BRPI0719580A2 - Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável, um tautômero ou um estereoisômero do mesmo, composição farmacêutica, e, uso do composto - Google Patents

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Mark E Layton
Philip E Sanderson
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Description

I “COMPOSTO OU UM SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL, UM TAUTÔMERO OU UM ESTEREOISÔMERO DO MESMO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DO COMPOSTO”
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos compostos de naftiridina
substituídos que são inibidores da atividade de uma ou mais das isoformas da serina/treonina cinase, Akt (também conhecida como PKB; doravante aludida como “Akt”). A presente invenção também diz respeito às composições farmacêuticas que compreendem tais compostos e métodos de usar os IO presentes compostos no tratamento de câncer.
A apoptose (morte celular programada) desempenha papéis essenciais no desenvolvimento embrionário e patogênese de várias doenças, tais como as doenças neuronais degenerativas, doenças cardiovasculares e câncer. Trabalho recente tem levado à identificação de vários produtos de 15 gene pró- e anti-apoptóticos que estão envolvidos na regulagem ou execução da morte celular programada. A expressão de genes anti-apoptóticos, tais como Bcl2 ou Bcl-xL, inibe a morte celular apoptótica induzida por vários estímulos. Por outro lado, a expressão de genes pró-apoptóticos, tais como Bax ou Bad, leva à morte celular programada (Adams et al. Science, 281: 20 1322-1326 (1998)). A execução da morte celular programada é mediada pelas proteinases relacionadas com a caspase-1, incluindo caspase-3, caspase-7, caspase-8 e caspase-9 etc (Thomberry et al. Science, 281: 1312-1316 (1998)).
O caminho da fosfatidilinositol 3’-OH cinase (PI3K)/Akt parece importante para regular a sobrevivência celular/morte celular (Kulik et al. Mol. Cell. Biol. 17: 1595-1606 (1997); Franke et al, Cell, 88: 435-437
(1997); Kauffmann-Zeh et al. Nature 385: 544-548 (1997) Hemmings Science, 275: 628-630 (1997); Dudek et al., Science, 275: 661-665 (1997)). Os fatores de sobrevivência, tais como fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento de nervo (NGF) e fator de crescimento
equivalente à insulina 1 (IGF-1), promovem a sobrevivência celular sob várias condições pela indução da atividade de PI3K (Kulik et al. 1997, Hemmings 1997). PI3K ativado leva à produção de (3,4,5)-trifosfato de fosfatidilinositol (Ptdlns(3,4,5)-P3), que por sua vez liga-se a, e promove a ativação da serina/treonina cinase Akt, que contém uma homologia de 5 plecstrina domínio (PH) (Franke et al Cell, 81: 727-736 (1995); Hemmings Science, 277: 534 (1997); Downward, Curr. Opin. Cell Biol. 10: 262-267
(1998), Alessi et al., EMBO J. 15: 6541-6551 (1996)). Os inibidores específicos de PI3K ou mutantes Akt negativos dominantes anulam as atividades que promovem a sobrevivência destes fatores de crescimento ou 10 citocinas. Foi anteriormente divulgado que inibidores de PI3K (LY294002 ou wortmanina) bloqueou a ativação de Akt pelas cinases a montante. Além disso, a introdução de PI3K constitutivamente ativo ou mutantes de Akt promove a sobrevivência celular sob condições em que as células normalmente sofrem a morte celular apoptótica (Kulik et al. 1997, Dudek et 15 al. 1997).
Três membros da subfamília de Akt de serina/treonina proteína cinases reguladas por mensageiro secundário foram identificados e chamados de Aktl/PKBa, Akt2/PKBP e Akt3/PKBy (doravante aludido como “Aktl”, “Akt2” e “Akt3”), respectivamente. As isoformas são homólogas, 20 particularmente em regiões que codificam os domínios catalíticos. Akts são ativados pelos eventos de fosforilação que ocorrem em resposta à sinalização de PI3K. PI3K fosforila fosfolipídeos de inositol de membrana, gerando os mensageiros secundários 3,4,5-trisfosfato de fosfatidilinositol e 3,4-bisfosfato de fosfatidilinositol, que mostraram ligar ao domínio PH de Akt. O modelo 25 corrente de ativação de Akt propõe o recrutamento da enzima para a membrana pelos fosfoinositídeos 3’-fosforilados, onde a fosforilação dos sítios reguladores de Akt pelas cinases a montante ocorre (B. A. Hemmings, Science 275: 628-630 (1997); B. A. Hemmings, Science 276: 534 (1997); J. Downward, Science 279: 673-674 (1998)). A fosforilação de Aktl ocorre em dois sítios reguladores,
30g 473 ·
ThR na alça de ativação do domínio catalítico e no SeR próximo ao término carbóxi (D. R. Alessi et al. EMBO J. 15: 6541-6551 (1996) e R. Meier et al. J. Biol. Chem. 272: 30491-30497 (1997)). Sítios de fosforilação 5 reguladores equivalentes ocorrem em Akt2 e Akt3. A cinase a montante, que fosforila Akt no sítio da alça de ativação foi clonado e chamado de cinase de proteína dependente de 3’-fosfoinositídeo 1 (PDK1). PDKl fosforila não apenas Akt, mas também p70 ribossômico S6 cinase, p90RSK, cinase regulada por soro e glicocorticóide (SGK), e cinase de proteína C.
A cinase a montante que fosforila o sítio regulador de Akt
próximo ao terminal carbóxi não foi ainda identificado, mas relatos recentes implicam um papel para a cinase ligada à integrina (ILK-1), uma serina/treonina proteína cinase ou autofosforilação.
A análise dos níveis de Akt em tumores humanos mostraram 15 que Akt2 é superexpressada em um número significante de canceres ovariano (J. Q. Cheng et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 9267-9271 (1992)) e pancreático (J. Q. Cheng et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93: 3636-3641 (1996)). Similarmente, Akt3 foi descoberta ser superexpressada em linhagens de célula de câncer de mama e próstata (Nakatani et al. J. Biol. Chem. 274: 20 21528-21532(1999).
O supressor de tumor PTEN, uma proteína e fosfatase lipídica que especificamente remove o 3’ fosfato de Ptdlns(3,4,5)-P3, é um regulador negativo do caminho PI3K/Akt (Li et al. Science 275: 1943-1947 (1997), Stambolic et al. Cell 95: 29-39 (1998), Sun et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 25 U.S.A. 96: 6199-6204 (1999)). As mutações de linha germinativa de PTEN são responsáveis pelas síndromes de câncer humano tais como doença de Cowden (Liaw et al. Nature Genetics 16: 64-67 (1997)).
PTEN é deletado em uma grande porcentagem de tumores humanos e linhagens de célula de tumor sem PTEN funcional mostra níveis elevados de Akt ativado (Li et al. supra, Guldberg et al. Cancer Research 57: 3660-3663 (1997), Risinger et al. Cancer Research 57: 4736-4738 (1997)).
Estas observações demonstram que o caminho de PI3K/Akt desempenha papéis importantes para regular a sobrevivência celular ou apoptose na tumorigênese.
A inibição da ativação de Akt e a atividade podem ser obtidas pela inibição de PI3K com inibidores tais como LY294002 e vortmanina. Entretanto, a inibição de PI3K tem o potencial para afetar indiscriminadamente não apenas todos as três isozimas de Akt mas também outras moléculas de sinalização contendo o domínio PH que são dependentes do Pdtlns(3,4,5)-P3, tal como a família Tec de tirosinas cinases. Além disso, foi divulgado que Akt pode ser ativada pelos sinais de crescimento que são independentes de PI3K.
Alternativamente, a atividade de Akt pode ser inibida pelo bloqueio da atividade da cinase PDKl a montante. Nenhum inibidor de PDKl específico foram divulgados. Mais uma vez, a inibição de PDKl resultaria na inibição de cinases de proteína múltiplas cujas atividades dependem de PDKl, tais como isoformas de PKC atípicas, SGK e S6 cinases (Williams et al. Curr. Biol. 10: 439-448 (2000).
Os compostos da presente invenção têm propriedades vantajosas inesperadas em relação aos compostos de naftiridina substituídos por ciclopropila especificamente descritos na WO 2006/135627.
E um objetivo da presente invenção fornecer novos compostos que são inibidores de Akt.
Também é um objetivo da presente invenção fornecer composições farmacêuticas que compreendam os novos compostos que são inibidores de Akt.
Também é um objetivo da presente invenção fornecer um método para tratar câncer que compreende administrar tais inibidores da atividade de AKT. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece compostos de naftiridina substituídos que inibem a atividade de Akt. Em particular, os compostos divulgados seletivamente inibem uma ou duas das isoformas de Akt. A invenção também fornece composições que compreendem tais compostos inibidores e métodos de inibir a atividade de Akt pela administração do composto a um paciente em necessidade de tratamento de câncer. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os compostos da presente invenção são úteis na inibição da atividade da serina/treonina cinase Akt.
Em uma forma de realização os inibidores da presente invenção são ilustrados pela Fórmula C:
em que:
a é 0 ou 1; b é 0 ou 1; m é 0, 1 ou 2; p é 0, 1 ou 2;
R é independentemente selecionado de: alquila (CrCe), alcóxi (C1-C6), CO2H, halo, OH e NH2;
O anel Y é cicloalquila (C4-C7);
R1 é selecionado de: H, oxo, (C=O)3Obalquila (Ci-Ci0), (C=0)a0b-arila, (C=O)aObalquenila (C2-Ci0), (C=0)a0balquinila (C2-Ci0), CO2H, halo, OH, Obperfluoroalquila (CrC6), (C=O)aNR7R8, CN, (C=0)aObcicloalquila (C3-C8), S(O)mNR7R8, SH, S(0)m-alquila (CrCi0) e (OO)aOb-heterociclila, os ditos alquila, arila, alquenila, alquinila, cicloalquila e heterociclila são opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de R6;
R6 é: (C=O)aObalquila CrCio, (C=0)a0barila, alquenila C2- 5 Cio, alquinila C2-Cio, (C=O)aOb heterociclila, CO2H, halo, CN, OH, Obperfluoroalquila CrC6, Oa(C=O)bNR7R8, oxo, CHO, (N=O)R7R8, S(O)mNR7R8, SH, S(0)m-alquila (CrCi0) ou (C=O)aOb cicloalquila C3-C8, os ditos alquila, arila, alquenila, alquinila, heterociclila e cicloalquila opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionado de R6a; 10 R6a é selecionado de: (C=O)aObalquila (CrCio),
Oaperfluoroalquila (CrC3), alquileno (CO-C6)-S(O)mRa, SH, oxo, OH, halo, CN, alquenila (C2-Ci0), alquinila (C2-Ci0), cicloalquila (C3-C6), alquileno (CO- C6) arila, alquileno (CO-C6) heterociclila, alquileno (CO-C6)-N(Rb)2, C(O)Ra, alquileno (CO-C6) CO2Ra, C(O)H e alquileno (CO-C6)-CO2H, os ditos alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, arila e heterociclila é opcionalmente
L
substituído com até três substituintes selecionados de R , OH, alcóxi (CrC6), halógeno, CO2H, CN, 0a(C=0)balquila (CrC6), oxo e N(Rb)2;
7 o
R1 e R0 são independentemente selecionados de: H, (C=0)a0balquila (CrCi0), (C=0)aObcicloalquila (C3-C8), (C=0)a0b-arila, 20 (C=0)aOb-heterociclila, alquenila (C2-Ci0), alquinila (C2-Ci0), SH, SO2Ra e (C=O)aNRb2, os ditos alquila, cicloalquila, arila, heterociclila, alquenila e alquinila são opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de R6a ou R7 e R8 podem ser tomados juntos com o nitrogênio ao qual estão ligados para formar um heterociclo monocíclico ou bicíclico com 3 25 a 7 membros em cada anel e opcionalmente contendo, além do nitrogênio, um ou dois heteroátomos adicionais selecionados de N, O e S, o dito heterociclo monocíclico ou bicíclico opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionado de R6a;
Ra é alquila (CrC6), cicloalquila (CrC6), arila ou heterociclila; Rb é independentemente: H, alquila (CrC6), arila, heterociclila, cicloalquila (CrC6), (C=0)a0balquila (CrC6) ou S(O)mRa;
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um estereoisômero
do mesmo.
Em uma outra forma de realização desta invenção, os inibidores da atividade de AKT são ilustrados pela Fórmula E:
em que
G
I
l-k
VQl'
,E
M
OU
O anel Y é ciclobutila;
R1 é H, pirimidila, metilimidazol, OH, metila ou ciclopropila; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
Um composto da presente invenção é:
Dicloridreto de l-{4-[3-(l-metil-lH-imidazol-4-il)-9- fenil[l,2,4]triazolo [3,4-/]-l,6-naftiridin-8-il]fenil}ciclobutanamina (1-9);
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Um composto da presente invenção é: {l-[4-(9-fenil[l,2,4]triazolo[3,44]-l,6-naftiridin-8-il)fenil]- ciclobutil}-carbamato de terc-butila (1-15);
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Um composto da presente invenção é:
1 -[4-(9-fenil-3-pirimidin-2-il[ 1,2,4]triazolo[3,44]-1,6-
naftiridin-8-il)-fenil] ciclobutanamina (1-10);
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Um composto da presente invenção é:
8-[4-(l-Aminociclobutil)fenil]-9-fenil[l,2,4]triazolo[3,44]-l,6- naftiridin-3(2H)-ona (1-16);
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Um composto da presente invenção é: l-[4-(3-metil-9-fenil[l,2,4]triazolo[3,4-f]-l,6-naftiridin-8- il)fenil] ciclobutanamina (1-17);
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Um composto da presente invenção é:
1 - [4-(3 -ciclopropil-9-fenil [ 1,2,4] triazolo [3,4-f\-1,6-naftiridin- 8-il)fenil] ciclobutanamina (1-23);
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Os compostos da presente invenção podem ter centros quirais
assimétricos, eixos quirais e planos quirais (como descrito em: E. L. Eliel e S.
H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1994, páginas 1119-1190) e ocorrem como racematos, misturas racêmicas e como diastereômeros individuais, com todos os isômeros e misturas possíveis destes, incluindo isômeros ópticos, todos de tais estereoisômeros sendo incluídos na presente invenção.
Além disso, os compostos aqui divulgados podem existir como tautômeros e ambas as formas tautoméricas são intencionadas a serem abrangidas pelo escopo da invenção, embora apenas uma estrutura tautomérica seja representada. Por exemplo:
Os
O
0;
Tetrazóis existem como uma mistura de tautômeros 1H/2H. As
formas tautoméricas da porção de tetrazol também estão dentro do escopo da presente invenção.
medicamentos dos compostos aqui divulgados. Um pró medicamento de qualquer um dos compostos pode ser fabricado usando técnicas farmacológicas bem conhecidas.
do que uma vez em qualquer constituinte, a sua definição em cada ocorrência é independente em cada outra ocorrência. Também, combinações de substituintes e variáveis são permissíveis apenas se tais combinações resulta em compostos estáveis. As linhas desenhadas nos sistemas de anel a partir dos substituintes representam que a ligação indicada pode ser ligada a qualquer 15 um dos átomos de anel substituíveis. Se o sistema de anel é bicíclico, é intencionado que a ligação seja ligada a qualquer um dos átomos adequados em cada anel da porção bicíclica.
incorporados nos compostos da presente invenção no lugar de um ou mais átomos de carbono por uma pessoa de habilidade na técnica para fornecer
5
Esta invenção também é intencionada a abranger pró-
Quando qualquer variável (por exemplo, R2, etc.) ocorre mais
r
E entendido que um ou mais átomos de silício (Si) podem ser compostos que sejam quimicamente estáveis e que possam ser facilmente sintetizados pelas técnicas conhecidas no ramo a partir de materiais de partida facilmente disponíveis. Carbono e silício diferem em seus raios covalentes levando a diferenças na distância de ligação e ao arranjo estérico quando comparando ligações de C-elemento e Si-elemento análogas. Estas diferenças levam a mudanças sutis no tamanho e forma dos compostos contendo silício quando comparados ao carbono. Uma pessoa de habilidade comum na técnica entenderia que as diferenças de tamanho e forma podem levar a mudanças sutis ou dramáticas na potência, solubilidade, falta de atividade fora do alvo, propriedades de empacotamento e assim por diante. (Diass, J. O. et al. Organometallics (2006) 5: 1188-1198; Showell, G. A. et al. Bio-organic & Medicinal Chemistry Letters (2006) 16: 2555-2558).
É entendido que substituintes e padrões de substituição nos compostos da presente invenção podem ser selecionados por uma pessoa de habilidade na técnica para fornecer compostos que fossem quimicamente estáveis e que pudessem ser facilmente sintetizados pelas técnicas conhecidas no ramo, assim como aqueles métodos apresentados abaixo, a partir de materiais de partida facilmente disponíveis. Se um substituinte é por si só substituído com mais do que um grupo, é entendido que estes grupos múltiplos podem estar no mesmo carbono ou em carbonos diferentes, contanto que uma estrutura estável resulte. A frase “opcionalmente substituído com um ou mais substituintes” deve ser considerado ser equivalente à frase “opcionalmente substituído com pelo menos um substituinte” e em tais casos a forma de realização preferida terá de zero a quatro substituintes e a forma de realização mais preferida terá de zero a três substituintes.
Como aqui usado, “alquila” é intencionado a incluir grupos de hidrocarboneto alifáticos saturados tanto de cadeia ramificada quanto reta tendo o número especificado de átomos de carbono, por exemplo, Q-Cio, como em “alquila (C1-C10)” é definido incluir grupos tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 carbonos em um arranjo linear ou ramificado. Por exemplo, “alquila (Ci-Cio)” especificamente inclui metila, etila, n-propila, i-propila, n- butila, t-butila, i-butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila e assim por diante.
O termo “cicloalquila” significa um grupo de hidrocarboneto alifático saturado monocíclico tendo o número especificado de átomos de carbono. Por exemplo, “cicloalquila” inclui ciclopropila, metil-ciclopropila, 2,2-dimetil-ciclobutila, 2-etil-ciclopentila, cicloexila e assim por diante.
“Alcóxi” representa um grupo alquila cíclico ou não cíclico de número indicado de átomos de carbono ligados através de uma ponte de oxigênio. “Alcóxi” portanto abrange as definições de alquila e cicloalquila acima.
Se nenhum número de átomos de carbono é especificado, o termo “alquenila” refere-se a um radical de hidrocarboneto não aromático, reto, ramificado ou cíclico, contendo de 2 a 10 átomos de carbono e pelo menos uma ligação dupla de carbono para carbono. Preferivelmente uma ligação dupla de carbono para carbono está presente e até quatro ligações duplas de carbono-carbono não aromáticas podem estar presentes. Assim, “alquenila (C2-C10)” significa um radical alquenila tendo de 2 a 10 átomos de carbono. Os grupos alquenila incluem etenila, propenila, butenila, 2- metilbutenila e cicloexenila. A porção reta, ramificada ou cíclica do grupo alquenila pode conter ligações duplas e pode ser substituída se um grupo alquenila substituído é indicado.
O termo “alquinila” refere-se a um radical de hidrocarboneto reto, ramificado ou cíclico, contendo de 2 a 10 átomos de carbono e pelo menos uma ligação tripla de carbono para carbono. Até três ligações triplas de carbono-carbono podem estar presentes. Assim, “alquinila (C2-C10)” significa um radical de alquinila tendo de 2 a 10 átomos de carbono. Os grupos alquinila incluem etinila, propinila, butinila, 3-metilbutinila e assim por diante. A porção reta, ramificada ou cíclica do grupo alquinila pode conter ligações triplas e pode ser substituído se um grupo alquinila substituído é indicado.
Em certos casos, os substituintes podem ser definidos com uma faixa de carbonos que inclui zero, tal como alquileno (CO-Cô) arila. Se arila é adotado ser fenila, esta definição incluiria o próprio fenila assim como -CH2Ph, -CH2CH2Ph, CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph e assim por diante.
Como aqui usado, “arila” é intencionado significar qualquer anel de carbono monocíclico ou bicíclico estável de até 7 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático. Os exemplos de tais elementos de arila incluem fenila, naftila, tetraidro-naftila, indanila e bifenila. Em casos onde o substituinte de arila é bicíclico e um anel é não aromático, é entendido que a ligação é por intermédio do anel aromático.
O termo heteroarila, como aqui usado, representa um anel monocíclico ou bicíclico estável de até 7 átomos em cada anel, em que pelo menos um anel é aromático e contém de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste de O, N e S. Os grupos heteroarila dentro do escopo desta definição incluem mas não são limitados a: acridinila, carbazolila, cinolinila, quinoxalinila, pirrazolila, indolila, benzotriazolila, furanila, tienila, benzotienila, benzofuranila, quinolinila, isoquinolinila, oxazolila, isoxazolila, indolila, pirazinila, piridazinila, piridinila, pirimidinila, pirrolila, tetraidroquinolina. Como com a definição de heterociclo abaixo, “heteroarila” também é entendido incluir o derivado de N-óxido de qualquer heteroarila contendo nitrogênio. Em casos onde o substituinte de heteroarila é bicíclico e um anel não é aromático ou não contém nenhum heteroátomo, é entendido que a ligação é por intermédio do anel aromático ou por intermédio do anel contendo heteroátomo, respectivamente. Tais porções de heteroarila para o substituinte Q incluem mas não são limitados a: 2-benzimidazolila, 2- quinolinila, 3-quinolinila, 4-quinolinila, 1-isoquinolinila, 3-isoquinolinila e 4- isoquinolinila.
O termo “heterociclo” ou “heterociclila” como aqui usado é intencionado significar um heterociclo aromático ou não aromático de 3 a 10 membros contendo de 1 a 4 heteroátomos selecionados do grupo que consiste de O, N e S e inclui grupos bicíclicos. “Heterociclila” portanto inclui as heteroarilas mencionadas acima, assim como análogos diidro e tetraidro destes. Outros exemplos de “heterociclila” incluem, mas não são limitados aos seguintes: benzoimidazolila, benzoimidazolonila, benzofuranila, benzofurazanila, benzopirazolila, benzotriazolila, benzotiofenila, benzoxazolila, carbazolila, carbolinila, cinnolinila, furanila, imidazolila, indolinila, indolila, indolazinila, indazolila, isobenzofuranila, isoindolila, isoquinolila, isotiazolila, isoxazolila, naftpiridinila, oxadiazolila, oxazolila, oxazolina, isoxazolina, oxetanila, piranila, pirazinila, pirazolila, piridazinila, piridopiridinila, piridazinila, piridila, pirimidila, pirrolila, quinazolinila, quinolila, quinoxalinila, tetraidropiranila, tetrazolila, tetrazolopiridila, tiadiazolila, tiazolila, tienila, triazolila, azetidinila, 1,4-dioxanila, hexaidroazepinila, piperazinila, piperidinila, piridin-2-onila, pirrolidinila, morfolinila, tiomorfolinila, diidrobenzoimidazolila, diidrobenzofuranila, diidrobenzo-tiofenila, diidrobenzoxazolila, diidrofuranila, diidroimidazolila, diidroindolila, diidroiso-oxazolila, diidroisotiazolila, diidro-oxadiazolila, diidro-oxazolila, diidropirazinila, diidropirazolila, diidropiridinila, diidropirimidinila, diidropirrolila, diidroquinolinila, diidrotetrazolila, diidrotiadiazolila, diidrotiazolila, diidrotienila, diidro-triazolila, diidroazetidinila, metilenodioxibenzoíla, tetraidrofuranila e tetraidrotienila e N-óxidos destes. A ligação de um substituinte de heterociclila pode ocorrer por intermédio de um átomo de carbono ou por intermédio de um heteroátomo.
Como avaliado por aqueles de habilidade na técnica, “halo” ou “halógeno” como aqui usado é intencionado a incluir cloro (Cl), flúor (F), bromo (Br) e iodo (I).
Em uma forma de realização, R1 é selecionado de: oxo, NH2, OH, SH, Oa.alquila (Ci-C6), o dito alquila é opcionalmente substituído com R6a.
Em uma forma de realização Rb é independentemente selecionado de H e alquila (CrC6).
Em uma forma de realização da Fórmula C, R1 é selecionado de: oxo, (C=O)aObalquila (Ci-Ci0), (C=0)a0b-arila, (C=0)a0balquenila (C2- 10 Cio), (C=O)aOb alquinila (C2-Cio), CO2H, halo, OH, Obperfluoroalquila (Cr C6), (C=O)aNR7R8, CN, (C=O)aOb-CiCloalquila (C3-C8), S(O)2NR7R8, SH, S(0)2-alquila (Ci-Ci0) e (C=0)aOb-heterociclila, os ditos alquila, arila, alquenila, alquinila, cicloalquila e heterociclila são opcionalmente substituídos com R6a.
Em uma outra forma de realização da Fórmula C, R1 é
selecionado de: oxo, (C=0)a0balquila (Ci-Ci0), CO2H, halo, OH, CN, alcóxi (CrC6), S(O)2NR7R8, SH, S(0)2-alquila (CrCi0), 0(C=0)alquila (CrC6) e N(Rb)2, o dito alquila é opcionalmente substituído com R6a.
Em uma outra forma de realização da Fórmula C, R1 é selecionado de: oxo, NH2, OH, SH, Oa.alquila (CrC6), o dito alquila é opcionalmente substituído com R6a.
Em uma outra forma de realização da Fórmula C, R é selecionado de: oxo, (C=O)aObalquila (CrCi0), CO2H, halo, OH, CN, alcóxi (CrC6), 0(C=0)alquila (CrC6), alquenila (C2-Ci0) e N(Rb)2, o dito alquila é opcionalmente substituído com Rb, OH, alcóxi (CrC6), halógeno, CO2H, CN, 0(C=0)alquila (CrC6), oxo e N(Rb)2.
Em uma outra forma de realização da Fórmula C, R1 é selecionado de: H, heterociclila, cicloalquila (C3-C6), OH, alquila (CrC6), NHalquila (CrC6), NH-heterociclila, NH-cicloalquila, os ditos heterociclila, cicloalquila e alquila são opcionalmente substituídos com: halo, alquila (Cr C6), alquila (CrC6)-NH2, OH, Oalquila (CrC6) e R2 é selecionado de: H e halógeno.
Em uma outra forma de realização da Fórmula C, o anel Y é ciclobutila; R1 é selecionado de: H, heterociclila, cicloalquila (CrC6), OH, alquila (CrC6), NHalquila (CrC6), NH-heterociclila, NHcicloalquila, o dito heterociclila, cicloalquila e alquila é opcionalmente substituído com: halo, alquila (CrC6), alquila (CrC6)-NH2, OH, Oalquila (CrC6) e R2 é H ou F.
Em uma outra forma de realização da Fórmula C, o anel Y é ciclobutila; R1 é: H ou alquila (CrC6); e R2 é H ou F.
Incluída na presente invenção está a forma livre dos compostos da Fórmula C ou E, assim como os sais farmaceuticamente aceitáveis e estereoisômeros destes. Alguns dos compostos isolados exemplificados aqui específicos são os sais protonados de compostos de amina. O termo “forma livre” refere-se aos compostos de amina na forma não salina. Os sais farmaceuticamente aceitáveis abrangidos não apenas incluem os sais isolados exemplificados para os compostos específicos aqui descritos, mas também todos os sais farmaceuticamente aceitáveis típicos da forma livre de compostos da Fórmula C ou E. A forma livre dos compostos salinos específicos descrita pode ser isolada usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a forma livre pode ser regenerado tratando-se o sal com uma solução básica aquosa diluída adequada tal como NaOH aquoso diluído, carbonato de potássio, amônia e bicarbonato de sódio. As formas livres podem diferir um pouco de suas respectivas formas salinas em certas propriedades físicas, tais como solubilidade em solventes polares, mas os sais de ácido e base são de outro modo farmaceuticamente equivalentes às suas respectivas formas livres para os propósitos da invenção.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos presentes compostos podem ser sintetizados a partir dos compostos desta invenção que contêm uma porção básica ou ácida pelos métodos químicos convencionais. No geral, os sais dos compostos básicos são preparados pela cromatografia de troca iônica ou pela reação da base livre com quantidades estequiométricas ou com um excesso do ácido inorgânico ou orgânico que forma o sal desejado em um solvente adequado ou várias combinações de solventes. Similarmente, os sais dos compostos ácidos são formados pelas reações com a base inorgânica ou orgânica apropriada.
Assim, os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem os sais não tóxicos convencionais dos compostos desta invenção como formados pela reação de um composto imediato básico com um ácido inorgânico ou orgânico. Por exemplo, sais não tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como clorídrico, bromídrico, sulfurico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e outros, assim como sais preparados a partir de ácidos orgânicos tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, lático, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2-acetóxi-benzóico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etanodissulfônico, oxálico, isetiônico, trifluoroacético (TFA) e outros.
Quando o composto da presente invenção é ácido, “sais farmaceuticamente aceitáveis” adequados referem-se aos sais preparados a partir de bases não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis incluindo bases inorgânicas e bases orgânicas. Sais derivados de bases inorgânicas incluem alumínio, amônio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio, magnésio, sais mangânicos, manganosos, potássico, sódio, zinco e outros. Particularmente preferidos são os sais de amônio, cálcio, magnésio, potássio e sódio. Os sais derivados de bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo as aminas substituídas que ocorrem naturalmente, as aminas cíclicas e as resinas de troca iônica básicas, tais como arginina, betaína, cafeína, colina, N5N^dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2- dimetil-aminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N- etilpiperidina, glicamina, glicosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglicamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina e outras.
A preparação dos sais farmaceuticamente aceitáveis descritos acima e outros sais farmaceuticamente aceitáveis típicos é mais completamente descrita por Berg et al., “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977: 66: 1-19.
Também deve ser mencionado que os compostos da presente invenção são potencialmente sais internos ou zuiteríons, visto que sob condições fisiológicas uma porção ácida desprotonada no composto, tal como um grupo carboxila, pode ser aniônica e esta carga eletrônica pode ser depois novamente equilibrada internamente contra a carga catiônica de uma porção básica protonada ou alquilada, tal como um átomo de nitrogênio quaternário.
UTILIDADE
Os compostos da presente invenção são inibidores da atividade de Akt e são assim úteis no tratamento de câncer, em particular canceres associados com irregularidades na atividade de Akt e alvos celulares a jusante de Akt. Tais canceres incluem, mas não são limitados a, canceres ovariano, pancreático, mamário e prostático, assim como canceres (incluindo glioblastoma) onde o supressor de tumor PTEN é mutado (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1992) 89: 9267-9271; Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1996) 93: 3636-3641; Bellacosa et al., Mt. J. Cancer (1995) 64: 280-285; Nakatani et al., Biol. Chem. (1999) 274: 21528-21532; Graff, Expert. Opin. Ther. Targets (2002) 6(1): 103-113; e Yamada e Araki, J. Cell Science. (2001) 114: 2375-2382; Mischel e Cloughesy, Brain Pathol. (2003) 13(1): 52- Os compostos, composições e métodos aqui fornecidos são particularmente julgados úteis para o tratamento de câncer. Os canceres que podem ser tratados pelos compostos, composições e métodos da invenção incluem, mas não são limitados a:
Cardíaco: sarcoma (angiossarcoma, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, lipossarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma e teratoma; Pulmonar: pulmonar de célula não pequena, carcinoma broncogênica (célula escamosa, célula pequena não diferenciada, célula grande não diferenciada, adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma brônquico, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; Gastrointestinal: esôfago (carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, linfoma), estômago (carcinoma, linfoma, leiomiossarcoma), pâncreas (adenocarcinoma dutal, insulinoma, glicagonoma, gastrinoma, tumores carcinóides, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinóides, sarcoma de Karposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grosso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma viloso, hamartoma, leiomioma), cólon, colorretal, retal; Trato genitourinário: rim (adenocarcinoma, tumor de Wilm [nefroblastoma], linfoma, leucemia), bexiga e uretra (carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula transicional, adenocarcinoma), próstata (adenocarcinoma, sarcoma), testículo (seminoma, teratoma, carcinoma embrionário, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de célula intersticial, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatóides, lipoma); Fígado: hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiossarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; Osso: sarcoma osteogênico (osteossarcoma), fibrossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de célula do retículo), mieloma múltiplo, cordoma de tumor de célula gigante maligno, osteocronfroma (exostoses osteocartilaginosa), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoma osteóide e tumores de célula gigante; Sistema nervoso: crânio (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteíte deformante), meninges (meningioma, meningiossarcoma, 5 gliomatose), cérebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, scvanoma, retinoblastoma, tumores congênitos), neurofibroma da medula espinhal, meningioma, glioma, sarcoma); Ginecológico: útero (carcinoma endometrial), cerviz (carcinoma cervical, displasia cervical pré-tumoral), 10 ovários (carcinoma ovariano [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma não classificado], tumores de célula tecal granulosa, tumores de célula de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma de célula escamosa, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrossarcoma, melanoma), vagina (carcinoma de célula clara, carcinoma de 15 célula escamosa, sarcoma botrióide (rabdomiossarcoma embrionário), tubos de falópio (carcinoma); Hematológico: sangue (leucemia mielóide [aguda e crônica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, doenças mieloproliferativas, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplástica), doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin [linfoma maligno]; Pele: melanoma maligno, 20 carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, sarcoma de Karposi, nervos displásticos moles, lipoma, angioma, dermatofibroma, quelóides, psoríase; e Glândulas adrenais: neuroblastoma. Assim, o termo “célula cancerosa” como aqui fornecido, inclui uma célula afligida por qualquer uma das condições identificadas acima.
Os canceres que podem ser tratados pelos compostos,
composições e métodos da invenção incluem, mas não são limitados a: mamário, prostático, colônico, colorretal, pulmonar, pulmonar de célula não pequena, cerebral, testicular, estomacal, pancreático, dérmico, intestino delgado, intestino grosso, garganta, cabeça e pescoço, oral, ósseo, hepático, bexiga, renal, tireóide e sanguíneo. Os canceres que podem ser tratados pelos compostos, composições e métodos da invenção incluem: mamário, prostático, colônico, ovariano, colorretal, pulmonar e pulmonar de célula não pequena.
Os canceres que podem ser tratados pelos compostos, composições e métodos da invenção incluem: mamário, colônico, (colorretal) e pulmonar (pulmonar de célula não pequena).
Os canceres que podem ser tratados pelos compostos, composições e métodos da invenção incluem: linfoma e leucemia.
Os compostos da presente invenção são úteis para o tratamento de câncer mamário.
Os compostos da presente invenção são úteis para o tratamento de câncer prostático.
A sinalização de Akt regula etapas críticas múltiplas na angiogênese. Shiojima e Walsh, Circ. Res. (2002) 90: 1243-1250. A utilidade dos inibidores de angiogênese no tratamento de câncer é conhecido na literatura, ver J. Rak et al. Cancer Research, 55: 4575-4580, 1995 e Dredge et al., Expert Opin. Ther. (2002) 2(8): 953-966, por exemplo. O papel da angiogênese no câncer foi mostrado em numerosos tipos de câncer e tecidos: carcinoma mamário (G. Gasparini e A. L. Harris, J. Clin. Oncol., 1995, 13: 765-782; M. Toi et al., Japão. J. Cancer Res., 1994, 85: 1045-1049); carcinomas da bexiga (A. J. Dickinson et al., Br. J. Urol., 1994, 74: 762-766); carcinomas colônicos (L. M. Ellis et al., Surgery, 1996, 120(5): 871-878); e tumores da cavidade oral (J. K. Williams et al., Am. Surg., 1994, 168: 373- 380). Outros canceres incluem, tumores avançados, leucemia de célula pilosa, melanoma, cabeça e pescoço avançado, célula renal metastática, linfoma não Hodgkin, mamário metastático, adenocarcinoma mamário, melanoma avançado, pancreático, gástrico, glioblastoma, pulmonar, ovariano, pulmonar de célula não pequena, prostático, pulmonar de célula pequena, carcinoma de célula renal, vários tumores sólidos, mieloma múltiplo, prostático metastático, glioma maligno, câncer renal, linfoma, doença metastática refratária, mieloma múltiplo refratário, câncer cervical, sarcoma de Kaposi, glioma anaplástico recorrente e câncer colônico metastático (Dredge et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2002) 2(8): 953-966). Assim, os inibidores de Akt divulgados no presente pedido também são úteis no tratamento deste canceres relacionados com a angiogênese.
Os tumores que sofreram neovascularização mostram um potencial aumentado para a metástase. De fato, a angiogênese é essencial para o crescimento de tumor e metástase. (S. P. Cunningham, et al., Can. Research, 61: 3206-3211 (2001)). Os Akt inibidores divulgados no presente pedido também são portanto úteis para prevenir ou diminuir a metástase de célula de tumor.
Ainda incluído dentro do escopo da invenção está um método de tratar ou prevenir uma doença em que a angiogênese está implicada, que é compreendida de administrar a um mamífero em necessidade de tal tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção. As doenças neovasculares oculares são um exemplo de condições onde muito do dano ao tecido resultante pode ser atribuído à infiltração aberrante de vasos sanguíneos no olho (ver a WO 00/30651, publicada em 2 de Junho de 2000). A infiltração indesejável pode ser deflagrada pela retinopatia isquêmica, tal como aquela que resulta da retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade, oclusões de veia retinal, etc. ou pelas doenças degenerativas, tais como a neovascularização coroidal observada na degeneração macular relacionada com a idade. A inibição do crescimento de vasos sanguíneos pela administração dos presentes compostos preveniria portanto a infiltração de vasos sanguíneos e preveniria ou trataria doenças onde a angiogênese é implicada, tal como em doenças oculares como a vascularização retinal, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada com a idade e outros. Ainda incluído dentro do escopo da invenção está um método de tratar ou prevenir uma doença não maligna em que a angiogênese é implicada, incluindo mas não limitada a: doenças oculares (tais como, vascularização retinal, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade), aterosclerose, artrite, psoríase, obesidade e doença de Alzheimer (Dredge et al., Expert Opin. Biol. Ther. (2002) 2(8): 953-966). Em uma outra forma de realização, um método de tratar ou prevenir uma doença em que a angiogênese é implicada inclui: doenças oculares (tais como, vascularização retinal, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade), aterosclerose, artrite e psoríase.
Ainda incluído dentro do escopo da invenção está um método de tratar distúrbios hiperproliferativos tais como restenose, inflamação, doenças autoimunes e alergia/asma.
Ainda incluído dentro do escopo da presente invenção está o uso dos presentes compostos para revestir sondas e portanto o uso dos presentes compostos sobre sondas revestidas para o tratamento e/ou prevenção de restenose (WO 03/032809).
Ainda incluído dentro do escopo da presente invenção está o uso dos presentes compostos para o tratamento e/ou prevenção da osteoartrite (WO 03/035048).
Ainda incluído dentro do escopo da invenção está um método de tratar o hiperinsulinismo.
Os compostos da invenção também são úteis na preparação de um medicamento que é útil no tratamento das doenças descritas acima, em particular câncer.
Em uma forma de realização da invenção, o presente composto é um inibidor seletivo cuja eficácia inibidora é dependente do domínio PH. Nesta forma de realização, o composto exibe uma atividade inibidora in vitro diminuída ou nenhuma atividade inibidora in vitro contra as proteínas Akt truncadas que carecem do domínio PH.
Em uma outra forma de realização, o presente composto é selecionado do grupo de um inibidor seletivo de Akt 1, um inibidor seletivo de Akt2 e um inibidor seletivo tanto de Aka quanto de Akt2.
Em uma outra forma de realização, o presente composto é selecionado do grupo de um inibidor seletivo de Akt 1, um inibidor seletivo de Akt2, um inibidor seletivo de Akt3 e um inibidor seletivo de duas das três isoformas de Akt.
Em uma outra forma de realização, o presente composto é um inibidor seletivo de todas as três isoformas de Akt, mas não é um inibidor de um, dois ou todos de tais isoformas de Akt que foram modificadas para deletar o domínio de PH, a região de fechadura ou tanto o domínio PH quanto a região de fechadura.
A presente invenção é ainda direcionada a um método de inibir a atividade de Akt que compreende administrar a um mamífero em necessidade deste uma quantidade farmaceuticamente eficaz do presente composto.
Os compostos desta invenção podem ser administrados aos mamíferos, incluindo seres humanos, sozinhos ou, em combinação com carregadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou diluentes, em uma composição farmacêutica, de acordo com a prática farmacêutica padrão. Os compostos podem ser administrados oral ou parenteralmente, incluindo as vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, retal e tópica de administração.
As composições farmacêuticas contendo o ingrediente ativo pode estar em uma forma adequada para o uso oral, por exemplo, como tabletes, pastilhas, pílulas, suspensões aquosas ou oleosas, pós dispersáveis ou grânulos, emulsões, cápsulas duras ou moles ou xaropes ou elixires. As composições intencionadas para o uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a fabricação de composições farmacêuticas e tais composições podem conter um ou mais agentes selecionados do grupo que consiste de agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes corantes e agentes conservantes de modo a fornecer preparações farmaceuticamente elegantes e palatáveis. Os tabletes contêm o ingrediente ativo em mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos que são adequados para a fabricação de tabletes. Estes excipientes podem ser por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e desintegração, por exemplo, celulose microcristalina, croscarmelose sódica, amido de milho ou ácido algínico; agentes de ligação, por exemplo amido, gelatina, polivinil-pirrolidona ou acácia e agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os tabletes podem ser não revestidos ou eles podem ser revestidos pelas técnicas conhecidas para mascarar o sabor desagradável do medicamento ou retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e deste modo fornecer uma ação prolongada em um período mais longo. Por exemplo, um material mascarador de sabor solúvel em água tal como hidroxipropilmetil-celulose ou hidroxipropilcelulose ou um material de retardo de tempo tal como etil celulose, acetato butirato de celulose pode ser utilizado.
As formulações para o uso oral também pode ser apresentado como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com carregador solúvel em água tal como polietileno glicol ou um meio oleoso, por exemplo óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva.
As suspensões aquosas contêm o material ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, alginato de sódio, polivinil- pirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes de dispersão ou umectação pode ser um fosfatídeo que ocorre naturalmente, por exemplo lecitina ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo estearato de polioxietileno ou produtos de condensação de óxido de etileno com alcoóis alifáticos de cadeia longa, por exemplo heptadecaetileno-oxicetanol ou produtos de condensação de óxido de etileno com derivados de ésteres parciais de ácidos graxos e um hexitol tal como mono-oleato de polioxietileno sorbitol ou produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo mono-oleato de polietileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo p- hidroxibenzoato de etila ou n-propila, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes flavorizantes e um ou mais agentes adoçantes, tais como sacarose, sacarina ou aspartame.
As suspensões oleosas podem ser formuladas colocando-se em suspensão o ingrediente ativo em um óleo vegetal, por exemplo óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco ou em óleo mineral tal como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente de espessamento, por exemplo cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Agentes adoçantes tais como aqueles apresentados acima e agentes flavorizantes podem ser adicionados para fornecer uma preparação oral palatável. Estas composições podem ser preservadas pela adição de um anti- oxidante tal como hidroxianisol butilado ou alfa-tocoferol.
Os pós e grânulos dispersáveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água fornecem o ingrediente ativo em mistura com um agente de dispersão ou umectação, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Os agentes de dispersão ou umectação adequados e agentes de suspensão são exemplificados por aqueles já mencionados acima. Os excipientes adicionais, por exemplo agentes adoçantes, flavorizantes e corantes, também podem estar presentes. Estas composições podem ser preservadas pela adição de um anti-oxidante tal como ácido ascórbico.
As composições farmacêuticas da invenção também podem estar na forma de uma emulsão de óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo óleo de oliva ou óleo de amendoim ou um óleo mineral, por exemplo parafina líquida ou misturas destes. Os agentes de emulsificação adequados podem ser fosfatídeos que ocorrem naturalmente, por exemplo lecitina de feijão de soja e ésteres ou derivados de éster parciais de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo mono-oleato de sorbitano e produtos da condensação dos ditos ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo mono-oleato de polioxietileno sorbitano. As emulsões também podem conter agentes adoçantes, flavorizantes, conservantes e antioxidantes.
Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçantes, por exemplo glicerol, propileno glicol, sorbitol ou sacarose. Tais formulações também podem conter um demulcente, um conservante, flavorizante e agentes de cor e antioxidante.
As composições farmacêuticas podem estar na forma de soluções aquosas injetáveis estéreis. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados são água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica.
A preparação injetável estéril também pode ser uma microemulsão de óleo em água injetável estéril onde o ingrediente ativo é dissolvido na fase oleosa. Por exemplo, o ingrediente ativo pode ser primeiro dissolvido em uma mistura de óleo de soja e lecitina. A solução oleosa depois introduzida em uma mistura de água e glicerol e processada para formar uma microemulsão. As soluções ou microemulsões injetáveis podem ser introduzidas em uma corrente sanguínea do paciente pela injeção de bolo local. Alternativamente, pode ser vantajoso administrar a solução ou microemulsão em um tal modo como para manter uma concentração circulante constante do presente composto. De modo a manter uma tal concentração constante, um dispositivo de liberação intravenoso contínuo pode ser utilizado. Um exemplo de um tal dispositivo é a bomba intravenosa Deltec CADDPLUS™ modelo 5400.
As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril para a administração intramuscular e subcutânea. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando aqueles agentes de dispersão e umectação e agentes de suspensão adequados que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetáveis estéreis em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo como uma solução em 1,3-butano diol. Além disso, óleos estéreis, fixos são convencionalmente utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixo brando pode ser utilizado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos tais como ácido oléico encontram uso na preparação de injetáveis.
Os compostos das Fórmulas C ou E também podem ser administrados na forma de supositórios para a administração retal do medicamento. Estas composições podem ser preparadas misturando-se o medicamento com um excipiente não irritante adequado que seja sólido nas temperaturas comuns mas líquidos na temperatura retal e portanto fundirão no reto para liberar o medicamento. Tais materiais incluem manteiga de cacau, gelatina glicerinada, óleos vegetais hidrogenados, misturas de polietileno glicóis de vários pesos moleculares e ésteres de ácido graxo de polietileno glicol.
Para o uso tópico, cremes, unguentos, geléias, soluções ou suspensões, etc., contendo o composto das Fórmulas C ou E são utilizados. (Para os propósitos deste pedido, a aplicação tópica deve incluir enxágues 5 bucais e líquidos para gargarejo).
Os compostos para a presente invenção podem ser administrado na forma intranasal por intermédio de uso tópico de veículos intranasais adequados e dispositivos de liberação ou por intermédio de vias transdérmicas, usando aquelas formas de emplastros dérmicos transdérmicos 10 bem conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Para ser administrada na forma de um sistema de liberação transdérmico, a administração da dosagem, naturalmente, será contínua ao invés de intermitente por todo o regime de dosagem. Os compostos da presente invenção também podem ser liberados como um supositório utilizando bases 15 tais como manteiga de cacau, gelatina glicerinada, óleos vegetais hidrogenados, misturas de polietileno glicóis de vários pesos moleculares e ésteres de ácido graxo de polietileno glicol.
Quando uma composição de acordo com esta invenção é administrada em um paciente humano, a dosagem diária normalmente será determinada pelo médico prescrevente com a dosagem no geral variando de acordo com a idade, peso e resposta do paciente individual, assim como da gravidade dos sintomas do paciente.
O regime de dosagem utilizando os compostos da presente invenção pode ser selecionado de acordo com uma variedade de fatores 25 incluindo tipo, espécie, idade, peso, sexo e do tipo de câncer que é tratado; da gravidade (isto é, estágio) do câncer a ser tratado; da via de administração; da função renal e hepática do paciente; e do composto ou sal particulares destes utilizados. Um médico ou veterinário ordinariamente habilitado pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz do medicamento requerido para tratar, por exemplo, para prevenir, inibir (total ou parcialmente) ou deter o progresso da doença. Por exemplo, os compostos da presente invenção podem ser administrados em uma dose diária total de até
10.000 mg. Os compostos da presente invenção podem ser administrados uma vez ao dia (QD) ou dividido em doses diárias múltiplas tais como duas vezes ao dia (BID) e três vezes ao dia (TID). Os compostos da presente invenção podem ser administrados em uma dosagem diária total de até 10.000 mg, por exemplo, 2.000 mg, 3.000 mg, 4.000 mg, 6.000 mg, 8.000 mg ou 10.000 mg, que podem ser administrados em uma dose diária ou podem ser divididos em dose diárias múltiplas como descrito acima.
Por exemplo, os compostos da presente invenção podem ser administrados em uma dose diária total de até 1.000 mg. Os compostos da presente invenção podem ser administrados uma vez ao dia (QD) ou divididos em doses diárias múltiplas tais como duas vezes ao dia (BID) e três vezes ao dia (TID). Os compostos da presente invenção podem ser administrados em uma dosagem diária total de até 1.000 mg, por exemplo, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 600 mg, 800 mg ou 1.000 mg, que podem ser administrados em uma dose diária ou podem ser divididos em doses diárias múltiplas como descrito acima.
Além disso, a administração pode ser contínua, isto é, todos os dias ou intermitentemente. Os termos “intermitente” ou “intermitentemente” como aqui usados significam interromper e iniciar em intervalos regulares ou irregulares. Por exemplo, a administração intermitente de um composto da presente invenção pode ser a administração de uma a seis dias por semana ou pode significar a administração em ciclos (por exemplo, a administração diária por duas a oito semanas consecutivas, depois um período de repouso sem nenhuma administração por até uma semana) ou pode significar a administração em dias alternados.
Além disso, os compostos da presente invenção podem ser administrados de acordo com qualquer um dos programas descritos acima, consecutivamente por umas poucas semanas, seguido por um período de repouso. Por exemplo, os compostos da presente invenção podem ser administrados de acordo com qualquer um dos programas descritos acima de duas a oito semanas, seguido por um período de repouso de uma semana ou duas vezes ao dia em uma dose de 100 a 500 mg por três a cinco dias por semana. Em uma outra forma de realização particular, os compostos da presente invenção podem ser administrados três vezes ao dia por duas semanas consecutivas, seguido por uma semana de repouso.
Qualquer uma ou mais das dosagens e programas de dosagem específicos dos compostos da presente invenção, também podem ser aplicáveis a qualquer um ou mais dos agentes terapêuticos a serem usados no tratamento de combinação (doravante aludido como o “segundo agente terapêutico”).
Além disso, a dosagem e programa de dosagem específicos deste segundo agente terapêutico pode variar e a dose, programa de dosagem e via de administração ótimas serão determinados com base no segundo agente terapêutico específico que está sendo usado.
Naturalmente, a via de administração dos compostos da presente invenção é independente da via de administração do segundo agente terapêutico. Em uma forma de realização, a administração para um composto da presente invenção é a administração oral. Em uma outra forma de realização, a administração para um composto da presente invenção é a administração intravenosa. Assim, de acordo com estas formas de realização, um composto da presente invenção é administrada oral ou intravenosamente e o segundo agente terapêutico pode ser administrado oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, retal, transbucal, intranasal, lipossomicamente, por intermédio de inalação, vaginal, intraocular, por intermédio da liberação local por cateter ou sonda, subcutânea, intradipósica, intra-articular, intratecalmente ou em uma forma de dosagem de liberação lenta.
Além disso, um composto da presente invenção e o segundo agente terapêutico pode ser administrado pelo mesmo modo de administração, isto é, ambos agentes administrados por exemplo, oralmente, pela IV. Entretanto, também está dentro do escopo da presente invenção administrar um composto da presente invenção por um modo de administração, por exemplo, oral e para administrar o segundo agente terapêutico por um outro modo de administração, por exemplo, IV ou qualquer outro dos modos de administração descritos acima.
No primeiro procedimento de tratamento, a administração de um composto da presente invenção, pode ocorrer antes do segundo procedimento de tratamento, isto é, do segundo agente terapêutico, depois do tratamento com o segundo agente terapêutico, ao mesmo tempo como o tratamento com o segundo agente terapêutico ou uma combinação destes. Por exemplo, um período de tratamento total pode ser decidido para um composto da presente invenção. O segundo agente terapêutico pode ser administrado antes do início de tratamento com um composto da presente invenção ou a seguir do tratamento com um composto da presente invenção. Além disso, o tratamento anticâncer pode ser administrado durante o período de administração de um composto da presente invenção mas não precisa ocorrer durante todo o período de tratamento de um composto da presente invenção.
Os presentes compostos também são úteis em combinação com agentes terapêuticos, quimioterapêuticos e anticâncer. Combinações dos compostos presentemente divulgados com agentes terapêuticos, quimioterapêuticos e anticâncer estão dentro do escopo da invenção. Os exemplos de tais agentes podem ser encontrados em Cancer Principies and Practice of Oncology por V. T. Devita e S. Hellman (editores), 6a edição (15 de fevereiro de 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Uma pessoa de habilidade comum na técnica seria capaz de discernir quais combinações de agentes seriam úteis com base nas características particulares dos medicamentos e do câncer envolvido. Tais agentes incluem os seguintes: moduladores do receptor de estrogênio, moduladores do receptor de androgênio, moduladores do receptor de retinóide, agentes citotóxicos/citostáticos, agentes antiproliferativos, inibidores da prenil- transferase de proteína, inibidores da HMG-CoA redutase e outros inibidores da angiogênese, inibidores da HIV protease, inibidores da transcriptase reversa, inibidores da proliferação celular e sinalização de sobrevivência, bisfosfonatos, inibidores de aromatase, produtos terapêuticos de siRNA, inibidores da γ-secretase, agentes que interferem com as tirosina cinases receptoras (RTKs) e agentes que interferem com os pontos de checagem do ciclo celular. Os presentes compostos são particularmente úteis quando co- administrados com terapia de radiação.
Um composto da presente invenção também pode ser útil para tratar câncer em combinação com os seguintes agentes terapêuticos: abarelix (Plenaxis depot®); aldesleucina (Prokine®); Aldesleucina (Proleukin®); Alemtuzumabb (Campath®); alitretinoína (Panretin®); alopurinol (Ziloprim®); altretamina (Hexalen®); amifostina (Etyol®); anastrozol (Arimidex®); trióxido arsênico (Trisenox®); asparaginase (Elspar®); azacitidina (Vidaza®); bevacuzimab (Avastin®); bexaroteno cápsulas (Targretin®); bexaroteno gel (Targretin®); bleomicina (Blenoxane®); bortezomib (Velcade®); busulfan intravenoso (Busulfex®); busulfan oral (Mileran®); calusterona (Metossarb®); capecitabina (Xeloda®); carboplatina (Paraplatin®); carmustina (BCNU®, BiCNU®); carmustina (Gliadel®); carmustina com Polifeprosan 20 Implante (Gliadel Wafer®); celecoxib (Celebrex®); cetuximab (Erbitux®); clorambucil (Leukeran®); cisplatina (Platinol®); cladribina (Leustatina®, 2-CdA®); clofarabina (Clolar®); ciclofosfamida (Cytoxan®, Neossar®); ciclofosfamida (Cytoxan Injeção®); ciclofosfamida (Cytoxan Tablet®); citarabina (Cytossar-U®); citarabina lipossômica (DepoCyt®); dacarbazina (DTIC-Dome®); dactinomicina, actinomicina D (Cosmegen®); Darbepoetina alfa (Aranesp®); daunorrubicina lipossômica (DanuoXome®); daunorrubicina, daunomicina (Daunorrubicina®); daunorrubicina, daunomicina (Cerubidina®); Denileucina diftitox (Ontak®); dexrazoxano (Zinecard®); docetaxel (Taxotere®); doxorrubicina (Adriamicina PFS®); doxorrubicina (Adriamicina®, Rubex®); doxorrubicina (Adriamicina PFS Injection®); doxorrubicina lipossômica (Doxil®); propionato de dromostanolona (dromostanolona®); propionato de dromostanolona (masterone injection®); Solução B da Elliott (Elliott’s B Solution®); epirrubicina (Ellence®); Epoetina alfa (epogen®); erlotinib (Tarceva®); estramustina (Emcyt®); fosfato de etoposida (Etopophos®); etoposida, VP-16 (Vepesid®); exemestano (Aromasin®); Filgrastim (Neupogene); floxuridina (intra-arterial) (FUDR®); fludarabina (Fludara®); fluorouracila, 5-FU (Adrucil®); fulvestrant (Faslodex®); gefitinib (Iressa®); gencitabina (Gemzar®); gemtuzumab ozogamicin (Milotarg®); acetato de goserelina (Zoladex Implant®); acetato de goserelina (Zoladex®); acetato de histrelin (Histrelin implant®); hidroxiuréia (Hydrea®); Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin®); idarrubicina (Idamicina®); ifosfamida (IFEX®); mesilato de imatinib (Gleevec®); interferon alfa 2a (Roferon A®); Interferon alfa-2b (Intron A®); irinotecano (Camptossar®); lenalidomida (Revlimid®); letrozol (Femara®); leucovorina (Wellcovorine, Leucovorin®); Acetato de Leuprolida (Eligard®); levamisol (Ergamisol®); lomustina, CCNU (CeeBU®); mecloretamina, mostarda nitrogenada (Mustargen®); acetato de megestrol (Megace®); melfalan, L-PAM (Alkeran®); mercaptopurina, 6-MP (Purinetol®); mesna (Mesnex®); mesna (Mesnex tabs®); metotrexato (Metotrexate®); metoxsalen (Uvadex®); mitomicina C (Mutamicina®); mitotano (Lysodren®); mitoxantrona (Novantrone®); fempropionato de nandrolona (Durabolin50®); nelarabina (Arranon®); Nofetumomab (Verluma®); Oprelvecina (Neumega®); oxaliplatina (Eloxatin®); paelitaxel (Paxene®); paclitaxel (Taxol®); partículas ligadas à proteína de paclitaxel (Abraxane®); palifermina (Kepivance®); pamidronato (Aredia®); pegademase (Adagen (Pegademase Bovina)®); pegaspargase (Oncaspar®); Pegfilgrastim (Neulasta®); pemetrexed disspodico (Alimta®); pentostatina (Nipent®); pipobroman (Vercyte®); plicamicina, mitramicina (Mithracin®); porfímero sódico (Photofrine); procarbazina (Matulane®); quinacrina (Atabri nee); Rasburicase (Elitek®); Rituximab (Rituxan®); sargramostim (Leukine®); Sargramostim (Prokine®); sorafenib (Nexavar®); estreptozocina (Zanossar®); maleato de sunitinib (Sutent®); talco (Sclerosol®); tamoxifeno (Nolvadex®); temozolomida (Temodar®); teniposida, VM-26 (Vumon®); testolactona (Teslac®); tioguanina, 6-TG (Tioguanine®); tiotepa (Tioplex®); topotecano (Hycamtin®); toremifeno (Fareston®); Tositumomab (Bexxar®); Tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®); Trastuzumab (Herceptin®); tretinoína, ATRA (Vesanoid®); Mostarda de Uracila (Uracil Mustard Capsules®); valrubicina (Valstar®); vinblastina (Velbari®); vincristina (Oncovin®); vinorrelbina (Navelbine®); zoldronato (Zometa®) e vorinostat (Zolinza®).
Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com taxanos.
Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com docetaxel (Taxotere®).
Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com vorinostat (Zolinza®).
Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com o inibidor da aurora cinase, MK-0457.
Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com o inibidor de mTor, AP 23573. Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com o inibidor de IGF IR, MK-0646.
Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com satraplatina.
Os compostos da presente invenção são úteis para tratar câncer em combinação com lapatinib (Tykerb®).
Assim, o escopo da presente invenção abrange o uso dos compostos presentemente reivindicados em combinação com um segundo composto selecionado de: um modulador do receptor de estrogênio, um modulador do receptor de androgênio, um modulador do receptor de retinóide, um agente citotóxico/citostático, um agente antiproliferativo, um inibidor da prenil-proteína transferase, um inibidor da HMG-CoA redutase, um inibidor da HIV protease, um inibidor da transcríptase reversa, um inibidor da angiogênese, agonistas de PPAR-γ, agonistas de PPAR-5, um inibidor da resistência a multimedicamento inerente, um agente anti-emético, um agente útil no tratamento de anemia, um agente útil no tratamento de neutropenia, um medicamento que realça o sistema imunológico, um inibidor da proliferação e sinalização de sobrevivência celulares, um bisfosfonato, um inibidor da aromatase, um produto terapêutico de siRNA, inibidores da γ- secretase, agentes que interferem com as tirosina cinases receptoras (RTKs), um agente que interfere com um ponto de checagem do ciclo celular e qualquer um dos agentes terapêuticos listados acima.
O termo “administração” e variantes destes (por exemplo, “administrar” um composto) em referência a um composto da invenção significa introduzir o composto ou um pró medicamento do composto no sistema do animal em necessidade de tratamento. Quando um composto da invenção ou pró medicamento deste é fornecido em combinação com um ou mais outros agentes ativos (por exemplo, um agente citotóxico, etc.), “administração” e suas variantes são cada um entendido incluir a introdução concorrente e seqüencial do composto ou pró medicamento deste e outros agentes.
Como aqui usado, o termo “composição” é intencionado a abranger um produto que compreende os ingredientes especificados nas quantidades especificadas, assim como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação dos ingredientes específicos nas quantidades especificadas.
O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” como aqui usado significa que a quantidade de composto ativo ou agente farmacêutico que evoca a resposta biológica ou medicinal em um tecido, sistema, animal ou ser humano que está sendo procurada por um pesquisador, veterinário, doutor médico ou outro clínico.
O termo “tratar câncer” ou “tratamento de câncer” refere-se à administração a um mamífero afligido com uma condição cancerosa e refere- se a um efeito que alivia a condição cancerosa pela morte das células cancerosas, mas também a um efeito que resulta na inibição do crescimento e/ou metástase do câncer.
Em uma forma de realização, o inibidor de angiogênese a ser usado como o segundo composto é selecionado de um inibidor da tirosina cinase, um inibidor do fator de crescimento derivado de epidérmico, um inibidor do fator de crescimento derivado de fibroblasto, um inibidor do fator de crescimento derivado de plaqueta, um inibidor de MMP (metaloprotease de matriz), um bloqueador da integrina, interferon-α, interleucina-12, polissulfato de pentosano, um inibidor da ciclo-oxigenase, carboxiamidotriazol, combretastatina A-4, esqualamina, 6-O-cloroacetil- carbonil)-fumagilol, talidomida, angiostatina, troponina-1 ou um anticorpo para VEGF. Em uma forma de realização, o modulador do receptor de estrogênio é tamoxifeno ou raloxifeno.
Também incluído no escopo das reivindicações está um método de tratar câncer que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção em combinação com terapia de radiação e/ou em combinação com um segundo composto selecionado de: um modulador do receptor de estrogênio, um 5 modulador do receptor de androgênio, um modulador do receptor de retinóide, um agente citotóxico-citostático, um agente antiproliferativo, um inibidor da prenil-proteína transferase, um inibidor da HMG-CoA redutase, um inibidor da HIV protease, um inibidor da transcriptase reversa, um inibidor de angiogênese, agonistas de PPAR-γ, agonistas de PPAR-5, um
inibidor da resistência a multimedicamento inerente, um agente anti-emético, um agente útil no tratamento de anemia, um agente útil no tratamento de neutropenia, um medicamento realçador do sistema imunológico, um inibidor da proliferação e sinalização de sobrevivência celulares, um bisfosfonato, um inibidor de aromatase, um produto terapêutico de siRNA, inibidores de γ- 15 secretase, agentes que interferem com tirosina cinases receptoras (RTKs), um agente que interfere com um ponto de checagem do ciclo celular e qualquer um dos agentes terapêuticos listados acima.
A presente invenção também inclui uma composição farmacêutica útil para tratar ou prevenir câncer que compreende uma 20 quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção e um segundo composto selecionado de: um modulador do receptor de estrogênio, um modulador do receptor de androgênio, um modulador do receptor de retinóide, um agente citotóxico/citostático, um agente antiproliferativo, um inibidor da prenil-proteína transferase, um Inibidor da 25 HMG-CoA redutase, um inibidor da HtV protease, um inibidor da transcriptase reversa, um inibidor da angiogênese, um agonista de PPAR-γ, um agonista de PPAR-5, um inibidor da proliferação e sinalização de sobrevivência celulares, um bisfosfonato, um inibidor de aromatase, um produto terapêutico de siRNA, inibidores de γ-secretase, agentes que interferem com tirosina cinases receptoras (RTKs), um agente que interfere com um ponto de checagem do ciclo celular e qualquer um dos agentes terapêuticos listados acima.
Todas as patentes, publicações e pedidos de patente pendentes identificados são por meio deste incorporados por referência.
As abreviações usadas na descrição da química e nos exemplos que seguem são: AEBSF (fluoreto de p-aminoetilbenzeno-sulfonila); BSA (albumina sérica bovina); BuLi (n-Butil lítio); CDCl3 (clorofórmio-d); CuI (iodeto de cobre); CUSO4 (sulfato de cobre); DCE (dicloroetano); DCM (diclorometano); DEAD (azodicarboxilato de dietila); DMF (N,N- dimetilformamida); DMSO (sulfóxido de dimetila); DTT (ditiotreitol); EDTA (ácido etilenodiamino-tetra-acético); EGTA (ácido etileno-glicol-tetra- acético); EtOAc (acetato de etila); EtOH (etanol); HOAc (ácido acético); HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho); HRMS (espectro de massa de alta resolução); IPA (álcool isopropílico); LCMS (cromatografia líquida-espectrômetro de massa); LFIMDS (bis(trimetilsilil)amida de lítio); LRMS (espectro de massa de baixa resolução); MeOH (metanol); MP- B(CN)H3 (Cianobroidreto macroporoso); NaHCO3 (bicarbonato de sódio); Na2SO4 (sulfato de sódio); Na(OAc)3BH (triacetoxiboroidreto de sódio); NH4OAc (acetato de amônio); NBS (N-bromossuccinamida); RMN (ressonância magnética nuclear); PBS (solução salina tamponada com fosfato); PCR (reação da cadeia da polimerase); Pd(dppf) ([1,1’- bis(difenilfosfino)ferroceno] paládio); Pd(Ph3)4 (paládio(O) tetracis-trifenilfosfina); POCl3 (oxicloreto de fósforo); PS-DIEA (poliestireno diisopropiletilamina); PS-PPh3 (poliestireno-trifenil fosfina); TBAB (brometo de tetrabutilamônio); TBAF (fluoreto de tetrabutilamônio); THF (tetraidrofurano); TFA (ácido trifluoroacético); TMSCH2N2 (trimetilsilildiazometano) e Ac (acetila); BOC (t-butoxicarbonila); Bu (butila); Cal (calculado); Cale’d (calculado); DIEA (diisopropiletilamina); DMAP (4-dimetilaminopiridina); EDC (N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida); Eq (equivalentes); Et (etila); HOBT (hidroxibenzotriazol); IPA (isopropanol); LC/MS (cromatografia líquida-espectrômetro de massa); Me (metila); MeCN (acetonitrila); NMP (N-metilpirrolidinona); Pr (propila); Pyr (piridina); Sat (saturado), Tosic (ácido p-toluenossulfônico) e Bn (benzila); t- Bu (terc-butila); dba (dibenzilidenoacetona); DIPEA (diisopropiletilamina); IPAC (acetato de isopropila); MTBE (éter terc-butil metílico); OAc (acetato); RT (temperatura ambiente); Wt (peso); e XRPD (difração de raio x no pó).
Os compostos desta invenção podem ser preparados utilizando-se reações como mostradas nos seguintes Esquemas de Reação, além de outras manipulações padrão que são conhecidas na literatura ou exemplificadas nos procedimentos experimentais. Os Esquemas de reação ilustrativos abaixo, portanto, não são limitados pelos compostos listados ou por qualquer substituinte particular utilizado com propósitos ilustrativos. A numeração de substituinte como mostrado nos Esquemas de Reação não necessariamente correlacionam-se com aqueles usados nas reivindicações e frequentemente, para clareza, um único substituinte é mostrado ligado ao composto onde substituintes múltiplos são permitidos sob as definições das Fórmulas C ou E acima.
Sinopse dos Esquemas de Reação
Os seguintes Esquemas de Reação, os Esquemas de Reação de
I a III, fornecem detalhes úteis para preparar os presentes compostos. Os intermediários necessários são em alguns casos comercialmente disponíveis ou podem ser preparados de acordo com procedimentos da literatura.
Como ilustrados no Esquema de Reação I, um derivado do ácido cicloalquil(fenil)acético, neste caso ciclobutila, é primeiro reagido e rearranjado sob as condições do tipo de Curtius para dar o carbamato I-1. A cianação, neste caso catalisada pelo paládio, dá a nitrila 1-2. A desprotonação de 1-2 seguida pela reação com um reagente de Grignard de benzila nucleofílico e o trabalho hidrolítico dá a cetona 1-3. A condensação de 1-3 com aldeído 1-4 sob condições básicas dá a cloronaftiridina 1-5. O deslocamento do cloro com hidrazina dá a hidrazida 1-6. A acilação dá a acil hidrazida 1-7 que é ciclizada sob condições ácidas dando a triazolonaftiridina 1-8. A desproteção da amina, neste caso com HCl, gera 1-9.
O triazol fundido pode ser preparado pela acilação da hidrazida 1-6 com um equivalente de carbonila ativado tal como carbonildiimidazol ou com ácido fórmico na presença de uma carbodiimida, sem a necessidade quanto a uma etapa de ciclização. Alternativamente cloronaftiridina 1-5 pode ser reagida com uma hidrazina derivada tal como um carboxilato de alquil hidrazina sob catálise ácida para dar o aduto de hidrazina que é ciclizado ao triazol sob condições básicas.
Os compostos da presente invenção em que R1 é um grupo aminoalquila podem ser preparados de acordo com os procedimentos esboçados no Esquema de Reação II. A hidrazida 1-6 é reagida com uma carbodiimida para gerar uma uréia que é ciclizada in situ sob condições ácidas para dar o alquilaminotriazol II-1. A desproteção depois dá II-2.
Uma síntese alternativa de cloronaftiridina 1-5 é ilustrada no Esquema de Reação III. Um derivado de (4-halofenil)acetonitrila III-1, neste caso bromo, é primeiro alquilado sob condições básicas para dar o ciclobutano III-2 que é hidratado com peróxido de hidrogênio na presença de base para dar a amida III-3. A amida é depois oxidativamente rearranjada na presença de t-butanol para dar o carbamato III-4. A cianação, neste caso catalisada por paládio, dá a nitrila 1-2. A reação de 1-2 com um excesso de reagente de Grignard de benzila nucleofílico e o trabalho hidrolítico dá a cetona 1-3. A desproteção do aldeído 1-4 com um ácido tal como TFA dá a aminopiridina III-5. A condensação de 1-3 com o aldeído III-5 sob condições básicas dá a cloronaftiridina 1-5. Esquema de Reação I
Boc2O, NaN3 TBAB, Zn(OTf)2
Zn(CN)2
Pd[(t-Bu)3P]2
NHBoc
iPr-MgCI
BnMgCI
1-1
I-2
N Cl
I-4
SN
EDC1 HOBt
K2CO3, DMF
N,H,
AcOH
HCI
Esquema de Reação II
AcOH
HCI
I-6 11-1
Esquema de Reação III KOKcmPWi
iu-1 Br m-2
II-2
Br'
Br
ill-3
PtJ(OAc)4
Br
1*3
IIM
ά o
Ill-S EXEMPLOS
Os exemplos e esquemas fornecidos são intencionados a ajudar em um entendimento adicional da invenção. Os materiais particulares utilizados, as espécies e condições são intencionados a serem ainda
clorofenil)ciclobutanocarboxílico (40,4 g, 192 mmoles), bicarbonato de di-
terc-butila (46,0 g, 211 mmoles), azida de sódio (43,6 g, 671 mmoles), brometo de tetrabutilamônio (9,27 g, 28,7 mmoles), trifluorometanossulfonato de zinco (2,30 g, 6,32 mmol) e THF (I L). A mistura de reação foi aquecida a 60° C sob agitação em um banho de óleo quente com um condensador de refluxo esfriado a água ligado sob uma atmosfera de nitrogênio por 18 horas. 15 A mistura de reação bruta foi adicionada uma solução saturada de bicarbonato de sódio, colocada em suspensão em acetato de etila e lavada com uma
ilustrativos da invenção e não limitam o seu escopo razoável.
ESQUEMA 1
KiCOatDfWP 80Ca 120* C
HCI
1-e
[l-(4-clorofenil)ciclobutil]carbamato de terc-butila (1-1)
A um frasco de fundo redondo foram adicionados ácido l-(4- solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica (0 a 3 % de IPA/DCM) para dar [l-(4- clorofenil)ciclobutil]carbamato de terc-butila (1-1) como um sólido branco. HRMS (M + Na)+: observado = 304,1075, calculado = 304,1075.
[l-(4-cianofenil)ciclobutil]carbamato de terc-butila (1-2)
A uma solução de [l-(4-clorofenil)ciclobutil]carbamato de terc-butila (1-1) (5,32 g, 18,9 mmoles) em 1,4-dioxano anidro (70 ml) foi adicionado cianeto de zinco (2,44 g, 20,8 mmoles), seguido por bis(tri-t- butilfosfina)paládio(O) (0,965 g, 1,89 mmol). A mistura de reação foi aquecida a 100° C sob agitação em um banho de óleo quente com um condensador de refluxo esfriado a água ligado sob uma atmosfera de nitrogênio por 1,5 hora. A mistura de reação foi filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica (0 a 5 % IPA/DCM) para dar o [l-(4-cianofenil)ciclobutil]carbamato de terc- butila (1-2) como um sólido ceroso branco amarelado/amarelo. HRMS (M + H)+: observado = 273,1598, calculado = 273,1597.
11 -Γ4-Γfenilacetil)fenillciclobutil} carbamato de terc-butila (1-
3)
Uma solução de [l-(4-cianofenil)ciclobutil] carbamato de terc- butila (1-2) (16,6 g, 61,0 mmoles) em THF anidro (300 ml) foi esfriada a -78° C sob agitação sob uma atmosfera de nitrogênio. Depois uma solução 2,0 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF (30,5 ml, 61,0 mmoles) foi adicionada às gotas em 5 minutos. A mistura de reação foi permitido agitar a - 78° C sob uma atmosfera de nitrogênio por 10 minutos. Depois uma solução
2,0 M de cloreto de benzilmagnésio em THF (116 ml, 232 mmoles) foi adicionado às gotas em 10 minutos. A mistura de reação foi permitida aquecer a 0o C. Depois de 2 horas a mistura de reação foi extinta a 0o C pela adição de uma solução saturada de cloreto de amônio. A reação foi permitida aquecer até a temperatura ambiente, colocada em suspensão em acetato de etila, lavada com uma solução saturada de cloreto de amônio, uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica (1 a 40 % de EtOAc/5 % de DCM/Hexano) para dar {l-[4-(fenilacetil)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-3) como um sólido ceroso branco amarelado. HRMS (M + Na)+: observado = 388,1892, calculado = 388,1883.
11 -14-(5-cloro-3-fenil-1,6-naítiridin-2-il)feninciclobutin carbamato de terc-butila (1-5)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado {l-[4- (fenilacetil)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-3) (2,7 g, 6,1 mmoles), (2-cloro-3-formilpiridin-4-il)carbamato de terc-butila (1-4) (1,6 g, 6,1 mmoles), carbonato de potássio (5,0 g, 6,0 mmoles) e DMF (20 ml). A mistura de reação foi aquecida a 80° C sob agitação em um banho de óleo quente sob uma atmosfera de nitrogênio por 15 horas. Depois que a mistura de reação foi aquecida a 120° C por 1 hora. A mistura de reação foi permitida esfriar até a temperatura ambiente, adicionada água, colocada em suspensão em acetato de etila, lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica (5 a 50 % de EtOAc/5 % de DCM/Hexano) para dar {l-[4-(5- cloro-3-fenil-l,6-naftiridin-2-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-5) como um sólido branco amarelado. HRMS (M + H)+: observado = 486,1954, calculado = 486,1943.
(1 - Γ4-Γ5 -hidrazino-3 -fenil-1,6-naftiridin-2-iQfenil1 ciclo- butil I carbamato de terc-butila (1-6)
A um frasco de micro-onda foi adicionado {l-[4-(5-cloro-3- fenil-l,6-naftiridin-2-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-5) (4,05 g, 8,34 mmoles), hidrazina anidra (5,24 ml, 167 mmoles) e 1,4-dioxano (15 ml). A mistura de reação foi depois aquecida sob irradiação de micro-onda por 5 minutos a 100° C (alta absorção). A mistura de reação foi permitida esfriar até a temperatura ambiente, colocada em suspensão em acetato de etila, lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguido por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo para dar {1 - [4-(5 -hidrazino-3 -fenil-1,6-naftiridin-2-il)fenil] ciclobutil} carbamato de terc-butila (1-6) como um sólido/espuma laranja. MS (M + H)+: observado =
482.3, calculado = 482,59.
(l-Γ4-(5-f2-ΓΠ-metil-lH-imidazol-4-il)carbonilΊhidrazino}-3- fenil-1.6-naftiridin-2-il)fenillciclobutiücarbamato de terc-butila (1-7)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado {l-[4-(5- hydrazino-3-fenil-1,6-naftiridin-2-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-6) (3,94 g, 8,18 mmoles), EDC (1,34 g, 10,6 mmoles), HOBt (1,44 g, 10,6 mmoles), ácido l-metil-lH-imidazol-4-carboxílico (1,34 g, 10,6 mmoles) e DMF (40 ml). A mistura de reação foi aquecida a 60° C sob agitação sob uma atmosfera de nitrogênio em um banho de óleo quente. Depois de 45 minutos a mistura de reação foi permitida esfriar até a temperatura ambiente, colocada em suspensão em acetato de etila, lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo para dar (l-[4-(5-{2-[(l-metil-lH-imidazol-4- il)carbonil] -hidrazino} -3 -fenil-1,6-naftiridin-2-il)fenil] ciclobutil} carbamato de terc-butila (1-7) como espuma vermelha. MS (M + H)+: observado =
590.3, calculado = 590,69.
(1-(4-Γ3-Γ l-metil-lH-imidazol-4-ilV9-feniir 1,2,41triazolo-[3,4- f1-l,6-naftiridin-8-il1fenil|ciclobutil)carbamato de terc-butila (1-8)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado {l-[4-(5-{2-[(l- metil-1 H-imidazol-4-il)carbonil]hidrazino} -3 -fenil-1,6-naftiridin-2- il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-7) (2,73 g, 4,63 mmoles), ácido acético (5,30 ml, 93 mmoles) e 1,4-dioxano (20 ml). A mistura de reação foi aquecida a 80° C sob agitação aberta para a atmosfera (tampada) em um banho de óleo quente. Depois de 3 horas a mistura de reação foi permitida esfriar até a temperatura ambiente, colocada em suspensão em acetato de etila, lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica 1 a 15 % de IPA/DCM. As frações apropriadas foram combinadas e o solvente foi removido a vácuo. O resíduo resultante foi repurificado pela cromatografia em coluna de fase reversa (Sunfire Cj 8) eluindo com gradiente de 5 a 95 % de acetonitrila / (0,1 % de TFA/água). As frações apropriadas foram liberadas da base colocando-se em suspensão em acetato de etila, lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo para dar (l-{4-[3-(l-metil-IH- imidazol-4-il)-9-fenil[ 1,2,4]triazolo[3,4-/|-1,6-naftiridin-8- il]fenil}ciclobutil)carbamato de terc-butila (1-8) como um sólido branco amarelado. MS (M + H)+: observado = 572,3, calculado = 572,7.
Dicloridreto de_1-{4-Γ3-(Τ -metil-1 H-imidazol-4-il V9-
feniir 1,2,41triazolor3,4-/1-l,6-naftiridin-8-il1fenin ciclobutanamina (1-9)
A uma solução de (l-{4-[3-(l-metil-lH-imidazol-4-il)-9- fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/|-l,6-naftiridin-8-il]fenil}ciclobutil)carbamato de terc-butila (1-8) (2,52 g, 4,41 mmoles) em MeOH (5 ml) e DCM (15 ml) foi adicionada uma solução 4 N de HCl em EtOAc (22 ml, 88 mmoles). A mistura de reação selada foi permitida agitar na temperatura ambiente. Depois de 4 horas a mistura de reação foi concentrada a vácuo para dar o dicloridreto de 1 - {4- [3 -(1 -metil-1 H-imidazol-4-il)-9-fenil- [ 1,2,4] triazolo [3,4-/| -1,6-
naftiridin-8-il]fenil}ciclobutanamina (1-9) como um sólido amarelo. HRMS (M + H)+: observado = 472,2249, calculado = 472,2244.
Os seguintes compostos foram preparados em uma maneira similar ao Exemplo 1-9:
Comp - Estrutura - HRMS calculado m/z (M + H)+ - HRMS observado m/z (M + H)+
Comp Estrutura HRMS Calculado HRMS Observado m/z (M+Hf m/z (MW I-IO !*jT N_cl 470,2088 470,2068 1-11 fVS* 510,2149 510,2124 M"c1 1-12 N"*1 509,2197 509,2192 1-13 ys rrMr^ ^ci 514,1809 514,1799 1-14 ί m-η Μ~α 459,2040 459,2081 M-N \^s» 1-15 ^sIf SMi 392,1870 392^1856 Ovjí^ b-ο Íh* I-W f^í'1MR* 408,1819 408,1803 (^V M-a H^y^Sfs M-Nl 1-17 f^y^KHí 406,2026 406,2006 H_ç, ir^O 1-18 P H-Cl 442,1838 442,1820 ^ N'M !-19 h-cj 422,1976 422,1988 *«/\X XJ 1-20 Γ{ J H-CT 436,2132 436,2130 1-21 H-W 436.2132 436,2116 1"22 f^Y'KiY^ H-W 450,2289 450,2303 1-23 /VxIiM, 432,2183 432,2190 |^^Ν·ν^*^ H-Cl 1-24 474,2652 474,2674 1-25 OW- 476,2445 476,2454 1-26 M-Cl ίί!ίΡΥ^ΝΗ* 491,2554 491,2564 1\/χχχ ™ ^*Λ-ί IJ 1-27 Η_α 490,2602 490,2616 QwjuVi ° ν-ν 1-28 P^i5ssJkNH1 476,2445 476,2469 ^XyKJ H-Cl Orr1-V1 M-N 1-29 476,2445 476,2471 O^rW iyV^NH, H-Cl ESQUEMA IA 8-r4-(l-aminociclobutil)fenil1-9-feniiri,2,41triazolor3,4-/1-1,6- naftiridin-3-ol (1-16)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado {l-[4-(5-hidrazino-3-fenil- l,6-naftiridin-2-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-6) (2,77 g, 5,75 mmoles) e 1,1 ’-carbonilbis(lH-imidazol) (4,10 g, 4,40 mmoles), em
1,4 Dioxano (30 ml). A mistura de reação selada foi depois aquecida a 95° C sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação bruta foi adicionada uma solução saturada de bicarbonato de sódio (100 ml) e acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, depois salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada. O resíduo resultante foi depois purificado pela cromatografia em gel de sílica eluindo com 0 a 10 % de IPA/DCM. As frações apropriadas foram depois combinadas e o solvente foi removido a vácuo para dar {l-[4-(3-hidróxi-9- fenil[ 1,2,4]triazolo[3,4-/|-1,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclobutil} carbamato de terc-butila (l-6a) como um sólido castanho. MS (M + H)+: observado =508,1, calculado = 508,6.
A uma solução de {l-[4-(3-hidróxi-9-fenil[l,2,4]triazolo-[3,4- f\-\,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (l-6a) (1,14 g, 2,25 mmoles) em MeOH (5 ml) e DCM (15 ml) foi adicionada uma solução 4 N de HCl em EtOAc (22 ml, 88 mmoles) na temperatura ambiente. Depois de
4 horas a mistura de reação foi concentrada a vácuo para dar o cloridreto de 8- [4-( 1 -aminociclobutil)fenil] -9-fenil [1,2,4] -triazolo [3,4-/] -1,6-naftiridin-3 -ol 15
20
20
(1-16) como um sólido amarelo. HRMS (M+H)+: observado = 408,1803, calculado = 408,1819.
sólido amarelo indica que o Composto 1-16 sólido existe como a seguinte estrutura química:
Cloridreto de 8-[4-(l-Aminociclobutil)fenil]-9-
fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/]-l,6-naftiridin-3(2H)-ona
(l-r4-(9-feniiri,2,41triazolor3,4-/1-l,6-naftiridin-8-ir)feniH- ciclobutil)carbamato de terc-butila Π-15)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado EDC (569 mg, 2,97 mmoles), HOBt (401 mg, 10,6 mmoles), ácido fórmico (248 mg, 5,40 mmoles), DCM (20 ml), & NMP (2,5 ml). A mistura de reação foi depois agitada na temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio por 30 minutos. Depois adicionado {l-[4-(5-hidrazino-3-fenil-l,6-naftiridin-2- il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-6) (1,30 g, 2,70 mmoles). A mistura de reação foi depois permitida agitar durante a noite na temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi depois colocada em suspensão em acetato de etila, lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi
Subsequentemente, a análise cristalográfica de raio X do
1-16
ESQUEMA IB purificado pela cromatografia em gel de sílica 50 a 90 % de EtOAc/DCM, depois de 1 a 15 % de IPA/DCM. As frações apropriadas foram combinadas e o solvente foi removido a vácuo para dar {l-[4-(9- fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/|-l,6-naftiridin-8-il)fenil]-ciclobutil}carbamato de 5 terc-butila (l-6b) como um sólido castanho. MS (M + H)+: observado = 492,2, calculado = 492,6.
nafitiridin-8-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (l-6b) (1,07 g, 2,177 mmoles) em MeOH (5 ml) e DCM (15 ml) foi adicionada uma solução 4 N de HCl em EtOAc (5,44 ml, 21,77 mmoles). A mistura de reação selada foi permitido agitar na temperatura ambiente. Depois de 4 horas a mistura de reação foi filtrada para dar o cloridreto de l-[4-(9- 15 fenil[ 1,2,4]triazolo[3,4-/]-1,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclobutanamina (1-15) como um sólido castanho. HRMS (M + H)+: observado = 392,1872, calculado = 392,1870.
Cloridreto de l-r4-(9-feniiri,2,41triazolor3,441-l,6-naftiridin- 8-il)fenil1 ciclobutanamina (1-15)
A uma solução de {l-[4-(9-fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/|-l,6-
ESOUEMA IC
Br
WZri (CN)z
ry nkboc
1-3
20
l-(4-bromofenil)ciclobutanocarbonitrila (l-2c)
TBAB (1,61 g, 0,5 mmol), dibromopropano (22,2 g, 110 mmoles) e a nitrila I-Ic (19,6 g, 100 mmoles) foram adicionados a uma solução agitada de KOH (31,17 g, 500 mmoles) em uma mistura de 15 ml de água e 200 ml de tolueno (temperatura mantida entre 72 e 79° C). A mistura foi aquecida por vapor e foi agitada de 99 a 108 ° C por 2,5 h. A mistura foi 5 esfriada a 80° C e 200 ml de heptano foi adicionado. Depois a mistura resultante foi esfriada até a temperatura ambiente com agitação, a solução de topo claro foi filtrada, lavada com água (3 X 30 ml) e concentrada a vácuo para dar produto oleoso l-2c.
l-(4-bromofenil)ciclobutanocarboxamida (l-3c)
H2O2 (30 % 11,3 ml, 118 mmoles) foi adicionado em 3 horas a
uma mistura agitada de nitrila l-2c (13,88 g, -58,9 mmoles) e K2CO3 (1,62 g,
11,8 moles) em 59 ml de DMSO a 40 a 87° C, esfriando com um banho de água. A mistura resultante foi esfriada a 27° C e água (100 ml) foi adicionada em 30 min. O produto cristalino l-3c formou-se. Mais água (100 ml) foi 15 adicionado em 1 hora. A pasta fluida resultante foi envelhecida na temperatura ambiente por 16 horas antes da filtração. A torta foi enxaguada com 100 ml de água e depois com 100 ml de heptano. Depois d secar em uma estufa a vácuo a 50° C, o produto l-3c foi obtido como um sólido branco.
ri-(4-bromofenil)ciclobutil1 carbamato de terc-butila (1-4c)
Pb(OAc)4 (25,7 g, 25,7 mmoles) foi adicionado a uma solução
agitada de amida l-3c (12,7 g, 50 mmoles) em 64 ml de t-BuOH de 57° C a 86° C esfriando com um banho de água. A mistura resultante foi agitada de 65 a 86° C por 0,5 h. A mistura foi esfriada a 26° C e 12,7 g de Na2CO3 foram adicionados seguidos por 65 ml de MTBE. Depois de 10 min, a mistura foi 25 filtrada. A torta foi enxaguada com 10 L de MTBE e o filtrado combinado foi lavado com 20 ml de água e a camada orgânica foi depois lavada com 3X10 ml de KHCO3 a 10 % (cuidado: borbulhamento) secada em Na2SO4 e concentrada a vácuo. O sólido resultante foi enxaguado com 8 ml de IPAc e 8 ml de heptano e secado em uma estufa a vácuo a 40° C para dar o produto 1- 4c como um sólido cinza. ri-(4-cianofenil)ciclobutill carbamato de terc-butila (1-2)
Uma pasta fluida agitada de Pd2dba3 (101 mg; 1 % em mol) e dppf (122 mg; 2 % em mol) em DMF (25 ml) foi espargida com nitrogênio por 5 min e depois aquecida a 65° C e envelhecida por 30 min. Nesta etapa foi adicionado o brometo de arila l-4c (3,6 g, 11 mmoles), pó de zinco (51 mg; 6 % em mol) e o cianeto de zinco (777 mg; 0,60 equiv) enxaguando com DMF (5 ml). A solução foi aquecida de 92 a 95° C e envelhecida por 4 h. A solução foi esfriada na temperatura ambiente durante a noite e filtrada através de uma almofada de Solka Floc, enxaguando a torta com DMF (5 ml). Água (30 ml) foi adicionada em 3,5 h de 25 a 33° C, junto com semente. Depois de envelhecer durante a noite na temperatura ambiente, a solução cristalina resultante foi filtrada e lavada com metanol aquoso e secada durante a noite para produzir 1-2 como um sólido amarelo.
11 -r4-fenilacetil)fenil1ciclobutil} carbamato de terc-butila (1-
3}
Benzil Grignard (19 ml, 38,5 mmoles) foi adicionado a uma solução agitada, levemente turva de nitrila 1-2 (3 g, 11 mmoles) em THF (25 ml) esfriada a cerca de -20° C a uma taxa tal que a temperatura de reação não aquecesse acima de -10° C. A solução foi envelhecida por 3 a 4 horas mantendo a temperatura de reação entre -10° C e -20° C. A solução agitada foi esfriada a -30° C e adicionada a uma solução aquosa a 15 % em peso de ácido cítrico (60 ml) que foi previamente esfriada de 5 a 10° C, mantendo a temperatura abaixo de 15° C. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi lavada com MTBE.
As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com salmoura semi saturada (60 ml) e concentrada sob pressão reduzida. Heptano foi adicionado e a mistura foi concentrada a uma pasta fluida que foi filtrada, lavada com heptano (15 ml) e secada sob nitrogênio para dar 1-3. 4-Amino-2-cloronicotinaldeído (l-5c)
Ácido trifluoroacético (17,4 ml, 234 mmoles) foi adicionado cuidadosamente a uma mistura agitada de aldeído Boc 1-4 (20 g, 78,1 mmoles) e diclorometano (60 ml) mantendo a temperatura abaixo de 25° C. A solução foi aquecida a 35° C, envelhecida durante a noite (desgaseificação vigorosa) e depois esfriada na temperatura ambiente. 25 ml de MTBE foram adicionados e a pasta fluida branca resultante foi envelhecida por uma hora, filtrada e a torta do filtro enxaguada com MTBE (10 ml x 2). Sal de TFA sólido l-5c foi secada sob vácuo.
(l-r4-(,5-cloro-3-fenil-l,6-naftiridin-2-il)fenil1ciclobutilV carbamato de terc-butila (1-5)
Solução de hidróxido de potássio a 45 % em peso (18 ml; 5 equiv) foi adicionada às gotas em 20 minutos a uma mistura agitada de sal de cloropiridina TFA l-5c (19,5 g), ciclobutilamino cetona 1-3 (26 g) e isopropanol (200 ml) mantendo a temperatura abaixo de 24° C. Depois de 1 h, água (100 ml) foi adicionada e depois de mais lha pasta fluida resultante foi filtrada, lavando com 2:1 IPA/água (30 ml, depois 24 ml) depois com água (80 ml depois 2 x 60 ml). O sólido foi secado sob fluxo de nitrogênio para produzir 1-5 como um sólido branco amarelado.
{1 -[4-(5-hidrazino-3-fenil-1,6-naftiridin-2-il)fenil]ciclo- butil}carbamato de terc-butila (1-6)
Hidrazina anidra (25 ml, 797 mmoles) foi adicionada a uma solução agitada de cloronaftiridina (1-5) (25,12 g, 51,7 mmoles) em 1,4- dioxano (200 ml) sob uma atmosfera de nitrogênio e a mistura de reação foi aquecida a 95° C. Depois de 30 min a solução foi esfriada na temperatura ambiente, acetato de etila (400 ml) foi adicionado e a solução foi lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água e salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo para dar (1-6) como um sólido laranja.
ESQUEMA ID
{l-r4-('9-fenil-3-pirimidin-2-iiri,2,41triazolor3.,4./l-l,6- naftiridin-8-il)feniliciclobutil)carbamato de terc-butila (l-6d)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado {l-[4-(5-
hidrazino-3-fenil-1,6-naftiridin-2-il)fenil]ciclobutil} carbamato de terc-butila (1-6) (267 mg, 0,554 mmol), EDC (138 mg, 0,721 mmol), HOBt (97 mg, 0,721 mmol), ácido pirimidino-2-carboxílico (89 mg, 0,721 mmol), DIPEA. (0,367 ml, 2,218 mmoles) e DMF (3 ml). A mistura de reação foi depois 10 tampada & aquecida sob irradiação de micro-onda a 100° C por 5 minutos. A mistura foi esfriada, ácido acético (0,476 ml, 8,32 mmoles) foi adicionado e a reação foi depois tampada & aquecida sob irradiação de micro-onda a 80° C por 5 minutos. A mistura de reação foi permitida esfriar até a temperatura ambiente, colocada em suspensão em acetato de etila, lavada com uma 15 solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água, salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica 0 a 10 % de IPA/DCM. As frações apropriadas foram combinadas e o solvente foi removido a vácuo para dar o {l-[4-(9-fenil-3-pirimidin-2-il[l,2,4]triazolo[3,4-/]-l,6-naftiridin-8- 20 il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (l-6d) como um sólido laranja. MS (M + H)+: observado = 570,2, calculado = 570,7. 15
58
Cloridreto de l-r4-(9-fenil-3-pirirnidin-2-iirh2,41triazolo \3A- /1-1.6-naftiridin-8-il)fenillciclobutanamina (1-10)
A uma solução de {l-[4-(9-fenil-3-pirimidin-2-il[l,2,4] triazolo[3,4-/]-l,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1- 6d) (71 mg, 0,125 mmol) em MeOH (2 ml) e DCM (3 ml) foi adicionada uma solução 4 N de HCl em EtOAc (3 ml, 12 mmoles). A mistura de reação selada foi permitida agitar na temperatura ambiente. Depois de 4 horas a mistura de reação foi concentrada. Depois de 4 horas a mistura de reação foi concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em coluna de fase reversa (Sunfire Ci8) eluindo com gradiente de 1 a 50 % de acetonitrila / (0,1 % de TFA / água). As frações apropriadas foram concentradas a vácuo. O resíduo resultante foi depois dissolvido em DCM (5 ml) & MeOH (5 ml), depois adicionada uma solução 4 N de HCl em EtOAc (5 ml, 20 mmoles), depois concentrada a vácuo para dar o cloridreto de l-[4-(9-fenil-3-pirimidin- 2-il[ 1,2,4]triazolo[3,4-/]-1,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclo-butanamina (1-10) como um sólido castanho. HRMS (M + H)+: observado = 470,2098, calculado = 470,2088.
ESQUEMA IE (SÍNTESE ALTERNATIVA PARA O COMPOSTO 1-16)
Intermediário l-5e
HD
NH1
2 Hd
1*16 Intermediário f l-5e)
Uma pasta fluida agitada de cloronaftiridina 1-5 (1,8 g), carboxilato de metil hidrazina (0,318 g) e isopropanol (20 L) é aquecida a 66° C antes de se tomar homogênea. HCl 5 a 6 N em IPA (0,05 ml) é adicionado e a temperatura é aumentada para 70° C por 16 horas e depois é esfriada na temperatura ambiente. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, 45 % em peso de solução de hidróxido de potássio (0,52 ml) são misturados com água (5,5 ml) e adicionados em 15 minutos. Depois de 30 minutos, ácido acético aquoso (0,7 ml em 6 ml de água) é adicionado seguido por água (2 ml). A pasta fluida resultante é envelhecida na temperatura ambiente por três horas, filtrada e lavada com 1:1 de IPA/água (2 x 2,4 ml). O produto é secado sob fluxo de nitrogênio depois empastado em cloreto de metileno a 20° C por 4 horas, filtrada e secada sob fluxo de nitrogênio para produzir l-5e como um sólido branco amarelado. 8-[4-(l-Aminociclobutil)fenil]-9-fenil[l,2,4] triazolo[3,4-/|-l ,6-nafitirídin-3(2H)-ona (1-16)
Uma solução de HCl concentrado aquoso (12,1 M, 1,64 ml) em etanol (2,0 ml) foi adicionada às gotas em 30 min a uma pasta fluida agitada de l-5e (500 mg, 0,985 mol) em etanol (1,7 ml) e água (0,2 ml) a 50°
C. Depois de 3 horas a seguir da adição de ácido, a mistura foi semeada e 20 envelhecida durante a noite a 50° C, esfriada na temperatura ambiente e filtrada. Cloreto de acetila (0,5 g, 7 mmoles) foi adicionado em 1 h ao etanol (2 ml) a 0o C. A solução foi depois esfriada na temperatura ambiente e envelhecida por 30 minutos. A torta de filtro foi lavada com esta solução (1 ml x 2), depois com acetato de etila (4 ml x 2) e secada, finalmente em uma 25 estufa a vácuo a 75,0° C com varredura de nitrogênio (50 torr) até que a conversão completa de 1-16 Forma IV para a Forma II fosse observada pelo XRPD.
O método utilizado no Esquema IA deu um sal de bis-HCl cristalino 1-16 denotado Forma I. Os procedimentos descritos no Esquema IE produziu três novos polimorfos do sal de bis-HCl 1-16, denotado Formas II, DT e IV. Foi descoberto que a secagem da Forma III ou da Forma IV sob pressão reduzida com uma varredura de nitrogênio converteu-as totalmente para a Forma II. Formando uma pasta fluida de uma mistura das Formas I e II em etanol ácido produziu a Forma III na pasta fluida. Isolando a Forma III e secando como descrito acima produz a Forma II.
Uma versão mono-HCl de 1-16 também foi produzida por intermédio da dissolução em água. Depois de 6 horas, a pasta fluida aquosa vira para amarelo claro e é filtrada. A titulação com cloreto de prata deste sólido revela a presença de um equivalente de cloreto. Finalmente, tratar o sal de bis-HCl 1-16 com KOH aquoso (2 equiv) produz 1-16 neutro como determinado pela titulação de cloreto.
ESOUEMA IF
1*6 1-€f MT
(1 - Γ4-Γ3 -metil-9-feniir 1,2,41triazolo Γ 3 A-f] -1,6-naftiridin-8- iDfenillciclobutiücarbamato de terc-butila (l-6f)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado EDC (4,63 g, 24,17 mmoles), HOBt (3,27 g, 24,17 mmoles), DCM anidro (50 ml) e ácido acético (13,2 ml, 13,86 mmoles). A mistura de reação foi depois agitada na temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio por 30 minutos. Depois adicionado l-{-[4-(5-hidrazino-3-fenil-l,6-naftiridin-2-
il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-6) (10,58 g, 21,97 mmoles). A mistura de reação foi depois permitida agitar durante a noite (18 horas) na temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio, depois aquecida a 80° C por 2 horas. A mistura de reação foi depois colocada em suspensão em acetato de etila, lentamente vertida em uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seguida por água e salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica 1 a 20 % de IPA/DCM. As frações apropriadas foram combinadas e o solvente foi removido a vácuo para dar {l-[4-(3-metil-9- 5 fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/]-l,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-61) como um sólido castanho. MS (M + H)+: observado = 506,2, calculado = 506,6.
Cloridreto de l-r4-('3-metil-9-feniirL2,41triazolor3,4-ll-l.,6- naftiridin-8-iOfeniHciclobutanamina (1-17)
A uma solução de {l-[4-(3-metil-9-fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/|-
l,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (1-61) (9,23 g, 18,26 mmoles) em MeOH (20 ml) e DCM (100 ml) foi adicionada uma solução 4 N de HCl em EtOAc (91 ml, 365 mmoles). A mistura de reação selada foi permitida agitar na temperatura ambiente. Depois de 18 horas a 15 mistura de reação foi filtrada para dar o cloridreto de l-[4-(3-metil-9- fenil[ 1,2,4]triazolo[3,41 ] -1,6-naftiridin-8-il)fenil]-ciclobutanamina (1-17) como um sólido branco amarelado. HRMS (M + H)+: observado = 406,2047, calculado = 406,2026.
ESQUEMA IG
j>-<
OH
LEDC li. AcOH
ICi
20 (1 -r4-(3-ciclopropil-9-feniir 1,2,41triazolor3,4-/l-1,6-naftiridin- 8-illfeniliciclobutilIcarbamato de terc-butila (l-6g)
A um frasco de fundo redondo foi adicionado EDC (535 mg, 2,79 mmoles), HOBt (377 mg, 2,79 mmoles), DCM anidro (17,5 ml), NMP anidro (2,5 ml) e ácido ciclopropanocarboxílico (248 mg, 5,40 mmoles). A mistura de reação foi depois agitada na temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio por 30 minutos. Depois adicionado {l-[4-(5- hidrazino-3-fenil-1,6-naftiridin-2-il)feniliciclobutil]-carbamato de terc-butila (1-6) (1,221 g, 2,54 mmoles). A mistura de reação foi depois permitida agitar durante a noite (18 horas) na temperatura ambiente sob uma atmosfera de
r
nitrogênio. Acido acético (2,178 ml, 38,0 mmoles) foi adicionado e a mistura de reação foi aquecida em um banho de óleo quente a 80° C por 2 horas. A mistura de reação foi permitida esfriar até a temperatura ambiente e acetato de etila foi adicionado e a mistura foi lavada com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, água e salmoura, secada em sulfato de sódio, filtrada e concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado pela cromatografia em gel de sílica 90 % de EtOAc/DCM (isocrático). As frações apropriadas foram combinadas e o solvente foi removido a vácuo para dar {l-[4-(3- ciclopropil-9-fenil[l ,2,4]triazolo[3,4-/|-1,6-naftiridin-8- il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (l-6g) como um sólido rosa. HRMS (M + H)+: observado = 532,2729, calculado = 532,2707.
Cloridreto de l-r4-(3-ciclopropil-9-feniiri,2,41triazolor3,4-/]-
1,6-naftiridin-8- iPfenillciclobutanamina (1-23)
A uma solução de (l-[4-(3-ciclopropil-9-fenil[l,2,4]triazolo [3,4-/)-l,6-naftiridin-8-il)fenil]ciclobutil}carbamato de terc-butila (MJK-9) (899,4 mg, 18,26 mmoles) em MeOH (5 ml) e DCM (15 ml) foi adicionada uma solução 4 N de HCl em EtOAc (4,23 ml, 16,92 mmoles). A mistura de reação selada foi permitida agitar na temperatura ambiente. Depois de 18 horas a mistura de reação foi filtrada para dar o cloridreto de l-[4-(3-metil-9- fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/|-l,6-naftiridin-8-il)fenil]-ciclobutanamina (1-23) como um sólido amarelo. HRMS (M + H)+: observado = 432,2186, calculado = 432,2183.
EXEMPLO 1
Clonagem das isoformas de Akt humano e APH-Aktl
O vetor pS2neo (depositado na ATCC em 3 de abril de 2001 como ATCC PTA-3253) foi preparado como segue: O vetor pRmHA3 (preparado como descrito em Nucl. Acid Res. 16: 1043-1061 (1988)) foi cortado com BglII e um fragmento de 2734 pares de base foi isolado. O vetor 10 pUChsneo (preparado como descrito em EMBO J. 4: 167-171 (1985)) também foi cortado com BglII e uma faixa de 4029 pares de base foi isolada. Estes dois fragmentos isolados foram ligados entre si para gerar um vetor chamado de pS2neo-l. Este plasmídeo contém um poliligador entre um promotor de metalotionina e um sítio de adição da álcool desidrogenase poli 15 A. Também tem um gene de resistência neo direcionado por um promotor de choque térmico. O vetor pS2neo-l foi cortado com Psp5II e BsiWI. Dois oligonucleotídeos complementares foram sintetizados e depois recozidos (CTGCGGCCGC (SEQ ID NO: I) e GTACGCGGCCGCAG (SEQ ID NO: 2)). O corte pS2neo-l e os oligonucleotídeos recozidos foram ligados entre si 20 para gerar um segundo vetor, pS2neo. Foi adicionado nesta conversão um sítio NotI para ajudar na linearização antes da transfecção em células S2.
O gene Aktl humano foi amplificado pela PCR (Clontech) de um cDNA de baço humano (Clontech) usando o iniciador 5’:
5 ’ CGCGA-ATTCAGATCTACCATGAGCGACGTGGCTA 25 TTGTG 3’ (SEQ ID NO: 3) e o iniciador 3’: 5’ CGCTCTAGAGGATCCTCAGGC CGTGCTGCTGGC3’ (SEQ ID NO: 4). O iniciador 5’ incluiu um sítio EcoRI e BglII. O iniciador 3’ incluiu um sítio XbaI e BamHI com propósitos de clonagem. O produto de PCR resultante foi subclonado em pGEM3Z (Promega) como um fragmento EcoRI/Xbal. Com propósitos de expressão/purificação, um rótulo T intermediário foi adicionado à extremidade 5’ do gene Aktl de tamanho natural usando o iniciador de PCR: 5’ GTACGATGCTGA-ACGATATCTTCG 3’ (SEQ ID NO: 5). O produto de PCR resultante abrangeu um sítio 5’ KpnI e um sítio 3’ BamHI que foram usados para subclonar o fragmento na matriz com um vetor de expressão de célula de inseto contendo rótulo de biotina, pS2neo.
Para a expressão de uma versão do domínio de homologia de plecstrina ( PH) deletado (Aa-a 4-129, que inclui a deleção de uma porção da região de dobradiça de Aktl) de Aktl, a mutagênese de deleção pela PCR foi feita usando o gene de Aktl de tamanho natural no vetor pS2neo como padrão. A PCR foi realizada em 2 etapas usando iniciadores internos de sobreposição (5’ GA-ATACATGCCGATGGA-A AGCGACGGGGCTGA- AGAGATGGAGGTG 3’ (SEQ ID NO: 6) e 5’ CCCCTCCATCTCTTCAGCCCCGTCGCTTTCCATCGGCATGTATTC 3 ’ (SEQ ID NO: 7)) que abrangeram a deleção e iniciadores flanqueadores 5’ e 3’ que, abrangeram o sítio KpnI e rótulo T intermediário na extremidade 5’. O produto de PCR final foi digerido com KpnI e SmaI e ligado no vetor de corte Kpnl/Smal de Aktl de tamanho natural pS2neo, eficazmente substituindo a extremidade 5 ’ do clone com a versão deletada.
O gene Akt3 humano foi amplificado pela PCR de cDNA de cérebro de adulto (Clontech) usando o iniciador de oligo de terminal amino:
5 ’ GA-ATTCAGATCTACCATGAGCGATGTTACCATTGT G 3’ (SEQ ID NO: 8); e o iniciador de oligo de terminal carbóxi:
5’ TCTAGATCTTATTCTCGTCCACTTGCAGAG 3’ (SEQ
ID NO: 9).
Estes iniciadores incluíram um sítio EcoRI/BglII 5’ e um sítio Xbal/BglII 3 ’ com propósitos de clonagem. O produto da PCR resultante foi clonado nos sítios EcoRI e XbaI de pGEM4Z (Promega). Com os propósitos de expressão/purificação, um rótulo T intermediário foi adicionado à extremidade 5 ’ do clone Akt3 de tamanho natural usando o iniciador de PCR:
5 ’ GGTACCATGGA-ATAC ATGCCGATGGA-
AAGCGATGTTACCAT TGTGA-AG 3’ (SEQ ID NO: 10). O produto de PCR resultante abrangeu um sítio 5’ KpnI que permitiu a clonagem de matriz com o vetor de expressão de célula de inseto contendo rótulo de biotina, pS2neo.
O gene Akt2 humano foi amplificado pela PCR a partir de cDNA de timo humano (Clontech) usando o iniciador de oligo de terminal amino:
5 ’ A-AGCTTAGATCTACCATGA-ATGAGGTGTCTGTC 3 ’
(SEQ ID NO: 11); e o iniciador de oligo de terminal carbóxi: 5’ GA- ATTCGGATCCTCACTCGCGGATGCTGGC 3’ (SEQ ID NO: 12). Estes iniciadores incluíram um sítio 5’ HindIII/BglII e um sítio 3’ EcoRI/BamHI com propósitos de clonagem. O produto de PCR resultante foi subclonado nos 15 sítios HindIII/EcoRI de pGem3Z (Promega). Com propósitos de expressão/purificação, um rótulo T intermediário foi adicionado à extremidade 5 ’ do Akt2 de tamanho natural usando o iniciador de PCR:
5 ’ GGT ACCAT GGA-AT ACAT GCCGAT GGA-AA-
ATGAGGTGTCTGT CATCA-AAG 3’ (SEQ ID NO: 13). O produto de PCR resultante foi subclonado no vetor pS2neo como descrito acima.
EXEMPLO 2 Expressão de isoformas de Akt humano e APH-Aktl O DNA contendo os genes Aktl, Akt2, Akt3 e APH-Aktl clonados no vetor de expressão pS2neo foi purificado e usado para transfectar células de Drosófila S2 (ATCC) pelo método do fosfato de cálcio. Reuniões de células resistentes a antibiótico (G418, 500 μg/ml) foram selecionadas. As células foram expandidas a um volume de 1,0 L (-7,0 x IO6 / ml), biotina e CuSO4 foram adicionados a uma concentração final de 50 μΜ e 50 mM respectivamente. As células foram cultivadas por 72 h a 27° C e colhidas pela centrifugação. A pasta de célula foi congelada a -70° C até necessário. EXEMPLO 3
Purificação de isoformas de Akt humana e APH-Aktl
A pasta de célula de um litro de células S2, descrita no Exemplo 2, foi lisada pela sonificação com 50 ml de CHAPS a 1 % em tampão A: (50 mM de Tris pH 7,4, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 0,2 mM de AEBSF, 104 ml de benzamidina, 5 μg/ml de leupeptina, aprotinina e pepstatina cada, 10 % de glicerol e I mM de DTT). A fração solúvel foi purificada em uma coluna de fluxo rápido de Proteína G Sepharose (Pharmacia) carregada com 9 mg/ml de anticorpo monoclonal anti-T intermediário e eluído com 75 μΜ do peptídeo EYMPME (SEQ ID NO: 14) em tampão A contendo 25 % de glicerol. As frações contendo Akt/PKB foram reunidas e a pureza da proteína avaliada pela SDS-PAGE. A proteína purificada foi quantificada usando um protocolo Bradford padrão. A proteína purificada foi subitamente congelada em nitrogênio líquido e armazenada a - 70° C.
As deleções de domínio de homologia de Akt e Akt plecstrina purificadas a partir das células S2 requereram ativação. As deleções de domínio de homologia de Akt e Akt plecstrina foram ativadas (Alessi et al. Current Biology 7: 261-269) em uma reação contendo 10 nM de PDKl (Upstate Biotechnology, Inc.), vesículas lipídicas (10 μΜ de fosfatidilinositol- 3,4,5-trisfosfato - Metreya, Inc, 100 μΜ de fosfatidilcolina e 100 μΜ de fosfatidilserina - Avanti Polar lipids, Inc.) e tampão de ativação (50 mM de Tris pH 7,4, 1,0 mM de DTT, 0,1 mM de EGTA, 1,0 μΜ de Microcistina- LR, 0,1 mM de ATP, 10 mM de MgCl2, 333 μg/ml de BSA e 0,1 mM de EDTA). A reação foi incubada a 22° C por 4 horas. As alíquotas foram subitamente congeladas em nitrogênio líquido. EXEMPLO 4 Ensaios de Akt Cinase
As isoformas de Akt ativadas e as construções de deleção do domínio de homologia de plecstrina foram ensaiadas utilizando um substrato de peptídeo biotinilado derivado de GSK. O grau de fosforilação do peptídeo foi determinado pela Fluorescência Resolvida com o Tempo Homogênea (HTRF) usando um anticorpo monoclonal ligado a quelato de lantanídeo (Lance) específico para o fosfopeptídeo em combinação com um fluoróforo de aloficocianina ligado à estreptavidina (SA-APC) que ligar-se-á à porção de biotina no peptídeo. Quando o Lance e APC estão em proximidade (isto é, ligado à mesma molécula de fosfopeptídeo), uma transferência de energia não radioativa ocorre do Lance para o APC, seguido pela emissão de luz do APC a 665 nm.
Materiais requeridos para o ensaio:
A. Isozima Akt ativada ou construção deletada no domínio de homologia de plecstrina
B. Substrato de peptídeo de Akt: GSK3a (S21) Peptídeo #3928 biotina-GGRARTSSFAEPG (SEQ ID NO: 15), Macromolecular Resources.
C. Anticorpo monoclonal GSK3a anti-fosfo rotulado com Lance (Cell Signaling Technology, clone # 27).
D. SA-APC (Prozyme catálogo no. PJ25S lote # 896067).
E. Placas Microtituladoras de Fundo em U Microfluor®B (Dynex Technologies, Catálogo no. 7205).
F. Analisador de Microplaca Discovery® HTRF, Packard Instrument Company.
G. Coquetel de Inibidor da Protease 100 X (PIC): 1 mg/ml de benzamidina, 0,5 mg/ml de pepstatina, 0,5 mg/ml de leupeptina, 0,5 mg/ml de aprotinina.
H. Tampão de Ensaio 10X: 500 mM de HEPES, pH 7,5, 1 % de PEG, mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1 % de BSA, 20 mM de fosfato de 4-Glicerol.
I. Tampão de Extinção: 50 mM de HEPES pH 7,3, 16,6 mM de EDTA, 0,1 % de BSA, 0,1 % de Triton X-100, 0,17 nM de anticorpo monoclonal rotulado com Lance # 27, 0,0067 mg/ml SA-APC
J. Solução de trabalho ATP/MgCl2: Tampão de ensaio IX, 1 mM de DTT, IX PIC, 125 mM de KCl, 5 % de Glicerol, 25 mM de MgCl2, 375 TMATP
K. Solução de trabalho de enzima: IX Tampão de ensaio, 1 mM de DTT, IX PIC5 5 % de Glicerol, Akt ativo. As concentrações de enzima final foram selecionadas de modo que o ensaio foi em uma faixa de resposta linear.
L. Solução de trabalho de peptídeo: IX Tampão de ensaio, 1 mM de DTT, IX PIC, 5 % de Glicerol, 2 TM GSK3 biotinilado peptídeo # 3928
A reação é montada pela adição de 16 TL da solução de trabalho ATPZMgCl2 aos reservatórios apropriados de uma placa microtituladora de 96 reservatórios. Inibidor ou veículo (1,0 Tl) é adicionado seguido por 10 Tl da solução de trabalho de peptídeo. A reação é iniciada pela 20 adição de 13 Tl da solução de trabalho de enzima e mistura. A reação é deixada processar por 50 min e depois interrompida pela adição de 60 Tl de Tampão de Extinção HTRF. As reações interrompidas foram incubadas na temperatura ambiente por pelo menos 30 min e depois lidas no instrumento Discovery.
Procedimento para Ensaio de Placa Cintilante de
Estreptavidina:
Etapa 1:
Uma solução de 1 μΐ do composto de teste em 100 % de DMSO foi adicionado a 20 μΐ de solução de substrato 2X (20 μΜ de Peptídeo GSK3, 300 μΜ de ATP5 20 mM de MgCl2, 20 μΟ/πύ de [γ33Ρ] ATP, Ix Tampão de ensaio, 5 % de glicerol, I mM de DTT, Ix PIC, 0,1 % de BSA e 100 mM de KCl). As reações de fosforilação foram iniciadas pela adição de
19 μΐ de 2X solução de Enzima (6,4 nM de Akt ativo/PKB, Ix Tampão de ensaio, 5 % de glicerol, I mM de DTT, Ix PIC e 0,1 % de BSA). As reações foram depois incubadas na temperatura ambiente por 45 minutos.
Etapa 2:
A reação foi interrompida pela adição de 170 μΐ de EDTA 125 mM. 200 μΐ de reação interrompida foi transferida a uma Streptavidin 10 Flashplate® PLUS (NEN Life Sciences, catálogo no. SMP103). A placa foi incubada por >10 minutos na temperatura ambiente em um agitador de placa. Os conteúdos de cada reservatório foram aspirados e os reservatórios enxaguados 2 vezes com 200 μΐ de TBS por reservatório. Os reservatórios foram depois lavados 3 vezes por 5 minutos com 200 μΐ de TBS por 15 reservatório com as placas incubadas na temperatura ambiente em um agitador de plataforma durante as etapas de lavagem.
As placas foram cobertas com fita de selagem e contadas usando o Packard TopCount com os ajustes apropriados para a contagem de [33P] nas Flashplates.
Procedimento para Ensaio de Placa de Filtração de
Estreptavidina:
Etapa 1:
As reações enzimáticas como descritas na Etapa 1 do ensaio de placa cintilante de estreptavidina acima foram realizadas.
Etapa 2:
A reação foi interrompida pela adição de 20 μΐ de Cloridreto de Guanidina 7,5 M. 50 μΐ da reação interrompida foram transferidos para a placa de filtração de Estreptavidina (SAM2® Biotin Capture Plate, Promega, catálogo no. V7542) e a reação foi incubada no filtro por 1 a 2 minutos antes de aplicar vácuo. A placa foi depois lavada usando um tubo de distribuição de vácuo como segue: 1) 4 x 200 μΐ/reservatório de NaCl 2 M; 2) 6 x 200 μΐ/reservatório de NaCl 2 M com 1 % de H3PO4; 3) 2 x 200 μΐ/reservatório de diH20; e 4) 2 x 100 μΐ/reservatório de Etanol a 95 %. As membranas foram depois deixadas secar ao ar completamente antes de adicionar cintilante.
O fundo da placa foi selado com fita de reforço branca, 30 μΐ/reservatório de Microscint 20 (Packard Instruments, catálogo no. 6013621) foram adicionados. O topo da placa foi selado com fita de selagem clara e a placa depois contada usando O Packard TopCount com os ajustes apropriados
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para [ P] com cintilante líquido.
Procedimento para Ensaio de Placa de Filtração de
Fosfocelulose:
Etapa 1:
As reações enzimáticas foram realizadas como descrito na Etapa 1 do ensaio de placa cintilante de estreptavidina (acima) utilizando KKGGRARTSSFAEPG (SEQ ID NO: 16) como o substrato no lugar de biotina-GGRARTSSFAEPG.
Etapa 2
A reação foi interrompida pela adição de 20 μΐ de H3PO4 a 0,75 %. 50 μΐ de reação interrompida foram transferidos para a placa de filtração (UNIFILTER™, Whatman P81 Strong Cation Exchanger, Placas Brancas de Poliestireno de 96 Reservatórios, Polifiltronics, catálogo no. 7700- 3312) e a reação incubada no filtro por 1 a 2 minutos antes de aplicar vácuo.
A placa foi depois lavada usando um tubo de distribuição de vácuo como segue: 1) 9 x 200 μΐ/reservatório de 0,75 % de H3PO4; e 2) 2 x 200 μΐ/reservatório de diH20. O fundo da placa foi selado com fita de reforço branca, depois 30 μΐ/reservatório de Microscint 20 foi adicionado. O topo da placa foi selado com fita de selagem clara e a placa contada usando o Packard TopCount com os ajustes apropriados para [33P] e cintilante líquido. Ensaio de PKA:
Cada ensaio de PKA individual consiste dos seguintes
componentes:
A. 5X tampão de ensaio de PKA (200 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de MgCl2, 5 mM de β-mercaptoetanol, 0,5 mM de EDTA)
B. 50 μΜ de estoque de Kemptide (Sigma) diluído em água
C. 33P-ATP preparado pela diluição 1,0 μΐ de 33P-ATP [10 mCi/ml] em 200 Tl de um estoque a 50 μΜ de ATP não rotulado
D. 10 μΐ de um estoque a 70 nM da subunidade catalítica de PKA (catálogo UBI # 14-114) diluído em 0,5 mg/ml de BSA
E. Solução de trabalho de PKA/Kemptide: volumes iguais de 5X tampão de ensaio de PKA, solução de Kemptide e subunidade catalítica de PKA.
A reação é montada em uma placa de ensaio de 96 reservatórios profundos. O inibidor ou veículo (10 Tl) são adicionados a 10 Tl
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da solução de P-ATP. A reação é iniciada pela adição de 30 Tl da solução de trabalho de PKA/Kemptide a cada reservatório. As reações foram misturadas e incubadas na temperatura ambiente por 20 mM. As reações foram interrompidas pela adição de 50 Tl de EDTA 100 mM e pirofosfato de sódio 100 mM e misturando.
O produto da reação enzimática (Kemptide fosforilado) foi coletado em placas de filtração de 96 reservatório p81 fosfocelulose (Millipore). para preparar a placa, cada reservatório de uma placa de filtração p81 foi enchido com 75 mM de ácido fosfórico. Os reservatórios foram esvaziados através do filtro pela aplicação de um vácuo ao fundo da placa. Ácido fosfórico (75 mM, 170 μΐ) foi adicionado a cada reservatório. Uma alíquota de 30 μΐ de cada reação de PKA interrompida foi adicionada aos reservatórios correspondentes na placa de filtração contendo o ácido fosfórico. O peptídeo foi aprisionado no filtro a seguir da aplicação de um vácuo e os filtros foram lavados 5 vezes com ácido fosfórico 75 mM. Depois da lavagem final, os filtros foram deixados secar ao ar. O fluído de cintilação (30 μΐ) foi adicionado a cada reservatório e os filtros contados em um T opCount (Packard).
Ensaio de PKC:
Cada ensaio de PKC consiste dos seguintes componentes:
A. IOX tampão de co-ativação de PKC: 2,5 mM de EGTA, 4
mM de CaCl2
B. 5X tampão de ativação de PKC: 1,6 mg/ml de
fosfatidilserina, 0,16 mg/ml de diacilglicerol, 100 mM de Tris pH 7,5, 50 mM de MgCl2, 5 mM de β-mercaptoetanol
C. 33P-ATP preparado pela diluição de 1,0 μΐ de 33P-ATP [10 mCi/ml] em 100 μΐ de um estoque de 100 μΜ de ATP não rotulado D. Proteína básica de mielina (350 μg/ml, UBI) diluída em
água
E. PKC (50 ng/ml, catálogo UBI # 14-115) diluído em 0,5
mg/ml de BSA
F. Solução de trabalho de PKC/Proteína Básica de Mielina: Preparada misturando-se 5 volumes de cada um de tampão de co-ativação de
PKC e Proteína Básica de Mielina com 10 volumes de cada um de tampão de ativação de PKC e PKC.
Os ensaios foram montados em placas de ensaio de 96 reservatórios profundos. Inibidor ou veículo (10 Tl) foram adicionados a 5,0
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μΐ de P-ATP. As reações foram iniciadas com a adição da solução de trabalho de PKC/Proteína Básica de Mielina e misturando. As reações foram incubadas a 30° C por 20 min. As reações foram interrompidas pela adição de 50 Tl de 100 mM de EDTA e 100 mM de piro fosfato de sódio e misturando. A Proteína Básica de Mielina Fosforilada foi coletada em membranas de PVDF em placas de filtração de 96 reservatórios e quantificadas pela contagem de cintilação.
Os compostos da presente invenção descritos nos Esquemas e Tabelas foram testados no ensaio descrito acima e foram descobertos ter IC5o de < 50 μΜ contra um ou mais de Akt 1, Akt2 e Akt3.
EXEMPLO 5
Ensaios com Base em Célula para Determinar a Inibição de
Akt/PKB
Células (por exemplo LnCaP ou uma linhagem de célula de tumor PTEN( /_) com Akt/PKB ativado) foram plaqueadas em placas de 100 mM. Quando as células foram aproximadamente 70 a 80 % confluentes, as células foram realimentadas com 5 ml de meio fresco e o composto de teste adicionado em solução. Os controles incluíram células não tratadas, células tratadas com veículo e células tratadas com LY294002 (Sigma) ou vortmanina (Sigma) a 20 μΜ ou 200 nM, respectivamente. As células foram incubadas por 2, 4 ou 6 horas e o meio removido, as células foram lavadas com PBS, raspadas e transferidas a um tubo de centrífuga. Estas foram pelotizadas e lavadas mais uma vez com PBS. Finalmente, a pelota de célula foi recolocada em suspensão em tampão de Iise (20 mM de Tris pH 8, 140 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 1 % de Triton, I mM de Pirofosfato de Na, 10 mM de Fosfato de β-Glicerol, 10 mM de NaF, 0,5 mM de NaVO4, 1 μΜ de Microcistina e Ix Coquetel de Inibidor de Protease), colocada em gelo por 15 minutos e suavemente turbilhonada para lisar as células. O lisado foi girado em uma ultra centrífuga de bancada Beckman a 100.000 x g a 4o C por 20 min. A proteína sobrenadante foi quantificada por um protocolo Bradford padrão (BioRad) e armazenada a -70° C até necessário.
As proteínas foram imunoprecipitadas (IP) a partir dos lisados clarificados como segue: Para os lisados de Aktl/ΡΚΒα, os lisados são misturados com Santa Cruz sc-7126 (D-17) em NETN (100 mM de NaCl, 20 mM de Tris pH 8,0, 1 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40) e Proteína A/G Agarose (Santa Cruz sc-2003) foi adicionada. Para os lisados de Akt2/PKBP, os lisados foram misturados em NETN com anti-Akt2 agarose (Upstate Biotechnology #16-174) e para os lisados de Akt3/PKBy, os lisados foram misturados em NETN com anti-Akt3 agarose (Upstate Biotechnology #16- 175). As IPs foram incubadas durante a noite a 4o C, lavadas e separadas pela SDS-P AGE.
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Western blots foram usados para analisar Akt total, pThR 08 Aktl, pSeR473 Aktl e os sítios de fosforilação correspondentes em Akt2 e Akt3 e alvos a jusante de Akt usando anticorpos específicos (Cell Signaling Technology): Anti-Akt Total (cat. no. 9272), Anti-Fosfo Akt Serina 473 (cat. no. 9271) e Anti-Fosfo Akt Treonina 308 (cat. no. 9275). Depois de incubar com o anticorpo primário apropriado diluído em PBS + 0,5 % de leite em pó desnatado (NFDM) a 4o C durante a noite, os blots foram lavados, incubados com anticorpo secundário rotulado com peroxidase de rábano (HRP) em PBS + 0,5 % de NFDM por 1 hora na temperatura ambiente. As proteínas foram detectadas com Reagentes ECL (Amersham/Pharmacia Biotech RPN2134).
EXEMPLO 6 Ativação de Akt Estimulada com Heregulina As células MCF7 (uma linhagem de câncer mamário humano que é PTEN+^) foram plaqueadas a 1 x IO6 células por placa de 100 mM. Quando as células foram 70 a 80 % confluentes, elas foram realimentadas com 5 ml de meio isento de soro e incubadas durante a noite. Na manhã seguinte, o composto foi adicionado e as células foram incubadas por 1 a 2 horas, tempo depois do qual heregulina foi adicionada (para induzir a ativação de Akt) por 30 minutos e as células foram analisadas como descrito acima.
EXEMPLO 7 Inibição do Crescimento de Tumor
A eficácia in vivo de um inibidor do crescimento de células cancerosas pode ser confirmada por vários protocolos bem conhecidos na técnica.
As linhagens de célula de tumor humano que exibe uma desregulagem do caminho de PI3K (tal como LnCaP, PC3, C33a, OVCAR-3, MDA-MB-468, A2780 ou semelhante) são injetadas subcutaneamente no flanco esquerdo de camundongos nus fêmeas de 6 a 10 semanas de idade (também camundongos machos [idade de 10 a 14 semanas] são usados para xenoenxertos de tumor prostático [LnCaP e PC3]) (Harlan) no dia 0. Os camundongos são aleatoriamente designados a um grupo de tratamento de veículo, composto ou combinação. A administração subcutânea diária começa no dia 1 e continua pela duração do experimento. Alternativamente, o composto de teste inibidor pode ser administrado por uma bomba de infusão contínua. O composto, combinação de composto ou veículo são liberados em um volume total de 0,2 ml. Os tumores são excisados e pesados quando todos os animais tratados com veículo exibiram lesões de 0,5 a 1,0 cm no diâmetro, tipicamente de 4 a 5,5 semanas depois que as células foram injetadas. O peso médio dos tumores em cada grupo de tratamento para cada linhagem de célula é calculado.
EXEMPLO 8 Ensaio de Mancha por multiplexação
Este procedimento descreve um imunoensaio intercalado usado para detectar proteínas fosforiladas múltiplas no mesmo reservatório de uma placa do formato de 96 reservatórios. Os lisados de célula são incubados em placas de 96 reservatórios nos quais anticorpos de captura diferentes são colocados em manchas espacialmente distintas no mesmo reservatório. Os anticorpos policlonais de coelho específicos de fosforilação são adicionados e o complexo é detectado por um anticorpo anti-coelho rotulado com um rótulo eletroquimioluminescente. Placas LNCaP de 96 Reservatórios +/- Compostos: Girar em Beckman J6 1200 rpm 10 min, o meio aspirado. Adicionar 50 μΐ/reservatório: TBS (Pierce #28376-20 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl) + 1 % de Triton X-IOO + Inibidores de Protease e Fosfatase. Enrolar em envoltório plástico, colocar em congelador a -70° C até completamente congelado. Placas De multiplexação de Bloqueio (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, AID) com 3 % de Bloqueador A em IX Tampão de Lavagem Tris, 150 μΐ/reservatório. Cobrir com selador de placa, incubar em agitador Micromix RT 2 horas (mínimo). Lavar com Ix RCM 51 (TTBS). Descongelar as placas com lisado de célula em gelo, adicionar 40 μΐ de lisado/reservatório em placas bloqueadas. Cobrir com selador de placa, incubar em agitador Micromix 4o C durante a noite, Lavar com Ix RCM 51. Diluir com Anticorpos Secundários em 1 % de Bloqueador A em IX Tampão de Lavagem Tris: Anti fosfo AKT (T308), Anti fosfo Tuberin (T1462), sozinho ou em combinação. Adicionar 25 μΐ/reservatório, cobrir com selador de placa, incubar em agitador Micromix RT 3 horas. Lavar com IX RCM 51.
Diluir Ru-GAR em 1 % de Blocker A em IX Tampão de Lavagem Tris. Adicionar 25 μΐ/reservatório, cobrir com selador de placa, incubar em agitador Micromix RT 1 hora. Lavar com Ix RCM 51. Diluir 4X Tampão de Leitura T a Ix com Água, adicionar 200 μΐ de Tampão de Leitura diluído/reservatório
Ler no Sector 6000 Imager.
Inibidores de Protease e Fosfatase:
Microcistina-LR, Calbiochem # 475815 a 1 μΜ de concentração final (estoque = 500 μπι)
Calbiochem # 524624, IOOX Conjunto I Calbiochem # 524625, IOOX Conjunto II Calbiochem # 539134, IOOX Conjunto III Anti Fosfo AKT (T308):
Cell Signaling Technologies # 9275 Anti Fosfo Tuberin (Tl462): Covance Affinity Purified (Rabbits MS 2731/2732) Ru-GAR = Cabra anti Coelho Rutenilado
IPX Tampão de Lavagem Tris, Bloqueador A e 4X Tampão de
Leitura T
IPX RCM 51 (TOX TTBS, RCM 51)
IX = 2P mM Tris pH 7,5, 14P mM de NaCl, 0,1 % de Tween-2P EXEMPLO 9
Ensaio com base em Célula (in vivo)
Este procedimento descreve um ensaio de atividade com base em célula (in vivo) para a Akt serina/treonina cinase. Akt endógena ativada é capaz de fosforilar o substrato de peptídeo de Akt específico (GSK3p) que é biotinilado. A detecção é realizada pela Fluorescência Resolvida com o Tempo Homogênea (HTRF) usando um anticorpo ligado a Criptato de Európio [Eu(K)] específico para o fluoróforo XL665 ligado a fosfopeptídeo e estreptavidina que ligará à porção de biotina no peptídeo. Quando o [Eu(K)] e XL665 estão em proximidade, (isto é, ligados à mesma molécula de fosfopeptídeo) uma transferência de energia não radioativa ocorre do Eu(K) para o XL665, seguido pela emissão de luz a partir do XL665 a 665 nm.
O ensaio pode ser usado para detectar inibidores de todas as três isozimas de Akt (Aktl, Akt2 e Akt3) a partir de espécies diferentes múltiplas se anticorpos específicos para cada um existam.
MATERIAIS E REAGENTES
A. Placas de 96 Reservatórios de Fundo Chato Microtituladora de Cultura de Célula, Corning Costar, Catálogo no. 3598
B. Placas de 96 Reservatórios Revestidas com Proteína A Reacti-Bind, Pierce, Catálogo no 1513P.
C. Placas de 96 Reservatórios Revestidas com Proteína G Reacti-Bind, Pierce, Catálogo no 15131.
D. Agitador Micromix 5. E. Placas Microtituladoras de Fundo em U Microfluor®B, Dynex Technologies, Catálogo no. 7205.
F. Lavadora de Placa de 96 Reservatórios, Bio-Tek Instruments, Catálogo no. EL 404.
G. Analisador de Microplaca Discovery® HTRF, Packard Instrument Company.
SOLUÇÕES TAMPÃO
A. Tampão de Lise de Célula IP Cinase: IX TBS; 0,2 % de Tween 20; IX Coquetel Inibidor de Protease DI (O estoque é de 100X, Calbiochem, 539134); IX Coquetel de Inibidor de Fosfatase I (O estoque é 100X, Calbiochem, 524624); e IX Coquetel Inibidor de Fosfatase II (O estoque é 100X, Calbiochem, 524625).
B. IOX Tampão de ensaio: 500 mM de Hepes pH 7,5; 1 % de PEG; 1 mM de EDTA; 1 mM de EGTA; e 20 mM de β-glicerofosfato.
C. Tampão de ensaio de IP Cinase: IX Tampão de ensaio; 50 mM de KCl; 150 μΜ de ATP; 10 mM de MgCl2; 5 % de Glicerol; 1 mM de DTT; 1 Tablete de Coquetel de Inibidor da Protease por 50 ml de Tampão de ensaio; e 0,1 % de BSA
D. Solução de Substrato de GSK3/3: Tampão de ensaio IP Cinase; e 500 nM de peptídeo GSK30 biotinilado.
E. Tampão Lance: 50 mM de Hepes pH 7,5; 0,1 % de BSA; e
0,1 % de Triton X-100.
F. Tampão de Interrupção Lance: Tampão Lance; e 33,3 mM
de EDTA.
G. Tampão de Detecção Lance: Tampão Lance; 13,3 μg/ml de SA-APC; e 0,665 nM de EuK Ab afosfo (Ser-21) GSK3p
Ensaio de Akt Cinase de Imunoprecipitação em Etapa Múltipla
Dia 1
A. Etapa de Semear células C33a: Placa 60.000 células Cs3a/ reservatório em placa microtituladora de 96 reservatórios. B. Incubar as células durante a noite a 37° C.
Dia 2
D. Etapa de Adição do Composto: Adicionar os compostos em meio fresco (alfa-MEM/10 % de FBS, temperatura ambiente) às placas de 96 reservatórios acima e incubar por 5 horas em incubador de cultura de tecido.
E. Etapa de Lise de Célula: Aspirar o meio e adicionar 100 μΐ de Tampão de Lise de Célula IP Cinase.
F. Congelar a placa microtituladora de 96 reservatórios a -70° C (NOTA: Esta etapa pode ser feita por um mínimo de 1 hora ou durante a noite).
Dia 3
G. Etapa de revestir a placa de 96 reservatórios com Proteína A/G: Adicionar a concentração apropriada de anticorpo a-Akt (Aktl, Akt2 ou Akt3) em 100 μΐ de PBS aos seguintes reservatórios:
a-Akt 1 (20 ng/reservatório/100 μ1)Β2 »»» BlO / fileiras B — G / placa Aktl
a-Akt 2 (50 ng/reservatório/100 μ1)Β2 »»» BlO / fileiras B - G / placa Akt2
IgG de Coelho (150 ng/reservatório/100 μΐ): Bll -Gll em cada placa (Aktl e Akt2)
H. Incubar em ambiente frio (+4° C) por 4 horas no Micromix (Forma 20; Atitude 2) (NOTA: Atitude depende da máquina Micromix 5).
I. Separar aspirando a solução de anticorpo α-Akt e adicionar 100 μΐ de PBS a cada reservatório.
J. Etapa de Imunoprecipitação de Akt: A 100 μΐ de PBS da Etapa(I) adicionar 5 μΐ de lisado de célula descongelado às placas de Aktl e μΐ de lisado de célula descongelado às placas Akt2. NOTA: lisado de célula descongelado em gelo. Misturar o lisado descongelado pipetando-se para baixo e para cima 10X antes de transferir para as placas de anticorpo. Manter as placas de lisado de célula em gelo. Depois da transferência do lisado de célula para as placas de anticorpo recongelar as placas de lisado de célula a -70° C.
K. Incubar no ambiente frio (+4° C) durante a noite em agitador Micromix 5 (forma 20, atitude 3).
Dia 4
L. Etapa de Lavagem da Placa de Imunoprecipitação: Lavar as placas de 96 reservatórios Ix com TTBS (RCM 51, IX = 2 ciclos) usando o Lavador de Placa de 96 Reservatórios. Encher os reservatórios com TTBS e incubar 10 por 10 minutos. Lavar as placas de 96 reservatórios 2X com TTBS. (NOTA: Lavar as placas novas antes do uso: 1. Checar os reservatórios de tampão, certificar-se de que eles estejam cheios e 2. Esvaziar os recipientes de resíduo.
M. Etapa de Lavagem de Placa Manual: Adicionar 180 μΐ de Tampão de Ensaio de IP Cinase.
N. Iniciar a Reação de Enzima Akt: Aspirar o sobrenadante.
Adicionar 60 μΐ de Solução de Substrato de GSK3p.
O. Incubar por 2,5 horas em agitador Micromix 5 em tomo da temperatura ambiente. NOTA: O tempo de incubação deve ser ajustado de modo que a razão da Coluna 10 /Coluna 11 não seja >10.
P. Combinar 30 μΐ de Tampão de Detecção Lance com 30 μΐ
de Tampão de Interrupção Lance (60 μΐ total/reservatório) e adicionar às placas pretas de 96 reservatórios de fundo em U Microfluor.
Q. Interromper a Reação Enzimática de Akt: Transferir 40 μΐ de Mistura de Reação de Enzima Akt da placa de 96 reservatório de Proteína A/G da Etapa (O) para as placas pretas de 96 reservatórios de fundo U Microfluor da Etapa (P).
U. Incubar na temperatura ambiente por 1 a 2 horas em agitador Micromix 5 (forma 20, atitude 3), depois Ier com o Analisador de Microplaca Discovery HTRF usando o programa Akt. Tampão de Lise de Célula IP Cinase 100 μΐ por reservatório
8 ml 45 ml (1 Placa) (6 Placas) IX TBS 7744 ul NA Tween 20 20 ul NA IX Coquetel de Inibidor de Protease 80 ul NA IX Coquetel de Inibidor de Fosfatase I 80 ul 450 μΐ IX Coquetel de Inibidor de Fosfatase II 80 ul 450 ul Microscistina LR (500X) 90 μΐ Tampão de Ensaio de IP Cinase
100 μΐ por reservatório
8 ml 50 ml (1 Placa) (3 Placas) 10X Tampão de Ensaio 800 μΐ 5 ml KCl I M 400 μΐ 2,5 ml 250 mM de ATP 4,8 μΐ 30 μΐ MgCl2 I M 80 μΐ 500 μΐ Glicerol 400 μΐ 2,5 ml DTT I M 8 μΐ 50 μΐ Coquetel Inibidor de Protease 1 tablete/50 I ml BSA a 10% 80 μΐ 500 μΐ di dH20 6227,2 μΐ 38,9 ml Solução de Substrato GSK3p
60 μΐ por reservatório
5 ml 7 ml (1 Placa) Tampão de Ensaio de IP Cinase 5 ml - Peptídeo GSK33 1 mM 2,5 μΐ 3,5 μΐ Tampão de Interrupção Lance
30 μΐ por reservatório
3 ml 5 ml 5 ml (1 Placa) IX Tampão Lance 2800,2 μΐ EDTA 0,5 M 199,8 μΐ Tampão de Detecção Lance
30 μΐ por reservatório
3 ml 5 ml (1 Placa) SA-APC (1 mg/ml em ddH20, diluído 1/75,2 em Tampão Lance) Eu-K Ab a-fosfo (Ser 21)GSK3p (680 nM, 2800,2 μΐ diluído 1/1133 em Tampão Lance) I LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
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<160> 16
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 10 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400> 1
ctgcggccgc 10
<210> 2 <211> 14 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400>2
gtacgcggcc gcag 14
<210 3 <211> 39 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400 3
cgcga-attca gatctaccat gagcgacgtg gctattgtg 39
<210> 4 <211> 33 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400>4
cgctctagag gatcctcagg ccgtgctgct ggc 33
<210 5 <211> 24 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400> 5
gtacgatgct ga-acgatatc ttcg 24
<210> 6 <211> 45 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400 6
ga-atacatgc cgatgga-aag cgacggggct ga-agagatgg aggtg 45
<210> 7 <211 >45 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400>7
cccctccatc tcttcagccc cgtcgctttc catcggcatg tattc 45
<210 8 <211> 36 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400>8
ga-attcagat ctaccatgag cgatgttacc attgtg 36
<210> 9 <211> 30 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética
<400>9 tctagatctt attctcgtcc acttgcagag 30
<210> 10 <211> 48 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400> 10
ggtaccatgg a-atacatgcc gatgga-aagc gatgttacca ttgtga-ag 48
<210> 11 <211> 33 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400> 11
a-agcttagat ctaccatga-a tgaggtgtct gtc 33
<210> 12 <211> 30 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400> 12
ga-attcggat cctcactcgc ggatgctggc 30
<210> 13 <211> 49 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220> <223> Seqüência de DNA Completamente Sintética <400> 13
ggtaccatgg a-atacatgcc gatgga-aa-at gaggtgtctg tcatca-aag 49
<210> 14 <211>6 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Aminoácido Completamente Sintética <400 14
Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5
<210 15 <211 > 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Aminoácido Completamente Sintética <400> 15
Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly 1 5 10
<210 16 <211> 15 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de Aminoácido Completamente Sintética <400> 16
Lys Lys Gly Gly Arg Ala Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Pro Gly 10 15

Claims (10)

1. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável, um tautômero ou um estereoisômero do mesmo, caracterizado pelo fato de que está de acordo com a Fórmula C: <formula>formula see original document page 88</formula> em que: a é O ou 1; b é O ou 1; m é 0,1 ou 2; p é 0, 1 ou 2; a linha pontilhada representa um ligação dupla opcional; R é independentemente selecionado de: alquila (C1-C6), alcóxi (C1-C6), CO2H, halo, OH e NH2; O anel Y é cicloalquila (C4-C7); R1 é selecionado de: H, oxo, (C=0)a0balquila (CrCio), (C=0)a0b-arila, (C=0)a0balquenila (C2-Ci0), (C=0)a0balquinila (C2-Ci0), CO2H, halo, OH, Obperfluoroalquila (C1-C6), (C=O)aNR7R8, CN, (C=0)aObcicloalquila (C3-C8), S(O)mNR7R8, SH, S(0)m-alquila (C1-C10) e (C=0)aOb-heterociclila, os ditos alquila, arila, alquenila, alquinila, cicloalquila e heterociclila são opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionado de R6; R6 é: (C=0)a0balquila C1-C10, (C=0)a0barila, alquenila C2-C10, alquinila C2-C10, (C=O)aOb heterociclila, CO2H, halo, CN, OH, Obperfluoroalquila C1-C6, Oa(C=O)bNR7R8, oxo, CHO, (N=O)R7R8, S(O)mNR7R8, SH, S(0)m-alquila (C1-C10) ou (C=O)aOb cicloalquila C3-C8, os ditos alquila, arila, alquenila, alquinila, heterociclila e cicloalquila opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionado de R6a; R6a é selecionado de: (C=O)aObalquila (Ci-Ci0), Oaperfluoroalquila (C1-C3), alquileno (CO-C6)-S(O)mRa, SH, oxo OH, halo, CN, alquenila (C2-Ci0), alquinila (C2-Ci0), cicloalquila (Ci-C6), alquileno (CO- C6)-arila, alquileno (C0-C6)-heteroeielila, alquileno (CO-C6)-N(Rb)2, C(O)Ra, alquileno (CO-C6)-CO2Ra, C(O)H e alquileno (CO-C6)-CO2H, os ditos alquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, arila e heterociclila é opcionalmente substituído com até três substituintes selecionados de R , OH, alcóxi (CpC6), halógeno, CO2H, CN, 0a(C=0)balquila (Ci-C6), oxo e N(Rb)2; R7 e R8 são independentemente selecionados de: H, (C=0)a0balquila (Ci-Ci0), (C=0)aObcicloalquila (C3-C8), (C=0)a0b-arila, (C=0)aOb-heterociclila, alquenila (C2-Ci0), alquinila (C2-Ci0), SH, SO2Ra e (C=O)aNRb2, os ditos alquila, cicloalquila, arila, heterociclila, alquenila e alquinila são opcionalmente substituídos com um ou mais substituintes selecionados de R6a ou R7 e R8 podem ser tomados juntos com o nitrogênio ao qual estão ligados para formar um heterociclo monocíclico ou bicíclieo com 3 a 7 membros em cada anel e opcionalmente contendo, além do nitrogênio, um ou dois heteroátomos adicionais selecionados de N, O e S, o dito heterociclo monocíclico ou bicíclieo opcionalmente substituído com um ou mais substituintes selecionados de R6a; Ra é alquila (CrC6), cicloalquila (CrC6), arila ou heterociclila; e Rb é independentemente: H ou alquila (CrC6).
2. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que está de acordo com a Formula E: NH2 <formula>formula see original document page 89</formula> em que: <formula>formula see original document page 90</formula> O anel Y é ciclobutila; e R1 é H, pirimidila, metilimidazol, OH, metila ou ciclopropila.
3. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é: dicloridreto de l-(4-[3-(l-metil-lH-imidazol-4-il)-9- fenil[l,2,4]triazolo [3,41]-l,6-naftiridin-8-il]fenil}ciclobutanamina.
4. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é: {1 -[4-(9-fenil[l ,2,4]triazolo[3,4-/]-1,6-naftiridin-8- il)fenil]ciclobutil} carbamato de terc-butila.
5. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é: l-[4-(9-fenil-3-pirimidin-2-il[l,2,4]triazolo[3,4-/]-l,6- naftiridin-8-il)fenil]ciclobutanamina.
6. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é: 8-[4-(l-Aminociclobutil)fenil]-9-fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/]- 1,6-naftiridin-3(2H)-ona.
7. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é: l-[4-(3-metil-9-fenil[l,2,4] triazolo[3,4-/]-l,6-nafi:iridin-8- il)fenil] ciclobutanamina.
8. Composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que é: l-[4-(3-ciclopropil-9-fenil[l,2,4]triazolo[3,4-/]-l,6-naftiridin- 8-il)fenil] ciclobutanamina.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um carregador farmacêutico e disperso no mesmo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto como definido na reivindicação 1.
10. Uso do composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento útil no tratamento ou prevenção de câncer em um mamífero em necessidade de tal tratamento.
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