BRPI0719563A2 - Ensaios diagnósticos amigáveis para terapia de câncer - Google Patents

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Stephen Kenneth Tahir
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Description

"ENSAIOS DIAGNÓSTICOS AMIGÁVEIS PARA TERAPIA DE CÂNCER" Técnica Relacionada
Esse pedido reivindica prioridade ao U.S. No. de Série 60/872.668, editado em 4 de dezembro de 2006.
Campo da Invenção
Essa invenção está relacionada a ensaios diagnósticos úteis na classificação de pacientes para a seleção da terapia do câncer, e em particular está relacionada medições das assinaturas de expressão, particularmente combinações biomarcadoras, onde as assi- naturas estão correlacionadas com responsividade à terapia do câncer e particularmente terapia por antagonista da família Bcl-2. Adicionalmente, métodos da presente invenção, e particularmente as combinações biomarcadoras, são úteis na identificação de pacientes ele- gíveis para receber terapia por antagonista da família Bcl-2 e que permitem o monitoramen- to de uma resposta do paciente a tal terapia. Fundamentos da Invenção A heterogeneidade genética do câncer é um fator complicador no desenvolvimento
de drogas eficazes contra o câncer. Cânceres que são considerados serem uma entidade de doenças única de acordo com a classificação histopatológica clássica muitas vezes reve- lam múltiplos subtipos genômicos quando submetidos ao levantamento do seu perfil molecu- lar. Em alguns casos, a classificação molecular se provou ser mais precisa que a patologia clássica. A eficácia de drogas voltadas ao tratamento do câncer pode estar correlacionada com a presença de uma característica genômica, tal como uma amplificação genética, Co- bleigh, Μ. A., et al., "Multinational study of the efficacy e safety of humanized anti-HER2 mo- noclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast câncer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease", J. Clin. Oncol., 17: 2639-2648, 1999; or a mutation, Lynch, T. J., et al., "Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiviness of non-small-cell Iung câncer to gefitinib", N. Engl. J. Med., 350: 2129-2139, 2004. Para Her-2 em câncer de mama, tem se demonstrado que a detecção da amplificação genética proporciona superiores prognóstico e informação de se- leção de tratamento como comparado com a detecção por imuno-histoquímica (IHC) da su- perexpressão da proteína, Pauletti, G., et al., "Assessment of Methods for Tissue-Based De- tection of the HER-2/neu Alteration in Human Breast Câncer: A Direct Comparison of Fluo- rescence In Situ Hybridization and Immunohistochemistry", J.Clin. Oncol., 18: 3651-3664, 2000. Dados do padrão de expressão da linhagem celular têm se mostrado serem especifi- camente preditivos quanto à sensibilidade do paciente aos quimioterápicos, Potti A., et al., Nat. Med. 2006 Epub ahead of print, PMID: 17057710. Existe portanto uma necessidade quanto a marcadores genômicos de classificação que possam melhorar a velocidade de resposta de pacientes a terapia voltada ao tratamento do câncer. A pesquisa da terapia vol- tada ao tratamento do câncer tem sido reportada contra membros da família da proteína Bcl- 2, que são os reguladores centrais da morte programada das células. Os membros da famí- lia Bcl-2s que inibem a apoptose estão superexpressados em cânceres e contribuem para a tumorigênese. A expressão de Bcl-2 tem sido fortemente correlacionada com a resistência à terapia do câncer e reduzida sobrevivência.
Um composto chamado ABT-737 é um inibidor de molécula pequena dos membros da família Bcl-2, Bcl-xl, e Bcl-w, e tem se mostrado induzir a regressão de tumores sólidos, Oltersdorf1 T., "An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumors", Natu- re, 435: 677-681, 2005. ABT-737 has been tested against a diverse panei of human câncer cell Iines and has displayed selective potency against SCLC e Iinfoma cell lines, Ibid., a estrutura química de ΑΒΤ-737's é provida por Oltersdorf et al. at p. 679.
Devido ao potencial uso terapêutico de inibidores para membros da família Bcl-2s, ensaios diagnósticos amigáveis que possam identificar pacientes elegíveis para receber terapia por inibidor da família Bcl-2 são necessários. Adicionalmente, está clara uma neces- sidade para sustentar essa terapia com ensaios diagnósticos utilizando biomarcadores que possam facilitar o monitoramento da eficácia de terapia por inibição da família Bcl-2.
Sumário da Invenção
A presente invenção está relacionada a identificação e o uso de padrões de ex- pressão gênica (ou perfis ou assinaturas), que sejam clinicamente relevantes para a terapia do câncer. Em particular, as identidades de genes que estão correlacionados com a identifi- cação, tratamento e monitoramento de pacientes para o tratamento do câncer e particular- mente terapia por antagonista da família Bcl-2.
A invenção proporciona ensaios diagnósticos amigáveis para a classificação de pa- cientes para o tratamento do câncer que compreendem avaliação em uma amostra de teci- do de paciente dos níveis de combinações biomarcadoras que se apresenta nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Os ensaios inventivos incluem ensaio métodos para identificar pacientes ele- gíveis para receber terapia por antagonista da família Bcl-2 e para monitorar a resposta do paciente a tal terapia. Os métodos da invenção compreendem a avaliação dos biomarcado- res em sangue, urina, ou outras amostras de fluido corporal por imunoensaio, ensaio prote- ômico ou hibridização de ácido nucléico ou ensaios de amplificação, e em amostras de teci- do ou outras amostras celulares corporais por imuno-histoquímica ou ensaios de hibridiza- ção in situ.
Padrões de expressão gênica da invenção são identificados como descrito adiante. De modo geral uma grande amostragem do perfil da expressão gênica de uma amostra é obtida através da quantificação dos níveis de expressão de mRNA correspondentes a mui- tos genes identificados nas combinações biomarcadoras. O perfil, ou conjunto de combina- ção é então analisado para identificar genes, a expressão dos quais está positivamente cor- relacionada com a identificação e monitoramento de pacientes elegíveis de tratamento de câncer e particularmente terapia por antagonista da família Bcl-2.
Em uma modalidade preferida, a invenção compreende um método para identificar um paciente como elegível para receber terapia do câncer, e preferentemente terapia por inibidor da família Bcl-2 compreendendo: (a) prover uma amostra do sangue periférico de um paciente; (b) determinar níveis de expressão na amostra de sangue periférico de combi- nações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; e (c) classificar os níveis de expressão relativamente aos níveis normais no sangue periférico de combinações bio- marcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; e (d) identificar o paciente como elegível para a terapia do câncer e preferentemente terapia por inibidor da família Bcl-2 on- de a amostra de sangue do paciente é classificada como possuindo elevados níveis de ex- pressão de combinações biomarcadoras que se apresenta nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Nessa modalidade, os níveis na amostra de sangue periférico são preferentemente determi- nados através de um ensaio de cadeia polimerase (PCR)1 por exemplo, ou realizados em uma amostra de biopsia de tumor canceroso.
Em uma modalidade preferida, a invenção compreende um método para identificar um paciente como elegível para a terapia do câncer e muito preferentemente terapia por inibidor da família Bcl-2 compreendendo: (a) prover uma amostra de tecido ou celular de um paciente; (b) contatar a amostra de tecido ou celular com um anticorpo ou proteína marcado capaz de se ligar às combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; (c) classificar os níveis de expressão relativamente ao normal nível normal do tecido ou celular das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; e (d) identificar o paciente como elegível para a terapia do câncer e muito preferentemente tera- pia por família Bcl-2 onde a amostra do paciente é classificada como possuindo níveis dife- renciais de membros das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, ou 6.
A invenção tem significativa capacidade para prover aperfeiçoada estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular para terapia por inibidor da família Bcl-2. A avaliação desses biomarcadores com a invenção também permite o acompanhamento das respostas individuais dos pacientes à terapia. Os ensaios inventivos têm particular utili- dade para a classificação de pacientes de carcinoma pulmonar de célula pequena (SCLC) e leucemia/linfoma.
A invenção também compreende um método preferido para o monitoramento de um paciente que está sendo tratado de câncer e preferentemente com terapia por inibidor da família Bcl-2 compreendendo: (a) prover uma amostra do sangue periférico de um paciente; (b) medir níveis de expressão na amostra de sangue periférico das combinações biomarca- doras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; e (c) determinar o nível de expressão relativamente ao nível sangüíneo basal de um paciente das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
A invenção também compreende um kit reagente para um ensaio dos níveis do RNA provenientes das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 "5 ou 6, bem como um kit reagente para os níveis de pelo menos um RNA proveniente das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A invenção tem significativa capacidade para proporcionar aprimorada estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular para terapia por inibidor da família Bcl-2. A avaliação des- ses biomarcadores com a invenção também permite o acompanhamento da resposta indivi- dual do paciente à terapia. Os ensaios inventivos têm particular utilidade para a classificação de pacientes de SCLC e linfoma.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra o perfil de expressão quanto aos grupos de combinação de bio- marcadores que diferenciam linhagens sensíveis e resistentes a ABT-737 para células de carcinoma pulmonar de célula pequena (Fig. 1-A) e células de leucemia/linfoma (Fig. 1-B).
A Figura 2 mostra o perfil de expressão quanto aos grupos de combinação de bio- marcadores que diferenciam linhagens sensíveis e resistentes a ABT-263 para células de carcinoma pulmonar de célula pequena (Fig. 2-A) e células de leucemia/linfoma (Fig. 2-B).
Descrição Detalhada da Invenção I. Geral
A invenção está baseada na descoberta pelos requerentes de gene e grupos de assinaturas genéticas em linhagens de células de câncer pulmonar de células pequenas (sele) e linhagens de células de leucemia/linfoma que se correlacionam com a resistência e sensibilidade da terapia. Em particular, os requerentes correlacionaram níveis diferenciais de expressão das novas combinações biomarcadoras, que se correlacionam com a sensibi- lidade e resistência a um inibidor da família Bcl-2.
Como usado aqui, um "inibidor da família Bcl-2" se refere a um composto terapêuti- co de qualquer tipo, incluindo composto de molécula pequena, anticorpo, anti-sentido, RNA de interferência pequena, ou compostos de base microRNA, que se ligam a pelo menos um de Bcl-2, Bcl-xl, e Bcl-w, e antagoniza a atividade do ácido nucléico ou proteína relacionados à família Bcl-2. Os métodos inventivos são úteis com qualquer inibidor da família Bcl-2 co- nhecido ou daqui em diante desenvolvido. Um inibidor da família Bcl-2 é ABT-737, N-(4-(4- ((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobenzenosulfonamida, que se liga a cada um de Bcl-2, Bcl-xl, e Bcl-w. Um outro inibidor da família Bcl-2 é ABT-263, N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5- dimetil-1-cicloex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida. A estrutura química de ABT-263 é:
Outros exemplos de compostos relacionados com a família Bcl-2 úteis na presente invenção podem ser encontrados nas Publicações Internacionais Números WO 05/049593 e WO 05/049594, ambos publicados em 2 de junho de 2005.
Os ensaios da invenção têm uso potencial com terapia voltada ao tratamento do
câncer. Em particular, os ensaios inventivos são úteis com seleção da terapia para pacien- tes de câncer pulmonar de células pequenas e leucemia/linfoma, tal como terapia com inibi- dor da família Bcl-2s. Outros exemplos de tais cânceres incluem cânceres epiteliais do teci- do sólido, por exemplo, câncer de próstata, ovário e esôfago. Os ensaios inventivos são rea- Iizados em uma amostra de tecido de paciente de qualquer tipo ou em um seu derivado, incluindo sangue periférico, tecidos tumorais ou suspeitos de tumor (incluindo recém conge- lados e fixados ou tecido encaixado em parafina), isolados celulares tal como células epiteli- ais circulatórias separadas ou identificadas em uma amostra de sangue, tecido de nodo Iin- fático, medula óssea e aspirados de agulha fina. Como usado aqui, Bcl-2 (símbolo oficial BCL2) significa o gene CLL/linfoma de cé-
lula B humana; Bcl-xl (símbolo oficial BCL2L1) significa o gene 1 tipo Bcl2 humano; Bcl-w (símbolo oficial BCL2L2) significa o gene 2 tipo Bcl2 humano.
Como usado aqui, ANXA2 (símbolo oficial ANXA2) anexina A2; CDC42EP1 (símbo- lo oficial CDC42EP1); CDC42 (símbolo oficial CDC42) proteína efetora (ligante 1 Rho GT- Pase; CNN2 (símbolo oficial CNN2) calponina 2; EPHB4 (símbolo oficial EPHB4) receptor EPH B4; F2R (símbolo oficial F2R) receptor de fator de coagulação Il (trombina); FZD2 (símbolo oficial FZD2) homólogo frizled 2 (Drosophila); GNPDA1 (símbolo oficial GNPDA1) glucosamina-6-fosfato deaminase 1; H0MER3 (símbolo oficial H0MER3) homer homólogo 3 (Drosophila); MFGE8 (símbolo oficial MFGE8) glóbulo de gordura Láctea-proteína 8 do fator EGF; MGMT (símbolo oficial MGMT) Ο-6-metilguanine-DNA metiltransferase; MME (símbolo oficial MME) membrana metalo-endopeptidase (neutral endopeptidase, encefalinase, CALLA, C); N0TCH2 (símbolo oficial NOTCH2) homólogo Notch 2 (Drosophila); PTPN 14 (símbolo oficial PTPN 14) proteína tirosina fosfatase, não receptor tipo 14; QKI (símbolo ofi- cial QKI) homólogo quaking, ligação RNA domínio KH (camundongo); RBMS2 (símbolo ofi- cial RBMS2) motivo de ligação ao RNA1 proteína interativa de fita única 2; TCF7L1 (símbolo oficial TCF7L1) fator de transcrição 7-tipo 1 (célula-T específica, HMG-box); TCF7L2 (símbo- lo oficial TCF7L2) fator de transcrição 7-tipo 2 (célula-T específica, HMG-box); VCL (símbolo oficial VCL) vinculina; VIM (símbolo oficial VIM) vinmentina; WWTRI (símbolo oficial WWTRI) regulador de transcrição 1 contendo domínio WW; ZFP36L1 (símbolo oficial ZFP36L1) pro- teína finger zinco 36, C3H tipo-como 1; PGD (símbolo oficial PGD) fosfogliconato dehidro- genase; UBE2S (símbolo oficial UBE2S) enzima conjugação ubiquitina E2S; CRYZ (símbolo oficial CRYZ) crystallin, zeta (quinone redutase); HMBS (símbolo oficial HMBS) hidroxyme- tilbilane sintase; DNAJB4 (símbolo oficial DNAJB4) DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília B1 membro 4; RAP1GA1 (símbolo oficial RAP1GA1) RAP1, proteína 1 de ativação GTPase; GCLM (símbolo oficial GCLM) glutamate-cysteine ligase, subunidade modificadora; ARG2 (símbolo oficial ARG2) arginase, tipo II; ATP7B (símbolo oficial ATP7B) ATPase1 transporta- dor Cu++, beta polipeptídeo (doença de Wilson); GCAT (símbolo oficial GCAT) glicina C- acetiltransferase (2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase); KCNH2 (símbolo oficial KCNH2) canal sincronizado-voltagem potássio, subfamília H (eag-relacionado), membro 2; TESK2 (símbolo oficial TESK2) testis-específica kinase 2; TALI (símbolo oficial TALI) célula- T leucemia linfocítica aguda 1; TNFRSF8 (símbolo oficial TNFRSF8) superfamília receptor do fator de necrose tumoral, membro 8; ATP2A3 (símbolo oficial ATP2A3) ATPase, trans- porte Ca++ , ubiquitous; TBPL1 (símbolo oficial TBPL1) TBP-tipo 1; EPHX2 (símbolo oficial EPHX2) epoxide hidrolase 2, citoplásmico; KCNH2 (símbolo oficial KCNH2) canal sincroni- zado com voltagem potássio, subfamília H (eag-relacionado), membro 2; MOCS1 (símbolo oficial MOCS1) síntese do cofator molibdênio 1; KIAA0241 (símbolo oficial KIAA0241) KIAA0241 proteína; MGC14376 (símbolo oficial MGC14376) proteína de hipótese MGC14376; YOD1 (símbolo oficial YOD1) YOD1 OTU homólogo 1 enzima desubiquinante (levedura); AGPAT1 (símbolo oficial AGPAT1) 1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferase 1 (ácido lisofosfatídico aciltransferase, alfa); RHCE (símbolo oficial RHCE) grupo de sangue Rhesus, antígenos CcEe; CDC42SE1 (símbolo oficial CDC42SE1) CDC42 efetor menor 1; TRIT1 (símbolo oficial TRIT1) tRNA isopenteniltransferase 1; YRDC (símbolo oficial YRDC) proteína induzível isquemia/reperfusão; ABHD5 (símbolo oficial ABHD5) abhidrolase domí- nio contendo 5; DDEFL1 (símbolo oficial DDEFL1) desenvolvimento e diferenciação do fator de intensificação tipo 1; CPEB1 (símbolo oficial CPEB1) proteína 1 Iigante a elemento de poliadenilação citoplásmica; CCDC21 (símbolo oficial CCDC21) domínio espiralado conten- do 21; MTL5 (símbolo oficial MTL5) metalotionein-tipo 5, testis-specifíc (tesmin); C6orf60 (símbolo oficial C6orf60) quadro de leitura aberta de cromossomo 6 60; FLJ22639 (símbolo oficial FLJ22639) proteína de hipótese FLJ22639; HBQ1 (símbolo oficial HBQ1) hemoglobi- na, theta 1; MRPS 18A (símbolo oficial MRPS 18A) proteína mitocondrial ribosomal S18A; AGPAT1 (símbolo oficial AGPAT1) 1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferase 1 (ácido Iisofos- fatídico aciltransferase, alfa); PIASI (símbolo oficial PIASI) inibidor de proteína STAT ativado, 1; PUM2 (símbolo oficial PUM2) homólogo pumilio 2 (Drosophila); SLC2A3 (símbolo oficial SLC2A3) portador soluto família 2 (transportador facilitado glicose), membro 3; fator de transcrição 7-tipo 2 (célula-T específica, HMG-box); TMBIM1 (símbolo oficial TMBIM1) moti- vo inibidor transmembrana BAX contendo 1; MOSCI (símbolo oficial MOSCI) MOCO domínio sulfurase C-terminal contendo 1; CXX1 (símbolo oficial CXX1) CAAX box 1; SYNGR3 (sím- bolo oficial SYNGR3) synaptogyrin 3; CCNGI (símbolo oficial CCNGI) ciclina G1; MGC14376 (símbolo oficial MGC14376) proteína de hipótese MGC14376; PRSS21 (símbolo oficial PRSS21) protease, serina, 21 (testisina); CASP9 (símbolo oficial CASP9) caspase 9, pepti- dase cisteína apoptose-relacionada; ALAS2 (símbolo oficial ALAS2) aminolevulinato, delta-, sintase 2 (anemia sideroblástica/hipocrômica); ST3GAL2 (símbolo oficial ST3GAL2) ST3 beta-galactosida alfa-2,3-sialiltransferase 2; BCL2L13 (símbolo oficial BCL2L13) BCL2-tipo 13 (facilitador da apoptose); PPIC (símbolo oficial PPIC) peptidilprolil isomerase C (ciclophi- Iin C); CLIC4 (símbolo oficial) canal 4 cloreto intracelular; TBPL1 (símbolo oficial TBPL1) TBP-tipo 1; HBB (símbolo oficial HBB) hemoglobina, beta Ill hemoglobina, beta; e HTATIP2 (símbolo oficial HTATIP2) HIV-1 Tat proteína interativa 2, 30 kDa. Como usado aqui, "consistindo essencialmente de se refere ao número máximo de
genes que são exigidos para o uso de um biomarcador para melhorar a estratificação of pa- cientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2. Em uma modalidade, um biomarcador para melhorar a estratificação of pacientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2 consistindo essencialmente de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou a totalidade dos biomarcadores da invenção. Em uma outra modalidade, um biomarcador para melhorar a estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2 consistindo essencialmente de qualquer um dos biomarcadores na Tabela 1. Em uma outra modalidade, um biomarcador para melhorar a estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2 consistindo essencialmente de qualquer um dos biomarcadores na Tabela 2. Em uma outra modalidade, um biomarcador para melhorar a estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2 con- sistindo essencialmente de qualquer um dos biomarcadores na Tabela 3. Em uma outra modalidade, um biomarcador para melhorar a estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2 consistindo essencialmente de qualquer um dos biomarcadores na Tabela 4. Em uma outra modalidade, um biomarcador para melhorar a estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2 consistindo essencialmente de qualquer um dos biomarcadores na Tabela 5. Em uma outra modalidade, um biomarcador para melhorar a estratificação de pacientes para a terapia do câncer, e em particular terapia por inibidor da família Bcl-2 con- sistindo essencialmente de qualquer um dos biomarcadores na Tabela 6.
As combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 podem
ser usadas sozinhas ou em combinação entre elas.
Como usado aqui, o termo "expressão diferencial" se refere a uma diferença no ní- vel da expressão do RNA de um ou mais biomarcadores da invenção, como medido pela quantidade ou nível de mRNA, e/ou um ou mais variantes emendadas do mRNA do biomar- cador em uma amostra como comparado com o nível da expressão do mesmo um ou mais biomarcadores da invenção numa segunda amostra. "Expresso diferencialmente" pode tam- bém incluir uma medição da proteína codificada pelo biomarcador da invenção em uma a- mostra ou população de amostras como comparado com a quantidade ou nível de expres- são protéica numa segunda amostra ou população de amostras. Expressão diferencial pode ser determinado como descrito aqui e como pode ser entendido por aqueles usualmente versados na técnica.
O termo "gene" se refere a um ácido nucléico (por exemplo, DNA) seqüência que compreende seqüências codificadoras necessárias para a produção de um polipeptídeo, RNA (por exemplo, incluindo mas não limitado a, mRNA, tRNA e rRNA) ou precursor (por exemplo, precursores). O polipeptídeo, RNA1 ou precursor pode ser codificado por uma se- qüência codificadora de comprimento completo ou por qualquer porção da seqüência codifi- cadora contanto que a desejada atividade ou propriedades funcionais (por exemplo, ativida- de enzimática, ligação ao ligando, transdução de sinal, etc.) do comprimento completo ou fragmento sejam mantidas. O termo também abrange a região codificadora de um gene es- trutural e as seqüências inclusas situadas adjacentes a região codificadora em ambas as terminações 5' e 3' por uma distância de cerca de 1 kb em uma o outra terminação tal que o gene corresponde ao comprimento do mRNA de comprimento completo. As seqüências que estão situadas em 5' da região de codificação e que estão presentes no mRNA são referidas como seqüências 5' não traduzidas. As seqüências que estão situadas em 3' ou mais além da região de codificação e que estão presentes no mRNA são referidas como seqüências 3' não traduzidas. O termo "gene" abrange ambas as formas cDNA e genômica de um gene. Uma forma genômica ou clone de um gene contém a região codificadora interrompida com seqüências não codificadoras denominadas "introns" ou "regiões intervenientes" ou "se- qüências intervenientes". Introns são segmentos de um gene que são transcritos no RNA nuclear (hnRNA); introns podem conter elementos regulatórios tal como melhoradores. In- trons são removidos ou "emendados" a partir do transcrito nuclear ou primário; introns por- tanto estão ausentes no transcrito RNA mensageiro (mRNA). O mRNA funciona durante a g tradução para especificar a seqüência ou ordem dos aminoácidos em um polipeptídio nas- cente.
Em particular, o termo "gene" se refere à seqüência nucleotídeo de comprimento completo. Todavia, é também pretendido que o termo abranja fragmentos da seqüência, bem como outros domínios dentro da seqüência nucleotídeo de comprimento completo. A- lém do mais, os termos "seqüência nucleotídica" ou "seqüência polinucleotídeo" abrange seqüências DNA, cDNA, e RNA (por exemplo, mRNA).
Como usado aqui, um "padrão da expressão gênica" ou "perfil da expressão gênica" ou "assinatura genética" se refere à expressão relativa dos genes correlacionados com a classificação de pacientes para a terapia do câncer e particularmente terapia por antagonis- ta da família Bcl-2, bem como a expressão da correlação genética com a responsividade e monitoramento de pacientes que experimentam terapia do câncer e particularmente terapia por inibidor da família Bcl-2. Além disso, o termos "padrão da expressão gênica" ou "perfil da expressão gênica" ou "assinatura genética" indicam esse padrão combinado dos resultados da análise do nível da expressão de dois ou mais biomarcadores da invenção incluindo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou a totalidade dos biomarcadores da invenção. Um padrão da ex- pressão gênica ou perfil da expressão gênica ou assinatura genética pode resultar a partir da medição da expressão do RNA e/ou das proteínas expressas pelo gene correspondente aos biomarcadores da invenção. No caso de RNA ele se refere aos transcritos RNA transcri- tos a partir dos correspondentes genes ao biomarcador da invenção. No caso da proteína ele se refere a proteínas traduzidas a partir dos correspondentes genes ao biomarcador da invenção. Por exemplo, técnicas para medir a expressão dos produtos RNA dos biomarca- dores da invenção incluem, métodos de base PCR (incluindo RT-PCR) e métodos não ba- seados em PCR bem como análises em microarranjos. Para medir produtos protéicos dos biomarcadores da invenção, as técnicas incluem análises western blotting e ELISA.
Pelo fato da invenção se basear na identificação que genes que são superexpres- sados, uma modalidade da invenção envolve a determinação da expressão mediante hibri- dização do mRNA, ou de uma sua versão amplificada ou clonada, de uma célula representa- tiva a um polinucleotídeo que seja único relativamente a uma seqüência genética particular. Polipeptídios preferidos desse tipo contêm pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 22, pelo menos cerca de 24, pelo menos cerca de 26, pelo menos cerca de 28, pelo menos cerca de 30, ou pelo menos cerca de 32 pares-base consecutivos de uma seqüência genéti- ca que não se encontra em outras seqüências genéticas. O termo "cerca de" como usado na sentença anterior se refere a um aumento ou redução de 1 a partir do valor numérico esta- belecido. Ainda mais preferido são polinucleotídeos de pelo menos ou cerca de 50, pelo menos ou cerca de 100, pelo menos cerca de ou 150, pelo menos ou cerca de 200, pelo menos ou cerca de 250, pelo menos ou cerca de 300, pelo menos ou cerca de 350, pelo menos ou cerca de 400, pelo menos ou cerca de 450, ou pelo menos ou cerca de 500 bases consecutivas de uma seqüência que não se encontra em outras seqüências genéticas. O termo "cerca de" como usado na sentença anterior se refere a um aumento ou redução de 10% a partir do valor numérico estabelecido. Polinucleotídeos maiores podem naturalmente conter menores incompatibilidades (por exemplo através da presença de mutações), que não influenciem a hibridização aos ácidos nucléicos de uma amostra. Tais polinucleotídeos podem ser também referidos como sondas polinucleotídeos que sejam capazes de se hibri- dizar às seqüências dos genes, ou partes únicas deles, descrito aqui. Tais polinucleotídeos podem ser marcados para ajudar na detecção deles. Preferentemente, as seqüências são aquelas do mRNA codificado pelos genes, o correspondente cDNA a tais mRNAs, e/ou ver- sões amplificadas de tais seqüências. Em modalidades preferidas da invenção, as sondas polinucleotídeos são imobilizadas em um arranjo, outros dispositivos suporte sólidos, ou em pontos individuais que alocam as sondas.
Em uma outra modalidade da invenção, a totalidade ou parte de uma seqüência re- velada pode ser amplificada e detectada através de métodos tal como a reação da cadeia polimerase (PCR) e suas variações, tal como, mas não limitado a, PCR quantitativa (Q- PCR), PCR de transcrição reversa (RT-PCR), e PCR em tempo reação, opcionalmente RT- PCR em tempo real. Tais métodos podem utilizar um ou dois iniciadores que sejam com- plementários às porções de uma seqüência revelada, onde os iniciadores são usados para dar início à síntese do ácido nucléico. Os ácidos nucléicos recém sintetizados são opcional- mente marcados e podem ser detectados diretamente ou por hibridização a um polinucleotí- deo da invenção. Os ácidos nucléicos recém sintetizados podem ser contatados com polinu- cleotídeos (seqüências portadoras) da invenção sob condições que permitam quanto a sua hibridização.
Alternativamente, e em ainda uma outra modalidade da invenção, a expressão gê-
nica pode ser determinada através da análise da proteína expressa em uma amostra celular de interesse pelo uso de um ou mais anticorpos específicos para um ou mais epitopos de produtos genéticos individuais (proteínas) na referida amostra celular. Tais anticorpos são preferentemente marcados para permitir sua fácil detecção após ligação ao produto genéti- co.
Como usado aqui, o termo "em combinação" quando referindo a tratamentos tera- pêuticos se refere ao uso de mais que um tipo de terapia (por exemplo, mais que um agente profilático e/ou agente terapêutico). O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem na qual as terapias (por exemplo, agentes profiláticos e/ou terapêuticos) são administradas a um indivíduo. Uma primeira terapia (por exemplo, um primeiro agente profilático ou tera- pêutico) pode ser administrado antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), de forma concomitante com, ou subsequente to (por exemplo, 5 mi- nutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 se- manas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas após) a administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico) a um indivíduo.
Além disso, terapia por inibidor da família Bcl-2 may também ser administrada em combinação com um ou mais que um agente terapêutico adicional, em que agentes terapêuticos adicionais incluem radiação ou agentes quimioterápicos, em que agentes quimioterápicos incluem, mas não se limitam a, carboplatin, cisplatin, ciclofosfamide, dacarbazine, dexametasone, docetaxel, doxorubicin, etoposide, fludarabine, irinotecan, CHOP (C: Cytoxan® (ciclofosfamide); H: Adiamycin® (hidroxy doxorubicin); O: Vincristine (Oncovin®); P: prednisone), paclitaxel, rapamycin, Rituxin® (rituximab) e vincristine.
Como usado aqui, o termo "nível de expressão" quando referindo a RNA se refere à quantidade mensurável de um dado ácido nucléico como determinado por hibridização ou medições tal como RT PCR em tempo real, que inclui o uso de ambas as tecnologias SYBR.RTM. green e TaqMan.RTM., e que corresponde em proporção direta com a exten- são até a qual o gene está expresso. O nível da expressão de um ácido nucléico é determi- nado através de métodos bem conhecidos na arte. Para análise por microarranjos, o nível da expressão é medido por análise de hibridização utilizando ácidos nucléicos marcados correspondentes a RNA isolado a partir de um ou mais indivíduos de acordo com métodos bem conhecidos na arte. O marcador no ácido nucléico usado para hibridização pode ser um marcador luminescente, um marcador enzimático, um marcador radioativo, um marcador químico ou um marcador físico. Preferentemente, os ácidos nucléicos tidos por alvo são marcados com uma molécula fluorescente. Marcadores fluorescentes preferidos incluem, mas não se limitam a: fluoresceína, ácido acético amino cumarina, isotiocianato de tetrame- tilrodamina (TRITC), Texas Red, Cyanine 3 (Cy3) e Cyanine 5 (Cy5).
O termo "marcador" se refere a uma composição capaz de produzir um sinal detec- tável indicativo da presença da molécula marcadora. Marcadores adequados incluem radioi- sótopos, cromóforos nucleotídeos, enzimas, substratos, moléculas fluorescentes, frações quimioluminescentes, partículas magnéticas, frações bioluminescentes, e semelhantes. Co- mo tal, um marcador é qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, foto- químicos, bioquímicos, inunoquímicos, elétricos, óticos ou químicos.
Um "microarranjo" se refere a um arranjo ordenado de elementos ordenados hibri- dizáveis, preferentemente sondas polinucleotídeos, em um suporte.
Como usado aqui, o termo "símbolo oficial" se refere a base de dados EntrezGene mantidas pelo United States National Centerfor Biotechnology Informtion. O termo "suporte" se refere a suportes convencionais, tal como microesferas, partí- culas, varetas de medida, fibras, filtros membranas e suportes silano ou silicato tal como lâminas de vidro.
A invenção compreende ensaios diagnósticos realizados em uma amostra de tecido de paciente de qualquer tipo ou um seu derivado, incluindo sangue periférico, tecidos tumo- rais ou suspeitos de tumor (incluindo recém congelados e fixados ou tecido encaixado em parafina), isolados celulares tal como células epiteliais circulatórias separadas ou identifica- das em uma amostra de sangue. Tecido de nodo linfático, medula óssea e aspirados de agulha fina. Amostras preferidas de tecidos para uso aqui são sangue periférico, tecido tu- moral ou suspeito de tumor e medula óssea.
II. Biomarcadores de Inibidorda Família Bcl-2
Os requerentes identificaram novas combinações biomarcadoras úteis para estrati- ficar e/ou monitorar a resposta do paciente para a terapia do câncer e particularmente à te- rapia por inibidor da família Bcl-2.
A invenção compreende a avaliação em uma amostra de tecido de paciente dos ní- veis dos genes nos conjuntos de biomarcadores, através da medição desses genes nos seus níveis expressos de proteína ou de mensageiro RNA traduzidos.
Esses biomarcadores genômicos foram identificados pelos requerentes através da análise da expressão gênica de slc humano e linhagens de células de leucemia/linfoma u- sada para testar inibidores Bcl-2 in vitro e in vivo e investigação da significação clínica deles. Essas combinações genômicas biomarcadoras são de particular interesse para uso em en- saios diagnósticos amigáveis para a utilização de ABT-737 e ABT-263.
Particularmente, os requerentes identificaram novas combinações biomarcadoras que discriminam entre grupos de linhagens celulares, sele (Ver TABELA 1) e leucemi- a/linfoma (Ver TABELA 2) que demonstram sensibilidade e resistência a ABT-737.
Conjunto de Assinaturas de Biomarcador ABT-737 SLC
TABELA 1
Identificação Affymetrix Nome do Gene Genbank Descrição 201590_x_at ANXA2 NM 004039 anexina A2 210427_x_at ANXA2 BC001388 anexina A2 213503_x_at ANXA2 BE908217 anexina A2 204693_at CDC42EP1 NM 007061 CDC42 proteína efetora (ligante Rho GTPase) 1 201605_x_at CNN2 NM 004368 calponin 2 202894_at EPHB4 NM 004444 EPH receptor B4 203989_x_at F2R NM 001992 Receptor do fator de coagulação Il (trombina) 210220_at FZD2 L37882 frizzled homólogo 2 (DrosophiIa) 202382_s_at GNPDA1 NM 005471 glucosamine-6-fosfato deaminase 1 215489_x_at HOMER3 AI871287 homer homólogo 3 (DrosophiIa) 210605_s_at MFGE8 BC003610 glóbulo de gordura láctea-EGF factor 8 proteína 204880_at MGMT NM 002412 Ο-6-metilguanine-DNA meti Itransferase membrana metalo-endopeptidase (neutral endopeptidase 203434_s_at MME NM 007287 enkephalinase, CALLA1 CD10 202443_x_at NOTCH2 AA291203 homólogo Notch 2 (DrosophiIa) homólogo Notch 2 (DrosophiIa) Ill homólogo Notch 2 210756_s_at NOTCH2 AF308601 (DrosophiIa) 212377_s_at NOTCH2 AU158495 homólogo Noteh 2 (DrosophiIa) 214722_at NOTCH2NL AW516297 homólogo Noteh 2 (DrosophiIa) tipo N- terminal 205503_at PTPN14 NM 005401 proteína tirosina fosfatase, não-receptor tipo 14 212262_at QKI AA149639 homólogo quaking, Iigante RNA domínio KH (camundongo) 205228_at RBMS2 NM 002898 motivo de ligação ao RNA1 single stranded proteína interativa 2 221016_s_at TCF7L1 NM 031283 fator de transcrição 7-tipo 1 (célula-T específica, HMG-box) 212761_at TCF7L2 AI949687 fator de transcrição 7-tipo 2 (célula-T específica, HMG-box) 212762_s_at TCF7L2 AI375916 fator de transcrição 7-tipo 2 (célula-T específica, HMG-box) 216035_x_at TCF7L2 AV721430 fator de transcrição 7-tipo 2 (célula-T específica, HMG-box) 216037_x_at TCF7L2 AA664011 fator de transcrição 7-tipo-2 (célula-T específica, HMG-box) 216511_s_at TCF7L2 AJ270770 fator de transcrição 7-tipo 2 (célula-T específica, HMG-box) 200931_s_at VCL NM 014000 vinculina 201426_s_at VIM AI922599 vinmentina 202133_at WWTR1 BF674349 regulador de transcrição 1 contendo domínio WW 211962_s_at ZFP36L1 BG250310 Proteína finger zinco 36, tipo C3H-tipo 1 Conjunto de Assinaturas de Biomarcador ABT-737 Leucemia/linfoma TABELA 2 Identificação Affymetrix Nome do Gene Genbank Descrição 201118_at PGD NM 002631 fosfogliconato dehidrogenase Ill fosfogliconato dehidrogenase 202779_s_at UBE2S NM 014501 enzima conjugação ubiquitina E2S 202950_at CRYZ NM 001889 crystallin, zeta (quinone redutase) 203040_s_at HMBS NM 000190 hidroxymetilbilane sintase 203810_at DNAJB4 BG252490 DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília B, membro 4 203911_at RAP1GA1 NM 002885 RAP1, GTPase activating proteína 1 203925_at GCLM NM 002061 glutamate-cysteine ligase, subunidade modificadora 203946_s_at ARG2 NM 001172 arginase, tipo Il 204624_at ATP7B NM 000053 ATPase1 Cu++ transporting, beta polipeptídeo (doença de Wilson) 205164_at GCAT NM 014291 glicina C-acetiltransferase (2-amino-3- ketobutyrate coenzyme A ligase) 205262_at KCNH2 NM 000238 canal sincronizado com voltagem potás- sio, subfamília H (eag-relacionado), membro 2 205486_at TESK2 NM 007170 kinase 2 testis-específica 206283_s_at TAL 1 NM 003189 Leucemia linfocítica aguda 1 de célula-T 206729_at TNFRSF8 NM 001243 Sperfamília de receptor de fator de necrose tumoral, membro 8 207522_s_at ATP2A3 NM 005173 ATPase1 Ca++ transporting, ubiquitous 208398_s_at TBPL1 NM 004865 TBP-tipo 1 209368_at EPHX2 AF233336 Epóxido hidrolase 2, citoplásmico 210036_s_at KCNH2 AB044806 canal sincronizado com voltagem potás- sio, subfamília H (eag-relacionado), membro 2 211673_s_at MOCS1 AF034374 síntese do cofator molibdênio 1 Ill síntese do cofator molibdênio 1 212475_at KIAA0241 AI797458 Proteína KIAA0241 213036_x_at ATP2A3 Y15724 ATPase, Ca++ transporting, ubiquitous 214696_at MGC14376 AF070569 proteína de hipótese MGC14376 215150_at YOD 1 AF090896 Homólogo 1 de YOD1 OTU deubiquinating enzima (levedura) 215535_s_at AGPAT1 AF007145 i-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferase 1 (ácido lisofosfatídico aciltransferase, alfa) 216317_x_at RHCE X63095 Antígenos CcEe de sangue de macaco Rhesus 218157_x_at CDC42SE1 NM 020239 CDC42 efetor menor 1 218617_at TRIT1 NM 017646 tRNA isopenteniltransferase 1 218647_s_at YRDC BE464161 proteína induzível isquemia/reperfusão 218739_at ABHD5 NM 016006 domínio abhidrolase contendo 5 219103_at DDEFL1 NM 017707 Fator de melhora do desenvolvimento e diferenciação-tipo 1 219578_s_at CPEB1 AF329403 cytoplasmic polyadenilation element binding proteína 1 219611_s_at CCDC21 NM 022778 Domínio espiralado contendo 21 219786_at MTL5 NM 004923 metalothionein-tipo 5, testis-específica (tesmin) 220150_s_at C6orf60 NM 024581 cromossoma 6 quadro de leitura aberta 60 220399_at FLJ22639 NM 024796 proteína de hipótese FLJ22639 220807_at HBQ1 NM 005331 hemoglobina, theta 1 Ill hemoglobina, theta 1 221693_s_at MRPS18A AB049952 proteína ribossomal mitocondrial S18A Ill proteína ribossomal mitocondrial S18A 32836_at AGPAT1 U56417 1 -acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferase 1 (ácido lisofosfatídico aciltransferase, alfa) 217862_at PIAS1 N24868 Inibidor proteína de STAT ativado, 1 216221_s_at PU M2 D87078 Homólogo pumilio 2 (DrosophiIa)
Os requerentes também identificaram combinações biomarcadoras que apresentam sensibilidade e resistência a ABT-263 e que também discriminam entre linhagens de células, sele (Ver TABELAS 3 e 4) e leucemia/linfoma (Ver TABELAS 5 e 6). Conjunto de Assinaturas de Biomarcador ABT-263 SLC TABELA 3
Identificação Affymetrix Nome do Gene Genbank Descrição 210605_s_at MFGE8 BC003610 glóbulo de gordura láctea-EGF factor 8 proteína 202443_x_at NOTCH2 NM 024408 homólogo Notch 2 (DrosophiIa) 203435_s_at MME NM 007287 membrana metalo-endopeptidase (neutral endopeptidase, enkephalinase, CALLA1 CD 10) 210220 at FZD2 L37882 frizzled homólogo 2 (DrosophiIa)
TABELA 4
Identificação Affymetrix Nome do Gene Genbank Descrição 202499_s_at SLC2A3 NM 006931 Veículo soluto família 2 (transporador glicose facilitado), membro 3 221016_s_at TCF7L1 NM 031283 fator de transcrição 7-tipo 1 (célula-T específica, HMG-box) 217730_at TMBIM1 NM 022152 motivo transmembranum inibidor BAX contendo 1 218865_at MOSC1 NM 022746 domínio sulfurase C-terminal MOCO contendo 1
Conjunto de Assinaturas de Biomarcador ABT-263 Leucemia/linfoma TABELA 5
Identificação Affymetrix Nome do Gene Genbank Descrição 201828_x_at CXX 1 NM 003928 CAAX box 1 205691_at SYNGR3 NM 004209 synaptogyrin 3 208796_s_at CCNG1 BC000196 ciclin G1 214696_at MGC14376 AF070569 proteína de hipótese MGC14376 220051_at PRSS21 NM 006799 protease, serina, 21 (testisina)
TABELA 6 Identificação Affymetrix Nome do Gene Genbank Descrição 210775_x_at CASP9 ABO15653 caspase 9, cisteína peptidase apoptosis- relacionado 211560_s_at ALAS2 AF130113 aminolevulinate, delta-, sintase 2 (sideroblastic/hypochromic anemia) 217650_x_at ST3GAL2 AI088162 ST3 beta-galactosida alfa-2,3- sialiltransferase 2 217955_at BCL2L13 NM 015367 BCL2-tipo 13 (apoptosis facilitator) 204517_at PPIC BE962749 peptidilprolil isomerase C (ciclophilin C) 201559_s_at CLIC4 AF109196 Canal 4 cloreto intracelular 208398_s_at TBPL1 NM 004865 TBP-tipo 1 209116_x_at HBB M25079 hemoglobina, beta Ill hemoglobina, beta 207180_s_at HTATIP2 NM 006410 HIV-1 Tat proteína interativa 2, 30 kDa
III. Ensaios
Os ensaios inventivos incluem ensaios tanto para selecionar pacientes elegíveis pa- ra receber terapia por inibidor da família Bcl-2 e ensaios to monitor a resposta do paciente.
Ensaios para predição de resposta são corridos antes da seleção da terapia e pacientes »
com elevados níveis são elegíveis para receber terapia por inibidor da família Bcl-2. Para o monitoramento da resposta do paciente, o ensaio é realizado no começo da terapia para estabelecer níveis basais do biomarcador em uma amostra de tecido. O mesmo tecido é então amostrado e ensaiado e os níveis do biomarcador comparado com a base referencial. Onde os níveis permanecerem iguais ou reduzirem, a terapia é possível de ser eficaz e pode ser continuada. Onde ocorrer significativo aumento do nível basal, o paciente pode não ser responsivo.
Os ensaios da presente invenção podem ser realizados através de métodos de en- saios protéicos e através de métodos de ensaios de ácidos nucléicos. Qualquer tipo de um ou outro ensaio por proteína ou por ácidos nucléicos pode ser usado. Métodos de ensaios protéicos úteis na invenção são bem conhecidos na arte e compreendem (i) métodos imu- noensaios envolvendo a ligação de um anticorpo ou proteína marcada à proteína expressa ou fragmento de genes no conjunto biomarcador, (ii) métodos de espectrometria de massa para determinar a proteína expressa ou fragmentos desses biomarcadores, e (iii) ensaios de base proteômica ou de "fragmento proteína". Métodos imunoensaios úteis incluem tanto en- saios de fase solução conduzidos utilizando qualquer formato conhecido na arte, tal como, mas não limitado a, um formato ELISA, um formato sanduíche, um formato de inibição com- petitiva (incluindo tanto ensaios de inibição competitiva direta e reversa) ou um formato de polarização de fluorescência, e ensaios de fase sólida tal como imuno-histoquímica (referido como "IHC").
Métodos IHC são ensaios particularmente preferidos. IHC é um método de detectar a presença de proteínas específicas em células ou tecidos e consiste das seguintes etapas: 1) uma lâmina é preparada com o tecido a ser pesquisado; 2) um anticorpo primário é apli- cado à lâmina e se liga ao antígeno específico; 2) o resultante complexo antígeno-anticorpo é unido por um secundário anticorpo enzima-conjugado; 3) em presença do substrato e cromógeno, a enzima forma um depósito colorido (uma "mancha") nos locais de ligação an- tígeno-anticorpo; e 4) a lâmina é examinada sob um microscópio para identificar a presença de e a extensão da mancha.
Métodos de ensaio de ácidos nucléicos úteis na invenção são também bem conhe- cidos na arte e compreendem (i) ensaios de hibridização in situ em amostras celulares ou de tecido intacto para detectar os níveis de mRNA, (ii) ensaios de hibridização por microarran- jos para detectar os níveis de mRNA, (iii) ensaios RT-PCR ou outros ensaios de amplifica- ção para detectar os níveis de mRNA. Ensaios utilizando análogos sintéticos de ácidos nu- cléicos, tal como ácidos peptido nucléicos, em qualquer desses formatos podem ser também utilizados.
O ensaio da presente invenção também provê quanto a detecção dos biomarcado- res genômicos mediante ensaios de hibridização utilizando sondas de base ácido nucléico marcadas de modo possível de detecção, tal como sondas de ácido desoxiribonucleico (DNA) ou sondas de proteína de ácido nucléico (PNA), ou iniciadores não marcados que sejam projetados/selecionados para hibridizar ao específico alvo genético projetado. Os ini- ciadores não marcados são usados em ensaios de amplificação, tal como pela reação da cadeia polimerase (PCR), em que após ligação do iniciador, uma polimerase amplifica a seqüência ácido nucléico alvo para a subsequente detecção. As sondas de detecção usadas em PCR ou outros ensaios de amplificação são preferentemente fluorescentes, e ainda mais preferentemente, sondas de detecção úteis em "PCR em tempo real". Marcadores fluores- centes são também preferidos para uso em hibridização in situ, mas outros marcadores de- tectáveis comumente usados em técnicas de hibridização,-por exemplo, marcadores enzi- máticos, cromogênicos e isotópicos, podem ser também utilizados. Tcnas úteis de marcação de sondas são descritas em Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, Y.-S. Fan, Ed., Chap. 2, "Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets", L. Morrison et.al., p. 21-40, Humana Press, ©2002.
Uma modalidade adicional dos níveis de expressão gênica das combinações bio- marcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 pode ser avaliada utilizando arran- jos baseados em ácidos nucléicos, tal como por exemplo, arranjos cDNA ou oligonucleotí- deo, ou arranjos protéicos. Arranjos ácidos nucléicos permitem quanto a detecção quantitativa dos níveis de expressão de um grande número de genes ao mesmo tempo. Exemplos time. Exemplos de arranjos ácidos nucléicos incluem, mas não se limitam a, Genechip® microarranjos da Affy- metrix (Santa Clara, CA), cDNA microarranjos da Agilent Technologies (Paio Alto, CA), e arranjos microesferas descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.288.220 e 6.391.562.
Os polinucleotídeos a serem hibridizados a um arranjo ácido nucléico podem ser marcados com uma ou mais frações marcadoras para permitir a detecção de complexos polinucleotídeos hibridizados. As frações de marcação podem incluir composições que se- jam detectáveis por meio espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, bioelétricos, imuno- químicos, elétricos, óticos ou químicos. Frações de marcação representativas incluem com- postos radioisótipos, quimioluminescentes, proteínas Iigantes marcadas, átomos de metais pesados, marcadores espectroscópicos, tal como marcadores e corantes fluorescentes, marcadores magnéticos, enzimas ligadas, etiquetas de espectrometria de massa, marcado- res de spin, doadores e receptores de transferência eletrônica, e semelhantes. Polinucleotí- deos não marcados podem ser também empregados. Os polinucleotídeos podem ser DNA, RNA, ou uma sua forma modificada.
Reações de hibridização podem ser realizadas em formatos de hibridização absolu- ta ou diferencial. No formato de hibridização absoluta, polinucleotídeos preparados a partir de uma amostra, tal como sangue periférico, tecidos tumorais ou suspeitos de tumor, ou isolados celulares tal como células epiteliais circulatórias separadas ou identificadas em uma amostra de sangue, em um momento específico durante o transcurso de um tratamento anti-câncer tratamento, são hibridizadas a um arranjo ácido nucléico. Sinais detectados após a formação dos complexos de hibridização indicam esses níveis de polinucleotídeos na a- mostra. Em uma modalidade, os fluoróforos Cy3 e Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech, Pis- cataway N.J.) são usados como frações de marcação para o formato de hibridização dife- rencial.
Sinais recolhidos provenientes de um arranjo ácido nucléico podem ser analisados utilizando software comercialmente disponível, tal como aqueles providos por Affymetric ou Agilent Technologies. Controles, tal como para sensibilidade da varredura, etiquetagem da sonda e quantificação de cDNA/cRNA, podem ser inclusos nos experimentos de hibridiza- ção. Em muitas modalidades, os sinais de expressão do ácido nucléico são escalonados ou normalizados antes de serem submetidos a análise adicional. Por exemplo, os sinais de ex- pressão para cada gene pode ser normalizado para levar em conta variações nas intensida- des de hibridização quando mais que um arranjo é usado sob condições similares de teste. Sinais para a hibridização de complexos polinucleotídeos individuais podem ser também normalizados usando as intesidades derivadas a partir de controles internos de normaliza- ção contidas em cada arranjo. Adicionalmente, genes com níveis de expressão relativamen- te consistentes no transcurso das amostras podem ser usados para normalizar os níveis de expressão de outros genes. Em uma modalidade, os níveis de expressão dos genes são normalizados no transcurso das amostras tal que a média seja zero e o desvio padrão seja um. Em uma outra modalidade, um dado de expressão detectado por arranjos ácidos nu- cléicos são submetidos a um filtro de variação que exclui genes que demonstram variação mínima ou insignificante no transcurso de todas as amostras.
IV. Processamento da Amostra e Performance do Ensaio
A amostra de tecido a ser ensaiada pelos métodos inventivos pode compreender qualquer tipo, incluindo uma amostra do sangue periférico, um tecido tumoral ou um tecido com suspeita de tumor, a amostra citológica de camada fina, uma amostra de aspirado de agulha fina, uma amostra de medula óssea, uma amostra de nodo linfático, uma amostra de urina, uma amostra de ascites, uma amostra de lavagem, uma amostra de esfregaço esofá- gico, uma amostra de lavagem de bexiga ou pulmão, uma amostra de fluido espinhal, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de aspirado ductal, uma amostra da descarga do mamilo, uma amostra da efusão pleural, uma amostra de tecido recém congelado, uma a- mostra de tecido encaixado em parafina ou uma amostra extraída ou processada produzida a partir de qualquer de uma amostra do sangue periférico, um tecido tumoral ou um tecido com suspeita de tumor, uma amostra citológica de camada fina, uma amostra de aspirado de agulha fina, uma amostra de medula óssea, uma amostra de nodo linfático, uma amostra de urina, uma amostra de ascites, uma amostra de lavagem, uma amostra de esfregaço esofágico, uma amostra de lavagem de bexiga ou pulmão, uma amostra de fluido espinhal, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de aspirado ductal, uma amostra da descarga do mamilo, uma amostra da efusão pleural, uma amostra de tecido recém congelado ou uma amostra de tecido encaixado em parafina. Por exemplo, uma amostra do sangue perifé- rico de um paciente pode ser inicialmente processada para extrair uma população de células epiteliais, e esse extrato pode ser então ensaiado. Uma microdissecção de uma amostra de tecido para obter uma amostra celular enriquecida com células tumorais suspeitas pode ser também utilizada. Amostras preferidas de tecidos para uso aqui são sangue periférico, teci- do tumoral ou tecido com suspeita de tumor, incluindo aspirados de agulha fina, tecido re- cém congelado e tecido encaixado em parafina, e medula óssea.
A amostra de tecido pode ser processada por qualquer método desejável para rea- lizar a hibridização in situ ou outros ensaios ácido nucléico. Para os preferidos ensaios de hibridização in situ, uma amostra de tumor ou amostra de medula óssea encaixada em para- fina é fixada em uma lâmina de vidro para microscópio e desparafinizada com um solvente, tipicamente xileno. Protocolos úteis para a desparafinização do tecido e hibridização in situ estão disponíveis da Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, Illinois). Qualquer instrumentação ou automação adequada pode ser usada na realização dos ensaios inventivos. Ensaios de base PCR podem ser realizados no sistema de instrumentos m2000 (Abbott Molecular, Des Plaines, IL). A imagiologia automatizada pode ser empregada para os preferidos ensaios de hibridização in situ.
Em uma modalidade, a amostra compreende uma amostra do sangue periférico de um paciente que é processada para produzir um extrato de células tumorais circulantes que possui aumentada expressão dos genes biomarcadores. As células tumorais circulantes podem ser separadas por tecnologia de separação imunomagnética tal como aquela dispo- nível da Immunicon (Huntingdon Valley, Pennsylvania). O número de células tumorais circu- lantes que demonstram alterada expressão de genes biomarcadores é então comparado ao nível basal de células tumorais circulantes que possuem alterada expressão de genes bio- marcadores determinadas preferentemente no início da terapia.
Amostras de teste podem compreender qualquer número de células que seja sufici- ente para um diagnóstico clínico, e contêm tipicamente pelo menos cerca de 100 células.
V. Kits de Ensaio
Em um outro aspecto, a invenção compreende kits de imunoensaio para a detecção
de quais kits compreendem um anticorpo marcado ou proteína específica marcada para li- gação aos genes no conjunto de biomarcadores. Esses kits podem também incluir um rea- gente de captura de anticorpo ou reagente indicador de anticorpo útil para realizar um imu- noensaio do tipo sanduíche. Kits preferidos da invenção compreendem recipientes conten- do, respectivamente, pelo menos um anticorpo capaz de se ligar especificamente a pelo menos um dos biomarcadores no conjunto, e um gene controle. Qualquer composição con- trole adequada para o particular ensaio biomarcador pode ser incluso nos kits da invenção. As composições de controle compreendem geralmente o biomarcador a ser ensaiado jun- tamente com quaisquer aditivos desejáveis. Um ou mais recipientes adicionais podem confi- nar elementos, tais como reagentes ou tampões, a serem usados no ensaio. Tais kits po- dem também, ou alternativamente, conter um reagente de detecção como descrito acima que contém um grupo mensageiro para a detecção direta ou indireta da ligação ao anticor- po.
Alternativamente, um kit pode ser projetado para detectar o nível do mRNA que co- difica os genes apresentados nas combinações biomarcadoras da presente invenção. Tais kits compreendem geralmente pelo menos uma sonda ou iniciador oligonucleotídeo, e prefe- rentemente conjuntos oligonucleotídeo correspondentes aos grupos de combinação de bio- marcadores que se apresenta nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 como descrito acima que hibri- dizam a um polinucleotídeo que codifica uma proteína. Tais oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, dentro de um ensaio PCR ou de hibridização. Componentes adicio- nais que podem estar presentes dentro de tais kits incluem um segundo oligonucleotídeo, ou um conjunto de oligonucleotídeos correspondente às combinações biomarcadoras apresen- tadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, e/ou um reagente diagnóstico ou recipiente para facilitar a detecção de um polinucleotídeo que codifica uma proteína tumoral.
VI. Bases de dados
Em ainda um aspecto adicional a invenção inclui bases de dados relacionais con- tendo informação da seqüência, por exemplo para um ou mais dos genes das Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, bem como informação da expressão gênica em diversas amostras de tecido de câncer de pulmão e leucemia/linfoma. As bases de dados podem também conter informação associada com uma dada seqüência ou amostra de tecido tal como informação descritiva acerca do gene associada com a informação da seqüência, informação descritiva com res- peito ao status clínico de uma amostra de tecido, ou informação com respeito ao paciente a partir do qual a amostra foi derivada. A base de dados pode ser projetada para incluir dife- rentes partes, por exemplo, uma base de dados da seqüência e uma base de dados da ex- pressão gênica. As bases de dados da invenção podem ser armazenadas em qualquer meio legível por computador disponível. Métodos para a configuração e construção de tais bases de dados são amplamente disponíveis, por exemplo, ver Akerblom et al, (Patente U.S. No. 5.953.727).
As bases de dados da invenção podem estar ligadas a uma base de dados ao lado de fora ou externa. Em uma modalidade preferida, como descrito nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 a base de dados externa é GenBank e as bases de dados associadas mantidas pelo National Center for Biotechnology Information or NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/). Outras bases de dados externas que podem ser usadas na invenção incluem aquelas provi- das por Chemical Abstracts Service
(http://stnweb.cas.org/) ou Incyte Genomics (http://www.incyte. com/sequence/index. shtml). Qualquer plataforma computacional apropriada pode ser usada para realizar as ne-
cessárias comparações entre a informação da seqüência, informação da expressão gênica e qualquer outra informação na base de dados ou provida como uma entrada de dados. Por exemplo, um grande número de estações computacionais de trabalho são disponíveis de uma variedade de fabricantes, tais como aqueles disponíveis da Silicon Graphics. Ambien- tes cliente-servidor, servidores de base de dados e redes são também amplamente disponí- veis e plataformas apropriadas para as bases de dados da invenção.
As bases de dados da invenção podem ser usadas para produzir, entre outras coi- sas, Northern blots eletrônicos (E-Northerns) para permitir ao usuário determinar o tipo ou tecido celular no qual um dado gene é expresso e para permitir a determinação da abun- dancia ou nível da expressão de um dado gene em um tecido ou célula particular. A análise E-northern pode ser usada como uma ferramenta para descobrir alvos terapêuticos de can- didatos teciduais específicos que não estejam superexpressados em tecidos tais como do fígado, rim, ou coração. Esses tipos de tecido muitas vezes levam a efeitos colaterais preju- diciais uma vez as drogas estejam desenvolvidas e uma pesquisa de primeira passagem para eliminar esses alvos logo na descoberta do alvo e processo de validação podem ser benéficos.
As bases de dados da invenção podem ser também usadas para apresentar infor-
mação identificando o nível de expressão em um tecido ou célula de uma combinação de genes apresentada nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, compreendendo a etapa de comparar o nível de expressão das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 no tecido relativamente ao nível da expressão do gene na base de dados. Tais méto- dos podem ser usados para predizer o estado fisiológico de um dado tecido mediante com- parar o nível de expressão das combinações genéticas apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, ou 6 provenientes de uma amostra relativamente aos níveis de expressão encontrados em tecido a partir de tecido normal, tecido proveniente de tumores, ou ambos. Tais métodos podem ser também usados em ensaios de classificação da droga ou agente como descrito aqui.
Sem descrição adicional, é acreditado que aqueles usualmente versados na técni- ca, utilizando a descrição apresentada anteriormente e os exemplos ilustrativos apresenta- dos a seguir, produzam e utilizem os compostos da presente invenção e pratiquem os méto- dos reivindicados. Os exemplos operacionais mencionados, portanto, são apenas ilustrati- vos, e não devem ser considerados como a limitar o escopo da invenção de nenhum modo.
VI. Experimental
EXEMPLO 1
Uma vista genômica ampla dos padrões de expressão gênica utilizando microarran-
jos.
Cultura celular
As linhagens de células SCLC apresentadas a seguir foram obtidas da ATCC (Ma- nassis, VA): NCI-H889, NCI-H1963, NCI-H1417, NCI-H146, NCI-H187, DMS53, NCI-H510, NCI-H209, NCI-H211, NCI-H345, NCI-H524, NCI-H69, DMS79, SHP77, NCI-H1688, NCI- H446, NCI-H740, NCI-H1048, NCI-H82, NCI-H196, SW1271, H69AR, NCI-H526, NCI-H865, NCI-H748, NCI-H711, e DMS114. Todas as células foram cultivadas no meio recomendado por ATCC a 37°C em uma atmosfera úmida contendo 5% CO2. As linhagens de células de leucemia e Iinfoma apresentadas a seguir foram obtidas da ATCC (Manassis, VA): MV-4-11, RS4;11, Loucy, KG-IA1 DOHH2, Rsl 1380, CCRF-HSB-2, CCRF-CEM, CEM/C1, Reh, SUP- B 15, MOLT-4, SUDHL4, HL-60, RPMI 8226, A3, Daudi, WSU-NHL, Pfeiffer, Jurkat I 9.2, Jurkat, MEG-OI, U-937, K-562, e Raji.
Análise por microarranjos da expressão gênica.
O RNA total foi isolado mediante utilizar o reagente Trizol (Invitrogen,) e purificado em colunas RNeasy (Qiagen, Valencia, Califórnia). cRNA marcado foi preparado de acordo com o protocolo do fabricante do microarranjo e hibridizado a arranjos humanos U133A 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, Califórnia). Os fragmentos U133A 2.0 contêm 14.500 genes bem caracterizados, bem como vários milhares de ESTs. Os arquivos de dados do microarranjo foram carregados no software Rosetta Resolver™ para análise e os valores da intensidade para todos os conjuntos de sondas foram normalizados usando Expefimental Definition da Resolver. Os valores da intensidade para os conjuntos de sondas correspondentes aos ge- nes contidos nas regiões amplificadas foram normalizados através de cada gene e compa- rados em mapas térmicos utilizando o software Spotfire™. RESULTADOS
As 27 linhagens de células SCLC foram testadas quanto a sensibilidade a ABT-737 utilizando o procedimento descrito em Oltersdorf, T., "An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours", Nature, 435: 677-681, 2005, com uma linhagem celular classificada como sensível se sua EC50 < 5 μΜ e como resistente se sua EC50 > 5 //Μ. O grupo de linhagem celular sensível consistiu de NCI-H889, NCI-H1963, NCI-H1417, NCI- H146, DMS 53, NCI-H187, NCI-H510, NCI-H209, NCI-H345, NCI-H526, NCI-H211, NCI- H865, NCI-H524, NCI-H748, DMS 79, NCI-H69, NCI-H711, SHP 77, NCI-H1688, e o grupo de linhagem celular resistente foi compreendido de NCI-H446, NCI-H740, NCI-H1048, NCI- H82, NCI-H196, SW1271, DMS 114, e NCI-H69AR. As 22 linhagens de células SCLC foram testadas quanto à sensibilidade a ABT-263
utilizando o procedimento descrito em Oltersdorf, T., "An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours", Nature, 435: 677-681, 2005, com uma linhagem de células classificadas como sensível se sua EC50 < 5 //M e como resistente se sua EC50 > 5 A/M. O grupo de linhagem celular sensível consistiu de NCI-H146, NCI-H889, NCI-H1963, NCI-H187, NCI-H1417, NCI-H211, NCI-H69, NCI-H209, NCI-H510, DMS 53, DMS 79, NCI- H345, NCI-H1048, SHP 77, NCI-H446 e o grupo de linhagem celular resistente foi compre- endido de NCI-H1688, NCI-H740, NCI-H82, NCI-H69AR, SW1271, DMS 114 e NCI-H196.
As 25 linhagens de células de leucemia/linfoma foram também testadas quanto a sensibilidade a ABT-737 utilizando o corte a 5 uM, e linhagens celulares sensíveis foram MV-4-11, RS4;11, Loucy, KG-IA, DOHH2, Rsl 1380, CCRF-HSB-2, CCRF-CEM, CEM/C1, Reh, SUP-B 15, MOLT-4, SUDHL4, HL-60, RPMI 8226, A3, Daudi, WSU-NHL, Pfeiffer, e Jurkat I 9.2, e as linhagens de células resistentes Jurkat, MEG-OI, U-937, K-562, e Raji.
As 25 linhagens de células de leucemia/linfoma foram também testadas quanto a sensibilidade a ABT-263 utilizando o corte a 5 uM, e linhagens celulares sensíveis foram MV-4-11, RS4; 11, Loucy, KG-IA, D0HH2, Rsl 1380, CCRF-HSB-2, CCRF-CEM, CEM/C1, Reh, SUP-B 15, MOLT-4, SUDHL4, HL-60, RPMI 8226, A3, Daudi, WSU-NHL, Pfeiffer, e Jurkat I 9.2, e as linhagens de células resistentes Jurkat, MEG-01, U-937, K-562, e Raji. Padrões de expressão RNA provenientes de linhagens e células sele não tratadas e linhagens de células de leucemia/linfoma foram determinadas utilizando microarranjos Affy- metrix HG-UI 33 A v.2.0 que contêm acima de 22.00 conjuntos de sondas. Em paralelo com culturas separadas, foi determinada a sensibilidade de cada linhagem de células aos com- postos. Os perfis de expressão foram divididos na forma de grupos sensíveis e resistentes, e uma série de filtros estatísticos aplicados para identificar quais genes foram os melhores em se discriminar entre as linhagens de células sensíveis e resistentes. O primeiro filtro foi um Analysis of Variance (ANOVA) utilizando software Spotfire. Genes variáveis (alto CV) foram em seguida filtrados. Os genes restantes foram analisados com a função de análise discriminante JMP para identificar os genes que melhor se discriminaram entre as linhagens de células sensíveis e resistentes. Os melhores conjuntos discriminantes foram testados usando função de validação cruzada de uma omissão de SAS para identificar o melhor con- junto de biomarcadores. Para ABT-263, 2 conjuntos para cada tipo de célula (células sele e de leucemia/linfoma) foram descobertos se desempenhar bem.
As modalidades representativas acima descritas são pretendidas a serem ilustrati- vas em todos os sentidos, ao contrário de serem restritivas da presente invenção. Desse modo, a presente invenção é capaz de implementação em muitas variações e modificações que podem ser derivadas a partir da descrição aqui apresentada, que podem ser feitas por aqueles usualmente versados na técnica. Todas as tais variações e modificações são consi- deradas estarem inseridas no escopo e espírito da presente invenção como definido pelas reivindicações apresentadas adiante.

Claims (45)

1. Método de identificar um paciente quanto a elegibilidade para a terapia do câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) prover uma amostra de tecido de um paciente; (b) determinar níveis de expressão em uma amostra de tecido das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; (c) classificar os níveis de expressão relativamente aos níveis em tecido normal de genes no correspondente conjunto biomarcador; e (d) identificar o paciente como elegível para receber a terapia do câncer onde a amostra do paciente é classificada como possuindo níveis alterados de genes no conjunto biomarcador.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de tecido compreende uma amostra do sangue periférico, um tecido tumoral ou um tecido com suspeita de tumor, uma amostra citológica de camada fina, uma amostra de aspirado de agulha fina, uma amostra de medula óssea, uma amostra de nodo linfático, uma amostra de urina, uma amostra de ascite, uma amostra de lavagem, uma amostra de esfregaço esofágico, uma amostra de lavagem de bexiga ou pulmão, uma amostra de fluido espinhal, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de aspirado ductal, uma amostra da descarga do mamilo, uma amostra da efusão pleural, uma amostra de tecido recém congelado, uma amostra de tecido encaixado em parafina ou uma amostra extraída ou processada produzida from qualquer de uma amostra do sangue periférico, um tecido tumoral ou um tecido com suspeita de tumor, uma amostra citológica de camada fina, uma amostra de aspirado de agulha fina, uma amostra de medula óssea, uma amostra de urina, uma amostra de ascite, uma amostra de lavagem, uma amostra de esfregaço esofágico, uma amostra de lavagem de bexiga ou pulmão, uma amostra de fluido espinhal, uma amostra de fluido cerebral, uma amostra de aspirado ductal, uma amostra da descarga do mamilo, uma amostra da efusão pleural, uma amostra de tecido recém congelado ou uma amostra de tecido encaixado em parafina.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de sangue periférico é de um paciente com um câncer selecionado a partir do grupo que compreende carcinoma de pulmão e leucemia/linfoma.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra de tecido é uma amostra de tecido fixado encaixado em parafina, um aspirado de agulha fina ou uma amostra de tecido recém congelado.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a determinação da etapa (b) é realizada através de hibridização in situ.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a hibridização in situ é realizada com uma sonda ácido nucléico marcada de modo fluorescente.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a hibridização in situ é realizada com pelo menos duas sondas ácidos nucléicos.
8. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a hibridização in situ é realizada com uma sonda peptídeo ácido nucléico.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinação (b) é realizada através de reação da cadeia polimerase.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinação (b) é realizada através de um ensaio microarranjo de ácido nucléico.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber um composto terapêutico anti-sentido projetado para se ligar a um de Bcl-2, Bcl-w, e Bcl-xl.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia do câncer compreende um inibidor da família Bcl-2.
13. Método, de acordo com a reivindicaçãos 11 ou 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-((4-((2-(4-clorofenil)-5,5- dimetil-1 -cicloex-1 -en-1 -il)metil)piperazin-1 -il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(morfolin-4-il)-1 - ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N- (4-(4-((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3- (dimeti 1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobenzenosulfonamida.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia do câncer compreende um inibidor da família Bcl-2 em combinação com quimioterapia.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5- dimetil-1- cicloex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4-((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2- il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilámino)-1-((fenilsulfanil)metil)propi nitrobenzenosulfonamida.
18. Método de identificar um paciente quanto a elegibilidade para terapia por inibidor da família Bcl-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compeende: (a) prover uma amostra de tecido de câncer de pulmão de um paciente; (b) detectar o nível da expressão em uma amostra de tecido; em que expressão diferencial das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1 ou 2 é indicativo de um paciente que é elegivel para receber terapia por inibidor da família Bcl-2.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinação (b) é realizada através de PCR.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinação (b) é realizada através de um ensaio microarranjo ácido nucléico.
21. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegivel para receber N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1- cicloex-1 -en-1 -il)metil)piperazin-1 -il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(morfolin-4-il)-1 - ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida.
22. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegivel para receber N-(4-(4-((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2- il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilam nitrobenzenosulfonamida.
23. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegivel para receber um composto terapêutico anti-sentido projetado para se ligar a um de Bcl-2, Bcl-w, e Bcl-xl.
24. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia do câncer compreende um inibidor da família Bcl-2 em combinação com quimioterapia.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegivel para receber N-(4-(4- ((2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1- cicIoex-1 -en-1 -il)metil)piperazin-1 -il)benzoil)-4-(((1 R)-3-(morfolin-4-il)-1 - ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegivel para receber N-(4-(4-((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2- il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3- (dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobenzenosulfonamida.
27. Método de identificar um paciente quanto a elegibilidade para terapia por inibidor da família Bcl-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) prover uma amostra de tecido de leucemia/linfoma de um paciente; (b) determinar níveis de expressão em uma amostra de tecido das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 3, 4, 5 ou 6; (c) classificar o nível relativamente aos níveis em tecido normal de genes no conjunto biomarcador; e (d) identificar o paciente como elegível para receber terapia por inibidor da família Bcl-2 onde a amostra do paciente é classificada como possuindo níveis alterados de genes no conjunto biomarcador.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinação (b) é realizada através de PCR.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de determinação (b) é realizada através de um ensaio microarranjo ácido nucléico.
30. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5- dimetil-1- cicloex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida.
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4- ((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-nitrobenzenosulfonamida.
32. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber um composto terapêutico anti-sentido projetado para se ligar a um de Bcl-2, Bcl-w, e Bcl-xl.
33. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia do câncer compreende um inibidor da família Bcl-2 em combinação com quimioterapia.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5 -dimetil-1- cicloex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(morfolin-4-il)-1- ((fenilsulfanil)metil)propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4-((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2- il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilam nitrobenzenosulfonamida.
36. Método para o monitoramento um paciente que está sendo tratado com terapia por inibidor da família Bcl-2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) prover uma amostra do sangue periférico de um paciente; (b) medir níveis de expressão na amostra de sangue periférico das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; e (c) determinar o nível de expressão relativamente ao nível sangüíneo basal de um paciente das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4-((2-(4-clorofenil)-5,5 -dimetil-1- cicloex-1-en-1-il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R propil)amino)-3-((trifluorometil)sulfonil)benzenosulfonamida.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente é classificado como elegível para receber N-(4-(4-((4'-cloro(1,1'-bifenil)-2- il)metil)piperazin-1-il)benzoil)-4-(((1R)-3-(dimetilamino)-1-((fenilsulfanil)metil)propil)am nitrobenzenosulfonamida.
39. Sistema computacional, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) uma base de dados contendo informação que identifica o nível de expressão em tecido de câncer de pulmão de um conjunto de genes que se apresenta na Tabela 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; e (b) uma interface usuário para visualizar a informação.
40. Sistema computacional, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que em que a base de dados adicionalmente compreende informação de seqüência quanto aos genes.
41. Sistema computacional, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a base de dados adicionalmente compreende informação que identifica o nível de expressão quanto aos genes em tecido normal.
42. Sistema computacional, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a base de dados adicionalmente compreende informação que identifica o nível de expressão quanto aos genes em tecido proveniente de um tumor de pulmão.
43. Sistema computacional, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-42, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende registros que incluem informação descritiva proveniente de uma base de dados externa, cuja informação correlaciona os referidos genes aos registros na base de dados externa.
44. Sistema computacional, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a base de dados externa é GenBank.
45. Método de utilizar um sistema computacional, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-42 para apresentar informação que identifica o nível de expressão em um tecido ou célula das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) comparar o nível de expressão das combinações biomarcadoras apresentadas nas Tabelas 1,2,3, 4, 5, ou 6 no tecido ou célula com o nível da expressão do gene na base de dados.
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