BRPI0718989A2 - Ablação genética de células com gene prp usando uma estratégia de captura de promotor direcionada para a produção de proteínas recombinantes isentas de soro como produtos terapêuticos. - Google Patents
Ablação genética de células com gene prp usando uma estratégia de captura de promotor direcionada para a produção de proteínas recombinantes isentas de soro como produtos terapêuticos. Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0718989A2 BRPI0718989A2 BRPI0718989-3A2A BRPI0718989A BRPI0718989A2 BR PI0718989 A2 BRPI0718989 A2 BR PI0718989A2 BR PI0718989 A BRPI0718989 A BR PI0718989A BR PI0718989 A2 BRPI0718989 A2 BR PI0718989A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- prp
- cells
- human
- cell line
- free
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 29
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 8
- 238000002679 ablation Methods 0.000 title description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 295
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 103
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 50
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims description 39
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 21
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 19
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 19
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 17
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 13
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 13
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 10
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 8
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 6
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 5
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 5
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 claims 2
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 claims 2
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 claims 2
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 claims 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 73
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 57
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 26
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 24
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 24
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 102100034452 Alternative prion protein Human genes 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 8
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 8
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 6
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 6
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 5
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 5
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 4
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241001489705 Aquarius Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 101150047086 arm gene Proteins 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 2
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 2
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 2
- 208000003736 Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010072075 Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome Diseases 0.000 description 2
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 125000001483 monosaccharide substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- IPVFGAYTKQKGBM-BYPJNBLXSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound F[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 IPVFGAYTKQKGBM-BYPJNBLXSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123373 Adenovirus E1A gene Drugs 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 101100152794 Caenorhabditis elegans dpl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- 208000031639 Chromosome Deletion Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000823435 Homo sapiens Coagulation factor IX Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N L-arginine amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000019735 Meat-and-bone meal Nutrition 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000004451 Pituitary Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010081865 Pituitary Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 208000012936 Sheep disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 229940036811 bone meal Drugs 0.000 description 1
- 239000002374 bone meal Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 208000026234 goat disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940052349 human coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- UMFCIIBZHQXRCJ-NSCUHMNNSA-N trans-anol Chemical compound C\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 UMFCIIBZHQXRCJ-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
- C12N5/0686—Kidney cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/95—Protein-free medium and culture conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ABLAÇÃO GENÉTICA DE CÉLULAS COM GENE PRP USANDO UMA ESTRATÉGIA DE CAPTURA DE PROMOTOR DIRECIONADA PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES ISENTAS DE SORO COMO PRODUTOS TERAPÊUTICOS".
A presente invenção refere-se a uma linhagem de célula huma- na somática imortalizada isenta de proteína de príon (PrP) em que ambos os alelos do gene PrP foram completamente deletados. A invenção ainda pro- porciona um método para a produção da referida linhagem de célula e seu uso para a produção de proteínas-alvo humanas as quais são adequadas como biofarmacêuticos. Introdução
Prions são patógenos infecciosos que causam encefalopatias espongiformes no sistema nervoso central em animais. Em contraste aos vírus e viróides, prions são totalmente desprovidos de ácido nucleico e são resistentes à proteases. A partícula infecciosa foi identificada como PrPsc, uma isoforma de PrPc, a proteína de príon celular normal. A hipótese de prí- on (Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sei. 95, 13363-13383, (1988)) propõe que a molécula de PrPsc em si converte PrPc à conformação anormal, quer através de um processo de heterodimerização ou através de polimerização nuclear.
As doenças por príon mais comuns de animais são scrapie em ovelhas e cabras e encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em gado. Em seres humanos, quatro doenças por príon foram identificadas: (1) Kuru, (2) doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) doença de Gerstmann-Straussler- Scheinker (GSS) e (4) insônia familial fatal (FFI). As doenças humanas por príon podem ter origem infecciosa ou genética, esporádica.
A primeira doença por príon infecciosa descrita foi scrapie como uma doença de ovelha e cabras há 250 anos. A scrapie foi demonstrada como sendo experimentalmente transmissível há 50 anos. Não há evidência de que a scrapie tenha sido ainda transmitida para o homem. A BSE foi pri- meiro descrita em gado no Reino Unido em 1985 (Wells e outros, Veterinary Record 121, 419-420, (1987)) e acredita-se que tenha se disseminado atra- vés de consumo oral de carne derivada de ruminante e farinha de osso (Wi- Iesmith e outros, Veterinary Record 123, 638-644, (1988)). A doença se es- palhou amplamente, atingindo um pico em 1992 com mais de 180.000 casos clínicos no Reino Unido, embora estimativas matemáticas sugiram que 1 a 2 milhões de gado possam ter sido infectados, mas abatidos e entraram na cadeia alimentar humana antes que eles estivessem velhos o bastante para demonstrar evidência de doença clínica (Anderson e outros, Nature 382, 779-5 788, (1996)). A BSE passou para até 20 outras espécies, incluindo gatos domésticos e exóticos (Wyatt e outros, Veterinary Record 129: 233- 236, (1991); Kirk-wood e Cunningham, Veterinary Record 135, 296-303 (1994)) e ungulados exóticos em zôos Britânicos. Em Julho de 1988, a dis- seminação da BSE levou o Governo do Reino Unido a restringir o uso de carne e farinha de osso derivadas de ruminante como uma ração para ani- mais e em Novembro de 1989 especificar que sobras bovinas fossem bani- das para consumo humano.
A transmissão de doenças por príon para seres humanos foi primeiro reportada em pessoas que vinham da Papua-Nova Guiné no final de 1950 (Gajdusek & Zigas, New England Journal of Medicine 257, 974-978 (1957)) e acredita-se que tenha sido transmitida durante canibalismo ritualís- tico e ritos funerários com sacrifícios. A transmissão latrogênica de CJD foi bem documentada através de inoculação direta do CNS através de instru- mentos e enxertos médicos contaminados. A transmissão latrogênica tam- bém ocorreu via hormônio de crescimento da pituitária humana cadavérica e gonadotropinas administradas através de injeção intramuscular (Buchanan e outros, British Medicai Journal 302, 824-824, (1991); Brown e outros, Trans- fusion 38: 810-816, (1992)).
A CJD variante (vCJD) é uma doença por príon humana aparen- temente resultante de exposição ao agente da encefalopatia espongiforme bovina (BSE). A vCJD foi primeiro descrita há 10 anos (Will e outros, Lancet 347: 921-5, (1996)) como um resultado de monitoramento sistemático da incidência e fenotipo clínico de CJD no Reino Unido.
Para vCJD, em contraste com outras doenças por príon em se- res humanos, a forma doença-associada da proteína de príon e infectividade é prontamente detectável em tecidos linfóides por todo o corpo (Hill1 A.F. e outros, Lancet 353: 83-9 (1999); Head, M.W. e outros, Am. J. Pathol. 164: 142 (2004)), mesmo antes do início de doença clínica (Hilton, D.A. e outros, Lancet 352: 703-4 (1998)). Isso dá origem à preocupações de que o sangue e produtos sangüíneos também possam conter partículas infecciosas, repre- sentando uma possível fonte de disseminação latrogênica de CJD variante.
Essa preocupação foi reforçada após a transmissão experimen- tal de BSE no modelo com ovelhas de transfusão de sangue e camada Ieu- coplaquetária de animais na fase pré-clínica da enfermidade (Hunter e ou- tros, J. Gen. Virol. 83: 2897-905 (2002)).
Estudos em modelos com animais sugerem que a maior parte da infectividade no sangue pode estar associada à célula, com menores níveis no plasma (Brown P. e outros, Transfusion 38: 810-816 (1998)) e há evidên- cia para sugerir que qualquer infectividade presente pode ser reduzida du- rante o processo de fracionamento do plasma (Stenland, CJ. e outros, Transfusion 42: 1497-500 (2002); Gregori, L. e outros, Biologicals 32: 1-10 (2004)). Em resposta à transmissão de vCJD através de transfusão sangüí- nea, um adiamento de doadores que eram recipientes de componentes san- guíneos desde 1980 foi instituído de forma a reduzir o risco de transmissões terciárias ou de ordem superior que levam a um surto autossustentado. To- davia, a possibilidade de que o plasma ou produtos sangüíneos possam transmitir a doença não pode ser excluída, uma vez que um teste de sangue apropriado ainda não está disponível (Aguzzi, A. & Glatzel M., Nat. Clin. Pract. Neurol. 2: 321-329 (2006)).
O risco de transmissão de distúrbios príon-relacionados através de produtos humanos é uma grave preocupação de saúde. No caso de pro- dutos sangüíneos, o método de prevenção é, por um lado, a manipulação de doadores de vCJD combinado com por exemplo, limpeza do sangue, através de filtração.
Por outro lado, há a produção segura de proteínas humanas re- combinantes, prevenindo o risco de transmissão de príon através de transfu- são sangüínea por doadores contaminados. A produção de proteínas huma- nas em organismos tais como Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae permite a produção de muitas proteínas humanas em síntese em larga esca- la, mas fatores tais como estabilidade do plasmídeo e insolubilidade do pro- duto de proteína desejado podem limitar a utilidade desses sistemas. A mai- oria das proteínas humanas requer modificações pós-traducionais adicionais para desempenhar a função da proteína endógena e, assim, requerem sua síntese em células de mamífero ou mesmo linhagens de célula espécie- específicas para funcionamento semelhante ao plasma da proteína produzi- da.
Por exemplo, para o fator VIII, o uso de linhagens de célula não humanas, tais como células de ovário de hâmster Chinês (CHO), se defronta com desvantagens críticas pelo fato de que as proteínas terapêuticas purifi- cadas são contaminadas com componentes vestigiais celulares, causando reações antigênicas nos pacientes (Refacto, Wyeth, bula na embalagem).
Além disso, proteínas expressas através de sistemas de expres- são não-humanos podem ter padrões de glicosilação não-humanos que também dão origem à reações antigênicas no paciente. A estabilidade bioló- gica e eficácia de fatores de coagulação são substancialmente influenciadas por seu padrão de O- e N-glicosilação. Especialmente, monossacarídeos periféricos e terminais são importantes porque eles são detectados por re- ceptores específicos de células as quais são responsáveis por sua degrada- ção. Fatores de coagulação trazem resíduos de ácido siálico como monos- sacarídeos terminais. Modificação na composição de ácidos siálicos nas an- tenas de glicoproteínas pode resultar em padrões de glicosilação heterogê- neos. Assim, a estabilidade biológica e eficácia são crucialmente afetadas quando modificação ocorre. Consequentemente, a avaliação da influência de glicosilação em linhagens de célula de produção não-humanas é uma consi- deração importante na produção de fatores de coagulação recombinantes. De modo geral, linhagens de célula humanas são mais qualificadas para a produção de fatores de coagulação recombinantes do que linhagens de célu- la não-humanas. A razão para isso é provavelmente que nenhum oligossa- carídeo estranho será incorporado nas porções de oligossacarídeo durante síntese de proteínas recombinantes.
Por essas razões, sistemas de mamífero, especialmente huma- nos, são preferíveis para a produção de proteínas humanas recombinantes.
Em particular, a linhagem de célula imortalizada HEK293 e seus derivados, por exemplo, Freestyle HEK293F, são capazes de expressão de proteínas humanas recombinantes (EP 05 105 965.7). Uma vez que muitos produtos terapêuticos são produzidos em sistemas de mamífero, há uma necessidade em assegurar a segurança desses produtos isolados de tais sistemas com relação à ausência completa de proteínas de príon. Levando em conta que, por um lado, nenhum teste apropriado para infectividade por príon está dis- ponível e que, por outro lado, propagação e infectividade por príon são de- pendentes da expressão da proteína de príon celular normal, a qual poderia converter a proteína de príon infecciosa, a forma mais segura e promissora para impedir a infectividade por príon em tais sistemas é prevenir completa- mente a expressão do gene de proteína de príon nos sistemas de produção através de "knockout" completo do gene de príon.
Tal sistema de produção de linhagem de célula com "knockout", conforme aquele descrito na presente invenção, impede completamente a expressão da proteína de príon e proporcionará proteínas humanas recom- binantes absolutamente livres de proteínas de príon infecciosas e livres de um risco de contaminação para os pacientes que recebem produtos farma- cêuticos recombinantes produzidos nessas células sem príon.
De forma a impedir especificamente a expressão de um deter- minado gene em uma célula eucariota, várias abordagens foram desenvolvi- das empregando tecnologias de engenharia genética e biologia molecular. Ablação genética (também comumente conhecida como ""knockout" genéti- co" no jargão usado pelos versados na técnica) implica na remoção da se- qüência de DNA que codifica uma proteína em particular. Como uma conse- quentemente dessa remoção, a "célula com "knockout"" resultante é comple- tamente incapaz de expressar o gene que sofreu "knockout". Em contraste, tecnologias de "RIMA de interferência" (RNAi) não removem a seqüência de DNA1 mas antes, introduzem uma seqüência antissenso ou complementar a qual, então, impede a tradução do gene suprimido. Na maioria dos casos, o gene com "knockdown" resultante é apenas parcialmente suprimido, permi- tindo algum nível de expressão residual.
Em virtude do amplo uso do camundongo como um modelo de
doença humana e em virtude da disponibilidade precoce de células tronco embriônicas de murino (ES) as quais são facilmente passíveis de manipula- ções genéticas e embriônicas, tecnologias de "knockout" foram desenvolvi- das principalmente em células ES de camundongo (Joyner A.L., Oxford U- niv. Press, Reino Unido 1993). Atualmente, a tecnologia de "knockout" no camundongo se desenvolveu o bastante para permitir não apenas "knoc- kout" completo ("alelos nulos"), mas também mutantes condicionais. A muta- ção direcionada pode ser temporariamente induzida ou suprimida, por e- xemplo, através de suplementação da ração para camundongo com tetraci- clina (sistemas "tet-on", "tet-off, Gossen, M. e Bujard, H. Proc. Natl. Acad. Sei, USA 89: 5547-5551 (1992)); ela pode ser acionada por um promotor célula- ou tecido-específico ou por um promotor abundante, mas regulado pelo desenvolvimento, o qual pode ser desviado durante desenvolvimento embriônico, mas rapidamente ativado após o nascimento. A geração de uma linhagem de célula ES com "knockout" sem-
pre requer as mesmas etapas iniciais: (1) a geração de um construto de di- recionamento especificamente criado para realizar "knockout" de um gene particular; (2) introdução desse construto nas células ES e (3) seleção e var- redura de células trazendo uma deleção direcionada do gene desejado. O construto de direcionamento sempre deve conter um cassete
de seleção e uma região significativa de homologia ao gene o qual sofrerá "knockout". Esses dois elementos são absolutamente necessários para obter e detectar a integração apenas no Iocus desejado: a região de homologia ao gene endógeno dispara a recombinação homóloga entre os dois fragmentos de DNA homólogos, enquanto que o cassete de seleção permite a varredura de células trazendo o construto integrado. O cassete de seleção mais am- plamente usado em tecnologia de "knockout" de ES é o cassete de fosfo- transferase de neomicina ("rieo"), consistindo na ORF que codifica essa en- zima acionada por um promotor de quínase de fosfoglicerato (pGK) de ca- mundongo (Soriano e outros, Cell 64, 693-702 (1991)) e flanqueada a jusan- te por um sinal de término de transcrição poliA. Quando de introdução do construto de direcionamento em células ES e seleção com G418, apenas aquelas células onde o construto foi estavelmente integrado serão resisten- tes ao antibiótico. Dentre essas células resistentes existirão algumas onde o construto de direcionamento substituiu a seqüência original endógena. Even- tos direcionados em clones isolados podem, então, ser selecionados através de PCR genômica ou através de análise de Southern blot genômica. Em cé- lulas ES de camundongo, a freqüência com a qual o construto de direciona- mento se integra na região desejada do genoma é muito menor do que a- quela de integração aleatória, o que usualmente torna necessário selecionar várias centenas de clones resistentes a antibiótico antes que um correta- mente direcionado seja identificado.
Uma possibilidade para aumentar a freqüência de direcionamen- to de um determinado construto é aumentar o comprimento da região de homologia, uma vez que há uma relação linear entre ambos os parâmetros (Hasty e outros, Mol Cell Biol. Nov. de 1991; 11(11): 5586-91 (1991)). Alter- nativamente, uma série de "abordagens de captura" foram desenvolvidas, as quais contam com o uso de elementos do Iocus-alvo para expressão eficien- te do cassete de seleção. Por exemplo, na abordagem de captura de endó- gena, o vetor de direcionamento é criado de uma forma tal que a maquinaria transcricional do gene alvo endógeno acionará a expressão do cassete de seleção clonado no vetor de direcionamento. Nesse caso, o vetor contém regiões homólogas ao gene-alvo as quais não têm qualquer atividade pro- motora e, portanto, a maioria dos clones nos quais a integração ocorreu ale- atoriamente não pode sobreviver à seleção com antibiótico. Tipicamente, seleções por captura de promotor obtêm enriquecimentos de 100 vezes para os clones-alvo.
Usando metodologias de RNAi, expressão do gene PrP tem si- do, até o momento, apenas transitória e parcialmente silenciada em células de neuroblastoma de camundongo infectadas com scrapie em cultura (Dau- de e outros, J. Cell. Sci., 1 de Julho de 2003; 116 (Pt 13): 2775-9 (2003)).
O direcionamento genético do gene de príon no genoma de ca- mundongo foi reportado com sucesso usando diferentes abordagens (Tabela 1) de forma a elucidar a conseqüência funcional de sua perda de função e sua possível relação com TSEs.
Tabela 1: Dados de "knockout" de PrP em camundongos disponíveis da lite- ratura _
Nome do "knoc- kout" Método Seleção com anti- biótico Braços ho- mólogos (kb) Células hospedei- ras Fre- qüência de re- combi- nação direcio- nada Zurich I Conven- cional G418 a 0,3 mg/ml n/a ES AB1 1/5000 Edin- burgh Conven- cional G418 a 0,2 mg/ml Ganeiclovir a 2 μΜ Esquerdo: 1,2 Direito: 2,4 E14 1/800 Nagasa- ki Conven- cional G418 a 0,2 mg/ml FIAU a 200 nM Esquerdo: 3,0 Direito: 9,0 J1 ES 1/321 RcmO Conven- cional G418 a 1 mg/ml n/a Neuroblas- toma N2a n/a Zurieh Il Condi- cional G418 a 0,4 mg/ml Esquerdo: 1,4 Direito: 3,7 E14.1 82/1046( PCR), 5/82
Conforme esperado a partir da "teoria de proteína de príon ape-
nas" (Prusiner Nobel Lecture, 8 de Dez. de 1997), camundongos homozigó- ticos para o gene inativado (isto é, totalmente desprovido de expressão de PrP) são na verdade resistentes à infecção por príon. Mais importante, con- tudo, todos os camundongos com "knockout" de PrP mencionados acima são viáveis e normais quanto ao desenvolvimento. Apenas um fenotipo neu- rológico relativamente brando foi caracterizado nos knockouts Nagasaki, RcmO e Zürich Il (Rossi e outros, EMBO J. 20, 4, 694-702, (2001)), indicando que a função do gene PrP não é absolutamente essencial. Alternativamente, conforme foi sugerido, pode haver algum mecanismo de compensação fun- cional do gene pelo Dpl1 um gene que mostra homologia considerável ao PrP e mapeando apenas 16 Kb a jusante do qual é superregulado no CNS de camundongos com "knockout" de PrP (Moore e outros, J. Mol. Biol. 292, 797-817 (1999)).
A tecnologia de "knockout" descrita acima tem se defrontado com dois problemas principais quando aplicada à células somáticas. Primei- ro, "knockout" de um gene nessas células proporciona apenas informação limitada a respeito das conseqüências funcionais da ruptura, uma vez que o fenotipo de células com "knockout" em cultura não reflete necessariamente o efeito final em um organismo mutante, tal como o camundongo derivado de células de ES com "knockout". O segundo problema e mais crítico é que a freqüência de direcionamento de recombinação homóloga em células somá- ticas é cerca de duas ordens de magnitude maior do que em células de ES (Hanson e Sedivy, Mol. Cell Biol. 15(1): 45-51 (1995)). Para direcionamento eficiente de gene em células somáticas, abordagens de captura de promotor utilizando vetores sem promotor são absolutamente essenciais (Sedivy e Dutriaux, Trends Genet. 15(3): 88-90 (1999)), uma vez que elas podem, tipi- camente, obter enriquecimentos de 100 a 500 vezes. Quando de introdução em células somáticas e seleção por antibiótico, o cassete de seleção pode ser expresso apenas após recombinação homóloga a partir do promotor do gene-alvo. Direcionamento gênico também pode ser aprimorado através da tecnologia CIonePix disponível da Genetix, Reino Unido.
Agora, descobriu-se que uma linhagem de célula somática hu- mana (por exemplo, uma linhagem de célula derivada da linhagem de célula HEK293F) poderia ser estabelecida na qual o gene que codifica a seqüência da proteína de príon tenha sido inativado em pelo menos um, de preferência em ambos os alelos ou três alelos em células triplóides. Isso foi obtido atra- vés de recombinação homóloga de um vetor "knockout" contendo um mar- cador de seleção o qual após integração do alvo no genoma permite a ex- pressão de dito marcador de seleção pelo promotor de PrP endógeno. Tais células com ablação de príon resultantes são adequadas para a produção recombinante de proteínas-alvo humanas após transfecção com um vetor de expressão adequado que codifica a proteína-alvo. Em combinação com uma purificação de proteína e inativação de vírus adequadas, esse método pro- porciona um sistema eficaz para produzir proteínas humanas recombinantes seguras e altamente ativas livres de proteínas de príon para aplicação tera- pêutica em seres humanos. Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a:
(1) uma linhagem de célula somática, imortalizada, sem proteína de príon (PrP) em que ambos os alelos do gene de PrP foram completamen- te deletados;
(2) um método para produção da linhagem de célula imortalizada isenta de PrP conforme definido em (1) acima o qual compreende subse- quente deleção de ambos os alelos da ORF de PrP em uma respectiva célu-
Ia inicial através de recombinação homóloga com construtos com "knockout" de PrP;
(3) um construto com "knockout" de PrP conforme definido em
(2) acima;
(4) o uso da linhagem de célula imortalizada isenta de PrP con- forme definido em (1) acima para a produção recombinante isenta de PrP de
uma proteína humana ou um derivado ou mutante da mesma (aqui depois "proteína-alvo");
(5) um método para preparo de uma linhagem de célula para a produção recombinante isenta de PrP de uma proteína-alvo o qual compre-
ende transfecção de uma linhagem de célula hospedeira imortalizada isenta de PrP conforme definido em (1) acima com um vetor de transfecção com- preendendo uma origem de replicação e um gene que codifica a referida proteína-alvo humana, pelo que o gene para a proteína-alvo humana está ligada, em sua extremidade 5', com um promotor e, em sua extremidade 3', com um sinal poliA;
(6) uma linhagem de célula imortalizada isenta de PrP estavel- mente transfectada, de preferência sob condições isentas de soro, com o vetor de transfecção conforme definido em (5) acima; e
(7) um método para produção recombinante isenta de PrP de uma proteína-alvo humana a ser usada como produto farmacêutico o qual compreende cultura da linhagem de célula humana imortalizada isenta de 5 PrP conforme definido em (6) acima.
O método da modalidade (7) da invenção é particularmente ade- quado para a produção de proteínas humanas recombinantes e anticorpos terapêuticos, incluindo fatores de coagulação, tal como fator Vll/a, fator VIII, fator IX, fator de von Willebrand (vWF) e Adamtsl 3 e fatores de crescimento, 10 tais como fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) ou fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito (GM-CSF), isenta de con- taminação por proteína de príon. Para esse método, uma linhagem de célula humana imortalizada, por exemplo, uma linhagem de célula HEK 293, com ablação de uma seqüência de proteína de príon da invenção é utilizada. Es- 15 sa linhagem de célula é obtenível através de transfecção de uma linhagem de célula humana imortalizada com um vetor contendo um marcador sele- cionável ou de seleção tal como, por exemplo, a ORF de fosfotransferase de neomicina, desprovido de seu próprio promotor e início de tradução.
Em uma modalidade, a linhagem de célula é uma linhagem de célula humana, tal como uma linhagem de célula derivada de células HEK 293F ou Per.C6 (células de retina fetal humana imortalizadas). Outras célu- las adequadas são células CHO (células de Ovário de Hâmster Chinês) e BHK (células de Rim de Hâmster Bebê).
Breve Descrição das figuras Figura 1: Estratégia de captura de promotor para realizar abla-
ção do gene de PrP humano.
Figura 2: Construto com K.O. de PrP pBS_Neo_P' _R+L_Braço_2B.
Figura 3: Estratégia de clonagem para gerar o construto pBS_Neo_P"_L+R_Braço_2B, A seqüência da região clonada no vetor pBlu- escript, i) gene de neomicina sem seu próprio promotor e ATG, ii) Braço es- querdo para recombinação homóloga, iii) Braço direito para recombinação homóloga.
Figura 4: Estratégia de seleção baseada em PCR após seleção
com G418.
Figura 5: Estratégia de Southern genômica para caracterizar clo- nes após integração estável do construto pBS_Neo-_P-_L+R_Braço_2B.
Figura 6: Varredura PCR genômica após integração do construto de direcionamento pBS_Neo_P-_R+L_Braço_2B. Marcador de DNA: Mistura GeneRuIer DNA Ladder; Controle positivo: DNA genômico de uma popula- ção mista de célula de PrP alvo. A1-8 e B1-8 são os clones de célula sele- 10 cionados através do CIonePixFL. Os clones rotulados com um círculo verde foram identificados como clones positivos através de PCR em virtude das bandas de 2,3 kb.
Figura 7: Análise de Southern de células com K.O. de PrP após integração direcionada do primeiro construto de K.O. pBS_Neo_P- 15 _R+L_Braço_2B: o seguinte é utilizado: Marcador de DNA: Mistura GeneRu- Ier DNA Ladder; WT: 293F do tipo selvagem: K.O.: um clone com K.O. iden- tificado após integração direcionada do 1o K.O. Construto pBS_Neo_P- _R+L_Braço_2B. DNA genômico do clone com K.O. e células 293F do tipo selvagem foi hibridizado com 5’-, 3’- e Neo-sondas. Conforme esperado, 20 293F do tipo selvagem mostram uma banda de 10,8 kb do tipo selvagem com ambas as sondas 5’- e 3’-, mas nenhum sinal com a Neo-sonda. Para os clones com K.O., uma banda de 4,2 kb com uma 3’-sonda e uma banda de 6,5 kb com uma 3’-sonda puderam ser detectadas; adicionalmente, uma banda de 6,5 kb foi observada com a Neo-sonda.
Figura 8: Análise por FISH de células com K.O. de PrP com um
alelo de PrP direcionado: padrão a: dois sinais de chr20 e Bac; Padrão b: 3 sinais chr20 e Bac; padrão c: 3 sinais de chr20, mas apenas 2 sinais de Bac.
Figura 9: Análise por ELISA de células com K.O. de PrP com um alelo de PrP direcionado e células 293F: 2 linhagens de célula com K.O. tra- zendo um alelo de PrP direcionado (K.O. 1 e K.O. 6) foram analisadas e comparadas com células 293F do tipo selvagem.
Figura 10: 2. Construto de K.O. de PrP pBS_Zeo_Fr _R+L_Braço.
Figura 11: Varredura por PCR de clones de células ou popula- ções de células mistas com duas integrações de K.O. de PrP: No gel, o se- guinte é utilizado: Marcador de DNA: Mistura GeneRuIer DNA Ladder; Con- 5 trole positivo: DNA genômico de uma população mista de células de PrP di- recionada. T3-1 é uma população de células mista selecionada com zeocina. T3-2 é uma população de células mista selecionada com zeocina e G418. Ambas as populações de células mistas foram identificadas como positivas.
Figura 12: Estratégia de Southern genômica para caracterizar clones após integração estável do construto de direcionamento pBS_Neo- _P-_L+R_Braço_.
Figura 13: Eficiência de transfecção de células com KO de PrP com um alelo direcionado de PrP. A mesma quantidade de células foi trans- fectada com um plasmideo de expressão e a eficiência de transfecção foi comparada.
Figura 14: Expressão de FVIII (Fig. 14a), FIX (Fig. 14b) e G- CSFb (Fig. 14c) em células com K.O. de PrP com um alelo de PrP direcio- nado. A expressão de unidades arbitrárias de FVIII, FIX e G-CSFb por célu- las 10E6 comparado com células 293F do tipo selvagem.
Descrição Detalhada da Invenção
As seguintes definições e abreviações são utilizadas no presente
pedido.
"BAC" significa cromossoma artificial bacteriano. "bp" significa pares de base. "G418" e "zeocina" são dois anticorpos de seleção diferen- 25 tes; células transfectadas estavelmente com construtos trazendo os mesmos como marcadores de seleção se tornam resistentes ("G418R" ou "zeocinaR") a esses antibióticos, "recombinação homóloga" se refere a um mecanismo pelo qual dois fragmentos de DNA de seqüência homóloga se recombinam um com o outro. "Braço esquerdo" se refere à região intrônica do gene de 30 PrP localizada imediatamente a montante do éxon 3. "Braço direito" se refe- re à região imediatamente a jusante do éxon 3 do gene de PrP. "Neo" se refere ao gene de fosfotransferase de neomicina. "ORF" significa rede de leitura aberta. "PCR" significa reação em cadeia de polimerase, "PrP" signifi- ca gene de príon ou a proteína de príon. "HEK293F" se refere a uma linha- gem de célula de rim embriônica humana específica.
Assim, a modalidade (1) da invenção se refere a uma linhagem 5 de célula humana somática, imortalizada, isenta de proteína de príon (PrP) em que ambos os alelos do gene de PrP foram completamente deletados.
De acordo com a invenção, a referida linhagem de célula é ca- paz de ser transfectada e ser cultivada sob condições isentas de soro.
Ainda, é preferido que a linhagem de célula tenha sido tornada 10 imortal através de integração de seqüências adenovirais em seu genoma. A linhagem de célula pode ser derivada de uma célula inicial selecionada do grupo consistindo em células de rim, bexiga, fígado, pulmão, músculo cardí- aco, músculo liso, ovário e gastrintestinais. É preferido que a célula inicial seja uma linhagem de célula de rim humano, tal como uma célula de rim fe- 15 tal humana. Particularmente preferido é que a célula de rim humano fetal seja uma célula FreeStyIe 293 (células 293F; Invitrogen R79007), HEK 293 (células 293; ATCC CRL-1573; DSM ACC 305) ou célula 293T (DSM ACC 2494), de preferência é uma célula 293F (Invitrogen R79007).
Em outra modalidade preferida da invenção, a ORF de PrP foi completamente deletada através de recombinação homóloga com "armadi- lhas" de "knockout" trazendo genes marcadores de seleção ou selecioná- veis, de modo que a expressão do marcador selecionável ou de seleção é acionada pelo promotor de PrP endógeno.
Em uma modalidade particularmente preferida, a linhagem de célula isenta de príon da modalidade (1) é a linhagem de célula 293F isenta de príon pf293F, a qual inclui todas as populações mistas intermediárias, clones isolados necessários para isolar a referida linhagem de célula com "knockout" final e modificações derivadas da mesma.
No método da modalidade (2) da invenção, os construtos com "knockout" podem ser adequados para deletar a ORF de PrP inteira em am- bos os alelos. Ainda, os construtos de "knockout" podem trazer os mesmos ou diferentes genes marcadores de seleção sem promotor flanqueados por duas seqüências homólogas ao sítio de inserção dentro do gene de PrP da célula inicial. Contudo, é preferido que os construtos de "knockout" tragam diferentes genes marcadores de seleção ou marcadores selecionáveis. Os construtos de "knockout" podem ainda trazer uma das seguintes seqüências 5 funcionais: uma seqüência poli A, seqüências de reconhecimento de recom- binase, IRES e similares.
As seqüências homólogas da construto de "knockout" podem ter um comprimento de 1 a 10 kb, de preferência de cerca de 6 kb e, de prefe- rência, correspondem às seqüências a montante e a jusante da ORF de PrP 10 da linhagem de célula inicial. Particularmente preferido é que as seqüências homólogas sejam aquelas mostradas em SEQ ID NOs: 2 e 3. Marcadores de seleção adequados codificam marcadores de seleção positivos incluindo, mas não limitado a, fosfotransferase de neomicina, zeocina, higromicina; e o marcador selecionável inclui marcadores de fluorescência, tais como GFP e 15 Dsred e enzimas, tal como LacZ.
É particularmente preferido que os construtos de "knockout" te- nham uma ou mais das seqüências mostradas em SEQ ID NOs: 1 e 16.
A invenção, além disso, é descrita através de referência à célu- las HEK 293 ou HEK 293F. Em tais linhagens de célula da invenção, a regi- ão de codificação do gene de PrP é completamente deletada por meio de captura de promotor. Três etapas consecutivas são necessárias para dele- ção da região de codificação do gene de PrP em células HEK 293F:
1. Direcionamento da região de codificação de PrP sobre um alelo com um construto de "knockout" de PrP (aqui depois "K.O.") contendo
um marcador de seleção de neomicina.
2. Identificação e isolamento de clones trazendo apenas um ale- lo de PrP direcionado e um alelo de PrP do tipo selvagem. Essa etapa é ne- cessária em virtude da heterogeneidade genética das células HEK 293F pa- rentais, as quais trazem 3 cópias do gene de PrP em 75% da população e 2
cópias em 25% da população.
3. Direcionamento da região de codificação de PrP sobre o alelo restante com um segundo construto de K.O. de PrP, nesse momento con- tendo um marcador de seleção de zeocina.
Após a transfecção estável do primeiro construto de K.O. de PrP (trazendo neomicina como o marcador selecionável, figura 2) em células HEK 293F, clones G418R foram isolados em várias concentrações diferentes 5 de antibiótico e selecionados através de uma estratégia baseada em PCR a qual identifica eventos direcionados (figura 4, figura 6). Clones trazendo inte- rações PrP-direcionadas foram, então, caracterizados através de análise de Southern blot genômica de forma a avaliar:
(a) se a integração do construto de direcionamento está correta em suas extremidades 5'e 3'
(b) quantos alelos de PrP foram direcionados (um, dois ou três) e quantos ainda estão intactos (tipo selvagem: um ou dois).
No segundo ciclo de K.O., o segundo construto de K.O. de PrP (trazendo zeocina ao invés de neomicina como o marcador selecionável) foi, 15 então, usado para realizar "knockout" do alelo de PrP restante naqueles clo- nes onde o alelo tinha sido direcionado com neomicina e o segundo alelo de PrP ainda estava intacto. Após varredura por PCR e análise de Southern genômica de clones zeocinaR isolados, a ablação completa do gene de PrP foi confirmada através de análise por RT-PCR para demonstrar a falta de 20 mRNA de PrP e através de análise de Western blot para mostrar a ausência completa da proteína de PrP.
A linhagem de célula com K.O. de PrP total resultante descrita na presente invenção pode, então, ser usada para expressão isenta de príon garantida de proteínas recombinantes humanas.
Durante o processo todo de transfecção, seleção por antibiótico,
isolamento de clone, varredura e expansão, as células foram cultivadas sob condições isentas de soro (por exemplo, em meio FreeStyIe ou meio particu- lar Octapharma). Após estabelecimento e caracterização genética e fenotípi- ca completa do clone de célula com K.O. de PrP final, um Banco de Célula 30 de Pesquisa foi gerado (vide métodos de cultura de célula de células 293F em 6.1 de Materiais e Métodos). Essa linhagem de célula com K.O. de PrP, aqui depois denominada "linhagem de célula 293F isenta de príon" pode, então, ser estavelmente transfectada com qualquer gene de interesse (por exemplo, Fator VIII, Fator IX, G-CSF, vWF, GM-CSF, Fator Vll/Vlla ou anti- corpos) completamente sob condições isentas de soro de acordo com o pe- dido de patente (vide EP 05 105 965 co-pendente, a divulgação do qual é 5 aqui incorporada em sua totalidade).
As células resultantes de tal transfecção estável realizada com células 293F isentas de príon que crescem rotineiramente em meio isento de soro e, por exemplo, com um construto pcDNA3.1 trazendo o gene de inte- resse são cultivadas em meio semissólido baseado em metil celulose con- 10 tendo um antibiótico apropriado para seleção de clone e um anticorpo rotu- lado para detecção dos maiores clones produtores via fluorescência. Gran- des números (por exemplo, dez mil) de clones são, então, analisados usan- do CIonePixFL (Genetix) com relação ao número de células e proteína re- combinante secretada de forma a selecionar subsequentemente apenas uns 15 poucos clones melhor produtores. Em contraste a outros métodos conheci- dos, onde clones não produtores e clones misturados são todos aleatoria- mente selecionados, o CIonePixFL permite identificação e seleção simultâ- neas dos clones de crescimento mais rápido os quais também são os maio- res produtores e os quais se originam de células únicas. As células selecio- 20 nadas são expandidas em lâminas de microtitulação e depois em tubos para centrífuga, frascos de cultura de célula e fermentadores sob condições isen- tas de soro para o procedimento todo.
Aqui também, todo o procedimento de transfecção estável é ge- rado sob condições isentas de soro. Adicionalmente, durante todo o proce- dimento seguinte de expansão e cultura de célula, as células não têm qual- quer contato com soro ou proteínas derivadas de animal.
Durante expansão, os melhores clones são selecionados com relação à robustez, alta taxa de crescimento, capacidade de escalonamento e produção, por exemplo, de proteína recombinante ativa, conforme medido 30 através de um teste ELISA. Durante essa seleção, o número é reduzido no- vamente para uns poucos melhores clones produtores. Além da produtivida- de, seqüência de cDNA correta, teor de mRNA e comportamento da célula quando de fermentação são critérios para identificar o(s) melhor(es) clone para subclonagem. Para isso, células do(s) clone(s) selecionado(s) são reco- locadas em lâminas, analisadas e selecionadas com CIonePixFL e, então, expandidas e selecionadas conforme descrito acima. Subclonagem é uma 5 etapa essencial de forma a selecionar apenas os melhores clones produto- res, eliminando possíveis variações genéticas na subpopulação do clone colocada na lâmina. Após subclonagem, o(s) clone(s) selecionado(s) é(são) testado(s) novamente sob condições isentas de soro. A proteína humana recombinante expressa pelo(s) subclone(s) selecionado(s) final é caracteri- 10 zada bioquimicamente em maiores detalhes.
Além disso, os clones com K.O. podem ser isolados em meio semissólido usando CIonePixFL com um anticorpo fluorescentemente rotu- lado que detecta clones nos quais o gene de PrP sofreu "knockout" comple- tamente.
Exemplos
Materiais e Métodos
1. Dispositivos usados para Técnicas de Biologia Molecular
Dispositivo Fornecedor Tipo Número de Comentários catálogo Câmara de eletrofo- BioRad SUB-CELL rese em gel de aga- GT rose Suprimento de ener¬ BioRad PAC 3000 gia para eletroforese UV-transiluminador Vilber Lourmat Centrífuga Heraeus Biofuge fres¬ Máximo de co 13,000 rpm Thermomixer Eppendorf 5436 Banho de água HAAKE Type 002- 9917 Incubadora a 37°C Menmert Modelo 300 Refrigerador Liebherr - +2-8°C Freezer Liebherr - -20°C Continuação...
Sistema de água Millipore Milli-Q pura Pipetas de transfe¬ Gilson P2, P20, - - rência P200, P1000 Pontas amarelas Josef Peske -200 μΙ oHG Pontas azuis Josef Peske -1000 μΙ oHG Pontas de filtro, 5 a Peske (ΜμΙίί) Rack de im, 1491-11 250 μΙ estéril Pontas de filtro, 100 Peske (ΜμΙίί) Rack im, 1420-111 a 1000 μΙ estéril espectrofotômetro Beckman DU 530 Sistema de docu¬ BioSciTec. Gelscript mentação em gel Science Group versão 1.1 Lâmina de 1 μΙ Ibidi ibiT reat 81826 2. Reagentes e Kits para técnicas de Biologia Molecular
Reagente Fornecedor Número de Condições de Comentários pedido armazenamento Pfx polimerase Invitrogen 11708-013 -20°C Notl NEB R0189S -20°C EcoRI NEB R0142S -20°C Kpnl NEB R0142S -20°C Notl NEB R0146S -20°C Sistema Concert® GIBCO 11453-024 TA Rapid Plasmid Mini- prep Kit de purificação por Qiagen 28104 TA PCR QIAquick Kit de Extração em Qiagen 28704 TA Gel Qia Quick Mistura DNA Ladder MBI SM0331/3 -20°C Continuação...
SmartLadder Eurogentec MW-1700- -20°C 07 agarose Sigma A9539 TA Triptona Sigma T9410 TA Extrato de levedo GIBCO 30393-029 TA NaCI Roth 9265.1 TA Agar Sigma A5054 TA T4 Iigase NEB #M0202S -20°C Células supercompe- Stratagene 200152 -80°C tentes SURE 2 Células competentes Invitrogen 44-0300 -80°C One shot Top10F’ Kit HiSpeed Plasmid Qiagen 12643 TA Midi Kit EndoFree Plasmid Qiagen 12362 TA Maxi Kit DNAeasy Blood & QIAGEN 69504 TA Tissue Kit Gentra Puregene QIAGEN 158767 TA Cell 3. Meio de crescimento bacteriano
Meio LB: 10 g de Triptona, 5 g de Extrato de Levedo, 10 g de NaCI1 dissolvido em 1 I de H2O1 então, submetido à autoclave.
Lâminas de agar LB/amp: agar a 1,5% em meio LB contendo
100 pg/ml de ampicilina.
4. Materiais para cultura de células 293/293F
4.1. Linhagens de célula
Linhagem de célula 293: A linhagem de célula 293 é uma Iinha- gem de célula permanente a qual cresce aderentemente na presença de soro. Ela foi estabelecida a partir de rim humano embriônico primário trans- formado com DNA de adenovírus do tipo 5 humano cisalhado (Graham e outros, 1977; Harrison e outros., 1977). O gene de adenovírus E1A é ex- presso nessas células e participa da transativação de alguns promotores virais, permitindo que essas células produzam níveis muito altos de proteína.
Linhagem de célula 293F: A linhagem de célula FreeStyIe 293F 5 é uma variante da linhagem de célula 293 que foi adaptada ao crescimento em suspensão em meio de expressão FreeStyIe 293. A linhagem de célula original foi obtida de Robert Horlick na Farmacopéia em 1988. A linhagem de célula FreeStyIe 293F é derivada da linhagem de célula 293 e se destina a ser usada com o sistema de expressão FreeStyIe 293 (Invitrogen Catálogo 10 n° K9000-01) disponível da Invitrogen ou outro meio isento de soro, tal como o meio particular Octapharma. As células FreeStyIe 293F são adaptadas à cultura em suspensão em meio de expressão FreeStyIe 293. A linhagem de célula FreeStyIe 293F exibe as seguintes características:
- Preparada a partir de culturas do Máster Cell Bank de baixa passagem derivadas de células 293F parentais que foram reclonadas atra- vés de diluição limitativa. As culturas derivadas de clones 293 são mantidas em condições isentas de soro durante apenas 30 a 35 passagens no total.
- Adaptada a crescimento em suspensão em alta densidade, i- sento de soro; pode ser mantida em meio de expressão FreeStyIe 293.
- Alta eficiência de transfecção com 293fectin.
- Culturas em suspensão podem ser transfectadas em Meio de Expressão FreeStyIe 293 sem a necessidade de trocar de meio.
- Permite a transfecção de células em grandes volumes.
4.2. Dispositivos para cultura de células 293/293F
Dispositivo Fornecedor Tipo Número Comentários de catᬠlogo Vaporizador esté¬ Heraeus HeraSafe ril Incubadora Kendro BDD6220 - CN O O ^ N- ^ Λ OO Continuação...
Agitador orbital GFL 3005 Colocado em uma incuba¬ dora de CO2 Incubadora com KuhnerAG ISF-W-1 SM1503 agitador de CO2 Microscópio Zeiss Axiovert 25 - - Centrífuga Kendro Megafuge 1.0 - Refrigerador Liebherr 200381 - +2-8°C Congelador a - Liebherr 20°C Congelador a - Heraeus HFC 586 Ba¬ - - 80°C sic Banho de água Memmert WB 14 - - GmbH Hemocitômetro Peske Neubauer Im- Profundidade (Neubauer) proved de 0,100 mm 0,0025 mm2 Lamínula de vidro Peske 03-0000 20 x 26 x 0,4 para hemocitôme¬ mm tro Contador manual Rexel, Reino ENM - - de células Unido Banho de isopro- Nalgene Recipiente de 5100- A ser enchido panol congelamento 0001 com 250 ml a 1°C de isopropa- nol Biostore (nitrogê¬ Air liquide Arpege 110 nio líquido, sub¬ mersão) Frascos de Er- Corning 125, 250, 500, 431143- Policarbonato lenmeyer, uso 1000 ml com 431147 único tampa com abertura para filtro Continuação...
Pipetas de uso Schubert & 9.380.431 único 1 mL Weiss Pipetas de uso Falcon/Costar - 356507 - único 2 mL Pipetas de uso Nunc - 159625 - único 5 mL Pipetas de uso Nunc - 159633 - único 10 mL Pipetas de uso Nunc - 159641 - único 25 mL Pipetas de uso Nunc - 159668 - único 50 mL Auxiliar de pipete- Sigma-Aldrich Accujet 356555 - amento Tubos de centri- Peske 17-1200 Embalado fugação de 15 ml estéril Tubos de centri- Peske 17-1020 Embalado fugação de 50 ml estéril Rótulos adesivos CILS Rótulos de LSL7-W- para criofrascos autolaminação 5-TN finos Criofrascos Simport plas- T-311-2 1,8 ml tics (CAN) Rack de manipu¬ TPP 100 x 200 x 99016 Veja figura 1 lação para crio¬ 25 mm de SOP frascos Criocaixas Simport 136x136x T314- 50 mm 2100 Fotômetro Dynex MRX Espectrofotômetro Beckman DU530 Microscópio de Olympus BX-41 fluorescência 4.3. Reaqentes para cultura de células 293/293F
Reagente Fornecedor Número de Condições de Comentários pedido armazenamento Meio de cultura isen¬ Invitrogen 12338-026 +8°C no escuro “ to de soro FreeSt- yle293 Lipofectami- Invitrogen 12566-014 4°C ne2000CD OptiProSFM Invitrogen 12309-019 4°C DMSO Sigma D-2650 temperatura Não armaze¬ ambiente, escu¬ nar a +8°C ro ou mais ge¬ lado, uma vez que o material co¬ meça a cris¬ talizar Etanol a 80% + MEK Zefa ADR §/36 temperatura Para desin- a 1% ambiente fecção Isopropanol 100% Sigma Al- I0398 temperatura Para banho p.a. drich ambiente, ar¬ de isopropa- mazenar venti¬ nol lado para sol¬ ventes inflamᬠveis Opti-MEM I Invitrogen 51985-034 +8°C no escuro - Zeocina Invitrogen R250-01 A-20°C - G418 PAA P11-012 A 4°C - Lipofectamin 2000CD Invitrogen 12566-014 4°C OptiPRO SFM Invitrogen 12309-019 4°C Colcimid Biochrom L6221 -20°C AG Tween 20 Sigma P9416 RT Albuminative a 40 g/l Octapharma Batch N0: 4417136161 4.4. Reaqentes para FISH. Imunocoloração e ELISA
Reagente Fornecedor Número de Condições de Comentários Pedido armazenamento Sonda de coloração Aquarius LPP20G -20°C de cromossoma intei¬ ro Chromosome 20 DAPI Antifade Aquarius DES 150L -20°C Protein Assay (Brad- BioRad 500-0006 4°C ford) Kit Príon Protein EIA SpiBio 589751 -20°C 3F4 (primeiro Ab) Sigma 054K1525 -20°C FITC - anticamun- Novus NB720-F 4°C dongo de cabra (se¬ gundo Ab) SAF32FITC (1,3 Spibio Sem n° de -20°C mg/ml) pedido SAF32 (200 pg) Spibio Sem n° de -20°C pedido POM 17 (1 mg/ml) Dr.Aguzzi -20°C Lab, Zurique, ETH POM 12 (1 mg/ml) Dr.Aguzzi -20°C Lab, Zurique, ETH 4.5. Meio inicial e de crescimento padrão para células 293F
Meio FreeStyle293, sem aditivos.
O meio de expressão FreeStyIe 293 permite crescimento, manu- 5 tenção e transfecção de células FreeStyIe 293F. Meio de expressão FreeSt- yle 293 disponível da Invitrogen é uma formulação isenta de soro, definida, especificamente desenvolvida para a cultura em suspensão em alta densi- dade e transfecção de células 293. O meio não contém componentes origi- nários de animal ou ser humano e é formulado com Glutamax-I para aumen- 10 tar a estabilidade e maximizar a vida útil.
4.6. Meio de congelamento para células 293F
Meio FreeStyle293 + DMSO a 10%.
5. Métodos de Biologia Molecular 5.1 Isolamento de DNA genômico de péletes de célula com o kit QIAGEN DNAeasy Blood & Tissue (cat N0 69504) ou o kit Gentra Cell (QIAGEN Cat N0 158767) para análise por PCR e Southern.
5.2 Isolamento de DNA genômico de uma lâmina com 96 cavidades para análise por PCR:
• As células foram enxaguadas duas vezes com PBS.
• Adicionar 50 μΙ de tampão de Iise (0,6 ml de proteinase K deve- rão ser adicionados a 12 ml de tampão de Iise [Tris a 10 mM, 10 mg de ED- TA, NaCI a 10 mM, sarcosila a 0,5%] a cada cavidade de acordo com a tabe-
Ia a seguir.
• Incubar as lâminas durante a noite a 50 0C, as lâminas deverão ser cobertas com Parafilm.
• Centrifugar a 2500 rpm durante 1 min. Adicionar 100 μΙ de Na- CI/EtOH (150 (I de NaCI a 5M a 10 ml de etanol absoluto gelado) a cada ca-
vidade e agitar a lâmina durante 20 min em temperatura ambiente. Os áci- dos nucleicos se precipitam como uma rede filamentosa.
(Centrifugar a 2500 rpm durante 1 min, inverter a lâmina cuida- dosamente para descartar a solução; os ácidos nucleicos permanecem pre- sos à lâmina. Secar o excesso de líquido sobre toalhas de papel.
(Enxaguar o ácido nucleico 3 vezes pingando 100 (I de etanol a
80% por cavidade usando uma pipeta multi-canais. Agitar a lâmina durante 30 min durante cada etapa de lavagem. Centrifugar a 2500 rpm durante 1 min e descartar o álcool cuidadosamente invertendo a lâmina cada vez.
(Dissolver o DNA genômico em 50 (I de TE e cobrir com Para-
film. A lâmina foi colocada na incubadora a 37 oC durante a noite ou 1-2 ho- ras a 50 oC para dissolver completamente.
• Armazenar a lâmina com DNA genômico a 4 0C para uso ou a - 20 0C para armazenamento.
6. Transfecção de células com Lipofectamin 2000CD:
Antes de começar, certificar-se de que as células são saudáveis e >90% vi- áveis.
1. Um dia antes de transfecção, preparar uma cultura em sus- Tl pensão com uma densidade celular de 0,8-1,1 x 106 células/ml em meio de crescimento sem antibióticos.
2. No dia de transfecção: preparar uma cultura em suspensão com 1,1 x 106 células viáveis/ml.
3. Para cada transfecção, preparar complexos usando as se-
guintes quantidades e volumes de reagente para cada ml de células trans- fectadas com ou sem Albuminative como suplemento no meio de crescimen- to:
• Diluir 0,5 a 1,5 μg de DNA em 34 μΙ de OptiMEM® SFM ou OptiPRO® SFM · Diluir 1-10 μΙ de Lipofectamin® 2000 CD em 34 μΙ de OptiMEM® SFM ou OptiPro® SFM
4. Adicionar os complexos ao frasco/lâminas contendo células e
meio.
5. Incubar as células sobre as lâminas a 37 0C ou cultivar em suspensão sobre um agitador orbital girando a 125 rpm durante 24 a 96 h
em uma incubadora com CO2.
6.3. Seleção da transfecção. expansão da cultura, cultura de células sobre lâminas com 96 cavidades e preparo para seleção de clone com CIonePix- FL:
1. Após transfecção, os antibióticos zeocina ou G418 foram adi-
cionados à cultura transfectada para seleção.
2. Após seleção, as células resistentes a antibiótico foram cole- tadas para isolamento de DNA genômico e selecionadas através de análise por PCR.
3. A cultura com resultado de seleção positiva por PCR foi ex-
pandida para atingir 5 x 105 células/ml.
4. Cultivar as células em uma lâmina com 96 cavidades com 1000 células/cavidade com meio de crescimento.
5. Preparar lâminas repetidas para PCR e congelamento de cé- lula, se a densidade celular atinge 50%.
6. No caso em que uma densidade celular de 80% foi atingida, a lâmina está pronta para seleção por PCR. 7. Empoçar as células positivas por PCR e cultivar novamente em 200 a 250 células por cavidade em uma lâmina com 96 cavidades; ou expandir as células positivas por PCR separadamente e cultivar 200 a 250 células/cavidade em uma lâmina com 96 cavidades.
8. Preparar lâminas repetidas para PCR e congelamento de cé-
lula se a densidade celular atinge 50%.
9. No caso em que uma densidade celular de 80% foi atingida, a lâmina está pronta para seleção por PCR.
10. Expandir as células positivas por PCR para 5 x 105 célu- Ias/ml para teste de cultura.
11. Cultivar as células em diferentes densidades em Meio Se- missólido para descobrir a melhor densidade celular, de modo que colônias únicas possam ser selecionadas através de CIonePixFL sem tocar outras colônias.
12. Selecionar colônias de células únicas com CIonePixFL.
13. Sincronizar e expandir as colônias selecionadas em uma lâ- mina com 96 cavidades, preparar réplicas a partir de células para congela- mento e análise por PCR.
7. Análise de FISH: Determinação do número de cromossomas 20 em célu- Ias 293F e células pf293F:
Antes de começar, certificar-se de que as células são saudáveis e >85% viáveis.
1. Preparar uma cultura em suspensão com uma densidade de células de 1-3 x 106 células em 5-10 ml de meio de crescimento.
2. Adicionar 0,2 μg/ml de Colcemid ao meio e incubar sobre um
agitador orbital girando a 125 rpm durante 30 minutos a 1 hora.
3. Coletar as células através de centrifugação a 1100 rpm duran- te 10 minutos.
4. Remover o excesso de sobrenadante para 500 μΙ e resuspen- der o pélete.
5. Incubação de 8 a 10 minutos em 5 a 10 ml de KCI a 75 mM em temperatura ambiente. O primeiro ml de solução de KCI deverá ser for- necido gota a gota às células.
6. Adicionar 2 a 3 ml de solução fixadora e centrifugar a 1100 rpm durante 10 minutos.
7. Transferir pélete de célula para um pequeno frasco para mi- crocentrífuga e fazer todas as subsequentes lavagens de fixador nesse fras- co. É importante que as células estejam completamente resuspensas.
8. As células são lavadas 3 a 6 vezes em solução fixadora, após cada etapa de lavagem centrifugar as células durante 1 minuto a 6000 rpm em uma microcentrífuga.
9. As lâminas devem estar em temperatura ambiente, passar a
lâmina através de vapor quente durante 2 a 3 minutos para umidificar a su- perfície (banho de água a 75 a 80 0C).
10. Colocar 10 a 30 μΙ de suspensão de célula sobre a lâmina, não deixar o líquido secar.
11. Após a superfície se tornar granular, passar a lâmina nova-
mente durante 1-2 segundos através de vapor quente.
12. Secar imediatamente a placa de metal realizando um gradi- ente de temperatura através de sua superfície.
13. Incubar as lâminas durante 2 a 3 dias em temperatura ambi-
ente ou incubar as lâminas durante a noite a 65 0C.
14. Submergir as lâminas em 2X SSC, pH de 7,0 durante 2 mi- nutos.
15. Desidratar as lâminas em uma série de etanol (70%, 85% e 100%), cada um durante 2 minutos.
16. Remover a sonda (sonda de coloração de cromossoma, Cy-
tocell/Aquarius, LPP20G) a partir de -20 0C e deixar aquecer para a tempera- tura ambiente.
17. Assegurar que a solução de sonda está uniforme através de mistura repetida com uma pipeta.
18. Remover 5 a 10 μΙ de sonda e colocar sobre a lâmina, cobrir
com uma lamínula de vidro de 24 x 24 mm e vedar com cola de solução de borracha ou esmalte de unha. 19. Desnaturar a 75 0C (+/-1 0C) durante 2 minutos e hibridizar a 37 0C (+/- 1°C) durante a noite.
20. Remover a lamínula e todos os vestígios de cola cuidadosa- mente.
21. Lavar a lâmina em 0,4 X SSC (pH de 7,0) a 72°C (+/- 1°C)
durante 2 minutos.
22. Drenar a lâmina e lavar em 2XSSC, Tween20 a 0,005% (pH de 7,0) em temperatura ambiente durante 30 segundos.
23. Drenar a lâmina e aplicar 10 μΙ de DAPI antifade.
24. Cobrir com uma lamínula e deixar a cor se desenvolver no
escuro durante 10 minutos.
25. Observar com um microscópio de fluorescência.
8. Imunocoloração: Análise da quantidade de proteína de PrP sobre a super- fície celular de células 293F e células pf293F:
Antes de começar, certificar-se de que as células são saudáveis
e >85% viáveis.
1. Cultivar 1-3 x 105 células por cavidade (lâmina de 1 μ, Ibidi) em 30 a 100μΙ de meio de crescimento e incubar durante a noite a 37°C.
2. Se as células crescem bem e se tornam aderentes, começar a
coloração.
3. Aspirar cuidadosamente o meio de cultura e enxaguar as célu- las cuidadosamente com PBS, não agitar.
4. Adicionar fixador gelado (Etanol a 50%, Metanol a 50%) du- rante 1 minuto em temperatura ambiente.
5. Lavar imediatamente as células duas vezes durante 5 minutos
com PBS.
6. Cobrir as células com BSA a 8%/PBS e incubar durante 1 ho- ra em temperatura ambiente. Realizar a incubação em uma câmara vedada à umidade para impedir secagem das células fixadas pelo ar.
7. Lavar as células duas vezes durante 5 minutos com 1x PBS.
8. Remover gentilmente o excesso de PBS e cobrir as células com anticorpo primário (3F4, POM12, POM17, SAF32, SAF32FITC, 6H4) diluído em BSA a 1%/PBS e incubar durante 1 a 2 horas em temperatura ambiente. Realizar a incubação em uma câmara vedada à umidade para impedir secagem das seções teciduais pelo ar.
9. Lavar as células duas vezes com PBS durante 5 minutos.
10. Remover gentilmente o PBS em excesso e cobrir as células
com anticorpo secundário (FITC - anticamundongo de cabra) diluído em BSA a 1%/PBS durante 1 a 2 horas em temperatura ambiente. Realizar a incuba- ção em uma câmara vedada à umidade para impedir secagem das seções teciduais pelo ar.
11. Lavar as células com PBS três vezes durante 5 minutos no
escuro.
12. Adicionar Dapi-anti-fade à lâmina, montar sobre uma lamínu- la e examinar o espécime sob um microscópio de fluorescência.
9. Ensaio ELISA: Quantificação dos níveis de proteína de PrP em células 293F e células pf293F contendo um ou dois alelos de PrP:
1. Coletar 2 x 107 células e centrifugar a 800 rpm durante 5 minu- tos.
2. Remover o meio.
3. Lavar as péletes de célula com 5 ml de PBS gelado.
4. Centrifugar as células a 800 rpm durante 5 minutos.
5. Remover o PBS.
6. Lavar o pélete de células com 1 ml de PBS gelado e centrifu- gar a 6000 rpm durante 5 min, remover o PBS.
7. O pélete de células pode ser submetido à Iise diretamente ou congelado para armazenamento a -80 0C.
8. 1000 μΙ de tampão de Iise gelado são adicionados ao pélete
de células.
9. Passar os Iisatos através de agulhas de seringa com calibre
20, 23 e 26.
10. A concentração de proteína dos Iisatos de célula foi medida
através do Ensaio de Bradford. Exemplo 1: Descrição detalhada para o primeiro ciclo de "knockout" com o construto de K.O. de PrP pBS_Neo_P‘ R+L_Braço_2B (SEQ ID NO:1) contendo neomicina
A. Estratégia de direcionamento:
5 Expressão de PrP será completamente anulada em células HEK
293 ou HEK 293F humanas por meio de uma armadilha de promotor. Essa estratégia (esboçada na figura 1) foi criada para selecionar especificamente aquelas células nas quais a ORF do gene de PrP é substituída pela ORF de fosfotransferase de neomicina (exceto o códon de início de tradução, o qual pertence ao gene de PrP).
O construto de plasmídeo 2B (representado na figura 2) consiste em 4 componentes principais: a parte principal do vetor (não-representada na figura): pBluescript, 2. Um cassete truncado "neo"(= fosfotransferase de neomicina), consistindo da ORF completa para esse gene, exceto seu pró- 15 prio códon de início de tradução, seguido por um sinal de término de trans- crição (veja SEQ ID NO. 1). Problemas críticos: esse cassete truncado de neo não traz qualquer promotor em si. A ORF de neo foi criada para ser tra- duzida a partir do códon ATG inicial o qual pertence ao gene de PrP. 3. Uma região de "braço esquerdo" a montante de neo, com seqüência idêntica ao 20 íntron de PrP localizado entre E2 e E3 (veja SEQ ID NO. 2). 4. Uma região de "braço direito" localizada a jusante de neo, com seqüência idêntica à re- gião de PrP a jusante da ORF de PrP (veja SEQ ID NO. 3).
Quando (a) de transfecção desse construto nas células hospe- deiras 293F, (b) subsequente integração em seu genoma e (c) seleção com 25 G418, o objetivo dessa abordagem foi enriquecimento daquelas células nas quais recombinação homóloga (simbolizada na figura 1 por dois "X" em pre- to) resulta em integração da ORF de neo a jusante das seqüências regulató- rias de transcrição e tradução de PrP (P, E1, E2).
Apenas aquelas células transfectadas nas quais o construto se integrou a jusante de um promotor funcional sobreviverão à seleção com G418. Portanto, espera-se que todas as células sobreviventes tragam inte- rações a jusante de promotores funcionais (consequentemente, "armadilha de promotor"). Em virtude da longa homologia dos braços do construto ao gene de PrP (no total, seqüência homóloga de ~6 kb), espera-se que re- combinação homóloga objetiva especificamente essa integração no Iocus de PrP1 resultando na integração representada na terceira fileira da figura 1.
B: Geração do construto de K.O. de direcionamento de PrP (pBS Neo P~ R+L Braco 2B>:
A geração do construto de direcionamento consiste em três eta- pas de clonagem consecutivas (figura 3), cada uma das quais inclui: uma etapa de amplificação por PRC para produzir um "inserto", uma etapa de 10 ligação de tal inserto em um vetor e transformação da mistura de ligação em E. coli e seleção de clones corretos através de digestão com enzima de res- trição.
1. Geração do construto pBS_Neo_P-_2B:
A ORF de neo foi amplificada através de PCR usando, como um modelo, o vetor pcDNA3.1+ (Invitrogen) usando os seguintes oligonucleotí- deos sintéticos:
2B-Neo-F: 5’-
GGCAAGAATTCGOIGAGCAGT CATT ATGATT GAACAAGAT GGATT GCAC
- GCAG -3’ (SEQ ID NO. 4)
2B-Neo-R: 5’- Ggaccgctcgag-Atgcttccggctcgtatgttgt-S1
(SEQ ID NO. 5),
os quais têm sítios de restrição EcoRI e Xhol (sublinhados). O produto ampli- ficado (1244 bp) foi digerido com EcoRI e Xhol e ligado no pBluescript Il KS+ digerido com EcoRHXhoI (Stratagene). A mistura de ligação foi, então, trans- 25 formada em células competentes One shot ToplOF’ (Invitrogen). Seleção foi realizada através de digestão por restrição com EcoRI/Xhol do DNA de plasmídeo preparado a partir de colônias individuais.
2. Geração do construto pBS_Neo_P-_L_Braço_2B:
O braço esquerdo do construto de direcionamento foi amplifica- do através de PCR usando, como um modelo, o clone 186 de DNA de BAC (BACPAC Resources Center, BPCR, http://bacpac.chori.org/) e os seguintes oligonucleotídeos sintéticos: 2B-L-F: 5’- GGCAAGCGGCCGC-CTCTGTCTAGGAACACTGCTGTG-3’ (SEQ ID NO. 6)
2B-L-R: 5’- GGCAAGAATT C-AAAAT GAAGAG GAGAAC GT CAGAGT C-3’ (SEQ ID NO. 7),
os quais têm sítios de restrição Notl e EcoRI, respectivamente (sublinhados). O produto amplificado (1929 bp) foi digerido com EcoRI e Notl e ligado no pBS_Neo_P-_2B digerido com EeoRI/ Noti A mistura de ligação foi, então, transformada em células competentes One shot ToplOF’ (Invitrogen). Sele- ção foi realizada através de digestão por restrição com EcoRIINotI do DNA 10 de plasmídeo preparado a partir de colônias individuais.
3. Geração do construto pBS_Neo_P-_R+L_Braço_2B:
O braço direito do construto de direcionamento foi amplificado através de PCR usando, como um modelo, o mesmo clone 186 de DNA de BAC conforme em B.2 acima e os seguintes oligonucleotídeos sintéticos:
2B-R-F: 5’- GGACCGCTCGAG-T GT GT ACCGAGAACT GGGGT GAT G-3’ (SEQ ID NO. 8)
2 B-R-R: 5’- GGCGGGGTACC-GCAGAAT CT CT GAGCT CACCT CAG-3’ (SEQ ID NO. 9),
os quais têm sítios Xhol e Kpnl, respectivamente (sublinhados).
O produto amplificado (4,6 Kb) foi digerido com Xhol e Kpnl e
ligado no pBS_Neo_P-_L_Braço_2B digerido com Xhol / Kpnl. A mistura de ligação resultante foi, então, transformada em células supercompetentes SURE 2 (Stratagene). Seleção foi realizada através de digestão por restrição com Xhol/Kpnl do DNA de plasmídeo preparado a partir de colônias indivi- 25 duais. No construto resultante, pBS_Neo_P-_R+L_Braço_2B (seqüência da região clonada apresentada em SEQ ID NO. 1), a ORF de neo (cassete de seleção sem qualquer seqüência promotora e sem seu próprio códon de iní- cio de tradução) foi flanqueada:
- a montante pela região intrônica a qual, no genoma humano, precede o éxon 3 do gene de PrP; e
- a jusante pela região de PrP a qual, no genoma humano, se- gue a ORF de PrP. 4. Linearização do construto pBS_Neo_P-_R+L_Braço_2B:
O construto de direcionamento foi Iinearizado através de diges- tão por restrição com Kpnl, purificado usando o kit de extração em gel QIA Quick (veja Métodos de Biologia Molecular, 5.2) e, então, quantificado pas- sando uma alíquota de 1 μΙ sobre um gel de agarose a 0,8% junto com 5 μΙ de marcador SmartLadder (Eurogentec).
C. Introdução do construto pBS Neo P- R+L Braço 2B em células huma- nas:
O construto de direcionamento pBS_Neo_P-_R+L_Braço_2B foi 10 introduzido nas células hospedeiras (293F, Invitrogen) usando o reagente Lipofectamin 2000CD (Invitrogen, veja método de transfecção, 6.2). 48 h após transfecção, as células foram colocadas sobre discos de 10 cm em uma densidade entre 1,25 e 1,5 x 106 células. Seleção com antibiótico foi iniciada no momento de cultura em concentrações oscilando entre 30 e 120 15 μg de G418/ml. Troca de meio foi realizada a cada dois/três dias durante 14 a 21 dias.
D. Seleção de clones direcionados:
Quando as células atingiram a confluência sob seleção com an- tibiótico, DNA genômico foi preparado, quer a partir de 1 x 106 a 1 x 107 célu- 20 Ias G418r usando o kit de tecido QIA DNAeasy (veja Métodos de Biologia Molecular, 5.3) ou usando um método previamente descrito desenvolvido para preparar DNA genômico de células de ES colocadas sobre lâminas com 96 cavidades (Ramirez-Solis e outros, 1992). De cada preparado de DNA genômico, uma mistura de PCR foi preparada contendo 80 a 300 ng de 25 DNA genômico, 1x tampão de PCR, cada iniciador de oligonucleotídeo a 200 nM, MgCI2 a 5 mM, dNTP a 200 nM e 1,33 unidades de Expand Fidelity Polymerase (Roche). A seqüência dos oligonucleotídeos sintéticos usados para seleção era como segue:
K.O.-F1: 5' CGACTCAGTGTCATTCCCTGCAGTCTC 3' (SEQ ID NO. 10)
K.O.-R1: 5' CATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAG 3' (SEQ ID NO. 11)
Os parâmetros de ciclo foram como segue: 94°C 2 min; [94°C, 15 s; 71,6°C, 30 s; 72°C 100 s] x16 ciclos; [94°C, 15 s; 71,6°C, 30 s; 72°C 100 s + 3 s a mais em cada ciclo sucessivo]x26 ciclos; 72°C 7 min. Amostras de DNA genômico que proporcionam um produto de PCR de 2,3 kb indicam a presença de um ou vários alelos direcionados na população de célula. Clones direcionados foram ainda analisados através de análise de Southern 5 blot.
E. Caracterização de clones direcionados trazendo um alelo de PrP direcio- nado:
1. Seleção por PCR genômica (figura 4):
DNA genômico foi isolado de populações de célula mistas ou colônias de células isoladas conforme descrito em D acima. Todas as rea- ções de PCR para seleção de K.O. de PrP foram realizadas com controles positivos e negativos. O modelo para o controle positivo foi 200 ng de DNA genômico de uma mistura de população de célula na qual um alelo de PrP direcionado tinha sido previamente detectado com o método de seleção por PCR de K.O. de PrP; o controle negativo usado foi água ao invés de DNA genômico como um modelo. O aparecimento de um produto de PCR de 2,2 kb sobre o gel de agarose após eletroforese indica que a colônia de célula correspondente traz pelo menos um alelo de célula de PrP direcionado. Com esse método, os clones selecionados através de CIonePixFL foram analisa- dos e os resultados são mostrados na figura 6.
2. Análise de Southern genômica (figura 7):
Clones de célula 293F com PrP direcionado identificados através de PCR genômica, conforme descrito acima, foram ainda geneticamente ca- racterizados através de análise de Southern blot. Após separação eletroforé- 25 tica de DNA genômico digerido com EcoRI e transferência capilar para membranas Hybond+, as blots foram radioativamente hibridizadas com son- das de DNA especificamente criadas (representadas como setas vermelhas na figura 5) de forma a verificar a integração correta e intacta da ORF de neo. Sondas 5’- e 3’- são homólogas às regiões externas 5’- e 3’- do sítio de 30 integração esperado. A Neo-sonda é usada para verificar se o construto de K.O. está integrado no Iocus alvo ou apenas aleatoriamente. As sondas 5’- e 3’- foram geradas através de amplificação por PCR usando o clone 186 de DNA de BAC descrito na seção B.2 desse exemplo. A sonda Neo foi amplifi- cada a partir do plasmídeo pcDNA3.1(+), o qual inclui um cassete de neomi- cina, resumido na tabela a seguir: _
Nome Comprimento Seqüência dos iniciadors de PCR Padrão de Sou¬ da son¬ da sonda de para sondas de DNA thern esperado da DNA para células com PrP dire¬ cionado sobre um alelo 5’-sonda 251 bp 5-K.O.-F1 (SEQ ID N0 12): 4,2 kbe 10,8 kb 1 5'-AGCTTTACCGTCCAGTCTTC-3’ 5-K.O.-R1 (SEQ ID N0 13): 5’-GGTCTTGATGGCGATAACTC-3’ 5’-sonda 252 bp 5-K.O.-F2 (SEQ ID N0 14): 4,2 kbe 10,8 kb 2 5’- GAGTTATCGCCATCAAGACC-3’ 5 -K.O.-R2 (SEQ ID N°15): 5’- CATGAGAACCAACGCTAGAG-3’ New 3’- 288 bp Nova-3’-sonda-dianteira (SEQ ID N0 28): 6,5 kbe 10,8 kb sonda 5’- CTAGAGGTCCAGGTCATCTTG -3’ Nova-3’-sonda-reversa (SEQ ID N0 29): 5’- TCAGGGAAATTGGGGATCCTG-3’ Neo- 304 bp Neo-Sonda-F (SEQ ID N0 21): 6,5 kb sonda 5’-AGCGAGCACGT ACT CGGAT G-3’ Neo-sonda-R (SEQ ID N°22): 5’-AAGCACGAGGAAGCGGTCAG-3’ A estratégia de Southern genômica com o construto pBS_Neo-
5 _P-_L+R_Braço_2B é representada na figura 5. Após digestão genômica com EcoRI e hibridização radioativa, clones de PrP direcionados mostram uma banda de 4,2 kb com a sonda 5-DNA e uma banda de 6,5 kb com a sonda 3’-DNA, enquanto que a banda do tipo selvagem do alelo não direcio- nado, detectada com qualquer sonda, é de 10,8 kb. Com a Neo-sonda, uma 10 banda de DNA de 6,5 kb deverá ser detectada para o alelo direcionado de PrP e nenhuma banda deverá ser detectada para as células 293F do tipo selvagem.
Clones mostrando o padrão correto em PCR e Southern blot com todas as 3 sondas foram identificados como células com K.O. de PrP direcionado sobre um alelo. Esses clones positivos foram ainda analisados com FISH, ELISAe imunocoloração. 3. Análise de FISH (figura 8):
O gene de PrP humano está localizado sobre o cromossoma 20. Células 293F foram hibridizadas com uma sonda WCP (coloração de cro- mossoma inteiro) para coloração do cromossoma 20. Essa análise por FISH 5 mostra que 25% das células 293F do tipo selvagem têm 2 cópias do cro- mossoma 20, enquanto que 75% das células 293F trazem 3 cópias do cro- mossoma 20. Tecnicamente, é muito difícil e quase impossível realizar a inativação "knockout" de 3 genes de PrP usando as tecnologias atuais. Por- tanto, análise por FISH com a sonda de coloração chr20 WCP ajuda a dis- 10 tinguir se os clones de célula já trazendo um alelo de PrP direcionado têm dois ou três cromossomas 20. Adicionalmente, uma sonda de clone 186 de DNA de BAC, a qual abrange mais de 100 kb, incluindo o gene de PrP e é uma parte do cromossoma 20, também foi usada para hibridização de FISH para detecção de possíveis deleções e translocações de cromossoma.
Três padrões de FISH diferentes puderam ser observados para
linhagens de célula com K.O. de PrP após a integração direcionada do 1o construto de K.O. pBS_Neo_P-_R+L_braço_2B:
a. Dois cromossomas/metáfase foram corados com a sonda cromossoma 20 e ambos mostraram o sinal de BAC (figura 8a).
b. Três cromossomas/metáfase foram corados e todos três mos-
travam o sinal de BAC (figura 8b).
c. Três cromossomas/metáfase foram corados (um cromossoma apenas parcialmente em virtude de uma translocação de um braço do cro- mossoma 20 para outro cromossoma) e apenas os dois cromossomas 20 completos mostraram o sinal de BAC (figura 8c).
A análise estatística para várias linhagens de célula com K.O. de PrP é re- sumida na tabela a seguir:
Linhagem 2 x chr. 20 3 x chr20 3 x chr. 20 outros N0 total de de célula 2xBAC 3 x BAC 2 x Bac células a- (padrão a) (padrão b) (padrão c) nalisadas K.O. 1 4 (12%) 1 (3%) 29 (85%) --- 34 K.O. 2 --- 22 (69%) 10(31%) --- 32 Continuação...
K.O. 3 2 (5%) 35 (87%) ~ 3 (8%) 40 K.O. 4 11 (27,5%) 28 (70%) --- 1 40 (2,5%) K.O. 5 --- 4(15%) 21 (78%) 2(7%) 27 K.O. 6 --- 1 (4%) 23 (96%) --- 24 Células com K.O. com dois sinais de BAC foram tomadas para
"knockout" do segundo gene de PrP, a despeito da existência de duas ou três cópias de chr20 por célula. Portanto, as duas linhagens de célula com K.O. a seguir foram escolhidas:
K.O. 1: essa linhagem de célula tinha uma população com duas cópias do cromossoma 20 corados e ambos com o sinal de BAC através de FISH (12% das células detectadas). Uma população maior (85%) mostrou três cópias do cromossoma 20 coradas. Um desses cromossomas foi ape- 10 nas parcialmente corado e translocado para outro cromossoma. Apenas os dois cromossomas 20 completamente corados mostraram o sinal do BAC através de FISH.
K.O. 6: 96% das células tinham três sinais de cromossoma 20 e 2 sinais de BAC.
K.O. 1 e K.O. 6 foram ainda analisadas através de ELISA para
determinar se seus níveis de proteína de PrP eram cerca de metade das células 203F do tipo selvagem.
4. Teste ELISA (figura 9)
ELISA foi realizado para quantificar a concentração de proteína 20 de PrP em células com K.O. de PrP comparado com células 203F do tipo selvagem. As linhagens de célula K.O. 1 e K.O. 6 trazendo um alelo com K.O. de PrP expressavam consistentemente apenas metade da proteína de PrP comparado com células 293F do tipo selvagem (figura 9). Esses dados sustentam adicionalmente e verificam adicionalmente a conclusão após aná- 25 Iise por FISH. Exemplo 2: Descrição detalhada para o segundo ciclo de "knockout" com um construto de K.O. de PrP contendo zeocina
A estratégia de direcionamento é a mesma conforme descrito no Exemplo 1, exceto que o antibiótico é diferente. Isto é, zeocina ao invés de neomicina é incluída no segundo construto de K.O. de PrP e, portanto, sele- ção de clones resistentes a antibiótico é realizada com zeocina ao invés de G418.
A. Clonagem do 2° construto de K.O. de PrP contendo cassete de zeocina:
A ORF de neomicina no primeiro construto de K.O. de PrP1 pBS_Neo_P-_L+R_Braço_2B, foi substituída pela ORF de zeocina sem seu próprio promotor e o códon de início de tradução ATG. O cassete de zeocina foi amplificado através de PCR sem seu próprio ATG a partir do plasmídeo pcDNA3.1-Zeo(+) com os seguintes iniciadors de PCR:
Zeo-F: 5’-
GGCAAGAATTCGCAGAGCAGTCATTATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTT CC-3’ (SEQ ID N0 27)
Zeo-R: 5’-GGACCGCTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCAC-3’ (SEQ ID N0 18)
O produto de PCR resultante tem 412 bp de comprimento.
O plasmídeo pBS_Neo_P-_R+L_Braço_2B foi digerido com E-
coRI e Xhol e ligado com o cassete de Zeocina PCR-amplificado, o qual con- tém, sobre suas extremidades, sítios de restrição EcoRI e Xhol. O plasmídeo gerado a partir dessa ligação foi denominado pBS_Zeo_P-_R+L_Braço (Fig. 10) (SEQ ID NO. 16) e usado para direcionamento do segundo alelo de PrP. 25 Esse segundo construto de K.O. de PrP, pBS_Zeo_P-_R+L_Braço, foi Iinea- rizado com BamHI para transfecção, conforme descrito em B.4.
B. Introdução do segundo construto de K.O. de PrP, pBS Zeo P R+L Braco em células com K.O. de PrP com um alelo do gene de PrP:
O segundo construto de K.O. de PrP, pBS_Zeo_P_R+L-Braço, foi introduzido em células alvo identificadas com um alelo de PrP direcionado usando reagente Lipofectamin 2000 CD (veja método de transfecção, página 19). 48 h após transfecção, as células foram colocadas sobre discos de 10 cm ou ainda cultivadas em suspensão em frascos de agitação de 125 ml em uma densidade entre 1,25 e 1,5 x 106 células/ml. Para seleção com antibióti- co, G418 e zeocina foram adicionados à cultura nas seguintes concentra- ções: G418, 0-30 pg/ml e zeocina, 0-30 pg/ml. Troca de meio foi realizada a cada dois/três dias durante 14-30 dias.
C. Seleção de clones zeocina-direcionados:
Quando as células atingiram a confluência sob seleção com an- tibiótico, DNA genômico foi preparado exatamente conforme descrito para a seleção do primeiro K.O. (página 25,D).
A estratégia de PCR foi similar àquela do Exemplo 1D, exceto
que o iniciador reverso para PCR foi criado para ser homólogo à ORF de zeocina.
Uma mistura de PCR foi preparada, contendo 20-300 ng de DNA genômico, 1x tampão de PCR, cada iniciador de oligonucleotídeo a 200 nM, MgCI2 a 1,25 mM, dNTP a 200 nM e 1,33 unidades de Expand Fidelity Poly- merase (Roche). A seqüência dos oligonucleotídeos sintéticos usados para seleção eram como segue:
Zeo-K.O.-F2: 5' CTCCTCTTCCTCCCATCTTACC 3' (SEQ ID NO. 19) Zeo-K.O.-R2: 5' CGAAGTCGTCCTCCACGAAGTC 3' (SEQ ID NO. 20)
Os parâmetros de ciclo foram como segue: 94°C 4 min; [94°C,
15 s; 63°C, 30 s; 72°C 100 s] x16 ciclos; [94°C, 15 s; 63°C, 30 s; 72°C 100 s + 3 s a mais em cada ciclo sucessivo] x24 ciclos; 72 0C 7 min. Amostras de DNA genômico que proporcionam um produto de PCR de 2,3 kb indicam a presença de um ou vários alelos direcionados na população de célula.
D. Caracterização de clones direcionados com dois alelos de PrP direciona- dos:
1. Seleção por PCR genômica (figura 11): para identificar se as células ou população misturada de célula traz dois alelos de PrP direciona- dos, duas seleções por PCR independentes deverão ser realizadas. O par 30 de iniciador de PCR Zeo-K.O.-F2 e Zeo-K.O.-R2 foi usado para provar a in- tegração direcionada do segundo construto de K.O. de PrP (pBS_Zeo_P- _R+L_Braço), enquanto que o par de iniciador K.O.-F1 e K.O.-F2 prova a integração direcionada do primeiro construto de K.O. de PrP (pBS_Neo_P- _R+L_Braço_2B).
DNA genômico foi isolado de populações de célula mista ou co- lônias de célula isoladas conforme descrito em C acima. Todas as reações 5 de PCR de seleção de K.O. de PrP foram realizadas com controles positivos e negativos. O modelo para o controle positivo foi 200 ng de DNA genômico de uma população de célula mista na qual um alelo de PrP direcionado tinha sido previamente detectado com o método de seleção por PRC de K.O. de PrP a princípio com o par de iniciador Zeo-K.O.-F2 e Zeo-K.O.-R2; o controle 10 negativo usado foi água ao invés de DNA genômico como um modelo. O aparecimento de um produto de PCR de 2,3 kb sobre o gel de agarose após eletroforese indica que a colônia de célula correspondente traz células tra- zendo um cassete de zeocina ao invés do gene de PrP como o resultado do segundo ciclo de K.O. Os resultados são mostrados na figura 11. Clones 15 identificados como positivos através de PCR com os iniciadors Zeo-K.O.-F2 e Zeo-K.O.-R2 foram ainda analisados através de PCR com K.O.-F1 e K.O.- R1 de forma a determinar se a integração alvo do primeiro construto de K.O. ainda está presente ou se foi substituído pelo segundo construto de K.O. (figura 11).
No caso em que ambas as PCR são positivas, esse clone será
ainda analisado com análise de Southern blot.
2. A estratégia de seleção por Southern blot (figura 12) foi similar àquela descrita no Exemplo 1.
A estratégia de Southern genômica com o construto pBSZeo- 25 _P-_L+R_Braço é representada na figura 11. Após digestão genômica com EcoRI e hibridização radioativa, os clones de PrP direcionados mostraram uma banda de 4,2 kb com a sonda 5’-DNA e uma banda de 5,7 kb com a sonda 3’-DNA, enquanto que a banda do tipo selvagem de alelos não dire- cionados, detectada com qualquer sonda, é de 10,8 kb. Com a Zeo-sonda, 30 uma banda de DNA de 5,7 kb deverá ser detectada para o alelo alvo de PrP e nenhuma banda pode ser detectada para células 293F do tipo selvagem.
A diferença do padrão de Southern para a integração direciona- da de ambos os construtos de K.O. pôde ser detectada apenas com a 3’- sonda e Zeo- ou Neo-sonda.
• Com a 3'-sonda: com o primeiro construto de K.O., uma banda de 6,5 kb deverá ser detectada, enquanto que, com o segundo construto de
K.O., uma banda de 5,7 kb deverá ser adicionalmente mostrada. Em ambos os casos, a banda WT é de 10,8 kb.
• Com a Neo-sonda: uma banda de 6,5 kb deverá ser detectada quando de integração do primeiro construto de K.O.
• Com a Zeo-sonda: nenhum sinal deverá ser detectado para a integração direcionada do primeiro construto de K.O., enquanto que, para o
segundo construto de K.O., uma banda de 5,7 kb deverá ser ressaltada.
• Sondas de DNA para análise de Southern e seu padrão esperado são re- sumidas na tabela a seguir:___
Nome Comprimento Seqüência de iniciadors de PCR Padrão Padrão de da da sonda de para sondas de DNA de Sou¬ Southern Sonda DNA thern esperado esperado para células para cé¬ com PrP lulas com direcionado PrP dire¬ sobre am¬ cionado bos os ale¬ sobre um los alelo 5’- 251 bp 5’-K.O.-F1 (SEQ ID N0 12): 4,2 kb e 4,2 kb e sonda 5’-AGCTTTACCGTCCAGTCTTC-3’ 10,8 kb 10,8 kb 1 5’-K.0.-R1 (SEQ ID N0 13): 5'-GGTCTTGATGGCGATAACTC-3’ 5’- 252 bp 5’-K.O.-F2(SEQ ID N0 14): 4,2 kb e 4,2 kb e sonda 5’- GAGTTATCGCCATCAAGACC-3’ 10,8 kb 10,8 kb 2 5-K.O.-R2 (SEQ ID N0 15): 5’- CATGAGAACCAACGCTAGAG- 3’ New 3’- 288 bp Nova-3’-sonda-dianteira (SEQ ID N0 6,5 kb e 5,7 kb, 6,5 sonda 28): 10,8kb kb e 10,8 5’- CTAGAGGTCCAGGTCATCTTG kb -3’ Nova-3’-sonda-reversa (SEQ ID N0 29): 5’- TCAGGGAAATTGGG- GATCCTG-3’ Continuação...
Neo- 304 bp Neo-Sonda-F (SEQ ID N0 21): 6,5 kb 6,5 kb sonda 5’-AGCGAGCACGTACTCGGATG- 3’ Neo-sonda-R (SEQ ID N0 22): 5’-AAGCACGAGGAAGCGGT CAG- 3’ Zeo- 376bp Zeo-Sonda-F (SEQ ID N0 23) Sem 5,7 kb sonda 5- banda AT GGCCAAGTT GACCAGTGCCG- 3’ Zeo-Sonda-R (SEQ ID N0 24) 5’- GT CAGT CCTGCTCCTCGGC- CAC:-3' 3. Análise por FISH: foi observado, para células 203F do tipo selvagem adaptadas isentas de soro particulares, que o número de cópias do cromossoma 20 aumentou com o tempo de cultura. É importante notar
que as células com K.O. trazendo dois alelos direcionados de PrP ainda con- têm um terceiro cromossoma 20 intacto com um Iocus de PrP do tipo selva- gem. Portanto, as células com K.O. identificadas trazendo dois alelos de PrP direcionados ainda deverão ser hibridizadas com a sonda BAC 186 e a son- da corante chr20 WCP. Para uma linhagem de célula com K.O. de PrP com- 10 pleta, não mais do que 2 sinais de BAC deverão ser observados.
4. Ensaio ELISA: realizado conforme descrito no método 9. Ne- nhuma proteína de PrP deverá ser detectada em células pf293F.
5. Imunocoloração: nenhum sinal com coloração de anticorpo sobre a superfície da célula no caso de células pf293F.
Exemplo 3: Transfecção isenta de soro da linhagem de célula 293F i- senta de príon pf293F para a geração de proteínas recombinantes isen- tas de príon
3.1 Transfecção das células pf293F com um alelo objetivo a PrP
Os clones com K.O. de PrP com um alelo direcionado de PrP foram transfectados com os vetores pcDNA3.1-FVIII (SEQ ID NO. 26), pcD- NA3.1-FIX (SEQ ID NO. 17) e pcDNA3.1-hyg(+)-G-CSFb (SEQ ID NO. 25) para expressar as proteínas FVIII, FIX e G-CSFb humanas.
Na figura 13, foi mostrado que a eficiência de transfecção quan- do de deleção do primeiro alelo de PrP é comparável com células 293F do tipo selvagem (Fig. 10). Expressão de unidades ativas de FVIII, FIX e G- CSFb por células 10E6 é comparável a células 293F do tipo selvagem (Fig. 14). Isso indica "knockout" do gene de PrP não influencia a capacidade de 5 transfecção das células nem diminui a quantidade de proteína recombinante produzida.
3.2 Transfecção isenta de soro e produção de proteínas recombinantes hu- manas em linhagens de célula 293F isentas de príon completas
A ablação com sucesso da ORF de príon resultou na geração da 10 nova linhagem de célula p293F, a qual é capaz de produzir produtos tera- pêuticos completamente isentos de príon. De forma a prevenir contaminação da nova linhagem de célula com prions resultantes, por exemplo, de subs- tâncias do meio, o procedimento todo (incluindo transfecção estável, cultura de célula e fermentação) foi realizado sob condições isentas de soro (veja 15 PCT/EP2006063705) e utilizando a abordagem CIonePixFL.
Em particular, o vetor pTG36, conforme divulgado no W001/70968 e pcDNA3.1-FIX, um fragmento de 1,4 kb contendo a rede de leitura aberta do fator de coagulação humana IX foi cortado através de di- gestão dupla com Hindlll e Notl. Esse fragmento foi ligado ao fragmento de 20 5,6 kb do vetor duplamente digerido com Hindlll e Notl pcDNA3.1Hygro(+)- zz (derivado de V870-20, Invitrogen) resultando no vetor pcDNA3.1-FIX, mostrado em SEQ ID NO. 17. 28 ml de cultura em suspensão foram prepa- rados com uma densidade de célula de 106 células pf293F viáveis. Um com- plexo de lipídio-DNA foi preparado através de diluição de 30 pg de DNA de 25 plasmídeo em Opti-MEM® I (Invitrogen) até um volume total de 1 ml e 40 μΙ de 293fectin® foram diluídos em Opti-MEM® I até um volume total de 1 ml. Após a incubação de 5 min em temperatura ambiente, DNA diluído foi adi- cionado a 293fectin® para obter um volume total de 2 ml. As amostras trans- fectadas foram incubadas durante 20 min em temperatura ambiente no escu- 30 ro. 2 ml da mistura de transfecção foram adicionados a 28 ml da cultura em suspensão de pf293F (densidade de célula final é de 1 x 106 células/ml). As células pf293F transfectadas foram incubadas a 37 °C/atmosfera umidificada de 8% de CO2 em ar sobre um agitador orbital girando a 125 rpm durante 72 h.
As células p293F transfectadas conforme descrito acima foram cultivadas em meio baseado em metilcelulose semissólido contendo um an- tibiótico apropriado, para seleção de clones e um anticorpo rotulado para detecção dos maiores clones produtores via fluorescência. Grandes núme- ros (milhares) de clones foram analisados usando CIonePixFL (Genetix) com relação ao número de célula e secreção da proteína FIX alvo de forma a, subsequentemente, selecionar apenas uns poucos clones melhor produtores de FIX. Em contraste a outros métodos conhecidos, onde clones não produ- tos e clones misturados são aleatoriamente selecionados também, o uso de CIonePixFL permite seleção de clones que crescimento rápido, os quais são altos produtores apenas, originários de células únicas. As células seleciona- das são expandidas em lâminas de microtitulação em tubos para centrífuga, frascos de cultura de célula e fermentadores sob condições isentas de soro para o procedimento completo.
Clones de produção de FIX identificados através do método descrito acima foram cultivados em meio de expressão FreeStyIe 293 isento de soro. As proteínas-alvo foram isoladas e purificadas de acordo com pro- 20 cedimentos padrões. Adicionalmente, para a produção de produtos terapêu- ticos seguros, as células Pf293F otimizadas também foram usadas para pro- dução isenta de soro de FVIII humana recombinante e G-CSF com o vetor de expressão pcDNA3.1-hyg(+)-G-CSFb (SEQ ID N0 25) e pcDNA3.1-FVIII (SEQ ID N0 26).
Listagem de Seqüência:
SEQ ID NO. 1: vetor de K.O. pBS_Neo_P-_R+L_Braço_2B Molécula: DNA de 10623 bps, circular
Tipo Início Final Nome/Descrição GENE 673 2580 Braço esquerdo de PrP GENE 2608 3807 Neo GENE 3817 8411 Braço direito de PrP GENE 9637 10494 AmpR SEQ ID Nos 2 e 3: braços esquerdo e direito de PrP SEQ ID Nos 4-15: iniciador
SEQ ID NO. 16: vetor de K.O. pBS_Zeo_P-_R+L_Braço Molécula: DNA de 9790 bps, circular
Tipo Início Final Nome/Descrição GENE 673 2581 Braço esquerdo de PrP GENE 2605 2976 Zeo GENE 2983 7583 Braço direito de PrP GENE 8805 9662 AmpR SEQ ID NO. 17: dcDNA3.1-FIX. Molécula : DNA de 6960 bps, circular Tipo Início Final Nome/Descrição REGIÃO 209 863 Promotor de CMV REGIÃO 895 'MCS GENE 939 2324 HFIX GENE 2328 2339 SV407SV40 poliA + íntron REGIÃO 2340 2370 'MCS REGIÃO 2381 2595 BGH pA REGIÃO 2658 3071 Origem f1 REGIÃO 3136 3460 Promotor SV40 GENE 3478 4501 HygR REGIÃO 4514 4886 SV40 pA REGIÃO 5819 5146 Origem C PUC GENE 6824 5964 C AmpR (fita complementar) SEQ ID Nos 18-24: iniciador
SEQ ID NO. 25: pcDNA3.1-hyg(+)-G-CSFb
Molécula: DNA circular de 6237 bps
209 863 Promotor de CMV Região 970 1584 GCSFb Gene 1658 1872 BGH pA Região 1935 2348 Origem f1 Região 2413 2737 Promotor SV40 Região 2755 3778 HygR 3791 4163 SV40 pA 5096 4423 Origem pUC 6101 5241 AmpR SEQ ID NO. 26: pcDNA3.1-FVIII Molécula: DNA circular de 9975 bps
1 655 Promotor de CMV 783 3082 h FVIII
783 839 Domínios A1 e A2 de FVIII humano Peptídeo sinalizador 840 1826 A1
Domínio A1 de hFVIII 1977 2972 A2
Domínio A2 de hFVIII 3084 3107 dobradiça 3105 5162 hFVIII
Domínios A3, C1, C2 de fator FVIII humano 3243 4226 A3
Domínio A3 de hFVIII 4227 4670 C1
Domínio C3 de hFVIII 4683 5141 C2
Domínio C2 de hFVIII 5188 5402 BGHpA 5465 5878 Origem f1 5943 6267 Promotor SV40 6285 7308 HygR 7321 7693 SV40 pA 8626 7953 Origem pUC 9631 8771 AmpR SEQ ID Nos 27-29: iniciador
Gene
Região
Região
Gene
Região
Gene
Região
Região
Região
Região
Gene
Região
Região
Região
Região
Região
Região
Gene
Região
Região
Gene *t Zf Listagem de Seqüência
<110> Octapharma AG
<12 0> "ABLAÇÃO GENÉTICA DE CÉLULAS COM GENE PRP USANDO UMA ESTRATÉGIA DE CAPTURA DE PROMOTOR DIRECIONADA PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
<130> 072819WC)
<160> 29
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10622
<212> DNA
<213> Artificial <22 0>
<223> Vetor DE KO pBS_NE0_P-_R+L_Arm_2B
<400> 1
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
ccgcggtggc ggccgcctct gtctaggaac actgctgtga acaaaaccaa actcccgccc 720
taaaggagcc tgcactcccg tggagaacat gaataataag cacagaggaa ataacataat 780
atctcaagta gctgtaactg ctccagagaa taatgaagcc aggaaagggg gtgggctagg 840
gggtgctgtt ttaggtagag tgatgggaac agccccactg agcaaacttt agccacatga 900
gtagctggaa gaaaagcctt ctaggaccag ggaacagcaa gtgcaacagc cctgagacag 960
gatgggcttg tcagtttgag gagcagtggg aggcctgaac caggttacat ggggcccagc 1020 cagtatggcc acgactttgt gttttatcca gagtacaaag gagcctcact gagggacaag 1080 ggaagtggca tgatgtgacc cgcatattaa gaggagagcg ctcaatggca gccaggggag 1140 gagcagggag gctggttggg aggctgttga agaaatcagg tgagaagtga tggaagcacc 1200 gaataagatg gtcatgttgg aaaaattgag aagctgaggt gcttagcatt gattttcaag 1260 gtagagctac tgagatttgc tgatagatcc aatgtatgct gggagagaaa attcagtcac 1320 tctagagcat tggctggatt tgtcacccat tgcagcgaat ggagaaggtg ctgacataaa 1380 agccctttag actgaaagct actgactgag gggatggtgc cctagtttga tttcctgggg 1440 tgtatgagta gcagggaggc caagagctgg gcctcacgag attgtgggga ctacatcagg 1500 gaagcaggcc tgcaaagaac ctgcaccaca gacccccacc taaaagagcc tccaaaaacc 1560 ctaactggca tgacctgagt actttaactc tgcttgtaac tttcaaatat attttgattt 1620 gcttatgacc accaaggcaa aacttcccat ttcaataatg ttagtagaaa cataaacagg 1680 atgttaattt atttatttgg taattctttt tatgaatatt atccagttta atcattagct 1740 ctgaaggaga tgaaaaataa ttttctaatt tttagaaaaa tttgcagcta attgggtgat 1800 aaaggtaagg ggtttctgag ttcacaaaaa tgttctaaaa ttggcaacag tttcggttgc 1860 acgtttcatt aaatgtacta aaaaccattg aactgtacat ggtatatggt gaattatatg 1920 gtatgtgaat tatatctcaa caagctgggt attgtttttt taaaaaataa aaataaaaaa 1980 ggagaaagag agagagaaaa acaattgcag atcatcccag cactgaggac aagactaact 2040 tcagtgttcc agtatatgcc attataggtt ttacggcaca cagtgatgat ttggagccta 2100 tgatttgacc tagggtacag caggtactgt ttagcaatca ttttactatt gtcataggtc 2160 tctgctcttg gagctaagtg cccagggtaa atgagatctt taatttgaaa agagattttt 2220 gatttgatga atgtacattc tccaaagggt cataaattgt cattctggat gtttgatctg 2280 tttgttgttt tggtacaaaa attagaagaa aataattcac tcataaaatg ttaaataatg 2340 aactaaaagt cattcatcaa gtccataact tagggtcaca tttgtccttg gagcaggaga 2400 aagagttgtg ttcacccttt tcttactttt gcttttgtcc taagtgcttc agagaagtac 2460 agggtggcaa cagtgtttct actgagcagc tgataccatt gctatgcact cattcattat 2520 gcaggaaaca tttagtaatt tcaacataaa tatgggactc tgacgttctc ctcttcattt 2580 tgaattcgca gagcagtcat tatgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 2640 gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 2700 gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 2760 tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 2820 ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 2880 ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 2940 tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 3000 gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 3060 gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 3120 ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 3180 ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 3240 gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 3300 ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 3360 atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga 3420 ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg 3480 aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg 3540 atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 3600 aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 3660 gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct 3720 agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 3780 ttccacacaa catacgagcc ggaagcatct cgagtgtgta ccgagaactg gggtgatgtt 3840 ttacttttca cagtatgggc tacacagcag ctgttcaaca agagtaaata ttgtcacaac 3900 actgaacctc tggctagagg acatattcac agtgaacata actgtaacat atatgaaagg 3960 cttctgggac ttgaaatcaa atgtttggga atggtgccct tggaggcaac ctcccatttt 4020 agatgtttaa aggaccctat atgtggcatt cctttcttta aactataggt aattaaggca 4080 gctgaaaagt aaattgcctt ctagacactg aaggcaaatc tcctttgtcc atttacctgg 4140 aaaccagaat gattttgaca tacaggagag ctgcagttgt gaaagcacca tcatcataga 4200 ggatgatgta attaaaaaat ggtcagtgtg caaagaaaag aactgcttgc atttctttat 4260 ttctgtctca taattgtcaa aaaccagaat taggtcaagt tcatagtttc tgtaattggc 4320 ttttgaatca aagaataggg agacaatcta aaaaatatct taggttggag atgacagaaa 4380 tatgattgat ttgaagtgga aaaagaaatt ctgttaatgt taattaaagt aaaattattc 4440 cctgaattgt ttgatattgt cacctagcag atatgtatta cttttctgca atgttattat 4500 tggcttgcac tttgtgagta ttctatgtaa aaatatatat gtatataaaa tatatattgc 4560 ataggacaga cttaggagtt ttgtttagag cagttaacat ctgaagtgtc taatgcatta 4620 acttttgtaa ggtactgaat acttaatatg tgggaaaccc ttttgcgtgg tccttaggct 4680 tacaatgtgc actgaatcgt ttcatgtaag aatccaaagt ggacaccatt aacaggtctt 4740 tgaaatatgc atgtacttta tattttctat atttgtaact ttgcatgttc ttgttttgtt 4800 atataaaaaa attgtaaatg tttaatatct gactgaaatt aaacgagcga agatgagcac 4860 cacctcccgt gtctgcagtt gtatttcctg gtgcttgccc tgtgttgggg actgttttgg 4920 gggttaatct gagccaagtg gcgctttctg tcctcccttc tcaagtgatg gccgatggtt. 4980 cacgcacttc cccctgttcc tgcccttgtc ctcacttccc agtcacccac tagttcatct 5040 ctgcggcttt tgcattttct ccacaagcat ctaagtgggc ttagcactgg taaactgcaa 5100 aggcactatt gcagcaggag gaacagtctg ggagcttttt tcagtcctgg atttagaaat 5160 agattttctt gattaaaatg aaaattaaca agctctaaag aactgttgac ccttgaacta 5220 cacagggatt agaggcactg acctgccgca cagtcgaaaa tctgcagaga agtttttttt 5280 gttttgtttt gttttttttg agacggagtc tcgctctgtc gcccaggctg gagtgcagtg 5340 gcgggatctc ggctcactgc aacctccgcc tcccgggttc aggcgattct cctgcctcag 5400 cctcctgagt agctgggact acaggcatat gccaccatgc ccggctaatt tttgtatttt 5460 tagtagagat ggagtttcac catattggcc aggctgttct caaactcggc ctcaagtgat 5520 ctgctcgcct cagccaccca aagtgctagg attacaagca tgagccaccg cgcccggcct 5580 gcatagaact tttaactccc ccaaaactta attgctaata gattaattgc ctgctgttgg 5640 ctggaagcct taccaataac gtaaacagtt ggttagcaca tatttcacat gtcatatata 5700 ctatatactg tattcttacc ataaagtaag ttagagaaaa tgttgttaaa acaatgagga 5760 aggaaaagta tatttactat tcactgactg gaagtggatc atcataaaga tcttcatctc 5820 atcttcctca cattgaggaa ggctgaggag gaaggggagg ggttggtctt gctgtctcct 5880 gggtggcaga ggcagaagaa aatctgtgtc tcgtggactc agttccaacc cgtggtgttc 5940 aagggtcacc tgtgcctgct ttatgcaccc caaatcaggc tctaaaatag tctcaggtcc 6000 tgtgagcctt agtgacacac tcttctcaga ttcaatacct ttgatctgaa aggtgacttt 6060 gatttgtcat aatcttccaa ctcattctct acatgtttcg acgcaccagc actgtgatgt; 6120 tcttggttat ccttggcaga agttttctcc tgcaactaat ttgctaaagg cagggggtaa 6180 tcagaagtga cagtggttga aatcacaggc caatatctta gcaaacgtct gtgttgtaaa 6240 tggggaagtg cctctggtgg ggtcttcaag gatcactcca gcctggctag ggaaactcta 6300 ggggagaggc acttgaaatt attgtactca taggtcctag agagggaggc atgtcatgcc 6360 aagcaggggg ctggattgga ggcgtgccca gggattgggt gcaactcagc gtgtatgaga 6420 cagaaagaga gagaactcct gggcaagtgc ctttactggg agccaggatg gaggacacaa 6480 gcacaaggtg taaggggatc tcactggtgt gtttgaatgt cactaagtca cagtcagggg 6540 aagacaagaa gtggaacttg tggcagggac cagccttatt acactggcac ctggttacct 6600 ggacagggtg cccactgcct atttgtagga tgtcaaggta tcaggaaaat atgaagtttt 6660 taaaaattta caatataatg ccaacctcct acggtgatca gaggatcagc tttgtattaa 6720 agatggaaag ataccaatca tcacccacaa aactactaaa acagaaagaa tgacaaatac 6780 aattctcggc caggcacagt tgctcacgcc
aggcagatca cttgaggtca ggagttcaag
ttccctacta aaattacaaa aaattagctg
tactcaggag gctgaggcag gagaatcgct
5 cgagatcccg ccattgcact ccagcctggc
aaaataaaat aaacttttca ttacctgcct
gagacttaaa gtgttcgaag catagctact
tatctttccc aggcctcatg tttcctttgt
atttttacta aaaaggaaaa gaaaaaaatt
caatccccca gaaagggtta ttcggggaac
cccatctggg gctaagacca aaaggggtct
cttcccactc taaggggagc cttaatccca
tgaccttgcc gactgatcta agcattctgc
ctcctggctg gggggctcct cccctaggac
tgtccatcct ttgttccgtt ctttgagtcc
gtccacgtgc cttgcctgtg cttctgtaga
gctcctggaa cttgaatgtg cacttgaatc
aacatgctgc tgggtgacgc tgtgcccgtc
ggttcccacg ccggagtctg cgtcagaaac
gaaccccatc cccagagttt ctgattccct
ttctaacaaa ttcccaggtg atactgatgc
ctgctcggca gatgcaaaag aagcagaagc
ctgtggagac cagacacctg ccgggggaat
agagagctgg gagctctatg ggtgaatgcc
gccgtctgaa aatagtgaag cacagccgag
gttaaacttg gaaatggtgc ccagtcactt
acatgaacca cctgaggatc ttattaaaat
gctcagagat tctgcggtac ccagcttttg
ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc
gcattaatga atcggccaac gcgcggggag
tgtaatccct gcactttggg aggccgaggc 6840 accagcctgg ccaacatggt gaaaccccca 6900 ggtgtggtcg cacgtgcctg taatcccagc 6960 tataaccggg aggcagaggc tgcagtgagc 7020 ggtaagagcg aaactccgtc tcaaaaaaat 7080 ataataattt ctcaaaaaga gtcaactgag 7140 tgtaggacca gagtgaataa tatccacctg 7200 tatttcaaac gtgtgagtca tgcaaaagga 7260 taaaatgacc agcataaaca taattgagtt 7320 agccaggcgc tgcccttgtt tttccccctc 7380 gtctttggag ggaaatctgg gtctgtacag 7440 gccggaacct gagcttctcc aggcaaggcc 7500 gcttcatttt caccccagaa aggtgacttc 7560 tcagctcatc ctgaactaat aaccgcgtta 7620 cacccatgtt cttcaggaaa gctgcagctg 7680 actacccctc ccttctctgc ctgcagcagg 7740 tgcaggtcct gactgtaggt ctgtgtttct 7800 ctgtggtcgg cattgtaaca aggctccgcg 7860 ctctggaggg cttgttatac acagatggct 7920 agtaccaggg tggggtctga gaatttgcat 7980 tgctggtgcg gagaggtcac atggaaacca 8040 cgccccaacc ctgaaatact cacaaagctg 8100 gagagcctgg ggatcctgcc tgggaggaag 8160 aatggaggtg caaggaggtg actaactcct 8220 gcctgaagcc cacccttagt gagagatata 8280 gaaaacagca cttctcagat tcagatgtac 8340 gtgggttctg aggctgtagc tctgaggtga 8400 ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt 8460 gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 8520 agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 8580 tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 8640 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 8700 ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 8760 ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 8820 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 8880 taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 8940 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 9000 tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 9060 gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 9120 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 9180 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 9240 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 9300 cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 9360 aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 9420 tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 9480 ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 9540 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 9600 ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 9660 tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 9720 aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 9780 acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 9840 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 9900 agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 9960 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 10020 agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 10080 tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 10140 tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 10200 attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 10260 taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 10320 aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 10380 caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 10440 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 10500 cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 10560 tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 10620 ac 10622
<210> 2
<211> 1909
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> região de homologia ao braço esquerdo PrP
<4 00> 2
ccgcctctgt ctaggaacac tgctgtgaac aaaaccaaac tcccgcccta aaggagcctg 60 cactcccgtg gagaacatga ataataagca cagaggaaat aacataatat ctcaagtagc 120 tgtaactgct ccagagaata atgaagccag gaaagggggt gggctagggg gtgctgtttt 180 aggtagagtg atgggaacag ccccactgag caaactttag ccacatgagt agctggaaga 240 aaagccttct aggaccaggg aacagcaagt gcaacagccc tgagacagga tgggcttgtc 300 agtttgagga gcagtgggag gcctgaacca ggttacatgg ggcccagcca gtatggccac 360 gactttgtgt tttatccaga gtacaaagga gcctcactga gggacaaggg aagtggcatg 420 atgtgacccg catattaaga ggagagcgct caatggcagc caggggagga gcagggaggc 480 tggttgggag gctgttgaag aaatcaggtg agaagtgatg gaagcaccga ataagatggt 540 catgttggaa aaattgagaa gctgaggtgc ttagcattga ttttcaaggt agagctactg 600 agatttgctg atagatccaa tgtatgctgg gagagaaaat tcagtcactc tagagcattg 660 gctggatttg tcacccattg cagcgaatgg agaaggtgct gacataaaag ccctttagac 720 tgaaagctac tgactgaggg gatggtgccc tagtttgatt tcctggggtg tatgagtagc 780 agggaggcca agagctgggc ctcacgagat tgtggggact acatcaggga agcaggcctg 840 caaagaacct gcaccacaga cccccaccta aaagagcctc caaaaaccct aactggcatg 900 acctgagtac tttaactctg cttgtaactt tcaaatatat tttgatttgc ttatgaccac 960 caaggcaaaa cttcccattt caataatgtt agtagaaaca taaacaggat gttaatttat 1020 ttatttggta attcttttta tgaatattat ccagtttaat cattagctct gaaggagatg 1080 aaaaataatt ttctaatttt tagaaaaatt tgcagctaat tgggtgataa aggtaagggg 1140 tttctgagtt cacaaaaatg ttctaaaatt ggcaacagtt tcggttgcac gtttcattaa 1200 atgtactaaa aaccattgaa ctgtacatgg tatatggtga attatatggt atgtgaatta 1260 tatctcaaca agctgggtat tgttttttta aaaaataaaa ataaaaaagg agaaagagag 1320 agagaaaaac aattgcagat catcccagca ctgaggacaa gactaacttc agtgttccag 1380 tatatgccat tataggtttt acggcacaca gtgatgattt ggagcctatg atttgaccta 1440 gggtacagca ggtactgttt agcaatcatt ttactattgt cataggtctc tgctcttgga 1500 gctaagtgcc cagggtaaat gagatcttta atttgaaaag agatttttga tttgatgaat 1560 gtacattctc caaagggtca taaattgtca ttctggatgt ttgatctgtt tgttgttttg 1620 gtacaaaaat tagaagaaaa taattcactc ataaaatgtt aaataatgaa ctaaaagtca 1680 ttcatcaagt ccataactta gggtcacatt tgtccttgga gcaggagaaa gagttgtgtt 1740 cacccttttc ttacttttgc ttttgtccta agtgcttcag agaagtacag ggtggcaaca 1800 gtgtttctac tgagcagctg ataccattgc tatgcactca ttcattatgc aggaaacatt 1860 tagtaatttc aacataaata tgggactctg acgttctcct cttcatttt 1909 <210> 3
<211> 4601
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> região de homologia ao braço direito PrP
<400> 3
tgtgtaccga gaactggggt gatgttttac ttttcacagt atgggctaca cagcagctgt 60 tcaacaagag taaatattgt cacaacactg aacctctggc tagaggacat attcacagtg 120 aacataactg taacatatat gaaaggcttc tgggacttga aatcaaatgt ttgggaatgg 180 tgcccttgga ggcaacctcc cattttagat gtttaaagga ccctatatgt ggcattcctt 240 tctttaaact ataggtaatt aaggcagctg aaaagtaaat tgccttctag acactgaagg 300 caaatctcct ttgtccattt acctggaaac cagaatgatt ttgacataca ggagagctgc 360 agttgtgaaa gcaccatcat catagaggat gatgtaatta aaaaatggtc agtgtgcaaa 420 gaaaagaact gcttgcattt ctttatttct gtctcataat tgtcaaaaac cagaattagg 480 tcaagttcat agtttctgta attggctttt gaatcaaaga atagggagac aatctaaaaa 540 atatcttagg ttggagatga cagaaatatg attgatttga agtggaaaaa gaaattctgt 600 taatgttaat taaagtaaaa ttattccctg aattgtttga tattgtcacc tagcagatat 660 gtattacttt tctgcaatgt tattattggc ttgcactttg tgagtattct atgtaaaaat 720 atatatgtat ataaaatata tattgcatag gacagactta ggagttttgt ttagagcagt 780 taacatctga agtgtctaat gcattaactt ttgtaaggta ctgaatactt aatatgtggg 840 aaaccctttt gcgtggtcct taggcttaca atgtgcactg aatcgtttca tgtaagaatc 900 caaagtggac accattaaca ggtctttgaa atatgcatgt actttatatt ttctatattt 960 gtaactttgc atgttcttgt tttgttatat aaaaaaattg taaatgttta atatctgact 1020 gaaattaaac gagcgaagat gagcaccacc tcccgtgtct gcagttgtat ttcctggtgc 1080 ttgccctgtg ttggggactg ttttgggggt taatctgagc caagtggcgc tttctgtcct 1140 cccttctcaa gtgatggccg atggttcacg cacttccccc tgttcctgcc cttgtcctca 1200 cttcccagtc acccactagt tcatctctgc ggcttttgca ttttctccac aagcatctaa 1260 gtgggcttag cactggtaaa ctgcaaaggc actattgcag caggaggaac agtctgggag 1320 cttttttcag tcctggattt agaaatagat tttcttgatt aaaatgaaaa ttaacaagct 1380 ctaaagaact gttgaccctt gaactacaca gggattagag gcactgacct gccgcacagt 1440 cgaaaatctg cagagaagtt ttttttgttt tgttttgttt tttttgagac ggagtctcgc 1500 tctgtcgccc aggctggagt gcagtggcgg gatctcggct cactgcaacc tccgcctccc 1560 gggttcaggc gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggactacag gcatatgcca 1620 ccatgcccgg ctaatttttg tatttttagt agagatggag tttcaccata ttggccaggc 1680 tgttctcaaa ctcggcctca agtgatctgc tcgcctcagc cacccaaagt gctaggatta 1740 caagcatgag ccaccgcgcc cggcctgcat agaactttta actcccccaa aacttaattg 1800 ctaatagatt aattgcctgc tgttggctgg aagccttacc aataacgtaa acagttggtt 1860 agcacatatt tcacatgtca tatatactat atactgtatt cttaccataa agtaagttag 1920 agaaaatgtt gttaaaacaa tgaggaagga aaagtatatt tactattcac tgactggaag 1980 tggatcatca taaagatctt catctcatct tcctcacatt gaggaaggct gaggaggaag 2040 gggaggggtt ggtcttgctg tctcctgggt ggcagaggca gaagaaaatc tgtgtctcgt 2100 ggactcagtt ccaacccgtg gtgttcaagg gtcacctgtg cctgctttat gcaccccaaa 2160 tcaggctcta aaatagtctc aggtcctgtg agccttagtg acacactctt ctcagattca 2220 atacctttga tctgaaaggt gactttgatt tgtcataatc ttccaactca ttctctacat 2280 gtttcgacgc accagcactg tgatgttctt ggttatcctt ggcagaagtt ttctcctgca 2340 actaatttgc taaaggcagg gggtaatcag aagtgacagt ggttgaaatc acaggccaat 2400 atcttagcaa acgtctgtgt tgtaaatggg gaagtgcctc tggtggggtc ttcaaggatc 2460 actccagcct ggctagggaa actctagggg agaggcactt gaaattattg tactcatagg 2520 tcctagagag ggaggcatgt catgccaagc agggggctgg attggaggcg tgcccaggga 2580 ttgggtgcaa ctcagcgtgt atgagacaga aagagagaga actcctgggc aagtgccttt 2640 actgggagcc aggatggagg acacaagcac aaggtgtaag gggatctcac tggtgtgttt 2700 gaatgtcact aagtcacagt caggggaaga caagaagtgg aacttgtggc agggaccagc 2760 cttattacac tggcacctgg ttacctggac agggtgccca ctgcctattt gtaggatgtc 2820 aaggtatcag gaaaatatga agtttttaaa aatttacaat ataatgccaa cctcctacgg 2880 tgatcagagg atcagctttg tattaaagat ggaaagatac caatcatcac ccacaaaact 2940 actaaaacag aaagaatgac aaatacaatt atccctgcac tttgggaggc cgaggcaggc gcctggccaa catggtgaaa cccccattcc tggtcgcacg tgcctgtaat cccagctact 5 accgggaggc agaggctgca gtgagccgag agagcgaaac tccgtctcaa aaaaataaaa taatttctca aaaagagtca actgaggaga ggaccagagt gaataatatc cacctgtatc tcaaacgtgt gagtcatgca aaaggaattt 10 atgaccagca taaacataat tgagttcaat aggcgctgcc cttgtttttc cccctcccca ttggagggaa atctgggtct gtacagcttc gaacctgagc ttctccaggc aaggcctgac cattttcacc ccagaaaggt gacttcctcc 15 ctcatcctga actaataacc gcgttatgtc catgttcttc aggaaagctg cagctggtcc cccctccctt ctctgcctgc agcagggctc ggtcctgact gtaggtctgt gtttctaaca ggtcggcatt gtaacaaggc tccgcgggtt 20 ggagggcttg ttatacacag atggctgaac ccagggtggg gtctgagaat ttgcatttct ggtgcggaga ggtcacatgg aaaccactgc ccaaccctga aatactcaca aagctgctgt gcctggggat cctgcctggg aggaagagag 25 gaggtgcaag gaggtgacta actcctgccg gaagcccacc cttagtgaga gatatagtta acagcacttc tcagattcag atgtacacat gttctgaggc tgtagctctg aggtgagctc <210> 4
<211> 53
<212> DNA <213> Artificial
ctcggccagg cacagttgct cacgcctgta 3000 agatcacttg aggtcaggag ttcaagacca 3060 ctactaaaat tacaaaaaat tagctgggtg 3120 caggaggctg aggcaggaga atcgcttata 3180 atcccgccat tgcactccag cctggcggta 3240 taaaataaac ttttcattac ctgcctataa 3300 cttaaagtgt tcgaagcata gctacttgta 3360 tttcccaggc ctcatgtttc ctttgttatt 3420 ttactaaaaa ggaaaagaaa aaaatttaaa 3480 cccccagaaa gggttattcg gggaacagcc 3540 tctggggcta agaccaaaag gggtctgtct 3600 ccactctaag gggagcctta atcccagccg 3660 cttgccgact gatctaagca ttctgcgctt 3720 tggctggggg gctcctcccc taggactcag 3780 catcctttgt tccgttcttt gagtcccacc 3840 acgtgccttg cctgtgcttc tgtagaacta 3900 ctggaacttg aatgtgcact tgaatctgca 3960 tgctgctggg tgacgctgtg cccgtcctgt 4020 cccacgccgg agtctgcgtc agaaacctct 4080 cccatcccca gagtttctga ttccctagta 4140 aacaaattcc caggtgatac tgatgctgct 4200 tcggcagatg caaaagaagc agaagccgcc 4260 ggagaccaga cacctgccgg gggaatgaga 4320 agctgggagc tctatgggtg aatgccaatg 4380 tctgaaaata gtgaagcaca gccgaggcct 4440 aacttggaaa tggtgcccag tcacttgaaa 4500 gaaccacctg aggatcttat taaaatgtgg 4560 agagattctg c 4601 <220>
<223> Iniciador
<4 00> 4
ggcaagaatt cgcagagcag tcattatgat tgaacaagat ggattgcacg cag 53
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 5
ggaccgctcg agatgcttcc ggctcgtatg ttgt 34
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 6
ggcaagcggc cgcctctgtc taggaacact gctgtg 36
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial
<22 0>
<223> Iniciador
<400> 7
ggcaagaatt caaaatgaag aggagaacgt cagagtc 37
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 8
ggaccgctcg agtgtgtacc gagaactggg gtgatg 36
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 9
ggcggggtac cgcagaatct ctgagctcac ctcag 35
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<4 00> 10
cgactcagtg tcattccctg cagtctc 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 11
catagccgaa tagcctctcc acccaag 27
<210> 12
<211> 20
<212> DNA <213> Artificial <220>
<223> Xniciador
<4 00> 12
agctttaccg tccagtcttc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 13
ggtcttgatg gcgataactc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 14
gagttatcgc catcaagacc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador <4 00> 15
catgagaacc aacgctagag 20
<210> 16
<211> 10158 <212> DNA <213> Artificial <22 0>
<223> Vetor DE KO PBS Zeo P- R+L Arm
<4 00> 16
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attttttaac caataggccg aaatcggcaa gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata ccgcggtggc ggccgcctct gtctaggaac taaaggagcc tgcactcccg tggagaacat atctcaagta gctgtaactg ctccagagaa gggtgctgtt ttaggtagag tgatgggaac gtagctggaa gaaaagcctt ctaggaccag gatgggcttg tcagtttgag gagcagtggg cagtatggcc acgactttgt gttttatcca ggaagtggca tgatgtgacc cgcatattaa gagcagggag gctggttggg aggctgttga gaataagatg gtcatgttgg aaaaattgag gtagagctac tgagatttgc tgatagatcc tctagagcat tggctggatt tgtcacccat agccctttag actgaaagct actgactgag tgtatgagta gcagggaggc caagagctgg gaagcaggcc tgcaaagaac ctgcaccaca ctaactggca tgacctgagt actttaactc gcttatgacc accaaggcaa aacttcccat atgttaattt atttatttgg taattctttt
attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660 actgctgtga acaaaaccaa actcccgccc 720 gaataataag cacagaggaa ataacataat 780 taatgaagcc aggaaagggg gtgggctagg 840 agccccactg agcaaacttt agccacatga 900 ggaacagcaa gtgcaacagc cctgagacag 960 aggcctgaac caggttacat ggggcccagc 1020 gagtacaaag gagcctcact gagggacaag 1080 gaggagagcg ctcaatggca gccaggggag 1140 agaaatcagg tgagaagtga tggaagcacc 1200 aagctgaggt gcttagcatt gattttcaag 1260 aatgtatgct gggagagaaa attcagtcac 1320 tgcagcgaat ggagaaggtg ctgacataaa 1380 gggatggtgc cctagtttga tttcctgggg 1440 gcctcacgag attgtgggga ctacatcagg 1500 gacccccacc taaaagagcc tccaaaaacc 1560 tgcttgtaac tttcaaatat attttgattt 1620 ttcaataatg ttagtagaaa cataaacagg 1680 tatgaatatt atccagttta atcattagct 1740 ctgaaggaga tgaaaaataa ttttctaatt aaaggtaagg ggtttctgag ttcacaaaaa acgtttcatt aaatgtacta aaaaccattg gtatgtgaat tatatctcaa caagctgggt 5 ggagaaagag agagagaaaa acaattgcag tcagtgttcc agtatatgcc attataggtt tgatttgacc tagggtacag caggtactgt tctgctcttg gagctaagtg cccagggtaa gatttgatga atgtacattc tccaaagggt 10 tttgttgttt tggtacaaaa attagaagaa aactaaaagt cattcatcaa gtccataact aagagttgtg ttcacccttt tcttactttt agggtggcaa cagtgtttct actgagcagc gcaggaaaca tttagtaatt tcaacataaa 15 tgaattcgca gagcagtcat tatggccaag cgcgacgtcg ccggagcggt cgagttctgg gtggaggacg acttcgccgg tgtggtccgg caggaccagg tggtgccgga caacaccctg ctgtacgccg agtggtcgga ggtcgtgtcc 20 atgaccgaga tcggcgagca gccgtggggg aactgcgtgc acttcgtggc cgaggagcag accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc atcctccagc gcggggatct catgctggag gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 25 tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa tgttatccgc tcacaattcc acacaacata gaactggggt gatgttttac ttttcacagt taaatattgt cacaacactg aacctctggc 30 taacatatat gaaaggcttc tgggacttga ggcaacctcc cattttagat gtttaaagga ataggtaatt aaggcagctg aaaagtaaat
tttagaaaaa tttgcagcta attgggtgat 1800 tgttctaaaa ttggcaacag tttcggttgc 1860 aactgtacat ggtatatggt gaattatatg 1920 attgtttttt taaaaaataa aaataaaaaa 1980 atcatcccag cactgaggac aagactaact 2040 ttacggcaca cagtgatgat ttggagccta 2100 ttagcaatca ttttactatt gtcataggtc 2160 atgagatctt taatttgaaa agagattttt 2220 cataaattgt cattctggat gtttgatctg 2280 aataattcac tcataaaatg ttaaataatg 2340 tagggtcaca tttgtccttg gagcaggaga 2400 gcttttgtcc taagtgcttc agagaagtac 2460 tgataccatt gctatgcact cattcattat 2520 tatgggactc tgacgttctc ctcttcattt 2580 ttgaccagtg ccgttccggt gctcaccgcg 2640 accgaccggc tcgggttctc ccgggacttc 2700 gacgacgtga ccctgttcat cagcgcggtc 2760 gcctgggtgt gggtgcgcgg cctggacgag 2820 acgaacttcc gggacgcctc cgggccggcc 2880 cgggagttcg ccctgcgcga cccggccggc 2940 gactgacacg tgctacgaga tttcgattcc 3000 ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg 3060 ttcttcgccc accccaactt gtttattgca 3120 atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 3180 ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata 3240 tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 3300 cgagccggaa gcatctcgag tgtgtaccga 3360 atgggctaca cagcagctgt tcaacaagag 3420 tagaggacat attcacagtg aacataactg 3480 aatcaaatgt ttgggaatgg tgcccttgga 3540 ccctatatgt ggcattcctt tctttaaact 3600 tgccttctag acactgaagg caaatctcct 3660 ttgtccattt acctggaaac cagaatgatt ttgacataca ggagagctgc agttgtgaaa 3720 gcaccatcat catagaggat gatgtaatta aaaaatggtc agtgtgcaaa gaaaagaact 3780 gcttgcattt ctttatttct gtctcataat tgtcaaaaac cagaattagg tcaagttcat 3840 agtttctgta attggctttt gaatcaaaga atagggagac aatctaaaaa atatct tagg 3900 ttggagatga cagaaatatg attgatttga agtggaaaaa gaaattctgt taatgttaat 3960 taaagtaaaa ttattccctg aattgtttga tattgtcacc tagcagatat gtattacttt 4020 tctgcaatgt tattattggc ttgcactttg tgagtattct atgtaaaaat atatatgtat 4080 ataaaatata tattgcatag gacagactta ggagttttgt ttagagcagt taacatctga 4140 agtgtctaat gcattaactt ttgtaaggta ctgaatactt aatatgtggg aaaccctttt 4200 gcgtggtcct taggcttaca atgtgcactg aatcgtttca tgtaagaatc caaagtggac 4260 accattaaca ggtctttgaa atatgcatgt actttatatt ttctatattt gtaactttgc 4320 atgttcttgt tttgttatat aaaaaaattg taaatgttta atatctgact gaaattaaac 4380 gagcgaagat gagcaccacc tcccgtgtct gcagttgtat ttcctggtgc ttgccctgtg 4440 ttggggactg ttttgggggt taatctgagc caagtggcgc tttctgtcct cccttctcaa 4500 gtgatggccg atggttcacg cacttccccc tgttcctgcc cttgtcctca cttcccagtc 4560 acccactagt tcatctctgc ggcttttgca ttttctccac aagcatctaa gtgggcttag 4620 cactggtaaa ctgcaaaggc actattgcag caggaggaac agtctgggag cttttttcag 4680 tcctggattt agaaatagat tttcttgatt aaaatgaaaa ttaacaagct ctaaagaact 4740 gttgaccctt gaactacaca gggattagag gcactgacct gccgcacagt cgaaaatctg 4800 cagagaagtt ttttttgttt tgttttgttt tttttgagac ggagtctcgc tctgtcgccc 4860 aggctggagt gcagtggcgg gatctcggct cactgcaacc tccgcctccc gggttcaggc 4920 gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggactacag gcatatgcca ccatgcccgg 4980 ctaatttttg tatttttagt agagatggag tttcaccata ttggccaggc tgttctcaaa 5040 ctcggcctca agtgatctgc tcgcctcagc cacccaaagt gctaggatta caagcatgag 5100 ccaccgcgcc cggcctgcat agaactttta actcccccaa aacttaattg ctaatagatt 5160 aattgcctgc tgttggctgg aagccttacc aataacgtaa acagttggtt agcacatatt 5220 tcacatgtca tatatactat atactgtatt cttaccataa agtaagttag agaaaatgtt 5280 gttaaaacaa tgaggaagga aaagtatatt tactattcac tgactggaag tggatcatca 5340 taaagatctt catctcatct tcctcacatt gaggaaggct gaggaggaag gggaggggtt 5400 ggtcttgctg tctcctgggt ggcagaggca gaagaaaatc tgtgtctcgt ggactcagtt 5460 ccaacccgtg gtgttcaagg gtcacctgtg cctgctttat gcaccccaaa tcaggctcta 5520 aaatagtctc aggtcctgtg agccttagtg acacactctt ctcagattca atacctttga 5580 tctgaaaggt gactttgatt tgtcataatc ttccaactca ttctctacat gtttcgacgc 5640 accagcactg tgatgttctt ggttatcctt ggcagaagtt ttctcctgca actaatttgc 5700 taaaggcagg gggtaatcag aagtgacagt ggttgaaatc acaggccaat atcttagcaa 5760 acgtctgtgt tgtaaatggg gaagtgcctc tggtggggtc ttcaaggatc actccagcct 5820 ggctagggaa actctagggg agaggcactt gaaattattg tactcatagg tcctagagag 5880 ggaggcatgt catgccaagc agggggctgg attggaggcg tgcccaggga ttgggtgcaa 5940 ctcagcgtgt atgagacaga aagagagaga actcctgggc aagtgccttt actgggagcc 6000 aggatggagg acacaagcac aaggtgtaag gggatctcac tggtgtgttt gaatgtcact 6060 aagtcacagt caggggaaga caagaagtgg aacttgtggc agggaccagc cttattacac 6120 tggcacctgg ttacctggac agggtgccca ctgcctattt gtaggatgtc aaggtatcag 6180 gaaaatatga agtttttaaa aatttacaat ataatgccaa cctcctacgg tgatcagagg 6240 atcagctttg tattaaagat ggaaagatac caatcatcac ccacaaaact actaaaacag 6300 aaagaatgac aaatacaatt ctcggccagg cacagttgct cacgcctgta atccctgcac 6360 tttgggaggc cgaggcaggc agatcacttg aggtcaggag ttcaagacca gcctggccaa 6420 catggtgaaa cccccattcc ctactaaaat tacaaaaaat tagctgggtg tggtcgcacg 6480 tgcctgtaat cccagctact caggaggctg aggcaggaga atcgcttata accgggaggc 6540 agaggctgca gtgagccgag atcccgccat tgcactccag cctggcggta agagcgaaac 6600 tccgtctcaa aaaaataaaa taaaataaac ttttcattac ctgcctataa taatttctca 6660 aaaagagtca actgaggaga cttaaagtgt tcgaagcata gctacttgta ggaccagagt 6720 gaataatatc cacctgtatc tttcccaggc ctcatgtttc ctttgttatt tcaaacgtgt 6780 gagtcatgca aaaggaattt ttactaaaaa ggaaaagaaa aaaatttaaa atgaccagca 6840 taaacataat tgagttcaat cccccagaaa gggttattcg gggaacagcc aggcgctgcc 6900 cttgtttttc cccctcccca tctggggcta agaccaaaag gggtctgtct ttggagggaa 6960 atctgggtct gtacagcttc ccactctaag gggagcctta atcccagccg gaacctgagc 7020 ttctccaggc aaggcctgac cttgccgact gatctaagca ttctgcgctt cattttcacc 7080 ccagaaaggt gacttcctcc tggctggggg gctcctcccc taggactcag ctcatcctga 7140 actaataacc gcgttatgtc catcctttgt tccgttcttt gagtcccacc catgttcttc 7200 aggaaagctg cagctggtcc acgtgccttg cctgtgcttc tgtagaacta cccctccctt 7260 ctctgcctgc agcagggctc ctggaacttg aatgtgcact tgaatctgca ggtcctgact 7320 gtaggtctgt gtttctaaca tgctgctggg tgacgctgtg cccgtcctgt ggtcggcatt 7380 gtaacaaggc tccgcgggtt cccacgccgg agtctgcgtc agaaacctct ggagggcttg 7440 ttatacacag atggctgaac cccatcccca gagtttctga ttccctagta ccagggtggg 7500 gtctgagaat ttgcatttct aacaaattcc ggtcacatgg aaaccactgc tcggcagatg aatactcaca aagctgctgt ggagaccaga cctgcctggg aggaagagag agctgggagc 5 gaggtgacta actcctgccg tctgaaaata cttagtgaga gatatagtta aacttggaaa tcagattcag atçtacacat gaaccacctg tgtagctctg aggtgagctc agagattctg ggttaattgc gcgcttggcg taatcatggt 10 cgctcacaat tccacacaac atacgagccg aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 15 caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 20 tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cagccactgg taacaggatt agcagagcga agtggtggcc taactacggc tacactagaa agccagttac cttcggaaaa agagttggta 25 gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc aagatccttt gatcttttct acggggtctg ggattttggt catgagatta tcaaaaagga gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 30 tccccgtcgt gtagataact acgatacggg tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa
caggtgatac tgatgctgct ggtgcggaga 7560 caaaagaagc agaagccgcc ccaaccctga 7620 cacctgccgg gggaatgaga gcctggggat 7680 tctatgggtg aatgccaatg gaggtgcaag 7740 gtgaagcaca gccgaggcct gaagcccacc 7800 tggtgcccag tcacttgaaa acagcacttc 7860 aggatcttat taaaatgtgg gttctgaggc 7920 cggtacccag cttttgttcc ctttagtgag 7980 catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 8040 gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 8100 tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 8160 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 8220 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 8280 tacggttatc cacagaatca ggggataacg 8340 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 8400 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 8460 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 8520 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 8580 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 8640 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 8700 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 8760 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 8820 ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 8880 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 8940 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 9000 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 9060 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 9120 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 9180 gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 9240 agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 9300 cagatttatc agcaataaac cagccagccg 9360 ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 9420 gttgccggga agctagagta agtagttcgc ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt cagcactgca taattctctt actgtcatgc agtactcaac caagtcattc tgagaatagt cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa gaatactcat actcttcctt tttcaatatt tgagcggata catatttgaa tgtatttaga ttccccgaaa agtgccac <210> 17 <211> 6960 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> vetor pcDNA3.1- -FIX <400> 17 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg gattattgac tagttattaa tagtaatcaa tggagttccg cgttacataa cttacggtaa cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg attgacgtca atgggtggag tatttacggt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg atgcccagta catgacctta tgggactttc tcgctattac catggtgatg cggttttggc actcacgggg atttccaagt ctccacccca cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 9480 cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 9540 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 9600 tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 9660 catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 9720 gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 9780 gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 9840 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 9900 catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 9960 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 10020 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 10080 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 10140 10158 ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 gtttaaactt aagcttgcat gccaattccg caaaggttat gcagcgcgtg aacatgatca 960 tggcagaatc accaggcctc atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat 1020 gtacagtttt tcttgatcat gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata 1080 attcaggtaa attggaagag tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa 1140 agtgtagttt tgaagaagca cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt 1200 ggaagcagta tgttgatgga gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt 1260 gcaaggatga cattaattcc tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact 1320 gtgaattaga tgtaacatgt aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata 1380 gtgctgataa caaggtggtt tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga 1440 agtcctgtga accagcagtg ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta 1500 agctcacccg tgctgagact gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg 1560 aaaccatttt ggataacatc actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgggttg 1620 ttggtggaga agatgccaaa ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag 1680 ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact 1740 gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag 1800 aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag 1860 ctattaataa gtacaaccat gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa 1920 acagctacgt tacacctatt tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat 1980 ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag 2040 ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt 2100 tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc 2160 aaggagatag tgggggaccc catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa 2220 ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat 2280 cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa caaagctcac ttaatgggat cggtcgagcg 2340 gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag 2400 ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 2460 tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 2520 ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 2580 caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 2640 ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 2700 tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 2760 cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 2820 tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 2880 tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 2940 cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 3000 ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 3060 gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 3120 aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 3180 accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 3240 aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 3300 agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 3360 gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 3420 ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca gcacgtgatg 3480 aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc 3540 gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta 3600 ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 3660 tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 3720 gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa 3780 gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg tcgcggaggc catggatgcg 3840 atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 3900 ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 3960 tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 4020 atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 4080 aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 4140 ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt 4200 atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg 4260 ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc 4320 aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc 4380 gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt 4440 gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa 4500 tagcacgtgc tacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga 4560 atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc 4620 ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 4680 acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 4740 atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 4800 tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 4860 gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 4920 gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 4980 atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 5040 actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 5100 gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 5160 cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 5220 ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 5280 ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 5340 ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 5400 agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 5460 cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 5520 aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 5580 gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 5640 agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 5700 ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 5760 cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 5820 tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 5880 aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 5940 tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 6000 atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 6060 cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 6120 gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 6180 gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 6240 tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 6300 tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 6360 tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 6420 aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 6480 atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 6540 tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 6600 catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 6660 aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 6720 tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 6780 gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 6840 tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 6900 tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 6960 <210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<4 00> 18
ggaccgctcg agtcagtcct gctcctcggc cac 33
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 19
ctcctcttcc tcccatctta cc 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial <220>
<223> Iniciador
<4 00> 20
cgaagtcgtc ctccacgaag te 22 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 21
agcgagcacg tactcggatg
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 22
aagcacgagg aagcggtcag 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial <22 0>
<223> Iniciador
<400> 23 atggccaagt tgaccagtge cg
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Iniciador
<400> 24
22 gtcagtcctg ctcctcggcc ac 22
<210> 25
<211> 6237
<212> DNA
<213> artificial <220>
<223> Expression vector
<4 00> 25
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt aacggccgcc agtgtgctgg 960 aattcggcta tggctggacc tgccacccag agccccatga agctgatggc cctgcagctg 1020 ctgctgtggc acagtgcact ctggacagtg caggaagcca cccccctggg ccctgccagc 1080 tccctgcccc agagcttcct gctcaagtgc ttagagcaag tgaggaagat ccagggcgat 1140 ggcgcagcgc tccaggagaa gctgtgtgcc acctacaagc tgtgccaccc cgaggagctg 1200 gtgctgctcg gacactctct gggcatcccc tgggctcccc tgagcagctg ccccagccag 1260 gccctgcagc tggcaggctg cttgagccaa ctccatagcg gccttttcct ctaccagggg 1320 ctcctgcagg ccctggaagg gatctccccc gagttgggtc ccaccttgga cacactgcag 1380 ctggacgtcg ccgactttgc caccaccatc tggcagcaga tggaagaact gggaatggcc 1440 cctgccctgc agcccaccca gggtgccatg ccggccttcg cctctgcttt ccagcgccgg 1500 gcaggagggg tcctggttgc ctcccatctg cagagcttcc tggaggtgtc gtaccgcgtt 1560 ctacgccacc ttgcccagcc ctgaagccga attctgcaga tatccatcac actggcggcc 1620 gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 1680 ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 1740 cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 1800 tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 1860 gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc 1920 tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 1980 gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg CtttCttCCC 2040 ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 2100 agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg 2160 ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 2220 gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 2280 ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 2340 ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 2400 tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 2460 aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 2520 tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 2580 tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 2640 gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 2700 tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcagca cgtgatgaaa 2760 aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc 2820 tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga 2880 gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat 2940 gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa 3000 ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac 3060 ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc 3120 gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt 3180 caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg 3240 caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg 3300 ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac 3360 aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc 3420 ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg 3480 gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc 3540 cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat 3600 ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg 3660 actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta 3720 gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag 3780 cacgtgctac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc 3840 gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc 3900 gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 3960 aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 4020 aatgtatctt atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg 4080 tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc 4140 ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg 4200 ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 4260 ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 4320 gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 4380 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 4440 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 4500 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 4560 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 4620 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 4680 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 4740 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 4800 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 4860 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 4920 agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 4980 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 5040 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 5100 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 5160 atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 5220 gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 5280 tgtctatttc gttcatccat agttgcctga gagggcttac catctggccc cagtgctgca ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc actttatccg cctccatcca gtctattaat 5 ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttggccgcag tgttatcact catggttatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 10 tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg agcagaactt taaaagtgct catcattgga atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 15 tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca <210> 26 <211> 9975 <212> DNA 20 <213> artificial <220>
<223> Expression Vector <4 00> 26
cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca 25 aattacgggg tcattagttc atagcccata aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 30 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 5340 atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 5400 ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 5460 tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 5520 attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 5580 tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 5640 ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 5700 gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 5760 gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 5820 gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 5880 aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 5940 taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 6000 tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 6060 tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 6120 atgagcggat acatatttga atgtatttag 6180 tttccccgaa aagtgccacc tgacgtc 6237 ttgattattg actagttatt aatagtaatc 60 tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 120 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 180 ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 240 gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 300 ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 360 catcgctatt accatggtga tgcggttttg 420 tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 480 ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 540 taacaactcc gccccattga cgcaaatggg aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc gactcactat agggagaccc aagctggcta ggatccacta gtccagtgtg gtggaattct 5 agatgcaaat agagctctcc acctgcttct ccaccagaag atactacctg ggtgcagtgg tcggtgagct gcctgtggac gcaagatttc acacctcagt cgtgtacaaa aagactctgt tcgctaagcc aaggccaccc tggatgggtc 10 atgatacagt ggtcattaca cttaagaaca ttggtgtatc ctactggaaa gcttctgagg gggagaaaga agatgataaa gtcttccctg tgaaagagaa tggtccaatg gcctctgacc atgtggacct ggtaaaagac ttgaattcag 15 aagggagtct ggccaaggaa aagacacaga tatttgatga agggaaaagt tggcactcag atgctgcatc tgctcgggcc tggcctaaaa ctctgccagg tctgattgga tgccacagga gcaccactcc tgaagtgcac tcaatattcc 20 atcgccaggc gtccttggaa atctcgccaa tggaccttgg acagtttcta ctgttttgtc aagcttatgt caaagtagac agctgtccag aagaagcgga agactatgat gatgatctta atgatgacaa ctctccttcc tttatccaaa 25 cttgggtaca ttacattgct gctgaagagg cccccgatga cagaagttat aaaagtcaat ggaagtacaa aaaagtccga tttatggcat ctattcagca tgaatcagga atcttgggac tgttgattat atttaagaat caagcaagca 30 ctgatgtccg tcctttgtat tcaaggagat ttccaattct gccaggagaa atattcaaat caactaaatc agatcctcgg tgcctgaccc
cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 600 cactgcttac tggcttatcg aaattaatac 660 gcgtttaaac ttaagcttgg taccgagctc 720 gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg 780 ttctgtgcct tttgcgattc tgctttagtg 840 aactgtcatg ggactatatg caaagtgatc 900 ctcctagagt gccaaaatct tttccattca 960 ttgtagaatt cacggatcac cttttcaaca 1020 tgctaggtcc taccatccag gctgaggttt 1080 tggcttccca tcctgtcagt cttcatgctg 1140 gagctgaata tgatgatcag accagtcaaa 1200 gtggaagcca tacatatgtc tggcaggtcc 1260 cactgtgcct tacctactca tatctttctc 1320 gcctcattgg agccctacta gtatgtagag 1380 ccttgcacaa atttatacta ctttttgctg 1440 aaacaaagaa ctccttgatg caggataggg 1500 tgcacacagt caatggttat gtaaacaggt 1560 aatcagtcta ttggcatgtg attggaatgg 1620 tcgaaggtca cacatttctt gtgaggaacc 1680 taactttcct tactgctcaa acactcttga 1740 atatctcttc ccaccaacat gatggcatgg 1800 aggaacccca actacgaatg aaaaataatg 1860 ctgattctga aatggatgtg gtcaggtttg 1920 ttcgctcagt tgccaagaag catcctaaaa 1980 aggactggga ctatgctccc ttagtcctcg 2040 atttgaacaa tggccctcag cggattggta 2100 acacagatga aacctttaag actcgtgaag 2160 ctttacttta tggggaagtt ggagacacac 2220 gaccatataa catctaccct cacggaatca 2280 taccaaaagg tgtaaaacat ttgaaggatt 2340 ataaatggac agtgactgta gaagatgggc 2400 gctattactc tagtttcgtt aatatggaga 2460 gagatctagc ttcaggactc attggccctc tcctcatctg ctacaaagaa tctgtagatc 2520 aaagaggaaa ccagataatg tcagacaaga ggaatgtcat cctgttttct gtatttgatg 2580 agaaccgaag ctggtacctc acagagaata tacaacgctt tctccccaat ccagctggag 2640 tgcagcttga ggatccagag ttccaagcct ccaacatcat gcacagcatc aatggctatg 2700 tttttgatag tttgcagttg tcagtttgtt tgcatgaggt ggcatactgg tacattctaa 2760 gcattggagc acagactgac ttcctttctg tcttcttctc tggatatacc ttcaaacaca 2820 aaatggtcta tgaagacaca ctcaccctat tcccattctc aggagaaact gtcttcatgt 2880 cgatggaaaa cccaggtcta tggattctgg ggtgccacaa ctcagacttt cggaacagag 2940 gcatgaccgc cttactgaag gtttctagtt gtgacaagaa cactggtgat tattacgagg 3000 acagttatga agatatttca gcatacttgc tgagtaaaaa caatgccatt gaaccaagaa 3060 gcttctccca gaattcaaga catcaagctt atcgataccg tcgaggggaa ataactcgta 3120 ctactcttca gtcagatcaa gaggaaattg actatgatga taccatatca gttgaaatga 3180 agaaggaaga ttttgacatt tatgatgagg atgaaaatca gagcccccgc agctttcaaa 3240 agaaaacacg acactatttt attgctgcag tggagaggct ctgggattat gggatgagta 3300 gctccccaca tgttctaaga aacagggctc agagtggcag tgtccctcag ttcaagaaag 3360 ttgttttcca ggaatttact gatggctcct ttactcagcc cttataccgt ggagaactaa 3420 atgaacattt gggactcctg gggccatata taagagcaga agttgaagat aatatcatgg 3480 taactttcag aaatcaggcc tctcgtccct attccttcta ttctagcctt atttcttatg 3540 aggaagatca gaggcaagga gcagaaccta gaaaaaactt tgtcaagcct aatgaaacca 3600 aaacttactt ttggaaagtg caacatcata tggcacccac taaagatgag tttgactgca 3660 aagcctgggc ttatttctct gatgttgacc tggaaaaaga tgtgcactca ggcctgattg 3720 gaccccttct ggtctgccac actaacacac tgaaccctgc tcatgggaga caagtgacag 3780 tacaggaatt tgctctgttt ttcaccatct ttgatgagac caaaagctgg tacttcactg 3840 aaaatatgga aagaaactgc agggctccct gcaatatcca gatggaagat cccactttta 3900 aagagaatta tcgcttccat gcaatcaatg gctacataat ggatacacta cctggcttag 3960 taatggctca ggatcaaagg attcgatggt atctgctcag catgggcagc aatgaaaaca 4020 tccattctat tcatttcagt ggacatgtgt tcactgtacg aaaaaaagag gagtataaaa 4080 tggcactgta caatctctat ccaggtgttt ttgagacagt ggaaatgtta ccatccaaag 4140 ctggaatttg gcgggtggaa tgccttattg gcgagcatct acatgctggg atgagcacac 4200 tttttctggt gtacagcaat aagtgtcaga ctcccctggg aatggcttct ggacacatta 4260 gagattttca gattacagct tcaggacaat atggacagtg ggccccaaag ctggccagac 4320 ttcattattc cggatcaatc aatgcctgga gcaccaagga gcccttttct tggatcaagg 4380 tggatctgtt ggcaccaatg attattcacg gcatcaagac ccagggtgcc cgtcagaagt 4440 tctccagcct ctacatctct cagtttatca tcatgtatag tcttgatggg aagaagtggc 4500 agacttatcg aggaaattcc actggaacct taatggtctt ctttggcaat gtggattcat 4560 ctgggataaa acacaatatt tttaaccctc caattattgc tcgatacatc cgtttgcacc 4620 caactcatta tagcattcgc agcactcttc gcatggagtt gatgggctgt gatttaaata 4680 gttgcagcat gccattggga atggagagta aagcaatatc agatgcacag attactgctt 4740 catcctactt taccaatatg tttgccacct ggtctccttc aaaagctcga cttcacctcc 4800 aagggaggag taatgcctgg agacctcagg tgaataatcc aaaagagtgg ctgcaagtgg 4860 acttccagaa gacaatgaaa gtcacaggag taactactca gggagtaaaa tctctgctta 4920 ccagcatgta tgtgaaggag ttcctcatct ccagcagtca agatggccat cagtggaccc 4980 tcttttttca gaatggcaaa gtaaaggttt ttcagggaaa tcaagactcc ttcacacctg 5040 tggtgaactc tctagaccca ccgttactga ctcgctacct tcgaattcac ccccagagtt 5100 gggtgcacca gattgccctg aggatggagg ttctgggctg cgaggcacag gacctctact 5160 gagcggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 5220 gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 5280 tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 5340 ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg 5400 gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc tagggggtat 5460 ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 5520 accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg CtttCttCCC ttcctttctc 5580 gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 5640 tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 5700 gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 5760 agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 5820 ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 5880 tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct 5940 ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa 6000 agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa 6060 ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 6120 ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctctgcct 6180 ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 6240 tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcagca cgtgatgaaa aagcctgaac 6300 tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga 6360 tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat 6420 atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc 6480 actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga 6540 gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa 6600 ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg 6660 atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta 6720 catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga 6780 tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg 6840 aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga 6900 cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc 6960 aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga 7020 cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata 7080 tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg 7140 cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc 7200 gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg 7260 ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag cacgtgctac 7320 gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg 7380 acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccca 7440 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 7500 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 7560 atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 7620 ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 7680 agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 7740 tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 7800 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 7860 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 7920 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 7980 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 8040 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 8100 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 8160 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 8220 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 8280 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 8340 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 8400 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 8460 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 8520 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc 8580 gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt 8640 ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct 8700 agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 8760 ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 8820 gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 8880 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 8940 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 9000 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 9060 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 9120 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 9180 gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 9240 tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 9300 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 9360 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 9420 taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 9480 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 9540 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 9600 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 9660 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 9720 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtcgac ggatcgggag 9780 atctcccgat cccctatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 9840 ccagtatctg ctccctgctt gtgtgttgga ggtcgctgag tagtgcgcga gcaaaattta 9900 agctacaaca aggcaaggct tgaccgacaa ttgcatgaag aatctgctta gggttaggcg 9960 ttttgcgctg cttcg 9975 <210> 27
<211> 51 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Iniciador <4 00> 27
ggcaagaatt cgcagagcag tcattatggc caagttgacc agtgccgttc c 51
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Iniciador
<4 00> 28 ctagaggtcc aggtcatctt g
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial <220>
<223> Iniciador
<400> 29
tcagggaaat tggggatcct g
Claims (17)
1. Linhagem de célula humana somática, imortalizada, isenta de proteína de príon (PrP) em que ambos os alelos do gene de PrP foram com- pletamente deletados.
2. Linhagem de célula de acordo com a reivindicação 1, a qual: (i) é capaz de ser transfectada e ser cultivada sob condições i- sentas de soro; e/ou (ii) tem seqüências adenovirais integradas em seu genoma; e/ou (Hi) é derivada de uma célula inicial selecionada do grupo consis- tindo em células de rim, bexiga, fígado, pulmão, músculo cardíaco, músculo liso, ovário e gastrintestinais, de preferência a célula inicial é uma linhagem de célula de rim humano; e/ou (iv) é adequada para a produção de proteínas recombinantes.
3. Linhagem de célula de acordo com a reivindicação 2, em que as células de rim são células de rim fetal humano, de preferência as células de rim fetal humano são selecionada de células 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), células FreeStyIe 293 (células 293F; Invitrogen R79007) e células 293T (DSM ACC 2494), de preferência são células 293F (Invitrogen R79007).
4. Linhagem de célula de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3 em que os alelos do gene de PrP foram completamente deleta- dos através de recombinação homóloga com "knockout traps" trazendo ge- nes de marcador selecionável ou de seleção, de modo que expressão do marcador selecionável ou de seleção é acionada pelo promotor de PrP en- dógeno.
5. Linhagem de célula de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, incluindo, mas não limitado a, linhagem de célula 293F isenta de príon final pf293F e todas as populações mistas intermediárias e clones isolados necessários para isolar a mesma.
6. Método para produção da linhagem de célula humana somáti- ca imortalizada, isenta de príon como definida em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 5, método o qual compreende subsequente deleção da ORF de PrP na respectiva célula inicial através de recombinação homóloga com vá- rios construtos de "knockout" de PrP ou com o mesmo construto e realização de seleção com antibiótico em concentrações progressivamente crescentes.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que os constru- tos de "knockout" trazem os mesmos ou diferentes genes marcadores de seleção sem promotor ou marcadores selecionáveis flanqueados por duas seqüências homólogas ao sítio de inserção dentro do gene de PrP da célula inicial.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que os constru- tos de "knockout": (i) trazem diferentes genes marcadores de seleção; e/ou (ii) ainda trazem uma das seguintes seqüências funcionais: uma seqüência poliA, seqüências de reconhecimento de recombinase, IRES; e/ou (iii) as seqüências homólogas têm um comprimento de 1 a 10 kb, de preferência cerca de 6 kb e/ou correspondem à seqüências a montante e a jusante da ORF de PrP da linhagem de célula inicial, mais preferivelmente as seqüências homólogas são aquelas mostradas em SEQ ID NOs: 2 e 3; e/ou (iv) os marcadores de seleção codificam marcadores de seleção positivos incluindo, mas não limitado a, neomicina, zeocina, higromicina; e o marcador selecionável inclui marcadores de fluorescência, tais como GFP e Dsred e enzimas, tal como LacZ.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que os constru- tos de "knockout" têm uma ou mais das seqüências mostradas em SEQ ID NOs: 1 e 16.
10. Construto de "knockout" de PrP como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 9.
11. Uso da linhagem de célula humana imortalizada isenta de PrP como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para a produ- ção recombinante isenta de PrP de uma proteína humana ou anticorpo ou um derivado ou mutante do mesmo (proteína-alvo).
12. Método para preparo de uma linhagem de célula humana para a produção recombinante isenta de PrP de uma proteína humana ou anticorpo ou um derivado ou mutante do mesmo (proteína-alvo) o qual com- preende transfecção de uma linhagem de célula hospedeira humana imorta- lizada isenta de PrP como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, com um vetor de transfecção compreendendo uma origem de replicação e um gene que codifica a referida proteína-alvo humana, pelo que o gene para a proteína-alvo humana é ligada, em sua extremidade 5', a um promotor e, em sua extremidade 3', com um sinal poliA.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que: (i) a transfecção é realizada sob condições isentas de soro; e/ou (ii) o vetor de transfecção é derivado do vetor pcDNA3.1 da Invi- trogen; e/ou (iii) a proteína-alvo humana é um fator de coagulação sanguí- nea, tal como fator de coagulação sanguínea Vlll (incluindo fator Vlll do tipo selvagem ou um fator Vlll com domínio B deletado), fator de coagulação sanguínea IX, fator Vll/Vlla, um fator de crescimento humano tal como, por exemplo, G-CSF ou GM-CSF, vWF ou alfa-1-antitripsina (A1AT) ou um anti- corpo humano.
14. Linhagem de célula de produção humana imortalizada isenta de PrP estavelmente transfectada, de preferência sob condições isentas de soro, com o vetor de transfecção como definido na reivindicação 12 ou 13.
15. Método para a produção recombinante isenta de PrP de uma proteína-alvo humana a qual compreende cultura, de preferência sob condi- ções isentas de soro, da linhagem de célula de produção humana imortali- zada isenta de PrP de acordo com a reivindicação 14.
16. Linhagem de célula imortalizada isenta de proteína de príon (PrP) em que ambos os alelos do gene de PrP foram completamente deleta- dos, selecionada de células HEK 293F ou células Per.C6 (células de retina fetal humana imortalizadas), células CHO (células de Ovário de Hâmster Chinês) e células BHK (células de Rim de Hâmster Bebê).
17. Uso da linhagem de célula imortalizada isenta de PrP como definida na reivindicação 16 para a produção recombinante isenta de PrP de uma proteína humana ou anticorpo ou um derivado ou mutante do mesmo (proteína-alvo).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06124427 | 2006-11-20 | ||
| EP06124427.3 | 2006-11-20 | ||
| PCT/EP2007/062597 WO2008061995A2 (en) | 2006-11-20 | 2007-11-20 | Genetic ablation of the prp gene cells using a targeted promoter trap strategy for production of serum-free recombinant proteins as therapeuticals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0718989A2 true BRPI0718989A2 (pt) | 2014-02-11 |
Family
ID=37685785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0718989-3A2A BRPI0718989A2 (pt) | 2006-11-20 | 2007-11-20 | Ablação genética de células com gene prp usando uma estratégia de captura de promotor direcionada para a produção de proteínas recombinantes isentas de soro como produtos terapêuticos. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2084269A2 (pt) |
| KR (1) | KR20090106474A (pt) |
| CN (1) | CN101605891A (pt) |
| AU (1) | AU2007324530A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0718989A2 (pt) |
| CA (1) | CA2670003A1 (pt) |
| IL (1) | IL198770A0 (pt) |
| MX (1) | MX2009005277A (pt) |
| NO (1) | NO20091875L (pt) |
| RU (1) | RU2009123458A (pt) |
| WO (1) | WO2008061995A2 (pt) |
| ZA (1) | ZA200903429B (pt) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2011250912A1 (en) * | 2010-05-12 | 2012-11-22 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| CN102277379B (zh) * | 2011-08-18 | 2013-07-24 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 表达凝血因子viii的表达载体及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
| WO1993010227A1 (en) * | 1991-11-14 | 1993-05-27 | Charles Weissmann | Transgenic animals lacking prion proteins |
| AU767893B2 (en) * | 1998-12-22 | 2003-11-27 | Regents Of The University Of California, The | Somatic cells with ablated Prp gene and methods of use |
| BR0109521A (pt) * | 2000-03-24 | 2003-06-10 | Univ Massachusetts Public Inst | Ungulados transgênicos sem prìons |
| US7265262B2 (en) * | 2001-03-21 | 2007-09-04 | Roslin Institute (Edinburgh) | Telomerizing nuclear donor cells and improving the efficiency on nuclear transfer |
-
2007
- 2007-11-20 BR BRPI0718989-3A2A patent/BRPI0718989A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-11-20 CN CNA2007800466531A patent/CN101605891A/zh active Pending
- 2007-11-20 EP EP07847234A patent/EP2084269A2/en not_active Withdrawn
- 2007-11-20 KR KR1020097012589A patent/KR20090106474A/ko not_active Withdrawn
- 2007-11-20 AU AU2007324530A patent/AU2007324530A1/en not_active Abandoned
- 2007-11-20 MX MX2009005277A patent/MX2009005277A/es not_active Application Discontinuation
- 2007-11-20 WO PCT/EP2007/062597 patent/WO2008061995A2/en not_active Ceased
- 2007-11-20 RU RU2009123458/10A patent/RU2009123458A/ru not_active Application Discontinuation
- 2007-11-20 CA CA002670003A patent/CA2670003A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-05-13 NO NO20091875A patent/NO20091875L/no not_active Application Discontinuation
- 2009-05-14 IL IL198770A patent/IL198770A0/en unknown
- 2009-05-19 ZA ZA200903429A patent/ZA200903429B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008061995A2 (en) | 2008-05-29 |
| MX2009005277A (es) | 2009-05-28 |
| EP2084269A2 (en) | 2009-08-05 |
| IL198770A0 (en) | 2011-08-01 |
| CN101605891A (zh) | 2009-12-16 |
| WO2008061995A3 (en) | 2008-07-10 |
| CA2670003A1 (en) | 2008-05-29 |
| ZA200903429B (en) | 2010-04-28 |
| KR20090106474A (ko) | 2009-10-09 |
| NO20091875L (no) | 2009-07-28 |
| RU2009123458A (ru) | 2010-12-27 |
| AU2007324530A1 (en) | 2008-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20230091894A (ko) | 부위 특이적 표적화 요소를 통한 프로그램 가능한 첨가(paste)를 사용하는 부위 특이적 유전 공학을 위한 시스템, 방법, 및 조성물 | |
| KR102652494B1 (ko) | 전장 t-세포 수용체 오픈 리딩 프레임의 신속한 조립 및 다양화를 위한 2-성분 벡터 라이브러리 시스템 | |
| KR20210056329A (ko) | 신규 cas12b 효소 및 시스템 | |
| KR20220047623A (ko) | 세포 유형 운명 특정화의 조절인자를 확인하기 위한 조성물 및 방법 | |
| KR101320489B1 (ko) | 인간 세포주에서 재조합 인간 단백질의 무혈청의 안정한형질감염 및 생산 | |
| KR20090122465A (ko) | 염증성 질환의 치료 | |
| KR20230035689A (ko) | 조작된 캐스케이드 구성성분 및 캐스케이드 복합체 | |
| AU2017352591B2 (en) | A two-part device for T-cell receptor synthesis and stable genomic integration to TCR-presenting cells | |
| EA030440B1 (ru) | Сопровождающая диагностика для терапии антигиалуронановым агентом и способы ее применения | |
| CN110684804B (zh) | 递送外源rnp的慢病毒载体及其制备方法 | |
| KR20160002880A (ko) | 엔도솜 포집을 극복하기 위해 설계된 인공 전사 인자 | |
| KR20100049084A (ko) | 질병 진단을 위한 방법 및 조성물 | |
| CN110042124A (zh) | 基因组碱基编辑增加人红细胞中胎儿血红蛋白水平的试剂盒及应用 | |
| CN101657097A (zh) | 以炎症为特征的疾病的治疗 | |
| KR101921698B1 (ko) | 재조합에 의해 제조된 인간 인자 ⅷ 및 ⅸ | |
| JP2024037917A (ja) | 組換えｔ細胞受容体遺伝子を用いて細胞ベースの治療薬を製造するための技法 | |
| KR20240029020A (ko) | Dna 변형을 위한 crispr-트랜스포손 시스템 | |
| CN111094569A (zh) | 光控性病毒蛋白质、其基因及包含该基因的病毒载体 | |
| KR20220016485A (ko) | 미엘린 단백질 제로 프로모터를 갖는 aav 벡터, 및 샤르코-마리-투스 질환과 같은 슈반 세포-관련 질환을 치료하기 위한 이의 용도 | |
| CN113474453B (zh) | 用于治疗iv a型粘多糖的腺相关病毒载体 | |
| CN114786685B (zh) | 一种基于线粒体的药物递送系统及其用途 | |
| KR20160003691A (ko) | Opa1 단상부족에 의해 원인이 되는 질병 치료를 위한 인공전사인자 | |
| KR20240022571A (ko) | Rna-가이드된 이펙터 동원을 위한 시스템, 방법 및 성분 | |
| CN116324408A (zh) | 分泌α-突触核蛋白靶向抗体、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原及两者的复合物以及GDNF的细胞系 | |
| KR20090106474A (ko) | 혈청-불포함 재조합 단백질의 치료제로서의 제조를 위한 표적화된 프로모터 트랩 전략을 이용한 ｐｒｐ 유전자 세포의 유전적 제거 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B11A | Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing | ||
| B11Y | Definitive dismissal - extension of time limit for request of examination expired [chapter 11.1.1 patent gazette] |