BRPI0719763A2 - Anticorpo, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula, composição, mistura, uso de um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo e/ou uma parte funcional e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura, métodos para a preparação de uma composição farmacêutica ou de uma mistura, para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de uma doença, de diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente e de determinação do grau da carga de placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, kits de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com amilóide, região variável de cadeia leve, região variável de cadeia pesada, linhagem de célula, gene de anticorpo, e, métodos para desagregar fibras de beta-amilóide pré formadas, para prevenir a degradação de neurônio induzida por abeta, para diagnosticar uma predisposição a uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente, para monitorar doença residual mínima em um paciente, para prognosticar a responsividade de um paciente que é tratado com um anticorpo ou uma composição de vacina, para reduzir a carga de placa no cérebro de um animal, para reduzir a quantidade de placas no cérebro de um animal, para diminuir a quantidade total de abeta solúvel no cérebro de um animal e para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero. - Google Patents

Anticorpo, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula, composição, mistura, uso de um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo e/ou uma parte funcional e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura, métodos para a preparação de uma composição farmacêutica ou de uma mistura, para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de uma doença, de diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente e de determinação do grau da carga de placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, kits de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com amilóide, região variável de cadeia leve, região variável de cadeia pesada, linhagem de célula, gene de anticorpo, e, métodos para desagregar fibras de beta-amilóide pré formadas, para prevenir a degradação de neurônio induzida por abeta, para diagnosticar uma predisposição a uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente, para monitorar doença residual mínima em um paciente, para prognosticar a responsividade de um paciente que é tratado com um anticorpo ou uma composição de vacina, para reduzir a carga de placa no cérebro de um animal, para reduzir a quantidade de placas no cérebro de um animal, para diminuir a quantidade total de abeta solúvel no cérebro de um animal e para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero. Download PDF

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Andreas Muhs
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Description

"ANTICORPO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA, COMPOSIÇÃO, MISTURA, USO DE UM ANTICORPO QUIMÉRICO OU UM FRAGMENTO DO MESMO OU UM ANTICORPO HUMANIZADO OU UM FRAGMENTO DO MESMO E/OU UMA PARTE FUNCIONAL E/OU UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU UMA MISTURA, MÉTODOS PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU DE UMA MISTURA, PARA PREVENIR, TRATAR OU ALIVIAR OS EFEITOS DE UMA DOENÇA, DE DIAGNÓSTICO DE UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO ASSOCIADA COM AMILÓIDE EM UM PACIENTE E DE DETERMINAÇÃO DO GRAU DA CARGA DE PLACA AMILOIDOGÊNICA EM UM TECIDO E/OU FLUIDOS CORPORAIS, KITS DE TESTE PARA A DETECÇÃO E DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS E CONDIÇÕES ASSOCIADAS COM AMILÓIDE, REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE, REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA, LINHAGEM DE CÉLULA, GENE DE ANTICORPO, E, MÉTODOS PARA DESAGREGAR FIBRAS DE BETA-AMILÓIDE PRÉ FORMADAS, PARA PREVENIR A DEGRADAÇÃO DE NEURÔNIO INDUZIDA POR ABETA, PARA DIAGNOSTICAR UMA PREDISPOSIÇÃO A UMA DOENÇA OU CONDIÇÃO ASSOCIADA COM AMILÓIDE EM UM PACIENTE, PARA MONITORAR DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA EM UM PACIENTE, PARA PROGNOSTICAR A RESPONSIVIDADE DE UM PACIENTE QUE É TRATADO COM UM ANTICORPO OU UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA, PARA REDUZIR A CARGA DE PLACA NO CÉREBRO DE UM ANIMAL, PARA REDUZIR A QUANTIDADE DE PLACAS NO CÉREBRO DE UM ANIMAL, PARA DIMINUIR A QUANTIDADE TOTAL DE ABETA SOLÚVEL NO CÉREBRO DE UM ANIMAL E PARA RETER OU AUMENTAR A CAPACIDADE DE MEMÓRIA COGNITIVA EM UM MAMÍFERO" A presente invenção diz respeito a métodos e composições para o diagnóstico e tratamento da amiloidose, um grupo de distúrbios e anormalidades associadas com a proteína de amilóide tais como o mal de Alzheimer.
A amiloidose não é uma entidade de doença única mas ao
invés um grupo diverso de processos de doença progressivos caracterizados pelos depósitos de tecido extracelulares de uma proteína cerosa, equivalente a amido chamada de amilóide, que acumula em uma ou mais órgãos ou sistemas corporais. Conforme os depósitos de amilóide se acumulam, eles começam a interferir com a função normal do órgão ou sistema corporal. Existem pelo menos 15 tipos diferentes de amiloidose. As formas principais são amiloidose primária sem antecedente conhecido, amiloidose secundária a seguir de alguma outra condição e amiloidose hereditária.
A amiloidose secundária ocorre durante a infecção crônica ou doenças inflamatórias, tais como a tuberculose, uma infecção bacteriana chamada de febre do mediterrâneo familiar, infecções ósseas (osteomielite), artrite reumatóide, inflamação do intestino delgado (ileíte granulomatosa), doença de Hodgkin e lepra.
Os depósitos de amilóide incluem componente de amilóide P (pentagonal) (AP), uma glicoproteína relacionada com o amilóide P sérico (SAP) normal e glicosaminoglicanos (GAG) sulfatados, carboidratos complexos de tecido conectivo. Fibrilas de proteína de amilóide, que são responsáveis por cerca de 90 % do material de amilóide, compreende um de diversos tipos diferentes de proteínas. Estas proteínas são capazes de dobrar nas chamadas fibrilas de folha "de placa beta", uma configuração de proteína única que exibe sítios de ligação para o Vermelho do Congo resultando nas propriedades de tingimento únicas da proteína de amilóide.
Muitas doenças do envelhecimento são fundamentadas ou associadas com proteínas equivalentes a amilóide e são caracterizadas, em parte, pela formação de depósitos extracelulares de amilóide ou material equivalente a amilóide que contribuem para a patogênese, assim como a progressão da doença. Estas doenças incluem, mas não são limitadas a, distúrbios neurológicos tais como Mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, a deterioração cognitiva branda (MCI), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, a deterioração cognitiva branda (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson- Demência de Guam. Outras doenças que são fundamentadas ou associadas com as proteínas equivalentes a amilóide são a paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo a degeneração macular.
Embora a patogênese destas doenças possam ser diversas, os seus depósitos característicos freqüentemente contém muitos constituintes moleculares compartilhados. A um grau signifícante, isto pode ser atribuível à ativação local de caminhos pró inflamatórios levando deste modo à deposição concorrente de componentes de complemento ativados, reagentes de fase aguda, moduladores imunes e outros mediadores inflamatórios (McGeer et al., 1994).
O mal de Alzheimer (AD) é um distúrbio neurológico
primariamente considerado ser causado pelas placas de amilóide, um acúmulo de depósito anormal de proteínas no cérebro. O tipo mais freqüente de amilóide encontrado no cérebro de indivíduos afetados é composto primariamente de fibrilas Αβ. a evidência científica demonstra que um aumento na produção e acúmulo de proteína de beta-amilóide em placas leva à morte de célula nervosa, que contribui para o desenvolvimento e progressão da AD. A perda de células nervosas em áreas cerebrais estratégicas, por sua vez, causa a redução nos neurotransmissores e a deterioração da memória. As proteínas principalmente responsáveis pela carga de placa incluem proteína precursora de amilóide (APP) e duas presenilinas (presenilina I e presenilina II). A clivagem seqüencial da proteína precursora de amilóide (APP), que é constitutivamente expressada e catabolizada na maioria das células, pelas enzimas da β e γ secretase leva à liberação de um peptídeo de Αβ de 39 a 43 aminoácidos. A degradação de APPs provavelmente aumenta a sua propensão para agregar em placas. É especialmente o fragmento Αβ(1-42) que tem uma alta propensão de formar agregados devido a dois resíduos de aminoácido muito hidrofóbicos no seu terminal C. acredita-se portanto que o fragmento Αβ(1-42) esteja principalmente envolvido e responsável pelo início da formação de placa neurítica na AD e tenha, portanto, um alto potencial patológico. Existe portanto uma necessidade quanto a agentes para prevenir a formação de placas de amilóide e para difundir placas existentes na AD.
Os sintomas da AD manifestam-se lentamente e o primeiro sintoma pode ser apenas esquecimento brando. Neste estágio, indivíduos podem esquecer eventos recentes, atividades, os nomes de pessoas familiares ou coisas e podem não serem capazes de resolver problemas de matemática simples. Conforme a doença progride, os sintomas são mais facilmente percebidos e tornam-se sérios o bastante para fazer com que a pessoa com AD ou seus membros familiares procurem ajuda médica. Os sintomas em estágio brando de AD incluem esquecimento de como executar tarefas simples tais como arrumar-se e desenvolver problemas com falar, entender, ler ou escrever. Os pacientes com AD no último estágio podem se tornar ansiosos ou agressivos, podem perambular fora de casa e por fim necessitam de cuidado total. Presentemente, o único modo definido para diagnosticar AD é identificar placas e emaranhados no tecido cerebral em uma autópsia depois da morte do indivíduo. Portanto, os médicos podem fazer apenas um diagnóstico de AD "possível" ou "provável" enquanto a pessoa ainda está viva. Usando os métodos correntes, os médicos podem diagnosticar a AD corretamente em até 90 porcento do tempo usando diversas ferramentas para diagnosticar a AD "provável". Os médicos perguntam questões a cerca da saúde geral da pessoa, problemas médicos passados e a história de quaisquer dificuldades que a pessoa tem que carregar nas atividades diárias. Os testes de comportamento de memória, solução de problemas, atenção, contagem e linguagem fornecem informação sobre a degeneração cognitiva e os testes médicos tais como testes de sangue, urina ou fluido espinhal e varreduras cerebrais podem fornecer alguma outra informação.
O controle da AD consiste de tratamentos fundamentados na medicação e não fundamentados na medicação. Os tratamentos visando na mudança do curso subjacente da doença (retardo ou reversão da progressão) tem sido até agora amplamente insatisfatórios. Os remédios que restauram o déficit (defeito) ou mal funcionamento, nos mensageiros químicos das células nervosas (neurotransmissores), em particular os inibidores da colinesterase (ChEIs) tais como tacrina e rivastigmina, têm sido mostrados melhorar os sintomas. Os ChEIs impedem a degradação enzimática de neurotransmissores aumentando deste modo a quantidade de mensageiros químicos disponíveis para transmitir os sinais nervosos no cérebro.
Para algumas pessoas nos estágios iniciais e intermediários da doença, os medicamentos tacrina (COGNEX®, Morris Plains, NJ), donepezil (ARICEPT®, Tóquio, JP), rivastigmina (EXELON®, East Hanover, NJ) ou galantamina (REMINYL®, New Brunswick, NJ) podem ajudar a prevenir alguns sintomas de se tornarem piores por um tempo limitado. Um outro medicamento, a memantina (NAMENDA®, Nova Iorque, NY), foi aprovado para o tratamento de AD de moderada a severa. Medicações também estão disponíveis para tratar as manifestações psiquiátricas da AD. Também, alguns remédios podem ajudar a controlar sintomas de comportamento da AD tais como insônia, agitação, delírio, ansiedade e depressão. Tratar estes sintomas freqüentemente torna os pacientes mais confortáveis e torna seu cuidado mais fácil para os profissionais de saúde. Infelizmente, a despeito dos avanços de tratamento significantes que mostram que esta classe de agentes é compativelmente melhor do que um placebo, a doença continua a progredir e o efeito médio sobre o funcionamento mental tem sido apenas modesto. Muitos dos medicamentos usados na medicação da AD tais como, por exemplo, ChEIs também têm efeitos colaterais que incluem disfunção gastrointestinal, toxicidade hepática e perda de peso.
A demência de corpo de Lewy (LBD) é um distúrbio neurodegenerativo que pode ocorrer em pessoas mais velhas do que 65 anos de idade, que tipicamente causa sintomas de deterioração cognitiva (pensativo) e mudanças comportamentais anormais. Os sintomas podem incluir a deterioração cognitiva, sinais neurológicos, distúrbios do sono e insuficiência autonômica. A deterioração cognitiva é a característica que torna conhecida a LBD na maioria dos casos. Os pacientes têm episódios recorrentes de confusão que progressivamente pioram. A flutuação na capacidade cognitiva é freqüentemente associada com graus de variação de atenção e vigilância. A deterioração cognitiva e as flutuações de pensamento podem variar em minutos, horas ou dias. Os corpos de Lewy são formados a partir de proteínas de neurofilamentos fosforilados e não fosforilados; eles contêm a proteína sináptica alfa-sinucleína assim como ubiquitina, que está envolvida na eliminação de proteínas danificadas ou anormais. Além dos Corpos de Lewy, os neuritos de Lewy, que são corpos de inclusão nos processos celulares das células nervosas, também podem estar presentes. As placas de amilóide podem se formar nos cérebros de pacientes afligidos com DLB, entretanto estas tendem a serem menores em número do que as observadas em pacientes com o mal de Alzheimer. Os emaranhados neurofíbrilares, a outra marca micropatológica da AD, não são uma característica principal de DLB mas estão freqüentemente presentes além das placas de amilóide.
A esclerose lateral amiotrófica (ALS) é caracterizada pela degeneração dos neurônios motores superior e inferior. Em alguns pacientes com ALS, a demência ou afasia podem estar presentes (ALS-D). A demência é mais habitualmente uma demência frontotemporal (FTD) e muitos destes casos têm inclusões positivas em ubiquitina, negativas em tau em neurônios da convolução denteada e camadas superficiais dos lobos frontal e temporal.
A miosite de corpo de inclusão (IBM) é uma doença mutilante usualmente encontrada eem pessoas acima de 50 anos de idade, em que as fibras musculares desenvolvem inflamação e começam a atrofiar — mas em que o cérebro é poupado e os pacientes retêm sua capacidade mental completa. Duas enzimas envolvidas na produção da proteína de amilóide β foram descobertas estarem aumentadas dentro das células musculares de pacientes com esta doença muscular progressiva, mais comum de pessoas mais velhas, em que o amilóide-β também é aumentado.
Uma outra doença que está fundamentada ou associada com o acúmulo e depósito de proteína equivalente a amilóide é a degeneração macular.
A degeneração macular é uma doença ocular comum que causa a deterioração da mácula, que é a área central da retina (o tecido fino como papel na parte de trás do olho onde as células sensíveis à luz enviam os sinais visuais para o cérebro). A visão nítida, clara, 'direta' é processada pela mácula. O dano à mácula resulta no desenvolvimento de pontos cegos e visão borrada ou distorcida. A degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é uma causa principal de deterioração visual nos Estados Unidos e para as pessoas com idade acima de 65 é a causa principal de cegueira legal entre os Caucasianos. Aproximadamente 1,8 milhões de americanos na idade dos 40 e mais velhos têm AMD avançada e umas outras 7,3 milhões de pessoas com AMID intermediária estão em risco substancial para a perda de visão. O governo estima que em 2020 haverá 2,9 milhões de pessoas com AMD avançada. As vítimas da AMD são freqüentemente surpreendidas e frustradas ao descobrir quão pouco é conhecido a cerca das causas e tratamento desta condição de cegueira.
Existem duas formas de degeneração macular: degeneração macular seca e degeneração macular úmida. A forma seca, em que as células da mácula lentamente começam a se romper, é diagnosticada em 85 por cento dos casos de degeneração macular. Ambos os olhos são usualmente afetados pela AMD seca, embora um olho possa perder a visão enquanto o outro olho permanece inafetado. Drusen, que são depósitos amarelos sob a retina, são habitualmente sinais iniciais da AMD seca. O risco de desenvolver AMD seca ou AMD úmida avançadas aumenta como o número ou tamanho do aumento da drusen. É possível para a AMD seca avançar e causar perda de visão sem virar na forma úmida da doença; entretanto, também é possível para a AMD seca de estágio inicial mudar subitamente para a forma úmida.
A forma úmida, embora seja responsável por apenas 15 por cento dos casos, resulta em 90 por cento da cegueira e é considerada AMD avançada (não existe nenhum estágio inicial ou intermediário da AMD úmida). A AMD úmida é sempre precedida pela forma seca da doença. Conforme a forma seca piora, algumas pessoas começam a ter vasos sangüíneos anormais crescendo por detrás da mácula. Estes vasos são muito frágeis e vazarão fluido e sangue (por este motivo degeneração macular 'úmida'), causando dano rápido à mácula.
A forma seca de AMD inicialmente de modo freqüente causará visão levemente borrada. O centro da visão em particular pode depois se tornar borrado e esta região cresce maior conforme a doença progride. Nenhum sintoma pode ser observado se apenas um olho é afetado. Na AMD úmida, linhas retas podem parecer onduladas e a perda da visão central pode ocorrer rapidamente.
O diagnóstico da degeneração macular tipicamente envolve
um exame de olho dilatado, teste de acuidade visual e uma visualização do fundo do olho usando um procedimento chamado de fundoscopia para ajudar no diagnóstico da AMD e - se a AMD úmida é suspeita -a angiografía com fluoresceína também pode ser realizada. Se a AMD seca atinge os estágios avançados, não existe nenhum tratamento corrente para prevenir a perda de visão. Entretanto, uma fórmula de dose alta específica de antioxidantes e zinco pode retardar ou prevenir a AMD intermediária de progredir para o estágio avançado. Macugen® (injeção de pegaptanib sódico), fotocoagulação a laser e terapia fotodinâmica podem controlar o crescimento de vaso sangüíneo anormal e hemorragia na mácula, que é útil para algumas pessoas que têm AMD úmida; entretanto, a visão que já está perdida não será restaurada por estas técnicas. Se a visão já está perdida, auxiliares de visão baixa existem que podem ajudar a melhorar a qualidade de vida.
Um dos sinais mais iniciais da degeneração macular relacionada com a idade (AMD) é o acúmulo de depósitos extracelulares conhecidos como drusen entre a lâmina basal do epitélio pigmentado retinal (RPE) e membrana de Bruch (BM). Estudos recentes conduzidos por Anderson et al. têm confirmado que a drusen contém beta-amilóide. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256). Pesquisa em andamento continua com estudos explorando os
fatores ambientais, genéticos e dietéticos que possam contribuir para a AMD. Novas estratégias de tratamento também estão sendo exploradas, incluindo transplantes de célula retinal, medicamentos que impedirão ou retardarão o progresso da doença, terapia de radiação, terapias de gene, um chip computadorizado implantado na retina que possam ajudar a estimular a visão e agentes que impedirão o crescimento de novos vasos sangüíneos sob a mácula.
Um fator importante a considerar quando do desenvolvimento de novos medicamentos é a facilidade de uso para os pacientes alvo. A liberação de medicamento oral, - especificamente tabletes, cápsulas e géis moles -, são responsáveis por 70 % de todas as formas de dosagem consumidas por causa da conveniência do paciente, os desenvolvedores de medicamento concordam que os pacientes preferem a liberação oral ao invés de submeter-se eles próprios a injeções ou outras, formas mais invasivas de administração medicinal. As formulações que resultam em intervalos de dosagem baixa (isto é, uma vez ao dia ou liberação prolongada) também são preferíveis. A facilidade de administrar antibióticos nas formas de dosagem oral resulta em um aumento da aceitação do paciente durante o tratamento. O que é necessário são métodos e composições eficazes para
prevenir ou tratar as complicações associadas com amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson- Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas ou associadas com as proteínas equivalentes a amilóide tais como a paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabete de Início no Adulto; amilóideose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo a degeneração macular. Em particular o que é necessário são agentes capazes de neutralizar as manifestações fisiológicas da doença tais como a formação de placas associadas com a agregação de fibras do amilóide ou peptídeo equivalente a amilóide.
Os anticorpos anti-amilóide evocados pela inoculação de Αβμ 42 misturados com adjuvante completo ou incompleto de Freund foram relatados reduzir a carga de amilóide em camundongos transgênicos para o mal de Alzheimer humana (Schenk et al., 1999). A inoculação intraperitoneal de Αβ, .16 tetrapalmitoilado reconstituído em lipossomas a camundongos transgênicos NORBA evocou títulos significantes de anticorpos anti-amilóide, que foram relatados solubilizar fibras e placas de amilóide in vitro e in vivo. (Nicolau et al., 2002). Um mecanismo possível pelo qual a dissolução de placas de
amilóide e fibras ocorreu foi primeiro sugerido por Bard et al., (2000), que concluiu que os anticorpos opsonizaram as placas, que foram subseqüentemente destruídas pelos macrófagos da microglia. De Mattos et al., (2001) indicaram que um mAb direcionado contra o domínio central de β- amilóide foi capaz de ligar e completamente seqüestrar amilóide plasmático, Eles demonstraram que a presença destes mAbs em circulação mudou o equilíbrio de Αβ entre cérebro e plasma, favorecendo a depuração e catabolismo periféricos ao invés da deposição dentro do cérebro.
A terapia humana prolongada com anticorpos de roedor pode resultar em uma resposta antiglobulina que é detectável em cerca de 8 a 12 dias depois da administração e atinge um pico em cerca de 20 a 30 dias. Se uma tal resposta antiglobulina é encontrada, o tratamento deve ser descontinuado depois de não mais do que cerca de 10 dias e a retomada do tratamento em uma data posterior é usualmente impedida porque o mesmo levará ao início rápido de uma resposta antiglobulina secundária. Embora anticorpos de roedor compartilhem um grau considerável de conservação de seqüência com aquela de anticorpos humanos, existem muitas diferenças de seqüência de anticorpos entre roedores e seres humanos suficientes para que os anticorpos de roedor sejam imunogênicos em seres humanos. Este problema pode ser superado pela geração de anticorpos diretamente em seres humanos ou pela criação de 'humanizados' (anticorpos 'reformados' a.k.a.). Os anticorpos humanizados têm uma seqüência de aminoácido da região variável que contém as CDRs derivadas de roedor intercaladas nas seqüências de matriz humana ou equivalente à humana. Visto que a especificidade do anticorpo humanizado é fornecida pelas CDRs derivadas de roedor, seus resíduos devem ser usados essencialmente imutados com apenas modificações menores sendo permissíveis, que não interferem significantemente com a afinidade e especificidade do anticorpo para o seu antígeno alvo. Os resíduos de matriz podem ser derivados de qualquer primata ou, particularmente, de qualquer região variável humana ou pode ser uma combinação destes e a região variável planejada resultante seria considerada reformada.
Para maximizar a probabilidade de que a afinidade será retida no anticorpo reformado é importante fazer uma seleção apropriada da região de matriz. E conhecido que as seqüências de matriz servem para manter as CDRs na sua orientação espacial correta para a interação com antígeno e que os resíduos de matriz podem algumas vezes participar mesmo na ligação de antígeno. De modo a manter a afinidade do anticorpo ao seu antígeno é vantajoso selecionar seqüências de matriz humanas que sejam mais similares às seqüências das matrizes de roedor. Depois pode ser ainda necessário substituir um ou mais aminoácidos na seqüência de matriz humana com o resíduo correspondente na matriz de roedor para evitar perdas com a afinidade. Esta substituição pode ser ajudada pela modelagem com computador.
A presente invenção fornece novos métodos e composições que compreendem anticorpos altamente específicos e altamente eficazes, particularmente anticorpos quiméricos incluindo fragmentos destes, mais particularmente anticorpos parcial ou completamente humanizados incluindo fragmentos destes, tendo a capacidade para reconhecer especificamente e ligar aos epítopos específicos de uma faixa de antígenos de antígenos de β- amilóide, que podem ser apresentados ao anticorpo em uma forma monomérica, dimérica, etc, uma forma polimérica, na forma de um agregado, fibras, filamentos ou na forma condensada de uma placa. Os anticorpos permitidos pela divulgação da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento da amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson- Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas ou associadas com a proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose tipo Holandês, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabete de Início no Adulto; amilóideose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo degeneração macular, para mencionar apenas umas poucas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos e mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distinto na proteína de β-amilóide em que o dito um, o dito pelo menos dois e o dito pelo menos três sítios de ligação cada um compreende pelo menos um ou dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo.
Em particular, o anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou o anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção liga-se a pelo menos dois, particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de β-amilóide em que pelo menos dois dos três sítios de ligação distintos compreendem pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo e pelo menos um dos três sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido. Os pelo menos dois sítios de ligação distintos que
compreendem pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo estão localizados em proximidade imediata entre si no antígeno, separados e/ou flanqueados em pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor como comparado com os ditos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, formando assim um epítopo descontínuo conformacional.
Os pelo menos três sítios de ligação distintos que compreendem pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos e pelo menos um resíduo de aminoácido, respectivamente, que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo estão localizados em proximidade imediata entre si no epítopo, separados e/ou flanqueados em pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou em um grau significantemente menor quando comparado com os resíduos de aminoácido, que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, formando assim um epítopo descontínuo conformacional.
Em particular, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β- amilóide em que o dito pelo menos um ou os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos representando, um primeiro sítio de ligação são -Phe-Phe- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo (SEQ ID NO: 9):
Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6, em que
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp,
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa3, Xaa4, Xaa5 e Xaa6 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado com o sítio de ligação -Phe-Phe-.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que
Xaa3 é Val ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa4 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala;
Xaa5 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu;
Xaa6 é Gln ou Asp, mas particularmente Asp.
Em particular, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo é fornecido, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β- amilóide em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos representando um primeiro sítio de ligação são -Phe-Phe- e o pelo menos um resíduo de aminoácido é - His- embutido dentro da seguinte seqüência de núcleo:
Xaa1 -His-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Phe-Phe-Xaa7 -Xaa8-Xaa9-, em que
Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu e Ile
Xaa8 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Gln e Asp,
Xaa9 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa1, Xaa3, Xaa6i Xaa7j Xaa8 e Xaa9j não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau menor a significantemente menor quando comparado com o sítio de ligação -His- e o -Phe-Phe-, respectivamente.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que
Xaa3 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;
Xaa4 é Lys
Xaas é Leu
Xaa6 é Val ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa7 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala;
Xaa8 é Gln ou Asp, mas particularmente Glu; e
Xaa9 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, que reconhecem e se ligam a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de β-amilóide, em que o dito pelo menos um ou os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos representando um segundo sítio de ligação são -Lys-Leu- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo (SEQ ID NO: 10):
Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3 em que
Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg;
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou em um grau menor a grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação -Lys-Leu-.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, que reconhecem e se ligam a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos um e os pelo menos dois aminoácidos consecutivos, que são separados em pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado aos resíduos de aminoácido predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, são -His- e -Lys-Leu-, respectivamente, embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8- em que Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp,
Xaa« é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp
e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3s Xaa6, Xaa7, Xaa8 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou em um grau menor a grau signifícantemente menor quando comparado ao -His- e o sítio de ligação -Lys-Leu-, respectivamente.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que
Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;
Xaa3 é Val ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa4 é Phe
Xaa5 é Phe
Xaa6 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala;
Xaa7 é Glu ou Asp, mas particularmente Gln; e
Xaa8 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, que reconhecem e se ligam a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína de β-amilóide em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois aminoácidos consecutivos são separados em pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou a um grau signifícantemente menor do que os ditos resíduos de aminoácido consecutivos, que são -Phe-Phe- e -Lys- Leu-, respectivamente, representando um primeiro e segundo sítios de ligação embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo: Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6, em que
Xaai é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg;
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp,
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5 e Xaa6 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou em um grau menor a grau significantemente menor quando comparado aos sítios de ligação -Lys-Leu- e -Phe-Phe-, respectivamente.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, que reconhecem e se ligam a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de β-amilóide em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos um e os pelo menos dois aminoácidos consecutivos são separados em pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado aos resíduos de aminoácido, que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo e em que os ditos resíduos de aminoácido são -His- e -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente, embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6, em que Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Gln e Asp,
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa65 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou em um grau menor a grau significantemente menor quando comparado ao -His-, os - sítio de ligação Lys-Leu- e -Phe-Phe-, respectivamente.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que
Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln; Xaa3 é Val ou Leu, mas particularmente Vai; Xaa4 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala; Xaa5 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e Xaa6 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp. Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, que reconhecem e se ligam a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois aminoácidos consecutivos são separados em pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor do que os ditos resíduos de aminoácido consecutivos, que são -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente, representando um primeiro e segundo sítios de ligação embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
XaarXaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6, em que Xaaj é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg;
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Vai, Ala, Leu, Met, Phe, norleucina e Ile Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que
consiste de Ala, Vai, Leu e lie;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp,
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2j Xaa3, Xaa4, Xaa5 Xaa6t não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou em um grau menor a grau significantemente menor quando comparado aos sítios de ligação -Lys-Leu- e -Phe-Phe, respectivamente.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que
Xaa1 é His ou Arg, mas particularmente His; Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln; Xaa3 é Val ou Leu, mas particularmente Vai; Xaa4 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala;
Xaa5 é Gln ou Asp, mas particularmente Glu; e
Xaa6 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp.
Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos que reconhecem e se ligam a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína de amilóide B em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, que são -Phe-Phe-Ala-Gln-, particularmente -Phe-Phe- Ala-, mas especialmente Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente e em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos exibem a seqüência de aminoácido -Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-mostrada na SEQ ID NO: 7 e seqüência de aminoácido His-Gln-Lys-Leu-Val- mostrada na SEQ ID NO: 8, respectivamente.
Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, que reconhecem e se ligam a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína β-amilóide em que o dito pelo menos um ou os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, que são -Phe-Phe- e - Lys-Leu- e -His-, respectivamente, em que os ditos sítios de ligação distintos são embutidos na seqüência de aminoácido -Val-Phe-Phe-Ala-Glu- e seqüência de aminoácido -His-Gln-Lys-Leu-Vai-, respectivamente.
Em uma outra forma de realização da invenção, o anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo compreende um sítio de reconhecimento e ligação de antígeno que reconhece e se liga a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína de β-amilóide em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos dentro da seqüência de aminoácido dada nas SEQ ID NOs: 7 e 8, respectivamente, em que os ditos resíduos de aminoácido consecutivos, particularmente -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína de β-amilóide.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção são fornecidos, que se liga aos 4 sítios de ligação distintos na proteína de β- amilóide em que os ditos 4 sítios de ligação distintos incluem 2 sítios de ligação cada um compreendendo um resíduo de aminoácido e 2 sítios de ligação cada um compreendendo dois resíduos de aminoácido consecutivos, resíduos estes que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os ditos 4 sítios de ligação distintos estão localizados em proximidade imediata entre si na proteína de β-amilóide e em que os ditos 4 sítios de ligação são separados em pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou envolvido na ligação mas a um grau significantemente menor quando comparado com o dito um resíduo de aminoácido e os ditos dois resíduos de aminoácido consecutivos dos 4 sítios de ligação distintos formando assim um epítopo descontínuo conformacional.
Em particular, o primeiro dos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo é -Lys- Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos é -Phe-Phe-, o primeiro dos resíduos de aminoácido únicos é -His- e o segundo dos resíduos de aminoácido únicos é -Asp- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
- Xaar His-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Asp-Xaa6 em que
Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg, mas particularmente His;
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln, mas particularmente Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie, particularmente Vai;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie, particularmente Ala;
Xaas é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp, particularmente Glu;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie, particularmente Vai; e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaah Xaa2, Xaa3, Xaa4j Xaa5, Xaa6, não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou são envolvidos na ligação mas a um grau significantemente menor quando comparado com os sítios de ligação -His-, -Asp-, o -Lys-Leu e o -Phe-Phe-.
Em um forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção, que se liga a 4 sítios de ligação distintos na proteína de β-amilóide, em que os ditos 4 sítios de ligação distintos incluem dois sítios de ligação cada um compreendendo um resíduo de aminoácido e dois sítios de ligação cada um compreendendo dois resíduos de aminoácido consecutivos, em que o primeiro dos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo é -Lys-Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos é -Phe-Phe-, o primeiro dos resíduos de aminoácido únicos é -His- e o segundo dos resíduos de aminoácido únicos é - Asp- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
XaarHis-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Asp-Xaa6 em que
Xaaj é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg, mas particularmente His;
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln, mas particularmente Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie, particularmente Vai;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie, particularmente Ala; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que
consiste de Glu e Asp, particularmente Glu;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie, particularmente Vai; e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4j Xaa5, Xaa6, não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou estão envolvidos na ligação mas a um grau significantemente menor quando comparado com os sítios de ligação -His-, -Asp-, o -Lys-Leu e o -Phe-Phe-.
Em uma forma de realização específica da invenção, os sítios de reconhecimento e ligação como aqui definidos antes estão formando um epítopo conformacional descontínuo localizado em uma região da proteína de amilóide β entre os resíduos de aminoácido de 12 a 24, particularmente entre os resíduos de 14 a 23, mais particularmente entre os resíduos de aminoácido 14 e 20, em que os pelo menos dois sítios de reconhecimento e ligação distintos cada um compreendendo pelo menos 2 resíduos de aminoácido, estão localizados nas posições 16 e 17 e nas posições 19 e 20, respectivamente e em que o pelo menos um sítio de reconhecimento e ligação distinto que compreende pelo menos 1 resíduo de aminoácido está localizado na posição 14, resíduos estes que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína amilóide β e em que os ditos sítios de reconhecimento e ligação distintos estão pelo menos em um lado flanqueado pelos resíduos de aminoácido, particularmente os resíduos 21 e 22 e separados por um resíduo de aminoácido localizado na posição 15 e 18, resíduos de aminoácido estes que não estão diretamente envolvidos na ligação do antígeno ou, pelo menos, a um grau substancialmente menor.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção o dito pelo menos três sítios de reconhecimento e ligação distintos são flanqueados em ambos os lados pelos resíduos de aminoácido, particularmente os resíduos 12 e 13 e os resíduos 21 e 22 e são separados por um resíduo de aminoácido localizado na posição 15 e 18, resíduos de aminoácido estes que não estão diretamente envolvidos na ligação do antígeno ou, pelo menos, a um grau substancialmente menor.
Em um forma de realização específica, os ditos resíduos de aminoácido consecutivos, particularmente -Lys-Leu- nas posições 16 e 17 e - Phe- Phe- nas posições 19 e 20, que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína de amilóide β, estão embutidos na seguinte região de núcleo:
Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Em uma outra forma de realização específica, os ditos resíduos de aminoácido, particularmente -Lys-Leu- nas posições 16 e 17 e -Phe- Phe- nas posições 19 e 20 e -His- na posição 14, que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína de amilóide β, estão embutidos na seguinte região de núcleo:
Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp- Val- 1 Glv- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos que compreende na Região Variável de Cadeia leve e de cadeia pesada, respectivamente, pelo menos uma CDR de origem não humana, particularmente duas CDRs de origem não humana, mais particularmente três CDR de origem não humana, embutidos em uma ou mais regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e, opcionalmente, uma região constante derivada de um anticorpo de fonte humana ou primata, anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo estes que são capazes de reconhecer e ligar especificamente proteína de amilóide β, particularmente um peptídeo monomérico de amilóide β, mais particularmente um peptídeo polimérico de amilóide β, ainda mais particularmente fibras, fibrilas ou filamentos de amilóide β em isolação ou como parte de uma placa de amilóide β, em um epítopo que compreende a seguinte seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 11):
Xaai-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe- Xaa4-Xaa5 -Xaa6, em que Xaai é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, mas particularmente His;
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln, mas particularmente Gln; e
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Vai, Leu e lie, mas particularmente Vai;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala e Vai, mas particularmente Ala;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp, mas particularmente Glu;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Gln e Asp, mas particularmente Asp.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos que compreendem na Região Variável de Cadeia leve e de cadeia pesada, respectivamente, pelo menos uma CDR de origem não humana, particularmente duas CDRs de origem não humana, mais particularmente três CDR de origem não humana, embutidas em uma ou mais regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e, opcionalmente, uma região constante derivada de um anticorpo de fonte humana ou primata, anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo estes que são capazes de reconhecer e ligar especificamente a proteína de amilóide β, particularmente um peptídeo monomérico de amilóide β, mais particularmente um peptídeo polimérico de amilóide β, ainda mais particularmente fibras, fibrilas ou filamentos de amilóide β em isolação ou como parte de uma placa de amilóide β, em um epítopo que compreende a seguinte seqüência de aminoácido:
His-Xaa2-Lys-Leu Xaa3 Phe-Phe- Xaa4-Xaa5-Xaa6, em que Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln, mas particularmente Gln; e
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Vai, Leu e lie, mas particularmente Vai;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala e Vai, mas particularmente Ala; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que
consiste de Glu e Asp, mas particularmente Glu;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Gln e Asp, mas particularmente Glu; e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2j Xaa3j Xaa4, Xaa5, Xaa6, não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau menor quando comparado aos sítios de ligação -His- e ao -Lys-Leu- e ao -Phe-Phe-.
Em uma forma de realização específica da invenção, a CDR de origem não humana é obtida de anticorpo doador, mas particularmente de anticorpo doador de murino, incitado contra um fragmento de antígeno que não contém dito sítio de ligação distinto. Esta mudança na região epitópica pode ter sido causada pelo menos parcialmente pelo uso de uma construção antigênica supramolecular compreendendo um peptídeo antigênico correspondente à seqüência de aminoácidos do peptídeo β-amilóide, particularmente de peptídeo β-amilóide ΑβΜ6, modificado com uma unidade hidrofílica tal como, por exemplo, polietileno glicol (PEG), caracterizado pelo fato de que dita unidade hidrofílica é covalentemente ligada a cada um dos términos do peptídeo antigênico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tal como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteína ou qualquer outro aminoácido adequado ou análogo de aminoácido capaz de servir como um dispositivo de conexão para acoplar a unidade hidrofílica ao fragmento de peptídeo, como descrito neste lugar abaixo no processo de imunização. Quando um PEG é usado como a unidade hidrofílica, os términos livres de PEG são covalentemente ligados a fosfatidiletanolamina ou qualquer outro composto adequado para funcionar como o elemento de ancoragem, por exemplo, para encaixar a construção antigênica na bicamada de um lipossomo como descrito neste lugar.
Em particular, a CDR de origem não humana é obtida de um anticorpo doador de murino que exibe as propriedades características de ACI- 01-Ab7C2 (também chamado de "mC2" por todo o pedido) depositado em Ol de dezembro de 2005 com o "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, sob as condições do Tratado de Budapest sob o acesso n- DSM ACC2750).
Em um forma de realização da invenção, a CDR de origem não humana é obtida a partir de anticorpo doador de murino ACI-O l-Ab7C2 (também chamado de "mC2" por todo o pedido) depositado em 01 de dezembro de 2005 com o "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Branuschweig, sob as condições do Tratado de Budapest sob o acesso n2 DSM ACC2750).
Também o uso de lipídeo A como parte do protocolo de imunização pode ter contribuído para uma mudança na região epitópica.
Em um forma de realização específica, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo que compreendem integrado nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata pelo menos um peptídeo com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, em que o dito anticorpo humanizado compreende integrado nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos um peptídeo com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR). Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz
respeito a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, em que o dito anticorpo humanizado compreende integrado nas regiões de matriz de cadeia leve derivadas de ser humano ou primata um peptídeo com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) que compreende integrado nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata pelo menos um peptídeo com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) que compreende integrado nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata pelo menos um peptídeo com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
A invenção diz respeito ainda a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, que compreende integrado nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos, peptídeos estes que são diferentes e exibem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo, em particular, se as pelo menos duas CDRs presentes são ambas CDRs da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), pelo menos uma das ditas CDRs deve ser a CDRl representada pela SEQ ID NO: 4.
Também é compreendido pela invenção um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo que compreendem integrados nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo 20 menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo em que a mesma CDR 25 não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) que compreende integrados nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a 5 um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, que compreendem integrados nas regiões de matriz de cadeia leve derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 10 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), que tem integrados nas regiões de matriz de cadeia leve derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da 15 SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo e, em particular, pelo menos uma das ditas CDRs deve ser a CDRl representada pela SEQ ID NO: 4.
A invenção também diz respeito a um anticorpo humanizado
ou um fragmento do mesmo, que compreendem integrado nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da 25 Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), particularmente na ordem indicada acima.
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) que compreende integrados nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), particularmente na ordem indicada acima.
Também é compreendido pela invenção um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo que compreendem integrados nas regiões de matriz de cadeia leve derivadas de ser humano ou primata peptídeo com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), particularmente na ordem indicada acima.
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) que compreende integrados nas regiões de matriz de cadeia leve derivadas de ser humano ou primata peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), particularmente na ordem indicada acima.
A invenção também diz respeito a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, que compreende integrados nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata pelo menos três peptídeos com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo. Em uma outra forma de realização a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, anticorpo este que compreende integrados nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata pelo menos quatro peptídeos com uma seqüência de aminoácido 5 selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve 10 (LCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, que 15 compreende integrados nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata pelo menos cinco peptídeos com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ 20 ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), mas particularmente um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz
respeito a um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, que compreende integrado nas regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl, SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em uma forma de realização específica, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado, uma Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou um fragmento do mesmo, em que o dito anticorpo humanizado, Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou fragmento do mesmo compreendem integrado nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos um peptídeo com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado, uma Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou um fragmento do mesmo, em que o dito anticorpo humanizado, Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou fragmento do mesmo compreende integrado nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos um peptídeo com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado, Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou um fragmento do mesmo, anticorpo, Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou fragmento do mesmo estes que compreendem integrados nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl e SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado, uma Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou um fragmento do mesmo, anticorpo, Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou fragmento do mesmo estes que compreendem integrado nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata 5 pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado, uma Região Variável de Cadeia Pesada 10 (HCVR) ou um fragmento do mesmo, anticorpo, Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) ou fragmento do mesmo estes que compreendem integrados nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 e SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 da 15 Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado, uma Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) ou um fragmento do mesmo, anticorpo, Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) ou fragmento do mesmo estes que compreendem integrados nas 20 regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl e SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em uma outra forma de realização específica, a invenção diz 25 respeito a um anticorpo humanizado, uma Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) ou um fragmento do mesmo, anticorpo, Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) ou fragmento do mesmo estes que compreendem integrados nas regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata pelo menos dois peptídeos com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl e SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Ainda é compreendido pela invenção um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo; em que tanto a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) quanto a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) do anticorpo C2 de camundongo cada uma contribui com pelo menos uma de suas regiões de CDR para as pelo menos duas regiões de CDR do anticorpo humanizado. O anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo resultantes podem compreender assim
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl (LCVR);
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl (LCVR);
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 que representa a CDRl (LCVR);
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 (LCVR);
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 (LCVR);
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 que representa a CDR2 (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 (LCVR);
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 que representa a CDRl (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 (LCVR); - pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 que representa a CDR2 (LCVR);
- pelo menos uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 que representa a CDR3 (HCVR) em combinação com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 que representa a CDR3 (LCVR).
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo como aqui descrito antes, anticorpo este que compreende uma região constante de cadeia leve e/ou uma de cadeia pesada de origem humana ou de primata.
Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, em que pelo menos um, particularmente pelo menos um mas não mais do que 5, mais particularmente pelo menos um mas não mais do que 4, ainda mais particularmente pelo menos um mas não mais do que 3, mas especialmente pelo menos um mas não mais do que 2, dos aminoácidos representativos das regiões de CDR de cadeia leve e/ou de cadeia pesada como dados nas SEQ ID NOs: 1 a 6 é mudado através de uma substituição conservativa tal que o anticorpo mantenha a sua funcionalidade completa.
Em particular, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, em que na CDR2 da Região Variável de Cadeia leve (LCVR) como dada na SEQ ID NO: 5, o Lys na posição Kabat 50 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Arg, Gln e Glu, particularmente por Arg.
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia leve (LCVR) em que na CDR2 como dada na SEQ ID NO: 5, o Lys na posição Kabat 50 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Arg, Gln e Glu, particularmente por Arg.
Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a 5 um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, em que na CDR2 da Região Variável de Cadeia leve (LCVR) como dado na SEQ ID NO: 5, o Ser na posição Kabat 53 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn ou Thr, mas particularmente por Asn.
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável
de Cadeia leve (LCVR) em que na CDR2 como dada na SEQ ID NO: 5, o Ser na posição Kabat 53 é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn ou, Thr, mas particularmente por Asn.
Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo 15 quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) tem uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntico à seqüência dada na SEQ ID NO: 15 e 16, respectivamente.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo
quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) tem uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntica à seqüência dada na SEQ ID NO: 12 e 13, respectivamente.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões de CDR da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) têm uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntica à região de CDR correspondente como dada na SEQ ID NO: 1 a 3.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que pelo menos 5 duas, mas especialmente três, das regiões de CDR da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) têm uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntica à região de CDR correspondente como dada na SEQ ID NO: 4-6.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz 10 respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção como aqui descrito antes em que a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) tem uma seqüência de aminoácido que é 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico à seqüência dada na 15 SEQ ID NO: 15 e 16, respectivamente.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção como aqui descrito antes em que a Região Variável de Cadeia Leve 20 (LCVR) tem uma seqüência de aminoácido que é 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico à seqüência dada na SEQ ID NO: 12 e 13, respectivamente.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um 25 anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção como aqui descrito antes, em que pelo menos uma, particularmente pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões de CDR da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) têm uma seqüência de aminoácido que é 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à região de CDR correspondente como dada nas SEQ ID NO: 1 a 3. Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção como aqui descrito antes, em que pelo menos uma, particularmente pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões de CDR da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) têm uma seqüência de aminoácido que é 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica à região de CDR correspondente como dada na SEQ ID NO: 4 a 6.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes, em que pelo menos um dos aminoácidos representativos das seqüências de matriz aceitadora obtidas das seqüências Vh e Vk da linha germinativa humana, respectivamente é mudada através de uma substituição a um aminoácido da região correspondente do anticorpo de murino ACI-O l-Ab7C2 ou uma substituição conservativa para esta.
Em particular, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que a Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, He, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu tal como mostrado na SEQ ID NO: 15.
A invenção diz respeito ainda a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Arg na posição de Kabat 94 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Set e Thr, especialmente apenas por Ser tal como mostrado na SEQ ID NO: 15.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIH da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Ph; particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Set e Thr, especialmente apenas por Ser tal como mostrado na SEQ ID NO: 15.
A invenção diz respeito ainda a uma Região Variável de Cadeia Leve e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Leve, respectivamente,, em que o Gln na posição de Kabat 45 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vk da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VkII da Região Variável de Cadeia Leve é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Lys, Arg, Gln e Asn, particularmente por Lys e Arg, especialmente apenas por Lys.
A invenção diz respeito ainda a uma Região Variável de Cadeia Leve e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Leve, respectivamente, em que o Tyr na posição de Kabat 87 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vk da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VkII da Região Variável de Cadeia Leve é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Phe, Leu, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu e Ph; especialmente apenas por Phe.
A invenção diz respeito ainda a uma Região Variável de Cadeia Leve e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Leve, respectivamente, em que o Lys na posição de Kabat 5 50 na região CDR2 obtida de um anticorpo monoclonal de camundongo, particularmente anticorpo de murino ACI-O l-Ab7C2, tal como mostrado na SEQ ID NO: 12 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Arg, Gin, His e Asn, especialmente apenas por Arg.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz 10 respeito a uma Região Variável de Cadeia Leve e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Leve, respectivamente, em que o Asn na posição de Kabat 53 na Região de CDR2 obtida de um anticorpo monoclonal de camundongo, particularmente anticorpo de murino ACI-O l-Ab7C2, tal como mostrado na SEQ ID NO: 12 é substituído por um 15 aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; mas especialmente Ser.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado, em que o Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa 20 humana de KABAT subgrupo VhIH da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, He, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT 25 subgrupo VhIH da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ser e Thr, especialmente apenas por Ser como mostrado na SEQ ID NO: 15 e o Tyr na posição de Kabat 87 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vk da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VkII da Região Variável de Cadeia Leve é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Phe, Leu, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu e Phe, especialmente apenas por Phe.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrado na SEQ ID NO: 15 é substituído por Leu.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Arg na posição de Kabat 94 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por Ser tal como mostrado na SEQ ID NO: 15.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por Leu e Ile, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por Ser tal como mostrado na SEQ ID NO: 15.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Leve e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Tyr na posição de Kabat 87 na seqüência de matriz aceitadora obtida da seqüências VK da linha germinativa de KABAT subgrupo VkII da Região Variável de Cadeia Leve é substituído por Phe.
Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por Leu e Ile, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por Ser tal como mostrado na SEQ ID NO: 15 e o Tyr na posição de Kabat 87 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vk da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VkII da Região Variável de Cadeia Leve é substituído por Phe.
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ser e Thr, especialmente apenas por Ser tal como mostrado na SEQ ID NO: 15 e em que o Lys na posição de Kabat 50 na Região de CDR2 obtida de um anticorpo monoclonal de camundongo, particularmente anticorpo de murino ACI-01-Ab7C2, é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Arg, Gin, His e Asn, especialmente apenas por Arg.
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a uma Região Variável de Cadeia Pesada e a um anticorpo humanizado que compreende esta Região Variável de Cadeia Pesada, respectivamente, em que o Trp na posição de Kabat 47 na seqüência de matriz aceitadora obtida das seqüências VH da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VhIII da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e Ile, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ser e Thr, especialmente apenas por Ser tal como mostrado na SEQ ID NO: 15 e em que o Asn na posição de Kabat 53 na Região de CDR2 obtida de um anticorpo monoclonal de camundongo, particularmente anticorpo de murino ACI-O l-Ab7C2, é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e Ile; mas especialmente Ser.
Em uma forma de realização específica, a invenção diz respeito à Região Variável de Cadeia leve da SEQ ID NO: 12.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia leve da SEQ ID NO: 12.
Em uma forma de realização específica, a invenção diz respeito à Região Variável de Cadeia leve incluindo seqüências de sinal como mostradas na SEQ ID NO: 13.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia leve completa incluindo seqüências de sinal como mostradas na SEQ ID NO: 13.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia leve da SEQ ID NO: 12 e a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 14.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia leve completa da SEQ ID NO: 13 e a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 14.
Em uma forma de realização específica, a invenção diz respeito à Região Variável de Cadeia pesada da SEQ ID NO: 15.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um
anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia pesada da SEQ ID NO: 15.
Em uma forma de realização específica, a invenção diz respeito à Região Variável de Cadeia pesada incluindo seqüências de sinal como mostradas na SEQ ID NO: 16.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia pesada completa incluindo seqüências de sinal como mostradas na SEQ ID NO: 16.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um
anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia pesada da SEQ ID NO: 15 e a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, um anticorpo humanizado é fornecido, que compreende a Região Variável de Cadeia pesada da SEQ ID NO: 16 e a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.
Em uma forma de realização o anticorpo humanizado de acordo com a invenção e como aqui descrito, na co-incubação com um peptídeo monomérico Αβ tendo pelo menos 30, particularmente pelo menos 35, mais particularmente pelo menos 38, ainda mais particularmente pelo menos 40 resíduos de aminoácido e/ou um peptídeo amilóide polimérico solúvel Αβ que compreende uma pluralidade das ditas unidades monoméricas 5 Αβ, mas especialmente com um peptídeo amilóide monomérico Αβι.42 e/ou um polimérico Αβ solúvel que compreende uma pluralidade das ditas unidades monoméricas Αβι.42, particularmente em uma razão de concentração molar de anticorpo para Αβι_42 de até 1:1000, particularmente de até 1:500, mais particularmente de até 1:300, ainda mais particularmente de até 1:200, 10 mas especialmente a uma razão de concentração molar de 1:10 e 1:100, inibe a agregação dos monômeros Αβ às fibrilas poliméricas moleculares altas.
Em particular, a co-incubação do anticorpo de acordo com a invenção com peptídeos de amilóides monoméricos e/ou amilóides poliméricos solúveis é realizada por 24 horas a 60 horas, particularmente por 15 30 horas a 50 horas, mais particularmente por 48 horas, mas especialmente 24 horas, a uma temperatura de 28° C a 40° C, particularmente de 32° C e 38° C, mais particularmente a 37° C.
Em uma forma de realização específica da invenção, a co- incubação com polipetídeos de amilóide monomérico e/ou amilóide polimérico solúveis é realizada por 24 horas a uma temperatura de 37° C.
Em particular, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste liga-se ao peptídeo monomérico Αβι_42 e/ou peptídeo de amilóide Αβ polimérico solúvel que 25 compreende uma pluralidade das ditas unidades monoméricas de Αβι.42 e, na co-incubação com o peptídeo monomérico Αβι_42 e/ou peptídeo de amilóide Αβ polimérico solúvel que compreendem uma pluralidade das ditas unidades monoméricas de Αβι_42 inibe a agregação dos monômeros e/ou polímeros Αβ às fibrilas poliméricas moleculares altas. Em uma forma de realização, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste inibe a agregação dos monômeros Αβ e/ou polímeros Αβ solúveis que compreendem uma pluralidade das ditas unidades monoméricas Αβ às fibrilas poliméricas moleculares altas em pelo menos 50 %, particularmente em pelo menos 60 %, particularmente em pelo menos 65 %, mais particularmente em pelo menos 75 %, ainda mais particularmente em pelo menos 80 %, especialmente apenas em pelo menos 85 % a 90 % ou mais quando comparado com os respectivos monômeros de peptídeo amilóide incubados em tampão (controle), a uma razão de concentração molar de anticorpo para Αβ^ de até 1:1000, particularmente a uma razão de concentração molar de 1:10 e 1:100, mas especialmente a uma razão de concentração molar de 1:10.
Em uma forma de realização específica da invenção, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste inibe a agregação dos monômeros de Αβ e/ou os polímeros solúveis de Αβ que compreendem uma pluralidade das ditas unidades monoméricas de Αβ às fibrilas poliméricas moleculares altas em pelo menos 30 % a uma razão da concentração molar de anticorpo para Αβι.42 de 1:100.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste inibe a agregação dos monômeros Αβ e/ou polímeros solúveis Αβ que compreendem uma pluralidade das ditas unidades monoméricas Αβ às fibrilas poliméricas moleculares altas em pelo menos 80 % a uma razão de concentração molar de anticorpo para Αβ1-42 de 1:10.
A ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e como aqui descrito aos peptídeos monoméricos e/ou poliméricos amilóideogênicos mas, particularmente, à forma de amilóide (1-42) leva à inibição da agregação dos peptídeos amilóideogênicos monoméricos e/ou poliméricos às fibrilas ou filamentos moleculares altos. Através da inibição da agregação de peptídeos monoméricos e/ou poliméricos amilóideogênicos os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de prevenir ou diminuir a formação de placas de amilóide, particularmente a forma de amilóide (1-42), que é conhecida tomar-se insolúvel pela mudança de conformação secundária e ser a parte principal das placas de amilóide nos cérebros de animais ou seres humanos doentes.
O potencial de inibição da agregação do anticorpo de acordo com a invenção pode ser determinado por qualquer método adequado conhecido na técnica, particularmente pela ultracentrifugação de gradiente de densidade seguida por uma análise de sedimentação de SDS-PAGE em um gradiente pré formado e/ou por um ensaio fluorescente de tioflavina T (Th-T).
Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo, particularmente um anticorpo humanizado como aqui descrito incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que na co-incubação, particularmente a uma razão de concentração molar de 1:5 e 1:1000, particularmente de 1:10 e 1:500, mais particularmente a uma razão de 1:10 a 1:300, ainda mais particularmente a uma razão de 1:10 e 1:100, com fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico molecular alto pré formados, formados pela agregação de peptídeos monoméricos Αβ tendo pelo menos 30, particularmente pelo menos 35, mais particularmente pelo menos 38, ainda mais particularmente pelo menos 40 resíduos de aminoácido e, mas especialmente peptídeos monoméricos Ap1^42, é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré formados em pelo menos 20 %, particularmente em pelo menos 30 %, mais particularmente em pelo menos 35 %, ainda mais particularmente em pelo menos 40 %, especialmente apenas em pelo menos 50 % ou mais. Em uma forma de realização específica da invenção, a inibição da agregação e o potencial de desagregação do anticorpo, respectivamente, são determinados pela ultracentrifugação de gradiente de densidade seguida por uma análise de sedimentação de SDS-PAGE em um gradiente pré formado.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, a inibição da agregação e o potencial de desagregação do anticorpo, respectivamente, são determinados pelo ensaio fluorescente de tioflavina T (Th-T).
Em uma outra forma de realização específica, o anticorpo de acordo com a invenção é co-incubado com amilóide pré formado com fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico molecular alto por 12 horas a 36 horas, particularmente por 18 horas a 30 horas, mais particularmente por 24 horas a uma temperatura de 28° C a 40° C, particularmente de 32° C a 38° C, mais particularmente a 37° C.
Em particular, a co-incubação com fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico molecular alto pré formado é feita por 24 horas a uma temperatura de 37° C.
Em uma forma de realização específica da invenção, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré formados em pelo menos 24 % a uma razão de concentração molar de anticorpo para Αβ1-42 de 1:100.
Em uma outra forma de realização específica da invenção, o anticorpo, particularmente o anticorpo humanizado de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré formados em pelo menos 32 % a uma razão de concentração molar de anticorpo para Αβ I -42 de 1:10. Através da desagregação de fibrilas ou filamentos poliméricos amilóideogênicos os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de prevenir ou diminuir a formação de placas de amilóide que leva a um alívio dos sintomas associados com a doença e um retardo ou reversão da sua progressão.
Consequentemente, é uma outra forma de realização da invenção fornecer um anticorpo, particularmente um anticorpo humanizado, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste como aqui descritos, anticorpo este que é capaz de diminuir a quantidade total de Αβ no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um ser humano que sofrem de uma doença ou condição que leva à concentração aumentada de Αβ no cérebro.
Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um anticorpo humanizado de acordo com a invenção e como aqui descrito antes, anticorpo este que é bi-eficaz em que o mesmo exibe tanto uma propriedade de inibição da agregação assim como uma propriedade de desagregação, particularmente emparelhada com um alto grau de sensibilidade conformacional.
Em particular, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes, anticorpo este que, na co-incubação com polipetídeos de amilóide monomérico e/ou amilóide polimérico solúveis, particularmente com peptídeos monoméricos de amilóide β tais como, por exemplo, peptídeos monoméricos Αβ 1-39; 1-40, 1-41 ou 1-42 e/ou um peptídeo polimérico solúvel de amilóide β que compreende uma pluralidade das ditas unidades monoméricas de Αβ, mas especialmente com um peptídeo de monomérico de Αβι-42 e/ou um polimérico de amilóide Αβ solúvel que compreende uma pluralidade das ditas unidades monoméricas de Αβι.42, inibe a agregação dos monômeros de Αβ em fibrilas ou filamentos poliméricos moleculares altos e, além disso, na co-incubação com fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico molecular alto pré formados, formados pela agregação de 5 peptídeos monoméricos de amilóide, particularmente peptídeos monoméricos de amilóide β tal como, por exemplo, peptídeos monoméricos Αβ 1-39; 1-40, 1-41 ou 1-42, mas especialmente peptídeos monoméricos Αβ1-42, é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré formados.
Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes, anticorpo este que é capaz de induzir uma transição da conformação de folha β na direção de uma α-hélice e/ou uma conformação espiralada aleatória, mas particularmente uma conformação espiralada aleatória, ainda mais particularmente uma conformação espiralada aleatória em uma dada localização na molécula, especialmente no ambiente de TyrlO e Val 12 da proteína Αβ, que leva a um aumento da conformação espiralada aleatória às custas da conformação de folha β e uma solubilização melhorada das fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico molecular alto pré formados. Em particular a diminuição da conformação de folha β atinge pelo menos 30 %, particularmente pelo menos 35 % e mais particularmente pelo menos 40 % e mais quando comparado com as respectivas fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico pré formados incubados em tampão (controle).
O potencial do anticorpo na indução de uma transição na estrutura secundária é determinado pela espectroscopia de 13C RMN de estado sólido mas, em particular, pela medição das intensidades integrais das conformações de Tyr 10 e Val 12 Οβ no peptídeo Αβι_42.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes, são fornecidos que compreendem pelo menos uma cadeia leve ou um fragmento desta ou pelo menos uma cadeia pesada ou um fragmento desta, em que o dito anticorpo ou fragmento liga a um monômero Αβ com uma alta 5 afinidade de ligação com um Kd em uma faixa de pelo menos cerca de 1 x 10' 7 a pelo menos cerca de 1 x IO'12 M, particularmente de pelo menos cerca de 1 x IO-8Ma pelo menos cerca de 1 x IO'11 M, mais particularmente de pelo menos cerca de 1 x IO'9 M a pelo menos cerca de 1 x IO'10 M, ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 1 x IO'8 M a pelo menos cerca de 2 x
Ω
10' M mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo; ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes, são fornecidos que compreendem pelo menos uma cadeia leve ou um fragmento desta ou pelo menos uma cadeia pesada ou um fragmento desta, em que o dito anticorpo ou fragmento liga a uma fibra, fibrila ou filamento de Αβ com uma alta afinidade de ligação com um Kd em uma faixa de pelo menos cerca de 1 x IO'7 M a pelo menos cerca de 1 x IO'12 M, particularmente de pelo menos cerca de 1 x IO'8 M a pelo menos cerca de 1 x IO'11 M, mais particularmente de pelo menos cerca de 1 x 10‘9 M a pelo menos cerca de 1 x IO'10 M, ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 2 x IO-9Ma pelo menos cerca de 5 x 10’9 M, mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP). Em uma outra forma de realização, o anticorpo de acordo com
a invenção e como aqui descrito antes ou um fragmento do mesmo exibe uma afinidade de ligação a uma fibra, fibrila ou filamento Αβ que é pelo menos 2 vezes, particularmente pelo menos 4 vezes, particularmente pelo menos 10 vezes, particularmente pelo menos 15 vezes, mais particularmente pelo menos 20 vezes, mas especialmente pelo menos 25 vezes mais alta do que a afinidade de ligação a um monômero de Αβ.
Ainda em uma outra forma de realização, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos como aqui descrito antes, anticorpo este que substancialmente se liga ao agregado Αβ, incluindo placas Αβ, no mamífero, particularmente no cérebro humano mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
Em uma outro aspecto da invenção, o anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo; ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos como aqui descritos antes, anticorpo este que substancialmente se liga ao amilóide polimérico solúvel, particularmente amilóide β (Αβ), incluindo monômeros Αβ, no mamífero, particularmente no cérebro humano mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
Ainda é fornecido um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes, anticorpo este que significantemente reduz a carga de placa Αβ no mamífero, particularmente no cérebro humano. Isto pode ser obtido ligando-se o anticorpo à placa ou alterando-se o equilíbrio entre amilóide, particularmente amilóide (Αβ), no seu estado insolúvel e agregado para a sua forma solúvel pela desagregação de fibras para as formas poli- e monoméricas pela indução de uma alteração na conformação e ligando e estabilizando as formas amilóide desagregadas e solubilizadas, particularmente as formas de amilóide β (Αβ), no tecido e/ou fluidos corporais, particularmente no cérebro. Através da atividade do anticorpo de acordo com a invenção a depuração periférica e o catabolismo é assim favorecido ao invés da deposição dentro do tecido e/ou fluidos corporais, particularmente no cérebro. O efeito benéfico do anticorpo de acordo com a invenção pode ser assim obtido sem a ligação do anticorpo à placa.
Através desta atividade de estabilização, o anticorpo de acordo com a invenção é capaz de neutralizar os efeitos tóxicos da proteína de amilóide polimérica e menos agregada solúvel, particularmente a amilóide β (Αβ), no tecido e/ou fluidos corporais. Em uma forma de realização específica da invenção o anticorpo de acordo com a invenção pode assim alcançar seus efeitos benéficos sem necessariamente ligar agregado beta-amilóide no cérebro.
Em um outro aspecto da invenção um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes, são fornecidos que compreendem pelo menos uma cadeia leve ou um fragmento desta ou pelo menos uma cadeia pesada ou um fragmento desta incorporando pelo menos um, particularmente dois e mais particularmente três regiões de CDR obtidas de um anticorpo doador de camundongo, particularmente de anticorpo ACI-O l-Ab7C2 de camundongo (chamado de “mC2” e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, por todo o pedido) depositado em 01 de dezembro de 2005 com o “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zelikulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, sob o acesso n° DSM ACC2750, em que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo tem uma afinidade ao antígeno Αβ que é pelo menos 5 vezes, particularmente pelo menos 8 vezes, mais particularmente pelo menos 10 vezes, mas especialmente pelo menos 15 vezes mais alto do que aquele do anticorpo doador de camundongo.
O anticorpo desta invenção pode ser, em uma forma de realização, um anticorpo inteiro (por exemplo, com duas cadeias leves de tamanho natural e duas cadeias pesadas de tamanho natural) de qualquer isótipo e subtipo (por exemplo, IgM, IgD, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAl e IgA2); mas especialmente um anticorpo do isótipo IgG4; alternativamente, em uma outra forma de realização, pode ser um fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, Fab, F(ab’)2 e Fv) de um anticorpo inteiro.
A invenção assim também diz respeito a fragmentos de ligação de antígeno dos anticorpos aqui descritos. Em uma forma de realização da invenção, o fragmento é selecionado do grupo que consiste de um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab)2 e um fragmento, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina de Fab e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos anticorpos e fragmentos mencionados acima.
Em uma outra forma de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção são conjugados ao polietileno glicol. Já em uma outra forma de realização, a região constante do anticorpo da invenção é modificada para reduzir pelo menos uma função efetora biológica mediada pela região constante em relação a um anticorpo não modificado. Ainda em uma outra forma de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da invenção compreende uma região Fc tendo uma função efetora alterada.
A invenção diz respeito ainda a uma molécula de nucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui divulgado antes.
Em particular, a invenção diz respeito a uma molécula de nucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um trecho de moléculas de aminoácido contíguas como dado nas SEQ ID NOs: 2 e 3, respectivamente ou a seqüência complementar, representando as Regiões Determinadoras de Complementaridade (CDRs) 2 e 3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR). Mais particularmente, a invenção diz respeito a uma molécula de nucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um trecho de moléculas de aminoácido contíguas como dado na SEQ ID NO: 4 ou a seqüência complementar, representando as Regiões Determinadoras de Complementaridade (CDRs) 1 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo como dada na SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19 ou a seqüência complementar, que codifica a seqüência de aminoácido de CDR 2 e CDR 3, respectivamente, da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo como dada na SEQ ID NO: 20 ou a seqüência complementar, que codifica a seqüência de nucleotídeo de CDR 1 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 21 ou a seqüência complementar, que codifica a Região Variável de Cadeia leve.
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 22 ou a seqüência complementar, que codifica a Região Variável de Cadeia leve completa incluindo seqüências de sinal.
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a Região Variável de Cadeia leve da SEQ ID NO: 22 e a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 23. A invenção também compreende o filamento complementar da dita molécula de nucleotídeo.
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 24 que codifica a Região Variável de Cadeia pesada. A invenção também compreende o filamento complementar da dita molécula de nucleotídeo.
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25 que codifica a Região Variável de Cadeia pesada completa incluindo seqüências de sinal. A invenção também compreende o filamento complementar da dita molécula de nucleotídeo.
Em uma outra forma de realização da invenção uma molécula de nucleotídeo é fornecida que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a Região Variável de Cadeia pesada da SEQ ID NO: 25 e a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 26. A invenção também compreende o filamento complementar da dita molécula de nucleotídeo.
Também é compreendido pela presente invenção uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza a uma das seqüências de nucleotídeo que codifica o anticorpo descrito acima da invenção, particularmente ao filamento complementar deste, em isolação ou como parte de molécula nucleotídeo maior.
Em particular, a invenção diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização convencional, particularmente sob condições de hibridização severas, a qualquer um das seqüências de nucleotídeo dadas nas SEQ ID NOs: 18 a 26 e 29 a 32, particularmente ao filamento complementar destas.
Em uma outra forma de realização da invenção um vetor de expressão é fornecido que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção e como aqui mencionado antes.
Em uma outra forma de realização da invenção uma célula é fornecida que compreende um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico de acordo com a invenção e como aqui mencionado antes. Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma composição que compreende o anticorpo de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou qualquer derivado ou partes funcionais deste, em uma quantidade terapeuticamente eficaz, em particular uma composição que é uma composição farmacêutica opcionalmente compreendendo ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
Em uma outra forma de realização da invenção, a dita composição compreende o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
E ainda compreendido pela invenção uma mistura que compreende um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou qualquer derivado ou partes funcionais deste, em uma quantidade terapeuticamente eficaz e, opcionalmente, uma substância biologicamente ativa adicional e/ou um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.
Em particular, a invenção diz respeito a uma mistura, em que a substância biologicamente ativa adicional é um composto usado na medicação de amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com amilóide ou proteína equivalente a amilóide tal como a proteína Αβ envolvida no mal de Alzheimer.
Em uma outra forma de realização da invenção, a outra substância ou composto biologicamente ativos também podem ser um agente terapêutico que pode ser usado no tratamento da amilóideose causada pelo amilóide ou pode ser usado na medicação de outros distúrbios neurológicos.
A outra substância ou composto biologicamente ativo podem exercer seu efeito biológico pelo mesmo mecanismo ou um similar como o anticorpo de acordo com a invenção ou por um mecanismo de ação não relacionado ou por uma multiplicidade de mecanismos de ação relacionados e/ou não relacionados.
No geral, o outro composto biologicamente ativo pode incluir estimuladores de transmissão de nêutrons, drogas psicoterapêuticas, inibidores de acetilcolinesterase, bloqueadores de canal de cálcio, aminas biogênicas, tranqüilizantes de benzodiazepina, estimuladores de síntese de, armazenamento ou liberação de acetilcolina, agonistas de receptor pós- sináptico de acetilcolina, inibidores de monoamina oxidase-A ou -B, antagonistas de receptor de N-metil-D-aspartato glutamato, drogas antiinflamatórias não esteroidais, antioxidantes e receptor antagonistas de receptor serotonérgico.
Mais particularmente, a invenção diz respeito a uma mistura que compreende pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste de compostos eficazes contra estresse oxidativo, compostos anti-apoptóticos, queladores metálicos, inibidores do reparo de DNA tais como pirenzepin e metabólitos, ácido 3-amino-l-propanosulfônico (SAPS), 1,3- propanodissulfonato (1,3PDS), ativadores da α-secretase, inibidores da β- e y~ secretase, proteínas tau, neurotransmissores, degradadores de folha β, atraentes para componentes celulares que a depuração/esgotamento de beta- amilóide, inibidores de beta-amilóide truncado no terminal N incluindo beta- amilóide 3-42 piroglutamatadas, moléculas anti-inflamatórias ou inibidores da colinesterase (ChEIs) tal como tacrina, rivastigmina, donepezil e/ou galantamina, agonistas de MI e outros medicamentos incluindo qualquer amilóide ou medicamento modificador de tau e suplementos nutritivos e suplementos nutritivos, juntos com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.
A invenção diz respeito ainda a uma mistura, em que o composto é um inibidor da colinesterase (ChEIs), particularmente uma mistura, em que o composto é um selecionado do grupo que consiste de tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina, niacina e memantina.
Em uma forma de realização adicional, as misturas de acordo com a invenção podem compreender niacina ou memantina junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em ainda outra forma de realização da invenção são fornecidas misturas que compreendem "antipsicóticos atípicos" tal como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina para o tratamento de sintomas psicóticos positivos e negativos incluindo alucinações, ilusões, desordens de pensamento (manifestadas por incoerência marcada, descarrilamento, tangencialidade) e comportamento bizarro ou desorganizado, assim como anedonia, emoção embotada, apatia e afastamento social, junto com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em uma forma de realização específica da invenção, as composições e misturas de acordo com a invenção e como descrito neste lugar antes compreendem o anticorpo e a substância biologicamente ativa, respectivamente, em uma quantidade terapeuticamente efetiva.
Outros compostos que podem ser adequadamente usados em misturas em combinação com o anticorpo de acordo com a presente invenção são descritos em WO 2004/058258 (veja especialmente páginas 16 e 17) incluindo alvos de droga terapêutica (página 36-39), ácidos alcanosulfônicos e ácidos alcanolsulfônicos (páginas 39-51), inibidores de colinesterase (páginas 51-56), antagonistas de receptor NMDA (páginas 56-58), estrógenos (páginas 58-59), drogas antiinflamatórias não esteroidais (páginas 60-61), antioxidantes (páginas 61-62), agonistas de receptor ativado por proliferadores de peroxissomo (PPAR) (páginas 63-67), agentes que diminuem colesterol (páginas 68-75); inibidores de amilóide (páginas 75-77), inibidores de formação de amilóide (páginas 77-78), quelantes de metal (páginas 78-79), antipsicóticos e antidepressivos (páginas 80-82), suplementos nutricionais (páginas 83-89) e compostos aumentando a disponibilidade de substâncias biologicamente ativas no cérebro (veja páginas 89-93) e pró-fármacos (páginas 93 e 94), cujo documento é incorporado neste lugar por referência.
Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma mistura que compreende o anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes e/ou a substância biologicamente ativa em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
A invenção diz respeito ainda ao uso de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes e/ou uma parte funcional do mesmo e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura que compreende o dito anticorpo, para a preparação de um medicamento para tratar ou aliviar os efeitos da amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade tal como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas na ou associadas com a proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabete de Início no Adulto; amilóideose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo degeneração macular.
Também compreendido pela presente invenção está um método para a preparação de um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes e/ou uma parte funcional do mesmo e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura que compreende o dito anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo, particularmente em uma quantidade terapeuticamente eficaz, para o uso em um método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos da amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo a amilóideose secundária e a amilóideose relacionada com a idade tal como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Holandês); o complexo Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas na ou associadas com a proteínas equivalentes a amilóide tais como a paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabete de Início no Adulto; amilóideose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo degeneração macular que compreende formular um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo; ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável.
Ainda é compreendido pela presente invenção um método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos da amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade tal como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas na ou associadas com a proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabete de Início no Adulto; amilóideose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo degeneração macular pela administração de um anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo, mas particularmente um anticorpo humanizado e/ou uma parte funcional do mesmo ou uma composição ou mistura que compreende um tal anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo; a um animal ou um ser humano afetado por um tal distúrbio que compreende administrar o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
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E também um objetivo da invenção fornecer um método para o tratamento de amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade incluindo, mas não limitados a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), particularmente uma doença ou condição caracterizada por uma perda da capacidade de memória cognitiva pela administração a um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, de um anticorpo, particularmente uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e como aqui descrita.
Em uma forma de realização específica a invenção fornece um método para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva mas, particularmente, para restaurar a capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de deterioração da memória pela administração a um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, de um anticorpo, particularmente uma composição farmacêutica de acordo com a invenção e como aqui descrita antes.
É um outro objetivo da invenção fornecer uma composição terapêutica e um método de produzir uma tal composição assim como um método para o tratamento de amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade incluindo, mas não limitados a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), particularmente uma doença ou condição caracterizada por uma perda da capacidade de memória cognitiva, usando um anticorpo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes.
Em particular, a invenção diz respeito ao tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofre de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda da capacidade de memória cognitiva leva à retenção da capacidade de memória cognitiva.
A invenção diz respeito ainda a um método de diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente que compreende detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína de amilóide em uma amostra ou in situ que inclui as etapas de
(a) levar a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas suspeitas de conter a proteína de amilóide em contato com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes e/ou uma parte funcional do mesmo, anticorpo este que liga um epítopo da proteína de amilóide;
(b) permitir que o anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo, se ligue à proteína de amilóide para formar um complexo imunológico;
(c) detectar a formação do complexo imunológico; e
(d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência da proteína de amilóide na amostra ou parte ou área do corpo específicas.
Também é compreendido um método de determinar o grau da carga de placa amilóideogênica em um tecido e/ou fluidos corporais que compreende
(a) obter uma amostra representativa do tecido e/ou fluidos corporais sob investigação;
(b) testar a dita amostra quanto a presença da proteína de amilóide com um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes e/ou uma parte funcional do mesmo;
(c) determinar a quantidade de anticorpo ligado à proteína; e (d) calcular a carga de placa no tecido e/ou fluidos corporais.
Em particular, a invenção diz respeito a um método de determinar o grau de carga de placa amilóideogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, em que a formação do complexo imunológico na etapa c) é determinada tal que a presença ou ausência do complexo imunológico correlacione-se com a presença ou ausência da proteína de amilóide.
Em uma outra forma de realização da invenção, um kit de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com amilóide é fornecido que compreende um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, mas particularmente um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes e/ou uma parte funcional do mesmo.
Em particular, a invenção diz respeito a um kit de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com amilóide que compreende um recipiente contendo um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e/ou uma parte funcional do mesmo e instruções para usar os anticorpos para o propósito de ligar à proteína de amilóide para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico tal que a presença ou ausência do complexo imunológico correlacione-se com a presença ou ausência da proteína de amilóide.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma região variável como relatada na SEQ ID NO: 27 ou uma variante desta em uma forma de realização, um linhagem de célula que expressa o anticorpo.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um gene de anticorpo que compreende uma região variável como relatada na SEQ ID NO: 29 ou uma variante deste. Em uma forma de realização, uma linhagem de célula expressa o anticorpo. Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para desagregar fibras de beta-amilóide pré formadas, que compreende interagir um anticorpo hC2 com fibras de beta-amilóide pré formadas.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo protege neurônios da degradação induzida por Abeta.
Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para prevenir a degradação de neurônio induzida por Abeta que compreende tratar neurônios com uma quantidade eficaz de um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a divulgação aqui.
Em um outro aspecto, a invenção fornece o uso de um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a descrição aqui para a preparação de um medicamento para prevenir a degeneração de neurônios na exposição ao oligômero de Abeta.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes é fornecido, que reconhece a conformação nativa de amilóide em que o mesmo especificamente se liga aos oligômeros e fibras de amilóide, mas não às espécies de amilóide não linearizadas.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes, são fornecidos, anticorpo ou fragmento estes que se ligam a um monômero de Αβ com uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1 χ IO"6 a pelo menos cerca de 1 χ IO"8, particularmente de pelo menos cerca de 1 χ IO"6 a pelo menos cerca de 1 χ 10" 7, mais particularmente de pelo menos cerca de 1 χ IO"7 a pelo menos cerca de -8 · 7
1 χ 10" , ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 1 χ 10" a pelo menos cerca de 4 χ IO"7 mas, preferivelmente, não apresenta nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes, são fornecidos anticorpo ou fragmento estes que se ligam a uma fibra, fibrila ou filamento de Αβ com uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1 χ 10"7 a pelo menos cerca de 1
9 · 7
χ 10" , particularmente de pelo menos cerca de 1 χ 10" a pelo menos cerca de
8 · 8 1x10", mais particularmente de pelo menos cerca de 1 χ 10" a pelo menos
cerca de 1 χ IO"9, ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 1 χ IO"8 a
pelo menos cerca de 5 χ IO"8, mas, preferivelmente, não mostra nenhuma
reatividade ccruzada significante com a proteína precursora de amilóide
(APP).
Em uma outra forma de realização, o anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste de acordo com a presente invenção e como aqui descrito antes exibe uma afinidade de ligação a uma fibra, fibrila ou filamento de Αβ que é pelo menos 5 vezes, particularmente pelo menos 10 vezes, mais particularmente pelo menos 15 vezes, mais alta do que a afinidade de ligação a um monômero Αβ.
Através da desagregação das fibrilas ou filamentos poliméricos amiloidogênicos os anticorpos de acordo com a presente invenção são capazes de prevenir ou retardar a formação de placas de amilóide que leva a um alívio dos sintomas associados com a doença e um retardo ou reversão da sua progressão.
Consequentemeente, é uma outra forma de realização da invenção fornecer um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste como aqui descrito antes, anticorpo este que é capaz de diminuir a quantidade total de Αβ no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um ser humano que sofre de uma doença ou condição que leva à concentração aumentada de Αβ no cérebro.
Em uma outra forma de realização da invenção um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste como aqui descrito antes são fornecidos, anticorpo este que é capaz de romper placas diminuindo assim a carga de placa no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente de um ser humano que sofre de uma doença ou condição que leva a uma carga de placa aumentada no cérebro. O anticorpo de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste diminui a carga de placa no cérebro em pelo menos 20 %, particularmente em pelo menos 25 %, mais particularmente em pelo menos 30 %, ainda mais particularmente mais do que 30 %.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste como aqui descrito antes são fornecidos, anticorpo este que é capaz de solubilizar placas que levam a uma redução da quantidade de placas no cérebro de um animal, particularmente de um mamífero, mas especialmente de um ser humano que sofrem de uma doença ou condição que levam a uma carga de placa aumentada no cérebro. O anticorpo de acordo com a invenção incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste reduz a quantidade de placas no cérebro em pelo menos 10 %, particularmente em pelo menos 15 %, mais particularmente eem pelo menos %.
Deve ser entendido quee o anticorpo de acordo com a invenção pode exibir uma, duas ou mais das propriedades específicas aqui descritas antes em várias combinações.
Em particular, um anticorpo ou um fragment deste é fornecido, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a um mínimo de dois sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que o dito pelo menos um ou os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido e pelo menos dois resísuos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que, em uma forma de realização específica da invenção, o pelo menos um resíduo que constitui o primeiro sítio de ligação distinto é Leu e os pelos menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, que constituem o segundo sítio de ligação distinto, são -Phe-Phe- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
- Xaai - Xaa2 - Xaa3 - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 -
Xaa7 -
em que
Xaai é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln, Lys e Arg; Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que
compreende Asn e Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Lys, His, Asn, Gln e Arg
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp, Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp.
Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo ou um fragmento do mesmo, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β, em que o dito um ou o pelo menos dois ou o pelo menos três sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos um, particularmente pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo.
Em particular, o anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção liga-se a pelo menos dois sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β, em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos são localizados em proximidade imediata entre si no antígeno, separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação do anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao dito pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, formando assim um epítopo descontínuo conformacional.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção é fornecido, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos um e os pelo menos dois aminoácidos consecutivos, que são separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado com os resíduos de aminoácido predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, são -His- e -Lys-Leu-, respectivamente, embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
- His - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa3- Xaa4- Xaa5-Xaa6- - Xaa7 -
Xaa8 - em que
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln;
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp,
Xaa8 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp
e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2j Xaa3 Xaa6, Xaa7 Xaa8 não estão envolvidos na ligação ao anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação -His- e ao - Lys-Leu-.
Em uma outra forma de realização, um anticorpo ou um fragmento do mesmo é fornecido, que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a pelo menos dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvido na ligação do anticorpo, em que os pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos que representam um primeiro sítio de ligação são -Phe-Phe- e o pelo menos um resíduo de aminoácido é -His- embutido dentro da seguinte seqüência de núcleo:
- Xaai - His - Xaa3 - Xaa4 - Xaa5 - Xaa6 - Phe - Phe - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 -, em que
Xaaj é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln, Lys e Arg
Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln, Lys e Arg
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu e Ile
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu e Ile
Xaa8 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp,
Xaa9 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaaj, Xaa3 Xaa6, Xaa7 Xaa8 e Xaa9, não estão envolvidos na ligação ao anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação His e ao -Phe-Phe-. Em uma forma de realização específica da invenção, o primeiro de pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo envolve -Lys- e -Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos envolve -Phe-Phe- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo:
- Xaai - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 -
Xaa7
em que
Xaaj é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln Lys e Arg;
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que
compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp,
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5s Xaa65 Xaa7 não estão envolvidos na ligação ao anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação -Lys-Leu e ao -Phe-Phe-.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo ou um fragmento do mesmo é fornecido, em que
Xaai é His ou Arg, mas particularmente His;
Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;
Xaa4 é Val ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa5 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala; Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e Xaa7 é Asp ou Glu, mas particularmente Asp. Em uma forma de realização adicional da invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção liga-se a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos pelo menos três sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, resíduos estes que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os ditos pelo menos três sítios de ligação distintos estão localizados na proximidade imediata entre si no antígeno, separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação ao anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado com o dito pelo menos um resíduo de aminoácido e os ditos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, formando assim um epítopo descontínuo conformacional.
Em uma forma de realização específica da invenção, o primeiro dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo envolve -Lys-Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos envolve - Phe-Phe- e o terceiro pelo menos um resíduo de amino envolve -His- embutido dentro da seguinte seqüência de núcleo:
-His - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7. em que
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp,
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4j Xaa5j Xaa6j Xaa7 não estão envolvidos na ligação ao anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação -His-, ao -Lys-Leu e ao -Phe-Phe-.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;
Xaa4 é Val ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa5 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala;
Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu; e
Xaa7 é Glu ou Asp, mas particularmente Asp;
Em uma forma de realização específica da invenção, o primeiro dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo eenvolve -Lys-Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos envolve -Phe-Phe- e o terceiro pelo menos um resíduo de amino envolve -Asp- embutido dentro da seguinte seqüência de núcleo:
- Xaa1 - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 -
Asp.
em que
Xaai é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln Lys e Arg;
Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4j Xaa5, Xaa6, Xaa7 não estão envolvidos na ligação ao anticorpo ou a um grau signifícantemente menor quando comparado ao sítio de ligação -Asp-, ao -Lys-Leu e ao -Phe-Phe-.
Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo ou um fragmento do mesmo são fornecidos, em que Xaai é His ou Arg, mas particularmente His;
Xaa2 é Gln ou Asn, mas particularmente Gln;
Xaa4 é Val ou Leu, mas particularmente Vai;
Xaa5 é Ala ou Vai, mas particularmente Ala; e
Xaa6 é Glu ou Asp, mas particularmente Glu Em uma forma de realização adicional específica da invenção,
um anticorpo ou um fragmento do mesmo de acordo com a invenção é fornecido, que se liga a 4 sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos 4 sítios de ligação distintos compreendem um resíduo de aminoácido e dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, resíduos estes que estão predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os ditos 4 sítios de ligação distintos estão localizados na proximidade imediata entre si no antígeno, separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação ao anticorpo ou a um grau signifícantemente menor quando comparado ao dito um resíduo de aminoácido e aos ditos dois resíduos de aminoácido consecutivos dos 4 sítioss de ligação distintos formando assim um epítopo descontínuo conformacional.
Em particular, o primeiro dos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são - Lys-Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe-Phe-, o primeiro dos resíduos de amino único é -His- e o segundo dos resíduos de amino único é -Asp- embutido dentro da seguinte seqüência de núcleo:
-His-Xaa2-Lys- Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5- Xaa6- Asp.
em que
Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln;
Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie;
Xaas é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie;
Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2j Xaa3, Xaa4 Xaa5 Xaa65 Xaa7 não estão envolvidos na ligação ao anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado aos sítios de ligação -His-, - Asp-, ao -Lys-Leu e ao -Phe-Phe-.
Em uma forma de realização específica da invenção, os sítios de reconhecimento e ligação como aqui definidos antes estão formando um epítopo descontínuo conformacional localizado em uma região da proteína de amilóide β entre os resíduos de aminoácido de 12 a 24, particularmente entre os resíduos de 14 a 23, mais particularmente entre os resíduo de aminoácidos 14 e 20, em que os três sítios de reconhecimento e ligação distintos que compreendem 1 e 2 resíduos de aminoácido, respectivamente, estão localizados na posição 16, 17 e nas posições 19 e 20 e na posição 14, respectivamente, resíduos estes que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína de amilóide β e em que os ditos três sítios de reconhecimento e ligação distintos são separados por um resíduo de aminoácido localizado nas posições 15 e 18, respectivamente, aminoácidos estes que não estão envolvidos na ligação do antígeno ou, pelo menos, a um grau substancialmente menor.
Em uma forma de realização específica, os ditos resíduos de aminoácido consecutivos, particularmente -Lys-Leu- nas posições 16 e 17 e - Phe- Phe- na posição 19 e 20, que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína de amilóide β, são embutidos na seguinte região de núcleo:
Val- His- His- Gin- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Em uma forma de realização adicional específica, os ditos
resíduos de aminoácido consecutivos, particularmente -Lys- na posição 16, -
Leu- na posição 17 e -Phe-Phe- nas posições 19 e 20 e -His- na posição 14,
que estão predominantemente envolvidos na ligação da proteína de amilóide β
estão embutidos na seguinte região de núcleo:
Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Também parte da invenção é o uso de um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura que compreende o dito anticorpo, para a preparação de um medicamento para tratar ou aliviar os efeitos de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com amilóide ou proteínas equivalentes a amilóide incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa de amilóide incluindo a amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não limitadas, distúrbios neurológicos tais como Mal de Alzheimer (AD) e doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deterioração cognitiva branda (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária hemorragia cerebral com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas em ou associadas com proteínas equivalentes a amilóide tais como a paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo a degeneração macular.
Em uma outra forma de realização da presente invenção um método é fornecido para a preparação de uma composição farmacêutica usando um anticorpo de acordo com a invenção e/ou uma parte funcional do mesmo mas especialmente um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo ou um anticorpo funcionalmente equivalente, para o uso no tratamento ou alívio dos efeitos de doenças e distúrbios que são causadas por ou associadas com amilóide ou proteínas equivalente a amilóide incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa de amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relalcionada com a idade tal como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD) e doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deterioração cognitiva branda (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas em ou associadas com proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outras, incluindo a degeneração macular que compreende formular um anticorpo de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável.
Os anticorpos e/ou partes funcionais destes mas especialmente os anticorpos monoclonais e/ou partes funcionais destes ou um anticorpo funcionalmente equivalente e as composições e misturas que compreendem o dito anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser usados para a preparação de um medicamento para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com amilóide ou proteínas equivalentes a amilóide incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa de amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como Mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva tais como, por exemplo, deterioração cognitiva branda (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson- Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas na ou associadas com as proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outras, incluindo a degeneração macular.
Em uma forma de realização adicional da invenção um método é fornecido para reduzir a carga de placa no cérebro de um animal, particularmente de um mamífero, mas especialmente de um ser human que sofre de uma doença ou condição que levam a uma carga de placa aumentada no cérebro que compreende administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como aqui descrito antes ou uma composição ou uma mistura que compreende o dito anticorpo.
Em particular, a carga de placa é reduzida em pelo menos 20 %, particularmente em pelo menos 25 %, mais particularmente em pelo menos 30 %, ainda mais particularmente em mais do que 30 %.
Em uma forma de realização adicional da invenção um método para reduzir a quantidade de placas no cérebro de um animal, particularmente de um mamífero, mas especialmente de um ser humano que sofre de uma doença ou condição que levam a uma carga de placa aumentada no cérebro que compreende administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como aqui descrito antes ou uma composição ou uma mistura que compreende o dito anticorpo.
Em particular, a quantidade de placas no cérebro é reduzida em pelo menos 10 %, particularmente em pelo menos 15 %, mais particularmente em mais do que 15 %.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção um método para diminuir a quantidade total de Αβ solúvel no cérebro de um animal, particularmente de um mamífero, mas especialmente de um ser humano que sofre de uma doença ou condição que levam às concentrações aumentadas de Αβ solúvel no cérebro que compreende administrar a um animal, particularmente a um mamífero, mais particularmente a um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como aqui descrito antes ou uma composição ou uma mistura que compreenda o dito anticorpo.
r
E um objetivo da presente invenção fornecer um método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com amilóide ou proteínas equivalentes a amilóide incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa de amilóide incluindo a amiloidose secundária e a amiloidose relacionada com a idade incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda de capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deterioração cognitiva branda (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas nas ou associadas com as proteínas equivalentes a amilóide tais como a paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacioada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outras, incluindo degeneração macular, pela administração de um anticorpo, mas particularmente um anticorpo monoclonal ou uma composição ou mistura que compreenda um tal anticorpo de acordo com a invenção a um animal ou a um ser humano afetado por um tal distúrbio que compreende administrar a um animal, particularmente a um mamífero, mais particularmente a um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo e/ou uma parte funcional do mesmo mas especialmente do anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo ou de um anticorpo funcionalmente equivalente de acordo com a invenção e como aqui descrito antes ou uma composição ou uma mistura que compreendam o dito anticorpo.
Em uma forma de realização específica a invenção fornece um método para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente de um mamífero ou de um ser humano que sofre de deterioração da memória pela administração a um animal, particularmente a um mamífero ou a um ser humano em necessidade de um tal tratamento, de um anticorpo, mas particularmente um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção ou uma composição ou mistura que compreenda um tal anticorpo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes. Em uma outra forma de realização da presente invenção um
método é fornecido para a preparação de uma composição farmacêutica usando um anticorpo de acordo com a invenção e/or uma parte funcional do mesmo mas especialmente um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo ou um anticorpo funcionalmente equivalente para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de doenças e distúrbios que são causados por ou associados com amilóide ou proteínas equivalentes a amilóide incluindo amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa de amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tal como doenças incluindo, mas não limitadas, a distúrbios neurológicos tais como Mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, deterioração cognitiva branda (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson- Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas nas ou associadas com as proteínas equivalentes a amilóide tais como a paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, ma 1 de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outras, incluindo a degeneração macular.
Em uma forma de realização específica a invenção fornece um método para a preparação de uma composição farmacêutica usando um anticorpo de acordo com a invenção e/or uma parte funcional do mesmo mas especialmente um anticorpo monoclonal e/ou uma parte funcional do mesmo ou um anticorpo funcionalmente equivalente para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva de um animal, particularmente de um mamífero ou de um ser humano, que sofrem de deterioração da memória pela administração a um animal, particularmente a um mamífero ou a um ser humano, um anticorpo, mas particularmente um anticorpo monoclonal ou uma composição ou mistura que compreenda um tal anticorpo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes.
Estes e outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes depois de uma revisão da seguinte descrição detalhada da forma de realização divulgada e das reivindicações anexas.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS E SEQÜÊNCIAS
Figura 1 (Exemplo 2): Cassete de Expressão da Região Variável de Cadeia leve do anticorpo quimérico de camundongo;
Figura 2 (Exemplo 2): Cassete de Expressão da Região Variável de Cadeia pesada do anticorpo quimérico de camundongo;
Figura 3 (Exemplo 5.2): Comparação da Região Variável de Cadeia pesada de camundongo com a seqüência da linha germinativa de murino mais próxima;
Figura 4 (Exemplo 8): Atividade de anticorpos C2 humanizados purificados;
Figura 5 (Exemplo 9): Atividade de ligação de anticorpos produzida pela expressão transitória de construções de CDRL2 modificadas por C2 em conjunção com C2 quimérico de cadeia pesada, comparado com o anticorpo quimérico C2ChVHAF/ChVK, produzido pela transíécção transitória e anticorpo purificado;
Figura 6 (Exemplo 11): Resultados de Ensaio de Ligação de Imunoistoquímica com anticorpo quimérico AF e anticorpo humanizado H4K1;
Figura 7 (Exemplo 12): Funcionalidade de mC2 em fibras
Amilóides;
Figura 8 (Exemplo 12): Afinidade de ligação de C2 humanizado em ELISA;
Figura 9 (Exemplo 14): Ligação específica de conformação de mC2 para classes diferentes de proteína de amilóide. Preparação de pelotização na legenda para esta figura refere-se às fibras Αβ1-42, preparação de sobrenadante refere-se aos monômeros de amilóide;
Figura 10: Seqüências C2 Vk humanizadas comparadas com a seqüência de murino e seqüências aceitadoras de DPK15 E JKl humanas;
Figura 11: Seqüências C2 Vh humanizadas comparadas com a seqüência de murino e seqüências DP54 E 31.16 aceitadora humana;
Figura 12: DNA completo e seqüência de proteína da Região Variável de Cadeia leve de anticorpo humanizado C2, C2HuVKl;
Figura 13: DNA completo e seqüência de proteína da região constante de cadeia leve (C Capa humano) de anticorpo C2 humanizada;
Figura 14: DNA completo e seqüência de proteína da região constante de cadeia pesada (IgG4 ser228-pro humana) de anticorpo C2 humanizado;
Figura 15A-C (Exemplo 15): Resultados de experimentos de Mapeamento de Epítopo;
Figura 16 (Exemplo 13): Resultados de experimentos de ensaio de agregação; Figura 17 (Exemplo 13): Resultados de experimentos de ensaio de desagregação;
Figura 18: (Exemplo 16): Resultados de experimentos de neuroproteção com anticorpo humanizado C2; Figura 19: Ligação de anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7
C2 às espécies de amilóide no Western blot e Dot blot;
Figura 20: Ligação de anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 às fibras de amilóide pela microscopia eletrônica de transmissão;
Figura 21: Resultados de um experimento de ponta a ponta entre o ensaio fluorescente de Th-T e a RMN de estado sólido de peptídeo amilóide β 1-42 rotulado com μ-BC TyrlO e Vall2.
SEQ ID NO: 1 Seqüência de aminoácido de Região Variável de Cadeia pesada (CDRl) de C2 HuVH AF 4 humanizado
SEQ ID NO: 2 Seqüência de aminoácido da Região Variável de Cadeia pesada (CDR2) de C2 HuVH AF 4 humanizado
SEQ ID NO: 3 Seqüência de aminoácido da Região Variável de Cadeia pesada (CDR3) de C2 HuVH AF 4 humanizado
SEQ ID NO: 4Seqüência de aminoácido da Região Variável de Cadeia leve (CDRl) de C2 HuVk 1 humanizada SEQ ID NO: 5Sequência de aminoácido da Região Variável de
Cadeia leve (CDR2) de C2 HuVk 1 humanizada
SEQ ID NO: óSequência de aminoácido da Região Variável de Cadeia leve (CDR3) de C2 HuVk 1 humanizada
SEQ ID NO: 7Seqüência de aminoácido da região 2 de epítopo
Αβ
SEQ ID NO: 8sequência de aminoácido da região 1 de epítopo
Αβ
SEQ ID NO: 9Sequência de aminoácido da região 2 de epítopo
Αβ modificada SEQ ID NO: 10 Seqüência de aminoácido da região 1 de epítopo Αβ modificada
SEQ ID NO: 11 Seqüência de aminoácido da região de epítopo modificada completa SEQ ID NO: 12 Seqüência de aminoácido da Região Variável
de Cadeia leve de C2 HuVk 1 humanizada
SEQ ID NO: 13 Seqüência de aminoácido da cadeia leve de C2 humanizada
SEQ ID NO: 14 Seqüência de aminoácido região constante de cadeia leve de C2 humanizada
SEQ ID NO: 15 Seqüência de aminoácido da Região Variável de Cadeia pesada de C2 HuVh AF 4 humanizada
SEQ ID NO: 16 Seqüência de aminoácido da cadeia pesada de C2 humanizada
SEQ ID NO: 17: Seqüência de aminoácido da REGIÃO C DE
CADEIA IG GAMA-4 - modificada
SEQ ID NO: 18: Seqüência de nucleotídeo de Região Variável de Cadeia pesada de C2 HuVh AF 4 humanizada SEQ ID NO: 19: Seqüência de nucleotídeo de Região Variável de Cadeia pesada de C2 HuVh AF 4 humanizada
SEQ ID NO: 20: Seqüência de nucleotídeo de Região Variável de Cadeia leve de C2 HuVk 1 humanizada
SEQ ID NO: 21: Seqüência de nucleotídeo da Região Variável de Cadeia leve de C2 HuVk 1 humanizada SEQ ID NO: 22: Seqüência de nucleotídeo de cadeia leve de
C2 humanizada
SEQ ID NO: 23: Seqüência de nucleotídeo da região constante de cadeia leve de C2 humanizada
SEQ ID NO: 24: Seqüência de nucleotídeo da Região Variável
CDR2 da CDR3 da CDRl da de Cadeia pesada de C2 HuVh AF 4 humanizada
SEQ ID NO: 25: Seqüência de nucleotídeo da C2 humanizada de cadeia pesada
SEQ ID NO: 26: seqüência de nucleotídeo da região constante de cadeia pesada de C2 humanizada
SEQ ID NO: 27: Seqüência de aminoácido da Região Variável de Cadeia Leve de C2 de Camundongo
SEQ ID NO: 28: Seqüência de aminoácido da Região Variável de Cadeia Pesada de C2 de Camundongo SEQ ID NO: 29: Seqüência de nucleotídeo da Região Variável
de Cadeia Leve de C2 de Camundongo
SEQ ID NO: 30: Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Leve de C2 de camundongo
SEQ ID NO: 31: Seqüência de nucleotídeo da Região Variável de Cadeia Pesada de C2 de Camundongo
SEQ ID NO: 32: Seqüência de nucleotídeo da Cadeia Pesada de C2 de Camundongo
SEQ ID NO: 33 a 40: Variantes de seqüência de aminoácido de região epitópica no peptídeo Αβ SEQ ID NO: 41: Seqüência de aminoácido da Cadeia Leve de
C2 de Camundongo
SEQ ID NO: 42: Seqüência de aminoácido da Cadeia Pesada de C2 de Camundongo
SEQ ID NO: 43: Peptídeo antigênico Αβ 1-15 SEQ ID NO: 44: Peptídeo antigênico Αβ 1-16
SEQ ID NO: 45: Peptídeo antigênico Αβ 1-16(Δ14) SEQ ID NO: 46: Peptídeo antigênico Αβ 22-35 SEQ ID NO: 47: Peptídeo antigênico Αβ 29-40 SEQ ID NO: 48: Peptídeo antigênico Αβ 1-17 DEFINIÇÕES
Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína", como usados neste lugar, são permutáveis e são definidos para significar uma biomolécula composta de aminoácidos ligados por uma ligação peptídica.
Os termos "um", "uma" e "o(a)" como usados neste lugar são definidos para significar "um ou mais" e incluem o plural a menos que o contexto seja inapropriado.
A linguagem "doenças e distúrbios que são causado por ou associadas com amilóide ou proteínas equivalentes a amilóide" inclui, mas não é limitada às doenças e distúrbios causados pela presença ou atividade de proteínas equivalentes a amilóide nos estados monomérico, fibrila ou polimérico ou qualquer combinação dos três, Tais doenças e distúrbios incluem, mas não são limitados a, amilóideose, tumores endócrinos e degeneração macular.
O termo "amilóideose" refere-se a um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo, mas não limitado a, amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade tal como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), incluindo doenças ou condições caracterizadas por uma perda da capacidade de memória cognitiva tal como, por exemplo, a deterioração cognitiva branda (MCI), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas nas ou associadas com as proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), miosite de corpo de inclusão (IBM), Diabete de Início no Adulto e amilóideose cardíaca senil; e várias doenças oculares incluindo degeneração macular, neuropatia óptica relacionada com drusa e catarata devido à deposição de beta-amilóide.
Os termos "detectar" ou "detectado" como usados neste lugar significam usar técnicas conhecidas para detecção de moléculas biológicas tal como métodos imunoquímicos e histológicos e se referem a determinar qualitativamente ou quantitativamente a presença ou concentração da biomolécula sob investigação.
"Amilóide solúvel polimérico" refere-se a monômeros agregados múltiplos de peptídeos de amilóide ou de peptídeos equivalentes a amilóide ou de peptídeos de amilóide modificados ou truncados ou de outros derivados de peptídeos de amilóide que formam estruturas oligoméricas ou poliméricas que são solúveis no corpo mamífero ou humano mais particularmente no cérebro, mas particularmente a monômeros agregados múltiplos de amilóide (Αβ) ou de peptídeos de amilóide (Αβ) modificados ou truncados ou de derivados destes, que são solúveis no corpo mamífero ou humano mais particularmente no cérebro.
"Amilóide β, Αβ ou β-amilóide" é um termo reconhecido na arte e se refere a proteínas e peptídeos β-amilóides, precursor de proteína β- amilóide (APP), assim como modificações, fragmentos e quaisquer equivalentes funcionais destas. Em particular, por β-amilóide como usado neste lugar é pretendido qualquer fragmento produzido por clivagem proteolítica de APP mas especialmente aqueles fragmentos que estão envolvidos em ou associados com as patologias amilóides incluindo, mas não limitado a, Αβ,.38, Αβ,.39, Αβ,.40, ΑβΜ1, Αβ,.42 e , Αβ,.43.
A estrutura e seqüências dos peptídeos β-amilóides como mencionado acima são bem conhecidos por aqueles versados na arte e métodos de produzir ditos peptídeos ou de extrair eles de cérebro e outros tecidos são descritos, por exemplo, em Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984). Além disso, peptídeos β-amilóides também são comercialmente disponíveis em várias formas. Por "isolada" é pretendida uma molécula biológica livre de pelo menos alguns dos componentes com os quais ela naturalmente ocorre.
Os termos "anticorpo" ou "anticorpos" como usados neste lugar são termos reconhecidos na técnica e são entendidos a se referir a moléculas ou fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos conhecidos, particularmente a moléculas de imunoglobulina e a porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, i.e moléculas que contêm um sítio de ligação que especificamente liga um antígeno. Um imunoglobulina é uma proteína que compreende um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados pelos genes das regiões constantes capa e lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu da imunoglobulina, assim como miríades de genes da região variável da imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que por sua vez definem as classes da imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Também subclasses da cadeia pesada são conhecidas. Por exemplo, Cadeias pesadas de IgG nos seres humanos podem ser qualquer uma das subclasses IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A imunoglobulina de acordo com a invenção pode ser de qualquer classe (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY) ou subclasses (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) da molécula de imunoglobulina.
Como aqui usado "especificamente liga" em referência a um anticorpo significa que o anticorpo liga-se ao seu antígeno alvo com afinidade maior do que a que ele o faz a um antígeno(s) estruturalmente diferente(s).
Uma unidade estrutural de imunoglobulina típica é conhecida compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50 a 70 kD). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis quanto ao reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia leve variável (Vl) e cadeia pesada variável (Vh) referem-se a estas cadeia leves e pesadas respectivamente.
Anticorpos existem como anticorpos intactos de tamanho natural ou como vários fragmentos bem caracterizados produzidos pela digestão com várias peptidases ou produtos químicos. Assim, por exemplo, a pepsina digere um anticorpo abaixo das ligações de dissulfeto na região de dobradiça para produzir F(ab')2, um dímero de Fab que por si só é uma cadeia leve unida a Vh-CH1 por uma ligação de dissulfeto. O F(ab')2 pode ser reduzido sob condições brandas para romper a ligação de dissulfeto na região de dobradiça convertendo por meio disso o dímero F(ab')2 em um monômero Fab'. O monômero Fab' é essencialmente um fragmento de Fab com parte da região de dobradiça (ver, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, Ν. Y. (1993), para uma descrição mais detalhada de outros fragmentos de anticorpo). Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, uma pessoa de habilidade avaliará que qualquer um de uma variedade de fragmentos de anticorpo pode ser sintetizado de novo quimicamente ou pela utilização da metodologia de DNA recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui usado também inclui fragmentos de anticorpo produzidos pela modificação de anticorpos inteiros ou sintetizados de novo ou anticorpos e fragmentos obtidos pela utilização das metodologias de DNA recombinante.
"Anticorpos" são pretendidos dentro do escopo da presente invenção para incluir anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos quiméricos, de cadeia única, biespecíficos, adaptados ao modelo símio, humanos e humanizados assim como fragmentos ativos destes. Exemplos de fragmentos ativos de moléculas que se ligam a antígenos conhecidos incluem cadeias leve e pesada separadas, fragmentos Fab e Fab/c, Fv, Fab' e F(ab')2, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de imunoglobulina Fab e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer dos anticorpos e fragmentos mencionados acima.
Estes fragmentos ativos podem ser derivados de um anticorpo da presente invenção por diversas técnicas. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser clivados com uma enzima, tal como pepsina e sujeitos a filtração em gel HPLC. A fração apropriada contendo fragmentos Fab pode então ser coletada e concentrada por filtração em membrana e os semelhantes. Para descrição adicional de técnicas gerais para o isolamento de fragmentos ativos de anticorpos, veja por exemplo, Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Métodos Enzymology, 121:663- 69, Academic Press, 1986.
Os anticorpos recombinantemente fabricados podem ser anticorpos de tamanho natural convencionais, fragmentos de anticorpo ativos conhecidos da digestão proteolítica, fragmentos de anticorpo ativos únicos tais como Fv ou Fv de cadeia única (scFv), anticorpos deletados no domínio e outros. Um anticorpo Fv é de cerca de 50 Kd no tamanho e compreende as regiões variáveis de cadeia leve e pesada. Um polipeptídeo Fv de cadeia única ("scFv") é um heterodímero Vh-Vl covalentemente ligado que pode ser expressado a partir de um ácido nucleico incluindo seqüências que codificam Vh e Vl unidas diretamente ou unidas por um ligador que codifica peptídeo. Ver Huston, et al. (1988) Proc. Nat, Acad. Sei. USA, 85: 5879-5883. Diversas estruturas para converter as cadeias de polipeptídeo leve e pesada naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas de uma região de anticorpo V em uma molécula scFv que dobrar-se-á em uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um sítio de ligação de antígeno. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N- 5.091.513, 5.132.405 e 4.956.778.
O sítio de combinação refere-se à parte de uma molécula de anticorpo que participa na ligação de antígeno. O sítio de ligação de antígeno é formada pelos resíduos de aminoácido das regiões variáveis de terminal N ("V") das cadeias pesada ("H") e leve ("L"). As regiões variáveis de anticorpo compreendem três trechos altamente divergentes aludidos como "regiões hipervariáveis" ou "regiões determinadoras de complementaridade" (CDRs) que são interpostas entre trechos flanqueadores mais conservados conhecidos como "regiões de matriz" (FRs). Em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) são dispostas relativas entre si no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação de antígeno ou bolsa. O sítio de combinação de anticorpo portanto representa os aminoácidos que compõem as CDRs de um anticorpo e quaisquer resíduos de matriz que compõem a bolsa do sítio de ligação.
A identidade dos resíduos de aminoácido em um anticorpo particular que compõem o sítio de combinação pode ser determinada usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as CDRs de anticorpo podem ser identificadas como as regiões hipervariáveis originalmente definidas por Kabat et al. (ver, "Sequences of Proteínas of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G e Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http: //immuno.bme.nwa.edu). As posições das CDRs também podem ser identificadas como as estruturas de alça estrutural originalmente descritas por Chothia e outros, (ver Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989) e Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)). Outros métodos incluem a "definição AbM" que é um compromisso entre Kabat e Chothia e é derivada usando o software de modelagem de anticorpo AbM da Oxford Molecular (agora Accelrys) ou a "definição de contato" de CDRs por Macallum et al., ("Anticorpo-antígeno interactions: contact analysis and sítio de ligação topography," J Mol Biol. 11 de outubro de 1996; 262(5): 732-45). O seguinte diagrama identifica CDRs fundamentadas em várias definições conhecidas.
Alça Kabat AbM Cliotia Contato
Ll L24--L34 L24-L34 L24 -- L34 L30-L36
L2 L50--L56 L50-L56 L50--L56 L46--L55
L3 L89 -- L97 L89 - L97 L89 ~ L97 L89 -- L96
Hl H31 — H35B H26 — H35B H26 — H32..34 H30-H35B
(Numeração de Kabat)
Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Numeração de Chotia)
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H47-H58
H3 H95-H102 H95--H102 H95-H102 H93-HlOl
As diretrizes gerais pelas quais pode-se identificar as CDRs em um anticorpo apenas a partir da seqüência são como segue: LCDRl:
Partida - Aproximadamente 24 resíduos. O resíduo anterior é sempre um Cys.
O resíduo posterior é sempre um Trp. Tipicamente TRP é seguido com TYR-GLN, mas também pode ser seguido por LEU-GLN, PHE- GLN ou TYR-LEU.
O comprimento é de 10 a 17 resíduos. LCDR2:
Partida 16 resíduos depois do final de LI. A seqüência anterior é no geral ILE-TYR, mas também pode ser VAL-TYR, ILE-LYS ou ILE-PHE. O comprimento é no geral de 7 resíduos.
LCDR3:
Partida no geral 33 resíduos depois do final de L2. O resíduo anterior é um Cys.
A seqüência posterior é PHE-GLY-X-GLΥ. O comprimento é de 7 a 11 resíduos,
HCDRl:
Partida - em aproximadamente 26 resíduos (quatro resíduos depois de um CYS) [definição de Chothia / AbM] a definição de Kabat começa 5 resíduos posteriores.
A seqüência anterior é CYS-X-X-X.
O resíduo posterior é um TRP, tipicamente seguido por VAL, mas também seguido por ILE ou ALA.
O comprimento é de IOa 12 resíduos na definição de AbM enquanto que a definição de Chothia exclui os 4 últimos resíduos.
HCDR2:
Partida - 15 resíduos depois do início da definição de KABAT /AbM de CDR-H1.
Seqüência anterior tipicamente LEU-GLU-TRP-ILE-GLY (SEQ ID NO. 1), mas diversas variações são possíveis.
A seqüência posterior é LYS/ARG-
LEU/ILETVAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA
O comprimento é de 16 a 19 resíduos sob a definição de Kabat (a definição de AbM termina 7 resíduos anteriores). HCDR3:
Partida - 33 resíduos depois do final da CDR-H2 (dois resíduos depois de um CYS). A seqüência anterior é CYS-X-X (tipicamente CYS-ALA-ARG). A seqüência posterior é TRP-GLY-X-GLY.
O comprimento é de 3 a 25 resíduos. A identidade dos resíduos de aminoácido em um anticorpo
particular que estão fora das CDRs, mas não obstante compõem parte do sítio de combinação por ter uma cadeia lateral que é parte do revestimento do sítio de combinação (isto é, está disponível para ligação através do sítio de combinação), pode ser determinado usando métodos bem conhecidos na técnica tais como modelagem molecular e cristalografia de raio X. Ver por exemplo, Riechmann et al., (1988) Nature, 332: 323-327.
Os anticorpos quiméricos são aqueles em que uma ou mais regiões do anticorpo são de uma espécie de animal e uma ou mais regiões do anticorpo são de uma espécie diferente de animal. Um anticorpo quimérico preferido é um que inclui regiões de uma imunoglobulina de primata. Um anticorpo quimérico para o uso clínico humano é tipicamente entendido ter regiões variáveis de um animal não humano, por exemplo, um roedor, com as regiões constantes de um ser humano. Ao contrário, um anticorpo humanizado usa CDRs do anticorpo não humano com a maioria ou todas das regiões variáveis de matriz da e todas as regiões constantes de uma imunoglobulina humana. Um anticorpo quimérico humano é tipicamente entendido ter as regiões variáveis de um roedor. Um anticorpo quimérico humano típico tem regiões constantes pesadas humanas e regiões constantes de cadeia leve humanas com as regiões variáveis tanto da pesada quanto leve vindo de um roedor anticorpo. Um anticorpo quimérico pode incluir algumas mudanças para uma seqüência de aminoácido nativa das regiões constantes humanas e da seqüência da região variável de roedor nativa. Anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados podem ser preparados pelos métodos bem conhecidos na técnica incluindo métodos de enxerto de CDR (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N- 5.843.708, 6.180.370, 5.693.762, 5.585.089, 5.530.101), estratégias de embaralhamento de cadeia (ver por exemplo, Patente U.S. N- 5.565.332; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1998) 95: 8910-8915), estratégias de modelagem molecular (Patente U.S. Ns 5.639.641) e outros.
Um "anticorpo humanizado" como aqui usado no caso de um anticorpo de duas cadeias é um onde pelo menos uma cadeia é humanizada. Uma cadeia de anticorpo humanizado tem uma região variável onde uma ou mais das regiões de matriz são humanas. Um anticorpo humanizado que é uma cadeia única é uma onde a cadeia tem uma região variável onde uma ou mais das regiões de matriz são humanas. As porções não humanas da região variável da cadeia de anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo é derivada de uma fonte não humana, particularmente um anticorpo não humano, tipicamente de origem roedor. A contribuição não humana ao anticorpo humanizado é tipicamente fornecida na forma pelo menos de uma região de CDR que é intercalada entre as regiões de matriz derivadas de uma (ou mais) imunoglobulina(s) humanas. Além disso, os resíduos de suporte de matriz podem ser alterados para preservar a afinidade de ligação.
O anticorpo humanizado pode compreender ainda as regiões constantes (por exemplo, pelo menos uma região constante ou porção desta, no caso de uma cadeia leve e preferivelmente três regiões constantes no caso de uma cadeia pesada). As regiões constantes de um anticorpo humanizado se presente no geral são humanas.
Métodos para se obter "anticorpos humanizados" são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, (ver, por exemplo, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et ai, Rio/Technology, 9: 421 (1991)).
Um "anticorpo humanizado" também pode ser obtido por um novo método de engendramento genético que possibilita a produção de anticorpos policlonais equivalentes ao de ser humano maturados por afinidade em animais grandes tais como, por exemplo, coelhos e camundongos. Ver, por exemplo, Pat U.S. N- 6.632.976.
O termo região constante (CR) como aqui usado refere-se a genes de regiões constantes da imunoglobulina. Os genes de região constante codificam a porção da molécula de anticorpo que confere funções efetoras. Para os anticorpos humanos quiméricos e anticorpos humanizados, tipicamente não humanos (por exemplo, murino), regiões constantes são substituídas pelas regiões constantes humanas. As regiões constantes dos anticorpos quiméricos ou humanizados objetos são tipicamente derivados de imunoglobulinas humanas. A região constante de cadeia pesada pode ser selecionada de qualquer um dos cinco isótipos: alfa, delta, épsilon, gama ou mu. Além disso, cadeia pesadas de várias subclasses (tais como as subclasses IgG de cadeias pesadas) são responsáveis para funções efetoras diferentes e assim, pela escolha da região constante de cadeia pesada desejada, anticorpos com a função efetora desejada podem ser produzidos. As regiões constantes que podem ser usadas dentro do escopo desta invenção são gama 1 (IgG 1), particularmente uma região Fc do isótipo gama 1 (IgGl), gama 3 (IgG3) e especialmente gama 4 (IgG4). A região constante de cadeia leve pode ser do tipo capa ou lambda, preferivelmente do tipo capa. Em uma forma de realização a região constante de cadeia leve é a cadeia constante capa humana (Hefter et al, (1980) Cell 22: 197-207) e a cadeia constante pesada é a cadeia constante de IgG4 humana. O termo "anticorpo monoclonal" também é bem reconhecido
na arte e se refere a um anticorpo que é o produto de uma única célula que produz anticorpo clonada e que reconhece apenas um antígeno. Anticorpos monoclonais tipicamente são feitos fundindo uma célula B produtora de anticorpo normalmente de vida curta a célula de crescimento rápido, tal como uma célula cancerosa (algumas vezes referida como uma célula "imortal"). A célula híbrida resultante ou hibridoma, se multiplica rapidamente, criando um clone que produz o anticorpo.
Para o propósito da presente invenção, "anticorpo monoclonal" também é para ser entendido por compreender anticorpos que são produzidos por um clone-mãe que ainda não atingiu monoclonalidade completa.
"Anticorpo funcionalmente equivalente" é entendido dentro do escopo da presente invenção para se referir a um anticorpo que compartilha substancialmente pelo menos uma propriedade funcional principal com um anticorpo mencionado acima e descrito neste lugar compreendendo: especificidade de ligação para a proteína β-amilóide, particularmente para a proteína Αβι_42 e mais particularmente para a região de epítopo 16-21 da proteína Ap^42, imunorreatividade in vitro, inibição de agregação dos monômeros Αβι_42 em fibrilas poliméricas moleculares superiores e/ou desagregação de fibrilas poliméricas Ap^42 pré-formadas, e/ou uma propriedade de quebra de folha-β e aliviando os efeitos da amilóideose, um grupo de doenças e desordens associadas com formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada à idade tal como doenças incluindo, mas não limitado a, desordens neurológicas tal como mal de Alzheimer (AD), demência com corpos de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Alemão); o complexo de demência Guam-Parkinson; assim como outras doenças que são baseadas em ou associadas com proteínas tipo amilóide tal como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; Doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada a HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabetes de Início no Adulto; amilóideose cardíaca senil; tumores endócrinos e outras, incluindo degeneração macular, quando administrado profilaticamente ou terapeuticamente. Os anticorpos podem ser de qualquer classe tal como IgG, IgM ou IgA, etc ou qualquer subclasse tal como IgGl , IgG2a, etc e outras subclasses mencionadas acima neste lugar ou conhecidas na arte, mas particularmente da classe IgG4. demais, os anticorpos podem ser produzidos por qualquer método, tal como apresentação em fago ou produzidos em qualquer organismo ou linhagem celular, incluindo bactérias, inseto, mamífero ou outro tipo de célula ou linhagem celular que produz anticorpos com características desejadas, tal como anticorpos humanizados. Os anticorpos também podem ser formados combinando uma porção Fab e uma região Fc de espécies diferentes.
O termo "hibridizar" como usado refere-se às condições de hibridização convencionais, preferivelmente às condições de hibridização em que 5x SSPE, 1 % de SDS, Ix de solução de Denhardt são usadas como uma solução e/ou as temperaturas de hibridização estão entre 35° C e 70° C, preferivelmente 65° C. Depois da hibridização, a lavagem é preferivelmente realizada primeiro com 2x S SC, 1 % de SDS e subseqüentemente com 0,2x SSC nas temperaturas entre 35° C e 70° C, preferivelmente a 65° C (com respeito à definição de SSPE, SSC e solução de Denhardt ver Sambrook et al, loc. cit.). as condições de hibridização severas como por exemplo, descritas em Sambrook et al, supra, são particularmente preferidas. As condições de hibridização severas particularmente preferidas estão por exemplo, presentes se a hibridização e lavagem ocorrem a 65° C como indicado acima. As condições de hibridização não severas, por exemplo, com hibridização e lavagem realizadas a 45° C são menos preferidas e a 35° C ainda menos.
"Homologia" entre duas seqüências é determinada por identidade de seqüência. Se duas seqüências que estão a ser comparadas uma com a outra diferem em comprimento, identidade de seqüência preferivelmente se refere à porcentagem dos resíduos de nucleotídeos da seqüência menor que são idênticos com os resíduos de nucleotídeos da seqüência maior. Identidade de seqüência pode ser determinada convencionalmente com o uso de programas computacionais tal como o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Grupo, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, a fim de encontrar o segmento tendo a maior identidade de seqüência entre duas seqüências. Ao usar Bestfit ou outro programa de alinhamento de seqüências para determinar se uma seqüência particular tem por exemplo 95 % de identidade com uma seqüência de referência da presente invenção, os parâmetros preferivelmente são ajustados de forma que a porcentagem de identidade é calculada pelo comprimento inteiro da seqüência de referência e que lacunas de homologia de até 5 % do número total dos nucleotídeos na seqüência de referência sejam permitidas. Ao usar Bestfit, os assim chamados parâmetros opcionais preferivelmente são deixados em seus valores pré- ajustados ("padrão"). Os desvios aparecendo na comparação entre uma dada seqüência e as seqüências descritas acima da invenção podem ser causados por exemplo por adição, deleção, substituição, inserção ou recombinação. Uma tal comparação de seqüências preferivelmente também pode ser realizada com o programa "fasta20u66" (versão 2.0u66, Setembro de 1998 por William R. Pearson e a University of Virgínia; veja também W.R. Pearson (1990), Métodos in Enzymology 183, 63-98, exemplos anexos e http://workbench.sdsc.edu/). Para este propósito, as configurações "padrão" de parâmetros podem ser usadas.
O anticorpo de acordo com a invenção pode ser uma imunoglobulina ou anticorpo, que são entendidos ter cada um dos seus sítios de ligação idênticos (se multivalentes) ou, na alternativa, podem ser um "anticorpo biespecífico ou bifuncional".
Um "anticorpo biespecífico ou bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, por exemplo, Songsivilai & Lachmarm, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
O termo "fragmento" refere-se a uma parte ou porção de um anticorpo ou cadeia de anticorpo que compreende menos resíduos de aminoácido do que um anticorpo ou cadeia de anticorpo intactos ou completos. Fragmentos podem ser obtidos por intermédio de tratamento químico ou enzimático de um anticorpo ou cadeia de anticorpo intactos ou completos. Fragmentos também podem ser obtidos por meios recombinantes. Os fragmentos exemplares incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc e/ou Fv. O termo "fragmento de ligação de antígeno" refere-se a um fragmento de polipeptídeo de uma imunoglobulina ou anticorpo que liga antígeno ou compete com anticorpo intacto (isto é, com o anticorpo intacto a partir do qual eles foram derivados) por ligação de antígeno (isto é, ligação específica).
Os fragmentos de ligação são produzidos pelas técnicas de DNA recombinante ou pela clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas. Os fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab )2, Fabc, Fv, cadeias simples e anticorpos de cadeia simples.
"Fragmento" também refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que compreendem uma seqüência de aminoácido de pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácido contíguos ou pelo menos 250 resíduos de aminoácido contíguos da seqüência de aminoácido de um outro polipeptídeo. Em uma forma de realização específica, um fragmento de um polipeptídeo retém pelo menos uma função do polipeptídeo.
O termo "antígeno" refere-se a uma entidade ou fragmento do mesmo que pode ligar-se a um anticorpo. Um imunógeno refere-se a um antígeno que pode evocar uma resposta imune em um organismo, particularmente um animal, mais particularmente um mamífero incluindo um ser humano. O termo antígeno inclui regiões conhecidas como determinantes antigênicos ou epítopos que referem-se a uma porção do antígeno (que são contatados ou que desempenham um papel significante em sustentar um contato reside no antígeno responsável pela antígenoicidade ou determinantes antigênicos.
Como aqui usado, o termo "solúvel" significa parcial ou completamente dissolvido em uma solução aquosa.
Também como aqui usado, o termo "imunogênico" refere-se às substâncias que evocam a produção de anticorpos, células T e outras células imunorreativas direcionadas contra um antígeno do imunógeno.
Uma resposta imune ocorre quando um indivíduo produz anticorpos, células T e outras células imunorreativas suficientes contra as composições imunogênicas administradas da presente invenção para moderar ou aliviar o distúrbio a ser tratado.
O termo imunogenicidade como aqui usado refere-se a uma medida da capacidade de um antígeno para evocar uma resposta imune (humoral ou celular) quando administrado a um receptor. A presente invenção diz respeito a métodos que reduzem a imunogenicidade dos anticorpos quiméricos ou humanizados objetos.
O anticorpo humanizado de imunogenicidade reduzida refere- se a um anticorpo humanizado que exibe imunogenicidade reduzida em relação ao anticorpo precursor, por exemplo, o anticorpo de murino.
O anticorpo humanizado substancialmente que retém as propriedades de ligação do anticorpo precursor refere-se a um anticorpo humanizado que retém a capacidade para ligar especificamente o antígeno reconhecido pelo anticorpo precursor usado para produzir tal anticorpo humanizado. Preferivelmente o anticorpo humanizado exibirá a mesma ou substancialmente a mesma afinidade de ligação de antígeno e avidez como o anticorpo precursor. Idealmente, a afinidade do anticorpo não será menos do que 10 % da afinidade do anticorpo precursor, mais preferivelmente não menor do que cerca de 30 % e o mais preferivelmente a afinidade não será menor do que 50 % do anticorpo precursor. Os métodos para ensaiar a afinidade de ligação de antígeno são bem conhecidos na técnica e incluem ensaio de ligação semi-máxima, ensaios de competição e a análise de Scatchard. Os ensaios de ligação de antígeno adequados são descritos neste pedido.
Uma "retro mutação" é uma mutação introduzida em uma seqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo humanizado, a mutação resulta em um aminoácido que corresponde a um aminoácido no anticorpo precursor (por exemplo, anticorpo doador, por exemplo, um anticorpo de murino). Certos resíduos de matriz do anticorpo precursor podem ser retidos durante a humanização dos anticorpos da invenção de modo a substancialmente reter as propriedades de ligação do anticorpo precursor, enquanto que ao mesmo minimiza a imunogenicidade potencial do anticorpo resultante. Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo precursor é de origem de camundongo. Por exemplo, as mudanças de retromutação de um resíduo de matriz humano para um resíduo de murino precursor. Exemplos de resíduos de matriz que podem ser retro mutados incluem, mas não são limitados a, resíduos canônicos, resíduos de empacotamento de interface, resíduos precursores não usuais que estejam próximos do sítio de ligação, resíduos na "Zona de Vernier" (que forma uma plataforma na qual as CDRs repousam) (Foote & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224, 487-499) e aqueles próximos à CDR H3.
Como aqui usado uma "mudança conservativa" refere-se a alterações que são de modo substancialmente conformacional ou antígenoicamente neutras, que produzem mudanças mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes ou que produzem mudanças mínimas nos determinantes antigênicos dos polipeptídeos mutantes, respectivamente, quando comparados com a proteína nativa. Quando da alusão aos anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção, uma mudança conservativa significa uma substituição de aminoácido que não torna o anticorpo incapaz de ligar ao receptor objeto. Aqueles de habilidade comum na técnica serão capazes de prognosticar quais substituições de aminoácido podem ser feitas enquanto se mantém uma alta probabilidade de serem conformacional e antígenoicamente neutras, Tal orientação é fornecida, por exemplo em Berzofsky, (1985) Science 229: 932-940 e Bowie et al. (1990) Science 247: 1306-1310. Fatores a serem considerados que afetam a probabilidade de manter a neutralidade conformacional e antigênica incluem, mas não são limitados a: (a) a substituição de aminoácidos hidrofóbicos é menos provável de afetar a antígenoicidade porque os resíduos hidrofóbicos são mais prováveis de serem localizados em um interior da proteína; (b) a substituição de aminoácidos físico-quimicamente similares, é menos provável de afetar a conformação porque o aminoácido substituído imita estruturalmente o aminoácido nativo; e (c) a alteração de seqüências evolucionariamente conservadas é provável de afetar adversamente a conformação visto que tal conservação sugere que as seqüências de aminoácido podem ter importância. Uma pessoa de habilidade comum na técnica será capaz de avaliar as alterações na conformação da proteína usando ensaios bem conhecidos, tais como, mas não limitados aos métodos de fixação de microcomplemento (Wasserman et al. (1961) J. Immunol. 87: 290-295; Levine et al. (1967) Meth. Enzymol. 11: 928-936) e através de estudos de ligação usando anticorpos monoclonais dependentes de conformação (Lewis et al. (1983) Biochem. 22: 948-954).
Além disso, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de anticorpo que, quando administrada a um ser humano ou animal, é suficiente para resultar em um efeito terapêutico no dito ser humano ou animal. A quantidade eficaz é facilmente determinada por uma pessoa de habilidade na técnica seguindo procedimentos de rotina.
Como aqui usado, os termos "tratar," "prevenir," "prevenindo," e "prevenção" referem-se à prevenção da recorrência ou início de um ou mais sintomas de um distúrbio em um paciente que resulta da administração de um agente profilático ou terapêutico. Construção de Anticorpos Humanizados
A presente invenção pode ser entendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada de formas de realização específicas incluídas neste lugar. Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a detalhes específicos de certas formas de realização, desta, não é pretendido que tais detalhes sejam considerados como limitações no escopo da invenção.
A presente invenção fornece novos métodos e composições que compreendem anticorpos altamente específicos e altamente eficazes tendo a capacidade para reconhecer e ligar-se especificamente aos epítopos específicos de uma faixa de antígenos de β-amilóide. Os anticorpos habilitados pela divulgação da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento da amilóideose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amilóideose secundária e amilóideose relacionada com a idade incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson- Demência de Guam; assim como outro doenças que são fundamentadas em ou associadas com proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, hemorragia cerebral hereditária com amilóideose tipo Holandês, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrófica), Diabete de Início no Adulto; amilóideose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo a degeneração macular, para mencionar apenas uns poucos.
Uma região variável totalmente humanizada ou reformada de acordo com a presente invenção pode ser criada dentro do escopo da invenção planejando-se primeiro uma seqüência de aminoácido de região variável que contém CDRs não derivadas de ser humano, particularmente roedor, mas especialmente CDRs derivadas de anticorpo de murino ACI-O l-Ab7C2 (chamado de "mC2" por todo o pedido e depositado em 01 de dezembro de 2005 com a "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg I B, 38124 Branuschweig, sob as condições do Tratado de Budapest e dado o Acesso n° DSM ACC2750) embutidas em seqüências de matriz derivadas de ser humano. As CDRs não derivadas ser humano, particularmente de roedor, que podem ser obtidas a partir do anticorpo de acordo com a presente invenção, fornecem a especificidade desejada. Consequentemente, estes resíduos devem ser incluídos no planejamento da região variável reformada essencialmente inalterados. Quaisquer modificações devem ser assim restritas a um mínimo e observadas de perto quanto as mudanças na especificidade e afinidade do anticorpo. Por outro lado, resíduos de matriz em teoria podem ser derivados, de qualquer região variável humana.
De modo a criar um anticorpo reformado que mostra uma afinidade aceitável ou uma mesmo melhorada, uma seqüência de matriz humana deve ser escolhida, que é igualmente adequada para criar uma região variável reformada e para reter a afinidade de anticorpo.
De modo a alcançar esta meta, a estratégia de melhor ajuste foi desenvolvida. Visto que é conhecido que as seqüências de matriz servem para manter as CDRs na sua orientação espacial correta para a interação com antígeno e que os resíduos de matriz podem algumas vezes participar na ligação de antígeno, esta estratégia visa minimizar mudanças que possam afetar negativamente a estrutura tridimensional do anticorpo pela derivação da seqüência de matriz humana usada para a reforma do anticorpo da região variável humana que seja o mais homólogo ou similar à região variável não derivada de ser humano, particularmente de roedor. Isto também maximizará a probabilidade de que a afinidade será retida no anticorpo reformado.
No seu nível mais simples, a estratégia de "melhor ajuste" envolve comparar a região V de roedor doadora com todas as seqüências de aminoácido da região V humana conhecida e depois selecionar o mais homólogo para fornecer as regiões de matriz aceitadoras para o exercício da humanização. Na realidade existem diversos outros fatores que devem ser considerados e que podem influenciar a seleção final de regiões de matriz aceitadoras. Os prognósticos de modelagem molecular podem ser usados a este respeito antes de qualquer trabalho experimental em uma tentativa de maximizar a afinidade do anticorpo reformado resultante. Essencialmente, a meta da modelagem é prognosticar quais resíduos chave (se algum) da matriz humana mais homóloga deve ser deixada como no roedor para se obter a melhor afinidade no anticorpo reformado.
Em uma forma de realização da invenção, as CDRs são obteníveis a partir de anticorpo monoclonal de camundongo, particularmente a partir de anticorpo monoclonal de camundongo ACT-O l-Ab7C2 (chamado de "mC2" por todo o pedido) descrito no pedido co-pendente EP 05 02 7092.5 depositado em 12.12.2005, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência.
As células de hibridoma FP-12H3-C2, que produzem anticorpo monoclonal de camundongo ACI-01-Ab7C2 (chamado de "mC2" e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, por todo o pedido) foram depositadas em 01 de dezembro de 2005 no pedido co-pendente n° EP05027092.5 com o "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH. (DSMZ) na Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, sob as condições do Tratado de Budapest e dado o acesso n° DSM ACC2750.
O anticorpo de camundongo pode ser incitado contra uma construção antigênica supramolecular que compreende um peptídeo antigênico que corresponde à seqüência de aminoácido do peptídeo β- amilóide, particularmente dos peptídeos β-amilóide ΑβΜ5, ΑβΜ6 e Αβι_]6(Δΐ4), modificados com uma porção hidrofóbica tal como, por exemplo, ácido palmítico ou uma porção hidrofílica tal como, por exemplo, polietileno glicol (PEG) ou uma combinação de ambos, em que as porções hidrofóbica e hidrofílica, respectivamente, são covalentemente ligadas a cada um dos terminais do peptídeo antigênico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tais como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteína ou qualquer outro aminoácido ou análogo de aminoácido adequados capazes de servir como um dispositivo de conexão para ligar as porções hidrofóbica e hidrofílica ao fragmento de peptídeo. Quando um PEG é usado como a porção hidrofílica, os terminais de PEG livres são covalentemente ligados à fosfatidiletanolamina ou qualquer outro composto adequado à função como o elemento de ancoragem, por exemplo, para embutir a construção antigênica na bicamada de um lipossoma.
Em particular, um anticorpo de camundongo pode ser incitado contra uma construção antigênica supramolecular que compreende um peptídeo antigênico que corresponde à seqüência de aminoácido do peptídeo β-amilóide A131-16 modificado com uma porção hidrofílica tal como, por exemplo, polietileno glicol (PEG). A porção hidrofílica é covalentemente ligada a cada um dos terminais do peptídeo antigênico através de pelo menos um, particularmente um ou dois aminoácidos tal como, por exemplo, lisina, ácido glutâmico e cisteína ou qualquer outro aminoácido adequado ou análogo de aminoácido capaz de servir como um dispositivo de conexão para ligar as porções hidrofóbica e hidrofílica ao fragmento de peptídeo. Quando um PEG é usado como a porção hidrofílica, os terminais de PEG livres são covalentemente ligados à fosfatidiletanolamina ou qualquer outro composto adequado para funcionar como o elemento de ancoragem, por exemplo, para embutir a construção antigênica na bicamada de um lipossoma.
Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos que compreendem na região variável pelo menos uma CDR de origem não humana embutida em uma ou mais regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e combinadas com uma região constante derivada de um anticorpo de fonte humana ou primata, anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo estes que são capazes de reconhecer e ligar especificamente peptídeo monomérico de amilóide β.
As CDRs contêm os resíduos mais prováveis de ligar antígeno e devem ser retidas no anticorpo reformado. As CDRs são definidas pela seqüência de acordo com Kabat et al, Sequence of Proteínas of Immunological Interest, 5a Edição, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991. As CDRs caem em classes canônicas (Chothia et al, 1989 Nature, 342, 877- 883) onde resíduos chave determinam em um grau maior a conformação estrutural da alça de CDR. Estes resíduos são quase sempre retidos no anticorpo reformado.
No processo para preparar um anticorpo humanizado de acordo com a invenção, as seqüências de aminoácido do C2 de cadeia pesada e as regiões variáveis de cadeia leve (VH e VK) são comparadas com as seqüências Yh e Vk de anticorpo de roedor nas bases de dados NCBI e Kabat.
O gene da linha germinativa de camundongo de emparelhamento mais próximo a C2 Vk é bbl, Local MMU231201, (Schable et al, 1999). Uma comparação revela que dois aminoácidos diferem desta seqüência de linha germinativa, ambas localizadas dentro da CDRL1. Os anticorpos de murino maduros com seqüência similar, mas não idêntica, podem ser encontrados. Diversos têm uma CDRL2 idêntica e CDRL3 idêntica, mas a CDRLl de C2 parece ser única. A comparação com as seqüências Vk da linha germinativa humana mostra que os genes do subgrupo VkII são os melhores emparelhados para C2 Vk (Cox et al, 1994). C2 Vk podem ser assim designadas a Kabat subgrupo MuVkII. Seqüência.
DPK15 junto com o HuJkI da região J humana pode ser selecionado para fornecer as seqüências de matriz aceitadora para o Vk humanizado.
Os resíduos na interface entre as variáveis de cadeia leve e
pesada foram definidos (Chothia et al, 1985 J. Mol. Biol., 186, 651-663). Estes são usualmente retidos no anticorpo reformado. O Phe na posição 87 de C2 Vk de camundongo não é usual na interface, onde um Tyr é mais comum no subgrupo VKII, indicando que este resíduo de matriz pode ser importante para a atividade do anticorpo. Tyr 87 está presente na linha germinativa humana e C2VK humanizada.
As seqüências VK humanizadas assim podem ser planejadas tal que o C2HuVKl consista de CDRs C2 VK de camundongo com matrizes de DPK 15 e JkI humanas. Em uma forma de realização específica da invenção, resíduos de murino podem ser substituídos na região de matriz humana nas posições 45 e/ou 87. Na região de CDR2 obtenível a partir de um anticorpo monoclonal de camundongo, particularmente anticorpo de murino ACI-Ol- Ab7C2, as substituições de aminoácido podem ser feitas nas posições de Kabat 50 e/ou 53. O resíduo 45 pode estar envolvido na sustentação da conformação das CDRs. O resíduo 87 está localizado na interface dos domínios Vh e VK. Portanto estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação de anticorpo.
O gene da linha germinativa de camundongo emparelhado mais próximo a C2 Vh AF é VH7183, Local AF120466, (Langdon et al, 2000). A comparação com as seqüências Vh da linha germinativa humana mostra que os genes do subgrupo VhIII são os melhores emparelhados para C2 VB. C2 Vh AF podem ser planejados para o subgrupo MuVHIIID de Kabat. A seqüência DP54 junto com a região J humana HuJh6 pode ser selecionada para fornecer as seqüências de matriz aceitadoras para o Vh humanizado.
A comparação mostra que existem nove diferenças de aminoácido entre as seqüências C2 Vh e as seqüências da linha germinativa humana aceitadoras DP54 e JH6, a maior parte estando localizada dentro da CDRH2. Os anticorpos de murino maduros com CDRHl idêntica ou similar (um resíduo diferente) ou com CDRH2 similar (um resíduo diferente) são encontrados, mas nenhum com todos as três CDRs idênticas a C2 Vh AF. CDRH3 de anticorpo C2 não é usualmente curto, que consiste de apenas três resíduos. Entretanto, outros anticorpos são encontrados na base de dados com CDRH3 deste comprimento. O resíduo 47 de C2 Vh é Leu ao invés do Trp mais comum e o resíduo 94 é Ser ao invés do Arg normal, indicando que estes resíduos de matriz pode ser importante para a atividade de anticorpo.
Varias seqüências Vh humanizadas podem ser planejadas. C2HuVh1 consiste das CDRs C2 Vh AF com matrizes de DP54 e HuJh6. Em uma forma de realização específica da invenção, resíduos de murino podem ser substituídos na região de matriz humana nas posições 47 ou 94 ou ambas. O resíduo 47 na matriz 2 torna o contato tanto com as CDRs quanto com o domínio VK. O resíduo 94 pode estar envolvido na sustentação da conformação das CDRs. Portanto estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação de anticorpo.
Regiões HCVR e LCVR diferentes podem ser planejadas que compreendem as CDRs não humanas obteníveis do anticorpo doador, por exemplo, um anticorpo de murino, embutidas nas regiões de matriz nativas ou modificadas derivadas de ser humano ou primata. A modificação particularmente diz respeito a uma troca de um ou mais resíduos de aminoácido dentro da região de matriz pelos resíduos não humanos, particularmente resíduos de murino, mais habitualmente encontrados nesta posição nos respectivos subgrupos ou pelos resíduos que têm propriedades 5 similares àqueles mais habitualmente encontrados nesta posição nos respectivos subgrupos.
A modificação da região de matriz das seqüências de matriz servem para manter as CDRs na sua orientação espacial correta para a interação com antígeno e que os resíduos de matriz podem algumas vezes 10 participar mesmo na ligação de antígeno. Em uma forma de realização da invenção medidas são tomadas para adaptar ainda mais as seqüências da matriz humana selecionada para tomá-las mais similares às seqüências das matrizes de roedor de modo a maximizar a probabilidade de que a afinidade será retida no anticorpo reformado.
Consequentemente, os resíduos de murino na região de matriz
humana podem ser substituídos. Em particular, os resíduos de murino podem ser substituídos na região de matriz humana da região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) nas posições 47 ou 94 ou ambas e na região de matriz humana da região de Cadeia Variável Leve (LCVR) nas posições 45 e/ou 87. 20 Na Região de CDR2 obtenível de um anticorpo monoclonal de camundongo, particularmente anticorpo de murino ACI-O l-Ab7C2, as substituições de aminoácido podem ser feitas nas posições de Kabat 50 e/ou 53.
Os resíduos encontrados nas posições indicadas acima na região de matriz humana podem ser trocados pelos resíduos de murino mais 25 habitualmente encontrados nesta posição nos respectivos subgrupos, em particular, o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrado na SEQ ID NO: 15 pode ser substituído por um Leu ou por um resíduo de aminoácido que tem propriedades similares e a substituição do qual leva às alterações que são de modo substancial conformacional ou antígenoicamente neutras, produzindo mudanças mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes ou produzindo mudanças mínimas nos determinantes antigênicos. Em particular, o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz 5 derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrado na SEQ ID NO: 15 pode ser ainda substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de norleucina, Ile, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente por Ile. As substituições conservativas alternativas podem ser consideradas que são conformacional e antígenoicamente neutras. 10 O Arg na posição de Kabat 94 na região de matriz derivada de
ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrado na SEQ ID NO: 15 pode ser substituído por Ser ou por um resíduo de aminoácido que tem propriedades similares e a substituição do qual leva às alterações que são de modo substancial conformacional ou antígenoicamente 15 neutras, produzindo mudanças mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes ou produzindo mudanças mínimas nos determinantes antigênicos. Em particular, o Arg na posição de Kabat 94 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 pode ser alternativamente substituído por 20 Thr.
Em uma outra forma de realização da invenção, ambos os resíduos podem ser substituídos no anticorpo humanizado.
O Gln na posição de Kabat 45 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrado na 25 SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por Lys ou por um resíduo de aminoácido que tenha propriedades similares e a substituição do qual leva às alterações que são de modo substancial conformacional ou antígenoicamente neutras, produzindo mudanças mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes ou produzindo mudanças mínimas nos determinantes antigênicos. em particular, o Gln na posição de Kabat 45 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrado na SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Arg, Gln e Asn, particularmente por 5 Arg.
O Leu na posição de Kabat 50 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrado na SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por Lys ou por um resíduo de aminoácido que tem propriedades similares e a substituição do qual leva às 10 alterações que são de modo substancial conformacional ou antígenoicamente neutras, produzindo mudanças mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes ou produzindo mudanças mínimas nos determinantes antigênicos. Em particular, o Leu na posição de Kabat 50 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como 15 mostrado na SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Arg, Gln e Asn, particularmente por Arg.
O Asn na posição de Kabat 53 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrado na 20 SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por His e Gln ou por um resíduo de aminoácido que tem propriedades similares e a substituição do qual leva às alterações que são de modo substancial conformacional ou antígenoicamente neutras, produzindo mudanças mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes ou produzindo mudanças mínimas nos determinantes 25 antigênicos. Em particular, o Asn na posição de Kabat 53 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrado na SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Gin, His, Lys e Arg.
O Thr na posição de Kabat 87 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrado na SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por Phe ou por um resíduo de aminoácido que tem propriedades similares e a substituição do qual leva às alterações que são de modo substancial conformacional ou antígenoicamente 5 neutras, produzindo mudanças mínimas na estrutura terciária dos polipeptídeos mutantes ou produzindo mudanças mínimas nos determinantes antigênicos. Em particular, o Tyr na posição de Kabat 87 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrado na SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por um aminoácido 10 selecionado do grupo que consiste de Leu, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu.
A região variável assim obtida que compreende pelo menos uma CDR de origem não humana embutida em uma ou mais regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata podem ser depois combinadas com uma 15 região constante derivada de um anticorpo de fonte humana ou primata, particularmente com IgG4 humana ou regiões constantes k, respectivamente. A região constante de IgG4 pode ser modificada, por exemplo, trocando-se Serina na posição 228 na região de dobradiça por Prolina (HuIgG4 Ser-Pro). Esta mutação estabiliza a ligação de dissulfeto intercadeia e previne a 20 formação de meias moléculas que podem ocorrer nas preparações de IgG4 humanas nativas. A região de IgG4 constante pode ser ainda modificada pela deleção do Lys terminal na posição 439 como mostrado na SEQID NO: 16.
As regiões variáveis modificadas podem ser construídas pelos métodos conhecidos na técnica tais como, por exemplo recombinação de PCR 25 de sobreposição. Os cassetes de expressão para o anticorpo quimérico, C2 ChVH AF e C2 ChVK, podem ser usados como padrões para a mutagênese das regiões de matriz para as seqüências requeridas. Conjuntos de pares de iniciador mutagênico são sintetizados que abrangem as regiões a serem alteradas. Os cassetes de expressão Vh e Vk humanizados produzidos podem ser clonados em vetores de clonagem apropriados conhecidos na técnica tais como, por exemplo, pUC19. Depois que a seqüência de DNA inteira é confirmada estar correta para cada Vh e VK, os genes da região V de cadeia pesada e leve modificada podem ser excisados do vetor de clonagem como 5 cassetes de Expressão. Estes podem ser depois transferidos para vetores de expressão apropriados tais como pSVgpt e pSVhyg que incluem Ser-Pro ou regiões constantes κ da IgG4 humana respectivamente.
VETORES DE EXPRESSÃO
O vetor de expressão pSVgpt é fundamentado no pSV2gpt 10 (Mulligan e Berg, 1980) e inclui o gene de resistência à ampicilina para a seleção em células bacterianas, o gene gpt para a seleção em células de mamífero, a região realçadora da imunoglobulina de cadeia pesada de murino, seqüência genômica que codifica o gene da região constante e seqüências poli A de SV40. A Região Variável de Cadeia pesada para a expressão é inserida 15 como um fragmento de HIndIII a BamHI.
O vetor de expressão pSVhyg inclui o gene de resistência à ampicilina para a seleção em células bacterianas, o gene hyg para a seleção em células de mamífero, a região realçadora de imunoglobulina de cadeia pesada de murino, seqüência genômica que codifica o gene da região capa 20 constante e incluindo o realçador capa e as seqüências poli A de SV40. A região variável de cadeia leve para a expressão é inserida como um fragmento de HIndIII a BamHI.
A seqüência de DNA é depois confirmada estar correta quanto a Vh e Vk humanizadas nos vetores de expressão.
Para a produção de anticorpo os vetores de expressão de
cadeia pesada e leve humanizadas podem ser introduzidos nas linhagens de célula de produção apropriadas conhecidas na técnica tais como, por exemplo, células NSO. A introdução dos vetores de expressão pode ser realizada pela co-transfecção por intermédio da eletroporação ou qualquer outra tecnologia de transformação adequada disponível na técnica, as linhagens de células que produzem anticorpo podem ser depois selecionadas e expandidas e anticorpos humanizados purificados. Os anticorpos purificados podem ser depois analisados pelas técnicas padrão tais como SDS-PAGE.
5 ANTICORPO COM AFINIDADE. ESPECIFICIDADE E ESTABILIDADE MELHORADAS
A seqüência de CDRL2 (“KVSNRFS”) do anticorpo C2 de camundongo pode ser modificada levemente sem afetar adversamente a atividade de anticorpo. As substituições conservativas podem ser feitas 10 através da troca de R no lugar de K na posição 50 e S no lugar de N na posição 53. As duas seqüências de CDRL2 alternativas são portanto “RVSNRFS” e “KVSSRFS”, respectivamente. Estas são incorporadas na seqüência Vk de murino sem nenhuma outra mudanças, como C2 Vk-R e C2 Vk-S, respectivamente.
A afinidade, especificidade e estabilidade de um anticorpo de
acordo com a invenção como aqui descrito antes ou um fragmento do mesmo pode ser modificada pela mudança do seu perfil ou padrão de glicosilação que resultam em valores terapêutico melhorados.
Para se obter esta mudança no padrão de glicosilação, as 20 células hospedeiras podem ser engendradas tal que elas sejam capazes de expressar uma faixa preferida de uma atividade de glicosil transferase que modifica a glicoproteína que aumenta oligossacarídeos ligados em N complexos que carregam GIcNAc que se divide em duas partes. Além disso, as glicoformas modificadas de glicoproteínas podem ser obtidas, por exemplo 25 anticorpos, incluindo moléculas de anticorpo inteiras, fragmentos de anticorpo ou proteínas de fusão que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina, tendo uma citotoxicidade celular mediada por Fc realçada.
Os métodos de obter anticorpos com padrão de glicosilação modificada são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e descritos, por exemplo, na EP1071700, US2005272128, Ferrara et al (2006) J Biol. Chem 281(8), 5032-5036); Ferrara et al (2006) Biotechnology and Bioengineering 93(5), 851-861.
PREPARAÇÃO E ADMINISTRAÇÃO FARMACÊUTICAS 5 Os anticorpos de acordo com a invenção, mas particularmente
um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção, podem ser preparados em uma formulação fisiologicamente aceitável e podem compreender um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável usando técnicas conhecidas. Por exemplo, o anticorpo de acordo com a invenção e 10 como descrito neste lugar antes incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes, em particular, o anticorpo monoclonal incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais destes é combinado com um carreador, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição 15 terapêutica. Carreadores, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, soluções de salina tamponada com fosfato, água, emulsões tal como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc.
Formulação da composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser realizada de acordo com metodologia padrão conhecida por aqueles habilitados na técnica.
As composições da presente invenção podem ser administradas a um sujeito na forma de um sólido, líquido ou aerosol em uma dose farmaceuticamente efetiva adequada. Exemplos de composições sólidas 25 incluem pílulas, cremes e unidades de dosagem implantáveis. Pílulas podem ser administradas oralmente. Cremes terapêuticos podem ser administrados topicamente. Unidades de dosagem implantáveis podem ser administradas localmente, por exemplo, em um sítio de tumor ou podem ser implantadas para liberação sistemática da composição terapêutica, por exemplo, subcutaneamente. Exemplos de composições líquidas incluem formulações adaptadas para injeção intramuscularmente, subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente e formulações para administração tópica e intraocular. Exemplos de formulações de aerosol incluem formulações inaladoras para administração aos pulmões.
As composições podem ser administradas por vias de administração padrão. Em geral, a composição pode ser administrada por via tópica, oral, retal, nasal, interdérmica, intraperitoneal ou parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea ou intramuscular). Em adição, a composição pode ser incorporada em matrizes de liberação a longo prazo tal como polímeros biodegradáveis, os polímeros sendo implantados na vizinhança de onde liberação é desejada, por exemplo, no sítio de um tumor. O método inclui administração de uma única dose, administração de doses repetidas em intervalos de tempo pré-determinados e administração sustentada por um período de tempo pré-determinado.
Uma matriz de liberação a longo prazo, como usado neste lugar, é uma matriz feita de materiais, normalmente polímeros que são degradáveis por hidrólise enzimática ou de ácido/base ou por dissolução. Uma vez inserida no corpo, a matriz é influenciada por enzimas e fluidos corporais. A matriz de liberação a longo prazo de forma desejável é escolhida por materiais biocompatíveis tal como lipossomos, polilactídeos (ácido polilactídeo), poliglicolida (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co- glicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico), polianidridos, poli(orto)ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídios, polissacarídeos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tal como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinil propileno, polivinilpirrolidona e silicone. Uma matriz biodegradável preferida é uma matriz de um de qualquer um de polilactídeo, poliglicolídeo ou polilactida co-glicolida (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico).
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E bem conhecido por aqueles habilitados na técnica pertinente que a dosagem da composição irá depender de vários fatores tal como, por exemplo, a condição sendo tratada, a composição particular usada e outros 5 fatores clínicos tal como peso, tamanho, sexo e condição geral de saúde do paciente, área de superfície corporal, o composto ou composição particular a ser administrada, outras drogas sendo administradas concorrentemente e a via de administração.
A composição pode ser administrada em combinação com 10 outras composições compreendendo uma substância ou composto biologicamente ativo, particularmente pelo menos um composto selecionado a partir do grupo consistindo de compostos contra estresse oxidativo, compostos anti-apoptóticos, quelantes de metal, inibidores de reparo de DNA tal como pirenzepina e metabólitos, 3-amino-l-ácido propanosulfônico 15 (3 APS), 1,3-propanodisulfonato (1,3PDS), ativadores de a-secretase, inibidores de β- e y-secretase, proteínas tau, neurotransmissor, degradadores de folha-β, atraentes para componentes celulares quee depuram/esgotam beta- amilóide, inibidores debeta-amilóide truncado no teerminal N incluindo beta- amilóide 3-41 piroglutamatado, moléculas antiinflamatórias, “antipsicóticos 20 atípicos” tal como, por exemplo clozapina, ziprasidona, risperidona, aripiprazol ou olanzapina ou inibidores de colinesterase (ChEls) tal como tacrina, rivastigmina, donepezil, e/ou galantamina, agonistas Ml e outros medicamentos incluindo qualquer medicamento modificador de amilóide ou tau e suplementos nutritivos tais como, por exemplo, vitamina B12, cisteína, 25 um precursor de acetilcolina, lecitina, colina, Ginkgo biloba, acetil-L- camitina, idebenona, propentofilina ou um derivado de xantina, junto com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitável e procedimentos para o tratamento de doenças. Matéria proteínaácea farmaceuticamente ativa pode estar presente em quantidades entre I ng e 10 mg por dose. Geralmente, o regime de administração deve ser no intervalo de entre 0,1 μg e 10 mg do anticorpo de acordo com a invenção , particularmente em um intervalo de 1,0 μg a 1,0 5 mg e mais particularmente em um intervalo de entre 1,0 μg e 100 μg, com todos os números individuais caindo dentro destes intervalos também sendo parte da invenção. Se a administração ocorre através de infusão contínua uma dosagem mais apropriada pode ser no intervalo de entre 0,01 μg e 10 mg unidades por quilograma de peso corporal por hora com todos os números 10 individuais caindo dentro destes intervalos também sendo parte da invenção.
A administração será geralmente parenteralmente, por exemplo, intravenosamente. Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas e não aquosas estéreis. Solventes não aquosos incluem sem ser limitado a, propilenoglicol, 15 polietilenoglicol, óleo vegetal tal como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tal como etil oleato. Solventes aquosos podem ser escolhidos a partir do grupo consistindo de água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose 20 e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos fixados. Veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutriente, repositores eletrolíticos (tal como aqueles baseados em dextrose de Ringer) e outros. Conservantes também podem estar presentes tal como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, etc.
A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente
carreadores proteínaáceos tal como, por exemplo, albumina de soro ou imunoglobulina, particularmente de origem humana. Agentes biologicamente ativos adicionais podem estar presentes na composição farmacêutica da invenção dependente de seu uso pretendido. Quando o alvo de ligação é localizado no cérebro, certas formas de realização da invenção fornecem o anticorpo ou fragmento ativo deste para atravessar a barreira hematoencefálica. Certas doenças neurodegenerativas estão associadas com um aumento na permeabilidade da 5 barreira hematoencefálica, tal que o anticorpo ou Jfragmento ativo deste possam ser facilmente introduzidos no cérebro. Quando a barreira hematoencefálica permance intacta, diversos métodos conhecidos na técnica existem para transportar moléculas através da mesma, incluindo, mas não limitado a, métodos físicos, métodos fundamentados em lipídeo e métodos 10 fundamentados em receptor e canal.
Os métodos físicos de transportar o anticorpo ou fragmento ativo deste através da barreira hematoencefálica incluem, mas não são limitados a, evitar a barreira hematoencefálica totalmente ou criando-se aberturas na barreira hematoencefálica. Os métodos de evitação incluem, mas 15 não são limitados a, injeção direta no cérebro (ver, por exemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implantando um dispositivo de liberação no cérebro (ver, por exemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); e Gliadel Wafers®, Guildford Pharmaceutical). Métodos de criar aberturas na barreira incluem, mas não são limitadas a, ultrassom 20 (ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. N° 2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, pela administração de manitol hipertônico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), permeabilização, por exemplo, pela bradilcinina ou permeabilizador A-7 (ver, por exemplo, a Patente U.S. N~ 25 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 e 5.686.416) e transfecção de neurônios que se estendem sobre a barreira hematoencefálica com vetores contendo genes que codificam o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno (ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. N- 2003/0083299).
Os métodos fundamentados em lipídeo de transportar o anticorpo ou fragmento ativo deste através da barreira hematoencefálica incluem, mas não são limitados a, encapsular o anticorpo ou fragmento ativo deste em lipossomas que são ligados aos fragmentos de ligação de anticorpo que se liggam aos receptores no endotélio vascular da barreira 5 hematoencefálica (ver, por exemplo, a Publicação do pedido de patente U.S. N° 20020025313) e revestir o anticorpo ou fragmento ativo deste em partículas de lipoproteína de baixa densidade (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 20040204354) ou apolipoproteína E (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 20040131692),
Os métodos fundamentados no receptor e canal de transportar
o anticorpo ou fragmento ativo deste através da barreira hematoencefálica incluem, mas não são limitadas a, usar bloqueadores de glicocorticóide para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (ver, por exemplo, as Publicações do Pedido de Patente U.S. N- 2002/0065259, 2003/0162695 e 15 2005/0124533); ativar os canais de potássio (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N- 2005/0089473), inibir os transportadores de medicamento ABC (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 2003/0073713); reevestir anticorpos com uma transferrina e atividade moduladora do um ou mais receptores de transferrina (ver, por exemplo, 20 Publicação do Pedido de Patente U.S. N- 2003/0129186) e cationizar os anticorpos (ver, por exemplo, Patente U.S. Ns 5.004.697). DETECÇÃO/DIAGNÓSTICO
Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece métodos e kits para a detecção e diagnóstico de doenças ou condições associadas com amilóide. Estes métodos incluem métodos imunológicos conhecidos habitualmente usados para detectar ou quantificar substâncias em amostras biológicas ou em uma condição in situ.
O diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente pode ser obtido pela detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína de amilóide em um amostra ou in situ, que inclui levar a amostra ou uma parte ou área do corpo específicas opcionalmente comparando a quantidade do dito complexo imunológico com um valor de 5 controle normal, em que um aumento na quantidade do dito agregado comparado com um valor de controle normal indica que o dito paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma doença ou condição associada com amilóide.
A monitorização da doença residual mínima em um paciente a 10 seguir do tratamento com um anticorpo ou uma composição de vacina de acordo com a invenção pode ser obtida pela detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína de amilóide em uma amostra ou in situ, que inclui levar a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas suspeitas 15 de conter o antígeno de amilóide em contato com um anticorpo que liga um epítopo da proteína de amilóide, permitindo que o anticorpo se ligue ao antígeno de amilóide para formar um complexo imunológico, detectando a formação do complexo imunológico e correlacionado a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno de 20 amilóide na amostra ou parte ou área do corpo específica, opcionalmente comparando a quantidade do dito complexo imunológico com um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do dito agregado comparada a um valor de controle normal indica que o dito paciente pode sofrer ainda de uma doença residual mínima.
O prognóstico da responsividade de um paciente a um
tratamento com uma composição de vacina de acordo com a invenção pode ser obtido pela detecção da ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epítopo da proteína de amilóide em uma amostra ou in situ, que inclui ligar a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específica suspeita de conter o antígeno de amilóide em contato com um anticorpo que se liga a um epítopo da proteína de amilóide, prmitindo que o anticorpo se ligue ao antígeno de amilóide para formar um complexo imunológico, detectando a formação do complexo 5 imunológico e correlacionando a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno de amilóide na amostra ou parte ou área do corpo específicas, opcionalmente comparando a quantidade do dito complexo imunológico antes e depois do início do tratamento, em que uma diminuição na quantidade do dito agregado indica IO que o dito paciente tem um alto potencial de ser responsivo ao tratamento.
As amostras biológicas que podem ser usadas no diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide são, por exemplo, fluidos tais como soro, plasma, saliva, secreções gástricas, muco, fluido cerebroespinal, fluído linfático e outros ou amostras de tecido ou célula 15 obtidas de um organismo tal como tecido neural, cérebro, cardíaco ou vascular. Para determinar a presença ou ausência da proteína de amilóide em uma amostra qualquer imunoensaio conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica. (Ver Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque 1988 555-612) pode ser usado 20 tal como, por exemplo, ensaios que utilizam métodos de detecção indirectos usando reagentes secundários para a detecção, ensaios de ELISA e imunoprecipitação e aglutinação. Uma descrição detalhada destes ensaios é, por exemplo, dado na W096/13590 concedida a Maertens e Stuyver, Zrein et al. (1998) e W096/29605.
Para diagnose in situ, o anticorpo de qualquer parte ativa e
funcional deste pode ser administrado ao organismo a ser diagnosticado por métodos conhecidos na arte tal como, por exemplo, injeção intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intra-arterial de forma que uma ligação específica entre o anticorpo de acordo com a invenção com uma região epitópica na proteína amilóide pode ocorrer. O complexo anticorpo/antígeno pode ser detectado através de uma marca acoplada ao anticorpo ou um fragmento funcional deste.
Os imunoensaios usados em aplicações diagnosticas tipicamente recorrem a antígenos marcados, anticorpos ou reagentes secundários para detecção. Estas proteínas ou reagentes podem ser marcados com compostos geralmente conhecidos por aqueles habilitados na técnica incluindo enzimas, radioisótopos e substâncias fluorescentes, luminescentes e cromogênicas incluindo partículas coloridas, tal como ouro coloidal e microesferas de látex. Destes, marcação radioativa pode ser usada para praticamente todos os tipos de ensaios e com mais variações. Marcadores conjugados a enzimas são particularmente úteis quando radioatividade precisa ser evitada ou quando resultados rápidos são necessários. Fluorocromos, embora requerendo equipamento caro para seu uso, fornecem um método muito sensível de detecção. Anticorpos úteis nestes ensaios incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos policlonais purificados por afinidade.
Alternativamente, o anticorpo pode ser marcado indiretamente por reação com substâncias marcadas que têm uma afinidade para 20 imunoglobulina, tal como proteína A ou G ou anticorpos secundários. O anticorpo pode ser conjugado com uma segunda substância e detectado com uma terceira substância marcada tendo uma afinidade para a segunda substância conjugada ao anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a biotina e o conjugado de anticorpo-biotina detectado usando 25 avidina ou estreptavidina marcada. Similarmente, o anticorpo pode ser conjugado a um hapteno e o conjugado de anticorpo-hapteno detectado usando anticorpo anti-hapteno marcado.
Aqueles habilitados na técnica saberão destas e outros marcadores adequados que podem ser empregados em conformidade com a presente invenção. A ligação destes marcadores a anticorpos ou fragmentos destes pode ser realizada usando técnicas padrão comumente conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Técnicas típicas são descritas por Kennedy, J. H., et al.,1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31) e Schurs, A. H. W. M., et al. 1977 5 (Clin. Chim Acta 81:1-40). Técnicas de acoplamento mencionadas no último são o método de glutaraldeído, o método de periodato, o método de dimaleimida e outros, todos os quais são incorporados por referência neste lugar.
Imunoensaios atuais utilizam um método com dois anticorpos para detectar a presença de um analito, em que. O anticorpo é marcado indiretamente por reatividade com um segundo anticorpo que foi marcado com um marcador detectável. O segundo anticorpo preferivelmente é um que se liga a anticorpos do animal do qual o anticorpo monoclonal é derivado. Em outras palavras, se o anticorpo monoclonal é um anticorpo de camundongo, então o segundo anticorpo marcado é um anticorpo anti-camundongo. Para o anticorpo monoclonal a ser usado no ensaio descrito abaixo, este marcador preferivelmente é uma microesfera revestida com anticorpo, particularmente uma microesfera magnética. Para o anticorpo policlonal a ser empregado no imunoensaio descrito neste lugar, o marcador preferivelmente é uma molécula detectável tal como uma substância radioativa, fluorescente ou uma eletroquimioluminescente.
Um sistema de anticorpo duplo alternativo, freqüentemente referido como sistemas de formatos rápidos porque eles são adaptados a determinações rápidas da presença de um analito, também pode ser 25 empregado dentro do escopo da presente invenção. O sistema requer alta afinidade entre o anticorpo e o analito. De acordo com uma forma de realização da presente invenção, a presença da proteína de amilóide é determinada usando um par de anticorpos, cada um específico para a pprroteína de amilóide. Um de ditos pares de anticorpos é referido neste lugar como um “anticorpo detector” e o outro de dito par de anticorpos é referido neste lugar como um “anticorpo de captura”. O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser usado ou como um anticorpo de captura ou um anticorpo detector. O anticorpo monoclonal da presente invenção também 5 pode ser usado tanto como anticorpo de captura como detector, juntos em um ensaio único. Uma forma de realização da presente invenção assim usa o método de sanduíche de anticorpo duplo para detectar a proteína de amilóide em uma amostra de fluido biológico. Neste método, o analito (proteína de amilóide) é colocado entre o anticorpo detector e o anticorpo de captura, o 10 anticorpo de captura sendo irreversivelmente imobilizado em um suporte sólido. O anticorpo detector pode conter um marcador detectável, a fim de identificar a presença do sanduíche anticorpo-analito e assim a presença do analito.
Substâncias de fase sólida exemplares incluem, mas não são 15 limitadas a, placas de microtítulo, tubos de teste de poliestireno, microesferas magnéticas, plásticas ou de vidro e lâminas que são bem conhecidas no campo de radioimunoensaio e imunoensaio enzimático. Métodos para acoplar anticorpos a fases sólidas também são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Mais recentemente, diversos materiais porosos tal como náilon, 20 nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polímeros porosos foram empregados como suportes sólidos.
A presente invenção também se refere a um kit diagnóstico para detectar a proteína de amilóide em uma amostra biológica compreendendo uma composição como definido acima. Além disso, a 25 presente invenção se refere ao último kit diagnóstico que, em adição a uma composição como definido acima, também compreende um reagente de detecção como definido acima. O termo “kit diagnóstico” se refere em geral a qualquer kit diagnóstico conhecido na arte. Mais especificamente, o último termo se refere a um kit diagnóstico como descrito em Zrein et al. (1998). É ainda um outro objetivo da presente invenção fornecer novas imunossondas e kits de teste para detecção e diagnose de doenças e condições associadas a amilóide compreendendo anticorpos de acordo com a presente invenção. Para imunossondas, os anticorpos são diretamente ou indiretamente acoplados a uma molécula repórter adequada, e.g., uma enzima ou um radionuclídeo. O kit de teste inclui um recipiente retendo um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e instruções para usar os anticorpos para o propósito de ligar um antígeno amilóide para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico de forma que presença ou ausência do complexo imunológico se correlaciona com presença ou ausência de antígeno amilóide.
EXEMPLOS
Materiais
O desenvolvimento e preparação de anticorpo monoclonal de camundongo ACI-O l-Ab7C2 (chamado de “mC2” e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, por todo o pedido) é descrito no pedido co-pendente EP 05 02 7092.5 depositado em 12.12.2005, a divulgação do qual é aqui incorporada por referência.
As células de hibridoma FP-12H3-C2, que produz anticorpo monoclonal de camundongo ACI-O l-Ab7C2 (chamado de “mC2” e hC2 para o anticorpo C2 humanizado, por todo o pedido) foram depositadas em 01 de dezembro de 2005 no pedido co-pendente N2 EP05027092.5 com o “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ) em Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, sob as condições do Tratado de Budapest e dado o acesso n° DSM ACC2750.
As células de hibridoma foram cultivadas em Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10 % de soro bovino fetal e antibióticos (Penicilina/Estreptomicina). O isótipo do anticorpo produzido foi checado e descoberto ser IgG2b/capa de camundongo, como esperado.
Ensaio
Um ELISA quanto à ligação ao Beta-amilóide forneceu uma medida confiável da potência de anticorpos C2. Os anticorpos de controle positivo, anticorpo FP-12H3-C2 de murino (Genovac Lote N2: AK379/01) e anticorpo Chemicon padrão 1560 (Lote N°: 0508008791).
Escolha de regiões constantes humanas
Visto que o recrutamento do sistema imune não é desejável para o candidato de anticorpo clínico, a região constante humana selecionada 10 para a cadeia pesada foi IgG4 humana, modificada para trocar a Serina na posição 228 na região de dobradiça para Prolina (HuIgG4 Ser-Pro). Esta mutação estabiliza a ligação de dissulfeto intercadeia e previne a formação de meias moléculas que pode ocorrer nas preparações de IgG4 humana nativa. O anticorpo expressado a partir das linhagens de célula de produção também 15 terão a lisina terminal removida. As seqüências das regiões constantes humanas HuIgG4 Ser-Pro e Capa humana são dadas nas SEQ ID NOs: 17 e 14, respectivamente.
Exemplo 1: Clonagem e Sequênciamento de Regiões Variáveis de Anticorpo O RNA total foi preparado a partir de 3 x IO6 células de hibridoma (um frasco Tl75) usando o mini kit Qiagen RNeasy (Cat N2: 74104). O RNA foi eluído em 50 μΐ de água e checado em um gel de agarose a 1,2 %. O meio condicionado das células foi retido e uma amostra usada para testar no ensaio de atividade de anticorpo.
Vh e Vk cDNAs foram preparados usando transcriptase reversa com iniciadores da região constante de IgG e K de camundongo.
Os cDNAs do primeiro filamento foram amplificados pela PCR usando um conjunto grande de iniciadores de seqüência de sinal. Os DNAs amplificados foram purificados em gel e clonados no vetor pGem® T Easy (Promega). Os clones Vh e Vk obtidos foram triados quanto aos insertos do ttamanho esperado pela PCR e a seqüência de DNA de clones selecionados determinada pelo sequênciamento de DNA automatizado. As localizações das regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) nas seqüências foram determinadas com referência a outras seqüências de anticorpo (Kabat BA et 5 al., 1991). A convenção de numeração de KABAT para as regiões variáveis de anticorpo é usada por todo este pedido; consequentemente os números de resíduo podem diferir do número linear exato.
A seqüência de DNA e a seqüência de aminoácido deduzida para mC2 Vk são mostradas nas SEQ ID NOs: 29 e 27, respectivamente. Quatro clones deram esta seqüência produtiva idêntica. Uma seqüência Vk aberrante não produtiva que surge do parceiro de fusão de hibridoma também foi encontrada em diversos clones.
Para mC2 VH, duas seqüências produtivas diferentes foram isoladas. A seqüência mC2 Vh AF (ver a SEQ ID NO: 30) foi encontrada em 15 um total de 29 clones, com 14 mudanças de par de base única em clones individuais. A seqüência mC2 Vh B foi encontrada em um total de 8 clones. Cinco destes representaram a maioria das seqüências, com os outros 3 clones sendo variações destas. É possível que estas seqüências Vh B similares surjam como um artefato da amplificação de PCR. Uma Vh aberrante não produtiva 20 também foi obtida a partir do hibridoma C2 e é atribuída à união V-D-J defeituosa.
De modo a determinar qual é a mC2 Vh ativa correta, dois anticorpos quiméricos foram preparados com as duas seqüências Vh diferentes, AF e B, combinadas com a mC2 VK, para serem testadas quanto a atividade de anticorpo correta.
Exemplo 2 Construção de Genes de Anticorpo Quiméricos
Um anticorpo quimérico humano na sua forma mais comum consiste de regiões constantes humanas ligadas às regiões variáveis de murino (ou outras não humanas). Um anticorpo quimérico fornece uma ferramenta muito útil, primeiramente para a confirmação de que as regiões variáveis corretas foram identificadas, em segundo lugar para o uso como um anticorpo de controle nos ensaios de ligação de antígeno com as mesmas funções efetoras e utilizando os mesmos reagentes de detecção secundários como um anticorpo humanizado ou engendrado e também pode ser usado para investigar a farmacocinética e outras propriedades das regiões constantes humanas com referência ao alvo particular para o anticorpo.
Dois vetores de expressão quiméricos de cadeia pesada foram construídos que consistem das regiões variáveis mC2 Vh AF ou mC2 Vh B ligadas à região constante de HuIgG4 (Ser-Pro) no vetor de expressão pSVgpt. Isto é fundamentado no pSV2gpt (Mulligan e Berg, 1980) e inclui o gene de resistência à ampicilina para a seleção em células bacterianas, o gene gpt para a seleção em células de mamífero, a região realçadora de imunoglobulina de cadeia pesada de murino, a seqüência genômica que codifica o gene da região constante e as seqüências poli A de SV40. A Região Variável de Cadeia pesada para a expressão é inserida como um fragmento de HIndIII a BamHI.
Um vetor quimérico de cadeia leve foi construído que consiste de C2 Vk ligado à região constante C Capa humana no vetor de expressão pSVhyg. (Hieter PA et al, 1980) pSVhyg inclui o gene de resistência à ampicilina para a seleção em células bacterianas, o gene hyg para a seleção em células de mamífero, a região realçadora da imunoglobulina de cadeia pesada de murino, a seqüência genômica que codifica o gene da região constante capa e incluindo a seqüência realçadora capa e a seqüência poli A de SV40. A região variável de cadeia leve para a expressão é inserida como um fragmento de HIndIII a BamHI.
Cassetes de Expressão para as seqüências de C2 Vh e Vk de murino foram construídas pela adição de seqüências flanqueadoras 5’ incluindo o peptídeo de sinal líder, intron líder e o promotor da imunoglobulina de murino e a seqüência flanqueadora 3’ incluindo o sítio de junção e a seqüência de intron, usando os vetores Vh-PCRI e Vk-PCRI como padrões (Riechmann et al., 1988). A seqüência de DNA foi confirmada ser corrigida quanto a Vh e Vk nos vetores de expressão quimérica. O DNA e as 5 seqüências de aminoácido dos genes Vh e Vk nos Cassetes de Expressão são mostrados nas Figuras 1 e 2.
Exemplo 3 Expressão de Anticorpos Quiméricos 3.1 Expressão em linhagens de célula estáveis
A linhagem de célula hospedeira para a expressão de anticorpo foi NSO, um 10 mieloma de camundongo que não produz imunoglobulina, obtida da European Collection of Animal Cell Cultures, Porton UK (ECACC N2 85110503). Os vetores de expressão de cadeia pesada e leve foram co-transfectados em células NSO pela eletroporação. As colônias que expressam o gene gpt foram selecionados em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) 15 suplementado com 10 % de soro boviino fetal (FBS), 0,8 μg/ml de ácido micofenólico e 250 μg/ml de xantina. Os clones de célula transfectada foram triados quanto a produção de anticorpo humano pelo ELISA para IgG humano. As linhagens de célula que secretam anticorpo foram expandidas e os produtores mais altos selecionados e congelados em nitrogênio líquido. A 20 melhor linhagem de células produzinda para cada anticorpo foi expandida em meio como acima mas apenas com 5 % de FBS. Os anticorpos quiméricos foram purificados usando Prosep®-A (Bioprocessing Ltd). A concentração foi determinada pelo ELISA para anticorpo IgGK humano. Os anticorpos também foram analisados pelo SDS-PAGE.
3.2 Expressão transitória de anticorpos quiméricos
Para acelerar o teste dos anticorpos quiméricos diferentes, a expressão transitória foi usada para produzir rapidamente quantidades pequenas de sobrenadante de célula contendo anticorpo recombinante para teste. Os cassetes de expressão Vh e Vk de mC2 foram transferidos para vetores fundamentados em pcDNA3.1 (Invitrogen) para a expressão transitória. O vetor de cadeia pesada incluiu uma região constante de IgG humana. O vetor de cadeia leve incluiu uma região constante capa humana. Tanto mC2 Vh AF quanto mC2 Vh B foram transfectados com mC2 Vk em células renais embrionárias humanas human (HEK 298) com reagente de Lipofectamina 2000 (Invitrogen Cat N2: 11668) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. O meio condicionado foi colhido das células 3 dias depois da transfecção. A quantidade de anticorpo produzido foi determinada pelo ELISA para o anticorpo de IgGK humano.
Exemplo 4 Atividade de Anticorpos C2 Quiméricos
4.1 Atividade de anticorpos C2 quiméricos produzidos pela transfecção transitória
Amostras de meio condicionado de transfecção transitória para os dois anticorpos quiméricos diferentes foram testados no ELISA quanto a ligação ao Beta-amilóide. Os resultados claramente indicam que a C2 Vh AF é a seqüência correta. O anticorpo quimérico C2 Vh AF/C2 Vk liga bem no ensaio, mas o C2 Vh B/C2 Vk não mostra nenhuma ligação sob qualquer condição. O anticorpo de controle de murino Chemicon 1560 mostrou boa ligação, mas a ligação pelo anticorpo C2 de murino purificado fornecido foi baixa. Deve ser mencionado que um anticorpo secundário diferente foi utilizado para os anticorpos de murino com as regiões constantes de camundongo comparadas comm os anticorpos quiméricos com regiões constantes humanas, de modo que os resultados não fossem diretamente comparáveis. O meio condicionado do hibridoma C2 foi mais tarde descoberto dar um bom resultado no ensaio.
4.2 Atividade de anticorpos C2 quiméricos purificados
Os dois anticorpos quiméricos C2 diferentes foram purificados a partir de linhagens de célula NSO estáveis como descrito e testado usando o ELISA de Beta-amilóide. Os resultados obtidos estão de acordo com os resultados obtidos com anticorpo transitoriamente expressado. O anticorpo C2 ChVH AF/ChVjt liga bem no ELISA e o anticorpo C2 ChVH B/ChVK não liga sob nenhuma condição.
Exemplo 5 Planejamento de Genes de Anticorpo C2 Humanizados
As seqüências de aminoácido mC2 Vh e Vk foram comparadas com seqüências de anticorpo Vh e Vk de roedor nas bases de dados da NCBI e Kabat.
5.1 Região variável de cadeia leve
O gene da linha germinativa de camundongo de emparelhamento mais próximo para mC2 Vk é bbl, Local MMU231201, (Schable et al, 1999). Apenas dois aminoácidos diferem desta seqüência da linha germinativa, ambas localizadas dentro da CDRL1. Anticorpos de murino maduros com seqüência similar, mas não idêntica, são encontrados. Diversos têm uma CDRL2 idêntica e CDRL3 idêntica, mas a CDRL1 de mC2 parece ser única. mC2 Vk pode ser designada ao subgrupo Kabat MuVKII. Posição 87 da mC2 Vk é F ao invés do Y que é mais comum no subgrupo, indicando que este resíduo de matriz pode ser importante para a atividade de anticorpo. A comparação com as seqüências da linha germinativa Vk humana mostra que os genes do subgrupo VkII são o melhor desemparelhamento para mC2 Vk (Cox et al, 1994). A seqüência DPKl5 junto com a região J humana HuJkI foram selecionadas para fornecer as seqüências de matriz aceitadoras para a Vk humanizada.
Quatro seqüências Vk humanizadas foram planejadas. C2HuVKl consiste das CDRs mC2 Vk com matrizes de DPK 15 e JkI humanas. Nas versões 2, 3 e 4 resíduos de murino foram substituídos na matriz nas posições 45 ou 87 ou ambas. O resíduo 45 pode estar envolvido na sustentação da conformação das CDRs. O resíduo 87 está localizado na interface dos domínios Vh e VK. Portanto estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação de anticorpo. As posições e mudanças que foram feitas nas regiões de matriz de cadeia leve são mostradas na Tabela 6. Uma comparação das seqüências humanizadas com a seqüência mC2 Vk e com DPKl5 e JkI humana.
5.2 Região variável de cadeia pesada
O gene da linha germinativa de camundongo de emparelhamento mais próximo a mC2 Va AF é ‘VH7183, Local AF120466, (Langdon et al, 2000). A comparação é mostrada na Figura 3. Nove aminoácidos diferem desta seqüência da linha germinativa, a maioria sendo localizada dentro da CDR2. Anticorpos de murino maduros com CDRl idêntica ou similar (um resíduo diferente) ou com CDR2 similar (um resíduo diferente) são encontrados, mas nenhum com todas as três CDRs idênticas a mC2 Vh AF. A CDR3 do anticorpo mC2 é extraordinariamente curta, que consiste de apenas três resíduos. Entretanto, outros anticorpos são encontrados na base de dados com CDR3 deste comprimento. mC2 Vh AF pode ser designado ao subgrupo de Kabat MUVHIIID. O resíduo 47 de mC2 Vh é L ao invés do W mais comum e o resíduo 94 é S ao invés do R normal, indicando que estes resíduos de matriz podem ser importantes para a atividade de anticorpo. A comparação com as seqüências Vh da linha germinativa humana mostra que os genes do subgrupo VhIII são o melhor emparelhamento para mC2 VH. A seqüência DP54 junta com a região J humana HuJh6 foi selecionada para fornecer as seqüências de matriz aceitadoras para Vh humanizado.
Quatro seqüências Vh humanizadas foram planejadas. C2HuVh1 consiste das CDRs mC2 Vh AF com matrizes de DP54 e HuJh6. Nas versões 2, 3 e 4 resíduos de murine foram substituídos na matriz nas posições 47 ou 94 ou ambas. O resíduo 47 na matriz 2 faz contato tanto com as CDRs quanto com o domínio VK. O resíduo 94 pode estar envolvido na sustentação da conformação das CDRs. Portanto estes resíduos podem ser críticos para a manutenção da ligação de anticorpo. As posições e mudanças que foram feitas nas regiões de cadeia pesada de matriz são mostradas na Tabela 7.
Exemplo 6: Construção de Genes de Anticorpo Humanizados
As regiões variáveis modificadas foram construídas pelo método de recombinação pela PCR de sobreposição. Os cassetes de expressão para o anticorpo quimérico, C2 ChVH AF e C2 ChVK, foram usados como padrões para a mutagênese das regiões de matriz para as seqüências requeridas. Os conjuntos de pares de iniciador mutagênicos foram sintetizados abrangendo as regiões a serem alteradas. Os cassetes de expressão Vh e Vk humanizados produzidos foram clonados no pUC19 e a seqüência de DNA inteira foi confirmada estar correta para cada Vh e VK. Os genes da região V de cadeia pesada e leve modificada foram excisados de PUC19 como cassetes de expressão de HIndIII a BamHI. Estes foram transferidos para os vetores de expressão pSVgpt e pSVhyg que incluem IgG4 Ser-pro humana ou regiões constantes κ respectivamente, como para os vetores de anticorpo quimérico. A seqüência de DNA foi confirmada estar correta para a Vh e Vk humanizada nos vetores de expressão.
Exemplo 7 Expressão de Anticorpos Humanizados
7.1 Expressão em linhagens de célula estáveis
Os vetores de expressão da cadeia pesada e leve humanizados foram co-transfectados em células NSO pela eletroporação, como para a expressão de anticorpos quiméricos. As linhagens de célula que produzem anticorpo foram selecionadas e expandidas e os anticorpos humanizados purificados, exatamente como para o anticorpo quimérico. Os anticorpos purificados foram analisados pela SDS-PAGE.
7.2 Expressão transitória de anticorpos humanizados
Para acelerar o teste das construções Vh e Vk humanizadas diferentes, os cassetes de expressão Vh e Vk de C2 humanizados foram também transferidos para os vetores para a expressão transitória descrita na seção 7.2. As quatro construções C2 Vk humanizadas foram co-transfectadas com a construção C2 Vh quimérica em células HEK293. Similarmente, as quatro construções C2 Vh humanizadas foram cotransfectadas com a construção C2 Vk quimérica em células HEK293. O meio condicionado foi colhido das células três dias depois da transfecção. A quantidade de anticorpo produzido foi determinada pelo ELISA para anticorpo IgGK humano.
Exemplo 8 Atividade de Anticorpos C2 humanizados
8.1 Atividade de anticorpos C2 humanizados produzidos pela transfecção transitória
As amostras de meio condicionado da transfecção transitória foram testadas no ELISA de Beta-amilóide. Os resultados obtidos claramente indicam que as construções Vh humanizadas de C2 HuVh AF versões 2 e 4 são funcionais quando combinadas com a cadeia C2 capa quimérica e são comparáveis ao anticorpo C2 quimérico no ensaio. Ao contrário, os anticorpos contendo de C2 HuVh AF versões 1 e 3 combinadas com a cadeia C2 capa quimérico não mostram nenhuma ligação sob qualquer condição no ensaio. Isto indica que a substituição do resíduo de murine na posição 94 é essencial para a atividade do anticorpo. Anticorpos contendo a C2 de cadeia pesada quimérica combinada com as cadeias capa quatro C2 humanizadas todas mostraram boa ligação, comparável ao anticorpo quimérico, no ELISA.
8.2 Atividade de anticorpos C2 humanizados purificados
Oito anticorpos C2 humanizados diferentes que compreendem todas as combinações de duas cadeias pesadas humanizadas e quatro cadeias leves humanizadas foram purificadas a partir de linhagens de célula NSO estáveis como descritas e testadas usando o ELISA de Beta-amilóide (Figura
4)·
Os resultados obtidos claramente indicam que anticorpos HuVh4 de C2 realizam melhor no ensaio do que os anticorpos HuVh2 de C2. Dos anticorpos HuVh2 de C2, HuVh2/HuVk3 de C2 mostram a melhor atividade de ligação, mas isto é aproximadamente 2 vezes reduzida comparada com o anticorpo de controle quimérico ChVHAF/ChVK de C2. A atividade de HuVh2/HuVK2 de C2 é quatro a cinco vezes reduzida comparada ao controle. As atividades dos anticorpos que compreendem C2HuVh4 com as quatro cadeias leves humanizadas diferentes são similares. A atividade mais alta é observada para C2HuVh4/HuVK1 e todos os quatro anticorpos estão próximos do anticorpo quimérico de controle no ensaio. Exemplo 9: Modificações para CDRL2
9.1 Planejamento de cadeia leve com CDR2 modificada
Como mencionado acima, muitos anticorpos compartilham a mesma seqüência de CDRL2 (“KVSNRFS”) como o anticorpo C2. Foi decidido testar se CDRL2 poderia ser modificado levemente sem afetar adversamente a atividade de anticorpo. Duas substituições conservativas foram selecionadas: R no lugar de K na posição 50 e S no lugar de N na posição 53. As duas seqüências de CDRL2 alternativas são portanto “RVSNRFS” e “KVSSRFS”. Estas foram incorporadas na seqüência Vk de murino sem nenhuma outra mudança, como mC2 Vk-R e mC2 Vk-S respectivamente.
9.2 Expressão transitória de anticorpo CDRL2 modificado
As duas construções de cadeia leve de C2 com CDRL2 modificada descritas na Seção 11.2.1 foram clonadas no vetor de cadeia leve para a expressão transitória. Cada uma foi co-transfectada com o vetor C2 Vh quimérico em células HEK293 . 0 meio condicionado foi colhido das células três dias depois da transfecção. A quantidade de anticorpo produzido foi determinada pelo ELISA para o anticorpo IgGK humano.
9.3 Atividade de anticorpo C2 com CDRL2 modificada
As amostras de meio condicionado da transfecção transitória de mC2 VKs com CDRL2 modificada combinada com mC2 Vh foram testadas no ELISA de Beta-amilóide. (Figura 5) Tanto o anticorpo Vk-R quanto o Vk-S são comparáveis ao anticorpo C2 quimérico, indicando que as modificações individuais para CDRL2 escolhidas não afetam acentuadamente a atividade do anticorpo no ensaio.
Exemplo 10 Determinação de Afinidade Para avaliar a especificidade e afinidade de ligação de
anticorpos de camundongo (ACI-01-Ab-7-C2) quiméricos (AF) e humanizados (H4K1; H4K4), a análise BIACORE.RTM. foi reealizada usando monômeros de beta-amilóide 1-42 e fibras como antígeno imobilizadas em um chip CM5. A tecnologia BIACORE.RTM. utiliza 10 mudanças no índice refrativo na camada de superfície na ligação do anticorpo ao antígeno imobilizado na caamada. A ligação é detectada pela ressonância de plasma de superfície (SPR) de laser leve refrangente da superfície. A análise das cinéticas de sinal no padrão e fora do padrão permite a discriminação entre a interação não específica e específica. A concentração de 15 anticorpo usada foi na faixa de 0,05 M a 1,0 M.
Tabela 1 :Especificidade e afinidade de ligação de anticorpos (ACI-O l-Ab-7- C2) quiméricos de camundongo (AF) e humanizados (H4K1; H4K4) para monômeros e fibras de beta-amilóide 1-42
Monômeros Fibras
Ml/Ms) Ml/s) KD Ica(IZMs) Icd(IZs) KD(M)
(M)
1.8E+04
2.7E-03 1.5E-07
2.4E+04
9.9E-04 4.1E-08
ACI-01-AB-7-C2 de Camundongo
AP quimérico 4.7E+04 9.5E-04 2E-08 5ΛΕ+04 3.3E-04 6.5E-09
H4K1 humanizado 5.0E+04 9.5E-04 1.9E-08 4.9E+04 2.3E-04 4.7E-09 HK4 humanizado 2.5E+04 4.4E-04 1.8E-08 1.3E+05 3.0E-Q4 2.3E-Q9
Exemplo 11 Ensaio de Ligação de Imunoistoquímica 11.1 Seções de cérebro humano
Os cérebros de pacientes saudáveis, pré-AD não dementados e AD foram obtidos da Universitatsklinik em Bonn depois da aprovação ética. Os cérebros foram fixados em formaldeído e a região do hipocampo foi desidratada, embutida em parafina e seções de 5 μηι foram cortadas com um micrótomo. As seções em parafina foram armazenadas na temperatura ambiente até o uso. Para material fresco, criosseções de 5 μηι foram cortadas com um criostato e as seções armazenadas a -80° C até o uso.
11.2 Imunoistoquímica 5 As seções de parafina foram desparafinizadas e reidratadas
pelqas lâminas no banho em xileno seguido por 100 % de etanol, 90 % de etanol e 70 % de etanol. O fundo foi diminuído em 30 minutos de incubação em 10 % de H2O2, 10 % de metanol em água. A recuperação de antígeno foi obtida pela incubação das lâminas em 100 % de ácido fórrmico por 3 minutos. 10 Depois de 3 lavagens em solução salina tamponada com Tris (TBS, pH 7,5), a rotulação não específica foi bloquada por uma incubação de 2 horas das lâminas em 10 % de BSA, 0,25 % de Triton X-100 em TBS. Depois da lavagem (3 lavagens em TBS) o bloqueio dos anticorpos endógenos foi realizado pela adição de um IgG anti-humano não rotulado (Biomeda) e 15 incubando as lâminas em câmaras úmidas durante a noite na temperatura ambiente. Depois de mais 3 lavagens, o anticorpo anti amilóide humano primário foi adicionado às lâminas e incubadas mais 24 horas na temperatura ambiente. A seguir da lavagem, um IgG anti ser humano secundário rotulado com fosfatase alcalina (Sigma) foi adicionado às lâminas e incubadas por 2 20 horas na temperatura ambiente. Depois da lavagem, as lâminas foram desenvolvidas com Vermelho permanente líquido (Dakocytomation) lavadas com água e secadas ao ar antes de montar com meio de montagem permanente (corbitbalsam).
Criosseções foram fixadas em metanol por 30 minutos a -80° 25 Ceo fundo diminuído pela adição de H2O2 ao metanol frio a uma concentração final de 10 % e incubando por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois de 3 lavagens em solução salina tamponada com Tris (TBS, pH 7,5), a rotulação não específica foi bloqueada por uma incubação de 2 horas das lâminas em 10 % de BSA, 0,25 % de Triton X 100 em TBS como acima e o mesmo procedimento de tingimento como acima foi realizado.
As seções foram examinadas com um mioscópio Leica DMLB e fotografado usando uma câmara Leica DC500 e o software Leica FireCam 1.2.0.
Placas rotuladas com anticorpos humanos tanto A quanto C de
cérebros de pacientes com a doença AD (Figura 6). As placas tanto difusas quanto nucleadas foram rotuladas. Além disso, as placas difusas em pacientes pré-AD não dementados também puderam ser detectadas pelos anticorpos A e C. O amilóide na angiopatia amilóide cerebral (CAA) foi rotulado com ambos 10 os anticorpos e algum tingimento de neurônios que podem corresponder ao amilóide intracelular também foi detectado. Nenhuma rotulação foi observada nos cérebros de controle de paciente saudável. As placas puderam ser detectadas em seções de parafina pré tratadas com ácido fórmico mas nenhuma placa foi rotulada nas seções de parafina sem o pré tratamento com 15 ácido fórmico e nas criosseções fixadas em metanol. O anticorpo humano B não detectou placas nas seções de parafina e o anticorpo de camundongo não tingiu em parafina ou criosseções de cérebros humanos.
Abreviações:
A = ligação de anticorpo quimérico AF (IgG4) (mC2ChVHAF)
B = não ligação de anticorpo quimérico B (IgG4) (mC2VHB)
C = ligação de anticorpo humanizado H4K1 (IgG4) (HuVh4/HuVk1) Camundongo = anticorpo de camundongo ACI-01 -Ab-C2 (IgG2b)
Exemplo 12 Funcionalidade de mC2 nas Fibras de Amilóide
12.1 Modificação da Conformação de Fibras um Αβ1-42 e Início da Desagregação depois da Ligação do anticorpo mC2
De modo a avaliar o mecanismo pelo qual o anticorpo é capaz de desagregar fibras de beta-amilóide (A 1-42) pré formadas uma comparação de ponta a ponta do ensaio fluorescente de Tioflavina-T (Th-T) foi realizado medindo a desagregação e a Ressonância Magnética Nuclear em estado sólido (RMN) de peptídeo Αβ1-42 rotulado com U-13C TyrosinalO e Valinal 2 analisando a conformação secundária (Figura 7A). O anticorpo mC2 solubilizou 35,4 % das fibras Αβ1-42 pré formadas e simultaneamente induziu uma mudança na conformação secundária da folha beta para espiralado aleatório. A redução na população da conformação de folha beta com respeito à espiral aleatória é da ordem de 35 % e está portanto de acordo com aquele medido usando o ensaio de fluorescência Th-T (Figura 7B). Estes dados indicam que a ligação do anticorpo mC2 inicia uma transição da estrutura secundária que potencialmente causa uma desestabilização do arranjo intermolecular paralelo das folhas beta produzindo uma ruptura das fibras alongadas em fragmentos menores.
12.2 Afinidade de Ligação Dependente da Conformação de Anticorpo mC2
Visto que é bem conhecido na literatura científica que uma proporção da energia de ligação de anticorpo-antígeno pode ser usada para a modificação dependente de energia da conformação de um antígeno (Blond e Goldberg, 1987), um experimento de comparação da afinidade de ligação do anticorpo C2 à proteína Αβι.42 inteira e a um peptídeo menor, nove aminoácido de comprimento, que compreende o epítopo do anticorpo foi realizada (Figura 8). Para a comparação das afinidades do anticorpo humanizado C2 foram analisadas pelo ELISA usando peptídeos biotinilados que abrangem a seqüência de aminoácido completa do epítopo de C2 (produzido pela Mimotopes e adquirido da ANAWA Trading SA) e um peptídeo Αβ1-42 completo biotinilado (Bachem). A análise foi feita de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes). Como demonstrado na Figura 8 e Tabela 2, o anticorpo liga com uma afinidade 36,0 % mais alta para o peptídeo que compreende o seu epítopo específico (aminoácidos 13 a 21 da seqüência Αβι.42) do que para a proteína Αβ1-42 inteira. É portanto sugerido que a diferença na energia de afinidade de ligação foi usada para a transição que consume energia da conformação secundária da proteína de amilóide para apresentar o antígeno em uma posição mais aceitável para a interação de anticorpo. Isto explica o porque a afinidade do anticorpo é mais baixa para a subunidade nativa (a proteína de amilóide inteira) do quee para a subunidade isolada.
Tabela 2
O.D Beta-amilóide 13-21 Beta-amilóide 1-42 hC2 1,225 0,9005 IgG de Controle 0,171 0,196 Exemplo 13 Efeitos do hC2 anti-amilóide na agregação do peptídeo de betaz amilóide 1-42
Para avaliar a capacidade do anticorpo monoclonal hC2 anti- beta-amilóide humano humanizado para mediar os efeitos anti-agregação e de desagregação sobre o beta-amilóide (Αβ) um ensaio de espectro fluorescência de tioflavina T foi realizado.
13.1 Inibição do Ensaio de Agregação
O pó de Αβ1-42 liofilizado foi reconstituído em hexafluoroisopropanol (HFIP) a I mM. A solução de peptídeo foi sonificada 15 por 15 min na temperatura ambiente, agitada durante a noite e alíquotas feitas em tubos de microcentrífuga não siliconizados. O HFIP foi depois evaporado sob uma corrente de argônio. A película de peptídeo resultante foi secada a vácuo por 10 min e armazenada a -80° C até usada.
Para ensaiar quanto à inibição mediada pelo anticorpo da 20 agregação de Αβ1-42 o anticorpo hC2 foi pré-diluído em PBS e uma solução de ensaio contendo os seguintes componentes foi feita em um tubo de incubação não siliconizado: 3.3 ou 0,33 μΜ de anticorpo pré diluído, 10 μΜ de tioflavina T, 33 μΜ de Αβ1-42 e 8,2 % de DMSO. Portanto as razões molares finais de anticorpo para Αβ1-42 foram 1:10 e 1:100. As soluções de 25 controle apropriadas também foram preparadas. As soluções foram depois incubadas por 24 horas a 37° C e a espectro fluorescência (unidades de fluorescência relativas; RFU) lidas em seis réplicas em placas de 384 reservatórios pretas (Perkin-Elmer) em um espectrofluorímetro FluoroCount da Perkin-Elmer. A espectrofluorescência foi depois medida e a % de desagregação calculada como descrito abaixo.
13.2 Ensaio de Desagregação
Para ensaiar quanto a desagregação mediada pelo anticorpo de
Αβ1-42 pré agregado, um Αβ1-42 de peso molecular baixo, preparado como descrito acima, foi fabricado como uma solução de 110 μΜ em 27 % de DMSO e Ix PBS. Esta solução foi depois deixada agregar a 37° C por 24 horas depois que os seguintes foram adicionados: 3,3 ou 0,33 μΜ de 10 anticorpo pré diluído e 10 μΜ de tioflavina T. Isto resultou em uma razão molar de 1:10 e 1:100 de anticorpo para Αβ1-42. Esta solução foi depois incubada por mais 24 horas a 37° C. A espectrofluorescência foi depois medida e a % de desagregação calculada como descrito abaixo.
13.3 Cálculo
Inibição da agregação ou desagregação é expressada como %
média da inibição ou desagregação, respectivamente, ± erro padrão da média (SEM) de acordo com a seguinte equação:
13.4 Resultado
13.4.1 Inibição da agregação de ΑβΙ-42 A inibição da agregação de Αβ 1 -42 usando o anticorpo hC2 é
mostrada na Tabela 3 e Figura 11. Em uma razão molar de anticorpo para ΑβΙ-42 de 1:100 a inibição deu em média 30 % (2 experimentos independentes), ao passo que uma razão molar de 1:10a inibição foi de 80 % (2 experimentos independentes; ver a Tabela 3).
Tabela 3. Inibição mediada pelo hC2 da agregação de ΑβΙ-42 a uma razão molar de 1:100 e 1:10 de anticorpo para Αβ 1-42.
Anticorpo Razão Molar (anticorpo Dara ΑβΙ-42) 1:100 1:10 hC2 30,0 ±4,1 % 80,4 ± 6,9 % 13.4.2 Desagregação de ΑβΙ-42 pré-agregado
Desagregação de ΑβΙ-42 pré-agregado usando o anticorpo hC2 é mostrado na Tabela 4 e Figura 12. Em uma razão molar de anticorpo para Αβ 1 -42 de 1:100 a desagregação teve em média 24 %, ao passo que a uma razão molar de 1:10 a desagregação foi de 32 % (3 experimentos independentes; ver a Tabela 4).
Tabela 4. Desagregação mediada por hC2 de ΑβΙ-42 pré-agregado a uma razão molar de 1:100 e 1:10 de anticorpo para Αβ 1 -42.
Anticorpo Razão Molar (anticorpo para ΑβΙ-42) 1:100 1:10 hC2 23,9 ± 4,4 % 31,9 ±3,5% Usando o ensaio da tioflavina T, as propriedades bifuncionais do anticorpo humanizado anti-Αβ hC2 podem ser demonstradas, isto é inibir a agregação de ΑβΙ-42 na conformação protofíbrilar patogênica e além das 10 protofibrilas ΑβΙ-42 pré formadas desagregadas. hC2 inibiu a agregação de ΑβΙ-42 em 80 % a uma razão molar de anticorpo para ΑβΙ-42 de 1:10. A capacidade de hC2 para desagregar protofibrilas pré-agregadas de ΑβΙ-42 a uma razão molar de 1:10 foi mostrada ser de 32 %.
Exemplo 14: Ligação específica de conformação de mC2 às classes diferentes de Proteína de Amilóide
De modo a avaliar a especificidade de mC2 aos estágios diferentes da proteína de amilóide polimerizada, ammilóide monomérico, polimérico solúvel e fibrílico, um ELISA revestido com estes estágios diferentes de beta-amilóide polimérico foi realizado (Figura 9). Os 20 monômeros foram preparados de acordo com um método modificado publicado por (Klein, 2002), beta-amilóide polimérico solúvel de acordo com (Barghoni et al., 2005), ao passo que as fibras foram realizadas pela incubação de amilóide (Bachem, Suiça) com uma concentração final de 1 μg/μl em Tris/HCl pH 7,4 a 37° C por 5 dias seguida por uma etapa de 25 centrifugação (10.000 rpm por 5 minutos). Depois os polímeros de amilóide foram revestidos em uma placa de ELISA com uma concentração final de 55 μg/ml e o ELISA de afinidade de ligação usando-se um anticorpo monoclonal IgG anti-camundongo (Jackson) rotulado com fosfato alcalino foi realizado. Como demonstrado na Tabela 5 o anticorpo mC2 liga com afinidade mais alta ao beta-amilóide polimérico solúvel do que às fibras e com a mais baixa aos monômeros. Estes dados indicam que a ligação do anticorpo é influenciada pelo epítopo de amilóide e pela conformação dos agregados de amilóide diferentes.
Tabela 5Ligação específica de conformação de mC2 aos Monômeros, Oligômeros e Fibras de Amilóide
mC2 O.D Conc de Ab Oligômero Fibras Monômeros (μβ/ηιΐ) 0,625 2,806 1,620 1,155 0,312 1,724 0,989 0,649 0,156 1,036 0,631 0,397 0,078 0,652 0,499 0,333 Exemplo 15: Mapeamento de epítopo de anticorpo monoclonal hC2 da AC Immune
O mapeamento de epítopo do anticorpo monoclonal hC2 humanizado foi realizado pelo ELISA usando três bibliotecas de peptídeo diferentes. Uma biblioteca compreendeu um total de 33 peptídeos biotinilados abrangendo a seqüência de aminoácido (aa) completa de ΑβΙ-42 (produzida pela Mimotopes e adquirida da ANAWA Trading SA), a segunda biblioteca conteve peptídeos biotinilados usando o peptídeo 12 (aa 12-20 de Αβ) da primeira biblioteca de peptídeo e substituindo cada aa na seqüência por uma alanina (ver a tabela 8 abaixo) e a terceira biblioteca contém peptídeos biotinilados 13, 14 ou 15 (aa 13-21, 14-22 ou 15-23 de Αβ) e substituindo em cada caso o último aminoácido por uma alanina ou por uma glicine no lugar do aa 21 que já é uma alanina (ver a tabela 9 abaixo). Um peptídeo ΑβΙ-42 completo biotinilado foi usado como controle positivo (Sachem). O mapeamento de epítopo foi feito de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes). Em resumo, as placas revestidas com Estreptavidina (NUNC) foram bloqueadas com 0,1 % de BSA em PBS, durante a noite a 4o C. Depois da lavagem com PBS-0,05 % de Tween 20, as placas foram revestidas por 1 hora na temperatura ambiente com os peptídeos diferentes da biblioteca, diluída em 0,1 % de BSA, 0,1 % de Azida de sódio em PBS a uma concentração final de 10 μΜ. Depois da lavagem, as placas foram incubadas por 1 hora na temperatura ambiente com o anticorpo hC2 ou um anticorpo IgG4 quimérico que não liga Αβ diluído a 200 mg/ml em 2 % de BSA, 0,1 % de Azida de Sódio em PBS. As placas foram lavadas mais uma vez e incubadas com IgG anti humano de cabra conjugado com fosfatase alcalina por 1 hora na temperatura ambiente. Depois da lavagem final, as placas foram incubadas com substrato de fosfatase (pNPP) e lida a 405 nm usando uma leitora de placa de ELISA.
Foi mostrado que o anticorpo monoclonal hC2 humanizado ligou especificamente aos peptídeos 12, 13, 14, 15 e 16 da primeira biblioteca de peptídeo. Estes peptídeos compreendem os aminoácidos 12-20, 13-21, 14- 22, 15-23 e 16-24 respectivamente de ΑβΙ-42, sugerindo que o epítopo reside na região 12-24 de Αβ. Uma segunda biblioteca com substituições de alanina foi usado para determinar o aminoácido crítico para a ligação a Αβ 12-20 (VHHQKLVFF).
A ligação do anticorpo hC2 é completamente perdida quando os aminoácidos 16, 17, 19 ou 20 são substituídos por uma alanina, indicando quee estes aas são absolutamente críticos para a ligação do anticorpo ao Αβ. A ligação do anticorpo hC2 é parcialmente perdida quando os aminoácidos 15 e 18 são substituídos.
A ligação também foi quase completamente perdida quando o aminoácido 14 foi substituído por uma alanina, indicando que o aminoácido
14 também é muito importante para a ligação.
Finalmente, uma terceira biblioteca foi usada para determinar se os aminoácidos 21, 22 ou 23 são críticos para a ligação ao epítopo. A ligação do anticorpo aos aminoácidos 15 a 23 foi reduzida quando o aminoácido 23 foi substituído por uma alanine, indicando que o aminoácido 23 também é importante para a ligação. A ligação foi parcialmente perdida quando o aminoácido 21 foi substituído por uma glicina e levemente perdida quando o aminoácido 22 foi substituído por uma alanina.
Exemplo 16: Neuroprotecão pelo Anticorpo hC2 A capacidade do anticorpo hC2 para proteger neurônios da
degeneração induzida pelo oligômero de Abeta foi avaliada em um ensaio in vitro. Neurônios corticais de camundongo nos dias embrionários de 16,5 a
17,5 foram isolados, dissociados e cultivados in vitro em meio N3-F12. As células foram cultivadas por nove dias no total e foram alimentadas no dia 3 e 10 no dia que o oligômero Abeta ou oligômero Abeta mais anticorpo anti-Abeta hC2 foi adicionado. No dia cinco (“Abeta de 4 dias”) ou dia seis (“Abeta de 3 dias”), certos reservatórios de células foram tratadas com 2 μΜ de oligômero Abeta sozinho ou uma combinação de 2 μΜ de oligômero de Abeta e 50 μg/ml de anticorpo anti-Abeta hC2.
O oligômero de Abeta foi preparado dissolvendo-se Abeta 1-
42 (rPeptídeo) em HFIP, a partir do qual os peptídeos Abeta foram aliquotados em 100 alíquotas a 1 mg/ml e depois evaporados em uma capela por 30 minutos e as películas de peptídeo foram armazenadas a -80° C até o uso. No uso, a película de peptídeo foi dissolvida em 10 μΐ de DMSO, depois 78,6 μΐ de HAMS F12 e a solução de peptídeo Abeta foi incubada a 4o C por
24 a 48 horas (25 μΜ de concentração final de Abeta).
Para as células de controle, apenas DMSO-F12 foi adicionado ao mesmo volume como Abeta-DMSO no dia 5 e as células foram cultivadas por um adicional de 4 dias sem qualquer tratamento adicional. No dia 9, os 25 neurônios de todas as condições de cultura foram fixadas e tingidas com Tuj 1 (um anticorpo anti-beta-tubulina), seguido pelo tingimento com anticorpos secundários rotulados com FITC para visualizar microtúbulos e assim processos neuronais no geral. Os resultados são mostrados na Figura 13.
Os neurônios corticais embrionários de camundongo não tratados mostraram morfologia normal depois de nove dias de cultura (Figura 13, painel mais à esquerda). O tratamento das células com oligômero Abeta por três dias induziu a degeneração de axônio e causou uma diminuição no número total de axônios (Figura 13, painel central inferior) e este efeito foi 5 ainda mais pronunciado em quatro dias de tratamento (Figura 13, painel central superior). Ao contrário, as células tratadas com a combinação de oligômero Abeta e anticorpo anti-Abeta hC2 pareceram similares às células de controle (Figura 13, panéis direitos superior e inferior). Estes resultados indicam que o anticorpo anti-Abeta hC2 foi capaz de proteger os neurônios IO corticais de camundongo embrionários da degeneração induzida de oligômero Abeta.
Tabela 6: Posições e mudanças feitas nas regiões de matriz de cadeia leve C2
humanizada
Posição da cadeia leve 45 87 50 53 C2VK de Camundongo K F K N C2HuVk1 Humanizado Q Y K N C2HuVk2 Humanizado 0 F K N C2HuVk3 Humanizado K Y K N C2HuVk4 Humanizado K F K N Linha Germinativa Humana dpkl5 Q Y L N C2VK-R de Camundongo R C2VK-S de Camundongo S Tabela 7: Posições e mudanças feitas nas regiões de matriz de cadeia pesada de C2 humanizadas
Posição da Cadeia Pesada 47 94 C2VhAF de Camundongo L S C2HuVhAF1 Humanizado W C2HuVhAF2 Humanizado W S C2HuVhAF3 Humanizado L R C2HuVhAF4 Humanizado L S Linha Germinativa Humana DP-54 W R Um total de 8 anticorpos diferentes foram construídas com cadeias leves humanizadas C2HUVK1, C2HuVK2, C2HuVK3, C2HuVK4 e cadeias pesadas C2HuVHAF4 e C2HuVhAF2 Tabela 8. Sumário de peptídeos usados na segundo biblioteca Aminoácidos que são importantes para ligar são marcados em itálicos e sublinhados e aminoácidos absolutamente críticos para a ligação são marcados em itálicos e negritos.
p 12-20 V H H Q K L V F F A12 A H H Q K L V F F A13 V A H Q K L V F F Α14 V H A Q K L V F F Α15 V H H A K L V F F Α16 V H H Q A L V F F Al 7 V H H Q K A V F F Α18 V H H Q K L A F F Α19 V H H Q K L V A F Α20 V H H Q K L V F A aano. 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tabela 9. Sumário de peptídeos usados na terceira biblioteca.
Aminoácidos que são importantes para a ligação são marcados em itálicos e sublinhados e aminoácidos absolutamente críticos para a ligação são marcados em itálicos e negrito
pl3-21 H H Q K. L V F F A pl3-21 G21 H H Q K L V F F G pl4~22 H Q K L V F F A E p!4-22 A22 H Q K V F F A A pl5-23 Q K L V F F A E D pl5-23 A23 Q K L V F F A E A aano. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 EXEMPLO 17: Ligação de anticorpo monoclonal de AC Immune mACI-01- Ab7 C2 a Espécies de amilóide em Western Blot e Dot Blot
Para determinar se a ligação do anticorpo de camundongo mACI-01-Ab7 C2 é dependente da conformação nativa de Αβ uma comparação da ligação a amilóide linearizado por Western Blot ou amilóide nativo em Dot Blot foi realizada (Figuras 2a e 2b)
Monômeros amilóides foram gerados dissolvendo peptídeo ΑβΙ-42 em HFIP e o solvente evaporado sob argônio. A película de peptídeo 15 seca foi armazenada a -80° C até o uso. Para a preparação de monômeros, a película de peptídeo foi recolocada em suspensão em DMSO a uma concentração de 2,75 μg/μl e diluído em PBS a 1 μg/μl. Para a preparação de oligômeros, a película de peptídeo seca foi recolocada em suspensão em DMSO a 5 mM, sonificado e PBS adicionado para atingir 400 μΜ de amilóide seguido pela adição de SDS a uma concentração final de 0,2 %. Depois de incubação por 6 horas a 37° C, o amilóide foi diluído em água a uma concentração final de 100 μΜ e incubado mais 18 h a 37° C. Os oligômeros de amilóides foram precipitados com 33 % de metanol gelado, 4 % de solução de ácido acético por 1 h a 4o C, agitados a 16200g por 10 minutos e o grânulo recolocado em suspensão em 5 mM de Na2H2P04, 35 mM de NaCl pH 7,4 a uma concentração final de 1 μg/μl. Para a preparação de fibras, a película de peptídeo foi diluída em 50 mM de tampão Tris-HCl para gerar uma concentração de 1 mg/ml de amilóide e incubados a 37° C por dias. Os tubos foram girados a I OOOOg por 5 minutos e o grânulo recolocado em suspensão em 0,1 M de tampão de carbonato pH 9,6 para atingir 1 μg/μl.
1 ou 5 μg de monômeros, oligômeros ou fibras foram diluídos em PBS e em tampão de carregamento e aplicados a uma SDS-PAGE de 12 % e o gel transferido para membranas de nitrocelulose. Alternativamente, 3 ou 1 μg ou 100 e 10 ng de espécies de amilóide foram diluídos em PBS e foram transferidos diretamente na membrana de nitrocelulose e as membranas secas na temperatura ambiente por 1 hora. Depois de bloquear por 30 minutos com solução de Caseína (Vector), as membranas foram incubadas por 30 minutos com anticorpos mACI-01-Ab7 C2 ou 6E10 (Chemicon) diluídos a 1 μg/ml em solução de Caseína. Depois de 3 lavagens em solução de Caseína, as membranas foram incubadas na temperatura ambiente por 30 minutos com IgG anti-camundongo de cabra rotulada com HRP (Dako Cytomation) diluídas em solução de Caseína, lavadas 3 vezes e desenvolvidas com substrato DAB (Dako Cytomation).
O anticorpo monoclonal de camundongo mACI-01-Ab7 C2 ligou-se especificamente aos monômeros, oligômeros e fibras no ensaio de Dot Blot como o anticorpo de controle positivo 6E10. Ao contrário, o anticorpo mACI-01-Ab7 C2 não detectou espécies de amilóide linearizadas pelo Western Blot ao contrário do anticorpo 6E10 que reconheceu claramente todos os peptídeos linearizados. Este resultado demonstra que a ligação de mACI-01-Ab7 C2 a amilóide é dependente da conformação nativa de amilóide.
EXEMPLO 18: Interações de mACI-01Ab7 C2 -Αβι.42
As interações entre o mais importante anticorpo mACI-01 -Ab7 C2 (mC2) da AC immune com peptídeo amilóide Αβι_42 foram estudadas usando ressonância de plásmon de superfície. A ligação do anticorpo de camundongo mACI-01-Ab7 C2 a monômeros ou fibras Αβ]_42 foi determinada.
Todos os experimentos SPR foram realizados em um instrumento Biacore X (Biacore AB). Reagentes para imobilização (EDC, NHS e etanolamina), chips sensores CM5 e SA assim como tampão de condução e de amostra HBS-EP foram adquiridos a partir de Biacore AB. Acetato de sódio (10 mM, pH 5,0) foi usado como tampão de ligação para aumentar o rendimento de ligação. Αβι.42 fibrilar (BAchem) foi preparado adicionando tampão PBS a ΑβΜ2 a uma concentração final de 3 mg/ml e deixando os frascos a 37° C por 7 dias. Αβι_42 fibrilar foi acoplado a um chip sensor CM5 contendo uma matriz de carboximetil dextrano ligada à superfície. Αβ]_42 monomérico biotinilado (Bachem) foi acoplado a um chip sensor SA consistindo de matriz de carboximetil dextrano com estreptavidina covalentemente ligada. Tipicamente quatro ou cinco concentrações de mAb foram ensaiadas por diluições seriais usando tampão de condução. Injeções foram realizadas partindo da concentração mais baixa e foram passadas tanto por fc 1 quanto 2 em uma vazão de 30 μί/ιηϊη por 3 min. A célula de fluxo 2 foi não derivatizada e respostas foram subtraídas de fc 1 para corrigir quanto ao ruído instrumental e mudanças refrativas de volume. Depois da injeção ter terminada, as superfícies foram lavadas imediatamente com tampão de condução por 5 min. Para remover o anticorpo ligado remanescente das fibrilas Αβι_42, a regeneração de superfície foi realizada injetando pulsos de 10 mM NaOH. A análise cinética foi realizada usando algoritmos para integração numérica e análise global usando BIAevaluation 3.0. As curvas obtidas para injeções de análito em diferentes concentrações foram sobrepostas e as linhas de base ajustadas para zero. Para ajuste de curva, todos os dados foram ajustados simultaneamente para um complexo homogêneo 1:1.
A ligação do anticorpo de camundongo mACI-01-Ab7 C2 a amilóide foi determinada como sendo relativamente forte. Como demonstrado na Tabela 2, o anticorpo de camundongo mACI-01-Ab7 C2 ligou-se especificamente às fibras Αβι.42 imobilizadas com uma constante de associação média (ka) de 3,8 x 10‘4 M/s, uma constante de dissociação (kd) de
1,1 x IO'3 s"1 e portanto com a KD média resultante de 3,5 x 10’8 M. A associação do mACI-01-Ab7 C2 a monômeros Αβ foi similar ou levemente mais rápida com uma ka média de 1,6 x 10‘4 M/s mas a dissociação foi mais rápida dando uma KD de 2,5 x 10’7 M.
Tabela 2
Monômeros KD(M) k*(l/Ms) Fibras KD(M) ka(l/Ms) Icd(IZs) Icd(IZs) ntACI-01-Ab7 Cl exp. 1 1.8E+04 2.7E-D3 1.5E-07 2,4 E+04 9,9E-04 4.1E-08 mAC!-0l-Ab7 C2 5.3E-G3 exp. 2 l,5E+04 3,5E-07 5,60 E+04 9,66E-04 1.73E-08 mACI-01-Ab7 C2 exp. 3 3,26E+04 1.49E-03 4.58E-08 médio mACI-01- 1.6E+04 4, OE-OS 2.5 £-07 3.8E+04 1,1 E~03 3,5E-08 Ab7C2 ±0,21 1,84 1,41 1,66 0,3 1,53 EXEMPLO 19: Ligação de anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 às Fibras amilóides
Para analisar o lado de ligação molecular do anticorpo nas fibras pré-formadas a microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
negativamente contrastada foi realizada (Figuras 3a e 3b).
O anticorpo, mACI-01-Ab7 C2, foi ligado com 8 nm de ouro coloidal de acordo com 4,5. Para a co-incubação de fibras amilóides 1-42 (ΑβΙ-42) as fibras de 6,65 uM foram incubadas por 24 h na temperatura ambiente com o anticorpo marcado com ouro com a proporção molar de 1:100. Subseqüentemente 5 μΐ de amostra foram incubadas na grade (malha 200) de Cu com descarga brilhante fresca coberta com película de parlódio/C por 45 segundos, lavados 3 vezes com água e 1 vez com 2 % de acetato de uranila fresco diluído e filtrado. As amostras foram rotuladas em 2 % de acetato de uranila por 15 a 20 s. O excesso de corante nas grades foi absorvido e conseqüentemente secado ao ar. Três grades de cada amostra foram preparadas. As grades foram analisadas em microscópio eletrônico de transmissão Hitachi 7000.
O anticorpo monoclonal, mACI-01-Ab7 C2, se liga diretamente as fibras Αβι_42. De maneira interessante o anticorpo não exibe nenhuma ligação simétrica ao eixo de fibras únicas mas se liga as áreas particulares e não todas de ramos laterais da rede de fibras. Parecem ser as regiões específicas alvos de anticorpo dentro dos ramos laterais. A explicação potencial é uma estrutura secundária específica que ocorre apenas nestes ramos laterais específicos. Esta hipótese é sustenta por dados de RMN demonstrando que o anticorpo induziu a transição em conformação e portanto é provável que sua ligação seja dependente de uma conformação da fibra amilóide compreendendo uma estrutura de folha-β.
EXEMPLO 20: Mapeamento de epítopo de anticorpo monoclonal mACI-01- Ab7 C2
O mapeamento de epítopo do anticorpo monoclonal mACI-01- Ab7 C2 foi realizado pelo ELISA usando três bibliotecas de peptídeo diferentes. Uma biblioteca compreende um total de 33 peptídeos biotinilados cobrindo a seqüência de aminoácidos (aa) completa de ΑβΙ-42 (produzido por Mimotopes e adquirido de ANAWA Trading SA), a segunda biblioteca contém peptídeos biotinilados usando o peptídeo 12 (aal2-20 de Αβ) da primeira biblioteca de peptídeos e substituindo cada aminoácido na seqüência por uma alanina (veja a tabela 41 abaixo), e a terceira biblioteca contém peptídeos biotinilados 13, 14, ou 15 (aa 13-21, 14-22 ou 15-23 de Αβ) e substituindo em cada caso os últimos aminoácidos por uma alanina ou por uma glicina para aa 21 que já é uma alanina (veja tabela 5 abaixo). Um peptídeo ΑβΙ-42 biotinilado completo foi usado como controle positivo (Bachem). O mapeamento de epítopo foi feito de acordo com as instruções do fabricante (Mimotopes). Resumidamente, as placas revestidas com estreptavidina (NUNC) foram bloqueadas com 0,1 % de BSA em PBS durante a noite a 4o C. Depois de lavagem com PBS-0,05 % de Tween 20, as placas foram revestidas por 1 hora na temperatura ambiente com os peptídeos diferentes da biblioteca, diluídos em 0,1 % de BSA, 0,1 % de Azida Sódica em PBS a uma concentração final de 10 μΜ. Depois da lavagem, as placas foram incubadas por 1 hora na temperatura ambiente com o anticorpo mACI- 01-Ab7 C2 ou um isótipo de anticorpo IgG2b de camundongo de controle, diluídas a 10 μg/ml em 2 % de BSA, 0,1 % de Azida Sódica em PBS. As placas foram lavadas novamente e incubadas com IgG anti-camundongo de cabra conjugada a fosfatase alcalina por 1 h na temperatura ambiente. Depois da lavagem final, as placas foram incubadas com substrato de fosfatase (pNPP) e lidas em 405 nm usando um leitor de placa de ELISA.
Foi mostrado que o anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 ligou-se especificamente aos peptídeos 12, 13, 14el5da primeira biblioteca de peptídeos. Estes 4 peptídeos compreendem aa 12-20 (VHHQKLVFF), 13-
21 (HHQKLVFFA), 14-22 (HQKLVFFAE) e 15-23 (QKLVFFAED) de ΑβΙ- 42 sugerindo que o epítopo fica na região 12-23 de Αβ. Uma segunda biblioteca com substituições de alanina foi usada para determinar os aa críticos para ligação ao peptídeo 12-20 (VHHQKLVFF). A ligação do anticorpo mACI-01-Ab7 C2 é perdida completamente quando aa 16, 17, 19 ou 20 são substituídos por uma alanina, indicando que estes aa são absolutamente críticos para ligação do anticorpo a Αβ. A ligação do anticorpo mACl-01-Ab7 C2 é parcialmente perdida quando aa 15 e 18 são substituídos. A ligação também foi quase completamente perdida quando aa 14 foi substituído por uma alanina, indicando que aa 14 também é muito importante para ligação.
Finalmente, uma terceira biblioteca foi usada para determinar
se aa 21, 22 ou 23 são críticos para ligação ao epítopo. A ligação do anticorpo a aa 15-23 foi reduzida quando aa 23 foi substituído por uma alanina, indicando que aa 23 também é importante para ligação. A ligação foi parcialmente perdida quando aa 21 foi substituído por uma glicina e levemente perdida quando aa 22 foi substituído por uma alanina.
Tabela 4. Resumo de peptídeos usados na segunda biblioteca.
aa que são importantes para ligação são marcados em itálico e sublinhados e aa absolutamente críticos para ligação são marcados em itálico e negrito e sublinhados
p 12-20 V H H Q K L V F F A12 A H H Q K L V F F A13 V A H Q K L V F F A14 V H A Q K L V F F A15 V H H A K L V F F A16 V H H Q A L V F F A17 V H H Q K A V F F A18 V H H Q K L A F F A19 V H H Q K L V A F A20 V H H Q K L V F A aa no 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tabela 5. Resumo de peptídeos usados na terceira biblioteca.
aa que são importantes para ligação são marcados em itálico e sublinhados e aa absolutamente críticos para ligação são marcados em itálico e negrito e sublinhados
F
p 13-21 H HQKLV FA p 13-21 G21 H HQKLVF FG P14-22 hqklvffae
p 14-22 Α22 HQKLVF FAA
p 15-23 QKLVp FAE D
p 15-23 Α23 QKLVFFaEa
aa no. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
EXEMPLO 21: Influência da Vacinação Passiva com mACI-01-Ab7 C2 em Carga de Amilóide no Cérebro de Camundongos hAPP transgênicos únicos
Para verificar a capacidade in vivo do anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 de se ligar e depurar amilóide solúvel do cérebro, 5 9camundongos hAPP de 6 meses de idade, com gênero e idade iguais, foram usados para um estudo de imunização passiva com dose diferente. A carga de amilóide solúvel foi analisada no fim do estudo coletando o cérebro dos animais e realizando um ELISA específico para Αβ 1-40 e Αβ 1-42 (TGC, Alemanha).
8 a 13 animais por grupo receberam duas injeções em um
intervalo de uma semana de 100, 300 e 1000 μg de anticorpo monoclonal em 200 μΐ de PBS ao passo que a injeção de PBS apenas serviu como controle. Um dia depois da segunda injeção os animais foram sacrificados para análise bioquímica da fração de amilóide solúvel. Para quantificar a quantidade de
Αβ 1-40 humano e Αβ 1-42 humano na fração solúvel dos homogenados cerebrais e/ou em fluido cerebroespinhal (CSF), kits de ensaio por enzimas imuno-adsorvidas (ELISA) comercialmente disponíveis foram usados (h Amilóide β40 ou β42 ELISA de alta sensibilidade, TGC, Suíça). O ELISA foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, padrões 20 (uma diluição de Αβ 1-40 ou Αβ 1-42 sintéticos) e amostras foram preparados em uma placa de polipropileno de 96 reservatórios sem capacidade de ligação de proteína (Greiner, Alemanha). As diluições padrão com concentrações finais de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3 e 15,6 pg/ml e as amostras foram preparadas no diluente de amostra, fornecido com o kit de ELISA, a um volume final de 60 μΐ. Uma vez que os níveis de amilóide aumentam com a idade do camundongo e uma vez que a avaliação real requer que as leituras das amostras estejam dentro da parte linear da curva padrão, as amostras para análise de Αβ 40 foram diluídas 2:3, as amostras para análise de Αβ 42 não foram diluídas.
Amostras, padrões e brancos (50 μΐ) foram adicionados à placa de polistirol revestida com anti-Αβ (o anticorpo de captura reconhece seletivamente a extremidade de terminal C do antígeno) além de um conjugado seletivo de anticorpo anti-Αβ (anticorpo de detecção biotinilado) e incubados durante a noite a 4o C a fim de permitir a formação do complexo anticorpo-amilóide-anticorpo. No dia seguinte, um conjugado de Estreptavidina-Peroxidase foi adicionado, seguido 30 minutos depois pela adição de uma mistura de TMB/peróxido, resultando na conversão do substrato em um produto colorido e a intensidade de cor foi medida por meio de fotometria com um leitor de ELISA com um filtro de 450 nm. A quantificação do conteúdo de Αβ das amostras foi obtida comparando a absorbância com a curva padrão feita com Αβ 1-40 ou Αβ 1-42 sintéticos. Os dados foram expressos como mudanças individuais para valor de controle médio (em porcentagem para controle).
A quantidade total de Αβ 40 em homogenados cerebrais pode ser reduzida de modo significante e aproximadamente de modo não significante para Αβ 42 quando camundongos hAPP únicos foram passivamente imunizados por duas injeções i.p. de anticorpo monoclonal ACI-01-Ab7 C2 em uma dose de 300 μg (Αβ 40: -27,3 ± 13,9 % com p < 0,05; Αβ 42: -8,6 ± 22,4 com p = 0,56; teste T de Student não pareado), ao passo que 100 e 1.000 μg não atingiram significância. A imunização com 100 μg levou a um aumento para Αβ 40 e Αβ 42 em homogenados cerebrais (Αβ 40: 32,3 ± 36,8 %; Αβ 42: 38,3 ±51,4 %) ao passo que o tratamento com 1.000 μg provocou a tendência certa de diminuição de carga amilóide e pode ser potencialmente eficaz com um número aumentado de animais por grupo (Αβ 40: -2,2 ± 26,0 %; Αβ 42: -9,3 ± 15,9 %). Estes dados demonstram que em um protocolo de imunização agudo o anticorpo mACI-01-Ab7 C2 é capaz de diminuir a quantidade total de Αβ solúvel no cérebro deste modelo de AD murino. De maneira interessante, parece que a relação de dose é transitória mas mais estudos com grupos maiores devem ser realizados a fim de ganhar dados significantes.
EXEMPLO 22: Influência da Administração Passiva Crônica de mACI-01- Ab7 C2 em Carga de Placa em Camundongos hAPP χ PSl Transgênicos Duplos
Para verificar a capacidade in vivo do anticorpo monoclonal mACI-01-Ab7 C2 de se ligar e reduzir placas amilóides no cérebro, camundongos hAPP χ PSl transgênicos duplos de 3,5 meses de idade 10, com gênero e idade compatíveis, foram usados para um estudo de imunização passiva crônica longo de 4 meses. Placas amilóides foram analisadas no fim do estudo por histoquímica do cérebro dos animais por ligação de Tioflavina S.
animais transgênicos receberam 16 injeções semanais de 500 μg de anticorpo monoclonal em PBS. 15 animais foram injetados com PBS apenas, servindo como controles. Todas as injeções foram dadas intraperitonealmente. No sacrifício, os camundongos foram anestesiados e lavados transcardialmente com soro fisiológico a 4o C para remover o sangue dos vasos cerebrais. Subseqüentemente, o cérebro foi removido do crânio e rombencéfalo e prosencéfalo foram separados com um corte no plano coronal/frontal. O prosencéfalo foi dividido igualmente em hemisfério esquerdo e direito usando um corte sagital mediano. Um hemisfério foi pós- fixado durante a noite em 4 % de paraformaldeído para histologia. Seções sagitais de vibrátomo (40 μιη) foram cortadas para incubações livres de flutuação e armazenadas a 4o C até coloração em PBS com 0,1 % de azida sódica. Cinco seções em diferentes níveis foram coloridas para placas densas com Tioflavina S. Seções de todos os animais usados foram randomizadas para coloração e quantificação cega. Imagens foram adquiridas com um microscópio Leica DMR equipado com uma câmara Sony DXC-9100P e analisadas com um computador usando o software Leica Q-Win. As configurações de intensidade de luz e condensador para o microscópio foram mantidas constantes ao longo do processo de aquisição de imagem. Todas as imagens adquiridas foram submetidas às mesmas subrotinas computacionais para minimizar a influência do investigador. A densidade do limiar de fatiamento foi aplicada uniformemente ao longo de análise. A área do subículo foi selecionada para quantificação automática da carga de amilóide na coloração de Tioflavina S.
A carga de placa total e o número de placas na área de subículo podem significantemente reduzidos quando camundongos hAPP/PS 1 duplos foram passivamente imunizados por 4 meses como descrito acima. Em carga de placa uma diminuição significante de 31 % (mACI-01- Ab7 C2: 1,11 ± 0,21 % e controle: 1,61 ±0,35 %; ρ = 0,003, teste U de Mann-Whitney) pode ser atingida ao passo que a imunização passiva crônica reduziu de modo significante a quantidade de placas em 19 % (mACI-01-Ab7 C2: 8,73 ± 1,36 e controle: 10,78 ± 1,36; ρ = 0,006, teste U de Mann-Whitney), indicando que solubilização de placa ocorreu em um grau levemente menor do que a ruptura de placas.
EXEMPLO 23: Influência da Vacinação Passiva com mACI-01-Ab7 C2 na Capacidade de Memória em Camundongos hAPP transgênicos únicos Para analisar a capacidade in vivo do anticorpo mACl-01-Ab7
C2 de modificar ou aumentar a funcionalidade cognitiva, camundongos hAPP únicos de 9 meses de idade, com gênero e idade compatíveis, foram usados para estudo de imunização passiva. A cognição não especial foi medida no final do período de imunização verificado por nova Tarefa de Reconhecimento de Objetos (ORT).
12 animais por grupo receberam duas injeções intraperitoneais de 400 μg de anticorpo monoclonal em 200 μΐ de PBS ao passo que a injeção de PBS serviu apenas como controle. Um dia depois da segunda injeção a capacidade cognitiva foi estudada em uma nova Tarefa de Reconhecimento de Objetos (ORT) 12,13. Para o protocolo de ORT os camundongos foram colocados por 10 minutos em uma arena comportamental e defrontados com um novo objeto desconhecido. O tempo de exploração foi registrado. Três horas depois os mesmos animais foram re-colocados na mesma arena para uma 2a sessão mas defrontados com o objeto velho, previamente explorado, e adicionalmente com um novo. Mais uma vez, os tempos de exploração para ambos objetos foram registrados e o índice de cognição resultante foi calculado como a proporção de tempo de exploração para o objeto novo relacionado ao tempo de exploração total e expresso como mudanças proporcionais para o controle.
A vacinação passiva com mACI-01-Ab7 C2 levou a um aumento significante de capacidades de memória cognitiva em camundongos AD transgênicos únicos (mACI-01-Ab7 C2: 131,6 ± 9,1 % e controle: 100,0 ± 9,2 % com ρ < 0,05; teste t de Student não pareado e η = 12 por cada grupo). Lista de Referência
Barghom S, Nimmrich V, Striebinger A, Krantz C, Keller P, Janson B, Bahr M, Schmidt M, Bitner RS, Harlan J, Barlow E, Ebert U, Hillen H (2005) Globular beta-amilóide-peptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological proteína in Mal de Alzheimer. J Neurochem 95: 834-847.
Blond e Goldberg, 1987, PNAS 1 de março de 1987 VoL 84 I
nü5 1147-1151
Cox JPL, Tomlinson IM e Winter G. Eur. J. Immunol. 1994; 24: 827-836. A directory of human germ-line Vk segments reveals a strong bias in their usage.
Hieter PA, Max BE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in fimctional segments. Cell. 22 de Nov de 1980 (1 Pt 1): 197-207.
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of proteínas of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991.
Klein WL (2002) Abeta toxicity in Mal de Alzheimer: globular soluble polymeric beta-amilóide (ADDLs) as new vaccine and drug targets. Neurochem hit 41(5): 345-352.
Langdon SD, lnaioki M, Kelsoe G e Tedder TF. Immunogenetics 2000; 51: 241-245. Germline sequences of V(H)7183 gene family members in C57BL/6 mice demonstrate natural selection of particular sequences during recent evolution
Mulligan RC e Berg P. Science 1980; 209: 1422-1427. Expression of a bacterial gene in mamíferoian cells.
Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G, Nature 1988; 332: 323-327. Reshaping human antibodies for therapy. Schable KY, Thiebe R, Bensch Α, Brensing-Kueppers J, Heim. V, Kirsehbaum Τ, Lamm R, Ohnrieh Μ, Pourrajabi S, Rosehenthaler F, Sehwendinger J, Wiehelhaus D, Zoeher I e Zaehau HG. Eur. J. Immunol. 1999; 29: 2082-2086. Characteristies of the immunoglobulin V kappa genes, pseudogenes, relics and orphons in the mouse genome.
Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB e Winter G. J. Mol. Biol. 1992; 227: 776 - 798. The repertoire of human germline VH sequences reveals about 50 grupos of Vn segments with different hypervariable loops

Claims (170)

1. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a pelo menos um epítopo na proteína β-amilóide em que o epítopo compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação ao anticorpo, em que o pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Lys-Leu- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo (SEQ ID NO: 10): Xaai-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3 em que Xaaj é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg, Xaa2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln; e Xaa3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie.
2. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a pelo menos um epítopo na proteína β-amilóide em que o dito epítopo compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação ao anticorpo, em que os pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe-Phe- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo (SEQ ID NO: 9): Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6, em que Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Len, Ser e lie; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp e Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Gln e Asp.
3. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a pelo menos dois epítopos na proteína β-amilóide em que os ditos pelo menos dois epítopos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos dois aminoácidos consecutivos são separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor do que os ditos resíduos de aminoácido consecutivos, que são -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente, embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo: Xaa1-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa5-Xaa6, em que Xaa1 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, Lys e Arg; Xaa2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln; Xaa3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa4 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa5 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp, e Xaa6 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp.
4. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que His e Arg; Asn e Gln; Val e Leu, Ala e Vai; Glu e Asp e Glu e Asp. Xaaj é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Xaa2 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Xaa3 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Xaa4 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Xaa5 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Xaa6 é um aminoácido selecionado do grupo que consiste de
5. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que Xaai é His Xaa2 é Gln; Xaa3 é Vai; Xaa4 é Ala; Xaa5 é Glu; e Xaa6 é Asp.
6. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que especificamente se liga a pelo menos dois epítopos na proteína de β-amilóide em que os ditos pelo menos dois epítopos cada um compreende pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, que são -Phe-Phe- e -Lys-Leu-, respectivamente e em que os ditos pelo menos dois sítios de ligação distintos exibem a seqüência de aminoácido -Val-Phe-Phe-Ala-Gln-Asp- mostrada na SEQ ID NO: 7 e a seqüência de aminoácido His-Gln-Lys-Leu-Val- mostrada na SEQ ID NO: 8, respectivamente.
7. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreendem na região variável pelo menos uma CDR de origem não humana e uma ou mais regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e, opcionalmente, uma região constante derivada de um anticorpo de fonte humana ou primata, cujo anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo são capazes de ligar especificamente proteína β- amilóide, peptídeo monomérico de β-amilóide, peptídeos de amilóide solúveis poliméricos que compreendem uma pluralidade de unidades monoméricas de β-amilóide, fibras de β-amilóide, fibrilas ou filamentos e um peptídeo polimérico de β-amilóide em isolação ou como parte de uma placa de β- amilóide, em um epítopo que compreende a seguinte seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 11): Xaai-Xaa2-Lys-Leu-Xaa3-Phe-Phe-Xaa4-Xaa5-Xaa6, em que Xaa, é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de His, Asn, Gln, mas particularmente His; Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Asn e Gln, mas particularmente Gln; e Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Vai, Leu e lie, mas particularmente Vai; Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ala e Vai, mas particularmente Ala; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp, mas particularmente Glu; e Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste de Glu e Asp, mas particularmente Asp.
8. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a CDR de origem não humana é obtida de um anticorpo doador incitado contra um fragmento de antígeno que não contém o dito epítopo.
9. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende regiões variáveis com regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e pelo menos uma CDR com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste de SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 representando a CDRl da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
10. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo humanizado compreende uma região variável de cadeia pesada com regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata e pelo menos uma CDR com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
11. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo humanizado compreende um região variável de cadeia leve com regiões de matriz derivadas de cadeia leve de ser humano ou primata e uma CDR com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
12. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis com regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e pelo menos duas CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO:1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
13. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende região variável de cadeia pesada com regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata e pelo menos duas CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consistem da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
14. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis de cadeia leve com regiões de matriz derivadas de cadeia leve de ser humano ou primata e pelo menos duas CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
15. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis de cadeia pesada com regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata e CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), particularmente na ordem indicada.
16. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis de cadeia leve com regiões de matriz derivadas de cadeia leve de ser humano ou primata e CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), particularmente na ordem indicada.
17. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis com regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e pelo menos três CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO:1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
18. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis com regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e pelo menos quatro CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
19. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis com regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e pelo menos cinco CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), em que a mesma CDR não pode estar presente duas vezes no anticorpo.
20. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado compreende regiões variáveis com regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
21. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma CDR é uma CDR com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
22. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma CDR é uma CDR com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
23. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas CDRs são CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 representando a CDRI e SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
24. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas CDRs são CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
25. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas CDRs são CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
26. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas CDRs são CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl e SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
27. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas CDRs são CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
28. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as pelo menos duas CDRs são selecionadas do grupo de CDRs como definido em qualquer uma das reivindicações de 23 a 27.
29. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 28, caracterizado pelo fato de que compreendem uma região constante de cadeia leve e/ou uma de cadeia pesada de origem humana ou de primata.
30. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos aminoácidos de uma região de CDR de cadeia leve e uma de cadeia pesada como dado nas SEQ ID NOs: 1 a 6 é mudado através de uma substituição conservativa tal que o anticorpo mantém a sua funcionalidade completa.
31. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que dentro da seqüência de aminoácido da CDR2 da região variável de cadeia leve (LCVR) como dado na SEQ ID NO: 5, o Lys na posição Kabat 50 é substituído por Arg, Gln ou Glu, mas particularmente por Arg e /ou o Asn na posição Kabat 53 é substituído por Ala, Vai, Leu, Ser e lie; mas especialmente Ser.
32. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 31, caracterizado pelo fato de que as seqüências de matriz são seqüências Vk da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VkIL
33. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 31, caracterizado pelo fato de que as seqüências de matriz são seqüências Vh da linha germinativa humana de KABAT subgrupo VHIII.
34. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 33, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos aminoácidos da região de matriz derivada de ser humano ou primata é mudado através de uma substituição para um aminoácido da região correspondente de anticorpo humanizado de murino ACI-Ol-AblCl ou uma substituição conservativa para este.
35. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, lie, Vai, Met, Ala e Phe.
36. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o Arg na posição de Kabat 94 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ser e Thr, mas especialmente por Ser.
37. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, lie, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e lie, mas especialmente Leu e Arg na posição de Kabat 94 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ser e Thr, mas especialmente por Ser.
38. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o Tyr na posição de Kabat 87 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrada na SEQ ID NO: 12 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Phe, Leu, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu e Phe, mas especialmente por Phe.
39. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, lie, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e lie, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ser e Thr, mas especialmente por Ser e o Tyr na posição de Kabat 87 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrada na SEQ ID NO: 12 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Phe, Len, Vai, Ile e Ala, particularmente por Leu e Phe, mas especialmente por Phe.
40. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu, norleucina, lie, Vai, Met, Ala e Phe, particularmente Leu e lie, mas especialmente Leu.
41. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o Arg na posição de Kabat 94 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Ser e Thr, mas especialmente por Ser.
42. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu e lie, mas especialmente Leu.
43. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o Tyr na posição de Kabat 87 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrada na SEQ ID NO: 12 é substituído por Phe.
44. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o Trp na posição de Kabat 47 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por um aminoácido selecionado do grupo que consiste de Leu e lie, mas especialmente Leu e o Arg na posição de Kabat 94 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Pesada como mostrada na SEQ ID NO: 15 é substituído por Ser e o Tyr na posição de Kabat 87 na região de matriz derivada de ser humano ou primata da Região Variável de Cadeia Leve como mostrada na SEQ ID NO: 12 é substituído por Phe.
45. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 44, caracterizado pelo fato de que a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) tem uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntica à seqüência dada nas SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente.
46. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 44, caracterizado pelo fato de que a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) tem uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntica à seqüência dada nas SEQ ID NOs: 12 e 13, respectivamente.
47. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 44, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões de CDR da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) têm uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntica à região de CDR correspondente como dada nas SEQ ID NOs: 1 a 3.
48. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 44, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas, mas especialmente três, das regiões de CDR da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) têm uma seqüência de aminoácido que é 90 %, particularmente 95 %, mais particularmente 98 % idêntica à região de CDR correspondente como dada nas SEQ ID NOs: 4 a 6.
49. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13.
50. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que compreende além disso a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 14.
51. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo, ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13 e a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 14.
52. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizados pelo fato de que compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 16.
53. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que compreende além disso a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.
54. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreendem a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 16 e a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.
55. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50, 51, 53 e 54, caracterizado pelo fato de que o Lys do terminal N da região constante de cadeia pesada foi removido.
56. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é do isótipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 incluindo um IgG4 mutado, mas particularmente do isótipo IgG4.
57. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é bi-eficaz em que exibe tanto uma propriedade de inibição de agregação assim como uma propriedade de desagregação, particularmente emparelhada com um alto grau de sensibilidade conformacional.
58. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, na co-incubação com peptídeos amilóide solúveis monoméricos e/ou poliméricos, particularmente com peptídeos monoméricos de β-amilóide tais como, por exemplo, peptídeos monoméricos Αβ 1-39; 1-40, 1-41 ou 1-42, e/ou um peptídeo β-amilóide solúvel polimérico que compreendem uma pluralidade das ditas unidades monoméricas de Αβ, mas especialmente com um peptídeo amilóide solúvel monomérico Αβι.42 e/ou um polimérico Αβ que compreende uma pluralidade das ditas unidades monoméricas Αβι.42, inibe a agregação dos monômeros Αβ em fibrilas ou filamentos poliméricos moleculares altos e, além disso, na co-incubação com fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico molecular alto pré formadas, formadas pela agregação de peptídeos monoméricos de amilóide, particularmente peptídeos monoméricos de β-amilóide tais como, por exemplo, peptídeos monoméricos Αβ 1-39; 1-40, 1-41 ou 1-42, mas especialmente peptídeos monoméricos Αβι. 42, é capaz de desagregar as fibrilas ou filamentos poliméricos pré formados.
59. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo substancialmente se liga ao Αβ agregado em um cérebro de mamífero, particularmente um cérebro humano.
60. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo reduz a carga de placa Αβ em um cérebro de mamífero, particularmente um cérebro humano.
61. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 60.
62. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma região variável de anticorpo que compreende as SEQ ID NOs: 2 e 3 representando as Regiões Determinadoras de Complementaridade (CDRs) 2 e 3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
63. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma região variável de anticorpo que compreende a SEQ ID NO: 4 representando as Regiões Determinadoras de Complementaridade (CDRs) 1 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
64. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação62, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo como dada na SEQID NO: 18 e SEQ ID NO: 19.
65. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação63, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo como dada na SEQ ID NO: 20.
66. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 22.
67. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 22 e a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 23.
68. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25.
69. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25 e a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 26.
70. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de nucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações de 60 a 69.
71. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão compreendendo a seqüência de nucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações de 60 a 68 ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 70.
72. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 60 incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
73. Composição de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pelo fato de que é uma composição farmacêutica opcionalmente compreendendo ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.
74. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 72 a 73, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
75. Mistura, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 60 incluindo qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste em uma quantidade terapeuticamente eficaz e, opcionalmente, uma outra substância biologicamente ativa e/ou um carreador e/ou um diluente e/ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
76. Mistura de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pelo fato de que a outra substância biologicamente ativa é um composto usado no tratamento de amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com amilóide ou proteína equivalente a amilóide tal como a proteína Αβ envolvida no mal de Alzheimer.
77. Mistura de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um composto selecionado do grupo que consiste de compostos contra o estresse oxidativo, compostos anti- apoptóticos, queladores metálicos, inibidores do reparo de DNA tais como pirenzepina e metabólitos, ácido 3-amino-l-propanossulfônico (SAPS), 1,3- propanodissulfonato (1,3PDS), ativadores da α-secretase, inibidores da β- e γ- secretases, proteínas tau, neurotransmissores, rompedores da folha β, atraentes para componentes celulares que depuram/esgotam beta-amilóide, inibidores de beta-amilóide truncado no terminal N incluindo beta-amilóide 3-42 piroglutamado, moléculas anti-inflamatórias ou inibidores da colinesterase (ChEIs) tais como tacrina, rivastigmina, donepezil e/ou galantamina, agonistas Ml e outros medicamentos incluindo qualquer medicamento modificador de amilóide ou tau e suplementos nutritivos, juntos com um anticorpo de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou um diluente e/ou um excipiente.
78. Mistura de acordo com a reivindicação 77, caracterizada pelo fato de que o composto é um inibidor da colinesterase (ChEIs).
79. Mistura de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 77, caracterizada pelo fato de que o composto é um selecionado do grupo que consiste de tacrina, rivastigmina, donepezil, galantamina, niacina e memantina.
80. Mistura de acordo com qualquer uma das reivindicações de 75 a 79, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo e/ou a substância biologicamente ativa em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
81. Uso de um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo e/ou uma parte funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 60 e/ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 72 a 74 ou uma mistura como definida em qualquer uma das reivindicações de 75 a 80, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para tratar ou aliviar os efeitos da amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tal como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como Mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas ou associadas com proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo degeneração macular.
82. Uso de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição associada com amilóide é o mal de Alzheimer.
83. Uso de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a condição associada com amilóide é distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano.
84. Uso de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva a um aumento da capacidade de memória cognitiva.
85. Uso de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofre de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva a uma restauração completa da capacidade de memória cognitiva.
86. Método para a preparação de uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 72 a 74 ou de uma mistura como definida em qualquer uma das reivindicações de 75 a80 para o uso em um método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos da amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas ou associadas com as proteínas equivalentes a amilóide tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo degeneração macular, caracterizado pelo fato de que compreende formular um anticorpo de acordo com a invenção em uma forma farmaceuticamente aceitável.
87. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é compreendido na composição em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
88. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição associada com amilóide é o mal de Alzheimer.
89. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a condição associada com amilóide é distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano.
90. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva a um aumento da capacidade de memória cognitiva.
91. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a condição associada com amilóide é distinguida por uma deterioração da capacidade de memória cognitiva em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano.
92. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva a uma reversão da capacidade de memória cognitiva e, particularmente, uma restauração completa da capacidade de memória cognitiva.
93. Método para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de uma doença, a dita doença sendo a amiloidose, um grupo de doenças e distúrbios associados com a formação de placa amilóide incluindo amiloidose secundária e amiloidose relacionada com a idade tais como doenças incluindo, mas não limitadas a, distúrbios neurológicos tais como o mal de Alzheimer (AD), demência de corpo de Lewy, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose (tipo Holandês); o complexo de Parkinson-Demência de Guam; assim como outras doenças que são fundamentadas ou associadas com a proteína equivalente a amilóides tais como paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla; doença de Creutzfeld Jacob, mal de Parkinson, demência relacionada com o HIV, ALS (esclerose lateral amiotrópica), Diabete de Início no Adulto; amiloidose cardíaca senil; tumores endócrinos e outros, incluindo a degeneração macular pela administração de um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo e/ou uma parte funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 60 e/ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 72 a 74 ou uma mistura como definida em qualquer uma das reivindicações de 75 a 80, a um animal ou um ser humano afetados por um tal distúrbio, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo em uma quantidade terapeuticamente eficaz.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição associada com amilóide é o mal de Alzheimer.
95. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a condição associada com amilóide é distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano.
96. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva a um aumento na retenção ou capacidade de memória cognitiva.
97. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a condição associada com amilóide é distinguida por uma deterioração da capacidade de memória cognitiva em um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano.
98. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva a uma restauração completa da capacidade de memória cognitiva.
99. Método de diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende (a) levar a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas suspeitas de conter a proteína de amilóide em contato com um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; (b) permitir que o anticorpo se ligue à proteína de amilóide; (c) detectar o anticorpo ligado à proteína; e (d) correlacionar a presença ou ausência de ligação de anticorpo com a presença ou ausência da proteína de amilóide na amostra ou parte ou área do corpo específicas.
100. Método de determinação do grau da carga de placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, caracterizado pelo fato de que compreende (a) obter uma amostra representativa do tecido e/ou fluidos corporais sob investigação; (b) testar a dita amostra quanto a presença de proteína de amilóide com um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; (c) determinar a quantidade de anticorpo ligado à proteína; e (d) calcular a carga de placa no tecido e/ou fluidos corporais.
101. Kits de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com amilóide, caracterizados pelo fato de que compreendem um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 60.
102. Kit de teste de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente contendo um ou mais anticorpos de acordo com a presente invenção e instruções para usar os anticorpos para o propósito de ligar à proteína de amilóide para formar um complexo imunológico e detectar a formação do complexo imunológico tal que a presença ou ausência do complexo imunológico correlacione-se com presença ou ausência da proteína de amilóide.
103. Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), caracterizada pelo fato de que compreende regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e pelo menos uma CDR com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
104. Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), caracterizada pelo fato de que compreende regiões de matriz derivadas de ser humano ou primata e pelo menos uma CDR com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
105. Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), caracterizada pelo fato de que compreende regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata e pelo menos duas CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR).
106. Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), caracterizada pelo fato de que compreende regiões de matriz de cadeia leve derivadas de ser humano ou primata e pelo menos duas CDRs com uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo de seqüências que consiste da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR).
107. Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), caracterizada pelo fato de que compreende regiões de matriz de cadeia pesada derivadas de ser humano ou primata e CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 representando a CDRl, SEQ ID NO: 2 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 3 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), particularmente na ordem indicada acima.
108. Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), caracterizada pelo fato de que compreende integrado nas regiões de matriz de cadeia leve derivadas de ser humano ou primata e CDRs com uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 representando a CDRl, SEQ ID NO: 5 representando a CDR2 e SEQ ID NO: 6 representando a CDR3 da Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), particularmente na ordem indicada acima.
109. Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), caracterizada pelo fato de que é da SEQ ID NO: 12.
110. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo são fornecidos, caracterizados pelo fato de que compreendem a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) da SEQID NO: 12.
111. Região Variável de Cadeia Leve (LCVR), caracterizada pelo fato de que inclui seqüências de sinal como mostrada na SEQ ID NO: 13.
112. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizados pelo fato de que compreendem a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) completa incluindo seqüências de sinal como mostrado na SEQ ID NO: 13.
113. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizados pelo fato de que compreendem a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) da SEQ ID NO: 12 e a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 14.
114. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizados pelo fato de que compreendem a Região Variável de Cadeia Leve (LCVR) completa da SEQ ID NO: 13 e a região constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 14.
115. Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), caracterizada pelo fato de que é da SEQ ID NO: 15.
116. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 15.
117. Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR), caracterizada pelo fato de que inclui seqüências de sinal como mostrado na SEQ ID NO: 16.
118. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) completa incluindo seqüências de sinal como mostrado na SEQ ID NO: 16.
119. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 15 e a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.
120. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 16 e a região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17.
121. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo substancialmente liga monômeros Αβ mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
122. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento liga-se a um monômero Αβ com uma afinidade de ligação representada por um Kd em uma faixa de pelo menos cerca de 1 χ 10" Ma pelo menos cerca de 1 χ 10" Μ, particularmente de pelo menos cerca de 1 χ a pelo menos cerca de 1 χ IO"11 M, mais particularmente de pelo menos cerca de 1 χ 10" Ma pelo menos cerca de 1 χ 10" Μ, ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 1 χ IO"8 M a pelo menos cerca de 5 χ 10" M mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com proteína precursora de amilóide (APP).
123. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo substancialmente liga fibra, fibrila ou filamento de Αβ mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
124. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento ligam-se a uma fibra, fibrila ou filamento Αβ com uma afinidade de ligação representada por um Kd em uma faixa de pelo menos cerca de 1 χ a pelo menos cerca de 1 χ 10" Μ, particularmente de pelo menos cerca de 1 χ 10" Ma pelo menos cerca de 1 χ mais particularmente de pelo menos cerca de 1 χ IO"9 M a pelo menos cerca de 1 χ IO"10 Μ, ainda mais particularmente de pelo menos cerca de 2 χ IO-9Ma pelo menos cerca de 8 χ mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
125. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo substancialmente liga beta-amilóide polimérico solúvel mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
126. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo substancialmente liga monômeros Αβ e/ou fibras, fibrilas ou filamentos Αβ e/ou beta-amilóide polimérico solúvel mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
127. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação aumenta na ordem ascendente.
128. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo exibe uma afinidade de ligação a uma fibra, fibrila ou filamento Αβ que é pelo menos 10 vezes, particularmente pelo menos 15 vezes, mais particularmente pelo menos 20 vezes, mas especialmente pelo menos 25 vezes mais alto do que a afinidade de ligação a um monômero Αβ.
129. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo substancialmente liga-se ao Αβ agregado, incluindo placas Αβ, no mamífero, particularmente no cérebro humano mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
130. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo substancialmente liga-se às fibras solúveis, incluindo monômeros Αβ, no mamífero, particularmente no cérebro humano mas, preferivelmente, não mostra nenhuma reatividade cruzada significante com a proteína precursora de amilóide (APP).
131. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é capaz de mudar o equilíbrio entre Αβ no seu estado solúvel e agregado para a sua forma solúvel pela desagregação das fibras para as formas poli- e monoméricas solúveis pela indução de uma mudança na conformação e ligar e estabilizar as formas de Αβ desagregadas e solubilizadas no tecido e/ou fluidos corporais, particularmente no cérebro.
132. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo são capazes de induzir uma transição da conformação de folha β para uma hélice α e/ou uma conformação espiralada aleatória, mas particularmente uma conformação espiralada aleatória, ainda mais particularmente uma conformação espiralada aleatória em uma dada localização na molécula, especialmente no ambiente de Tyr IOe Val 12 da proteína Αβ, que leva a um aumento da conformação espiralada aleatória às custas da conformação de folha β e uma solubilização melhorada das fibrilas ou filamentos de amilóide polimérico molecular alto pré formado.
133. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que a diminuição da conformação de folha β importa em pelo menos 30 %, particularmente em pelo menos 35 % e mais particularmente em pelo menos 40 % e mais quando comparado com as respectivas fibrilas ou filamentos poliméricos de amilóide pré formados incubados em tampão (controle).
134. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo substancialmente liga-se à espécie de proteína Αβ solúvel polimérica e menos agregada incluindo as formas monoméricas modificando assim a depuração periférica e o catabolismo destas espécies de proteína Αβ e reduzindo seus efeitos tóxicos.
135. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreendem pelo menos uma cadeia leve ou um fragmento desta ou pelo menos uma cadeia pesada ou um fragmento desta que incorporam pelo menos um, particularmente dois e mais particularmente três regiões de CDR obtidas de um anticorpo doador de camundongo, particularmente de anticorpo de camundongo ACI-Ol- Ab7C2, em que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo tem uma afinidade ao antígeno Αβ que é pelo menos 5 vezes, particularmente pelo menos 8 vezes, mais particularmente pelo menos vezes, mas especialmente pelo menos 15 vezes mais alto do que aquele do anticorpo doador de camundongo.
136. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de83 a 85, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo não liga necessariamente beta-amilóide agregado no cérebro.
137. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 89 a 91, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo não liga necessariamente agregado beta-amilóide no cérebro.
138. Uso de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva à retenção da capacidade de memória cognitiva.
139. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o tratamento de um animal, particularmente um mamífero ou um ser humano, que sofrem de uma condição associada com amilóide distinguida por uma perda de capacidade de memória cognitiva leva à retenção da capacidade de memória cognitiva.
140. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo é capaz de mudar o equilíbrio entre Αβ no seu estado solúvel e agregado contra a sua forma solúvel.
141. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo são capazes de mudar o equilíbrio entre Αβ no seu estado solúvel e agregado para a sua forma solúvel pela desagregação das fibras para as formas poli- e monoméricas solúveis.
142. Anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes; caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do mesmo não liga substancialmente Αβ no tecido e/ou fluidos corporais humanos, particularmente no cérebro, mas é capaz de mudar o equilíbrio entre Αβ no seu estado solúvel e agregado para a sua forma solúvel pela desagregação das fibras para as formas poli- e monoméricas solúveis pela indução de uma mudança na conformação e ligar e estabilizar as formas de Αβ desagregadas e solubilizadas no tecido e/ou fluidos corporais, particularmente no cérebro.
143. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo exibem uma afinidade de ligação que é pelo menos 5 vezes, 10 vezes, particularmente pelo menos 15 vezes, mais particularmente pelo menos 20 vezes, mas especialmente pelo menos 100 vezes mais alta do que a afinidade de ligação do anticorpo de camundongo.
144. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a afinidade, especificidade e estabilidade do dito anticorpo ou fragmento do mesmo foram modificadas por uma mudança do perfil de glicosilação.
145. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável como relatada na SEQ ID NO: 27 ou uma variante desta.
146. Linhagem de célula, caracterizada pelo fato de que expressa o anticorpo como definido na reivindicação 145.
147. Gene de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável como relatada na SEQ ID NO: 29 ou uma variante desta.
148. Linhagem de célula, caracterizada pelo fato de que expressa o anticorpo como definido na reivindicação 147.
149. Método para desagregar fibras de beta-amilóide pré formadas, caracterizado pelo fato de que compreende interagir um anticorpo hC2 com fibras de beta-amilóide pré formadas.
150. Anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento do mesmo protege os neurônios da degradação induzida Abeta.
151. Método para prevenir a degradação de neurônio induzida por Abeta, caracterizado pelo fato de que compreende tratar os neurônios com uma quantidade eficaz de um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
152. Uso de um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para prevenir a degeneração de neurônios na exposição ao oligômero Abeta.
153. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a um mínimo de dois sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que o dito pelo menos um ou o dito pelo menos dois sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um resíduo de aminoácido e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que, em uma forma de realização específica da invenção, o pelo menos um resíduo que constitui o primeiro sítio de ligação distinto é Leu e o pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, que constitui o segundo sítio de ligação distinto, são -Phe-Phe- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo: - Xaai - Xaa2 - Xaa3 - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 em que Xaai é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln, Lys e Arg; Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln; Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Lys, His, Asn, Gln e Arg Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp, Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp.
154. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a um mínimo de dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide B em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos um e o pelo menos dois aminoácidos consecutivos, que são separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado aos resíduos de aminoácido predominantemente envolvido na ligação do anticorpo, são -His- e -Lys-Leu-, respectivamente, embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo: - His - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa3- Xaa4- Xaa5-Xaa6- - Xaa7 - Xaa8 - em que Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln; Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ile Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp, Xaa8 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3 Xaa6j Xaa7 Xaa8, não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação -His- e ao - Lys-Leu-.
155. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a um mínimo de dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos que representam um primeiro sítio de ligação são -Phe-Phe- e o pelo menos um resíduo de aminoácido é -His- embutido dentro da seguinte seqüência de núcleo: - Xaai - His -Xaa3 - Xaa4 - Xaa5- Xaa6 - Phe - Phe - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 -, em que Xaaj é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln, Lys e Arg Xaa3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln, Lys e Arg Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu e Ile Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu e Ile Xaa8 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp, Xaa9 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaaj, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8 e Xaa9, não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação His e ao -Phe-Phe-.
156. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a um mínimo de dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o primeiro dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são -Lys- e -Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe- Phe- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo: - Xaa1 - Xaa2 - Lys - Leu - Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 em que Xaai é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln Lys e Arg; Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln; Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp, Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6j Xaa7 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado ao sítio de ligação -Lys-Leu e ao -Phe-Phe-.
157. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a um mínimo de dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o primeiro dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são -Lys-Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe- Phe- e o terceiro pelo menos um resíduo de amino é -His- embutido dentro da seguinte seqüência de núcleo: -His - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7j em que Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln; Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp, Xaa7 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4 Xaa5j Xaa65 Xaa7 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado com o sítio de ligação -His- , o -Lys-Leu e o -Phe-Phe-.
158. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que reconhece e se liga a pelo menos um sítio de ligação distinto, particularmente a um mínimo de dois sítios de ligação distintos, mais particularmente a pelo menos três sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos sítios de ligação distintos compreendem pelo menos um e pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que o primeiro dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são -Lys-Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe- Phe- e o terceiro pelo menos um resíduo de amino é -Asp- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo: - Xaa1 - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5 - Xaa6 - Asp. em que Xaa1 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende His, Asn, Gln, Lys e Arg; Xaa? é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln; Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e Ue; Xaas é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4> Xaa5, Xaa65 Xaa7 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado com o sítio de ligação -Asp- , o -Lys-Leu e o -Phe-Phe-.
159. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, anticorpo este que se liga a 4 sítios de ligação distintos na proteína de amilóide β em que os ditos 4 sítios de ligação distintos compreendem um resíduo de aminoácido e dois resíduos de aminoácido consecutivos, respectivamente, resíduos estes que são predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo, em que os ditos 4 sítios de ligação distintos estão localizados em proximidade imediata entre si no antígeno, separados por pelo menos um resíduo de aminoácido não envolvido na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado com o dito um resíduo de aminoácido e os ditos dois resíduos de aminoácido consecutivos dos 4 sítios de ligação distintos formando assim um epítopo descontínuo conformacional.
160. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, em que o primeiro dos dois resíduos de aminoácido consecutivos predominantemente envolvidos na ligação do anticorpo são -Lys-Leu- e o segundo dos pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivos são -Phe-Phe-, o primeiro dos resíduos de amino únicos é -His- e o segundo dos resíduos de amino únicos é -Asp- embutidos dentro da seguinte seqüência de núcleo: - His - Xaa2 - Lys - Leu -Xaa4 - Phe - Phe - Xaa5- Xaa6- Asp. em que Xaa2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Asn e Gln; Xaa4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, norleucina, Met, Phe e lie; Xaa5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Ala, Vai, Leu, Ser e lie; Xaa6 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que compreende Glu e Asp e em que os ditos resíduos de aminoácido Xaa2, Xaa3, Xaa4 Xaa5 Xaa65 Xaa7 não estão envolvidos na ligação de anticorpo ou a um grau significantemente menor quando comparado com o sítio de ligação -His- , -Asp-, o -Lys-Leu e o -Phe-Phe-.
161. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações de 157 a 160, caracterizado pelo fato de que inclui qualquer anticorpo funcionalmente equivalente ou partes funcionais deste, em que os ditos resíduos de aminoácido consecutivos, particularmente -Lys-Leu- nas posições 16 e 17 e -Phe- Phe- nas posições 19 e 20, que estão predominantemente envolvidas na ligação da proteína de amilóide β, são embutidos na seguinte região de núcleo do peptídeo de amilóide: Val His Hia Gln Lys Lsi Val Ρbe Phe Als Qhi Asp .12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
162. Método para diagnosticar uma predisposição a uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende detectar a ligação imunoespecífica de um anticorpo monoclonal ou um fragmento ativo deste a um epitope da proteína de amilóide em uma amostra ou in situ que inclui as etapas de (a) levar a amostra ou uma parte de corpo ou área de corpo específicas suspeitas de conter o antígeno de amilóide em contato com um anticorpo de acordo com a invenção e como descrito aqui antes, anticorpo este que se liga a um epítopo da proteína amilóide; (b) deixar o anticorpo ligar ao antígeno de amilóide para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno de amilóide na amostra ou parte ou área do corpo específica, (e) comparar a quantidade do dito complexo imunológico com um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do dito agregado comparado com um valor de controle normal indica que o dito paciente está sofrendo de ou está em risco de desenvolver uma doença ou condição associada com amilóide.
163. Método para monitorar doença residual mínima em um paciente a seguir do tratamento com um anticorpo ou uma composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) levar a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas suspeitas de conter o antígeno de amilóide em contato com um anticorpo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes, anticorpo este que se liga a um epítopo da proteína de amilóide; (b) deixar o anticorpo ligar ao antígeno de amilóide para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno de amilóide na amostra ou parte ou área do corpo específicas, (e) comparar a quantidade do dito complexo imunológico a um valor de controle normal, em que um aumento na quantidade do dito agregado comparado a um valor de controle normal indica que o dito paciente ainda sofre de uma doença residual mínima.
164. Método para prognosticar a responsividade de um paciente que é tratado com um anticorpo ou uma composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado pelo fato de que compreende (a) levar a amostra ou uma parte do corpo ou área do corpo específicas suspeitas de conter o antígeno de amilóide em contato com um anticorpo de acordo com a invenção e como aqui descrito antes, anticorpo este que se liga a um epítopo da proteeína de amilóide; (b) deixar o anticorpo ligar ao antígeno de amilóide para formar um complexo imunológico; (c) detectar a formação do complexo imunológico; e (d) correlacionar a presença ou ausência do complexo imunológico com a presença ou ausência de antígeno de amilóide na amostra ou parte ou área do corpo específicas, (e) comparar a quantidade do dito complexo imunológico antes e depois do início do tratamento, em que uma diminuição na quantidade do dito agregado indica que o dito paciente tem um potencial alto de ser responsivo ao tratamento.
165. Método para reduzir a carga de placa no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um ser humano que sofre de uma doença ou condição que leva a uma carga de placa aumentada no cérebro caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações de 153 a 161.
166. Método de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que a carga de placa no cérebro é diminuída em pelo menos 20 %, particularmente em pelo menos 25 %, mais particularmente em pelo menos 30 %, ainda mais particularmente em mais do que 30 %
167. Método para reduzir a quantidade de placas no cérebro de um animal, particularmente um mamífero, mas especialmente um ser humano que sofre de uma doença ou condição que leva a uma carga de placa aumentada no céerebro, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um animal, particularmente um mamífero, mais particularmente um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações de 153 a 161.
168. Método de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a quantidade de placas no cérbro é reduzida em pelo menos 10 %, particularmente em pelo menos 15 %, mais particularmente em pelo menos 20 %.
169. Método para diminuir a quantidade total de Αβ solúvel no cérebro de um animal, particularmente de um mamífero, mas especialmente de um ser humano que sofre de uma doença ou condição que leva às concentrações aumentadas de Αβ solúvel no cérebro, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um animal, particularmente a um mamífero, mais particularmente a um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações de 153 a 161.
170. Método para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero que exiba uma doença ou condição associada com amilóide, caracterizado pelo fato de que compreendem administrar a um animal, particularmente a um mamífero, mais particularmente a um ser humano em necessidade de um tal tratamento, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações de 153 a 161.
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Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
PT1954718E (pt) 2005-11-30 2014-12-16 Abbvie Inc Anticorpos anti-globulómeros aβ, suas porções de ligação ao antigénio, correspondentes hibridomas, ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras, métodos de produção dos ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos para uso dos ditos anticorpos
KR20180058863A (ko) 2005-11-30 2018-06-01 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
CA2632822C (en) 2005-12-12 2018-08-28 Ruth Greferath A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
PL2468770T3 (pl) 2006-07-14 2018-07-31 Ac Immune S.A. Humanizowane przeciwciało przeciw amyloidowi beta
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
US20100311767A1 (en) 2007-02-27 2010-12-09 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US20090022728A1 (en) * 2007-03-09 2009-01-22 Rinat Neuroscience Corporation Methods of treating ophthalmic diseases
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
NZ599497A (en) * 2007-06-12 2013-11-29 Ac Immune Sa Humanized antibodies to amyloid beta
EP2586795B1 (en) 2007-10-05 2018-05-16 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
BRPI0818621A8 (pt) * 2007-10-05 2018-01-30 Ac Immune Sa composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa e a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um indivíduo, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular, para diagnosticar uma doença ocular e uma predisposição a uma doença ocular, para monitorar doença ocular, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir pressão ocular nos olhos de um indivíduo
EP2650308A3 (en) * 2007-10-05 2014-11-12 Genentech, Inc. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
NZ590563A (en) 2008-07-21 2012-06-29 Probiodrug Ag Diagnostic antibody assay
GB0821994D0 (en) * 2008-12-02 2009-01-07 Ge Healthcare Ltd In viva imaging method
BR112012008346B1 (pt) 2009-09-11 2021-12-21 Vivoryon Therapeutics N.V. Derivados heterocíclicos, seu processo de preparação, e composição farmacêutica
US8464722B2 (en) 2010-03-04 2013-06-18 Medline Industries, Inc. Folded telescopic equipment drape and method of folding and using the same
MX336196B (es) * 2010-04-15 2016-01-11 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
MY164579A (en) 2010-07-30 2018-01-15 Ac Immune Sa Safe and functional humanized antibodies
EP3533803B1 (en) 2010-08-14 2021-10-27 AbbVie Inc. Anti-amyloid-beta antibodies
US20140302532A1 (en) 2011-04-12 2014-10-09 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patient's recovery from a brain injury
US10188475B2 (en) 2011-10-13 2019-01-29 Medline Industries, Inc. Drape for equipment having cylindrical or other non-planar contours
EP2834644B1 (de) * 2012-04-05 2019-08-21 Forschungszentrum Jülich GmbH Polymere, enthaltend multivalente amyloid-beta-bindende d-peptide und deren verwendung
EP3030580A4 (en) * 2013-08-05 2017-04-05 St. Vincent's Institute Of Medical Research An antibody therapy for amyloid beta disease
KR102332302B1 (ko) 2013-09-13 2021-12-01 제넨테크, 인크. 세포주에서 숙주 세포 단백질 및 재조합 폴리펩티드 생성물을 검출 및 정량화하기 위한 조성물 및 방법
SG10201802525QA (en) 2013-09-13 2018-04-27 Genentech Inc Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
TWI769970B (zh) * 2014-02-08 2022-07-11 美商建南德克公司 治療阿茲海默症之方法
SMT202100263T1 (it) * 2014-07-10 2021-07-12 Eisai R&D Man Co Ltd Anticorpi leganti protofibrille a-beta migliorati
CN104558172A (zh) * 2015-01-04 2015-04-29 东南大学 一种针对β淀粉样蛋白的单域重链纳米抗体及其应用
CN108350052A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β中间区域中的表位及其构象选择性抗体
HK1259325A1 (zh) 2015-11-09 2019-11-29 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β中的N-末端表位及其构象选择性抗体
KR20180094876A (ko) 2015-11-09 2018-08-24 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 아밀로이드 베타 에피토프 및 이에 대한 항체
CA3011739A1 (en) * 2016-01-20 2017-07-27 Genentech, Inc. High dose treatments for alzheimer's disease
US12071472B2 (en) 2016-07-18 2024-08-27 The University Of British Columbia Methods of reducing toxicity induced by Amyloid beta (A-beta) oligomers using antibodies specific to A-beta oligomers
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
BR112019014187A2 (pt) * 2017-01-09 2020-02-11 Tesaro, Inc. Métodos de tratamento de câncer com anticorpos anti-pd-1
KR101989383B1 (ko) * 2017-04-04 2019-06-14 조선대학교산학협력단 알츠하이머성 치매의 조기진단을 위한 펩타이드 프로브
US12286469B2 (en) 2017-07-18 2025-04-29 The University Of British Columbia Humanized antibodies binding to amyloid-beta (A-beta)
US11382974B2 (en) 2017-08-01 2022-07-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for treatment of amyloid deposition diseases
PL3461819T3 (pl) 2017-09-29 2020-11-30 Probiodrug Ag Inhibitory cyklazy glutaminylowej
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits
CA3118692A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 Alsatech, Inc. Cell-based gene therapy for neurodegenerative diseases
US12352719B2 (en) 2019-09-20 2025-07-08 KYCERA AVX Components Corporation Somatic cell-based electrical biosensor
MX2023000949A (es) 2020-07-23 2023-02-22 Othair Prothena Ltd Anticuerpos anti-beta-amiloide (abeta).
CN114591429B (zh) * 2022-05-07 2022-08-09 北京第一生物化学药业有限公司 结合β-淀粉样蛋白的抗体及其用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20020094335A1 (en) * 1999-11-29 2002-07-18 Robert Chalifour Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
KR20020073341A (ko) * 1999-11-29 2002-09-23 뉴로켐, 인크. 알츠하이머 및 아밀로이드 관련 질병의 예방 및 치료용 백신
WO2001062801A2 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Washington University Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide
AR038568A1 (es) * 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
NZ554725A (en) * 2004-10-25 2009-10-30 Merck & Co Inc Anti-ADDL antibodies and uses thereof
EP1838349A1 (en) * 2004-12-15 2007-10-03 Neuralab, Ltd. Amyloid beta antibodies for use in improving cognition
KR20180058863A (ko) * 2005-11-30 2018-06-01 애브비 인코포레이티드 아밀로이드 베타 단백질에 대한 모노클로날 항체 및 이의 용도
CA2632822C (en) * 2005-12-12 2018-08-28 Ruth Greferath A beta 1-42 specific monoclonal antibodies with therapeutic properties
PL2468770T3 (pl) * 2006-07-14 2018-07-31 Ac Immune S.A. Humanizowane przeciwciało przeciw amyloidowi beta

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