BRPI0719072A2

BRPI0719072A2 - Método para preparar um polipeptídeo, polipeptídeo, e, método para realizar uma reação catalisada por lipase

Info

Publication number: BRPI0719072A2
Application number: BRPI0719072-7A
Authority: BR
Inventors: Leonardo De Maria; Jesper Brask; Michael Skjot; Shamkant Anant Patkar; Kim Borch; Allan Svendsen
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2006-11-28
Filing date: 2007-11-26
Publication date: 2013-12-03
Also published as: US20130157325A1; CN101541956B; EP2264158A3; WO2008065060A3; RU2474611C2; EP2264159A3; CN101541956A; EP2099908A2; MY152163A; RU2009124454A; EP2264158A2; EP2264157A2; EP2264159A2; EP2264159B1; WO2008065060A2; EP2264157A3; EP2267121A3; EP2267121B1; EP2267121A2; EP2264157B1

Description

I “MÉTODO PARA PREPARAR UM POLIPEPTÍDEO, POLIPEPTÍDEO, E, MÉTODO PARA REALIZAR UMA REAÇÃO CATALISADA POR LIP ASE”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um polipeptídeo com atividade

de enzima lipolítica e a um método para prepará-lo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

WQ8802775 descreve lipase B de Candida antarctica (CALB). Uppenberg, Hansen, Patkar, Jones, Structure 2, 293-308 (1994) 10 descrevem a seqüência de aminoácidos e a estrutura tridimensional (3D) de CALB. A estrutura 3D foi encontrada no Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCBS PDB) (http://www.rcsb.org/), seu identificador sendo 1TCA.

Variantes de CALB são descritas em Zhang et al. Prot. Eng. 2003, 16, 599-605; Lutz. 2004, Tetrahedron: Asymmetry, 15, 2743-2748; Qian e Lutz, JACS, 2005, 127, 13466-13467; e em WO 2004/024954.

W09324619 descreve uma lipase de Hyphozyma sp. Seqüências de aminoácidos para outras lipases podem ser encontradas em UniProt [o Universal Protein Resource] com números de acesso Q4pepl, Q7RYD2, Q2UE03, Q4WG73, Q6BVP4 e Q4HUY1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores realizaram simulação de dinâmica molecular (MD) sobre a estrutura de 1TCA. A análise revela dois capuzes até agora desconhecidos com mobilidade notável, Capuz 1 consistindo dos resíduos de 25 135 ou 136 a 155 ou 160, e Capuz 2 consistindo dos resíduos 267-295. A simulação indicou uma forma semelhante a mais fechada em solução aquosa e uma forma mais totalmente aberta em solução em solvente orgânico. A análise revelou áreas importantes reveladas na estrutura 3D para afetar a atividade e a funcionalidade da lipase, e os inventores usaram isto para projetar variantes de enzima lipolítica com atividade específica aumentada, particularmente para substratos volumosos (e.g. ésteres de um ácido ramificado ou ácido graxo de cadeia longa e/ou um álcool secundário) e/ou atividade aumentada em pH alto (mais alto que pH ótimo) e/ou enanciosseletividade aumentada.

Ademais, os inventores têm selecionado resíduos de aminoácido e projetado variantes de enzima lipase baseado em um alinhamento de CALB com algumas seqüências de lipase homólogas.

Consequentemente, a invenção proporciona um método para preparar um polipeptídeo, compreendendo

a) selecionar um polipeptídeo originário que tem atividade de enzima lipolítica e tem uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 30% de identidade com CALB (SEQ ID NO: 1),

b) selecionar um ou mais resíduos de aminoácido na seqüência correspondendo a qualquer um dos resíduos 1, 13, 25, 38-51, 53-55, 58, 69- 79, 91, 92, 96, 97, 99, 103, 104-110, 113, 132-168, 173, 187-193, 197-205, 215, 223-231, 242, 244, 256, 259, 261-298, 303, 305, 308-313, ou 315 de CALB (SEQ ID NO: 1),

c) alterar a seqüência de aminoácidos selecionada sendo que a alteração compreende substituição ou deleção do(s) resíduo(s) selecionado(s) ou inserção de pelo menos um resíduo adjacente ao(s) resíduo(s) selecionado(s),

d) preparar um polipeptídeo alterado tendo a seqüência de aminoácidos alterada,

e) determinar a atividade de enzima lipolítica ou a enanciosseletividade para ligações de éster carboxílico do polipeptídeo alterado, e

f) selecionar um polipeptídeo alterado que tem atividade de enzima lipolítica mais alta ou uma enanciosseletividade mais alta do que a do polipeptídeo originário. A invenção também proporciona um polipeptídeo que:

a) tem atividade de enzima lipolítica, e

b) tem uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade (particularmente pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade) com CALB (SEQ ID NO: 1) e tem uma diferença de CALB (SEQ ID NO: 1) que compreende uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido em uma posição correspondendo a qualquer um dos resíduos

1,13, 25, 38-51, 53-55, 58, 69-79, 91, 92, 96, 97, 99, 103, 104-110, 113, 132- 168, 173, 187-193, 197-205, 215, 223-231, 242, 244, 256, 259, 261-298, 303, 305, 308-313, ou 315.

Finalmente, a invenção proporciona o uso do polipeptídeo variante acima em um processo catalisado por lipase.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra um alinhamento de seqüências de aminoácidos de SEQ ID NOS. 1-7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipeptídeo originário

O polipeptídeo originário tem atividade de enzima lipolítica e tem uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 30% de identidade (particularmente pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%) com lipase B de Candida antarctica (CALB, SEQ ID NO: 1) que é descrita em WQ8802775, e cuja seqüência é dada em Uppenberg, J., Hansen, M.T., Patkar, S., Jones, T.A., Structure v2 pp. 293-308, 1994. O polipeptídeo originário pode ser qualquer uma das seguintes lipases. Um alinhamento é mostrado em Fig. 1.

SEQ ID NO: 1: lipase B de Candida antarctica (CALB),

ITCA

SEQ ID NO: 2: Hyphozyma sp., W09324619 SEQ ID NO: 3: Ustilago maydis, UniProt Q4pepl SEQ ID NO: 4: Gibberella zeae (Fusarium graminearum), UniProt Q4HUY1

SEQ ID NO: 5: Debaryomyces hansenii, UniProt Q6BVP4 SEQID NO: 6: Aspergillus fumigatus, UniProt Q4WG73

SEQ ID NO: 7: Aspergillus oryzae, UniProt Q2UE03

SEQ ID NO: 8: lipase de Neurospora crassa, UniProt

Q7RYD2

O alinhamento foi feito usando o programa agulha do pacote 10 EMBOSS (http://www.emboss.org) versão 2.8.0 com os seguintes parâmetros: Penalidade de abertura de lacuna: 10,00, Penalidade de extensão de lacuna: 0,50, Matriz de substituição: EBLOSUM62. O programa de computador é descrito em EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice,P. LongdenJ. e BleasbyA, Trends in Genetics 16, 15 (6) pp276-277. O programa agulha implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453, e Kruskal, J. B. (1983).

Outros polipeptídeos originários podem alinhar com as seqüências em Fig. 1 pelo mesmo método ou pelos métodos descritos em D. Sankoff e J. B. Kruskal, (ed.), "Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison", pp. 1-44 Addison Wesley. Capuzes e estrutura tridimensional (3D)

Em ITCA de estrutura 3D, os inventores identificaram dois capuzes com mobilidade alta em resíduos de aminoácido de 135 ou 136 a 155 25 ou 160 (Capuz 1) e resíduos 267-295 (Capuz 2) de SEQ ID NO: I. A simulação MD indicou que as seguintes regiões são de interesse particular por causa de uma mobilidade particularmente alta: resíduos 141-149 em Capuz 1 e as seguintes regiões em Capuz 2: 267-269, 272, 275-276, 279-280, 282-283, 286-290. Seleção de resíduo de aminoácido

Um resíduo de aminoácido pode ser selecionado tendo um átomo de não-hidrogênio dentro de 0,8 nm de um átomo de não-hidrogênio em Capuz 1 ou Capuz 2 em uma estrutura 3D. Este critério seleciona os 5 seguintes resíduos na estrutura 1TCA: 38-51, 53-55, 58, 69-79, 104-110, 113, 132-168, 173, 187-193, 197-205, 223-231, 259, 261-298, 305, 308-313, 315 de SEQ ID NO: 1.

O resíduo pode ser particularmente selecionado dentro de 0,6 nm dos capuzes, levando aos seguintes resíduos em 1TCA: 40-42, 46-51, 54, 58, 70-77, 79, 104-107, 109, 133-165, 167, 173, 187-192, 197-203, 223-225, 228-229, 261-297, 308-312.

Um resíduo de aminoácido também pode ser selecionado pelo alinhamento de seqüências de enzima lipolítica homólogas e seleção de um resíduo em uma posição com variabilidade, i.e. uma posição onde seqüências 15 diferentes têm resíduos diferentes. Assim, os seguintes resíduos em CALB (SEQ ID NO: 1) podem ser selecionados por uma comparação com Hyphozyma lipase (SEQ ID NO: 2) baseado no alinhamento mostrado em Fig. 1:1,3, 5, 10, 12-15, 25, 30, 31, 32, 57, 62, 66, 76, 78, 80, 83, 88, 89, 91, 92, 96, 97, 114, 121, 123, 143, 147-149, 159, 163, 164, 168, 169, 174, 188, 194, 20 195, 197, 199, 205, 210, 214, 215, 221, 223, 229, 238, 242, 244, 249, 251, 254, 256, 261, 265, 268, 269, 212-21 A, 277-280, 282-284, 287, 303-306, 309,314,315,317.

Os seguintes resíduos são de interesse especial: 1,13, 25, 38, 42, 74, 140, 143, 147, 164, 168, 190, 199, 215, 223, 242, 244, 256, 265, 277, 280, 281, 283, 284, 285, 292, 303, 315 de CALB (SEQ ID NO: 1).

Resíduos correspondentes em outras lipases podem ser identificados de um alinhamento de seqüência. Um alinhamento de várias seqüências é mostrado em Fig. 1. Outras seqüências podem ser alinhamentos por métodos conhecidos, tais como AlignX (um componente do vetor nti suite 9.0.0) usando ajustes padrão.

Seqüência de aminoácidos alterada

A seqüência de aminoácidos alterada é derivada da seqüência originária pela realização de alteração de um aminoácido em uma ou mais 5 posições selecionadas, e opcionalmente também em outras posições. Cada alteração de aminoácido consiste de substituição ou deleção do resíduo selecionado ou inserção de pelo menos um resíduo adjacente ao resíduo selecionado no lado N- ou C-terminal.

Substituições particulares As seguintes alterações em SEQ ID NO: 1 podem ser

opcionalmente combinadas:

• Kl3Q, A25G, P38V,L,S, T42N, N74Q, V78I, Y91S, A92S, N96S, L99V, W104H, D134L,M,N, T138L, L140E, P143S,L, D145S, A146T, L147N,F, A148P, V149P, S150A, W155Q,N, Q157N, T158S,

L163F, T164V, R168D, V190I.A, S197L,G, L199P, V215I, D223G, T229Y, R242A, T244P, T256K, L261A, D265P, P268A, E269Q, L277I, P280V, A281S, A283K, A284N, I285E,D, G288D, N292C,Q, P303K, K308D, otV3151.

• Substituições múltiplas:

o I258D G288D

o S197GL199P o T164VL163F o V190XQ157X o A281XW155X o D223XA281X

o D223XI285X ο A281XI285X o A281XW155XA148X o D145XK308XK138X o D223XA281ΧΙ285Χ

• Inserções: L147FN, G137ASV, V190GAH, LIQL,

LlQGPL

• Deleção: N97*

Baseado no alinhamento tal como aquele mostrado em Fig. 1,

uma seqüência pode ser usada como um modelo para alterações em outra seqüência. Assim, Capuz 1 ou Capuz 2 de uma seqüência pode ser substituído pela região de capuz correspondente de outra seqüência. As seguintes variantes são projetadas pela alteração de Capuz 1 de CALB usando o polipeptídeo indicado como modelo:

• Q7RYD2 (Neurospora crassa) como modelo: Y135F K136H V139M G142Y P143G D145C L147G A148N V149F S15OGKVAKAGAPC A151P W155L

• Q4HUY1 (Fusarium graminearum) como modelo: Vl391 G142N P143I L144G D145G L147T A148G V149L S150IN A151T S153A

W155V

• lipase de Hyphozyma sp. como modelo: L140E P143L L147F A148G V149L.

• Q4PEP1 (Ustilago maydis) como modelo: V1391 L140E P143L D145S A146T L147F A148G V149L S150A A151S P152Q.

Cada uma das variantes acima pode ser opcionalmente combinada com N292C e/ou D223G e/ou A281S e/ou I285E.

As seguintes substituições podem ser feitas em SEQ ID NO: 2 (lipase de Hyphozyma sp.): V192I, Q159N, D136L,M,N, P41V.L, S50A, N45S, W106H.

Nomenclatura para alterações de aminoácido

Neste relatório descritivo, uma substituição de aminoácido é descrita pelo uso de códigos de uma letra, e.g. W155Q. X é usado para indicar uma substituição com qualquer resíduo diferente (e.g. V190X). Substituições múltiplas são concatenadas, e.g. S197G L199P para indicar uma variante com duas substituições. Alternativas são indicadas por vírgulas, e.g. W155Q,N para indicar uma substituição de Wl 55 com Q ou N. Um asterisco indica uma deleção. Uma inserção é indicada como substituição de um resíduo com dois ou mais resíduos (e.g. Ll 47FN)

Atividade de enzima lipolítica

Os polipeptídeos originários e variante têm atividade de enzima lipolítica (particularmente atividade de lipase), i.e. são capazes de hidrolisar ligações éster carboxílico para liberar carboxilato (EC 3.1.1), particularmente ligações éster em triglicerídeos (atividade de triacil-glicerol- lipase, EC 3.1.1.3).

A atividade de enzima pode ser expressada como atividade específica, i.e. atividade hidrolítica por mg de proteína enzima. A quantidade de proteína enzima pode ser determinada e.g. da absorção a 280 nm ou por titulação de sítio-ativo (AST), como descrito por Rotticci et al. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1483, 132-140.

Enanciosseletividade

Enanciosseletividade é muitas vezes um parâmetro importante em reações catalisadas por CaLB, tanto na hidrólise quanto na direção de 20 síntese. O substrato pode ser uma mistura racêmica de dois enanciômeros, ou pode ser uma forma meso pró-quiral. Em ambos os casos um produto de enanciômero único é muitas vezes desejado. Excesso enanciomérico (ee) é medido pela quantificação da quantidade de ambos os produtos enancioméricos, e então calculando ee = (rendimento de enanciômero 25 desejado - rendimento de outro enanciômero) / (soma de ambos os rendimentos). A quantificação é muitas vezes por cromatografia gasosa (GC) quiral ou cromatografia líquida de desempenho alto (HPLC).

Uso de variante de enzima lipolítica

A variante de enzima lipolítica pode ser usada para biocatálise em uma reação catalisada por lipase, tanto em hidrólise de éster quanto em reações de síntese, e.g. em síntese de alguns polímeros. A reação catalisada por lipase pode ser:

a) hidrólise com um éster de ácido carboxílico e água como reagentes, e um ácido carboxílico livre e um álcool como produtos,

b) síntese de éster com um ácido carboxílico livre e um álcool como reagentes, e um éster de ácido carboxílico como produto,

c) alcoólise com um éster de ácido carboxílico e um álcool como reagentes, ou

d) acidólise com um éster de ácido carboxílico e um ácido

graxo livre como reagentes.

Como CALB, a variante da invenção pode ser particularmente usada em aplicações onde quimio-, regio-, e/ou estereosseletividade, estabilidade e velocidade de reação de enzima ou a capacidade para aceitar

uma variedade relativamente ampla de substratos é importante. Os produtos de reação são tipicamente usados na indústria química, de química fina, farmacêutica, ou agroquímica, ou como ingredientes de alimento. A variante pode estar imobilizada, e.g. por adsorção sobre uma resina adsorvente tal como polipropileno.

O éster na reação catalisada por lipase pode ter um grupo ácido

volumoso ou uma parte de álcool secundário ou volumoso, tal como 2-Me- butirato de pNP, octanoato de 6,8-difluoro-4-metil-umbeliferila (octanoato de DiFMU) ou um iso-propil-éster de ácido graxo iso- (e.g. ácido Ci6-Cjs graxo que pode ser saturado ou insaturado).

A variante pode ser usada como descrito para CALB em A. J.

J. Straathof, S. Panke, A. Schmid. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 548-556; E. M. Anderson, Κ. M. Larsson, O. Kirk. Biocat. Biotrans. 1998, 16, 181- 204; R. A. Gross, A. Kumar, B. Kaira. Chem. Rev. 2001,101, 2097-2124). EXEMPLOS Exemplo 1: Seleção de resíduos de aminoácido por dinâmica molecular

Foram encontradas a partir de simulações de dinâmica molecular 2 regiões de importância alta para a atividade de lipase B de Candida antarctica, como segue.

5 CHARMm foi usado para preparar a estrutura de ITCA para

as simulações. Átomos de hidrogênio foram adicionados em ambas proteína e águas usando o comando HBUILD. O sistema foi embebido em moléculas de água explícitas e confinado em uma caixa cúbica de lado igual a 9,0 nanômetros. Houve no total 24630 moléculas de água incluindo aquelas já presentes na estrutura de 1TCA. Uma simulação em temperatura constante, 300K, e pressão constante, 102,668 quilopascais, foi realizada por um total de nanossegundos usando NAMD. Método de copulação de Berendsen foi usado para manter a temperatura e a pressão nos valores desejados. Os resultados da estimulação foram então analisados usando CHARMm (Referências para CHARMM: MacKerell, A. D., Bashford, D., Bellott, M., Dunbrack, R. L, Evanseck, J. D., Field, M. J., Fischer, S., Gao, J., Guo, H., Ha, S., Joseph-McCarthy, D., Kuchnir, L, Kuczera, K., Lau, F. T. K., Mattos, C, Michnick, S., Ngo, T., Nguyen, D. T., Prodhom, B., Reiher, W. E., Roux, B., Schlenkrich, M., Smith, J. C, Stote, R., Straub, J., Watanabe, M., Wiorkiewicz-Kuczera, J., Yin, D., Karplus, M. J. Phys. Chem. B 1998, 102, 3586; MacKerell, A. D., Jr., Brooks, B., Brooks, C. L, III, Nilsson, L, Roux, B., Won, Y., Karplus, M. Em The Encyclopedia of Computational Chemistry; Schleyer, P. v. R. et al., Eds.; John Wiley & Sons: Chichester, 1998; Vol. 1, p 271; Brooks, B. R., Bruccoleri, R. E., Olafson, B. D., States, D. J., Swaminathan, S., Karplus, M. J. Comput. Chem. 1983,4, 187).

A análise revelou até agora capuzes desconhecidos com mobilidade alta. Foi verificado que várias regiões se movem quando a enzima está em solução. Foi concluído que a especificidade e a funcionalidade da enzima são dependentes desta mobilidade e a estrutura específica no meio escolhido para a hidrólise ou a reação de síntese. A simulação indicou uma forma semelhante a mais fechada em solução aquosa e uma forma mais totalmente aberta em solução em solvente orgânico, i.e. mais semelhante à estrutura cristalina em solução aquosa contendo algum tensoativo.

Uso de cálculo do Quadrado da Média da Raiz dos Deslocamentos isotrópicos para os átomos de C-alfa dos resíduos em CALB ao longo da simulação mencionada acima, regiões com mobilidade aumentada foram identificadas. As regiões de capuz móveis encontradas foram resíduos 136-160 para Capuz 1 e resíduos 267-295 para Capuz 2. Foi concluído que os resíduos na vizinhança destes capuzes novos interagem com a mobilidade de capuz e são assim muito importantes para a atividade de enzima.

Exemplo 2: Reações de hidrólise

Atividade hidrolítica das variantes foi avaliada em butirato de pNP, 2-metil-butirato de pNP racêmico, e octanoato de 6,8-difluoro-4-metil- umbeliferila (octanoato de DiFMU). 2-Me-butirato de pNP racêmico foi sintetizado de acordo com J. Biol Chem. 1971, 246, 6019-6023. Octanoato de DiFMU, adquirido de Molecular Probes, tem sido previamente relatado por Lutz et al. (J. Am. Chem. Soc. 2005,127, 13466-13467) em ensaios de CALB. Enquanto que 2-Me-butirato de pNP seleciona variantes com aceitação melhorada de substratos com um grupo ácido volumoso, octanoato de DiFMU seleciona variantes com aceitação melhorada de uma parte de álcool volumosa. Reações foram realizadas em tampão aquoso de fosfato 50 mM, pH 7,0 com 0,1% de Triton X-100. Cinética de reação foi seguida por aproximadamente 15 min em placas de microtítulo, medindo a 405 nm (pNP) ou 350/485 nm (ex/em para DiFMU). Atividades foram normalizadas baseado em A28o de enzima. o ο (^γΗ°2

butirato de pNP

2-Me-butirato de pNP

Octanoato de DiEMU

Resultados são mostrados abaixo como atividade para vários substratos em % de CALB de tipo selvagem.

Variante Butirato de 2-Me-butirato Octanoato de pNP de pNP DiFMU N74Q 77 113 110 P143S 50 113 42 A281S 215 232 208 P38S 35 107 44 N292Q 73 158 105 LlQGPL 63 144 85 LlQL 65 193 49 I285E 233 332 236 L147F 98 232 90 L147N 79 178 79 N292C 80 282 90 L140E 51 151 79 P143L 79 192 112 A146T 55 126 42 P280V 48 100 36 A283K 104 115 94 A284N 65 125 19 T103G, A148P 70 167 0 W104H, A148P 11 146 0 N74Q, A281S 88 156 0 V190A 64 143 L199P 74 162 75 T256K 105 120 79 T42N 35 216 47 R242A 24 119 39 V215I 105 133 43 T164 V 75 130 80 L163F, T164V 81 160 92 D265P 28 117 44 P303K 35 108 50 R168D 62 122 53 A25G 66 111 26 V3151 65 102 19 T244P 56 146 20 K13Q 56 122 39 L277I 53 137 51 Y91S, A92S, N96S, N97*, L99V 39 135 76 D223G 830 3621 820 originário (CALB) 100 100 100 Os resultados demonstram que a atividade específica para um

substrato volumoso (éster com um ácido graxo ramificado) pode ser aumentada em até 37 vezes pela substituição de um único resíduo de aminoácido selecionado.

Exemplo 3: Variantes com substituição de capuz

Variantes baseadas em CaLB de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) foram projetadas pela substituição de capuz 1 pelos resíduos correspondentes da lipase de Fusahum (SEQ ID NO: 4), da lipase de Debaryomyces (SEQ ID NO: 5) ou da lipase de Neurospora (SEQ ID NO: 8).

Outras variantes foram projetadas pela combinação desta com uma única substituição de um resíduo selecionado (A281S). Resultados são expressados

como atividade em % de atividade de CALB sobre o mesmo substrato.

Variante butirato de 2-Me-butirato octanoato de pNP de pINP DiFMU V1391, G142N, P143I, L144G, D145G, 187 661 836 L147T, A148G, V149L, S150IN, A151T,S153A, W155V Y135F, V139R, L140M, A141V, G142P, 62 306 14 P143V, D145C, A146P, L147S, A148F, V149P, S150KLSC, A151P,W155L Y135F, K136H, V139M, G142Y, P143G, 341 1223 14 D145C, L147G, A148N, V149F, S15OGKVAKAGAPC, A151P, W155L V1391, G142N, P143I, L144G, D145G, 1052 1612 631 L147T, A148G, V149L, S150IN, A151T, S153A, W155V, A281S Y135F, K136H, V139M, G142Y, P143G, 378 2397 76 D145C, L147G, A148N, V149F, S150GKVAKAGAPC, A151P, W155L, A281S Os resultados demonstram que a atividade específica para um

substrato volumoso pode ser significativamente aumentada pela substituição do capuz de uma lipase pelo capuz de outra lipase, e que esta pode ser adicionalmente aumentada pela combinação com uma única substituição de um resíduo selecionado.

Exemplo 4: Enanciosseletividade

Reações de hidrólise foram realizadas em escala de 2 mL 5 usando 2-Me-butirato de pNP 2 mM como substrato em tampão fosfato de sódio, 0,5 M pH 7,0 com 1% de Triton X-100. As reações foram interrompidas pela adição de HCl 2 M (0,1 mL), e então extraídas em Et2O (2 mL). Após análise por GC quiral (coluna Varian CP-Chiralsil-DEX CB 10 m, programa de temperatura 80 a 180°C a 2 °C/min), E (razão enanciomérica) foi 10 calculada como E = ln[eep(l-ees)/(eep+ees)] / ln[eep(l+ees)/(eep+ees)], com ees e eep sendo ee (excesso enanciomérico) para substrato e produto, respectivamente. Reações foram realizadas em tripletos para cada enzima (interrompida em conversões diferentes) e E relatado como uma média.

CALB foi testada e comparada com variante Y135F, K136H, 15 V139M, G142Y, P143G, D145C, L147G, A148N, V149F, S150GKVAKAGAPC, A151P, W155L. Os resultados foram E=2,4 para a variante e E= 1,05 para a lipase originária (CALB), mostrando que CALB é quase inteiramente não-seletiva, mas a variante tem uma enanciosseletividade aumentada.

Exemplo 5: Hidrólise de éster de ácido graxo de cadeia longa

Constantes de Michaelis-Menten foram determinadas para uma variante de CALB com laurato de pNP como um substrato de cadeia longa. Experimentos foram realizados em tampão fosfato de sódio 0,5 M, pH

7,0, contendo 1% de Triton X-IOO (para evitar soluções turvas em concentrações de substrato altas). _

kca, (S-') Km (micro-M) IwTCm^M-1) originário (caLB) 3,1 535 0,58 *104 V139I, G142N, P1431, L144G, D145G, 23 170 O L147T, A148G, V149L, S150IN, AI51T, * S153A, W155V I Os resultados mostram que a variante é 23 vezes mais ativa do que a lipase originária sobre substrato de cadeia longa (medido como Iccat / Km).

Exemplo 6: Hidrólise de iso-propil-éster

A variante usada no exemplo prévio também foi testada em hidrólise de palmitato de iso-propila. Os resultados mostraram que a hidrólise foi 26% mais alta para a variante do que para CALB. A hidrólise foi realizada como segue:

Como substrato, palmitato de isopropila foi adicionado em uma concentração de 3 mg/ml em Acetato de Na 50 mM Na de pH 5,0 (= tampão), aquecido a 60°C por 5 minutos e homogeneizado por Ultra Turrax por 45 segundos e usado imediatamente após a preparação. Preparações de enzima purificada foram diluídas para uma concentração correspondendo a 00280=0,00016 em água dessalinizada e 10 ppm de Triton X-100. Em placas para PCR 20 micro-L de tampão, 60 micro-L de substrato e 20 micro-L de solução de enzima foram misturados a 800 RPM por 20 segundos e transferidos para um termociclizador de PCR por 30 minutos de reação a 3 0°C seguido por 5 minutos a 90°C para inativar as enzimas e adição de 20 micro-L de solução 10% de TritonXlOO (em água dessalinizada). A quantidade para ácidos graxos produzidos foi determinada usando o kit NEFA C de Wako e resultados foram calculados como uma média de 6 determinações e subtração do branco de enzima.

Exemplo 7: Atividade em pH alto

Atividade de lipase de duas variantes de CALB foi medida em vários pH a 30°C com tributirina como substrato e goma arábica como emulsificador. Os resultados são expressados como atividade relativa, considerando a atividade em pH 7,0 como 100.

pH5,0 pH6,0 pH7,0 pH8,0 pH9,0 Y135F, K136H, V139M, G142Y, P143G, D145C, 53 97 100 90 151 L147G, A148N, V149F, S150GKVAKAGAPC, A151P, W155L V139I, G142N, P143I, L144G, D145G, L147T, 41 76 100 99 148 A148G, V149L, S150IN, A15IT, S153A,W155V Lipase originária (CALB) 47 62 100 60 49 10

É visto que as variantes têm atividade aumentada em pH alcalino (pH 7-9) e um ótimo pH mais alto.

Exemplo 8: Reações de síntese

As variantes foram imobilizadas em polipropileno poroso Accurel por adsorção física para uma carga de 20 mg/g (baseada em A280). Reações foram realizadas em tubos Eppendorf com 1 mmol de cada reagente, aproximadamente 0,8 mL de hexano, e 5 mg de enzima imobilizada @ 40 0C, 1200 rpm. Amostras foram retiradas para análise por NMR e GC quiral.

Resultados de uma reação de síntese com 2-etil-l-hexanol e acetato de vinila como reagentes são mostrados abaixo como conversão % (ee%):

Variante 15 min 30 min 1 h 2 h 3 h originária (CaLB) 11 (32) 24 (27) 43 (22) 61(17) 63(17) Y135F K136H V139M G142Y P143G D145C 6(46) 13(46) 24 (45) 41 (40) 52 (38) L147G A148N V149F S150GKV AKAG APC A151P W15 5 L V139I G142N P143I L144G D145G L147T 0,1 (51) 6(49) 12(50) 22 (49) 33 (48) A148G V149L S150rN A151T S153AW155V A razão enanciomérica foi calculada pela fórmula dada acima. Os resultados foram E= 1,9 para a lipase originária (CALB), e E=3,0 e E=3,2 para as duas variantes. Assim, os resultados mostram enanciosseletividade melhorada para as duas variantes.

Outro experimento foi feito na mesma maneira, mas com benzoato de vinila e 1-hexanol como reagentes.

o

_ . _ -0-

O^

Após 72 horas, foi verificada uma conversão de 17% para a variante I285E, enquanto que a CALB originária deu 9%. I LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<?10> NovozyirBS AiS

<120> Vaxicintes da enzima lipolítica <130> 10617-VO

<160> 8

<170> Patentln ver si on 3,4

<210> 1 <211> 317 <212> PRF

<213> Candidaantarctlca <400 > 1

Leu Pro Ser Gl y Sei Asp Pro Aia Phe Ser Qn Pro Lys Ser Vai Leu 15 10 15

Asp Al a Q y Leu Thr Oys Q n Q y Al a Ser Ro Ser Ser Val 20 25 30

Ser Lys

Pro 11 e Leu Leu Val Pro Gy Thr Gy Thf Thr Qy Pro 3n Ser Phe 35 40 45

Asp Ser Asn Trp Ne FVo Leu Ser 50 55

Thr <3 n Leu Q y Tyr

60

Thr Pro CVs

Trp 11 @ Ser Pf o Pro Ro Phe kfet Leu Asn Asp Thr G n Val Asn Thr 65 70 75 80

O u Tyr Mst Val

Asn

85

Al a I I e Thr Al a

Leu

90

Tyr Al a Q y Ssr

G y Asn 95

Asn Lys Leu Ro Val Leu Thr Trp Ssr QnGyQy Lsu Val Al a Q n 100 105 110

Trp Gy Leu Thr

115

Pha Phe Pro Ser

120

I e Arq Ser Lys Val

125

Asp Arg Leu

f«bt

Al a Pha

130

Pro Asd Tyr Lys Q v Thr 135

Val

Lsy Al a Gy Pr í 140

Lou

Asp Al a Leu 145

Al a Val

Ser

150

Ai a Pr o Ser Va l

Tf p Qn Qn Thr Thr 155

Q y

160

Ser Ala Leu Thr Thr Aia Leu Arg Asn Ala Qy Gy Leu Tnr GnHe 165 170 175

Val Pro Thr

Thr Asn Leu Tyr

180

Ser

Al a 185

Thr Asp Gull

190

G n Pr o

Q n Vai Ser Asn Ser Pr o Leu Asp Ser Ser Tyr Lbsj Phe Asn Gy Lys 195 200 205 Asn Val GrtAIaGnAa Val Cys G y Pro Leu Phe Val 11 e Asp H s

A a G y Ser Leu Thr Ser G n Phe S&r Tyr Val Vaf G y Arg Ser Aa 225 230 235 240

Leu Ar g Ser Thr Thr <3y Gn Ala Ag Ser Aí a Asp Tyr Gy Ile Thr 245 250 255

Asp Cys Asn Rro Leu Pro Ai a Asn Asp Leu Thr Pro Gu Gn Lys Val

260 265 270

AaAlaAaAla Ley Lsu AaProAaAaAaAaiieVai AaQy 27S 280 285

Pro Lys G n Asn Cys Gu Pro Asp Leu f*fel Pf o Tyr Al a Arg Pro Rie 290 295 300

Aa Val Gy Lvs Arg Thr Cys Ser GyIIe Val Thr Pro 305 31D 315

<21Q> 2 <211> 319

c212> PRT

<213> HypbazynB sp.

<400> 2

Phe Thr Pro Ftie Pro Thr GyAa Asp Pro A a Phe Thr G n Ser G n 10 15

A a Thr Leif Asp AaGy Leu Thr Cys O n Ser G y Ser Pr o Ser Ser 20 25 30

Gn Lys Asrt Pr o Ne Ley Leu Va! Pro Qy Thr Gy Asn Tiir G y Pro 35 40 45

G n Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser AaGn Leu G y Tyr 5§ 55 60

Ser Pro Cys Trp Vai Ser Pro Pro Pro Phe Kfei Ieu Asn Asp Ser G n 65 70 75 SO

i i e Asn AaGu Tyr 11 e Val Asn Aa Ile Hs Thr Leu Ser Ser Q y 85 90 95

Ser Q y Ser Lys Val Pro Val Leu Thr Trp Ser GnQyQy Leu Aa 100 105 110

AaGn Trp Aa Leu Thr Pfie Phe Pro Ser Thr Arg Asn Lys Va! Asp

115 120 125 Pe Q Leu Kfet Λ a Phe At a Pro Asp Tyr Lys Q y Thr Val Qu Al a Q y 130 1-35 140

Leu Leu As-p Al a Phe Q y Leu Ser Al a Pro Ser Vai: Trp Qn Qn Ttir 145 150 155 160

AaQn Ser Al a Phe Val Thr Al a Leu Asp QnAIaQyQy Leu Asn 165 1:70 175

Q n Ile Val FV o Thr Thr Asn Leu Tyr Ser M a Thr Asp Q u Val Val 180 185 190

<3 n Pro On Ftie Al a Asn Qy Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Asn 195 200 205

Q: y Lys Asrt fie Qn Af a Qn Ser ΪI e Qf s Q y Pro Leu Phe Ile Us

210 215 220

QyHsAIaQy Ssr Leu Tyr Ser Q n Phe Ser Tyr Val Val Q y Lys 230 235 24D

Ser Ala Leu Ala Ser FsTo Tfir Qy Gn Ala Qn Ser Ser Asp Tyr Ser 245 250 255

f I e Lys Asp Cys Asn FVo A) a Pro Al a Asn FV o Leu Thr Ai s Qn Qn

260 265 270

Lys Leu Asp Ser Al a M a He Ne Leu Val Al a Gy Lvs Asn 11 e Val

275 280 285

Thr Qy FsTo Lys Gfl Asn Cys Q u Pro Asp Leu Wfet Pro Tyr ,Ala Arg 290 296 3DO

Lys Tyr Ar§ He Gy Lys Lys Thr Qys Ser Qy Vai Ile Thr Qy 305 310 315

«210> 3 <211> 336 <212> PRT

<213> Ltei i I ago rraydi s <400 > 3

foteí Lys Thr Thr Ser Val IS e Ser Al a Leu Val Thr Leu Al a Ser 11 10 15

e Arg Al a Al a Fro Leu Al a Ser Ser Asp Ρϊo Al a Phe Sfer Ihr Pro 20 25 30

Lys Al a Thr Leu Asp AaQy Leu Q u Cys Q n Thr Q y Ser Pro Ser 35 40 45

Ser Qn Thr Lys Pro He Leu Leu Val Pro Qy Thr Qy Ala Asn Qy 50 55 60 Thr Gln Thr Rhe Asp Ser Ser Trp 11 e Pro Leu Ser Λ a Lys Leu Qy 65 70 75 60

Phe Ssr Pro Cys Trp Me Sôr Pro Pro Pro Phe Kfet Leu Asn Asp Ser

85 90 95

Q η Val Asn Val Q υ Tyr 1I θ Vai Asn Al a Val Qn Thr Leu Tyr At a 100 105 110

Qy Ser Qy Ser Lys Lys Val Pro Val Lew Thr Trp Ser Qn Qy Qy 115 120 125

Leu Al a Thr O η Trp Al a Leu Thr Phe Phe Pr o Ser 11 e Ar g Asn Q η 130 136 140

Val Asp Arg Leu Wbl Al a Piie Al a Pro Asp Tyr Lys Q y Thr IIeQu 145 ISD 155 160

Al a G y Leu Leu Ser Thr Phe Q y Leu Al a Ser Q η Ser Val Trp Q η 1:65 170 175

Qn Qn Ala Qy Ser Al a Ptie Val Thr Al a Leu Lys Asn Al a Qy Qy

180 185 190

Lqu Thr Ser Ftie Va! RrO Thr Thr Asn Leu Tvr Ser PhB Phe Asp Q u

195 200 205

I I β Val Q π Pr ο Q π Val Pha Asn Ser Asp Al a Asp Ser Ssr Tyr Lau 210 215 2:20

Q y Asn Ser Lys Asn Hs Qn Al a Gn Thr Val Cys QyQy Phe Phe

225 23 D 235 24D

Val I I β Asp H ε Al a Q y Ser Leu Thr Ser O η Phe Ser Tyr Val Val

245 250 255

Q y Lys Ser Al a Leu Thr Ser Ser Ser G y Val Al a Asn Ster Al a Asp

260 265 270

Tyr Ser Ser Lys Asp Cys Lys Al a Ser Pro Al a Asp Asp Leu Ser Al a 275 ' 280 285

Lys G η Lys Al a ASp Ai a Ser Al a Leu Leu Fhe Vai Al a Ai a Gv Asn 290 295 300

Leu Leu AJ a Qy Pro Lys Qn Asr* Cys G u Pro Asp Leu Lys Pro Tyr 305 31D 315 320

Ai a Arg <3 η Phe Al a Val Qy Lys Lys Thr Cys Ser Q y Thr 11 β Asn 325 330 335 <210> 4

<211> 445

<212> Pm

<213> Gbberel la zaaa

<400> 4

Λ a Pro Ssr Tvr Sei Asp Leu Qu Ser Arg Gn Lsu Ile Gy Gy Leu

1 5 10 15

Leu Lys G y Val Asp G y Thr Leu 3 u Thr Val Val GyG y Leu Leu 20 25 30

Gy Tlir Leu Λ-g Lys Ala He Asp Ser G y Asp Arg Asp Lys Thr Leu 35 40 45

Asp 11 e Leu Hs s Vai Leu Gu Pro Al a Lys Lys H s Lys Asn VaJ G u 50 55 60

G u Al a Phe Al a Al a Leu G u Lys 11 e Ser Lys Ser Lys Pr o Lys Thr 65 70 75 BO

He Ile Asp Tyr Ser A! a G n Leu He Val Asn G y Leu 11 e Ser G y 85 90 95

Asr Thr Leu Asp Leu Phe Al a Tyr Al a Lys G y Leu Val Ser Al a G n

100 105 110

Asn Q y Ser Asn Asn Lys Asn Arg Asn Pro Pro Lys G u Val Tyf Pro

115 120 125

Lys Val Al a Asn Cys Aso Al a Ser Tyr Thr Thr Ser Q u Ala Lys Leu

130 ' 135 140

Arg Al a Ala lie Hs Ne Pf o Pro Thr Phe Thr Tyr QyQu Lys Pr o

145 150 155 160

Pro Val He Leu Phe Pro Gy Thr Qy Ser Thr Qy Phe Thr Thr Tyr

155 170 175

Arg Qy Asn Ffne He Pro Leu Leu Thr Asp Val Gu Trp ASa Asp Pro

180 185 190

Val Trp Val Asn Val FVo Val Leu Leu Leu Gu Asp Al a G n Val Asn

195 200 205

Ala Gu Tyr Al a Ala Tyr Al a Leu Asn Tyr Ils Al a Ser Leu Thr Lys

210 215 220

Arg Asn Vsl Ssr Vai 11 e Al a Trp Ssr QnOy Asn 11 a Asp Val □ n

225 230 235 240

Trp Ala Leu Lys Tyr Trp Pro Ser Thr Arg Lys Val Thr Thr Asp H s 245 250 ' 255

Val Al a Ne Ser Al a Asp Tyr Lys G y Thr 11 e Leu Al a Asrt IIeOy

260 265 270

Q y Al a Thr O y Leu 11 e Asn Thr Pro Al a Val Val On Qn 0« Aia 275 280 285

Q y Ser Thr Rie 11 β Asn Tftr Lsu Arg Ser Asn Asp G y Asp Sér Q y 290 235 300

Tyr ! I β Pro Tfir Thr Ssr Leu Tyr Ser Ser Leu Phe Asp Qu Val Vâl 305 310 315 320

Gm Pro Sn Qu Gy Ala Gy Ala Ser Ala Tyr Ieu Leu £sp Al a Arg

325 330 335

Asp Vai Q y Val Thr Asn Al a G u Val Q n Lys Val Cys Thr G y Lys 340 345 350

Leu Gy Qy Ser Phe Tyr Ttsr Hs Gu Sei Mg? Leu Ala Asn Pro Leu 355 360 365

Thr Phe Al a Leu Al a Lys Asp Al a Leu Thr Hs Gu Qy Pr o Gy Thr

370 3/6 360

11 e Ser Ara Leu Asp Leu Ala Asp Vai Cys Asn Arg Ser Leu Al a Pro

385 390 395

Q ¥ Leu Q y Leu Lys Asp Leu Leu ! l © Thr Qu Asn Al a Val Vai 11 e 405 410 415

Al a Ala Leu Ser Leu Val Leu Tyr Leu Pro Lys Gn N e Asp Q u Fto 420 426 430

Ala Ila Lvs Qn Tyf AJa Leu Qu Ala Thr Gl y Thf Cys

435 440 445

<210> 5 <211> 455 <212> PRT

■c.213> Cfebaryonyces hanseni i <400> 5

H s Pt o Thr Lys Qy Leu Gu Arg Arg Asp Leu Ile Ser Asn He Asp 10 15

Asp Ile Val Asn Set Thr i i e Asp Asn Gy Ou Ai a Hs Lvs Asp Asn 20 25 30

Al a Lys Ser Al a Ile Thr Asp 11 e Pfie Asp Lys He Asn Asp QyHe 35 40 45 Lys G n Asp I i e Asp Asn Leu Lys G u Vai Gy tys Ser 11 β Al a Asp 50

55

60

Leu He Lys Ser Val Val Pro Thr Qg Asp Leu Ser Thr Pro Qu Gy

65

70

75

60

Val G η Al a Tyr Leu GyGn Leu Pfie G u Asn GyGu Asp Leu Phe

85

90

95

Lys Asn Ser Il θ Asp Nfet Vai GyHsQy Leu Lys Pro Gy Ser Ile

100

105

11

Al a G y Asn Phe QuGy Pha Ser Asp Gu He Asn Thr Ser Asp Asrs

115

120

125

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130

135

140

Q u Asp Rro Ser Phe Ser Leu Ser Gu G u Qn Leu Arg Ser Al a 11 β

145

150

155

160

Gn Hs Pro Gu Qu Phs □ n Tyr G y Asn G y Ser Lys S»r Pro Val

165

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175

11 β Leu Val Pr o G y Thr O y Ser Lys GyGy fcfeí Thr Tyr Al a Ser 180 185 190

Asn Tyr AJ a Lys Leo Leu Lys G u Thr Asp Phe Al a Asp Val Val Tr p 1S5 200 205

Lsu Asn Val Pro G y Tvr Leu Lsu Asp Asp Al a G π Asn Asn Al a G u 210 ' 215 220

Tyr Vai Al a Tyr AJ a Hs Asn Tyr He Ser Qy He Ser Asn Asn Lys 225 230 235 240

Vai Ser Me Ile Ser Tfp Ser Gn Gy Oy Leu Asp Thr Gn Trp 245 250 255

M a teu Lys Tyr Irp M a Ser Thr Arg Ser Lys Vaf Ser Asp Phe M β

260 265 270

Pro He Ser Pro Asp Phe Lys G y Tfir Arg fcfet Vaf Pro Val Leu Cys 275 280 285

Pro Ser Phe Pro Iys Leu Ser Cys PfO Pro Ser Vai Leu Gn GnGu

290

235

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305

310

15

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Tyr Ser G y Pha Asp Gu 11 β Val

330 335

Qn Pro Q η Ser G y Lys Ql y Al a Ser Q y Leu 11 θ Asn Asp Asn Arg

340 345 350

Asn Vat ~ Val Thi Asn Asn <3 α Vai Q η Ttir 11 s Cys Pro Asp Arg

Pro Al a Oy Lys Tyr Tyr Thr HsQuGy Val Lbu Tyr Asn Pro Val 370 375 360

<3 y Tyr Al a Leu Al â Val Asd Al a Leu Thr H:s Qu Gy Ptd Gy Gn

38B 390 395 400

Leu Ser Arg M 8 Asp Leu Αερ Thr Qu Cys Qy Arg Ile Val Pro Asp 405 410 415

Gy Leu Ihr Tyr Thr Asp Leu Leu Ala Thr G u Al a Leu 11 θ Pro Gu 420 425 430

Al a Leu Vêl Leu 11 β Leu Ser Tyr Asp Asp Lys Thr Arg Asp G υ Pro 435 440 445

Gu He Arg S&r Tyi Al a G η 450 455

<210> 6

<211> 440

<212> PRT

<213> Aspergi 11 08 fynrigatus

<400> 6

Al a Val Il 0 Ρίο Arg Gy Ala Val Pro Vai Ma Ser Asp Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ser 11 & Leu Sef Sar Λ a Al a Asn Asp Sar Ser ISeGu Ser G u

Α! a Arg Sor iio Al a Ssr Leu 11 β Al a Ser Gu Na Val Ser Lys 11 β 35 40 45

Gy Lys Thr Gu Pha Ser Arg Ser Thr Lys Asp Al a Lvs Ser VaS Gn 5# 55 60

G u Al a Phs Asp Lys IIeGn Ser 11 β Phe Al a Asp G y Tlir Pro Asp 65 70 75 60

Phe Leu Lys fvfet Thf Arg Gu Ne Leu Thr Val Gv Leu Ile Pro Al a 85 90 ' 95

Asp Ils Val Ser Phe Leu Asn Gy Tyr Lbu Asn Lbu Asp Leu Asn Ser

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365

30

100

105

110 i I e H s Aarv Ar g Asn FVo Sôr Pro Lys Qy Gn Al a Ile Tyr Pro Val 115 120 125

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145

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155

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165

170

175

Tvr Tyr Phe Asn Phe Q y Lys Iey Q y Ser Ai a Al a Asp Al a Asp Val

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Ser Asn Val Al a VaS Leu Ssr Trp Ser Gn Gy Gy Leu Asp Thr G n

225 230 235 240

Trp Ala Leu Lys Tyr Trp Pro Ser Thr Arq Lys Val Val Asp Asp Phe

245 25Ò 255

He Al a Ile Ser Pro Asp Phe HsGv Thr Val Arg Ser Leu Val

260 265 270

Qcs Pro Trp Leu Al a Al a Leu Al a Cys Thr Pro Ser Leu Trp Qn Gn

275

280

285

Gy Trp Asn Tiir Qu PhB He Arg Thr Leu Arg Qy Qy Gy Qy Asp

290

295

300

Ser Ala Tyr Val Pro Thr Thr Thr 116 Tyr Ser Thr Phe Asp Quile 305 310 315 320

Val Gn Pro Ser Q y Ser Qn Al a Ser A! a 11 e Leu Ser Asp Ser 325 330 335

Arg Al a Val G y Vai Ser Asn Asn Hi s Leu Q n Thr 11 e Cys QyGy 34-0 345 350

Lys Pro Al a Gy Gy Val Tyr Thf Hi s Qu Qy Val Leu Tyr Asn Pr o 355 ' 360 365

Leu Al a Trp Ai a Leu A) a Val Asp Al a Leu Ser H s Asp Gy Pro G y 370 375 360 Asp Pro Ser Ar g Leu Asp Leu Asp Val Vat Cys Qy Arg VaJ Leu FVo 385 390 395 400

Pro G η Leu Gy Leu Asp Asp Ley Leu Gi y Tfir GuQy Leu Leu Leu 405 410 415

Il e Al a Lsu Al a G g Vàl Lbu Al a Tyr Lys FVo Lys Thr Phe GyQu 420 425 430

Pro Ala 11 β Al a Ser Tvr Al a H s

435 440

<210> 7 <211> 401 *212> PRT

<213> AspergH Ius oryzae <400> 7

Lau Pro Ser Ser Ser Q υ Tftr Val G u AJ a Asn Cys Vsl Lys Pro Tyr 10 15

Leu Qys QfS QyQu Leu Lys Thr Pro Leu Asp Ser Thr Leu Asp FVo 20 25 30

11 e Leu Leu Asp Leu Gy He A&p Al a Al a Ser 11 e Val O y Ser Val 35 40 45

Gy Leu Leu Cys Leu Iie Pr o Ser Lys Ala Leu Thr Oyg Leu Asn Gy 50 55 6D

Tyr Ala Me ile Asp Leu Asn Ser ile Hs Arg Hs Asn Pro Ser FVo 65 70 75 80

Gu Asn Leu Ser Ne Tyr Pro Tyr Lys Ala Lys Ser Asp Aia Pro Tyr 85 90 95

Ser He AJ a Qu Asn Thr Leu Arg Al a Al a i I e Hs Ile Pr o Arg Ser 100 105 110

FVi^ Ser H s Lys Arg Asp Lys Lys 11 e F3TO Val Leu Leu Val Pro Q y 115 ' ' 120 125

Thr Al a Val F¥ o Al a Ai a 11 e Thr Phe Tyr Ftie Asn Ftie Gy Lys Leu

130 136 140

Arg Ar g Al a Leu Pro Qy Ser Qu Leu Val Tr p I I θ Asp Leu Pr o O n

W'5 " 150 155 160

Al a Ssr Lqu Asp Asp IieQn Leu Ser Al a Q u Tyr Val AJ a Tyr Al a

165 170 1?5

Lau Asn Tyr Val Ser Al a Lsu Thr Ser Ser Lys I I a Al a Val Ile Ser 180

185

190

Trp Ser <3 n fl y Al a Leu Asp IIeQn Trp Al a Leu Lys Tyr Trp Pro 195 200 205

Ser Tbf Arg Ser Vai Val Asn Asp Phe He Ala Ile Ser Pro Asp Phe 210 215 220

HsQy Thr He Vai Lys Trp Leu Val Cys RrO Leu Leu Asn Asp Leu 225 230 235 240

Al a Cys Thr Pr ο Ser Iie Tr ρ Qn Qn Qy Tr ρ Asp Al a Asn Phe I ( e 245 250 255

Qn Al a Leu Ar g Ser Qn Qy Qy Asp Ser Ai a Tyr Val Thr Thr Thr 260 265 270

Thr (le Tyr Ser Ser Phe Asp Lys He Vaf Arg Pro Kfet Ser QyQu 275 280 285

Asrt Al a Ser Ala Arg Lsu Leu Asp Tyr Arg Qy Vai Qy Val Ser Asn 250 295 300

Asn H s Leu G η Thr He Cys Al a Asn Asn Al a Al a Q y Qy Leu Tyr 305 310 315 320

Thr Hs Qu Qy Val Leu Tyr Asn Pro Leu Al a Trp Al a Leu Thf Val

325 330 335

Asp Aia Leu Leu Hs Asp Qy Pro Ser Asn Me Thr Aro He Asp Thr

340 345 350

Q η Lys 11 e CVs G u <3 η Vai Leu Pro Pro Tyr Leu Q υ Leu Thr Asp

355 360 365

füfet Leu Q y Thr Q u Al a Leu Leu Leu Val Α! a Leu Al a Lys 11 e Leu

370 375 360

Thr Tyr Ser Pro Lys Val Ser QyQu Pro Asp 11 e Al a Lys Tyr Λα

385 390 395 400

Tyr

<210? 6

<211> 388

<212> PRT

■=213=> Neurospora crassa

<400> 8

Leu PrO Thr Thr Ser Qu Pro Vai Hi s Hs G u Ser Val Arg Al a Me 10 15 QyGu Leu Ser Hl s Arg Asp Q u Leu M S Asp Al a G y Val Vaf Trp

20

25

30

Asn Lys Val Val Arg Gn Ssr Pro Leu Val Aia Pro Thr Asp Pro Arg

35

40

46

As ρ Ser Phe Asn Asn Gn Asn Pro Αερ Val Pro Gy Val Gy Tyf Pro

50 55 60

Arg Ser Ser Asp Al a Asp Pro Al a Ris Thr Sie Pr ο Gu Al a Lys Leu

©5 70 75 60

Arg Ser Al a 11 θ T|r Lau PfO Ser Gy Phe Asn Ser Ser Thr Asn

90

95

G η Val Val Leu Phe Val Rro G y Ttir Q y Ai a Tyr Gy Hl s Gu Sar 100 105 110

Phe Al a Asp Asn Leu Leu Lys Vai IS a Thr Asn AIaGyAIaAIa Asp 115 120 125

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130 135 140

Asn Al a G u Tyr 11 e Al a Tyr Al a i I e Ser Tyr Va! Lys Al a Leu 11 e 145 1SD 155 160

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165 170 175

Al a Thr Gn Trp Val Leu Thr Tyr Trp Pro Ser Thr Al a Pr o Lys Val 180 185 130

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210 215 220

Pr o Cys Pro Pro Ser Val Leu Qn Qn Leu Tyr Ser Ser Asn Leu He 225 230 235 240

Asn Thr Leu ArgAlaAla Gy Gy Gy Asp Al a G n Val Pr o Thr Thr 245 250 255

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260

265

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Leu Thr Ala Ser Al a Arg te! Gy Asp Ala Arg Asn Lys Gy Val Thr

275

280

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290 295 300

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305 310 315 320

Lau Asp Ala Leu Lys Asn Qy Qy Pro Ala Ser Lsu Ser Arg He Arg

325 330 335

Sar Q η Ptie Arg Ai a Cys Ser Asn Val Val Al a Pr o Qy Leu Q η 340 345 350

Lsu Tbr Asp Arg Ala Lys Thr QuQy Leu Leu Ala Thr Wa Qy Ala 355 360 365

Arg IAi Q y Al a Phe Pro Ttir Lys Leu Lsu Arg Qu Pro Ala Leu Arg 370 375 3Β0

Q η Tyr Al a AS a 385

Claims

1. Método para preparar um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de compreender: a) selecionar um polipeptídeo originário que tem atividade de enzima lipolítica e tem uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 30% de identidade com SEQ ID NO: 1, b) selecionar pelo menos um resíduo de aminoácido na seqüência correspondendo a qualquer um dos resíduos 1, 13,25,38-51,53- 55,58,69-79,91,92,96,97,99, 103, 104-110, 113, 132-168, 173, 187-193, 197- 205, 215, 223-231, 242, 244, 256, 259, 261-298, 303, 305, 308-313, ou 315 de SEQ ID NO: 1, c) alterar a seqüência de aminoácidos sendo que a alteração compreende substituição ou deleção do resíduo selecionado ou inserção de pelo menos um resíduo adjacente ao resíduo selecionado, d) preparar um polipeptídeo alterado tendo a seqüência de aminoácidos alterada, e) determinar a atividade de enzima lipolítica específica, a atividade lipolítica em pH alcalino e/ou a enanciosseletividade do polipeptídeo alterado, e f) selecionar um polipeptídeo alterado que tem uma atividade de enzima lipolítica específica maior, uma atividade mais alta em pH alcalino e/ou uma enanciosseletividade aumentada do que o polipeptídeo originário.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo selecionado corresponde a qualquer um dos resíduos1,13 ,25, 38, 42, 74, 140, 143, 147, 164, 168, 190, 199, 215, 223, 242, 244 ,256, 265, 277, 280, 281, 283, 284, 285, 292, 303, 315, 135-160 ou 267-295 de SEQ ID NO: 1.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a alteração compreende substituição do resíduo selecionado por um resíduo encontrado na posição correspondente de qualquer uma de SEQ ID NOS: 1-8.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo originário é selecionado dentre SEQ ID NOS: 1-8.

5. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que: a) tem atividade de enzima lipolítica, e b) tem uma seqüência de aminoácidos que tem pelo meno 80% de identidade com SEQ ID NO: 1 e comparada com SEQ ID NO: 1 compreende uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido em uma posição correspondendo a qualquer um dos resíduos 1,13, 25, 38, 42, 74, 140, 143, 147, 164, 168, 190, 199, 215, 223, 242, 244, 256 , 265, 277, 280, 283, 284, 285, 292, 303, 315, 135-160 ou 267-295.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a diferença de SEQ ID NO: 1 compreende uma alteração correspondendo a N74Q, P143S, A281S, P38S, N292Q, L1QGPL, LIQL, I285E, L147F, L147N, N292C, L140E, P143L, A146T, P280V, A283K, A284N, T103G, A148P, W104H, A148P, N74Q, A281S, V190A, L199P, T256K, T42N, R242A, V215I, T164V, L163F, T164V, D265P, P303K, R168D, A25G, V315I, T244P, K13Q, L277I, Y91S, A92S, N96S, N97*, L99V, ou D223G.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de compreender um conjunto de alterações de aminoácido em comparação com a SEQ ID NO: 1 que é: a)V139I G142N P143I L144G D145G L147T A148G V149L S150IN A151T S153A W155Y; b)Y135F V139R L140M A141V G142P P143V D145C A146P L147S A148F V149P S150KLSCA151PW155L; c)Y135F K136H V139M G142Y P143G D145C L147G A148Ν V149F S150GKVAKAGAPCA151PW155L; d) V139I G142N P143I L144G D145G L147T A148G V149L S150IN A151T S153A W155VA281S,ou e)Y135F K136H V139M G142Y P143G D145C L147G A148N V149F S150GKVAKAGAPC A151P W155LA281S.

8. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de estar na forma imobilizada.

9. Método para realizar uma reação catalisada por lipase, caracterizado pelo fato de compreender contatar reagentes com o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes sendo que a reação é: a) hidrólise com um éster de ácido carboxílico e água como reagentes, e um ácido carboxílico livre e um álcool como produtos, b) síntese de éster com um ácido carboxílico livre e um álcool como reagentes, e um éster de ácido carboxílico como produto, c) alcoólise com um éster de ácido carboxílico e um álcool como reagentes, ou d) acidólise com um éster de ácido carboxílico e um ácido graxo livre como reagentes.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a reação é hidrólise de um iso-propil-éster, ou síntese de éster ou alcoólise com iso-propanol como um reagente.