BRPI0719078A2 - Vacina contra leishmania canina - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "VACINA CONTRA LEISHMANIA CANINA"

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Esse pedido reivindica benefício do pedido de patente provisória americana No. de Série 60/866.848, depositado em 21 de novembro de 2006.

Todos os documentos citados ou referenciados aqui ("documentos aqui citados") e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e folhetos de produtos do fabricante para quaisquer produtos aqui mencionados ou em qualquer documento incorporado aqui por referência são por meio disto aqui incorporados por referência, e podem ser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere ao campo da vacina contra Leishmaniose, especificamente contra Leishmaniose canina.

TÉCNICA ANTERIOR

Leishmaniose é uma doença parasitária principal e severa em humanos, canídeos (cachorros, lobos, coiotes, chacais) e felídeos (leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros gatos grandes e outros felinos, incluindo chitas e linces).

O agente da leishmaniose é um parasita protozoário e pertence ao complexo Leishmania donovani. Esse parasita está amplamente distribuído em países temperados e 5 subtropicais da Europa Meridional, África, Ásia, América do Sul e América Central (Desjeux P., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 2001, 95: 239-43). Leishmania donovani infantum (L. infantum) é responsável pela doença felina e canina na Europa Meridional, África e Ásia. Na América do Sul e na 10 América Central, o agente é Leishmania donovani chagasi (L. chagasi), o qual está intimamente relacionado com L. infantum. Em humanos, o agente é Leishmania donovani (L. donovani) , o qual está intimamente relacionado com L. infantum e L. chagasi.

O parasita é transmitido aos humanos, felídeos e

canídeos por flebotomíneos (sand flies), cuja espécie varia dependendo da localização geográfica. Phlebotomus ariasi (P. ariasi) e Phlebotomus perniciosus (P. perniciosus) são os vetores mais comuns na Europa Meridional, África e Ásia, 20 enquanto Lutzomyia longipalpis (L. Iongipalpis) é mais comum na América do Sul e na América Central.

O hospedeiro doméstico da Leishmaníase são cachorros, os quais podem sofrer de uma doença severa caracterizada pela evolução crônica de sinais víscero-cutâneos ocorrendo em menos de 50% dos animais infectados (Lanotte G. et al., Ann. Parasitol. Hum. Comp., 1979, 54: 277-95). Por ouro lado, cachorros tanto sintomáticos quanto assintomáticos com anticorpos detectáveis podem ser infecciosos para 5 vetores d fleobotomina (Molina R. et al, Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg., 1994, 88: 491-3; Courtenay 0. et al, J. Infect. Dis., 2002, 186: 1314-20). Gatos podem ser vetores dos parasitas protozoários e são considerados como hospedeiros potenciais secundários.

.Esses parasitas causam leishmaniose visceral e/ou

leishmaniose cutânea. Leishmaniose visceral resulta em sintomas clínicos como febre, caquexia, hepatosplenomegalia (aumento do fígado e baço) e citopenia sanguínea. Leishmaniose cutânea ocorre sob várias apresentações, das 15 formas auto-limitativas e mesmo auto-curativas até a doença fatal sistêmica. Lesões de leishmaniose cutânea podem ocorrer em qualquer parte no corpo, porém, os sítios mais comuns são aqueles os quais são expostos ao ambiente e são, por isso, mais suscetíveis às picadas de flebotomíneos. A 20 pápula inicial rapidamente se transforma em uma úlcera. Leishmaniose sistêmica é rara, porém invariavelmente fatal se não for prontamente tratada. Leishmaniose sistêmica afeta os órgãos corporais internos, especificamente o baço e o fígado. Em caninos, a doença está associada a sintomas cutâneos ou com sintomas viscerais ou com sintomas tanto cutâneos quanto viscerais, e é letal na ausência de terapia.

5 Vários tratamentos têm sido descritos, porém nenhum é

totalmente satisfatório devido à toxicidade do próprio tratamento ou a uma tendência recidiva para o animal.

A detecção de massa dos cachorros soropositivos seguido por separação e/ou tratamento com medicamentos, ou a aplicação de massa de colares impregnados com deltametrina foi demonstrada como tendo um impacto na redução da prevalência de leishmaniose humana e canina em áreas endêmicas da Europa Meridional, África e Ásia (Maroli M. et al., Med. Vet. Entomol, 2001, 15: 358-63; Mazloumi Gavgani A.S. et al., Lancet, 2002, 360: 374-9), embora a eficácia da eliminação de caninos soropositivos tenha sido debatida (Dietze R. et al, Clin. Infect. Dis., 1997, 25: 1240-2; Moreira Jr. E. D. et al, Vet. Parasitol., 2004, 122: 245-52). Essas medidas de controle são consideradas inaceitáveis, caras ou não-eficazes (Gradoni L. et al, Vaccine, 2005, 23: 5245-51).

Modelos matemáticos usados para comparar a eficácia de várias ferramentas pra controlar leishmaniose sugerem que uma vacina canina pode ser o método mais prático e eficaz (Dye C, Am. J. Trap. Med. Hyg., 1996, 55: 125-30). Consequentemente, o desenvolvimento de vacinas capazes de proteger canídeos de leishmaniose e/ou prevenirem o progresso da doença em animais infectados é altamente 5 desejável para a implementação de programas de controle de leishmaniose, assim como para a comunidade veterinária (Gradoni L. et al., Vaccine, 2005, 23: 5245-51).

O estado da arte é melhor resumido no pedido de patente americano US-A-2006/0194753. Esse documento 10 descreve uma vacina contendo um vetor de expressão de DNA codificando KMPll de L. infantum (proteína da membrana cinetoplástida). Entretanto, os resultados experimentais em camundongos (conforme mostrado na Figura 1 de 2006/01947 53) mostraram que camundongos vacinados com plasmídeos pMCVl.4 15 expressando KMPll tiveram resultados piores do que os camundongos de controle como a presença de lesões em 8 semanas depois da infecção desafio (pontuação das lesões de cerca de 3.2 e cerca de 1.6 para camundongos vacinados e controle, respectivamente). Além disso, experimentos em 20 cachorros na Figura 2 de 2006/0194753 mostram que depois da administração de uma mistura de um plasmídeo pMOK recombinante expressando o antígeno p36 de L. infantum e três plasmídeos pMCVl.4 recombinantes expressando os antígenos TSA de L. infantum (proteína antioxidante tiol- especifica) , gp63 de L. infantum e KMPll de L. infantum, nenhum anticorpo foi detectável. Não houve diferença clara entre os resultados do grupo vacinado e aqueles do grupo de controle. Depois da infecção desafio com IO7'7 promastigotos de L. infantum, a quantidade de cachorros infectados no grupo vacinado apresentou somente uma leve diferença em relação ao grupo de controle.

Basu et al. (Basu R. et al., J. Immunol, 2005, 174: 7160-71) descreveu um experimento usando hamsters dourados imunizados com KMPll contendo o vetor de expressão mamífero pCMV-LIC versus animais de controle com um constructo de vetor branco não abrigando KMPll (pCMV-LIC). Animais de ambos os grupos receberam duas administrações intramusculares no músculo posterior da coxa (usando uma agulha de medida 28), administrada com 8 dias de distância dos 100 μg dos plasmídeos dissolvidos em salina. No dia 15, um desafio com parasita letal foi feito com qualquer uma das duas cepas, L donovani AG83 ou L. donovani GE1F8R. Todos os hâmsters vacinados imunizados com DNA KMPll sobreviveram ao desafio letal de AG83 e GE1F8R e permaneceram saudáveis até o término do experimento 8 meses após a infecção, enquanto que todos os hâmsters não- imunizados e imunizados com vetor branco sucumbiram ao desafio com L. donovani virulento no período de 6 meses. Atualmente, nenhuma vacina está disponível para indivíduos suscetíveis à Leishmaniar incluindo canídeos.

RESUMO DA INVENÇÃO

Portanto, a presente invenção se refere a uma 5 estratégia de vacina inovadora, a qual é baseada no antígeno KMPll da Leishmania (proteína de membrana cinetoplatídea 11) para prevenir a difusão e implantação do parasita em órgãos internos.

É, consequentemente, um objeto desta invenção fornecer uma vacina capaz de proteger indivíduos (isto é, canídeos, felídeos e humanos) de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença em indivíduos infectados.

Também é um objeto da presente invenção fornecer métodos de uso de tais vacinas para proteger os canídeos de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença em canídeos infectados.

Também é um objeto da presente invenção fornecer métodos de uso de tais vacinas para proteger felídeos de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença em felídeos infectados.

Também é um objeto da presente invenção fornecer métodos de uso de tais vacinas para proteger humanos de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença em humanos infectados. É, consequentemente, ainda um objeto desta invenção fornecer vetores de expressão in vivo codificando o antígeno KMPll da Leishmania ou um imunógeno ou um epitopo seu para tais vacinas e/ou tais métodos de uso.

5 É verificado que nessa descoberta e particularmente

nas reivindicações, termos tais como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem ter o significado atribuído a eles na lei de patentes americana; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", 10 "incluindo" e semelhantes; e que termos tais como "consistindo essencialmente de" tem o significado atribuído a eles na lei de patentes americana, por exemplo, eles permitem elementos não explicitamente citados, porém excluem elementos que são encontrados na técnica anterior 15 ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

Essas e outras modalidades são reveladas ou são óbvias de e englobada pela descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada a seguir, dada a título de

exemplo, e a qual não é tencionada a limitar a invenção às modalidades específicas descritas, pode ser entendida juntamente com as figuras associadas incorporadas aqui por referência, nas quais: A Figura 1 mostra a frequência de CD8 antes da vacinação, entre uma vacinação inicial e uma vacinação de reforço subsequente, e depois da vacinação de reforço; expressa em porcentagem de células CD8 periféricas presentes no sangue.

A Figura 2 mostra a frequência de células produtoras de IFN-gama antes da vacinação, entre uma vacinação inicial e uma subsequente vacinação de reforço, e depois da vacinação de reforço; expressa em porcentagem de linfócitos IFN-gama+ periféricos presentes no sangue.

A Figura 3 mostra a proliferação das células CD8 T específicas antes da vacinação, entre uma vacinação inicial e uma vacinação de reforço subsequente, e depois da vacinação de reforço; expressa em porcentagem de células CD8 T anti-KMPll na população de células CD8 T.

A Figura 4 mostra a proliferação das células CD4 T específicas antes da vacinação, entre uma vacinação inicial e uma vacinação de reforço subsequente e depois da vacinação de reforço; expressa em porcentagem de células CD4 T anti-KMPll na população de células CD4 T.

A Figura 5 é um Western Blot mostrando a resposta de IgG de um cachorro vacinado KMPll, onde a coluna 1 é cachorro não-vacinado, coluna 2 é cachorro vacinado com KMPll pós-iniciação (D14), coluna 3 é cachorro vacinado com KMPll pós-reforço (D41), coluna 4 é cachorro vacinado com KMPll pós-reforço (D55), coluna 5 é cachorro vacinado com KMPll pós-reforço (D76) , coluna 6 é cachorro controle pós- iniciação (D14) e coluna 7 é cachorro controle pós-reforço 5 (D41). 0 estudo utilizou antígenos de L. infantum em 6 μg/10 μία, os primeiros anticorpos (soro) 1/1000 e os segundos anticorpos (anti-cachorros IgG-HRP) 1/2000.

A Figura 6 é o diagrama de plasmídeo do plasmídeo doador ALVAC pJSY1992.1.

A Figura 7 mostra um gel de enzima de restrição

teórica para o DNA genômico de VCP2350.1.1.5, criado.no Vetor NTI.

A Figura 8 é um gel de análise de restrição de vCP2350.1.1.5 depois da digestão com BgIII, HindIIIe PstI, e separação por eletroforese em gel de agarose 0,8%.

A Figura 9 é uma análise de Southern blot de vCP2350.1.1.5 obtida pela sondagem com sonda KMPl de Leishmania sintética.

A Figura 10 é o diagrama de plasmídeo do plasmídeo doador VR2001-TOPA ou VR2001- TOPO.

As seqüências da SEQ ID NO: I e da SEQ ID NO: 2 mostram a seqüência de ácidos nucléicos de KMPll de L. infantum da cepa de uso nos exemplos e a seqüência de aminoácidos da proteína codificada por esta seqüência de ácidos nucléicos, respectivamente.

A seqüência SEQ ID NO: 3 mostra a seqüência de ácidos nucléicos otimizada por códons codificando a proteína KMPll de L. infantum, conforme apresentando no banco de dados GenBANK NCBI No. de acesso CAA64883, e na SEQ ID NO: 4.

A seqüência SEQ ID NO: 5 mostra a seqüência de ácido nucléico de uma fita do plasmídeo KMPll pVR1020.

A seqüência SEQ ID NO: 6 mostra a seqüência do ácido nucléico de uma fita do plasmídeo doador ALVAC pJSY1992.1. DESCRIÇÃO DETAIjHADA

Em um aspecto, a presente invenção se refere a uma estratégia de vacina, a qual é baseada em um regime de administração inicial-reforço, onde a administração inicial e a(s) administração(ões) de reforço utiliza(m) uma 15 composição compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e um vetor de expressão in vivo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos, que contém e expressa o antígeno KMPll de Leishmania ou seus imunógenos e epítopos, conforme aqui 20 descrito.

Os antígenos KMPll de Leishmania são derivados, por exemplo, de L. infantum ou de L. chagasi. KMPll é uma proteína de membrana de superfície altamente conservada presente em todos os membros da família Kinetoplastidae e é diferentemente expressa tanto nas formas amastigota quanto promastigota de Leishmania (Jardim A. et al., Biochem. J., 1995, 305: 315-20; Jardim A. et al., Biochem. J., 1995, 305: 307-13 ; Berberich C. et al., Biochim. Biophys. Acta, 5 1998, 1442: 230-7). As seqüências de ácido nucléico do gene e da seqüência de aminoácidos da proteína KMPll da Leishmania estão disponíveis nos bancos de dados de acesso público, notoriamente como L. infantum no banco de dados GenBank sob os números de acesso X95627 e X95626. A 10 seqüência de ácido nucléico de L. donovani também está disponível a partir do banco de dados GenBank, notoriamente sob o número de acesso S77039.

A presente invenção se refere ao uso dos vetores de expressão in vivo em um regime de administração inicial- 15 reforço, compreendendo a administração inicial de uma vacina compreendendo, em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável de um vetor de expressão in vivo contendo uma seqüência de polinucleotídeos para expressar, in vivo, o polipeptídio, antígeno, epítopo ou 2 0 imunógeno de KMPll de Leishmania, seguido por uma administração de reforço de uma vacina compreendendo, em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, um vetor de expressão in vivo contendo uma seqüência de polinucleotídeos para expressar, in vivo, o antígeno, epítopo ou imunógeno de KMPll de Leishmania pra proteger canídeos, felídeos e humanos de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença em canídeos, felídeos e humanos infectados.

5 Por definição, um regime inicial-reforço compreende

pelo menos uma administração inicial e pelo menos uma administração de reforço usando pelo menos um polipeptídio, antígeno, epítopo ou imunógeno comum. A vacina usada na administração inicial pode ser diferente na sua natureza 10 daquelas usadas como uma vacina de reforço posterior. A administração inicial pode compreender uma ou mais administrações. Semelhantemente, a administração de reforço pode compreender uma ou mais administrações.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma 15 composição de vacina compreendendo um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e um vetor de expressão in vivo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos, a qual contém e expressa o antígeno KMPll de Leishmania ou seus imunógenos ou epítopos, 20 conforme descrito abaixo.

Conforme aqui utilizado, o termo "antígeno" ou "imunógeno" significa uma substância que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. 0 antígeno pode compreender um organismo total, morto, atenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor recombinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; um pedaço ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune na apresentação a um animal 5 hospedeiro; uma proteína, polipeptídio, um peptídeo, um epítopo, um hapteno ou qualquer combinação desses. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou antitoxina.

0 termo "proteína ou peptídeo imunogênico", conforme aqui utilizado, também se refere e inclui peptídeos e polipeptídios que são imunologicamente ativos no sentido de que uma vez administrados ao hospedeiro, ele é capaz de suscitar uma resposta imune do tipo humoral e/ou celular direcionada contra a proteína. Preferivelmente, o fragmento de proteína é tal que ele tem substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteína total. Deste modo, um fragmento de proteína de acordo com a invenção compreende ou consiste essencialmente de ou consiste em pelo menos um epítopo ou determinante antigênico. 0 termo epítopo se refere a um sítio de proteína capaz de induzir uma reação imune do tipo humoral (células B) e/ou tipo celular (células T).

0 termo "proteína ou peptídeo imunogênico" contempla ainda anulações, adições, e substituições da seqüência, até que as funções polipeptídicas produzam uma resposta imunológica conforme aqui definido. Sob esse aspecto, substituições particularmente preferidas serão geralmente conservativas na natureza, isto é, aquelas substituições 5 que ocorrem em uma família de aminoácidos. Por exemplo, aminoácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácidos - aspartato e glutamato; (2) básicos - lisina, arginina e histidina; (3) não-polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, 10 triptofano; e (4) polares não-carregados - glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são algumas vezes classificados como aminoácidos aromáticos. É razoavelmente previsível que uma substituição isolada de 15 leucina com isoleucina ou valina, ou vice-versa; um aspartato com um glutamato ou vice-versa; uma treonina com uma serina ou vice-versa; ou uma substituição conservativa similar de um amínoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um efeito maior na atividade 20 biológica. As proteínas com substancialmente a mesma seqüência de aminoácidos em relação à molécula de referência, porém possuindo substituições de aminoácidos menores que não afetem substancialmente a imunogenicidade da proteína estão, consequentemente, dentro da definição de polipeptidio de referência.

0 termo "epítopo" se refere ao sitio em um antígeno ou hapteno ao qual respondera as células B específicas e/ou células T. 0 termo também é usado concomitantemente com 5 "determinante antigênico" ou "sítio determinante antigênico". Anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados em um imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo bloquear a ligação de outro anticorpo a um antígeno alvo.

Uma "resposta imunológica" a uma composição ou vacina

é o desenvolvimento no hospedeiro de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpo a uma composição ou vacina de interesse. Geralmente, uma "resposta imunológica" inclui, porém não está limitada, a um ou mais dos seguintes 15 efeitos: a produção dos anticorpos, células B, células T helper e/ou células T citotóxicas, direcionado especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. Preferivelmente, o hospedeiro irá apresentar uma resposta imunológica, 20 terapêutica ou protetora, de modo que a resistência a novas infecções será intensificada e/ou a severidade clínica da doença será reduzida. Tal proteção será demonstrada ou por uma redução ou falta de sintomas normalmente apresentados por um hospedeiro infectado, um tempo de recuperação mais rápido e/ou um título viral reduzido no hospedeiro infectado.

Os termos proteína ou polipeptídio "imunogênico", conforme aqui utilizados, também se referem a uma seqüência 5 de aminoácidos a qual elicia uma resposta imune, conforme descrito acima. Uma proteína ou polipeptídio "imunogênica", conforme aqui utilizado, inclui a seqüência completa da proteína, seus análogos ou fragmentos imunogênicos seus. Por "fragmento imunogênico" se entende um fragmento de uma 10 , proteína a qual inclui um ou mais epítopos e, deste modo, elicia a resposta imunológica descrita acima. Tais fragmentos podem ser identificados usando qualquer quantidade de técnicas de mapeamento de epítopo, bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Epitope Mapping 15 Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados, por exemplo, concorrentemente pela síntese de grandes quantidades de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondendo às porções da molécula 20 de proteína, e a reação dos peptídeos com os anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na arte e descritas, por exemplo, na Patente Americana No. 4.708.871; Geysen et al, 1984; Geysen et al, 1986, todos aqui incorporados por referência nas suas totalidades. Semelhantemente, os epitopos conformacionais são prontamente identificados pela determinação da conformação espacial dos aminoácidos tais como, por exemplo, cristalografia de raio-X e ressonância 5 magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, acima. Métodos especialmente aplicáveis às proteínas de T. parva são totalmente descritos no Pedido PCT No. de Série PCT/US2004/022605, aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Antígenos sintéticos também estão incluídos na

definição, por exemplo, poliepítopos, epítopos flanqueadores e outros antígenos recombinantes ou sinteticamente derivados. Ver, por exemplo, Bergmann et al, 1993; Bergmann et al, 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al, 15 1998. Fragmentos imunogênicos, para propósitos da presente invenção, irão geralmente incluir pelo menos cerca de 3 aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 5 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 a 15 aminoácidos, e mais preferivelmente cerca de 15 a 25 20 aminoácidos ou mais aminoácidos da molécula. Não existe limite superior crítico para o comprimento do fragmento, o qual poderia compreender quase todo o comprimento da seqüência de proteína, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um epítopo da proteína. Portanto, uma estrutura mínima de um polinucleotídeo expressando um epítopo é aquela que compreende ou consiste essencialmente de ou consiste em nucleotídeos para codificar um epítopo ou determinante antigênico de uma 5 poliproteína ou proteína de influenza. Um polinucleotídeo codificando um fragmento da proteína ou poliproteína total, mais vantajosamente, compreende ou consiste essencialmente de ou consiste em um mínimo de 15 nucleotídeos, pelo menos 15 - 30, vantajosamente cerca de 30 a 45 nucleotídeos, e 10 preferivelmente cerca de 45 a 75, pelo menos 57, 87 ou 150 nucleotídeos consecutivos ou contíguos da seqüência codificando a proteína ou poliproteína total. Procedimentos de determinação de epítopo, tais como a geração de bibliotecas de peptídeo sobreponíveis (Hemmer et al., 15 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) e algoritmos (De Groot et al. , 1999), e no Pedido PCT No. de Série No. PCT/US2004/022605, todos os quais sendo aqui incorporados 20 por referência nas suas totalidades, podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação demasiada. Outros documentos citados e aqui incorporados também podem ser consultados para métodos para determinar epítopos de um imunógeno ou um antígeno e as moléculas de ácido nucléico que codificam tais epítopos.

O termo "composição de vacina" ou "vacina" engloba aqui qualquer composição capaz, uma vez injetada em um indivíduo, incluindo caninos, felídeos e humanos, de 5 proteger o indivíduo de leishmaniose cutânea e/ou leishmaniose visceral, incluído a prevenção de implantação do parasita, e/ou de prevenir a progressão da doença nos indivíduos infectados, e/ou de limitar a difusão de parasitas "em fuga" dos órgãos internos. Isso pode ser 10 conseguido pela vacina através da indução da resposta imune humoral contra KMPll, notoriamente a indução de IgGl anti- KMP11, e/ou através da indução de uma reposta imune mediada por células contra KMP11, incluindo através da indução de uma resposta imune mediada por célula CD8 contra KMPll e/ou 15 a indução de uma resposta imune mediada por células CD4 contra KMPll. A indução de uma resposta imune humoral é desejável em exemplos de leishmaniose cutânea, e a indução imune mediada por células é desejável nos exemplos de resposta no caso de leishmaniose visceral. Uma vantagem da 20 estratégia de vacina e do uso de vacinas da presente invenção é induzir tanto a resposta imune humoral e imune quanto a resposta imune mediada por células, o qual permite a proteção do indivíduo a partir de leishmaniose cutânea e leishmaniose visceral. O excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser água, salina ou um tampão, ou outra substância conhecida pelas pessoas versadas na técnica e reconhecida pelas pessoas versadas na 5 técnica como um excipiente aceitável.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um vetor de expressão in vivo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos, a qual contém e expressa o antígeno da Leishmania KMPll ou imunógeno ou epítopos seus, conforme aqui descrito.

0 vetor de expressão in vivo inclui qualquer unidade de transcrição contendo um polinucleotídeo ou um gene de interesse e . aqueles elementos essenciais para a sua expressão in vivo. Esses vetores de expressão podem ser plasmídeos ou vetores virais recombinantes.

Conforme aqui utilizado, o termo "polinucleotídeo" inclui DNA e RNA, e seus derivados, tais como aqueles contendo estruturas modificadas. Deve ser percebido que a invenção fornece polinucleotídeos compreendendo seqüências complementares àquelas aqui descritas.

Polinucleotídeos de acordo com a invenção podem ser preparados de diferentes formas (por exemplo, por síntese química, por clonagem de genes, etc.) e pode assumir várias formas (por exemplo, de fita única, de fita dupla, iniciadores, sondas, etc.) (ver Maniatis et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) .

O polinucleotídeo é geralmente uma estrutura de leitura aberta (ORF), iniciando de um códon de partida (códon de metionina) e terminando em um sinal de terminação (códon de parada). O polinucleotídeo também pode incluir regiões que regulem a sua expressão, tais como iniciação de transcrição, tradução e terminação de transcrição. Deste modo, também são incluídos os promotores e regiões de ligação a ribossoma (em geral, esses elementos regulatórios se encontram aproximadamente entre 60 e 250 nucleotídeos À montante do códon de partida do gene ou seqüência codificadora; Doree S M et al, J. Bacterid. 2001, 183(6): 1983-9; Pandher K et al , Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613- 9; Chung J Y et al, FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289- 296) , terminadores de transcrição (em geral o terminador está localizado aproximadamente 50 nucleotídeos à jusante do códon de parada da seqüência ou gene codificador; Ward C K et al., Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326- 36). No caso de um operon, tais regiões regulatórias podem estar localizadas em uma distância maior à montante do gene ou seqüência codificadora.

Conforme aqui utilizado, o termo "derivado" se refere a um polipeptídio, ou a um ácido nucléico codificando um polipeptídio, que tem uma ou mais variações de aminoácidos conservativas ou outras modificações menores, tal como (1) o polipeptídio correspondente que tem função 5 substancialmente equivalente em comparação com o polipeptídio do tipo selvagem ou (2) um anticorpo suscitado contra o polipeptídio é imunorreativo com o polipeptídio do tipo selvagem.

0 termo "variação conservativa" denota a substituição 10 de um resíduo de aminoácidos por outro resíduo biologicamente similar, ou a substituição de um nucleotídeo em uma seqüência de ácido nucléico de modo que o resíduo de aminoácido codificado não muda ou é outro resíduo biologicamente semelhante. Exemplos de variações 15 conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina para outro resíduo hidrofóbico, ou a substituição de um resíduo polar por outro resíduo polar, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico ou 20 aspártico, ou glutamina por asparagina e assim por diante. O termo "variação conservativa" também inclui o uso de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido de origem não-substituído, com a condição de que os anticorpos suscitados ao polipeptídio substituído também imunorreajam com o polipeptídio não-substituído.

De um modo mais geral, a presente invenção engloba derivados polinucleotídicos. Conforme aqui utilizado, o termo "derivado" se refere a um polipeptídio, ou a um ácido 5 nucléico codificando um polipeptídio, que tenha pelo menos cerca de 50% de identidade, pelo menos cerca de 60% de identidade, pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 75% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 85% de identidade, 90% 10 de identidade, pelo menos cerca de 95% de identidade e pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais de identidade com a seqüência de aminoácido SEQ ID NO: 2. As seqüências com tal homologia ou identidade podem englobar a degeneração do código genético. A porcentagem de identidade 15 entre duas seqüências de aminoácidos pode ser estabelecida pela matriz blosum.62 e por blast em par pelo NCBI (National Center for Biotechnlogy Information) , usando os parâmetros padrões (ver, por exemplo, o algoritmo BLAST ou BLASTX disponível no servidor do "National Center for Biotechnlogy 20 Information" (NCBI, Bethesda, Md., EUA), assim como em Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410; e deste modo, esse documento fala sobre o uso do algoritmo ou da matriz BLAST ou BLASTX e BLOSUM62 pelo termo "blasts").

"Código", conforme aqui utilizado, não significa que o polinucleotídeo esteja limitado a uma seqüência codificadora efetiva, porém também engloba o gene como um todo incluindo as suas seqüências regulatórias as quais não são seqüências codificadoras.

Homologia ou identidade de seqüência, tal como

homologia de seqüência de nucleotídeo, também pode ser determinada usando o programa "Align" de Myers e Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988, incorporada aqui por referência) e disponível no 10 NCBI, assim como o mesmo ou outros programas disponíveis na internet em seus sítios, tal como o sítio do NCBI.

Alternativamente ou adicionalmente, o termo "homologia" ou "identidade", por exemplo, em relação a uma seqüência de nucleotídeo ou de aminoácido, pode indicar uma 15 medida quantitativa de homologia entre as duas seqüências. A homologia da seqüência porcentual pode ser calculada como: (Nref - Ndif) *100/Nref, em que Ndif é a quantidade total de resíduos não-idênticos nas duas seqüências, quando alinhadas, e em que Nref é a quantidade de resíduos em uma 20 das seqüências. Deste modo, a seqüência de DNA AGTCAGTC terá uma identidade de seqüência de 75% com a seqüência AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2) .

Alternativamente ou adicionalmente, "homologia" ou "identidade" em relação às seqüências pode se referir à quantidade, de posições com nucleotídeos ou aminoácidos idênticos dividido pela quantidade de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas seqüências nas quais o alinhamento das duas seqüências pode ser determinada com o 5 algoritmo de Wilbur e Lipman (Wilbur e Lipman, 1983 PNAS USA 80:726, incorporado aqui por referência), por exemplo, usando uma janela com tamanho de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma penalidade de intervalo de 4, e a análise auxiliada por computador e a 10 interpretação dos dados da seqüência incluindo o alinhamento podem ser convenientemente efetuadas usando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Quando as seqüências de RNA são consideradas como sendo semelhantes, 15 ou têm um grau de identidade ou homologia de seqüência com as seqüências de DNA, timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual à uracil (U) e a seqüência de RNA. Deste modo, as seqüências de RNA estão dentro do escopo da invenção e podem ser derivadas a partir das seqüências de 20 DNA, por timidina (T) na seqüência de DNA sendo considerada igual ao uracil (U) nas seqüências de RNA.

Vantajosamente, a identidade ou homologia da seqüência, tal como a identidade ou homologia da seqüência de aminoácido pode ser determinada usando o programa BlastP (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402, aqui incorporado por referência) e disponível n NCBI, assim como o mesmo ou outros programas disponíveis pela Internet nos sítios nela contidos, tal como o sítio NCBI.

5 Os seguintes documentos (cada um aqui incorporado por

referência) fornecem algoritmos para comparar a identidade ou homologia relativa das seqüências tais como os resíduos de aminoácidos das duas proteínas, e adicionalmente ou alternativamente em relação ao precedente, os ensinamentos 10 nessas referências podem ser usados para determinar a homologia ou identidade porcentual: Needleman SB e Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins," J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF e Waterman MS, 15 "Comparison of Bio-sequences," Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981); Smith TF, Waterman MS e Sadler JR, 'fStatistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res., 11 :2205- 2220 (1983); Feng DF e Dolittle RF, "Progressive sequence 20 alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees," J. of Molec. Evol., 25:351-360 (1987); Higgins DG e Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer," CABI0S, 5: 151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG e Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice," Nucleic Acid Res., 22: 4673-480 (1994); e, Devereux J, Haeberlie P e Smithies O, "A 5 comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984). E, sem experimentação demasiada, a pessoa habilitada pode consultar com muitos outros programas ou referências para determinar a homologia percentual.

As vacinas de acordo com a presente invenção incluem

vetores codificando pelo menos o polinucleotídeo ou gene KMPll de L. infantum e/ou o polinucleotídeo ou gene KMPll de L. chagasi, e/ou o polinucleotídeo ou gene KMPll de L. donovani. Vantajosamente, para a Europa Meridional, África 15 e Ásia, vacinas incluem vetores codificando o polinucleotídeo KMPll ou gene a partir de pelo menos L. infantum. Vantajosamente, para as Américas do Sul e Central, as vacinas incluem vetores codificando o polinucleotídeo ou o gene KMPll a partir de pelo menos L. 20 chagasi.

A preferência de código dentre as espécies diferentes podem ser dramaticamente diferente. Para intensificar o nível de expressão de uma proteína exógena, é importante emparelhar a frequência de códons da proteína exógena com aquela do sistema de expressão hospedeiro (Kim et al, Gene, 1997, 199(1-2): 293- 301). Para a otimização do códon, outros fatores diferentes da frequência do códon podem ser levados em consideração, por exemplo, porções e repetições 5 de DNA, estrutura secundária, conteúdo de GC, códons repetitivos, sítios de endonuclease de restrição, porções funcionais como sítio de união ou estrutura terminadora. Algoritmos foram criados para facilitar a modelagem da seqüência de nucleotídeo ótima. Geneart GmbH (REgensburg, 10 Alemanha) desenvolveu o software GeneOptimizer™ proprietário (W0-A-04/059556 e WO-A-06/013103) que implementa a otimização multiparamétrica em uma única operação. Levando-se em consideração os parâmetros mais importantes em paralelo, o software gera um total de até 15 500.000 variantes otimizadas da seqüência alvo em uma abordagem evolucionária e seleciona aquela que é mais bem adequada. Foi reportado que tais genes otimizados têm um aumento de até 100 vezes de rendimentos de expressão em comparação com a seqüência do gene original (Bradel- 20 Tretheway et al., J. Virol. Methods, 2003, 111(2): 145-56; Disbrow et al., Virology, 2003, 311(1): 105-14).

As seqüências de ácidos nucléicos publicadas para a proteína KMPll de L. infantum (número de acesso do bando de dados GenBank NCBI CAA64883) foram otimizadas pelo software GeneOptimizer™.

A seqüência sintética de ácido nucléico com códon otimizado para a proteína KMPll de L. infantum é projetada como SEQ ID NO: 3. As seqüências de ácido nucléico com 5 códons otimizados codificam um polipeptídio com a mesma seqüência de aminoácidos que aquelas descritas no GenBank CAA64883, também designada SEQ ID NO: 4. A otimização do códon somente muda a seqüência de ácido nucléico e não a seqüência de aminoácidos codificada.

Outro objeto da presente invenção se refere a uma

seqüência de polinucleotídeos com códon otimizado codificando um antígeno de Leishmania KMPll. Uma modalidade dessa invenção é a seqüência de polinucleotídeo com códon otimizado SEQ ID NO: 3, codificando um antígeno KMPll de L. infantum da SEQ ID NO: 4.

Outro objeto se refere a um vetor de expressão in vivo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos com códon otimizado codificando um antígeno KMPll de Leishmania. Uma modalidade desse objeto é um vetor de expressão in vivo 20 compreendendo a seqüência de polinucleotídeo com códon otimizado SEQ ID NO: 3, codificando a SEQ ID NO: 4 do antígeno KMPll de L. infantum.

De modo mais geral, a presente invenção engloba vetores de expressão in vivo incluindo qualquer plasmídeo (ΕΡ-Α2-1001025; Chaudhuri P Res. Vet. Sei. 2001, 70(3), 255-6) contendo o polinucleotídeo ou gene da Leishmania KMPll e elementos necessários para a sua expressão in vivo.

Conforme aqui utilizado, o termo "plasmídeo" inclui 5 qualquer unidade de transcrição de DNA compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejadas; e, sob esse aspecto, é verificado que um plasmídeo circular enovelado 10 ou superenovelado, assim como uma forma linear, são pretendidos a estar dentro do escopo da invenção.

Em um exemplo específico não limitativo, o plasmídeo pVR1020 ou pVR1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97; Hartikka J. et al., 15 Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217) ou pABllO (Patente Americana No. 6.852.705) pode ser usado como um vetor para a inserção de uma seqüência de polinucleotídeo. 0 plasmídeo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a seqüência de sinal tPA humana. Cada plasmídeo compreende ou contém ou consiste 20 essencialmente do polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor, em que o promotor é vantajosamente adjacente ao polinucleotídeo da presente invenção. Em geral, é vantajoso empregar um promotor forte que seja funcional em células eucarióticas. Um exemplo de um promotor útil é o promotor do citomegalovírus inicial (CMV-IE) de origem humana ou murina, ou opcionalmente com outra origem, tal como o rato 5 ou porquinho-da-índia. O promotor CMV-IE pode compreender a parte do promotor efetiva, a qual pode ou não estar associada com a parte intensificadora. Pode ser feita referência à EP-A-260 148, ΕΡ-Ά-323 597 e às Patentes Americanas Nos. 5.168.062, 5.385.839 e 4.968.615, assim 10 como ao Pedido PCT No WO-A-87/03905. 0 promotor CMV-IE é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al, Cell, 1985, 41, 521-530) ou CMV-IE de murino. Em termos mais gerais, o promotor tem origem ou viral ou celular. Um promotor viral forte diferente de CMV-IE que pode ser 15 utilmente empregado na prática da invenção é o promotor inicial/tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus Rous sarcoma. Um promotor celular forte que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor de um gene para o citoesqueleto, tal como, por exemplo, o 20 promotor de desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), ou o promotor de actina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-277) . Subfragmentos funcionais desses promotores, isto é, porções desses promotores que mantêm a atividade promotora adequada, estão incluídos na presente invenção, por exemplo, promotores CMV-IE truncados de acordo com o Pedido PCT No. WO-A-98/00166 ou o Pedido de Patente Americana No. 6.156.567 podem ser usados na prática da invenção. Um promotor útil na prática da invenção inclui 5 consequentemente derivados e subfragmentos de um promotor de comprimento total que mantém uma atividade promotora adequada e, deste modo, funciona como um promotor, vantajosamente com atividade promotora substancialmente similar àquela do promotor efetivo ou de comprimento total 10 a partir do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, semelhante à atividade dos promotores CMV-IE truncados da Patente Americana No. 6.156.567 em comparação com a atividade dos promotores CMV-IE de comprimento total. Deste modo, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode 15 compreender ou consistir essencialmente de uma porção promotora do promotor de comprimento total e/ou de uma porção intensificadora do promotor de comprimento total, assim como derivados e subfragmentos.

Vantajosamente, os plasmídeos compreendem ou consistem 20 essencialmente em outros elementos de controle de expressão. É especialmente vantajoso incorporar seqüência(s) estabilizadora(s) , por exemplo, seqüência(s) de intron, por exemplo, o primeiro íntron de hCMV-IE (Pedido PCT No. WO-A-89/01036) , o íntron II do gene da β- globina de coelho (van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344). Como em relação ao sinal de poliadenilação (poliA) para os plasmídeos e vetores virais diferentes dos poxvirus, o uso pode ser mais ser feito do sinal poli (A) do 5 gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (ver Patente Americana No. 5.122.458) ou o sinal poli (A) do gene da β- globina de coelho do sinal poli (A) do virus SV40.

Em uma modalidade da presente invenção, o vetor de plasmídeo é pVR1020 KMPll conforme descrito no Exemplo 1 aqui.

Mais geralmente, a presente invenção engloba os vetores de expressão in vivo incluindo qualquer vetor viral recombinante contendo o polinucleotídeo ou gene KMPll de Leishmania e todos os elementos necessários para a sua expressão in vivo.

Os referidos vetores virais recombinantes poderiam ser selecionados, por exemplo, dos poxvirus, especialmente dos vírus avipox, tais como o vírus fowlpox ou os vírus canarypox. Em uma modalidade, o vírus fowlpox é um TROVAC 20 (ver WO-A-96/40241). Em uma modalidade, o vetor canarypox é um ALVAC. 0 uso desses vetores virais recombinantes e a inserção de polinucleotídeos ou genes de interesse é completamente descrito no US-A-5.174.993; US-A-5.505.941 e US-A-5.7 66.599 para fowlpox, e na US-A-5.756.103, para o canarypox. Mais do que ura sítio de inserção dentro do genoma viral poderia ser usado para a inserção de vários genes de interesse.

Ern uma modalidade, o vetor viral é um adenovírus, tal 5 como um adenovírus humano (HAV) ou um adenovírus canino (CAV).

Em outra modalidade, o vetor viral é um adenovírus humano, especificamente um adenovírus de sorotiopo 5, tornado incompetente para replicação por uma anulação na 10 região El do genoma viral, especialmente aproximadamente do nucleotídeo 459 até aproximadamente o nucleotídeo 3510 por referência à seqüência do hAd5 revelado em GenBank sob o número de acesso M73260 e na publicação de referência Chroboczek et al., 1992. 0 adenovírus anulado é propagado 15 em células 293 expressando El (Graham et al., 1977) ou células PER, especialmente PER.C6 (Falloux et al., 1998). 0 adenovírus humano pode ser adicionalmente ou alternativamente anulado na região E3, especialmente aproximadamente do nucleotídeo 28592 até aproximadamente o 20 nucleotídeo 30470. A anulação na região El pode ser feita juntamente com uma anulação na região E3 (ver, por exemplo, Shriver et al., 2002; Graham et al., 1991; Ilan et al., 1997; Patentes Americanas Nos. 6.133.028 e 6.692.956; Tripathy et al., 1994; Tapnell, 1993; Danthinne et al., 2000; Berkner, 1988; Berkner et al., 1983; Chavier et al., 1996). Os sítios de inserção podem ser nos locais El e/ou E3 (região) eventualmente após a anulação parcial ou completa das regiões El e/ou E3. Vantajosamente, quando o 5 vetor de expressão é um adenovírus, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, tais como um promotor forte, vantajosamente um promotor do gene inicial imediato do citomegalovírus (promotor CMV-IE), especialmente a região 10 intensificadora/promotora aproximadamente pelo nucleotídeo -734 até aproximadamente o nucleotídeo +7 em Boshart et al., 1985 ou a região intensif icadora/promotora do vetor pCI de Promega Corp. 0 promotor CMV-IE é vantajosamente de origem murina ou humana. 0 promotor do fator de alongamento 15 Ia também pode ser usado. Um promotor específico de músculo também pode ser usado (Li et al., 1999). Os promotores fortes também são aqui discutidos em relação aos vetores de plasmídeo. Em uma modalidade, uma seqüência de união pode estar localizada à jusante da região 20 intensificadora/promotora. Por exemplo, o íntron 1 isolado do gene CMV-IE (Stenberg et al., 1984), o íntron isolado do gene da β-globina de coelho ou ser humano, especialmente o íntron 2 do gene da b-globina, o íntron isolado do gene da imunoglobulina, uma seqüência de união do gene inicial de SV40 ou a seqüência de íntron quimérica isolada do vetor pCI da Promega Corp. compreendendo a seqüência doadora do gene da β-globina humana que pode ser fundida à seqüência 5 aceptora de imunoglobulina de camundongo (aproximadamente do nucleotídeo 890 até aproximadamente o nucleotídeo 1022 em GenBank sob o número de acesso CVU47120). Uma seqüência poli (A) e a seqüência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, um 10 gene do hormônio de crescimento bovino, especialmente aproximadamente do nucleotídeo 2339 até aproximadamente o nucleotídeo 2550 no Genbank sob o número de acesso BOVGHRH, um gene da β-globina de coelho ou um sinal de poliadenilação do gene tardio SV40.

Em outra modalidade, o vetor viral é um adenovírus

canino, especialmente um CAV-2 (ver, por exemplo, Fischer et al., 2002; Patentes Americanas Nos. 5.529.780 e 5.688.920; Pedido PCT No. W095/14102). Para CAV, os sítios de inserção podem estar na região R3 e/ou na região 20 localizada entre a região E4 e a região ITR da direita (ver as Patentes Americanas Nos. 6.090.393 e 6.156.567). Em uma modalidade, a inserção está sob o controle de um promotor, tal como um promotor do gene de ativação imediata do citomegalovírus (promotor CMV-IE) , ou um promotor já descrito para um vetor de adenovírus humano. Uma seqüência poli (A) e uma seqüência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, um 5 sinal de poliadenilação do gene do hormônio de crescimento bovino ou do gene β-globina de coelho.

Em outra modalidade, o vetor viral é um herpesvírus, tal como um herpesvírus canino (CHV) ou um herpesvírus felino (FHV). Para CHV, os sítios de inserção podem estar 10 no gene da timidina quinase, na 0RF3 ou na ORF UL43 (ver Patente Americana No. 6.159.477). Em uma modalidade, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, vantajosamente um promotor CMV-IE (murino ou humano). Uma 15 seqüência poli (A) e uma seqüência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, hormônio do crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene β-globina de coelho.

Para vetores recombinantes baseados em um vetor poxvirus, um vírus vaccinia ou um vírus vaccinia atenuado (por exemplo, MVA, uma cepa Ankara modificada obtida depois de mais de 57 0 passagens da cepa de vacina Ankara em fibroblastos de embriões de galinha; ver Stickl & Hochstein-Mintzel, Stickl & Hoehstein-Mintzel, Muneh. Med. Wsehrf 1971, 113, 1149-1153; Sutter et al, Proc. Natl- Acad. Sei. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; disponível como ATCC VR-1508; ou NYVAC, ver a Patente Americana No.

5 5.494.807, por exemplo, os Exemplos de 1 a 6 e a seqüência da Patente Americana No. 5.494.807, os quais discutem a construção de NYVAC, assim como variações de NYVAC com ORFs adicionais anulados do genoma do vírus vaccinia da cepa Copenhagen, assim como a inserção das moléculas de ácido 10 nucléico codificantes heterólogas em sítios deste recombinante, e também o uso dos promotores emparelhados; ver também WO-A-96/40241) , um vírus apivox ou um vírus avipox atenuado (por exemplo, canarypox, fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC ou TR0VAC; ver, por exemplo, a 15 Patente Americana No. 5.505.941, 5.494.807) podem ser usados. Vírus canarypox atenuados estão descritos na Patente Americana No. 5.756.103 (ALVAC) e WO-A-01/05934. Também é feita referência á Patente Americana No. 5.7 66.599, a qual pertence à cepa fowlpox atenuada TROVAC. 20 É feita referência ao canarypox disponível da ATCC sob o número de acesso VR-Ill. Várias cepas de vacinação do vírus fowlpox também são disponíveis, por exemplo, a cepa DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL e a vacina NOBILIS VARIOLE comercializada por INTERVET. Para informações sobre o método usado para gerar seus recombinantes e como administrar os seus recombinantes, a pessoa habilitada pode se referir aos documentos aqui citados e ao W0-A-90/12882, por exemplo, uma vez que é feita menção ao vírus vaccinia 5 das Patentes Americanas Nos. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 e 5.762.938 inter alia; em relação ao fowlpox, é feita menção das Patentes Americanas Nos. 5.174.993, 5.505.941 e 5.766.599 inter alia; em relação ao canarypox, é feita menção da Patente Americana 10 No. 5.756.103 inter alia. Se o vetor de expressão é um vírus vaccinia, o sítio ou sítios de inserção para o polinucleotídeo ou polinucleotídeos a serem expressos estão vantajosamente no sítio de inserção ou gene da timidina quinase (TK), no sítio de inserção ou gene da hemaglutinina 15 (HA) , na região codificadora do corpo de inclusão do tipo A (ATI). também ver os documentos citados aqui, especialmente aqueles pertencendo ao vírus vaccinia. No caso do canarypox, vantajosamente o sítio ou sítios de inserção são ORF(s) C3, C5 e/ou C6; ver também os 20 documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencendo ao vírus canarypox. No caso do fowlpox, vantajosamente o sítio ou sítios de inserção são as 0RFsF7 e/ou F8; ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencendo ao vírus fowlpox. 0 sítio ou sítios de inserção para a área do vírus MVA estão vantajosamente como em várias publicações, incluindo Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. et al, J. Virol, 2000, 74 (9), 4236- 4243; Sutter G. et al., 1994, 5 Vaccine, 12 (11), 1032-1040; e, sob esse aspecto, também é verificado que o genoma MVA completo está descrito em Antoiine G., Virology, 1998, 244, 365-396, o qual permite que a pessoa habilitada use outros sítios de inserção ou outros promotores.

Vantajosamente, o polinucleotídeo a ser expresso é

inserido sob o controle de um promotor poxvirus específico, por exemplo, o promotor vaccinia de 7,5 KDa (Cochran et al, J. Virology, 1985, 54, 30-35),o promotor vaccinia I3L (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), o 15 promotor vaccinia HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), o promotor cowlpox ATI Funahashi et al., J. Gen. Virol, 1988, 69, 35-47), o promotor vaccinia H6 (Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al, J. Virol, 1989, 63, 3829- 20 3836), inter alia.

Em uma outra modalidade, o vetor viral recombinante é o vírus canarypox ALVAC recombinante vCP2350, conforme descrito no exemplo 3.

As vacinas contendo vetores virais recombinantes de acordo com a invenção podem ser Iiofilizadas, vantajosamente com um estabilizador. A liofilização pode ser feita de acordo com os procedimentos de liofilização padrões bem conhecidos. Os estabilizantes farmaceuticamente 5 ou veterinariamente aceitáveis podem ser carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextrana, trealose), glutamato de sódio (Tsvetkov T et al, Cryobiology 1983, 20(3): 318-23; Israeli E et al, Cryobiology 1993, 30(5): 519-23), proteínas tais como 10 peptona, albumina, lactalbumina ou caseína, proteínas contendo agentes tais como leite desnatado (Mills C K et al, Cryobiology 1988, 25(2): 148-52; Wolff E et al, Cryobiology 1990, 27(5): 569-75), e tampões (por exemplo, tampão fosfato, tampão fosfato de metal alcalino). Um 15 adjuvante pode ser usado para tornar solúvel as preparações Iiofilizadas.

Qualquer composição de vacina de acordo com a invenção pode conter vantajosamente um ou mais adjuvantes.

Para os plasmideos:

As vacinas à base de plasmideos podem ser formuladas

com lipídeos catiônicos, vantajosamente com DMRIE (N-(2- hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1- propanamônio; WO-A-96/34109) , e vantajosamente em associação com um lipídeo neutro, por exemplo, DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina; Behr J. P., Bioconjugate Chemistry, 1994: 5: 382-389), para formar DMRIE-DOPE. Em uma modalidade, a mistura é feita extemporaneamente, e antes de sua administração é vantajoso aguardar cerca de 10 5 min até cerca de 60 min, por exemplo, cerca de 30 min para a complexação apropriada da mistura. Quando DOPE é usada, a proporção molar de DMRIE/DOPE pode ser de 95/5 até 5/95 e é vantajosamente de 1/1. A proporção em peso de plasmídeo/DMRIE ou de DMRIE-adjuvante DOPE é, por exemplo, 10 de 50/1 até 1/10, de 10/1 até 1/5, ou de 1/1 até 1/2.

Opcionalmente, uma citocina pode ser adicionada à composição, especialmente GM-CSF ou citocinas incluindo Thl (por exemplo, IL12). Essas citocinas podem ser adicionadas à composição como um plasmídeo codificando a proteína 15 citocina. Em uma modalidade, as citocinas são de origem canina, por exemplo, GM-CSF canina, cuja seqüência gênica foi depositada no banco de dados GenBank (número de acesso S49738). Essa seqüência pode ser usada para criar o referido plasmídeo de modo similar ao qual foi criado em 20 WO-A-00/77210 (aqui incorporado por referência).

Para os vetores virais recombinantes:

A vacina baseada em vetor viral recombinante pode ser combinada com fMLP (N-formilmetionilleucilfenilalanina; US- A-6.017.537, aqui incorporado por referência) e/ou adjuvante Carbomer (Pharmeuropa Vol. 8, No. 2, junho de 1996) . As pessoas versadas na técnica também podem se referir à Patente Americana No. 2.909.462 (aqui incorporado por referência) a qual descreve tais polímeros acrílicos 5 reticulados com um composto poliidroxilado com pelo menos 3 grupos hidroxila, vantajosamente não mais do que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados com pelo menos 2 átomos de carbono. Por exemplo, os radicais são 10 aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinis, alis e outros grupos etila insaturados. Os radicais insaturados podem por si só conter outros substituintes, tais como metil. Os produtos vendidos com o nome Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EUA) são apropriados. Os produtos são 15 reticulados com uma alilsacarose ou com alilpentaeritritol. Dentre eles, podem ser vantajosamente mencionados Carbopol® 974P, 934P e 971P.

Dentre os copolímeros do anidrido maleico e do derivado alquenila, os copolímeros EMA® (Monsanto), os 20 quais são copolímeros do anidrido maleico e etileno, lineares ou reticulados, por exemplo, reticulados com éter divinílico, são vantajosos. Pode ser feita referência a J. Fields et al, Nature, 186: 778-780, de 4 de junho de 1960, aqui incorporado por referência. Os polímeros do ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros EMA® são formados, por exemplo, de unidades básicas da fórmula a seguir:

Rl R2

I

C (CHi)x C —(CH2) y----

COOH COOH

na qual:

Ri e Ra, os quais são idênticos ou diferentes, representam H ou CH3

- x = 0 ou 1, preferivelmente x = 1

- y = 1 ou 2, com x + y = 2

Para os copolímeros EMA®, x = o.eey = 2. Para os carbômeros, x = y = 1.

A dissolução desses polímeros em água leva a uma solução ácida, a qual é neutralizada, vantajosamente até pH fisiológico, para fornecer a solução adjuvante na qual a própria vacina é incorporada. Os grupos caboxil do polímero estão então parcialmente na forma de C00~.

Em uma modalidade, uma solução adjuvante, especialmente de carbômero, é preparada em água destilada, vantajosamente na presença de cloreto de sódio, a solução obtida estando em pH ácido. Essa solução estoque é diluída pela adição a isto de uma quantidade desejada (para obter a concentração final desejada), ou uma parte substancial sua, de água carregada com NaCl, vantajosamente salina fisiológica (NaCl 9 g/L) tudo de uma vez em várias porções com neutralização concomitante ou subsequente (pH 7,3 a 7,4), vantajosamente com NaOH. Esta solução em pH fisiológico é usada para misturar com a vacina, a qual pode ser especialmente armazenada na forma liofilizada, líquida ou congelada.

A concentração de polímero na composição de vacina final pode ser de 0,01% até 2% p/v, de 0,06 a 1% p/v ou de 0,1 a 0,6% p/v.

Outro aspecto da presente invenção é o método de vacinação inicial-reforço de indivíduos suscetíveis à Leishmania usando as composições de vacina de acordo com a invenção.

Por definição, indivíduos suscetíveis à Leishmania englobam humanos, felídeos (isto é, gatos domesticados, filhotes de gatos, gatos grandes e gatos selvagens, por exemplo) e canídeos (isto é, cachorros, cadelas, filhotes de cachorro, raposas, chacais e lobos, por exemplo). Em uma modalidade, os caninos são indivíduos adequados para a administração da vacina de acordo com a presente invenção.

Esses métodos de administração inicial-reforço incluem, pelo menos, duas administrações diferentes, as quais consistem em pelo menos uma administração inicial de uma quantidade eficaz de uma composição de vacina de acordo com a invenção e, depois de certo período de tempo, pelo menos uma administração de reforço de uma quantidade eficaz 5 de uma composição de vacina de acordo com a invenção, em que: 1) as composições de vacina para a administração inicial são vacinas à base de plasmideos e as composições de vacina para a administração inicial são vacinas baseadas em vetores virais recombinantes; e/ou 2) as composições de 10 vacina para a administração inicial são vacinas à base de plasmideos acopladas ao tratamento de eletrotransferência.e as composições de vacina para a administração de reforço são vacinas à base de vetor viral recombinante; e/ou 3) as composições de vacina são as mesmas da administração 15 inicial e para a administração de reforço e a via de administração e/ou os meios de administração não são os mesmos para a administração inicial e para a administração de reforço. As vias de administração podem ser, por exemplo, intramuscular (IM) ou intradérmica (ID) ou 20 subcutânea. Os meios de administração podem ser, por exemplo, uma seringa com uma agulha, ou um aparelho sem agulha, ou uma seringa com uma agulha acoplada ao tratamento de eletrotransferência (ET), ou aparelho sem agulha acoplado ao tratamento ET. As administrações iniciais-reforços são vantajosamente efetuadas com um intervalo de 2 a 6 semanas, por exemplo, com um intervalo de cerca de 3 semanas. De acordo com uma modalidade, um reforço semi-anual ou um reforço anual, 5 vantajosamente usando a vacina à base de vetor viral, também é considerado. Os animais são vantajosamente pelo menos de 6 a 8 semanas de idade no momento da primeira administração.

Outra modalidade do regime de administração inicial- reforço consiste da administração inicial de uma vacina à base de plasmídeo e de uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor poxvirus recombinante, por exemplo, com um vetor de vírus canarypox. .Tanto a primeira administração quanto a administração de reforço são vantajosamente feitas através de via transdérmica (ID) usando um aparelho sem agulha. Em uma modalidade, essa vacina à base de plasmídeo é uma vacina compreendendo pVRl020 KMPll conforme descrito no Exemplo 1, e esse vetor de vírus canarypox é vCP2350 conforme descrito no exemplo 3.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, a administração inicial é feita com uma vacina à base de plasmídeo através da via ID usando um aparelho sem agulha e a administração de reforço é feita com uma vacina à base de plasmídeo através da via intramuscular (IM) usando uma seringa e uma agulha acoplada ao tratamento ET. Em outra modalidade, essa vacina à Bse de plasmídeo é uma vacina compreendendo pVR1020 KMPll conforme descrito no exemplo 1.

Outra modalidade de um regime de administração inicial-reforço consiste em uma administração inicial de uma vacina à base de plasmídeo acoplada ao tratamento ET e uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor poxvirus recombinante, vantajosamente com um vetor de vírus canarypox. A administração inicial é vantajosamente feita intramuscularmente e a administração de reforço é vantajosamente feita através da via transdérmica usando um aparelho sem agulha. Em outra modalidade, essa vacina à base de plasmídeo é uma vacina compreendendo pVR1020 KMPll conforme descrito no exemplo 1, e esse vetor de vírus canarypox é VCP2350 conforme descrito no exemplo 3.

Em outra modalidade, a administração inicial compreende uma vacina à base de plasmídeo através da via intramuscular (IM) usando uma seringa e uma agulha acoplada ao tratamento ET e a administração de reforço compreende uma vacina à base de plasmídeo através de via ID usando um aparelho sem agulha. Em uma modalidade, essa vacina à base de plasmídeo é uma vacina compreendendo pVR1020 KMPll conforme descrito no exemplo 1. Em uma modalidade do regime inicial-reforço, a administração inicial utiliza um aparelho sem agulha através da via ID com uma vacina à base de plasmídeo. üma primeira administração inicial compreende uma vacina à base 5 de plasmídeo através de via IM usando uma seringa e uma agulha acoplada ao tratamento ET, e uma segunda administração inicial utiliza um aparelho sem agulha através da via ID com uma vacina à base de vetor viral recombinante, vantajosamente com um vetor canarypox. Em 10 outra modalidade, essa vacina à base de plasmídeo é uma vacina compreendendo pVR1020 KMPll conforme descrito no exemplo 1, e esse vetor de vírus canarypox é vCP2350, conforme descrito no exemplo 3.

Outro aspecto da invenção é o uso de uma vacina à base 15 de plasmídeo de acordo com a presente invenção para a administração aos animais suscetíveis à Leishmaniar em que essa administração é acoplada ao tratamento ET. A administração de uma vacina à base de plasmídeo é vantajosamente intramuscular. Os meios de administração 20 são, por exemplo, uma seringa e uma agulha. Uma ou várias injeções podem ser administradas sucessivamente. No caso de várias injeções, elas podem ser dadas com um intervalo de 2 a 6 semanas, por exemplo, de cerca de 3 semanas de intervalo. De acordo com uma modalidade, um reforço semi- anual ou um reforço anual também é considerado.

Para vacinas à base de plasmideos, uma via vantajosa de administração é a ID. Essa administração pode ser feita por uma seringa com uma agulha ou com um aparelho sem agulha, tal como Dermojet ou Biojector (Biojet, Oregon, EUA) ou VEtj et™ (Merial) ou Vitajet™ (Bioject Inc.), ver US-A-2006/0034867. A dosagem pode ser de 50 μg a 500 μg por plasmídeo. Quando DMRIE-DOPE é adicionado, 100 μg por plasmídeo pode ser utilizado. Quando GM-CSF canino ou outrascitocinas são usadas, o plasmídeo codificando essa proteína está presente em uma dosagem de cerca de 200 μg até cerca de 500 μg e pode vantajosamente ser 200 μg. 0 volume de doses pode estar entre 0,01 mL e 0,5 mL, por exemplo, 0,25 mL. A administração pode ser fornecida com vários pontos de injeção.

Outra via prevista de administração para vacinas à base de plasmídeo é a via IM acoplada com o tratamento de eletrotransferência (ET). 0 tratamento ET pode ser efetuado usando um aparelho para eletrotransferência e as 20 especificações do fabricante (isto é, o gerador Sphergen G250 (Sphergen SARL, Evry GEnopole, França); um sistema de eletroporação de DNA MedPulser® (Innovio Biomedical Corporation, São Diego, Califórnia, EUA)). Em uma modalidade, o aparelho para eletrotransferência tem um campo unipolar. A intensidade do campo pode ser de cerca de 50 até cerca de 250 V/cm, de cerca de 50 até cerca de 200 V/cm, ou de cerca de 50 até cerca de 175 V/cm. A duração do 5 pulso é de cerca de 1 até cerca de 50 mseg, ou de cerca de 15 até cerca de 25 mseg. A frequência é de cerca de 1 até cerca de 50 Hz, ou de cerca de 5 até cerc de 15 Hz. O intervalo de interpulso é de cerca de 1 até 1000 mseg, ou de cerca de 1 até cerca de 200 mseg. A quantidade de pulsos 10 é de 1 a 20, ou de 5 a 10. A intensidade intra-tecidual é vantajosamente até cerca de 2 A. A distância entre os eletrodos é de cerca de 0,2 até cerca de 1 cm, ou de cerca: de 0,2 até cerca de 0,5 cm.

Para vacinas à base de vetor viral recombinante, a via 15 de administração é vantajosamente a ID. Essa administração pode ser feita com uma seringa com uma agulha ou com um aparelho sem agulha como Dermojet ou Biojector (Biojet, ORegon, EUA) ou Vetj et™ (Merial) ou Vitaj et™ (Bioject Inc.) . A dosagem é de cerca de IO3 pfu até cerca de IO9 pfu 20 por vetor de poxvirus recombinante. Quando o vetor é um vírus canarypox, a dosagem é, por exemplo, de cerca de IO5 pfu até cerca de IO9 pfu, ou de cerca de IO6 pfu até cerca de IO8 pfu. O volume de doses é de cerca de 0,01 mL até 0,2 mL, e é vantajosamente de 0,1 mL. A administração pode compreender múltiplos pontos de injeção.

Para a via IM o volume da vacina fornecido é de 0,2 a 2 mL, ou de cerca de 0,5 a I mL. As mesmas dosagens são utilizadas para qualquer um dos vetores da presente 5 invenção.

Outro aspecto da presente invenção é um kit para a vacinação inicial-reforço de acordo com a presente invenção. 0 kit compreende pelo menos dois frascos: um primeiro frasco contendo uma vacina para a administração 10 inicial de acordo com a presente invenção, e um segundo frasco contendo uma vacina para a administração inicial de acordo com a presente invenção. 0 kit pode conter vantajosamente um primeiro ou segundo frascos adicionais para vacinações iniciais adicionais ou vacinações de 15 reforço adicionais.

Em uma modalidade, o kit compreende dois frascos, um contendo uma vacina à base de plasmídeo para a vacinação inicial, de acordo com a presente invenção, e outro frasco contendo uma vacina à base de vetor viral recombinante para a vacinação de reforço de acordo com a presente invenção.

Em outra modalidade, o kit compreende dois frascos, um contendo uma vacina à base de plasmídeo pVR1020 KMPll para a vacinação inicial de acordo com a presente invenção, o outro frasco contendo uma vacina à base de vetor VCP2350 para a administração de reforço de acordo com a presente invenção.

A invenção será ainda descrita a título dos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Sem elaborações adicionais, acredita-se que uma pessoa versada na técnica possa, usando as descrições precedentes, praticar a presente invenção em toda a sua extensão. Os seguintes exemplos detalhados são para serem construídos 10 como meramente ilustrativos, e não é, de qualquer forma, uma limitação à exposição precedente. As pessoas versadas na técnica irão prontamente reconhecer variações apropriadas a partir dos procedimentos tanto dos reagentes como doas condições reacionais e técnicas.

A construção de inserções de DNA, plasmideos, vetores

virais recombinantes foi efetuada usando as técnicas de biologia molecular padrões descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 20 1989) . Todos os fragmentos de restrição usados para a presente invenção foram isolados usando o kit "Geneclean" (BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.).

EXEMPLO 1: Construção de um plasmídeo expressando o antígeno KMPll de L. infantum A seqüência de ácido nucléico codificando o KMPll de L. infantum foi sintetizada quimicamente, com a seqüência descrita na SEQ ID NO: 1 e com as caudas de poliadenina. 0 fragmento KMPll foi amplificado por PCR e clonado no sitio 5 de clonagem TOPO de pVR2()01-TOPA (ou pVR2001-TOPO) (Oliveira F. et al. Vaccine (2006) 24: 374-90), com o peptídeo de sinal ativador de plasminogênio tecidual (TPA), para obter o plasmídeo KMPll pVR1020. O VR2001-T0p0 é derivado do plasmídeo VR 1020. O VR 1020 é uma estrutura de 10 plasmídeo disponível de Vical, Inc., (São Díego, CA) a qual foi anteriormente usada, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 6.451.769 e 7.078.507; conforme descrito em Oliveira et al., o plasmídeo VR2001-TOPO (ou pVR2001-TOPA) é VR1020 modificado pela adição de topoisomerases 15 flanqueando o sítio de clonagem e contendo o código para expressar um peptídeo sinal secretório que aumente a probabilidade de produzir uma proteína secretada (ver Figura 1 em Oliveira F. et al., Vaccine (2006) 24: 374-90).

A seqüência de ácido nucléico de uma cepa do plasmídeo 20 PVR1020 KMPll é descrita na SEQ ID NO: 5, e o mapa de plasmídeo é fornecido na Figura 10. De acordo com a presente invenção, VR1020 KMPll deste modo contém e expressa um DNA codificando um promotor para direcionar a expressão em uma célula de mamífero, um DNA codificando um peptídeo líder para facilitar a secreção/liberação de uma seqüência de proteína procariótica de uma célula de mamífero, por exemplo, um promotor CMV, um DNA codificando KMPll, e um DNA codificando um terminador. VR1020 adicionalmente contém topoisomerases flanqueando o DNA que codifica KMPll e contendo o código para um peptídeo sinal secretório que aumenta a probabilidade de produção de uma proteína secretada.

EXEMPLO 2: Vacinação inicial-reforço de cachorros contra leishmaniose com vacinas à base de plasmídeo

Dois grupos de 5 cachorros convencionais foram vacinados ou com um plasmídeo expressando o antígeno KMPll de L. infantum ou com o plasmídeo de controle sem inserção. A administração inicial foi efetuada intradermicamente em DO (dia 0) usando o injetor sem agulha Merial Vetjet™.

O Merial Vetjet™ usa ar comprimido como fonte de energia. A injeção sem agulha leva a lesões reduzidas e trauma no sítio de injeção em comparação com o uso de agulha atual. 0 dispositivo é ativado pela colocação do bico contra o indivíduo e não irá disparar até o mecanismo de deslocar aproximadamente 0,30" contra uma carga de compressão.

Merial Vetjet™ tem três etapas básicas no ciclo de operação: (1) puxar o gatilho, (2) empurrar o dispositivo contra o sítio de injeção alvo e (3) retirar o dispositivo do sítio de injeção e soltar o gatilho. Quando o gatilho é puxado, ele ativa a válvula iniciadora. 0 gatilho coloca o mecanismo de disparo na posição de aceleração. Quando o dispositivo é empurrado contra o sítio de injeção alvo, o mecanismo de disparo desliza para trás e libera a válvula do cabeçote móvel e o fármaco é expelido pelo bico. Quando o dispositivo é puxado do sítio de injeção e o gatilho é liberado, o mecanismo de disparo se retrai. 0 ar de descarga é expelido, ativando o sistema de corante (caso desejado). 0 sistema de enchimento de fármaco carrega uma dose fresca.

A área da coxa interna dos dois grupos de 5 cachorros convencionais foi tosquiada e desinfetada com iodopovidona (Vetedine®, Vetoquinol, Lure, França) antes da administração. Os cachorros vacinados (n = 5) receberam na, porção mediai direita da coxa, uma dose de 400 μg de plasmídeo pVRl020 KMPll purificado ) (ver Exemplo 1) em um volume de 0,2 mL do tampão TE pH 8 (isto é, 2 mg/mL) . Os cachorros de controle (n= 5) receberam de modo semelhante o plasmídeo de expressão vazio pVRl020. Os cachorros não foram anestesiados para essa administração.

Uma administração de reforço foi efetuada no D21 usando os mesmos plasmideos que para o iniciador (isto é, pVR1020 KMPll em cachorros vacinados e pVRl020 em cachorros de controle) e a mesma dose (400 μς a 2 mg/mL) , porém usando uma distribuição intramuscular acoplada ao tratamento com eletrotransferência (ET). Os cachorros foram 5 anestesiados pela via intramuscular usando 5 mg/Kg de cetamina e 10 mg/Kg de medetomidina.

A administração IM e o tratamento ET foram aplicados na área da coxa interna esquerda (isto é, músculo semimembranoso esquerdo) . A área foi tosquiada e 10 desinfetada com iodopovidona (Vetedine®) antes do tratamento. A injeção foi efetuada usando o dispositivo de agulha Sphergen 3 INJ-I (Sphergen SARL, Evry Genopole, França) com agulhas separadas por 0,5 cm cada. O tratamento ET irá ocorrer imediatamente após a injeção, usando um 15 gerador Sphergen G250 (Sphergen SARL, Evry Genopole, França). As seguintes especificações ET foram usadas: Tl: 20 mseg; T2: 80 mseg, frequência: 10 Hz, 10 pulsos. A voltagem aplicada foi de 87,5 V, criando um campo elétrico de 175 V/cm no músculo.

Em D0, D14, D41, D55 e D76, os soros foram analisados

quanto a frequência das células CD8+ (ver Figura 1), frequência de células produtoras de interferon γ (IFN-γ) (ver Figura 2), proliferação de células CD8 T específicas (ver Figura 3) e proliferação de células CD4 T especificas (ver Figura 4).

Produção de IFN-γ por sangue total cultivado

0 sangue total foi diluído 1:8 em RPMI suplementado com solução de antibiótico/antimicotina 3% (GIBCO, Grand Island, NY, EUA) em uma placa de cultivo de fundo plano com 48 poços com um volume final de 1 mL por poço. As células foram estimuladas pela adição de 25 μg/mL de extrato de L. infantum solúvel (SLE) de Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA, Sigma-Aldrich Co., EUA). Depois de 48 h de incubação a 37 °C, 700 μL de sobrenadante foram removidos a partir de cada poço e armazenados a -20 0C até necessário para o ensaio de citocina. 0 IFN-γ foi medido usando um ensaio de ELISA de captura para cachorros (R&D Systems, Mineápolis, MN, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Os anticorpos de detecção marcados com biotina foram usados, revelados com estreptavidina-HRP (Amersham Biosciences) e substrato TMB (KPL, GAithesburgh, MD, EUA) . A reação foi interrompida pela adição de solução de parada (KPL) em cada poço. Os valores de absorvância são lidos a 450 nm em um leitor de micro-ELISA AUTOMÁTICO (Thermo Multiskan EX, Waltham, MA, EUA).

Proliferação celular periférica do sangue e coloração de citosina

A fenotipagem das populações de células sanguíneas periféricas foi efetuada usando amostras de sangue total coletadas nos dias indicados. Resumidamente, 1 mL de sangue 5 foi fixado e os eritrócitos foram lisados co solução de fixação (10,0 g/L de paraformaldeído; 10,2 g/L de ácido cacodílico; 6,65 g/L de cloreto de sódio; pH 7,2). Depois de 10 min de incubação, as células foram lavadas duas vezes com tampão PBS-BSA 1%. A coloração da superfície foi 10 efetuado em uma microplaca de fundo redondo co 96 poços com CD4-Alexa 647 anti-canino e ÇD8-PE anti-canino. Os dados das células fluorescentemente marcadas foram obtidos em um citômetro de fluxo FACScalibur (Becton Dickinson, São José, CA, EUA). Pelo menos trinta mil eventos foram contados. 0 A 15 coloração de citocina intracelular foi efetuada depois da permeabilização com saponina para o IFN-yusando IFN-γ-ΡΕ anti-bovino (Serotec) .

Linfoproliferação dos leucócitos periféricos do sangue (PBLs)

0 ensaio de Iinfoproliferação foi efetuado usando PBLs

obtidos depois da separação com ficoll. PBMCs foram diluídos em 1 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) e marcados com o corante fluorescente diacetato succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE, Molecular probes, Carlsbad, Califórnia, EUA). Depois da marcação, as células forma ressuspensas em RPMI 200 μΐ suplementado com FBS 10% e solução de antibiótico/antimicótico 3% (GIBCO, Grand Island, NY, EUA). Todos os testes foram efetuados em 5 triplicata em placas de cultivo de fundo plano de 96 poços usando SLE em uma concentração de 25 μς/πΛ e Concanavalina A (ConA) (Sigma-Aldrich Co., EUA) a 160 μg/mL. A incubação foi efetuada em uma atmosfera de CO2 5% umidificada a 37 0C por 5 dias. As células foram a seguir coletadas e marcadas 10 para a expressão de CD4 ou CD8 conforme descrito acima. A porcentagem de proliferação foi avaliada pela perda de intensidade fluorescente nessas populações.

Análise sorolóqica

Sangue foi coletado em diferentes pontos de tempo, e o 15 soro foi separado, armazenado e congelado a -20 °C. Niveis de IgG, IgGi e IgG2 caninos antígeno-específ icos foram medidos por Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) indireto. Resumidamente, os antígenos foram revestidos em microplacas de 96 poços (MaxiSorp™, Nalge Nunc, Rochester, 20 NY, EUA) em uma concentração de 8 μg/mL para SLE a 5 μg/mL para os antígenos recombinantes. Soros foram adicionados nas concentrações de 1:100, 1:500 e diluições em série de três vezes depois disso, seguido por lavagens e adição de IgG, IgG1 e IgG2 anti-cão de peroxidase conjugada (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, EUA) em diluições de 1:8000, 1:1500 e 1:3000, respectivamente. Os poços foram então lavados e o substrato e cromógeno (TMB, KPL) foram 5 adicionados e a absorvância foi lida em um leitor de microplaca de ELISA automático a 450 nm. A densidade ótica média do soro de caninos de controle foi usada como linha de base. A última diluição de soro maior do que três vezes acima da linha de base foi considerada como o ponto final 10 da titulação. A média geométrica desses pontos finais foi calculada para os cinco cachorros de cada grupo.

Análise de Western Blot

A análise de Western Blot foi efetuada usando SLE (0,6 mg/mL), os quais foram levados à ebulição em tampão de 15 amostra SDS, separado em um gradiente de 4 a 12% de gel SDS-PAGE tris-glicina (Invitrogen, Cal) e transferido para uma membrana PVDF (Pall Life Sciences, East Hills, NY) . A mancha foi bloqueada de um dia para o outro com solução de bloqueio (Invitrogen, CArlsbad, Califórnia, EUA) e foi 20 sondada com cada soro individual diluído em 1:1000. Anti- cachorro conjugado com peroxidase de rábano silvestre foi usado como um anticorpo secundário em uma diluição de 1:2000. O desenvolvimento foi efetuado com reagente ECL (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra) de acordo com as instruções do fabricante.

Figura 1 mostra uma diferença significativa no total de células CD8 T periféricas presentes no sangue depois da administração de reforço entre os soros dos cachorros vacinados com KMPll e aqueles dos cachorros de controle (p = 0,01) .

A Figura 2 mostra uma diferença significativa nas células produtoras de IFN-γ periféricas totais presentes no sangue depois da administração inicial e depois da administração inicial entre os soros dos cachorros vacinados com KMPll e aqueles dos cachorros de controle (p = 0,04).

Figura 3 mostra uma diferença significativa no total das células CD8 T anti-KMPll periféricas especificas no sangue antes da administração de reforço (3 semanas depois do início) e depois da administração de reforço entre os soros dos cachorros vacinados com KMPll e aqueles dos cachorros de controle (p = 0,007).

Figura 4 mostra uma diferença significativa no total das células CD4 T anti-KMPll periféricas específicas presentes no sangue antes da administração de reforço (3 semanas depois do início) e depois da administração de reforço entre os soros dos cachorros vacinados com KMPll e aqueles dos cachorros de controle (p = 0,03). Em DO, Dl4, D41, D55 e D76, os soros foram analisados para as respostas do anticorpo por Western Blot usando lisado celular de L. infantum em β μς/10 μΐ por raia (ver Figura 5) . Os soros foram testados em uma diluição de 1:1000. O anticorpo secundário foi o reagente IgG anti- canino HRP usado em uma diluição de 1:2000. Os resultados do Western Blot mostrados na Figura 5 mostram uma resposta IgG pós-reforço com KMPll especifica (ver as bandas circuladas).

EXEMPLO 3: Construção de um vetor de virus canarypox

expressando o antígeno KMPll de L. Infantum

A inserção de nucleotideo usada na construção de VCP2350 foi derivada do gene KMPll de L. infantum fornecido por GeneArt GmbH (Regensburg, Alemanha). A seqüência de ácido nucléico é sintética com a otimização do códon para expressão em células de mamífero (SEQ ID NO: 3) . Essa seqüência de ácido nucléico codifica o antígeno KMPll de L. infantum (SEQ ID NO: 4). Dois sítios de restrição enzimática flanqueados com a inserção de nucleotideo, um sítio EcoRV 5' da região codificadora e um sítio XbaI 3' da região codificadora.

Para construir o plasmídeo doador ALVAC, pALVAC C5 H6p-Leishinania-Il (pJSY1992.1) , a inserção do nucleotideo foi digerida usando a digestão EcoRV/Xbal para isolar o fragmento compreendendo o gene KMPll sintético. (Para discussão e exemplos do plasmideo, pALVAC, e o local C5, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.756.103; 5.833.975; e 6.780.407). A seqüência do promotor H6 do virus vaccinia foi anteriormente descrita (ver, por exemplo, Taylor et al., Vaccine. 6: 497-503, 1988a; Taylor et al. Vaccine. 6: 504- 508, 1988b; Guo et al. J Virol 63: 4189-4198, 1989).

Esse fragmento foi então ligado ao doador Palvac C5 H6p digerido EcoRV/Xbal (Pcxll48.2). 0 plasmideo resultante pJSY1992.1 (Figura 6) foi sequenciado (SEQ ID NO: 6) e confirmado como contendo a seqüência de ácido nucléico correta (SEQ ID NO: 3) do gene KMPll.

Para gerar vCP2350, o plasmideo pJSY1992.1, o qual continha o gene KMPll sintético, foi linearizado com a enzima de restrição NotI. Os fragmentos linearizados foram transfectados individualmente nas células CEF primárias infectadas com ALVAC pelo uso do método de precipitação com fosfato de cálcio descrito anteriormente (Panicali et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 1982, 79: 4927-4931; Piccini et al., Methods Enzymol, 1987, 153: 545-563). Depois de 24 h, as células transfectadas foram coletadas, submetidas ao ultra-som e usadas para a varredura com virus recombinante.

As placas recombinantes foram varridas baseando-se no método de hibridização plaque Iift usando uma sonda KMPll- específica sintética de Leishmanial a qual foi marcada com peroxidase de rábano silvestre de cavalo de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham # Cat RPN-3001). Depois de três ciclos seqüenciais de purificação de placa, os recombinantes, designados como vCP2350.1.1.5, foram gerados e confirmados por hibridização como sendo 100% positiva para a inserção de KMPll sintética de Leishmania e 100% negativa para o ORF C5. Uma única placa foi selecionada a partir do terceiro

ciclo de purificação de placa e expandida para obter os estoques Pl (60 mm), P2 (frascos de T75) , P3 (frascos de cultivo) para amplificar VCP2350.1.1.5. O fluido das culturas de células infectadas dos frascos de cultivo foi coletado e concentrado para produzir estoque de virus (cerca de 3,5 mL a 1,3 χ IO10 PFU/mL) .

Um gel de enzima de restrição teórico para o DNA genômico foi criado no vetor NTI e está mostrado na Figura 7. O DNA genômico foi extraído a partir de VCP2350.1.1.5 e digerido com BgIII, HindIII e PstI, e separado por eletroforese em gel de agarose 0,8%. Os resultados mostraram a inserção correta da seqüência de gene estrangeira (ver Figura 8) .

O DNA genômico digerido com BgIII, HindIII e PstI foi transferido para a membrana de náilon e a análise de Southern blot foi efetuada pela sondagem com sonda KMPll sintética de Leishmania. As bandas foram observadas nos tamanhos esperados, indicando a inserção correta do KMPll sintético de Leishmania no local C5 (Figura 9).

Uma análise mais detalhada do DNA genômico estoque P3 foi efetuada por amplificação de PCR e a análise da seqüência dos braços flanqueadores do local C5 e da inserção de KMPll sintético de Leishmania. Os iniciadores 7931'.DC (SEQ ID NO: 7) e a 7932.DC (SEQ ID NO: 8) localizadas além dos braços de C5 foram usados para amplificar o fragmento CR5-inserção de KMPll sintética de Leishmania-C5L completo. Os resultados mostraram que a seqüência da inserção de KMPll sintético de Leishmania e os braços esquerdo e direito C5 ao redor da inserção de KMPll sintética de Leishmania em vCP2350.1.1. 5 estavam corretas.

Os vetores recombinantes, de acordo com a presente invenção, podem consequentemente compreender um vetor avipox recombinante, por exemplo, vetor do virus canarypox, 2 0 tal como o vetor ALVAC recombinante, com um promotor para direcionar a expressão, por exemplo, o promotor H6, operavelmente ligado ao DNA codificando KMPll em um sitio adequado no genoma do virus avipox tal como o local C3 ou C5 de canarypox (por exemplo, ALVAC). EXEMPLO 4: Vacinação dose-reforço dos cachorros contra leishmaniose com vacinas à base de plasmideo e vacinas à base do vetor viral de canarypox ALVAC

Na semana 17 depois da administração inicial, os animais do grupo vacinado do Exemplo 2 foram administrados com a vacina do vetor VCP2350 do virus canarypox ALVAC do Exemplo 3 co um volume de 0,2 mL de tampão pH 8 TE (isto é, 2 mg/mL).

Ao mesmo tempo, os animais do grupo de controle do Exemplo 2 foram administrados com uma vacina compreendendo um vetor do virus canarypox ALVAC controle expressando um antigeno CDV (vCP258, ver Exemplo 19 de ÜS-A-5.756.102) era um volume de 0,2 mL de tampão pH 8 TE (isto é, 2 mg/mL).

A dose da vacina, a vacina do vetor vP2350 para animais vacinados e a vacina do vetor vCP258 para os animais de controle, foi de IO8 PFU por animal. A administração foi efetuada para cada animal intradermicamente na coxa mediai direita usando o injetor sem agulhas Merial Vetjet™. A área da coxa interna teve a pele tosquiada e desinfetada com iodopovidona (Vetedine®, VEtoquinol, Lure, França) antes da administração.

Os soros dos animais foram coletados e analisados em relação à freqüência das células CD8+, à freqüência das células produtoras de IFN-γ, à proliferação das células CD8 T especificas e à proliferação das células CD4 T especificas conforme descrito no Exemplo 2.

Um desafio com os amastigotos de L. infantum foi agendado na semana 22 depois da administração inicial.

A invenção será agora adicionalmente descrita pelos seguintes parágrafos numerados:

1. Uso dos vetores de expressão in vivo em um regime de administração inicial-reforço, compreendendo uma administração inicial de uma vacina compreendendo, em um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, um vetor de expressão in vivo contendo uma seqüência de polinucleotideo para expressar, in vivo, o polipeptidio, antigeno, epitopo ou imunógeno de KMPll de Leishmania, seguido por uma administração de reforço de uma vacina compreendendo, em um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, um vetor de expressão in vivo contendo uma seqüência de polinucleotideo para expressar, in vivo, o antigeno, epitopo ou imunógeno de KMPll de Leishmania para proteger animais caninos das leishmanioses e/ou prevenir a progressão da doença em animais caninos infectados.

2. 0 uso, de acordo com o parágrafo 1, em que a proteção é mostrada pela prevenção da difusão e implantação do parasita em órgãos internos dos referidos animais caninos.

3. O uso, de acordo cora o parágrafo 1, para a produção de uma vacina para a indução de resposta imune humoral em animais caninos contra KMPll.

4. O uso, de acordo com o parágrafo 3, em que a indução em animais caninos é a indução da IgGl anti-KMPll.

5. O uso, de acordo com os parágrafos 1 a 4, para a produção de uma vacina para a indução da resposta imune mediada por célula em animais caninos contra KMPll.

β. O uso, de acordo com o parágrafo 5, em que a indução em animais caninos é a indução da resposta imune mediada por célula CD8 T contra KMPll.

7. O uso, de acordo com o parágrafo 5 ou 6, em que a indução em animais caninos é a indução da resposta imune mediada pela célula CD4 T contra KMPll.

8. O uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que o vetor de expressão in vivo para a administração inicial é um plasmideo, e o vetor de expressão in vivo para a administração de reforço é um vetor viral recombinante.

9. O uso, de acordo com o parágrafo 8, em que o vetor de expressão in vivo para a administração inicial é um plasmideo, e o vetor de expressão in vivo para a administração de reforço é um vetor do virus canarypox recombinante. 10. O uso, de acordo com o parágrafo 9, em que o vetor de expressão in vivo para a administração inicial é o plasmídeo pVR1020 KMP11, e o vetor de expressão in vivo para a administração de reforço é o vetor vCP2350 do virus canarypox recombinante.

11. O uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, em que a seqüência de polinucleotideo codificando KMPll de Leishmania é a seqüência de polinucleotideo com códon otimizado SEQ ID NO: 3, codificando a SEQ ID NO: 4 do antigeno KMPll de Leishmania infantum.

12. O uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 11, em que a administração inicial é acoplada ao tratamento de eletrotransferência.

13. O uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que os vetores de expressão in vivo para a administração inicial e para a administração de reforço são plasmideos e compreendem uma seqüência de polinucleotideo codificando um antigeno ou imunógeno KMPll de Leishmania ou um epitopo seu, e a administração inicial é feita intradermicamente com um aparelho sem agulha e a administração de reforço é feita intramuscularmente com uma seringa e uma agulha e acoplado ao tratamento de eletrotansferência.

14. O uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que os vetores de expressão ín vivo para a administração inicial e para a administração de reforço são plasmídeos e compreendem uma seqüência de polinucleotideo codificando um antígeno ou imunógeno KMPll de Leishmania ou um epitopo seu, e a administração inicial é feita intramuscularmente com uma seringa e uma agulha e acoplada a um tratamento de eletrotransferência e a administração de reforço é feita intradermicamente com um aparelho sem agulha.

15. O uso, de acordo com o parágrafo 13 ou 14, em que

os vetores de expressão in vivo são o plasmideo pVR1020 KMPll.

16. O uso, de acordo com o parágrafo 13 ou 14, em que a seqüência de polinucleotideo codificando KMPll de

Leishmania é a seqüência de polinucleotideo com códon otimizado SEQ ID NO: 3, codificando a SEQ ID NO: 4 do antigeno KMPll de Leishmania infantum.

17. Um kit para o regime de administração inicial- reforço de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 12,

compreendendo pelo menos dois frascos, um frasco contendo uma vacina para a vacinação inicial, o(s) outro(s) frasco (s) contendo uma vacina para a administração de reforço.

18. O kit, de acordo com o parágrafo 17, em que o kit compreende dois frascos, um contendo uma vacina à base de plasmídeo para a vacinação inicial, o outro frasco contendo uma vacina à base de vetor viral recombinante para a vacinação de reforço.

Claims (20)

1. Método de vacinação de um indivíduo suscetível à Leishmania caracterizado pelo fato de compreender um regime de administração de dose inicial reforço, em que o referido regime compreende uma primeira administração de uma vacina compreendendo em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, um vetor de expressão in vivo contendo uma seqüência de polinucleotídeo para expressar, in vivo, o imunógeno, epítopo, antígeno ou polipeptídio KMPll da Leishmania, seguido por uma administração de reforço de uma vacina compreendendo, em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, um vetor de expressão in vivo contendo uma seqüência de polinucleotídeos para expressar, in vivo, um antígeno, epítopo ou imunógeno KMPll de Leishmania, para proteger o indivíduo de leishmaniose e/ou para prevenir a progressão da doença no indivíduo infectado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a vacinação previne a difusão e o implante do parasita nos órgãos internos do indivíduo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é induzida uma resposta imune humoral contra KMPll e/ou é induzida uma resposta imune mediada por célula contra KMPll.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a produção de uma IgGl anti-KMPll é induzida.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a resposta induzida é uma resposta imune mediada por células T CD8+ contra KMPll e/ou uma resposta imune mediada por células T CD4+ contra KMPll.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão in vivo para a primeira administração é um plasmideo e o vetor de expressão in vivo para a administração de reforço é um vetor viral recombinante.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão in vivo para a primeira administração é um plasmideo e o vetor de expressão in vivo para a administração de reforço é um vetor de virus canarypox recombinante.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão in vivo para a primeira administração é o plasmideo pVRl020 KMPll ou um plasmideo com todas as características identificadoras de pVR1020 KMPll e o vetor de expressão in vivo para a administração de reforço é um vetor de vírus canarypox recombinante vCP2350 ou um vetor de vírus canarypox recombinante com todas as características identificadoras do vCP2350.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos que codifica a KMPll da Leishmania é a seqüência de polinucleotídeos códon-otimizada SEQ ID NO: 3 codificando um antígeno KMPll da Leishmania infantum da SEQ ID NO: 4.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira administração é acoplada com o tratamento de eletrotransferência.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os vetores de expressão in vivo para a primeira administração e para a administração de reforço são plasmídeos e compreendem uma seqüência de polinuceotídeos codificando um antígeno ou imunógeno KMPll da Leishmania ou um epítopo seu que elicie uma resposta imune em cachorro contra Leishmania, onde a primeira administração é feita intradermicamente com um aparelho sem agulhas e a administração de reforço é feita intramuscularmente com uma seringa e uma agulha e acoplada ao tratamento de eletrotransferência.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que vetores de expressão in vivo para a primeira administração e para a administração de reforço são plasmídeos e compreendem uma seqüência de polinucleotídeos codificando um antigeno ou imunógeno Leishmania KMPll ou um epitopo seu que elicie resposta imune em um cachorro contra Leishmania, e a primeira administração é feita intramuscularmente com uma seringa e uma agulha e acoplada ao tratamento de eletrotransferência e a administração de reforço é feita intradermicamente com um aparelho sem agulha.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão in vivo é o plasmideo pVR1020 KMPll ou um plasmídeo com todas as características identificadoras de pVR1020 KMPll.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeo codificando Leishmania KMPll é a seqüência de polinucleotídeo códon-otimizada SEQ ID NO: 3, codificando uma seqüência SEQ ID NO: 4 de um antigeno KMPll da Leishmania infantum.

15. Kit para um regime de administração de dose inicial- reforço conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 caracterizado pelo fato de compreender pelo menos dois frascos, o primeiro frasco contendo uma vacina para a primeira vacinação, e o(s) frasco(s) remanescente (s) contendo uma vacina para a vacinação de reforço.

16. Kit, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o kit compreende dois frascos, um contendo uma vacina à base de plasmideo para a primeira vacinação, e o outro frasco contendo uma vacina à base de vetor viral recombinante para a administração de reforço.

17. Vetor caracterizado pelo fato de que contém e expressa a KMPll da Leishmania in vivo ou um epitopo seu capaz de eliciar uma resposta imune em um cachorro contra Leishmania.

18. Composição de vacina ou imunológica caracterizada pelo fato de compreender o vetor da reivindicação 17.

19. Composição de vacina ou imunológica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o vetor é selecionado de um plasmideo e de um vetor viral recombinante.

20. Composição de vacina ou imunológica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o vetor viral recombinante é um virus canarypox recombinante. Resumo da Patente de Invenção para: "VACINA CONTRA LEISHMANIA CANINA” A presente invenção fornece vetores que contêm e expressam a KMPll da Leishmania ou um epítopo seu que elicia uma resposta imune em um cachorro contra Leishmania, composições compreendendo os referidos vetores, métodos de vacinação contra Leishmania e kits para uso com tais métodos e composições.