificação de su- bunidades independentes menores, isto é, uma subunidade dentro de um único monômero ou dobradura αββαββα (direita superior e esquerda inferior) poderia permitir o projeto de novas moléculas quiméricas (direita inferior), por combinção de mutações dentro do mesmo monômero. Tais moléculas das duas etapas de formador permitiriam uma abordagem de combinação maior, envolvendo quatro diferentes subdomínios. Em uma primeira etapa, pares de novas meganucleases poderiam ser combinadas em novas molé- culas ("meia meganuclease") clivando alvos palindrômicos derivados a partir de um que quer clivar. Em seguida a combinação de tal "meia meganuclea- se" pode resultar em uma espécie heterodimérica clivando o alvo de interes- se. Assim a identificação de um número pequeno de clivadores para cada subdomínio permitiria o projeto de um número muito maior de novas endo- nucleases com especificidades personalizadas.

- figura 2 representa o gene Hipoxantina-Guanina Fosforribosil Transferase e o mRNA correspondente. Os éxons são encaixotados e o ta- manho de cada éxon no gene de camundongo (número de acesso NC 000086) é indicado; diferenças no tamanho com o gene humano (NC 000023) são também indicadas. Os sítios de clivagem (SEQ ID NO: 1 a 14) das variantes I-Crel são indicados acima dos éxons. O mRNA HPRT Critecu- Ius sp. (número de acesso J00060.1; SEQ ID NO: 15) é representado abaixo do gene. O ORF é indicado como uma caixa cinza. O sítio alvo HprCH3 é indicado com sua seqüência (SEQ ID NO: 4) e posição.

- figura 3 ilustra quatro diferentes estratégias para a utilizaçãode uma meganuclease clivando o gene Hipoxantina-Guanina Fosforribosil Transferase (HPRT). A. inserção do gene e/ou inativação do gene. Na cliva- gem por uma meganuclease e recombinção com uma matriz de reparo con- tendo um gene de interesse (inserção de gene) ou um cassete de inativação (inativação de gene), flaqueado por seqüências que compartilham homologia com as seqüências em volta do sítio de clivagem, a inserção de gene ou ina- tivação de gene ocorre. B. Inativação de gene por junção de extremidade não-homóloga. Na clivagem por uma meganuclease, as extremidades de DNA são degradas e rejuntadas por Junção de Extremidade Não-homóloga (NHEJ), e inativação de gene ocorre. C. Correção de gene. Uma mutação ocorre dentro do gene HPRT. Na clivagem por uma meganuclease e recom- binação com uma matriz de reparo a mutação prejudicial é corregida. D. Knock-irt de seqüências exônicas. Uma mutação ocorre dentro do gene H- PRT. A transcrição do mRNA mutado é caracterizada abaixo do gene. Na matriz de reparo, éxons localizados a jusante do sítio de clivagem são fundi- dos no quadro (como em um cDNA), com um sítio de polipeptídeo para parar trasncrição no 3'. Seqüências de íntrons e éxons podem ser usadas como regiões homólogas. Knock-in de seqüências exônicas resulta em um gene construído, transcrito para um mRNA capaz de codificar para uma proteína funcional.

- figura 4 representa a seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína suspensa e as seqüências dos iniciadores degenerados usados para a construção de bibliotecas Ulib4 e Ulib5. A. A suspensão (SEQ ID NO: 111) é o ORF I-Crel incluindo a substituição de códon D75N, a inserção de um códon de alanina (A) após o códon de iniciação ATG e três códons adi- cionais (AAD) na extremidade 3'. B. Iniciadores (SEQ ID NO: 112, 113, 114),

- figura 5 ilustra exemplos de padrões e os números de mutantes clivando cada alvo. A. Exemplos de perfis. Cada nova endonuclease é perfi- lada em leveduras em uma série de 64 alvos palindrômicos, arranjados co- mo na figura 5B, diferindo da seqüência C1221 (SEQ ID NO: 16; figura 8B), nas posições ±8, ±9 e ±10. Cada seqüência alvo é nomeada após a trinca - 10, -9, -8 (10NNN). Por exemplo, GGG corresponde ao alvo tcgggacgtcgtac- gacgtcccga (SEQ ID NO: 122; figura 8B). Meganucleases são testadas 4 vezes contra os 64 alvos. Alvos clivados por I-Crel (D75), I-Crel N75 ou dez variantes derivadas são visualizadas por pontos pretos ou cinzas. B. Núme- ros de mutantes clivando cada alvo, e a intensidade média de clivagem. Ca- da seqüência é nomeada após a trinca -10,-9,-8 (10NNN). O número de pro- teínas que clivam cada alvo é mostrado abaixo, e o nível de coloração cinza é proporcional à intensidade de sinal média obtida com esses cortadores em leveduras.

- figura 6 representa os padrões de clivagem das variantes I-Crel na posição 28, 30, 33, 38 e/ou 40. para cada uma das 141 variantes I-Crel obtidas após seleção, e definidas por resíduos na posição 28, 30, 33, 38, 40, 70 e 75, clivagem foi monitorada em leveduras com os 64 alvos derivados do alvo palindrômico C1221 clivado por l-Crel, por substituição dos nucleotí- deos nas posições ± 8 a IO. Alvos são designados por três cartas, corres- pondentes aos nucleotídeos na posição -10, -9 e -8. Por exemplo, GGG cor- responde ao alvo tcgggacgtcgtacgacgtcccga (SEQ ID NO: 122). Valores (en- caixotados) correspondem à intensidade da clivagem, avaliada por um soft- ware apropriado após varredura do filtro, ao passo que (0) indica nenhuma clivagem.

- figura 7 representa the localização das mutações na proteína e no alvo de DNA, em um homodímero I-Crel ligado a seu alvo. Os dois con- juntos de mutações (resíduos 44, 68 e 70; resíduos 30, 33 e 38) são mostra- dos em preto no monômero na esquerda. Os dois conjuntos de mutações são claramente distintos espacialmente. Entretanto, não existe nenhuma evidência estrutural para subdomínios distintos. Regiões cognatas no sítio de alvo de DNA (região -5 a -3; região -10 a -8) são mostradas em cinza em uma metade do sítio.

- figura 8: definição de alvo de derivado I-Crel (A e B) e Perfil (C eD). Todos os alvos são derivados de C1221, um alvo palindrômico clivado por I-CreI tipo selvagem, e mostrado no topo de A e B. A. Uma primeira série de 64 alvos é derivada por mutagênese das posições ±5 a ±3 (em caixas cinzas). Uns poucos exemplos são mostrados abaixo. Interações com resí- duos de I-CreI 44, 68 e 70 são mostradas. B. Uma segunda série de 64 al- vos é derivada por mutagênese das posições ±10 a ±8 (in em caixas cinzas). Uns poucos exemplos são mostrados abaixo. Posições ±8, ±9 e ±10 não são contactadas por resíduos 44, 68 e 70. C. Organização dos alvos como na Figura 8D. Para os painéis esquerdos, as três cartas na tabela indicam as bases nas posições -5, -4, -3 (por exemplo, GGG significa tcaaaacgggg- taccccgttttga (SEQ ID NO: 115)). Para os painés direitos, as três cartas indi- cam as bases nas posições -10, -9, -8 (por exemplo, GGG significa tcgg- gacgtcgtacgacgtcccga (SEQ ID NO: 122)). D. Perfil. Dez variantes I-CreI cli- vando o alvo C1221, incluindo I-Crel N75 (QRR) são perfiladas com dois conjuntos de 64 alvos (±5 a +3 na esquerda, e ±10 a ±8 na direita). Alvos são dispostos como na Figura 8G. O alvo C1221 (quadriculado) é encontra- do em ambos os conjuntos. Mutantes são identificados por três cartas cor- respondentes aos resíduos encontrados na posição 44, 68 e 70 (examplo: QRR é Q44, R68, R70), e todos eles têm uma mutação D75N adicional.

- figura 9 representa a localização das mutações na proteína e

no alvo de DNA1 em um homodímero I-Crel ligado ao seu alvo. Os dois con- juntos de mutações (resíduos 44, 68 e 70; resíduos 28, 30, 33, 38 e 40) são mostrados em preto no monômero na esquerda. Os dois conjuntos de muta- ção são claramente distintos espacialmente. Entretanto, não existe nenhuma evidência estrutural para subdomínios distintos. Regiões cognatas no sítio de alvo de DNA (região -5 a -3; região -10 a -8) são mostradas em cinza em uma metade do sítio.

- figura 10 representa a série HprCH3 de alvos e derivados fe- chados. 10GAGP, 10CAT_P e 5CTT_P (SEQ ID NO: 17 a 19) são deriva-

dos fechados encontrados para serem clivados por mutantes l-Crel. Eles diferem de C1221 (SEQ ID NO: 16) por motivos encaixotados. C1221, 10GAG_P, 10CAT_P e 5CTT_P foram primeiro descritos como seqüências 24 bp, mas dados estruturais sugerem que apenas as 22 bp sejam relevan- tes para proteína/interação de DNA. Entretanto, posições ±12 são indicadas entre parênteses. No alvo HprCH3.2 (SEQ ID NO: 20), a seqüência atga no meio do alvo é recolocada com gtac, as bases encontradas em C1221. Hpr- CH3.3 (SEQ ID NO: 21) é a seqüência palindrômica derivada da parte es- querda de HprCH3.2, e HprCH3.4 (SEQ ID NO: 22) é a seqüência palindrô- mica derivada da parte direita de HprCH3.2. Como mostrado na figura, os botivos encaixotados de 10GAG_P, 10CAT_P e 5CTT_P são encontrados na série HprCH3 dos alvos.

- figura 11 ilustra a clivagem de HprCH3.3 por mutantes 10NNN_P. A figura exibe um exemplo de seleção primária de I-Crel com o alvo HprCH3.3. Clones positivos são encaixotados. As seqüências de mu-

tantes positivos na posição G1, H6 e H7 são KNDTQS/QRRDI (SEQ ID NO: 24), KNTPQS/QRRDI (SEQ ID NO: 44) e KNTTQS/QRRDI (SEQ ID NO: 45), respectivamente (mesma nomenclatura como para a tabela III). - figura 12 ilustra a clivagem de HprCH3.4 por mutantes combi- natórios. A figura exibe um exemplo de seleção primária de mutantes combi- natórios I-Crel com o alvo HprCH3.4. As seqüências de mutantes positivos na posição A9 e B1 são KNTHQS/RYSDN (SEQ ID NO: 54) e KNSYQS/

RYSNI (SEQ ID NO: 60), respectivamente (mesma nomenclatura como para a tabela IV).

- figura 13 ilustra clivagem de HprCH3.2 r HprCH3 por mutantes combinatórios heterodiméricos. A. Seleção secundária de combinações de mutantes I-Crel com o alvo HprCH3.2. B. Seleção secundária das mesmas

combinações de mutantes I-Crel com o alvo HprCH3.

- figura 14 ilustra a clivagem do alvo HprCH3. Um série de mu- tantes I-Crel reduzindo HprCH3.4 foram otimizados e co-expressos com um mutante HprCH3.3. A clivagem é testada com o alvo HprCH3. Mutantes exi- bindo clivagem melhorada de HprCH3 são circulados. No filtro mostrado, C9

corresponde ao heterodímero 28R, 32S, 33S, 38Y, 40Q, 44R, 68, 70S, 75N, 77N (SEQ ID NO: 65) + 33H (SEQ ID NO: 32), E6 corresponde ao 28R, 32S33S, 38Y, 40Q, 44R, 68A, 70S, 75H, 77Y (SEQ ID NO: 66) + 33H (SEQ ID NO: 32) e F3 corresponde ao 28K, 32T, 33H, 38Q, 40S, 44K, 68Y, 70S, 75D, 77R, 92R, 96R, 107R, 132V, 140A, 143A (SEQ ID NO:74) + 33H (SEQ

ID NO: 32). H11 é o heterodímero original (um mutante clivando HprCH3.4, KSSQQS/RYSDN (SEQ ID NO:53), co-expresso com um mutante clivando HprCH3.3, KNSHQS/QRRDI, (SEQ ID NO: 32). H12 é um controle positivo.

- figura 15 ilustra a clivagem do alvo HprCH3. Uma série de mu- tantes I-Crel reduzindo HprCH3.3 foram otimizados e expressos com um

mutante reduzindo HprCH3.4. A clivagem é testada com o alvo HprCH3. Mu- tantes exibindo clivagem eficientes de HprCH3 são circulados. No primeiro filtro, B10 corresponde ao heterodímero 33H, 71R, 1031, 129A e 130G (SEQ ID NO: 80) + 33T, 38Y, 44K, 68Y, 70S, 75E, e 77V (SEQ ID NO: 56). No se- gundo filtro, H3 corresponde ao heterodímero 21, 33H, 81V, 86I, 110G, 131R,

135Q, 151A e 157V (SEQ ID NO:79) + 33T, 38Y, 44K, 68Y, 70S, 75E e 77V (SEQ ID NO: 56). H12 é um controle positivo.

- figura 16 representa o mapa do vetor pCLS1055. - figura 17 representa o mapa do vetor pCLS0542.

- figura 18 representa o mapa do vetor pCLS1107.

- figura 19 ilustra as seqüências de alvo de DNA que são apre- sentadas no gene HPRT Criteculus griseus e a variante I-Crel corresponden-

te que são capazes de clivar o alvo de DNA. O alvo de DNA é apresentado (coluna 3), com seu primeiro nucleosídeo (início, coluna 1) e último nucleo- sídeo (final, coluna 2); as posições são indicadas relativamente para a se- qüência de mRNA HPRT (número de acesso J00060.1). A seqüência de ca- da variante heterodimérica é definida pelos resíduos de aminoácido nas po- sições indicadas no primeiro monômero (coluna 4) e do segundo monômero (coluna 5). Por exemplo, a primeira variante heterodimérica da figura 19 consiste em um primeiro monômero tendo K, Q, D, Y1 Q1 S, Ν, K, S, R e T nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 e 77, respectivamente e um segundo monômero tendo Κ, N, S, G, C, S, Q, R, R, N e I nas posições 28, 30, 32, 38, 40, 44, 68, 70, 75 e 77, respectivamente. As posições são indicadas pela referência à seqüência I-Crel SWISSPROT P05725 ou código de acesso pdb Ig9y; I-Crel tem Κ, N, S, Y, Q, S, Q, R, R, D, I, nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 e 77, respectivamente. As posições que não são indcadas não são mutadas e assim correspondem à seqüência I- Crel tipo selvagem.

- figura 20 ilustra um projeto de sistemade relatório em células de mamífero. O gene de resitência à puromicina, interrompido por sítio de clivagem I-Scel 132 bp a jusante do códon de início, está sob o controle do promotor EFIa (1). O transgene foi estavelmente expresso em células CHO-

K1 em cópia única. A fim de introduzir sítios alvo de meganuclease no mes- mo contexto cromossomial, a matriz de reparo é composta de i) um gene de resitência à higromicina sem promotor, ii) um cassete de expressão IacZ cmpleto e iii) dois braços de seqüências homólogos (1.1 kb e 2.3 kb). Muitas matrizes de reparo têm sido construídas diferindo apenas pelo sítio de reco- nhecimento que interrompe o gene IacZ (2). Assim, muitas linhagens celula- res similares têm sido produzidas como linhagem celular A1, linhagem celu- lar I-Scel e linhagem celular l-Crel. Um gene IacZ funcional é restaurado quando a matriz de reparo IacZ (2kb em comprimento) é co-transfectadas com vetores expressando meganuclease clivando o sítio de reconhecimento (3). O nível de recombinação induzida por meganuclease pode ser inferida a partir do número de colônias azuis ou foco após transfecção.

- figura 21 representa o mapa de pCLS1088, um plasmídeo para

a expressão de I-Crel N75 em células de mamífero.

- figura 22 ilustra a eficiência de meganucleases clivando a se- qüência de alvo de DNA HprCH3. A freqüência de reparo do gene LacZ ge- ne é detectada após transfecção de células CHO contendo um sistema de relatório cormossomial HprCH3, com uma matriz de reparo e várias quanti- dades de vetores de expressão de meganuclease, codificando para os hete- rodímeros construídos iniciais (HprCH3.3/HprCH3.4) ou seus derivados de G19S (HprCH3.3/HprCh3.4 G19S ou HprCH3.3 G19S/HprCh3.4). Exemplo 1: Endonucleases funcionais com nova especificidade no que se refere a nucleotídeos ±8 a ±10 (10NNN).

O método para produzir variantes de meganuclease e os ensai- os com base em recombinação induzida por clivagem em células de mamífe- ro ou levedura, que são usadas para variantes de seleção com especificida- de alterada são descritos no Pedido PCT Internacional WO 2004/067736; Epinat et ah, Nucleic acids Res., 2003, 31, 2952-2962; Chames et al, Nucleic acids Res., 2005, 33, el 78, e Arnould et al., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443- 458. Esses ensaios resultam em um gene de relatório LacZ funcional que pode ser monitorado por métodos padrão. A) Materiais e métodos a) Construção de bibliotecas mutantes

Quadros de leitura abertos I-Crel wt (l-Crel D75), I-Crel D75N (I- Crel N75) e I-Crel S70 N75 foram sintetizados, como descrito anteriormente (Epinat et al, N.A.R., 2003, 31, 2952-2962). Bibliotecas de combinação foram derivadas das suspensões I-Crel N75, I-Crel D75 e I-Crel S70 N75, recolo- cando combinações diferentes de resíduos, potencialmente envolvidos nas interações com as bases nas posições ± 8 a 10 de uma metade de sítio alvo de DNA (Q26, K28, N30, S32, Y33, Q38 e S40). A diversidade das bibliote- cas de meganuclease foi gerada por PCR usando iniciadores degenerados abrigando um códon degenerado exclusivo em cada uma das posições sele- cionadas.

Mutação D75N foi introduzida recolocando o códon 75 com aac. Em seguida, os três códons nas posições N30, Y33 e Q38 (Ulib4 library) ou K28, N30 e Q38 (biblioteca Ulib5) foram recolocados por um códon degene- rado WK (18 códons) codificando para 12 aminoácidos diferentes: A, D, E, G, Η, Κ, Ν, P, Q, R1 S, T). Em conseqüência, a diversidade máxima (teórica) dessas bibliotecas de proteína 123 ou 1728. Entretanto, em termos de ácidos nucleicos, a diversidade foi de 183 ou 5832.

Em Lib4, ordenada de BIOMETHODES, uma arginina na posi- ção 70 da suspensão I-Crel N75 foi primeiro recolocada com uma serina (R70S). Em seguida, as posições 28, 33, 38 e 40 foram aleatorizadas. Os aminoácidos regulares (K28, Y33, Q38 e S40) foram reclocados com um fora dos 10 aminoácidos (A, D, Ε, Κ, N, Q, R, S, Τ, Υ). A biblioteca resultante foi uma complexidade teórica de 10000 em termos de proteína.

Em adição, bibliotecas pequenas de complexidade 225 (152) re- sultantes da aleatorização apenas de duas posições foram construídas em uma suspensão I-Crel N75 ou I-Crel D75, usando códon degenerado NVK (24 códons, aminoácidos ACDEGHKNPQRSTWY).

Fragmentos portando combinações das mutações desejadas foram obtidos por PCR, usando um par de iniciadores degenerados que co- dificam para 10, 12 ou 15 aminoácidos diferentes, e como modelo de DNA, o I-Crel N75 (Figura 4A), I-Crel D75 ou I-Crel S70 N75 abrem quadros de leitu- ra (ORF). Por exemplo, a figura 4B ilustra os dois pares de iniciadores (U- lib456for e Ulib4rev; Ulib456for e Ulib5rev) usados para gerar as bibliotecas Ulib4 e Ulib5, respectivamente. Os produtos PCR correspondentes foram clonados de volta no I-Crel N75,1-Crel D75 ou I-Crel S70 N75 ORF, no vetor de expressão replicativo de levedura pCLS0542 (Epinat et al, pré-citado; fi- gura 17), portando um gene marcador LEU2 auxotrófico. Neste vetor replica- tivo baseado em 2 mícrons, as variantes I-Crel estão sob o controle de um promotor induzível por galactose. b) Construção de clones alvos

Os 64 alvos palindrômicos derivados de C1221 foram construí- dos como descrito a seguir: 64 pares de oligonucleotídeos ggcatacaag tttcnnnacgtcgtacgacgtnnngacaatcgtc tgtca (SEQ ID NO: 109) e seqüências complementares reversas foram ordenadas de Sigma, enrijecidas e fecha- das em pGEM- T Easy (PROMEGA) nas mesma orientação. Depois, um fragmento 400 bp Pvull foi excisado e clonado no vetor de levedura pFL39- ADH-LACURAZ, também chamado pCLS0042, descrito anteriormente (Epi- nat et al, pré-citado), resultando em 64 vetores de levedura de relatórios (plasmídeos alvos).

c) Cepas de Levedura

As três bibliotecas de variantes de expressão de foram transfor- madas na cepa de levedura haploide mutante Ieu2 mutant FYC2-6A: MATaI- pha, trplA63, leu2A1, his3A200. Uma química clássica/protocolo de choque de aquecimento que rotineiramente dá 106 transformantes independentes por μg de DNA derivados de (Gietz and Woods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87-96), foi usada para trnasformação. Clones transformantes de indiví- duo (Leu+) foram individualmente colocados em microplacas de 96 cavida- des. Os 64 plasmídeos alvo foram transformados usando o mesmo protocolo padrão, na cepa de levedura haploide FYBL2-7B: MATa, ura3A851, trpl Δ63, leu2A1, lys2A202, resultando em 64 cepas de teste.

d) Cruzamento de clones de expressão de meganuclease e seleção em le- veduras.

Clones de expressão de meganuclease foram cruzados com ca- da uma das 64 cepas alvo, e diploides foram testados para atividade beta- galactosidase, usando o ensaio de seleção anteriormente descrito no Pedido PCT Internacional WO 2004/067736; Epinat et al, Nucleic Acids Res., 2003, 31, 2952-2962; Chames et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33, el 78, e Arnould et al., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443- 458. Os clones de variante I-Crel bem como cepas de relatório de evedura foram estocadas em glicerol (20%) e replicadas em novas microplacas. O cruzamento foi realizado usando uma grelha de colônia (Qpixll, GENETIX). Os mutantes foram grelhados em filtros de náilon cobrindo as placas YPD1 usando uma alta densidade (cerca de 20 pontos/cm2). Um segundo processo de grelha foi realizado usando os mes- mos filtros para pontear uma segunda camada consistindo em 64 cepas de levedura de abrigo de relatório para cada variante. As membranas foram colocadas em meio rico em YEPD de agarose sólida, e incubadas a 30°C por uma noite, para permitir cruzamento. A seguir, os filtros foram transferi- dos para um meio sintético, faltando Ieucina e triptofano, com galactose (1%) como uma fonte de carbono (e com G418 para exprerimentos de co- expressão), e incubados por cinco dias a 37°C, para selecionar diploides portando os vetores de expressão e alvo. Depois de 5 dias, os filtros foram colocados em um meio de agarose sólido com 0,02% X-Gal em tampão de fosfato de sódio a 0,5 M, pH 7,0, 0,1% SDS, 6% de dimetil formamida (DMF), 7 mM β-mercaptoetanol, 1% agarose, e incubados a 37°C, paramoni- tora atividade β-galactosidase. Após dois dias de incubação, clones positivos foram identificados por varreduras e a atividade β-galactosidase dos clones foi quantificada usando um software apropriado.

Os clones mostrando uma atividade contra pelo menos um alvo foram isolados (primeira peneiração) e cada clone positivo foi testado contra as 64 cepas de relatório em quadruplicatas, desse m odo, criando perfis completos (peneiração secundária). c) Seqüência

O quadro de leitura aberto (ORF) de clones positivos identifica- dos durante a primeira e/ou segunda seleção na levedura foi amplificado por PCR sobre colônias de levedura usando iniciadores: PCR-GaMO-F (gcaactt- tagtgctgacacatacagg, SEQ ID NO: 48) e PCR-GaIIO-R (acaaccttgattgca- gacttgacc, SEQ ID NO: 49) de PROLIGO. Brevemente, colônia de levedura foi separada e ressuspensa em 100 μΙ de meio líquido LGIu e cultivadas du- rante a noite. Após centrifugação, pélete de levedura é ressuspenso em 10 μΙ de água estéril e usado para realizar reação PCR em um volume final de 50 μΙ contendo 1,5 μΙ de cada um dos iniciadores específicos (100 pmol/μΙ). As condições PCR foram um ciclo de desnaturação por 10 minutos a 94°C, ciclos de desnaturação por 30s a 94°C, enrijecimento ou 1 min a 55°C, extensão por 1,5 min a 72°C, e uma extensão final por 5 min. O sequencia- mento foi realizado diretamente sobre o produto PCR por MILLEGEN. d) Análise de estrutura

Todas as análises de estrutura de proteína foram realizadas u- sando Pymol. As estruturas do I-Crel correspondem a entrada pdb Ig9y. Os números de resíduos no teste sempre se referem a essas estruturas, exceto para resíduos no segundo domínio de preteína I-Crel do homodímero onde números de resíduo foram estabelecidos como para o primeiro domínio. B) Resultados

I-Crel é uma endonuclease residente dimérica que cliva alvo pseudo-palindrômio a 22 bp. A análise da estrutura I-Crel ligada a seu alvo natural tem mostrado que em cada monômero, oito resíduos estabelecem interações diretas com sete bases (Jurica et al., 1998, pré-citado). De acordo com esses dados estruturais, as bases dos nucleotídeos nas posições ± 8 a estabelecem contato direto com aminoácido I-Crel N30, Y33, Q38 e con- tatos indiretos com aminoácido I-Crel K28 e S40. Assim, novas proteínas com mutações nas posições 30, 33 e 38 poderiam exibir novos perfis de cli- vagem com os 64 alvos resultantes das substituições nas posições ± 8, ± 9 e ± 10 de um alvo palindrômico clivado por I-Crel (10NNN alvo). Em adição, mutações podem alterar o número e posições dos resíduos envolvidos em contato direto com as bases de DNA. Mais especificamente, outras posições que não 30, 33, 38, mas localizadas na vizinhaça próxima nas proteínas do- bradas, poderiam envolver a interação com os mesmos pares de base.

Uma abordagem de biblioteca de proteína exaustiva vs. bibliote- ca alvo foi submetida a engenharia local desta parte da interface de ligação de DNA. Aleatorização de posições de 5 levaria a uma diversidade teórica de 205 = 3,2x106. Entretanto, bibliotecas com baixa diversidade foram gera- das por aleatorização de 2, 3 ou 4 resíduos de uma vez, resultando em uma diversidade de 225 (152), 1728 (123) ou 10,000 (104). Esta estratégia permi- tiu uma seleção exaustiva de cada uma dessas bibliotecas contra 64 alvos de DNA 10NNN palindrômicos usando uma um ensaio baseado em levedura descrito anteriormente (Epinat et al, 2003, pré-citado e Pedido PCT Interna- cional WO 2004/067736).

Primeiro, a suspensão I-Crel foi mutada a partir de D75 a Ν, A mutação D75N não afetou a estrutura da proteína, mas diminuiu a toxicidade de I-Crel em experimentos de sobre-expressão.

A seguir, a biblioteca Ulib4 foi construída: resíduos 30, 33 e 38, foram aleatorizados, e os aminoácidos regulares (N30, Y33, e Q38) recolo- cados com um foram dos 12 aminoácidos (A, D, E, G, Η, Κ, Ν, P, Q, R, S, T). A biblioteca resultante teve uma complexidade de 1728 em termos de prote- ína (5832 em termos de ácidos nucleicos).

Em seguida, duas outras bibliotecas foram construídas: Ulib5 e Lib4. Em Ulib5, os resíduos 28, 30 e 38, foram aleatorizados, e os aminoáci- dos regulares (K28, N30, e Q38) recolocados com um foram dos 12 aminoá- cidos (ADEGHKNPQRST). A biblioteca resultante teve uma complexidade de 1728 em termos de proteína (5832 em termos de ácidos nucleicos). Em Lib4, uma arginina na posição 70 foi primeiro recolocada com uma serina. Em seguida, as posições 28, 33, 38 e 40 foram aleatorizadas, e os aminoá- cidos regulares (K28, Y33, Q38 e S40) recolocados com um dos 10 aminoá- cidos (A, D, Ε, Κ, N, Q, R1 S, Τ, Υ). A biblioteca resultante teve uma comple- xidade de 10000 em termos de proteína.

Em um experimento de seleção primário, 20000 clones de Ulib4, 10000 clones de Ulib5 e 20000 clones de Lib4 foram cruzados com cada uma das 64 cepas de teste, e diploides foram testados para atividade beta- galactosidase. Todos os clones exibindo a atividade de clivagem com pelo menos um fora dos 64 alvos foram testados em uma segunda etapa de sele- ção com os 64 alvos, em quadriplicatas, e cada perfil de clivagem foi estabe- lecido, como mostrado na figura 5. Em seguida, ORFs de meganuclease foram ampliados a partir de cada cepa por PCR, e sequenciados.

Após seleção e sequenciamento secundários de positivos sobre a região de codificação inteira, um total de 1484 mutantes exclusivos foram isolados mostrando uma atividade de clivagem contra pelo menos um alvo. Diferentes padrões poderiam ser observados. A figura 6 ilustra 37 novos al- vos clivados por uma coleta de 141 variantes, incluindo 34 alvos que não são clivados por I-Crel e 3 alvos que são clivados por I-Crel (aag, aat e aac). Doze exemplos de perfis, incluindo I-Crel N75 e I-Crel D75 são mostrados na Figura 5A. Alguns desses novos perfis compartilharam alguma similarida- de com a suspensão tipo selvagem ao passo que muitos outros foram total- mente diferentes. Endonucleases residentes podem comumente acomodar alguma degeneração em suas seqüências alvo, e proteínas I-Crel e I-Crel N75 por si só clivam uma série de dezesseis e três alvos, respectivamente. A degeneração de clivagem foi encontrada por muitas das novas endonucle- ases, com uma média de 9.9 alvos clivados por mutante (desvio padrão: 11). Entretanto, entre os 1484 mutantes identificados, 219 (15%) foram encontra- dos para clivar apenas um alvo de DNA, 179 (12%) clivam dois, e 169 (11%) e 120 (8%) foram capazes de clivar 3 e 4 alvos, respectivamente. Assim, independente de seu alvo preferido, um número significante de derivados de I-Crel exibe um nível de especificidade que é similar se não maior do que aquele do mutante I-Crel N75 (três seqüências alvo 10NNN clivadas), ou I- Crel (dezesseis seqüências alvo 10NNN clivadas). Também, a maioria dos mutantes isolados para especificidade alterada para seqüências 10NNN não mais cliva a seqüência alvo C1221 original (61% e 59%, respectivamente).

No geral, esta ampla coleta de mutantes permitiu o alvo de todas as 64 sequêncas de DNA possíveis nas posições ±10, ±9, e ±8 (Figura 5B). Entretanto, existiu uma grande variação nos números de mutantes que cli- vam cada alvo (Figura 5B), esses números variam de 3 a 936, com uma mé- dia de 228,5 (desvio padrão: 201,5). A clivagem foi freqüentemente observa- da por alvos com uma guanina em ±8 ou uma adenina em ±9, ao passo que uma citosina e ±10 ou ±8 foi correlacionada, com baixos números de clivado- res. Em adição, todos os alvos não foram clivados com a mesma eficiência. Uma vez que variações significantes poderiam ser observadas por um mes- mo alvo, dependendo do mutante (comparar eficiências de clivagem para um alvo 10AAA tipo selvagem na figura 5B, porexemplo), uma eficiência de cli- vagem média foi medida por cada alvo como anteriormente relatado (Ar- nould et al, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458). Essas eficiências médias são representadas por níveis de escala cinza na figura 5B. A análise dos resulta- dos mostra uma clara correlação entre esta eficiência média e os números de clivadores, com mais alvo mais freqüentemente cortado sendo também mais eficientemente cortado (comparar, por exemplo, alvos 10TCN, 10CTN e 10CCN com 10GAN, 10AAN e 10TAN na Figura 5B). Assim, milhares de novas variantes foram obtidas, incluindo mu-

tantes com nova especificidade de substrato; essas variantes podem manter altos níveis de atividade e a especificidade das novas proteínas pode ser ainda mais limitada do que a proteína tipo selvagem para seu alvo. Exemplo 2: Dois subdomínios funcionais I-Crel podem se comportar de forma independente em termos de ligação de DNA.

Este exemplo mostra que um alvo I-Crel pode ser separado em duas partes, ligadas por diferentes subdomínios, se comportando de forma independente. No alvo de DNA l-Crel, as posições ±5, ±4 e ±3 são ligadas por resíduos 44, 68 e 70. Muitas variantes l-Crel, mutadas nas posições 44, 68, 70 e 75, obtidas como descrito no exemplo 1, foram mostradas para exi- bir uma atividade detectável em C1221, um alvo palindrômico clivado por I- Crel tipo selvagem (Chevalier, et al, 2003), mas foram clivando outros alvos com várias eficácias. Na parte externa do sítio de ligação, as posições ±9 e ±8 são contactadas pelos resíduos 30, 33 e 38. Como mostrado na figura 7, os dois conjuntos de resíduos estão em partes distintas das proteínas ±8. Se as posições ±5 a ±3 e ±10 a ±8 forem ligadas por dois subdomínios funcio- nais, independentes, diferentes, a engenharia de um subdomínio não deve- ria impactar nas propriedades de ligação do outro domínio.

A fim de determinar se as posições ±5 a ±3 e ±9 a ±8 são liga- das por dois subdomínios funcionais, independentes, diferentes, mutantes com especificidade alterada na região ±5 a ±3, mas ainda ligando C1221, foram ensaiados por suas propriedades de clivagem na região ±10 a ±8. A) Material e Métodos

a) Análise de estrutura O procedimento experimental como no exemplo 1.

b) Variante I-Crel expressando cepa de levedura mutantes foram gerados como descrito no exemplo 1, mutando as posições 44, 68, 70 e 75, e selecionando clones capazes de clivar C1221 alvos derivados. Mutantes expressando plasmídeos são transformados em cepa S. cerevisiae FYC2-6A (MATa, trplA63, leu2AI, his3A200).

c) Construção do clone alvo

Os 64 plasmídeos alvo palindrômicos derivados de C1221 por mutação em ±5 a ±3 foram construídos como descrito no exemplo 1, usando 64 pares de oligonucleotídeos (ggcatacaagtttcaaaacn nngtacnnngttttgaca- atcgtctgtca (SEQ ID NO : 110) e seqüências complementares reversas). Os 64 plasmídeos alvo foram transformados usando o protocolo descrito no e- xemplo 1, na cepa de levedura haploide FYBL2-7B: MATa, ura3A851, trpl Δ63, leu2A1, lys2A202, resultando em 64 cepas de teste.

d) Cruzamento de meqanuclease expressando clones e seleção em levedu- ras

O cruzamento foi realizado como descrito no exemplo 1, usando uma baixa densidade de grelha (cerca de 4 pontos/cm2). B) Resultados

64 alvos correspondendo a todos os alvos palindrômicos deriva- dos de C1221 foram construídos por mutagênese de bases ±10 a ±8, como mostrado na figura 8B. O perfil de clivagem I-Crel N75 foi estabelecido, mos- trando um forte sinal com alvos aaa e aat, e um mais fraco com um alvo aag.

Como mostrado na figura 8C, as proteínas com perfil de cliva- gem claramente diferente em ±5 a ±3, tal como QAR1 QNR, TRR, NRR, ERR e DRR têm um perfil similar em ±10 a ±8. A seqüência aaa em ±10 a ±8 cor- responde ao alvo C1221, e é necessariamente clivada por todas as variantes que clivam C1221. aat é clivada bem como em muitos mutantes (90 %), ao passo que aag é freqüentemente não observada, provavelmente porque o sinal cai abaixo do nível de detecção em clivadores fracos. Nenhum outro alvo é clivado. Esses resultados mostram que as regiões ±5 a ±3 e ±10 a ±8 são ligadas por suas unidades de ligação amplamente independentes, dife- rentes.

Exemplo 3: Estratégia para construir novas meganucleases clivando um alvo a partir do gene HPRT. A) Princípio da abordagem de combinação paraprojetar no- vas meganucleases com especificidade personalizadas.

O objetivo aqui é determinar se é possível combinar subdomí- nios funcionais separáveis na interface de ligação de DNA I-Crel1 a fim de clivar novos alvos DNA.

A identificação de grupos distintos de mutações na seqüência de codificação I-Crel que altera a especificidade de clivagem no que se refere a duas regiões diferentes da seqüência alvo C1221 (10NNN (posições -10a- 8 e + 8 a +10: ± 8 a 10 ou ± 10 a 8; exemplo 1) e 5NNN (posições- 5 a -3 e + 3 a +5: ± 3 a 5 a ± 5 a 3; Arnould et al., J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458, Pedidos Internacionais WO 2006/097784 e WO 2006/097853) surge a pos- sibilidade de combinar esses dois grupos de mutantes intramolecularmente para gerar um mutante combinatório capaz de clivar uma seqüência alvo simultaneamente alterada nas posições 10NNN e 5NNN (Figura 1C).

As posições 28, 30, 33, 38 e 40 por um lado, e 44, 68 e 70, por outro lado estão na mesma dobradura de ligação de DNA, e não existe ne- nhuma evidência estrutural que elas deveriam se comportar de forma inde- pendente. Entretanto, os dois conjuntos de mutações estão claramente em duas regiões espacialmente distintas desta dobradura (figuras 7 e 9) locali- zadas ao redor de diferentes regiões do alvo de DNA. Em adição, o impacto cumulativo de uma série de mutações poderia eventalmente interromper a dobradura. Para verificar se elas são parte de duas subunidades funcionais independentes, as mutações a partir dessas duas séries de mutantes foram combinadas, e a capacidade das variantes resultantes para clivar a seqüên- cia alvo de combinação foi ensaiada (Figura 1D).

Portanto, uma seqüência alvo não-palindrômica que seria um trabalho de quatro alvos 5NNN e 10NNN clivados, é identificada. Em adição, duas seqüências alvo derivadas representando as metades esquerda e direi- ta em forma palindrômica, são projetadas. Para gerar mutantes combinató- rios I-Crel capazes de alvejar alvos palindrômicos, mutantes clivando de forma eficiente a parte 10NNN e 5NNN de cada seqüência palindrômica são selecionados e suas mutações características incorporadas. Por todo o texto e figuras, as seqüências de mutantes de combi- nação são nomeadas com um código carta de onze, após resíduos nas po- sições 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68 e 70, 75 e 77. Por exemplo, KNSTYS/KYSEV que representam I-Crel K28, N30, S32, T33, Y38, S40, K44, Y68, S70, E75, e V77 (l-Crel 28K, 30N, 32S, 33T, 38Y, 40S, 44K, 68Y, 70S, 75E e 77V). Controles de origem são nomeados com um código carta de seis, após resíduos nas posições 28, 30, 32, 33, 38 e 40 ou um código carta de cinco, após resíduos nas posições 44, 68, 70, 75 e 77. Por exemplo, KNSTYS que representam I-Crel 28K, 30N, 32S, 33T, 38Y e 40S, e KYSEV que representam I-Crel 44K, 68Y, 70S, 75E e 77V.

Todas as seqüências alvo descritas nesses exemplos são se- qüências palindrômicas de 22 ou 24 bp. Portanto, elas serão descritas ape- nas pelos primeiros 11 ou 12 nucleotídeos, seguidas pelo sufixo P; por e- xemplo, alvo 5' tcaaaacgtcgtacgacgttttga 3' (SEQ ID NO: 16) clivadas pela proteína l-Crel, serão chamadas de tcaaaacgtcgt_P.

B) Projeto de novas meganucleases clivando um alvo a par- tir do gene HPRT Criteculus griseus.

Esta abordagem de combinação, foi usada para construir o do- mínio de ligação de DNA da meganuclease l-Crel, e clivar o gene HPRT Cri- cetulus griseus.

HprCH3 é um alvo 22 bp (não-palindrômico) (Figura 2) localiza- do, em Éxon 3 (posições 17 a 38) do gene HPRT Criteculus griseus (Hams- ter Chinês); a seqüência alvo corresponde as posições 241 a 262 do mRNA (número de acesso J00060; SEQ ID NO: 15; Figura 2).

A meganucleases clivando HprCH3 poderia ser usada, ou para inserir um gene de interesse homólogo no Lócus de HPRT, para permitir ní- veis de expressão de gene reduzíveís em linhagens de célula recombinante de vertebrado ou animais transgênicos, ou para inativar o gene HPRT, para permitir a seleção de linhagens de célula recombinate de vertebrado ou ani- mais transgênicos (Figura 3A e 3B).

A seqüência HprCH3 é parcialmente um trabalho dos alvos 10GAG_P, 10CAT_P e 5CTT_P (Figura 10) que são clivados por meganu- cleases identificadas anteriormente, obtidas como descrito nos Pedidos PCT Internacionais WO 2006/097784 e WO 2006/097853; Arnould et al, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458; exemplo 1. Assim, HprCH3 poderia ser clivada por mutantes combinatórios resultando dessas meganucleases anteriormente identificadas.

As seqüências alvo 10GAG_P, 10CAT_P e 5CTT_P são deriva- dos de 24 bp de C1221, uma seqüência palindrômica clivada por I-Crel (Ar- nould et al, pré-citado). Entretanto, a estrutura de I-Crel ligada a seu alvo de DNA sugere que os dois pares de base experimentais externos desses alvos (posições -12 e 12) não tenham nenhum impacto sobre a ligação e a cliva- gem (Chevalier et al, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312-316; Chevalier and Stoddard, Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774; Chevalier et al, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269), e neste estudo, apenas as posições -11 a 11 fo- ram consideradas. Consequentemente, a série de alvos HprCHS foi definida como seqüências de 22 bp em vez de 24 bp. HprCH3 difere de C1221 na região central de 4 bp. De acordo com a estrutura da proteína I-Crel ligada a seuq alvo, não existe nenhum contato entre os pares de base centrais (posi- ções -2 a 2) e a proteína I-Crel (Chevalier et al, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312-316; Chevalier and Stoddard, NucIeicAcids Res., 2001, 29, 3757-3774; Chevalier et al, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269). Assim, as bases nessas posições não deveriam impactar na eficiência de ligação. Entretanto, elas poderiam afetar a clivagem, que resulta de dois cortes na borda desta regi- ão. Assim, a seqüência atga em -2 a 2 foi primeiro substituída com a se- qüência gtac a partir de C1221, resultando no alvo HprCH3.2 (Figura 10). Em seguida, dois alvos palindrômicos, HprCH3.3 e HprCH3.4, foram deriva- dos de HprCH3.2 (Figura 10). Uma vez que HprCH3.3 e HprCH3.4 são pa- lindrômicos, eles poderiam ser clivados por proteínas homodiméricas. Assim, proteínas são capazes de clivas as seqüências HprCH3.3 e HprCH3.4 como homodímeros foram primeiro designados (exemplos 4 e 5) e em seguida co- expressos para obter heterodímeros clivando HprCH3 (exemplo 6). Hetero- dímeros que clivam os alvos HprCH3.2 e HprCH3 poderiam ser identifica- dos. A fim de melhorar a atividade de clivagem para o alvo HprCH3, uma série de mutantes que clivam HprCH3.3 e HprCH3.4 foi escolhida, e em se- guida refinada. Os mutantes escolhidos foram aleatoriamente mutageniza- dos, e usados para formar novos heterodímeros que foram peneirados con- tra o alvo HprCH3 (exemplos 7 e 8). Heterodímeros poderiam ser identifica- dos com uma atividade de clivagem melhorada para o alvo HprCH3. Exemplo 4: Identificação de meganucleases clivando HprCH3.3

Neste exemplo, mostra que mutantes I-Crel podem cortar a se- qüência alvo de DNA HprCH3.3 derivada da parte esquerda do alvo Hpr- CH3.2 em uma forma palindrômica (Figura 10). Seqüências alvo descritas neste exemplo são seqüências palindrômicas de 22 bp. Portanto, portanto, elas serão descritas apenas pelos primeiros 11 nucleotídeos, seguidas pelo sufixo P (Por exemplo, alvo HprCH3.3 irá ser anotado cgagatgtcgt_P (SEQ ID NO: 21).

HprCH3.3 é similar à 10GAG_P em todas as posições exceto ±6. Foi hipotetizado que posições ±6 teriam um efeito menor sobre a ligação e a atividade de clivagem. Mutantes capazes de clivar o alvo 10GAG_P fo- ram obtidos por mutagênese de I-Crel ou I-Crel S70 N75, nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40, como descrito no exemplo 1. Seleção desses mutantes permitiria a identificação de meganucleases que clivam o alvo HprCFB.3.

A) Material e Métodos

a) Construção de vetor alvo

O alvo foi clonado como segue: oligonucleosídeo corresponden- te à seqüência alvo flanqueada por uma seqüência de clonagem do tipo ga- teway foi ordenadaa partir de PROLIGO: 5'tggcatacaagtttcgagatgtcgtacga catctcgacaatcgtctgtca3' (SEQ ID NO: 23). DNA alvo de duplo folamento, ge- rado por amplificação de PCR oligonucleosídeo de único filamento, foi clo- nado usando o protocolo do tipo gateway (INVITROGEN) no vetor de relató- rio de levedura (pCLS1055, Figura 16). Vetor de relatório de levedura foi transformafo em cepa Saccharomyces cerevisiae FYBL2-7B (ΜΑΤ α, ura 3Δ851, trp1A63, ieu2Al, lys2A202), resultando em uma cepa de relatório.

b) Cruzamento de meganuclease expressando clones e seleção em Ievedu- ra Mutantes I-Crel clivando 10GAG_P foram anteriormente identifi- cados, como descrito no exemplo 1. Esses mutantes estavam presentesem um plasmídeo de expressão de levedura (pCLS0542, Figura 17) na cepa S. cerevisiae FYC2-6A (MATa, trplA63, leu2Al, his3A200).

Meganuclease expressando clones foram cruzadas com a cepa de relatório e diploides foram testados para atividade beta-galactosidade, usando o ensaio de seleção como descrito no exemplo 1, usando uma baixa densidade de gralha (cerca de 4 pontos/cm2). c) Sequenciamento de mutantes

O procedimento experimental é como descrito no exemplo 1. B) Resultados

Mutantes I-Crel capazes de clivar 10GAG_P foram selecionados para clivagem contra alvo de DNA HprCH3.3 (cgagatgtcgt_P; (SEQ ID NO: 21). 38 clones positivos foram encontrados, e após sequenciamento e vali- dação por seleção secundária 24 mutantes listados na tabela Ill foram identi- ficados. Exemplos de positivos são mostrados na tabela 11.

Tabela III: Mutantes I-Crel capazes de clivar o alvo de DNA HprCH3.3.

Aminoácidos nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40 /44, 68, 70, 75 e 77 dos mutantes I-Crel (ex: KNDTQS/QRRDI re- presentam K28, N30, D32, T33, Q38, S40/Q44, R68, R70, D75 e Ϊ77) SEQ ID NO: KNDTQS/QRRDI 24 KNETQS/QRRDI 25 KNPAQS/QRRDI 26 KNRDQS/QRRDI 27 KNSCKS/QRRDI 28 KNSCSS/QRRDI 29 KNSCTS/QRRDI 30 KNSGAS/QRRDI 31 KNSHQS/QRRDI 32 KNSPHS/QRRDI 33 KNSPQS/QRRDI 34 KNSQQS/QRRDI 35 KNSQYS/QRRDI 36 KNSRQY/QRSNI 37 KNSSDS/QRRDI 38 KNSTGS/QRRDI 39 KNSTNS/QRRDI 40 KNSTSS/QRRDI 41 Tabela III: Continuação

KNSTTS/QRRDI 42 KNSVHS/QRRDI 43 KNTPQS/QRRDI 44 KNTTQS/QRRDI 45 KTSTNS/QRRDI 46 TNSRQR/QRSNI 47

Exemplo 5: Preparação de meganucleases clivando HprCH3.4

Este exemplo mostra que mutantes I-Crel podem clivar a se- qüência alvo de DNA HprCH3.4 derivada da parte direita do alvo HprCH3.2 em uma forma palindrômica (Figura 10). Todas as seqüências alvo descritas neste exemplo são seqüências palindrômicas de 22 bp. Portanto, elas serão descritas apenas pelos primeiros 11 nucleotídeos, seguidas pelo sufixo _P (por exemplo, HprCH3.4 será chamado de ccatctcttgt P; SEQ ID NO: 22).

HprCH3.4 é similar a 5CTT_P nas posições ±1, ±2, ±3, ±4, ±5 e ±11 e a 10CAT_P nas posições +1, ±2, ±8, ±9 +10 e ±11. Foi hipotetizado que nas posições ±6 e ±7 teriam pouco efeito sobre a ligação e a atividade de clivagem. Mutantes capazes de clivar 5CTT_P (caaaaccttgt P; SEQ ID NO: 19 ) foram obtidos por mutagênese de I-Crel N75 nas posições 44, 68 e 70 ou I-Crel S70 nas posições 44, 68, 75 e 77, como descrito anteriormente (Pedidos PCT Internacionais WO 2006/097784 e WO 2006/097853; Arnould et al, J. Mol. Biol., 2006, 355, 443- 458). Mutantes capazes de clivar o alvo 10CAT_P (ccatacgtcgt P; SEQ ID NO: 18) foram obtidos por mutagênese de I-Crel (D75), nas posições 30, 32, 33 e 38, como descrito no exemplo 1. As- sim, combinar tais pares de mutantes permitiria a clivagem do alvo Hpr- CH3.4. Portanto, para verificar se mutantes clivados poderiam clivar o alvo HprCH3.4, aminoácidos nas posições 44, 68, 70, 75 e 77 a partir de proteí- nas que clivam 5CTT_P foram combinados com os aminoácidos nas posi- ções 30, 32, 33 e 38 a partir de proteínas que clivam 10CAT_P. A) Material e Métodos a) Construção do vetor alvo

O procedimento experimental é como descrito no exemplo 4. b^ Construção de mutantes combinatórios

Mutantes I-Crel que clivam 10CAT_P ou 5CTT_P foram anteri- ormente identificados, como descrito nos Pedidos PCT Internacionais WO 2006/097784 e WO 2006/097853; Arnould et al„ J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458, e no exemplo 1. A fim de gerar seqüência de codificação derivada de I-Crel contendo mutações de ambas as séries, reações de PCR de so- breposição separadas foram realizadas e amplificam a extremidade 5' (posi- ções aa 1-43) ou a extremidade 3' (posições 39-167) da seqüência de codifi- cação de l-Crel. Para ambas as extremidades 5' e 3', amplificação de PCR é realizada usando iniciadores (GaMOF 5'-gcaactttagtgctgacacatacagg-3' (SEQ ID NO: 48) ou GaMOR 5'-acaaccttgattggagacttgacc-3' (SEQ ID NO: 49) es- pecíficos para o vetor (pCLS0542, Figura 11) e iniciadores (assF 5'- ctannnttgaccttt-3' (SEQ ID NO: 50) ou assR 5'-aaaggtcaannntag-3'(SEQ ID NO: 51), onde nnn codifica o resíduo 40. Os fragmentos de PCR resultando da reação de amplificação realizada com os mesmos iniciadores e com a mesma seqüência de codificação para o resíduo 40 foram agrupados. Em seguida, cada grupo de fragmentos de PCR resultando da reação com inici- adores GaMOF e assR ou assF e GaMOR foram misturados em uma razão equimolar. Finalmente, aproximadamente 25 ng de cada grupo final dos dois fragmentos de PCR de sobreposição e 75 ng de DNA do vetor (pCLS1107, Figura 18) Iinearizado pela digestão com Dralll e NgoMIVforam usando para transformar a cepa Saccharomyces cerevisiae de levedura FYC2-6A (MATa, trplA63, leu2Al, his3A200) usando um protocolo de transformação LiAc de alta eficiência (Gietz and Woods, Methods Enzymol., 2002, 350, 87-96). Uma seqüência de codificação intacta contendo ambos os grupos de mutações é gerada por recombinação homóloga in vivo em leveduras.

c) Cruzamento de meganuclease expressando clones e seleção em levedu- ras

O procedimento experimental é como descrito no exemplo 4.

d) Sequenciamento de mutantes

O procedimento experimental é como descrito no exemplo 4. B) Resultados

Mutantes I-Crel usados neste exemplo, e cortando o alvo 10CAT P ou o alvo 5CTT P são listados na tabela IV. Mutantes combinados de I-Crel foram construídos por associação na suspensão I-Crel1 aminoáci- dos nas posições 44, 68, 70, 75 e 77 a partir de mutantes clivando o alvo 5CTT_P, com os aminoácidos nas posições 30, 32, 33 e 38 a partir dos mu- tantes clivando o alvo 10CAT_P (tabela IV), resultando em uma biblioteca de complexidade 480. esta biblioteca foi transformada em levedura e 1728 clo- nes (3.6 vezes a diversidade) foram selecionados por clivagem contra o alvo de DNA HprCH3.4 (ccatctcttgt P; SEQ ID NO: 22). 10 clones positivos foram encontrados, e após sequenciamento e validação por seleção secundária 9 mutantes combinatórios foram encontrados (tabela IV). Os mutantes são identificados por um código carta 11, correspondendo aos resíduos de ami- noácido nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40, 44, 68, 70, 75 e 77. Por exem- plo, KNSTYS/KYSEV representam I-Crel K28, N30, S32, T33, Y38, S40, K44, Y68, S70, E75, e V77 (SEQ ID NO: 56).

Entre esses nove mutantes, quatro correspondem a montagem original de 2 moléculas parentais (tabela IV; SEQ ID NO: 52 a 55), ao passo que as cinco outras exibiram combinção de não-parentais nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40 ou 44, 68, 70, 75, 77. Eses cinco mutantes são:

- KNSTYS/KYSEV (SEQ ID NO: 56)

- KNRDQS/KYSDR (SEQ ID NO: 57)

- KNSSDS/KYSDR (SEQ ID NO: 58)

- KNTHQS/KYSNR (SEQ ID NO: 59)

- KNSYQS/RYSNI (SEQ ID NO: 60)

Tais mutantes provavelmente resultam da recombinação entre fragmentos de PCR similares durante o processo de transformação. Exem- plos de positivos são mostrados na Figura 12. Tabela IV: Clivagem do alvo HprCH3.4 por mutantes teoricamente pre- sentes na biblioteca de combinação___

Aminoácidos nas posições 28, 30, 32, 33, 38, e 40 (ex: KNRDQS re- Dresentam «28. N30, R32, D33, Q38, e S40) KNRDQS KNTGQS KNSQYS KNSSDS KSSQQS KCSTQS KNTHQS KTSYQS Aminoácidos nas posições 44, 68, 70, 75 e 77 (ex: GQTNI representam G44, Q68, T70, N75 e 177) GQTNl KASDK KASDV KASNI KESDK KESDR KGSNI KNQNI KNSNI KQSNR KRDNI KRENI KRSDA KRSNV KRTNI KSSNI KSSNV KTQNI KTSDR KTSDV KTSNI KYSDI KYSDT KYSEV KYSNI KYSYN NHNNI NQRNI QASQR QASYR QESNR QNSQR + QRSHY + QRSNI QRSNK QRSQR QRSYR RASER RASNI RASNN +++ RESDR RNSDR RNSNN RQSNN RRSDQ RRSNN RSSER RTSER RTSNN RYGYI RYSDQ RYSDN +++ +++ RYSDR +++ RYSEI RYSER RYSHI RYSNI RYSNN RYSNQ RYSQY

+ indica uma combinação funcional.

Exemplo 6: Preparação de meganucleases clivando HprCH3.2 e HprCH3

Mutantes I-Crel capazes de clivar cada um dos alvos derivados de HprCH3 palindrômicos (HprCH3.3 e HprCH3.4) foram identificados no exemplo 4 e no exemplo 5. Pares de tais mutantes (um cortando HprCH3.3 e um cortando HprCH3.4) foram co-expressos em leveduras. Na co- expressão, deveria ter três espécies moleculares ativas, dois homodímeros e um heterodímero. Foi ensaiado se os heterodímeros que deveriam ser for- mados, cortam o alvos HprCH3 e HprCH3.2. A) Materiais e Métodos

a) Co-expressão de mutante

Os procedimentos experimentais são como descritos no Pedido PCT Internacional WO 2006/097854 e Arnould et al. J. Mol. Biol., 2006, 355, 443-458. Brevemente, DNA de levedura foi extraído a partir de mutantes que clivam o alvo HprCH3.4 usando protocolos padrão e foi usado para trans- formar E. coli. O DNA de plasmídeo resultante foi então usado para trans- formar cepas de levedura que expressam um mutante cortanto o alvo Hpr- CH3.3. Transformantes foram selecionados sobre meio -L Glu + G418.

b) Cruzamento de meqanuclease co-expressando clones e seleção em leve- dura

O procedimento experimental é como descrito no exemplo 4, exceto que uma baixa grelha (cerca de 4 pontos/cm2) foi usada. B) Resultados:

Co-expressão de mutantes clivando as seqüências HprCH3.3 e

HprCH3.4 resultou em uma clivagem eficiente do alvo HprCH3.2 em muitos casos (Figura 13A). Em adição, algumas dessas combinações foram capa- zes de cortar o alvo natural HprCH3 que difere da seqüência HprCH3.2 por 4 bp nas posições -1, -2, 1 e 2. (Figura 13B). Combinações funcionais são re- sumidas na tabela V e na tabela VI.

Tabela V: Clivagem do alvo HprCH3.2 pelos mutantes heterodiméricos

Aminoácidos nas posições 28, 30, 32, 33, 38, 40 /44, 68, 70, 75 e 77 dos mu- tantes I-Crel clivando o alvo HprCH3.3 (ex: KNSCK/QRRDI representam K28, N30, S32, C33, K38, S40/Q44, R68, R70, D75 e I77» io «çf I tf KNSCKS/ QRRDI KNDTQS/ QRRDI KNSTSS/ QRRDI KNsrrs/ QRRDl KNTPQS/ QRRDl KNSCS& QRRDI KNTTQS/ QRRDI KNSHQS/ QRRDI KNSQQS/ QRRDI SS KNTHQS/ RYSDN + + + + + + + + + KNSYQSf RYSNI + + + + + + ■ + + co -S-X - ο DJ P £ > Ε2 Ρ KNSTYS/ KYSEV + + + + + + + + cm" ο ο a> O ? z. t KNTHQS/ KYSNR + + + + + OO 5 OO h^ cd έ 2 S KNRDQS/ KYSDR + + + + + + + + + J £ -2 co- S » 8 cl φ c- w S <d to <o S: c = z KNSSDS/ KYSDR + + + + + + + + KNTHQS/ RASNN + + + + + + + + + 8 El- 75 o >- II + + + + + + + + § Ü w i-s < h KSSQQS/ RYSDN + + + + + + + +

+ indica uma combinação funcional. Mutantes em negrito são mutantes com mutações alternativas no exemplo 5. co ο ο ΐ .φ

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Mutantes I-Crel capazes de clivar o alvo HprCH3.2 e o HprCH3 por montagem de mutantes clivando o alvo HprCH3.3 e HprCH3.4 foram anteriormente identificados no exemplo 4. Entretanto, esses mutantes exi- bem atividade mais forte com o alvo HprCH3.2 comparado ao alvo HprCH3.

Portanto, os mutantes combinatórios que clivam HprCH3 foram mutagenizados, e variantes exibindo clivagem mais forte deste alvo foram selecionadas. De acordo com a estrutura da proteína I-Crel ligada a seu al- vo, não existe nenhum contato entre os 4 pares de base centrais (posições - 2 a 2) e a proteína I-Crel (Chevalier et al, Nat. Struct. Biol., 2001, 8, 312-316; Chevalier and Stoddard1 Nucleic Acids Res., 2001, 29, 3757-3774; Chevalier et al, J. Mol. Biol., 2003, 329, 253-269). Assim, é difícil racionalizar a escolha de um conjunto de posições para mutagenizar, e a mutagênese foi realizada na proteína toda. Mutagênese aleatória resulta em bibliotecas de alta com- plexidade. Portanto, para limitar a complexidade das bibliotecas de variante a serem testadas, apenas um dos dois componentes dos heterodímeros que clivam HprCH3 foi mutagenizado. Assim, em uma primeira etapa, proteínas que clivam HprCH3.4 foram mutagenizadas, e em uma segunda etapa, foi avaliado se elas poderiam clivar HprCH3 quando co-expressas com uma proteína que cliva HprCH3.3. A) Material e Métodos

a) Construção de bibliotecas por mutagênese aleatória

Mutagênese aleatória foi realizada em uma grupo de mutantes escolhidos, por PCR usando Mn2+ ou por um processo de PCR de duas eta- pas usando derivados de dNTP 8-oxo dGTP e dPTP como descrito no proto- colo de Jena Bioscience GmbH para Kit de mutagênese JBS dNTP. Os inici- adores usados foram preATGCreFor (5-gcataaattactatacttctatagacacgcaaac acaaatacacagcggccttgccac c-3': SEQ ID NO: 61) e ICreIpostRev (S'-ggctc gaggagctc gtctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgc-S': SEQ ID NO: 62). Aproxi- madamente 25 ng do produto PCR e 75 ng do DNA de vetor (pCLS 1107, Figura 18) Iinearizado pela digestão com Dralll e NgoMIV foram usados para trnasformar a cepa Saccharomyces cerevisiae de levedura FYC2-6A (MATa, trp1A63, leu2A1, his3A200) usando um protocolo de trnasformação LiAc de alta eficiência (Gietz and Woods1 Methods Enzymol., 2002, 350, 87-96). Plasmídeos de expressão contendo uma seqüência de codificação intacta para o mutante I-Crel foram gerados por recombinação homóloga in vivo em levedura.

b) Mutante-cepas de levedura alvo, seleção e sequenciamento

A cepa de levedura FYBL2-7B (ΜΑΤ α, ura3A851, trp1A63, leu2A1, lys2A202) contendo o alvo HprCH3 no vetor de relatório de levedura (pCLS1055, Figura 16) foi transformada com mutantes, no vetor de Ieucina (pCLS0542), cortando o alvo HprCH3.3, usando um protocolo de trnasfor- mação LiAc de alta eficiência. Leveduras alvo de mutante foram usadas co- mo cepas alvo para ensaios de cruzamento como descrito no exemplo 4. Positivos resultando em clones foram verificados por sequenciamento (MIL- LEGEN) como descrito no exemplo 4. B) Resultados:

Quatro mutantes clivando HprCH3.4 (l-Crel 32T, 33H, 44K, 68Y, 70S, 75N, 77R, I-Crel 30S, 33Q, 44R, 68Y, 70S, 77N, I-Crel 32T, 33H, 70S, 75H, 77Y e I-Crel 32T, 33H, 68N, 70S, 75Q, 77R, também chamados KN- THQS/KYSNR, KSSQQS/RYSDN, KNTHQS/QRSHY e KNTHQS/QNSQR de acordo com a nomenclatura da tabela IV; SEQ ID NO: 59, 53, 63 e 64) foram agrupados, aleatoriamente mutagenizados e transformados em levedura. 1140 clones transformados foram em seguida cruzados com uma cepa de levedura que contém (i) o alvo HprCH3 em um plasmídeo de relatório (ii) um plasmídeo de expressão contendo um mutante que cliva um alvo HprCH3.3 (l-Crel 33H ou KNSHQS/QRRDI; SEQ ID NO: 32). Após cruzamento com esta cepa de levedura, 23 clones foram encontrados para clivar o alvo Hpr- CH3 mais eficientemente do que o mutante original. Assim, 23 proteínas que continham positivos capazes de formar heterodímeros com KNSHQS/QRRDI com forte atividade de clivagem para o alvo HprCH3. Um exemplo de positi- vo é mostrado na figura 14. Sequenciamento desses 23 clones positivos in- dica que 10 mutantes distintos listados na tabela VTI foram identificados. Tabela VII: Combinações de mutante funcionais exibindo forte atividade

de clivagem para HprCH3.

Mutantes Optimizados HprCH3.4 (SEQ ID NO: 65 a 74) Mutante HprCH3.3 28K30N32S33H38Q40S44Q68R70R75D77I (KNSHQS/QRRDI) I-Crel 28R,30N,32S,33S,38Y,40Q,44R,68A,70S,75N,77N l-Crel28R,30N,32S,33S,38Y,40Q,44R,68A,70S,75H,77Y I-Crel 28R,30N,32T,33S,38Y,40Q,44R,68Y,70S,75N,77N,140M I-Crel 28K,30N,32T,33H138H,40S,44Q,68Y,70S,75D,77R I-Crel 28K, 30N, 32T, 33H, 38Q,40S,44K, 68 Yt 70S, 75D, 77R I-Crel 28K, 30N, 32T, 33H, 38Q, 40S, 44 Q, 68N, 70S, 75H, 77R I-Crel 28K,30N,32T,33H,38Q,40S,44Q, 68R.70S, 75H.77R I-Crel 28KI30W,327,33H,38Q,40SI44Q168H,70S,75H,77H I-Crel 28K,30A/,327",33H,38Q,4OS,44Q,68H,7OS,75H,77H,92R I-Crel 28K,30N,32T,33H)38Q,4OS,44K,68Y,7OS,75D,77R,92R,96RJ1O7R,132V,14OA)143A

Exemplo 8: Aperfeiçoamento de meganucleases clivando HprCH3 por mutagênese aleatória de proteínas que clivam HprCH3.3 e montagem com proteínas que clivam HprCH3.4

Como um complemento ao exemplo 6, foi também decidido rea- lizar mutagênese aleatória com os mutantes que clivam HprCH3.3. Apenas um mutante HprCh3.3 foi capaz de clivar HprCH3 de modo que este mutante e três outros mutantes que clivaram fortemente HprCH3.3 mas não HprCH3 foram usados para mutagênese aleatória.

As proteínas mutagenizadas que clivam HprCH3.3 foram em seguida testadas para determinar se elas poderiam clivar de modo eficiente HprCH3 quando co-expressas com uma proteína que cliva HprCH3.4. A) Material e Métodos

a) Construção de bibliotecas por mutagênese aleatória

Mutagênese aleatória foi realizada em um grupo de mutantes escolhidos, por PCR usando Mn2+ ou por um processo de PCR de duas eta- pas usando derivados de dNTP 8-oxo-dGTP e dPTP como descrito no pro- tocolo de Jena Bioscience GmbH para o Kit de Mutagênese JBS dNTP. Os iniciadores usados foram preATGCreFor (5- cataaattactatacttctatagacacgc aaacacaaatacacagcggccttgccac c-3': SEQ ID NO: 61) e ICreIpostRev (S'- ggctcgaggagctcgt ctagaggatcgctcgagttatcagtcggccgo-S': SEQ ID NO: 62). Aproximadamente 25 ng do produto PCR e 75 ng do DNA de vetor (p- CLS0542, Figura 17) Iinearizados por digestão com Ncol e Eagl foram usa- dos para transformar a cepa Saccharomyces cerevisiae de levedura FYC2- 6A {ΜΑΤ α, trp1A63, leu2A1, his3A200) usando um protocolo de trnasforma- ção LiAc de alta eficiência (Gietz and Woods1 Methods Enzymol., 2002, 350, 87-96). Plasmídeos de expressão contendo uma seqüência de codificação intacta para o mutante 1 -CreI mutant foram gerados por recombinação ho- mólogo in vivo em levedura.

b) Mutante-cepas de levedura alvo, seleção e sequenciamento

A cepa de levedura FYBL2-7B (ΜΑΤ α, ura3A851, trp1A63, leu2A1, lys2A202) contendo o alvo HprCH3 no vetor de relatório de levedura (pCLS1055, Figura 16) foi transformada com mutantes, no vetor resistente a canamicina (pCLS1107), cortando o alvo HprCH3.4, usando um protocolo de transformação LiAc de alta eficiência. Leveduras alvo de mutantes foram usadas como cepas alvo para ensaios de cruzamento como descrito no e- xemplo 6. Clones de resultado positivo foram verificados por sequenciamen- to (MILLEGEN) como descrito no exemplo 4. B) Resultados

Quatro mutantes clivando HprCH3.3 (l-Crel 32D.33T, I-Crel 32T.33T, I-Crel 33H e I-Crel 33Q, também chamados KNDTQS/QRRDI, KNTTQS/QRRDI, KNSHQS/QRRDI e KNSQQS/QRRDI de acordo com a nomenclatura da tabela IV; SEQ ID NO: 24, 45, 32 e 35) foram agrupados, aleatoriamente mutagenizados e transformados em levedura. 1140 clones transformados foram em seguida cruzados com uma cepa de levedura que contém (i) o alvo HprCH3 em um pkasmídeo de relatório (ii) um plasmídeo de expressão contendo um mutante que o alvo HprCH3.4 (l-Crd 33T, 38Y, 44K, 68Y, 70S, 75E, 77V ou KNSTYS/KYSEV; SEQ ID NO: 56). Após cru- zamento com esta cepa de levedura, 18 clones foram encontrados para cli- var de modo eficiente o alvo HprCH3. Assim, 18 proteína que continham po- sitivos capazes de formar heterodímeros com KNSTYS/KYSEV com ativida- de de clivagem para o alvo HprCH3. Um exemplo de positivos é mostrado na figura 15. Exemplos de tais mutantes heterodiméricos são listados na tabela VIII.

Tabela VIII: Combinações de mutantes funcionais que apresentam ati- vidade de clivagem para HprCH3 HprCH3 _

Mutantes Optimizados HprCH3.3 (SEQ ID NO: 75 a 82) Mutante HprCH3 I-Crel 28K30N32S33T38Y40S44M68Y70S75E77V (KNSTYS/KYSEV) I-Crel 33H 66C 137V155R 162P I-Crel 9L 33H 1001108V154G 155P161P I-Crel 2Y33H109V125A I-Crel 33H113S136S I-Crel 2133H 81V 861110G 131R 135Q151A157V I-Crel 33H 71R 1031129A 130G I-Crel 33H 69V82R 90R120V139R 158M I-Crel 33H 54L 86D 100R 104M105A 136S 159R

Exemplo 9: Refinamento de meganucleases clivando o sítio alvo Hpr- CH3 por mutagênese direcionada a sítio resultando em substituição de GLicina-19 com serina (G19S)

Para validar a capacidade da substituição G19Spara aumentar a atividade de clivagem de meganucleases derivadas de l-Crel, esta mutação foi incorporada em cada uma das duas proteínas do heterodímero HprCH3.3 (KNSHQS/QRRDI/42A43L, SEQ ID NO: 147)/HprCH3.4 (KNTHQS/RYSNN/ 72T, SEQ ID NO: 148). Este heterodímero que cliva o alvo HprCH3 foi obtido por mutagênese aleatória, como descrito nos exemplos 7 e 8.

Para avaliar a atividade de clivagem dos mutantes derivados de G19S e originais um sistema de relatório de cromossoma em células CHO foi usado (Figura 20). Neste sistema um gene LacZ de cópia única acionado pelo promotor CMV é interrompido pelo sítio HprCH3 e é desse modo não- funcional. A transformação da linhagem de célula com os plasmídeos de ex- pressão CHO para HprCH3.3/HprCH3.4 e um plasmídio de reparo LacZ permite a restauração de um gene LacZ funcional por recombinação homó- logo. Foi anteriormente mostrado que quebras de duplo filamento podem induzir recombinação homólogo; a freqüência com a qual o gene LacZ é re- parado è indicativa da eficiência de clivagem do sítio alvo HprCH3 genômico. I) Material e Métodos a) Mutaqênese direcionada ao sítio

Para introduzir a substituição G19S nas seqüências de codifica- ção HprCH3.3 e HprCH3.4, das reações de PCR de sobreposição separadas foram realizadas para amplificar a extremidade 5' (resíduos 1-24) ou a ex- tremidade 3' (resíduos 14-167) da seqüência de codificação l-Crel. Para am- bas as extremidades 5' e 3', amplificação de PCR é realizada usando um iniciador com homologia para o vetor:

CCM2Direto 5'-aagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggctt atcgaccatggccaalacca aatataacaaagagttcc-3 (SEQ ID NO: 149) ou CCMRe- verso õ-tctgatcgattcaagtcagtgtctctctagatagcgagtcggccgccggggaggatttcttcttct cgc-3': SEQ ID NO: 150) e um iniciador específico para a seqüência de codi- ficação I-Crel para aminoácidos 14-24 que contém a mutação de substitui- ção G19S: G19SF 5'-gccggctttgtggactctgacggtagcatcatc-3' (SEQ ID NO:151) ou G19SR 5'-gatgatgctaccgtcagagtccacaaagccggc-3' (SEQ ID NO: 152).

Os produtos de PCR resultantes contêm 33 bp de homologia um com o outro. Subseqüentemente, os fragmentos são montados por PCR u- sando uma alíquota de cada um dos dois fragmentos e dos iniciadores CCM2Direto e CCMReverso.

b) Clonagem de mutantes em um vetor de expressão CHO

Produtos de PCR digeridos com Sacl-Xbal foram clonados nos sítios Sacl-Xbal correspondentes do plasmídeo pCLS1088 (Figura 21), um vetor de expressão de gateway CHO pCDNA6.2 (INVITROGEN) contendo a seqüência de codificação I-Crel N75. A substituição da seqüência de codifi- cação HprCH3.3-G19S ou HprCH3.4-G19S para a seqüência de codificação I-Crel N75 foi verificada por sequenciamento (MILLEGEN).

c) Ensaio de cromossoma em células de mamíferos

Linhagens de células CHO suportando o sistema de relatório foram semeadas a uma densidade de 2x105 céluas por 10cm disco em meio completo (meio de Kaighn modificado F-12 (F12-K), suplementado com 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 μg/ml), anfoterici- na B (Fongizona) (0,25 ng/ml) (INVITROGEN-LIFE SCIENCE) e 10% de FBS (SIGMA- ALDRICH CHIMIE). O dia posterior, células foram transfecta- das com reagente de transfecção Poly feet (QIAGEN). Brevemente, 2 μg de vetor de matriz de reparo Iacz foi transfectado com várias quantidades de vetores de expressão de meganucleases. Após 72 horas de incubação a 37°C, as células foram fixadas em 0,5% de glutaraldehído a 4°C por 10 min, lavadas duas vezes em 100 mM de tampão de fosfato com 0,02% NP40 e tinjidas com o seguinte tampão de tinjimento (10 mM de tampão de fosfato, 1 mM de MgCI2, 33 mM de K haexacianoferrato (III), 33 mM de K hexaciano- ferrato (II), 0,1% (v/v) X-Gal). Depois, uma incubação durante a noite a 37°C, placas foram examinadas sob um microscópio leve e o número de clones de célula positiva LacZ contado. A freqüência do reparo LacZ é expressa no número de LacZ+ foci dividido pelo número de células transfectadas (5x105) e corrigido pela eficiência de transfecção. 2) Resultados

As atividades de heterodímeros contendo ou os dois mutantes iniciais (HprCH3.3 / HprCH3.4) ou um dos dois mutantes derivados de G19S combinados com o mutante inicial coreespondente (HprCH3.3 / HprCh3.4 G19S ou HprCH3.3 G19S / HprCh3.4) foram testadas usando um ensaio de cromossoma em linhagens de célula CHO contendo o alvo HprCH3. Este ensaio de cromossoma foi extensivamente descrito em uma publicação re- cente (Amould et al, J. Mol. Biol. Epub May 10, 2007). Brevemente, uma li- nhagem celular de CHO portando um transgene de única cópia foi primeiro criada. O transgene contém um promotor EF1a a montante um sítio de cli- vagem I-Scel (Figura 20, etapa 1). Segundo, a meganuclease I-Scel foi usa- da para acionar recombinação homólogo induzida por DSB neste lócus, in- serir um cassete de 5,5 kb com um novo sítio que cliva meganuclease (Figu- ra 20, etapa 2). Este cassete contém um quadro de leitura aberto LacZ acio- nado por um promotor CMV, e um promotor menos o gene marcador de hi- gromicina. O gene LacZ por si só é inativado por uma inserção de 50 bp con- tendo o sítio que cliva meganuclease a ser testada (aqui, o sítio de clivagem HprCH3). Estas linhagens celulares podem por sua vez ser usadas para avaliar gene induzido por DSB objetivando eficiências (reparo LacZ) com derivados I-Crel clivando o alvo HprCH3 (Figura 20, etapa 3).

Esta linhagem celular foi transfectada com a matriz de reparo e várias quantidades dos vetores expressando as meganucleases. A freqüên- cia de reparo do gene LacZ aumentou de um máximo de 2,0 x10"3 com hete- rodímeros construídos iniciais (HprCH3.3 / HprCH3.4), para um máximo de 1,15 χ 10"2 com o mutante derivado de G19S HprCH3.3 e um máximo de 1.2 χ 10~2 com o mutante derivado de G19S HprCH3.4 (Figura 22).

Estas descobertas demonstram que mutação G19S é capaz, por si só, de melhorar a atividade de um heterodímero, quando encontrada em apenas um de seus monômeros. Uma única substituição G19S foi mostrada para melhorar a atividade de heterodímeros competamente diferentes, cli- vando outros alvos. Assim, a mutação G19S se comporta como um motivo "portátil", capaz de melhorar a atividade de diferentes derivados de I-Crel por si só, ou em combinações com outras mutações.

Entretanto, quando o heterodímero HprCH3.3 G19S / HprCH3.4 G19S foi transformado com a matriz de reparo, nenhum LacZ+ foci foi detecta- do, indicando uma freqüência de recombinação de menos do que 6,0 χ 10"6. Essas descobertas indicam que uma única substituição G19S melhora a ati- vidade, uma substituição G19S em cada um dos monômeros do heterodíme- ro resulta em uma diminuição muito forte da atividade. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> CELLECTIS

SMITH, Julianne GRIZOT, Sylvestre GOUBLE, Agnès

<12 0> VARIANTES MEGANUCLEASE QUE CLIVAM UMA OU SEQÜÊNCIA ALVO DE DNA A PAR- TIR DO GENE HPRT E USOS DAS MESMAS

<130> BLOcpHLP154 6-13PCT

<160> 152

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Alvo de HprCH <400> 1

ccagccgacc gattccgtca tg

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 2

tattcctaat cactatgtcg ag

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Alvo de HprCH <400> 3

tattcctcat ggagtgatta tg

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH3

<4 00> 4

cgagatgtca tgaaagagat gg

<210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH <400> 5

ccctctgtgt gctgaagggg gg

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 6

tttgctgacc tgctggatta ca

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 7

tgacctgctg gattacatta aa

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<4 00> 8

catgactgta gattttatca ga

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 9

tgacactggt aaaacaatgc aa

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<4 00> 10

ctttccctgg tcaagcggta ca <210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 11

tttccctggt caagcggtac aa

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 12

ttggatttga aattccagac aa

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 13

tgtcattagt gaaactggga aa

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Alvo de HprCH

<400> 14

taagatgaga gttcaagttg aa

<210> 15 <211> 1301 <212> DNA

<213> Criteculus sp. <400> 15

ttacctcacc gctttctcgt gcctcggcgc cttcgctccc gccagccgac cgattccgtc agtgatgatg aaccaggcta tgacctagat gatttggaaa aggtgtttat tcctcatgga cgagatgtca tgaaagagat gggaggccat ggctataaat tctttgctga cctgctggat

ctcctctgcg ggcttcctcc tcacaccgct atggcgaccc gcagccccag cgtcgtgatt ttattttgta ttcctaatca ctatgtcgag gtgattatgg acaggactga aagacttgcc cacattgtgg ccctctgtgt gctgaagggg tacattaaag cactgaatag aaatagtgat agatccattc ccatgactgt agattttatc agactgaaga gctactgtaa tgatcagtca 420 acaggggaca taaaagttat tggtggggat gatctctcaa ctttaactgg aaagaatgtc 480 ttgattgttg aggacataat tgacactggt aaaacaatgc aaactctgct ttccctggtc 540 aagcggtaca acctcaaaat ggttaaggtt gcaagcttgc tggtgaaaag gacctctcga 600 agtgttggat ataggccaga ctttgttgga tttgaaattc cagacaagtt tgttgttgga 660 tatgcccttg actataatga gtacttcagg gatttgaatc atatttgtgt cattagtgaa 720 actgggaaag ccaaatacaa agcctaagat gagagttcaa gttgaatctg caaacacgag 780 gagtcccatt catgttccca gtaaaattac caagcattct agttctgcag ccatctgctt 840 agtacagctt tttgcatgaa ccttctaaga attttatggt tttttatttt tagaaatgtc 900 agttgctgca ttcttaaact ttttatttgc actatgagcc ttcgatagat tgtcgcttac 960 cttgtgagca aagtaaatct cttaaattac cactattaaa aatgctgaga ttgtatctgt 1020 aagaaacatt taaagaggag atatattagt tttttaattg gtattttaat ttttatatat 1080 tcgggaaaga aagctgtgat tgaatattgt taattatacc accatgtgtt tagaacagtg 1140 tgaagcactc agtttcatgt cagtaaccat ctaagaagtt ttgctcagtg gaataaacat 1200 atgttttatc agtgttgcct atattttccc acttggattc tttcagtgag tcattgtcaa 1260 cagttccttt aaatgcaaat aaattctaaa aatttaccac t 1301

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> alvo de C1221 I-CreI

<4 00> 16

tcaaaacgtc gtacgacgtt ttga 24

17 24 DNA

Seqüência artificial <220>

<223> alvo de 10GAG_P <4 00> 17

tcgagacgtc gtacgacgtc tcga 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> alvo de 10CAT P

<210> <211> <212> <213>

<400> 18

tccatacgtc gtacgacgta tgga

24 <210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> alvo de 5CTT_P

<400> 19

tcaaaacctt gtacaaggtt ttga

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> alvo de HprCH3.2

<4 00> 20

cgagatgtcg tacaagagat gg

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> alvo de HprCH3.3

<400> 21

cgagatgtcg tacgacatct cg

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> alvo de HprCH3.4

<400> 22

ccatctcttg tacaagagat gg

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Oligonucleotideo alvo de HprCH3.3

<4 00> 23

tggcatacaa gtttcgagat gtcgtacgac atctcgacaa tcgtctgtca

<210> 24

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência

artificial

<220>

<223> variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 24

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Asp 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 ,55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 25

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3

<400> 25

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Glu 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 26 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 26

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Pro 25 30

Ala Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 27 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 27

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Arg 25 30

Asp Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

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Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 28

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 28

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Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 29

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 29

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Ser Ser Pro

<210> 30 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 30

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Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

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Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 31

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3

<400> 31

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Gly Lys Phe Lys His Ala Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro <210> 32

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3

<400> 32

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 33 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 33

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Pro Lys Phe Lys His His Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 i4o

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 34

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3

<400> 34

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Pro Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 35

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência

artificial

<220> <223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <4 00> 35

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Gln Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 36

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3

<400> 36

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Gln Lys Phe Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 37 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 37

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Arg Lys Phe Lys His Gln Leu Tyr Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Als Asn Leu. Val Leu Lys Ιΐθ Ι1θ Glu Gln Lgu 100 105 110

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Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 38 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 38

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Xle Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Ser Lys Phe Lys His Asp Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

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Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

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Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 39

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3

<400> 39

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

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Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 40 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <4 00> 40

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Thr Lys Phe Lys His Asn Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 41 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <4 00> 41

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Thr Lys Phe Lys His Ser Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 . 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 42

<211> 163

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 42

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Thr Lys Phe Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

/ <210> 43

<211> 163

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 43

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 25 30

Val Lys Phe Lys His His Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 44 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.3 <400> 44

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 25 30

Pro Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80 He Lys Pro Leu His Asn Phe Leu 85

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu 100

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp 115 120

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn 130 135

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Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 105 HO

Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 125

Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 45 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 45 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 46

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220> <223> Variante de I-CreI de clivagera de HprCH3.3 <400> 46

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 15 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Thr Gln Ser 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Asn Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 47 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 47 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Thr Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Arg Lys Phe Lys His Gln Leu Arg Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

155 160

145 150 Ser Ser Pro <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de GallOF <4 00> 48 gcaactttag tgctgacaca tacagg <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de GallOR <4 00> 49 acaaccttga ttggagactt gacc <210> 50 <211> 15 <212> DNA 26

24

<213> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador de assF <220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(6)

<223> n e a, c, g, ou t

<400> 50

ctannnttga ccttt 15

<210> 51

<211> 15

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> iniciador de assR <220>

<221> misc_feature

<222> (10).. (12)

<223> n e a, c, g, ou t <4 00> 51

aaaggtcaan nntag 15

<210> 52 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 52

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Ala Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 53 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <4 00> 53

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1.5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Ser Gln Ser 20 25 30

Gln Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 54 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 54

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Pro

<210> 55 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 55 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 56 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 56

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln He Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 Thr Lys Phe Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Glu Tyr Val Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 ' 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 57 <211> 163 w <212> PRT <213> Seqüência artificial * <220> <223> Variante de I-CreI de <4 00> 57 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Arg 20 25 30

Asp Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 58 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 58 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Ser Lys Phe Lys His Asp Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 - 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 59 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3.4 <400> 59

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile He Ala Gln He Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 60

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <4 00> 60

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 61 <211> 59 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de preATGCreFor <4 00> 61 gcataaatta ctatacttct atagacacgc <210> 62 <211> 48 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Iniciador de ICreIpostRev <400> 62 ggctcgagga gctcgtctag aggatcgctc gagttatcag tcggccgc

<210> 63 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 63 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser He Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr Tyr Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

59

48

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Pro

<210> 64 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 64 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser Gln Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 65 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <4 00> 65

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Arg Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Ser Lys Phe Lys His Tyr Leu Gln Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val 50 55

Asp Glu Ile Gly Val 60

Gly Tyr Val Ala Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn 65 70 75

Tyr Asn Leu Ser Glu 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu 85 90

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Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys 100 105

Ile Ile Glu Gln Leu 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu 115 120

Glu Val Cys Thr Trp 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys 130 135

Thr Arg Lys Thr Thr 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu 145 150 155

Ser Glu Lys Lys Lys 160

Ser Ser Pro

<210> 66 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <4 00> 66 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile He Ala Gln Ile Arg Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Ser Lys Phe Lys His Tyr Leu Gln Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Ala Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr Tyr Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro <210> 67 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 67 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Arg Pro Asn Gln Thr 20 25 30

Ser Lys Phe Lys His Tyr Leu Gln Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 . 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Met Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 68 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 68

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His His Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 69 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <4 00> 69 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 70 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 70

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 15 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 71 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial A A Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 O CO CM CM CM CM V V <400> 71 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30 His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60 Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile He Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln He Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 72 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <4 00> 72 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val His Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr His Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 73

<211> 163

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 73

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val His Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr His Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Arg Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 74

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3

<400> 74

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Arg Pro Phe Leu Arg 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Arg Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125 Val Asp Gln Val Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Ala Arg Lys Ala Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Pro <210> 75

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3

<400> 75

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Cys Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Val Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Arg Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Pro Pro

<210> 76 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 76 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Leu Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

1 5 10 15 Va'1 Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu He Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Ile Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Val Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Gly Pro Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Pro Ser Pro

<210> 77 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 77 Met Tyr Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Val Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Ala Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr

130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 78 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 78 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile IIe Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Ser Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Ser Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 79 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <4 00> 79

Met Ile Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu He Gly Val 50 ‘ 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Val Lys Pro Leu His Ile Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Gly Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Arg Ile Ala Ala Gln Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Asp Ser Leu Ser Val Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 80

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3

<4 00> 80

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser He Ile Ala Gln He Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu He Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Arg Ser Val Ser Asp Tyr He Leu Ser Glu 65 70 75 80

He Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala He Leu Val Leu Lys He He Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu GIu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Ala Gly Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr

130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 81 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 81 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Val Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Arg Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Arg Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Val Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln He Ala Ala Leu Asn Asp Ser Arg Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Met Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 82 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 82

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Leu Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr He Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asp Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Arg Gln Ala Asn Met Ala Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Ser Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Arg Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 83 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> Variante I-CreI de clivagem de alvo i de Hpr <223> <400> 83 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Gln Gln Asp 20 25 30 Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60 Gly Tyr Val Lys Asp Ser Gly Ser Val Ser Arg Tyr Thr Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125 Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 84 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <400> 84

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asp Gln Ser 20 25 30

Arg Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Gln Asp Ser Gly Ser Val Ser Ser Tyr Val Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 85 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <400> 85

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Thr Gln Ser 20 25 30 Gly Lys Phe Lys His Gln Leu Ser 35 40

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp 50 55

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser 65 ’ 70

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu 85

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu 100

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp 115 120

Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 45

Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 60

Val Ser Arg Tyr Tyr Leu Ser Glu 75 80

Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 90 95

Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 105 110

Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 86

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr

<400> 86

Met Asn Thr Lys Tyr 1 5

Val Asp Gly Asp Gly 20

Tyr Lys Phe Lys His 35

Thr Gln Arg Arg Trp 50

Gly Tyr Val Arg Asp 65

Ile Lys Pro Leu His 85

Leu Lys Gln Lys Gln 100

Pro Ser Ala Lys Glu

Val Asp Gln Ile Ala 130

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Ser Ile Ile Ala Gln Ile 25

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Phe Leu Asp Lys Leu Val 55

Ser Gly Ser Val Ser Tyr 70 75

Asn Phe Leu Thr Gln Leu 90

Ala Asn Leu Val Leu Lys 105

Ser Pro Asp Lys Phe Leu 120

Ala Leu Asn Asp Ser Lys

135

Tyr Leu Ala Gly Phe 15

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Asn Val Thr Gln Lys 45

Asp Glu Ile Gly Val 60

Tyr Ile Leu Ser Glu 80

Gln Pro Phe Leu Lys 95

Ile Ile Glu Gln Leu 110

Glu Val Cys Thr Trp 125

Thr Arg Lys Thr Thr 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 87 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante I-' <400> 87 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ala Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Lys Asp Ser Gly Ser Val Ser Arg Tyr Thr Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 ' 160

Ser Ser Pro

<210> 88 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <4 00> 88

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Ser Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Asp Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 89 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante I -CreI de clivagem <400> 89 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Gly Lys Phe Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Lys Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr Phe Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90. 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro <210> 90

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr

<400> 90

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Lys Gln Ser 20 25 30

Arg Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Asp Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Ser Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp

115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ála Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr

130 ,135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 91 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <400> 91 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu 1 5 10 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro 15

25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Thr Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Glu Tyr Tyr Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu 85

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu 100

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp 115 120

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn 130 135

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu 145 150

Ser Ser Pro

Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 90 95

Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 105 110

Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 125

Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 140

Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 155 160

<210> 92 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante I-CreI de clivagem <4 00> 92 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Tyr Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Val Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 HO

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 93 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreX de clivagem de alvo de Hpr <400> 93

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Tyr Gln Thr 20 25 30

Cys Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Lys Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145■ 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 94 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> Variante I-CreI de clivagem de alvo < de Hpr <223> <400> 94 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 His Lys Phe Lys His Gly Leu Ser Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val ’ 50 55 60 Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu 85

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu 100

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp 115 120

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn 130 135

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu 145 150

Ser Ser Pro

Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 90 95

Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 105 110

Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp

125

Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 140

Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 155 160

<210> 95 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 95 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Ala Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu He Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Gln Tyr Glu Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 96

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <400> 96

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Arg Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Glu Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val His Asp His Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 97 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> Variante de I-CreI <223> <4 00> 97 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 Gly Lys Phe Lys His Cys Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60 Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 98 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 98 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gly Leu Ser Leu Thr Phe Thr Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Tyr Tyr Thr Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 99

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI <400> 99

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Arg Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Glu Asp Ser Gly Ser Val Ser Arg Tyr Lys Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

LeuLys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 100 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> Variante de I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <223> <4 00> 100 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 His Lys Phe Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60 Gly Tyr Val Arg Asp Asn Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Pne Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 101 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <400> 101

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Gly Lys Phe Lys His Gln Leu Gln Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Ala Asp Lys Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 102

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <4 00> 102 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 15 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Cys Gln Ser 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Arg Tyr Gln Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe 'Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 103 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> Variante de I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <223> <400> 103 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 ■ 30 Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Gln Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60 Gly Tyr Val Lys Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr Phe Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125 Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Pro <210> 104 <211> 163 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <400> 104 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Arg Lys Phe Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Thr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 105

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de alvo de Hpr

<4 00> 105

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Gly 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Asn Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Arg Tyr Tyr Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 106

<211> 163

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de alvo de Hpr

<4 00> 106

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser He Ile Ala Gln He Lys Pro Asn Gln Trp 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu He Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asn Tyr He Leu Ser Glu 65 70 75 80

He Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys He Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr

130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 107 <211> 163 <212> PRT M <213> Seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI de <4 00> 107 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Ala Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Leu Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 108 <211> 163 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Variante I-CreI de clivagem de alvo de Hpr <400> 108

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 15 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 Cys Lys Phe Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr He Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser LeU Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 109 <211> 49 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> oligonucleotídeo alvo <220> <221> misc feature <222> (15) . . (17) <223> 2 OU t (D O íQ <220> <221> misc feature <222> (32) .. (34) <223> n e a, c, g. OU t <400> 109 ggcatacaag tttcnnnacg tcgtacgacg tnnngacaat cgtctgtca 4 9

<210> 110

<211> 49

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> oligonucleotídeo alvo 5ΝΝΝ

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(22)

<223> η e a, c, g, ou t

<22 0>

<221> misc_feature

<222> (27)..(29) <223> η e a, c, g, ou t <4 00> 110

ggcatacaag tttcaaaacn nngtacnnng ttttgacaat cgtctgtca 4 9

<210> 111 <211> 501 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cDNA N75 de I-CreI <4 00> 111

atggccaata ccaaatataa caaagagttc ctgctgtacc tggccggctt tgtggacggt 60

gacggtagca tcatcgctca gattaaacca aaccagtctt ataagtttaa acatcagcta 120 agcttgacct ttcaggtgac tcaaaagacc cagcgccgtt ggtttctgga caaactagtg 180 gatgaaattg gcgttggtta cgtacgtgat cgcggatccg tttccaacta catcttaagc 240 gaaatcaagc cgctgcacaa cttcctgact caactgcagc cgtttctgaa actgaaacag 300 aaacaggcaa acctggttct gaaaattatc gaacagctgc cgtctgcaaa agaatccccg 360 gacaaattcc tggaagtttg tacctgggtg gatcagattg cagctctgaa cgattctaag 4 20 acgcgtaaaa ccacttctga aaccgttcgt gctgtgctgg acagcctgag cgagaagaag 480 aaatcctccc cggcggccga c 501

<210> 112 <211> 68 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Ulib4Rev <400> 112

ctgaaaggtc aagcttagmb batgtttaaa cttmbbagac tgmbbtggtt taatctgagc 60

gatgatgc 68

<210> 113

<211> 68

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> Iniciador de Ulib5Rev

<400> 113

ctgaaaggtc aagcttagmb batgtttaaa cttataagac tgmbbtggmb baatctgagc 60

gatgatgc

<210> 114

<211> 18

<212> DNA

<213> seqüência artificial

68 <220> <223> Iniciador de Ulib456For

<400> 114 ctaagcttga cctttcag

<210> 115

<211> 24

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> alvo de 5GGG P

<400> 115 tcaaaacggg gtaccccgtt ttga <210> 116 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 5GGA_P <400> 116 tcaaaacgga gtactccgtt ttga <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 5GGT P <400> 117 tcaaaacggt gtacaccgtt ttga <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 5GGC_P DNA <400> 118 tcaaaacggc gtacgccgtt ttga <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 5GAG P DNA <400> 119 tcaaaacgag gtacctcgtt ttga <210> 120 <211> 24

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> alvo de 5GAA P DNA

<400> 120 tcaaaacgaa gtacttcgtt ttga <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 5GAT P DNA <400> 121 tcaaaacgat gtacatcgtt ttga <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 10GGG P <400> 122 tcgggacgtc gtacgacgtc ccga <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 10GGA_P DNA <400> 123 tcggaacgtc gtacgacgtt ccga

<210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 10GGT_P DNA <4 00> 124 tcggtacgtc gtacgacgta ccga

<210> 125

<211> 24

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> alvo de 10GGC P DNA <400> 125

tcggcacgtc gtacgacgtg ccga 24

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

126

24

DNA

seqüência artificial

alvo de IOGGA P DNA

<400> 126

tcgagacgtc gtacgacgtc tcga

24

<210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de IOGAA P DNA <400> 127 tcgaaacgtc gtacgacgtt tcga <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> alvo de 10GAT_P DNA <4 00> 128 tcgatacgtc gtacgacgta tcga <210> 129 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 129 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Ser Gln Ser 20 25 30

Gln Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 130 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 130 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 131 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI <400> 131

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 15 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Thr Lys Phe Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 132 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> Variante de I-CreI <223> <4 00> 132 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Arg 20 25 30 Asp Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60 Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80 Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

155 160

145 150 Ser Ser Pro <210> 133 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <4 00> 133 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys 1 5 10 , 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Ser Lys Phe Lys His Asp Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 134 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <4 00> 134 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Ala Asp Ser Gly Ser Val Ser Ser Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 135

<211> 163

<212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI

<4 00> 135

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125 Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr

130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys

145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 136 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 136 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 15 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 137 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 137 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe

10 15 Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile 20

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser 35 40

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp 50 55

Gly Tyr Val Asn Asp Ser Gly Ser 65 70

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu 85

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu 100

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp 115 120

Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser

30

Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 45

Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 60

Val Ser Gln Tyr Arg Leu Ser Glu 75 80

Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 90 95

Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 105 110

Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 138 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <4 00> 138 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe I 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys . 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Ser Gly Ser Val Ser His Tyr Tyr Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr

130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 1 160

Ser Ser Pro

<210> 139 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 139 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser He Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Glu Tyr Val Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 140

<211> 163

<212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI

<400> 140

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile He Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30 Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 141 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 141 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys.Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Lys Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Arg Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 142 <211> 163 <212> PRT <213> seqüência artificial <220> <223> Variante de I-CreI <400> 142 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Ser Val Ser Asn Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 143 <211> 163 <212> PRT

<213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 143

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe ίο 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Ala Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45 Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Trp Arg Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 144

<211> 163

<212> PRT

<213> Chlamydomonas reinhardtii

<4 00> 144

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro I 149

<210> 145

<211> 1289

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 145

ttacctcact gctttccgga gcggtagcac ctcctccgcc ggcttcctcc tcagaccgct 60 ttttgccgcg agccgaccgg tcccgtcatg ccgacccgca gtcccagcgt cgtgattagc 120 gatgatgaac caggttatga cctagatttg ttttgtatac ctaatcatta tgccgaggat 180 ttggaaaaag tgtttattcc tcatggactg attatggaca ggactgaaag acttgctcga 240 gatgtcatga aggagatggg aggccatcac attgtggccc tctgtgtgct caaggggggc 300 tataagttct ttgctgacct gctggattac attaaagcac tgaatagaaa tagtgataga 360 tccattccta tgactgtaga ttttatcaga ctgaagagct actgtaatga tcagtcaacg 420 ggggacataa aagttattgg tggagatgat ctctcaactt taactggaaa gaatgtcttg 480 attgttgaag atataattga cactggtaaa acaatgcaaa ctttgctttc cctggttaag 540 cagtacagcc ccaaaatggt taaggttgca agcttgctgg tgaaaaggac ctctcgaagt 600 gttggataca ggccagactt tgttggattt gaaattccag acaagtttgt tgttggatat 660 gcccttgact ataatgagta cttcaggaat ttgaatcacg tttgtgtcat tagtgaaact 720 ggaaaagcca aatacaaagc ctaagatgag cgcaagttga atctgcaaat acgaggagtc 780 Ctgttgatgt tgccagtaaa attagcaggt gttctagtcc tgtggccatc tgcctagtaa 840 agctttttgc atgaaccttc tatgaatgtt actgttttat ttttagaaat gtcagttgct 900 gcgtccccag acttttgatt tgcactatga gcctataggc cagcctaccc tctggtagat 960 tgtcgcttat cttgtaagaa aaacaaatct cttaaattac cacttttaaa taataatact 1020 gagattgtat ctgtaagaag gatttaaaga gaagctatat tagtttttta attggtattt 1080 taatttttat atattcagga gagaaagatg tgattgatat tgttaattta gacgagtctg 1140 aagctctcga tttcctatca gtaacagcat ctaagaggtt ttgctcagtg gaataaacat 1200 gtttcagcag tgttggctgt attttcccac tttcagtaaa tcgttgtcaa cagttccttt 1260 taaatgcaaa taaataaatt ctaaaaatt 1289 <210> 146 sapiens <211> 1331 <212> DNA <213> Homo <400> 146 cctccgcctc ctcctctgct ccgccaccgg cttcctcctc ctgagcagtc 60 tcttgctgcg agcccgcgcg ccggccggct ccgttatggc gacccgcagc cctggcgtcg tgattagtga 120 tgatgaacca ggttatgacc ttgatttatt ttgcatacct aatcattatg ctgaggattt 180 ggaaagggtg tttattcctc atggactaat tatggacagg actgaacgtc ttgctcgaga 240 tgtgatgaag gagatgggag gccatcacat tgtagccctc tgtgtgctca aggggggcta 300 taaattcttt gctgacctgc tggattacat caaagcactg aatagaaata gtgatagatc 360 cattcctatg actgtagatt ttatcagact gaagagctat tgtaatgacc agtcaacagg 420 ggacataaaa gtaattggtg gagatgatct ctcaacttta actggaaaga atgtcttgat 480 tgtggaagat ataattgaca ctggcaaaac aatgcagact ttgctttcct tggtcaggca 540 gtataatcca aagatggtca aggtcgcaag cttgctggtg aaaaggaccc cacgaagtgt 600 tggatataag ccagactttg ttggatttga aattccagac aagtttgttg taggatatgc 660 ccttgactat aatgaatact tcagggattt gaatcatgtt tgtgtcatta gtgaaactgg 720 aaaagcaaaa tacaaagcct aagatgagag ttcaagttga gtttggaaac atctggagtc 780 ctattgacat cgccagtaaa attatcaatg ttctagttct gtggccatct gcttagtaga 840 gctttttgca tgtatcttct aagaatttta tctgttttgt actttagaaa tgtcagttgc 900 tgcattccta aactgtttat ttgcactatg agcctataga ctatcagttc cctttgggcg 960 gattgttgtt taacttgtaa atgaaaaaat tctcttaaac cacagcacta ttgagtgaaa 1020 cattgaactc atatctgtaa gaaataaaga gaagatatat tagtttttta attggtattt 1080 taatttttat atatgcagga aagaatagaa gtgattgaat attgttaatt ataccaccgt 1140 gtgttagaaa agtaagaagc agtcaatttt cacatcaaag acagcatcta agaagttttg 1200 ttctgtcctg gaattatttt agtagtgttt cagtaatgtt gactgtattt tccaacttgt 1260 tcaaattatt accagtgaat ctttgtcagc agttcccttt taaatgcaaa tcaataaatt 1320 cccaaaaatt t 1331 <210> 147 <211> 163 <212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <4 00> 147

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Ala Leu Gln Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110 Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125 Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Pro <210> 148

<211> 163

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> Variante de I-CreI de clivagem de HprCH3 <400> 148

Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe 1 5 10 15

Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Thr 20 25 30

His Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Thr Phe Arg Val Thr Gln Lys 35 40 45

Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val 50 55 60

Gly Tyr Val Tyr Asp Ser Gly Thr Val Ser Asn Tyr Asn Leu Ser Glu 65 70 75 80

Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu 100 105 110

Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp 115 120 125

Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr 130 135 140

Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys 145 150 155 160

Ser Ser Pro

<210> 149 <211> 84 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> iniciador de CCM2Direto <4 00> 149 aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg accatggcca ataccaaata taacaaagag ttcc

<210> 150 <211> 69 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> iniciador de CCMReverso <4 00> 150 tctgatcgat tcaagtcagt gtctctctag atagcgagtc ggccgccggg gaggatttct tcttctcgc

<210> 151 <211> 33 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> iniciador de G19SF <4 00> 151 gccggctttg tggactctga cggtagcatc atc

<210> 152 <211> 33 <212> DNA <213> seqüência artificial <220> <223> iniciador de G19SR <400> 152 gatgatgcta ccgtcagagt ccacaaagcc ggc

Claims (52)

1. Uso de uma variante I-Crel ou um derivado de cadeia simples para induzir uma modificação sítio-específica no gene HPRT, para finalidade não-terapêutica, em que a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples tem pelo menos uma substituição em um dos dois subdomínios funcionais do domínio núcleo LAGLIDADG situado a partir das posições 26 a 40 e 44 a 77 de l-Crel, e é capaz de clivar uma seqüência alvo de DNA selecionada a par- tir dos grupos consistindo nas seqüências SEQ ID NO: 1 a 14.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que o gene HPRT é um gene HPRT de mamífero não-humano.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, em que o gene HPRT é o gene HPRT Criteculus sp.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, em que o gene HPRT é o gene HPRT Mus musculus.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, em que a variante I- Crel cliva um alvo DNA da seqüência SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 14.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que o gene HPRT é o gene HPRT Homo sapiens.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, em que a variante I- Crel cliva um alvo DNA da seqüência SEQ ID NO: 6, 8, 9, 12 ou 14

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples são combinados com um constructo de DNA alvo compreendendo uma seqüência para ser introduzido flanqueados por seqüências que compartilham homologias com as regiões do gene HPRT que circundam o sítio de clivagem de DNA genô- mico da variante I-Crel ou derivado de cadeia simples.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, em que a seqüência a ser introduzida compreende um gene de interesse.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 8, em que a seqüência a ser introduzida compreende um cassete de inativação para o gene HPRT.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que o constructo de DNA alvo é inserido em um vetor.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a variante I-Crel ou derivado de cadeia simples é codificada por um fragmento de polinucleotídeo.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, em que o fragmento é inserido em um vetor de expressão.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, em que o vetor com- preende dois fragmentos de polinucleotídeo diferentes, cada um codificando um dos monômeros de uma variante I-Crel heterodimérico.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, em que o vetor inclui um constructo de DNA alvo como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a modificação de local específico do gene HPRT consiste na inser- ção de um gene de interesse por clivagem do gene HPRT pela variante I-Crel e recombinação homólogo com um constructo de DNA alvo como de- finido na reivindicação 9.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a modificação de local específico do gene HPRT consiste na inser- ção de um cassete de inativação por clivagem do gene HPRT pela variante I-Crel e recombinação homólogo com um constructo de DNA alvo como de- finido na reivindicação 10.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a modificação de local específico do gene HPRT consiste na inativa- ção do gene HPRT por clivagem do gene HPRT pela variante I-Crel e reparo da quebra de filamentos duplos por junção final não-homólogo.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, para preparar animais transgênicos não-humanos ou linhagens de célula recombinante.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, para preparar linha- gens de células humanas recombinantes.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que a variante I-Crel é obtenível por um método compreendendo pelo menos as etapas de : (a) construir uma primeira série de variantes I-Crel tendo pelo menos uma substituição no primeiro subdomínio funcional do domínio núcleo LAGLIDADG situado a partir das posi- ções 26 a 40 de l-Crel, (b) construir uma segunda série de variantes I-Crel tendo pelo menos uma substituição em um segundo subdomínio fun- cional do domínio núcleo LAGLIDADG situado a partir das posições 44 a 77 de I-CreI, (c) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da primeira série de etapa (a) que são capazes de clivar um sítio de I- Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posi- ções -10 a -8 do sítio I-Crel foi recolocado com uma trinca de nucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em cag, att, cct, ttg, gac, atg, ttt, ttc, tgg, gtc, aag, gag e (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições +8 a +10 foi recoloca- do com a seqüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo que e substituído na posição -10 a -8 do sítio I- Crel (isto é: ctg, aat, agg, caa, gtc, cat, aaa, gaa, cca, gac, ctt, e ctc, respectivamente), (d) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da segunda série de etapa (b) que são capazes de clivar um sítio de I- Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posi- ções -5 a -3 do sítio I-Crel foi recolocada com uma trinca de nucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em: gac, taa, tca, gtg, gct, tgt, tgg, ctg, ttg, tag, e gag e (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições +3 a +5 foi recolocada com a seqüência complementar reversa da trinca de nu- cleotídeo que é substituída na posição -5 a -3 do sítio I- Crel (isto é: gtc, tta, tga, cac, age, aca, cca, cag, caa, cta e ctc, respectivamente), (e) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da primeira série de etapa (a) que são capazes de clivar um sítio de I- Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posi- ções +8 a +10 do sítio I-Crel foi recolocada uma trinca de nucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em: cat, cga, tat, ggg, tac, taa, cag, gca, aca, gaa, tga, atg, e (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições -10 a -8 foi recolocada com a seqüência complementar reversa da trinca de nu- cleotídeo que e substituída na posição +8 a +10 do sítio I- Crel (isto é: atg, tcg, ata, ccc, gta, tta, ctg, tgc, tgt, ttc, tca e cat, respectivamente), (f) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir da segunda série de etapa (b) que são capazes de clivar um sítio de I- Crel mutante em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posi- ções +3 a +5 do sítio I-Crel foi trocada pela a trinca de nu- cleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo em: tcc, tat, gtg, gaa, tgg, tac, ttt, aca, age, gcg, tcc, act, caa e aag e (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições -5 a -3 foi recolocada com a seqüência complementar reversa da qual é substituída na posição +3 a +5 do sítio I-Crel (isto é: gga, ata, cac, ttc, cca, gta, aaa, tgt, gct, cgc, gga, agt, ttg e ctt, respectivamente), (gi) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir das etapas (c) a (f) que são capazes de clivar um alvo DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que a variante I-Crel é obtenível por um método compreendendo pelo menos as etapas (a) a (f) como definidas na reivindicação 21, e as etapas adicionais de: (g2) combinar variantes diferentes obtidas em qualquer uma das etapas (c) a (f) uma com a outra ou com l-Crel, para formar heterodímeros, e (h2) selecionar e/ou peneirar os heterodímeros a partir da etapa (g2) que são capazes de clivar o alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14.

23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que a variante I-Crel é obtenível por um método compreendendo pelo menos as etapas (a) a (f) como definidas na reivindicação 21, e as etapas adicionais de: (g3) combinar em uma variante única, as mutações nas posi- ções 26 a 40 e 44 a 77 de duas variantes a partir da etapa (c) e etapa (d), para obter uma nova variante I-Crel homo- dimérica que cliva uma seqüência em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posições -10 a -8 é idêntica à trinca de nu- cleotídeo que está presente nas posições -10 a -8 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições +8 a +10 é idêntica à seqüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo que está presente nas posições -10 a -8 do alvo de DNA da seqüên- cia SEQ ID NO: 1 a 14, (iii) a trinca de nucleotídeo nas po- sições -5 a -3 é idêntica à trinca de nucleotídeo que está presente nas posições -5 a -3 do alvo de DNA da seqüên- cia SEQ ID NO: 1 a 14 (iv) a trinca de nucleotídeo nas po- sições +3 a +5 é idêntica à seqüência complementar rever- sa da trinca de nucleotídeo que está presente nas posições -5 a -3 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, e/ou, (h3) combinar em uma variante única, as mutações nas posi- ções 26 a 40 e 44 a 77 de duas variantes a partir da etapa (e) e etapa (f), para obter uma nova variante I-Crel homo- dimérica que cliva uma seqüência em que (i) a trinca de nucleotídeo nas posições +3 a +5 é idêntica à trinca de nu- cleotídeo que está presente nas posições +3 a +5 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, (ii) a trinca de nucleotídeo nas posições -5 a -3 é idêntica à seqüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo que está presente nas posições +3 a +5 do alvo de DNA da seqüên- cia SEQ ID NO: 1 a 14, (iii) a trinca de nucleotídeo nas po- sições +8 a +10 do sítio I-Crel foi recolocada com a trinca de nucleotídeo que está presente nas posições +8 a +10 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14 e (iv) a trinca de nucleotídeo nas posições -10 a -8 é idêntica à se- qüência complementar reversa da trinca de nucleotídeo nas posições +8 a +10 do alvo de DNA da seqüência SEQ ID NO: 1 a 14, e (13) selecionar e/ou peneirar as variantes a partir das etapas (g3) ou (Ii3) que são capazes de clivar um alvo DNA da se- qüência SEQ ID NO: 1 a 14.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que a variante I-Crel é obtenível por um método compreendendo pelo menos as etapas (a) a (f) como definidas na reivindicação 20, a etapa (g3) e/ou a etapa (h3) como definida na reivindicação 23, e as etapas adicionais de: (i4) combinar as variantes obtidas na etapa (g3) com as varian- tes obtidas na etapa (h3), I-Crel ou as variantes obtidas na etapa (e) ou etapa (f), para formar heterodímeros, ou (i’4) combinar as variantes obtidas na etapa (h3) com I-Crel ou as variantes obtidas na etapa (c) ou etapa (d), para formar heterodímeros, e G4) selecionar e/ou peneirar os heterodímeros a partir da etapa (i4) ou (i’4) que são capazes de clivar um alvo DNA da se- qüência SEQ ID NO: 1 a 14.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 21 a 24, em que as substituições no subdomínio situado a partir das posições 44 a 77 de I-Crel estão nas posições 44, 68, 70, 75 e/ou 77.

26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 21 to 24, em que as substituições no subdomínio situado a partir das posições 26 a 40 de I-Crel estão nas posições 26, 28, 30, 32, 33, 38 e/ou 40.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 21 a 26, em que a variante I-Crel compreende uma ou mais substituições adicio- nais em l-Crel.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, em que as substitui- ções estão nas posições : 2, 9, 19, 42, 43, 54, 66, 69, 72, 81 , 82, 86, 90, 92,96, 100, 103, 104, 105, 107, 108 , 109, 110, 113, 120, 125, 129, 130, 131 , 132, 135, 136, 137, 140, 143, 151, 154, 155, 157, 158, 159, 161 ou 162 de Ι- ΙΟ Crel.

29. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 21 a 28, em que as substituições são recolocações dos aminoácidos iniciais nos aminoácidos selecionados no grupo consistindo em A, C, D, E, G, Η, K, N, P, Q, R, S, T , Y, W, L, V, M e I.

30. Uso, de acordo com a reivindicação 28 ou reivindicação 29, em que a substituição é a mutação G 19S ou G 19 A.

31. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, em que a variante I-Crel é um heterodímero, resultando da associação de um primeiro e um segundo monômero tendo diferentes mutações nas posi- ções 26 a 40 e/ou 44 a 77 de l-Crel.

32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, em que pelo menos um monômero tem pelo menos duas substituições, um em cada um dos dois subdomínios funcionais situado a partir das posições 26 a 40 e 44 a 77 de l-Crel.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 32, em que o heterodí- mero consiste em um primeiro e um segundo monômero selecionado a partir dos seguintes pares de seqüência: SEQ ID NO: 83 e 97, SEQ ID NO: 84 e 98, SEQ ID NO: 85 e 99, SEQ ID NO: 32 e 52, SEQ ID NO: 32 e 53, SEQ ID NO: 32 e 54, SEQ ID NO: 32 e 55, SEQ ID NO: 32 e 56, SEQ ID NO: 32 e 57, SEQ ID NO: 32 e 58, SEQ ID NO: 32 e 60, SEQ ID NO: 32 e 65, SEQ ID NO: 32 e 66, SEQ ID NO: 32 e 67, SEQ ID NO: 32 e 68, SEQ ID NO: 32 e 69, SEQ ID NO: 32 e 70, SEQ ID NO: 32 e 71, SEQ ID NO: 32 e 72, SEQ ID NO: 32 e 73, SEQ ID NO: 32 e 74, SEQ ID NO: 75 e 56, SEQ ID NO: 76 e 56, SEQ ID NO: 77 e 56, SEQ ID NO: 78 e 56, SEQ ID NO: 79 e 56, SEQ ID NO: 80 e 56, SEQ ID NO: 81 e 56, SEQ ID NO: 82 e 56, SEQ ID NO: 86 e96, SEQ ID NO: 87 e 100, SEQ ID NO: 88 e 101, SEQ ID NO: 89 e 102, SEQ ID NO: 90 e 103, SEQ ID NO: 91 e 104, SEQ ID NO: 92 e 105, SEQ ID NO: 93 e 106, SEQ ID NO: 94 e 107, SEQ ID NO: 95 e 108, SEQ ID NO: 147 e 148.

34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33,em que um monômero do heterodímero compreende a mutação G19S.

35. Uso de uma variante I-Crel ou um derivado de cadeia sim- ples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 21 a 34, para a pre- paração de um medicamento para prevenir, melhorar ou curar uma doença genética associada com uma mutação no gene HPRT.

36. Uso, de acordo com a reivindicação 35, em que a variante I- - Crel ou derivado de cadeia simples é associada com um constructo de DNA alvo que compreende uma seqüência que repara uma mutação no gene HPRT flanqueado por seqüências que compartilham homologias com as re- giões do gene HPRT que circunda o alvo de DNA genômico da variante I- Crel ou derivado de cadeia simples, como definido na reivindicação 8 ou 11.

37. Uso, de acordo com a reivindicação 36, em que a seqüência que repara a mutação é a seqüência correta do gene HPRT.

38. Uso, de acordo com a reivindicação 36, em que a seqüência que repara a mutação compreende os éxons do HPRT a jusante do sítio de clivagem genômico fundido no quadro, e um sítio de poliadenilação para pa- rar a transcrição em 3'.

39.Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, em que o I-Crel ou derivado de cadeia simples é codificado por um vetor compreendendo o constructo de DNA alvo.

40. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, em que a doença genética é a Síndrome de Lesch Nyhan.

41. Variante I-Crel como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 e 21 a 34.

42. Endonuclease quimérica de cadeia simples derivada de uma variante I-Crel como definida na reivindicação 41.

43. Fragmento de polinucleotídeo que codifica uma variante co- mo definida na reivindicação 41 ou uma endonuclease quimérica de cadeia simples como definida na reivindicação 42.

44. Vetor de expressão que compreende pelo menos um frag- mento de polinucleotídeo como definida na reivindicação 43.

45. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 44, que compreende, dois fragmentos de polinucleotídeo diferentes, cada um codifi- cando um dos monômeros de uma variante de heterodímero como definida em qualquer uma das reivindicações 14 e 30 a 34.

46. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 44 ou reivindicação 45, que compreende um constructo de DNA alvo como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10 e 36 a 38.

47. Vetor que compreende um constructo de DNA alvo como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10 e 36 a 38.

48. Célula hospedeiro que é modificada por um polinucleotídeo como definida na reivindicação 41, ou um vetor, como definida em qualquer uma das reivindicações 44 a 47.

49. Animal transgênico não-humano compreendendo um ou dois fragmentos de polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindi- cações 41 a 43.

50. Planta transgênica compreendendo um ou dois fragmentos de polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 43.

51. Composição que compreende pelo menos uma variante I- Crel como definida em qualquer uma das reivindicações 1 e 21 a 32 ou uma endonuclease quimérica de cadeia simples como definida na reivindicação 39, e/ou pelo menos um vetor de expressão, como definida em qualquer uma das reivindicações 42 a 44.

52. Produtos contendo pelo menos uma variante I-Crel como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 21 a 32, uma endonuclea- se quimérica de cadeia simples, de acordo com a reivindicação 39, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, e um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 34 a 36, co- mo uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou sequen- ciai na prevenção ou tratamento ou de uma doença genética associada com uma mutação no gene HPRT.