BRPI0719262B1

BRPI0719262B1 - Saccharomyces cell and process for ethanol production

Info

Publication number: BRPI0719262B1
Application number: BRPI0719262-2A
Authority: BR
Inventors: Jeroen Adriaan Van Maris Antonius; Thomas Pronk Jacobus; Wouter Wisselink Hendrik; Pieter Van Dijken Johannes; Adriaan Winkler Aaron; Hendrik De Winde Johannes
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2017-09-12
Also published as: CN103289908B; BRPI0719262A2; DK2069476T3; CN101522886B; PL2069476T3; ES2601052T3; CN103289908A; CN101522886A

Description

"CÉLULA DE SACCHAROMYCES E PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL" Campo da Invenção [001] A invenção se refere a uma célula eucariótica apresentando a capacidade de usar L-arabinose e/ou converter L-arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado e a um processo para produção de um produto de fermentação pelo que esta célula é usada, Histórico da Invenção [002] Combustível etanol é conhecido como uma alternativa valiosa aos combustíveis fósseis. A produção de etanol economicamente viável da fração de hemicelulose dá biomassa da planta requer a conversão fermentativa simultânea de ambas as pentoses e hexoses em taxas comparáveis e com altos rendimentos. Leveduras, especificamente, Saccharomyces spp., são as candidatas mais apropriadas para este processo, uma vez que elas podem desenvolver e fermentar rapidamente em hexoses, ambas aeróbica e anaerobicamente. Adicionalmente, elas são muito mais resistentes ao ambiente tóxico dos hidrolisados de lignocelulose que as bactérias (geneticamente modificadas).

[003] O EP 1 499 708 descreve um processo para fabricação de cepas de S. c&rèvlsiâè capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose. Estas cepas foram modificadas por introdução do gene de ara A (L-arabinose isomerase) de Bacillus subtilis, os genes araB (L-ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de Escherichia coli. Adicionalmente, estas cepas portavam tanto mutações adicionais em seu genoma quanto superexpressando um gene TALl (transaldolase). Contudo, estas cepas possuem várias desvantagens. Elas fermentam arabinose em condições limitadas de oxigênio. Além disso, elas possuem uma taxa de produção de tanol baixa de 0,05 g.g_1.h_1 (Becker and Boles, 2003). Adicionalmente, estas cepas não são capazes de usar L-arabinose sob condições anaeróbicas. Finalmente, estas cepas de S. cerevisiae possuem uma base do tipo selvagem, portanto elas não podem ser usadas para co-fermentar vários açúcares C5.

[004] O WO 03/062430 e o WO 06/009434 revelam cepas de levedura capazes de converter xilose em etanol. Estas cepas de levedura são capazes de isomerizar diretamente xilose em xilulose.

[005] Ainda, existe a necessidade de cepas alternativas para produção de etanol que funcionem melhor e sejam mais robustas e resistentes para condições de produção relativamente severas.

Descrição dos Desenhos [006] Figura 1. Mapas de plasmídeos de pRW231 e pRW243.

[007] Figura 2. Padrão de crescimento de cultivos em frasco de agitação da cepa RWB219 (O) e IMS0001 (·) em meio sintético contendo 0,5% de galactose (A) e 0,1% de galactose + 2% L-arabinose (B) . As culturas cresceram por 72 horas em meio sintético com galactose (A) e então foram transferidas para o meio sintético com galactose e arabinose (B). O crescimento foi determinado por medição de ODeeo · [008] Figura 3. Taxa de crescimento durante transferências em série de S. cerevisiae IMS0001 em culturas em frasco de agitação contendo meio sintético com 2% (peso/volume) de L-arabinose. Cada ponto de dado representa a taxa de crescimento estimada de OÜ660 medido durante o crescimento (exponencial). Os círculos abertos e fechados representam experimentos de transferência em série em duplicata.

[009] Figura 4. Taxa de crescimento durante uma fermentação de SBR anaeróbica de S. cerevisiae IMS0001 em meio sintético com 2% (peso/volume) de L-arabinose. Cada ponto de dados representa a taxa de crescimento estimada do perfil de CO2 (linha cheia) durante o crescimento exponencial.

[010] Figura 5. Consumo de açúcar e formação do produto durante fermentações de batelada anaeróbica da cepa IMS0002. As fermentações foram realizadas em um meio sintético suplementado com: 20 g L-1 de arabinose (A) ; 20 g L_1 de glicose e 20 g L_1 de arabinose (B) ; 30 g L-1 de glicose, 15 g L_1 de xilose, e 15 g L_1 de arabinose (C) ;

Consumo de açúcar e formação de produto durante fermentações de batelada anaeróbica com uma mistura das cepas IMS0002 e RWB218. As fermentações foram realizadas em 1 litro de meio sintético suplementado com 30 g L_1 de glicose, 15 g L_1 de xilose, e 15 g L_1 de arabinose (D) . Símbolos: glicose (·) ; xilose (O); arabinose (I); etanol calculado da produção cumulativa de CO2 (□) ; etanol medido por HPLC (A); produção cumulativa de CO2 (Δ) ; xilitol(T).

[011] Figura 6. Consumo de açúcar e formação de produto durante fermentação da batelada anaeróbica das células da cepa IMS0002 selecionada para crescimento anaeróbico em xilose. A fermentação foi realizada em 1 litro de meio sintético suplementado com 20 g L_1 de xilose e 20 g L_1 de arabinose. Símbolos: xilose (O); arabinose (■); etanol medido por HPLC (▲) ; produção cumulativa de CO2 (Δ) ; xilitol (T) .

[012] Figura 7. Consumo de açúcar e formação de produto durante uma fermentação de batelada anaeróbica da cepa IMS0003. A fermentação foi realizada em 1 litro de meio sintético suplementado com: 30 g L-1 de glicose, 15 g L_1 de xilose e 15 g L-1 de arabinose. Símbolos: glicose (·); xilose (O); arabinose (■); etanol calculado de produção cumulativa de CO2 (□) ; etanol medido por HPLC (A); produção cumulativa de CO2 (Δ) .

Descrição da Invenção Célula Eucariótica [013] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a uma célula eucariótica capaz de expressar as sequências de nucleotídeo que se seguem, pelo que a expressão destas sequências de nucleotídeo confere à célula a capacidade de usar L-arabinose e/ou converter L-arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado tal como etanol: (a) uma sequência de nucleotídeo codificando uma arabinose isomerase (araA), pelo que a dita sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: (i) sequências de nucleotídeo codificando uma araA, dita araA compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 55% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. (ii) sequências de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO:2. (iii) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequência de (i) ou (ii); (iv) sequências de nucleotideo as sequências das mesmas diferem da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, (b) uma sequência de nucleotideo codificando uma L-ribuloquinase (araB), pelo que a dita sequência de nucleotideo é selecionada do grupo consistindo em: (i) sequências de nucleotideo codificando uma araB, dita araB compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 20% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:3. (ii) sequências de nucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO:4. (iii) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequência de (i) ou (ii) ; (iv) sequências de nucleotideo as sequências das mesmas diferem da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, (c) uma sequência de nucleotideo codificando uma L-ribulose-5-P-4-epimerase (araD), pelo que a dita sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: (i) sequências de nucleotídeo codificando uma araD, dita araD compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5. (ii) sequências de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO:6. (iii) sequências de nucleotídeo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequência de (i) ou (ii); (iv) sequências de nucleotídeo as sequências das mesmas diferem da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético.

[014] Uma concretização preferida se refere a uma célula eucariótica capaz de expressar as sequências de nucleotídeo que se seguem, pelo que a expressão destas sequências de nucleotídeo confere à célula a capacidade de usar L-arabinose e/ou converter L-arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado tal como etanol: (a) uma sequência de nucleotídeo codificando uma arabinose isomerase (araA) , pelo que a dita sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: (i) sequências de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO:2, (ii) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequência de (i); (iii) sequências de nucleotideo as sequências das mesmas diferem da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (ii) em razão da degeneração do código genético, (b) uma sequência de nucleotideo codificando a L-ribuloquinase (araB) , pelo que a dita sequência de nucleotideo é selecionada do grupo consistindo em: (i) sequências de nucleotideo codificando uma araB, dita araB compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 20% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:3. (ii) sequências de nucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo que possui pelo menos 50% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO:4. (iii) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequência de (i) ou (ii); (iv) sequências de nucleotideo as sequências das mesmas diferem da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético, (c) uma sequência de nucleotideo codificando uma L-ribulose-5-P-4-epimerase (araD), pelo que a dita sequência de nucleotideo é selecionada do grupo consistindo em: (i) sequências de nucleotídeo codificando uma araD, dita araD compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:5. (ii) sequências de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que possui pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO:6. (iii) sequências de nucleotídeo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma molécula de ácido nucléico da sequência de (i) ou (ii) ; (iv) sequências de nucleotídeo as sequências das mesmas diferem da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (iii) em razão da degeneração do código genético.

Identidade da Sequência e Similaridade [015] A identidade da sequência é definida neste documento como a relação entre duas sequências de aminoácido (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucléico (polinucleotídeo), conforme determinado por comparação das sequências. Geralmente, as identidades ou similaridades da sequência são comparadas em relação ao comprimento total das sequências comparadas. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação da sequência entre as sequências de aminoácido ou de ácidos nucléicos, conforme for o caso, conforme determinado pela combinação entre "strings" de tais sequências. A "similaridade" entre duas sequências de aminoácido é determinada pela comparação da sequência de aminoácido e seus substitutos de aminoácido conservados de um polipeptídeo para a sequência de um segundo polipeptídeo. "Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas por vários métodos conhecidos dos versados na técnica.

[016] Métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer a maior combinação entre as sequências testadas. Os métodos pra determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem, por exemplo, o BestFit, BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S. F. e outros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), publicamente disponivel na NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., e outros, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Um algoritmo mais preferido utilizado é o EMBOSS (http: //www. ebi .ac.uk/eitboss/aliqn) . Parâmetros preferidos para a comparação das sequências de aminoácido usando EMBOSS são fenda aberta 10,0, fenda estendida 0,5, matriz Blosum 62. Os parâmetros preferidos para comparação da sequência de ácido nucléicos usando EMBOSS são fenda aberta 10.0, fenda estendida 0,5, matriz plena de DNA (matriz de identidade de DMA).

[017] Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade do aminoácido, um versado na técnica pode levar em consideração as substituições de aminoácido denominadas "conservadoras", conforme ficará claro a um versado na técnica. As substituições de aminoácido conservadoras se referem à capacidade de intercâmbio dos resíduos possuindo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais hidroxila alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e tiptofano; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre é cisteina e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservadores preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. Variantes de substituição da sequência de aminoácido revelada neste documento são aquelas nas quais pelo menos um resíduo nas sequências reveladas tenha sido removido e um resíduo diferente tenha sido inserido em seu lugar.

Preferivelmente, a alteração do aminoácido é conservadora. Substituições conservadoras preferidas para cada um dos aminoácidos ocorrendo naturalmente são como se segue: Ala em ser; Arg em lys; Asn em gin ou his; Asp em glu; Cys em ser ou ala; Gin em asn; Glu em asp; Gly em pro; His em asn ou gin; Ile em leu ou vai; Leu em ile ou vai; Lys em arg;

Gin em glu; Met em leu ou ile; Phe em met, leu ou tyr; Ser em thr; Thr em ser; Trp em tyr; Tyr em trp ou phe; e, Vai em ile ou leu.

Hibridização da Sequência de Ácidos Nucléicos [018] As sequências de nucleotídeo codificando as enzimas expressas na célula da invenção podem também ser definidas por sua capacidade de hibridizar com as sequências de nucleotideo das SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 respectivamente, sob condições de hibridização moderada ou preferivelmente estringente. Condições de hibridização estringente são definidas neste documento como condições que permitem que uma sequência de ácido nucléico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotideos, 75 ou 100 e mais preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotideos, hibridize a uma temperatura de cerca de 65 °C em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução possuindo uma resistência iônica comparável, e lavagem a 65°C em uma solução compreendendo cerca de 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução possuindo uma resistência iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada por toda noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Estas condições permitirão a hibridização especifica de sequências possuindo cerca de 90% ou mais de identidade de sequência.

[019] Condições moderadas são definidas neste documento como condições que permitem que sequências de ácido nucléico de pelo menos 50 nucleotideos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotideos, hibridizem a uma temperatura de cerca de 45 °C em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução possuindo uma resistência iônica comparável, e lavagem a temperatura ambiente em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução possuindo uma resistência iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada por toda noite, isto é, pelo menos por 10 horas, e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas trocas da solução de lavagem. Estas condições permitirão a hibridização especifica de sequências possuindo até 50% de identidade de sequência. Um versado na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização, a fim de identificar especificamente as sequências variando na identidade entre 50% e 90%.

AraA

[020] Uma sequência de nucleotideo preferida codificando uma arabinose isomerase (araA) expressa na célula da invenção é selecionada do grupo consistindo em: (a) sequências de nucleotideo codificando um polipeptideo araA dito araA compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1; (b) sequências de nucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo que possui pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 2; (c) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma sequência de molécula de ácido nucléico de (a) ou (b); (d) sequências de nucleotideo, onde a sequência das mesmas difere da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (c) em razão da degeneração do código genético.

[021] A sequência de nucleotideo codificando uma araA pode codificar tanto uma araA procariótica quanto eucariótica, isto é, uma araA com uma sequência de aminoácido que é idêntica aquela de uma araA que ocorre naturalmente no organismo procariótico ou eucariótico. Os presentes inventores verificaram que a capacidade de uma araA especifica de conferir a uma célula hospedeira eucariótica a capacidade de usar arabinose e/ou converter arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado tal como etanol quando coexpressa com araB e araD não depende muito se a araA é de origem procariótica ou eucariótica. Ao invés disto, isso depende da relação da sequência de aminoácido de araA para com aquela sequência SEQ ID NO: 1.

AraB

[022] Uma sequência de nucleotideo preferida codificando uma L-ribuloquinase (AraB) expressa na célula da invenção é selecionada do grupo consistindo em: (a) sequências de nucleotideo codificando um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3; (b) sequências de nucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo que possui pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID N04; (c) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma sequência de molécula de ácido nucléico de (a) ou (b); (d) sequências de nucleotídeo, onde a sequência das mesmas difere da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (c) em razão da degeneração do código genético.

[023] A sequência de nucleotídeo codificando uma araB pode codificar tanto uma araB procariótica quanto eucariótica, isto é, uma araB com uma sequência de aminoácido que é idêntica aquela de uma araB que ocorre naturalmente no organismo procariótico ou eucariótico. Os presentes inventores verificaram que a capacidade de uma araB específica de conferir a uma célula hospedeira eucariótica a capacidade de usar arabinose e/ou converter arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado quando coexpresso com araA e araD não depende muito se a araB é de origem procariótica ou eucariótica. Ao invés disto, isso depende da relação da sequência de aminoácido de araB para aquela sequência SEQ ID NO: 3.

AraD

[024] Uma sequência de nucleotídeo preferida codificando uma L-ribulose-5-P-4-epimerase (araD) expressa na célula da invenção é selecionada do grupo consistindo em: (e) sequências de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5; (f) sequências de nucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que possui pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID N06; (q) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma sequência de molécula de ácido nucléico de (a) ou (b); (h) sequências de nucleotideo, onde a sequência das mesmas difere da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (c) em razão da degeneração do código genético.

[025] A sequência de nucleotideo codificando uma araD pode tanto ser uma araD procariótica quanto eucariótica, isto é, uma araD com uma sequência de aminoácido que é idêntica aquela de uma araD que ocorre naturalmente no organismo procariótico ou eucariótico. Os presentes inventores verificaram que a capacidade de uma araD especifica de conferir a uma célula hospedeira eucariótica a capacidade de usar arabinose e/ou converter arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado quando coexpressa com araA e araB não depende muito se a araD é de origem procariótica ou eucariótica. Ao invés disto, isso depende da relação da sequência de aminoácido de araD para aquela sequência SEQ ID NO: 5.

[026] Surpreendentemente, o índice de inclinação do códon indicou que a expressão dos genes de Lactobacillus plantarum araA, araB e araD genes foi mais favorável para expressão na levedura que o dos genes procarióticos araA, araB e araD descritos no EP 1 499 708.

[027] Deve ser observado que L. plantarum é um organismo Considerado Geralmente como Seguro (GRAS), que é reconhecido como seguro pelas autoridades de registro de alimentos. Portanto, uma sequência de nucleotideo preferida codifica uma araA, araB ou araD possuindo respectivamente uma sequência de aminoácido que está relacionada às sequências SEQ ID NO: 1, 3, ou 5 respectivamente, conforme definido acima. Uma sequência de nucleotideo preferida codifica um fungo araA, araB ou araD respectivamente (por exemplo, de um Basidiomycete) , mais preferivelmente uma araA, araB ou araD respectivamente de um fungo anaeróbico, por exemplo um fungo anaeróbico que pertence às familias Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces, Orpinomyces ou Ruminomyces. Alternativamente, uma sequência de nucleotideo preferida codifica uma araA, araB ou araD bacteriana, respectivamente, preferivelmente de uma bactéria gram positiva, mais preferivelmente do gênero Lactobacillus, mais preferivelmente das espécies Lactobacillus plantarum. Preferivelmente, uma, duas ou três das sequências de nucleotideo araA, araB e araD se originam de um gênero Lactobacillus, mais preferivelmente da espécie Lactobacillus plantarum. A araA bacteriana expressa na célula da invenção não é a araA do Bacillus subtilis revelada no EP 1 499 708 e fornecida como SEQ ID NO: 9. A SEQ ID NO: 10 representa a sequência de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO: 9. As araB e araD bacterianas expressas na célula da invenção não são as de Escherichia coli (E. coli) conforme revelado na EP 1 499 708 e fornecidas como SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:13. A SEQ ID NO: 12 representa a sequência de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO: 11. A SEQ ID NO: 14 representa a sequência de ácido nucléico codificando a SEQ ID NO:13.

[028] De modo a aumentar a probabilidade das enzimas de araA, araB e araD (bacterianas) respectivamente de serem expressas na forma ativa em uma célula hospedeira eucariótica da invenção, tal como levedura, a sequência de nucleotideo de codificação correspondente pode ser adaptada para otimizar seu uso do códon para aquela da célula hospedeira eucariótica escolhida. A adaptação de uma sequência de nucleotideo codificando as enzimas araA, araB e araD (ou outras enzimas da invenção, vide abaixo) ao uso do códon da célula hospedeira escolhida pode ser expressa como indice de adaptação do códon (CAI). O índice de adaptação do códon é definido neste documento como a medição da adaptação relativa do uso do códon de um gene na direção do uso do códon de genes altamente expressos. A adaptação relativa (w) de cada códon é a razão do uso de cada códon, em relação aquele do códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice CAI é definido como a média geométrica destes valores de adaptação relativa. Códons não sinônimos e códons de terminação (dependentes do código genético) são excluídos. Os valores de CAI variam de 0 a 1, com valores mais altos indicando uma proporção maior de códons mais abundantes (vide Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 1281-1295; vide também: Jansen e outros, 2003, Nucleic Acids Res. (8):2242-51) . Uma sequência de nucleotídeos adaptada possui preferivelmente um CAI de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 ou 0,7.

[029] Em uma modalidade preferida, a expressão das sequências de nucleotideo codificando uma ara A, uma ara B e uma ara D, conforme definido neste documento anteriormente, confere à célula a capacidade de usar L- arabinose e/ou converter a mesma em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato. Sem desejar ligação a qualquer teoria, é esperado que a L-arabinose seja convertida primeiro em L-ribulose, que é subsequentemente convertida em xilulose 5-fosfato que é a molécula principal que entra na via da pentose fosfato. No contexto da invenção, "uso de L-arabinose" significa preferivelmente que a densidade óptica medida em 660 nm (OD660) das células transformadas cultivadas sob condições aeróbicas ou anaeróbicas na presença de pelo menos 0,5% de L-arabinose durante pelo menos 20 dias é aumentada de aproximadamente 0,5 até 1,0 ou mais. Mais preferivelmente, a OÜ660 é aumentada de 0,5 até 1,5 ou mais. Mais preferivelmente, as células são cultivadas na presença de pelo menos 1%, pelo menos 1,5%, pelo menos 2% de L-arabinose. Mais preferivelmente, as células são cultivadas na presença de aproximadamente 2% de L-arabinose.

[030] No contexto da invenção, uma célula é capaz de "converter L-arabinose em L-ribulose" quando quantidades detectáveis de L-ribulose são detectadas nas células cultivadas sob condições aeróbicas ou anaeróbicas na presença de L-arabinose (mesmas concentrações preferidas como no parágrafo anterior) durante pelo menos 20 dias usando um ensaio apropriado. Preferivelmente o ensaio é HPLC para L-ribulose.

[031] No contexto da invenção, uma célula é capaz de "converter L-arabinose em xilulose 5-fosfato" quando um aumento de pelo menos 2% da xilulose 5-fosfato é detectado nas células cultivadas sob condições aeróbicas ou anaeróbicas, na presença de L-arabinose (mesmas concentrações preferidas como no parágrafo anterior) durante pelo menos 20 dias usando um ensaio apropriado. Preferivelmente, um ensaio à base de HPCL para xilulose 5-fosfato foi descrito em Zaldivar J., e outros ((2002), Appl. Microbiol. Biotechnol., 59:436-442). Este ensaio é descrito resumidamente na parte experimental. Mais preferivelmente, o aumento é de pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ou mais.

[032] Em outra concretização preferida, a expressão das sequências de nucleotideo codificando uma ara A, ara B e ara D, conforme definida neste documento anteriormente, confere à célula a capacidade de converter L-arabinose em um produto de fermentação desejado quando cultivada sob condições aeróbicas ou anaeróbicas na presença de L-arabinose (mesmas concentrações preferidas como no parágrafo anterior) durante pelo menos um mês até um ano. Mais preferivelmente, uma célula é capaz de converter L-arabinose em um produto de fermentação desejado quando quantidades desejáveis de um produto de fermentação desejado são detectadas usando um ensaio apropriado e quando as células são cultivadas sob as condições fornecidas na sentença anterior. Mesmo mais preferivelmente, o ensaio é HPLC. Mesmo mais preferivelmente, o produto de fermentação é etanol.

[033] Uma célula para transformação com as sequências de nucleotideo codificando as enzimas araA, araB e araD respectivamente, conforme descrito acima, preferivelmente é uma célula hospedeira capaz de transporte ativo ou passivo de xilose em uma isomerização de xilose dentro da célula. A célula preferivelmente é capaz de glicólise ativa. A célula pode conter, adicionalmente, uma via pentose fosfato endógena e pode conter atividade de xilulose quinase endógena, de modo que a xilulose isomerizada da xilose pode ser metabolizada em piruvato. A célula contém, adicional e preferivelmente, enzimas para conversão de piruvato no produto de fermentação desejado, tal como, etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina. A célula pode ser transformada para ser capaz de produzir butanol por introdução de um ou mais genes da via de butanol conforme revelado no W02007/041269.

[034] Uma célula preferida é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, preferivelmente, fermentação alcoólica anaeróbica. A célula hospedeira adicional e preferivelmente possui uma alta tolerância ao etanol, uma alta tolerância ao pH baixo (isto é, capaz de crescimento em um pH inferior a 5, 4, 3 ou 2,5) ena direção de ácidos orgânicos, tais como, ácido láctico, ácido acético ou ácido fórmico e produtos de degradação de açúcar, tais como, furfural e hidróxi-metilfurfural e alta tolerância às temperaturas elevadas. Qualquer uma dessas características ou atividades de uma célula hospedeira podem estar naturalmente presentes em uma célula hospedeira ou podem ser introduzidas ou modificadas através da seleção genética ou por modificação genética. Uma célula hospedeira apropriada é um microorganismo eucariótico como, por exemplo, um fungo, contudo, mais apropriadamente como célula hospedeira são leveduras ou fungos filamentosos.

[035] As leveduras são definidas neste documento como microorganismos eucarióticos e incluem todas espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, In: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., New York) que cresce predominantemente na forma unicelular. As leveduras podem tanto crescer por brotamento de um talo unicelular ou podem crescer por fissura do organismo. As células hospedeiras de leveduras preferidas pertencem a um dos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. Preferivelmente a levedura é capaz de fermentação anaeróbica, mais preferivelmente fermentação alcoólica anaeróbica.

[036] Fungos filamentosos são definidos aqui como microorganismos eucarióticos que incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina. Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetativo composto de quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção são morfológica, fisiológica e geneticamente distintos das leveduras. O crescimento vegetativo por fungos filamentosos é realizado por alongamento da hifa e catabolismo de carbono dos fungos mais filamentosos é obrigatoriamente aeróbico. Fungos filamentosos preferidos como células hospedeiras pertencem a um dos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium, Fusarium ou Penicillium.

[037] Com o passar dos anos, sugestões foram feitas para a introdução de vários organismos para a produção de bioetanol dos açúcares de colheita. Na prática, contudo, todos os processos de produção de bioetanol principais continuaram a utilizar leveduras do gênero Saccharomyces como produtoras de etanol. Isto se deve aos muitos aspectos atraentes das espécies Saccharomyces para processos industriais, isto é, tolerância ao ácido, etanol e osmose alta, capacidade de crescimento anaeróbico e naturalmente sua alta capacidade de fermentação alcoólica. Espécies de levedura preferidas como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus, K. fragilis.

[038] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira da invenção é uma célula hospedeira que foi transformada com uma construção de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotideo codificando as enzimas araA, araB e araD conforme definido acima. Em uma ou mais concretização preferida, a célula hospedeira é co-transformada com três construções de ácido nucléico cada construção de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotideo codificando araA, araB ou araD. A construção do ácido nucléico compreendendo a sequência de codificação araA, araB, e/ou araD sendo capaz de expressão das enzimas araA, araB, e/ou araD na célula hospedeira. Para esta finalidade, a construção do ácido nucléico pode ser constituída conforme descrito, por exemplo, no WO 03/0624430. A célula hospedeira pode compreender uma cópia simples, porém preferivelmente compreende cópias múltiplas de cada construção de ácido nucléico. A construção do ácido nucléico pode ser mantida epissomicamente e assim compreender uma sequência para replicação autônoma, tal como uma sequência ARS. As construções de ácido nucléico epissômicas apropriadas podem ter como base, por exemplo, os plasmídeos de levedura 2μ ou pKDl (Fleer e outros, 1991, Biotechnology 9^:968-975). Preferivelmente, contudo, cada construção de ácido nucléico está integrada em uma ou mais cópias dentro do genoma da célula hospedeira. A integração dentro do genoma da célula hospedeira pode ocorrer aleatoriamente por recombinação ilegítima, porém preferivelmente a construção de ácido nucléico é integrada ao genoma da célula hospedeira por recombinação homóloga, como é bem conhecido na arte das genéticas moleculares de fungos (vide, por exemplo, WO 90/14423, EP-A-0 481 008, EP-A-0 635 574 e US 6,265,186).

[039] Consequentemente, em uma concretização mais preferida, a célula da invenção compreende uma construção de ácido nucléico compreendendo a sequência de codificação araA, araB, e/ou araD e é capaz de expressão das enzimas araA, araB e/ou araD. Em uma concretização mesmo mais preferida, as sequências de codificação araA, araB, e/ou araD são ligadas operativamente a um promotor que fornece expressão suficiente das sequências de nucleotídeo correspondentes na célula para conferir à célula a capacidade de usar L-arabinose, e/ou converter L-arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato. Preferivelmente a célula é uma célula de levedura. Consequentemente, em um aspecto adicional, a invenção também engloba uma construção de ácido nucléico conforme ressaltado neste documento anteriormente. Preferivelmente, uma construção de ácido nucléico compreende uma sequência de ácido nucléico codificando uma araA, araB e/ou araD. Sequências de ácido nucléico codificando uma araA, araB ou araD foram todas definidas neste documento anteriormente.

[040] Mesmo mais preferivelmente, a expressão das sequências de nucleotideo correspondentes em uma célula conferem à célula a capacidade converter L-arabinose em um produto de fermentação desejado conforme definido neste documento mais adiante. Em uma concretização mesmo mais preferida, o produto de fermentação é etanol. Mesmo mais preferivelmente, a célula é uma célula de levedura.

[041] Conforme usado neste documento, o termo "ligado operativamente" se refere a uma ligação de elementos de polinucleotídeo (ou sequências de codificação ou de ácido nucléico) em uma relação funcional. Uma sequência de ácido nucléico é "ligada operativamente" quando a mesma é colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor ou melhorador é ligado operativamente a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência de codificação. Ligada operativamente significa que as sequências de ácido nucléico sendo ligadas são tipicamente continuas e, quando necessário unir duas regiões de codificação de proteína, contínuas e no quadro de leitura.

[042] Conforme usado neste documento, o termo "promotor" se refere a um fragmento de ácido nucléico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados a montante com relação à direção de transcrição do sítio de iniciação de transcrição do gene e sendo estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para RNA polimerase dependente de DNA, sítios de iniciação de transcrição e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo porém não limitado aos sítios de ligação de fator de transcrição, sítios de ligação de proteína repressora e ativadora e quaisquer outras sequências de nucleotideo conhecidas por um versado na técnica para atuarem direta ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição do promotor. Um promoter "constitutivo" é um promoter que é ativo sob condições mais ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento.

[043] O promotor que seria usado para obter uma expressão das sequências de nucleotideo codificando araA, araB e/ou araD pode não ser nativo com relação à sequência de nucleotideo codificando a enzima a ser expressa, isto é, um promotor que é heterólogo a sequência de nucleotideo (sequência de codificação) à qual está ligado operativamente. Embora o promotor preferivelmente seja heterólogo com relação à sequência de codificação a qual ele deve ser ligado operativamente, é também preferido que o promotor seja homólogo, isto é, endógeno com relação à célula hospedeira. Preferivelmente, o promotor heterólogo (com relação à sequência de nucleotideo) é capaz de produzir um nível de estado firme superior da transcrição compreendendo a sequência de codificação (ou é capaz de produzir mais moléculas de transcrição, isto é, moléculas de RNAm, por unidade de tempo) em relação ao promotor que é nativo à sequência de codificação, preferivelmente sob condições onde arabinose ou arabinose e glicose ou xilose e arabinose ou xilose e arabinose e glicose são disponíveis como fontes de carbono, mais preferivelmente como fontes de carbono principais (isto é, mais de 50% de disponibilidade da fonte de carbono consistem em arabinose ou arabinose e glicose ou xilose e arabinose ou xilose e arabinose e glicose), mais preferivelmente como as únicas fontes de carbono. Os promotores apropriados no contexto incluem ambos promotores naturais constitutivos e induziveis, bem como promotores transformados geneticamente. Um promotor preferido para uso na presente invenção será também sensível à repressão do catabolito (glicose) e/ou preferivelmente não necessitará de arabinose e/ou xilose para indução.

[044] Os promotores possuindo estas características são amplamente disponíveis e conhecidos do versado na técnica. Exemplos apropriados de tais promotores incluem, por exemplo, promotores de genes glicolíticos, tais como, promotores de fosfofrutoquinase (PPK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato quinase (PGK) de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes destes promotores de levedura podendo ser encontrados no (WO 93/03159). Outros promotores úteis são proteínas ribossômicas codificando promotores de gene, o promotor do gene de lactase (LAC4), promotores de álcool desidrogenase (ADH1, ADH4 e semelhantes), o promotor de enolase (ENO), o promotor de glicose-6-fosfato isomerase (PGIl, Hauf e outros, 2000) ou o promotor do transportador de hexose(glicose) (HXT7) ou do gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (TDH3). A sequência do promotor de PGIl é fornecida na SEQ ID NO:51. A sequência do promotor de HXT7 é fornecida na SEQ ID NO:52. A sequência do promotor de TDH3 é fornecida na SEQ ID NO:49. Outros promotores, ambos constitutivos e induziveis e melhoradores ou sequências de ativação a montante serão conhecidos dos versados na técnica. Os promotores usados nas células hospedeiras da invenção podem ser modificados, caso desejado, para afetar suas características de controle.

[045] Uma célula preferida da invenção é uma célula eucariótica transformada com os genes de araA, araB e araD de L. plantarum. Mais preferivelmente, a célula eucariótica é uma célula de levedura, mesmo mais preferivelmente uma cepa de S. cerevisiae transformada com os genes de araA, araB e araD de L. plantarum. Mais preferivelmente, a célula é tanto CBS 120327 quanto CBS 120328 ambas depositadas no CBS Institute (Paises-Baixos) em 27 de setembro de 2006.

[046] O termo "homóloga" quando usado para indicar a relação entre uma dada molécula de ácido nucléico (recombinante) ou polipeptídeo e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, significa que na natureza a dita molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo é produzida por uma célula hospedeira ou organismos das mesmas espécies, preferivelmente da mesma variedade de cepa. Se homóloga a uma célula hospedeira, uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo será tipicamente ligada operativamente a outra sequência promotora, ou, caso aplicável, outra sequência de sinal secretora e/ou sequência terminadora em relação ao seu ambiente natural. Quando usado para indicar a relação das duas sequências de ácido nucléico, o termo "homóloga" significa que uma sequência de ácido nucléico de fita simples pode hibridizar com relação à sequência de ácido nucléico de fita simples, complementar. O grau de hibridização dependerá de vários fatores incluindo a quantidade de identidade entre as sequências e as condições de hibridização, tais como, temperatura e concentração de sal conforme apresentado anteriormente. Preferivelmente, a região de identidade é superior a 5 pares de base, mais preferivelmente, a região de identidade é superior a 10 pares de base.

[047] O termo "heterólogo" quando usado com relação a um ácido nucléico (DNA ou RNA) ou proteína se refere ao ácido nucléico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou sequência de DNA ou RNA onde ele está presente ou é encontrado em uma célula ou localização ou localizações no genoma ou sequência de DNA ou RNA que diferem daquela na qual ele é encontrado na natureza. Ácidos nucléicos ou proteínas heterólogos não são endógenos à célula dentro da qual ele é introduzido, porém foram obtidos de outra célula ou produzidos sintética ou recombinantemente. De modo geral, embora não necessariamente, tais ácidos nucléicos codificam proteínas que não são normalmente produzidas pela célula na qual o DNA é transcrito ou expresso. De modo semelhante, RNA exógeno codifica proteínas que não são normalmente expressas na célula na qual o RNA exógeno está presente. Ácidos nucléicos e proteínas heterólogos podem também ser referidos como ácidos nucléicos ou proteínas estanhos. Qualquer ácido nucléico ou proteína que um versado na técnica reconheça como sendo heterólogo ou estanho á célula na qual é expresso está englobado, neste documento, pelo termo ácido nucléico ou proteína heterólogo. O termo heterólogo também se aplica às combinações não naturais de sequências de ácido nucléico ou de aminoácido, isto é, combinações onde pelo menos duas da sequências combinadas são estranhas uma com relação a outra. Célula Eucariótica Preferida Capaz de Usar e/ou Converter L-arabinose e xilose [048] Em uma concretização mais preferida, a célula da invenção que expressa araA, araB e araD é capaz de usar L-arabinose e/ou converter a mesma em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou um produto de fermentação desejado, conforme definido neste documento anteriormente e adicionalmente exibir a capacidade de usar xilose e/ou converter xilose em xilulose. A conversão de xilose em xilulose é preferivelmente uma etapa da isomerização (isomerização direta de xilose em xilulose) . Este tipo de célula é portanto capaz de usar ambos L-arabinose e xilose. "Uso" de xileno possui preferivelmente o mesmo significado de "uso" de L-arabinose conforme descrito neste documento anteriormente.

[049] As definições de enzima são conforme usadas no WO 06/009434, para xilose isomerase (EC 5.3.1.5), xilulose quinase (EC 2.7.1.17), ribulose 5-fosfato epimerase (5.1.3.1), ribulose 5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6), transcetolase (EC 2.2.1.1), transaldolase (EC 2.2.1.2), e aldose reductase" (EC 1.1.1.21).

[050] Em uma modalidade preferida, a célula eucariótica da invenção expressando araA, araB e araD, conforme definido neste documento anteriormente, possui a capacidade de isomerizar xilose em xilulose, conforme descrito, por exemplo, no WO 03/0624430 ou no WO 06/009434. A capacidade de isomerizar xilose em xilulose é conferida a uma célula hospedeira por transformação de uma célula hospedeira com uma construção de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotideo codificando a xilose isomerase. A capacidade da célula hospedeira transformada de isomerizar xilose em xilulose é uma disomerização direta da xilose em xilulose. Fica entendido que a xilose isomerizada em xilulose é uma reação simples catalisada por uma xilose isomerase, quando oposta à conversão de duas etapas da xilose em xilulose através de um intermediário de xilitol, conforme catalisado por xilose reductase e xilitol desidrogenase, respectivamente.

[051] A sequência de nucleotideo codifica a xilose isomerase que é preferivelmente expressa na forma ativa na célula hospedeira transformada da invenção. Assim, a expressão da sequência de nucleotideo na célula hospedeira produz uma xilose isomerase com atividade especifica de pelo menos 10 U de atividade de xilose isomerase por MG de proteína a 30°C, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300 ou 500 U por mg a 30°C. A atividade específica da xilose isomerase expressa na célula hospedeira transformada é definida, neste documento, como a quantidade de unidades de atividade de xilose isomerase por MG de proteína do lisado isento de célula da célula hospedeira, por exemplo, um lisado isento de célula de levedura. A determinação da xilose isomerase já foi descrita neste documento anteriormente.

[052] Preferivelmente, a expressão da sequência de nucleotideo codificando a xilose isomerase na célula hospedeira produz a xilose isomerase com um Km para xilose que é inferior a 50, 40, 30 ou 25 mM, mais preferivelmente, o Km para xilose é cerca de 20 mM ou menos.

[053] Uma sequência de nucleotideo preferida codificando a xilose isomerase pode ser selecionada do grupo consistindo em: (e) sequências de nucleotideo codificando um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 15; (f) sequências de nucleotideo compreendendo uma sequência de nucleotideo que possui pelo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO:16; (g) sequências de nucleotideo onde a fita complementar das mesmas hibridiza com relação a uma sequência de molécula de ácido nucléico de (a) ou (b); (h) sequências de nucleotideo, onde a sequência das mesmas difere da sequência de uma molécula de ácido nucléico de (c) em razão da degeneração do código genético.

[054] A sequência de nucleotideo codificando a xilose isomerase pode codificar tanto uma xilose isomerase procariótica quanto eucariótica, isto é, uma xilose isomerase com uma sequência de aminoácido que é idêntica aquela de uma xilose isomerase que ocorre naturalmente no organismo procariótico ou eucariótico. Os presentes inventores verificaram que a capacidade de uma xilose isomerase especifica de conferir a uma célula hospedeira eucariótica a capacidade de isomerizar xilose em xilulose não depende muito se a isomerase é de origem procariótica ou eucariótica. Ao invés disto, isso depende da relação da sequência de aminoácido da isomerase em relação à sequência Piromyces (SEQ ID NO: 7). Surpreendentemente, a Piromyces isomerase está mais relacionada às isomerases procarióticas que às outras isomerase de leveduras conhecidas. Portanto, uma sequência de nucleotideo preferida codifica a xilose isomerase possuindo uma sequência de aminoácido que está relacionada à sequência Piromyces conforme definido acima. Uma sequência de nucleotideo preferida codifica uma xilose isomerase fúngica (por exemplo de um Basidiomycete) , mais preferivelmente a xilose isomerase de um fungo anaeróbico, por exemplo a xilose isomerase de um fungo anaeróbico que pertence às famílias Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces, Orpinomyces ou Ruminomyces. Alternativamente, uma sequência de nucleotideo preferida codifica uma xilose isomerase bacteriana, preferivelmente uma bactéria gram-negativa, mais preferivelmente uma isomerase da classe Bacteroides ou do gênero Bacteroides, mais preferivelmente de B. thetaiotaomicron (SEQ ID NO: 15).

[055] De modo a aumentar a probabilidade da xilose isomerase ser expressa na forma ativa em uma célula hospedeira eucariótica, tal como levedura, a sequência de nucleotideo codificando a xilose isomerase pode ser adaptada para otimizar seu uso do códon aquela da célula hospedeira eucariótica conforme definido neste documento anteriormente.

[056] Uma célula hospedeira para transformação com a sequência de nucleotideo codificando a xilose isomerase, conforme descrito acima, preferivelmente é uma hospedeira capaz de ativar ou inativar o transporte da xilose dentro da célula. A célula hospedeira preferivelmente contém glicólise ativa. A célula hospedeira pode conter, adicionalmente, uma via pentose fosfato endógena e pode conter atividade xilulose quinase endógena, de modo que a xilulose isomerizada da xilose pode ser metabolizada em piruvato. A hospedeira preferivelmente contém enzimas para conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado, tal como, etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina. Uma célula hospedeira apropriada é uma célula hospedeira que é naturalmente capaz de fermentação alcoólica, preferivelmente, fermentação alcoólica anaeróbica. A célula hospedeira possui, adicional e preferivelmente uma tolerância alta ao etanol, uma tolerância alta ao pH baixo (isto é, capaz de desenvolver em um pH inferior a 5, 4, 3 ou 2,5) e na direção dos ácidos orgânicos, tais como, ácido láctico, ácido acético ou ácido fórmico e produtos de degradação de açúcar, tais como, furfural e hidróxi-metilfurfural e alta tolerância às temperaturas elevadas. Qualquer uma destas características ou atividades da célula hospedeira pode estar naturalmente presente na célula hospedeira ou pode ser introduzida ou alterada por modificação genética. Uma célula apropriada é um microorganismo eucariótico semelhante, por exemplo, a um fungo, contudo mais apropriadas como células hospedeiras são as leveduras ou fungos filamentosos. Leveduras preferidas e fungos filamentosos já foram definidos neste documento anteriormente.

[057] Conforme usado neste documento, a palavra célula hospedeira possui o mesmo significado da célula.

[058] A célula da invenção é preferivelmente transformada com uma construção de ácido nucléico compreendendo a sequência de nucleotideo codificando a xilose isomerase. A construção do ácido nucléico que é preferivelmente usada é a mesma que a usada compreendendo a sequência de nucleotideo codificando araA, araB ou araD.

[059] Em outra concretização preferida da invenção, a célula da invenção: - expressando araA, araB e araD e exibindo a capacidade de isomerizar diretamente xilose em xilulose, conforme definido neste documento anteriormente compreende uma modificação genética que aumenta o fluxo da via de pentose fosfato, conforme descrito no WO 06/009434. Especificamente, a modificação genética causa um aumento no fluxo da via de pentose fosfato da parte não oxidativa. Uma modificação genética que causa um fluxo aumentado da parte não oxidativa da via de pentose fosfato é entendida neste documento como significando uma modificação que aumenta o fluxo em um fator de pelo menos 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20, em comparação ao fluxo em uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto pela modificação genética causando o fluxo aumentado. 0 fluxo da parte não oxidativa da via de pentose fosfato pode ser medido por crescimento do hospedeiro modificado na xilose como uma fonte de carbono única, determinando a taxa de produção especifica de xilitol da taxa de consumo de xilose especifica, se qualquer xilitol for produzido. Contudo, o fluxo da parte não oxidativa da via de pentose fosfato é proporcional à taxa de crescimento da xilose como fonte de carbono única, preferivelmente com a taxa anaeróbica de crescimento na xilose como a única fonte de carbono. Existe uma relação linear entre a taxa de crescimento na xilose como um fonte de carbono única (pmax) e o fluxo da parte não oxidativa da via de pentose fosfato. A taxa de consumo de xilose especifica (Qs) é igual à taxa de crescimento (μ) dividida pelo rendimento da biomassa no açúcar (Yxs) uma vez que o rendimento da biomassa no açúcar é constante (de acordo com um dado conjunto de condições: meio de crescimento anaeróbico, pH, histórico genético da cepa, etc.,; isto é, Qs = μ/ Yxs). Portanto, o fluxo aumentado da parte não oxidativa da via de pentose fosfato pode ser deduzido do aumento na taxa máxima de crescimento sob estas condições. Em uma modalidade preferida, a célula compreende uma modificação genética que aumenta o fluxo da via de pentose fosfato e que possui uma taxa de consumo de xilose especifica de pelo menos 346 mg xilose/g biomassa/h.

[060] As modificações genéticas que aumentam o fluxo da via de pentose fosfato podem ser introduzidas na célula hospedeira de vários modos. Estes incluem, por exemplo, obtenção de níveis de atividade de estado firme maiores de xilose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da parte não oxidativa da via de pentose fosfato e/ou um nivel de estado firme reduzido de atividade da aldose redutase não específica. Estas alterações nos níveis de atividade de estado firme podem se efetuadas por seleção de mutantes (espontâneas ou induzidas por substâncias químicas ou radiação) e/ou por tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, por superexpressão ou inativação, respectivamente dos genes codificando as enzimas ou fatores regulando estes genes.

[061] Em uma célula hospedeira mais preferida, a modificação genética compreende superexpressão de pelo menos uma enzima da via pentose fosfato (parte não oxidativa). Preferivelmente, a enzima é selecionada do grupo consistindo nas enzimas codificando ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase, conforme descrito no WO 06/009434.

[062] Várias combinações de enzimas da via pentose fosfato (parte não oxidativa) podem ser superexpressas. Por exemplo as enzimas que são superexpressas podem ser pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, e transcetolase. Em uma concretização da invenção cada uma das enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase são superexpressas na célula hospedeira. Mais preferida é uma célula hospedeira na qual a modificação genética compreende pelo menos superexpressão de ambas as enzimas transcetolase e transaldolase como tal, uma célula hospedeira já é capaz de crescimento anaeróbico na xilose. De fato, em algumas condições, nós verificamos que células hospedeiras superexpressando apenas a transcetolase e a transaldolase já possuem a mesma taxa de crescimento anaeróbico na xilose, como das células hospedeiras que expressam todas as quatro enzimas, isto é, ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase. Além disto, as células hospedeiras superexpressando ambas as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase 3 ribulose-5-fosfato epimerase são preferidas em relação às células hospedeiras superexpressando apenas a isomerase ou apenas a epimerase como superexpressão de apenas uma destas enzimas pode produzir desequilíbrios metabólicos.

[063] Existem vários meios disponíveis na técnica para superexpressão de enzimas nas células da invenção. Especificamente, uma enzima pode ser superexpressa por aumento do número de cópias da codificação genética para a enzima em uma célula hospedeira, por exemplo, por integração das cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira, por expressão do gene a partir de um vetor de expressão epissomal ou por introdução de um vetor de expressão epissomal que compreende múltiplas cópias do gene.

[064] Alternativamente, a superexpressão das enzimas nas células hospedeiras da invenção pode ser obtida por emprego de um promotor que não é nativo em relação à sequência codificando a enzima a ser superexpressa, isto é, um promotor que é heterólogo com relação à sequência de codificação a qual ele é ligado operativamente. Promotores apropriados para esta finalidade já foram definidos neste documento.

[065] A sequência de codificação usada para superexpressão das enzimas preferivelmente é homóloga em relação à célula hospedeira da invenção. Contudo, sequências de codificação que são heterólogas com relação à célula hospedeira da invenção podem da mesma forma se aplicadas, conforme mencionado no WO 06/009434.

[066] Uma sequência de nucleotideo usada para superexpressão da ribulose-5-fosfato isomerase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotideo codificando um polipeptideo com atividade ribulose-5-fosfato isomerase, pelo que, preferivelmente o polipeptideo possui uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 17 ou pelo que a sequência de nucleotideo é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 18, sob condições moderadas, preferivelmente sob condições estringentes.

[067] Uma sequência de nucleotideo usada para superexpressão de ribulose-5-fosfato epimerase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotideo codificando um polipeptideo com atividade ribulose-5-fosfato epimerase, pelo que, preferivelmente o polipeptideo possui uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 19 ou pelo que a sequência de nucleotideo é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 20, sob condições moderadas, preferivelmente sob condições estringentes.

[068] Uma sequência de nucleotideo usada para superexpressão de transcetolase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotideo codificando um polipeptideo com atividade transcetolase, pelo que preferivelmente o polipeptideo possui uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 21 ou pelo que a sequência de nucleotideo é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 22, sob condições moderadas, preferivelmente sob condições estringentes.

[069] Uma sequência de nucleotideo usada para superexpressão da transaldolase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotideo codificando um polipeptideo com atividade transaldolase, pelo que preferivelmente o polipeptideo possui uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 23 ou pelo que a sequência de nucleotideo é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 24, sob condições moderadas, preferivelmente sob condições estringentes.

[070] Superexpressão de uma enzima, quando se referindo à produção da enzima em uma célula hospedeira geneticamente modificada, significa que a enzima é produzida em um nivel maior de atividade enzimática especifica em comparação à célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. Geralmente isto significa que a proteína enzimaticamente ativa (ou proteínas no caso de enzimas de múltiplas subunidades) é produzida em quantidades maiores ou ao invés disso em um nivel de estado firme mais alto, em comparação à célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. De modo semelhante, isso geralmente significa que a codificação de RNAm para a proteina enzimaticamente ativa é produzida em quantidades maiores ou novamente ao invés disto, em um nivel de estado firme mais alto quando comparado à célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. A superexpressão de uma enzima é assim preferivelmente determinada por medição do nível da atividade especifica da enzima em uma célula hospedeira usando ensaios de enzima apropriados, conforme descrito neste documento. Alternativamente, a superexpressão da enzima pode ser determinada indiretamente por quantificação do nível de estado firme especifico da proteína da enzima, por exemplo, usando anticorpos específicos para a enzima ou por quantificação do nível firme específico de codificação de RNAm para a enzima. 0 último podendo especificamente ser apropriado para enzimas da via de pentose fosfato para as quais os ensaios enzimáticos não são facilmente praticáveis como substratos para as enzimas não são comercialmente disponíveis. Preferivelmente nas células hospedeiras da invenção, uma enzima a ser superexpressa é superexpressa por um fator de pelo menos 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20 em comparação a uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto pela modificação genética causando a superexpressão. Deve ser entendido que estes níveis de superexpressão podem ser aplicar ao nível de estado firme da atividade da enzima, o nível de estado firme da proteína da enzima, bem como o nível de estado firme da transcrição codificando a enzima.

[071] Em uma concretização adicionalmente preferida, a célula hospedeira da invenção: expressando araA, araB e araD, e exibindo a capacidade de isomerizar diretamente xilose em xilulose e opcionalmente - compreendendo uma modificação genética que aumenta o fluxo da via de pentose conforme definido neste documento anteriormente, compreende adicionalmente uma modificação genética que aumenta a atividade especifica da xilulose quinase. Preferivelmente a modificação genética causa a superexpressão de uma xilulose quinase, por exemplo, por superexpressão de uma sequência de nucleotideo codificando uma xilulose quinase. O gene codificando a xilulose quinase pode ser endógeno à célula hospedeira ou pode ser uma xilulose quinase que é heteróloga à célula hospedeira. Uma sequência de nucleotideo usada para superexpressão da xilulose quinase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotideo codificando um polipeptideo com atividade de xilulose quinase, pelo que preferivelmente o polipeptideo apresenta uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 25 ou pelo que a sequência de nucleotideo é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 26, sob condições moderadas, preferivelmente sob condições estringentes.

[072] Uma xilulose quinase especificamente preferida é uma xilose quinase que está relacionada à xilulose quinase xylB de Piromyces conforme mencionado no WO 03/0624430. Uma sequência de nucleotideo mais preferida para uso na superexpressão da xilulose quinase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotideo codificando um polipeptideo com atividade xilulose quinase, pelo que preferivelmente o polipeptideo apresenta uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 27 ou pelo que a sequência de nucleotideo é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotideo da SEQ ID NO: 28, sob condições moderadas, preferivelmente sob condições estringentes.

[073] Nas células hospedeiras da invenção, a modificação genética que aumenta a atividade especifica da xilulose quinase pode ser combinada com quaisquer modificações que aumentando o fluxo da via de pentose fosfato conforme mencionado acima, porém esta combinação não é essencial para a invenção. Assim, uma célula hospedeira da invenção compreendendo uma modificação genética que aumenta a atividade especifica da xilulose quinase, além da expressão das enzimas araA, araB e araD conforme definido neste documento é especificamente incluída na invenção. Os vários dispositivos disponíveis na técnica para obtenção e análise de uma xilulose quinase nas células hospedeiras da invenção são as mesmas descritas acima para as enzimas da via pentose fosfato. Preferivelmente nas células hospedeiras da invenção, a xilulose quinase a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ou 20 em comparação a uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética levando à superexpressão. Deve ser entendido que estes níveis de superexpressão podem ser aplicar ao nível de estado firme da atividade da enzima, o nível de estado firme da proteína da enzima, bem como o nível de estado firme da transcrição codificando a enzima.

[074] Em uma concretização adicional preferida, a célula hospedeira da invenção: - expressando araA, araB e araD, e exibindo a capacidade de isomerizar diretamente xilose em xilulose e opcionalmente - compreendendo uma modificação genética que aumenta o fluxo da via de pentose e/ou - compreendendo adicionalmente uma modificação genética que aumenta a atividade específica da atividade da xilulose quinase, tudo conforme descrito aqui anteriormente compreende adicionalmente, uma modificação genética que reduz a atividade não específica da aldose reductase na célula hospedeira. Preferivelmente, a atividade não específica da aldose reductase é reduzida na célula hospedeira por uma ou mais modificações genéticas que reduzem a expressão ou inativam um gene codificando uma aldose reductase não específica, conforme descrito no WO 06/009434. Preferivelmente, as modificações genéticas reduzem ou inativam a expressão de cada cópia endógena de um gene codificando uma aldose reductase não específica nas células hospedeira. As células hospedeiras podem compreender múltiplas cópias de genes codificando aldoses reductases não específicas como resultado de di, poli ou aneuplóide, e/ou a célula hospedeira pode conter várias (isso)enzimas diferentes com atividade aldose reductase que diferem na sequência de aminoácido e que são clonadas por um gene diferente. Também, em tais momentos, preferivelmente a expressão de cada gene que codifica uma aldose reductase não específica é reduzida ou inativada. Preferivelmente, o gene é inativado por deleção de pelo menos parte do gene ou por interrupção do gene, pelo gue, neste contexto, o termo gene também inclui qualguer sequência de não codificação a montante ou a jusante da sequência de codificação, a deleção ou inativação (parcial) resultando na redução da expressão de atividade não específica da aldose reductase na célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeo codificando uma aldose reductase cuja atividade deve ser reduzida na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo com atividade aldose reductase, pelo que preferivelmente o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 29 ou pelo que a sequência de nucleotídeo é capaz de hibridizar com a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 30 sob condições moderadas, preferivelmente sob condições estringentes.

[075] Nas células hospedeiras da invenção, a expressão das enzimas araA, araB e araD conforme definida neste documento é combinada com modificação genética que reduz a atividade não específica da aldose reductase. A modificação genética conduzindo à redução da atividade não específica da aldose reductase pode ser combinada com qualquer uma das modificações aumentando o fluxo da via pentose fosfato e/ou com qualquer uma das modificações aumentando a atividade da xilulose quinase específica nas células hospedeiras conforme descrito acima, porém estas combinações não são essenciais para a invenção. Assim, uma célula hospedeira expressando araA, araB, e araD, compreendendo uma modificação genética adicional que reduz a atividade não especifica da aldose reductase é especificamente incluída na invenção.

[076] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é CBS 120327 depositada no CBS Institute (Paises-Baixos) em 27 de setembro de 2006.

[077] Em uma concretização adicional e preferida, a invenção se refere às células hospedeiras modificadas que são adicionalmente adaptadas à L-arabinose (uso da L-arabinose e/ou conversão da mesma em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado e, opcionalmente, utilização da xilose por seleção de mutantes, tanto espontâneos quanto induzidos (por exemplo, por radiação ou substâncias químicas), para o crescimento na L-arabinose e opcionalmente xilose, preferivelmente na L-arabinose e opcionalmente xilose como a única fonte de carbono e, mais preferivelmente sob condições anaeróbicas. A seleção dos mutantes pode ser realizada por passagem em série das culturas, por exemplo, conforme descrito em Kuyper e outros (2004, FEMS Yeast Res. 4_: 655-664) e/ou por cultivo sob pressão seletiva em uma cultura do quimiostato conforme descrito no Exemplo 4 do WO 06/009434. Este processo de seleção pode continuar por tanto tempo quanto necessário. Este processo de seleção é preferivelmente realizado durante uma semana até um ano. Contudo, o processo de seleção pode ser realizado por um período de tempo mais longo, caso necessário. Durante o processo de seleção, as células são preferivelmente cultivadas na presença de aproximadamente 20 g/L de L-arabinose e/ou aproximadamente 20 g/L de xilose. Espera-se que a célula obtida ao final deste processo de seleção seja aperfeiçoada em suas capacidades de uso da L-arabinose e/ou xilose, e/ou conversão da L-arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou um produto de fermentação desejado, tal como, etanol. Neste contexto, "célula aperfeiçoada" pode significar que uma célula obtida é capaz de usar L-arabinose e/ou xilose de um modo mais eficiente que a célula que deriva da mesma. Por exemplo, espera-se que a célula obtida tenha um crescimento melhor: aumento da taxa especifica de crescimento de pelo menos 2% em relação à célula da qual deriva sob as mesmas condições. Preferivelmente, o aumento é de pelo menos 4%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% ou mais. A taxa de crescimento especifica pode ser calculada de OÜ660 conforme conhecido de um versado na técnica. Portanto, por monitoramento de OD660, pode-se deduzir a taxa especifica de crescimento. Neste contexto "célula aperfeiçoada" pode significar que a célula obtida converte L-arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou um produto de fermentação desejado, tal como, etanol em um modo mais eficiente que na célula da qual deriva. Por exemplo, espera-se que a célula obtida produza quantidades maiores de L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou um produto de fermentação desejado tal como etanol: aumento em pelo menos um destes compostos de pelo menos 2% em relação à célula da qual deriva sob as mesmas condições. Preferivelmente, o aumento é de pelo menos 4%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% ou mais. Neste contexto "célula aperfeiçoada" pode também significar que a célula obtida converte xilose em xilulose e/ou um produto de fermentação desejado tal como etanol de modo mais eficiente que a célula da qual deriva. Por exemplo, espera-se que a célula obtida produza quantidades maiores de xilulose e/ou um produto de fermentação desejado tal como etanol: aumento de pelo menos um destes compostos em pelo menos 2% em relação à célula da qual deriva sob as mesmas condições. Preferivelmente, o aumento é de pelo menos 4%, 6%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25% ou mais.

[078] Em uma célula hospedeira preferida da invenção, pelo menos uma das modificações genéticas descritas acima, incluindo modificações obtidas por seleção de mutantes, confere à célula hospedeira a capacidade de se desenvolver em L-arabinose e opcionalmente xilose como fonte de carbono, preferivelmente como a única fonte de carbono, e preferivelmente sob condições anaeróbicas. Preferivelmente a célula hospedeira modificada não produz essencialmente xilitol, por exemplo, o xilitol produzido está abaixo do limite de detecção ou, por exemplo, menos de 5, 2, 1, 0,5 ou 0,3 % do carbono consumido em uma base molar.

[079] Preferivelmente a célula hospedeira modificada possui a capacidade de se desenvolver na L-arabinose e opcionalmente xilose como a única fonte de carbono a uma taxa de pelo menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 h_1 sob condições aeróbicas, ou se aplicável, em uma taxa de pelo menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,12, 0,15 ou 0,2 h"1 sob condições anaeróbicas. Preferivelmente a célula hospedeira modificada apresenta a capacidade de se desenvolver na mistura de glicose e L-arabinose e opcionalmente xilose (em uma razão em peso de 1:1) como a única fonte de carbono a uma taxa de pelo menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ou 0,3 h-1 sob condições aeróbicas, ou se aplicável, a uma taxa de pelo menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,12, 0,15 ou 0,2 h-1 sob condições anaeróbicas.

[080] Preferivelmente, a célula hospedeira modificada possui uma taxa de consumo especifica de L-arabinose e opcionalmente de xilose de pelo menos 346, 350, 400, 500, 600, 650, 700, 750, 800, 900 ou 1.000 mg/g células/h. Preferivelmente, a célula hospedeira modificada possui um rendimento de produto de fermentação (tal como, etanol) em L-arabinose e opcionalmente xilose que é pelo menos de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95 ou 98% do rendimento da célula hospedeira do produto de fermentação (tal como etanol) na glicose. Mais preferivelmente, o rendimento da célula hospedeira modificada do produto de fermentação (tal como etanol) na L-arabinose e opcionalmente xilose é igual a um rendimento da célula hospedeira do produto de fermentação (tal como, etanol) na glicose. Da mesma forma, o rendimento da biomassa da célula hospedeira modificada na L-arabinose e opcionalmente xilose é preferivelmente de pelo menos 55, 60, 70, 80, 85, 90, 95 ou 98% do rendimento da biomassa da célula hospedeira na glicose. Mais preferivelmente, o rendimento da biomassa da célula hospedeira modificada e opcionalmente da xilose é igual ao rendimento da biomassa da célula hospedeira na glicose. Fica entendido que na comparação dos rendimentos na glicose e L-arabinose e opcionalmente xilose ambos os rendimentos se comparam sob condições aeróbicas ou sob condições anaeróbicas.

[081] Em uma concretização mais preferida, a célula hospedeira é CBS 120328 depositada no CBS Institute (Países-Baixos) em 27 de setembro de 2006 ou CBS 121879 depositado no CBS Institute (Países-Baixos) em 20 de setembro de 2007.

[082] Em uma modalidade preferida, a célula expressa uma ou mais enzimas que conferem à célula a capacidade de produzir pelo menos um produto de fermentação selecionado do grupo consistindo em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina. Em uma concretização mais preferida, a célula hospedeira da invenção é uma célula hospedeira para a produção de etanol. Em outra concretização preferida, a invenção se refere à célula hospedeira transformada para produção de produtos de fermentação além de etanol. Tais produtos de fermentação não etanólicos incluem em princípio, qualquer volume ou substâncias químicas finas que podem ser produzidas por um microorganismo eucariótico, tais como, uma levedura ou fungos filamentosos. Tais produtos de fermentação incluem, por exemplo, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butano, um antibiótico β-lactama e cefalosporina. Uma célula hospedeira preferida para produção de produtos de fermentação não etanólicos é uma célula hospedeira que contém uma modificação genética que resulta em atividade de álcool desidrogenase diminuída. Método [083] Em um aspecto adicional, a invenção se refere aos processos de fermentação onde uma célula hospedeira da invenção é usada para a fermentação de uma fonte de carbono compreendendo uma fonte de L-arabinose e opcionalmente uma fonte de xilose. Preferivelmente, a fonte de L-arabinose e a fonte de xilose são L-arabinose e xilose. Além disso, a fonte de carbono no meio de fermentação também compreende uma fonte de glicose. A fonte de L-arabinose, xilose ou glicose pode ser L-arabinose, xilose ou glicose como tal ou pode ser qualquer polimero ou oligopolimero de carboidrato compreendendo unidades L-arabinose, xilose ou glicose, tais como, por exemplo, lignocelulose, xilanas, celulose, amido, arabinano e semelhantes. Para liberação das unidades de xilose ou glicose de tais carboidratos, carboidratos apropriados (tais como, xilanases, glicanases, amilases e semelhantes) podem ser adicionados ao meio de fermentação ou podem ser produzidos pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser transformada geneticamente para produzir e excretar tais carboidratos. Uma vantagem adicional do uso de fontes oligo ou poliméricas de glicose é que elas permitem manter uma concentração baixa(mais baixa) de glicose livre durante a fermentação, por exemplo por emprego de quantidades limitando a taxa das carboidrolases. Isto, por sua vez, impedirá a repressão dos sistemas necessários ao metabolismo e transporte de açúcares de não glicose, tais como, xilose. Em um processo preferido, a célula hospedeira modificada fermenta ambas a L-arabinose (opcionalmente xilose) e glicose, preferível e simultaneamente, quando, preferivelmente, uma célula hospedeira modificada é usada sendo insensível à repressão da glicose para prevenir desenvolvimento diáuxico. Além de uma fonte de L-arabinose, opcionalmente xilose (e glicose) como fontes de carbono, o meio de fermentação compreenderá, adicionalmente, o ingrediente apropriado e necessário para o crescimento de uma célula hospedeira modificada. As composições dos meios de fermentação para crescimento dos microorganismos, tais como leveduras ou fungos filamentosos são bem conhecidos na técnica.

[084] Em um processo preferido, é provido um processo para produção de um produto de fermentação selecionado do grupo consistindo em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina pelo que o processo compreende as etapas de: (a) fermentação de um meio contendo uma fonte de L-arabinose e opcionalmente xilose com uma célula hospedeira modificada conforme definido neste documento, pelo que a célula hospedeira fermenta L-arabinose e opcionalmente xilose no produto de fermentação, e opcionalmente, (b) recuperação do produto de fermentação.

[085] 0 processo de fermentação é um processo para a produção de um produto de fermentação, tal como, por exemplo, etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β- lactama, tal como Penicilina G ou Penicilina V e derivados fermentativos dos mesmos, e/ou uma cefalosporina. 0 processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico é definido neste documento como um processo de fermentação operado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, mais preferivelmente 0 mmol/L/h sendo consumido (isto é, consumo de oxigênio não detectável) e pelo que as moléculas orgânicas servem como doadoras de elétrons e aceitadoras de elétron. Na ausência de oxigênio, NADH produzido na glicólise e formação de biomassa, não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver este problema muitos microorganismos usam piruvato ou um de seus derivados como um elétron e aceitador de hidrogênio pelo que regenerando NAD+. Assim, em um processo de fermentação anaeróbico, piruvato é usado como um elétron (um aceitador de hidrogênio) e é reduzido aos produtos de fermentação, tais como, etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina. Em uma modalidade preferida, o processo de fermentação é anaeróbico. Um processo anaeróbico é vantajoso uma vez que é mais barato que o processo aeróbico: menos equipamento especial é necessário. Adicionalmente, espera-se que os processos anaeróbicos forneçam um rendimento de produto superior em relação aos processos aeróbicos. Sob condições aeróbicas, geralmente o rendimento da biomassa é superior em relação às condições aeróbicas. Como uma consequência, geralmente sob condições aeróbicas, o rendimento do produto esperado é inferior aquele sob condições anaeróbicas. De acordo com os inventores, o processo da invenção é o primeiro processo anaeróbico de fermentação com um meio compreendendo uma fonte de L-arabinose que foi desenvolvida até agora.

[086] Em outra concretização preferida, o processo de fermentação é realizado sob condições limitadas de oxigênio. Mais preferivelmente, o processo de fermentação é aeróbico e sob condições limitadas de oxigênio. Um processo de fermentação limitado ao oxigênio é um processo no qual o consumo do oxigênio é limitado por transferência do oxigênio do gás para o liquido. O grau de limitação do oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás de entrada, bem como pelas propriedades de transferência de mistura/massa reais do equipamento de fermentação usado. Preferivelmente, no processo sob condições limitadas de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5.5, mais preferivelmente pelo menos 6 e mesmo mais preferivelmente pelo menos 7 mmol/L/h.

[087] O processo de fermentação é preferivelmente operado a uma temperatura que é ótima para a célula modificada. Assim, para a maior parte das leveduras ou células fúngicas, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que é inferior a 42°C, preferivelmente inferior a 38°C. Para células hospedeiras de fungos filamentosos ou leveduras, o processo de fermentação é preferivelmente realizado a uma temperatura que é inferior a 35, 33, 30 ou 28°C e a uma temperatura que é superior a 20, 22 ou 25°C.

[088] Um processo preferido é um processo para a produção de etanol, pelo que o processo compreende as etapas de: (a) fermentação de um meio contendo uma fonte de L-arabinose e opcionalmente xilose com uma célula hospedeira modificada conforme definido neste documento, pelo que a célula hospedeira fermenta L-arabinose e opcionalmente xilose em etanol; e opcionalmente, (b) recuperação do etanol. O meio de fermentação também pode compreender uma fonte de glicose que também é fermentada em etanol. Em uma modalidade preferida, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbico. Anaeróbico foi definido neste documento anteriormente. Em outra concretização preferida, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbico. Em outra concretização preferida, o processo de fermentação para a produção de etanol é realizado sob condições limitadas de oxigênio, mais preferivelmente, aeróbico e sob condições limitadas de oxigênio. As condições limitadas de oxigênio há foram definidas neste documento anteriormente.

[089] No processo, a produtividade volumétrica do etanol é preferivelmente de pelo menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ou 10,0 g de etanol por litro, por hora. 0 rendimento do etanol na L-arabinose e opcionalmente xilose e/ou glicose no processo preferivelmente é de pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98%. O rendimento do etanol é definido neste documento como a porcentagem do rendimento máximo teórico que, para glicose e L-arabinose e opcionalmente xilose é de 0,51 g de etanol por g de glicose ou xilose. Em outra concretização preferida, a invenção se refere a um processo para produção de um produto de fermentação selecionado do grupo consistindo em ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina. 0 processo compreende, preferivelmente, as etapas de: (a) fermentação de um meio contendo uma fonte de L-arabinose e opcionalmente xilose com uma célula hospedeira modificada conforme definido neste documento acima, pelo que a célula hospedeira fermenta L-arabinose e opcionalmente xilose no produto de fermentação, e opcionalmente, (b) recuperação do produto de fermentação. Em um processo preferido, o meio também contém uma fonte de glicose.

[090] No processo de fermentação da invenção que leva à produção de etanol, podem ser citadas várias vantagens por comparação aos processos de fermentação de tanol conhecidos: - processos anaeróbicos são possíveis, condições limitadas de oxigênio são também possíveis, - rendimentos e taxas de produção maiores de etanol podem ser obtidos, - a cepa usada pode ser capaz de usar L-arabinose e opcionalmente xilose.

[091] Alternativamente em relação aos processos de fermentação descritos acima, outro processo de fermentação é provido como um aspecto adicional da invenção, pelo que, pelo menos duas células distintas são usadas para a fermentação de uma fonte de carbono compreendendo pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo consistindo, porém não limitado a: uma fonte de L-arabinose, uma fonte de xilose e uma fonte de glicose. Neste processo de fermentação, "pelo menos duas células distintas" significa que este processo é preferivelmente um co-processo de fermentação. Em uma concretização preferida, duas células distintas são usadas: uma sendo aquela da invenção conforme definida anteriormente capaz de usar L-arabinose, e/ou converter a mesma em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado tal como etanol e opcionalmente sendo capaz de usar xilose, a outra sendo, por exemplo, uma cepa que é capaz de usar xilose e/ou converter a mesma em um produto de fermentação desejado tal como etanol, conforme definido no WO 03/062430 e/ou WO 06/009434. Uma célula que é capaz de usar xilose é preferivelmente uma cepa que exibe a capacidade de isomerizar diretamente a xilose em xilulose (em uma etapa), conforme definido neste documento anteriormente. Estas duas cepas distintas são preferivelmente cultivadas na presença de uma fonte de L-arabinose, uma fonte de xilose e opcionalmente uma fonte de glicose. Três células distintas ou mais podem ser co-cultivadas e/ou três ou mais fontes de carbono podem ser usadas, contanto que, pelo menos uma célula seja capaz de usar pelo menos uma fonte de carbono presente e/ou converter a mesma em um produto de fermentação desejado tal como etanol. A expressão "uso de pelo menos uma fonte de carbono" possui o mesmo significado que a expressão "uso de L-arabinose". A expressão "converte a mesma (isto é, uma fonte de carbono) em um produto de fermentação desejado possui o mesmo significado da expressão "converte L-arabinose em um produto de fermentação desejado".

[092] Em uma modalidade preferida, a invenção se refere a um processo para produção de um produto de fermentação selecionado do grupo consistindo em etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, aminoácidos, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, antibiótico β-lactama e cefalosporinas, pelo gue o processo compreende as etapas de: (a) fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de L-arabinose e uma fonte de xilose com uma célula da invenção conforme mencionado neste documento anteriormente e uma célula capaz de usar xilose e/ou exibindo a capacidade de isomerizar diretamente xilose em xilulose, pelo que cada célula fermenta L-arabinose e/ou xilose no produto de fermentação, e opcionalmente, (b) recuperação do produto de fermentação.

[093] Todas concretizações preferidas dos processos de fermentação, conforme descrito acima, são também concretizações preferidas destes processos adicionais de fermentação: identidade do produto de fermentação, identidade da fonte de L-arabinose e fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbicas ou anaeróbicas, condições limitadas por oxigênio, temperatura na qual o processo está sendo realizado, produtividade do etanol, rendimento do etanol).

Modificações Genéticas [094] Para superexpressão das enzimas nas células hospedeiras da invenção, conforme descrito acima, bem como para modificação genética adicional de células hospedeiras, preferivelmente as leveduras, células hospedeiras são transformadas com as várias construções de ácido nucléico da invenção por métodos bem conhecidos na arte. Tais métodos são, por exemplo, conhecidos de livros padrões, tais como, Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press ou F. Ausubel e outros, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Os métodos para transformação e modificação genética das células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671.

[095] Promotores para uso na construção dos ácidos nucléicos para superexpressão das enzimas nas células hospedeiras da invenção foram descritos acima. Na construção dos ácidos nucléicos para superexpressão, a terminação 3' da sequência de ácido nucléico codificando a(s) enzimas(s) preferivelmente é ligada operativamente a uma sequência terminadora de transcrição. Preferivelmente a sequência terminadora é operável em uma célula hospedeira de escolha, tal como, por exemplo, as espécies de levedura de escolha. Em qualquer caso, a escolha do terminador não é critica; podendo, por exemplo, ser de qualquer gene de levedura, embora terminadores possam algumas vezes ser de gene eucariótico diferente de levedura. A sequência de terminação de transcrição compreende, adicional e preferivelmente um sinal de poliadenilação. Sequências terminadoras preferidas são a álcool desidrogenase (ADH1) e os terminadores PGI1. Mais preferivelmente, os terminadores ADH1 e PGI1 são ambos de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 53 respectivamente).

[096] Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente na construção do ácido nucléico. Conforme usado neste documento, o termo "marcador" se refere ao gene codificando um traço ou um fenótipo que permite a seleção de classificação para uma célula hospedeira contendo o marcador. O gene marcador pode ser um gene de resistência antibiótica, pelo que o antibiótico apropriado pode ser usado para selecionar as células transformadas dentre as células que não são transformadas. Preferivelmente, contudo, os marcadores de resistência não antibióticos são usados, tais como, marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2). Em uma modalidade preferida as células hospedeiras transformadas com a construção dos ácidos nucléicos são isentas de gene marcador. Os métodos para construção das células hospedeiras microbianas isentas de gene marcador recombinante são revelados na EP-A-0 635 574 e se baseiam no uso de marcadores bidirecionais. Alternativamente, um marcador classificável, tal como, Proteina Fluorescente Verde, lacZ, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase, beta-glicuronidase pode ser incorporado à construção dos ácidos nucléicos da invenção, permitindo a classificação das células transformadas.

[097] Elementos adicionais opcionais que podem estar presentes na construção dos ácidos nucléicos da invenção incluem, porém não estão limitados a uma ou mais sequências líder, melhoradores, fatores de integração e/ou genes repórteres, sequências de íntron, centrômeros, telômeros e/ou sequências de anexação de matriz (MAR). A construção dos ácidos nucléicos da invenção pode também compreender uma sequência para replicação autônoma, tal como uma sequência de ARS. Construções de ácido nucléico epissômicas apropriadas podem se basear, por exemplo, nos plasmídeos de levedura 2μ ou pKDl (Fleer e outros, 1991, Biotechnology 9q 968-975). Alternativamente a construção do ácido nucléico pode compreender sequências de integração, preferivelmente por recombinação homóloga. Tais sequências podem assim ser sequências homólogas ao sítio alvo para integração em um genoma de célula hospedeira. A construção dos ácidos nucléicos da invenção pode ser provida de modo conhecido, que geralmente envolve técnicas, tais como, restrição e ligação de ácidos nucléicos/sequência de ácido nucléicos, as quais são feito referência em livros padrões, tal como, Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[098] Os métodos para inativação e interrupção do gene na levedura ou fungos são bem conhecidos na arte (vide, por exemplo, Fincham, 1989, Microbiol Rev. 53(1):148-70 e EP-A-0 635 574) .

[099] Neste documento e em suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações são usados em seu sentido não limitante e significam que os itens que acompanham as palavras estão incluídos, porém os itens não especificamente mencionados não estão incluídos. Além disso, referência a um elemento pelo artigo indefinido "um, uma" não exclui a possibilidade de mais de um elemento estar presente, a menos que o contexto claramente requeira que exista um e apenas um dos elementos. 0 artigo indefinido "o, a" assim geralmente significa "pelo menos um (a) [100] A invenção será adicionalmente descrita pelos exemplos que se seguem, que não devem concebidos como limitando o escopo da invenção.

Exemplos Plasmideo e Construção de Cepas Cepas [101] A L-arabinose que consome a cepa Sachharomyces cerevisiae descrita neste trabalho se baseia na cepa RWB220, que é propriamente um derivado da RWB217. A RWB217 é uma cepa CEN.PK na qual quatro genes codificando a expressão das enzimas na via pentose fosfato foram superexpressos, TAL1, TKL1, RPE1, RKI1 (Kuyper e outros, 2005a). Além disto, o gene codificando a aldose reductase [GRE3) , foi deletado. A cepa RWB217 também contém dois plasmideos, um plasmideo de cópia simples com um marcador LEU2 para a superexpressão da xiluloquinase (XKS1) e um plasmideo epissômico, de múltiplas cópias com URA3 como o marcador para a expressão da xilose isomerase, XylA. RWB217 foi submetida a um procedimento de seleção para crescimento aperfeiçoado na xilose que é descrito em Kuyper e outros (2005b). O procedimento resultou em duas cepas puras, RWB218 (Kuyper e outros, 2005b) e RWB219. A diferença entre RWB218 e RWB219 é que, após o procedimento de seleção, RWB218 foi obtido por colocação em placa e reraiamento no meio mineral com glicose como a fonte de carbono, enquanto que, para RWB219 foi usada xilose.

[102] A cepa RWB219 cresceu não seletivamente em YP com glicose (YPD) como a fonte de carbono, a fim de facilitar a perda de ambos os plasmideos. Após colocação em placa, as colônias de YPD simples foram testadas quanto a perda de plasmideo por acompanhamento auxotrofia de uracila e leucina. Uma cepa que havia perdido ambos os plasmideos foi transformada com pSH47, contendo a cre recombinase, a fim de remover um cassete KanMX (Guldener e outros, 1996), ainda presente após integração da construção de superexpressão de RKIl. As colônias com o plasmideo foram ressuspensas em meio de Levedura de Peptona (YP) (10 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de peptona, ambos da BD Difco Bélgica) com galactose a 1% e incubados por 1 hora a 30°C. Cerca de 200 células foram colocadas em placa na YPD. As colônias resultantes foram verificadas quanto a perda do marcador KanMX (G418 de resistência) e pSH47 (URA3). A cepa que havia perdido ambos o marcador KanMX e o plasmideo pSH47 foi então denominada RWB220. De modo a obter a cepa testada nesta patente, RWB220 foi transformado com pRW231 e pRW243 (tabela 2), resultando na cepa IMS0001.

[103] Durante a construção, as cepas foram mantidas em YP complexa: 10 g L_1 de extrato de levedura (BD Difco), 20 g L-1 de peptona (BD Difco) ou meio sintético (MY) (Verduyn e outros, 1992) suplementada com glicose (2%) como fonte de carbono (YPD ou MYD) e 1,5% de ágar no caso das placas. Após transformação com os plasmideos, as cepas foram colocadas em placa em MYD. As transformações da levedura foram realizadas de acordo com Gietz and Woods (2002) . Os plasmídeos foram ampliados em cepa Escherichia coli XL-1 azul (Stratagene, La Jolla, CA, USA) . A transformação foi realizada de acordo com Inoue e outros (1990). E. coli cresceu em placas de LB (Luria-Bertani) ou em meio TB liquido (Caldo Terrific) para o isolamento dos plasmídeos (Sambrook e outros, 1989).

Plasmídeos [104] A fim de se desenvolver na L-arabinose, a levedura precisa expressar três genes diferentes, uma L- arabinose isomerase (AraA), uma L-ribuloquinase (AraB), e uma L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase (AraD) (Becker e Boles, 2003). Neste trabalho nós escolhemos expressar AraA, AraB e AraD do ácido láctico da bactéria Lactobacillus plantarum em S. cerevisiae. Em razão do eventual objetivo de consumir L-arabinose em combinação com outros açúcares, como D- xilose, os genes codificando a via de L-arabinose bacteriana foram combinados no mesmo plasmídeo com os genes codificando o consumo de D-xilose.

[105] A fim de obter um alto nível de expressão, os genes de L. plantarum AraA e AraD foram ligados no plasmídeo pAKX002, o plasmídeo portando 2μ de XylA.

[106] O cassete AraA foi construído por ampliação de uma versão truncada do promotor TDH3 com SpeI5'Ptdh3 e 5'AraAPtdh3 (SEQ ID NO: 49) , o gene AraA com Ptdh5'AraA e Tadh3'AraA e o terminador ADHl (SEQ ID NO: 50) com 3'AraATadhl e 3'Tadhl-Spel. Os três fragmentos foram extraídos do gel e misturados em quantidades grosseiramente equimolares. Neste mistura, uma PCR foi realizada usando os oligos SpeI-5'Ptdh3 e 3'TadhlSpeI. O cassete resultante PTDH3-AraA-TADHi foi purificado com gel, cortado nos sítios Spel 5'e 3' e então ligados no corte pAKX002 com Nhel, resultando no plasmídeo pRW230.

[107] A construção AraD foi realizada primeiro por ampliação de uma versão truncada do promotor HXT7 (SEQ ID NO:52) com oligos SalI5'Phxt7 e 5'AraDPhxt, o gene AraD com Phxt5'AraD e Tpgi3'AraD e a região do terminador GPU (SEQ ID NO:53) com os oligos 3'AraDTpgi e 3'TpgiSalI. Os fragmentos resultantes foram extraídos do gel e misturados em quantidades grosseiramente equimolares, após o que uma PCR foi realizada usando os oligos SalI5'Phxt7 e 3'TpgilSalI. O cassete PHXT7-AraD-TpGii resultante foi purificado com gel, cortado nos sítios Sall 5'e 3' e então ligado no corte pRW230 com Xhol, resultando no plasmídeo pRW231 (Figura 1).

[108] Uma vez que uma expressão de L-ribuloquinase muito alta é prejudicial ao crescimento (Becker and Boles, 2003), o gene AraB foi combinado com o gene XKS1, codificando xiluloquinase, em um plasmídeo de integração. Para isto, p415ADHXKS (Kuyper e outros, 2005a) foi primeiro alterado dentro do pRW229, por corte de ambos p415ADHXKS e pRS305 com Pvul e ligando o fragmento Pvul contendo ADHXKS-a partir do p415ADHXKS à estrutura de vetor de pRS305, resultando no pRW229.

[109] O cassete, contendo o gene L. plantarum AraB entre o promotor PGIl (SEQ ID NO: 51) e o terminador ADHl (SEQ ID NO:50) foi fabricado por ampliação do promotor PGIl com os oligos SacI5'Ppgil e 5'AraBPpgil, o gene AraB com os oligos Ppgi5'AraB e Tadh3'AraB e o terminador ADHl com os oligos 3'AraBTadhl e 3'TadhlSacI. Os três fragmentos foram extraídos do gel e misturados em quantidades grosseiramente equimolares. Na mistura, foi realizada uma PCR com os oligos SacI-5'Ppgil e 3'TadhlSacI. 0 cassete PpGii-AraB-Tadhi resultante foi purificado com gel, cortado nos sitios Saci 5' e 3' e então ligado no corte pRW229 com Saci, resultando no plasmideo pRW243 (Figura 1).

[110] A cepa RWB220 foi transformada com pRW231 e pRW243 (tabela 2), resultando na cepa IMS0001.

[111] As endonucleases de restrição (New England Biolabs, Beverly, MA, USA e Roche, Basel, Suíça) e DNA ligase (Roche) foram usadas de acordo com as instruções dos fabricantes. O isolamento do plasmideo do E. coli foi realizado com o kit de minipreparação Qiaprep (Qiagen, Hilden, Alemanha). Os fragmentos de DNA foram separados em gel agarose a 1% (Sigma, St. Louis, MO, USA) em 1*TBE (Sambrook e outros, 1989) . O isolamento dos fragmentos do fel foi realizado com kit de extração de gel Qiaquick (Quiagen). A ampliação dos (elementos de) cassetes de AraA, AraB e AraD foi realizado com VentR DNA polimerase (New England Biolabs) de acordo com as instruções dos fabricantes. O gabarito era DNA cromossômico de S. cerevisiae CEN.PK113-7D para os promotores e terminadores ou Lactobacillus plantarum DSM20205 para os genes Ara. A reação da cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em um Termociclador Biometra TGradient (Biometra, Gõttingen, Alemanha) com os seguintes ajustes: 30 ciclos de 1 minuto de saturamento a 55 °C, 60 °C ou 65 °C, 1 a 3 minutos de extensão a 75°C, dependendo do tamanho do fragmento esperado e 1 minuto de desnaturação a 94°C.

Cultivo e Meios [112] Cultivos em frascos de agitação foram realizados a 30°C em um meio sintético (Verduyn e outros, 1992). O pH do meio foi ajustado para 6,0 com 2 M de KOH antes da esterilização. Para meio sintético sólido, 1,5% de ágar foi empregado.

[113] Pré-culturas foram preparadas por inoculação de 100 mL de meio contendo o açúcar apropriado em um frasco de agitação de 500 mL com uma cultura de estoque congelada. Após inoculação a 30°C em um agitador orbital (200 rpm), esta cultura foi usada para inocular as culturas do frasco de agitação ou culturas do fermentador. 0 meio sintético para cultivo anaeróbico foi suplementado com 0,01 g L_1 de ergosterol e 0,42 g L_1 de Tween 80 dissolvidos em etanol (Andreasen and Stier, 1953; Andreasen and Stier, 1954). O cultivo da batelada anaeróbica (sequenciamento) foi realizado a 30 °C em fermentadores de laboratório de 2 litros (Applikon, Schiedam, Paises-Baixos) com um volume de trabalho de 1 litro. O pH da cultura foi mantido em pH 5,0 por adição automática de 2M de KOH. As culturas foram agitadas a 800 rpm e borrifadas com gás nitrogênio 0,5 L min-1 (<10 ppm de oxigênio) . Para minimizar a difusão do oxigênio, os fermentadores foram equipados com tubulação Norprene (Cole Palmer Instrument company, Vernon Hills, USA). Oxigênio dissolvido foi monitorado com um elétrodo de oxigênio (Applisens, Schiedam, Paises-Baixos). Condições limitadas por oxigênio foram obtidas no mesmo ajuste experimental por areação do espaço superior em aproximadamente 0,05 L min-1.

Determinação do Peso Seco [114] Amostras de cultura (10,0 mL) foram filtradas nos filtros de nitrocelulose pré-pesados (tamanho de poro 0,45 lm; Gelman Laboratory, Ann Arbor, USA). Após remoção do meio, os filtros foram lavados com água desmineralizada e secos em um forno de microondas (Bosch, Stuttgart, Alemanha) por 20 minutos a 360 W e pesados. Determinações em duplicata variaram em pelo menos 1%.

Análise de Gás [115] Gás de exaustão foi resfriado em um condensador (2°C) e seco com um secador Permapure tipo MD-110-48P-4 (Permapure, Toms Ri ver, USA) . Concentrações de O2 e COa foram determinadas com um analisador NGA 2000 {Rosemount Analytical, Orrville, USA) . A taxa de fluxo de gás de exaustão e taxas de produção de dióxido de carbono e consumo de oxigênio foram determinadas conforme descrito anteriormente (Van Urk e outros, 1988; Weusthuis e outros, 1994). Quando do cálculo destas taxas especificas da biomassa, alterações no volume causadas pela retirada das amostras de cultura foram levadas em consideração.

Análise do Metafoolito [116] Glicose, xilose, arabinose, xilitol, ácidos orgânicos, glicerol e etanol foram analisados por HPLC usando uma HPLC Waters Alliance 2690 (Waters, Milford, USA) fornecida com uma coluna BioRad HPX 8?H (BioRad, Hercules, USA), um detector de indice de refração Waters 2410 e um detector de UV Waters 2487. A coluna foi eluída a 6QeC com 0,5 g L-1 de ácido sulfürico em uma taxa de fluxo de 0,6 mL min-1.

Ensaio para Xilulose 5-Fosfato (Zaldivar J. , e outros, Appl. Microbiol. Biotechnol., <2002), 59:436-442) [117] Para análise dos metabolitos intracelulares, tais como, xilulose 5-fosfato, foram colhidos dos reatores 5 mL de caldo em duplicata, antes da exaustão da glicose (em 22 e 26 horas de cultivo) e após exaustão da glicose (42, 79 e 131 horas de cultivo). Os procedimentos para parada metabólica, extração da fase sólida dos metabolitos e análise foram descritos em detalhes por Smits H.P. e outros (Anal. Biochem., 261:36-42, (1998)). Contudo, a análise por cromatografia de troca de ion em pressão alta acoplada à detecção amperométrica pulsada empregada para analisar os extratos de células foi ligeiramente modificada. As soluções empregadas foram eluente A, 75 mM NaOH e eluente B, 500 mM NaAc. De modo a prevenir a contaminação do carbonato nas soluções eluentes, uma solução de NaOH a 50% com concentração de carbonato baixa (Baker Analysed, Deventer, Países-Baixos) foi usada ao invés das microesferas de NaOH. Os eluentes foram desgaseifiçados com hélio (He) por 30 minutos e então mantidos sob atmosfera de He. Uma bomba gradiente foi programada para gerar os gradientes que se seguem: 100% A e 0% B (0 minutos), uma diminuição linear de A a 70% e um aumento linear de B a 30% (0-30 minutos), uma diminuição linear de A a 30% e um aumento linear de B a 70% (30-70 minutos), uma diminuição linear de A a 0% e um aumento linear de B a 100% (70-75 minutos), 0% A e 100% B (75-85 minutos), um aumento linear de A a 100% e uma diminuição linear de B a 0% (85-95 minutos). A fase móvel foi operada em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Outras condições estavam de acordo com Smits e outros (1998) .

Recuperação de Carbono [118] As recuperações de carbono foram calculadas como carbono nos produtos formados, dividido pela quantidade total de açúcar no carbono consumido e se basearam no teor de carbono da biomassa de 48%. Para corrigir a evaporação do etanol durante as fermentações, a quantidade de etanol produzido foi presumida como sendo igual à produção cumulativa medida de CO? menos a produção de CO2 que ocorreu devido à síntese da biomassa (5,85 mmol CO? por grama de biomassa (Verduyn e outros, 1990)) e o CO? associado com a formação de acetato.

Seleção para Crescimento em L-arabinose [119] A cepa IMS0001 (CBS 120327 depositada na CBS em 27/09/06), contendo os genes codificando as vias para metabolização de ambas xilose (XylA e XKSl) e arabinose (AraA, AraB, AraD) foi construída de acordo com o procedimento descrito acima. Embora capa2 de se desenvolver na xilose (dados não mostrados), a cepa IMSGGG1 não parece ser capaz de se desenvolver no meio sintético sólido suplementado com L-arabinose a 2%. Os mutantes de IMS0001 capazes de utilizar a L-arabinose como fonte de carbono para o desenvolvimento foram selecionados por transferência em série nos frascos de agitação e por cultivo de batelada de sequenciamento nos fermentadores (SBR).

[120] Para os experimentos de transferência em série, um frasco de agitação de 500 mL contendo 100 mL de meio sintético contendo 0,51 de galactose foi inoculado tanto com a cepa ΙΜΞ0001 quanto a cepa de referência RWB219. Após 72 horas, em uma densidade óptica de 660 nm de 3,0, as culturas foram usadas para inocular um novo frasco de agitação contendo 0,1% de galactose e 21 de arabinose. Cora base na determinação de HPLC com D-ribulose como padrão de calibração, foi determinado que já nos primeiros cultivos da cepa IMS0001, no meio contendo uma mistura de galactose/arabinose, parte da arabinose foi convertida em ribulose e subsequentemente excretada do sobrenadante. Estas análises de HPLC foram realizadas usando uma HPLC da Waters Alliance 2690 (Waters, Milford, USA) fornecida com uma coluna BioRad HPX 87H (BioRad, Hercules, USA), um detector de índice de refração Waters 2410 e um detector Waters 2487 UV. A coluna foi eluída a 60°C com 0,5 g L-1 de ácido sulfúrico em uma taxa de fluxo de 0,6 mL min-1. Em contraste com a cepa de referência RWB219, a OD660 da cultura da cepa IMS0001 aumentou após esgotamento da galactose. Após aproximadamente 850 horas de crescimento, em arabinose, da cepa IMS0001 ter sido observada (figura 2), esta cultura foi transferida em uma OD660 de 1,7 para um frasco de agitação contendo 2% de arabinose. As culturas foram então sequencialmente transferidas para o meio fresco contendo 2% de arabinose a uma Οϋβεο de 2-3. A utilização da arabinose foi confirmada por medição ocasional das concentrações da arabinose por HPLC (dados não mostrados) . A taxa de crescimento destas culturas aumentou de 0 a 0,15 h_1 em aproximadamente 3.600 horas (figura 3).

[121] Uma fermentação por batelada sob condições limitadas de oxigênio foi iniciada por inoculação de 1 L do meio sintético suplementado com 2% de arabinose com uma cultura de frasco de agitação de 100 mL de células de IMS0001 desenvolvidas em arabinose com uma taxa máxima de crescimento em 2% de L-arabinose de aproximadamente 0,12 h" 1. Quando o crescimento na arabinose foi observado, a cultura foi submetida às condições anaeróbicas borrifando com gás nitrogênio. Os ciclos següenciais de cultivo de batelada anaeróbica foram iniciados tanto por substituição manual quanto automatizada de 90% da cultura com meio sintético contendo 20 g L_1 de arabinose. Para cada ciclo durante a fermentação com SBR, a taxa de crescimento exponencial foi estimada do perfil de CO2 (figura 4) . Nos 13 ciclos, a taxa exponencial de crescimento aumentou de 0,025 para 0,08 h_1. Após 20 ciclos a amostra foi retirada e colocada no meio sintético sólido suplementado com 2% de L-arabinose e incubado a 30°C por vários dias. As colônias separadas foram reraiadas duas vezes no meio sólido sintético com L-arabinose, Finalmente, o frasco de agitação contendo meio sintético com 2% de L-L-arabinose foi inoculado com uma colônia simples e incubado por 5 dias a 30 °C. Esta cultura foi designada como cepa IMS0002 (CBS 120328 depositada no Centraal Bureau voor Schimmelculturen (CBS) em 27/09/06). Amostras de cultura foram retiradas, glicerol a 30% foi adicionado e as amostras foram armazenadas a -80°C.

Fermentação de Cultura Mista [122] Hidrolisados de biomassa, uma carga de alimentação desejada para biotecnologia industrial contém misturas complexas consistindo em vários açúcares dentre os quais a glicose, xilose e arabinose estão geralmente presentes em frações significativas. De modo a realizar a fermentação etanólica não apenas da glicose e arabinose, porém também da xilose, uma fermentação de batelada anaeróbica foi realizada com uma cultura mista de cepa de fermentação de arabinose IMS0002 e a cepa de fermentação de xilose RWB218. Um fermentador de batelada anaeróbico contendo 800 mL de meio sintético fornecido com 30 g L'1 de D-glicose, 15 g L-1 de π-xilose, e 15 g L'1 de L-arabinose foi inoculado com 100 mL de pré-cultura da cepa IMS0002. Após 10 horas, 100 mL de inócuo de RWB218 foram adicionados. Em contraste com a fermentação de açúcar mista apenas com a cepa IMSG002, ambas xilose e arabinose foram consumidas após esgotamento da glicose (figura 5D). A cultura mista consumiu completamente todos os açúcares e dentro de 80 horas 564,0 ± 6,3 mmol L"1 de etanol (calculados da produção de CO?) foram produzidos com um rendimento total alto de 0,42 g g-1 de açúcar. Xilitol foi produzido apenas em pequenas quantidades a uma concentração de 4,7 mmol L_1.

Caracterização da cepa IMS0002 [123] O crescimento e a formação de produto da cepa IMSQQ02 foram determinados durante fermentações de batelada anaeróbicas no meio sintético tanto com L-arabinose como a única fonte de carbono ou uma mistura de glicose, xilose e L-arabinose. As pré-culturas destas fermentações de batelada anaeróbica foram preparadas em frascos de agitação contendo 100 mL de meio sintético com 2% de L-arabinose, por inoculação com soluções mestras congeladas a -80°C da cepa ΙΜΞ0002 e incubação por 48 horas a 30°C.

[124] A figura 5A mostra que a cepa IMS0002 é capaz de fermentar 20 g L_1 de L-arabinose em etanol durante uma fermentação de batelada anaeróbica de aproximadamente 70 horas. A taxa especifica de crescimento sob condições anaeróbicas com L-arabinose como a única fonte de carbono foi de 0,05 ± 0,001 h-1. Levando-se em conta a evaporação de etanol durante a fermentação em batelada, o rendimento do etanol de 20 g L_1 de arabinose foi de 0,43 ± 0,003 g g~ 1. Sem correção da evaporação, o rendimento do etanol foi 0,35 ± 0,01 g g_1 da arabinose. Nenhuma formação de arabinitol foi observada durante crescimento anaeróbico na arabinose.

[125] Na figura 5B, é mostrada a fermentação etanólica de uma mistura de 20 g Ir1 de glicose e 20 g L-1 de L-arabinose pela cepa IMS0002. O consumo de L-arabinose iniciou após esgotamento da glicose. Dentro de 70 horas, ambas a glicose e a L-arabinose estavam completamente esgotadas. O rendimento do etanol do total de açúcares foi de 0,42 + 0,003 g g_1.

[126] Na figura 5C, é mostrado o perfil de fermentação de uma mistura de 30 g L_1 de glicose, 15 g L-1 de D-xilose e 15 g L_1 de L-arabinose pela cepa IMS0002. O consumo de arabinose foi iniciado após esgotamento da glicose. Dentro de 8 0 horas, ambas a glicose e a arabinose foram completamente esgotadas. Apenas 20 mM de 100 mM de xilose foram consumidos pela cepa IMS0002. Além disso foi observada a formação de 20 mM de xilitol. Aparentemente, a xilose foi convertida em xilitol pela cepa IMS0002. Consequentemente, o rendimento do etanol do total de açúcares foi inferior para as fermentações descritas acima: 0,38 ± 0,001 g g_1. O rendimento do etanol do total de gi icose e arabinose foi semelhante ao de outras fermentações: 0,43 ± 0,001 g g_1.

[127] A tabela 1 mostra as taxas de consume de arabinose e as taxas de produção de etanol observadas na fermentação da batelada anaeróbica da cepa IMS0002. A arabinose foi consumida em uma taxa de 0,23 - 0,7 5 g h-1 g-1 de peso seco da biomassa. A taxa de etanol produzida da arabinose variou de 0,08 - 0,31 g h-1 g-1 do peso seco da biomassa.

[128] Inicialmente, a cepa construída IMS0001 foi capaz de fermentar xilose (dados não mostrados). Em contraste com as nossas expectativas, a cepa selecionada IMS0002 não foi capaz de fermentar xilose em etanol (figura 5) . De modo a recuperar a capacidade de fermentar xilose, uma colônia da cepa IMS0002 foi transferida para meio sólido sintético com 2% de D-xilose e foi incubada em uma jarra anaeróbica a 30°C por 25 dias. Subsequentemente uma colônia foi novamente transferida para o meio sólido sintético com 2% de arabinose. Após 4 dias de incubação a 30°C, a colônia foi transferida para um frasco de agitação contendo meio sintético com 2% de arabinose. Após incubação a 30°C por 6 dias, glicerol a 30% foi adicionado, as amostras foram retiradas e armazenadas a 80°C. Um frasco de agitação contendo 100 mL de meio sintético com 2% de arabinose foi inoculado com tal solução mestra congelada e foi usado como pré-cultura para uma fermentação de batelada anaeróbica no meio sintético com 20 g Ir1 de xilose e 20 g L-1 de arabinose. Na figura 6, o perfil de fermentação desta fermentação de batelada é mostrado. Xilose e arabinose foram consumidas simultaneamente. A arabinose foi completada dentro de 70 horas, considerando-se que a xilose foi completamente consumida em 120 horas. Pelo menos 250 mM de etanol foram produzidos do total de açúcares, não sendo levada em consideração a evaporação do etanol. Presumindo-se um peso seco de biomassa final de 3,2 g L_1 (presumindo- se um rendimento da biomassa de 0,08 g g"1 de açúcar), a concentração de etanoi estimada da produção cumulativa dê CO2 (355 mmol L_:) foi de aproximadamente 330 mmol L_1, correspondendo a um rendimento de etanoi de 0,41 g g_1 de açúcar pentose. Além do etanoi, glicerol e ácidos orgânicos, uma pequena quantidade de xilitol foi produzida (aproximadamente 5 mM).

Seleção da Cepa IM50003 [129] Inicialmente, a cepa construída IMS0001 foi capaz de fermentar xilose (dados nâo mostrados). Ao contrário das nossas expectativas, a cepa selecionada IM5QQ02 não foi capaz de fermentar xilose em etanoi (figura 5C). De modo a reconquistar a capacidade de fermentação da xilose, uma colônia da cepa IMS0002 foi transferida para meio sólido sintético com 21 de D-xilose e incubada em uma jarra anaeróbica a 30°C por 25 dias. Subsequentemente, a colônia foi novamente transferida para meio sólido sintético com 2% de arabinose. Após 4 dias de incubação a 30°C, uma colônia foi transferida para um frasco de agitação contendo meio sintético com 2% de arabinose. Após incubação a 30°C por 6 dias, glicerol a 30% foi adicionado e as amostras retiradas e armazenadas a -80°C.

[130] Desta solução mestra congelada, as amostras foram dispersar no meio sintético sólido com 2% de L-arabinose e incubadas a 30°C por vários dias. Colônias separadas foram reraiadas duas vezes em um meio sintético sólido com L-arabinose. Finalmente, um frasco de agitação contendo meio sintético com 2% de L-arabinose foi inoculado com uma colônia simples, e incubado por 4 dias a 30°C. Esta cultura foi designada como IMS0003 (CBS 121879 depositada na CBS era 20/09/07). As amostras de cultura foram retiradas, glicerol a 30% foi adicionado e as amostras armazenadas a -80°C.

Caracterização da Cepa IMS0003 [131] 0 desenvolvimento e formação de produto da cepa IMS0003 foram determinados durante a fermentação de uma batelada anaeróbica no meio sintético com uma mistura de 30 g L'1 de glicose, 15 g L"1 de D-xilose e 15 g L·"1 de L-arabinose. A pré-cultura para a fermentação de batelada anaeróbica foi preparada em frascos de agitação contendo 100 mL de meio sintético com 2% de L-arabinose, por inoculaçâo com uma solução mestra congelada a 80°C da cepa IMS0003, e incubada por 48 horas a 30eC.

[132] Na figura 7, é mostrado o perfil de fermentação de uma mistura de 30 g L_1 de glicose, 15 g L_1 de D-xilose e 15 g L-1 de L-arabinose por cepa de IMS0003. O consumo de arabinose iniciou após esgotamento de glicose. Dentro de 70 horas, a glicose, xilose e arabinose foram completamente esgotadas. Xilose e arabinose foram consumidas simultaneamente. Pelo menos 406 mM de etanol foram produzidos dos açúcares totais, não levando em consideração a evaporação do etanol. A concentração de etanol final calculada da produção cumulativa de CO; foi de 572 mmol L_1, correspondendo a um rendimento de etanol de 0,46 g g_1 dé açúcar total. Em contraste com a fermentação da mistura de glicose, xilose e arabinose pela cepa de IMS0002 {figura 5C) ou uma cultura misturada das cepas IMSQ002 e RWB218 (figura 5D) , cepa ΙΜΞ0003 não produziu quantidades desejáveis de xilitol.

TABELAS

Tabela 1: Cepas de S, cerevisiae empregadas ________Tabela 3: oliqos empregados neste trabalho___________ Tabela 4: [133] Taxas de consumo máximas observadas específicas para glicose e arabinose e taxas de produção de etanol durante fermentações de batelada anaeróbicas de S. cerevisiae IMSQQQ2.

Qgiu: taxa de consumo especifica de glicose cjarà* taxa de consumo especifica de arabinose cjeth, giu * taxa de produção específica para etanol durante desenvolvimento em glicose : taxa de produção específica para etanol durante desenvolvimento em arabinose Lista de Referências Andreasen AA, Stier TJ (1954) Anaerobic nutrition o £ Saccharomyces cer&visiae. II. Unsaturated fatty acid requirement for growth in a defined médium. J Cell Physiol 43:271-281.

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Claims

1. Célula de Saccharomyces capaz de expressar as seguintes sequências de nucleotídeo, introduzidas na mesma, caracterizada pelo fato de que a expressão dessas sequências de nucleotídeo, confere à célula de Saccharomyces a capacidade de usar L-arabinose e/ou converter L-arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em etanol: (a) uma sequência de nucleotídeo representada por SEQ ID NO:2 e suas degenerações que geram a mesma arabinose isomerase (araA) representada por SEQ ID N0:1; (b) uma sequência de nucleotídeo representada por SEQ ID NO: 4 e suas degenerações que geram a mesma L-ribuloquinase (araB) representada por SEQ ID NO:3; (c) uma sequência de nucleotídeo representada por SEQ ID NO: 6 e suas degenerações que geram a mesma L-ribulose-5-P-4-epimerase (araD) representada por SEQ ID NO: 5 ; em que a célula de Saccharomyces é adicionalmente adaptada à L-arabinose por seleção de mutantes.

2. Célula de Saccharomyces, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma, duas ou três dentre as sequências de nucleotídeo de araA, araB e araD se originam de um gênero Lactobacillus, preferivelmente uma espécie Lactobacillus plantarum.

3. Célula de Saccharomyces, de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a célula de Saccharomyces pertence a uma das espécies: 5. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus.

4. Célula de Saccharomyces, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as sequências de nucleotideo codificando araA, araB e/ou araD são ligadas operacionalmente a um promotor que causa expressão suficiente das sequências de nucleotideo correspondentes na célula para conferir à célula a capacidade de usar L-arabinose e/ou converter L-arabinose em L-ribulose, e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em etanol.

5. Célula de Saccharomyces, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o produto de fermentação é etanol.

6. Processo para produção de etanol, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fermentação de um meio contendo uma fonte de arabinose com uma célula de Saccharomyces modificada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a célula de Saccharomyces fermenta arabinose a etanol; e (b) recuperação do etanol.

7. Processo, de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o meio também contém uma fonte de glicose.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que a produtividade volumétrica de etanol é de pelo menos 0,5 g de etanol por litro por hora.

9. Processo, de acordo com reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o rendimento do etanol é de pelo menos 30%.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que o processo é anaeróbico.