BRPI0719572A2

BRPI0719572A2 - Vetor viral, uso de um vetor viral, linhagem de células estáveis, método de geração in vitro de uma linhagem de células estáveis, uso de uma linhagem de células estáveis e método de produção in vitro de um produto heterólogo

Info

Publication number: BRPI0719572A2
Application number: BRPI0719572-9A
Authority: BR
Inventors: Cristian Smerdou Picazo; Erkuden Casales Zoco; Juan Roberto Rodriguez Madoz; Nerea Razquin Erro; Yolanda Cuevas Labrador; Marta Ruiz Guillen; Jesus Prieto Valtuena
Original assignee: Proyecto Biomedicina Cima Sl
Priority date: 2006-11-28
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2013-12-10
Also published as: RS51484B; US20100055736A1; PT2097533E; SI2097533T1; AU2007327452B2; WO2008065225A2; ATE478959T1; DE602007008761D1; CA2670163A1; HRP20100638T1; RU2009124471A; EP2097533B9; DK2097533T3; EP2097533B1; WO2008065225A3; EP2097533A2; MX2009005572A; CY1111187T1; PL2097533T3; JP2010510790A

Description

VETOR VIRAL, USO DE UM VETOR VIRAL, LINHAGEM DE CÉLULAS ESTÁVEIS, MÉTODO DE GERAÇÃO IN VITRO DE UMA LINHAGEM DE CÉLULAS ESTÁVEIS/ USQ DE UMA LINHAGEM DE CÉLULAS ESTÁVEIS E MÉTODO DE PRODUÇÃO IN VITRO DE UM PRODUTO HETERÓLOGO

5 CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção é compreendida no campo de engenharia genética. A presente invenção refere-se especificamente a vetores virais que sofreram mutação e suas aplicações, particualrmente em geração de linhagem de 10 células estáveis in vitro e produção de proteínas de forma constitutiva.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Vetores de expressão de alfa vírus foram desenvolvidos a partir de diferentes vírus, que incluem o 15 vírus Sindbis (SIN) (34), o vírus de Floresta Semliki (SFV) (18) e o vírus da encefalite equina venezuelana (VEE) (25). Os vetores de alfa vírus são normalmente baseados em réplicas de RNA nas quais os genes estruturais foram substituídos por um gene heterólogo.

2 0 A réplica de alfa vírus contém um ORF que

codifica a replicase viral (Rep) na sua extremidade 5', que é traduzida quando o RNA é transfectado em células eucarióticas. A Rep é expressa na forma de poliproteína que é processada em seguida em quatro subunidades (nsps 1 a 4) 2 5 (30) . A Rep não processada pode copiar o vetor de RNA em uma linhagem de RNA negativa, um processo que tem lugar apenas durante as primeiras três a quatro primeiras horas após a transfecção ou infecção. Uma vez processada, a Rep utilizará o RNA de linhagem negativa como um molde para a síntese de outras moléculas reprodutoras. A Rep processada pode também reconhecer uma seqüência interna no RNA de linhagem negativa ou promotor sugenômico, do qual sintetizará um RNA de linhagem positiva sugenômica 5 correspondente à extremidade 3' da réplica. Este RNA subgenômico será traduzido para produzir a proteína heteróloga em grandes quantidades. 0 RNA de réplica pode também ser embalado em partículas virais por meio da cotransfecção de células com um ou mais RNAs auxiliares que 10 podem fornecer as proteínas estruturais virais em trans (2, 4, 8, 25, 29) ou utilizando linhagens celulares de embalagem estáveis (24) .

A reprodução do vetor de alfavírus é citopática na maior parte das células de mamíferos devido a mecanismos 15 que ainda não são completamente compreendidos (3, 9, 13). 0 efeito citopático induzido por esses vetores é mediado por apoptose independente de p53 e normalmente ocorre de 4 8 a 72 horas após a transfecção ou infecção (14) . Suspeita-se que nsp2, um dos quatro componentes da replicase viral, 2 0 poderá ter um papel importante na indução da apoptosse (11, 12) .

Os vetores alfavírus citopáticos vêm sendo utilizados em uma série de aplicações, que incluem a produção e caracterização de proteína in vitro (33), bem 25 como em estudos sobre a vacinação e em terapia genética de câncer (19, 26) . Uma desvantagem importante desse vetor viral do tipo selvagem repousa no fato de que eles não podem ser utilizados em aplicações em que se deseja expressão de transgene de longa duração. Para solucionar esta desvantagem, diversos grupos identificaram uma série de mutações na replicase de alfavírus que podem converter esses vetores virais citopáticos em vetores virais não citopáticos, o que 5 permite uma expressão com duração mais longa dos produtos recombinantes expressos pelo vetor viral. Estes estudos levaram à geração de vetores não citopáticos derivados de SIN (7, 22) , SFV (20-22) e, mais recentemente, de VEE e EEE (vírus da encefalite equina do leste) (23).

A maior parte das mutações não citopáticas

detectadas em alfavírus foi localizada na subunidade Rep nsp2. Esta proteína contém um domínio helicase na extremidade amino e um domínio proteolítico na extremidade carboxila, em que este último está envolvido no 15 processamento de Rep nas suas quatro subunidades (3 0) . Demonstrou-se que as mutações não citopáticas descritas para nsp2 afetam o domínio proteolítico de nsp2 ou as posições próximas dos locais de divisão entre nspl/2 ou nsp2/3, de forma a alterar o processamento de Rep.

Um mutante não citopático isolado em SIN, que

continha uma única alteração de aminioácido (P para L) na posição 726 em nsp2 (vetor SIN P726L em nsp2) , exibiu hiperprocessamento de Rep (7) . Este mutante foi capaz de estabelecer efetivamente a reprodução contínua em células 25 de BHK. A introdução de diferentes alterações de aminoácidos na mesma posição desse mutante demonstrou que existe uma forte correlação positiva entre o nível de reprodução de NRA e a citopatogenicidade do vetor. Este vetor de SIN não citopático possui ampla utilização in vitro, pois ele pode fornecer uma expressão de transgene de longa duração com bons níveis de estabilidade e níveis de expressão que foram de cerca de 4% dos obtidos com o vetor SIN original do tipo selvagem (wt) (1) . Apesar do 5 fato de que o mencionado vetor não é citopático, entretanto, ele não possui a capacidade de gerar linhagens celulares estáveis com altos níveis de expressão. De fato, em linhagens celulares geradas com o vetor de SIN P726L que conduz o gene LacZ, a expressão do transgene foi perdida em 10 45% das células transfectadas após cinco passagens e a estabilidade da expressão somente foi atingida por meio de seleção de clones individuais (1) , que atrasaram consideravelmente a obtenção de um alto número de células que podem expressar eficientemente o transgene. Mesmo 15 assim, estas linhagens mantiveram baixos níveis de expressão (4% dos níveis obtiveram o vetor SIN do tipo selvagem).

Um vetor de SFV não citopático que compreende as mutações P718T e R649H (R649H/P718T) na subunidade nsp2, 20 que expressa o gene pac de resistência à puromicina, foi descrito adicionalmente, embora a sua capacidade de geração de linhagens celulares estáveis em alta expressão não tenha sido descrita (Smerdou, C. et al, 2004, Sétimo Simpósio Internacional Sobre Vírus de RNA de Linhagem Positiva, São 25 São Francisco, Estados Unidos).

Com relação aos mutantes de SFV não citopáticos descritos por Perri et al (22) , que incluem os mutantes SF2A (mutação LlOT em nsp2) e SF2C (mutação L713P em nsp2), bem como ED mutante duplo (S259P e R650D em nsp2) descrito por Lundstrõm et al (21) , é verdade que eles podem expressar níveis de proteína que são similares ou até maiores que os do vírus do tipo selvagem (PD mutante), mas em todos os casos estes mutantes ainda são citopáticos 5 (vide o Exemplo 8 do presente relatório descritivo) e a geração de linhagens celulares estáveis que expressam proteínas heterólogas com base nos mencionados vetores virais não foi descrita. Os dados relativos ao efeito citopático do vetor SFV-PD são adicionalmente sustentados 10 por resultados publicados posteriormente por Lundstrõm et al (20), que demonstram como a expressão de β-gal ou GFP em células de BHK infectadas com um vetor de SFV-PD que conduz LacZ ou GFP como um gene marcador atinge o máximo após 4 8 horas para cair drasticamente em seguida nos três a quatro 15 dias seguintes, o que indica a ocorrência de um efeito citopático nas células (vide Figura 2 da referência mencionada).

Embora mutantes pontuais no gene que codifica a proteína nsp2 dos alfavírus SIN e SFV tenham sido descritos 20 e embora esses mutantes possuam uma redução da citopatogenicidade, nenhum dos mencionados mutantes exibiu a capacidade de gerar linhagens de células estáveis com altos níveis de expressão.

Existe ainda, portanto, a necessidade de desenvolver vetores alfavírus virais não citopáticos alternativos, úteis para a produção de linhagens de células estáveis que podem produzir a proteína heteróloga na presença de seleção.

Resumo da Invenção Vetores alfavírus podem expressar altos níveis de proteína recombinante em diferentes tipos de células. Esta expressão, entretanto, é transitória devido à natureza citopática da reprodução viral. Para adaptar estes vetores 5 a estudos de longo prazo, foram isolados mutantes não citopáticos do vírus Sindbis (SIN), do vírus de floresta Semliki (SFV) e do vírus da encefalite equina venezuelana (VEE) . A maior parte desses mutantes contém alterações em nsp2, uma subunidade da replicase viral.

Para gerar novos fatores de SFV não citopáticos,

as mutações descritas para a criação de um vetor SIN não citopático foram introduzidas em uma posição conservada em SFV. Curiosamente, descobriu-se que uma réplica de SFV que contém mutação P718T em nsp2 e carrega gene LacZ como um 15 gene heterólogo (SFV-LacZ) gerou variantes não citopáticas que formam colônias que expressam β-galactosidase (β-gal) sem a aplicação de seleção a elas, apesar do fato de que aparentemente eram incapazes de reproduzir-se na maior parte das células. Formulou-se a hipótese de que as 20 variantes não citopáticas deveram-se a mutações adaptativas secundárias. Para isolar estas variantes, o gene puromicina N-acetiltransferase (pac) (gene de seleção) foi introduzido no mutante SFV-P718T e foram selecionados os clones de células BHK que foram resistentes à puromicina. Uma réplica 25 não citopática que contém uma segunda mutação no sinal de localização nuclear nsp2, especificamente a mutação R649H, foi resgatada de um dos clones selecionados. Este mutante duplo, identificado como SFV-S2-9 no presente relatório descritivo, que contém as mutações R649H e P718T em nsp2, reproduziu-se em níveis que foram sessenta vezes menores que os do vetor SFV do tipo selvagem, que foi correlacionado à ausência de citopatogenicidade em células transfectadas com o vetor SFV que contém a mutação dupla 5 R649H/P718T em nsp2. Observou-se um nível de expressão de β-gal similar em células transfectadas com SFV-S2-9-LacZ e SFV-LacZ 24 horas após a transfecção, que estava na faixa de cerca de 15 pg/célula (Figura 6).

Surpreendentemente, vetores virais não

citopáticos baseados no mencionado mutante SFV duplo (SFV- S2-9) que contém a mutação dupla R64 9H/P718T em nsp2 foram capazes de gerar linhagens celulares estáveis que podem expressar β-gal por pelo menos dez passagens em cultivo (o percentual de células que expressam β-gal, determinado em 15 cada passagem por meio de manchas de X-gal, variou de 70% a 90% de acordo com a passagem, mas era de mais de 85% na passagem 10, o que indicou uma grande estabilidade da expressão de transgene na presença de seleção, como se pode observar na Figura 7), que é ainda a expressão constitutiva 20 pois aumentou ao longo do tempo em células transfectadas com SFV-S2-9-LacZ, atingindo estabilização em cerca de 3 0 pg de β-gal/célula 48 horas após a transfecção. Em outras palavras, por meio de transfecção com o vetor SFV mutante duplo não citopático (R649H/P718T), atingiu-se 25 quantitativamente uma expressão que era duas vezes a atingida 24 horas após a transfecção quando as células foram transfectadas com o vetor SFV do tipo selvagem.

0 mencionado vetor SFV mutante duplo não citopático (R649H/P718T) também foi capaz de gerar linhagens de células estáveis que podem expressar constitutivamente proteínas heterólogas de interesse, tais como cardiotrofina-1 de rato (rCT) e o fator de crescimento similar a insulina humano (IGF-I), em níveis similares aos obtidos ao utilizar-se o vetor SFV do tipo selvagem.

De fato, o mencionado vetor SFV mutante duplo (R649H/P718T) foi capaz de gerar linhagens celulares estáveis que podem expressar constitutivamente rCT em níveis similares aos obtidos com o vetor SFV do tipo 10 selvagem, que foram de cerca de 4,3 pg/célula (Exemplo 9). Embora fosse observada uma alta estabilidade do vetor nas linhagens celulares analisadas, nas linhagens que expressam rCT e pac de dois promotores subgenômicos independentes, observou-se uma estabilidade mais baixa que com o gene 15 LacZ, em que a expressão de rCT começa a cair a partir da passagem 6 até virtualmente desaparecer na passagem 11 (Figura 16) . A fusão dos genes rCT e pac utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease 2A de vírus de doença da boca e dos pés (FMDV) como um ligante 20 permitiu, entretanto, a geração de linhagens de células estáveis nas quais a estabilidade da expressão de rCT permaneceu sem variações por pelo menos dez passagens (Figura 17).

De forma similar, o mencionado vetor SFV mutante 25 duplo (R64 9H/P718T) também foi capaz de gerar linhagens de células estáveis que podem expressar IGF-I em níveis que podem ser comparados com os obtidos com o vetor de SFV do tipo selvagem (Figura 19) , que foram de cerca de 50 pg/célula (Exemplo 10). As linhagens que expressam IGF-I e pac de dois promotores subgenômicos independentes exibiram níveis de expressão de IGF-I que eram um pouco mais baixos que o vetor SFV do tipo selvagem (cerca de duas vezes menos na passagem 1) e exibiram ainda uma estabilidade mais baixa que com o gene LacZ, em que a expressão começa a cair a partir da passagem 5 e diminui cerca de oitenta vezes entre as passagens I e 10 (Figura 20) . A fusão dos genes pac e IGF-I utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease de FMDV 2A como um ligante permitiu a geração de linhagens estáveis nas quais a expressão de IGF-I na passagem 1 era mais próxima do vetor SFV do tipo selvagem e em que a estabilidade da expressão de IGF-I foi mantida com pequenas variações até a passagem 10 (na passagem 10, foi apenas quatro vezes menor que a observada na passagem 1) (Figura 20).

Além disso, como se pode verificar no Exemplo 8, a presente invenção rompe um preconceito estabelecido no estado da técnica por demonstrar que vetores SFV que sofreram mutação presentes no estado da técnica e definidos 20 como não citopáticos mantêm as características de citopatogenicidade.

Conforme expresso na presente invenção, a expressão "linhagem de células estáveis" refere-se a linhagens celulares nas quais o percentual de células que 25 expressam um produto heterólogo (tal como um peptídeo ou uma proteína heteróloga etc.) na passagem 10 é de mais de 85%, em que o mencionado percentual é capaz de ser mantido ou excedido em passagens sucessivas ou subsequentes.

A expressão "expressão constitutiva", da forma utilziada no presente, designa a capacidade adicional que, surpreendentemente, as linhagens de células estáveis mencionadas acima possuem para expressar o produto heterólogo em um nível quantitativamente alto (mais de 50% 5 com relação ao atingido 24 horas após a tradução, quando as células são traduzidas com o vetor do tipo selvagem).

De forma similar, como se sabe no estado da técnica, uma "réplica de RNA" é uma seqüência de nucleotídeos que utiliza unitariamente um RNA complementar 10 como um intermediário que útil como um molde de produção de mais moléculas do RNA original. Com este propósito, geralmente são necessárias seqüências específicas nas extremidades de RNA. A réplica contida nos vetores virais fornecida pela presente invenção compreende a extremidade 15 5' necessária para reprodução de SFV, em que a seqüência codifica a enzima SFV replicase com mutações P718T e R649H na região nsp2, pelo menos um promotor subgenômico de SFV viral, um polinucleotídeo que compreende um gene de seleção, um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de 20 nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse e a extremidade 3' necessária para reprodução de SFV que contém uma seqüência terminal de poliadeninas (Póli A) . Em uma realização específica, o mencionado polinucleotídeo que compreende o gene de seleção, bem como 25 o mencionado polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse, são colocados abaixo no fluxo de dois promotores subgenômicos independentes e ligados operativamente aos mencionados promotores (ou seja, um dos mencionados polinucleotídeos é colocado abaixo no fluxo de um promotor subgenômico e a ele ligado operativamente e o outro polinucleotídeo é colocado abaixo no fluxo do outro promotor subgenômico e a ele ligado operativamente). Em uma outra realização específica, o mencionado polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o mencionado polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse são fundidos entre si, convenientemente por meio de um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão proteolítica pós-tradução, convenientemente um local de divisão autoproteolítica pós-tradução, e são colocados abaixo no fluxo de um único promotor subgenômico e a ele ligados operativamente.

Em um aspecto, portanto, a presente invenção refere-se a um vetor viral (vetor viral de acordo com a presente invenção) que compreende uma réplica do vírus de Floresta Semliki (SFV), em que a mencionada réplica 20 compreende (i) a seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima replicase de SFV com mutações P718T e R649H na subunidade nsp2, (ii) um polinucleotídeo que compreende um gene de seleção e (iii) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto 25 heterólogo de interesse.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere- se ao uso de um vetor viral conforme a presente invenção para a geração de linhagens celulares estáveis in vifcro que podem expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma linhagem celular estável que pode expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse, 5 caracterizada pelo fato de que é uma linhagem celular transfectada com um vetor viral conforme a presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de geração in vitro da mencionada linhagem de células estáveis podem expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere- se ao uso da mencionada linhagem de células estáveis para a geração in vitro de produtos heterólogos de interesse.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-

se a um método de produção in vitro de um produto heterólogo de interesse que compreende o cultivo da mencionada linhagem de células estáveis em condições que permitam a expressão do produto heterólogo de interesse 20 contido no vetor viral utilizado para gerar a mencionada linhagem de células estáveis.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1. Avaliação da citopatogenicidade dos reatores SFV que conduzem mutações derivadas de SIN. Os 25 plasmídeos pSFV-LacZ que contêm as mutações P718T (pSFV-S2- LacZ) e P718F (pSFV-S3-LacZ) em nsp2 foram construídos conforme descrito nos exemplos. RNA foi transcrito in vitro a partir de cada um desses plasmídeos, bem como do pSFV3- LacZ original, e sofreu eletroporação em células BHK que foram semeadas em placas com um diâmetro de 3 5 mm sob baixa confluência e manchadas com X-gal após o cultivo pelos tempos indicados. No caso de SFV-S2-LacZ ou SFV-S3- LacZ, foi fornecida uma passagem 1:5 para as células 5 transfectadas com os mencionados vetores após 96 horas em cultivo. Uma representação esquemática do RNA de cada vetor é exibida acima de cada conjunto de imagens. Cap: círculo na extremidade esquerda dos vetores; nsp: proteínas não estruturais; seta horizontal: promoter subgenômico de SFV; 10 An: póli A.

Figura 2. Células de BHK resistentes a puromicina selecionadas após a eletroporação com diferentes RNAs. As células BHK foram eletroporadas com os vetores de RNA SFV indicados ou sem RNA (nenhum RNA), semeadas em placas com 15 um diâmetro de 3 5 mm e mantidas em recuperação por 24 horas antes da adição de puromicina a 5 pg/ml. As placas foram manchadas com violeta de metila nos momentos indicados após a transfecção.

Figura 3. Localização intracelular de nsp2 em 20 células transfectadas com RNA de SFV. As células BHK foram eletroporadas com os vetores de RNA SFV ou vetores sem RNA (nenhum RNA) e foram analisadas por meio de imunofluorescência 24 horas após a transfecção. Anticorpos monoclonais de camundongos que foram específicos para as 25 formas nucleares (ansp-n) ou citoplasmãticas (ansp2-c) de nsp2 foram utilizados como anticorpos primários e um soro de coelho policlonal específico para IgGs de camundongos conjugados a FITC foi utilizado como um anticorpo secundário. Núcleos manchados com Dapi das mesmas células foram observados com um filtro de UV (Dapi).

Figura 4. Análise do RNA SFV nas células BHK transfectadas. 0 RNA total foi extraido de uma linhagem de células BHK estáveis obtida após a eletroporação da réplica 5 SFV-S2-9-pac e a seleção com puromicina (linha 1) ou de células BHK eletroporadas com SFV-S2-9-pac (linhas 2 a 4) , SFV-pac (linha 5) , SFV-LacZ (linha 6) ou coeletroporadas com réplicas SFV-S2-9-pac e SFV-pac (linha 7) e foi analisado em 24 horas (linhas 2, 5 a 7), 48 horas (linha 3) 10 ou 72 horas (linha 4) após a eletroporação. A presença dos RNAs SFV (g) genômicos e (sg) subgenômicos foi analisada por meio de Northern Blot com um oligonucleotídeo marcado com 32P específico para o promotor subgenômico SFV. Os números na parte inferior dos géis indicam as razões de RNA 15 subgenômico/genômico (sg/g) em cada caso. Na linha 7, eles se referem ã razão sg/g de SFV-S2-9-pac (pac) ou de SFV- LacZ (LacZ), respectivamente. A parte esquerda do gel foi exposta por 72 horas, enquanto a parte direita foi exposta por uma hora.

Figura 5. Expressão in vitro e in vivo de

proteínas não estruturais, a. 0 RNA SFV-pac original (tipo selvagem) ou o RNA SFV-pac que contém as mutações indicadas foram traduzidos em lisatos de reticulócitos de coelhos na presença de [35S] -metionina e [35S] -cisteína e foram 25 analisados por meio de SDS-PAGE em géis a 8% e posteriormente autorradiografados. Dois géis que contêm as mesmas amostras foram conduzidos por tempos diferentes para obter uma melhor separação das faixas com alto peso molecular (gel superior, migração mais longa) e detectar os monômeros nspl e 3 cora um peso molecular menor (gel inferior, migração mais curta). b. Análise da expressão de replicase nas células transfectadas. Os lisatos das células BHK controle, de linhagem de células BHK estáveis obtidas 5 após a eletroporação com réplica SFV-S2-9-pac e seleção com puromicina (S2-9) ou de células que sofreram eletroporação com o RNA SFV-pac original (tipo selvagem) ou de SFV-RHR- pac (RHR) mutante foram analisados por meio de imunomanchas utilizando um antissoro de coelho policlonal específico 10 contra nsp2 (gel superior) ou contra nsp3 (gel central). As mesmas amostras com um anticorpo específico contra β-actina foram analisadas como um controle interno.

Figura 6. Análise da expressão de β-gal. Células BHK foram eletroporadas com os RNAs indicados e o nível de 15 expressão de β-gal por célula foi determinado nos momentos indicados após eletroporação. 0 eixo x exibe o tempo após a transfecção em horas e o eixo y exibe os picogramas de β- gal por célula.

Figura 7. Estabilidade da expressão de β-gal nas 20 células transfectadas com vetor SFV-S2-9-LacZ-pac. As células BHK sofreram eletroporação com SFV-S2-9-LacZ-pac RNA e foram selecionadas na presença de puromicina a 5 pg/ml. As células selecionadas passaram a cada dois ou três dias com ou sem puromicina e o percentual de células que 25 expressam β-gal em cada passagem foi determinado por meio de manchas de X-gal. Os dados correspondem à média de três experimentos diferentes, sendo exibido o desvio padrão. A figura exibe um campo típico de células BHK que contêm o vetor SFV-S2-9-LacZ-pac que passou por dez vezes na presença de puromicina e foi manchado com X-gal. 0 eixo X exibe o número de passagens e o eixo y exibe o percentual de células manchadas de azul.

Figura 8. Representação esquemática de duas 5 realizações, na forma de RNA, do vetor viral para geração de linhagens de células estáveis e produção de proteínas estáveis. A réplica de SFV é ladeada pelas seqüências 5' e 3' necessárias para reprodução de SFV, em que a seqüência 3' incorpora uma seqüência terminal de poliadeninas (Póli 10 A) . A replicase com subunidades nspl a nsp4 e o promotor subgenômico SFV sobreposto com nsp4 (SGl) são incluídos no interior da réplica. As mutações R649H e P718T típicas do vetor replicase são exibidas sobre nsp2. A réplica também incorpora um gene de seleção (PAC) e um gene de interesse 15 (GOI) que codifica a proteína recombinante que deve ser produzida constitutivamente. Nos Exemplos A e C, a réplica também incorpora um segundo promotor subgenômico (SG2), de tal forma que a expressão de PAC e GOI seja controlada por um promotor de SG diferente, SGl ou SG2 sem distinção 20 conforme a construção A ou C selecionada. No Exemplo B, a expressão de PAC e GOI é controlada pelo mesmo promotor de SGl, produzindo uma proteína híbrida que é dividida por proteases em um local específico intercalado entre PAC e GOI. cap: estrutura de cap.

Figura 9. Avaliação do efeito citopático de SFV-

LacZ. RNA foi transcrito in vitro a partir de plasmídeo pSFV-LacZ (vetor de tipo selvagem) e foi eletroporado em células BHK. As células foram distribuídas em placas de 35 mm sob baixa confluência e foram fixadas e manchadas com X- gal nos tempos indicados (d, dia).

Figura 10. Avaliação do efeito citopático de SFV- SF2A-LacZ. RNA foi transcrito in vitro a partir de plasmídeo pSFV-SF2A-LacZ e foi eletroporado em células BHK.

5 As células foram distribuídas em placas de 35 mm sob baixa confluência e foram fixadas e manchadas com X-gal nos tempos indicados (d, dia). As células passaram 1:5 quatro dias após a transfecção.

Figura 11. Avaliação do efeito citopático de SFV- 10 SF2C-LacZ. RNA foi transcrito in vitro a partir de plasmídeo pSFV-SF2C-LacZ e foi eletroporado em células BHK. As células foram distribuídas em placas de 3 5 mm sob baixa confluência e foram fixadas e manchadas com X-gal nos tempos indicados (d, dia). As células passaram 1:5 quatro 15 dias após a transfecção.

Figura 12. Avaliação do efeito citopático de SFV- PD-LacZ. RNA foi transcrito in vitro a partir de plasmídeo pSFV-PD-LacZ e foi eletroporado em células BHK. As células foram distribuídas em placas de 3 5 mm sob baixa confluência 2 0 e foram fixadas e manchadas com X-gal nos tempos indicados (d, dia).

Figura 13. Avaliação do efeito citopático de SFV- S2-LacZ. RNA foi transcrito in vitro a partir de plasmídeo pSFV-S2-LacZ e foi eletroporado em células BHK. As células 25 foram distribuídas em placas de 3 5 mm sob baixa confluência e foram fixadas e manchadas com X-gal nos tempos indicados (d, dia) . As células passaram 1:5 quatro dias após a transfecção. Este mutante S2 foi capaz de gerar a formação de colônias de células que expressam β-gal. Figura 14. Avaliação do efeito citopático do vetor SFV-S2-9-LacZ que conduz as mutações P718T e R649H. RNA foi transcrito in vitro a partir de plasmídeo pSFV-S2- 9-LacZ, pSFV-S2-LacZ ou pSFV-LacZ e foi eletroporado em 5 células BHK. As células foram distribuídas em placas de 35 mm sob baixa confluência e foram fixadas e manchadas com X- gal nos tempos indicados (d, dia).

Figura 15. Análise da expressão de cardiotrofina-

1 de ratos (rCT) . a. Diagrama dos dois vetores de SFV não citopáticos que conduzem o gene PAC e o gene rCT. sg Pr, promotor subgenômico; 2A, seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease 2A do vírus de doença da mão e dos pés (FMDV) . b. Análise da expressão de rCT. Células BHK sofreram eletroporação com RNA de SFV-S2-9-rCT-pac (rCT- pac) , SFV-S2-9-pac2A-rCT (pac-2A-rCT) ou SFV-S2-9-pac (S2- 9-pac) como um controle negativo e foram selecionadas na presença de puromicina a 5 pg/ml. As células selecionadas foram lisadas e a expressão de rCT foi analisada por meio de imunomanchas utilizando um anticorpo específico para cardiotrofina (gel superior). Como uma quantidade de controle, as mesmas amostras foram analisadas com um anticorpo contra actina (gel inferior). wtCT, lisato de células BHK transfectadas com SFV-rCT obtido 24 horas após a transfecção e utilizado como controle positivo. M, marcadores de peso molecular (kDa).

Figura 16. Análise da estabilidade da expressão de rCT em células BHK do vetor SFV-S2-9-rCT-pac. As células BHK sofreram eletroporação com RNA SFV-S2-9-rCT-pac e foram selecionadas na presença de puromicina a 5 μg/ml. As células selecionadas passaram 1:5 a cada dois a três dias até onze passagens consecutivas (pl a pll) , em que a expressão de rCT em lisatos celulares é analisada em cada passagem por meio de imunomanchas com um anticorpo 5 específico para cardiotrofina (gel superior) e com um anticorpo específico contra actina como um controle de carga (gel inferior) . Diversas quantidades de rCT recombinante purificado (recCT) foram utilizadas como um controle de quantidade. É exibido um experimento 10 representativo de dois experimentos conduzidos que geraram um resultado de expressão e estabilidade similar. S2-9-pac, controle negativo de células eletroporadas com vetor SFV- S2-9-pac. M, marcadores de peso molecular (kDa).

Figura 17. Análise da estabilidade da expressão 15 de rCT em células BHK do vetor SFV-S2-9-pac2A-rCT. As células BHK sofreram eletroporação com SFV-S2-9-pac2A-rCT RNA e foram selecionadas na presença de puromicina a 5 μg/ml. As células selecionadas passaram 1:5 a cada dois a três dias até dez passagens consecutivas (pl a plO), em que 20 a expressão de rCT em lisatos celulares é analisada em cada passagem por meio de imunomanchas com um anticorpo específico para cardiotrof ina (gel superior) e com um anticorpo específico contra actina como um controle de carga (gel inferior) . Diversas quantidades de rCT 25 recombinante purificado (recCT) foram utilizadas como um controle de quantidade. É exibido um experimento representativo de quatro experimentos conduzidos que geraram um resultado de expressão e estabilidade similar. S2-9-pac, controle negativo de células eletroporadas com vetor SFV-S2-9-pac. M, marcadores de peso molecular (kDa).

Figura 18. Diagrama dos vetores SFV não citopáticos que carregam o gene pac e o gene IGF-I. O vetor SFV-S2-9-IGF-pac que carrega o gene PAC e o gene IGF-I sob 5 o controle de promotores subgenômicos (sg Pr) virais independentes, em que o gene IGF-I foi fundido com o aprimorador de tradução de capsídeo SFV (bl) utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease de FMDV 2A (2A) como um ligante. O vetor SFV-S2-9-pac2A-IGF conduz 10 o gene PAC fundido com o gene IGF-I utilizando a seqüência 2A como um ligante.

Figura 19. Análise da expressão de IGF-I. As células BHK sofreram eletroporação com RNA de SFV-S2-9-IGF- pac, SFV-S2-9-pac2A-IGF ou SFV-S2-9-pac (controle negativo) 15 e foram selecionadas na presença de puromicina a 5 pg/ml. As células selecionadas passaram uma vez (passagem 1) , em que o sobrenadante é recolhido em 24, 4 8 ou 72 horas após o seu plantio. A expressão de IGF-I foi analisada em cada um dos sobrenadantes por meio de um ELISA específico para IGF- 20 I humano. SFV-IGF-I, sobrenadante de células BHK transfectadas com RNA do vetor SFV-IGF-I do tipo selvagem obtido 24 horas após a transfecção e utilizado como controle positivo.

Figura 20. Análise da estabilidade da expressão 25 de IGF-I em células BHK de diferentes vetores. As células BHK sofreram eletroporação com RNA de SFV-S2-9-IGF-pac ou SFV-S2-9-pac2A-IGF e foram selecionadas na presença de puromicina a 5 μg/ml. As células selecionadas passaram uma vez a cada dois ou três dias até dez passagens consecutivas, em que o sobrenadante é recolhido em cada passagem 24 horas após o seu plantio. A expressão de IGF-I foi analisada nos sobrenadantes de cada uma das passagens por meio de um ELISA específico para IGF-I humano. SFV-IGF- 5 I, sobrenadante de células BHK transfectadas com RNA do vetor SFV-IGF-I obtido 24 horas após a transfecção e utilizado como controle positivo.

Descrição Detalhada da Invenção Descrição da Invenção Os vetores alfavírus possuem diversas vantagens,

tais como altos níveis de expressão transgênica, amplo tropismo e fácil manipulação. A citopatogenicidade causada por esses vetores na maior parte das células de vertebrados pode ser vantajosa em algumas aplicações, tais como 15 vacinação e terapia genética de câncer, em que a apoptose de células que sofreram transdução pode gerar a liberação de antígenos que podem ser absorvidos por células imunes, o que favoreceria uma reação imune contra o antígeno recombinante expresso ou contra antígenos de tumores, 20 respectivamente (19) . 0 uso desses vetores em aplicações nas quais é necessária uma expressão transgênica de longa duração é obstruído pela sua natureza citopática.

A possibilidade de adaptação de vetores de alfavírus para expressão a longo prazo foi pesquisada por 25 diferentes laboratórios, o que gerou o isolamento de variantes não citopáticas de SIN, SFV, VEE e EEE (7, 20- 23) . Na maior parte dos casos, as mutações não citopáticas foram isoladas utilizando vetores que conduzem um gene heterólogo que codifica uma proteína que confere resistência a um antibiótico, tal como puromicina ou G418. Quando as células transfectadas com este tipo de vetor foram incubadas na presença do antibiótico, somente foram selecionadas as que contêm réplicas mutantes não 5 citopáticas que expressam o gene de resistência.

Embora a maior parte dos mutantes alfavírus que foram descritos carregue mutações em nsp2, estas mutações alteram diferentes resíduos de proteína em diferentes vírus, apesar da existência de um alto grau de homologia de 10 seqüências entre os diferentes alfavírus. Tomando esta seqüência de homologia como base, o efeito de uma mutação de SIN bem caracterizada, que afetou o resíduo 726 de nsp2 em SIN, foi pesquisado no contexto de SFV. As mutações P726L e P726T foram descritas como não citopáticas por 15 Frolov et al (7) e Perri et al (22), respectivamente. No primeiro estudo, o resíduo 726 também sofreu mutação em todos os outros aminoácidos possíveis, o que gerou uma série de mutantes de SIN com diferentes graus de citopatogenicidade. Frolov et al puderam estabelecer uma 20 correlação entre o nível de reprodução de RNA e a citopatogenicidade, concluindo que alterações no resíduo 72 6 de nsp2 que reduzissem os níveis de RNA para menos de 5% dos níveis observados no vetor do tipo selvagem produziriam um fenótipo não citopático (7).

Foram selecionadas duas alterações diferentes,

P726T e P726F, que foram capazes de reduzir os níveis de RNA em SIN para 5,1% e para 1,6% dos níveis selvagens, respectivamente, e as mutações correspondentes foram introduzidas na posição 718 de SFV nsp2, sendo gerados os mutantes identificados pelos inventores como S2 e S3, respectivamente. Nenhuma destas alterações foi capaz de produzir um fenótipo não citopático em SFV por si própria. Os estudos conduzidos por meio de transfecção de células 5 BHK com os mutantes de SFV (S2 e S3) nos quais o gene relator de LacZ havia sido incorporado demonstraram que somente um pequeno percentual das células transfectadas pôde manter a reprodução do vetor. 0 mutante S2 (P718T) pareceu mais estável que S3 (P718F) e gerou grandes 10 colônias de células que expressam β-gal na ausência de seleção. Intuiu-se, portanto, que essas colônias continham réplicas com mutações adaptativas adicionais. Para selecionar estas colônias e identificar as possíveis mutações secundárias presentes nas réplicas, o gene N- 15 acetiltransferase (pac) foi clonado no mutante SFV S2 e as colônias das células cultivadas na presença de puromicina foram isoladas. Em um dos clones analisados, foi encontrada uma segunda mutação na posição 64 9 de nsp2 (R64 9H) que, em combinação com a mutação P718T, foi capaz de fornecer um 20 fenótipo não citopático para o vetor SFV com base naquele mutante SFV duplo (P718T/R649H). Esse mutante SFV duplo (P718T/R64 9H) foi denominado mutante S2-9 pelos inventores e aparece indistintamente no presente relatório descritivo como mutante SFV-S2-9 ou simplesmente S2-9.

A mutação R649H afeta o sinal de localização

nuclear SFV 648RRR que foi descrito como sendo responsável pelo transporte parcial de nsp2 para o núcleo celular (27). A alteração de Arg por Hys na posição 649 constitui uma alteração muito conservadora, o que poderá explicar o fato de que nenhum efeito evidente é observado sobre o transporte de nsp2 para o núcleo, nem no mutante duplo S2-9 (P718T/R649H), nem no mutante simples R649H. Este último mutante (R4 69H) não exibiu nenhuma redução da citopatogenicidade em comparação com o vetor SFV do tipo selvagem, o que indicou que as duas mutações nas posições 649 e 718 eram necessárias para eliminar o efeito citopático. Fazakerley et al descreveram uma alteração mais drástica na posição 649 (R649D), o que gerou a atenuação da neurovirulência de SFV no contexto de um genoma viral completo (6). Neste caso, a mutação R649D interrompeu completamente o transporte de nsp2 para o núcleo, embora não suprimisse o efeito citopático do vírus sobre células BHK. Todos estes dados sugeriram que a seqüência 648RRR de nsp2 poderia estar envolvida na citopatogenicidade do SFV.

0 mutante S2-9, que contém a mutação dupla P718T/R64 9H, pôde reproduzir-se em níveis que eram cerca de sessenta vezes mais baixos que os observados para o vetor SFV do tipo selvagem, o que poderia explicar a ausência de 20 citopatogenicidade do mencionado mutante S2-9. O nível de RNA subgenômico no mutante S2-9 foi apenas trinta vezes mais baixo que o do vetor SFV do tipo selvagem, o que indicou que a razão entre RNA subgenômico e genômico havia aumentado em cerca de duas vezes em mutante não citopático 25 S2-9. Esta razão era ainda maior pouco tempo após a transfecção, o que sugere que a síntese de RNA genômico no vetor não citopático poderia atrasar com relação à de RNA subgenômico. A redução da quantidade de RNA e o aumento da razão entre RNA subgenômico e genômico observada para o mutante S2-9 foram muito similares às descritas nos vetores SIN que contêm mutações não citopáticas na posição 726 de nsp2 (7, 22) . Estes resultados contradisseram, entretanto, os descritos por Perry et al para mutantes de SFV não citopáticos, em que a quantidade de RNAs mutantes foi maior que a do vírus do tipo selvagem e em que as razões entre RNA subgenômico e genômico também caíram (22), o que sugere que diferentes mecanismos puderam ser envolvidos no estabelecimento de uma reprodução de longa duração nos mutantes de SFV isolados por esse grupo. O nível mais baixo de reprodução de RNA no mutante S2-9 não sse deveu a um efeito em cis das mutações presentes na seqüência de RNA, pois uma replicase do tipo selvagem fornecida em trans pelo vetor SFV do tipo selvagem permitiu a recuperação dos níveis de RNA genômico e subgenômico do mutante S2-9 para valores próximos do vetor SFV do tipo selvagem. Diversos estudos conduzidos com os mutantes alfavírus demonstraram que mutações não citopáticas em nsp2 podem alterar a atividade proteolítica dessa proteína, que gera um hiperprocessamento de replicase (7) ou um processamento mais lento dessa poliproteína (22). Na presente invenção, não foram observadas diferenças claras do processamento de replicase entre o mutante S2-9 e o vetor SFV do tipo selvagem, nem por meio de tradução in vitro, nem por meio de análise de imunomanchas.

Apesar dos baixos níveis de reprodução do mutante S2-9, a quantidade de β-galactosidase (β-gal) produzida pelo vetor SFV-S2-9-LaZ (um vetor viral com base no mutante SFV S2-9) 24 horas após a transfecção foi muito similar à obtida com um vetor SFV do tipo selvagem que expressa o mesmo transgene. 0 nível de expressão de vetor S2-9 aumentou cerca de duas vezes em momentos posteriores após a transfecção, o que é correlacionado ao aumento observado 5 nos níveis de RNA. 0 nível de expressão de proteína recombinante em outros vetores não citopáticos descritos demonstrou grande variabilidade, variando de apenas 4% da expressão de tipo selvagem no caso do mutante SIN P726L (1) até 1000% no caso de SFV-PD mutante duplo desenvolvido por 10 Lundstrõm et al (21). A natureza não citopática deste vetor foi colocada em dúvida, entretanto, quando os mesmos autores demonstraram que a exprssão de GFP ou β-gal em células BHK infectadas com um vetor SFV-PD que conduz LacZ ou GFP como um gene marcador atinge o máximo após 4 8 horas 15 para cair drasticamente nos três a quatro dias seguintes (20) . Com relação a isso, vale a pena adicionar que o Exemplo 8 do presente relatório descritivo rompe um preconceito no estado da técnica, por demonstrar que o vetor SFV-PD desenvolvido por Lundstrõm et al (21) é 20 citopático. Alguns mutantes adicionais descritos por este grupo que contêm mutações sensíveis ao calor também puderam expressar altos níveis de proteína recombinante, mas somente sob temperatura permissiva (20, 21) . A razão pela qual o mutante S2-9 poderá expressar quantidades maiores da 25 proteína recombinante que o vetor SFV do tipo selvagem que contém níveis de RNA muito mais baixos poderá estar relacionada com a forte inibição da síntese de proteínas induzida por este último vetor. Duas publicações recentes indicam que a fosforiilação de EIF2alfa é o mecanismo por meio do qual os alfavírus induzem uma inibição de tradução na célula hospedeira posteriormente durante a infecção (15, 31) . Ao mesmo tempo, esses autores demonstram que o elemento aprimorador da tradução presente na extremidade 5' 5 do gene capsídeo permite uma tradução eficiente da poliproteína estrutural viral na presença de eIF2alfa fosforilado. Demonstrou-se que, quando o aprimorador da tradução de capsídeo for fundido em fase com a extremidade amino de uma proteína recombinante no vetor SFV ou SIN, ela 10 aumenta o nível de expressão de proteína recombinante em oito vezes (10, 28) . Este efeito não foi observado no contexto do vetor viral derivado do mutante SFV S2-9, provavelmente porque a tradução por meio de fosforilação de eIF2alfa não estava sendo inibida nas células transfectadas 15 com aquele vetor. A ausência de inibição da síntese de proteínas nas células transfectadas com o vetor viral derivado de mutante SFV S2-9 poderia ser responsável pela geração de altos níveis de expressão com níveis de RNA mais baixos que os atingidos com o vetor SFV do tipo selvagem.

A eficiência de embalagem do vetor viral derivado

do mutante SFV S2-9 foi cerca de seis unidades logarítmicas mais baixa que a do vetor SFV do tipo selvagem que carrega o mesmo transgene. Isso poderá dever-se aos baixos níveis de reprodução de RNA ou a uma deficiência na embalagem do 25 mutante SFV duplo (S2-9). Os experimentos de embalagem nos quais o RNA do mencionado vetor viral derivado do mutante SFV duplo S2-9 reproduziu-se em níveis quase normais por meio de cotransfecção de células com um vetor SFV do tipo selvagem foram capazes apenas de aumentar em quinze vezes o título das partículas virais S2-9, o que indicou que os baixos níveis de RNA foram apenas parcialmente responsáveis pela baixa eficiência de embalagem desse vetor. 0 vetor SFV que contém a mutação R64 9H foi apenas embalado em níveis 5 similares aos do vetor SFV do tipo selvagem, enquanto o vetor SFV que contém a mutação P718T (SFV-S2) foi embalado apenas de forma deficiente. Embora o fato de que o vetor SFV-S2 não foi capaz de reproduzir-se na maior parte das células trnsfectadas pudesse ser o fator responsável por 10 essa baixa eficiência de embalagem, tudo indica que esta mutação isoladamente ou em combinação com a mutação R64 9H afeta a encapsidação de RNA SFV em partículas virais. Os sinais de embalagem de SFV foram mapeados em uma região de genoma que compreende os nucleotídeos 2767 a 2824 (32) e 15 que não sobrepõe nenhuma das mutações presentes no mutante S2-9, localizado nas posições 3643 (R649H) e 3849-51 (P718T) . Não se pode descartar, entretanto, que essas mutações podem afetar a estrutura secundária de RNA genômico, alterando a capacidade de acesso dos sinais de 20 embalagem. São necessários mais estudos de mutagênese para determinar a função precisa das seqüências em embalagem de SFV.

Também se demonstrou que vetores virais derivados de S2-9 mutante podem ser utilizados eficientemente para 25 gerar linhagens celulares estáveis de células BHK que expressam constitutivamente proteínas recombinantes, sem a necessidade de isolamento de clones. Com este propósito, além das mutações P718T e R649H, o vetor deve conter o transgene desejado e um gene de seleção (tal como um gene que codifica uma proteína que confere resistência a um antibiótico etc.) útil para a seleção de células que tenham sofrido transdução eficiente. Utilizando LacZ como o transgene relator e o gene pac como um gene de seleção, foi 5 gerada uma linhagem celular que exibiu estabilidade muito alta, cerca de 85% das células que expressam β-gal após dez passagens no cultivo e com níveis de expressão que foram muito similares aos do vetor SFV do tipo selvagem. Isso ocorre em contraste com as observações em uma linhagem 10 celular similar gerada com um vetor SIN não citopático que conduz a mutação P726L em nsp2 e o gene LacZ como um gene relator que expressa β-gal em níveis que são cerca de 25 vezes mais baixos que o vetor SIN selvagem (1) . Neste último caso, a expressão de LacZ foi perdida em 4 5% das 15 células após cinco passagens, embora pudesse ser atingida uma estabilidade superior com este sistema caso a linhagem celular fosse derivada de uma população clonada de células que expressam β-gal.

O vetor viral derivado de S2-9 mutante pôde gerar 20 linhagens de células estáveis que expressam constitutivamente cardiotrofina-1 de rato (rCT). Neste caso, a expressão de rCT e pac de um vetor que contém dois promotores subgenômicos (SFV-S2-9-rCT-pac) levou à geração de linhagens celulares nas quais a expressão permaneceu 25 estável pelas cinco primeiras passagens, sendo gradualmente perdida a partir da passagem 5 (Figura 16). 0 vetor SFV-S2- 9-pac2A-rCT no qual o gene pac e o gene codificador de rCT são fundidos em fase utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease de FMDV 2A como um ligante levou, entretanto, à geração de uma linhagem de células muito estáveis que mantiveram uma alta expressão de rCT similar à obtida com um vetor SFV do tipo selvagem por pelo menos dez passagens em cultivo (Figura 17).

De forma similar, o vetor viral derivado do

mutante S2-9 também pôde gerar linhagens de células estáveis que expressam fator de crescimento similar a insulina I (IGF-I). Neste caso, a expressão de IGF-I e pac de um vetor que contém dois promotores subgenômicos (SFV- S2-9-IGF-pac) levou à geração de linhagens celulares nas quais a expressão permaneceu estável pelas primeiras quatro ou cinco passagens, sendo gradualmente perdida a partir da passagem 5 em diante e reduzida em oitenta vezes até atingir a passagem 10 (Figura 20). 0 vetor SFV-S2-9-pac2A- IGF no qual o gene pac e o gene codificador de IGF-I são fundidos em fase utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease de FMDV 2A como um ligante, levou, entretanto, à geração de uma linhagem de células com estabilidade mais alta que mantiveram uma alta expressão de IGF-I similar à obtida com um vetor SFV do tipo selvagem com uma redução de apenas cerca de quatro vezes em dez passagens em cultivo (Figura 20) . Este último vetor (SFV- S2-9-pac2A-IGF) exibiu ainda níveis de expressão de IGF-I em passagens anteriores que foram cerca de duas vezes maiores que os observados com o vetor SFV-S2-9-IGF-pac.

0 vetor SFV-S2-9-pac pode ser utilizado, portanto, para gerar rapidamente linhagens de células de mamíferos estáveis que podem gerar produtos heterólogos de interesse, tais como proteínas recombinantes, em grandes quantidades.

Vetor viral de acordo com a presente invenção Em um aspecto, portanto, a presente invenção refere-se a um vetor viral com base no vírus de Floresta Semliki (SFV), denominado a seguir vetor viral conforme a presente invenção, que compreende uma réplica do vírus de Floresta Semliki (SFV), em que a mencionada réplica compreende (i) a seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima replicase de SFV com mutações P718T e R649H na subunidade nsp2, (ii) um polinucleotídeo que compreende um gene de seleção e (iii) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse.

O vetor viral de acordo com a presente invenção 15 contém uma réplica de SFV que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica a replicase de SFV que compreende as mutações P718T e R649H na subunidade nsp2. Cada uma dessas mutações afeta um trio de nucleotídeos e cada uma delas está localizada na seqüência codificadora da 20 subunidade ou proteína não estrutural nsp2 da replicase viral. A mutação P718T indica que a prolina (P), localizada na posição 718 da seqüência de aminoácidos da proteína nsp2 codificada pelo SFV do tipo selvagem, é substituída por uma treonina (T) na proteína nsp2 codificada pelo vetor que 25 sofreu mutação (vetor viral de acordo com a presente invenção). Da mesma forma, a mutação R649H indica que arginina (R) , localizada na posição 64 9 da seqüência de aminoácidos da subunidade nsp2 codificada pelo SFV do tipo selvagem, é substituída por uma histidina (H) na subunidade nsp2 codificada pelo vetor que sofreu mutação (vetor viral de acordo com a presente invenção) . As duas posições 718 e 649 referem-se à posição do aminoácido substituído na seqüência já dividida e processada da subunidade nsp2.

Em uma realização específica da presente

invenção, a réplica de SFV presente no vetor viral de acordo com a presente invenção compreende SEQ ID N0 Ie SEQ ID N0 2:

SEQ ID N0 1 inclui a extremidade 5' necessária para a reprodução de SFV, em que a seqüência codifica a replicase de SFV com mutações P718T e R649H em nsp2 e, sobrepondo-se à replicase, um promotor subgenômico de SFV viral; e

SEQ ID N0 2 inclui a extremidade 3' necessária para reprodução de SFV que contém uma seqüência terminal de poliadeninas (Póli A) .

Estas duas seqüências juntas formam o esqueleto do vetor e o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a seqüência de 2 0 nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse são intercalados entre elas.

A expressão do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e a expressão do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o 25 produto heterólogo de interesse pode ser controlada por dois promotores subgenômicos de SFV independentes ou por um único promotor subgenômico que controle a expressão do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e a expressão do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse na forma de uma proteína de fusão.

Em uma realização específica, portanto, o vetor viral de acordo com a presente invenção compreende:

a. um polinucleotídeo que compreende a

seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse, cuja expressão é controlada por um primeiro promotor subgenômico de SFV (SGl); e

b. um polinucleotídeo que compreende um gene de seleção, cuja expressão é controlada por um segundo promotor subgenômico de SFV (SG2).

Os mencionados primeiro e segundo promotores subgenômicos de SFV podem ser idênticos ou diferentes. Em uma realização específica, a expressão do gene de seleção e 15 a expressão do produto heterólogo de interesse são controladas por dois promotores subgenômicos de SFV independentes idênticos ou diferentes.

Conforme exibido na Figura 8, o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um 20 produto heterólogo de interesse e o polinucleotídeo que compreende um gene de seleção estão localizados no interior da réplica de SFV, entre o promotor subgenômico sobreposto na replicase e a extremidade 31 necessária para reprodução de SFV.

Em uma realização específica, o polinucleotídeo

que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse (GOI, gene de interesse) está localizado abaixo no fluxo do promotor subgenômico (SGl) sobreposto na replicase e a sua expressão é controlada pelo mencionado SGl. Um outro promotor subgenômico SG2 que controla a expressão do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção, que está localizado abaixo no fluxo de SG2 é incorporado em seguida e a sua 5 expressão é controlada pelo mencionado promotor SG2 (Figura 8A) . Conforme mencionado acima, os promotores subgenômicos SGl e SG2 podem ser idênticos ou diferentes.

Em uma outra realização específica, o vetor viral de acordo com a presente invenção também é construído com os mesmos dois promotores subgenômicos (SGl e SG2) , mas trocando as posições do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse (GOI) e o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção, de tal forma que SGl controle a expressão do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e SG2 controle a expressão do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse (GOI) (Figura 8C). Conforme mencionado acima, os promotores subgenômicos SGl e SG2 podem ser idênticos ou diferentes.

Em uma outra realização específica alternativa, o vetor viral de acordo com a presente invenção compreende, abaixo no fluxo de um promotor subgenômico (tal como SGl), uma construção que compreende o polinucleotídeo que 25 compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse, fundido em fase por meio de um ligante de polinucleotídeos; em que o mencionado ligante é convenientemente um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão (auto)proteolítica pós-tradução.

Virtualmente qualquer seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão (auto)proteolítica pós-

5 tradução e, consequentemente, a (auto)protease ou a seqüência de peptídeos ou aminoácidos codificada pela mencionada seqüência de nucleotídeos pode ser utilizada no contexto da presente invenção.

Em uma realização específica, o mencionado 10 ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica uma (auto)protease que age em cis entre as proteínas resultantes da tradução do gene de seleção e da seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse; ou seja, em uma realização 15 específica, o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que, quando traduzida, fornece um local de divisão por meio do qual a poliproteína ou proteína de fusão expressa é processada após a tradução nas proteínas que formam a mencionada 20 proteína de fusão ou poliproteína. Para fins de simplicidade, portanto, a expressão "seqüência de nucleotídeos que codifica uma protease" é ocasionalmente utilizada no presente relatório descritivo como um sinônimo da expressão "seqüência de nucleotídeos que codifica um 25 local de divisão (auto)proteolítica pós-tradução". Por meio de uma ilustração não limitadora, a mencionada seqüência de nucleotídeos que codifica uma (auto)protease que age em cis entre as proteínas resultantes da tradução do gene de seleção e da seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse, vem de um vírus, tal como um pícornavírus, alfavírus etc. Em uma realização específica, o mencionado ligante compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica a região de codificação de seqüências 2A da poliproteína de vírus de doença dos pés e da boca (FMDV) ou autoprotease de FMDV 2A. Em uma outra realização específica, o mencionado ligante compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio de terminal carbóxi do capsídeo SFV com atividade proteolítica. Uma representação esquemática desta realização específica alternativa é exibida na Figura 8B, em que se demonstra que um promotor subgenômico (tal como SGl) controla a expressão da mencionada construção que compreende o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse (GOI) , fundido em fase por meio do mencionado ligante. A cotradução (tradução conjunta) dos dois genes (gene de seleção e GOI) ocorre, desta forma, em uma única poliproteína que, após a tradução, é rapidamente dividida por meio de ruptura no local de divisão (auto)proteolítica, produzindo a proteína de seleção e o produto heterólogo de interesse. 0 uso desses locais de ruptura (auto)proteolíticos pós-tradução foi descrito anteriormente no Pedido de Patente Europeu n° EP 736099 e também por Ryan

& Drew (35), particularmente o uso da seqüência que codifica a região 2A da poliproteína de FMDV (autoprotease FMDV 2A) , cujo teor completo é incluído por meio de referência. Alternativamente, em uma outra realização específica, o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão para uma protease que age em trans; neste 5 caso, a mencionada protease poderá ser expressa pela célula transfectada com o vetor viral de acordo com a presente invenção, seja de forma nativa ou recombinante ou, alternativamente, a mencionada protease poderá ser adicionada de forma exógena para liberar o produto 10 heterólogo de interesse da proteína de fusão que compreende a proteína de seleção e o produto heterólogo de interesse. Virtualmente qualquer seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão para uma protease que age em trans e, consequentemente, a seqüência de aminoácidos 15 codificada pela mencionada seqüência pode ser utilizada no contexto da presente invenção. Por meio de uma ilustração não limitadora, a mencionada seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão de uma protease que age em trans pode ser uma seqüência de nucleotídeos que codifica 20 uma seqüência de aminoácidos que pode ser dividida por uma endopeptidase etc. Por meio de uma ilustração não limitadora, a mencionada seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão para uma protease que age em trans é uma seqüência de nucleotídeos que codifica um local 25 de divisão para uma protease de vírus, um polivírus, por exemplo, tal como o Vírus de Corrosão do Fumo (ETV) etc. e a mencionada protease pode ser expressa pela célula transfectada com o vetor viral de acordo com a presente invenção (de forma nativa ou porque foi transformada de forma apropriada) etc.

Alternativamente, em uma outra realização específica, o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um 5 local de divisão que pode ser reconhecido por um reagente química, tal como brometo de cianogênio, divisão dos resíduos de metionina etc.

Na mencionada construção que compreende o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção fundido em fase ao polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse e a extremidade 3' do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção pode fundida em fase por meio do mencionado ligante à extremidade 5' do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse (GOI). Alternativamente, a extremidade 3' do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse (GOI) pode ser fundida em fase por meio do mencionado ligante à extremidade 5' do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção.

Quando expresso por células veículo, o gene de seleção presente no vetor viral de acordo com a presente invenção permite a seleção das células que conduzem o vetor 25 viral de acordo com a presente invenção dentre as células que não foram transfectadas ou que a perderam. Virtualmente qualquer gene de seleção que permita a seleção das células que conduzem o vetor viral de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para implementar a presente invenção. Por meio de uma ilustração não limitadora, o mencionado gene de seleção pode ser um gene cuja expressão confere resistência a um antibiótico, um gene que permita a síntese de um nutriente essencial que é omitido no meio de 5 cultivo, um gene que oferece uma vantagem seletiva às células transfectadas etc. Em uma realização específica, o mencionado gene de seleção é um gene cuja expressão que confere resistência a um antibiótico, um antibiótico tóxico para células de mamíferos, tal como o gene que confere 10 resistência à higromicina (hph) , o gene que confere resistência à neomicina (neoR), o gene que codifica a enzima N-acetiltransferase de puromicina (pac), cuja expressão confere às células que conduzem o vetor viral conforme a presente invenção resistência ao antibiótico 15 puromicina etc. 0 uso do gene pac permite a seleção das células que conduzem o vetor viral conforme a presente invenção daqueles que tenham sido transfectados ou que o perderam, adicionando puromicina ao meio.

0 produto heterólogo de interesse pode ser 20 virtualmente qualquer proteína ou peptídeo de interesse, tal como uma proteína relatora ou peptídeo (β-gal etc.); ou um peptídeo, proteína ou um anticorpo (ou um de seus fragmentos funcionais) com aplicações terapêuticas ou de diagnóstico; ou qualquer proteína recombinante ou peptídeo 25 de interesse. Da forma utilizada no presente, o termo "heterólogo" inclui adicionalmente "recombinante", ou seja, não aparece naturalmente. Exemplos não limitadores ilustrativos de produtos heterólogos de interesse incluem peptídeos e proteínas com aplicações terapêuticas, tais como fator de crescimento similar a insulina I (IGF-I), cardiotrofina-1 (CTl), oncostatina M (OSM), interferona alfa (tal como IFNa5), anfirregulina (AR), fator neutrófico derivado de células gliais (GDNF), proteína de células 5 endoteliais C/receptor de proteína C ativada (EPCR) , anticorpos (ou seus fragmentos funcionais) de interesse ou de aplicação terapêutica ou de diagnóstico etc. 0 polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse presente no 10 vetor viral conforme a presente invenção compreende, portanto, a seqüência que codifica o produto heterólogo de interesse.

0 conjunto de "gene replicase de SFV que sofreu mutação - GOI - gene de seleção" ou, alternativamente, o 15 conjunto "gene replicase SFV que sofreu mutação - gene de seleção - GOI", ladeado pelas seqüências 5' e 3' necessárias para reprodução, forma uma réplica de RNA que pode ser autoamplificada no interior da célula.

0 vetor viral conforme a presente invenção pode ser utilizado em forma de RNA ou também em forma de DNA.

Quando for utilizado em forma de RNA, o vetor viral conforme a presente invenção é completado com a adição de uma estrutura de tampa na sua extremidade 5'.

Quando utilizado em forma de DNA, o vetor 25 completo incluiria um promotor funcional em eucariotes, um promotor de citomegalovírus (CMV) , tal como a seqüência de réplica de SFV em qualquer das realizações definidas anteriormente e uma seqüência de sinal de término de transcrição, uma seqüência de sinal derivada, por exemplo, de SV4 0. O vetor é transcrito, portanto, em RNA no interior das células transfectadas, onde será autoamplificado.

Opcionalmente, se desejado, o vetor viral 5 conforme a presente invenção pode conter um amplificador de tradução ou transcrição genética, ou seja, um ácido nucleico que pode unir-se a um ativador, tal como um fator de transcrição, para aumentar o nível de tradução ou transcrição genética; como se sabe, o mencionado 10 amplificador pode ser adjacente ao gene sobre o qual atua ou distante dele. Da forma utilizada no presente relatório descritivo, o termo "amplificador" inclui os amplificadores de transcrição genética e amplificadores de tradução genética, incluindo as regiões conhecidas como IRES (Local 15 de Entrada de Ribossomos Interno) que, como se sabe, são regiões que favorecem o início de tradução. Se desejado, o mencionado amplificador pode ser formado em um conjunto com um ligante de polinucleotídeo (previamente definido) que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um 20 local de divisão (auto)proteolítico pós-tradução. Virtualmente, qualquer amplificador de tradução ou transcrição genética apropriado pode ser utilizado no contexto da presente invenção. Como forma de ilustração, o mencionado amplificador pode ser o amplificador de tradução 25 SFV mínimo "bl" que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica os 34 primeiros aminoácidos do capsídeo de SFV. Em uma realização específica, o vetor viral conforme a presente invenção compreende o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse fundido na sua extremidade 5' a um aprimorador ou, alternativamente, a um conjunto que compreende o mencionado amplificador e um ligante de polinucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos 5 que codifica um local de divisão (auto)proteolítica pós- tradução (previamente definido). Em uma realização específica, o vetor viral conforme a presente invenção compreende a seqüência precursora de IGF-I humana (IGF-IB) fundida na sua extremidade 5' com um conjunto que 10 compreende o amplificador de tradução mínimo ("bl") do capsídeo de SFV seguido pela seqüência de nucleotídeos que codifica a autoprotease de FMDV 2A (pSFVbl2A-IGF-IB, Exemplo 10).

As construções de RNA ou DNA para preparação do 15 vetor viral conforme a presente invenção podem ser obtidas por meio de métodos de biologia molecular convencional incluídos em manuais gerais de laboratório, tal como em Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Joseph Sambrook, David W. Russel, Eds., 2001, 3a Ed., Cold Spring Harbor, 20 Nova Iorque) ou em Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman e K. Struhl, Eds., vol. 2. Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, Nova Iorque, NY, atualizado em setembro de 2006.

0 vetor viral conforme a presente invenção,

derivado do mutante duplo não citopático isolado em SFV S2-

9 (P718T/R649H) exibe níveis de expressão muito similares aos do vetor SFV do tipo selvagem.

0 vetor viral conforme a presente invenção pode ser utilizado para a geração in vitro de linhagens celulares estáveis que podem expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse. 0 uso do mencionado vetor viral conforme a presente invenção para a geração in 5 vitro de linhagens celulares estáveis que podem expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse forma um aspecto adicional da presente invenção.

Linhagens de células estáveis conforme a presente

invenção

0 vetor viral conforme a presente invenção pode

ser utilizado para a geração de linhagens celulares estáveis in vitro que podem expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse.

Em um outro aspecto, portanto, a presente invenção refere-se a uma linhagem de células estáveis que pode expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse, a seguir linhagem de células estáveis conforme a presente invenção, caracterizada pelo fato de que é uma linhagem celular transfectada com um vetor viral conforme a presente invenção, que compreende uma réplica de SFV, em que a mencionada réplica compreende (i) a seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima replicase de SFV com mutações P718T e R649H na subunidade nsp2, (ii) um polinucleotídeo que compreende um gene de seleção e (iii) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse.

Conforme mencionado acima, segundo a presente invenção, uma linhagem celular é "estável" quando o percentual de células que expressam o produto heterólogo de interesse na passagem 10 é de mais de 85%, em que o mencionado percentual é capaz de ser mantido ou excedido em passagens sucessivas ou subsequentes. De forma similar, uma 5 expressão é "constitutiva" quando as linhagens de células estáveis mencionadas acima podem expressar adicionalmente o produto heterólogo em um nível quantitativamente alto (mais de 50% com relação à atingida 24 horas após a transdução quando as células sofrem transdução com o vetor do tipo 10 selvagem).

Em uma realização específica, a linhagem de células estáveis conforme a presente invenção é uma linhagem de células estáveis transfectadas com um vetor viral conforme a presente invenção cuja réplica de SFV compreende seqüências SEQ ID N0 Ie SEQ ID N0 2.

Em uma outra realização específica, a linhagem de células estáveis conforme a presente invenção é uma linhagem de células estáveis transfectadas com um vetor viral conforme a presente invenção que compreende:

a. um polinucleotídeo que compreende a

Os mencionados primeiro e segundo promotores subgenômicos de SFV podem ser idênticos ou diferentes.

Em uma outra realização específica, a linhagem de células estáveis conforme a presente invenção é uma linhagem de células estáveis transfectadas com um vetor viral conforme a presente invenção, em que o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos 5 que codifica um produto heterólogo de interesse está localizado abaixo no fluxo de um primeiro promotor subgenômico (SGl) sobreposto na replicase e sua expressão é controlada pelo mencionado promotor SGl e o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção está localizado abaixo no 10 fluxo de um segundo promotor subgenômico (SG2) que controla a expressão do mencionado polinucleotídeo que compreende o gene de seleção. Os mencionados promotores subgenômicos SGl e SG2 podem ser idênticos ou diferentes. A posição relativa entre os dois polinucleotídeos pode variar conforme o 15 mencionado acima com relação ao vetor viral conforme a presente invenção.

Em uma outra realização específica, a linhagem de células estáveis conforme a presente invenção é uma linhagem de células estáveis transfectada com um vetor 20 viral conforme a presente invenção que compreende, abaixo no fluxo de um promotor subgenômico (tal como SGl) , uma construção que compreende o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo 25 de interesse, fundido em fase por meio de um ligante de polinucleotídeos; em que o mencionado ligante é convenientemente um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão (auto)proteolítica pós-tradução. As características do mencionado ligante já foram mencionadas acima com relação ao vetor viral conforme a presente invenção. Em uma realização específica, o mencionado ligante compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica uma (auto)protease 5 que age em cis entre as proteínas resultantes da tradução do gene de seleção e da seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse, tal como a seqüência de nucleotídeos que codifica a região 2A da poliproteína de vírus de doença dos pés e boca (FMDV) ou 10 autoprotease de FMDV 2A ou a seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio terminal carbóxi do capsídeo de SFV etc. Ern urna outra realização específica, o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão para uma 15 protease que age em trans, tal como a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão para uma protease viral, tal como a protease de ETV etc., neste caso, a mencionada protease poderá ser expressa pela linhagem celular conforme a presente invenção ou, 20 alternativamente, a mencionada protease poderá ser adicionada de forma exógena. Em uma outra realização específica, o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão que pode ser reconhecido por um reagente 25 químico, tal como brometo de cianogênio, divisão dos resíduos de metionina etc., conforme mencionado acima.

Nesta realização específica da linhagem de células estáveis conforme a presente invenção em que um vetor viral conforme a presente invenção é utilizado compreende, abaixo no fluxo de um promotor subgenômico, uma construção que compreende o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o 5 produto heterólogo de interesse, fundido em fase por meio de um ligante de polinucleotídeo, o promotor subgenômico (tal como SGl) controla a expressão da mencionada construção que compreende o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a 10 seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse, fundido em fase por meio do mencionado ligante, em que a cotradução dos dois genes (gene de seleção e gene de interesse) que ocorre em uma única poliproteína que, após a tradução, é rapidamente dividida 15 por meio de rompimento no local de divisão (auto)proteolítica, que produz a proteína de seleção e o produto heterólogo de interesse. A posição relativa entre os dois polinucleotídeos no interior da construção mencionada acima pode variar conforme o mencionado acima

2 0 com relação ao vetor viral conforme a presente invenção, ou seja, na mencionada construção, a extremidade 3' do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção pode ser fundida em fase por meio do mencionado ligante à extremidade 5' do polinucleotídeo que compreende a 25 seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse ou vice-versa, em que a extremidade 3' do polinucleotídeo compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse pode ser fundido em fase por meio do mencionado ligante à extremidade 5' do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção. Diversos testes conduzidos pelos inventores demonstraram que este tipo de vetores virais conforme a presente invenção que compreende, abaixo no fluxo de um promotor sugenômico, uma 5 construção que compreende o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse, fundidos em fase por meio de um ligante que compreende uma seqüência de DNA, gera linhagens celulares 10 muito estáveis mantendo uma alta expressão do produto heterólogo de interesse similar ao obtido com um vetor SFV do tipo selvagem.

As duas características do gene de seleção e do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse foram mencionadas com relação ao vetor viral conforme a presente invenção.

Em uma realização específica, o gene de seleção presente no vetor viral conforme a presente invenção 20 utilizado para gerar a linhagem de células estáveis conforme a presente invenção é um gene cuja expressão confere resistência a um antibiótico, um gene que permite a síntese de um nutriente essencial que é omitido no meio de cultivo, um gene que oferece uma vantagem seletiva às 25 células transfectadas etc., tal como o gene que confere resistência à higromicina (hph), o gene que confere resistência a neomicina (neoR), o gene que codifica a enzima N-acetiltransferase puromicina (pac), cuja expressão confere às células que conduzem o vetor viral conforme a presente invenção resistência ao antibiótico de puromicina etc.

De forma similar, em uma realização específica, o produto heterólogo de interesse expresso pela linhagem de 5 células estáveis conforme a presente invenção é uma proteína relatora (β-gal etc.); ou uma proteína, peptídeo ou anticorpo (ou seu fragmento) com aplicações terapêuticas ou de diagnóstico; ou qualquer outra proteína recombinante ou peptídeo de interesse; exemplos não limitadores 10 ilustrativos dos mencionados produtos heterólogos de interesse incluem peptídeos e proteínas com aplicações terapêuticas, tais como IGF-I, CTl, OSM, IFN, AR, GDNF, EPCR7 anticorpos de interesse ou com aplicação terapêutica ou de diagnóstico etc.

Em uma realização específica, a linhagem de

células estáveis conforme a presente invenção é uma linhagem de células estáveis que expressa constitutivamente cardiotrofina-1 de rato (rCT). Dois tipos de linhagens celulares foram gerados utilizando dois vetores virais 20 diferentes conforme a presente invenção. Em um caso, a expressão de rCT e pac de um vetor viral conforme a presente invenção que contém dois promotores subgenômicos (SFV-S2-9-rCT-pac) levou à geração de linhagens celulares nas quais a expressão permaneceu estável pelas cinco 25 primeiras passagens, sendo gradualmente perdida a partir da passagem 5 em diante (Figura 16) . Em outro caso, entretanto, quando for utilizado o vetor conforme a presente invenção identificado como SFV-S2-9-pac2A-rCT, no qual o gene pac e o gene codificador de rCT são fundidos em fase utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica a autoprotease de FMDV 2A como um ligante, foram obtidas linhagens de células muito estáveis que mantiveram uma alta expressão de rCT similar à obtida com um vetor SFV do tipo 5 selvagem por pelo menos dez passagens em cultivo (Figura 17) .

Em uma outra realização específica, a linhagem de células estáveis conforme a presente invenção é uma linhagem de células estáveis que expressa fator de 10 crescimento similar a insulina I (IGF-I) . Dois tipos de linhagens celulares foram gerados utilizando dois vetores virais diferentes conforme a presente invenção. Em um caso, a expressão de IGF-I e pac de um vetor viral conforme a presente invenção que contém dois promotores subgenômicos 15 (SFV-S2-9-IGF-pac) levou à geração de linhagens celulares nas quais a expressão permaneceu estável pelas primeiras quatro ou cinco passagens, sendo gradualmente perdida a partir da passagem 5 em diante e reduzida em oitenta vezes ao atingir a passagem 10 (Figura 20) . Ao utilizar-se o 20 vetor viral conforme a presente invenção identificado como SFV-S2-9-pac2A-IGF, no qual o gene pac e o gene codificador de IGF-I são fundidos em fase utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease de FMDV 2A como um ligante, entretanto, foram geradas linhagens celulares com 25 estabilidade mais alta que mantiveram uma alta expressão de IGF-I similar à obtida com um vetor SFV do tipo selvagem com uma redução de apenas cerca de quatro vezes em dez passagens em cultivo (Figura 20) . Este último vetor (SFV- S2-9-pac2A-IGF) exibiu ainda níveis de expressão de IGF-I em passagens anteriores que foram cerca de duas vezes maiores que os observados com o vetor SFV-S2-9-IGF-pac.

As linhagens de células estáveis conforme a presente invenção podem ser obtidas por meio dos métodos de biologia molecular convencionais, tais como por meio de transfecção de células apropriadas ou linhagens celulares com o vetor viral conforme a presente invenção etc., incluídos em manuais gerais de laboratório, tal como em Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Joseph Sambrook, David W. Russel, Eds., 2001, 3a Ed., Cold Spring Harbor, Nova Iorque) ou em Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman e K. Struhl, Eds., vol. 2. Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, Nova Iorque, NY, atualizado em setembro de 2006.

A célula a ser transfectada pode ser virtualmente qualquer célula eucariótica ou linhagem celular que permita a reprodução do vetor viral conforme a presente invenção. A mencionada célula ou linhagem celular 20 pode ser uma linhagem de mamífero. Em uma realização específica, a mencionada célula ou linhagem celular a ser transfectada é uma linhagem celular derivada de fibroblastas de rins de hamster, tal como a linhagem de células BHK-21.

A transfecção das células é conduzida por meio de

qualquer processo físico ou químico convencional que permite a introdução do vetor viral conforme a presente invenção nas células, tal como por meio de eletroporação ou de conjugação do material genético com lipídios catiônicos. Estes processos serão úteis para a transfecção do vetor viral conforme a presente invenção na forma de RNA ou de DNA. Em uma realização específica, a transfecção é conduzida por meio de eletroporação (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al, mencionado acima).

Método de geração de linhagens de células estáveis in vitro conforme a presente invenção

Em um outro aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de geração in vitro de uma

linhagem de células estáveis conforme a presente invneção, com a capacidade de expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse, a seguir método de geração de linhagens de células estáveis conforme a presente invenção, que compreende:

I. transfecção de células com um vetor viral

conforme a presente invenção, que compreende uma réplica do SFV, em que a mencionada réplica compreende (i) a seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima SFV replicase com mutações P718T e R649H na subunidade nsp2, (ii) um 20 polinucleotídeo que compreende um gene de seleção e (iii) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse;

II. seleção das células estáveis geradas na

etapa I; e

III. cultivo e manutenção das células estáveis.

Conforme mencionado acima, a célula a ser

transfectada pode ser virtualmente qualquer célula eucariótica ou linhagem celular que permita a reprodução do vetor viral conforme a presente invenção. Como forma de ilustração não limitadora, a mencionada célula ou linhagem celular a ser transfectada pode ser uma linhagem de mamíferos. Em uma realização específica, a mencionada 5 célula ou linhagem celular a ser transfectada é uma linhagem celular derivada de fibroblastas de rins de hamster, tal como a linhagem de células BHK-21.

As características do vetor viral conforme a presente invenção já foram mencionadas anteriormente. O vetor viral conforme a presente invenção pode ser utilizado em forma de RNA ou, alternativamente, em forma de DNA. Quando for utilizado em forma de RNA, o vetor viral conforme a presente invenção é completado com a adição de uma estrutura de tampa na sua extremidade 5'. Quando for utilizado em forma de DNA, o vetor completo inclui um promotor funcional em células eucarióticas, um promotor de citomegalovírus (CMV) , tal como a seqüência de réplica de SFV em qualquer das realizações definidas anteriormente com relação ao vetor viral conforme a presente invenção e uma seqüência de sinal de término de transcrição, tal como uma seqüência de sinal derivada de SV4 0.

As células podem ser transfectadas por meio de qualquer processo físico ou químico convencional que permita a introdução do vetor viral conforme a presente 2 5 invenção nas células, tal como por meio de eletroporação ou de conjugação do material genético com lipídios catiônicos. Estes processos serão úteis para a transfecção do vetor viral conforme a presente invenção na forma de RNA ou de DNA. Em uma realização específica, a transfecção é conduzida por meio de eletroporação (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al, mencionado acima) .

Células esteáveis serão selecionadas de uma forma diferente conforme o gene de seleção incorporado ao vetor viral conforme a presente invenção, por meio do quê as células são transfectadas. Conforme explicado acima, a expressão do gene de seleção confere às células transf ectadas uma vantagem que permite a sua seleção. Será suficiente submeter as células a condições seletivas para as células transfectadas. Quando o gene pac for utilizado como o gene de seleção, a sua expressão transfectada nas células torna-as resistentes a puromicina. Neste caso, será suficiente adicionar puromicina ao meio de cultivo para eliminar as células não transfectadas ou as células que perderam o vetor viral conforme a presente invenção.

As células estáveis são cultivadas e mantidas em condições e meios de cultivo convencionais, conforme o tipo de célula transfectada, e sua manutenção sob o estímulo seletivo para células transfectadas (na presença, por 20 exemplo, de puromicina). Quando as células forem BHK-21, elas são cultivadas em condições já descritas (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al, mencionado acima).

Método de produção de produtos heterólogos in vitro de interesse

A linhagem de células estável conforme a presente invenção pode ser utilizada para a geração in vitro de produtos heterólogos de interesse. Como resultado, o uso da mencionada linhagem de células estáveis conforme a presente invenção para a geração in vitro de produtos heterólogos de interesse forma um aspecto adicional da presente invenção.

Em um outro aspecto, portanto, a presente 5 invenção refere-se a um método de produção in vitro de produtos heterólogos de interesse que compreende o cultivo de uma linhagem de células estáveis de acordo com a presente invenção sob condições que permitam a expressão do produto heterólogo de interesse contido no vetor viral 10 conforme a presente invenção utilizado para gerar a mencionada linhagem de células estáveis conforme a presente invenção.

Mais especificamente, o método de elaboração in vitro de produtos heterólogos de interesse compreende:

I. transfecção de células com um vetor viral

conforme a presente invenção que compreende uma réplica do SFV, em que a mencionada réplica compreende (i) a seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima replicase de SFV com mutações P718T e R649H na subunidade nsp2, (ii) um 20 polinucleotídeo que compreende um gene de seleção e (iii) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse;

II. seleção das células estáveis geradas na etapa I (linhagens de células estáveis conforme a presente

invenção);

III. cultivo e manutenção das mencionadas células estáveis (linhagens celulares conforme a presente invenção); e, se desejado, IV. extração do produto heterólogo de

interesse.

As etapas I, II e III correspondem realmente à geração da linhagem de células estáveis conforme a presente invenção que expressa constitutivamente o produto heterólogo de interesse. Neste caso, a célula será transfectada com um vetor viral conforme a presente invenção que inclui um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse que deve ser produzido. Conforme indicado acima, o mencionado polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse é inserido no vetor viral conforme a presente invenção em uma posição tal que a sua expressão é controlada por um promotor subgenômico de SFV.

Conforme mencionado acima, o produto heterólogo de interesse pode ser qualquer proteína ou peptídeo de interesse, tal como uma proteína relatora (β-gal etc.); ou uma proteína, peptídeo ou anticorpo (ou um de seus 20 fragmentos) com aplicações terapêuticas ou de diagnóstico; ou qualquer outra proteína recombinante ou peptídeo de interesse. Exemplos não limitadores ilustrativos de produtos heterólogos de interesse incluem peptídeos e proteínas com aplicações terapêuticas, tais como fator de 25 crescimento similar a insulina I (IGF-I), cardiotrofina-1 (CTl) , oncostatina M (OSM) , interferona alfa (tal como IFNa5), anfirregulina (AR), fator neutrófico derivado de células gliais (GDNF), proteína de células endoteliais C/receptor de proteína C ativada (EPCR), anticorpos de interesse ou com aplicação terapêutica ou de diagnóstico etc.

As etapas de geração da linhagem de células estáveis conforme a presente invenção serão conduzidas conforme descrito anteriormente no método de geração de linhagens de células estáveis conforme a presente invenção.

0 produto heterólogo de interesse pode ser ocasionalmente utilizado na forma em que se encontra no meio de cultivo, ou seja, sem isolamento nem purificação; 10 pode ocasionalmente ser vantajoso, entretanto, extrair (isolar) e opcionalmente purificar o produto heterólogo de interesse. Neste caso, a extração do produto heterólogo de interesse pode ser conduzida a partir de um lisato celular quando o produto heterólogo de interesse for intracelular 15 (ele não pode ser secretado para o meio) ou do sobrenadante das células estáveis quando os produtos heterólogos de interesse puderem ser secretados para o meio circunvizinho.

Qualquer processo convencional de extração e purificação de peptídeos e proteínas que é apropriado para 20 o produto heterólogo específico de interesse que deve ser produzido, dependendo da natureza do mencionado produto, pode ser utilizado para a extração. Exemplos não limitadores ilustrativos desses processos incluem processos baseados na separação por tamanho e/ou carga elétrica 25 (precipitação em sulfato de amônio, filtragem de gel, ultracentrifugação, eletroforese, eletroconcentração etc.), por meio de imunopurificação (coluna de afinidade, imunoprecipitação etc.), separação por meio de união a um ligante específico etc. O objetivo dos exemplos a seguir é ilustrar a presente invenção sem pretender limitá-la.

Exemplos Materiais e Métodos 5 Construções de plasmídeos

Os plasmídeos pSFV-1 e pSFV3-LacZ, gentilmente fornecidos pelo Dr. P. Lilijestrôm (Instituto Karolinska, Estocolmo) (18), foram descritos anteriormente. Para construir os plasmídeos pSFV-S2 e pSFV-S3, um fragmento de 10 3,5 kb que contém a área de nsp2 a sofrer mutagênese foi extraído de pSFV-1 com Sacl/Xhol e foi subclonado em plasmídeo pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, Estados Unidos) digerido com as mesmas enzimas, que geraram o plasmídeo Blu-nsp2. As mutações P718T e P718F foram 15 introduzidas em nsp2 neste plasmídeo por meio de PCR cruzado. Os primers externos SF3669-VS (SEQ ID N0 3) e SF4096-RS (SEQ ID N0 4) foram combinados seqüencialmente com os pares de oligonucleotídeos projetados para introduzir as mutações correspondentes. Para S2, o par de 20 oligonucleotídeos interno utilizado foi mutS2-VS (SEQ ID N0 5) e mutS2-RS (SEQ ID N0 6) que se sobrepõe em 2 5 nucleotídeos e em que o CCC de códons que codifica Pro 718 em nsp2 sofreu mutação em ACG que codifica Thr (sublinhado). Para S3, os oligonucleotídeos internos 25 utilizados foram mutS3-RS (SEQ ID N0 7) e mutS3-RS (SEQ ID N0 8) que se sobrepõe em 25 nucleotídeos e em que o CCC de códons que codifica Pro 718 em nsp2 sofreu mutação em TTT que codifica Phe (sublinhado). PCR cruzado foi conduzido com Pfu e produziu fragmentos de DNA de 43 0 bp que foram digeridos com EagI/NarI e clonados em Blu-nsp2 após digestão parcial com EagI e digestão completa com NarI, que gerou plasmídeos Blu-nsp2-S2 ou Blu-nsp2-S3,

respectivamente. A presença de mutações S2 ou S3 foi confirmada nesses plasmídeos por meio de sequenciamento. Por fim, um fragmento de Sacl/Xhol com 3,5 kb que contém nsp2 que sofreu mutação foi extraído de Blu-nsp2-S2 ou de Blu-nsp2-S3 e foi subclonado em pSFV-1 digerido com as mesmas enzimas, que geraram os plasmídeos pSFV-S2 e pSFV- S3, respectivamente. A fim de clonar LacZ nesses plasmídeos, um fragmento de DNA com 3,86 kb que contém esse gene foi extraído com Xbal/Xmal de pSFV3-LacZ e foi clonado em pSFV-S2 ou pSFV-S3 digerido com as mesmas enzimas, que geraram plasmídeos pSFV-S2-LacZ e pSFV-S3-LacZ, respectivamente.

A fim de gerar o plasmídeo pSFV-pac, um fragmento de 0,95 kb de DNA que contém o gene puromicina N- acetiltransferase (pac) foi extraído de plasmídeo pBSpac (5) (gentilmente fornecido pelo Dr. J. Ortin, CNB, Madri, 20 Espanha) por meio de digestão com NotI e HpaI. Após corte obtuso da extremidade NotI com Klenow, este fragmento foi clonado em pSFV-1 digerido com SmaI, que gerou pSFV-pac. 0 plasmídeo pSFV-S2-pac foi gerado mediante substituição do fragmento de Sacl/Xhol de 3,5 kb que contém a maior parte 2 5 de nsp2 em pSFV-pac com o mesmo fragmento obtido de Blu- nsp2-S2, que contém a mutação S2.

O plasmídeo pSFV-S2-9-LacZ foi gerado mediante substituição do fragmento Rsrll/Xhol com 3,2 kb em pSFV3- LacZ com o mesmo fragmento obtido de pSFV-S2-9-pac cobrindo a área da replicase que contém mutações P718T e R649H de nsp2. A fim de gerar o vetor duplo pSFV-S2-9-LacZ-pac, um conjunto de 1,9 kb que contém o promotor subgenômico de SFV seguido pelo gene pac foi extraído de pSFV-pac com 5 Mscl/Spel e foi clonado em pSFV-S2-9-LacZ digerido com Smal/Spel.

A fim de gerar pSFV-RHR-pac, a primeira mutação R649H de nsp2 foi introduzida em Blu-nsp2 por meio de PCR. Resumidamente, foi obtido um fragmento de PCR com 1,67 kb 10 com os oligonucleotídeos SF1947-VS (SEQ ID N0 9) e SF3623- S29-RS (SEQ ID N0 10) com Pfu utilizando pSFV-1 como molde. Neste último oligonucleotídeo, o códon CGC foi substituído por CAC, que gera a mutação R64 9H em nsp2 (sublinhado; observe que o primer contém a seqüência reversa). A 15 seqüência deste oligonucleotídeo compreende o local NarI de nsp2 próximo da mutação R649H (indicado em itálico). O fragmento de PCR foi digerido com BstEIl/NarI, que gerou um fragmento de DNA com 1,36 kb que foi clonado em Blu-nsp2 digerido com as mesmas enzimas, de forma a gerar Blu-nsp2- 20 RHR. Por fim, um fragmento de Sacl/Xhol de 3,5 kb contendo nsp2 que sofreu mutação foi extraído de Blu-nsp2-RHR e subclonado em pSFV-pac digerido com as mesmas enzimas, que geraram o plasmídeo pSFV-RHR-pac.

Transcrição e transfecção de RNA 0 DNA de plasmídeo purificado foi linearizado por

meio de digestão com SpeI e transcrito na presença de um análogo de tampa (New England Biolabs, Estados Unidos) utilizando polimerase de SP6 (Amersham-Pharmacia). Os RNAs sintetizados in vitro foram transfectados em células BHK-21 por meio de eletroporação conforme descrito anteriormente (17) .

Embalagem de réplicas

A embalagem do RNA recombinante de SFV em partículas virais (vp) foi conduzida por meio da coeletroporação de células BHK-21 com o RNA recombinante e com RNAs SFV auxiliar-S2 e auxiliar-C-S219A conforme descrito (29). As partículas de SFV que conduzem LacZ como um gene indicador foram tituladas por meio de manchas de Χ- gal das células de BHK-21 com diluições em série do vírus. Para as partículas de SFV que conduzem o gene de pac, a titulação foi conduzida por meio de imunofluorescência indireta das células BHK-21 infectadas com um antissoro de coelho policlonal específico contra SFV nsp2 como um anticorpo primário (E. Casales, resultados ainda não publicados).

Seleção e passagens das linhas de células resistentes a puromicina

Uma solução de 1 mg/ml de puromicina (Sigma, St. 2 0 Louis, Estados Unidos) em MEM foi preparada, filtrada, parcelada e armazenada a -20 °C. Após transfecção das células de BHK com os RNAs recombinantes de SFV que conduzem o gene pac, as células foram mantidas em recuperação por 24 horas antes da adição de puromicina a 5 25 μg/ml. A fim de selecionar as células resistentes a puromicina, o meio foi substituído a cada dois a três dias com um novo meio contendo puromicina. Após a seleção, as passagens das células sempre foram conduzidas na presença de puromicina na concentração indicada. No caso de células transfectadas com SFV-S2-pac, locais individuais foram clonados, expandidos e armazenados congelados em nitrogênio líquido. 0 meio utilizado para cultivar as células foi MEM Glasgow BHK-21 (Invitrogene, Estados Unidos) suplementadas 5 com soro de feto bovino a 5%, meio de fosfato triptose a 10% (Invitrogene, Estados Unidos), 2 mM de glutamina, 20 mM de HEPES, estreptomicina a 100 μg/ml e penicilnia a 100 Ul/ml (meio BHK completo) .

Mapeamento das mutações adaptativas 0 RNA celular total das células resistentes à

puromicina obtidas após a transfecção com o RNA SFV-S2-pac foi isolado com o kit RNeasy (Qiagen, Alemanha) . 5 pg de RNA de cada clone foram utilizados para sintetizar cDNA com transcriptase reversa de M-MLV (Promega, Madison, Estados 15 Unidos) utilizando um oligonucleotídeo com sentido negativo complementar a nucleotídeos SFV 4977 a 5010 (SEQ ID N0 11) como um primer. Após a transcrição reversa, os cDNAs foram amplificados por meio de trinta ciclos de PCR com Taq Plus Long (Stratagene, La Jolla, Estados Unidos) com o mesmo 20 primer com sentido negativo e um oligonucleotídeo com sentido positivo complementar a nucleotídeos SFV 104 0 a 1074 (SEQ ID N0 12). 0 fragmento de 3971 bp resultante foi digerido com BcII (1106) e Bsu36I (4916) e foi clonado nos locais pSFV-pac correspondentes. O DNA de plasmídeo 25 derivado de cada clone individual foi linearizado e utilizado como um molde para sintetizar RNA in vitro, que foi transfectado em seguida em células BHK-21 a fim de determinar a sua capacidade de conferir resistência a puromicina. Quando a subregião compreendida entre as posições 1106 e 4916 era capaz de permitir a sobrevivência e divisão celular na presença de puromicina, como foi o caso do clone S2-9, ela foi completamente sequenciada a partir de dois clones de plasmídeos independentes.

Análise de RNA

O RNA total foi extraído das células transfectadas ou de certas linhagens celulares utilizando um minikit RNeasy (Qiagen, Alemanha) e foi analisado por meio de Northern Blot. 3 pg de RNA total foram fracionados 10 por tamanho em gel de agarose a 1,2% com formaldeído, transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Hybond-N+, Amersham) e hibridizados com um oligonucleotídeo marcado com 32P específico para o promotor subgenômico de SFV (SEQ ID N0 13) . As quantidades relativas dos RNAs de SFV 15 genômicos e subgenômicos foram determinadas utilizando um PhosphorImager (Cyclone, Packard, Estados Unidos) e software Optiquant (versão 4.0, Packard).

Análise da expressão e processamento de replicase Para os experimentos de tradução in vitro, os RNAs de SFV foram transcritos em primeiro lugar in vitro conforme descrito anteriormente, purificados com o kit RNeasy (Qiagen, Alemanha) , misturados com lisatos de reticulócitos de coelho tratados com nuclease (Promega) na presença de uma mistura de [35S] -metionina e [35S] -cisteína (Amersham, Estados Unidos) e foram incubados por noventa minutos a 3 0 0C conforme as instruções do fabricante. Cada reação de tradução continha 2,3 pg de RNA transcrito purificado. As reações de tradução terminaram mediante adição do tampão de carga Laemmli e foram analisadas por meio de SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 8% seguidos por autorradiografia. Os lisatos foram obtidos para os experimentos de análise de imunomanchas das células BHK-21 transf ectadas com os vetores SFV por meio de incubação em 5 um tampão que contém 1% Igepal (Sigma, Estados Unidos) , 50 mM de Tris HCl, pH 7,6, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA e PMSF a 1 pg/ml (Sigma, St. Louis, Estados Unidos) e foram clarificados por meio de centrifugação por seis minutos a 6000 rpm em um microcentrifugador refrigerado e 10 quantificados por meio de análise Bradford. Os lisatos foram analisados por meio de SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 8%, transferidos para uma membrana de nitrocelulose e incubados com antissoros de coelho policlonais específicos contra SFV nsp3 e nsp2 (E. Casales, 15 resultados ainda não publicados) ou actina (Sigma, St. Louis, Estados Unidos) como anticorpos primários, respectivamente. Um antissoro de carneiro específico para imunoglobulinas de coelho conjugado com HRP foi utilizado como anticorpo secundário. As proteínas foram observadas 20 utilizando Reagente de Quimioluminescência Western Lightning Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Estados Unidos), conforme as instruções do fabricante. Para os estudos de localização nuclear, imunofluorescência indireta das células transfectadas foi conduzida utilizando como 25 anticorpo primário um Acm específico contra SFV nsp2 citoplasmático (gentilmente fornecido por W. Bodemer) ou um Acm específico contra o nsp2 SFV nuclear (gentilmente fornecido pelo Dr. L. Kaariainen) (16).

Análise da expressão de β-gal As células transfectadas foram lisadas conforme descrito acima e a atividade total do β-gal presente no lisato foi medida conforme descrito (17), ou elas foram manchadas nos momentos indicados com X-gal. A quantidade da 5 proteína produzida por cada célula foi obtida dividindo-se a quantidade média de β-gal detectada por placa pela quantidade média das células transfectadas em cada placa.

Exemplo 1

Construção e Caracterização de Vetores SFV que Carregam Mutações Não Citopáticas Derivadas de SIN

Uma possível abordagem de geração de novos vetores alfavírus não citopáticos é a introdução das mutações descritas anteriormente em outros alfavírus, utilizando a homologia de seqüências compartilhada pelos 15 diferentes vírus deste gênero. Segundo esta abordagem, foi avaliado o efeito das mutações não citopáticas descritas no vírus SIN em um vetor de expressão derivado de SFV. Havia sido demonstrado anteriormente que as mutações que afetaram o resíduo 726 da subunidade nsp2 de SIN Rep reduzem 2 0 consideravelmente a citopatogenicidade desse vírus, um fato que foi correlacionado com um nível mais baixo de reprodução de RNA nos mutantes (7, 22) . Duas mutações que afetaram este resíduo, P726T e P726F, que haviam sido descritas como parcialmente citopáticas e não citopáticas 25 para SIN, respectivamente, foram introduzidas no resíduo homólogo de nsp2 no vetor pSFV-1, que gerou os mutantes pSFV-S2 e pSFV-S3, conduzindo mutações P718T ou P718F em nsp2, respectivamente. A fim de avaliar a citopatogenicidade desses novos vetores, o gene relator LacZ foi clonado em seguida a partir do promotor subgenômieo viral, que gerou os vetores pSFV-S2-LaeZ e pSFV-S3-LaeZ. 0 RNA foi sintetizado in vitro para cada um desses plasmídeos e foi eletroporado em células BHK-21, que 5 foram cultivadas e nas quais a expressão de β-gal foi analisada por meio de manchas de X-gal em diferentes momentos após a transfecção (Figura 1) . Ao contrário das células eletroporadas com o RNA SFV-LacZ controle no qual,

24 horas após a transfecção, mais de 95% das células 10 expressaram β-gal e exibiram um fenótipo citopático, apenas um pequeno percentual das células transfectadas com os RNAs de SFV-S2-LacZ ou SFV-S3-LacZ expressou β-gal 24 horas após a transfecção, sem exibir uma morfologia citopática. No caso de SFV-S2-LacZ, o número de células positivas aumentou 15 ao longo do tempo, podendo formar grandes colônias de células que expressam β-gal cinco dias após a eletroporação. Este efeito foi consideravelmente menor em SFV-S3-LacZ, com o qual nunca foram observadas colônias azuis no dia 5 após manchas de X-gal. Estes dados sugerem 20 que as mutações P718T e P718F poderão bloquear a reprodução viral ou a expressão de transgene, mas elas geram variantes não citopáticas com frequência relativamente alta que poderão ser o resultado de mutações adaptativas secundárias durante a transcrição in vitro ou reprodução de SFV.

Exemplo 2

Seleção e mapeamento das réplicas derivadas de SFV-S2 que contêm novas mutações adaptativas A fim de selecionar as populações celulares que contêm réplicas de SFV não citopáticas, o gene relator LacZ foi substituído em plasmídeo pSFV-S2-LacZ com o gene que codifica o marcador de seleção dominante N- acetiltransferase de puromicina (pac) que confere resistência a puromicina, que gerou o plasmídeo pSFV-S2- 5 pac. Utilizando este plasmídeo como molde, RNA foi sintetizado in vitro e eletroporado em células BHK-21. Puromicina a 5 pg/ml foi adicionada 24 horas após a eletroporação, o que levou à seleção de colônias resistentes à droga que foram expandidas em seguida. A fim 10 de identificar as possíveis mutações adaptativas nas réplicas presentes nas células selecionadas, o RNA total foi extraído de clones individuais e um fragmento de 3,9 kb da replicase SFV que compreende toda a seqüência de nsp2 foi amplificado por meio de RT-PCR com primers específicos. 15 A região nsp2 da replicase foi amplificada porque a maior parte das mutações não citopáticas descritas no alfavírus havia sido mapeada nesta região. O fragmento de cDNA resgatado de cada clone foi subclonado no plasmídeo original pSFV-pac que substitui a seqüência de nsp2 do tipo 20 selvagem. Para verificar se haviam sido resgatadas mutações não citopáticas, RNA foi sintetizado in vitro de cada um dos novos plasmídeos e utilizado para eletroporar células BHK-21. Vinte e quatro horas após a transfecção, adicionou- se puromicina a 5 μg/ml e as células foram manchadas com 25 violeta de metila em tempos diferentes, a fim de comparar o seu crescimento com o observado nas células transfectadas com o mutante inicial SFV-S2-pac ou com o SFV-pac original. Um dos clones, o SFV-S2-9-pac, exibiu um claro fenótipo não citopático, pois ele conferiu resistência à puromicina à maior parte das células transfectadas (Figura 2) . Outros clones testados exibiram um padrão similar ao de SFV-S2 e não foram adicionalmente analisados neste estudo. As células transfectadas com o SFV-pac original exibiram um 5 claro efeito citopático e a maior parte delas morreu antes do dia 4. 0 sequenciamento do fragmento de nsp2 de pSFV-S2- 9-pac demonstrou que, além da mutação original P718T, houve uma segunda mutação adaptativa na posição 64 9 de nsp2 na qual Arg havia sido substituído por Hys. Esta nova mutação 10 afeta o sinal de localização nuclear 648RRR (27) de SFV nsp2 que, em SFV-S2-9, é alterado para 648RHR.

Exemplo 3

Efeito de mutação R649H sobre a citopatogenicidade e sobre a localização nuclear de nsp2

A fim de verificar o efeito da mutação R649H

isoladamente sobre a citopatogenicidade de SFV, esta mutação foi introduzida no plasmídeo pSFV-pac, de forma a gerar o plasmídeo pSFV-RHR-pac. 0 RNA deste plasmídeo foi transcrito e eletroporado em células BHK-21, que foram 20 mantidas em recuperação por 24 horas. Puromicina a 5 pg/ml foi adicionada em seguida e o crescimento das células foi analisado em diferentes momentos manchando-se as células com violeta de metila conforme descrito acima (Figura 2, coluna à direita). SFV-RHR-pac exibiu um padrão muito 25 similar ao observado para o vetor original SFV-pac, induzindo um efeito citopático forte e precoce que levou à morte a maior parte das células antes do dia 4. Estes resultados sugerem que a ausência de citopatogenicidade do vetor SFV-S2-9 deveu-se à combinação de mutações P718T e R649H. A fim de verificar o efeito da mutação R649H sobre a localização nuclear de nsp2, as células BHK-21 foram transfectadas com o RNA dos vetores que continham essa mutação (SFV-S2-9-pac) e SFV-RHR-pac) ou com vetores que 5 não os continham (SFV-pac e SFV-S2-pac) e foram analisados por meio de imunofluorescência com anticorpos monoclonais específicos para a forma nuclear ou para a forma citoplasmática de SFV nsp2, respectivamente (Figura 3). Em todos os casos, nsp2 foi detectado no núcleo e no 10 citoplasma das células transfectadas, o que sugere que a mutação RHR não afetou o transporte para o núcleo dessa proteína.

Exemplo 4

Reprodução de RNA em células transfectadas com SFV-S2-9-pac

A fim de determinar o nível de reprodução de RNA

do mutante SFV não citopático duplo, células BHK-21 foram eletroporadas com RNA SFV-S2-9-pac, RNA total foi extraído em 24, 48 e 72 horas após a eletroporação e analisado por meio de Northern Blot com um oligonucleotídeo marcado com 20 32P específico para a seqüência do promotor subgenômico SFV, que está presente no RNA genômico e em RNA subgenômico (Figura 4, linhas 2 a 4) . A quantidade dos RNAs SFV-S2-9- pac genômicos e subgenômicos, bem como a proporção entre eles, foi comparada com a obtida em células transfectadas 25 com RNA SFV-pac 24 horas após a eletroporação (Figura 4, linha 5) . Os RNAs SFV-S2-9-pac genômicos e subgenômicos aumentaram ao longo do tempo e aparentemente atingiram um pico 4 8 horas após a eletroporação. Níveis de RNA similares foram observados em uma linhagem de células BHK resistentes a puromicina obtida com o vetor SFV-S2-9-pac (Figura 4, linha 1) . Em todos os casos, os RNAs SFV-S2-9 foram produzidos em uma quantidade muito menor que a obtida em células transfectadas com o RNA SFV-pac original (observe- 5 se que a linha 5 foi exposta 72 vezes mais que as linhas 1 a 4). As razões entre RNA subgenômico e genômico observadas nas células transfectadas com SFV-S2-9-pac e selecionadas com puromicina foram cerca de 1,5 vezes maiores que as observadas em células transfectadas com SFV-pac (Figura 4, 10 números na parte inferior). Nas células transfectadas com SFV-S2-9-pac não selecionadas, entretanto, esta razão foi consideravelmente maior, especialmente 24 horas após a transfecção, mas foram reduzidas ao longo do tempo, o que indicou que a síntese de RNA genômico no mutante duplo pôde 15 ser retardada com relação à do RNA subgenômico. Duas faixas adicionais de RNA com um tamanho intermediário entre os RNAs genômicos e subgenômicos também foram detectadas nas células transfectadas com SFV-S2-9-pac (Figura 4, linhas 1 a 4) . Estas faixas não foram caracterizadas, mas poderão 2 0 corresponder a RNAs interferentes defeituosos que podem aparecer durante a reprodução do mutante SFV duplo. Por fim, para determinar se os baixos níveis de reprodução do RNA SFV-S2-9-pac puderam ser recuperados com uma replicase do tipo selvagem fornecida em trans, as células BHK-21 25 foram eletroporadas simultaneamente com os RNAs SFV-S2-9- pac e SFV-LacZ (vetor selvagem) . Após 24 horas, o RNA total foi extraído das células coeletroporadas e analisado por meio de Northern Blot (Figura 4, linha 7) . Os RNAs das células eletroporadas com o SFV-pac original (Figura 4, linha 5) e SFV-LacZ (Figura 4, linha 6) foram analisados no mesmo gel e utilizados como marcadores de tamanho molecular para cada um dos RNAs genômicos e subgenômicos. Os RNAs SFV-LacZ e SFV-S2-9-pac genômicos e subgenômicos 5 foram facilmente detectados nas células coeletroporadas após a exposição do gel por uma hora, o que indicou que a replicase do tipo selvagem era capaz de recuperar ao menos parcialmente a reprodução do mutante duplo. Embora a quantidade dos dois RNAs subgenômicos fosse muito similar, 10 o RNA SFV-LacZ genômico foi produzido em níveis cerca de duas a três vezes maiores que o do mutante SFV-S2-9-pac.

Exemplo 5

Processamento de replicase em mutante SFV-S2-9

A quantidade menor de RNA detectada nas células 15 transfectadas com a réplica de SFV-S2-9-pac poderia dever- se a uma alteração no processamento de replicase. A SFV replicase é sintetizada na forma de poliproteína nspl234, que é dividida em seguida nos seus componentes monoméricos maduros por meio da atividade de protease presente no 20 domínio da extremidade carboxila de nsp2 (30) , na qual as mutações P718T e R649H tenham sido mapeadas. A fim de examinar o efeito dessas mutações sobre o processamento de replicase, os RNAs SFV-S2-9-pac, SFV-RHR-pac e SFV-S2-pac sintetizados in vitro foram traduzidos por meio de 25 incubação com lisatos de reticulócitos de coelhos na presença de [35S]-metionina e [35S] -cisteína. O padrão de processamento de replicase nesses mutantes foi comparado com o obtido para o RNA SFV-pac original por meio de SDS- PAGE seguido por autorradiografia (Figura 5A). Nenhuma diferença foi observada no processamento de replicase entre os três mutantes analisados e a replicase do tipo selvagem, que geraram um acúmulo simialr dos monômeros nsp em todos os casos. A fim de determinar se o processamento de replicase foi afetado in vivo, os lisatos de uma linhagem de células BHK-21 resistentes a puromicina que conduz vetor SFV-S2-9-pac ou de células BHK-21 transfectadas com RNA SFV-pac original ou com RNA SFV-RHR- pac obtido 24 horas após a eletroporação foram analisados por meio de imunomanchas com um antissoro de coelhos específico contra nsp2 (Figura 5B, painel superior) ou contra nsp3 (Figura 5B, painel central) como anticorpos primários, respectivamente. Nos dois casos, as amostras derivadas de SFV-pac e de SFV-RHR-pac exibiram um padrão muito similar, pois expressaram quantidades comparáveis dos monômeros nsp2 e nsp3. A quantidade de nsp2 e nsp3 na linhagem de células BHK-SFV-S2-9-pac resistentes a puromicina foi cerca de 1,5 vezes mais baixa, o que poderia dever-se ã reprodução inferior desse vetor. Muito embora quantidades apenas insignificantes de produtos com alto peso molecular fossem detectadas nas amostras analisadas, puderam ser observadas faixas diferenciais entre SFV-S2-9 e os dois outros vetores com o antissoro contra nsp2, o que poderia indicar uma pequena alteração do processamento de replicase S2-9 in vivo.

Exemplo 6

Expressão do transgene e embalagem da réplica de SFV-S2-9

A fim de determinar o nível de expressão do gene heterólogo em mutante SFV-S2-9, o gene relator de Lac-Z após a clonagem do promotor subgenômico de SFV nesse vetor gerou o plasmídeo pSFV-S2-9-Lac-Z. RNA foi sintetizado in vitro a partir desse plasmídeo e utilizado para eletroporar células BHK-21, em que a expressão de β-gal foi analisada 5 em diferentes momentos após a eletroporação. As células foram também transfectadas com RNA do vetor original SFV- LacZ, mas foram analisadas apenas 24 horas após a eletroporação devido ao efeito citopático induzido por esse vetor. Observou-se um nível de expressão de β-gal similar 10 nas células transfectadas com SFV-S2-9-LacZ e SFV-LacZ 24 horas após a transfecção, que estava na faixa de cerca de 15 pg/célula (Figura 6). Este nível de expressão aumentou ao longo do tempo nas células transfectadas com SFV-S2-9- LacZ, estabilizando-se em cerca de 30 pg de β-gal/célula 48 15 horas após a transfecção. A fim de determinar a eficiência de embalagem de mutante duplo SFV-S2-9, células BHK-21 com RNA SFV-S2-9-LacZ e os RNAs SFV-auxiliar-S2 e SFV-auxiliar- C-S219A auxiliares foram coeletroporados conforme descrito (29) . Os sobrenadantes das células foram recolhidos 24 20 horas após a eletroporação e foram titulados sobre monocamadas de células BHK-21 por meio de manchas com X- gal. O RNA SFV-S2-9-LacZ foi embalado de forma um tanto ineficiente, o que forneceu títulos de 7 x IO3 pv/ml, que foram muito mais baixos que os obtidos pelo SFV-LacZ 25 original (5 x IO9 pv/ml) . A fim de comparar se a presença da replicase do tipo selvagem poderá aumentar a eficiência de embalagem de mutante duplo S2-9, as células BHK-21 com os RNAs de SFV-S2-9-LacZ, SFV-pac e os dois RNAs auxiliares de SFV foram coeletroporados. Neste caso, observou-se que o SFV vetor original foi capaz de aumentar moderadamente a produção de partículas de SFV-S2-9-LacZ, que reagiram em um título de 1 x IO5 pv/ml 24 horas após a eletroporação, que foi determinada por meio de manchas de X-gal das células 5 BHK infectadas. A embalagem do RNA SFV-pac original foi reduzida cerca de cinco vezes nas células em que esse vetor foi coeletroporado com SFV-S2-9-LacZ (2,6 x IO8 pv/ml), em comparação com os títulos obtidos quando o SFV-pac foi embalado isoladamente (1,2 x IO9 pv/ml), o que foi 10 determinado por meio de imunofluorescência indireta das células infectadas utilizando um antissoro de coelho policlonal específico contra SFV nsp2 como um anticorpo primário. A fim de determinar o efeito que cada uma das duas mutações individuais presentes em SFV-S2-9 possui 15 sobre a embalagem, as células BHK-21 com RNAs SFV auxiliares e com os RNAs SFV-RHR-pac ou SFV-S2-pac foram coeletroporadas e as partículas virais foram tituladas conforme descrito acima para SFV-pac. SFV-RHR-pac foi embalado com altos títulos (6,5 x IO8 pv/ml), enquanto SFV- 20 S2-pac exibiu uma eficiência de embalagem muito baixa (2 x IO4 pv/ml) .

Exemplo 7

Produção de uma linhagem de células estáveis que expressa LacZ utilizando vetor SFV-S2-9

Como se demonstrou neste estudo, o vetor SFV-S2-

9-pac pode ser utilizado para selecionar as células que podem manter a réplica na presença de puromicina. Para estudar se foi possível utilizar este tipo de vetor para gerar linhagens de células estáveis que expressam outros transgenes, o gene relator de LacZ foi introduzido em pSFV-S2-9-pac, que gerou o plasmídeo pSFV-S2-9-LacZ-pac em que os genes pac e LacZ estão localizados abaixo no fluxo de promotores subgenômicos independentes. 0 RNA deste plasmídeo foi sintetizado in vitro e eletroporado nas células BHK-21. Vinte e quatro horas após a eletroporação, adicionou-se puromicina a 5 pg/ml e, quando as células selecionadas atingiram a confluência, foram conduzidas dez passagens na presença do antibiótico por um período de trinta dias. O percentual de células que expressam β-gal, determinado em cada passagem por meio de manchas de X-gal, variou de 70% a 90% conforme a passagem, mas foi de mais de 85% na passagem 10, o que indicou uma alta estabilidade da expressão de transgene na presença de seleção (Figura 7) . Quando as células selecionadas passaram sem puromicina, o percentual das células que expressam β-gal caiu muito rapidamente, sendo de menos de 5% após três passagens. O nível de expressão de β-gal nas células selecionadas com puromicina foi determinado após seis e oito passagens, atingindo 13 e 18 pg/célula, respectivamente. Estes valores são muito similares aos obtidos nas células transfectadas com o vetor original SFV-LacZ 24 horas após a transfecção, o que indicou que as linhagens celulares geradas com o vetor SFV-S2-9 poderão ser utilizadas para expressar grandes quantidades de proteínas recombinantes.

Exemplo 8

Avaliação de outros mutantes de SFV não citopáticos definidos anteriormente

As mutações que haviam sido definidas anteriormente como não citopáticas para SFV foram introduzidas no gene de subunidade nsp2 da replicase de SFV, em plasmídeo pSFV-1, que contém a seqüência de vetor. Estas mutações incluíram:

-LlOT (alteração de TTG para ACC) : mutante

SF2A (22).

L713P (alteração de CTA para CCT) : mutante

SF2C (22).

Além disso, o plasmídeo pSFV-PD que contém a seqüência de vetor SFV com mutações S259P e R650D em nsp2 foi gentilmente fornecido pelo Dr. K. Lundstrôm (21).

Os plasmídeos pSFV-SF2A, pSFV-SF2C e pSFV-PD foram gerados (ou obtidos) desta forma, nos quais o gene LacZ foi clonado sob o controle do promotor subgenômico viral, e foram obtidos os plasmídeos: pSFV-SF2A-LacZ, pSFV- SF2C-LacZ e pSFV-PD-LacZ, respectivamente.

Estes plasmídeos foram utilizados para sintetizar RNA in vitro, que foi eletroporado em células BHK-21. Após a eletroporação, as células foram distribuídas em 20 diferentes placas que foram fixadas e manchadas com X-gal em diferentes momentos após a transfecção. A mancha de X- gal causa uma coloração azul nas células que estão expressando β-gal do gene LacZ, o que permite detectar-se o número de células que conduzem o vetor e que tenham 25 sobrevivido em diferentes momentos, bem como a análise da sua morfologia, o que é um indicador de citopatogenicidade. Neste experimento, células eletroporadas com RNA SFV-LacZ, que é citopático para as células de BHK, foram utilizadas como um controle negativo. De forma similar, RNA SFV-S2- LacZ, que conduz a mutação P718T em nsp2 e gera um fenótipo não citopático em um certo percentual das células, foi utilizado como um controle positivo.

Como se pode observar nas Figuras 10 e 12, os 5 mutantes SFV-SF2A e SFV-PD exibem um fenótipo que foi muito similar ao do vetor SFV selvagem, induzindo um forte efeito citopático nas células transfectadas, que foi traduzido no surgimento de uma série de corpos apoptóticos a partir do dia 3 e uma ausência quase total de expressão após longos 10 períodos (sete dias). Os dados relativos à natureza citopática do vetor SFV-PD são adicionalmente sustentados por resutados publicados posteriormente pelo próprio K. Lundstrõm, em que se demonstra como a expressão de β-gal ou GFP em células BHK infectadas com um vetor de SFV-PD que 15 conduz LacZ ou GFP como um gene marcador atinge o máximo após 4 8 horas para cair drasticamente em seguida nos três a quatro dias seguintes (20, vide Figura 2 desta referência). SFV-SF2C mutante exibiu um fenótipo um pouco menos citopático, mas muitos corpos apoptóticos aparecem no dia 3 2 0 e, embora aparentemente existam altos níveis de expressão no dia 4, isso desaparece quase completamente no dia 7, o que indica que este mutante provavelmente permite expressões um pouco mais prolongadas que o vetor selvagem, mas sem deixar de ser citopático. 0 vetor SFV-S2 é o único 25 vetor que não causa o surgimento de corpos apoptóticos e que permite a manutenção da expressão por pelo menos sete dias, gerando o surgimento de colônias. 0 vetor SFV-S2-9 que carrega as mutações P718T e R64 9H foi selecionado a partir de uma das colônias obtidas com SFV-S2 quando o gene LacZ foi substituído pelo gene pac no mencionado vetor. A Figura 14 inclui fotos de células transfectadas com vetor RNA SFV-S2-9-LacZ e manchada em diferentes momentos com X- gal. 0 vetor S2-9 não produziu efeito citopático nas células transfectadas, que também puderam dividir-se.

Exemplo 9

Obtenção de linhagens de células estáveis produtoras de cardiotrofina 1 utilizando o vetor SFV-S2-9

Plasmídeos foram gerados por meio da introdução 10 do gene cardiotrof ina de rato (rCT) em pSFV-S2-9-pac em dois ambientes diferentes e utilizados para gerar linhagens celulares que expressam rCT. Tanto a expressão de rCT quanto a estabilidade da expressão de rCT foram analisadas com o propósito de identificar linhagens de células 15 estáveis que expressam rCT.

9.1 Construção do plasmídeo

Para o propósito de geração de linhagens celulares que expressam cardiotrofina, foram gerados plasmídeos com base em SFV-S2-9-pac por meio da introdução do gene cardiotrof ina de rato (rCT) conforme duas realizações diferentes:

plasmídeo pSFV-S2-9-rCT-pac, em que os genes pac e rCT são colocados abaixo no fluxo de promotores subgenômicos independentes (Figura 15A); e - plasmídeo pSFV-S2-9-pac2A-rCT, contruído

conforme a estrutura geral descrita na Figura 8B, que contém o gene pac e o gene rCT fundidos abaixo no fluxo de um único promotor subgenômico (Figura 15A) ; nesta realização, a seqüência de autoprotease FMDV 2A (SEQ ID N0 14) (35) foi introduzida entre os dois genes para permitir a liberação da cardiotrofina da proteína de fusão (Figura 15A) .

Para construir o plasmídeo pSFV-S2-9-rCT-pac, o 5 vetor de clonagem pSFV-S2-9-mcs-pac, que contém a replicase SFV-S2-9, um primeiro promotor subgenômico seguido por um local de clonagem múltipla e um segundo promotor subgenômico seguido pelo gene pac foram gerados anteriormente.

Resumidamente, os oligonucleotídeos SEQ ID N0 15

e SEQ ID N° 16 foram hibridizados, gerando um fragmento de DNA sintético com extremidades 5' protuberantes compatíveis com BamHI e cuja seqüência contém um local de clonagem múltipla com alvos para enzimas AvrII, ApaI, NruI e BstBI, 15 três códons de término de tradução nas três possíveis etapas de leitura e a seqüência promotora subgenômica SFV. Este fragmento foi clonado no local BamH I de pSFV-S2-9- pac, sendo gerado o plasmídeo pSFV-S2-9-mcs-pac.

Em uma segunda etapa, um fragmento de PCR com 645 2 0 bp que contém o gene de cardiotrof ina de rato foi sintetizado a partir do plasmídeo pRSET-rCT (36), utilizando os oligonucleotídeos SEQ ID N0 17 e SEQ ID N° 18 em hibridização com o início e o fim do gene rCT, respectivamente, e contendo locais BamH I nas extremidades 25 para facilitar a clonagem. 0 fragmento de PCR foi digerido com BamH I e foi clonado no local BamH I de pSFV-S2-9-mcs- pac, sendo obtido o plasmídeo pSFV-S2-9-rCT-pac. De forma similar, o mesmo fragmento de PCR foi clonado em pSFV-1 digerido com BamH I, sendo gerado o plasmídeo pSFV-rCT. Para construir o plasmídeo pSFV-S2-9-pac2A-rCT, o vetor de clonagem pSFV-S2-9-pac2A, que contém a seqüência de vetor SFV-S2-9-pac na qual o gene pac é fundido em fase na sua extremidade 3' com a seqüência de nucleotídeos que 5 codifica a autoprotease FMDV 2A (35), que contém na extremidade dessa seqüência o local de clonagem Smal/Xmal, foi gerado anteriormente. Resumidamente, utilizando o plasmídeo pSFV-S2-9-pac como molde, foi conduzido um cruzamento de PCR com os oligonucleotídeos externos: SEQ ID 10 N0 19 e SEQ ID N° 20 e os oligonucleotídeos internos: SEQ ID N0 21 e SEQ ID N0 22, gerando um fragmento de DNA com 842 bp que foi digerido com BamH I e Xma I e clonado em pSFV-S2-9-pac digerido com as mesmas enzimas, de forma a obter o plasmídeo pSFV-S2-9-pac2A. O PCR cruzado foi 15 conduzido para o propósito duplo de introduzir a seqüência 2A-XmaI na extremidade 3' do gene pac, eliminando-se simultaneamente um local XmaI presente no interior daquele gene.

Por fim, para gerar o plasmídeo pSFV-S2-9-pac2A- 2 0 rCT, um fragmento de PCR com 64 5 bp que contém o gene cardiotrofina de rato do plasmídeo pRSET-rCT (36) , utilizando os oligonucleotídeos SEQ ID N0 23 e SEQ ID N0 24 em hibridização com o início e o fim do gene rCT, respectivamente, e contendo locais Xma I nas extremidades 25 para facilitar a clonagem. 0 fragmento de PCR foi digerido com Xma I e foi clonado no local Xma I de pSFV-S2-9-pac2A, obtendo o plasmídeo pSFV-S2-9-pac2A-rCT.

9.2 Obtenção de linhagens de células estáveis produzindo cardiotrofina e análise da expressão de cardiotrofina

0 RNA de cada plasmídeo sintetizado in vitro (capítulo 9.1) foi eletroporado em células BHK-21. Vinte e quatro horas após a eletroporação, adicionou-se puromicina 5 a 5 pg/ml e, quando as células selecionadas atingiram confluência, a expressão de cardiotrofina foi analisada nos lisatos celulares por meio de imunomanchas com um anticorpo específico para cardiotrofina (Figura 15B).

Para os experimentos de análise por meio de 10 imunomanchas, os lisatos das células BHK-21 transfectadas com os vetores SFV foram obtidos por meio de incubação em um tampão que contém 1% Igepal (Sigma, Estados Unidos), 50 mM de Tris HCl, pH 7,6, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA e PMSF a 1 μg/ml (Sigma, St. Louis, Estados Unidos) e foram 15 clarificados por meio de centrifugação por seis minutos a 6000 rpm em um microcentrifugador refrigerado e quantificados por meio de análise Bradford. Os lisatos foram analisados por meio de SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 12%, transferidos para uma membrana de 20 nitrocelulose e incubados com um antissoro policlonal contra cardiotrofina murina CT-I (R&D Systems) ou actina (Sigma, St. Louis, Estados Unidos) como anticorpos primários, respectivamente. Utilizou-se um antissoro de cabra ou carneiro específico para imunoglobulinas de rato 25 ou coelho, respectivamente, conjugado com HRP como anticorpo secundário. As proteínas foram observadas utilizando Reagente de Quimioluminescência Western Lightning Plus (Perkin Elmer Life Sciences, Estados Unidos), conforme as instruções do fabricante. Para quantificar os níveis de rCT, diferentes quantidades dos lisatos das células que expressam rCT foram analisadas por meio de imunomanchas e comparadas com quantidades conhecidas de cardiotrofina recombinante, utilizando o 5 programa Imagequant TL (Amersham) com este propósito.

Os níveis de expressão de cardiotrofina nas linhagens geradas com cada um dos vetores foram similares aos obtidos em células eletroporadas com RNA vetor com a replicase SFV-rCT selvagem (Figura 15B). A expressão de rCT 10 nas linhagens selecionadas foi de cerca de 4,3 pg/célula. Nas linhagens geradas com o vetor SFV-S2-9-pac2A-rCT, observou-se que a maior parte do rCT havia sido liberada da proteína de fusão, embora houvesse uma fração não digerida que também foi detectada por meio de imunomanchas.

Para analisar a estabilidade desses vetores nas

células transfectadas, foram conduzidas dez passagens sucessivas das células que os contêm na presença de puromicina por um período de cerca de vinte dias e a expressão de rCT em cada passagem em lisatos celulares foi 20 determinada por meio de imunomanchas. No caso de linhagens celulares geradas com o vetor SFV-S2-9-rCT-pac, observou-se que a expressão foi mantida até a passagem 5, a partir da qual começou a cair drasticamente até virtualmente desaparecer na passagem 11 (Figura 16) . Esta perda de 25 estabilidade, entretanto, não ocorreu nas linhagens que contêm o vetor SFV-S2-9-pac2A-rCT, no qual a expressão permaneceu constante por pelo menos dez passagens (Figura 17) , o que indica a fusão em fase do transgene (gene rCT) em que o gene pac que utiliza a seqüência de nucleotídeos que codifica a autoprotease FMDV 2A permite aumento considerável da estabilidade da expressão de proteína heteróloga nas linhagens geradas a partir do vetor SFV-S2- 9.

Exemplo 10

Obtenção de linhagens de células estáveis produtoras de fator de crescimento similar a insulina humano (IGF-I) utilizando o vetor SFV-S2-9

Plasmídeos foram gerados por meio da introdução 10 do gene de crescimento similar a insulina humano (IGF-I) em pSFV-S2-9-pac em dois ambientes diferentes e foram utilizados para gerar linhagens celulares que expresssam IGF-I. Tanto a expressão de IGF-I quanto a estabilidade da expressão de IGF-I foram analisadas com o propósito de 15 identificar linhagens de células estáveis que expressam IGF-I.

10.1 Construção do plasmídeo

Para o propósito de geração de linhagens celulares que expressam IGF-I, foram gerados plasmídeos com base em SFV-S2-9-pac por meio da introdução do gene IGF-I conforme duas realizações diferentes:

plasmídeo pSFV-S2-9-IGF-pac, no qual os genes pac e IGF-I são colocados abaixo no fluxo de promotores subgenômicos independentes (Figura 18) ; nesse 25 plasmídeo, o gene IGF-I foi fundido com o amplificador de tradução de capsídeos SFV utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease FMDV 2A como um ligante, pois esta estratégia permitiu o aumento considerável dos níveis de expressão de proteína heteróloga no vetor SFV selvagem (3 7); e

plasmídeo pSFV-S2-9-pac2A-IGF, contruído conforme a estrutura geral descrita na Figura 8B, que contém o gene pac e o gene IGF-I fundidos abaixo no fluxo 5 de um único promotor subgenômico (Figura 18) ; nesta ralização, a seqüência de nucleotídeos que codifica autoprotease FMDV 2A (SEQ ID N0 14) (35) foi introduzida entre os dois genes para permitir a liberação da cardiotrofina da proteína de fusão (Figura 18).

Para construir o plasmídeo pSFV-S2-9-IGF-pac, o

plasmídeo pSFVbl2A-IGF-IB (3 8) foi digerido com BglII+Klenow e SpeI, obtendo um fragmento de 2,3 kb que foi ligado ao fragmento de 11,1 kb obtido a partir de pSFV-S2- 9-pac digerido com BsmI+T4pol e SpeI. 0 plasmídeo pSFVbl2A- 15 IGF-IB contém a seqüência precursora de IGF-I humana (IGF- IB) fundida na sua extremidade 5' com um conjunto que compreende a seqüência que codifica os 34 primeiros aminoácidos do capsídeo SFV (amplificador de tradução mínimo ou "bl") seguido pela seqüência de nucleotídeos que 20 codifica a autoprotease de FMDV 2A. IGF-IB precursor codifica uma preparação com 195 aminoácidos que inclui os domínios II, B, C, A, D, D, E, Ea, Eb e 6 do gene IGF-I. Esta proteína prévia é procesada até a forma madura de IGF-

I que é secretada, perdendo os domínios aminoterminais II e os domínios carboxiterminais E, Ea, Eb e 6 (39).

Para construir o plasmídeo pSFV-S2-9-pac2A-IGF, o plasmídeo pSFVbl2A-IGF-I (38) foi digerido com XmaI, obtendo um fragmento com 0,59 kb que contém seqüência IGF- IB que foi ligada com pSFV-S2-9-pac2A (cujas características e forma de obtenção são descritas no Exemplo 9.1, com relação â construção do plasmídeo pSFV-S2- 9-pac2A-rCT) digerido anteriormente com XmaI. Os clones foram selecionados em seguida, nos quais o fragmento de 0,59 kb havia sido introduzido na orientação correta.

10.2 Obtenção de linhagens de células estáveis produtoras de IGF-I e análise da expressão de IGF-I

O RNA de cada plasmídeo foi sintetizado in vitro (capítulo 10.1) e eletroporado nas células BHK-21. Vinte e 10 quatro horas após a eletroporação, adicionou-se puromicina a 5 pg/ml e, quando as células selecionadas atingiram a confluência, a expressão de IGF-I foi analisada nos sobrenadantes celulares recolhidos em momentos diferentes por meio de ELISA específico para IGF-I humano (Figura 19). 15 A expressão de IGF-I foi analisada em

sobrenadantes celulares utilizando um kit ELISA específico para a medição de IGF-I humano livre (IGF-I livre, ref. DSL-10-9400, Diagnostic Systems Laboratories, Webster, Texas, Estados Unidos). Para cada uma das passagens 20 analisadas, foram semeadas 5 x IO5 células por cavidade, houve uma espera de quatro horas para que as células se aderissem e o meio foi alterado adicionando-se 1 ml de meio Glasgow-MEM com soro de feto bovino a 5% (37) e puromicina a 5 pg/ml. 0 sobrenadante foi recolhido após 24, 4 8 ou 72 25 horas, centrifugado a 6000 rpm por cinco minutos em um microcentrifugador refrigerado para eliminar resíduos celulares e congelado a -80 0C até a análise. Para o propósito de controle da quantidade de células presentes em cada amostra, células BHK foram recolhidas das mesmas cavidades em que os sobrenadantes haviam sido recolhidos e lisadas por meio de incubação em um tampão que contém 1% Igepal (Sigma, Estados Unidos), 50 mM Tris HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA e 1 pg/ml PMSF (Sigma, St. Louis, 5 Estados Unidos) , foram clarificados por meio de centrifugação a 6000 rpm em um microcentrifugador refrigerado e quantificados por meio de análise Bradford. Os valores da quantidade de proteína obtida por Bradford foram muito similares em todas as amostras analisadas.

Os resultados obtidos com relação à expressão de

IGF-I nos sobrenadantes celulares recolhidos demonstraram que, depois de horas, os níveis de expressão de IGF-I no sobrenadante das linhagens geradas com cada um dos vetores não citopáticos foram apenas 1,5 a 2 vezes mais baixos que 15 os obtidos em células eletroporadas com RNA do vetor selvagem SFV-IGF-I (Figura 19) . Esta expressão foi um pouco maior na linhagem obtida com o vetor SFV-S2-9-pac2A- IGF (34,5 pg/célula) com relação à expressão na linhagem selecionada com SFV-S2-9-IGF-pac (21,3 pg/célula). A 20 análise da expressão de IGF-I em sobrenadantes tomada em tempos mais longos demonstrou que IGF-I pode ser acumulado até no máximo 67 e 34 pg/célula em vetores SFV-S2-9-pac2A- IGF e SFV-S2-9-IGF-pac, respectivamente. Estes resultados demonstram que IGF-I está sendo secretado para o meio 25 extracelular, que está indicando um processamento correto de poliproteína.

Para analisar a estabilidade desses vetores nas células transfectadas, foram conduzidas dez passagens sucessivas das células que os contêm na presença de puromicina por um período de cerca de vinte dias e a expressão de IGF-I em sobrenadantes celulares recolhidos em

24 horas após cada uma das passagens foi determinada por meio de ELISA específico para IGF-I humano. No caso das linhagens geradas com vetor SFV-S2-9-IGF-pac, observou-se que a expressão foi mantida até a passagem 4, a partir da qual começou a cair drasticamente, atingindo níveis que eram oitenta vezes menores na passagem 10 (Figura 20). Esta perda de estabilidade não ocorreu tão notadamente nas linhagens que contêm o vetor SFV-S2-9-pac2A-IGF, no qual a expressão permaneceu quase constante, caindo quatro vezes entre as passagens I e 10 (Figura 20) . Este resultado confirma que a fusão em fase do transgene com o gene pac utilizando a seqüência de nucleotídeos que codifica a autoprotease FMDV 2A permite aumento considerável da estabilidade da expressão de proteína heteróloga nas linhagens geradas com o vetor SFV-S2-9.

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<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA, S.L.

<120> VETOR VIRAL E SUAS APLICAÇÕES

<13 0> P3499PC00

<140> ES P200603036

<141> 2006-11-28

<140> ES P200700882

<141> 2007-04-07

<160> 24

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 7382

<212 > DNA

<213> Vírus Floresta Semliki <22 0>

<221> 5'UTR

<222> (1) . . (86)

<223> Extremidade 5' UTR não traduzida que inclui as seqüências necessárias para reprodução

<220>

<221> misc_feature

<222> (87) . . (89)

<223> Trio de inicio de tradução de replicase <220>

<221> misc_feature <222> (3642) . . (3644)

<223> Trio correspondente à mutação R649H <220>

<221> misc_feature <222> (3849) . . (3851)

<223> Trio correspondente à mutação P718T <220>

<221> misc_feature <222> (7351) . . (7374)

<223> Promotor subgenômico viral sobreposto <22 0>

<221> misc_feature <222> (7380)..(7382)

<223> Trio de término de tradução de replicase <4 00> 1

gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc gccacctcc 60

gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 12 0

acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180 aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240

tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga 300

gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg 3 60

aaaggctcga tagctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag 42 0

agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc 480

ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc 540

aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca 600

gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg 660

cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag 72 0 gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga 780

agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga 84 0

gcagaaagct actgaggagc tggcacttac cctccgtatt ccacctgaaa ggtaaacaat 900

cctttacctg taggtgcgat accatcgtat catgtgaagg gtacgtagtt aagaaaatca 960

ctatgtgccc cggcctgtac ggtaaaacgg tagggtacgc cgtgacgtat cacgcggagg 102 0

gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat 1080

gcacctacgt cccctcaacc atctgtgatc aaatgactgg catactagcg accgacgtca 1140

caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa 12 00

gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat 1260

ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc 1320 gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca 1380

tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg 1440

tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc 1500

ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg 1560

atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac 1620

ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag 1680

agtatcacgc aggtgcaggg gtcgtggaaa cacctcgcag cgcgttgaaa gtcaccgcac 1740

agccgaacga cgtactacta ggaaattacg tagttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga 1800

gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg 1860 ggagggccgg cggttaccag gtcgacggat atgacggcag ggtcctacta

ccatgtggat 1920

cggccattcc ggtccctgag tttcaagctt tgagcgagag cgccactatg

gtgtacaacg 1980

aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccg

tcgctgaaca 2040

ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag

tacgtgttcg 2100

acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg

ttggtgggag 2160

agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc

aggccgtcgg 2220

caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc

aagtctgcta 2280

ttattaagag cctcgtgacc aaacacgatc tggtcaccag cggcaagaag

gagaactgcc 2340

aggaaatagt taacgacgtg aagaagcacc gcgggaaggg gacaagtagg

gaaaacagtg 2400

actccatcct gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgtggacat cctatatgtg gacgaggctt 2460 tcgcttgcca ttccggtact ctgctggccc taattgctct tgttaaacct

cggagcaaag 252 0

tggtgttatg cggagacccc aagcaatgcg gattcttcaa tatgatgcag

cttaaggtga 2580

acttcaacca caacatctgc actgaagtat gtcataaaag tatatccaga

cgttgcacgc 2640

gtccagtcac ggccatcgtg tctacgttgc actacggagg caagatgcgc

acgaccaacc 2700

cgtgcaacaa acccataatc atagacacca caggacagac caagcccaag

ccaggagaca 2 760

tcgtgttaac atgcttccga ggctgggcaa agcagctgca gttggactac

cgtggacacg 2 82 0

aagtcatgac agcagcagca tctcagggcc tcacccgcaa aggggtatac

gccgtaaggc 2880

agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat

gtactgctga 2940

cgcgcactga ggataggctg gtgtggaaaa cgctggccgg cgatccctgg attaaggtcc 3000 tatcaaacat tccacagggt aactttacgg ccacattgga agaatggcaa gaagaacacg 3 06 0

acaaaataat gaaggtgatt gaaggaccgg ctgcgcctgt ggacgcgttc cagaacaaag 3120

cgaacgtgtg ttgggcgaaa agcctggtgc ctgtcctgga cactgccgga atcagattga 3180

cagcagagga gtggagcacc ataattacag catttaagga ggacagagct tactctccag 3240

tggtggcctt gaatgaaatt tgcaccaagt actatggagt tgacctggac agtggcctgt 33 00

tttctgcccc gaaggtgtcc ctgtattacg agaacaacca ctgggataac agacctggtg 3360

gaaggatgta tggattcaat gccgcaacag ctgccaggct ggaagctaga cataccttcc 3420

tgaaggggca gtggcatacg ggcaagcagg cagttatcgc agaaagaaaa atccaaccgc 3480

tttctgtgct ggacaatgta attcctatca accgcaggct gccgcacgcc ctggtggctg 3540

agtacaagac ggttaaaggc agtagggttg agtggctggt caataaagta agagggtacc 3600 acgtcctgct ggtgagtgag tacaacctgg ctttgcctcg acacagggtc acttggttgt 3660

caccgctgaa tgtcacaggc gccgataggt gctacgacct aagtttagga ctgccggctg 3720

acgccggcag gttcgacttg gtctttgtga acattcacac ggaattcaga atccaccact 3780

accagcagtg tgtcgaccac gccatgaagc tgcagatgct tgggggagat gcgctacgac 3 84 0

tgctaaaaac gggcggcatc ttgatgagag cttacggata cgccgataaa atcagcgaag 3900

ccgttgtttc ctccttaagc agaaagttct cgtctgcaag agtgttgcgc ccggattgtg 3960

tcaccagcaa tacagaagtg ttcttgctgt tctccaactt tgacaacgga aagagaccct 4020

ctacgctaca ccagatgaat accaagctga gtgccgtgta tgccggagaa gccatgcaca 4080

cggccgggtg tgcaccatcc tacagagtta agagagcaga catagccacg tgcacagaag 414 0

cggctgtggt taacgcagct aacgcccgtg gaactgtagg ggatggcgta tgcagggccg 4200 tggcgaagaa atggccgtca gcctttaagg gagcagcaac accagtgggc acaattaaaa 4260

cagtcatgtg cggctcgtac cccgtcatcc acgctgtagc gcctaatttc tctgccacga 4320

ctgaagcgga aggggaccgc gaattggccg ctgtctaccg ggcagtggcc gccgaagtaa 43 80

acagactgtc actgagcagc gtagccatcc cgctgctgtc cacaggagtg ttcagcggcg 4440

gaagagatag gctgcagcaa tccctcaacc atctattcac agcaatggac gccacggacg 4500

ctgacgtgac catctactgc agagacaaaa gttgggagaa gaaaatccag gaagccattg 4560

acatgaggac ggctgtggag ttgctcaatg atgacgtgga gctgaccaca gacttggtga 4620

gagtgcaccc ggacagcagc ctggtgggtc gtaagggcta cagtaccact gacgggtcgc 4680

tgtactcgta ctttgaaggt acgaaattca accaggctgc tattgatatg gcagagatac 474 0

tgacgttgtg gcccagactg caagaggcaa acgaacagat atgcctatac gcgctgggcg 4800 aaacaatgga caacatcaga tccaaatgtc cggtgaacga ttccgattca

tcaacacctc 4860

ccaggacagt gccctgcctg tgccgctacg caatgacagc agaacggatc

gcccgcctta 4920

ggtcacacca agttaaaagc atggtggttt gctcatcttt tcccctcccg

aaataccatg 4980

tagatggggt gcagaaggta aagtgcgaga aggttctcct gttcgacccg

acggtacctt 5040

cagtggttag tccgcggaag tatgccgcat ctacgacgga ccactcagat

cggtcgttac 5100

gagggtttga cttggactgg accaccgact cgtcttccac tgccagcgat

accatgtcgc 5160

tacccagttt gcagtcgtgt gacatcgact cgatctacga gccaatggct

cccatagtag 5220

tgacggctga cgtacaccct gaacccgcag gcatcgcgga cctggcggca

gatgtgcacc 5280

ctgaacccgc agaccatgtg gacctcgaga acccgattcc tccaccgcgc

ccgaagagag 534 0

ctgcatacct tgcctcccgc gcggcggagc gaccggtgcc ggcgccgaga aagccgacgc 5400 ctgccccaag gactgcgttt aggaacaagc tgcctttgac gttcggcgac tttgacgagc 5460

acgaggtcga tgcgttggcc tccgggatta ctttcggaga cttcgacgac gtcctgcgac 5520

taggccgcgc gggtgcatat attttctcct cggacactgg cagcggacat ttacaacaaa 5580

aatccgttag gcagcacaat ctccagtgcg cacaactgga tgcggtccag gaggagaaaa 564 0

tgtacccgcc aaaattggat actgagaggg agaagctgtt gctgctgaaa atgcagatgc 5700

acccatcgga ggctaataag agtcgatacc agtctcgcaa agtggagaac atgaaagcca 5760

cggtggtgga caggctcaca tcgggggcca gattgtacac gggagcggac gtaggccgca 5820

taccaacata cgcggttcgg tacccccgcc ccgtgtactc ccctaccgtg atcgaaagat 5880

tctcaagccc cgatgtagca atcgcagcgt gcaacgaata cctatccaga aattacccaa 5940

cagtggcgtc gtaccagata acagatgaat acgacgcata cttggacatg gttgacgggt 6000 cggatagttg cttggacaga gcgacattct gcccggcgaa gctccggtgc tacccgaaac 6060

atcatgcgta ccaccagccg actgtacgca gtgccgtccc gtcacccttt cagaacacac 6120

tacagaacgt gctagcggcc gccaccaaga gaaactgcaa cgtcacgcaa atgcgagaac 6180

tacccaccat ggactcggca gtgttcaacg tggagtgctt caagcgctat gcctgctccg 6240

gagaatattg ggaagaatat gctaaacaac ctatccggat aaccactgag aacatcacta 6300

cctatgtgac caaattgaaa ggcccgaaag ctgctgcctt gttcgctaag acccacaact 6360

tggttccgct gcaggaggtt cccatggaca gattcacggt cgacatgaaa cgagatgtca 6420

aagtcactcc agggacgaaa cacacagagg aaagacccaa agtccaggta attcaagcag 6480

cggagccatt ggcgaccgct tacctgtgcg gcatccacag ggaattagta aggagactaa 6540

atgctgtgtt acgccctaac gtgcacacat tgtttgatat gtcggccgaa gactttgacg 6600 cgatcatcgc ctctcacttc cacccaggag acccggttct agagacggac attgcatcat 6660

tcgacaaaag ccaggacgac tccttggctc ttacaggttt aatgatcctc gaagatctag 6720

gggtggatca gtacctgctg gacttgatcg aggcagcctt tggggaaata tccagctgtc 6780

acctaccaac tggcacgcgc ttcaagttcg gagctatgat gaaatcgggc atgtttctga 6840

ctttgtttat taacactgtt ttgaacatca ccatagcaag cagggtactg gagcagagac 6900

tcactgactc cgcctgtgcg gccttcatcg gcgacgacaa catcgttcac ggagtgatct 6960

ccgacaagct gatggcggag aggtgcgcgt cgtgggtcaa catggaggtg aagatcattg 7020

acgctgtcat gggcgaaaaa cccccatatt tttgtggggg attcatagtt tttgacagcg 7080

tcacacagac cgcctgccgt gtttcagacc cacttaagcg cctgttcaag ttgggtaagc 714 0

cgctaacagc tgaagacaag caggacgaag acaggcgacg agcactgagt gacgaggtta 7200 gcaagtggtt ccggacaggc ttgggggccg aactggaggt ggcactaaca tctaggtatg 7260

aggtagaggg ctgcaaaagt atcctcatag ccatggccac cttggcgagg gacattaagg 732 0

cgtttaagaa attgagagga cctgttatac acctctacgg cggtcctaga ttggtgcgtt 7380

aa 7382

<210> 2 <211> 841 <212> DNA

<213> Vírus Floresta Semliki <220>

<221> 3'UTR <222 > (1) . . (841)

<223> Extremidade 3 SFV não traduzida que inclui as seqüências necessárias para reprodução

<22 0>

<221> misc_feature <222> (772)..(841)

<223> Extremidade de poliadeninas (Póli A)

<400>

2 attacatccc tacgcaaacg ttttacggcc gccggtggcg cccgcgcccg gcggcccgtc 60

cttggccgtt gcaggccact ccggtggctc ccgtcgtccc cgacttccag gcccagcaga 12 0

tgcagcaact catcagcgcc gtaaatgcgc tgacaatgag acagaacgca attgctcctg 180

ctaggcctcc caaaccaaag aagaagaaga caaccaaacc aaagccgaaa acgcagccca 240

agaagatcaa cggaaaaacg cagcagcaaa agaagaaaga caagcaagcc gacaagaaga 3 00

agaagaaacc cggaaaaaga gaaagaatgt gcatgaagat tgaaaatgac tgtatcttcg 360

tatgcggcta gccacagtaa cgtagtgttt ccagacatgt cgggcaccgc actatcatgg 420

gtgcagaaaa tctcgggtgg tctgggggcc ttcgcaatcg gcgctatcct ggtgctggtt 480

gtggtcactt gcattgggct ccgcagataa gttagggtag gcaatggcat tgatatagca 54 0

agaaaattga aaacagaaaa agttagggta agcaatggca tataaccata actgtataac 600 ttgtaacaaa gcgcaacaag acctgcgcaa ttggccccgt ggtccgcctc acggaaactc 660

ggggcaactc atattgacac attaattggc aataattgga agcttacata agcttaattc 720

gacgaataat tggattttta ttttattttg caattggttt ttaatatttc caaaaaaaaa 780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 84 0

a 841

<210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial

<22 0>

<223> Primer SF3669-VS <400> 3

aatgtcacag gcgccgatag g 21

<210> 4 <211> 21

<213> Artificial <22 0>

<223> Primer SF4096-RS

<400> 4

ggtgcacacc cggccgtgtg c 21

<210> 5

<211> 37

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Primer mutS2-VS

<400> 5

gactgctaaa aacgggcggc agcctcttga tgagagc 3 7

<210> 6

<211> 38

<212 > DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> Primer mutS2-RS

<400> 6

aagaggctgc cgcccgtttt tagcagtcgt agcgcatc 3 8

<210> 7

<211> 37 <212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Primer mutS3-VS

<400> 7

gactgctaaa atttggcggc agcctcttga tgagagc 3 7

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> Primer mutS3-RS

<400> 8

aagaggctgc cgccaaattt tagcagtcgt agcgcatc 3 8

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213 > Artificial

<22 0>

<223> Primer SF1947-VS

<4 00> 9 cggtccctga gtttcaag 18

<210> 10

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer SF3623-S29-RS <400> 10

agcacctatc ggcgcctgtg acattcagcg gtgacaacca agtgaccctg tgtcgaggca 60

aagccaggtt g 71

<210> 11

<211> 34

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Primer <400> 11

tctcgcactt taccttctgc accccatcta catg 34

<210> 12

<211> 35 <212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 12

cacagacact gtcaaaggag aaagagtctc attcc 35

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> Primer

<400> 13

gaattctgtg tattaacgca c 21

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> Aftovírus

<4 0 0> 14

aattttgacc ttcttaagct tgcgggagac gtcgagtcca accctgggcc c 51 <210> 15 <211> 92

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer <4 O 0> 15

gatcctaggg ccctcgcgat tcgaataatt gattaattat acacctctac ggcggtccta 60

gattggtgcg ttaatacaca gaattctgat tc 92

<210> 16

<211> 92

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer <4 00> 16

gatcgaatca gaattctgtg tattaacgca ccaatctagg accgccgtag aggtgtataa 6 0

ttaatcaatt attcgaatcg cgagggccct ag 92

<210> 17

<211> 36 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 17

gggggatcct agcaccatga gccagaggga gggaag 36

<210> 18

<211> 34

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 18

gggggatcca catatgtcag gcaacgcccc ctgg 34

<210> 19

<211> 20

<212 > DNA

<213 > Artificial

<22 0>

<223> Primer

<400> 19 ttggcgaggg acattaaggc 20

<210> 20

<211> 91

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> Primer <400> 20

cactggatat ctcacccggg cccagggttg gactcgacgt ctcccgcaag cttaagaagg 6 0

tcaaaattgg caccgggctt gcgggtcatg c 91

<210> 21

<211> 41

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer <4 0 0> 21

ggcgagggtg cgtacggccc gcgggacgtc gtcgcgggtg g 41

<210> 22

<211> 40 <212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 22

gccacccgcg acgacgtccc gcgggccgta cgcaccctcg 4 0

<210> 23

<211> 36

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 23

cgtatacgta cccgggatga gccagaggga gggaag 36

<210> 24

<211> 34

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 24

cgtatacgta cccgggtcag gcaacgcccc ctgg

34

Claims

1. Vetor viral que compreende uma réplica do vírus de Floresta Semliki (SFV), caracterizado pelo fato de que a mencionada réplica compreende (i) a seqüência de nucleotídeos que codifica a enzima replicase SFV com mutações P718T e R649H na subunidade nsp2, (ii) um polinucleotídeo que compreende um gene de seleção e (iii) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse.

2. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende SEQ ID N0 Ie SEQ ID N0 2.

3. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a. polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um produto heterólogo de interesse, cuja expressão é controlada por um primeiro promotor subgenômico de SFV (SGl); e b. polinucleotídeo que compreende um gene de seleção, cuja expressão é controlada por um segundo promotor subgenômico de SFV (SG2).

4. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os mencionados primeiro e segundo promotores subgenômicos SFV são idênticos.

5. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os mencionados primeiro e segundo promotores subgenômicos SFV são diferentes.

6. Vetor viral, de acordo com a reivindicação .1, caracterizado pelo fato de que compreende, abaixo no fluxo de um promotor subgenômico, uma construção que compreende o polinucleotídeo que compreende o gene de seleção e o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse, fundido em fase.

7. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o mencionado polinucleotídeo que compreende o gene de seleção é fundido em fase com o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse, por meio de um ligante de polinucleotídeos.

8. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão (auto)proteolítica pós- tradução.

9. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica uma (auto) protease que age em cis entre as proteínas resultantes da tradução do gene de seleção e da seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse.

10. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mencionada (auto)protease é a autoprotease 2A do vírus de doença dos pés e da boca (FMDV).

11. Vetor viral, de acordo com a reivindicação .8, caracterizado pelo fato de que o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão para uma protease que age em trans.

12. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a mencionada protease que age em trans é a protease do Vírus de Corrosão do Fumo (ETV).

13. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o mencionado ligante é um polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica um local de divisão que pode ser reconhecido por um reagente químico.

14. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a extremidade 3' do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção é fundida em fase à extremidade 5' do polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse.

15. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos que codifica o produto heterólogo de interesse é fundido em fase à extremidade 5' do polinucleotídeo que compreende o gene de seleção.

16. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mencionado gene de seleção é um gene cuja expressão confere resistência a um antibiótico, um gene que permita a síntese de um nutriente essencial que é omitido no meio de cultivo ou um gene que ofereça uma vantagem seletiva às células transfectadas com o mencionado vetor viral.

17. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o mencionado gene de seleção é o gene cuja expressão confere resistência à higromicina (hph), o gene cuja expressão confere resistência à neomicina (neoR) ou o gene que codifica a enzima puromicina N-acetiltransferase (pac), cuja expressão confere resistência à puromicina.

18. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mencionado produto heterólogo de interesse é uma proteína relatora ou peptídeo; um peptídeo, proteína, anticorpo ou um fragmento do mencionado anticorpo, com aplicações terapêuticas ou em diagnóstico; ou uma proteína ou peptídeo recombinante.

19. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o mencionado produto heterólogo de interesse é selecionado a partir de fator de crescimento similar a insulina I (IGF-I), cardiotrofina 1, oncostatina M (OSM), alfa interferona, anfirregulina (AR) , fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF), receptor de proteína C ativada/proteína C de células endoteliais (EPCR) e um anticorpo, ou seu fragmento afuncional, de interesse ou aplicação terapêutica ou em diagnóstico.

20. Uso de um vetor viral conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que se destina à geração in vitro de linhagens celulares estáveis que podem expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse.

21. Linhagem de células estáveis que pode expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse, caracterizada pelo fato de que é uma linhagem celular transfectada com um vetor viral conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 19.

22. Método de geração in vitro de uma linhagem de células estáveis conforme definido na reivindicação 21 que pode expressar constitutivamente produtos heterólogos de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende: I. transfecção de células com um vetor viral conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 19; II. seleção das células estáveis geradas na etapa I; e III. cultivo e manutenção das células estáveis.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as células a serem transfectadas são células eucarióticas ou uma linhagem de células eucarióticas, preferencialmente de mamíferos.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as células a serem transfectadas são transfectadas por meio de eletroporação ou de conjugação do material genético com lipídios catiônicos.

25. Uso de uma linhagem de células estáveis conforme definido na reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que se destina à geração in vitro de produtos heterólogos de interesse.

26. Método de produção in vitro de um produto heterólogo de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma linhagem de células estáveis conforme definido na reivindicação 21 sob condições que permitam a expressão do produto heterólogo de interesse contido no vetor viral utilizado para gerar a mencionada linhagem de células estáveis.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende: I. transfecção de células com um vetor viral conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 19; II. seleção das células estáveis geradas na etapa I; III. cultivo e manutenção das mencionadas células estáveis; e, se desejado, IV. extração do produto heterólogo de interesse.