BRPI0720280A2 - Métodos e composições para tratar e monitorar tratamento de desordens associadas à il-13 - Google Patents

Métodos e composições para tratar e monitorar tratamento de desordens associadas à il-13 Download PDF

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Marion T Kasaian
Timothy A Cook
Samuel J Goldman
Donald G Raible
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAR E MONITORAR TRATAMENTO DE DE- SORDENS ASSOCIADAS À IL-13".
Referência Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados Este pedido de patente reivindica a prioridade sobre o U.S. Ap-
plication Serial N0 60/874.333, arquivado em 11 de dezembro de 2006, e U.S. Application Serial N0 60/925.932, arquivado em 23 de abril de 2007, os conteúdos de ambos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Listagem de Seqüências
Uma cópia da Listagem de Seqüências em forma eletrônica e em papel está sendo submetida em anexo. Antecedente
lnterleucina-13 (IL-13) é uma citocina secretada por linfócitos T e mastócitos (McKenzie et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:3735-39; Bost et al. (1996) Immunology 87:663-41). IL-13 compartilha várias ativida- des biológicas com IL-4. Por exemplo, IL-4 ou IL-13 podem causar substitui- ção do isotipo da IgE em células B (Tomkinson et al. (2001) J. Immunol. 166:5792-5800). Adicionalmente, níveis aumentados do CD23 de superfície celular e do CD23 sérico(sCD23) foram relatados em pacientes asmáticos (Sanchez-Guererro et al. (1994) Allergy 49:587-92; DiLorenzo et al. (1999) Allergy Asthma Proc. 20:119-25). Além disso, IL-4 ou IL-13 podem regular para cima a expressão de MHC de classe Il e do receptor IgE de baixa afini- dade (CD23) em células B e monócitos, que resulta em apresentação de antígeno aumentada e função de macrófago regulada (Tomkinson et al., su- pra). Com importância, IL-4 ou IL-13 podem aumentar a expressão de VCAM-1 em células endoteliais, que facilita o recrutamento preferencial de eusinófilos (e células T) para tecidos das vias aéreas (Tomkinson et al., su- pra). IL-4 ou IL-13 também podem aumentar a secreção de muco das vias aéreas, que pode exacerbar a responsividade das vias aéreas (Tomkinson et al., supra). Estas observações sugerem que embora IL-13 não seja necessá- ria para, ou até capaz de, induzir o desenvolvimento de Th2, IL-13 possa ser um participante-chave no desenvolvimento da eusinofilia das vias aéreas e AHR (Tomkinson etal., supra; Wills-Karp et al. (1998) Science 282:2258-61). Sumário
Métodos e composições para tratar e/ou monitoração do trata- mento de desordens ou condições associadas à IL-13 são revelados. Em um aspecto, os Requerentes descobriram que uma administração única de um antagonista de IL-13 ou um antagonista de IL-4 a um indivíduo, antes do iní- cio de uma desordem ou condição associada à IL-13, reduz um ou mais sin- tomas da desordem ou condição, em relação a um indivíduo não tratado. A redução acentuada dos sintomas da desordem ou condição é detectada a- pós a coadministração do antagonista de IL-13 com o antagonista de IL-4, em relação à redução detectada após a administração do agente isolado. Dessa forma, métodos para redução ou inibição, ou prevenção ou retardo do início de, um ou mais sintomas de uma desordem ou condição associada à IL-13 usando um antagonista de IL-13 isolado ou em combinação com um antagonista de IL-4 são revelados. Em outras modalidades, métodos para avaliar a eficácia de um antagonista de IL-13 em tratamento ou prevenção de uma desordem ou condição associada à IL-13 em um indivíduo, por e- xemplo, um indivíduo humano, também são revelados. Consequentemente, em um aspecto, a invenção caracteriza um
método de tratamento ou prevenção de uma desordem ou condição associ- ada à IL-13 em um indivíduo. O método inclui administração de um antago- nista de IL-13 e/ou um antagonista de IL-4 ao indivíduo, em uma quantidade eficaz para reduzir um ou mais sintomas da desordem ou condição (por e- xemplo, em uma quantidade eficaz para reduzir um ou mais de: níveis de IgE, liberação de histamina, níveis de eotaxina, ou um sintoma respiratório no indivíduo). No caso de uso profilático (por exemplo, para prevenção, re- dução ou retardamento do início ou recorrência de um ou mais sintomas da desordem ou condição), o indivíduo pode ou não ter um ou mais sintomas da desordem ou condição. Por exemplo, o antagonista de IL-13 e/ou antagonis- ta de IL-4 podem ser administrados antes de qualquer manifestação detec- tável dos sintomas, ou após pelo menos alguns, mas não todos os sintomas serem detectados. No caso de uso terapêutico, o tratamento pode melhorar, curar, manter, ou reduzir a duração da desordem ou condição no indivíduo. Em usos terapêuticos, o indivíduo pode ter uma manifestação parcial ou total dos sintomas. Em um caso típico, o tratamento melhora a desordem ou a condição do indivíduo até um ponto detectável por um médico, ou previne a piora da desordem ou condição.
Em uma modalidade, o antagonista de IL-13 e/ou o antagonista de IL-4 é administrado em um tratamento de intervalo único, por exemplo, como uma dose única, ou como uma dose repetida de não mais do que duas ou três doses durante um tratamento de intervalo único, por exemplo, a dose repetida é administrada dentro de uma semana ou menos a partir da dose inicial. Por exemplo, o antagonista de IL-13 e/ou o antagonista de IL-4 pode ser administrado em um tratamento de intervalo único antes do início ou re- corrência de um ou mais sintomas associados com a desordem ou condição de IL-13, mas antes de manifestações totais dos sintomas associados com a desordem ou condição. Em certas modalidades, o antagonista de IL-13 e/ou o antagonista de IL-4 é administrado ao indivíduo antes da exposição a um agente que provoca ou exacerba uma desordem ou condição associada à IL-13, por exemplo, um alergênio, um poluente, um agente tóxico, uma in- fecção e/ou estresse. Em algumas modalidades, o antagonista de IL-13 e/ou o antagonista de IL-4 é administrado antes de, durante, ou logo após a ex- posição ao agente que provoca e/ou exacerba a desordem ou condição as- sociada à IL-13. Por exemplo, o antagonista de IL-13 e/ou o antagonista de IL-4 pode ser administrado 1, 5, 10, 25 ou 24 horas; 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou 30 dias; ou 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas, ou bem antes ou após exposição ao agente iniciador ou exacerbante. Tipicamente, o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser administrado em qualquer período entre 24 horas e 2 dias antes ou após exposição ao agente iniciador ou exacerbante. Naquelas mo- dalidades onde a administração ocorre após exposição ao agente, o indiví- duo pode não experimentar sintomas ou pode experimentar uma manifesta- ção parcial dos sintomas. Por exemplo, o indivíduo pode ter sintomas de uma etapa inicial da desordem ou condição. Cada dose pode ser adminis- trada por inalação ou por injeção, por exemplo, subcutaneamente, em uma quantidade de aproximadamente 0,5 a 10 mg/kg (por exemplo, aproximada- mente 0,7 a 5 mg/kg, 0,9 a 4 mg/kg, 1 a 3 mg/kg, 1,5 a 2,5 mg/kg, 2 mg/kg).
O antagonista de IL-13 e/ou antagonista de IL-4 pode ser admi- nistrado a um indivíduo tendo, ou em risco de ter, uma desordem ou condi- ção associada à IL-13. Tipicamente, o indivíduo é um mamífero, por exem- plo, um humano (por exemplo, uma criança, um adolescente ou um adulto) sofrendo de ou em risco de ter uma desordem ou condição associada à IL- 13. Exemplos de desordens ou condições associadas à IL-13 incluem, mas não são limitadas a, desordens escolhidas entre uma ou mais de: desordens relacionadas à IgE, incluindo mas não limitadas a, desordens atópicas, por exemplo, resultante de uma sensibilidade aumentada à IL-13 ou IL-4 (por exemplo, dermatite atópica, urticária, eczema, e condições alérgicas, tais como rinite alérgica e enterogastrite alérgica); desordens respiratórias, por exemplo, asma (por exemplo, asma alérgica e não-alérgica (por exemplo, asma devido à infecção com, por exemplo, vírus sincicial respiratório (RSV), por exemplo, em crianças mais jovens)), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), e outras condições que envolvem inflamação das vias aéreas, eu- sinofilia, fibrose e produção excessiva de muco, por exemplo, fibrose cística e fibrose pulmonar; ou desordens e/ou condições inflamatórias autoimunes, por exemplo, desordens ou condições inflamatórias da pele (por exemplo, dermatite atópica), desordens ou condições gastrintestinais (por exemplo, doenças intestinais inflamatórias (Dll), colite ulcerativa e/ou doença de Crohn), desordens ou condições hepáticas (por exemplo, cirrose, carcinoma hepatocelular), e escleroderma; tumores ou cânceres (por exemplo, tumores de tecido mole ou sólido), tais como leucemia, glioblastoma, e linfoma, por exemplo, o linfoma de Hodgkin; infecções virais (por exemplo, por HTLV-1); fibrose de outros órgãos, por exemplo, fibrose do fígado (por exemplo, fibro- se causada por um vírus de hepatite B e/ou C); e supressão da expressão de respostas imunes protetoras do tipo 1, (por exemplo, durante a vacina- ção).
Por exemplo, o indivíduo pode ser um humano alérgico a um alergênio sazonal, por exemplo, plantas do gênero Ambrosia, ou um pacien- te asmático após exposição ao vírus do frio ou gripe ou durante a estação fria ou de gripe. Antes do início dos sintomas (por exemplo, sintomas alérgi- cos ou asmáticos, ou antes de ou durante uma alergia, ou estação fria ou de gripe), um intervalo de dose única do antagonista anti-IL-13 e/ou antagonista de IL-4 pode ser administrado ao indivíduo, tal que os sintomas são reduzi- dos e/ou o início da desordem ou condição é retardado. Semelhantemente, a administração do antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser efetuada antes da manifestação de um ou mais sintomas (por exemplo, antes de manifesta- ções totais dos sintomas) associados com a desordem ou condição quando tratarem condições crônicas que são caracterizadas por surtos ou episódios recorrentes da desordem ou condição. Um método exemplar para tratamen- to da rinite alérgica ou outras desordens alérgicas pode incluir a terapia de iniciação com um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 antes da exposição a um alergênio, por exemplo, antes da exposição sazonal a um alergênio, por e- xemplo, antes de flores alergênicas. Tal terapia pode incluir um tratamento de intervalo único, por exemplo, uma dose única, do antagonista de IL-13 e/ou de IL-4. Em outras modalidades, o tratamento de intervalo único de IL- 13 e/ou o antagonista de IL-4 é administrado em combinação com a imuno- terapia de alergia. Por exemplo, o tratamento de intervalo único do antago- nista de IL-13 e/ou de IL-4 é administrado em combinação com uma imuni- zação para alergia, por exemplo, uma vacina que contém um ou mais aler- gênios, tais como plantas do gênero Ambrosia (ragweed), ácaros na poeira, e gramíneas. O tratamento de intervalo único pode ser repetido até que um nível desejável da imunidade seja obtido no indivíduo.
Em outras modalidades, o antagonista de IL-13 e/ou o antago- nista de IL-4 é administrado em uma quantidade eficaz para redução ou ini- bição, ou prevenção ou retardamento do início de, um ou mais dos sintomas da desordem ou condição associada à IL-13. Por exemplo, o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser administrado em uma quantidade que reduz um ou mais de: (i) os níveis de IL-13 no indivíduo; (ii) os níveis de eotaxina no indivíduo; (iii) os níveis de histamina liberada por basófilos (por exemplo, basófilos sangüíneos); (iv) os títulos de IgE no indivíduo; e/ou (v) uma ou mais modificações nos sintomas respiratórios do indivíduo (por exemplo, respiração com dificuldade, chiado, tosse, respiração curta e/ou dificuldade de executar atividades diárias normais).
Em outras modalidades, o antagonista de IL-13 e/ou o antago-
nista de IL-4 inibe ou reduz uma ou mais atividades biológicas de IL-13 ou IL-4, ou um receptor de IL-13 (por exemplo, um receptor de IL-13 ou um receptor de IL-13 l2) ou um receptor de IL-4 (por exemplo, um receptor de IL-4 α ou um receptor associado a subunidade do mesmo, por exemplo, ca- deia γ). Atividades biológicas exemplares que podem ser reduzidas usando os antagonistas de IL-13 ou IL-4 revelados neste pedido incluem, mas não são limitados a, um ou mais de: indução de expressão de CD23; produção de IgE por células B humanas; fosforilação de um fator de transcrição, por exemplo, proteína STAT (por exemplo, proteína STAT6); eusinofilia induzida pelo antígeno in vivo: broncoconstrição induzida pelo antígeno in vivo\ e/ou hiperreatividade das vias aéreas induzida pela droga in vivo. O antagonismo usando um antagonista de IL-13/IL-13R ou IL-4/IL-4R não necessariamente indica uma eliminação total da atividade biológica do polipeptídeo IL-13/IL- 13R e/ou polipeptídeo IL-4/IL-4R. Para fins de clareza, o termo "antagonista de IL-13" ou "antago-
nista de IL-4,"como usado neste pedido, coletivamente se refere a um com- posto, tal como uma proteína (por exemplo, um polipeptídeo multi-cadeia, um polipeptídeo), um peptídeo, molécula pequena, ou ácido nucleico inibidor que reduz, inibe ou de outra maneira bloqueia uma ou mais atividades bioló- gicas de IL-13 e um IL-13R, ou IL-4 e uma IL-4R, respectivamente. Em uma modalidade, o antagonista de IL-13 interage com, por exemplo, se liga a, um polipeptídeo IL-13 ou IL-13R (também mencionado neste pedido como "um agente de ligação antagonístico à IL-13". Por exemplo, o antagonista de IL- 13 pode interagir com, por exemplo, pode se ligar a, IL-13 ou receptor de IL- 13, preferencialmente, mamífero, por exemplo, IL-13 humana ou IL-13R (também individualmente mencionado neste pedido como um "antagonista de IL-13" e "antagonista de IL-13R", respectivamente), e reduz ou inibe uma ou mais atividades biológicas associadas à IL-13 e/ou IL-13R. Em outra mo- dalidade, o antagonista de IL-4 interage com, por exemplo, se liga a, um po- lipeptídeo IL-4 ou uma IL-4R (por exemplo, mamífero, por exemplo, IL-4 hu- mana ou IL-4R (também individualmente mencionado neste pedido como um "antagonista de IL-4" e "antagonista de IL-4R," respectivamente)), e reduz ou inibe uma ou mais atividades de IL-4 e/ou IL-4R. Antagonistas se ligam a IL- 13 ou IL-4, ou IL-13R ou IL-4R com a alta afinidade, por exemplo, com uma afinidade constante de pelo menos aproximadamente 107 M"1, preferencial- mente aproximadamente 108 M"1, e mais preferencialmente, aproximada- mente 109 M"1 a 1010 M"1 ou mais forte. É notado que o termo "antagonista de IL-13" ou "antagonista de IL-4" incluem agentes que inibem ou reduzem uma ou mais das atividades biológicas reveladas neste pedido, mas pode não se ligar a IL-13 ou IL-4 diretamente.
Os termos "agente de ligação anti-IL13"e "agente de ligação à IL-13" são usados intercambiavelmente neste pedido. Estes termos como usados neste pedido referem-se a qualquer composto, tal como uma proteí- na (por exemplo, um polipeptídeo multi-cadeia, um polipeptídeo) ou um pep- tídeo, que inclui uma interface que se liga a uma proteína IL-13, por exem- plo, uma IL-13 de mamífero, particularmente, uma IL-13 humana. O agente de ligação geralmente se liga com um Kd de menos de 5 χ 10"7 Μ. Um agen- te de ligação exemplar de IL-13 é uma proteína que inclui um sítio de ligação ao antígeno, por exemplo, uma molécula de anticorpo. O agente de ligação anti-IL13 ou agente de ligação à IL-13 pode ser um antagonista de IL-13 que se liga à IL13, ou também pode incluir agentes de ligação à IL-13 que sim- plesmente se ligam à IL-13, mas não provocar uma atividade, ou podem de fato ser agonistas de uma atividade IL-13. Por exemplo, certos agentes de ligação à IL-13, por exemplo, moléculas de anticorpo anti-IL-13, que se ligam e inibem uma ou mais atividades biológicas de IL-13, por exemplo, anticor- pos 13.2, MJ2-7 e C65, também são mencionados neste pedido como agen- tes de ligação antagonísticos à IL-13. Exemplos de antagonistas de IL-13 que não são agentes de ligação à IL-13 como definidos neste pedido inclu- em, por exemplo, inibidores a montante ou a jusante da sinalização de IL-13 (por exemplo, inibidores de STAT6).
Modalidades adicionais podem incluir uma ou mais das seguin- tes características:
Em algumas modalidades, o antagonista de IL-13 ou o antago- nista de IL4 podem ser uma molécula de anticorpo que se liga a IL-13 ou um IL-13R, ou IL-4 ou uma IL-4R. O antagonista de IL-13 ou IL-4 também po- dem ser uma forma solúvel do IL-13R (por exemplo, IL-13Ra2 ou IL-13Ra1 solúveis) ou o IL-4R (por exemplo, IL-4Ra), sozinho ou fusionado a outra porção (por exemplo, uma região Fc da imunoglobulina) ou como um hete- rodímero de subunidades (por exemplo, um heterodímero solúvel IL-13R-IL- 4R ou um heterodímero comum IL-4r-Y solúvel). Em outras modalidades, o antagonista é uma muteína de citocina (por exemplo, uma muteína de IL-13 ou IL-4 que se liga ao receptor correspondente, mas não ativa substancial- mente o receptor), ou uma citocina conjugada a uma toxina. Em outras mo- dalidades, o antagonista de IL-13 ou IL-4 é uma pequena molécula inibidora, por exemplo, uma pequena molécula inibidora de STAT6, ou um inibidor de peptídeo. Ainda em outras modalidades, o antagonista de IL-13 ou IL-4 é um inibidor da expressão de ácido nucleico. Por exemplo, o antagonista é um RNA antissenso ou siRNA que bloqueia ou reduz a expressão de um gene IL-13 ou IL-13R, ou IL-4 ou IL-4R.
Em uma modalidade, o antagonista de IL-13 ou agente de liga- ção (por exemplo, a molécula de anticorpo, receptor solúvel, muteína de ci- tocina, ou inibidor de peptídeo) se ligam a IL-13 ou um IL13R e inibem ou reduzem uma interação (por exemplo, ligação) entre IL-13 e um receptor de IL-13, por exemplo, IL-13Ra1, IL-13Ra2, e/ou IL-4Ra, por meio disso redu- zindo ou inibindo a transdução de sinal. Por exemplo, o antagonista de IL-13 pode se ligar a um ou mais componentes de um complexo escolhido a partir de, por exemplo, IL-13 e IL-13Ra1 ('IL-13/IL-13aR1"); IL-13 e IL-4Ra ("IL- 13/IL-4Ra"); IL-13, IL-13Ra1, e IL-4Ra ("IL-13/IL-13Ra1/IL-4Ra"); e IL-13 e IL-13Ra2 ("IL-13/IL13Ra2"). Em modalidades, o antagonista de IL-13 se liga a IL-13 ou um IL-13R e interfere com (por exemplo, inibe, bloqueia ou reduz de outra maneira) uma interação, por exemplo, ligação, entre IL-13 e um complexo de receptor de IL-13, por exemplo, um complexo que compreende IL-13Ra1 e IL-4Ra. Em outras modalidades, o antagonista de IL-13 se liga a IL-13 e interfere com (por exemplo, inibe, bloqueia ou reduz de outra manei- ra) uma interação, por exemplo, ligação, entre IL-13 e uma subunidade do complexo de receptor de IL-13, por exemplo, IL-13Ra1 ou IL-4Ra, individu- almente. Ainda em outra modalidade, o antagonista de IL-13, por exemplo, o anticorpo anti-IL-13 ou fragmento do mesmo, se liga a IL-13, e interfere com (por exemplo, inibe, bloqueia ou reduz de outra maneira) uma interação, por exemplo, ligação, entre IL-13/IL-13Ra1 e IL-4Ra. Em outra modalidade, o antagonista de IL-13, se liga a IL-13 e interfere com (por exemplo, inibe, blo- queia ou reduz de outra maneira) uma interação, por exemplo, ligação, entre IL-13/IL-4Ra e IL-13Ra1. Tipicamente, o antagonista de IL-13 interfere com (por exemplo, inibe, bloqueia ou reduz de outra maneira) uma interação, por exemplo, ligação, de IL-13/IL-13Ra1 com IL-4Ra. Anticorpos exemplares inibem ou previnem a formação do complexo ternário, IL-13/IL-13Ra1/IL- 4Ra.
Em outra modalidade, o antagonista de IL-4 (por exemplo, a mo- lécula de anticorpo, receptor solúvel, muteína de citocina, ou inibidor de pep- tídeo) se liga à IL-4 ou a um IL4R, e inibe ou reduz uma interação (por e- xemplo, ligação) entre IL-4 e um receptor de IL-4, por exemplo, IL-4Ra e/ou γ comum), por meio disso reduzindo ou inibindo a transdução de sinal. Por exemplo, o antagonista de IL-4 pode se ligar a um ou mais componentes de um complexo escolhido a partir de, por exemplo, IL-4 e IL-4Rl ("IL-4/IL- 4Ra"), IL-4 e γ comum ("IL-4/YComum"), ou IL-4, IL-4Ra, e γ comum ("IL-4/IL- 4R^/ γ comum"). Em modalidades exemplares, o antagonista de IL-4 se liga a IL-4 e interfere com (por exemplo, inibe, bloqueia ou reduz de outra manei- ra) uma interação, por exemplo, ligação, entre IL-4 e uma subunidade do complexo de receptor de IL-4, por exemplo, IL-4Ra ou γ comum, individual- mente. Ainda em outra modalidade, o antagonista de IL-4, se liga a IL-4, e interfere com (por exemplo, inibe, bloqueia ou reduz de outra maneira) uma interação, por exemplo, ligação, entre IL-4/IL-4Ra e γ comum.
Em uma modalidade, o antagonista de IL-13/IL-13R ou IL-4/IL- 4R ou agente de ligação é uma molécula de anticorpo (por exemplo, um an- ticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga a IL- 13/IL-13R ou IL-4/IL-4R. Por exemplo, a molécula de anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal de tamanho total ou especificidade única que se liga a IL-13 ou IL-4, ou um receptor de IL-13 ou um receptor de IL-4 (por exemplo, uma molécula de anticorpo que inclui pelo menos uma, e tipicamente duas, cadeias pesadas completas, e pelo menos uma, e tipicamente duas, cadeias leves completas); ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um monômero ou dímero do domínio variável da cadeia pesada ou leve (por exemplo, Vh, VHh), um Fab, F(ab')2, Fv, ou fragmento Fv de cadeia única). Tipicamente, a molécula de anticorpo é um anticorpo humano, came- lídeo, de tubarão, humanizado, quimérico, ou gerado in vitro para IL-13 ou IL-4 humanas, ou um receptor de IL-13 ou receptor de IL-4 humanos. Em certas modalidades, a molécula de anticorpo inclui uma região constante da cadeia pesada escolhida a partir de, por exemplo, regiões constantes da ca- deia pesada de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgAI, lgA2, IgD, e IgE; particu- larmente, escolhida a partir de, por exemplo, regiões constantes da cadeia pesada de IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4, particularmente, regiões constantes da cadeia pesada de IgGI (por exemplo, IgGI humana ou forma modificada da mesma). Em outra modalidade, a molécula de anticorpo tem uma região constante da cadeia leve escolhida a partir de, por exemplo, as regiões constantes da cadeia leve do kappa ou lambda, preferencialmente kappa (por exemplo, kappa humana). Em uma modalidade, a região constante é alterada, por exemplo, mutada, para modificar as propriedades da molécula de anticorpo (por exemplo, para aumentar ou reduzir uma ou mais de: liga- ção de receptor de Fc, glicosilação de anticorpo, o número de resíduos de cisteína, função celular efetora, ou função do complemento). Por exemplo, a região constante da IgGI humana pode ser mutada em um ou mais resí- duos, por exemplo, um ou mais resíduos 234 e 237, como descrito no E- xemplo 5, para reduzir um ou mais de: ligação de receptor de Fc, glicosila- ção de anticorpo, o número de resíduos de cisteína, função celular efetora, ou função de complemento. Em modalidades, a molécula de anticorpo inclui a região constante da IgGI humana mutada em um ou mais resíduos de SEQ ID NO: 193, por exemplo, mutadas nas posições 116 e 119 de SEQ ID NO:193.
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo inibidora ou neutralizadora. Por exemplo, a molécula de anti- corpo anti-IL13 pode ter uma atividade funcional comparável a IL-13Ra2 (por exemplo, a molécula de anticorpo anti-IL13 reduz ou inibe a interação de IL- 13 com IL-13Ra1). A molécula de anticorpo anti-IL13 pode prevenir a forma- ção de um complexo entre IL-13 e IL-13Ra1, ou interromper ou desestabili- zar um complexo entre IL-13 e IL-13Ra1. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL13 inibe a formação de complexo ternário, por exemplo, formação de um complexo entre IL 13, IL-13Ra1 e IL4-R. Em uma modali- dade, a molécula de anticorpo confere uma efeito protetor pós-injeção contra a exposição a um antígeno, por exemplo, um antígeno Ascaris em um mode- Io de ovelha, pelo menos 6 semanas após a injeção. Em outras modalida- des, a molécula de anticorpo anti-IL13 pode inibir uma ou mais atividades biológicas associadas à IL-13 com uma IC5o de aproximadamente 50 nM a 5 pM, tipicamente aproximadamente 100 a 250 pM ou menos, por exemplo, inibição melhor. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL13 po- de associar-se com IL-13, com cinética na faixa de 103 a 108 M"1s"1, tipica- mente 104 a 107 M"1 s"1. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti- IL13 se liga a IL-13 humana com um kon entre 5x104 e 8x105 M"V1. Ainda em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL13 tem cinética de dis- sociação na faixa de 10~2 a 10"6 s"1, tipicamente 10"2 a 10"5 s"1. Em uma mo- dalidade, a molécula de anticorpo anti-IL13 se liga à IL-13, por exemplo, IL- 13 humana, com uma afinidade e/ou cinética similar (por exemplo, com um fator 20, 10, ou 5) ao anticorpo monoclonal 13.2, MJ 2-7 ou C65, ou formas modificadas dos mesmos, por exemplo, formas quiméricas ou formas huma- nizadas do mesmo. A afinidade e a cinética de ligação de agente de ligação à IL-13 podem ser testadas usando, por exemplo, tecnologia de biossensor (BIACORE™).
Ainda em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL13 se liga especificamente a um epítopo, por exemplo, um epítopo linear ou con- formacional, de IL-13, por exemplo, de mamífero, por exemplo, IL-13 huma- na. Por exemplo, a molécula de anticorpo se liga a pelo menos um aminoá- cido em um epítopo definido pela ligação do IL-13Ra1 à IL-13 humana ou um epítopo definido pela ligação do IL-13Ra2 à IL-13 humana, ou um epíto- po que se sobrepõe com tais epítopos. A molécula de anticorpo anti-IL13 pode competir com IL-13Ra1 e/ou IL-13Ra2 para ligação à IL-13, por exem- plo, à IL-13 humana. A molécula de anticorpo anti-IL13 pode inibir competiti- vamente a ligação de IL-13Ra1 e/ou IL-13Ra2 a IL-13. A molécula de anti- corpo anti-IL 13 pode interagir com um epítopo em IL-13 que, quando ligado, evita estericamente a interação com IL-13Ra1 e/ou IL-13Ra2. Em modalida- des, a molécula de anticorpo anti-IL13 se liga especificamente à IL-13 hu- mana e inibe competitivamente a ligação de um segundo anticorpo à dita IL- 13 humana, em que o dito segundo anticorpo é escolhido a partir de 13.2, MJ 2-7 e/ou C65 (ou qualquer outro anticorpo anti-IL13 revelado neste pedi- do) para ligação à IL-13, por exemplo, à IL-13 humana. A molécula de anti- corpo anti-IL13 pode inibir competitivamente a ligação de 13.2, MJ 2-7 e/ou C65 à IL-13. A molécula de anticorpo anti-IL13 pode se Iigarespecificamente a pelo menos um aminoácido em um epítopo definido por ligação de 13.2, MJ 2-7 à IL-13 humana ou um epítopo definido pela ligação de C65 à IL-13 humana. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL13 pode se ligar a um epítopo que se sobrepõe com os de 13.2, MJ 2-7 ou C65, por e- xemplo, incluem pelo menos um, dois, três, ou quatro aminoácidos em co- mum, ou um epítopo que, quando ligado, evita estericamente a interação com 13.2, MJ 2-7 ou C65. Por exemplo, a molécula de anticorpo pode se conectar com um ou mais resíduos de IL-13 escolhidos a partir de um ou mais dos resíduos 81 a 93 e/ou 114 a 132 da IL-13 humana (SEQ ID NO: 194), ou escolhidos a partir de um ou mais de: Glutamato na posição 68 [49], Asparagina na posição 72 [53], Glicina na posição 88 [69], Prolina na posi- ção 91 [72], Histidina na posição 92 [73], Lisina na posição 93 [74], e/ou Ar- ginina na posição 105 [86] de SEQ ID NO: 194 [posição na seqüência madu- ra; SEQ ID NO: 195], Em outras modalidades, a molécula de anticorpo se conecta com um ou mais resíduos de aminoácidos de IL-13 escolhidos a partir de um ou mais de resíduos 116, 117, 118, 122, 123, 124, 125, 126, 127, e/ou 128 de SEQ ID NO:24 ou SEQ ID NO:178. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo se liga a IL-13 independente da presença de polimor- fismo na posição 130 na SEQ ID NO:24.
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo inclui uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seis CDR's de mAb13.2, MJ2-7, C65, ou ou- tros anticorpos revelados neste pedido, ou CDRs estreitamente relaciona- das, por exemplo, CDRs que são idênticas ou que têm pelo menos uma alte- ração de aminoácido, mas não mais de duas, três ou quatro alterações (por exemplo, substituições (por exemplo, substituições conservativas), deleções, ou inserções). Opcionalmente, a molécula de anticorpo pode incluir qualquer CDR descrita neste pedido. Em modalidades, o domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina compreende uma CDR3 da cadeia pesada que difere por menos de 3 substituições de aminoácido de uma CDR3 da cadeia pesada do anticorpo monoclonal MJ2-7 (SEQ ID NO: 17), mAb 13.2 (SEQ ID NO:196) ou C65 (SEQ ID NO:123). Em outras modalidades, o domínio vari- ável da cadeia leve da imunoglobulina compreende uma CDR1 da cadeia leve que difere por menos de 3 substituições de aminoácidos de uma CDR da cadeia leve correspondente do anticorpo monoclonal MJ2-7 (SEQ ID NO: 18), mAb 13.2 (SEQ ID NO: 197) ou C65 (SEQ ID NO:118). A seqüência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada de MJ2-7 tem a seqüên- cia de aminoácidos mostrada como SEQ ID N0.130. A seqüência de amino- ácidos do domínio variável da cadeia leve de MJ2-7 tem a seqüência de a- minoácidos mostrada como SEQ ID NO:133. A seqüência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal 13.2 tem a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 198. A seqüência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal 13.2 tem a seqüência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 199. Em certas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada da
molécula de anticorpo inclui uma ou mais de:
G-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H (SEQ ID NO:48), em CDR1, (WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-G (SEQ ID NO:49), em CDR2, e/ou
SEENWYDFFDY (SEQ ID NO: 17), em CDR3; ou GFNIKDTYIH (SEQ ID NO: 15), em CDR1, RIDPANDNIKYDPKFQG (SEQ ID NO: 16), em CDR2, e/ou
SEENWYDFFDY (SEQ ID NO: 17), em CDR3 Em outras modalidades, o domínio variável da cadeia leve da molécula de anticorpo inclui uma ou mais de:
(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L- (EDNQYAS)(SEQ ID NO:25), em CDR1,
K-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-S (SEQ ID NO:27), em CDR2, e/ou Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-I-P (SEQ ID NO:28), em CDR3; ou RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 18), em CDR1 KVSNRFS (SEQ ID NO: 19), em CDR2, e FQGSHIPYT (SEQ ID N0:20), em CDR3.
Em outras modalidades, a molécula de anticorpo inclui uma ou mais CDRs incluindo uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo composto da seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:197, SEQ ID N0.200, SEQ ID N0:201, SEQ ID N0.202, SEQ ID N0:203, e SEQ ID NO: 196.
Ainda em outra modalidade, a molécula de anticorpo inclui pelo menos uma, duas, ou três alças hipervariáveis de Chothia de uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo escolhido a partir de, por exem- plo, mAb13.2, MJ2-7, C65, ou qualquer outro anticorpo revelado neste pedi- do, ou pelo menos particularmente os aminoácidos daquelas alças hipervari- áveis que contactam IL-13. Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou frag- mento do mesmo inclui pelo menos uma, duas, ou três alças hipervariáveis de uma região variável da cadeia leve de um anticorpo escolhido a partir de, por exemplo, mAb13.2, MJ2-7, C65, ou outros anticorpos revelados neste pedido, ou pelo menos inclui aminoácidos daquelas alças hipervariáveis que contactam IL-13. Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo inclui pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis alças hiper- variáveis das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo es- colhido a partir de, por exemplo, mAb13.2, MJ2-7, C65, ou outros anticorpos revelados neste pedido.
Em uma modalidade, a proteína inclui todas as seis alças hiper- variáveis de mAb13.2, MJ2-7, C65, ou outros anticorpos revelados neste pedido ou alças hipervariáveis estreitamente relacionadas, por exemplo, al- ças hipervariáveis que são idênticas ou que têm pelo menos uma alteração de aminoácido, mas não mais de duas, três ou quatro alterações, das se- qüências reveladas neste pedido. Opcionalmente, a proteína pode incluir qualquer alça hipervariável descrita neste pedido.
Ainda em outro exemplo, a proteína inclui pelo menos uma, du- as, ou três alças hipervariáveis que têm as mesmas estruturas canônicas que a alça hipervariável correspondente de mAb13.2, MJ2-7, C65, ou outros anticorpos revelados neste pedido, por exemplo, as mesmas estruturas ca- nônicas que pelo menos a alça 1 e/ou alça 2 dos domínios variáveis da ca- deia pesada e/ou leve de mAb13.2, MJ2-7, C65, ou outros anticorpos reve- lados neste pedido. Ver, por exemplo, Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798 para descri- ções de estruturas canônicas de alça hipervariável. Estas estruturas podem ser determinadas pela inspeção das tabelas descritas nestas referências.
Em uma modalidade, a região conservada da cadeia pesada da molécula de anticorpo (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica à região conservada da cadeia pesada de uma das seguintes seqüências do segmento V de linhagem germinativa: DP- 25, DP-1, DP-12, DP-9, DP-7, DP-31, DP-32, DP-33, DP-58, ou DP-54, ou outro gene V que é compatível com a estrutura canônica de classe 1-3 (ver, por exemplo, Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798). Outras regiões conservadas compatíveis com a estrutura canônica de classe 1-3 incluem regiões conservadas com um ou mais dos seguintes resíduos de acordo com a numeração Kabat: Ala, Gly1 Thr, ou Val na posição 26; Gly na posição 26; Tyr, Phe, ou Gly na posi- ção 27; Phe, Val1 lie, ou Leu na posição 29; Met1 lie, Leu, Vai, Thr, Trp, ou Ile na posição 34; Arg1 Thr, Ala, Lys na posição 94; Gly, Ser, Asn, ou Asp na posição 54; e Arg na posição 71.
Em uma modalidade, a região conservada da cadeia leve da mo-
lécula de anticorpo (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior idêntica à região conservada da cadeia leve de um sub- grupo V_ Il da seqüência de linhagem germinativa ou uma das seguintes seqüências do segmento V de linhagem germinativa: A17, A1, A18, A2, A19/A3, ou A23 ou outro gene V que é compatível com a estrutura canônica de classe 4-1 (ver, por exemplo, Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628). Outras regiões conservadas compatíveis com a estrutura canônica de classe 4-1 incluem regiões conservadas com um ou mais dos seguintes resíduos de acordo com a numeração Kabat: Val ou Leu ou Ile na posição 2; Ser ou Pro na posição 25; Ile ou Leu na posição 29; Gly na posição 31 d; Phe ou Leu na posição 33; e Phe na posição 71.
Em outra modalidade, a região conservada da cadeia leve da molécula de anticorpo (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica à região conservada da cadeia leve de um subgrupo V^ I da seqüência de linhagem germinativa, por exemplo, uma seqüência DPK9.
Em outra modalidade, a região conservada da cadeia pesada da molécula de anticorpo (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica à região conservada da cadeia leve de um subgrupo VH I da seqüência de linhagem germinativa, por exemplo, uma seqüência DP-25 ou um subgrupo VH Ill da seqüência de linhagem germina- tiva, por exemplo, uma seqüência DP-54.
Em certas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina da molécula de anticorpo inclui uma seqüência de aminoáci- dos codificada por uma seqüência nucleotídica que hibridiza sob condições de alta estringência ao complemento da seqüência nucleotídica que codifica um domínio variável da cadeia pesada de V2.1 (SEQ ID NO:71), V2.3 (SEQ ID NO:73), V2.4 (SEQ ID NO:74), V2.5 (SEQ ID NO:75), V2.6 (SEQ ID NO:76), V2.7 (SEQ ID NO:77), V2.11 (SEQ ID N0:80), ch13.2 (SEQ ID N0:204), h13.2v1 (SEQ ID N0:205), h13.2v2 (SEQ ID N0:206) ou h13.2v3 (SEQ ID N0:207); ou inclui uma seqüência de aminoácidos que é pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica à seqüência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada de V2.1 (SEQ ID NO:71), V2.3 (SEQ ID NO:73), V2.4 (SEQ ID NO:74), V2.5 (SEQ ID NO:75), V2.6 (SEQ ID NO:76), V2.7 (SEQ ID NO:77), V2.11 (SEQ ID N0:80); chl3.2 (SEQ ID N0:208), hl3.2vl (SEQ ID N0:209), hl3.2v2 (SEQ ID N0:210) ou hl3.2v3 (SEQ ID NO:211). Em modalidades, o domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina inclui a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0:80, que pode por sua vez incluir, além disso, uma região conservada 4 (FR4) do domínio variável da cadeia pesada que inclui a seqüência de ami- noácidos de SEQ ID NO:116ouSEQ ID NO:117.
Em outras modalidades, o domínio variável da cadeia leve da imunoglobulina da molécula de anticorpo inclui uma seqüência de aminoáci- dos codificada por uma seqüência nucleotídica que hibridiza sob condições de alta estringência ao complemento da seqüência nucleotídica que codifica um domínio variável de cadeia leve de V2.11 (SEQ ID NO:36) ou h13.2v2 (SEQ ID NO:212); ou inclui uma seqüência de aminoácidos que é pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica a um domínio variável da cadeia leve de V2.11 (SEQ ID NO:36) ou h13.2v2 (SEQ ID NO:212). Em modalidades, o domínio variável da cadeia leve da imunoglo- bulina inclui a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:36, que pode incluir por sua vez, além disso, uma região conservada 4 (FR4) de domínio variável da cadeia leve que inclui a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:47. Ainda em outra modalidade, a molécula de anticorpo inclui uma região conservada da seqüência de domínio variável da cadeia pesada compreendendo:
(i) em uma posição correspondente a 49, Gly;
(ii) em uma posição correspondente a 72, Ala;
(iii) em posições correspondentes a 48, lie, e a 49, Gly;
(iv) em posições correspondentes a 48, lie, a 49, Gly, e a 72,
(v) em posições correspondentes a 67, Lys, a 68, Ala, e a 72,
(vi) em posições correspondentes a 48, lie, a 49, Gly, a 72, Ala,
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL13 inclui pelo menos uma cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:177 (ou uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica à SEQ ID NO:177) e pelo menos uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 176 (ou uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica à SEQ ID NO:176).
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-ll_13 inclui duas cadeias de imunoglobulina: uma cadeia leve que inclui SEQ ID NO:199, 213, 214, 212, ou 215 e uma cadeia pesada que inclui SEQ ID NO:198, 208, 209, 210, ou 211 (ou uma seqüência de aminoácidos pelo me- nos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica a SEQ ID NO:199, 213, 214, 212, ou 215, ou SEQ ID NO:198, 208, 209, 210, ou 211). A molécula de anticorpo pode incluir, além disso, na cadeia pesada a se- qüência de aminoácidos de SEQ ID NO:193 e na cadeia leve a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:216 (ou uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica a SEQ ID NO:193 ou SEQ ID NO:216).
Exemplos adicionais de moléculas de anticorpo anti-IL13 são
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Ala; Ala; e/ou a 79, Ala. revelados em US 07/0128192 ou WO 05/007699 e em Blanchard, C. et al. (2005) Clinicai and Experimental Allergy 35(8): 1096-1103 revelando CAT- 354; WO 05/062967, WO 05/062972 e Clinicai Trials Gov. Identifier: NCT00441818 revelando TNX-650; Clinicai Trials Gov. Identifier: NCT532233 revelando QAX-576; US 06/0140948 ou WO 06/055638, arqui- vado em nome de Abgenix; US 6.468.528 propriedade de AMGEN; WO 05/091856 denominando Centocor, Inc. como o requerente; e em Yang et al. (2004) Cytokine 28(6):224-32 e Yang et al. (2005) J Pharmacol Exp Ther 313(1 ):8-15; e anticorpos anti-IL13 como revelado em WO 07/080174 arqui- vado em nome da Glaxo, e como revelado em WO 07/045477 em nome da Novartis.
Exemplos adicionais de antagonistas de IL-13 ou IL-4 incluem, mas não são limitados a, moléculas de anticorpo contra IL-4 (por exemplo, pascolizumabe e anticorpos relacionados revelados em Hart, T.K. et al. (2002) Clin Exp Immunol. 130(1):93-100; Steinke, J. W. (2004) Immunol. Al- Iergy Clin North Am 24(4):599-614; e em Ramanthan et al. US 6.358.509), IL-4Ra (por exemplo, AMG-317 e anticorpos anti-IL4R relacionados revela- dos em US 05/0118176, US 05/0112694 e em Clinicai Trials Gov. Identifier: NCT00436670); IL-13Ra1 (por exemplo, anticorpos anti-13Ra1 revelado em WO 03/080675 que denomina AMRAD como requerente); e moléculas de anticorpo mono- ou bi-específico que se ligam a IL4 e/ou IL-13 (revelado, por exemplo, em WO 07/085815).
Em outras modalidades, o antagonista de IL-13 ou IL-4 é uma muteína de IL-13 ou IL-4 (por exemplo, uma forma truncada ou variante de citocina que se liga a um IL-13R ou um receptor IL-4, mas não aumenta sig- nificativamente a atividade do receptor), ou uma toxina conjugada a uma citocina. Muteínas de IL-4 são reveladas por Weinzel et al. (2007) Lancet 370:1422-31. Exemplos adicionais de peptídeos de inibição de IL-13/IL-4 são revelados em Andrews, A.L. et al. (2006) J. Allergy and Clin Immunol 118:858-865. Um exemplo de uma citocina conjugada a toxina é revelado em WO 03/047632, em Kunwar, S. et al. (2007) J. Clin Oncoi 25(7):837-44 e em Husain, S. R. et al. (2003) J. Neurooncol 65(1):37-48. Ainda em outras modalidades, o antagonista de IL13 ou o anta- gonista de IL-4 é um polipeptídeo de tamanho total ou um fragmento ou for- ma modificada de um receptor de IL-13 (por exemplo, IL-13Ra2 ou IL13Ra1) ou um polipeptídeo de receptor de IL-4 (por exemplo, IL-4Ra). Por exemplo, o antagonista pode ser uma forma solúvel de um receptor de IL-13 ou um receptor de IL-14 (por exemplo, uma forma solúvel de mamífero (por exem- plo, humano) de IL-13Ra2, IL13Ra1 ou IL-4Ra compreendendo um domínio de ligação a citocina; por exemplo, uma forma solúvel de um domínio extra- celular de mamífero (por exemplo, humano) de IL-13Ra2, IL13Ra1 ou IL- 4Ra). Antagonistas de receptor exemplares incluem, por exemplo, fusões de ligação IL-4R-IL-13R como descrito em WO 05/085284 e Economides, A.N. etal. (2003) Nat Med 9(1):47-52, bem como em Borish, L.C. et al. (1999) Am J Respir Crit Care Med 160(6): 1816-23.
Uma forma solúvel de um receptor de IL-13 ou receptor de IL-4, ou uma muteína de IL-13 ou de IL-4 pode ser usada sozinha ou ligada fun- cionalmente (por exemplo, pela lligação química, genética ou fusão polipep- tídica, associação não-covalente ou de outra maneira) a uma segunda por- ção para facilitar expressão, flexibilidade estérica, detecção e/ou isolamento ou purificação, por exemplo, um domínio Fc da imunoglobulina, albumina sérica, pegilação, uma GST, Lex-A ou uma seqüência polipeptídica MBP. As proteínas de fusão podem incluir adicionalmente uma seqüência Iigadora que junta a primeira porção à segunda porção. Por exemplo, um receptor de IL-13 ou receptor de IL-4 solúveis, ou uma muteína de IL-13 ou IL-4 podem ser fusionadas a uma região constante da cadeia pesada de vários isotipos, incluindo: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgAI, lgA2, IgD, e IgE). Tipicamente, a proteína de fusão pode incluir o domínio extracelular de um receptor de IL- 13 ou receptor de IL-4 solúveis humanos, ou uma muteína de IL-13 ou de IL- 4 (ou uma seqüência homóloga a estas), e, por exemplo, fusionado a, uma cadeia Fc da imunoglobulina humana, por exemplo, IgG humana (por exem- pio, IgGI humana ou lgG2 humana, ou uma forma mutada das mesmas). A seqüência Fc pode ser mutada em um ou mais aminoácidos para reduzir a função celular efetora, ligação ao receptor de Fc e/ou atividade de comple- mento.
Será entendido que as moléculas de anticorpo e proteínas de fusão ou solúveis descritas neste pedido podem ser ligadas funcionalmente (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não-covalente ou de outra maneira) a uma ou outras entidades moleculares, tais como um anticorpo (por exemplo, um anticorpo bispecífico ou um multiespecífico), to- xinas, radioisótopos, agentes citotóxicos ou citostáticos.
Em outra modalidade, o antagonista de IL-13 ou IL-4 inibe a ex- pressão de ácido nucleico que codifica uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R. Exemplos de tais antagonistas incluem moléculas de ácidos nuclei- cos, por exemplo, moléculas antissenso, ribozimas, RNAi, siRNA, moléculas de tripla hélice que hibridizam em um ácido nucleico que codifica uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R, ou uma região reguladora de transcrição, e bloqueia ou reduz a expressão de mRNA de IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R. ISIS-369645 fornece um exemplo de um ácido nucleico antissenso que inibe a expressão de IL-4Ra (desenvolvido por ISIS Pharmaceuticals e revelado em, por exemplo, Karras, J.G. et al. (2007) Am J Respir Cell Mol Biol. 36(3):276-86). RNAs de interferência curta exemplares (siRNAs) que interferem no RNA que codifica IL-4 ou IL-13 são revelados em WO 07/131274.
Ainda em outra modalidade, o antagonista de IL-13 ou IL-4 é um inibidor, por exemplo, uma pequena molécula inibidora, da sinalização de IL- 13 a montante ou a jusante (por exemplo, inibidores de STAT6). Exemplos de inibidores de STAT6 são revelados em WO 04/002964, em Canadian Pa- tent Application: CA 2490888 e em Nagashima, S. et al. (2007) Bioorg Med Chem 15(2): 1044-55; e em US 6.207.391 e WO 01/083517.
Em outra modalidade, um ou mais antagonistas de IL-13 são administrados em combinação com um ou mais antagonistas de IL-4. A te- rapia de combinação pode incluir o antagonista de IL-13 formulado com e/ou administrado com o antagonista de IL-4. O antagonista de IL-13 e o antago- nista de IL-4 podem ser administrados simultaneamente, ou seqüencialmen- te. Se administrados seqüencialmente, um médico pode selecionar uma se- quência apropriada para administração do antagonista de IL-13 em combi- nação com o antagonista de IL-4. A terapia de combinação também pode incluir outros agentes terapêuticos escolhidos a partir de um ou mais de: es- teróides inalados; beta-agonistas, por exemplo, beta-agonistas de curta ou longa duração; antagonistas de Ieucotrienos ou receptores de leucotrieno; drogas de combinação, tais como ADVAIR®; inibidores de IgE1 por exemplo, anticorpos de anti-IgE (por exemplo, XOLAIR®); inibidores de fosfodiesterase (por exemplo, inibidores de PDE4); xantinas; drogas anticolinérgicas; agen- tes estabilizadores de mastócitos, tais como cromolina; inibidores de IL-5; inibidores de eotaxina/CCR3; e anti-histamínicos. Tais combinações podem ser usadas para tratar asma e outras desordens respiratórias. Exemplos adi- cionais de agentes terapêuticos que podem ser coadministrados e/ou cofor- mulados com um agente de ligação à IL-13 incluem um ou mais de: antago- nistas de TNF (por exemplo, um fragmento solúvel de um receptor de TNF, por exemplo, receptor TNF humano p55 ou p75 ou derivados do mesmo, por exemplo, IgG para TNFR de 75 kd (proteína de fusão de IgG ao receptor de TNF 75 kD, ENBREL )); antagonistas de enzima de TNF, por exemplo, inibi- dores da enzima de conversão de TNFa (TACE); antagonistas de receptor muscarínico; antagonistas de TGF-β; interferon gama; perfenidona; agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, leflunomida, ou um sirolimus (ra- pamicina) ou um análogo dos mesmos, por exemplo, CCI-779; inibidores de COX2 e cPLA2; AINEs; imunomoduladores; inibidores de p38, TPL-2, inibi- dores de Mk-2 e NFentre outros. Em outro aspecto, o pedido fornece um método de avaliação da eficácia de um agente de ligação antagonístico a IL- 13, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL13 como descrita neste pedido, no tratamento da (por exemplo, redução) inflamação pulmonar em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano ou não-humano.
Ainda em outra modalidade, os métodos revelados neste pedido, além disso, incluem as etapa(s) de: avaliação de (por exemplo, detecção) uma modificação em um
ou mais dos seguintes parâmetros em um indivíduo após administração do antagonista de IL-13 e/ou antagonistas de IL-4: (i) detecção dos níveis de IL- 13 não-ligada e/ou ligada a um agente de ligação à IL13 em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica (por exemplo, soro, plasma, sangue) como descrito nos métodos de detecção in vitro neste pedido; (ii) medida dos níveis de eotaxina em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológi- ca (por exemplo, soro, plasma, sangue); (iii) detecção de liberação de hista- mina por basófilos; (iv) detecção de títulos de IgE; e/ou (v) avaliação das modificações nos sintomas do indivíduo (por exemplo, respiração com difi- culdade, chiado, tosse, respiração curta e/ou dificuldades para executar ati- vidades diárias normais). Em modalidades, a detecção dos parâmetros (i) a (v) pode ser realizada antes e/ou após administração do agente de ligação antagonístico à IL-13 (após administrações únicas ou múltiplas) ao indivíduo (por exemplo, em intervalos selecionados após início da terapia). A detecção e/ou avaliação das modificações em um ou mais de (i) a (v) podem ser reali- zadas pelo um clínico ou pessoal de suporte. Uma modificação, por exem- pio, uma redução, em um ou mais de (i) a (v) relativos a um nível pre- determinado (por exemplo, comparando antes e após tratamento) indica que o agente de ligação antagonístico à IL-13 está reduzindo efetivamente a in- flamação pulmonar nos indivíduos. Em modalidades, o indivíduo é um paci- ente humano, por exemplo, um adulto ou uma criança. Em outro aspecto, a invenção fornece composições, por exem-
plo, composições farmacêuticas, ou formulações de dose que incluem um veículo farmaceuticamente aceitável e pelo menos um agente de ligação antagonístico à IL-13, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL-13, formulada com um antagonista de IL-4. Combinações dos antagonistas su- pracitados e outra droga, por exemplo, um agente terapêutico (por exemplo, um ou mais inibidores de citocina e de fator de crescimento, imunossupres- sores, agentes anti-inflamatórios (por exemplo, agentes sistêmicos anti- inflamatórios), inibidores metabólicos, inibidores enzimáticos, e/ou agentes citotóxicos ou citostáticos, como descritos neste pedido, também podem ser usados.
Ainda em outro aspecto, a invenção caracteriza um conjunto que inclui um antagonista de IL-13 e/ou um antagonista de IL-4 para uso nos mé- todos revelados neste pedido com instruções para administração do antago- nista como um tratamento de intervalo único para tratar ou prevenir uma de- sordem ou condição associada à IL-13 (por exemplo, uma desordem ou condição como descritas neste pedido).
Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma composição que
inclui um antagonista de IL-13 e/ou um antagonista de IL-4 para uso nos mé- todos revelados neste pedido.
Ainda em outro aspecto, a invenção caracteriza o uso de uma composição que inclui um antagonista de IL-13 e/ou antagonista de IL-4 na produção de um medicamento para tratar ou prevenir uma desordem ou condição associada à IL-13 (por exemplo, uma desordem ou condição como descritas neste pedido).
Em outro aspecto, este pedido de patente fornece um método para detecção da presença de IL-13 em uma amostra in vitro (por exemplo, uma amostra biológica, tal como soro, plasma, tecido, biópsia). O método experimental pode ser usado para diagnosticar uma desordem, por exemplo, uma desordem associada à IL-13, ou monitorar a eficácia de um tratamento. O método inclui: (i) contatar a amostra com um agente de ligação à IL-13, por exemplo, um primeiro agente de ligação à IL-13 ou molécula de anticor- po anti-IL13 como descrito neste pedido; e (ii) detecção da formação de um complexo entre o primeiro agente de ligação de IL-13 e IL-13 (por exemplo, substancialmente livre de IL-13 e/ou IL-13 ligada a um segundo agente de ligação à anti-IL-13 ou molécula de anticorpo), na amostra. Uma modificação estatisticamente significante no nível de IL-13 ligada ao primeiro agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo na amostra em relação a um va- lor de referência ou amostra (por exemplo, uma amostra controle) é indicati- va da presença da IL-13 na amostra.
Em certas modalidades, o primeiro agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo é imobilizada em um suporte (por exemplo, um suporte sólido, tal como uma placa de ELISA, contas ("beads")).
Em outras modalidades, o método, além disso, inclui a obtenção de uma amostra de um indivíduo antes e/ou após exposição do indivíduo a um segundo agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo. A amos- tra pode conter IL-13 substancialmente livre e/ou IL-13 ligada ao segundo agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo. A amostra entre é colocada em contato e imobilizada com o primeiro agente de ligação anti-IL- 13 ou molécula de anticorpo, sob condições que permitem a ligação da IL-13 ao primeiro agente de ligação anti-IL-13 imobilizado ou molécula de anticor- po a ocorrer.
Em modalidades, a etapa de detecção inclui detecção da pre- sença de IL-13 (por exemplo, IL-13 substancialmente livre e/ou IL-13 ligada a um segundo agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo) ligada ao primeiro agente de ligação anti-IL-13 imobilizado ou molécula de anticor- po, por exemplo, usando um terceiro agente de ligação anti-IL-13 marcado ou molécula de anticorpo, ou um agente marcado que reconhece o primeiro complexo de IL-13 ou segundo agente de ligação ou molécula de anticorpo. A marcação pode ser diretamente ou indiretamente anexada ao agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo, por exemplo, fluorescência, ra- dioatividade, biotina-avidina, como descrito neste pedido. Por exemplo, o agente de ligação anti-IL13 ou molécula de anticorpo é diretamente ou indi- retamente marcado com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. Substâncias detectáveis adequadas inclu- em várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais Iuminescentes e materiais radioativos.
Em uma modalidade, o primeiro agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo se liga a IL-13 substancialmente livre, e não se liga substancialmente a IL-13 ligada a um segundo agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo. Em outras modalidades, o primeiro agente de li- gação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo se liga a IL-13 substancialmente livre e IL-13 ligada a um segundo agente de ligação anti-IL-13 ou molécula de anticorpo.
Em outra modalidade, o primeiro, segundo, e/ou terceiro agentes
de ligação anti-IL-13 ou moléculas de anticorpo se ligam a epítopos diferen- tes em IL-13. Por exemplo, a primeira molécula de anticorpo anti-IL-13 é um mAb13.2 ou uma versão humanizada do mesmo (revelado neste pedido e em US 06/0063228), ou um agente de ligação à IL-13 capaz de competir com mAb13.2 para ligação à IL-13; a segunda molécula de anticorpo anti-IL- 13 é um MJ2-7 ou uma versão humanizada do mesmo; e/ou a terceira molé- cuia de anticorpo anti-IL-13 é um anticorpo C65 ou versão humanizada do mesmo (revelado neste pedido e em US 06/0073148) (ou um agente de liga- ção à IL-13 capaz de competir com mJ2-7 ou C65 para ligação à IL-13). Qualquer ordem das moléculas de anticorpo anti-IL13 pode ser usada nos métodos de detecção. Em modalidade, o complexo de IL-13 ligado ao segundo agente
de ligação à IL-13, que é imobilizado ao primeiro agente de ligação à IL-3, é detectado pelo contato do complexo imobilizado com um agente de ligação à Fc (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-Fc), por meio disso deter- minando a quantidade de IL-13 ligada ao segundo agente de ligação à IL-13 em uma amostra.
Em modalidades, um aumento no nível de IL-13 na amostra (por exemplo, uma amostra biológica, tal como soro, plasma, tecido, biópsia) do indivíduo em relação a um nível pré-determinado é indicativo da inflamação aumentada no pulmão. Ainda em outro aspecto, a invenção fornece um método para
detecção da presença de IL-13 in vivo (por exemplo, por diagnóstico por i- magem in vivo em um indivíduo). O método experimental pode ser usado para diagnosticar uma desordem, por exemplo, uma desordem associada à IL-13, ou para medir a eficácia de um tratamento. O método inclui: (i) admi- nistração de um primeiro agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma pri- meira molécula de anticorpo anti-IL-13 como descrito neste pedido, a um indivíduo sob condições que permitem a ligação do primeiro agente de liga- ção à IL-13 a IL-13 ocorrer; e (ii) detecção de IL-13 in vivo (por exemplo, de- tectando a formação de um complexo entre IL-13 e o primeiro agente de Ii- gação à IL-13) usando um segundo agente de ligação à IL-13 detectável marcado, em que uma modificação estatisticamente significante no nível de IL-13 no indivíduo em relação ao indivíduo controle é indicativa da presença de IL-13. Em modalidades, um aumento no nível de IL-13 no indivíduo em relação a um nível pré-determinado é indicativo da inflamação aumentada no pulmão.
Em uma modalidade, o agente de ligação à IL-13 e o antagonis- ta de IL-13 se ligam a IL-13 substancialmente livre e/ou IL-13 ligada a um segundo agente de ligação à IL-13. Em uma modalidade, o antagonista de IL-13 e o agente de ligação à IL-13 reconhecem epítopos diferentes em IL- 13. Por exemplo, o antagonista de IL-13 pode ser um mAb13.2 ou uma ver- são humanizada do mesmo (revelado neste pedido e em US 06/0063228), ou um antagonista de IL-13 capaz de competir com mAb13.2 para ligação a IL-13; o agente de ligação à IL-13 é um MJ2-7 ou uma versão humanizada do mesmo; ou o agente de ligação é um anticorpo C65 ou uma versão hu- manizada do mesmo (revelado neste pedido e em US 06/0073148) (ou um agente de ligação à IL-13 capaz de competir com mJ2-7 ou C65 para ligação a IL-13). Qualquer arranjo de antagonista anti-IL13 ou agentes de ligação pode ser usada nos métodos de detecção.
Em outro aspecto, o pedido de patente fornece um método de avaliação da eficácia de um agente de ligação antagonístico à IL-13, por e- xemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL13 como descrito neste pedido, no tratamento (por exemplo, redução) da inflamação pulmonar em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano ou não-humano. O método inclui:
administração de um antagonista de IL-13 e/ou antagonista de IL-4 ao indivíduo;
detecção de uma modificação em um ou mais dos seguintes pa- 25 râmetros; (i) detecção dos níveis de IL-13 não-ligada e/ou ligada a um agen- te de ligação à IL13 em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica (por exemplo, soro, plasma, sangue) como descrito nos métodos de detec- ção in vitro neste pedido, em que uma modificação nos níveis de IL-13 não- ligada e/ou ligada em relação a um valor de referência (por exemplo, uma 30 amostra controle) é indicativo da eficácia do agente.
Em modalidades, o método, além disso, inclui: (i) medida dos níveis de eotaxina em uma amostra, por exemplo, uma amostra biológica (por exemplo, soro, plasma, sangue); (ii) detecção de liberação de histamina, por exemplo, por basófilos; (iii) detecção de títulos de IgE; e/ou (iv) avaliação das modificação nos sintomas do indivíduo (por exemplo, respiração com dificuldade, chiado, tosse, respiração curta e/ou dificuldades para executar atividades diárias normais). A detecção de parâmetros (i) a (v) pode ser rea- lizada antes e/ou após administração do agente de ligação antagonístico à IL-13 (após administrações únicas ou múltiplas) ao indivíduo (por exemplo, em intervalos selecionados após início da terapia). A avaliação e/ou detec- ção das modificações em um ou mais de (i) a (v) podem ser realizadas por um clínico ou pessoal de suporte. Uma modificação, por exemplo, uma redu- ção, em um ou mais de (i) a (v) em relação a um nível pré-determinado (por exemplo, comparando antes e após tratamento) indica que o agente de liga- ção antagonístico à IL-13 está reduzindo efetivamente a inflamação pulmo- nar nos indivíduos. Em modalidades, o indivíduo é um paciente humano, por exemplo, um adulto ou uma criança.
Em modalidades, a eficácia de um agente de ligação à IL-13 (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL13 como descrita) na neutraliza- ção de uma ou mais atividades associadas à IL-13 in vivo pode ser avaliada em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo não-humano, tal como ovelha, 20 roedor, primata não-humano (por exemplo, um macaco cinomolgus natural- mente alérgico a um antígeno, por exemplo, Ascaris suum). Por exemplo, a eficácia de agentes de ligação à IL-13 pode ser avaliada medindo em maca- cos cinomolgus naturalmente alérgicos a Ascaris suum, antes e após desafio com o antígeno de Ascaris na presença ou ausência do agente de ligação à 25 IL-13, um ou mais dos seguintes: (i) detecção de células inflamatórias (por exemplo, eusinófilos, macrófagos, neutrófilos) nas vias aéreas; (ii) medida dos níveis de eotaxina; (iii) detecção de liberação de histamina de basófilo específico para antígeno (por exemplo, específico para Asearis); e/ou (iv) detecção de títulos de IgE específica para o antígeno (por exemplo, específi- 30 co para Asearis). Uma modificação, por exemplo, uma redução, no nível de um ou mais de (i) a (iv) em relação a um nível pré-determinado (por exem- plo, comparação antes e após tratamento) indica que o agente de ligação à IL-13 está reduzindo efetivamente a eusinofilia das vias aéreas nos indiví- duos.
Métodos de diagnosticar uma desordem associada à IL-13 u- sando um agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma molécula de anticor- po anti-IL13 como descrito neste pedido também são revelados.
Como usado neste pedido, os artigos "um", "uma", "uns" e "u- mas", se referem a um ou a mais de um (por exemplo, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo.
O termo "ou" é usado neste pedido para significar, e é usado intercambiavelmente com o termo "e/ou", a menos que o contexto claramen- te indique de outra maneira.
Os termos "proteínas" e "polipeptídeos" são usados intercambia- velmente neste pedido.
"Aproximadamente"e "próximo a" significará geralmente que um grau aceitável de erro para a quantidade medida dada a natureza ou preci- são das medidas. Graus exemplares de erro estão dentro de 20 porcento (%), tipicamente, dentro de 10%, e mais tipicamente, dentro de 5% de um dado valor ou faixa de valores.
Os conteúdos de todas as publicações, pedidos de patentes pendentes, pedidos de patentes publicados (incluindo US 06/0073148 e US 06/0063228), e patentes publicadas citadas em todas as partes são neste pedido incorporados por referência em sua totalidade.
Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir do relatório descritivo e desenhos, e das reivindicações.
Breve Descrição Dos Desenhos
A figura 1A é um alinhamento das SEQ NO: 178 e SEQ ID NO:24 completas de IL-13 humana e de macaco cinomolgus, respectiva- mente. Diferenças de aminoácidos são indicadas pelos resíduos com mar- cações sombreadas ("shaded boxed"). A localização da substituição de R 30 para Q (que corresponde ao polimorfismo detectado em pacientes alérgicos) está marcada na posição 130. A localização do sítio de clivagem é mostrada pela flecha. A figura 1B é uma lista de peptídeos exemplares da IL-13 de macaco cinomolgus, (SEQ ID NOS: 179 a 188, respectivamente).
A figura 2 é um gráfico que representa a neutralização da ativi- dade de IL-13 em NHP por vários agentes de ligação à IL-13, como medido pela porcentagem de monócitos CD23+ (eixo y). Concentrações de MJ2-7 (Δ), C65 (♦), e slL-13Ra2-Fc (·) são indicadas no eixo x.
A figura 3 é um gráfico que representa a neutralização da ativi- dade de IL-13 em NHP por MJ2-7 (murino;·) ou MJ2-7 humanizado v2.11 (o). Atividade de IL-13 em NHP foi medida pela fosforilação da STAT6 (eixo y) como uma função da concentração de anticorpo (eixo x).
A figura 4 é um gráfico que representa a neutralização de ativi- dade de IL-13 em NHP por MJ2-7 v2.11 (o) ou slL-13Ra2-Fc (□). Atividade de IL-13 em NHP foi medida pela fosforilação da STAT6 (eixo y) como uma função da concentração de antagonista (eixo x).
A figura 5 é um gráfico que representa a neutralização de ativi-
dade de IL-13 em NHP por MJ2-7 (Δ), C65 (♦), ou slL-13Ra2-Fc (·). Ativida- de de IL-13 em NHP foi medida pela fosforilação da STAT6 (eixo y) como uma função da concentração de antagonista (eixo x).
A figura 6 A é um gráfico que representa a indução da produção de tenascina (eixo y) pela IL-13 nativa humana (eixo x).
A figura 6B é um gráfico que representa a neutralização da ativi- dade de IL-13 em NHP por MJ2-7, como medido pela inibição da indução da produção de tenascina (eixo y) como uma função da concentração de anti- corpo (eixo x).
A figura 7 é um gráfico que representa a ligação dos anticorpos
MJ2-7 ou controle a IL-13 de NHP ligada a slL-13Ra2-Fc ligada a um chip de SPR.
A figura 8 é um gráfico que representa a ligação de concentra- ções variadas (0,09 a 600 nM) de IL-13 de NHP ao anticorpo hMJ2-7 V2-11 capturado.
A figura 9 é um gráfico que representa a neutralização da ativi- dade de IL-13 em NHP por anticorpos MJ2-7 de camundongo (·) ou Versão 1 (o), Versão 2 (♦), ou Versão 3 (Δ) humanizadas. Atividade de IL-13 em NHP foi medida pela fosforilação da STAT6 (eixo y) como uma função da concentração de anticorpo (eixo x).
A figura 10 é um gráfico que representa a neutralização da ativi- 5 dade de IL-13 em NHP por anticorpos incluindo VH e VL de MJ2-7 de ca- mundongo (·), VH de camundongo e VL da Versão 2 humanizada (Δ), ou VH e VL da Versão 2 (♦). Atividade de IL-13 em NHP foi medida pela fosforila- ção da STAT6 (eixo y) como uma função da concentração de anticorpo (eixo x).
As figuras 11A e 11B são gráficos que representam a inibição da
ligação de IL-13 ao receptor de IL-13 imobilizado pelo anticorpo MJ2-7, co- mo medido por ELISA. A ligação é representada como absorvância em 450 nm (eixo y). Concentração do anticorpo MJ2-7 é representada no eixo x. A figura 11A representa a ligação a IL-13Ra1. A figura 11B representa a Iiga- ção a IL-13Ra2.
A figura 12 é um alinhamento da seqüência de aminoácidos de linhagem germinativa DPK18 (SEQ ID NO:126) e a VL da Versão 3 de MJ2- 7 humanizado (SEQ ID N0:190).
A figura 13A é uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:124) de IL-13 humana madura, processada.
A figura 13B mostra uma seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 125) do IL-13Ra1 humano.
A figura 14A a 14D mostram um aumento no número total de células/ml e porcentagem presente de células inflamatórias no fluido BAL pós-desafio com Ascaris em comparação com amostras pré (referência).
As figuras 15A a 15B mostram o total de células/ml em BAL em fluidos de BAL no controle e em macacos cinomolgus tratados com anticorpo pré e pós-desafio com Ascaris. Controle (círculos (o); amostras tratadas com MJ2-7 (triângulos abertos (Δ)) e amostras tratadas com mAb13.2 (triângulos 30 pretos (1)). (As versões humanizadas de MJ2-7 (MJ2-7v.2) e mAb13.2 v2 foram usadas neste estudo).
As figuras 16A a 16B mostram modificações nos níveis de eota- xina no fluido de BAL concentrado coletado a partir de macacos cinomolgus tratados com anticorpo pós-desafio com Ascaris em relação ao controle. A figura 16A representa um gráfico de barras mostrando um aumento nos ní- veis de eotaxina (pg/ml) do desafio pós-Ascaris em relação a uma referên- 5 cia, valores pré-desafio. A figura 16B representa uma redução nos níveis de eotaxina em fluidos de BAL concentrados a partir de macacos cinomolgus tratados com anticorpos mAb13.2- (círculos cinzas) ou MJ2-7-(triângulos cinzas) em comparação a um controle. (As versões humanizadas de MJ2-7 (MJ2-7v.2) e mAb13.2 v2 foram usadas neste estudo).
As figuras 17A a 17B representam as modificações nos títulos
de IgE específica para Asearis em controle e amostras tratadas com anticor- po 8 semanas pós-desafio. A figura 17A representa exemplos representan- tes não mostrando modificação no título de IgE específica para Asearis em um macaco individual tratado com Ig irrelevante (MG; animal 20 a 45; painel 15 superior), e título reduzido de IgE específica para Asearis em um macaco individual tratado com MJ2-7v.2 humanizado (animal 120 a 434; painel infe- rior). A figura 17B representa uma redução nos títulos de IgE específica para Asearis em mAb13.2 ou MJ2-7 (círculos pretos) em relação a macacos ci- nomolgus tratados com Ig irrelevante (IVIG (círculos cinzas)) 8 semanas 20 pós-desafio com Asearis.
As figuras 18A a 18B mostram as modificações na liberação de histamina basofílica específica para Asearis em controle e amostras tratadas com anticorpo 24 horas e 8 semanas pós-desafio. A figura 15A é um gráfico que representa as amostras seguintes em macacos individuais representati- 25 vos tratados com salina (esquerda) ou mAb13.2v.2 humanizado (direita): amostras pré-anticorpo ou desafiadas com Asearis (círculos); 48 horas pós- tratamento com anticorpo, amostras desafiadas 24 horas pós-Asearis (triân- gulos); e amostras desafiadas 8 semanas pós-Asearis (losangos). A figura 18B representa um gráfico de barras mostrando as modificações nos níveis 30 normalizados de histamina pré e 8 semanas pós-desafio com Asearis no controle (preto), em macacos cinomolgus tratados com mAb13.2 humaniza- do-(branco) e MJ2-7v.2 humanizado-(sombreado). A figura 19 representa a correlação entre a liberação de histami- na específica para Asearis e níveis de IgE específica para Asearis no contro- le (círculos abertos) e amostras tratadas com anti-IL13 ou dexametasona (círculos pretos).
5 A figura 20 é uma série de gráficos de barras que representam
as modificações nos níveis séricos de IL-13 em macacos cinomolgus indivi- duais tratados com MJ2-7 humanizado (hMJ2-7v2). A marca em cada painel (por exemplo, 120 a 452) corresponde ao número de identificação do maca- co. A amostra "pré"foi coletada antes da administração do anticorpo. O tem- 10 po TTfoi coletado 24 horas na pós-administração do anticorpo, mas antes do desafio com Asearis. Os pontos de tempo restantes foram pós-desafio com Asearis.
A figura 21 é um gráfico de barras que representa a atividade de fosforilação da STAT6 de IL-13 de primata não-humano em 0, 1, ou 10 15 ng/ml, na ausência do soro ("sem soro"); a presença de soro de animais tra- tados com salina ou IVIG ("controle"); ou na presença de soro de animais tratados com anticorpo anti-IL13, antes da administração do anticorpo ("pré"), ou 1 a 2 semanas pós-administração do anticorpo indicado. O soro foi testado em diluição 1:4. (Versões humanizadas de MJ2-7 (MJ2-7v.2) e 20 mAb 13.2 v2 foram usadas neste estudo).
As figuras 22A a 22C são gráficos lineares mostrando que os níveis de IL-13 em primata não-humano capturado por MJ2-7 humanizado (hMJ2-7v2) no soro de macaco cinomolgus correlaciona-se com o nível de inflamação medida nos fluidos de BAL do pós-desafio com Asearis.
As figuras 23A a 23B são gráficos de linha mostrando função
pulmonar alterada em camundongos em resposta à administração intratra- queal de IL-13 R110Q recombinante humana; a figura 23 mostra as modifi- cações na resistência das vias aéreas (RI) em resposta a doses crescentes de metacolina nebulizada; a figura 23B mostra as modificações na compla- 30 cência pulmonar dinâmica (Cdyn) em resposta a doses crescentes de meta- colina nebulizada.
As figuras 24A a 24B são gráficos de barras mostrando inflama- ção pulmonar aumentada e produção de citocina em camundongos em res- posta à administração intranasal de IL-13 R110Q recombinante humana. Na figura 24A, a porcentagem de eusinófilos e neutrófilos em lavagem broncoal- veolar (BAL) foi determinada por contagens celulares diferenciais. Na figura 5 24B, os níveis de citocinas, MCP-1, TNF-α, e IL-6, na BAL foram determina- dos pelo método citométrico de esferas ordenadas. Os dados são mediana ± s.e.m. de 10 animais por grupo.
As figuras 25A a 25B são gráficos de pontos ("dot plots") mos- trando os níveis de anticorpo MJ2-7-11 humanizado (hMJ2-7v.2-11) na BAL 10 e soro seguintes à administração intratraqueal e intravenosa. Animais foram tratados com IL-13 R110Q recombinante humana, ou um volume equivalente (20 pL) de salina, intratraquealmente nos dias 1, 2, e 3. O anticorpo MJ2- 7v.2-11 humanizado foi administrado no dia 0 e 2 horas antes de cada dose de IL-13 R110Q recombinante humana. A figura 25A representa os resulta- 15 dos quando o anticorpo é administrado intravenosamente no dia 0 e intrape- ritonealmente nos dias 1, 2, e 3; ou intranasalmente nos dias 0, 1, 2, e 3 (mostrado na figura 25B). Os níveis de IgG humana total na BAL e soro fo- ram analisados por ELISA.
As figuras 26A a 26C mostram o efeito do anticorpo MJ2-7v.2-11 20 humanizado após administração intranasal de R110Q recombinante humana na função pulmonar alterada induzida por IL-13. (A) a figura 26A mostra as modificações na resistência pulmonar (RI; cm H20/ml/seg) expresso como modificação a partir da referência. A figura 26B mostra dados expressos co- mo dose de metacolina necessária para provocar resistência pulmonar (RI) 25 correspondente a uma modificação de 2,5 ml H20/cm/seg a partir da refe- rência. Os valores medianos são mostrados para cada grupo de tratamento, os valores p foram calculados pelo teste t de duas caudas. A figura 26C mostra os níveis medianos de IgG humana na BAL e nos soros.
As figuras 27A a 27D mostram as modificações na BAL e no so- ro de níveis de IL-13 R110Q recombinante humana administradas isoladas (figuras 27A a 27B) ou em complexo com anticorpo MJ2-7v.2-11 humaniza- do (figuras 26C a 27D) seguinte à administração intratraqueal de IL-13 R110Q recombinante humana e administração intranasal de anticorpo MJ2- 7v.2-11 humanizado. Os valores medianos são indicados para cada grupo, n.d. é não detectável.
As figuras 28A a 28B são gráficos de pontos mostrando níveis 5 de infiltração eusinofílica (figura 28A) e neutrofílica (figura 28B) na BAL se- guinte à administração intranasal de IL-13 R110Q recombinante humana e administração intranasal de 500, 100, e 20 pg de MJ2-7v.2-11 humanizado e 13.2v.2 humanizado, salina, ou 500 Mg de IVIG. Porcentagens eusinofílica e neutrofílica foram determinadas por contagens celulares diferenciais. Os va- 10 Iores medianos para cada grupo são indicados, os valores p foram determi- nados pelo teste de duas caudas e são indicados para cada grupo tratado com anticorpo quando comparado com IVIG.
As figuras 29A a 29C são gráficos de pontos mostrando modifi- cações nos níveis de citocina, MCP-1, TNF-α, e IL-6, respectivamente, se- 15 guintes à administração intranasal de IL-13 R110Q recombinante humana e administração intranasal de 500 pg de MJ2-7v.2-11 humanizado, 13.2v.2 humanizado, ou IVIG, ou salina. A linha tracejada indica o limite de sensibili- dade do ensaio. Os dados representam valores medianos para cada grupo. O valor de p foi < 0,0001, de acordo com o teste t de duas caudas.
As figuras 30A a 30B são gráficos de pontos mostrando que os
níveis IL-13 R110Q recombinante humana estão diretamente relacionados à inflamação pulmonar, como medido pela eosinofilia; e inversamente propor- cional a níveis na BAL de MJ2-7v.2-11 humanizado seguintes à administra- ção intranasal de IL-13 R110Q recombinante humana e administração intra- 25 nasal de doses de 500, 100, ou 20 pg de anticorpo MJ2-7V.2-11 humaniza- do. Níveis na BAL de anticorpo MJ2-7v.2-11 humanizado foi medido por E- LISA. Níveis na BAL de IL-13 R110Q recombinante humana foram determi- nados por método citométrico de esferas ordenadas. A % de eusinófilo foi determinada pela contagem celular diferencial. Associações são mostradas 30 entre níveis de; (figura 30A) % de inflamação eosinofílica e IL-13 R110Q re- combinante humana, incluindo dados de animais controle com salina, ca- mundongos tratados com IL-13 R110Q recombinante humana isolada, e ca- mundongos tratados com IL-13 R110Q recombinante humana e 500, 100, e pg de anticorpo MJ2-7v.2-11 humanizado ou 500 M9 de IVIG; e (figura 30B) MJ2-7v.2-11 humanizado e IL-6, incluindo dados de camundongos tra- tados com 500, 100, e 20 Mg de MJ2-7V2-11 humanizado, r2 e valores de p foram determinados pela análise de regressão linear.
A figura 31 mostra os esquemas de administração de IL-13Ra2 um dia antes e um dia após o desafio com OVA (Esquema 1), e slL-13Ra2, anti-IL-4 ou ambos um dia antes do desafio com OVA (Esquema 2).
As figuras 32A a 32C mostram a IgE sérica total (figura 32A), IgE específica para OVA (figura 32B), e IgGI específica para OVA (figura 32C) seguinte ao tratamento com slLRa2.Rc um dia antes e após desafio com OVA. A linha tracejada na figura 32B indica o limite de sensibilidade do en- saio, n = 20 camundongos/grupo.
As figuras 33A a 33C mostram a IgE sérica total (figura 33A), IgE específica para OVA (figura 33B), e IgGI específica para OVA (figura 33C) seguinte ao tratamento único com slLRa2.Fc um dia antes de desafio com OVA. A linha tracejada na figura 33B indica o limite de sensibilidade do en- saio, n = 20 camundongos/grupo.
As figuras 34A a 34B mostram a IgE sérica total (figura 34A) e IgE específica para OVA (figura 34B) seguinte ao tratamento único de sIL- 13Ra2.Fc ou tratamento com anti-IL-4 um dia antes do desafio com OVA. A linha tracejada na figura 34B indica o limite de sensibilidade do ensaio, n = camundongos/grupo.
As figuras 35A a 35B mostram a IgGI específica para OVA (figu- ra 35A) e lgG3 específica para OVA (figura 35B) seguinte ao tratamento úni- co um dia antes do desafio com OVA com slL-13Ra2.Fc e anti-IL-4 combi- nadas.
Descrição Detalhada
Métodos e composições para tratar e/ou monitoração do trata- mento de desordens ou condições associadas à IL-13 são revelados. Em um aspecto, os Requerentes descobriram que uma administração única de um antagonista de IL-13 ou um antagonista de IL-4 a um indivíduo, antes do iní- cio de uma desordem ou condição associada à IL-13, reduz um ou mais sin- tomas da desordem ou condição, em relação a um indivíduo não tratado. A redução acentuada dos sintomas da desordem ou condição é detectada a- pós coadministração de um antagonista de IL-13 com um antagonista de IL- 5 4, em relação à redução detectada após administração do agente isolado. Dessa forma, métodos para redução ou inibição, ou impedimento ou retardo do início de, um ou mais sintomas de desordem ou condição associada à IL- 13 usando um antagonista de IL-13, isolado ou em combinação com um an- tagonista de IL-4, são revelados. Em outras modalidades, métodos para ava- 10 liação da eficácia de um antagonista de IL-13, em um indivíduo, por exem- plo, um indivíduo humano ou não-humano, também são revelados.
Definições
Por conveniência, certos termos são definidos neste pedido. De- finições adicionais podem ser encontradas em todas as partes do relatório descritivo.
O termo 'IL-13" inclui a forma não processada de tamanho total das citocinas conhecidas na técnica como IL-13 (independente da espécie de origem, e incluindo mamífero, por exemplo, IL-13 de primata humano e não-humano) bem como formas maduras dos mesmos, processados, bem 20 como qualquer fragmento (de pelo menos 5 aminoácidos) ou variantes de tais citocinas. As posições dentro da seqüência de IL-13 podem ser desig- nadas de acordo com a numeração da seqüência da IL-13 humana de tama- nho total, não processada. Para uma IL-13 exemplar de macaco de tamanho total, ver SEQ ID NO:24; para IL-13 de macaco madura processada, ver 25 SEQ ID NO:14; para IL-13 humana de tamanho total, ver SEQ ID NO:178, e para IL-13 humana madura, processada, ver SEQ ID NO: 124. Uma seqüên- cia exemplar é citada como se segue:
MALLLTTVIALTCLGGFASPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKA PLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSA GQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO:178)
Por exemplo, a posição 130 é um sítio de um polimorfismo co- mum. Seqüências exemplares das proteínas receptoras de IL-13 e formas solúveis das mesmas (por exemplo, IL-13Ra1 e IL-13Ra2 ou fusões das mesmas) são descritas, por exemplo, em Donaldson et al. (1998) J Im- munol. 161:2317-24; US 6.214.559; US 6.248.714; e US 6.268.480.
5 Seqüências exemplares e a caracterização de IL-4, por exemplo,
IL-4 humana, são reveladas em Strober et al. (1988) Pediatr. Res. 24:549; e em Ramanthan etal. US 6.358.509.
Seqüência exemplar das proteínas receptoras de IL-4, formas solúveis e fusões das mesmas são descritas em, por exemplo, em Stahl et 10 al. US 7.083.949; Seipelt, I. etal. (1997) Biochem and Biophys Res Comm 239:534-542; Stahl, N. et al. (1999) FASEB Journal Abstract, 1457; e Hara- da, N. et al. (1990) Proc Natl Aead Sei USA 87:857-861. Uma forma exem- plar do receptor secretada de IL-4 humana é citada como se segue:
MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGNMKVLQEPTCVSDYMSIS TCEWKMNGPTNCSTELRLLYQLVFLLSEAHTCPENNGGAGCVCHLLMDD WSADNYTLDLWAGQQLLWKGSFKPSEHVKPRAPGNLTVHTNVSDTLLLT WSNPYPPDNYLYNHLTYAVNIWSENDPADFRIYNVTYLEPSLRIAASTLKSG ISYRARVRAWAQCYNTTWSEWSPSTKWHNSNIC (SEQ ID NO:224)
A frase "uma atividade biológica de" polipeptídeo IL-13/IL-13R e/ou o polipeptídeo IL-4/IL-4R refere-se a uma ou mais das atividades bioló- gicas do polipeptídeo IL-13 ou IL-4 maduro correspondente, incluindo, mas não limitado a, (1) interação com, por exemplo, ligação a, um polipeptídeo IL-13R ou IL-4R (por exemplo, polipeptídeo IL-13R ou 1L-4R humano); (2) associação com moléculas de transdução de sinal, por exemplo, γ comum; (3) estimulação de fosforilação e/ou ativação de proteínas stat, por exemplo, STAT6; (4) indução da expressão de CD23; (5) produção de IgE por células B humanas; (6) indução de eusinofilia in vivo induzida por antígeno; (7) indu- ção de broncoconstrição in vivo induzida por antígeno; (8) indução de hiper- reatividade das vias aéreas in vivo induzida por droga; (9) indução de níveis de eotoxina in viVo; e/ou (10) indução de liberação de histamina por basófi- los.
Uma "desordem ou condição associada à IL-13" é uma na qual IL-13 contribui para uma patologia ou sintoma da desordem ou condição. Consequentemente, um agente de ligação à IL-13, por exemplo, um agente de ligação à IL-13 que é antagonista de uma ou mais atividades associadas à IL-13, pode ser usado para tratar ou prevenir a desordem.
5 Como usado neste pedido, "uma quantidade terapeuticamente
eficaz" de antagonista de IL-13/IL-13R ou antagonista de IL-4/IL-4 refere-se a uma quantidade de um agente que é eficaz, na administração de dose úni- ca ou múltipla a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, em cura, redução da severidade, melhora, ou prevenção de um ou mais sintomas de 10 uma desordem, ou no prolongamento da sobrevivência do indivíduo, além do esperado na ausência de tal tratamento.
Como usado neste pedido, "uma quantidade profilaticamente eficaz" de um antagonista de IL-13/IL-13R ou um antagonista de IL-4/IL-4R refere-se a uma quantidade de um antagonista de IL-13/IL-13R ou um anta- 15 gonista IL-4/IL-4R que é eficaz, na administração de dose única ou múltipla a um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, na prevenção, redução da severidade, ou retardo da ocorrência do início ou recorrência de uma desor- dem ou condição associada à IL-13, por exemplo, uma desordem ou condi- ção como descritas neste pedido.
Como usado neste pedido "um tratamento de intervalo único"
refere-se a uma quantidade e/ou frequência de administração de um anta- gonista de IL-13/IL-13R e/ou antagonista de IL-4/IL-4R que quando adminis- trado como uma dose única, ou como uma dose repetida de frequência limi- tada reduz a severidade, melhora, evita, ou retarda a ocorrência do início ou 25 recorrência de, um ou mais sintomas de uma desordem ou condição associ- ada à IL-13, por exemplo, uma desordem ou condição como descritas neste pedido. Em modalidades, a frequência da administração é limitada a não mais do que duas ou três doses durante um tratamento de intervalo único, por exemplo, a dose repetida é administrada dentro de uma semana ou me- 30 nos a partir da dose inicial.
O termo 'Isolado" refere-se a uma molécula que é substancial- mente livre de seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína isolada é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas a partir da fon- te celular ou tecidual da qual é derivada. O termo refere-se a preparações onde a proteína isolada é suficientemente pura para ser administrada como uma composição terapêutica, ou pelo menos 70% a 80% (p/p) pura, mais 5 preferencialmente, pelo menos 80% a 90% (p/p) pura, até mais preferenci- almente, 90 a 95% pura; e, ainda mais preferencialmente, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% (p/p) pura. Um composto "separado" refere- se a um composto que é removido de pelo menos 90% de pelo menos um componente de uma amostra a partir da qual o composto foi obtido. Qual- 10 quer composto descrito neste pedido pode ser fornecido como um composto isolado ou separado.
Como usado neste pedido, o termo "hibridiza sob condições de baixa estrigência, média estrigência, alta estrigência, ou de estrigência muito alta"descreve condições de hibridização e lavagem. A orientação para reali- zar reações de hibridização pode ser encontrada em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Métodos aquosos e não-aquosos são descritos naquela referência e podem ser usa- dos. Condições de hibridização específicas mencionadas neste pedido são como se segue: 1) condições de hibridização de baixa estrigência em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguidos por duas lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1% pelo menos a 50°C (a tempera- tura das lavagens pode ser aumentada para 55°C em condições de baixa estrigência); 2) condições de hibridização de média estrigência em 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguidos por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1% a 60°C; 3) condições de hibridização de alta estrigência em 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguidos por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 0,1% a 65°C; e preferencialmente 4) condições de hibridização de estrigência muito alta são fosfato de sódio 0,5 M, SDS 7% a 65°C, segui- dos por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, SDS 1% a 65°C. As condições de estrigência muito alta (4) são as condições preferenciais e as que são usadas a menos que de outra maneira especificado.
Os métodos e composições da presente invenção englobam po- lipeptídeos e ácidos nucleicos que têm as seqüências especificadas, ou se- qüências substancialmente idênticas ou similares a estas, por exemplo, se- qüências pelo menos 85%, 90%, 95% ou maior, idênticas à seqüência espe- cificada. No contexto de uma seqüência de aminoácidos, o termo "substan- 5 cialmente idêntica" é usado neste pedido para referir-se a um primeiro ami- noácido que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de amino- ácido que são i) idêntico a, ou ii) substituições conservativas de resíduos de aminoácido alinhados em uma segunda seqüência de aminoácidos tal que as primeira e segunda seqüências de aminoácido possam ter um domínio 10 estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, seqüências de aminoácido que contêm um domínio estrutural comum que tem pelo me- nos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou de 99% de identidade à seqüência especificada são denominadas substancialmente idênticas.
No contexto da seqüência nucleotídica, o termo "substancial-
mente idêntica" é usado neste pedido para referir-se a uma primeira se- qüência de ácido nucleico que contém um número suficiente ou mínimo de nucleotídeos que são idênticos a nucleotídeos alinhados em uma segunda seqüência de ácido nucleico tal que a primeiras e segunda seqüências nu- 20 cleotídicas codificam um polipeptídeo que tem atividade funcional comum, ou codificam um domínio de polipeptídeo estrutural comum ou uma atividade de polipeptídeo funcional comum. Por exemplo, seqüências nucleotídicas que têm pelo menos aproximadamente 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou de 99% de identidade à seqüência especificada 25 são denominadas substancialmente idênticas.
O termo "variante funcional" refere-se a polipeptídeos que têm uma seqüência de aminoácidos substancialmente idêntica à seqüência que ocorre naturalmente, ou são codificados por uma seqüência nucleotídica substancialmente idêntica, e são capazes de ter uma ou mais atividades da seqüência que ocorre naturalmente.
Cálculos de homologia ou identidade de seqüência entre se- qüências (os termos são usados intercambiavelmente neste pedido) são rea- Iizados como se segue.
Para determinação da porcentagem de identidade de duas se- qüências de aminoácido, ou de duas seqüências de ácidos nucleicos, as seqüências são alinhadas com alvos ótimos de comparação (por exemplo, 5 lacunas ("gaps") podem ser introduzidas em uma ou ambas as seqüências de um primeiro e um segundo aminoácido ou de ácido nucleico para alinha- mento ótimo e seqüências não-homólogas podem ser desconsideradas com objetivos de comparação). Em uma modalidade preferencial, o tamanho de uma seqüência de referência alinhada com objetivos de comparação é pelo 10 menos 30%, preferencialmente pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, 60%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do tamanho da seqüência de referência. Os resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em posições de aminoácidos correspondentes ou posições de nucleotídeos são então comparados. Quando uma posição 15 na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como usado neste pedido, 'Identi- dade" de aminoácido ou ácido nucleico é equivalente a "homologia" de ami- noácido ou ácido nucleico).
A porcentagem de identidade entre as duas seqüências é uma
função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências, permitindo o número de lacunas, e o tamanho de cada lacuna, que precisam ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas seqüências.
A comparação de seqüências e a determinação da porcentagem 25 de identidade entre duas seqüências podem ser realizadas usando um algo- ritmo matemático. Em uma modalidade preferencial, a porcentagem de iden- tidade entre duas seqüências de aminoácidos é determinada usando o algo- ritmo de Needleman and Wunsch ((1970) J. Moi Bioi 48:444-453) que foi incorporado no programa GAP no pacote de programas GCG (disponível em 30 http:// www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um tamanho de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um com- primento de tamanho 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Ainda em outra modalidade prefe- rencial, a porcentagem de identidade entre duas seqüências nucleotídicas é determinada usando o programa GAP no pacote de programas GCG (dispo- nível em http://www.gcg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um tamanho de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um comprimento de tamanho 5 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Um conjunto particularmente preferencial de parâmetros (e aquele que deve ser usado a menos que de outra maneira especificada) são uma matriz de marcação Blossum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4, e uma penalidade de lacuna de mudança de posição de polinucleotídeo ("frameshift") de 5.
A porcentagem de identidade entre duas seqüências de aminoá-
cidos ou de nucleotídeos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que foi incorporado no pro- grama ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de tamanho de resíduo PAM 120, uma penalidade de tamanho de lacuna de 12 e uma penalidade de Ia- cuna de 4.
As seqüências de ácido nucleico e de proteína descritas neste pedido podem ser usadas como "uma seqüência de consulta" para realizar uma busca frente a bancos de dados públicos, por exemplo, para identificar outros membros da família ou seqüências relacionadas. Tais pesquisas po- 20 dem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Buscas de nucleotídeo no BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, ta- manho de seqüência ("wordlength") = 12 para obter seqüências nucleotídi- cas homólogas a moléculas de ácidos nucleicos da invenção. As buscas por 25 proteínas no BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, tamanho de seqüência = 3 para obter seqüências de aminoácidos ho- mólogas a moléculas de proteína da invenção. Para obtenção de alinhamen- tos abertos ("gapped") com objetivo de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 30 25:3389-3402. Quando usados os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. Moléculas de Anticorpo
Exemplos de antagonistas e/ou agentes de ligação à IL-13 ou IL-
4 incluem moléculas de anticorpo. Como usado neste pedido, o termo "mo- lécula de anticorpo" refere-se a uma proteína compreendendo pelo menos uma seqüência de domínio variável de imunoglobulina. O termo molécula de anticorpo inclui, por exemplo, anticorpos de tamanho total, maduros e frag- mentos de ligação ao antígeno de um anticorpo. Por exemplo, uma molécula de anticorpo pode incluir uma seqüência de domínio variável da cadeia pe- sada (H) (abreviado neste pedido como VH), e uma seqüência de domínio variável da cadeia leve (L) (abreviado neste pedido como VL). Em outro e- xemplo, uma molécula de anticorpo inclui uma ou duas seqüências de domí- nio variável da cadeia pesada (H) e/ou uma de duas seqüências de domínio variável da cadeia leve (L). Exemplos de fragmentos de ligação a antígeno incluem: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente composto dos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento biva- Iente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd composto dos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv composto dos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um domínio VH ou VHH; (vi) um fragmento dAb, que consiste de um domínio VH; (vii) um domínio variável de camelídeo ou camelizado; e (viii) uma Fv de cadeia única (scFv).
As regiões VH e VL podem ser, além disso, subdivididas em re- giões da hipervariabilidade, denominada "regiões de determinação de com- plementaridade" (CDR), entremeadas com regiões que são mais conserva- 25 das, denominadas "regiões conservadas" (FR). A extensão da região con- servada e CDRs foi precisamente definida por diversos métodos (ver, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological lnterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health e Human Services, NIH Publication N0 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; e a definição de 30 anticorpo monoclonal ("AbM") usada por Oxford Molecular's AbM antibody modelling software. Ver, em geral, por exemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Em: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann1 R., Springer-Verlag1 Heidel- berg). Geralmente, a menos que especificamente indicado, as seguintes de- finições são usadas: definição de AbM de CDR1 do domínio variável da ca- deia pesada e definições Kabat de outras CDRs. Além disso, modalidades 5 da invenção descrita com respeito a Kabat ou CDRs de AbM também podem ser implementadas usando alças hipervariáveis de Chothia. Cada VH e VL tipicamente inclui três CDRs e quatro FRs, arranjados de amino-terminal a carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Como usado neste pedido, uma "seqüência de domínio variável
da imunoglobulina" refere-se a uma seqüência de aminoácidos que pode formar a estrutura do domínio variável de uma imunoglobulina. Por exemplo, a seqüência pode incluir toda ou parte da seqüência de aminoácidos de um domínio variável que ocorre naturalmente.
Por exemplo, a seqüência pode ou não incluir um, dois, ou mais
aminoácidos N- ou C-terminais, ou pode incluir outras alterações que são compatíveis com a formação da estrutura proteica.
O termo "sítio de ligação ao antígeno" refere-se à parte de um agente de ligação à IL-13 que compreende determinantes que formam uma 20 interface que se liga à IL-13, por exemplo, uma IL-13 de mamífero, por e- xemplo, IL-13 de primata humano ou não-humano, ou um epítopo das mes- mas. Com respeito a proteínas (ou proteína mimétícas), o sítio de ligação ao antígeno inclui tipicamente uma ou mais alças (de pelo menos quatro amí- noácidos ou aminoácidos miméticos) que formam uma interface que se liga 25 à IL-13. Tipicamente, o sítio de ligação ao antígeno de uma molécula de an- ticorpo inclui pelo menos uma ou duas CDRs, ou mais tipicamente pelo me- nos três, quatro, cinco ou seis CDRs.
Um "epítopo" refere-se ao sítio em um composto alvo que está ligado por um agente de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo. Um epítopo pode ser um epítopo linear ou conformacional, ou uma combina- ção dos mesmos. No caso onde o composto alvo é uma proteína, por exem- plo, um epítopo pode referir-se a aminoácidos que estão ligados pelo agente de ligação. Epítopos sobrepostos incluem pelo menos um resíduo de amino- ácido comum.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usados neste pedido referem-se a uma preparação de 5 moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal mostra uma especificidade de ligação e afinidade úni- cas para um epítopo particular. Um anticorpo monoclonal pode ser feito pela tecnologia de hibridoma ou por métodos que não usam a tecnologia de hibri- doma (por exemplo, métodos recombinantes).
Uma proteína "efetivamente humana" é uma proteína que não
evoca uma resposta de anticorpo de neutralização, por exemplo, a resposta de anticorpo anti-murino humano (HAMA). HAMA pode ser problemático em diversas circunstâncias, por exemplo, se a molécula de anticorpo for admi- nistrada repetidamente, por exemplo, no tratamento de uma condição de 15 doença crônica ou recorrente. Uma resposta a HAMA pode fazer a adminis- tração de anticorpo repetida potencialmente ineficaz por causa de uma de- puração de anticorpo aumentada no soro (ver, por exemplo, Saleh et al., Cancer lmmunol. Immunother., 32: 180-190 (1990)) e também por causa de reações alérgicas potenciais (ver, por exemplo, LoBugIio et al., Hybridoma, 20 5:5117-5123 (1986)). Numerosos métodos estão disponíveis para obtenção de moléculas de anticorpo.
Um método exemplar de geração de moléculas de anticorpo in- clui classificação de bibliotecas de expressão proteica, por exemplo, bibliote- cas de exposição de fago ou ribossomo. A exposição de fago é descrita, por 25 exemplo, em Ladner et al, US Patent N0 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809. Além do uso de bibliotecas de exposição, outros métodos podem ser usados para obter uma molécula de anticorpo anti-IL-13. Por exemplo, uma proteína IL-13 ou 30 um peptídeo da mesma podem ser usados como um antígeno em um animal não-humano, por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo, hams- ter, ou rato. Em uma modalidade, o animal não-humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imunoglobulina humana. Por exemplo, é possível projetar linhagens de camundongo deficientes na produção de anticorpo de camundongo com grandes fragmentos nos Ioci da Ig humana. Usando a tec- 5 nologia de hibridoma, anticorpos monoclonais específicos para o antígeno derivados a partir dos genes com a especificidade desejada podem ser pro- duzidos e selecionados. Ver, por exemplo, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, publica- do em 31 de outubro de 1996, e PCT Application N0 PCT/US96/05928, ar- 10 quivado em 29 de abril de 1996.
Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal é obtido a partir do animal não-humano, e então modificado, por exemplo, humanizado ou deimunizado. Winter descreve um método de enxerto de CDR exemplar que pode ser usado para preparar os anticorpos humanizados descritos neste 15 pedido (U.S. Patent N0 5.225.539). Todas as CDRs de um anticorpo humano particular podem ser substituídas com pelo menos uma porção de uma CDR não-humana, ou somente algumas das CDRs podem ser substituídas com CDRs não-humanas. É necessário somente substituir o número de CDRs necessárias para ligação do anticorpo humanizado a um antígeno pré- 20 determinado.
Anticorpos humanizados podem ser gerados através da substitu- ição das seqüências do domínio variável de Fv que não estão diretamente envolvidos na ligação ao antígeno com seqüências equivalentes dos domí- nios variáveis de Fv humanos. Métodos exemplares para geração de molé- 25 cuias de anticorpo humanizado são fornecidos por Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; e por US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; e US 6.407.213. Aqueles métodos incluem isolamento, manipulação, e expressão das se- qüências de ácidos nucleicos que codificam todos ou parte dos domínios 30 variáveis de Fv da imunoglobulina a partir de pelo menos um de uma cadeia pesada ou leve. Tais ácidos nucleicos podem ser obtidos a partir de um hi- bridoma que produz um anticorpo contra um alvo pré-determinado, como descrito acima, bem como de outras fontes. O DNA recombinante que codifi- ca a molécula de anticorpo humanizado então pode ser clonado em um vetor de expressão apropriado.
Uma molécula de anticorpo também pode ser modificada pela deleção específica de epítopos de célula T humana ou "deimunização" pelos métodos revelados em WO 98/52976 e WO 00/34317. Resumidamente, os domínios variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo podem ser ana- lisados para peptídeos que se ligam à MHC de Classe II; estes peptídeos representam epítopos potenciais de célula T (como definido em WO 98/52976 e WO 00/34317). Para a detecção de epítopos potenciais de célula T, uma abordagem de modelagem computacional denominada "enfileira- mento peptídico" ("peptide threading") pode ser aplicada, e, além disso, um banco de dados de peptídeos de ligação à MHC de classe Il humano podem ser buscados por motivos presentes nas seqüências Vh e VL, como descrito em WO 98/52976 e WO 00/34317. Estes motivos se ligam a qualquer um dos 18 principais alótipos de DR de MHC de classe II, e dessa maneira constituem epítopos potenciais de célula T. Os epítopos de célula T potenci- ais detectados podem ser eliminados pela substituição de pequenos núme- ros de resíduos de aminoácido nos domínios variáveis, ou preferencialmen- te, por substituições únicas de aminoácidos. Tipicamente, substituições con- servativas são feitas. Muitas vezes, mas não exclusivamente, aminoácido comum em uma posição em seqüências de anticorpo de linhagem germina- tiva humana pode ser usado.
Seqüências de linhagem germinativa humana, por exemplo, são 25 reveladas em Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et ai (1995) Immunol. Todayvol 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; e Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. O diretório V BASE fornece um diretório abrangente de seqüências de região variável da imunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I.A. et al. 30 MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Estas seqüências po- dem ser usadas como uma fonte de seqüência humana, por exemplo, para regiões conservadas e CDRs. Regiões consenso de regiões conservadas humanas também podem ser usadas, por exemplo, como descrito em US 6.300.064.
Adicionalmente, moléculas de anticorpo de cadeia única, quimé- ricas, humanizadas (por exemplo, proteínas que incluem ambas as porções 5 humana e não-humana), podem ser produzidas usando técnicas de DNA recombinante padrão. Anticorpos humanizados também podem ser produzi- dos, por exemplo, usando camundongos transgênicos que expressam genes humanos de cadeia pesada e leve, mas são incapazes de expressar genes de cadeia pesada e leve da imunoglobulina endógena de camundongo.
Adicionalmente, as moléculas de anticorpo descritas neste pedi-
do também incluem aquelas que se ligam ã IL-13, interferem na formação de um complexo funcional de sinalização de IL-13, e têm mutações nas regiões constantes da cadeia pesada. Às vezes é desejável mutar e inativar certos fragmentos da região constante. Por exemplo, mutações na região constante 15 pesada podem ser feitas para produzir anticorpos com ligação reduzida ao receptor de Fe (FcR) e/ou complemento; tais mutações são bem conhecidas na técnica. Um exemplo de tal mutação da seqüência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada de IgG é fornecido na SEQ ID NO:128. Certos fragmentos ativos de subunidades de CL e CH (por exemplo, CH1) 20 são covalentemente ligados um ao outro. Um aspecto adicional fornece um método para obtenção de um sítio de ligação ao antígeno que é específico para uma superfície de IL-13 que participa na formação de um complexo funcional de sinalização de IL- 13.
Moléculas de anticorpo exemplares podem incluir seqüências de 25 cadeias VL como estabelecidas nas SEQ ID N0s:30 a 46, e/ou cadeias VH como estabelecidas nas SEQ ID N0s:50 a 115, mas também podem incluir variantes destas seqüências que conservam capacidade de ligação à IL-13. Tais variantes podem ser derivadas das seqüências fornecidas usando téc- nicas bem conhecidas na técnica. Substituições, deleções ou adições de 30 aminoácidos, podem ser feitas nas FRs ou nas CDRs. Ao passo que as mo- dificações nas regiões conservadas são normalmente projetadas para me- lhorar a estabilidade e reduzir a imunogenicidade da molécula de anticorpo, modificações nas CDRs são normalmente projetadas para aumentar a afini- dade da molécula de anticorpo pelo seu alvo. Tais modificações de aumento da afinidade são tipicamente determinadas empiricamente pela alteraçã da região da CDR e testando a molécula de anticorpo. Tais alterações podem 5 ser feitas de acordo com os métodos descritos em Antibody Engineering, 2nd. Ed. (1995), ed. Borrebaeck, Oxford University Press.
Um método exemplar para obtenção de uma seqüência de do- mínio variável da cadeia pesada que é uma variante de uma seqüência de domínio variável da cadeia pesada descrita neste pedido, inclui a adição, 10 deleção, substituição, ou inserção de um ou mais aminoácidos em uma se- qüência de domínio variável da cadeia pesada descrita neste pedido, opcio- nalmente combinando a seqüência de domínio variável da cadeia pesada com uma ou mais seqüências de domínio variável da cadeia leve, e testando uma proteína que inclui a seqüência de domínio variável da cadeia pesada 15 modificada para ligação específica à IL-13, e (preferencialmente) testando a capacidade de tal domínio de ligação ao antígeno para modular uma ou mais atividades associadas à IL-13. Um método análogo pode ser empregado usando uma ou mais variantes de seqüência de uma seqüência de domínio variável da cadeia leve descrita neste pedido.
Variantes de moléculas de anticorpo podem ser preparadas a-
través da criação de bibliotecas com uma ou mais CDRs variadas e selecio- nando as bibliotecas para encontrar membros que se ligam à IL-13, por e- xemplo, com afinidade melhorada. Por exemplo, Marks et al. (Bi- o/Technology (1992) 10:779-83) descrevem métodos de produção de reper- 25 tórios de domínios variáveis de anticorpo nos quais iniciadores consenso direcionados ou adjacentes a extremidade 5' da área de domínio variável são usados em conjunto com iniciadores consenso para a terceira região conservada de genes VH humanos para fornecer um repertório de domínios variáveis VH desprovidos de uma CDR3. O repertório pode ser combinado 30 com uma CDR3 de um anticorpo particular. Além disso, as seqüências deri- vadas de CDR3 podem ser misturadas com repertórios de domínios VH ou VL desprovidos de uma CDR3, e domínios VH ou VL completos misturados combinados com um domínio cognato VL ou VH para fornecer fragmentos de ligação específica ao antígeno. O repertório então pode ser mostrado em um sistema hospedeiro adequado, tal como o sistema de exposição de fago de WO 92/01047, para que os fragmentos de ligação ao antígeno adequado 5 possam ser selecionados. Técnicas de mistura análoga ou combinatória também são reveladas por Stemmer (Nature( 1994)370:389-91). Uma alter- nativa adicional é a geração de regiões alteradas VH ou VL usando mutagê- nese randômica de um ou mais genes selecionados VH e/ou VL para gerar mutações dentro do domínio variável inteiro. Ver, por exemplo, Gram et al. 10 Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1992) 89:3576-80.
Outro método que pode ser usado para mutagênese dirigida às regiões CDR dos genes de VH ou VL. Tais técnicas são reveladas por, por exemplo, Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1994) 91:3809-13) e Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263:551-67). Similarmente, uma ou mais, ou 15 todas as três CDRs pode ser enxertadas em um repertório de domínios VH ou VL, ou até algum outra estrutura (tal como um domínio de fibronectina). A proteína resultante é avaliada pela capacidade de se ligar à IL-13.
Em uma modalidade, um agente de ligação que se liga a um al- vo é modificado, por exemplo, por mutagênese, para fornecer um agrupa- 20 mento ("pool") de agentes de ligação modificados. Os agentes de ligação modificados então são avaliados para identificar um ou mais agentes de li- gação alterados que tenham propriedades funcionais alteradas (por exem- plo, ligação melhorada, estabilidade melhorada, estabilidade alongada in vivo). Em uma implementação, a tecnologia de biblioteca de exposição é 25 usada para selecionar ou classificar o agrupamento de agentes de ligação modificados. Agentes de ligação com maior afinidade então são identificados a partir da segunda biblioteca, por exemplo, usando maior estrigência ou condições mais competitivas de ligação e lavagem. Outras técnicas de clas- sificação também podem ser usadas.
Em algumas modalidades, a mutagênese é direcionada a regi-
ões conhecidas ou prováveis de estarem na interface de ligação. Se, por exemplo, os agentes de ligação identificados forem moléculas de anticorpo, então a mutagênese pode ser dirigida às regiões CDR das cadeias pesadas ou leves como descrito neste pedido. Além disso, a mutagênese pode ser direcionada a regiões conservadas próximas ou adjacentes a CDRs, por e- xemplo, regiões conservadas, determinadas dentro de 10, 5, ou 3 aminoáci- 5 dos de uma ligação CDR. No caso de anticorpos, mutagênese também pode ser limitada a uma ou algumas das CDRs, por exemplo, para fazer melhorias gradativas.
Em uma modalidade, a mutagênese é usada para fazer um anti- corpo mais similar a uma ou mais seqüências da linhagem germinativa. Um método de linhagem germinativa exemplar pode incluir: identificação de uma ou mais seqüências de linhagem germinativa que são similares (por exem- plo, as mais similares em um determinado banco de dados) à seqüência do anticorpo isolado. Então mutações (em termos de aminoácido) podem ser feitas no anticorpo isolado, incrementalmente, em combinação, ou ambos. Por exemplo, uma biblioteca de ácido nucleico que inclui seqüências que codificam algumas ou todas as mutações de linhagem germinativa possíveis é feita. Os anticorpos mutados então são avaliados, por exemplo, para iden- tificar um anticorpo de linhagem germinativa que tem um ou mais resíduos adicionais em relação ao anticorpo isolado e que é ainda útil (por exemplo, tem uma atividade funcional). Em uma modalidade, tantos resíduos de linha- gem germinativa são introduzidos em um anticorpo isolado quanto possível.
Em uma modalidade, mutagênese é usada para substituir ou inserir um ou mais resíduos de linhagem germinativa em uma região CDR. Por exemplo, a linhagem germinativa do resíduo de CDR pode ser de uma 25 seqüência de linhagem germinativa que é similar (por exemplo, a mais simi- lar) ao domínio variável que é modificado. Depois da mutagênese, a ativida- de (por exemplo, ligação ou outra atividade funcional) do anticorpo pode ser avaliada para determinar se o resíduo ou resíduos da linhagem germinativa são tolerados. Mutagênese similar pode ser realizada nas regiões conserva- 30 das.
Seleção uma seqüência de linhagem germinativa pode ser reali- zada de diferentes maneiras. Por exemplo, uma seqüência de linhagem germinativa pode ser selecionada se reunir um critério pré-determinado de seletividade ou similaridade, por exemplo, pelo menos certa porcentagem de identidade, por exemplo, identidade de pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 99,5%. A seleção pode ser realizada usando 5 pelo menos 2, 3, 5, ou 10 seqüências de linhagem germinativa. No caso de CDR1 e CDR2, a identificação de uma seqüência de linhagem germinativa similar pode incluir a seleção de tal seqüência. No caso de CDR3, a identifi- cação de uma seqüência de linhagem germinativa similar pode incluir a se- leção de tal seqüência, mas pode incluir a utilização de duas seqüências de 10 linhagem germinativa que separadamente contribuem para a porção amino- terminal e a porção carbóxi-terminal. Em outras implementações, mais de uma ou duas seqüências de linhagem germinativa são usadas, por exemplo, para formar uma seqüência consenso.
Em outras modalidades, o anticorpo pode ser modificado para ter um padrão de glicosilação alterado (isto é, alterado a partir do padrão de glicosilação original ou nativo). Como usado neste contexto, "alterado" signi- fica ter uma ou mais porções de carboidrato deletadas, e/ou ter um ou mais sítios de glicosilação adicionados ao anticorpo original. A adição de sítios de glicosilação aos anticorpos presentemente revelados pode ser acompanha- da por alteração da seqüência de aminoácidos para conter seqüências con- senso do sítio de glicosilação; tais técnicas são bem conhecidas na técnica. Outro meio de aumentar o número de porções de carboidratos nos anticor- pos é pela ligação química ou enzimática de glicosídeos aos resíduos de aminoácido do anticorpo. Estes métodos são descritos em, por exemplo, WO 87/05330, e Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 22:259-306. A remoção de quaisquer porções de carboidrato presentes nos anticorpos po- de ser realizada quimicamente ou enzimaticamente como descrito na técnica (Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52; Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 1 18:131; e Thotakura etal. (1987) Meth. Enzymol. 138:350). Ver, por exemplo, US 5.869.046 para uma modificação que aumenta a meia- vida in vivo pelo fornecimento de um epítopo de ligação ao receptor de libe- ração. Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL-13 inclui pelo menos uma, duas e preferencialmente três CDRs do domínio variável da cadeia leve ou pesada de um anticorpo revelado neste pedido, por exem- plo, MJ 2-7. Por exemplo, a proteína inclui uma ou mais das seguintes se- quências dentro de uma região CDR:
GFNIKDTYIH (SEQ ID N0:15),
RIDPANDNIKYDPKFQG (SEQ ID NO:16),
SEENWYDFFDY (SEQ ID N0:17),
RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:18),
KVSNRFS (SEQ ID NO: 19), e
FQGSHIPYT (SEQ ID N0:20), ou uma CDR tendo uma seqüên- cia de aminoácidos que se diferencia por não mais do que 4, 3, 2,5, 2, 1,5, 1 ou 0,5 alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções) para cada 10 aminoácidos (por exemplo, o número de diferenças que são propor- 15 cionais ao tamanho da CDR) em relação a uma seqüência listada acima, por exemplo, pelo menos uma alteração mas não mais de duas, três, ou quatro por CDR.
Por exemplo, a molécula de anticorpo anti-IL-13 pode incluir, na seqüência de domínio variável de cadeia leve, pelo menos uma, duas, ou três das seguintes seqüências dentro de uma região CDR: RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:18),
KVSNRFS (SEQ ID NO:19), e
FQGSHIPYT (SEQ ID N0:20), ou uma seqüência de aminoáci- dos que se diferencia por não mais do que 4, 3, 2,5, 2, 1,5, 1 ou 0,5 substitu- ições, inserções ou deleções de cada 10 aminoácidos em relação a uma seqüência listada acima.
A molécula de anticorpo anti-IL-13 pode incluir, na seqüência de domínio variável da cadeia pesada, pelo menos uma, duas, ou três das se- guintes seqüências dentro de uma região de CDR:
GFNIKDTYIH (SEQ ID NO:15),
RIDPANDNIKYDPKFQG (SEQ ID NO:16), e SEENWYDFFDY (SEQ ID NO:17), ou uma seqüência de amino- ácidos que se diferencia por não mais do que 4, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 substituições, inserções ou deleções de cada 10 aminoácidos em relação a uma seqüência listada acima. A região CDR3 da cadeia pesada pode ser menos de 13 ou menos do que 12 aminoácidos no tamanho, por exemplo, 11 aminoácidos no tamanho (usando definições de Chothia ou Kabat).
Em outro exemplo, a molécula de anticorpo anti-IL-13 pode in- cluir, na seqüência de domínio variável da cadeia leve, pelo menos uma, duas, ou três das seguintes seqüências dentro de uma região CDR (aminoá- cidos entre parênteses representam alternativas para uma determinada po- sição):
(i)(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)-Y-L- (EDNQYASXSEQ ID NO:25) ou (RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N-(TN)- Y-L-E (SEQ ID NO:26), ou (RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-N-G-N-T-Y-L- (EDNQYAS) (SEQ ID NO:21),
(ii) K-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)-S (SEQ ID NO:27), ou K-(LV)-S-
(NY)-R-F-S (SEQ ID NO:22), e
(iii) Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-I-P (SEQ ID NO:28), F-Q-(GSA)-(SIT)- (HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:23), ou Q-(GSAMST)-(HEQ)-I-P-Y-T (SEQ ID NO: 194), ou F-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-(IL)-P-Y-T (SEQ ID NO:29).
Em uma modalidade preferencial, a molécula de anticorpo anti-
IL-13 inclui todas as seis CDR's de MJ 2-7 ou CDRs estreitamente relacio- nadas, por exemplo, CDRs que são idênticas ou que têm pelo menos uma alteração de aminoácido, mas não mais de duas, três ou quatro alterações (por exemplo, substituições, deleções, ou inserções). O agente de ligação à 25 IL-13 pode incluir pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis, ou sete resíduos de aminoácido de MJ 2-7 que contatam IL-13.
Ainda em outro exemplo, a molécula de anticorpo anti-IL-13 in- clui pelo menos uma, duas, ou três regiões CDR que têm as mesmas estru- turas canônicas e as regiões CDR correspondentes de MJ 2-7, por exemplo, pelo menos CDR1 e CDR2 dos domínios variáveis da cadeia leve e/ou pe- sada de MJ 2-7.
Em outro exemplo, a molécula de anticorpo anti-IL-13 pode in- cluir, na seqüência de domínio variável da cadeia pesada, pelo menos uma, duas, ou três das seguintes seqüências dentro de uma região CDR (aminoá- cidos entre parênteses representam alternativas a uma determinada posi- ção):
(i)G-(YF)-(NT)-l-K-D-T-Y-(MI)-H (SEQ ID NO:48),
(ii)(WR)-l-D-P-(GA)-N-D-N-l-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-G (SEQ ID
NO:49), e
(iii)SEENWYDFFDY (SEQ ID N0:17).
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL-13 inclui pelo menos uma, duas e preferencialmente três CDR's do domínio variável da cadeia leve ou pesada de um anticorpo revelado neste pedido, por exem- plo, C65. Por exemplo, a molécula de anticorpo anti-IL-13 inclui uma ou mais das seguintes seqüências dentro de uma região CDR:
QASQGTSINLN (SEQ ID N0:118),
GASNLED (SEQ ID NO:119), e
LQHSYLPWT (SEQ ID N0:120)
GFSLTGYGVN (SEQ ID NO:121),
IIWGDGSTDYNSAL (SEQ ID NO:122), e
DKTFYYDGFYRGRMDY (SEQ ID NO:123), ou uma CDR que 20 tem uma seqüência de aminoácidos que se diferencia por não mais do que 4, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 substituições, inserções ou deleções de cada 10 aminoácidos (por exemplo, o número de diferenças é proporcional ao tama- nho da CDR) em relação a uma seqüência listada acima, por exemplo, pelo menos uma alteração mas não mais de duas, três, ou quatro por CDR. Por 25 exemplo, a proteína pode incluir, na seqüência de domínio variável da ca- deia leve, pelo menos uma, duas, ou três das seguintes seqüências dentro de uma região CDR:
QASQGTSINLN (SEQ ID NO:118),
GASNLED (SEQ ID NO:119), e LQHSYLPWT (SEQ ID N0:120), ou uma seqüência de aminoá-
cidos que se diferencia por não mais do que 4, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 substi- tuições, inserções ou deleções de cada 10 aminoácidos em relação a uma seqüência listada acima.
A molécula de anticorpo anti-IL-13 pode incluir, na seqüência de domínio variável da cadeia pesada, pelo menos uma, duas, ou três das se- guintes seqüências dentro de uma região CDR:
GFSLTGYGVN (SEQ ID NO:121),
IIWGDGSTDYNSAL (SEQ ID NO:122), e
DKTFYYDGFYRGRMDY (SEQ ID NO: 123), ou uma seqüência de aminoácidos que se diferencia por não mais do que 4, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 substituições, inserções ou deleções de cada 10 aminoácidos em rela- ção a uma seqüência listada acima.
Em modalidades, a molécula de anticorpo para IL-13 pode incluir uma das seguintes seqüências:
• DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQS PQLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEA-
EDVGVYYCFQGSHIPYT (SEQ ID N0:30)
DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQS PRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG SHIPYT (SEQ ID NO:31)
• DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQS PQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG
SHIPYT (SEQ ID NO:32)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQP PQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG SHIPYT (SEQ ID NO:33)
· DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQS PQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG SHIPYT (SEQ ID NO:34)
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWLQQRPGQP PRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG SHIPYT (SEQ ID NO:35)
• DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGK APKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQG SHIPYT (SEQ ID NO:36)
DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNWFQQRPGQ SPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQ GSHIPYT (SEQ ID NO:37)
· DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQ GSHIPYT (SEQ ID NO:38) ou uma seqüência que tem menos de oito, sete, seis, cinco, quatro, três ou duas alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções, por e- xemplo, substituições conservativas ou uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em MJ 2-7). Substituições e- xemplares estão em uma das seguintes posições Kabat: 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64 a 69, 85, 87, 98, 99, 101, e 102. As substituições podem, por exemplo, substituir um aminoácido em uma posição correspondente de MJ 2-7 em uma região conservada humana.
A molécula de anticorpo para IL-13 também pode incluir uma das seguintes seqüências:
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISC-(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G- N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQSPQLLIYK-(LVI)-S-(NY)- (RW)- (FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC F-Q-(GSA)-
(SIT)- (HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:39)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC-(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G- N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WFQQRPGQSPRRLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)- (FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)- (SIT)-(HEQ)-(IL)-P (SEQ ID N0:40)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC-(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G- N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQSPQLLI YK-(LVI)-S-(NY)-(RW)- (FD)-SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)- (SIT)-(HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:41)
· DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N- (TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQPPQLLI YK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)- SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)- (HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:42)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G-N- (TN)-Y-L-(EDNQYASJWYLQKPGQSPQLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-(FD)- SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)- (HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:43)
DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISC (RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G- N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WLQQRPGQPPRLLI YK-(LVI)-S-(N Y)-(RW)- (FD)-SGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCF-Q-(GSA)- (SIT)-(HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:44)
. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G- N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYQQKPGKAPKLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)- (FD)-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCF-Q-(GSA)-(SIT)- (HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:45)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC(RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-H-S-(ND)-G- N-(TN)-Y-L-(EDNQYAS)WYLQKPGQSPKLLIYK-(LVI)-S-(NY)-(RW)-
(FD)SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCF-Q-(GSA)-(SIT)- (HEQ)-(IL)-P (SEQ ID NO:46) ou uma seqüência que tem menos de oito, sete, seis, cinco, quatro, três, ou duas alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções, por e- xemplo, substituições conservativas ou uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em MJ 2-7) na região conser- vada. Substituições exemplares estão em uma ou mais das seguintes posi- ções Kabat: 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64 a 69, 85, 87, 98, 99, 101, e 102. As substituições, por exemplo, podem substituir um aminoácido em uma posição correspondente de MJ 2-7 em uma região conservada humana. As seqüências também podem ser seguidas pelo dipeptídeo Tyr-Thr. A regi- ão FR4 pode incluir, por exemplo, a seqüência FGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:47).
Em outras modalidades, a molécula de anticorpo para IL-13 po- de incluir uma das seguintes seqüências:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLE
WMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVY YCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:50)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQRLE WMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVY YCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:51)
· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG FNIKDTYIHWVRQAT GQGLE WMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVY YCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:52)
• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLE WMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAV
YYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:53)
• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSG FNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW MGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYY CATSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:54)
• QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQALE WMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAM
YYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:55)
• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQAPGQGLE WMGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:56)
· QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFNIKDTYIHWVRQARGQRLE WIGRIDPANDNIKYDPKFQGRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CAASEENWYDFFDY (SEQ ID NO:57)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:58)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYY CAKDSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:59)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWIRQAPGKGLEW VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY
CARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:60)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYY CTTSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:61)
EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYH CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:62)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:63)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHVfVRQAPGKGLEW VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY
CAKSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:64)
• QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW VARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CAKSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:65)
· QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:66)
EVQLVESGGVWQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYY CAKDSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:67)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:68)
• EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFNIKDTYIHWFRQAPGKGLEW VGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYC
TRSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:69)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEY VSRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:70)
· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW IGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSEENWYDFFDY (SEQ ID NQ:71) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VARIDPANDNIKYDPKFQGKATISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:72)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW VARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY
CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:73)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:74)
· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VARIDPANDNIKYDPKFQGKATISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:75)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW IGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:76)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:77)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW VARIDPANDNIKYDPKFQGRFTISRDNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYY
CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:78)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEW VGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYY CARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:79)
· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW IGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:80)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTGSGFNIKDTYI HWVRQAPGKGLEW IGRIDPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:81)
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEW
IGRIDPANDNIKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYC ARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:82) ou uma seqüência que tem menos de oito, sete, seis, cinco, quatro, três, ou duas alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções, por e- xemplo, substituições conservativas ou uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em MJ 2-7). Substituições e- xemplares estão em uma ou mais das seguintes posições Kabat: 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106, e 107. Substituições exemplares também podem estar em uma ou mais das seguintes posições (de forma correspondente à numeração seqüencial): 48, 49, 67, 68, 72, e 79. As substi- tuições podem, por exemplo, substituir um aminoácido em uma posição cor- respondente de MJ 2-7 em uma região conservada humana. Em uma moda- lidade, a seqüência inclui (de forma correspondente à numeração seqüenci- al) uma ou mais das seguintes: Ile em 48, Gly em 49, Lys em 67, Ala em 68, Ala em 72 e Ala em 79; preferencialmente, por exemplo, Ile em 48, Gly em 49, Ala em 72, e Ala em 79.
Além disso, as regiões conservadas da seqüência do domínio variável da cadeia pesada podem incluir: (i) em uma posição correspondente a 49, Gly; (ii) em uma posição correspondente a 72, Ala; (iii) em posições correspondentes a 48, lie, e a 49, Gly; (iv) em posições correspondente a 48, 20 Ile1 a 49, Gly, e a 72, Ala; (v) em posições correspondente a 67, Lys, a 68, Ala, e a 72, Ala; e/ou (vi) em posições correspondente a 48, lie, a 49, Gly, a 72, Ala, a 79, Ala.
A molécula de anticorpo para IL-13 também pode incluir uma das seguintes seqüências:
· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H,
WVRQAPGQGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0.83)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H,
WVRQAPGQRLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:84) • QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQATGQGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:85)
· QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1
WVRQAPGQGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:86)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSG-(YF)-(NT)-1 -K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:87)
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGQALEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCARSEENWYDFFDY
(SEQ ID NO:88)
• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H, WVRQAPGQGLEWMG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY
(SEQ ID NO:89)
• QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQARGQRLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAASEENWYDFFDY (SEQ ID N0:90)
· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1
WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:91)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-1-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:92) • QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WIRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:93)
· EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H,
WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:94)
• EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H,
WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:95)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY
(SEQ ID NO:96)
• EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-1 -K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSEENWYDFFDY
(SEQ ID NO:97)
. QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSEENWYDFFDY (SEQ ID NO: 98)
· QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1
WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:99)
EVQLVESGGVWQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCAKDSEENWYDFFDY (SEQ ID NQ:100) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:101)
· Evqlvesggglvqpgrslrlsctasg-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1
WFRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDGSKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:102)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEYVS(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GRFTISRDNSKNTLYLQMGSLRAEDMAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:103)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY
(SEQ ID N0:104)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H; WVRQAPGKGLEWV A(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GKATISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0;105)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:106)
· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H,
WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:107)
Evqlvesggglvqpggslrlscaasg-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GKATISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NQ:108) • EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H, WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:109)
· EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H,
WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID N0:110)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVA(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q-
GRFTISRDNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:111)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWVG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY
(SEQ ID NO:112)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:113)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTGSG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVRQAPGKGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GRFTISADNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:114)
· EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSG-(YF)-(NT)-I-K-D-T-Y-(MI)-H1 WVKQRPEQGLEWIG(WR)-I-D-P-(GA)-N-D-N-I-K-Y-(SD)-(PQ)-K-F-Q- GKATITADTSSNTAYLQLNSLTSEDTAVYYCARSEENWYDFFDY (SEQ ID NO:115)
ou uma seqüência que tem menos de oito, sete, seis, cinco, quatro, três, ou duas alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções, por e- xemplo, substituições conservativas ou uma substituição de um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em MJ 2-7) na região conser- vada. Substituições exemplares estão em uma ou mais das seguintes posi- ções Kabat: 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106, e 107. As substituições, por exemplo, pode substituir um aminoácido em uma posição correspondente de MJ 2-7 em uma região conservada humana. A região 5 FR4 pode incluir, por exemplo, a seqüência WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:116) ou WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:117).
Exemplos adicionais de anticorpos para IL-13, que interferem na ligação à IL-13 a IL-13R (por exemplo, um complexo de receptor de IL-13), ou uma subunidade do mesmo, incluem "mAb13.2"e modificado, por exem- 10 pio, formas quiméricas ou humanizadas do mesmo. As seqüências de ami- noácido e nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de mAb13.2 são apresentados neste pedido como SEQ ID NO:198 e SEQ ID NO:217, res- pectivamente. As seqüências de aminoácidos e nucleotídeos da região vari- ável da cadeia leve de mAb13.2 são apresentados neste pedido como SEQ 15 ID NO:199 e SEQ ID NO:218, respectivamente. Uma forma quimérica exem- plar (por exemplo, uma forma compreendendo a região variável da cadeia pesada e leve de mAb13.2) é referida neste pedido como "ch13.2". As se- qüências de aminoácido e nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de ch13.2 são apresentados neste pedido como SEQ ID N0:208 e SEQ ID 20 N0:204, respectivamente. As seqüências de aminoácidos e nucleotídeos da região variável da cadeia leve de ch13.2 são apresentados neste pedido como SEQ ID NO:213 e SEQ ID NO:219, respectivamente. Uma forma hu- manizada de mAb13.2, a qual é referida neste pedido como "h13.2v1”, tem seqüências de aminoácido e nucleotídeos da região variável da cadeia pe- 25 sada apresentada neste pedido como SEQ ID N0:209 e SEQ ID N0.205, respectivamente. As seqüências de aminoácido e nucleotídeos da região variável da cadeia leve de h13.2v1 são apresentados neste pedido como SEQ ID NO:214 e SEQ ID N0:220, respectivamente. Outra forma humani- zada de mAb13.2, que é referida neste pedido como "hl3.2v2", tem sequên- 30 cias de aminoácidos e nucleotídeos da região variável da cadeia pesada a- presentada neste pedido como SEQ ID N0:210 e SEQ ID N0:206, respecti- vamente. As seqüências de aminoácidos e nucleotídeos da região variável da cadeia leve de h13.2v2 são apresentados neste pedido como SEQ ID NO:212 e SEQ ID NO:221, respectivamente. Outra forma humanizada de mAb13.2, a qual é referida neste pedido como "h13.2v3", tem seqüências de aminoácido e nucleotídeos da região variável da cadeia pesada apresenta- 5 das neste pedido como SEQ ID NO:211 e SEQ ID N0:207, respectivamente. As seqüências de aminoácido e nucleotídeos da região variável da cadeia leve de h13.2v3 são apresentados neste pedido como SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:223, respectivamente.
Em outra modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL-13 com- preende pelo menos uma, duas, três, ou quatro regiões de ligação ao antí- geno, por exemplo, regiões variáveis, tendo uma seqüência de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NOS: 198, 208, 209, 210, ou 211 para VH, e/ou SEQ ID NOs:199, 213, 214, 212, ou 215 para VL), ou uma seqüência substancialmente idêntica a estas (por exemplo, uma seqüência pelo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica a estas, ou que se diferencia por não mais do que 1, 2, 5, 10, ou 15 resíduos de aminoácido de SEQ ID NOS: 199, 213, 214, 212, 198, 208, 209, 210, 215, ou 211). Em ou- tra modalidade, o anticorpo inclui um domínio VH e/ou VL codificado por um ácido nucleico que tem uma seqüência nucleotídica como apresentada em SEQ ID NOs:222, 204, 205, 208, ou 207 para VH, e/ou SEQ ID NOs:218, 219, 220, 221, ou 223 para VL), ou uma seqüência substancialmente idênti- ca a estas (por exemplo, uma seqüência pelo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica a estsa, ou que se diferenciam por não mais do que 3, 6, 15, 30, ou 45 nucleotídeos de SEQ ID NOs:218, 219, 220, 221, 222, 204, 205, 206, 223, ou 207). Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende pelo menos uma, duas, ou três CDRs de uma região variável da cadeia pesada que tenha uma seqüên- cia de aminoácidos como apresentada em SEQ ID N0s:202, 203, ou 196 para CDRs 1 a 3 de VH, respectivamente, ou uma seqüência substancial- mente homóloga a estas (por exemplo, uma seqüência pelo menos aproxi- madamente 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica a estas, e/ou que tem uma ou mais substituições, por exemplo, substituições conservadas). Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende pelo menos uma, duas, ou três CDRs de uma região variável da cadeia leve que tem uma seqüência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID NOS: 197, 200, ou 201 para CDRs 1 a 3 de VL, respectivamente, ou uma sequên- 5 cia substancialmente homóloga a estas (por exemplo, uma seqüência pelo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica a estas, e/ou que tem uma ou mais substituições, por exemplo, substituições conser- vadas). Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de 10 regiões variáveis de cadeia pesada e leve que tem uma seqüência de ami- noácidos como apresentada em SEQ ID N0s:202, 203, 196 para CDRs VH 1 a 3, respectivamente; e SEQ ID NO: 197, 200, ou 201 para CDRs 1 a 3 de VL, respectivamente, ou seqüência substancialmente homóloga a estas (por exemplo, uma seqüência pelo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 15 99% ou mais idêntica a estas, e/ou que tem uma ou mais substituições, por exemplo, substituições conservadas).
Em uma modalidade, a molécula de anticorpo anti-IL-13 inclui todas as seis CDRs de C65 ou CDRs estreitamente relacionadas, por exem- plo, CDRs que são idênticas ou que têm pelo menos uma alteração de ami- noácido, mas não mais de duas, três ou quatro alterações (por exemplo, substituições, deleções, ou inserções).
Ainda em outra modalidade, o agente de ligação à IL-13 inclui pelo menos uma, duas ou três regiões CDR que têm as mesmas estruturas canônicas e as regiões CDR correspondentes de C65, por exemplo, pelo menos CDR1 e CDR2 dos domínios variáveis de cadeia leve e/ou pesada de C65.
Em uma modalidade, a região conservada da cadeia pesada (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que en- globa FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de ami- 30 noácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mai- or idêntica à região conservada da cadeia pesada de uma das seguintes se- qüências do segmento V da linhagem germinativa: DP-71 ou DP-67 ou outro gene V que é compatível com a classe da estrutura canônica de C65 (ver, por exemplo, Chothia et al. (1992) J. Moi Biol. 227:799 - 817; Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798).
Em uma modalidade, a região conservada da cadeia leve (por 5 exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de aminoáci- dos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior i- dêntica à região conservada de cadeia leve de DPK-1 ou seqüência de li- nhagem germinativa DPK-9 ou outro gene V que é compatível com a classe 10 da estrutura canônica de C65 (ver, por exemplo, Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628).
Em outra modalidade, a região conservada de cadeia leve (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de aminoáci- 15 dos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior i- dêntica à região conservada da cadeia leve de uma seqüência do subgrupo Vk I da linhagem germinativa, por exemplo, uma seqüência DPK-9 ou DPK- 1.
Em outra modalidade, a região conservada da cadeia pesada 20 (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma seqüência que en- globa FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma seqüência de ami- noácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mai- or idêntico à região conservada de cadeia leve de uma seqüência dosubgru- po VH IV da linhagem germinativa, por exemplo, um DP-71 ou seqüência 25 DP-67.
Em uma modalidade, a região conservada variável de cadeia pesada ou leve (por exemplo, a região que engloba pelo menos FR1, FR2, FR3, e opcionalmente FR4) pode ser escolhida a partir de: (a) uma região conservada variável da cadeia leve ou pesada incluindo pelo menos 80%, 30 85%, 90%, 95%, ou 100% dos resíduos de aminoácido de uma região con- servada variável da cadeia leve ou pesada humana, por exemplo, um resí- duo da região conservada variável da cadeia leve ou pesada de um anticor- po maduro humano, uma seqüência de linhagem germinativa humana, uma seqüência consenso humana, ou um anticorpo humano descrito neste pedi- do; (b) uma região conservada variável da cadeia leve ou pesada incluindo de 20% a 80%, 40% a 60%, 60% a 90%, ou 70% a 95% dos resíduos de aminoácidos de uma região conservada variável da cadeia leve ou pesada humana, por exemplo, um resíduo da região conservada variável da cadeia leve ou pesada de um anticorpo maduro humano, uma seqüência de linha- gem germinativa humana, uma seqüência consenso humana; (c) uma região conservada não-humana (por exemplo, uma região conservada de roedor); ou (d) uma região conservada não-humana que foi modificada, por exemplo, para remoção de determinantes antigênicos ou citotóxicos, por exemplo, deimunizada, ou parcialmente humanizados. Em uma modalidade, a se- qüência de domínio variável da cadeia pesada inclui resíduos humanos ou resíduos de seqüência consenso humana em uma ou mais das seguintes posições (preferencialmente pelo menos cinco, dez, doze, ou todos): (na FR do domínio variável da cadeia leve) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, e/ou (na FR do domínio variável da cadeia pesada) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H, e/ou 103H (de acordo com a numeração Kabat).
Em uma modalidade, as moléculas de anticorpo anti-IL13 inclu- em pelo menos uma CDR não-humana, por exemplo, uma CDR murina, por exemplo, uma CDR de, por exemplo, mAb13.2, MJ2-7, C65, e/ou formas modificada dos mesmos (por exemplo, variantes humanizadas ou quiméricas 25 dos mesmos), e pelo menos uma região conservada que se diferencia de uma região conservada de, por exemplo, mAb13.2, MJ2-7, C65, e/ou formas modificadas dos mesmos (por exemplo, variantes humanizadas ou quiméri- cas dos mesmos) por pelo menos um aminoácido, por exemplo, pelo menos 5, 8, 10, 12, 15, ou 18 aminoácidos. Por exemplo, as proteínas incluem uma, 30 duas, três, quatro, cinco, ou seis de tais CDRs não-humanas e inclui pelo menos uma diferença de aminoácido em pelo menos três dos FR1 de HC, FR2 de HC1 FR3 de HC, FR1 de LC, FR2 de LC, e FR3 de LC. Em uma modalidade, a seqüência do domínio variável da cadeia pesada ou leve da molécula de anticorpo anti-IL-13 inclui uma seqüência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou maior, idêntica a uma seqüência do domínio variável de um anticorpo descri- 5 to neste pedido, por exemplo, mAb13.2, MJ2-7, C65, e/ou formas modifica- das dos mesmos (por exemplo, variantes humanizadas ou quiméricas dos mesmos); ou que se diferencia em pelo menos 1 ou 5 resíduos, mas menos de 40, 30, 20, ou 10 resíduos, de uma seqüência de domínio variável de um anticorpo descrito neste pedido, por exemplo, mAb13.2, MJ2-7, C65, e/ou 10 formas modificadas dos mesmos (por exemplo, variantes humanizadas ou quiméricas dos mesmos). Em uma modalidade, a seqüência do domínio va- riável da cadeia pesada ou leve da proteína inclui uma seqüência de amino- ácidos codificada por uma seqüência de ácido nucleico descrita neste pedido ou um ácido nucleico que hibridiza em uma seqüência de ácido nucleico 15 descrita neste pedido ou seu complemento, por exemplo, sob condições de baixa estrigência, média estrigência, alta estrigência, ou estrigência muito alta.
Em uma modalidade, uma ou ambas as seqüências de domínio variável incluem posições de aminoácido na região conservada que são va- riadamente derivadas tanto a partir de um anticorpo não-humano (por exem- plo, um anticorpo murino, tal como mAb13.2) quanto um anticorpo humano ou seqüência de linhagem germinativa. Por exemplo, uma seqüência do do- mínio variável pode incluir diversas posições nas quais o resíduo de aminoá- cido é idêntico tanto no anticorpo não-humano como no anticorpo humano (ou seqüência de linhagem germinativa humana) porque os dois são idênti- cos naquela posição. Das posições da região conservada restantes onde o não-humano e o humano se diferenciam, pelo menos 50, 60, 70, 80, ou 90% das posições do domínio variável são preferencialmente idênticas ao anti- corpo humano (ou seqüência de linhagem germinativa humana) ao invés do não-humano. Por exemplo, nenhum, ou pelo menos uma, duas, três, ou qua- tro da tal posição da região conservada restante pode ser idêntica ao anti- corpo não-humano ao invés do humano. Por exemplo, em FR1 de HC, uma ou duas das tais posições podem ser não-humanas; em FR2 de HC1 uma ou duas das tais posições podem ser não-humanas; em FR3, uma, duas, três, ou quatro das tais posições podem ser não-humanas; em FR1 de LC, uma, duas, três, ou quatro das tais posições podem ser não-humanas; em FR2 de 5 LC, uma ou duas das tais posições podem ser não-humanas; em FR3 de LC, uma ou duas das tais posições podem ser não-humanas. As regiões conservadas podem incluir posições não-humanas adicionais.
Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo tem seqüên- cias CDR que se diferenciam somente não substancialmente daquelas de MJ 2-7, C65, ou 13.2. Diferenças não substanciais incluem modificações menores de aminoácido, tais como substituições de 1 ou 2 tipicamente de qualquer um dos 5 a 7 aminoácidos na seqüência de uma CDR, por exem- plo, uma CDR Chothia ou Kabat. Tipicamente, um aminoácido é substituído por um aminoácido relacionado que tem carga, hidrofobicidade ou caracte- rísticas estereoquímicas similares. Tais substituições estão dentro das habi- lidades ordinárias de um versado. Diferente em CDRs, modificações mais substanciais em regiões conservadas estruturais (FRs) podem ser feitas sem afetar adversamente as propriedades de ligação de um anticorpo. Modifica- ções nas FRs incluem, mas não são limitadas a, humanização de uma regi- ão conservada derivada de não-humano ou engenharia de certos resíduos da região conservada que são importantes para o contato do antígeno ou para estabilização do sítio de ligação, por exemplo, modificando a classe ou subclasse da região constante, modificando resíduos de aminoácidos espe- cíficos que podem alterar uma função efetora, tal como ligação ao receptor de Fe (Lund et al. (1991) J. Immunol. 147:2657-62; Morgan et al. (1995) Im- munology 86:319-24), ou modificação das espécies a partir das quais a regi- ão constante é derivada. Anticorpos podem ter mutações na região CH2 da cadeia pesada que reduzem ou alteram a função efetora, por exemplo, a ligação ao receptor de Fc e a ativação do complemento. Por exemplo, os anticorpos podem ter mutações, tais como aquelas descritas em U.S. Patent Nos. 5.624.821 e 5.648.260. Na cadeia pesada da IgGI ou lgG2, por exem- plo, tais mutações podem ser feitas para serem similares à seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 17. Anticorpos também podem ter mutações que estabilizam a ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesa- das de uma imunoglobulina, tais como mutações na região de dobradiça de lgG4, como revelado na técnica (por exemplo, Angal et al. (1993) Mol. Im- 5 munol. 30:105-08).
A molécula de anticorpo anti-IL-13 pode estar na forma de anti- corpos intactos, fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno, por exem- plo, Fab, F(ab')2, Fd, dAb, e fragmentos de scFv, e anticorpos intactos e frag- mentos que foram mutados em seu domínio constante e/ou variável (por e- 10 xemplo, mutações para produzir anticorpos quiméricos, parcialmente huma- nizados, ou totalmente humanizados, bem como para produzir anticorpos com um traço desejado, por exemplo, ligação à IL-13 potencializada e/ou ligação à FcR reduzida).
A molécula de anticorpo anti-IL-13 pode ser derivatizada ou Iiga- 15 da à outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab). Por exemplo, o agente de ligação pode estar funcionalmente ligado (por exemplo, por ligação química, fusão gênica, as- sociação não covalente ou de outra maneira) a uma ou mais entidades mo- leculares, tais como outra molécula de anticorpo (por exemplo, para formar 20 uma molécula de anticorpo bispecífica ou multiespecífica), toxinas, radioisó- topos, agentes citotóxicos ou citostáticos, entre outros.
Agentes de Ligação Adicionais à IL-13/IL-13R ou IL-4/IL-4R
Também são fornecidos outros agentes de ligação, outros além de moléculas de anticorpo, que se ligam ao polipeptídeo ou ácido nucléico 25 de IL-13 ou IL-4, ou ao polipeptídeo ou ácido nucleico IL-13R ou IL-4R. Em modalidades, os outros agentes de ligação descritos neste pedido são anta- gonistas e dessa maneira reduzem, inibem ou de outra maneira diminuem uma ou mais atividades biológicas de IL-13 e/ou IL-4 (por exemplo, uma ou mais atividades biológicas de IL-13 e/ou IL-4 como descrito neste pedido).
Agentes de ligação podem ser identificados por meios diversos,
incluindo a modificação de um domínio variável descrito neste pedido ou en- xerto de uma ou mais CDRs de um domínio variável descrito neste pedido para outro domínio estrutural. Agentes de ligação também podem ser identi- ficados a partir de bibliotecas diversas, por exemplo, por seleção. Um méto- do para seleção de bibliotecas proteicas usa a exposição de fago. As regiões particulares de uma proteína são variadas e proteínas que interagem com IL- 5 13 ou IL-4, ou seus receptores, são identificadas, por exemplo, pela retenção em um suporte sólido ou por outra associação física. Por exemplo, para i- dentificar determinados agentes de ligação que se ligam ao mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição como MJ2-7, C65 ou mAb 13.2 em IL-13, agentes de ligação podem ser eluídos pela adição de MJ2-7, C65 ou mAb 10 13.2 (ou anticorpo relacionado), ou agentes de ligação podem ser avaliados em experimentos de competição com MJ2-7, C65 ou mAb 13.2 (ou anticorpo relacionado). É também possível depletar a biblioteca de agentes que se ligam a outros epítopos pelo contato da biblioteca com um complexo que contém IL-13 e MJ2-7, C65 ou mAb 13.2 (ou anticorpo relacionado). A biblio- 15 teca depletada então pode ser contatada com IL-13 para obter um agente de ligação que se liga a IL-13 mas não a IL-13 quando está ligada a MJ 2-7, C65 ou mAb 13.2. É também possível usar peptídeos de IL-13 que contêm o MJ 2-7, epítopo de C65, ou mAb 13.2 como um alvo.
A exposição de fago é descrita, por exemplo, em U.S. Patent N0 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; WO 94/05781; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49; e Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982. A exposição da su- perfície de levedura é descrita, por exemplo, em Boder e Wittrup (1997) A/aí. Biotechnol. 15:553-557. Outra forma da exposição é a exposição de ribos- somo. Ver, por exemplo, Mattheakis et al. (1994) Proc. Nati Acad. Sei. USA 91:9022 e Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18: 1287-92; Hanes et al. (2000) Methods
EnzymoL 328:404-30. e Schaffitzel et al. (1999) J Imunol Me- thods. 231 (1-2): 119-35.
Agentes de ligação que se ligam a IL-13 ou IL-4, ou seus recep- tores, podem ter características estruturais de proteínas estruturais, por e- xemplo, um domínio de prega. Um domínio estrutural exemplar, baseado em um anticorpo, é uma estrutura de "minicorpo" projetada pela deleção de três folhas beta de um domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo mo- noclonal (Tramontano et al., 1994, J. MoL Recognit. 7:9; e Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-5309). Este domínio inclui 61 resíduos e pode ser usado para apresentar duas alças hipervariáveis, por exemplo, uma ou mais alças hipervariáveis de um domínio variável descrito neste pedido ou uma variante descrita neste pedido. Em outra abordagem, o agente de ligação inclui um domínio estrutural que é um domínio similar ao V (Coia et al. WO 99/45110). Domínios similares ao V referem-se a um domínio que tem carac- terísticas estruturais similares aos domínios variável pesado (VH) ou variável leve (VL) dos anticorpos. Outro domínio estrutural é derivado de tendamista- tina, um resíduo 74 no sanduíche da folha beta de seis fitas mantidas juntas por duas ligações dissulfeto (McConneII and Hoess, 1995, J. Mol. Biol. 250:460). Esta proteína parental inclui três alças. As alças podem ser modifi- cadas (por exemplo, usando CDRs ou alças hipervariáveis descritas neste pedido) ou variadas, por exemplo, para selecionar domínios que se ligam à IL-13 ou IL-4, ou seus receptores. WO 00/60070 descreve uma estrutura sanduíche de β derivada do domínio extracelular que ocorre naturalmente de CTLA-4 que pode ser usada como um domínio estrutural.
Outro domínio estrutural ainda para um agente de ligação à IL- 13/13R ou IL-4/IL-4R é um domínio baseado no domínio de fibronectina tipo Ill ou proteínas relacionadas similares a fibronectina. A prega total do domí- nio de fibronectina tipo Ill (Fn3) está estreitamente relacionada àquela do 30 menor fragmento de anticorpo funcional, o domínio variável da cadeia pesa- da do anticorpo. Fn3 é um sanduíche de β similar àquele do domínio VH do anticorpo, exceto que Fn3 tem sete fitas β ao invés de nove. Há três alças no final de Fn3; as posições das alças BC, DE e FG correspondem aproxi- madamente àquelas de CDR1, 2 e 3 do domínio VH de um anticorpo. Fn3 é vantajoso porque não tem ligações dissulfeto. Por isso, Fn3 é estável sob condições de redução, diferentemente de anticorpos e seus fragmentos (ver 5 WO 98/56915; WO 01/64942; WO 00/34784). Um domínio de Fn3 pode ser modificado (por exemplo, usando CDRs ou alças hipervariáveis descritas neste pedido) ou variado, por exemplo, para selecionar domínios que se li- gam à IL-13 ou IL-4, ou seus receptores.
Outros domínios de estrutura exemplares ainda incluem: recep- 10 tores de célula T; proteínas de MHC; domínios extracelulares (por exemplo, repetições de fibronectina Tipo III, repetições de EGF); inibidores de protea- se (por exemplo, domínios de Kunitz, ecotina, BPTI, e similares); repetições de TPR; estruturas trefoil; domínios de dedo de zinco; proteína de ligação a DNA; particularmente proteínas monoméricas de ligação a DNA; proteína de 15 ligação a RNA; enzimas, por exemplo, proteases (particularmente proteases inativadas), RNase; chaperonas, por exemplo, tioredoxina, e proteínas de choque térmico; e domínios de sinalização intracelular (tais como domínios SH2 e SH3). US 20040009530 descreve exemplos de algumas estruturas alternativas.
Exemplos de domínios estruturais pequenos incluem: domínios
de Kunitz (58 aminoácidos, 3 ligações dissulfeto), domínios de inibidor de tripsina de Cucurbida maxima (31 aminoácidos, 3 ligações dissulfeto), domí- nios relacionados a guanilina (14 aminoácidos, 2 ligações dissulfeto), domí- nios relacionados a enterotoxina estável ao calor IA a partir de bactérias 25 gram negativas (18 aminoácidos, 3 ligações dissulfeto), domínios de EGF (50 aminoácidos, 3 ligações dissulfeto), domínios kringle (60 aminoácidos, 3 ligações dissulfeto), domínios de ligação a carboidrato fúngico (35 aminoáci- dos, 2 ligações dissulfeto), domínios de endotelina (18 aminoácidos, 2 liga- ções dissulfeto), e domínio de ligação a IgG Estreptocócica G (35 aminoáci- 30 dos, nenhuma ligação dissulfeto). Exemplos de pequenos domínios estrutu- rais intracelulares incluem domínios SH2, SH3, e EVH. Geralmente, qual- quer domínio modular, intracelular ou extracelular, pode ser usado. Critérios exemplares para avaliação de um domínio estrutural podem incluir: (1) seqüência de aminoácidos, (2) seqüências de vários do- mínios homólogos, (3) estrutura 3-dimensional, e/ou (4) dados de estabilida- de acima de uma faixa de pH, temperatura, salinidade, solvente orgânico, 5 concentração de oxidante. Em uma modalidade, o domínio estrutural é um pequeno, de domínio proteico estável, por exemplo, uma proteína de menos de 100, 70, 50, 40 ou 30 aminoácidos. O domínio pode incluir uma ou mais ligações dissulfeto ou pode quelar um metal, por exemplo, zinco.
Outros agentes de ligação ainda são baseados em peptídeos, 10 por exemplo, proteínas com uma seqüência de aminoácidos que são menos de 30, 25, 24, 20, 18, 15, ou 12 aminoácidos. Peptídeos podem ser incorpo- rados em uma proteína maior, mas tipicamente uma região que pode se ligar independentemente a IL-13, por exemplo, a um epítopo descrito neste pedi- do. Peptídeos podem ser identificados pela exposição de fago. Ver, por e- 15 xemplo, US 20040071705.
Um agente de ligação pode incluir ligações não-peptídicas e ou- tra modificação química. Por exemplo, parte ou todo do agente de ligação pode ser sintetizado como um peptídeo mimético, por exemplo, um peptóide (ver, por exemplo, Simon et ai (1992) Proc. Nati Acad. Sei. USA 89:9367-71 20 e Horwell (1995) Trends Biotechnol. 13:132-4). Um agente de ligação pode incluir um ou mais (por exemplo, todas) ligações não-hidrolizáveis. Muitas ligações peptídicas não-hidrolizáveis são conhecidas na técnica, junto com procedimentos de síntese de peptídeos contendo tais ligações. Ligações não-hidrolizáveis exemplares incluem -[CH2NH]- ligações de peptídeo de 25 amida reduzida, --[COCH2]-- ligações de peptídeo de cetometileno, -- [CH(CN)NH]-- ligações de peptídeo (cianometileno)amino, --[CH2CH(OH)]-- ligações de peptídeo de hidroxietileno, --[CH20]--Iigações peptídicas, e -- [CH2S]- ligações de peptídeo de tiometileno (ver, por exemplo, U.S. Pat. N0 6.172.043).
Em outra modalidade, o antagonista de IL-13 ou IL-4 é derivado
de uma lipocalina, por exemplo, uma Iipocalina estrutural humana. Receptores Solúveis Uma forma solúvel de um receptor de IL-13 ou IL-4 ou uma cito- cina antagonística modificada podem ser usadas isoladas ou funcionalmente ligadas (por exemplo, pela ligação química, fusão polipeptídica ou gênica, associação não-covalente ou de outra maneira) a uma segunda porção, por 5 exemplo, um domínio Fc da imunoglobulina, albumina sérica, pegilação, uma GST, Lex-A ou uma seqüência polipeptídica de MBP. Como usado neste pedido, uma "proteína de fusão" refere-se a uma proteína que contém dois ou mais associados operacionalmente, por exemplo, ligados, porções, por exemplo, porções proteicas. Tipicamente, as porções são covalentemente 10 associadas. As porções podem ser diretamente associadas, ou conectadas através de um espaçadorou ligante.
As proteínas de fusão podem incluir adicionalmente uma se- qüência ligante que junta a primeira porção à segunda porção. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir um peptídeo ligante, por exemplo, um peptí- 15 deo ligante de aproximadamente 4 a 20, mais preferencialmente, 5 a 10, a- minoácidos em tamanho; o peptídeo ligante tem 8 aminoácidos em tamanho. Cada um dos aminoácidos no peptídeo ligante é selecionado a partir do gru- po composto de Gly, Ser, Asn, Thr e Ala; o peptídeo ligante inclui um ele- mento Gly-Ser. Em outras modalidades, a proteína de fusão inclui um peptí- 20 deo ligante e o peptídeo ligante inclui uma seqüência que tem a fórmula (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y em que y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
Em outras modalidades, seqüências adicionais de aminoácidos podem ser adicionadas ao N- ou C-terminal da proteína de fusão para facili- tar expressão, detecção e/ou isolamento ou purificação. Por exemplo, a pro- 25 teína de fusão do receptor pode ser ligada a uma ou mais porções adicio- nais, por exemplo, GST, etiqueta His6, etiqueta FLAG. Por exemplo, a prote- ína de fusão pode ser adicionalmente ligada a uma proteína de fusão GST em que as seqüências de proteína de fusão é fusionada ao C-terminal das seqüências da GST (isto é, glutationa S-transferase). Tais proteínas de fu- 30 são podem facilitar a purificação da proteína de fusão do receptor. Em outra modalidade, a proteína de fusão inclui uma seqüência de sinalização heteró- Ioga (isto é, uma seqüência polipeptídica que não está presente em um poli- peptídeo codificado por um ácido nucleico do receptor) no seu N-terminal. Por exemplo, a seqüência de sinalização de receptor nativa pode ser remo- vida e substituída com uma seqüência de sinalização de outra proteína. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamífero), 5 expressão e/ou secreção do receptor pode ser aumentada pelo uso de uma seqüência de sinalização heteróloga.
Uma proteína de fusão ou quimérica da invenção pode ser pro- duzida por técnicas de DNA recombinante padrão. Por exemplo, fragmentos de DNA de codificação para as diferentes seqüências polipeptídicas está 10 ligada enquadradas em conjunto conforme técnicas convencionais, por e- xemplo, pelo emprego de terminações de extremidade cega ("blunt-ended") ou extremidade balanceada ("stagger-ended") para ligação, digestão por enzima de restrição para fornecimento de terminações apropriadas, preen- chimento de extremidades coesivas como apropriado, tratamento com fosfa- 15 tase alcalina, para prevenir a junção indesejável, e ligação enzimática. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas con- vencionais incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamen- te, amplificação por PCR de fragmentos gênicos pode ser realizada usando iniciadores de ancoragem que dão origem a saliências complementares en- 20 tre dois fragmentos gênicos consecutivos que podem ser subsequentemente anelados e reamplificados para gerar uma seqüência gênica quimérica (ver, por exemplo, Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). Além disso, muitos vetores de expressão que codificam uma porção de fusão estão disponíveis comercialmente (por e- 25 xemplo, uma região Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina). Um re- ceptor que codifica ácido nucleico pode ser clonado em tal vetor de expres- são tal que a porção de fusão seja enquadrada ligada à proteína de imuno- globulina.
Em algumas modalidades, polipeptídeos de fusão existem como oligômeros, tais como dímeros ou trímeros.
Em outras modalidades, a porção polipeptídica do receptor é fornecida como um polipeptídeo do receptor de variantes que tem uma mu- tação na seqüência do receptor que ocorre naturalmente (tipo selvagem) que resulta em afinidade maior (em relação à seqüência não-mutada) a ligação do polipeptídeo do receptor à citocina.
Em outras modalidades, seqüências adicionais de aminoácidos 5 podem ser adicionadas ao N- ou C-terminal da proteína de fusão para facili- tar expressão, flexibilidade estérica, detecção e/ou isolamento ou purifica- ção. O segundo polipeptídeo é preferencialmente solúvel. Em algumas mo- dalidades, o segundo polipeptídeo aumenta a meia-vida, (por exemplo, a meia-vida sérica) do polipeptídeo ligado. Em algumas modalidades, o se- 10 gundo polipeptídeo inclui uma seqüência que facilita a associação do poli- peptídeo de fusão com um segundo polipeptídeo do receptor de BMP-10. Em modalidades, o segundo polipeptídeo inclui pelo menos uma região de um polipeptídeo da imunoglobulina. O polipeptídeo de fusão da imunoglobu- Iina é conhecido na técnica e é descrito em, por exemplo, U.S. Patent N0 15 5.516.964; 5.225.538; 5.428.130; 5.514.582; 5.714.147; e 5.455.165. Por exemplo, uma forma solúvel de um receptor de BMP-10 ou um peptídeo an- tagonístico a BMP-10 pode serfusionado a uma região constante da cadeia pesada dos vários isotipos, incluindo: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgAI, lgA2, IgD, e IgE). Tipicamente, a proteína de fusão pode incluir o domínio 20 extracelular de um receptor de BMP-10 humano, ou um pró-peptídeo de BMP-10 (ou uma seqüência homóloga a estes), e, por exemplo, fusionado a, uma cadeia de Fc da imunoglobulina humana, por exemplo, IgG humana (por exemplo, IgGI humana ou lgG2 humana, ou formas mutadas das mes- mas).
A seqüência de Fc pode ser mutada em um ou mais aminoáci-
dos para reduzir a função celular efetora, ligação do receptor de Fc e/ou ati- vidade de complemento. Métodos para alterar uma região constante do anti- corpo são conhecidos na técnica. Anticorpos com função alterada, por e- xemplo, afinidade alterada para um ligante efetor, tal como FcR em uma cé- 30 lula, ou componente C1 do complemento podem ser produzidos pela substi- tuição de pelo menos um resíduo de aminoácido na porção constante do anticorpo com um resíduo diferente (ver por exemplo, EP 388.151 Al, U.S. Pat. N0 5.624.821 e U.S. Pat. N0 5.648.260). Tipo similar de alterações pode ser descrito que se aplicado a murina, ou imunoglobulina de outras espécies reduziria ou eliminaria estas funções. Por exemplo, é possível alterar a afini- dade de uma região Fc de um anticorpo (por exemplo, uma IgG1 tal como 5 IgG humana) para um FcR (por exemplo R1 gama de Fe), ou para ligação de C1q pela substituição do resíduo(s) especificado com um resíduo(s) que tem uma funcionalidade apropriada na sua cadeia lateral, ou pela introdução de um grupo funcional carregado, tal como glutamato ou aspartato, ou possi- velmente um resíduo aromático não-polar, tal como fenilalanina, tirosina, 10 triptofano ou alanina (ver por exemplo, U.S. Pat. N0 5.624.821).
Em modalidades, o segundo polipeptídeo tem menos função efe- tora que a função efetora de uma região Fc de uma cadeia pesada da imu- noglobulina de tipo selvagem. A função efetora de Fc inclui, por exemplo, ligação ao receptor de Fe, fixação de complemento e atividade de depleção 15 de célula T (ver, por exemplo, U.S. Pat. N0 6.136.310). Métodos para anali- sar a atividade de depleção de célula T, função efetora de Fe, e estabilidade do anticorpo são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o segundo polipeptídeo tem baixa ou nenhuma afinidade detectável para o receptor de Fe. Em uma modalidade alternativa, o segundo polipeptídeo tem baixa ou 20 nenhuma afinidade detectável para a proteína de complemento C1q.
Será entendido que as moléculas de anticorpo e receptor solúvel ou proteína de fusão descritos neste pedido podem estar funcionalmente ligadas (por exemplo, por ligação química, fusão gênica, associação não- covalente ou de outra maneira) a uma ou outras entidades moleculares, tais 25 como um anticorpo (por exemplo, um anticorpo bispecífico ou um multiespe- cífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos ou citostáticos, entre ou- tros.
Antagonistas de Ácidos Nucleicos
Ainda em outra modalidade, o antagonista inibe a expressão de ácido nucleico que codifica uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R. E- xemplos de tais antagonistas incluem moléculas de ácidos nucleicos, por exemplo, moléculas antissenso, ribozimas, RNAi, moléculas de tripla hélice que hibridizam em um ácido nucleico que codifica uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R, ou uma região reguladora de trancrição, e bloqueia ou reduz a expressão de mRNA de uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R.
Em modalidades, antagonistas de ácidos nucleicos são usados 5 para reduzir a expressão de um gene endógeno que codifica uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R. Em uma modalidade, o antagonista de ácido nucleico é um siRNA que visa o mRNA que codifica uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R. Outros tipos de ácidos nucleicos antagonísticos também podem ser usados, por exemplo, um dsRNA, uma ribozima, uma hélice tripla 10 original, ou um ácido nucleico antissenso. Consequentemente, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas que são inibidores de ácidos nucleicos, por e- xemplo, antissenso, RNAi, para uma molécula de ácido nucleico que codifi- cada uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R são fornecidas.
Um ácido nucleico "antissenso" pode incluir uma seqüência nu- cleotídica que é complementar a um ácido nucleico "senso"que codifica uma proteína, por exemplo, complementar à fita de codificação de uma molécula de cDNA de dupla fita ou complementar a uma seqüência de mRNA. O ácido nucleico antissenso pode ser complementar a uma fita de codificação inteira de uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R, ou somente para uma porção das mesmas. Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico antissenso é antissenso a uma "região de não-codificação" da fita de codificação de uma seqüência nucleotídica que codifica uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R (por exemplo, as regiões não traduzidas 5' e 3'). Agentes antissen- so podem incluir, por exemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleobases (isto é, de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nu- cleotídeos), por exemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucle- obases, ou aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleobases. Com- postos antissenso incluem ribozimas, seqüência de orientação externa (EGS) oligonucleotídeos (oligozimas), e outros RNAs catalíticos curtos ou oligonucleotídeos catalíticos que hibridizam no ácido nucléico alvo e modula sua expressão. Compostos antissenso podem incluir um intervalo de pelo menos oito nucleobases consecutivas que são complementares a uma se- quência no gene alvo. Um oligonucleotídeo não precisa ser 100% comple- mentar à sua seqüência de ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo ao alvo interfere na função normal da molécula 5 alvo para causar uma perda da utilidade, e há um grau suficiente de com- plementaridade para prevenir a ligação não-específica do oligonucleotídeo a seqüências não-visadas sob condições nas quais a ligação específica é de- sejada, isto é, sob condições fisiológicas no caso de ensaios in vivo ou tra- tamento terapêutico ou, no caso de ensaios in vitro, sob condições nas quais 10 os ensaios são conduzidos. Hibridização de oligonucleotídeos antissenso com mRNA pode interferir em uma ou mais das funções normais de mRNA. As funções de mRNA a serem interferidas incluem todas as funções-chave tal como, por exemplo, a translocação do RNA para sítio de tradução protei- ca, tradução da proteína a partir do RNA, splicing do RNA para produzir uma 15 ou mais espécies de mRNA, e atividade catalítica que pode ser empregada pelo RNA. A ligação da proteína(s) específica ao RNA também pode ser in- terferida pela hibridização de oligonucleotídeo antissenso ao RNA.
Compostos antissenso exemplares incluem seqüências de DNA ou RNA que especificamente hibridizam no ácido nucleico alvo, por exemplo, o mRNA que codifica BMP-1 O/receptor de BMP-10. A região complementar pode estender-se entre aproximadamente 8 a aproximadamente 80 nucleo- bases. Os compostos podem incluir uma ou mais nucleobases modificadas. Nucleobases modificadas podem incluir, por exemplo, pirimidinas 5 substitu- ídas tais como 5-iodouracil, 5-iodocitosina, e C5-propinil pirimidinas, tais co- mo C5-propinilcitosina e C5-propiniluracila. Outras nucleobases modificadas adequadas incluem N4--(CrCi2) alquilaminocitosinas e N41N4--(CrCi2) dial- quilaminocitosinas. Nucleobases modificadas também podem incluir 8-aza-7- deazapurinas 7-substituídas e 7-deazapurinas 7-substituídas tais como, por exemplo, 7-iodo-7-deazapurinas, 7-ciano-7-deazapurinas, 7-aminocarbonil- 7-deazapurinas. Exemplos destas incluem 6-amino-7-iodo-7-deazapurinas, 6-amino-7-ciano-7-deazapurinas, 6-amino-7-aminocarbonil-7-deazapurinas, 2-amino-6-hidróxi-7-iodo-7-deazapurinas, 2-amino-6-hidróxi-7-ciano-7- deazapurinas, e 2-amino-6-hidróxi-7-aminocarbonil-7-deazapurinas. Além disso, N6--(C1-Ci2) alquilaminopurinas e N61N6-(Ci-Ci2) dialquilaminopurinas, incluindo N6-metilaminoadenina e N6,N6-dimetilaminoadenina, também são nucleobases modificadas adequadas. Semelhantemente outras purinas 6- 5 substituídas incluindo, por exemplo, 6-tioguanina pode constituir nucleoba- ses modificadas apropriadas. Outras nucleobases adequadas incluem 2- tiouracila, 8-bromoadenina, 8-bromoguanina, 2-fluoroadenina, e 2- fluoroguanina. Derivativos de quaisquer umas das nucleobases modificadas acima mencionadas também são apropriados. Substituintes de quaisquer 10 dos compostos precedentes podem incluir alquila C1-C30, alquenila C2-Cao, alquinil C2-C30, arila, aralquila, heteroarila, halo, amino, amido, nitro, tio, sul- fonila, carboxila, alcóxi, alquilcarbonila, alcoxicarbonila, e similares. Descri- ções de outros tipos de agentes de ácidos nucleicos também estão disponí- veis. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 4.987.071; 5.116.742; e 5.093.246; 15 Woolf et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA\ Antisense RNA and DNA, D.A. Melton, Ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1988); 89:7305-9; Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-59; Helene, C. (1991) Antieaneer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Aead. Sei. 660:27-36; e Maher (1992) Bioassays 14:807-15.
As moléculas de ácidos nucleicos antissenso da invenção são
tipicamente administradas a um indivíduo (por exemplo, pela injeção direta em um sítio tecidual), ou geradas in situ tal que hibridizam ou se ligam ao mRNA celular e/ou DNA genômico que codifica uma proteína BMP- 10/receptor de BMP-10 para inibir por meio disso a expressão da proteína, 25 por exemplo, pela inibição da transcrição e/ou tradução. Alternativamente, moléculas de ácidos nucleicos antissenso podem ser modificadas para visar células selecionadas e então administradas sistemicamente. Para adminis- tração sistêmica, moléculas antissenso podem ser modificadas tal que espe- cificamente se liguem a receptores ou antígenos expressos em uma superfí- 30 cie celular selecionada, por exemplo, pela ligação de moléculas de ácidos nucleicos antissenso a peptídeos ou anticorpos que se ligam a receptores de superfície celular ou antígenos. As moléculas de ácidos nucleicos antissenso também podem ser entregues às células usando os vetores descritos neste pedido. Para alcançar concentrações intracelulares suficientes das molécu- las antissenso, construtos de vetor em que a molécula de ácido nucleico an- tissenso é colocada sob controle de um promotor forte pol Il ou pol Ill são 5 preferidos.
Ainda em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico antis- senso da invenção é uma molécula de ácido nucleico α-anomérica. Uma mo- lécula de ácido nucleico α-anomérica forma híbridos de dupla fita específicos com o RNA complementar em que, ao contrário das habituais β-unidades, as 10 fitas correm paralelas reciprocamente (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). A molécula de ácido nucleico antissenso também pode compreender um 2’-o-metilrribonucleotídeo (Inoue et al. (1987) Nucleie Aeids Res. 15:6131-6148) ou um análogo quimérico de RNA-DNA (Inoue et al. (1987) FEBS. Lett. 215:327-330).
siRNAs são pequenos RNAs dupla fita (dsRNAs) que opcional-
mente incluem saliências. Por exemplo, a região dúplex de um siRNA é a- proximadamente 18 a 25 nucleotídeos em tamanho, por exemplo, aproxima- damente 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 nucleotídeos em tamanho. Tipicamente, as seqüências de siRNA são exatamente complementares ao mRNA alvo. 20 dsRNAs e siRNAs em particular podem ser usados para silenciar a expres- são gênica em células de mamíferos (por exemplo, células humanas). siR- NAs também incluem grampos curtos de RNA (shRNAs) com 29 pares de bases no cerne e 2 nucleotídeos na saliência 3’. Ver, por exemplo, Clemens et al. (2000) Proe. NatL Aead. Sei. USA 97:6499-6503; Billy et al. (2001) 25 Proc. Natl. Sei. USA 98:14428-14433; Elbashir et al. (2001) Nature. 411:494- 8; Yang et al. (2002) Proc. Natl. Aead. Sei. USA 99:9942-9947; Siolas et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23 (2):227-31; 20040086884; U.S. 20030166282; 20030143204; 20040038278; e 20030224432.
Ainda em outra modalidade, um ácido nucleico antissenso da invenção é uma ribozima. Uma ribozima tendo especificidade por uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R que codifica ácido nucleico pode incluir uma ou mais seqüências complementares à seqüência nucleotídica de uma cD- NA de IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R reveladas neste pedido, e uma seqüência tendo seqüência catalítica responsável pela clivagem do mRNA conhecida (ver U.S. Pat. N0 5.093.246 ou Haselhoff and Gerlach (1988) Na- ture 334:585-591). Por exemplo, um derivativo de um RNA de Tetrahymena 5 L-19 IVS pode ser construído no qual a seqüência nucleotídica do sítio ativo é complementar à seqüência nucleotídica a ser clivada em um mRNA que codifica BMP-IO/receptor de BMP-10. Ver, por exemplo, Cech et al. U.S. Pa- tent N0 4.987.071; e Cech et al. U.S. Patent N0 5.116.742. Alternativamente, o mRNA de BMP-1 O/receptor de BMP-10 pode ser usado para selecionar um 10 RNA catalítico que tem uma atividade de ribonuclease específica a partir de um agrupamento de moléculas de RNA. Ver, por exemplo, Bartel, D. e Szos- tak, J.W. (1993) Science 2^ : 1411-1418.
a expressão gênica de uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL- 4R pode ser inibida visando seqüências nucleotídicas complementares à região regulatória de uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R (por exem- plo, os promotores e/ou potencializadores de uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R) para formar estruturas helicoidais triplas que evitam a trans- crição do gene de uma IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R em células alvo. Ver geralmente, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; He- Iene, C. I. (1992) Ann. N.Y. Aead. Sei. 660:27-36; e Maher, LJ. (1992) Bioas- says 14:807-15. As seqüências potenciais que podem ser visadas para a formação de tripla hélice podem ser aumentadas pela criação de uma cha- mada molécula de ácido nucleico "switchback". Moléculas switchback são sintetizadas de uma maneira de alternância 5'-3‘, 3'-5', tal que o par de base com a primeira fita simples de um dúplex e então ao outro, eliminando a ne- cessidade de um estiramento relativamente grande de purinas ou de pirimi- dinas para estar presentes em uma fita de um dúplex.
A invenção também fornece iniciador de oligonucleotídeo mar- cado detectável e moléculas de sonda. Tipicamente, tais marcadores são quimioluminescentes, fluorescentes, radioativos, ou colorimétricos.
Uma molécula de ácido nucleico de IL-13 ou IL-13R, ou uma IL-4 ou IL-4R pode ser modificada na porção da base, porção do açúcar ou es- queleto de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, hibridização, ou solubilidade da molécula. Para exemplos não-limitantes dos oligonucleo- tídeos sintéticos com modificações, ver Toulmé (2001) Nature Biotech. 19:17 e Faria et al. (2001) Nature Biotech. 19:40-44. Tais oligonucleotídeos fosfo- 5 ramiditas podem ser agentes antissenso eficazes.
Por exemplo, o esqueleto de fosfato da desoxirribose das molé- culas de ácidos nucleicos pode ser modificado para gerar ácidos nucleicos peptídicos (ver Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5- 23). Como usado neste pedido, os termos "ácido nucleico peptídico" ou 10 'PNA" refere-se a um ácido nucleico mimético, por exemplo, um DNA mimé- tico, no qual o esqueleto de fosfato da desoxirribose é substituído por um esqueleto pseudopeptídico e somente quatro nucleobases naturais são con- servadas. O esqueleto neutro de um PNA pode levar em conta a hibridiza- ção específica a DNA e RNA sob condições de baixa força iônica. A síntese 15 de oligômeros de PNA pode ser realizada usando protocolos de síntese pep- tídica de fase sólida padrão como descrito em Hyrup B. et al. (1996) supra and Perry-OKeefe et al. Proc. Natl. Aead. Sei. 93: 14670-675.
PNAs podem ser usados em aplicações terapêuticas e diagnos- ticas. Por exemplo, PNAs podem ser usados como agentes antissenso ou 20 antigênicos para modulação específica para a seqüência da expressão gêni- ca por, por exemplo, indução da parada da transcrição ou tradução ou inibi- ção da replicação. PNAs de moléculas de ácidos nucleicos também podem ser usados na análise de mutações únicas em par de base em um gene, (por exemplo, por PCR de fixação dirigida ao PNA); como 'enzimas de restri- 25 ção artificiais' quando usadas em combinação com outras enzimas, (por e- xemplo, nucleases S1 (Hyrup B. et al. (1996) supra))·, ou como sondas ou iniciadores para sequenciamento ou hibridização de DNA (Hyrup B. et al. (1996) supra; Perry-0’Keefe supra).
Em outras modalidades, o oligonucleotídeo pode incluir outros grupos anexados, tais como peptídeos (por exemplo, para visar receptores de célula hospedeira in vivo), ou agentes facilitadores de transporte através da membrana celular (ver, por exemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Aead. Sei. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Aead. Sei. USA 84:648-652; W088/09810) ou na barreira hematoencefálica (ver, por exemplo, WO 89/10134). Além disso, os oligonucleotídeos podem ser modi- ficados com agentes de clivagem provocada por hibridização (ver, por e- 5 xemplo, Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) ou agentes intercalan- tes {Ver, por exemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para este fim, o oligonucleotídeo pode ser conjugado a outra molécula, (por exemplo, um peptídeo, agente de ligação cruzada provocada por hibridização, agente de transporte, ou agente de clivagem provocado por hibridização).
Produção do Agente de Ligação
Algumas moléculas de anticorpo, por exemplo, Fabs, ou agentes de ligação podem ser produzidos em células bacterianas, por exemplo, célu- las de E. coli. Por exemplo, se Fab é codificado por seqüências em um vetor de exposição de fago que incluí um códon de parada supressível entre a en- 15 tidade de exposição e uma proteína bacteriófaga (ou fragmento da mesma), o ácido nucleico vetor pode ser transferido a uma célula bacteriana que não pode suprimir um códon de parada. Neste caso, a Fab não é fusionada à proteína do gene Ill e é secretada no periplasma e/ou no meio.
Moléculas de anticorpo também podem ser produzidas em célu- Ias eucarióticas. Em uma modalidade, os anticorpos (por exemplo, scFv’s) são expressos em uma célula de levedura, tal como Piehia (ver, por exem- plo, Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251: 123-35), Hanseula, ou Saeeharomiees.
Em uma modalidade, moléculas de anticorpo são produzidas em 25 células de mamíferos. Células hospedeiras de mamíferos típicas para ex- pressar os anticorpos de clone ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos incluem Ovário de Hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr', descritas em Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Aead. Sei. USA 77:4216-4220, usado com um marcador selecionável DHFR, por exem- 30 pio, como descrito em Kaufman and Sharp (1982) MoL Biol. 159:601-621), linhagens celulares linfocíticas, por exemplo, células de mieloma NSO e célu- las SP2, células COS, e uma célula de um animal transgêníco, por exemplo, um mamífero transgênico. Por exemplo, a célula é uma célula epitelial ma- mária.
Além das seqüências de ácidos nucleicos que codificam a molé- cula de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes podem transpor- 5 tar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens da replicação) e ge- nes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a sele- ção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver, por exem- plo, U.S. Patents Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipi- 10 camente o gene de marcador selecionável confere a resistência a drogas, tais como G418, higromicina, ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido.
Em um sistema exemplar da expressão de recombinante de uma molécula de anticorpo, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo como a cadeia leve do anticorpo são in- troduzidas em células CHO dhfr' pela transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes da cadeia pe- sada e leve do anticorpo estão cada um operacionalmente ligados a elemen- tos regulatórios potencializadores/promotores (por exemplo, derivados de SV40, CMV1 adenovirus e similares, tais como um elemento regulatório po- tencializador de CMV/promotor de AdMLP ou um elemento regulatório po- tencializador de SV40/promotor de AdMLP) para levar a altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também trans- porta um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção/amplificação com metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas podem ser cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Técnicas de biologia mole- cular padrão podem ser usadas para preparação do vetor de expressão re- combinante, transfecção das células hospedeiras, seleção dos transforman- tes, cultivo das células hospedeiras e recuperação da molécula de anticorpo a partir do meio de cultura. Por exemplo, algumas moléculas de anticorpo podem ser isoladas por cromatografia de afinidade com uma matriz ligada a Proteína A ou Proteína G.
Para moléculas de anticorpo que incluem um domínio Fe, o sis- tema de produção de anticorpo preferencialmente sintetiza anticorpos nos 5 quais a região Fc é glicosilada. Por exemplo, o domínio Fc de moléculas IgG é glicosilada na asparagina 297 no domínio CH2. Esta asparagina é o sítio para modificação com oligossacarídeos do tipo biantenário. Foi demonstrado que esta glicosilação é necessária para funções efetoras mediadas por re- ceptores de Fcy e complemento C1q (Burton and Woof(1992) Adv. Immunol. 10 51:1-84; Jefferis et ai (1998) Immunol. Rev. 163:59-76). Em uma modalida- de, o domínio Fc é produzido em um sistema de expressão de mamífero que glicosila apropriadamente o resíduo correspondente a asparagina 297. O domínio Fc também pode incluir outras modificações pós-traducionais euca- rióticas.
Moléculas de anticorpo também podem ser produzidas por um
animal transgênico. Por exemplo, U.S. Patent N0 5.849.992 descreve um método de expressão de um anticorpo na glândula mamária de um mamífero transgênico. Um transgene é construído incluindo um promotor específico para o leite e ácidos nucleicos que codificam a molécula de anticorpo e uma 20 seqüência de sinalização da secreção. O leite produzido por fêmeas de tais mamíferos transgênicos inclui, secretado nelas, o anticorpo de interesse. A molécula de anticorpo pode ser purificada a partir do leite, ou para algumas aplicações, usada diretamente.
Caracterização dos Agentes de Ligação As propriedades de ligação de um agente de ligação podem ser
medidas por qualquer método, por exemplo, um dos seguintes métodos: a- nálise BIACORE™, Ensaio Imunoabsorvente de Ligação de Enzimas (ELI- SA), cristalografia de raio X, análise de seqüência e mutagênese de varredu- ra. A capacidade de uma proteína de neutralizar e/ou inibir uma ou mais ati- 30 vidades associadas à IL-13 pode ser medida pelos seguintes métodos: en- saios para medida da proliferação de uma linhagem celular dependente de IL-13, por exemplo, TFI; ensaios para medir a expressão de polipeptídeos mediados por IL-13, por exemplo, análise citométrica de fluxo da expressão de CD23; ensaios de avaliação da atividade de moléculas sinalizadoras a jusante, por exemplo, STAT6; ensaios de avaliação da produção de tenasci- na; ensaios para testar a eficiência de um anticorpo descrito neste pedido 5 para prevenir asma em um modelo animal relevante, por exemplo, macaco cinomolgus, e outros ensaios. Um agente de ligação à IL-13, particularmente uma molécula de anticorpo para IL-13, pode ter um efeito estatisticamente significante em um ou mais destes ensaios. Ensaios exemplares de proprie- dades de ligação incluem o seguinte.
A interação de ligação de um agente de ligação à IL-13 ou IL-4 e
um alvo (por exemplo, IL-13 ou IL-4) pode ser analisada usando ressonância de plásmon de superfície (SPR). SPR ou Análise de Interação Biomolecular (BIA) detectam interações biospecíficas em tempo real, sem qualquer mar- cação dos interagentes. Modificações na massa na superfície de ligação (in- 15 dicativo de um evento de ligação) do chip de BIA resultam em alterações do índice refrativo da Iuz próxima à superfície. As modificações na refratividade geram um sinal detectável, que é medido como uma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas. Métodos para uso de SPR são descritos, por exemplo, em U.S. Patent N0 5.641.640; Raether (1988) Surfa- 20 ce Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczki (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 e fon- tes online fornecem por BIAcore Internacional AB (Uppsala, Sweden).
Informação a partir de SPR pode ser usada para fornecer uma medida acurada e quantitativa da constante de dissociação de equilíbrio 25 (Kd)1 e parâmetros cinéticos, incluindo Kon e Koff, para a ligação de uma mo- lécula a um alvo. Tais dados podem ser usados para comparar moléculas diferentes. Informação a partir de SPR também pode ser usada para desen- volver relações de atividade-estrutura (SAR). Por exemplo, os parâmetros de ligação cinética e de equilíbrio da molécula de anticorpo diferente podem ser 30 avaliados. Aminoácidos variantes em posições dadas podem ser identifica- dos que se correlacionam com determinados parâmetros de ligação, por e- xemplo, alta afinidade e baixo K0ff. Esta informação pode ser combinada com modelagem estrutural (por exemplo, usando modelagem de homologia, mi- nimização energética, ou determinação estrutural por cristalografia de raio X ou RMN). Como resultado, uma dedução da interação física entre a proteína e seu alvo pode ser formulada e usada para guiar outros processos de proje- to.
Desordens Respiratórias
Um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser usado para tratar ou prevenir desordens respiratórias incluindo, mas não são limitadas à asma (por exemplo, asma alérgica e não-alérgica (por exemplo, devido à infecção, por exemplo, com o vírus sincicial respiratório (RSV), por exemplo, em crian- ças mais jovens)); bronquite (por exemplo, bronquite crônica); doença pul- monar obstrutiva crônica (DPOC) (por exemplo, enfisema (por exemplo, en- fisema induzido pelo cigarro); condições que envolvem inflamação das vias aéreas, eusinofilia, fibrose e produção excessiva de muco, por exemplo, fi- brose cística, fibrose pulmonar, e rinite alérgica. Por exemplo, um agente de ligação à IL-13 (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL-13) pode ser administrado em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a desordem ou melhorar pelo menos um sintoma da desordem.
Asma pode ser provocada por muitas condições, por exemplo, inalação de um alergênio, presença de uma infecção respiratória superior ou infecção de ouvido, etc. (Opperwall (2003) Nurs. Clin. North Am. 38:697- 711). Asma alérgica é caracterizada pela hipersensibilidade das vias aéreas (AHR) a uma variedade de estímulos específicos e não-específicos, imuno- globulina E sérica elevada (IgE), produção excessiva de muco nas vias aé- reas, edema, e injúria epitelial brônquica (Wills-Karp, supra). Asma alérgica começa quando o alergênio provoca uma resposta inicial imediata das vias aéreas, que é freqüentemente seguida várias horas após por uma resposta retardada das vias aéreas em fase tardia (LAR) (Henderson et aí. (2000) J. Immunol. 164:1086-95). Durante a LAR, há um influxo de eusinófilos, linfóci- tos, e macrófagos por todas as partes da parede das vias aéreas e no fluido brônquico. (Henderson et ai, supra). Eusinofilia pulmonar é uma caracterís- tica da asma alérgica e é responsável pela maior parte do dano ao epitélio respiratório (Li et ai (1999) J. Immunol. 162:2477-87).
Células T auxiliares (Th) CD4+ são importantes para inflamação crônica associada com asma (Henderson et al., supra). Vários estudos mos- traram aquele comprometimento de células CD4+ com células T auxiliares tipo 2 (Th2) e a produção subsequente de citocinas tipo 2 (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13) são importantes na resposta inflamatória alérgica levan- do a AHR (Tomkinson et ai (2001) J. Immunol. 166:5792-5800, e referências citadas neste pedido). Em primeiro lugar, mostrou-se que células T CD4+ são necessárias para asma induzida por alergia em modelos murinos. Em segundo lugar, células T CD4+que produzem citocinas tipo 2 sofrem a ex- pansão não somente nestes modelos animais mas também em pacientes com asma alérgica. Em terceiro lugar, níveis de citocina tipo 2 são aumenta- dos nos tecidos das vias aéreas de modelos animais e asmáticos. Em quarto lugar, citocinas de Th2 estão envolvidas desempenhando um papel central no recrutamento de eusinófilos em modelos murinos de asma alérgica, e adotivamente transferidas às células Th2 foram correlacionadas com níveis aumentados de eotaxina (um potente quimioatrativo de eusinófilos) no pul- mão bem como eusinofilia pulmonar (Wills-Karp etal., supra; Li et ai, supra).
Os métodos para tratamento ou prevenção da asma descritos neste pedido incluem aqueles para asma extrínseca (também conhecido como asma alérgica ou asma atópica), asma intrínseca (também conhecido como asma não-alérgica ou asma não-atópica) ou combinações de ambas, que foi mencionada como asma variada. Asma extrínseca ou alérgica inclui incidentes causados por, ou associados com, por exemplo, alergênios, tais como pólens, esporos, gramas ou ervas, descamação do pelo de animais domésticos, poeira, ácaros, etc. Como alergênios e outros irritantes apresen- tam-se em pontos variáveis no ano, estes tipos de incidentes também são tratados como asma sazonal. Também incluído no grupo da asma extrínseca é asma brônquica e aspergilose broncopulmonar alérgica. Desordens que podem ser tratadas ou aliviadas pelos agentes
descritos neste pedido incluem aquelas desordens respiratórias e asma cau- sada por agentes infecciosos, tais como vírus (por exemplo, vírus de frio e gripe, vírus sincicial respiratório (RSV)1 paramixovírus, rinovírus e vírus influ- enza. Infecções de RSV, rinovírus e vírus de gripe são comuns em crianças, e são uma das principais causas que levam a doenças do trato respiratório em crianças e crianças jovens. Crianças com bronquiolite viral podem de- senvolver chiado crônico e asma, que pode ser tratados usando os métodos descritos neste pedido. Também são incluídas as condições asmáticas que podem ser ocasionadas em alguns asmáticos pelo exercício e/ou ar frio. Os métodos são úteis para asmas associadas com exposição de fumaça (por exemplo, induzida por cigarro e fumaça industrial), bem como exposições industriais e ocupacionais, tais como fumaça, ozônio, gases nocivos, dióxido de enxofre, óxido nitroso, fumos, incluindo isocianatos, a partir de tinta, plás- ticos, poliuretanos, vernizes, etc., madeira, planta ou outros poeiras orgâni- cas, etc. Os métodos também são úteis para incidentes asmáticos associa- dos com aditivos alimentares, conservantes ou agentes farmacológicos. Também são incluídos métodos para tratamento, inibição ou alívio dos tipos de asma mencionados como asma silenciosa ou asma variante tussígena.
Os métodos revelados neste pedido também são úteis para tra- tamento e alívio da asma associada com refluxo gastroesofágico (DRGE), que pode estimular broncoconstrição. DRGE, junto com secreções corpó- reas retidas, tosse suprimida, e exposição a alergênios e irritantes no quarto pode contribuir para condições asmáticas e foi coletivamente tratada como asma do período da noite ou asma noturna. Em métodos de tratamento, ini- bição ou alívio da asma associada com DRGE, uma quantidade farmaceuti- camente eficaz do antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser usada como descrito neste pedido em combinação com uma quantidade farmaceutica- mente eficaz de um agente para tratamento de DRGE. Estes agentes inclu- em, mas não são limitados a, agentes de inibição de bomba protônica como PROTONIX®, pastilhas de liberação retardada de pantoprazol de sódio, PRI- LOSEC®, cápsulas de liberação retardada de omeprazol, ACIPHEX®, pasti- lhas de liberação retardada de rebeprazol de sódio ou PREVACID®, cápsu- las de liberação retardada de lansoprazol. Desordens Atópicas e Sintomas Das Mesmas Foi observado que as células a partir de pacientes atópicos tem sensibilidade aumentada à IL-13. Consequentemente, um antagonista de IL- 13 e/ou de IL-4 pode ser administrado em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir uma desordem atópica. "Atópico" refere-se a um grupo de doen- ças no qual há muitas vezes uma tendência herdada de desenvolver uma reação alérgica.
Exemplos de desordens atópicas incluem alergia, rinite alérgica, dermatite atópica, asma e febre do feno. Asma é uma desordem fenotipica- mente heterogênea associada com sintomas respiratórios intermitentes tais como, por exemplo, hipersensibilidade brônquica e obstrução do fluxo de ar reversível. Características imuno-histopatológicas da asma incluem, por e- xemplo, desnudação do epitélio das vias aéreas, deposição de colágeno sob a membrana basal; edema; ativação de mastócito; e infiltração celular infla- matória (por exemplo, por neutrófilos, eusinófilos, e linfócitos). Inflamação das vias aéreas pode contribuir, além disso, para hiperresponsividade das vias aéreas, limitação do fluxo de ar, broncoconstrição aguda, formação de rolhas de muco, remodelamento da parede das vias aéreas, e outros sinto- mas respiratórios. Um agente de ligação à IL-13 (por exemplo, um agente de ligação à IL-13, tal como uma molécula de anticorpo descrita neste pedido) pode ser administrado em uma quantidade eficaz para melhorar um ou mais destes sintomas.
Sintomas de rinite alérgica (febre do feno) incluem prurido, cori- za, espirro, ou congestão nasal, e olhos prurientes. Um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser administrado para melhorar um ou mais destes sinto- mas. Dermatite atópica é uma doença crônica (de longa duração) que afeta a pele. Informação sobre a dermatite atópica está disponível, por exemplo, em NIH Publication N0 03-4272. Na dermatite atópica, a pele pode ficar ex- tremamente pruriente, levando a vermelhidão, inchaço, ressecamento, fluido exudativo límpido, e finalmente, encrostamento e descamação. Em muitos casos, há períodos de tempo quando a doença é pior (chamado exacerba- ção ou surtos) seguido por períodos onde a pele melhora ou se resolve intei- ramente (chamado remissões). Dermatite atópica é muitas vezes referida como "eczema", que é um termo geral para vários tipos de inflamação da pele. Dermatite atópica é a mais comum dos muitos tipos de eczema. Exem- plos de dermatite atópica incluem: eczema de contato alérgico (dermatite: uma reação avermelhada, pruriente, exudativa onde a pele entrou em conta- to com uma substância que o sistema imune reconhece como estranha, tal como hera venenosa ou certos conservantes em cremes e loções); eczema de contato (uma reação localizada que inclui vermelhidão, prurido e ardência onde a pele entrou em contato com um alergênio (uma substância causado- ra de alergia) ou com um irritante, tal como um ácido, um agente de limpeza, ou outro produto químico); eczema desidrótico (irritação da pele nas palmas das mãos e solas dos pés caracterizada por bolhas límpidas, profundas que coçam e ardem); neurodermatite (lesões escamosas da pele na cabeça, pernas, pulsos, ou antebraços causados por um prurido localizado (tais co- mo uma mordida de inseto) que ficam intensamente irritados quando coça- das); eczema numular (manchas em forma de moeda de pele irritada -mais comum nos braços, costas, nádegas, e pernas- que podem ser encrostadas, escamosas, e extremamente prurientas); eczema seborreico (manchas ama- reladas, oleosas, escamosas da pele no couro cabeludo, rosto, e ocasional- mente outras partes do corpo). Sintomas adicionais particulares incluem dermatite permanente, prega atópica (prega de Dennie-Morgan), queilitis, palmas hiperlineares, pálpebras hiperpigmentadas (pálpebras que ficaram escurecidas a partir da inflamação ou febre do feno), ictiose, ceratose pilar, liquenificação, pápulas, e urticária. Um antagonista de IL-13 ou de IL-4 pode ser administrado para melhorar um ou mais destes sintomas. Um método exemplar para tratamento da rinite alérgica ou outra
desordem alérgica pode incluir a terapia de iniciação com um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 antes da exposição a um alergênio, por exemplo, antes de exposição sazonal a um alergênio, por exemplo, antes de flores alergênicas. Tal terapia pode incluir uma ou mais doses, por exemplo, doses em interva- Ios regulares. Câncer
IL-13 e seus receptores podem estar envolvidos no desenvolvi- mento de pelo menos alguns tipos de câncer, por exemplo, câncer derivado de células hematopoiéticas ou um câncer derivado de células cerebrais ou neuronais (por exemplo, um glioblastoma). Por exemplo, bloqueio da via de sinalização da IL-13, por exemplo, através do uso de um receptor de IL-13 solúvel ou um camundongo deficiente em STAT6-/-, leva ao início tumoral retardado e/ou crescimento de linhagens celulares de Iinfoma de Hodgkin ou um carcinoma mamário metastático, respectivamente (Trieu et al. (2004) Câncer Res. 64: 3271-75; Ostrand-Rosenberg et al. (2000) J. Immunol. 165: 6015-6019). Cânceres que expressam IL-13R(2 (Husain and Puri (2003) J. Neurooncol. 65:37-48; Mintz et al. (2003) J. Neurooncol. 64:117-23) podem ser especificamente visados por anticorpos anti-IL-13 descritos neste pedido. Antagonistas de IL-13 podem ser úteis para inibir a proliferação celular do câncer ou outra atividade celular do câncer. Um câncer refere-se a uma ou mais células que tem uma perda da responsividade a controles normais de crescimento, e tipicamente prolifera com regulação reduzida em relação a uma célula normal correspondente.
Exemplos de cânceres contra os quais antagonistas de IL-13 (por exemplo, um agente de ligação à IL-13, tais como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito neste pedido) podem ser usados para tratamento, incluem leucemias, por exemplo, leucemia linfocítica crôni- ca de célula B, leucemia mieloide aguda e células T transformadas pelo ví- rus de leucemia de célula T humana tipo 1 (HTLV-1); linfomas, por exemplo, Iinfoma de célula T, Iinfoma de Hodgkin; glioblastomas; cânceres pancreáti- cos; carcinoma de célula renal; carcinoma ovariano; sarcoma de Kaposi- AIDS, e câncer de mama (como descrito em Aspord, C. et al. (2007) JEM 204:1037-1047). Por exemplo, um agente de ligação à IL-13 (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL-13) pode ser administrado em uma quan- tidade eficaz para tratar ou prevenir a desordem, por exemplo, reduzir a pro- liferação celular, ou melhorar pelo menos um sintoma da desordem. Fibrose
Antagonistas de IL-13 e/ou de IL-4 também podem ser úteis no tratamento de inflamação e fibrose, por exemplo, fibrose do fígado. Produ- ção de IL-13 foi correlacionada com a progressão da inflamação hepática (por exemplo, hepatite viral) em direção à cirrose, e possivelmente, carcino- ma hepatocelular (de Lalla etal. (2004) J. Immunol. 173:1417-1425). Fibrose ocorre, por exemplo, quando tecido normal é substituído pelo tecido cicatri- zado, muitas vezes após inflamação. Ambos os vírus de hepatite B e hepati- te C causam uma reação fibrótica no fígado, que pode para cirrose. Cirrose, por sua vez, pode desenvolver-se em complicações severas, tais como fa- lência hepática ou carcinoma hepatocelular. Bloqueio da atividade de IL-13 usando antagonistas de IL-13 e/ou de IL-4 descritos neste pedido pode re- duzir a inflamação e a fibrose, por exemplo, inflamação, fibrose, e cirrose associada com doenças hepáticas, especialmente hepatites B e C. Por e- xemplo, o antagonista(s) pode ser administrado em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a desordem ou melhorar pelo menos um sintoma e/ou desordem fibrótica inflamatória. Doença Inflamatória Intestinal
Doença inflamatória intestinal (DII) é o nome geral de doenças que causam a inflamação dos intestinos. Dois exemplos de doença inflama- tória intestinal são doença de Crohn e colite ulcerativa. Foi encontrado que sinalização de IL-13/STAT6 está envolvida na hipercontratividade de múscu- Io liso de camundongo induzida por inflamação, um modelo de doença infla- matória intestinal (Akiho et ai. (2002) Am. J. Phisiol. Gastrointest. Liver Phi- siol. 282:G226-232). Por exemplo, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 po- de ser administrado em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a de- sordem ou melhorar pelo menos um sintoma da desordem inflamatória intes- tinal.
Composições Farmacêuticas
Antagonistas de IL-13 e/ou de IL-4 (tais como os descritos neste pedido) podem ser usados in vitro, ex vivo, ou in vivo. Podem ser incorpora- dos em uma composição farmacêutica, por exemplo, pela combinação do agente de ligação à IL-13 com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal composição pode conter, além do agente de ligação à IL-13 e veículo, vários diluentes, enchedores, sais, tampões, estabilizadores, solubilizantes, e ou- tros materiais bem conhecidos na técnica. Materiais farmaceuticamente acei- táveis são geralmente um material não-tóxico que não interfere na eficácia da atividade biológica de um agente de ligação à IL-13. As características do veículo podem depender da via da administração.
A composição farmacêutica descrita neste pedido também pode
conter outros fatores, tais como, mas não limitados a, outras moléculas de anticorpo para anti-citocina ou outros agentes anti-inflamatórios como descri- to mais detalhadamente abaixo. Tais fatores e/ou agentes adicionais podem estar incluídos na composição farmacêutica para produzir um efeito sinergís- tico com um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 descritos neste pedido. Por exemplo, no tratamento da asma alérgica, uma composição farmacêutica descrita neste pedido pode incluir moléculas de anticorpo anti-IL-4 ou drogas conhecidas para reduzir uma resposta alérgica.
A composição farmacêutica descrita neste pedido pode estar na forma de um Iipossoma no qual um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4, tal como descrito neste pedido é combinado, além de outros veículos farmaceu- ticamente aceitáveis, com agentes anfipáticos, tais como lipídios que exis- tem na forma agregada como micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, ou camadas Iamelares enquanto em solução aquosa. Lipídios ade- quados para formulação Iipossomal incluem, sem restrição, monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfatídeos, lisolecitina, fosfolipídios, saponina, ácidos biliares, e similares. Métodos exemplares para preparar tais formulações Iipossomais incluem métodos descritos em U.S. Patent Nos. 4.235.871; 4.501.728; 4.837.028; e 4.737.323. Como usado neste pedido, o termo "quantidade terapeuticamen-
te eficaz" significa a quantidade total de cada componente ativo da composi- ção farmacêutica ou método que é suficiente para mostrar um benefício sig- nificativo ao paciente, por exemplo, melhoria dos sintomas, cura, ou aumen- to na taxa de cura de tais condições. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual, administrado isolado, o termo refere-se àquele ingrediente sozi- nho. Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, se administrado em combinação, serialmente ou simultaneamente.
Administração de um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 usado na composição farmacêutica pode ser realizada de várias formas convencio- nais, tais como ingestão oral, inalação, ou injeção cutânea, subcutânea, ou intravenosa. Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anta- gonista de IL-13 e/ou de IL-4 é administrada por injeção intravenosa, cutâ- nea ou subcutânea, o agente de ligação pode ser preparado como solução aquosa parenteralmente aceitável, livre de pirogênicos. A composição de tais soluções proteicas parenteralmente aceitáveis pode ser adaptada tendo em vista fatores, tais como pH, isotonicidade, estabilidade, e similares, por exemplo, para otimizar a composição em condições fisiológicas, estabilidade de agente de ligação, e similares. Uma composição farmacêutica para inje- ção intravenosa, cutânea, ou subcutânea pode conter, por exemplo, um veí- culo isotônico, tal como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Inje- ção de Dextrose, Injeção de Cloreto de Sódio e Dextrose, Injeção de Ringer com Lactato, ou outro veículo como conhecido na técnica. A composição farmacêutica também pode conter estabilizantes, conservantes, tampões, antioxidantes, ou outro aditivo.
A quantidade de um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 na com- posição farmacêutica pode depender da natureza e severidade da condição que é tratada, e da natureza de tratamentos prévios que o paciente sofreu. A composição farmacêutica pode ser administrada a pacientes normais ou pa- cientes que não mostram sintomas, por exemplo, de um modo profilático. Um médico assistente pode decidir a quantidade de antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 com a qual tratar cada paciente individual. Por exemplo, um médico assistente pode administrar doses pequenas do antagonista e ob- servar a resposta do paciente. Doses maiores do antagonista podem ser administradas até que o efeito terapêutico ótimo seja obtido para o paciente, e naquele ponto, geralmente, a dosagem não é aumentada adicionalmente. Por exemplo, um produto farmacêutico pode conter entre aproximadamente 0,1 mg e 50 mg de anticorpo por kg de peso corporal, por exemplo, entre aproximadamente 0,1 mg e 5 mg ou entre aproximadamente 8 mg e 50 mg de anticorpo por kg de peso corporal. Em uma modalidade na qual o anticor- po é entregue subcutaneamente em uma freqüência de não mais que duas vezes por mês, por exemplo, uma semana sim, uma semana não ou men- salmente, a composição inclui uma quantidade de aproximadamente 0,7 a 3,3, por exemplo, 1,0 a 3,0 mg/kg, por exemplo, aproximadamente 0,8 a 1,2, 1,2 a 2,8, ou 2,8 a 3,3 mg/kg.
A duração da terapia usando a composição farmacêutica pode variar, dependendo da severidade da doença que é tratada e a condição e potencial resposta idiossincrásica de cada paciente individual. Em uma mo- dalidade, o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 também pode ser administrado através da via subcutânea, por exemplo, na faixa de uma vez por semana, uma vez cada 24, 48, 96 horas, ou não mais freqüentemente do que tais in- tervalos. Dosagens exemplares podem estar na faixa de 0,1 a 20 mg/kg, mais preferencialmente 1 a 10 mg/kg. O agente pode ser administrado, por exemplo, por infusão intravenosa a uma taxa de menos de 20, 10, 5, ou 1 mg/minuto para alcançar uma dose de aproximadamente 1 a 50 mg/m2 ou aproximadamente 5 a 20 mg/m2.
Em uma modalidade, uma administração de um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 ao paciente inclui a variação da dosagem da proteína, por exemplo, para reduzir ou minimizar efeitos colaterais. Por exemplo, ao indi- víduo pode ser administrada uma primeira dosagem, por exemplo, uma do- sagem menor que uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em um intervalo subsequente, por exemplo, pelo menos 6, 12, 24, ou 48 horas após, ao pa- ciente pode ser administrada uma segunda dosagem, por exemplo, uma do- sagem que é pelo menos 25, 50, 75, ou 100% maior do que a primeira do- sagem. Por exemplo, a segunda e/ou uma terceira, quarta e quinta dosa- gens comparáveis podem ser pelo menos aproximadamente 70, 80, 90, ou 100% de uma quantidade terapeuticamente eficaz. Inalação
Uma composição que inclui um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4
pode ser formulada para inalação ou outro modo de entrega pulmonar. O termo "tecido pulmonar" como usado neste pedido refere-se a qualquer teci- do do trato respiratório e inclui ambos os tratos respiratórios superior e infe- rior, exceto onde de outra maneira indicado. Um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser administrado em combinação com uma ou mais das moda- lidades existentes para tratar doenças pulmonares.
Em um exemplo, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 é formu-
lado para um nebulizador. Em uma modalidade, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser armazenado em uma forma Iiofilizada (por exemplo, à temperatura ambiente) e reconstituído na solução antes da inalação. É tam- bém possível formular um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 para inalação usando um dispositivo médico, por exemplo, um inalador. Ver, por exemplo, U.S. 6.102.035 (um inalador de pó) e 6.012.454 (um inalador de pó seco). O inalador pode incluir compartimentos separados para o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 em um pH adequado para o armazenamento e outro comparti- mento para um tampão de neutralização e um mecanismo para combinação do antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 com um tampão de neutralização ime- diatamente antes da atomização. Em uma modalidade, o inalador é um ina- lador de dose medida.
Os três sistemas comuns usados para entregar drogas local- mente às vias aéreas pulmonares incluem inaladores de pó seco (DPIs), ina- Iadores de dose medida (MDIs) e nebulizadores. MDIs, método mais popular da administração de inalação, pode ser usado para entregar medicamentos em uma forma solubilizada ou como uma dispersão. Tipicamente MDIs com- preendem um Freon ou outro propelente com pressão de vapor relativamen- te alta que força a medicação aerossolizada no trato respiratório sob ativa- ção do dispositivo. Diferentemente de MDIs, DPIs geralmente confiam intei- ramente nos esforços inspiratórios do paciente para introduzir um medica- mento em uma forma de pó seco aos pulmões. Nebulizadores formam um aerossol do medicamento a ser inalado pela transmissão de energia a uma solução líquida. A entrega pulmonar direta de drogas durante a ventilação líquida ou lavagem pulmonar usando um meio fluoroquímico também foi ex- plorada. Estes e outros métodos podem ser usados para entregar um anta- gonista de IL-13 e/ou de IL-4. Em uma modalidade, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 associa-se com um polímero, por exemplo, um polímero que estabiliza ou aumenta a meia-vida do composto.
Por exemplo, para administração por inalação, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 é entregue na forma de uma pulverização de aerossol de recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propelente ade- quado ou um nebulizador. O antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode estar na forma de uma partícula seca ou como um líquido. Partículas que incluem o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 podem ser preparadas, por exemplo, pela secagem por pulverização, pela secagem de uma solução aquosa do anta- gonista de IL-13 e/ou de IL-4 com um agente de neutralização de carga e então criação de partículas do pó seco ou pela secagem de uma solução aquosa em um modificador orgânico e então criando partículas do pó seco.
O antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser convenientemente entregue na forma de uma apresentação de pulverização de aerossol a partir de recipientes pressurizados ou um nebulizador, com o uso de um propelen- te adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclo- rotetrafluoroetano, dióxido de carbônico ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada pe- lo fornecimento de uma válvula para entregar uma quantidade medida. Cáp- sulas e cartuchos para uso em um inalador ou insuflador podem ser formu- lados contendo uma mistura de pó de um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 e uma base de pó adequada, tal como Iactose ou amido, se a partícula for uma partícula formulada. Além do composto formulado ou não formulado, outros materiais, tais como DPPC 100% ou outros tensoativos podem ser misturados com um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 para promover a en- trega e dispersão do composto formulado ou não formulado. Métodos de preparação de partículas secas são descritos, por exemplo, em WO 02/32406.
Um antagonista de IL-13 e/ou IL-4 de pode ser formulado para entrega por aerossol, por exemplo, como partículas secas em aerossol, tais que quando administrado pode ser rapidamente absorvido e pode produzir um resultado terapêutico local ou sistêmico rápido. Administração pode ser adaptada para fornecer atividade detectável dentro de 2 minutos, 5 minutos, 1 hora, ou 3 horas da administração. Em algumas modalidades, a atividade mais alta pode ser alcançada ainda mais rapidamente, por exemplo, dentro de meia hora ou ainda dentro de dez minutos. Um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser formulado para meia-vida biológica mais longa (por exem- plo, pela associação com um polímero, tal como PEG) para uso como uma alternativa para outros modos de administração, por exemplo, tal que os an- tagonistas de IL-13 e/ou de IL-4 entrem em circulação a partir do pulmão e sejam distribuídos a outros órgãos ou a um determinado órgão alvo. Em uma modalidade, o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 é en-
tregue em uma quantidade tal que pelo menos 5% da massa do polipeptídeo seja entregue ao trato respiratório inferior ou pulmão profundo. O pulmão profundo tem uma rede capilar extremamente rica. A membrana respiratória que separa o lúmen capilar do espaço aéreo alveolar é muito fina (< 6 μιτι) e extremamente permeável. Além disso, a camada líquida que alinha a super- fície alveolar é rica em tensoativos pulmonares. Em outras modalidades, pe- lo menos 2%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ou 80% da composição de um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 é entregue ao trato respiratório inferior ou ao pulmão profundo. A entrega a um ou a ambos des- tes tecidos resulta na absorção eficiente de antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 e alta biodisponibilidade. Em uma modalidade, o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 é fornecido em uma dose medida usando, por exemplo, um inalador ou nebulizador. Por exemplo, o agente de ligação à IL-13 é entregue em uma forma de unidade de dosagem de pelo menos aproximadamente 0,02, 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 20, 40, ou 50 mg/sopro ou mais. A biodisponibilida- de porcentual pode ser calculada como se segue: a biodisponibilidade por- centual = (AUCnão-invasiva/AUCi.v.ous.c.) X (dosei.v. ou s.c/dosenão-invasiva) x 100.
Embora não necessário, potencializadores de entrega, tais como tensoativos podem ser usados para aumentar adicionalmente a entrega pulmonar. Um "tensoativo"como usado neste pedido refere-se a um antago- nista de IL-13 e/ou de IL-4 que tem uma porção hidrofílica e lipofílica, que promove a absorção de uma droga pela interação com uma interface entre duas fases imiscíveis. Tensoativos são úteis nas partículas secas por várias razões, por exemplo, redução da aglomeração de partícula, redução de fa- gocitose por macrófago, etc. Quando ligado com tensoativo pulmonar, uma absorção mais eficiente do antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser alcan- çado porque tensoativos, tais como DPPC, facilitarão muito a difusão do composto. Tensoativos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a fosfoglicerídeos, por exemplo, fosfatidilcolinas, L-alfa- fosfatidilcolina de dipalmitoíla (DPPC) e difosfatidil glicerol (DPPG); hexade- canol; ácidos graxos; polietilenoglicol (PEG); polioxietileno-9-; éter de aurila; ácido palmítico; ácido oleico; trioleato de sorbitano (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxômero; éster de ácido graxo de sorbitano; trioleato de sorbi- tano; tiloxapol; e fosfolipídeos. Estabilização
Em uma modalidade, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 está associado fisicamente com uma porção que melhora sua estabilização e/ou retenção na circulação, por exemplo, no sangue, soro, linfa, lavagem bron- copulmonar, ou outros tecidos, por exemplo, em pelo menos 1,5, 2, 5, 10, ou 50 vezes.
Por exemplo, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser as- sociado com um polímero, por exemplo, um polímero substancialmente não- antigênico, tal como óxidos de polialquileno ou óxidos de polietileno. Políme- ros adequados variarão substancialmente por peso. Polímeros que tem pe- sos médios pelo número molecular nos limites de aproximadamente 200 a aproximadamente 35.000 (ou aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, e 2.000 a aproximadamente 12.500) podem ser usados.
Por exemplo, um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 pode ser conjugado a um polímero solúvel em água, por exemplo, polímeros de poli- vinil hidrofílicos, por exemplo, polivinilálcool e polivinilpirrolidona. Uma lista não-limitante de tais polímeros inclui homopolímeros de óxido de polialquile- no, tais como polietilenoglicol (PEG) ou polipropilenoglicóis, polióis polioxieti- lenados, copolímeros dos mesmos e copolímeros em bloco dos mesmos, contanto que a solubilidade em água dos copolímeros em bloco seja manti- da. Polímeros úteis adicionais incluem polioxialquilenos, tais como polioxieti- leno, polioxipropileno, e copolímeros em blocos de polioxietileno e polioxi- propileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbômeros; polissacarídeos ramifi- cados ou não ramificados que compreendem monômeros de sacarídeos D- mannose, D- e L- galactose, fucose, frutose, D-xilose, L-arabinose, ácido D- glicurônico, ácido siálico, ácido D-galacturônico, ácido D-manurônico (por exemplo, ácido polimanurônico, ou ácido algínico), D-glicosamina, D- galactosamina, D-glicose e ácido neuramínico incluindo homopolissacarí- deos e heteropolissacarídeos, tais como lactose, amilopectina, amido, hidro- xietil amido, amilose, sulfato de dextrana, dextrana, dextrinas, glicogênio, ou a subunidade polissacarídica de mucopolisacarídeos ácidos, por exemplo, ácido hialurônico; polímeros de álcoois de açúcar, tais como polissorbitol e polimanitol; heparina ou heparana.
Os conjugados de um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 e um polímero podem ser separados dos materiais iniciais não reagidos, por e- xemplo, pela filtração em gel ou cromatografia de troca iônica, por exemplo, HPLC. Espécies heterólogas dos conjugados são purificadas a partir de ou- tro da mesma maneira. Resolução de espécies diferentes (por exemplo, con- tendo um ou dois resíduos PEG) é também possível devido à diferença nas propriedades iônicas de aminoácidos não reagidos. Ver, por exemplo, WO 96/34015.
Outros Usos de Antagonistas de IL-13 e/ou de IL-4
Ainda em outro aspecto, a invenção caracteriza um método para modulação (por exemplo, redução, neutralização e/ou inibição) de uma ou mais atividades associadas à IL-13 in vivo pela administração de um anta- gonista de IL-13 e/ou de IL-4 descritos neste pedido em uma quantidade su- ficiente para inibir sua atividade. Um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 tam- bém pode ser administrado a indivíduos para os quais a inibição de uma resposta inflamatória mediada por IL-13 é necessária. Estas condições in- cluem, por exemplo, inflamação das vias aéreas, asma, fibrose, eusinofilia e produção aumentada de muco.
A eficácia de um antagonista de IL-13 e/ou de IL-4 descrito neste pedido pode ser avaliada, por exemplo, pela avaliação da capacidade do antagonista de modulação da inflamação das vias aéreas em macacos ci- nomolgus expostos a um alergênio de Ascaris suum. Um antagonista de IL- 13 e/ou de IL-4 pode ser usado para neutralizar ou inibir uma ou mais ativi- dades associadas à IL-13, por exemplo, para reduzir a inflamação mediada por IL-13 in vivo, por exemplo, para tratar ou prevenir patologias associadas à IL-13, incluindo asma e/ou seus sintomas associados.
Em uma modalidade, o antagonista de IL-13 e/ou de IL-4, ou composições farmacêuticas dos mesmos, são administrados na terapia de combinação, isto é, combinados com outros agentes, por exemplo, agentes terapêuticos, que são úteis para tratamento das condições ou desordens patológicas, tais como desordens alérgicas e inflamatórias. O termo "em combinação" neste contexto significa que os agentes são fornecidos subs- tancialmente contemporaneamente, simultaneamente ou seqüencialmente. Se dado seqüencialmente, no início da administração do segundo composto, o primeiro dos dois compostos é preferencialmente ainda detectável em concentrações eficazes no sítio do tratamento.
Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um ou mais agentes de ligação à IL-13 (por exemplo, o antagonista de IL-13 isolado ou em combinação com o antagonista de IL-4) que se ligam a IL-13 e interferem na formação de um complexo de sinalização funcional de IL-13, coformulado e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, uma ou mais citocinas e inibidores de fator de crescimento, imu- nossupressores, agentes anti-inflamatórios, inibidores metabólicos, inibido- res enzimáticos, e/ou agentes citotóxicos ou citostáticos, como descrito com mais detalhes abaixo. Além disso, um ou mais agentes de ligação à IL-13 (por exemplo, o antagonista de IL-13 isolado ou em combinação com o an- tagonista de IL-4) podem ser usados em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos descritos neste pedido. Tal terapia de combinação po- de utilizar vantajosamente dosagens menores dos agentes terapêuticos ad- ministrados, dessa forma evitando possíveis toxicidades ou complicações associadas com as várias monoterapias. Além disso, os agentes terapêuti- cos revelados neste pedido atuam em vias que se diferenciam a partir da via de IL-13/receptor de IL-13, e dessa maneira são esperados potencializar e/ou sinergizar com os efeitos dos agentes de ligação à IL-13.
Agentes terapêuticos que interferem em disparadores diferentes de asma ou inflamação das vias aéreas, por exemplo, agentes terapêuticos usados no tratamento da alergia, infecções respiratórias superiores, ou in- fecções de ouvido, podem ser usadas em combinação com um agente de ligação à IL-13 (por exemplo, o antagonista de IL-13 isolado ou em combina- ção com o antagonista de IL-4). Em uma modalidade, um ou mais agentes de ligação à IL-13 (por exemplo, o antagonista de IL-13 isolado ou em com- binação com o antagonista de IL-4) podem ser coformulados com, e/ou co- administrados com um ou mais agentes adicionais, tais como outra citocina ou antagonistas de fator de crescimento (por exemplo, receptores solúveis, inibidores peptídicos, pequenas moléculas, adesinas), moléculas de anticor- po que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a ou- tras citocinas ou fatores de crescimento, seus receptores, ou outras molécu- las da superfície celular), e citocinas anti-inflamatórias ou agonistas das mesmas. Exemplos não-limitantes dos agentes que podem ser usados em combinação com agentes de ligação à IL-13 (por exemplo, o antagonista de IL-13 isolado ou em combinação com o antagonista de IL-4) incluem, mas não são limitados a, esteróides inalados; beta-agonistas, por exemplo, beta- agonistas de curta ou longa duração; antagonistas de Ieucotrienos ou recep- tores de leucotrieno; drogas de combinação, tais como ADVAIR®; inibidores de IgE, por exemplo, anticorpos anti-IgE (por exemplo, XOLAIR®); inibidores de fosfodiesterase (por exemplo, inibidores de PDE4); xantinas; drogas anti- colinérgicas; agentes de estabilização de mastócito, tais como cromolina; inibidores de IL-5; inibidores de eotaxina/CCR3; e anti-histamínicos.
Em outras modalidades, um ou mais antagonistas de IL-13 iso- lados ou em combinação com um ou mais antagonistas de IL-4 podem ser coformulados e/ou coadministrados com uma ou mais drogas anti- inflamatórias, imunossupressoras, ou inibidores metabólicos ou enzimáticos. Exemplos das drogas ou inibidores que podem ser usados em combinação com os agentes de ligação à IL-13 incluem, mas não são limitados a, um ou mais de: antagonistas de TNF (por exemplo, um fragmento solúvel de um receptor de TNF, por exemplo, receptor de TNF humano p55 ou p75 ou deri- vados dos mesmos, por exemplo, TNFR-IgG 75 kd (TNF 75 kD proteína de fusão de receptor à IgG, ENBREL™)); antagonistas de enzima de TNF, por exemplo, inibidores da enzima de conversão de TNFa (TACE); antagonistas de receptor muscarínico; antagonistas de TGF-β; interferon gama; perfeni- dona; agentes quimioterápicos, por exemplo, metotrexato, leflunomida, ou um sirolimus (rapamicina) ou um análogo dos mesmos, por exemplo, CCI- 779; inibidores de COX2 e cPLA2; AINEs; imunomoduladores; inibidores de p38, inibidores de TPL-2, Mk-2 e NFKB. Formulações de Vacina
Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de modifi- cação de uma resposta imune associada com imunização. Um antagonista de IL-13, isolado ou em combinação com um antagonista de IL-4, pode ser usado para aumentar a eficácia da imunização pela inibição da atividade de IL-13. Antagonistas podem ser administrados antes, durante, ou após entre- ga de um imunógeno, por exemplo, administração de uma vacina. Em uma modalidade, a imunidade elevada pela vacinação é uma imunidade celular, por exemplo, uma imunidade contra células cancerígenas ou células infecta- das por vírus, por exemplo, infectadas por retrovírus, por exemplo, infecta- das por HIV. Em uma modalidade, a formulação de vacina contém um ou mais antagonistas e um antígeno, por exemplo, um imunógeno. Em uma modalidade, os antagonistas de IL-13 e/ou de IL-4 são administrados em combinação com imunoterapia (por exemplo, em combinação com uma imu- nização para alergia com um ou mais imunógenos escolhidos a partir de plantas do gênero Ambrosia, gramínea, poeira de ácaro e similares. Em ou- tra modalidade, o antagonista e o imunógeno são administrados separada- mente, por exemplo, dentro de uma hora, três horas, um dia, ou dois dias de cada um.
Inibição de IL-13 pode melhorar a eficácia de, por exemplo, va- cinas celulares, por exemplo, vacinas contra doenças, tais como câncer e infecção viral, por exemplo, infecção retroviral, por exemplo, infecção por HIV. Indução de linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTL) por vacinas é modulada para baixo por células T CD4+, provavelmente através da citocina IL-13. Foi mostrado que a inibição de IL-13 potencializa a indução da resposta de CTL pela vacina (Ahlers et al. (2002) Proc. Nati Acad. Sei. USA 99:13020- 10325). Um antagonista de IL-13 pode ser usado em conjunto com uma va- cina para aumentar a eficácia da vacina. Câncer e infecção viral (tal como infecção retroviral (por exemplo, HIV)) são desordens exemplares contra as quais uma resposta celular à vacina pode ser eficaz. Eficácia da vacina é potencializada pelo bloqueio da sinalização de IL-13 no momento da vacina- ção (Ahlers et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 99:13020-25). Uma for- mulação de vacina pode ser administrada a um indivíduo na forma de uma composição farmacêutica ou terapêutica.
Métodos para Diagnóstico, Prognóstico, e Monitoração de Desordens Agentes de ligação à IL-13 podem ser usados in vitro e in vivo
como agentes diagnósticos. Um método exemplar inclui: (i) administração do agente de ligação à IL-13 (por exemplo, uma molécula de anticorpo para IL- 13) a um indivíduo; e (ii) detecção do agente de ligação à IL-13 no indivíduo. A detecção pode incluir determinação da localização do agente de ligação à IL-13 no indivíduo. Outro método exemplar inclui contatar um agente de liga- ção com IL-13 com uma amostra, por exemplo, uma amostra de um indiví- duo. A presença ou a ausência de IL-13 ou o nível de IL-13 (qualitativo ou quantitativo) na amostra podem ser determinados.
Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método di- agnóstico para detectar a presença de uma IL-13, in vitro (por exemplo, uma amostra biológica, tal como tecido, biópsia) ou in vivo (por exemplo, diagnós- tico por imagem in vivo em um indivíduo). O método inclui: (i) contato de uma amostra com o agente de ligação à IL-13; e (ii) detecção da formação de um complexo entre o agente de ligação à IL-13 e a amostra. O método também pode incluir contatar uma amostra referência (por exemplo, uma amostra controle) com o agente de ligação, e determinar a extensão da for- mação do complexo entre o agente de ligação e uma amostra em relação ao mesmo para a amostra referência. Uma modificação, por exemplo, uma mo- dificação estatisticamente significante, na formação do complexo na amostra ou indivíduo em relação à amostra controle ou indivíduo podem ser indicati- vas da presença de IL-13 na amostra.
Outro método inclui: (i) administração do agente de ligação à IL-
13 a um indivíduo; e (ii) detecção de formação de um complexo entre o a- gente de ligação à IL-13 e o indivíduo. A detecção pode incluir determinação da localização ou tempo da formação do complexo.
O agente de ligação à IL-13 pode ser diretamente ou indireta- mente marcado com uma substância detectável para facilitar a detecção da proteína ligada ou não ligada. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais Iumi- nescentes e materiais radioativos.
Formação de complexo entre o agente de ligação à IL-13 e IL-13 pode ser detectado pela mensuração ou visualização do agente de ligação ligado à IL-13 ou agente de ligação não ligado. Ensaios de detecção con- vencionais podem ser usados, por exemplo, um ensaio imunoabsorvente de ligação de enzimas (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou imuno- histoquímica tecidual. Ainda para marcação do agente de ligação à IL-13, a presença de IL-13 pode ser analisada em uma amostra por um imunoensaio de competição usando padrões marcados com uma substância detectável e um agente de ligação à IL-13 não marcado. Em um exemplo deste ensaio, a amostra biológica, os padrões marcados e o agente de ligação à IL-13 são combinados e a quantidade do padrão ligado marcado ao agente de ligação não marcado é determinada. A quantidade de IL-13 na amostra é inversa- mente proporcional à quantidade do padrão marcado ligado ao agente de ligação à IL-13.
Métodos para Diagnóstico, Prognóstico e/ou Monitoração da Asma
Os agentes de ligação descritos neste pedido podem ser usa- dos, por exemplo, em métodos para diagnóstico, prognóstico, e monitoração do progresso da asma pela mensuração do nível de IL-13 em uma amostra biológica. Além disso, esta descoberta permite a identificação de novos ini- bidores da sinalização de IL-13, que também serão úteis no tratamento da asma. Tais métodos para diagnóstico da asma alérgica e não-alérgica po- dem incluir detecção de uma alteração (por exemplo, uma redução ou au- mento) de IL-13 em uma amostra biológica, por exemplo, soro, plasma, flui- do de lavagem broncoalveolar, saliva, etc. 'Diagnóstico" ou "diagnosticar" significa identificar a presença ou ausência de uma condição patológica. Mé- todos diagnósticos envolvem detecção da presença de IL-13 pela determi- nação de uma quantidade teste de polipeptídeo IL-13 em uma amostra bio- lógica, por exemplo, em fluido de lavagem broncoalveolar, a partir de um indivíduo (mamífero humano ou não-humano), e comparar a quantidade tes- te com uma quantidade ou faixa normais (isto é, uma quantidade ou faixa de um indivíduo(s) que sabe-se não sofrer de asma) para o polipeptídeo IL-13. Enquanto um determinado método diagnóstico pode não fornecer um diag- nóstico definitivo de asma, é suficiente se o método fornece uma indicação positiva que auxilie no diagnóstico.
Métodos para prognóstico de asma e/ou desordens atópicas po- dem incluir regulação para cima da detecção de IL-13, ao nível de mRNA ou proteico. 'Prognóstico" ou "prognosticar" significa predizer a desenvolvimen- to e/ou severidade prováveis de uma condição patológica. Métodos prognós- ticos envolvem a determinação da quantidade teste de IL-13 em uma amos- tra biológica de um indivíduo, e comparação da quantidade teste à quantida- de ou faixa prognostica (isto é, uma quantidade ou faixa de indivíduos com severidades variadas de asma) de IL-13. Várias quantidades da IL-13 em uma amostra teste são compatíveis com certas prognósticos para asma. A detecção de uma quantidade de IL-13 em um determinado nível prognóstico fornece um prognóstico para o indivíduo.
O presente pedido de patente também fornece métodos para monitoração do curso da asma pela detecção da regulação para cima de IL- 13. Métodos de monitoração envolvem a determinação das quantidades tes- te de IL-13 em amostras biológicas tomadas de um indivíduo em uma primei- ra e segunda vez, e comparação das quantidades. Uma modificação na quantidade de IL-13 entre a primeiro e segunda vez pode indicar uma modi- ficação no curso da asma e/ou desordem atópica, com uma redução na quantidade indicando remissão da asma, e um aumento na quantidade indi- cando progressão da asma e/ou desordem atópica. Tais ensaios de monito- ração também são úteis para avaliação da eficácia de uma determinada in- tervenção terapêutica (por exemplo, atenuação e/ou reversão da doença) em pacientes que são tratados para uma desordem associada à IL-13.
Agentes de ligação marcados fluoróforo e cromóforo podem ser preparados. As porções fluorescentes podem ser selecionadas para ter ab- sorção substancial em comprimentos de onda acima de 310 nm, e preferen- cialmente acima de 400 nm. Vários fluorescedores e cromóforos adequados são descritos por Strier (1968) Science, 162:526 e Brand, L. et ai (1972) Annual Review of Biochemistry, 41:843-868. Os agentes de ligação podem ser marcados com grupos cromóforos fluorescentes por procedimentos con- vencionais, tais como os revelados na U.S. Patent Nos. 3.940.475, 4.289.747, e 4.376.110. Um grupo de fluorescedores tendo várias proprieda- des desejáveis acima é o corante xanteno, que incluí as fluoresceínas e ro- daminas. Outro grupo de compostos fluorescentes são as naftilaminas. Uma vez marcado com um fluoróforo ou cromóforo, o agente de ligação pode ser usado para detectar a presença ou a localização da IL-13 em uma amostra, por exemplo, usando microscopia fluorescente (tal como microscopia confo- cal ou deconvolução).
Análise Histológica. Imuno-histoquímica pode ser realizada u- sando os agentes de ligação descritos neste pedido. Por exemplo, no caso de um anticorpo, o anticorpo pode ser sintetizado com um marcador (tal co- mo uma etiqueta de purificação ou epítopo), ou pode ser detectável marca- do, por exemplo, pela conjugação ao grupo marcador ou de ligação ao mar- cador. Por exemplo, um quelante pode ser anexado ao anticorpo. O anticor- po então é contatado com uma preparação histológica, por exemplo, uma seção fixada do tecido que está em uma lâmina de microscopia. Após uma incubação para ligação, a preparação é lavada para remoção do anticorpo não ligado. A preparação é então analisada, por exemplo, usando microsco- pia, para identificar se o anticorpo se ligou à preparação. O anticorpo (ou outro polipeptídeo ou peptídeo) pode estar não marcado no tempo da liga- ção. Após ligação e lavagem, o anticorpo é marcado para a fim de torná-lo detectável.
Arranjos de Proteína. Um agente de ligação à IL-13 (por exem- pio, uma proteína que é um agente de ligação à IL-13) também pode ser i- mobilizado em um ensaio de proteína. O arranjo de proteína pode ser usado como uma ferramenta diagnostica, por exemplo, para seleção de amostras médicas (tais como células isoladas, sangue, soros, biópsias, e similares). O arranjo de proteína também pode incluir outros agentes de ligação, por e- xemplo, aqueles que se ligam à IL-13 ou a outras moléculas alvo.
Métodos de produção de arranjos de proteína são descritos, por exemplo, em De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge (2000) Nucleic Aeids Res. 28,e3,1-VII; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; WO 01/40803 e WO 99/51773A1. Polipeptídeos para o arranjo podem ser identi- ficados em alta velocidade, por exemplo, usando aparato robótico comerci- almente disponível, por exemplo, de Genetic MicroSystems ou BioRobotics. O substrato do arranjo pode ser, por exemplo, nitrocelulose, plástico, vidro, por exemplo, vidro com superfície modificada. O arranjo também pode incluir uma matriz porosa, por exemplo, acrilamida, agarose, ou outro polímero. Por exemplo, o arranjo pode ser um arranjo de anticorpos, por exemplo, como descrito em De Wildt, supra. Células que produzem a proteína podem ser cultivadas em um filtro em um formato arranjado, produção de proteína é induzida, e a proteína expressa é imobilizada no filtro na posição da célula. Uma arranjo de proteína pode ser contatado com uma amostra
para determinar a extensão de IL-13 na amostra. Se amostra for não marca- da, um método de sanduíche pode ser usado, por exemplo, usando uma sonda marcada, para detectar a ligação da IL-13. A informação sobre a ex- tensão da ligação em cada local dão arranjo pode ser armazenado como um perfil, por exemplo, em um banco de dados de computador. O arranjo de proteína pode ser produzido em replicatas e usado para comparar perfis de ligação, por exemplo, de diferentes amostras. Citometria de Fluxo. O agente de ligação à IL-13 pode ser usado para marcar células, por exemplo, células em uma amostra (por exemplo, uma amostra de paciente). O agente de ligação pode ser anexado (ou ane- xável) a um composto fluorescente. As células então podem ser analisadas por citometria de fluxo e/ou separadas usando célula ativada fluorescente separada (por exemplo, usando um separador disponível em Becton Dickin- son Immunocitometry Systems, San Jose CA; ver também U.S. Patent N0 5.627.037; 5.030.002; e 5.137.809). Como as células passam através do separador, um raio laser excita o composto fluorescente enquanto um detec- tor conta células que passam através e determina quanto um composto fluo- rescente é anexado à célula pela detecção de fluorescência. A quantidade de marcador ligado a cada célula pode ser quantificada e analisada para caracterizar a amostra. O separador pode também desviar a célula e separar células ligadas pelo agente de ligação daquelas células não ligadas pelo a- gente de ligação. As células separadas podem ser cultivadas e/ou caracteri- zadas.
Diagnóstico por imagem in vivo. Ainda em outra modalidade, a invenção fornece um método para detecção da presença de uma IL-13 em um indivíduo in vivo. O método inclui (i) a administração em um indivíduo (por exemplo, um paciente que tem uma desordem associada à IL-13) um molécula de anticorpo anti-IL-13, conjugada a um marcador detectável; (ii) exposição do indivíduo a um meio para detecção do marcador detectável. Por exemplo, o indivíduo é visualizado, por exemplo, por RMN ou outros meios tomográficos. E Exemplos de marcadores úteis para diagnóstico por imagem incluem radiomarcadores tais como 131I1 111In, 123I, 99mTc, 32P, 33P, 125I, 3H, 14C, e 188Rh, marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, marcadores ativos em ressonância magnética nuclear, varredu- ra de isótopos de emissão de pósitron detectáveis por uma tomografia por emissão de pósitrons ('PET"), quimioluminescentes, tais como luciferina, e marcadores enzimáticos, tais como peroxidase ou fosfatase. Emissores ra- dioativos de faixa curta, tais como isótopos detectáveis por sondas de detec- tar de faixa curta também podem ser empregados. O agente de ligação pode ser marcado com tais reagentes usando técnicas conhecidas.
Por exemplo, ver Wensel and Meares (1983) Radioimmunoima- ging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York para técnicas relaciona- das com a radiomarcação de anticorpos e Colcher et al. (1986) Meth. Enzy- mol. 121:802-816. Um agente de ligação radiomarcado também pode ser usado para testes diagnósticos in vitro. A atividade específica de um agente de ligação marcado isotopicamente depende da meia-vida, da pureza isotó- pica do marcador radioativo, e como o marcador é incorporado no anticorpo. Procedimentos para marcação de polipeptídeos com os isótopos radioativos (tais como 14C, 3H1 35S, 125I, 99mTc, 32P, 33P, e 131I) são geralmente conheci- dos. Ver, por exemplo, U.S. 4.302.438; Goding, J. W. (Monoclonal antibod- ies: principies and practices: production and application of monoclonal anti- bodies in cell biology, biochemistry, and immunology 2nd ed. London; Orlan- do: Academic Press, 1986. pp 124-126) e as referências citadas nestes; e A.R. Bradwell et al. 'Developments in Antibodies Imaging", Monoclonal Anti- bodies for Câncer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), pp 65- 85 (Academic Press 1985).
Agentes de ligação à IL-13 descritos neste pedido podem estar conjugados à agentes de contraste para Ressonância Magnética por Ima- gem (MRI). Algumas técnicas de MRI estão resumidas em EP-A-O 502814. Geralmente, as diferenças nas constantes de tempo de repouso dos prótons da água Tl e T2 em diferentes ambientes são usadas para gerar uma ima- gem. Entretanto, estas diferenças podem ser insuficientes para fornecer i- magens de altas resolução exatas. As diferenças nestas constantes de tem- po de repouso podem ser potencializadas por agentes de contraste. Exem- plos de tais agentes de contraste incluem diversos agentes magnéticos, a- gentes paramagnéticos (que principalmente alteram TI) e ferromagnético ou superparamagnético (que principalmente alteram a resposta de T2). Quela- tos (por exemplo, quelatos de EDTA, DTPA e NTA) podem ser usados para ligar algumas substâncias paramagnéticas (e reduzir a toxicidade) (por e- xemplo, Fe3+, Mn2+, Gd3+). Outros agentes podem estar na forma de partícu- las, por exemplo, menos que 10 pm a aproximadamente 10 nm em diâme- tro) e que tem propriedades ferromagnéticas, antiferromagnéticas, ou super- paramagnéticas. Os agentes de ligação à IL-13 também pode ser marcados com um grupo de indicação o átomo ativo 19F na RMN, como descrito por Pikett (1982) Scientific American, 246:78-88 para localização e imagem da distribuição de IL-13.
Também dentro do escopo descrito neste pedido estão conjun- tos compreendendo um agente de ligação à IL-13 e instruções para uso di- agnóstico, por exemplo, o uso do agente de ligação à IL-13 (por exemplo, uma molécula de anticorpo ou outro polipeptídeo ou peptídeo) para detectar IL-13, in vitro, por exemplo, na amostra, por exemplo, uma biópsia ou células a partir de um paciente que tem uma desordem associada à IL-13, ou in vi- vo, por exemplo, por dignóstico de imagem de um indivíduo. O conjunto po- de ainda conter pelo menos um reagente adicional, tal como um marcador ou agente diagnóstico adicional. Para uso in vivo o agente de ligação pode ser formulado como uma composição farmacêutica. Conjuntos
Um agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL-13, e/ou o antagonista de IL-4 pode ser fornecido em um conjunto, por exemplo, como um componente de um conjunto. Por exemplo, o conjunto inclui (a) um agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma molé- cula de anticorpo anti-IL-13, e/ou o antagonista de IL-4 e, opcionalmente (b) material informativo. O material informativo pode ser descritivo, instrutivo, propaganda ou outro material que relaciona a um método, por exemplo, um método descrito neste pedido. O material informativo dos conjuntos não é limitado na sua forma. Em uma modalidade, o material informativo pode in- cluir informação sobre a produção do composto, peso molecular do compos- to, concentração, data de validade, lote ou informação sobre local de produ- ção, e similares. Em uma modalidade, o material informativo relaciona-se ao uso do agente de ligação à IL-13 para tratar, prevenir, diagnosticar, prognos- ticar, ou monitorar uma desordem descrita neste pedido. Em uma modalida- de, o material informativo inclui instruções para administração da ligação à IL-13 como um tratamento de intervalo único. Em uma modalidade, o material informativo pode incluir instru- ções para administração de um agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-IL-13, de uma maneira adequada de realizar os métodos descritos neste pedido, por exemplo, em uma dose, forma de do- sagem ou modo adequados da administração (por exemplo, uma dose, for- ma de dosagem, ou modo de administração descrito neste pedido). Em outra modalidade, o material informativo pode incluir instruções para administra- ção de um agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma molécula de anti- corpo anti-IL-13, a um indivíduo adequado, por exemplo, um humano, por exemplo, um humano que tem, ou em risco de, asma alérgica, asma não- alérgica, ou uma desordem mediada por IL-13, por exemplo, desordem alér- gica e/ou inflamatória ou infecção HTLV-1. A produção IL-13 foi correlacio- nada com a infecção por HTLV-1 (Chung etal., (2003) Blood 102:4130-36).
Por exemplo, o material pode incluir instruções para administra- ção de um agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma molécula de anti- corpo anti-IL-13, a um paciente, um paciente com ou em risco de asma alér- gica, asma não-alérgica, ou uma desordem mediada por IL-13, por exemplo, desordem alérgica e/ou inflamatória, ou infecção por HTLV-1.
O conjunto pode incluir um ou mais recipientes da composição contendo um agente de ligação à IL-13, por exemplo, uma molécula de anti- corpo anti-IL-13. Em algumas modalidades, o conjunto contém recipientes separados, divisores ou compartimentos para composição e material infor- mativo. Por exemplo, a composição pode estar contida em uma garrafa, frasco, ou seringa, e o material informativo podem estar contidos em uma capa ou pacote plásticos. Em outras modalidades, os elementos separados do conjunto são contidos em um recipiente único, não dividido. Por exemplo, a composição é contida em uma garrafa, frasco ou seringa que tem anexada a mesma, material informativo na forma de uma pasta. Em algumas modali- dades, o conjunto inclui uma pluralidade (por exemplo, um pacote) de recipi- entes individuais, cada um contendo uma ou mais formas de unidade de do- sagem (por exemplo, uma forma de dosagem descrita neste pedido) de um agente de ligação à IL-13, por exemplo, molécula de anticorpo anti-IL-13. Por exemplo, o conjunto inclui uma pluralidade de seringas, ampolas, saches de folha metálica, dispositivos atomizadores ou de inalação, cada um con- tendo uma dose única unitária de um agente de ligação à IL-13, por exem- plo, uma molécula de anticorpo anti-IL-13, ou doses unitárias múltiplas.
O conjunto opcionalmente inclui um dispositivo adequado para a
administração da composição, por exemplo, uma seringa, inalador, pipeta, fórceps, colher medida, conta-gotas (por exemplo, conta-gotas ocular), coto- nete ("swab") (por exemplo, um cotonete de algodão ou contonete de madei- ra), ou qualquer dispositivo de entrega. Em uma modalidade preferencial, o dispositivo é um dispositivo implantável que dispensa doses medidas do a- gente de ligação.
Os exemplos que seguem são apresentados para ajudar na compreensão das invenções mas não são destinados a, e não deveriam ser interpretados para limitar seu escopo de qualquer modo. EXEMPLOS Exemplo 1
(a) Clonagem de IL-13 de NHP e homologia à IL-13 humana A IL-13 de macaco cinomolgus (NHP IL-13) foi clonada usando sondas de hibridização. Uma comparação da seqüência de aminoácidos de IL-13 de macaco cinomolgus àquela de IL-13 humana é mostrada na figura 1 A. Há identidade de aminoácido de 94% entre as duas seqüências, devido a 8 diferenças de aminoácidos. Uma destas diferenças, R130Q, representa um polimorfismo humano comum preferencialmente expresso em indivíduos asmáticos (Heinzmann et al. (2000) Hum. Mol. Genet. 9:549-559). (b) Ligação de IL-13 de NHP ao IL13Ra2 humano
A IL-13 humana se liga com alta afinidade à forma alfa2 do re- ceptor de IL-13 (IL13Ra2). Uma forma solúvel deste receptor foi expressa com uma cauda Fc de IgGI humana (slL13R.:2-Fc). Pela ligação de IL-13 e seqüestrando a citocina do complexo de sinalização da superfície celular IL13Ra1-IL4R, slL13Ra2-Fc pode atuar como um inibidor potente da bioati- vidade de IL-13 humana. Foi mostrado que slL13Ra2-Fc se liga a IL-13 de NHP produzida por células CHO ou E. coli. (c) Bioatividade de IL-13 de NHP em monócitos humanos
(i) Expressão de CD23 em monócitos humanos. cDNA que codi- fica IL-13 de macaco cinomolgus foi expresso em E. coli e redobradas para manter a bioatividade. A reatividade de células humanas a IL-13 de cinomol- gus foi demonstrada usando um bioensaio em que células mononucleares normais de sangue periférico de doadores saudáveis foram tratadas com IL- 13 durante a noite a 37°C. Isso induziu regulação para cima da expressão de CD23 na superfície dos monócitos. Os resultados mostraram que IL-13 de cinomolgus tinha bioatividade em monócitos humanos primários.
(ii) Fosforilacão de STAT6 em células HT-29. A linhagem celular
epitelial humana HT-29 responde a IL-13 pela submissão à fosforilação de STAT6, uma conseqüência da transdução de sinal através do receptor de IL- 13. Para analisar a capacidade da IL-13 de NHP recombinante induzir a fos- forilação de STAT6, células HT-29 foram desafiadas com a IL-13 de NHP
durante 30 minutos a Zl0C, então fixadas, permeabilizadas, e coradas com anticorpo fluorescente para STAT6-fosfo. Os resultados mostraram que IL- 13 de cinomolgus induziram eficientemente a fosforilação de STAT6 nesta linhagem celular humana.
(d) Geração de anticorpos que se ligam a IL-13 de NHP
Camundongos ou outros animais apropriados podem ser imuni-
zados e estimulados com IL-13 de cinomolgus, por exemplo, usando um ou mais dos seguintes métodos. Um método para imunização pode ser combi- nado com mesmo método ou diferente para estimulação:
(i) Imunização com proteína IL-13 de cinomolgus expressa em E.
coli, purificada pela inclusão de corpos, e redobrado para conservar a ativi- dade biológica. Para a imunização, a proteína é emulsionada com adjuvante de Freund completo (CFA), e os camundongos são imunizados de acordo com protocolos padrão. Para estimulação, a mesma proteína é emulsionada com adjuvante de Freund incompleto (IFA).
(ii) Imunização com peptídeos que atravessam a seqüência intei-
ra da IL-13 madura de cinomolgus. Cada peptídeo contém pelo menos um aminoácido que é único para IL-13 de cinomolgus e não presente na proteí- na humana. Ver a figura 1B. Onde o peptídeo tem um outro resíduo C- terminal além de cisteína, uma cisteína é adicionada para conjugação a uma proteína carreadora. Os peptídeos são conjugados a uma proteína carreado- ra imunogênica, tal como KLH, e usados para imunizar camundongos de acordo com protocolos padrão. Para imunização, a proteína é emulsionada com adjuvante de Freund completo (CFA), e os camundongos são imuniza- dos de acordo com protocolos padrão. Para estimulação, a mesma proteína é emulsionada com adjuvante de Freund incompleto (IFA).
(Mi) Imunização com IL-13 de NHP codificado pelo cDNA expres- so. O cDNA que codifica IL-13 de NHP, incluindo a seqüência líder, é clona- do em um vetor apropriado. Este DNA é recoberto em contas de ouro que são injetadas intradermicamente pela arma genética.
(iv) A proteína ou peptídeos podem ser usados como um alvo para seleção de uma biblioteca proteica, por exemplo, uma biblioteca de ex- posição de fago ou ribossomo. Por exemplo, a biblioteca pode mostrar molé- culas de imunoglobulina variadas, por exemplo, Fab's, scFv's, ou Fd's.
(e) Seleção de clones de anticorpo com reação cruzada com NHP e opcionalmente uma IL-13 humana, por exemplo, uma IL-13 nativa humana. Classificação primária
A classificação primária de anticorpos foi a seleção da ligação à IL-13 de NHP recombinante por ELISA. Neste ELISA, os poços são recober- tos com NHP IL-13 recombinante. O soro imune foi adicionado em diluições seriadas e incubado por uma hora à temperatura ambiente. Os poços foram lavados com PBS contendo TWEEN®-20 0,05% (PBS-Tween). O anticorpo ligado foi detectado usando IgG anti-camundongo marcada com peroxidase de raiz-forte ("horseadish") (HRP) e substrato tetrametilbenzideno (TMB). Absorvância foi lida a 450 nm. Tipicamente, todos os camundongos imuni- zados geraram altas títulos do anticorpo para IL-13 de NHP. Classificação secundária
A classificação secundária foi a seleção da inibição da ligação do IL-13 de NHP recombinante a slL-13Ra1-Fc por ELISA. Os poços foram recobertos de IL-13Ra1-Fc solúvel, a qual IL-13 de NHP marcada com FLAG se ligaria. Esta ligação foi detectada com anticorpo anti-FLAG conjugado a HRP. A hidrólise do substrato TMB foi lida com absorvância a 450 nm. No ensaio, a IL-13 de NHP marcada por FLAG foi adicionada junto com concen- trações crescentes do soro imune. Se o soro imune continha o anticorpo que se ligou a IL-13 de NHP e preveniu sua ligação aos poços revestidos com slL13Ra1-Fc, o sinal de ELISA foi reduzido. Todos os camundongos imuni- zados produziram anticorpo que competiu com a ligação de slL13Ra1-Fc a IL-13 de NHP, mas os títulos variaram de camundongo para camundongo. Os baços foram selecionados para fusão a partir de animais cujos soros mostraram a ligação de slL13Ra1-Fc a IL-13 de NHP inibida na diluição maior.
Classificação terciária
A classificação terciária testada para inibição da bioatividade de IL-13 de NHP. Vários bioensaios foram disponíveis para serem usados, in- cluindo o ensaio de proliferação de TF-1, ensaio de expressão de monócito de CD23, e o ensaio de fosforilação de STAT6 na célula HT-29. Soros imu- nes foram testados para a inibição da fosforilação de STAT6 mediada por IL- 13 de NHP. A linhagem celular epitelial humana HT-29 foi desafiada por 30 minutos a 37°C com IL-13 de NHP recombinante na presença ou ausência da concentração indicada de soro imune de camundongo. Células então fo- ram fixadas, permeabilizadas, e coradas com mAb conjugado com ALEXA™ Fluor 488 para STAT6-fosfo (Pharmingen). A porcentagem de células res- pondendo a IL-13 sofrendo fosforilação de STAT6 foi determinada pelo cito- metria de fluxo. Os baços de camundongos com atividade de neutralização mais potente, determinada como inibição mais forte da bioatividade de IL-13 de NHP em uma alta diluição de soro, foram selecionados para geração de hibridomas.
Classificação Quaternária Uma preparação bruta contendo IL-13 humana foi gerada a par-
tir de células mononucleares do sangue de cordão umbilical humano (Bio- Whittaker/Cambrex). As células foram cultivadas em uma incubadora a 37°C em CO2 5%, em meio RPMI contendo SFB 10% inativado por calor, penicili- na 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml, e L-glutamina 2 mM. Células foram estimuladas por 3 dias com o mitógeno PHA-P (Sigma), e desviadas em di- reção à Th2 com IL-4 recombinante humana (R&D Systems) e anti-IL-12 humana. As células Th2 foram expandidas por uma semana com IL-2, então ativadas para produzir citocina pelo tratamento com forbol 12-miristato 13- acetato (PMA) e ionomicina por três dias. O sobrenadante foi coletado e dia- Iizado para remoção de PMA e ionomicina. Para depletar GM-CSF e IL-4, que poderiam interferir em bioensaios para IL-13, o sobrenadante foi tratado com anticorpos biotinilados para GM-CSF e IL-4 (R&D Systems, Inc), então incubada com contas magnéticas recobertas com estreptavidina (Dynal). A concentração final de IL-13 foi determinada por ELISA (Biosource), e de pro- teína total pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad). A preparação típica contém <0,0005% de IL-13 por peso. Seleção de clones de hibridoma.
Usando métodos estabelecidos, hibridomas foram gerados a partir de baços de camundongos selecionados como supracitado, fusionados à linhagem celular de mieloma P3X63_AG8.653 (ATCC). As células foram plaqueadas no limite de diluição e os clones foram selecionados de acordo com os critérios de classificação descritos acima. Dados foram coletados para seleção de clones baseados na capacidade de competir pela ligação de IL-13 de NHP a slL13Ra1-Fc por ELISA. Clones foram ainda testados para a capacidade de neutralizar a bioatividade de IL-13 de NHP. Os sobrenadan- tes de hibridomas foram testados para competição da fosforilação de STAT- 6 induzida por IL-13 de NHP na linhagem celular epitelial humana HT-29. Exemplo 2: Anticorpo MJ 2-7
O RNA total foi preparado a partir de células de hibridoma MJ 2- 7 usando o QIAGEN RNEASY™ Mini Kit (Qiagen). RNA foi reversamente transcrito a cDNA usando SMART PCR Synthesis Kit (BD Biosciences Clontech). A região variável da cadeia pesada de MJ 2-7 foi extrapolada por PCR usando oligonucleotídeo SMART™ como um iniciador sentido 5'-3' e anelamento do iniciador mlgG1 ao DNA que codifica a parte N-terminal do domínio CH1 da região constante da IgGI do camundongo como um inicia- dor sentido 3'-5'. O fragmento de DNA que codifica a região variável da ca- deia leve MJ 2-7 foi gerado usando SMART™ e iniciadores específicos kap- pa de camundongo. A reação de PCR foi realizada usando DNA polimerase DEEP VENT™ (New England Biolabs) e 25 nM de dNTPs em 24 ciclos (94°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto). Os produtos de PCR foram subclonados no vetor de pED6, e a seqüência dos insertos foi identificada por sequenciamento de DNA. Sequenciamento do N-terminal da proteína do anticorpo MJ 2-7 de camundongo purificado foi usado para con- firmar que as seqüências traduzidas correspondiam à seqüência proteica observada.
Seqüências nucleotídicas e de aminoácidos exemplares de anti- corpo de camundongo monoclonal MJ 2-7 que interage com NHP IL-13 e que tem características que sugerem que possa interagir com a IL-13 huma- na são como se segue:
Uma seqüência nucleotídica exemplar que codifica o domínio variável da cadeia pesada inclui:
GAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT GTGAAGCCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGGTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC ACCTATATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGGAAGGATT GATCCTGCGA ATGATAATAT TAAATATGAC CCGAAGTTCC AGGGCAAGGC CACTATAACA GCAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTGCTAG ATCTGAGGAA AATTGGTACG ACTTTTTTGA CTACTGGGGC CAAGGCACCA CTCTCACAGT CTCCTCA (SEQ ID NO:129)
Uma seqüência de aminoácidos exemplar do domínio variável da cadeia pesada inclui:
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRI DPANDNIKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLOLNSLTSEDTAVYYCARSEEN WYDFFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID N0:130)
As CDRs estão sublinhadas. O domínio variável opcionalmente é precedido por uma seqüência líder, por exemplo, MKCSWVIFFL- MAVVTGVNS (SEQ ID NO: 131). Uma seqüência nucleotídica exemplar que codifica o domínio variável da cadeia leve inclui:
GAT GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA AGCCTCCATC TCTTGCAGGT CTAGTCAGAG CATTGTACAT AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTAC CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT GGGGTCCCAG ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATTAGC AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA TATTCCGTAC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAA (SEQ ID NO: 132)
Uma seqüência de aminoácidos exemplar do domínio variável da cadeia leve inclui:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKL LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTF GGGTKLEIK (SEQ ID NO:133)
As CDRs estão sublinhadas. A seqüência de aminoácidos op- cionalmente é precedida por uma seqüência líder, por exemplo, MKLPVRL- LVLMFWIPASSS (SEQ ID NO:134). O termo "MJ 2-7" é usado intercambia- velmente com o termo "mAb7.1.1", neste pedido. Exemplo 3: Anticorpo C65
As seqüências nucleotídicas e de aminoácido exemplares do anticorpo monoclonal de camundongo C65, que interage com NHP IL-13 e que tem características que sugerem que possa interagir com IL-13 humana são como se segue:
Uma seqüência de ácido nucleico exemplar do domínio variável da cadeia pesada inclui:
1 ATGGCTGTCC TGGCATTACT CTTCTGCCTG GTAACATTCC CAAGCTGTAT
51 CCTTTCCCAG GTGCAGCTGA AGGAGTCAGG ACCTGGCCTG GTGGCGCCCT 101 CACAGAGCCT GTCCATCACA TGCACCGTCT CAGGGTTCTC ATTAACCGGC 151 TATGGTGTAA ACTGGGTTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT 201 GGGAATAATT TGGGGTGATG GAAGCACAGA CTATAATTCA GCTCTCAAAT 251 CCAGACTGAT CATCAACAAG GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTAAAA 3 01 ATGAACAGTC TGCAAACTGA TGACACAGCC AGGTACTTCT GTGCCAGAGA 3 51 TAAGACTTTT TACTACGATG GTTTCTACAG GGGCAGGATG GACTACTGGG 401 GTCAAGGAAC CTCAGTCACC GTCTCCTCA (SEQ ID NO: 13 5)
Uma seqüência de aminoácidos exemplar do domínio variável da cadeia pesada inclui: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGYGVNWVRQPPGKGLEWLGII WGDGSTDYNSALKSRLIINKDNSKSKVFLKMNSLQTDDTARYFCARDKTFY YDGFYRGRMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:136)
As CDRs estão sublinhadas. A seqüência de aminoácidos op- cionalmente é precedida por uma seqüência líder, por exemplo, MAVLAL- LFCLVTFPSCILS (SEQ ID NO:137).
Uma seqüência nucleotídica exemplar que codifica o domínio variável da cadeia leve inclui:
1 ATGAACACGA GGGCCCCTGC TGAGTTCCTT GGGTTCCTGT TGCTCTGGTT 51 TTTAGGTGCC AGATGTGATG TCCAGATGAT TCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTTT GGGAGACATT GTCACCATGA CTTGCCAGGC AAGTCAGGGC 151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AAGCTCCTAA 201 GCTCCTGATC TTTGGTGCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAAATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 3 01 GAGGATGAAG ATATGGCAAC TTATTTCTGT CTACAGCATA GTTATCTCCC 351 GTGGACGTTC GGTGGCGGCA CCAAACTGGA AATCAAA (SEQ ID NO: 13 8)
Uma seqüência de aminoácidos exemplar do domínio variável da cadeia leve inclui:
DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGKAPKLLIFGA SNLEDGVPSRFSGSRYGTNFTLTISSLEDEDMATYFCLQHSYLPWTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO:139)
As CDRs estão sublinhadas. A seqüência de aminoácidos op- cionalmente é precedida por uma seqüência líder, por exemplo, MNTRAPA- EFLGFLLLWFLGARC (SEQ ID N0:140). Exemplo 4: seqüências de Fc A Ser na posição #1 de SEQ ID NO: 128 representa o resíduo de
aminoácido #119 em um primeiro esquema de numeração de anticorpo de tamanho total exemplar no qual a Ser é precedida pelo resíduo #118 de um domínio variável da cadeia pesada. No primeiro esquema de numeração de anticorpo de tamanho total exemplar, aminoácidos mutados estão em nume- rados 234 e 237, e correspondem as posições 116 e 119 de SEQ ID NO: 128. Dessa maneira, a seguinte seqüência representa um domínio Fc com duas mutações: L234A e G237A, de acordo com o primeiro esquema de numeração de anticorpo de tamanho total exemplar. Mus musculus (SEQ ID NO: 128)
A seguinte é outra seqüência do domínio Fc humano exemplar: STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N0:141)
Outras alterações exemplares que podem ser usadas para reduzir a função efetora incluem L234A; L235A), (L235A; G237A), e N297A. Exemplo 5: IL-13 e IqE em Camundonqos
IL-13 está envolvida na produção de IgE1 um importante media- dor de doença atópica. Camundongos deficientes em IL-13 tiveram reduções parciais na IgE sérica e respostas do mastócito à IgE1 ao passo que camun- dongos em falta do agente de ligação à IL- 13 natural, iL-13Ra2-/-, tiveram níveis aumentados de IgE e função efetora de IgE.
Camundongos fêmeas BALB/c foram obtidos a partir de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Os camundongos IL-13Ra2-/- são descritos, por exemplo, em Wood et al. (2003J J. Exp. Med. 197:703-9. Camundongos deficientes em IL-13 são descritos, por exemplo, em McKenzie et al. (1998) Immunity 9:423-32. Todas as linhagens mutantes estavam no contexto de BALB/c.
Níveis séricos IgE foram medidos por ELISA. Placas de ELISA
(MaxiSorp; Nunc, Rochester, NY) foram recobertas durante a noite a 4°C com IgE anti-camundongo de rato (BD Biosciences, San Diego, CA). As pia- cas foram bloqueadas por 1 hora à temperatura ambiente com a gelatina 0,5% em PBS1 lavadas em PBS contendo TWEEN®-20 0,05% (PBS-Tween), e incubads por seis horas à temperatura ambiente com IgE de camundongo purificada (BD Biosciences) como padrões ou com diluições de soro. A Iiga- ção foi detectada com IgE anti-camundongo biotinilada (BD Biosciences) usando IgG de camundongo (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) como um blo- queador. A ligação foi detectada com estreptavidina ligada à peroxidase (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) e substrato SU- RE BLUE™ (KPL Inc., Gaithersburg, MD). A fim de investigar a exigência de IL-13 para sustentas os níveis
basais de IgE em camundongos naive, o soro foi examinado na ausência de imunização específica de camundongos de tipo selvagem e de camundon- gos geneticamente deficientes em IL-13 e IL-13Ra2. Camundongos deficien- tes em IL-13 tiveram níveis praticamente indetectáveis de IgE sérica. Ao contrário, camundongos em falta do receptor inibitório de IL-13Rcc2 exibiram níveis elevados de IgE sérica. Estes resultados demonstram que o bloqueio de IL-13 pode ser útil para tratamento ou prevenção de desordens atópica. Exemplo 6: IL-13 e Desordens Atópicas
A capacidade de MJ2-7 inibir a bioatividade da IL-13 humana nativa (a 1 ng/ml) foi avaliada em um ensaio de fosforilação de STAT6. MJ2- 7 inibiu a atividade da IL-13 nativa humana com uma IC50 de aproximada- mente 0,293 nM neste ensaio. Um anticorpo com a cadeia pesada murina de MJ2-7 e uma cadeia leve humanizada inibiu a atividade da IL-13 nativa hu- mana com um IC50 de aproximadamente 0,554 nM neste ensaio. A capacidade de MJ2-7 inibir IL-13 de primata não-humano (a 1
ng/ml) foi avaliada em um ensaio para expressão de CD23. O MJ2-7 inibiu a atividade de IL-13 de primata não-humano com uma IC50 de aproximada- mente 0,242 nM neste ensaio. Um anticorpo com a cadeia pesada murina de MJ2-7 e uma cadeia leve humanizada inibiu a atividade da IL-13 de primata não-humano com uma IC50 de aproximadamente 0,308 nM neste ensaio. Exemplo 7: Seqüências nucleotídicas e de aminoácidos de anticorpo MJ 2-7 de camundongo A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada (com um líder opcional) é como se segue:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTTAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT GTGAAGCCAG 101 GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGGTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC 151 ACCTATATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT 201 TGGAAGGATT GATCCTGCGA ATGATAATAT TAAATATGAC CCGAAGTTCC 251 AGGGCAAGGC CACTATAACA GCAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA 3 01 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTGCTAG 351 ATCTGAGGAA AATTGGTACG ACTTTTTTGA CTACTGGGGC CAAGGCACCA 401 CTCTCACAGT CTCCTCA (SEQ ID NO:142)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da com um líder opcional (sublinhado) é como se segue: 1 MKCSWVIFFL MAWTGVNSE VQLQQSGAEL VKPGASVKLS CTGSGFNIKD 51 TYIHWVKQRP EQGLEWIGRI DPANDNIKYD PKFQGKATIT ADTSSNTAYL
101 QLNSLTSEDT AVYYCARSEE NWYDFFDIWG QGTTLTVSS (SEQ ID NO: 143)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia leve é como se segue:
1 ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC 51 CAGCAGTGAT GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC 101 TTGGAGATCA AGCCTCCATC TCTTGCAGGT CTAGTCAGAG CATTGTACAT 151 AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTAC CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC 201 TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT GGGGTCCCAG 251 ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATTAGC 301 AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA
351 TATTCCGTAC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAA (SEQ ID NO: 144)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve com um líder opcional (sublinhado) é como se segue: 1 MKLPVRLLVL MFWIPASSSD VLMTQTPLSL PVSLGDQASI SCRSSQSIVH 51 SNGNTILEWY LQKPGQSPKL LIYKVSNRFS GVPDRFSGSG SGTDFTLQUIS 101 RVEAEDLGVY YCFQGSHIPY TFGGGTKLEI K (SEQ ID NO:145) Exemplo 8: Seqüências nucleotídicas e de aminoácidos das primeiras vari- antes humanizadas exemplares do anticorpo MJ 2-7
A Versão 1 do anticorpo humanizada (VI) é baseada nos clones de linhagem germinativa humana mais próximos. A seqüência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de hMJ 2-7 V1 (hMJ 2-7 VH V1) (com uma seqüência que codifica uma seqüência líder opcional) é como se segue:
1 ATGGATTGGA CCTGGCGCAT CCTGTTCCTG GTGGCCGCTG CCACCGGCGC 51 TCACTCTCAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG CGCCGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GCGCTTCCGT GAAGGTGTCC TGTAAGGCCT CCGGCTTCAA CATCAAGGAC 151 ACCTACATCC ACTGGGTGCG GCAGGCTCCC GGCCAGCGGC TGGAGTGGAT 201 GGGCCGGATC GATCCTGCCA ACGACAACAT CAAGTACGAC CCCAAGTTTC 251 AGGGCCGCGT GACCATCACC CGCGATACCT CCGCTTCTAC CGCCTACATG 301 GAGCTGTCTA GCCTGCGGAG CGAGGATACC GCCGTGTACT ACTGCGCCCG 351 CTCCGAGGAG AACTGGTACG ACTTCTTCGA CTACTGGGGC CAGGGCACCC 401 TGGTGACCGT GTCCTCT (SEQ ID NO:14 6)
A seqüência de aminoácidos da região variável cia cadeia pesa-
da (hMJ 2-7 V1) é baseada em uma CDR enxertada em DP-25, VH-I, 1-03. A seqüência de aminoácidos com um líder opcional (primeira região subli- nhada; CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões subse- quentes sublinhadas) é como se segue: 1 MDWTWRILFL VAAATGAHS - Q VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGFNIKD 51 TYIHWVRQAP GQRLEWMGRI DPANDNIKYD PKFQGRVTIT RDTSASTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARSEE NWYDFFDYWG QGTLVTVSSG ESCR (SEQ ID NO: 147)
A seqüência nucleotídica da região variável da cadeia leve de hMJ 2-7 Vl (hMJ 2-70 VL V1) (com uma seqüência que codifica uma se- qüência líder opcional) é como se segue:
1 ATGCGGCTGC CCGCTCAGCT GCTGGGCCTG CTGATGCTGT GGGTGCCCGG 51 CTCTTCCGGC GACGTGGTGA TGACCCAGTC CCCTCTGTCT CTGCCCGTGA 101 CCCTGGGCCA GCCCGCTTCT ATCTCTTGCC GGTCCTCCCA GTCCATCGTG 151 CACTCCAACG GCAACACCTA CCTGGAGTGG TTTCAGCAGA GACCCGGCCA 201 GTCTCCTCGG CGGCTGATCT ACAAGGTGTC CAACCGCTTT TCCGGCGTGC 251 CCGATCGGTT CTCCGGCAGC GGCTCCGGCA CCGATTTCAC CCTGAAGATC 3 01 AGCCGCGTGG AGGCCGAGGA TGTGGGCGTG TACTACTGCT TCCAGGGCTC
351 CCACATCCCT TACACCTTTG GCGGCGGAAC CAAGGTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:148)
Esta versão é baseada em um enxerto de CDR em DPK18, V kappall. A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de hMJ 2-7 V1 (hMJ 2-7 VL V1) (com líder opcional como primeira região subli- nhada; CDRs baseadas na definição de AbM em regiões subsequentes sub- linhadas) é como se segue:
1 MRLPAQLLGL LMLWVPGSSG-DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSIV
51 HSNGNTYLEW FQQRPGQSPR RLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLQUI 101 SRVEAEDVGV YYCFQGSHIPYTfrGGGTKVE IK (SEQ ID NO:149)
Exemplo 9: Seqüências nucleotídicas e de aminoácidos das segundas vari- antes humanizadas exemplares do anticorpo MJ 2-7
A seguinte região variável da cadeia pesada é baseada em um enxerto de CDR em DP-54, VH-3, 3-07. A seqüência nucleotídica da região variável da cadeia pesada da Versão 2 (V2) de hMJ 2-7 (hMJ 2-7 VH V2) (com uma seqüência que codifica uma seqüência líder opcional) é como se segue:
1 ATGGAGCTGG GCCTGTCTTG GGTGTTCCTG GTGGCTATCC TGGAGGGCGT 51 GCAGTGCGAG GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG CGGCGGACTG GTGCAGCCTG 101 GCGGCTCTCT GCGGCTGTCT TGCGCCGCTT CCGGCTTCAA CATCAAGGAC 151 ACCTACATCC ACTGGGTGCG GCAGGCTCCC GGCAAGGGCC TGGAGTGGGT
2 01 GGCCCGGATC GATCCTGCCA ACGACAACAT CAAGTACGAC CCCAAGTTCC 251 AGGGCCGGTT CACCATCTCT CGCGACAACG CCAAGAACTC CCTGTACCTC
3 01 CAGATGAACT CTCTGCGCGC CGAGGATACC GCCGTGTACT ACTGCGCCCG 351 GAGCGAGGAGAACTGGTACG ACTTCTTCGA CTACTGGGGC CAGGGCACCC
401 TGGTGACCGTGTCCTCT (SEQ ID NO:150)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de hMJ 2-7 V2 (hMJ 2-7 VH V2) com um líder opcional (primeira região sublinhada; CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub- Iinhadas subsequentes) é como se segue:
1 MELGLSWVFL VAILEGVQC-E VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFNIKD 51 TYIHWVRQAP GKGLEWVARI DPANDNIKYD PKFQGRFTIS RDNAKNSLYL 101 QMNSLRAEDT AVYYCARSEE NWYDFFDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO:151)
A região variável da cadeia leve de hMJ 2-7 V2 foi baseada em um enxerto de CDR em DPK9, V kappal, 02. A seqüência nucleotídica da região variável da cadeia leve de hMJ 2-7 V2 (hMJ 2-7 VL V2) (com uma seqüência que codifica uma seqüência líder opcional) é como se segue:
1 ATGGATATGC GCGTGCCCGC TCAGCTGCTG GGCCTGCTGC TGCTGTGGCT 51 GCGCGGAGCC CGCTGCGATA TCCAGATGAC CCAGTCCCCT TCTTCTCTGT 101 CCGCCTCTGT GGGCGATCGC GTGACCATCA CCTGTCGGTC CTCCCAGTCC 151 ATCGTGCACT CCAACGGCAA CACCTACCTG GAGTGGTATC AGCAGAAGCC 201 CGGCAAGGCC CCTAAGCTGC TGATCTACAA GGTGTCCAAC CGCTTTTCCG 251 GCGTGCCTTC TCGGTTCTCC GGCTCCGGCT CCGGCACCGA TTTCACCCTG 3 01 ACCATCTCCT CCCTCCAGCC CGAGGATTTC GCCACCTACT ACTGCTTCCA 351 GGGCTCCCAC ATCCCTTACA CCTTTGGCGG CGGAACCAAG GTGGAGATCA 401 AGCGT (SEQ ID NO:152)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia leve
de hMJ 2-7 V2 região variável da cadeia leve (hMJ 2-7 VL V2) (com o peptí- deo líder opcional sublinhado e CDRs baseadas na definição de AbM mos- trada nas regiões sublinhadas subsequentes) é como se segue: 1 MDMRVP AQLL GLLLLWLRGA RC-DIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRSSQS 51 IVHSNGNTYL EWYQQKPGKA PKLLIYKVSN RFSGVPSRFS GSGSGTDFTL 101 TISSLQPEDF ATYYCFQGSH IPYTFGGGTK VEIKR (SEQ ID NO:153)
Versões humanizadas adicionais da região variável da cadeia pesada de MJ 2-7 V2 foram feitas. Estas versões incluíram mutações rever- sas que têm aminoácidos murinos em posições selecionadas da região con- servada.
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada da "Versão 2.1" ou V2.1 com as mutações reversas V48I, A29G é como se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 2 01 gttcaccatc tctcgcgaca acgccaagaa ctccctgtac ctccagatga 251 actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag
3 01 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac
3 51 cgtgtcctct (seq id no:154)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa-
da de V2.1 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub- linhadas subsequentes) é como se segue:
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR 51 IDPANDNIKY DPKFOGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE 101 ENWYDFFDYW GOGTLVTVSS (SEQ ID NO:155)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada de V2.2 com as mutações reversas (R67K; F68A) é como se segue:
ι gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc 51 tctgcggctg tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca ιοί tccactgggt gcggcaggct cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgg 151 atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac gaccccaagt tccagggcaa 201 ggccaccatc tctcgcgaca acgccaagaa ctccctgtac ctccagatga
251 actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 3 01 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac 351 cgtgtcctct (seq id no:156)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.2 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub- linhadas subsequentes) é como se segue: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR 51 IDPANDNIKY DPKFOGKATI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE 102 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:157)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada de V2.3 com as mutações reversas (R72A):
1 gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc 51 tctgcggctg tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca 101 tccactgggt gcggcaggct cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgg 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG
301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC
351 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO:15 8)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.3 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub- linhadas subsequentes) é como se segue:
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR 51 IDPANDNIKY PPKFQGRFTI SADNAKNSLY LOMNSLRAED TAVYYCARSE
103 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:159)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada de V2.4 com as mutações reversas (A49G) é como se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGGCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTCGCGACA ACGCC AAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 3 01 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC 351 CGTGTCCTCT (SEQ ID N0:160)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.4 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub- linhadas subsequentes) é como se segue: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVGR 51 IDPANDNIKY PPKFQGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE
104 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 161)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada de V2.5 com as mutações reversas (R67K;F68A;R72A) é como se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGCCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCAA 201 GGCCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA
251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 3 01 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC
352 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO:162)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.5 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub- linhadas subsequentes) é como se segue: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR 51 IDPANDNIKY DPKFQGKATI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE
105 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 163)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada de V2.6 com as mutações reversas (V48I;A49G;R72A) é como se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC 351 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO:164)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.6 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub- linhadas subsequentes) é como se segue:
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR 51 IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE
106 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 165)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca-
deia pesada de V2.7 com as mutações reversas (A49G;R72A) é como se segue: 1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGGCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 3 01 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC 351 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO:16 6)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa da de V2.7 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub Iinhadas subsequentes) é como se segue:
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVGR 51 IDPANDNIKY PPKFQGRFTI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE
107 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 167)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca deia pesada de V2.8 com as mutações reversas (L79A) é como se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGCCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTCGCGACA ACGCCAAGAA CTCCGCCTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC 351 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO:16 8)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa da de V2.8 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sub Iinhadas subsequentes) é como se segue:
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR 51 IDPANDNIKY PPKFQGRFTI SRDNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCARSE
108 ENWYDFFDYW GOGTLVTVSS (SEQ ID NO: 169)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca deia pesada de V2.10 com as mutações reversas (A49G;R72A;L79A) é co mo se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GGTGGGCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCGCCTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC 351 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO:170)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.10 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sublinhadas subsequentes) é como se segue:
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVGR 51 IDPANDNIKY DPKFOGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCARSE
109 ENWYPFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO:171)
A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada de V2.11 com as mutações reversas (V48I;A49G;R72A;L79A) é como se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCGCCG CTTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCGCCTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 301 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC 351 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO: 172)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.11 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sublinhadas subsequentes) são como se segue: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR 51 IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCARSE
110 ENWYPFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ IDNO:173) A seqüência nucleotídica que codifica a região variável da ca- deia pesada de V2.16 com as mutações reversas (V48I;A49G;R72A) é como se segue:
1 GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGCGGCGGA CTGGTGCAGC CTGGCGGCTC 51 TCTGCGGCTG TCTTGCACCG GCTCCGGCTT CAACATCAAG GACACCTACA 101 TCCACTGGGT GCGGCAGGCT CCCGGCAAGG GCCTGGAGTG GATCGGCCGG 151 ATCGATCCTG CCAACGACAA CATCAAGTAC GACCCCAAGT TCCAGGGCCG 201 GTTCACCATC TCTGCCGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAC CTCCAGATGA 251 ACTCTCTGCG CGCCGAGGAT ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CCGGAGCGAG 3 01 GAGAACTGGT ACGACTTCTT CGACTACTGG GGCCAGGGCA CCCTGGTGAC 3 51 CGTGTCCTCT (SEQ ID NO:174)
A seqüência de aminoácidos da região variável da cadeia pesa- da de V2.16 (CDRs baseadas na definição de AbM mostrada nas regiões sublinhadas subsequentes) é como se segue: 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCTGSGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWIGR 51 IDPANDNIKY DPKFQGRFTI SADNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARSE 111 ENWYDFFDYW GQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 175)
O seguinte é a seqüência de aminoácidos de um MH 2-7 V2.11 de IgGI humanizada com um domínio CH2 mutado: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWIGRI DPANDNIKYDPKFQGRFTISADNAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSEEN WYDFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:176)
O domínio variável está nos aminoácidos 1 a 120; CHI em 121 a
218; dobradiça em 219 a 233; CH2 em 234 a 343 e CH3 em 344 a 450. A cadeia leve inclui a seguinte seqüência com o domínio variável em 1 a 133. DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQKPGKAPKL LIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSHIPYTF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLQUSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEV- THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 177)
Exemplo 10: Ensaios Funcionais de Variantes Exemplares de MJ2-7
A capacidade do anticorpo MJ2-7 e variantes humanizadas foi avaliada para inibir a IL-13 humana em ensaios de atividade da IL-13. Ensaio de fosforilação de STAT6. Células epiteliais colônicas humanas HT-29 (ATCC) foram culti-
vadas como uma monocamada aderente em meio de McCoy 5A contendo FBS 10%, Pen-Estrep1 glutamina e bicarbonato de sódio. Para o ensaio, as células foram removidas da garrafa usando tripsina, lavadas com meio fres- co, e distribuídas em tubos de poliestireno de 12x75 mm. IL-13 recombinante humana (R&D Systems, Inc.) foi adicionada nas faixas de concentrações de 100 a 0,01 ng/ml. Para ensaios que testam a capacidade do anticorpo de inibir a resposta de IL-13, 1 ng/ml de IL-13 recombinante humana foi adicio- nado junto com diluições do anticorpo na faixa de 500 a 0,4 ng/ml. As células foram incubadas em um banho de água a 37°C por 30 a 60 minutos, então lavadas com PBS gelado contendo BSA 1%. As células foram fixadas por incubação em paraformaldeído 1% em PBS por 15 minutos a 37°C, então lavadas no PBS contendo BSA 1%. Para permeabilização do núcleo, as cé- lulas foram incubadas durante a noite a -20°C em metanol absoluto. Elas foram lavadas em PBS contendo BSA 1%, então marcadas com anticorpo para STAT6 marcado com ALEXA™ Fluor 488 (BD Biosciences).
A fluorescência foi analisada com um FACSCAN™ e programa CELLQUEST™ (BD Biosciences). Indução de CD23 em monócitos humano
Células mononucleares foram isoladas a partir do sangue perifé- rico humano por gradiente de sedimentação com HISTOPAQUE® (Sigma). As células foram lavadas em RPMI contendo SFB 10% inativado pelo calor, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml, L-glutamina 2mM, e plaqueadas em placa de cultura de tecido de 48 poços (Costar/Corning). IL-13 recombi- nante humana (R&D Systems, Inc.) foi adicionada em na faixa de diluição de 100 a 0,01 ng/ml. Para ensaios que testam a capacidade do anticorpo de inibir resposta de IL-13, 1 ng/ml de IL-13 recombinante humana foi adiciona- da junto com diluições do anticorpo na faixa de 500 a 0,4 ng/ml. As células foram incubadas durante a noite a 37°C em uma incubadora de CO2 5%. No dia seguinte, as células foram colhidas dos poços usando Solução de Disso- ciação Celular não-enzimática (Sigma), então lavadas com PBS gelado con- tendo BSA 1%. As células foram incubadas com anticorpo para CD23 hu- mano marcado com ficoeritrina (PE) (BD Biosciences, San Diego1 CA), e anticorpo para CD11b humano marcado com Cy-Chrome (BD Biosciences). Monócitos foram selecionados com base na alta dispersão frontal e lateral da luz, e expressão de CD11b. A expressão de CD23 em monócitos foi de- terminada por citometria de fluxo usando um FACSCAN™ (BD Biosciences), e a porcentagem de células CD23+ foi analisada com o programa CELL- QUEST™ (BD Biosciences). Proliferação celular de TF-1
Células TF-1 são uma linhagem celular hemopoiética humana dependente de fatores necessitando interleucina-3 (IL-3) ou fator estimulante de colônia de granulóciteo/macrófago (GM-CSF) para seu crescimento a longo prazo. As células TF-1 também respondem a várias outras citocinas, incluindo interleucina-13 (IL-13). Células TF-1 (ATCC) foram mantidas em meio RPMI contendo SFB 10% inativado por calor, penicilina 50 U/ml, es- treptomicina 50 mg/ml, L-glutamina 2 mM, e GM-CSF recombinante humano 5 ng/ml (R&D Systems). Antes do ensaio, as células foram privadas de GM- CSF durante a noite. Para o ensaio, as células TF-1 foram plaqueadas em duplicata a 5000 células/poço em microplacas de 96 poços com fundo chato (Costar/Corning), e desafiadas com IL-13 humana (R&D Systems), de faixa de 100 a 0,01 ng/ml. Após 72 horas em uma incubadora a 37°C com CO2 5%, as células foram pulsadas com 1 pCi de 3H-timidina/poço (Perkin El- mer/New England Nuclear). Elas foram incubadas 4,5 horas adicionais, en- tão as células foram colhidas sobre uma manta de filtro usando um coletador ΤΟΜΤΕΚ™. A incorporação de 3H-timidina foi avaliada por contagem de cin- tilação líquida.
Ensaio para produção de tenascina
Células epiteliais brônquicas humanas BEAS-2B (ATCC) foram mantido em meio BEGM com suplementos (Clonetics). As células foram pla- queadas em 20.000 por poço em placa de cultura de 96 poços de fundo cha- to durante a noite. Meio fresco foi adicionado contendo IL-13 na presença ou ausência do anticorpo indicado. Após incubação noturna, os sobrenadantes são coletados, e analisados para a presença do componente de matriz ex- tracelular, tenascina C, por ELISA. As placas de ELISA são recobertas du- rante a noite com 1 pg/ml do anticorpo monoclonal murino para tenascina humana (lgG1, k; Chemicon International) em PBS. As placas são lavadas com PBS contendo TWEEN®-20 0,05% (PBS-TWEEN), e bloqueadas com PBS contendo BSA 1%. A solução de bloqueio fresca foi adicionada a cada 6 minutos para um total de três modificações. As placas foram lavadas 3X com PBS-TWEEN. Os sobrenadantes celulares ou a tenascina humana pa- drão (Chemicon International) foram adicionados e incubados por 60 minutos a 37°C. As placas foram lavadas 3X com PBS-TWEEN. Tenascina foi detec- tada com o anticorpo monoclonal murino para tenascina (lgG2a, k; Biohit). A ligação foi detectada com o anticorpo lgG2a para camundongo marcado com HRP, seguido por substrato TMB. A reação foi parada com ácido sulfúrico 0,01 N. Absorvância foi lida a 450 nm.
A linhagem celular epitelial humana HT 29 pode ser usada para analisar a fosforilação de STAT6. Células HT 29 são incubadas com a pre- paração bruta de IL-13 humana nativa 1 ng/ml na presença de concentra- ções crescentes do anticorpo teste por 30 minutos a 37°C. A análise por Western blot dos Iisados celulares com um anticorpo para STAT6 fosforilada pode ser usada para detectar a fosforilação de STAT6 dependente de dose mediada por IL-13. Semelhantemente, a análise por citometria de fluxo pode detectar STAT6 fosforilada em células HT 29 que foram tratadas com uma concentração de saturação de IL-13 por 30 minutos a 37°C, fixadas, perme- abilizadas, e marcadas com mAb para STAT6-fosfo marcado com ALEXA™ Fluor 488a. Um conjunto exemplar de resultados é apresentado na Tabela 1. A atividade inibidora de V2.11 foi comparável a de slL-13Ra2-Fc._
Construto VH VL Mutação rever- sa em VH Expressão Mg/ml/ COS; 48h IC 50 do ensaio de STAT6e hIL-13 nativa, nM V 2.0 V2 enxerto de CDR Nenhum, CDR enxertada 8 a 10 >100 V 2.1 V2 V48I; A49G 9 a 14 2,8 V 2.2 V2 R67K; F68A 5 a 6 >100 V 2.3 V2 R72A 8a 9 1,67 a 2,6 V 2.4 V2 A49G 10 17,5 V 2.5 V2 R67K; F68A; R72A 4 a 5 1,75 V 2.6 V2 V48I; A49G; R72A 11 a 12 1,074 a 3,37 V 2.7 V2 A49G; R72A 10 a 11 1,7 V2.11 V2 V48I; A49G: R72A: L79A 24 0,25 a 0,55
Exemplo 11: Sítio de Interação de Ligação Entre IL-13 e IL-13Ra1
Um complexo de IL-13, o domínio extracelular de IL-13Ra1 (re-
síduos 27 a 342 de SEQ ID NO:125), e um anticorpo que se liga ào IL-13 humana foram estudados por cristalografia de raio x. Ver, por exemplo, US 07/0048785. Dois pontos de interação substancial foram encontrados entre IL-13 e IL-13Ra1. A interação entre o domínio 1 da Ig de IL-13Ra1 e IL-13 resulta na formação de uma folha de beta estendida atravessando as duas moléculas. Os resíduos Thr88 [Thr107], Lys89 [Lys108], Ile90 [Ile109] e Glu91 [Glu110] da IL-13 (SEQ ID NO:124, seqüência madura [seqüência de completa (SEQ ID NO:178)]) formam uma folha de beta que interage com os resíduos Lys76, Lys77, Ile78 e Ala79 do receptor (SEQ ID NO: 125). Adicio- nalmente, a cadeia lateral de Met33 [Met52] da IL-13 (SEQ ID NO: 124 [SEQ ID NO:178]) estende-se em uma bolsa hidrofóbico que é criada pelas cadei- as laterais destas folhas contíguas. A característica predominante da intera- ção com o domínio 3 da Ig é a inserção de um resíduo hidrofóbico (Phe107 [Phe126]) de IL-13 (SEQ ID NO:124 [SEQ ID NO:178]) em uma bolsa hidro- fóbicao no domínio 3 da Ig do receptor IL-13Ra1. A bolsa hidrofóbica de IL- 13Ra1 é formada pelas cadeias laterais dos resíduos Leu319, Cys257, Arg256 e Cys320 (SEQ ID NO:125). A interação com Phe107 [Phe126] da IL-13 (SEQ ID NO:124 [SEQ ID NO:178]) resulta em um conjunto extenso de interações de van der Waals entre os resíduos de aminoácido Ile254, Ser255, Arg256, Lis318, Cis320, e Tir321 do IL-13Ra1 (SEQ ID NO:125) e os resíduos de aminoácido Arg11 [Arg30], Glu12 [Glu31], Leu13 [Leu32], Ile14 [Ile33], Glu15 [Ile34], Lys104 [Lys123], Lys105 [Lys124], Leu106 [Leu125], Phe107 [Phe126], e Arg107 [Arg 127] da IL-13 (SEQ ID NO:124 [SEQ ID NO:178]). Estes resultados demonstram que um agente de ligação à IL-13 que se liga às regiões de IL-13 envolvidas na interação com IL- 13Ra1 pode ser usado para inibir a sinalização de IL-13.
Exemplo 12: Expressão do anticorpo MJ 2- 7 humanizado em células COS
Para avaliar a produção de anticorpos anti-IL-13 de NHP quimé- ricos no sistema recombinante de mamífero, as regiões variáveis do anticor- po MJ 2-7 de camundongo foram subclonados em um vetor de expressão pED6 contendo kappa humano e regiões constantes da IgGImut. As células COS-1 de rim de macaco foram cultivadas em meio DME (Gibco) contedo soro fetal bovino 10% inativado pelo calor, glutamina 1 mM e Penicili- na/Estreptomicina 0,1 mg/ml. Transfecção de células COS foi realizada u- sando o reagente de Trasnfecção TRANSITIT™-LT1 (Mirus) de acordo com o protocolo sugerido pelo fornecedor do reagente. Células COS transfecta- das foram incubadas por 24 horas a 37°C na presença de CO2 10%, lavadas com PBS estéril, e então cultivadas em meio RICDI (Gibco) sem soro por 48 horas para permitir a secreção de anticorpo e a acúmulo no meio condicio- nado. A expressão do anticorpo chMJ 2-7 foi quantificada por ELISA de IgG humana total usando anticorpo IgGI/kappa humano purificado como um pa- drão.
A produção de anticorpo MJ 2-7 quimérico em células COS foi significativamente menor que a do anticorpo quimérico controle (Tabela 2). Por isso, a otimização da expressão do Ab foi incluída no processo de hu- manização de MJ 2-7. MJ 2-7 Vl humanizado foi construído através do en- xerto de CDR nas CDRs da cadeia pesada de MJ 2-7 de camundongo no clone de linhagem germinativa humana mais homólogo, DP 25, que é bem expresso e representado na resposta a anticorpo humano típico. As CDRs da cadeia leve foram subclonadas no clone de linhagem germinativa huma- no DPK 18 a fim de gerar huMJ 2-7 Vl VL. O MJ 2-7 V2 humanizado foi feito através do enxerto de CDR de CDRs da região variável da cadeia pesada de MJ 2-7 na região gênica conservada da linhagem germinativa humana DP54 e as CDRs da região variável da cadeia leve de MJ 2-7 na região gênica conservada da linhagem germinativa humana DPK9. O clone DP 54 perten- ce ao subgrupo de genes da linhagem germinativa humana VH Ill e DPK9 é do subgrupo V kappa I da linhagem germinativa humana. As moléculas de anticorpo que incluem as regiões conservadas de VH Ill e V kappa I têm alto nível de expressão no sistema de E. coli e possuem alta estabilidade e solu- bilidade em soluções aquosas (ver, por exemplo, Stefan Ewert et al., J. Moi Bioi (2003), 325; 531-553, Adrian Auf et al., Methods (2004) 34:215-224). Usamos a combinação de regiões conservadas humanas DP54/DPK9 na produção de vários anticorpos recombinantes e alcançamos uma alta ex- pressão do anticorpo (> 20 Mg/ml) nos experimentos de transfecção transien- te em COS.
Tabela 2
mAb Expressão, pg/ml 3D6 10,116 Ch MJ 2-7 PED6 (1) 2,44 Ch MJ 2 -7 PED6 (2) 2,035 h12A11 V2 1,639
A CDR enxertada nos genes MJ 2-7 V1 e V2, VH e VL foram subclonados em dois sistemas de vetor de expressão de mamíferos (pED6kappa/pED6 IgGImut e pSMEN2kappa/pSMED2lgG1 mut), e a produ- ção de anticorpos MJ 2-7 humanizados foi avaliada nos experimentos de transfecção transiente em COS como descrito acima. No primeiro conjunto de experimentos o efeito de várias combinações de huMJ 2-7 VL e VH a ex- pressão de anticorpos foi avaliado (Tabela 3). A modificação das regiões conservadas de MJ 2-7 VL para DKP9 aumentou a produção de anticorpo 8 a 10 vezes, ao passo que VL Vl (CDR enxertada em DPK 18) mostrou ape- nas um aumento moderado na produção de anticorpo. Este efeito foi obser- vado quando VL humanizada foi combinado com VH de MJ 2-7 quimérico e MJ 2-7 V1 e V2 humanizados. A CDR enxertada em MJ 2-7 V2 teve um nível de expressão 3 vezes maior que a CDR enxertada em MJ 2-7 V1 nas mes- mas condições de ensaio.
Tabela 3
mAb Expressão, Mg/ml ChMJ 2-7 1,83 hVH V1/mVL 3,04 hVH V1/ hVL V1 6,34 hVH V1 / hVL V2 15,4 hVH V2/ mVL 0,2 mVH / hVL-V2 18,41 hVH-V2 / hVL-V1 5,13 hVH-V2 / hVL-V2 10,79
Experimentos similares foram realizados com huMJ 2-7 V2 que
contêm mutações reversas nas regiões variáveis da cadeia pesada (Tabela 4). O maior nível de expressão foi detectado para huMJ 2-7 V2.11 que con- servou as propriedades de neutralização e ligação ao antígeno do anticorpo MJ 2-7 de camundongo. A introdução de mutações reversas nas posições 48 e 49 (V48I e A49G) aumentou a produção de anticorpo huMJ 2-7 V2 em células COS, ao passo que as mutações reversas de aminoácidos nas posi- ções 23, 24, 67 e 68 (A23T; A24G; R67K e F68A) tiveram um impacto nega- tivo na expressão do anticorpo. Tabela 4
mAb Expressão, pg/ml V2 8,27 V 2.1 12,1 V 2.2 5,29 V 2.3 9,60 V 2.4 8,20 V 2.5 6,05 V 2.6 11,3 V 2.10 9,84 V2.11 14,85 V 2.16 1,765 Exemplo 13: Avaliação das propriedades de liqacão ao antíaeno de anticor-
pos MJ 2-7 humanizados em NHP IL-13-FLAG por ELISA
A capacidade de mAb MJ 2-7 totalmente humanizado (VI, V2 v2) competir com o Ac MJ 2-7 de camundongo biotinilado para se ligar a IL-13 de NHP-FLAG foi avaliada por ELISA. As microplacas(Costar) foram reco- bertas por 1 Mg/ml de anticorpo monoclonal anti-FLAG de M2 (Sigma). A pro- teína IL-13 de NHP FLAG na concentração de 10 ng/ml foi misturada com 10 ng/ml de anticorpo MJ 2-7 de camundongo marcado com biotina e várias concentrações do anticorpo MJ 2-7 humanizado e de camundongo não mar- cado. A mistura foi incubada por 2 horas à temperatura ambiente e então adicionada à placa recoberta com o anticorpo anti-FLAG. A ligação de com- plexos de Ac IL-13 de NHP-FLAG/bioMJ2-7 foi detectada com estreptavidi- na-HRP e 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). O MJ humanizado 2-7 V2 per- deu significativamente a atividade ao passo que huMJ 2-7 V2.11 restaurou
Exemplo 14: modelagem molecular de MJ2-7 V2VH humanizado
Os moldes de estrutura para modelagem da versão 2 da cadeia pesada de MJ2-7 (MJ2-7 V2VH) humanizado foram selecionados com base em pesquisas de homologia no BLAST contra o Banco de Dados de Proteí- na (PDB). Além das duas estruturas selecionadas para pesquisa a partir do BLAST1 um molde adicional foi selecionado de um banco de dados interno de estruturas de proteína. O modelo de MJ2-7 V2VH foi construído usando as três estruturas molde 1JPS (estrutura co-cristalina do fator tecidual hu- mano no complexo com Fab humanizado de D3h44), 1N8Z (estrutura co- cristalina de Her2 humano no complexo com Fab de Herceptin) e F 13.2 (IL- 13 em complexo com o fragmento Fab do anticorpo de camundongo) como moldes e o módulo de Homologia do Insightll (Accelrys, San Diego). As regi- ões estruturalmente conservadas (SCRs) de 1JPS1 1N8Z e F13.2 (disponível de 16163-029001) foram determinadas com na matriz de distância Ca para cada molécula e as estruturas de molde foram sobrepostas com base no desvio mínimo de RMS de átomos correspondentes em SCRs. A seqüência da proteína alvo MJ2-7 V2VH foi alinhada às seqüências da proteína dos moldes sobrepostos e as coordenadas das SCRs foram determinadas para os resíduos correspondentes da proteína alvo. Baseado no grau de similari- dade de seqüência entre o alvo e os moldes em cada uma das SCRs, as coordenadas dos diferentes moldes foram usadas para SCRs diferentes. As coordenadas das alças e regiões variáveis não incluídas na SCRs foram ge- radas pelos métodos de Busca por Alça ou geração de Alça como implemen- tado no módulo de Homologia. Resumidamente, o método de Busca por Al- ça varre estruturas proteicas que se ajustariam corretamente entre duis S- CRs por comparação à matrix de distância de Ca dos resíduos de flanquea- mento da SCR com uma matriz pré-calculada derivada de estruturas protéi- cas que têm o mesmo número de resíduos flanqueadores e um segmento peptídico interveniente de um dado tamanho. O método de Gereção de Alça que gera coordenadas atômicas de novo foi usado nos casos onde as Busca por Alça não produziram resultados desejados. A conformação de cadeias laterais de aminoácidos foi mantida no mesmo como enquanto que no molde se o resíduo de aminoácido foi idêntico no molde e no alvo. Contudo, uma busca conformacional de rotâmeros foi feita e a conformação energicamente mais favorável foi conservada para aqueles resíduos que não são idênticos no molde e no alvo. Isto foi seguido pelo Reparo de Junção que configura uma simulação de mecânica molecular para obter tamanhos de ligação pró- prios e ângulos de ligação nas junções entre duas SCRs ou entre a SCR e uma região variável. Finalmente o modelo foi submetido à minimização e- nergética usando o algoritmo de Steepest Descents até um derivativo máxi- mo de 5 kcal/(mol A) ou 500 ciclos e o algoritmo de Conjugate Gradients até um derivativo máximo de 5 kcals/(mol A) ou 2000 ciclos. A qualidade do mo- delo foi avaliada usando o comando ProStat/Struct_Check. O modelo molecular de MJ2-7 VH de camundongo foi construído
pelo seguinte procedimento descrito para MJ2-7 V2VH humanizado exceto os moldes usados que foram 1QBL e 1QBM, estruturas cristalinas de FabE8 de anticorpo de cavalo anti-citocromo c.
Diferenças potenciais em ligações de H da CDR à região con- servada preditas pelos modelos
hMJ2-7 V2VH:G26 - hMJ2-7 V2VH:A24 hMJ2-7 V2VH:I109 - hMJ2-7 V2VH:S25 mMJ2-7 VH:D61 - mMJ2-7 VH:I48 mMJ2-7 VH:K63 - mMJ2-7 VH:E46 mMJ2-7 VH:I109 - mMJ2-7 VH:R98
Estas diferenças sugeriram as seguintes mutações reversas op- cionais: A23T, A24G e V48I.
Outras mutações reversas opcionais sugeridas com base no desvio significante de RMS dos aminoácidos individuais e as diferenças nos resíduos de aminoácido adjacentes a estes são: G9A, L115T e R87T. Exemplo 15: Atividade de neutralização de IL-13 de MJ2-7 e C65
As capacidades de neutralização de IL-13 de MJ2-7 e C65 foram testadas em uma série de bioensaios. Em primeiro lugar, a capacidade des- tes anticorpos de neutralizar a bioatividade de IL-13 de NHP foi testada em um ensaio de expressão de CD23 em monócito. PBMC humanos isolados há pouco tempo foram incubados durante a noite com 3 ng/ml de IL-13 de NHP na presença de concentrações crescentes de MJ2-7, C65 ou sIL- 13Ra2-Fc. As células foram coletadas, marcadas com anticorpo para o mar- cador específico para monócito marcado com CYCHROME™, CD11b, e com o anticorpo para CD23 marcado com PE. Em resposta ao tratamento com IL-13, a expressão de CD23 é regulada para cima na superfície dos monócitos, que foram selecionados com base na expressão de CD11 b. MJ2- 7, C65, e slL13Ra2-Fc foram capazes de neutralizar atividade de IL-13 de NHP neste ensaio. As potências de MJ2-7 e slL-13Ra2-Fc foram equivalen- tes. C65 foi aproximadamente 20 vezes menos ativo (figura 2).
Em um segundo bioensaio, as capacidades de neutralização de MJ2-7 e C65 da IL-13 nativa humana foram testadas em um ensaio de fosfo- rilação de STAT6. A linhagem celular epitelial HT-29 foi incubada com IL-13 nativa humana 0,3 ng/ml na presença de concentrações crescentes de MJ2- 7, C65, ou slL-13Ra2-Fc, por 30 minutos a 37°C. As células foram fixadas, permeabilizadas, e marcadas com anticorpo para STAT6 fosforilada marca- do com ALEXA™ Fluor 488. O tratamento com IL-13 estimulou a fosforilação de STAT6. MJ2-7, C65, e slL13Ra2-Fc foram capazes de neutralizar ativida- de IL-13 nativa humana neste ensaio (figura 3). As IC50's do anticorpo muri- no MJ-27 e da forma humanizada (V2.11) foram 0,48 nM e 0,52 nM respecti- vamente. As potências de MJ2-7 e slL-13Ra2-Fc foram aproximadamente equivalentes. A IC50 de slL-13Ra2-Fc foi 0,33 nM (figura 4). C65 foi aproxi- madamente de 20 vezes menos ativo (figura 5).
Em um terceiro bioensaio, a capacidade de MJ2-7 de neutralizar a IL-13 nativa humana foi testada em um ensaio de produção de tenascina. A linhagem celular epitelial de pulmão BEAS-2B humana foi incubada duran- te a noite com IL-13 nativa humana 3 ng/ml na presença de concentrações crescentes de MJ2-7. Sobrenadantes foram coletados e testados para a produção de proteína da matriz extracelular, tenascina C, por ELISA (figura 6A). MJ2-7 inibiu esta resposta com IC50 de aproximadamente 0,1 nM (figu- ra 6B).
Estes resultados demonstram que MJ2-7 é um neutralizador efi-
caz tanto de IL-13 de NHP como da IL-13 nativa humana. A capacidade de neutralização de IL-13 do MJ2-7 é equivalente aquela de slL-13Ra2-Fc. MJ 1-65 também tem atividade de neutralização da IL-13, mas é aproximada- mente 20 vezes menos potente do que MJ2-7. Exemplo 16: Mapeamento do epítopo do anticorpo MJ2-7 por SPR
slL-13Ra2-Fc recobriu diretamente um chip CM5 pela ligação padrão à amina. IL-13 de NHP na concentração de 100 nM foi injetada, e a sua ligação ao IL-13Ra2-Fc imobilizado foi detectada por BIACORE™. Uma injeção adicional de 100 nM de anticorpos anti-IL-13 foi adicionada, e as modificações na ligação foram monitoradas. O anticorpo MJ2-7 não ligou à IL-13 de NHP quando estave em um complexo com hu IL-13Ra2, ao passo que um anticorpo controle positivo anti-IL-13 o fez (figura 7). Estes resulta- dos indicam que hu IL-13Ra2 e MJ2-7 se ligam ao mesmo ou a epítopos sobrepostos de IL-13 de NHP.
Exemplo 17: Mensuração de constantes de velocidade cinéticas da interação entre IL-13 de NHP e anticorpo MJ2-7 humanizado V2-11 Para preparar a superfície do biosensor, a Fc do anticorpo espe-
cífica IgG anti-humana de cabra foi imobilizada para um chip de busca gra- duada em carboxi de metila dextrana (CM5) usando ligação à amin. A super- fície foi ativada com uma mistura de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 0,1 M e N-Hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M.
O anticorpo de captura foi injetado em uma concentração de 10 pg/ml em tampão acetato de sódio (pH 5,5). Os grupos ativados restantes foram bloqueados com etanolamina 1,0 M (pH 8,0). Como um controle, a primeira célula de fluxo foi usada como uma superfície de referência para correção índice refrativo da massa, efeitos da matriz, e ligação não- específica, as segundas, terceiras e quartas células de fluxo foram cobertas com a molécula de captura.
Para a análise cinética, o anticorpo monoclonal hMJ2-7 V2-11 foi capturado pela superfície de anticorpo anti IgG por injeção de 40 μΙ de uma solução 1pg/ml. A diferença líquida entre a referência e o ponto aproxima- damente 30 segundos após da realização da injeção foi tomada para repre- sentar a quantidade do alvo ligado. Soluções de IL-13 de NHP em concen- trações de 600, 200, 66,6, 22,2, 7,4, 2,5, 0,8, 0,27, 0,09 e 0 nM foram injeta- das em triplicata em uma taxa de fluxo de 100 μΙ por min por 2 minutos, e a quantidade do material ligado como uma função do tempo foi registrada (fi- gura 8). A fase de dissociação foi monitorada em tampão HBS/EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, contendo NaCI 150 mM, EDTA 3 mM e 0,005% (v/v)) por 5 minutos na mesma taxa de fluxo seguida por duas injeções de 5 μΙ de glici- na, pH 1,5, para regenerar uma superfície de captura totalmente ativa. To- dos os experimentos cinéticos foram feitos a 22,5°C em tampão HBS/EP. Os efeitos do branco e do tampão foram subtraídos de cada sensorgrama usan- do referência dupla.
Os dados cinéticos foram analisados usando o programa BIAE- VALUATION™ 3.0.2 aplicando o modelo 1:1. As constantes da taxas de dis- sociação aparente (kd) e de associação (ka) foram calculadas a partir das regiões apropriadas do sensorgramas usando uma análise global. A cons- tante de afinidade da interação entre o anticorpo e IL-13 de NHP foi calcula- da a partir das constantes de velocidade cinética pela seguinte fórmula: Kd = kd / ka. Estes resultados indicam que huMJ2-7 V2-11 tem taxas de associa- ção e dissociação de 2,05x107 M"1s"1 e de 8,89x1o"4 l/s, respectivamente, resultando em um anticorpo com afinidade de 43 pM para IL-13 de NHP. Exemplo 18: Atividade inibidora da humanização de MJ2-7 serve de inter- mediária em bioensaios
A atividade inibidora de vários intermediários no processo de humanização foi testada por bioensaios de fosforilação de STAT6 e produ- ção de tenascina. Um nível sub-máximo de IL-13 de NHP ou preparação bruta de IL-13 nativa humana foi usada para produzir a resposta biológica, e a concentração da versão humanizada de MJ2-7 necessária para a inibição semi-máxima da resposta foi determinada. Análise de hMJ2-7 VI, hMJ2 - 7 V2 e hMJ2-7 V3, expresso com o IgGI humana e regiões constantes kappa, mostraram que a Versão 2 conservou a atividade de neutralização contra a IL-13 nativa humana. Esta concentração da Versão 2 humanizada do anti- corpo necessária para a inibição semi-máxima da bioatividade da IL-13 nati- va humana foi aproximadamente 110 vezes maior do que aquela de MJ2-7 murino (figura 9). A análise de uma forma semi-humanizada, na qual V1 ou V2 VL foram combinados com MJ2-7 murino VH, demonstrou que a redução da atividade de neutralização de IL-13 humana nativa não foi devida a VL humanizada, mas um tanto à seqüência de VH (figura 10). Ao passo que o anticorpo MJ2-7 semi-humanizado com VL Vl só conservou parcialmente a atividade de neutralização da versão com VL V2 humanizado foi como ativa como o anticorpo de camundongo parental. Por isso, uma série de mutações reversas foram introduzidas na seqüência de V1 VH para melhorar a ativida- de de neutralização da IL-13 humana nativa do MJ2-7 murino. Exemplo 19: MJ2-7 bloqueia interação de IL-13 com IL-13Ra1 e IL-13Ra2
MJ2-7 é específico para o C-terminal 19-mer de IL-13 de NHP, correspondente aos resíduos de aminoácido 114 a 132 da proteína imatura (SEQ ID NO:24), e resíduos 95 a 113 da proteína madura (SEQ ID NO:14). Para a IL-13 humana, que forma a parte da D alfa hélice da proteína, foi rela- tado que contem resíduos importantes para ligação tanto a IL-13Ra1 como a IL-13Ra2. A análise de mutantes de IL-13 humana identificou A, C, e D- helices como contendo sítio de contato importante para o complexo de sina- lização de IL-13Ra1/IL-4Ra (Thompson e Debinski (1999) J. Biol. Chem. 21 A: 29944 - 50). Varredura de mutagênese de alanina da D-hélice identificou os resíduos K123, K124, e R127 (SEQ ID NO:24) como responsáveis pela interação com IL-13Ra2, e os resíduos E110, E128 e L122 como contatos importantes para IL-13Ra1 (Madhankmuar et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 43194-205). Estruturas de solução de alta resolução de IL-13 humana de- terminadas por RMN predisseram interações de ligação de IL-13 baseadas em similaridades relacionadas à estrutura conhecida de pares de receptor do ligante. Estes estudos de RMN apoiaram um papel-chave de A e D-hélices da IL-13 na criação de contatos importantes com IL-13Ra1 (Eisenmesser et al. (2001) J. Mol. Biol. 310:231-241; Moy et al. (2001) J. MoL Biol. 310:219- 230). A ligação de MJ2-7 a este epítopo localizado no C-terminal, a D-hélice da IL-13 foi predito para interromper a interação de IL-13 com IL-13Ra1 e IL- 13Ra2.
A capacidade de MJ2-7 inibir a ligação de IL-13 de NHP a IL- 13Ra1 e IL-13Ra2 foi testada por ELISA. Formas solúveis recombinantes de IL-13Ra1-Fc e IL-13Ra2-Fc humanos foram recobertos nas placas de ELI- SA. IL-13 de NHP-FLAG foram adicionadas presença de concentrações crescentes de MJ2-7. Os resultados mostraram que MJ2-7 competiu com ambas as formas de receptor solúveis para ligação a IL-13 de NHP (figuras 11A e 11B). Isto fornece uma base para a neutralização da bioatividade de IL-13 por MJ2-7.
Exemplo 20: As CDRs da cadeia leve de MJ 2-7 contribuem para a ligação ao antígeno
Para avaliar se as três cadeias leves das regiões CDR são ne-
cessárias para a ligação do anticorpo MJ 2-7 a IL-13 de NHP1 duas versões humanizadas adicionais de MJ 2-7 VL foram construídas pelo enxerto de CDR. A versão 3 VL foi projetada baseada em clone da linhagem germinati- va humano DPKI8, continha CDR1 e CDR2 do clone da linhagem germinati- va humana e CDR3 anticorpo MJ2-7 de camundongo (figura 12). No segun- do construto (hMJ 2-7 V4), só CDR1 e CDR2 do anticorpo MJ 2-7 foi enxer- tado na região conservada de DPK 18, e CDR3 foi derivado de anticorpo monoclonal de camundongo irrelevante.
Os MJ 2-7 V3 e V4 humanizados foram produzidos em células COS pela combinação de hMJ 2-7 VH Vl com hMJ 2-7 VL V3 e V4. As pro- priedades de ligação ao antígeno do anticorpos foram examinadas por ELI- SA de ligação direta a IL-13 de NHP. O hMJ 2-7 V4 em que CDR3 da cadeia leve MJ 2-7 estava ausente conservou a capacidade de se ligar a IL-13 de NHP1 ao passo que V3 que continha CDR1 e CDR2 na cadeia leve da Iinha- gem germinativa humana não se ligou à IL-13 de NHP imobilizada. Estes resultados demonstram que CDR1 e CDR2 da cadeia leve do anticorpo MJ 2-7 são mais provavelmente responsáveis pelas propriedades de ligação ao antígeno deste anticorpo. Seqüência nucleotídica de hMJ 2-7 VL V3
1 ATGCGGCTGC CCGCTCAGCT GCTGGGCCTG CTGATGCTGT GGGTGCCCGG 51 CTCTTCCGGC GACGTGGTGA TGACCCAGTC CCCTCTGTCT CTGCCCGTGA 101 CCCTGGGCCA GCCCGCTTCT ATCTCTTGCC GGTCCTCCCA GTCCCTGGTG 151 TACTCCGACG GCAACACCTA CCTGAACTGG TTCCAGCAGA GACCCGGCCA 201 GTCTCCTCGG CGGCTGATCT ACAAGGTGTC CAACCGCTTT TCCGGCGTGC 251 CCGATCGGTT CTCCGGCTCC GGCAGCGGCA CCGATTTCAC CCTGAAGATC
301 AGCCGCGTGG AGGCCGAGGA TGTGGGCGTG TACTACTGCT TCCAGGGCTC 351 CCACATCCCT TACACCTTTG GCGGCGGAAC CAAGGTGGAG ATCAAG (SEQ ID NO:18 9)
Seqüência de aminoácidos de hMJ 2-7 VL V3
MRLPAQLLGLLMLWVPGSSG-DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVYSDGNTYLNW FQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLQUISRVEAEDVGVYYCFQGSHIP YTFGGGTKVEIK (SEQ ID N0:190) Seqüência nucleotídica de hMJ 2-7 VL V4
GATGTTGTGATGACCCAATCTCCACTCTCCCTGCCTGTCACTCCTGGAGAGCCAGCCTCC ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTGCATAGTAATGGAAACACCTACCTGGAATGG TACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTT TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATC AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAAGTTCACATGTTCCT CTCACCTTCGGT - CAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 191)
Seqüência de aminoácidos de hMJ 2-7 VL V4
DWMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPQ LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLQUISRVEAEDVGV YYCFQSSHVP LTFGQGTKLE IK (SEQ ID NO:192)
Exemplo 21: Atividades de Neutralização de Anticorpos Anti-ILI 3 em Modelo de Macaco Cinomolqus
A eficácia de um agente de ligação à IL-13 (por exemplo, um anticorpo anti-IL13) na neutralização de uma ou mais atividades associadas à IL-13 in vivo pode ser testada usando um modelo de inflamação das vias aéreas induzida por antígeno em macacos cinomolgus naturalmente alérgi- cos a Ascaris suum. Estes ensaios podem ser usados para confirmar que o agente de ligação reduz efetivamente a eusinofilia das vias aéreas em ani- mais alérgicos desafiados com um alergênio. Neste modelo, o desafio de um macaco alérgico com antígeno de Ascaris suum resulta em um ou mais dos seguintes: (i) um influxo de células inflamatórias, por exemplo, eusinófilos nas vias aéreas; (ii) níveis de eotaxina aumentados; (iii) aumento na libera- ção de histamina de basófilos específica para Ascaris; e/ou (iv) aumento nos títulos de IgE específica para Ascaris.
Para testar a capacidade de um anticorpo anti-IL-13 de prevenir o influxo de células inflamatórias, o anticorpo pode ser administrado 24 ho- ras antes do desafio com antígeno de Ascaris suum. No dia do desafio, uma amostra da lavagem broncoalveolar de referência (BAL) pode ser obtida do pulmão esquerdo. O antígeno de Ascaris suum pode ser instilado intratra- quealmente no pulmão direito. Vinte e quatro horas após, o pulmão direito é lavado, e o fluido de BAL dos animais tratados intravenosamente com o anti- corpo foi comparado com o fluido de BAL de animais não tratados. Se o an- ticorpo reduz a inflamação das vias aéreas, um aumento na porcentagem dos eusinófilos em BAL pode ser observado no grupo não tratado, mas não para o grupo tratado com o anticorpo.
As figuras 14A-14D representam um aumento no total número de células e na porcentagem de células inflamatórias, por exemplo, eusinófi- los (figura 14B), neutrófilos (figura 14C) e macrófagos (figura 14D) 24 horas após do desafio das vias aéreas com Ascaris. Um aumento estatisticamente significante na porcentagem de células inflamatórias foi observado 24 horas após o desafio em comparação com os valores de referência. Os anticorpos anti-IL13 (MJ2-7v.2-11 humanizado e mAb13.2v.2
humanizado) foram administrados a macacos cinomolgus 24 horas antes do desafio com o antígeno Ascaris suum. (mAb 13.2 e a sua forma humanizada hmAb13.2v2 foram repetidamente descritos no pedido de patente de propri- edade PCT WO 05/123126, os conteúdos do qual são incorporados neste pedido por referência em sua totalidade). Macacos controle foram tratados com salina. 10 mg/kg de hMJ2-7v2-l 1, hmAb13.2v2, ou Ig humana irrelevan- te (IVIG) foram administrados intravenosamente. No dia seguinte, as amos- tras de BAL pré-desafiadas, do controle e macacos tratados (mencionado na figura 15A como "controle pré"e "pré Ac") foram coletadas do pulmão es- querdo dos macacos. Os macacos foram tratados com 0,75 microgramas de antígeno de Ascaris suum intratraquealmente no pulmão direito. Vinte e qua- tro horas pós-desafio, as amostras de BAL foram coletadas do pulmão direi- to do controle e dos macacos tratados, e analisadas para a infiltração celular (mencionado na figura 15B como "controle pós"e "pós Ac," respectivamen- te). As amostras de BAL coletadas de macacos tratados pelo anticorpo mos- traram uma redução estatisticamente significante do número total de infiltra- ção celular em comparação com animais controle (figura 15A). As amostras controle são representadas na figura 15A como círculos, amostras tratadas com hmAb13.2v2 e hMJ2-7v2-l1 são mostradas como triângulos escuros e claros, respectivamente. HMJ2-7v2-11 e hmAb13.2v2 mostrou eficácia com- parável neste modelo. A figura 15B mostra um gráfico linear que representa a concentração de hMJ2-7v2-11 ou de hmAb13.2v2 com respeito a dias pós- infusão com Ascaris. Uma cinética de redução comparável é detectada para ambos os anticorpos.
Os níveis de eotaxina foram significativamente aumentados 24 horas após o desafio de Ascaris (figura 16A). Tanto hMJ2-7v2-ll como hmAb13.2v2 reduziram os níveis de eotaxina detectados em fluidos de BAL de macacos cinomolgus 24 horas após desafio com o antígeno de Ascaris suum, em comparação com os controles tratados com salina.
Os macacos cinomolgus sensibilizados com Ascaris suum de- senvolvem IgE para o antígeno de Ascaris. IgE se liga a FceRI em basófilos circulantes, tal que o desafio in vitro de basófilos do sangue periférico com o antígeno de Ascaris induz degranulação e liberação da histamina. A exposi- ção ao antígeno repetidamente eleva a sensibilização do basófilo, resultando em respostas de liberação de histamina aumentadas. Para testar os efeitos de hMJ2-7v2-l 1 e hmAb13.2v2 no níveis IgE e de basófilo, os macacos ci- nomolgus administrados com hMJ2-7v.2 humanizado, hmAb13.2v2, Ig irrele- vante (IVIG), ou salina, como descrito acima, foram sangrados 8 semanas pós-desafio com Ascaris, e os níveis de IgE total e específica para Ascaris no plasma foram determinados por ELISA. A figura 17A mostra um gráfico linear das modificações na absorvância com respeito à diluição de amostras obtidas pré e pós-desafio de 8 semanas a partir de animais tratados com IVIG ou hMJ2-7v2-11. Os círculos abertos representam mensurações pré- sangria; círculos cheios representam mensurações pós-tratamento. Uma redução significante na absorvância foi detectada em amostras pós-desafio tratadas com hMJ2-7v2-11 em relação aos valores pré-desafio analisados em todas as diluições figura 17A representa todas os exemplos representati- vos mostrando que nenhuma modificação no título de IgE específica para Ascaris em um macaco individual tratado com Ig irrelevante (IVIG; animal 20 a 45; painel superior), e o título de IgE específica para Ascaris reduzido em um macaco individual tratado com hMJ2-7v2-11 (animal 120 a 434; painel inferior).
Animais tratados com hMJ2-7v.2-11 ou com hmAb13.2v2 fuma- nizados mostraram uma redução significante nos níveis de IgE circulante específica para Ascaris em soros de macaco cinomolgus (figura 17B). Não houve modificação significante no título total de IgE qualquer um dos grupos de tratamento. A figura 17A mostra um gráfico linear das modificações na absorvância com respeito à diluição de amostras obtidas pré e pós-desafio de 8 semanas a partir de animais tratados com IVIG ou hMJ2-7v2-11. Os círculos abertos representam mensurações pré-sangria; os círculos cheios representam mensurações pós-tratamento. Uma redução significante na ab- sorvância foi detectada em amostras pós-desafio tratadas com hMJ2-7v211 em relação aos valores pré-desafio em todas as diluições analisadas. As designações '20 a 45" e "120 a 434" referem-se ao número de identificação do macaco cinomolgus.
Para avaliar os efeitos dos anticorpos anti-IL13 na liberação de histamina do basófilo, os animais foram sangrados 24 horas e 8 semanas pós-desafio com Ascaris. O sangue total foi desafiado com o antígeno de Ascaris por 30 minutos a 37°C, e a histamina liberada no sobrenadante foi quantificada por ELISA (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Como mostrado nas figuras 18A-18B, os animais controle demonstraram níveis aumentados de liberação de histamina de basófilo induzida por Ascaris particularmente 8 semanas seguintes ao desafio com antígeno (representado pelos losangos na figura 18A e barra do lado esquerdo na figura 18B). Ao contrário, os ani- mais tratados com hMJ2-7v.2-11 ou com hmAb13.2v2 humanizados não mostraram este aumento na sensibilização de basófilo em resposta a Asca- ris 8 semanas após o desafio (figuras 18A-18B). A maioria dos animais indi- viduais tratados com hMJ2-7v.2-11 ou hmAb13.2v2 humanizados mostrou uma redução (exemplo na figura 18A) ou nenhuma modificação pós-desafio na liberação de histamina de basófilo em 8 semanas em comparação com o pré ou 24 horas pós-desafio. Dessa maneira, uma administração única do anticorpo anti-IL13 humanizado teve um efeito duradouro na modificação na liberação de histamina neste modelo.
A figura 19 representa a correlação entre a liberação de histami- na específica para Ascaris e níveis de IgE específica para Ascaris. Os maio- res valores foram detectados em amostras controle (amostras tratadas com salina ou IVIG) (círculos azuis claros) em comparação com os tratados com anticorpo anti-IL13 ou dexametasona (dex) (círculos vermelhos-escuros). O anticorpo anti-IL13 humanizado (mAb13.2v.2 humanizado) administrado i.v. 24 horas antes do desafio com Ascaris, ou dexametasona administrada in- tramuscular em duas injeções cada uma em uma concentração de 1 mg/kg 24 horas e 30 min. antes do desafio de Ascaris. Vinte e quatro horas pós- desafio, lavado de BAL foi coletado do pulmão direito e analisado para níveis de liberação de histamina e de IgE. Os resultados mostrados neste pedido demonstraram que o pré-tratamento de macacos cinomolgus com MJ2-7 ou com mAb13.2 reduziu a inflamação das vias aéreas induzida por antígeno de Ascaris suum a níveis comparáveis como detectado por níveis de citocina em amostras de BAL, níveis séricos de IgE1S específicas para Ascaris e libe- ração de histamina de basófilo em resposta ao desafio com Ascaris in vitro. A figura 20 é uma série de gráficos de barra que representam os aumentos no soro dos níveis de IL-13 em macacos cinomolgus individuais tratados com MJ2-7 humanizado (hMJ2-7v2-11). A marca em cada painel (por exem- plo, 120-452) eqüivale ao número de identificação do macaco. A amostra "pré"foi coletada antes da administração do anticorpo. O tempo "0"foi cole- tado 24 horas pós-administração do anticorpo, mas antes do desafio com Ascaris. Os pontos de tempo restantes foram pós-desafio com Ascaris. Os ensaios usados para detectar os níveis de IL-13 são capazes de detectar IL- 13 na presença de anticorpos hMJ2-7v2-11 ou hmAb13.2v2. Mais especifi- camente, placas de ELISA (MaxiSorp; Nunc, Rochester, New York), foram recobertas durante a noite a 4°C com mAb13.2 0,5 Mg/ml em PBS. As placas foram lavadas com PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-TWEEN). Os pa- drões de IL-13NHP, ou diluições do soro de macacos cinomolgus, foram adi- cionados e incubados por 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas, e de MJ 1-64 biotinilado 0,3 pg/ml (mencionado neste pedido como anticorpo C65) foram adicionados em PBS-TWEEN. As placas foram incu- badas 2 horas, à temperatura ambiente, lavadas, e a ligação detectada u- sando HRP-estreptavidina (Southern Biotechnology Associates) e substrato Sure Blue (Kirkegaard and Perry Labs). Para a detecção de IL-13 na presen- ça de mAb13.2, o mesmo protocolo foi seguido, exceto que as placas ELISA foram recobertas com de MJ2-7 0,5 pg/ml.
A figura 21 mostra dados que demonstram que os soros de ma- cacos cinomolgus tratados com anticorpos anti-IL13 têm capacidade de neu- tralização residual de IL-13 nas concentrações de IL-13 do primata não- humano testado. A figura 21 é um gráfico de barra que representa a ativida- de de fosforilação da STAT6 de IL-13 de primata não-humano em 0, 1, ou 10 ng/ml, na ausência de soro ("nenhum soro"); na presença soro na salina ou animais tratados com IVIG ("controle"); ou na presença de soro de animais tratados com o anticorpo anti-IL13, qualquer antes de administração de anti- corpo ("pré"), ou pós-administração de 1 a 2 semanas do anticorpo indicado. O soro foi testado em diluição 1:4. Uma versão humanizada de MJ2-7 (MJ2- 7v.2-11) foi usada neste estudo. Os ensaios para medir a fosforilação de STAT6 são revelados neste pedido. A figura 22 são gráficos lineares mostrando que os níveis de IL-
13 no primata não-humano imobilizada por MJ2-7 humanizado (hMJ2-7v2- 11) em um ponto de tempo semana 1 no soro de macaco cinomolgus se cor- relaciona com o nível de inflamação medido nos fluidos de BAL pós-desafio com Ascaris. Tal correlação suporta a detecção de IL-13 sérica (não ligada ou ligada a um anticorpo anti-IL13) como um biomarcador para detectar indi- víduos que têm inflamação. Os indivíduos que têm inflamação mais severa mostraram níveis maiores de IL-13 sérica. Embora os níveis de IL-13 não ligada sejam tipicamente difíceis de quantificar, os ensaios acima revelados neste pedido na figura 20 fornecem um ensaio confiável para medir IL-13 ligada a um anticorpo anti-IL-13.
Exemplo 22: Efeitos de Anticorpos Anti-IL-13 Humanizados na Inflamação das vias aéreas, Resistência pulmonar, e Complacência Pulmonar Dinâmica Induzida por Administração de IL-13 humana a Camundongos
Modelos murinos da asma comprovaram ferramentas inestimá- veis para entendimento do papel de IL-13 nesta doença. O uso deste modelo para avaliar eficácias in vivo das séries de anticorpos IMA (13.2v. humaniza- do 2 e MJ2-7v.2-11 humanizado) foi inicialmente impedido pela incapacidade destes anticorpos de reagir cruzadamente com a IL-13 de roedor. Esta limi- tação foi driblada neste pedido pela administração de IL-13 recombinante humana a camundongos. IL-13 humana é capaz de ligação ao receptor de IL-13 murino, e quando administrado exogenamente induz inflamação das vias aéreas, hipersensibilidade, e outros correlatos com asma.
Em primatas não-humanos, o epítopo de IL-13 reconhecido por MJ2-7v.2-11 humanizado inclui uma GLN na posição 110. Em humanos, contudo, a posição 110 é uma variante polimórfica, tipicamente com ARG substituindo GLN (por exemplo, R110). A variante polimórfica R110Q asso- cia-se largamente com a prevalência aumentada de doença atópica. Neste exemplo, IL-13 R110Q recombinante humana foi expressa em E. coli e re- dobrada. O anticorpo 13.2 (lgG1, k) foi clonado a partir de camundongos BALB/c imunizados com a IL-13 humana, e a versão humanizada deste anti- corpo é designada 13.2v.2 humanizada (ou hl3.2v.2). Anticorpo MJ2-7 (lgG1, k) foi clonado a partir de camundongos BALB/c imunizados com os 19 ami- noácidos do N-terminal de IL-13 de primata não-humana, e a versão huma- nizada deste anticorpo é denominada MJ2-7v.2-11 humanizado (ou hMJ2- 7v.2 -11). Ambos os anticorpos foram formulados em L-histidina 10 mM, pH 6, contendo sacarose 5%. Carimune NH globulina imune intravenosa (IVIG humana) (ZLB Bioplasma Inc. Switzerland) foi purificada pela cromatografia em Proteína A e formulado em L-histidina 10 mM, pH 6, contendo sacarose 5%. Para analisar a resposta pulmonar do camundongo à presença da recombinante R110Q IL-13 humana, camundongos BABL/c fêmeas foram tratados com 5 pg de IL-13 R110Q recombinante humana (por exemplo, a- proximadamente 250 pg/kg), ou um volume equivalente de salina (20 pL), administrados intratraquealmente nos dias 1, 2, e 3. No dia 4, os animais foram testados para sinais de resistência das vias aéreas (RI) e complacên- cia (Cdin) em resposta a doses crescentes de metacolina nebulizada. Re- sumidamente, os camundongos anestesiados e traqueostomizados foram colocados no pletismógrafo de corpo inteiro, cada um com uma duplicata incorporada na placa princiapal da câmara, com portas para conecção à tra- quéia, para portas de inspiração e de expiração de eum ventilador, e a um transdutor de pressão, monitorando a pressão traqueal. Um pneumotacógra- fo na parede de cada pletismógrafo monitorou o fluxo de entrada e saída da câmara, devido ao movimento torácico do animal ventilado. Os animais fo- ram ventilados em uma taxa de 150 respirações/minuto e um volume perió- dico de 150 ml. As computações de resistência foram derivados da pressão traqueal e sinais de fluxo de ar, usando um algoritmo de covariância.
Como mostrado nas figuras 23A a 23B, a administração intratra- queal da R110Q IL-13 recombinante humana na resistência pulmonar au- mentada produzida e complacência dinâmica reduzida em resposta ao desa- fio com metacolina. Esta observação não foi, contudo, acompanhada por forte inflamação pulmonar.
Para aumentar a resposta inflamatória no pulmão em camun- dongos, 5 pg da R110Q IL-13 recombinante humana, ou um volume equiva- lente (50 pL) de salina, foi administrado a camundongos C57BL/6 intrana- salmente nos dias 1, 2, e 3. Os animais foram sacrificados no dia 4 e o fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) foi coletado. Pré-análise, BAL foi filtrado por um através de filtro celular de 70pm e centrifugado a 2.000 rpm por 15 minutos para precipitar as células. As frações celulares foram analisadas para uma contagem total de leucócitos, girada em lâminas de microscópio (CYtospin; Pittsburgh, PA), e corados com Diff-Quick (Dade Behring, Inc. Newark DE) para análise diferencial. Níveis de IL-6, TNF α e MCP-1 foram determinados pelo arranjo de contas citométricas (CBA; BD Pharmingen, San Diego, CA). Os limites da sensibilidade do ensaio foram 1 pg/ml de IL-6, e 5 pg/ml de TNF α e MCP-1.
Como mostrado na figura 24 A, a administração intranasal da R110Q IL-13 recombinante humana induziu uma forte resposta inflamatória nas vias aéreas, como indicado por infiltração elevada de eusinófilos e neu- trófilos em BAL. As infiltrações celulares compuseram-se principalmente de eusinófilos (por exemplo, aproximadamente 40%). Como mostrado no figura 24B, a administração intranasal da R110Q IL-13 recombinante humana tam- bém significativamente aumentou os níveis de várias citocinas em BAL inclu- indo, por exemplo, MCP-1, TNF-α, e IL-6.
Para determinar o melhor método de entrega de MJ2-7v.2-11 humanizado, os níveis de anticorpo em BAL e no soro foram analisados a- pós administração intraperitoneal e intravenosa, ou intranasal após trata- mento com a R110Q IL-13 recombinante humana administrada intranasal- mente ou intratraquealmente. Resumidamente, camundongos BALB/c fê- meas foram administrados com 5 pg de R110Q IL-13 recombinante humana ou um volume equivalente de salina intratraquealmente nos dias 1, 2 e 3. No dia O, e 2 horas antes da administração de cada dose de IL-13, os camun- dongos foram tratados com 500 pg de MJ2-7v.2 humanizado administrado intravenosamente no dia 0, e por IP nos dias 1, 2 e 3 (figura 25A). Alternati- vamente, 500 pg de MJ2-7v.2-11 humanizado foram administrados intrana- salmente nos dias 0, 1, 2 e 3. IgG humana total foi medida por ELISA, como se segue: placas de ELISA (MaxiSorp; Nunc, Rochester, NY) foram recober- tos durante a noite a 4°C com diluição de 1:1500 da Fc de Ig de cabra anti- humana (M+G+A) (ICN-Cappel, Costa Mesa, CA) em 50 μΙ/poço em tampão de bicarbonato carbonato 25 mM, pH 9,6. As placas foram bloqueadas por 1 hora à temperatura ambiente com a gelatina 0,5% em PBS, lavada com PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-TWEEN). MJ2-7v.2-11 Humanizado padrão ou 6 χ diluições 1:2 de soro de ovelhas começando em 1:500 a 1:50.000 fo- ram adicionados e incubadas por 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS-TWEEN, e uma diluição 1:5000 da IgG anti-humana de camundongo biotinilada (Southern Biotechnology Associates) foi incuba- da por 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS- TWEEN, e a ligação foi detectada com estreptavidina ligado à peroxidase (Southern Biotechnology Associates) e substrato Sure Blue (KPL lnc). A sensibilidade do ensaio foi 0,5 ng/ml de IgG humana.
A figura 25 mostra níveis elevados de IgG humana no soro em comparação com BAL seguida de administração intraperitoneal e intraveno- sa do anticorpo MJ2-7v.2-11 humanizado. Como mostrado na figura 25B, os níveis de IgG total em pg/ml foram significativamente maiores em BAL do que níveis sérica seguintes à administração intranasal do anticorpo MJ2- 7v.2-11 humanizado.
Para determinar se o anticorpo MJ2-7v.2-11 humanizado foi ca- paz da modulação da função pulmonar observada acima e resposta inflama- tória, a hipersensibilidade das vias aéreas foi induzida pela administração intratraqueal de 5 pg da R110Q IL-13 recombinante humana ou um volume equivalente (20 pL) de salina nos dias 1, 2 e 3. No dia 0 e 2 horas antes de administrar cada dose da R110Q IL-13 recombinante humana, os animais foram tratados com 500 pg de MJ2-7v.2-11 humanizado, dose de 500 pg de IVIG, ou volume equivalente de salina, administrados intranasalmente. Os animais foram testados no dia 4 para resistência das vias aéreas (RI) e complacência (Cdin) em resposta a doses crescentes de metacolina nebuli- zada, como descrito acima. Níveis de MJ2-7v.2 Humanizado e IVIG no BAL e no soro foram analisados por ELISA, como descrito acima. Como mostra- do nas figuras 26A a 26B, MJ2-7v.2-11 humanizado reduziu efetivamente a resposta asmática, resultando em uma redução significante da dose de me- tacolina necessária para alcançar o grau semi-máximo de resistência pulmo- nar. Ao contrário, uma dose equivalente de IVIG não teve nenhum efeito. Modificações na complacência pulmonar dinâmica não foram evidentes a- baixo destas condições. Como mostrado na figura 26C, níveis de anticorpo IgG no BAL foram aproximadamente 10 a 20 vezes maiores do que os níveis séricos.
Para determinar se administração MJ2-7v.2-11 humanizado de anticorpo anti-IL-13 promoveu um aumento nos níveis circulantes de IL-13, BAL e os soros foram analisados para os níveis de IL-13 por ELISA, como se segue: Resumidamente, camundongos BALB/c fêmeas foram tratados como descrito para a figura 26A-26B. As placas de ELISA (Nunc Maxi-Sorp) foram recobertas durante a noite com 50 μΙ /poço com o anticorpo anti-IL-13 de camundongo, mAb13.2 diluído a 0,5 mg/ml em PBS. As placas foram la- vadas 3 vezes com PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-TWEEN) e blo- queadas por 2 horas à temperatura ambiente com gelatina 0,5% em PBS. As placas então foram lavadas e o padrão de IL-13 humana (Wyeth, Cambrid- ge, MA), ou as diluições do soro de camundongo (diluições seriadas 3X que começam em 1:4) foram adicionadas, em PBS-TWEEN contendo soro fetal bovino 2% (SFB). As placas foram incubadas por 4 horas adicionais à tem- peratura ambiente, e lavadas. O anticorpo IL-13 anti-humano de camundon- go biotinilado, C65, foi adicionado em 0,3 pg/ml em PBS-TWEEN. As placas foram incubadas por 1 a 2 horas à temperatura ambiente, lavadas, então incubadas com HRP-estreptavidina (Southern Biotechnology Associates), Birmingham, AL) por 1 hora à temperatura ambiente. A cor foi desenvolvida usando substrato de peroxidase Sure Blue (KPL, Gaithersburg, MD), e a re- ação parada com ácido sulfúrico 0,01 M. Absorvância foi lido a 450 nm na leitura em um leitor de placa SpectraMax (Molecular Devices Corp. Sunnyva- le, CA). Níveis séricos de IL-13 foram determinados em relação à curva pa- drão de IL-13 humana, que foi independentemente estabelecida para cada placa.
Como mostrado nas figuras 27A a 27B, compatível com a figura 26C, níveis IL-13 foram elevados em BAL de camundongos tratados com anticorpo, mas não no soro. Além disso, observamos que IL-13 isolada des- tas amostras não tinha atividade biológica detectável (dados não mostra- dos). Para determinar se esta falta de observação da atividade biológica de IL-13 foi devido a formação de complexo IL-13 e MJ2-7v.2-11 humanizado, um ELISA foi desenvolvido para detectar especificamente IL-13 e MJ2-7v.2- 11 humanizado no complexo. Resumidamente, placas de ELISA (Nunc maxi- Sorp) foram recobertos durante a noite com 50 μΙ/poço com anticorpo anti- IL-13 de camundongo mAb13.2 diluído a 0,5 mg/ml em PBS. As placas fo- ram lavadas 3 vezes com PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-TWEEN) e bloqueadas por 2 horas à temperatura ambiente com gelatina 0,5% em PBS. As placas então foram relavadas, e o Padrão de IL-13 humana (Wyeth, Cambridge, MA), ou as diluições do soro de camundongo (3X diluições séri- cas que começam em 1:4) foram adicionadas, em PBS-TWEEN contendo soro fetal bovino 2% (SFB). As placas foram posteriormente incubadas du- rante 4 horas à temperatura ambiente. IgG anti-humana biotinilada (Fc espe- cífica) (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) diluída 1:5000 em PBS-TWEEN foi então adicionado. As placas foram incubadas por 1 a 2 horas à temperatura ambiente, lavadas, e finalmente incubadas com HRP- estreptavidina (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante 1 hora à temperatura ambiente. A cor foi desenvolvida usando substrato de peroxidase Sure Blue (KPL, Gaithersburg, MD), e a reação parou com ácido sulfúrico 0,01 M. Absorvância foi lida a 450 nm em leitura em um leitor de placa SpectraMax (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA).
Como mostrado nas figuras 27-27E, complexos de IL-13 e MJ2- 7v.2-1 humanizado 1 foram recuperados a partir de BAL e do soro de ca- mundongos neste modelo. Esta observação indica que MJ2-7v.2-11 humani- zado é capaz de se ligar a IL-13 in vivo, e que esta interação pode negar a atividade biológica de IL-13.
Os efeitos de MJ2-7v.2-11 humanizado na inflamação pulmonar mediada por IL-13 humana e a produção de citocina foram testados em ca- mundongos, e comparados com um segundo anticorpo, 13.2v.2 humaniza- do, como se segue. Resumidamente, camundongos C57BL/6 fêmeas (1 O/grupo) foram tratados com 5 pg da R110Q IL-13 recombinante humana (por exemplo, aproximadamente 250 pg/kg), ou um volume equivalente (50 μΙ) da salina, nos dias 1, 2, e 3, administrados intranasalmente. No dia 0 e 2 horas antes de administrar cada dose de IL-13, aos camundongos foram dadas doses intranasais de 500 pg, 100 μg, ou 20 μ9 de MJ2-7v.2-11 huma- nizado ou 13.2v.2 humanizado. Grupos de controle receberam 500 pg de IVIG1 ou volume equivalente da salina. Os animais foram sacrificados no dia 4, e BAL coletada. Infiltração de eusinófilo e neutrófilo em BAL foi determi- nada pela contagem celular diferencial e expressa como uma porcentagem.
Como mostrado nas figuras 28A a 28B, compatível com a figura 24A, o tratamento com R110Q IL-13 recombinante humana provocou um aumento nos níveis de infiltração de neutrófilo e eusinófilo. De maneira inte- ressante, MJ2-7v.2-11 humanizado e 13.2v.2 humanizado reduzem significa- tivamente a infiltração de eusinófilo (figura 28A) e neutrófilo (figura 28B) em comparação com controles (por exemplo, salina, IL-13, IVIG). Como mostra- do na figura 29A a 29C, HMJ2-7V2-11 e MJ2-7v.2-11 humanizados também anularam aumentos nos níveis de MCP-1, TNF-α, e citocina IL-6.
Para confirmar que os níveis de citocina em BAL representam exatamente o grau da inflamação, camundongos C57BL/6 fêmeas foram tratados com 5 pg da R110Q IL-13 recombinante humana (por exemplo, a- proximadamente 250 pg/kg) ou um volume equivalente (50 μΙ) de salina nos dias 1, 2, e 3, administrados intranasalmente. No dia 0, e 2 horas antes de administrar cada dose de IL-13, foram dadas aos camundongos doses intra- nasais de 500, 100, ou 20 pg de MJ2-7v.2-11 humanizado. No dia 4, os ani- mais foram sacrificados e BAL coletada. Níveis de anticorpo MJ2-7v.2-11 humanizado em BAL foram determinados por ELISA, como descrito acima. Os níveis de IL-6 em BAL foram determinados pela tabela de contagem de citometria. As porcentagens de eusinófilo foram determinadas por contagem celular diferencial.
Como mostrado nas figuras 30A a 30B, níveis de citocina IL-6 em BAL foram relacionados ao grau da inflamação. Além disso, níveis maio- res de MJ2-7v.2-11 humanizado no fluido de BAL foram inversamente corre- lacionados com a concentração de citocina, implicando fortemente um efeito de tratamento.
Os níveis do anticorpo necessários para reduzir a bioatividade de IL-13 in vivo neste modelo foram altos. A melhor eficácia foi vista em uma dose de anticorpo de 500 pg, correspondente a aproximadamente 25 mg/kg no camundongo. Esta alta dose do anticorpo necessária é mais provável ser uma conseqüência dos altos níveis de IL-13 (5 pg/dose χ 3 doses) usados para obter respostas pulmonares. De maneira interessante, boa neutraliza- ção in vivo da bioatividade de IL-13 foi vista somente quando MJ2-7v.2-11 humanizado foi administrado intranasalmente, e não quando o anticorpo foi administrado via intravenosa ou intraperitoneal. Estudos de distribuição mos- traram que seguinte à dosagem intravenosa e intraperitoneal, os altos níveis do anticorpo foram recuperados no soro no momento do sacrifício, mas ní- veis muito baixos foram encontrados em BAL. Ao contrário, após dosagem intranasal, níveis comparáveis do anticorpo foram encontrados no soro e em BAL. Dessa maneira, níveis de MJ2-7v.2-11 humanizado no fluido de BAL foram aproximadamente 100 vezes maiores após dosagem intranasal do que dosagem intravenosa e intraperitoneal. A observação que a dosagem intranasal foi eficaz, mas a dosagem intravenosa e intraperitoneal não foi, indica que neste modelo, o sítio da ação do anticorpo foi o pulmão. Este sítio da ação é esperado com base na via de entrega intratraqueal ou intranasal da IL-13, e foi confirmado pela observação que o anticorpo imobilizado em IL-13 no fluido de BAL, mas muito pouco anticorpo / complexo de IL-13 foi visto no soro.
Finalmente, estes achados ainda apoiam a atividade de neutrali- zação de IL-13 do MJ2-7v.2-11 humanizado in vivo. Exemplo 23: Efeitos da Neutralização de IL-13 e/ou IL-4 no Momento de De- safio com Alerqênio no Título de IqE Específica para Alerqênio
IL-13 e IL-4 conduzem a produção de IgE1 um mediador impor- tante da doença alérgica (Oettgen, H.C. (2000) Curr Opin Immunol 12:618- 623; Winn, T. A. (2003) Anuu Rev. Immunoi. 21:425-456). Os efeitos de uma administração única de antagonista de IL-4 ou IL-13, entregue 24 horas an- tes do desafio, níveis de IgE específica para alergênio foram examinados. Estas perguntas foram confrontadas usando uma sensibilização de OVA mu- rino padrão e modelo de desafio.
Camundongos Balb/c fêmeas entre 6 e 8 semanas de idade fo- ram adquiridos de Jackson Laboratory. Camundongos foram alojados em condições ambientalmente controladas, sem agente patogênico durante 2 semanas antes do estudo e na duração dos experimentos. Todos os proce- dimentos foram revistos e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee at Wyeth Research.
Grupos de camundongos foram imunizados por injeções intrape- ritoneais com 200 μΙ de solução contendo 20 pg de OVA (grau V, Sigma- Aldrich, St. Louis1 MO) emulsionado com 4 mg de hidróxido de alumí- nio/hidróxido de magnésio (ImjectAIum; Pierce, Rockford, IL) em PBS nos dias 0 e 13 (figura 31). Aos camundongos sensibilizados foram administra- dos 200 μg/dose de proteína de fusão de IgG a IL-13Ra2 murino solúvel (slL-13Ra2. Fe; Wyeth Research) ou 200 μg/dose de anticorpo monoclonal de rato anti-camundongo para IL-4 (clone 30340; IgGI de rato anti- camundongo para IL-4; R&D Systems, Minneapolis1 MN), por injeção intra- peritoneal um dia antes do desafio. Animais controle receberam lgG2a de camundongo (Wyeth Research) ou IgGI de rato purificada (Wyeth Resear- ch). Alguns grupos foram tratados com slL-13Ra2.Fc ou controle um dia an- tes e um dia após desafio. No dia 21, os camundongos foram anestesiados com solução de isoflurano (Henry Schein1 Melville1 NY) usando um sistema Impac6 (VetEquip1 Pleasanton1 CA) e desafiados intranasalmente com 20 pg OVA/camundongo em 50 μΙ de PBS.
Os camundongos foram sacrificados no dia 28 e sangue coleta- do por punção cardíaca. O soro foi obtido pelo uso de tubos de barreira em gel com coagulação ativatora (CapiJect; Terumo Medicai, Somerset1 NJ).
Para análise dos títulos de IgE1 placas de ELISA (MaxiSorp; Nunc) foram recobertas de IgE de rato anti-camundongo (BD Biosciences1 San Jose1 CA). As placas foram bloqueadas com gelatina 0,5% em PBS por 1 hora; lavadas em PBS contendo Tween-20 0,05% (PBS-TWEEN); incuba- das por 6 horas à temperatura ambiente com IgE de camundongo purificada (BD Biosciences) como padrão, ou diluições sérica, na presença de IgG de camundongo (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) como bloqueador. O ensaio foi desenvolvido usando estreptavídina ligada a peroxidase (Southern Biotech- nology Associates, Birmingham, AL) e solução de substrato TMB (SureBlue; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersberg, MD). Para a determinação de OVA específica para IgE ou subtipos de IgG, as placas foram recobertas durante a noite com OVA (Sigma-AIdrich). IgE ligada foi quantificada com IgE de rato anti-camundongo biotinilada (BD Biosciences) na presença do agente de bloqueio da IgG de camundongo (Sigma-AIdrich). IgGI ligada foi quantificada com IgGI de rato anti-camundongo biotinilada ou lgG3 de rato anti-camundongo (BD Biosciences). Concentrações de IgE total foram de- terminadas em relação a uma curva padrão da IgE de camundongo purifica- da (BD Biosciences). O limite de detecção foi 2 ng/ml. Ig específica para os títulos de OVA foi quantificada como a diluição sérica necessária alcançar um valor de absorvância dado, em relação ao padrão de referência. O limite de detecção foi um título relativo de 0,5. As diluições seriais do soro foram conduzidas em cada ensaio, com cada amostra conduzida em pelo menos três ensaios separados.
Para cada teste, os valores médios para determinações replica- das a partir de cada animal foram incluídos. Grupos de 20 animais foram dirigidos em cada ensaio. Dados foram analisados usando programa Graph- Pad Prism. Todos os valores de ρ informados foram determinados pelo teste t de Student não pareado.
Para confrontar a necessidade de IL-13 na condução da produ- ção de IgE em resposta ao desafio de alergênio, antagonista de IL-13 (sIL- 13Ra2.Fc) foi administrado a camundongos imunizados com OVA 24 horas antes e 24 horas após desafio intranasal com o antígeno. Como delineado na figura 31, camundongos foram imunizados i.p. com OVA/alúmen no dia 0, potencializado com OVA/alúmen no dia 13, e desafiados intranasalmente no dia 21. SIL-13Ra2.Fc (200 pg) foi administrado i.p. em ambos os dias 20 e 22. Os animais foram sacrificados no dia 28, e sangue coletado em tubos separadores de soro. IgE sérica total foi quantificada por ELISA. Não houve nenhuma diferença em título de IgE total em animais tratados com sIL- 13Ra2.Fc comparando com os dados camundongo de controle lgG2a (figura 32A). Os animais tratados tanto antes como após desafio com o antagonista de IL-13 tinham reduzido o título de IgE específica para OVA quando compa- rados com animais tratados com o controle de isotipo, mas esta diferença não falhou em alcançar a significação estatística por causa da presença de vários animais no grupo de controle sem título detectável da IgE específica para OVA (figura 32B). Não houve nenhuma diferença significante nos títulos da IgGI específica para OVA (figura 32C).
Como houve uma tendência em direção a títulos reduzidos de IgE específica para OVA em animais tratados com slL-13Ra2.Fc tanto antes como após desafio, avaliamos a eficácia de uma administração única de sIL- 13Ra2.Fc, dada 24 horas antes do desafio. Concentração de IgE sérica total foi reduzida nos camundongos tratados com slL-13Ra2.Fc quando compa- rados com aquele dado controle de lgG2a (p <0,05; figura 33A). Título de IgE específica para OVA também foi reduzido após uma administração única de slL-13Ra2.Fc (p <0,01; figura 33B). Não houve nenhuma modificação em título de IgGI específica para OVA.
Para avaliar se a neutralização de IL-4 pode afetar a resposta de IgE ao desafio de OVA de um modo similar a neutralização de IL-13, deram a camundongos uma dose única de 200 pg de anti-IL-4 i.p., pré-desafio de 24 horas. Um grupo adicional de camundongos foi tratado com uma combi- nação de slL-13Ra2.Fc e anti-IL-4 (200 pg cada um). Neutralização de qual- quer IL-13 (p <0,05) ou IL-4 (p <0,02) produziu uma redução significante do título de IgE sérica total (figura 34A). Títulos de IgE específica para OVA também foram significativamente reduzidos após tratamento com qualquer anti-IL-4 (p <0,02) ou slL-13Ra2.Fc (p <0,02) (figura 34B). Títulos de IgGI específica para OVA não foram afetados por qualquer tratamento (figura 35A). Títulos de lgG3 específicos para OVA também foram medidos neste estudo e mostraram uma redução significante com antagonista de IL-13 (p <0,001), mas não com o tratamento anti-IL-4 (figura 35B).
Administração de slL-13Ra2.Fc em conjunto com anti-IL-4 pro- duziu uma maior redução do título de IgE sérica total que aquela produzida por qualquer agente isolado (p <0,001) (figura 34A). Similarmente, títulos de IgE específica para OVA foram reduzidos até a maior extensão seguindo tratamento com slL-13Ra2.Fc e anti-IL-4 do que foram vistos por bloqueio de qualquer citocina isolada (p <0,001) (figura 34B). Os camundongos tratados com a combinação de slL-13Ra2.Fc e anti-IL-4 não se diferenciaram em títu- Ios da IgGI específica para OVA (figura 35A) ou lgG3 específica para OVA (figura 35B) em comparação com animais controle.
Vários estudos examinaram a utilidade da neutralização de IL-4 ou IL-13, entregue através de todas as partes do curso do desafio e/ou imu- 5 nização de OVA, na modulação de respostas de IgE (Zhou, C.Y. et al. (1997) J Asthma 34:195-201; Yang1 G. et al. (2004) Cytokine 28:224-232). Embora este paradigma de tratamento seja eficaz, estudos no modelo NHP, discutido neste pedido, indica que neutralização IL-13 eficaz pode ter um impacto du- radouro em respostas de IgE. Por isso, a exigência de múltiplas administra- 10 ções de um agente de neutralização de IL-4 ou IL-13 foi visada em um mo- delo de camundongo. Determinamos se, abaixo de condições ótimas de sensibilização e desafio, um tratamento único com agente de neutralização de IL-4 ou IL-13 pode modular efetivamente respostas de IgE ao antígeno.
SIL-13Ra2.Fc é um potente antagonista de IL-13, que foi mos- trado bloqueando a inflamação pulmonar, AHR, e a produção de muco em modelos animais de asma (Wills-Karp, M. et al. (1998) Science 282:2258- 2261). Em estudos prévios dirigindo seus efeitos sobre a produção de IgE, deram a camundongos dois ciclos do desafio pulmonar com OVA também por 10 dias (Will-Karp, M. et al. (1998) supra) ou 6 semanas (Taube, C. et al. (2002) J. Immunol. 169:6482-6489) após desafio inicial. SIL-13Ra2.Fc en- tregue somente no momento do desafio de alergênio secundário não alterou o título de IgE sérica específica para OVA (Wills-Karp, M. et al. (1998) supra, Taube, C. et al. (2002) supra). A falta do efeito sobre o título de IgE não sur- preendeu dada a resposta de IgE robusta vista com um desafio secundário (Karp, M. et al. (1998) supra). Compatível com isto, a entrega de várias do- ses de antagonista de IL-13, que começa no desafio inicial, foi mais eficaz. Níveis séricos de IgE específica para o alergênio, mas não IgGI, foram re- duzidos quando o anticorpo à IL-13 foi administrado antes de cada um dos 5 desafios intranasais semanais com OVA em um modelo de asma crônica (Zhou, C.Y. etal. (1997) supra).
Para indicar se um paradigma de dosagem única com agente de neutralização de IL-13 afetaria a produção de IgE específica em camundon- gos, slL-13Ra2.Fc foi administrado antes do desafio intranasal com OVA. Camundongos foram sensibilizados com OVA/alúmen nos dias O e 13, então dados um desafio intranasal único com OVA no dia 21. Os resultados mos- traram que uma administração única de slL-13Ra2.Fc, entregue 24 horas 5 antes do desafio, reduziu os títulos de IgE específica para OVA no momento de sacrifício, no dia 28. Títulos de IgGI específica para OVA não foram afe- tados. Concentrações séricas de IgE total também foram reduzidas na maior parte dos experimentos. De maneira interessante, entrega de duas doses de slL-13Ra2.Fc, 24 horas antes e 24 horas após desafio, não melhorou a efi- 10 cácia deste tratamento.
Para comparar a eficácia de neutralização de IL-13 e IL-4, os grupos de camundongos foram sensibilizados e desafiados com OVA como descrito acima, e tratados 24 horas antes de qualquer desafio com sIL- 13Ra2.Fc, anticorpo à IL-4, ou ambos slL-13Ra2.Fc e anti-IL-4. Tratamento 15 com slL-13Ra2.Fc ou anti-IL-4 reduziu significativamente títulos de IgE es- pecífica para OVA. A concentração de IgE sérica total foi também, significa- tivamente, reduzida. Administração de ambos sEL-13Ra2.Fc e anti-IL-4 pro- duziu uma maior magnitude da modificação em título específico para OVA e na concentração de IgE sérica total do que foi visto com qualquer tratamento 20 isolado. Estes efeitos pareceram específicos para IgE, contudo, como nem para concentrações de IgGI específica os OVA nem lgG3 específica para OVA foram afetados pelo tratamento combinado com slL-13Ra2.Fc e anti-IL- 4.
Estes achados apoiam a observação a partir de estudos de 25 NHP, que a entrega de um agente de neutralização de IL-13 na administra- ção única antes do desafio de alergênio pode reduzir a resposta de IgE ao alergênio. Um agente de neutralização de IL-4 pode ter atividade similar. A neutralização tanto de IL-4 como de IL-13 tinha um efeito mais potente sobre a redução de respostas de IgE do que a neutralização de qualquer citocina 30 sozinha. Estes achados acentuam a necessidade crítica de IL-4 e IL-13 no momento do desafio de alergênio.
Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de apurar usando experimentação de rotina, muitos equivalentes das moda- lidades específicas descritas neste pedido descritas neste pedido. Outras modalidades estão dentro das seguintes reivindicações. Listagem de Seqüências
<110> Wyeth
<12 O > "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAR E MONITORAR TRATAMENTO DE DESOR- DENS ASSOCIADAS Ã IL-13"
< 13 O > 1615 8 -105W01 <150> US 60/874,333 <151> 2006-12-11 <150> US 60/925,932 10 <151> 2007-04-23 <160> 224
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 1
Phe Val Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 15 10 15
Gln Phe Asn
<210> 2 <211> 19
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<400> 2
Phe Val Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 15 10 15 Arg Phe Asn
<210> 3 <211> 19 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 3
Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 15 10 15
Gln Phe Asn
<210> 4
< 211 > 19
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 4
Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 15 10 15
Arg Phe Asn
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<4 0 0 > 5
Phe Val Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly 10 15
<210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 6
Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly I 5 10 15
<210> 7 <211> 17 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 7
Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe 15 10 15
Asn
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<400> 8
Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe 1 5 10 15
Asn <210> 9 <211> 17 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 9
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe 15 10 15
Asn
< 210 > 10
<211> 17
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<400> 10
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe 'l 5 10 15
Asn
<210> 11 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 11
Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 15 10
<210> 12 <211> 13 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 12
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 15 10
<210> 13 <211> 8
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<40 0 > 13
His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 1 5
<210> 14 <211> 112 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 14
Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Lys Glu Leu He Glu Glu Leu 15 10 15
Val Asn He Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30
Val Trp Ser He Asn Leu Thr Ala Gly Val Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45
Ser Leu He Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala He Glu Lys Thr Gln Arg 50 55 60
Met Leu Asn Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser 65 70 75 80 Ser Leu Arg Val Arg Asp Thr Lys He Glu Val Ala Gln Phe Val Lys 85 90 95
Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln Phe Asn 100 105 110
<210 > 15 <211> 10 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 15
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 15 10
<210> 16 <211> 17
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 16
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 15 10 15
Gly
<210> 17
<2I1> 11
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<4 0 0 > 17
Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr I 5 10 15
15
20
25
30
I 5 10 <210 > 18 <211> 16 <212> PRT <213> Seqüência artificial <22 0 > <223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 18 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente gerado <400> 19 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210 > 20 <211> 9 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente gerado <400> 20 Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210 > 21 < 211 > 16 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <22 O >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222 > 1
<223> Xaa = Arg or Lys <220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = Leu or Ile <220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = Lys or Val
<220>
<221> VARIANT
<222> 16
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gin, Tyr1 Ala or ser
<400> 21
Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Xaa 15 10 15
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = Leu or Val <220> <221> VARIANT <222> 4
<223> Xaa = Asn or Tyr <400> 22
Lys Xaa Ser Xaa Arg Phe Ser 1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222> 3
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<221> VARIANT
<222> 4
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<221> VARIANT
< 222 > 5
<223> Xaa = His, Glu or Gln
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = Ile or Leu
<400> 23
Phe Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro 1 5
<210> 24 <211> 132 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 24
Met Ala Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 15 10 15
Phe Ala Ser Pro Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Lys Glu Leu 20 25 30
Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45
Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Val Tyr Cys 50 55 60
Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80
Lys Thr Gln Arg Met Leu Asn Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala
85 90 95
Gly Gln Phe Ser Ser Leu Arg Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110
Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125
Gly Gln Phe Asn 130 <210> 25 <2I1> 16
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <22 0 >
<221> VARIANT <222 > 1
<223> Xaa = Arg or Lys <220>
<22I> VARIANT
<222> 6
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<220>
<221> VARIANT <222> 7
<223> Xaa = Lys or Val <220>
<221> VARIANT <222> 10
<223> Xaa = Asn or Asp <22 0 >
<221> VARIANT
<222> 13
<223> Thr or Asn <22 0 >
<221> VARIANT <222> 16
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, gln, Tyr, Ala or Ser <400> 25
Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Xaa 15 10 15
<210> 26 < 211 > 16
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<220>
<221> VARIANT <222 > 1 <223> Xaa = Arg or Lys <220>
<221> VARIANT <222 > 6 <223> Xaa = Leu or Ile <220>
<221> VARIANT <222> 7
<223> Xaa = Lys or Val <22 0 >
<221> VARIANT <222> 10
<223> Xaa = Asn or Asp <220>
<221> VARIANT <222> 13
<223> Xaa = Thr or Asn <400> 26
Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 27
<2I1> 7
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = Leu, Val or Ile <220>
<221> VARIANT <222> 4 <223 > Xaa = Asn or Tyr <220> <221> VARIANT <222> 5 < 223 > Xaa = Arg or Trp <220> <221> VARIANT <222> 6 <223 > Xaa = Phe or Asp <400> 27 Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 28 <211> 6 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente <22 0 > <221 > VARIANT <222> 2 <223 > Xaa = Gly, , Ser or Ala <220> <221> VARIANT <222 > 3 <223 > Xaa = Ser or Thr <22 0 > <221> VARIANT <222 > 4 < 223 > Xaa = His1 , Glu or Gln <400> 28 Gln Xaa Xaa Xaa Ile Pro
1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente <22 0 > <221> VARIANT <222 > 3 <223 > Xaa = Gly, Ser or Ala <220> <221 > VARIANT <222> 4 <223 > xaa = Ser, Ile or Thr <220> <221> VARIANT <222 > 5 <22 3 > Xaa = His, Glu or Gln <220> <221> VARIANT <222 > 6 <223 > Xaa = Ile or Leu <4 0 0 > 29 Phe Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr Thr I 5
<210> 30 <211> 102 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220> <223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr 100
<210> 31 <211> 102 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 31
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 5 0 5 5 6 0
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr
100
<210> 32 <211> 102 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr 100
<210> 33 <211> 102 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4OO> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro 15 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr
100
<210> 34 <211> 102 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 15 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75
Gly
Ser
Pro
Pro
Ile
80
Gly
Gly
Ser
Ser
Pro
Ile
80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr 100
<210> 35 <211> 102 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr
100
<210> 36
<211> 102
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr 100
<210> 37 <211> 102 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial c220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 37
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr 100
<210> 38
<211> 102
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 38
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr 100
<210> 39 <211> 100
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT <222> 24
<223> Xaa = Arg or Lys
<220>
<221> VARIANT
<222> 29
<223> Xaa = Leu or Ile <220>
<221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = Lys or Val <220>
<221> VARIANT <222> 33
<223> Xaa = Asn or Asp
<220>
<221> VARIANT <222> 3 6
<223> Xaa = Thr or Asn <22 0 >
<221> VARIANT <222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gln, Tyr, Ala or Ser <220>
<221> VARIANT
<222> 56
<223> Xaa = Leu, Val or Ile <22 0 >
<221> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = Asn or Tyr <22 0 >
<221> VARIANT <222 > 59
<223> Xaa = Arg or Trp
<220>
<221> VARIANT
5 <222> 60
<223> Xaa = Phe or Asp <220>
<221> VARIANT <222> 96
10 <223> Xaa = Gly, Ser or Ala <220>
<221> VARIANT <222> 97
<223> Xaa = Ser, Ile or Thr
15 <220>
<221> VARIANT <222 > 98
<223> Xaa = His, Glu or Gln <220>
20 <221> VARIANT <222> 99
<223> Xaa = Ile or Leu
Pro Gly 15
His Ser Gln Ser Val Pro Lys Ile
Asp Ile Val
ι
Glu Pro Ala
Xaa Gly Asn 35
Pro Gln Leu 50
Asp Arg Phe
Met Thr Gln Thr Pro Leu 5
Ser Ile Ser Cys Xaa Ser 25
Xaa Tyr Leu Xaa Trp Tyr 40
Leu Ile Tyr Lys Xaa Ser 55
Ser Gly Ser Gly Ser Gly
Ser Leu Pro Val Thr 10
Ser Gln Ser Xaa Xaa 30
Leu Gln Lys Pro Gly 45
Xaa Xaa Xaa Ser Gly 60
Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro
100
<210> 40
<211> 100
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <22 0 >
<221> VARIANT
<222> 24
<223> Xaa = Arg or Lys <220>
<221> VARIANT
<222> 29
<223> Xaa = Leu or Ile <220>
<221> VARIANT
<222 > 30
<223> Xaa = Lys or Val <220>
<221> VARIANT
<222> 33
<223> Xaa = Asn or Asp <220>
<221> VARIANT
< 222 > 36
<223> Xaa = Thr or Asn <220> <221> VARIANT <222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gln, Tyr, Ala or Ser <220>
<221> VARIANT <222> 56
<223> Xaa = Leu, Val or Ile <220>
<221> VARIANT
<222> 58
<223> Xaa = Asn or Tyr <220 >
<221> VARIANT <222> 59 <223> Xaa = Arg or Trp <220>
<221> VARIANT <222 > 60
<223> Xaa = Phe or Asp <22 0 >
<221> VARIANT <222> (96) ... (0)
<223> Xaa = Gly, Ser or Ala <22 0 >
<221> VARIANT <222> 97
<223> Xaa = Ser, Ile or Thr <220>
<221> VARIANT
<222> 98)
<223> Xaa = His, Glu or Gln <220> <221> VARIANT <222> 99
<223> Xaa = Ile or Leu <400> 40
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser 20 25 30
Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Xaa Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro 100
<210> 41 <211> 100 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<220>
<221> VARIANT <222> 24
<223> Xaa = Arg or Lys <220 >
<221> VARIANT <222> 29
<223> Xaa = Leu or Ile <220>
<22I> VARIANT <222> 30
<223> Xaa = Lys or Val
<220 >
<22I> VARIANT
<222> 33
<223> Xaa = Asn or Asp <22 0 >
<221> VARIANT
<222> 36
<223> Xaa = Thr or Asn <220>
<221> VARIANT
<222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn1 Gin, Tyr, Ala or Ser <22 0 >
<221> VARIANT <222> 56
<223> Xaa = Leu, Val ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222> 58
<223> Xaa = Asn ou Tyr
<220>
<221> VARIANT <222> 59
<223> Xaa = Arg ou Trp <220>
<221> VARIANT
< 222 > 60
<223> Xaa = Phe ou Asp 10
15
20
<220> <221> VARIANT <222> 96 <223> Xaa = Gly, , Ser ou Ala <220> <221> VARIANT <222> 97 <223> Xaa = Ser1 , Ile ou Thr <220> <221> VARIANT <222 > 98 <223> Xaa = His, . Glu ou Gln <220> <221> VARIANT <222> 99 <223> Xaa = Ile ou Leu <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr 1 5 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Xaa Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys 50 55 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 65 70 15
30
40 45
Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro 50 55 60
r Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro 100
<210> 42 <211> 100 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT <222> 24
<223> Xaa = Arg ou Lys <220>
<221> VARIANT <222> 29
<223> Xaa = Leu ou Ile <220>
<221> VARIANT <222> 30
<223> Xaa = Lys ou Val <220>
<221> VARIANT
<222? 33
<223> Xaa = Asn ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 36 <223> Xaa = Thr ou Asn <220>
<221> VARIANT <222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gin, Tyr, Ala ou Ser
<22 0 >
<221> VARIANT <222 > 56 <223> Xaa = Leu, Val ou Ile
<220>
<221> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = Asn ou Tyr <220>
<221> VARIANT <222> 59
<223> Xaa = Arg ou Trp <220>
<22I> VARIANT <222> 60
<223> Xaa = Phe ou Asp <220>
<221> VARIANT <222 > 96
<223> Xaa = Gly, Ser ou Ala <220>
<221> VARIANT
<222> 97
<223> Xaa = Ser, Ile ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 98
<223> Xaa = His, Glu ou Gln <22 0 >
<221> VARIANT <222> 99
<223> Xaa = Ile ou Leu <400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser 20 25 30
Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Xaa Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro 100
<210> 43 <211> 100 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
< 222 > 24
<223> Xaa = Arg ou Lys <220 >
<221> VARIANT
<222> 29
<223> Xaa = Leu ou Ile <22 0 >
<221> VARIANT
< 222 > 30
<2 23> Xaa = Lys ou Val
< 22 0 >
<221> VARIANT <222> 33
<223> Xaa = Asn ou Asp
<220>
<221> VARIANT
<222> 36
<223> Xaa = Thr ou Asn <220>
<22I> VARIANT
<222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gin, Tyr, Ala ou Ser <220>
<221> VARIANT
<222> 56
<223> Xaa = Leu, Val ou Ile
<220 >
<221> VARIANT <222> 58
<223> Xaa = Asn ou Tyr <22 0 >
<221> VARIANT <222> 59
<223> Xaa = Arg ou Trp <220>
<221> VARIANT
<222> 60
<223> Xaa = Phe ou Asp
< 22 0 >
<221> VARIANT
< 222 > 96
<223> Xaa = Gly, Ser ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 97
<223> Xaa = Ser, Ile ou Thr
<220 >
<221> VARIANT
<222> 98
<223> Xaa = His, Glu ou Gln <220>
<221> VARIANT <222> 99 <223> Xaa = Ile ou Leu <400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser
20 25 30
Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Xaa Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro 5 0 5 5 6 0
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro
100
<210> 44
<211> 100
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <22 0 > <22I> VARIANT <222 > 24
<223> Xaa = Arg ou Lys <220>
<221> VARIANT <222> 29
<223> Xaa = Leu ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222> 30
<223> Xaa = Lys ou Val <220>
<221> VARIANT <222> 33 <223> Xaa = Asn ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 36
<223> Xaa = Thr ou Asn <220>
<221> VARIANT <222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gin, Tyr, Ala ou Ser <220>
<221> VARIANT <222> 56
<223> Xaa = Leu, Val ou Ile <220>
<221? VARIANT
<222> 58
<223> Xaa = Asn ou Tyr <220> <221> VARIANT
< 222 > 59
<223> Xaa = Arg ou Trp <220>
<221> VARIANT <222> 60
<223> Xaa = Phe ou Asp <22 0 >
<221> VARIANT
<222 > 96
<223> Xaa = Gly, Ser ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 97
<223> Xaa = Ser, He ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 98
<223> Xaa = His, Glu ou Gln <220>
<221> VARIANT <222> 99
<223> Xaa = He ou Leu <400> 44
Asp He Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15
Gln Pro Ala Ser He Ser Cys Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser 20 25 30
Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Xaa Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 3 5 4 0 4 5
Pro Arg Leu Leu He Tyr Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro 100
<210> 45 <211> 100 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222> 24
<223> Xaa = Arg ou Lys <220>
<221> VARIANT <222> 29 <223> Xaa = Leu ou Ile <220>
<221> VARIANT <222> 30
<223> Xaa = Lys ou Val
<22 0 >
<221> VARIANT <222 > 33
<223> Xaa = Asn ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 36
<223> Xaa = Thr ou Asn
Ile
80
Xaa <22 O >
<221> VARIANT <222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gln, Tyr, Ala ou Ser
<220>
<221> VARIANT
<222> 56
<223> Xaa = Leu, Val ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222 > 58
<223> Xaa = Asn ou Tyr <22 0 >
<221> VARIANT
<222 > 59
<223> Xaa = Arg ou Trp <220>
<221> VARIANT
<222> 60
<223> Xaa = Phe ou Asp <220>
<22I> VARIANT
<222> 96
<223> Xaa = Gly, Ser ou Ala
<220>
<221> VARIANT <222 > 97
<223> Xaa = Ser, He ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 98
<223> Xaa = His, Glu ou Gln <22 O >
<221> VARIANT <222> 99
<223> Xaa = Ile ou Leu <400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Ser Ser Gln Ser Xaa Xaa His Ser 20 25 30
Xaa Gly Asn Xaa Tyr Leu Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro 50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Xaa 85 90 95
Xaa Xaa Xaa Pro 100
<210> 46 <211> 100 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220> <22 3 > Pepitídio sinteticamente <22 0 > <221> VARIANT <222> 24 <223> Xaa = Arg ou Lys <22 0 > <221 > VARIANT <222> 29 <223> Xaa = Leu ou Ile <220>
<221> VARIANT <222> 30 <223> Xaa = Lys ou Val <220>
<221> VARIANT <222> 33
<223> Xaa = Asn ou Asp <220>
<221> VARIANT <222 > 36
<223> Xaa = Thr ou Asn <22 0 >
<221> VARIANT <222> 39
<223> Xaa = Glu, Asp, Asn, Gln, Tyr, Ala ou Ser <220 >
<22I> VARIANT
<222> 56
<223> Xaa = Leu, Val ou Ile <22 0 >
<22I> VARIANT <222> 58 <223> Xaa = Asn ou Tyr <220>
<221> VARIANT <222 > 59
<223> Xaa = Arg ou Trp
<22 0 >
<221> VARIANT <222> 60 <223> Xaa = Phe ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 96
<223> Xaa = Gly, Ser ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 97
<223> Xaa = Ser, Ile ou Thr <220>
<221> VARIANT <222 > 98
<223> Xaa = His, Glu ou Gln <220>
<221> VARIANT
Val Ser Leu Gly 15
Xaa Xaa His Ser 30
Pro Gly Gln Ser 45
Ser Gly Val Pro
Thr Leu Lys Ile 80
Cys Phe Gln Xaa 95
<222> 99
<223> Xaa = Ile ou Leu <400> 46
Asp Val Leu Met Thr ι 5
Asp Gln Ala Ser Ile 20
Xaa Gly Asn Xaa Tyr 35
Pro Lys Leu Leu Ile 50
Asp Arg Phe Ser Gly 65
Ser Arg Val Glu Ala
85
Xaa Xaa Xaa Pro 100
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 10
Ser Cys Xaa Ser Ser Gln Ser 25
Leu Xaa Trp Tyr Leu Gln Lys 40
Tyr Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 70 75
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr 90 10
15
20
25
30
<210 > 47 <211> 11 <212 > PRT <213> Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente gerado <400> 47 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212 > PRT <213> Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente gerado <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222 > 3 <223 > Xaa = Asn ou Thr <220> <221> VARIANT <222 > 9 <223 > Xaa = Met ou Ile <400> 48 Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr Tyr Xaa His 1 5 10 <210 > 49 <211> 17 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<22 0 >
<221> VARIANT <222 > 1
<223> Xaa = Trp ou Arg <22 0 >
<221> VARIANT <222> 5
<223> Xaa = Gly ou Ala <22 0 >
<221> VARIANT
<222 > 12
<223> Xaa = Ser ou Asp <22 0 >
<221> VARIANT <222 > 13 <223> Xaa = Pro ou Gln <400> 49
Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe Gln 15 10 15
Gly
25
<210> 50 <211> 109 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 51
<211> 109
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 52
<211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 52
Gln Val Gln 1
Ser Val Lys
Tyr Ile His 35
Gly Arg Ile 50
Gln Gly Arg
65
Met Glu Leu Ala Arg Ser
<210> 53
<211> 109
< 212 > PRT <213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 5 10 15
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 25 30
Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 40 45
Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 55 60
Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 70 75 80
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 54
<211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 <210> 55 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência <220>
<223> Pepitídio <400> 55 Gln Met Gln 1
Ser Val Lys Tyr Ile His
35
Gly Arg Ile 50
Gln Gly Arg 65
Met Glu Leu Ala Arg Ser <210> 56
<211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220 >
<223> Pepitídio sinteticamente
<4 0 0 > 56
15
Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 30
Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 45
Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 60
Asp Arg Ser Met Ser Thr Ala Tyr 75 80
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 90 95
Asp Phe Phe Asp Tyr 105
gerado
Ala Thr Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
artificial
sinteticamente gerado
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 5
Val Ser Cys Lys Ala 20
Trp Val Arg Gln Ala 40
Asp Pro Ala Asn Asp 55
Val Thr Ile Thr Arg 70
Ser Ser Leu Arg Ser 85
Glu Glu Asn Trp Tyr 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210 > 57 <211> 107 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 57
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Arg 35 40 45
Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly 50 55 60
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
< 210 > 58 <2II> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 58
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210 > 59 <211> 110 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <40 0 > 5 9
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
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<210 > 60 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <22Q>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 60
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
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<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 61
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<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 62
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100 105
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<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 63
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< 210 > 64 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 64
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100 105
<210> 65
<211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 65
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
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Ala Lys Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 66
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
100 105
<210 > 67 <211> 110 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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<213> Seqüência artificial <220 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
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<211> 109
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<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
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<210> 70
<211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45
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<210> 71
<211> 109
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 72 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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<210 > 73
<2II> 109
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly I 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 74 <211> 109 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 75 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
I 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210 > 76 <211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 > <223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 77 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 00 > 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 78 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 79 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 O O > 79
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
100 105
<210> 80 <211> 109 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 81
< 211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
100 105
<210> 82 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 82 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
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Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
15
20
25
30
<210> 83 < 211 > 109 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial <220> < 22 3 > Pepitídio sinteticamente <220> <221 > VARIANT < 222 > 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> < 221 > VARIANT <222> 28 < 22 3 > Xaa = Asn ou Thr <22 0 > < 221 > VARIANT <222 > 34 <223 > Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT
< 222 > 50
<223> Xaa = Trp ou Arg
<220>
<22I> VARIANT <222> 54
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<221> VARIANT <222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp
< 2 2 0 >
<221> VARIANT
<222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <4 0 0 > 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
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Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 84 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT <222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT <222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 34
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<221> VARIANT
<222> 50
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<221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = Gly ou Ala <2 2 0 >
<221> VARIANT <222> 61
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<22 0 >
<221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = Pro ou Gln <400> 84
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
20
25
30
<210> 85 <211> 109 <212 > PRT <213> Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente <220 > <221> VARIANT < 222 > 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222 > 28 < 2 2 3 > Xaa = Asn ou Thr < 22 0 > <221> VARIANT <222> 34
<223> Xaa = Met ou He <220>
<221> VARIANT
<222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222 > 54 <223> Xaa = Gly ou Ala <22 0 >
<221> VARIANT <222 > 61
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<22 0 >
<221> VARIANT <222> 62
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10
15
20
25
30
<210 > 86 <211 > 109 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial < 22 0 > <22 3 > Pepitidio sinteticamente <22 0 > <221> VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = Asn OU Thr <220> < 221 > VARIANT <222> 34 <223 > Xaa = Met OU Ile <220> <221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = Trp OU Arg <220> <221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = Gly OU Ala <220> <2 21 > VARIANT < 222 > 61 <223> Xaa = Ser OU Asp <220> <22I> VARIANT
< 222 > 62
<223 > Xaa = Pro ou Gln <400> 86
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
20
25
30
< 210 > 87 <211> 109 <212> PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente <220> <221> VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222 > 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT
<222> 34
<223> Xaa = Met ou Ile
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT
<222> 54
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<221> VARIANT
<222> 61
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<221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = Pro ou Gln
Gly Ala 15
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Trp Met
Lys Phe
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Tyr Cys
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys
20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr
65 70 75
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
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<210> CO 00 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223> Pepitídio sinteticamente <220> <221> VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr <220> <221> VARIANT <222> 34 <223 > Xaa = Met ou Ile < 220 > <221> VARIANT <222 > 50 <223> Xaa = Trp ou Arg <22 0 > <221 > VARIANT <222 > 54 <223 > Xaa = Gly ou Ala <220> <221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = Ser ou Asp
<220>
<221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = Pro ou Gln <400> 88
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
20
25
30
100 105 <210> 89 <211> 109 < 212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220> <22 3 > Pepitídio sinteticamente gerado < 22 0 > <221> VARIANT < 2 22 > 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe < 2 2 0 > <221 > VARIANT <222> 28
<223 > Xaa = Asn ou Thr
<220>
<221> VARIANT <222> 34
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
I 5 10
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys
25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa 50 55 60
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100 105
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<213> Seqüência artificial <220>
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<221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT <222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <22 0 >
<221> VARIANT <222> 34
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<221> VARIANT <222> 50
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<221> VARIANT
<222> 54
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<222> 61
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<221> VARIANT <222> 62
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Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Arg Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Xaa 35 40 45
Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe Gln Gly 50 55 60
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Met Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 85 90 95
Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 91 <211> 109
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220 >
<221> VARIANT <222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT
<222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr
<220>
<221> VARIANT <222> 34
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< 220 >
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<221> VARIANT
<222 > 54
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<221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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15
20
25
30
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
105
100 <210> 92 <211> 110 <212> PRT <213> Seqüência artificial <22 0 > < 223 > Pepitídio sinteticamente <220> <221> VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr < 22 0 > <221> VARIANT <222> 34 <223 > Xaa = Met ou Ile < 22 0 > <221> VARIANT <222 > 50 <223 > Xaa = Trp ou Arg <22 0 > <221> VARIANT <222 > 54 <223> Xaa = Gly ou Ala
<220>
<221> VARIANT <222> 61 <223 > Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
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<210> 93
<211> 109
<212> PRT
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<223> Pepitídio sinteticamente gerado
< 22 0 >
<221> VARIANT <222> 27
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<220>
<221> VARIANT
<222> 28
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<221> VARIANT
<222> 34
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<221> VARIANT
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<221> VARIANT <222> 54
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<221> VARIANT
<222> 62
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 10
15
20
25
30
35 40 45
Ser Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210 > 94 <211> 109 <212> PRT < 213 > Seqüência artificial <220> <22 3 > Pepitídio sinteticamente <220> <221> VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr <22 0 > <221 > VARIANT <222 > 34 <223 > Xaa = Met ou Ile <220> <221> VARIANT <222 > 50 <223> Xaa = Trp ou Arg <220> <221> VARIANT
<222 > 54
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<221> VARIANT <222> 62
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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<222> 27
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<220>
<221> VARIANT
<222> 28
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<221> VARIANT
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 15 10 15
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15
20
25
30
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15
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<210> 97
<211> 109
<212 > PRT
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<221> VARIANT
<222> 61
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
15
20
25
30
<210> 98 <211> 109 <212> PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223> Pepitídio sinteticamente <220> <221 > VARIANT <222 > 27 <223> Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222 > 28 <2 23 > Xaa = Asn ou Thr <22 0 > <221> VARIANT <222 > 34 <22 3 > Xaa = Met ou Ile <220 > <221> VARIANT
<222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222 > 54
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Ala Lys Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
100 105
< 210 > 99 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<220>
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<222> 34
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<221> VARIANT <222> 54
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<220>
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<221> VARIANT <222> 62
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
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Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
100 105
20
25
30
<210> 100 <211> 110 <212 > PRT < 213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente <220> <221> VARIANT <222 > 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr < 22 0 > <221 > VARIANT <222> 34 <223> Xaa = Met ou Ile <22 0 >
<22I> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = Trp ou Arg
< 22 0 >
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<223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105 110 <210> 101
<211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT <222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr
<220 >
<221> VARIANT <222 > 34
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<221> VARIANT <222> 50
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<221> VARIANT
<222 > 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <22 0 >
<221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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105
20
25
30
100 <210 > 102 <211> 109 <212 > PRT <213 > Seqüência artificial <220> < 22 3 > Pepitídio sinteticamente <220> <221 > VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <2 2 0 > <221> VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr < 220 > <22I> VARIANT
<222> 34
<223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT <222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT
<222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln
<4 0 0 > 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210 > 103
<211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT
<222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT
<222> 34
<223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222 > 50
<223> Xaa = Trp ou Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala
< 22 0 >
<221> VARIANT
<222 > 61
<223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa He Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45
Ser Xaa He Asp Pro Xaa Asn Asp Asn He Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 104
<211> 109
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <22 0 >
<221> VARIANT
<222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe
< 22 0 >
<221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = Asn <220>
<22I> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = Met <22 O >
<221> VARIANT <222> 50 <223> Xaa = Trp <220>
<221> VARIANT
<222> 54
<223> Xaa = Gly
<220>
<221> VARIANT <222> 61 <223 > Xaa = Ser <220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro <400> 104 Glu Val Gln Leu 1
Ser Leu Arg Leu 20
Tyr Xaa His Trp 35
Gly Xaa He Asp
5 0
Gln Gly Arg Phe 65
ou Thr
ou Ile
ou Arg
ou Ala
ou Asp
ou Gln
Val Glu Ser Gly Gly Gly 10
Ser Cys Ala Ala Ser Gly 25
Val Arg Gln Ala Pro Gly 40
Pro Xaa Asn Asp Asn Ile
55
Thr He Ser Arg Asp Asn 70
Leu Val Gln Pro Gly Gly 15
Xaa Xaa He Lys Asp Thr 30
Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45
Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe
60
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 105 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<22I> VARIANT <222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe
<220>
<221> VARIANT <222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <22 0 >
<221> VARIANT <222 > 34
<223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = Gly ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT
<222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa He Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Xaa He Asp Pro Xaa Asn Asp Asn He Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 106 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <22 0 >
<221> VARIANT
<22 2 > 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 34
<223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222> 54 <223> Xaa = Gly ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222 > 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa He Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn He Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60 10
15
20
25
30
Gln Gly Arg Phe Thr He Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 107 <211> 109 <212> PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente <220> <221> VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221> VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr <220> <221> VARIANT <222 > 34 < 22 3 > Xaa = Met ou Ile <220> <221> VARIANT <222 > 50 <223 > Xaa = Trp ou Arg <220> <221 > VARIANT <222> 54 <223 > Xaa = Gly ou Ala <220>
<22I> VARIANT <222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp
<220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 108 <211> 109
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado
<220>
<221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 34
<223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT <222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <220>
<221> VARIANT <222 > 61
<223> Xaa = Ser ou Asp <22 0 >
<221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = Pro ou Gln <400> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
105
100 <210> 109 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <22 0 > <223 > Pepitídio sinteticamente <220> <221> VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <22 0 > <221> VARIANT <222> 28 <223> Xaa = Asn ou Thr <220> <221> VARIANT <222> 34 <223 > Xaa = Met ou Ile <220> <221 > VARIANT <222 > 50 <223 > Xaa = Trp ou Arg <220> <221> VARIANT <222 > 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <22 0 >
<221> VARIANT
<222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62 <223> Xaa = Pro ou Gln <400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
100 105
<210> 110 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220> <22I> VARIANT <222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT <222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT
<222> 34
<223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT
<222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT
<222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <220>
<221> VARIANT
<222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp
< 22 0 >
<221> VARIANT
<222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln
<4 0 0 > 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
100 105
15
20
25
30
<210> 111 <211> 109 <212> PRT <213 > Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente < 22 0 > <221> VARIANT < 222 > 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe < 22 0 > <221 > VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr <220> <221> VARIANT <222 > 34 <223> Xaa = Met ou Ile <22 0 > <221> VARIANT <222 > 50 <22 3 > Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala
<22 0 >
<221> VARIANT <222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT
<222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 112 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 > <223> Pepitídio sinteticamente gerado <220 >
<221> VARIANT <222> 27 <223> Xaa = Tyr ou Phe <220 >
<221> VARIANT <222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 34
<223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT <222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT
<222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala 35 40
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp 50 55
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala 65 70
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
85
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr 100
<210 > 113 <211> 109 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT
<222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT <222> 34 <223> Xaa = Met ou Ile <220>
<221> VARIANT
Ser Gly Xaa Xaa 25
Pro Gly Lys Gly
Asn Ile Lys Tyr 60
Asp Asn Ala Lys
75
Glu Asp Thr Ala 90
Asp Phe Phe Asp 105
Ile Lys Asp Thr 30
Leu Glu Trp Val 45
Xaa Xaa Lys Phe
Asn Ser Ala Tyr 80
Val Tyr Tyr Cys 95
Tyr <222 > 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <220>
<221> VARIANT <222> 61 <223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222 > 62
<223> Xaa = Pro ou Gln <400> 113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
<210> 114
<2I1> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <22 O >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <220>
<221> VARIANT
<222> 27
<223> Xaa = Tyr ou Phe <220>
<221> VARIANT
<222> 28
<223> Xaa = Asn ou Thr <220>
<221> VARIANT
<222 > 34
<223> Xaa = Met ou Ile <22 0 >
<221> VARIANT
<222 > 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT
<222 > 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <2 2 0 >
<221> VARIANT
<222 > 61
<223> Xaa = Ser ou Asp
< 22 0 >
<221> VARIANT
< 222 > 62
<223> Xaa = Pro ou Gln
<400> 114 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Xaa His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
15
20
25
30
<210> 115 <211> 109 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220> <223 > Pepitídio sinteticamente <220> <221 > VARIANT <222> 27 <223 > Xaa = Tyr ou Phe <220> <221 > VARIANT <222> 28 <223 > Xaa = Asn ou Thr <22 0 > <221> VARIANT <222 > 34 <223 > Xaa = Met ou Ile <22 O >
<221> VARIANT <222> 50
<223> Xaa = Trp ou Arg <220>
<221> VARIANT <222> 54
<223> Xaa = Gly ou Ala <22 0 >
<221> VARIANT <222> 61
<223> Xaa = Ser ou Asp <220>
<221> VARIANT <222> 62
<223> Xaa = Pro ou Gln
Gly Ala 15
Asp Thr
Trp Ile
Lys Phe
Ala Tyr 80 Tyr Cys 95
<210> 116
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro
10
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Xaa Xaa Ile Lys
25 30
Tyr Xaa His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu
40 45
Gly Xaa Ile Asp Pro Xaa Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Xaa Xaa
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 65 70 75
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105 <211> 11
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 116
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
10
<210> 117 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 117
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
10
<210> 118 <211> 11 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 118
Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn
10
<210 > 119 <211> 7
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 119
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 120 <211> 9
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitidio sinteticamente gerado
<400> 120
Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 121 <211> 10 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 121
Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn 10
<210> 122 <211> 14 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 122
Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu
1 5 10
<210> 123 <211> 16 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 123
Asp Lys Thr Phe Tyr Tyr Asp Gly Phe Tyr Arg Gly Arg Met Asp Tyr
10 15
<210 > 124 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124
Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu
10 15
Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser
25 30
Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu
40 45
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln
50 55 60
Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe 65 70 75 80
Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val
85 90 95
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe 100 105 110
Asn
<210> 125
<211> 427 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 O O > 125 Met Glu Trp Pro 1
Ala Gly Gly Gly 20
Pro Pro Val Thr 35
Ile Trp Thr Trp 50
Trp Tyr Phe Ser 65
Glu Thr Arg Arg
Gln Val Gly Ser 100
Leu Val Glu Lys 115
Val Ile Glu Leu 130
Ser Trp Leu Pro 145
Tyr Tyr Trp His
Phe Arg Glu Gly 180
Lys Asp Ser Ser 195
Asn Ala Gly Lys 210
Arg Val Lys Pro 225
Asp Asp Leu Tyr
Ala Arg Leu Cys 5
Gly Gly Gly Gly
Asn Leu Ser Val 40
Asn Pro Pro Glu 55
His Phe Gly Asp 70
Ser Ile Glu Val 85
Gln Cys Ser Thr
Cys Ile Ser Pro 120
Gln Cys Ile Trp 135
Gly Arg Asn Thr 150
Arg Ser Leu Glu 165
Gln Tyr Phe Gly
Phe Glu Gln His 200
Ile Lys Pro Ser 215
Asp Pro Pro His 230
Val Gln Trp Glu
Gly Leu Trp Ala 10
Gly Ala Ala Pro 25
Ser Val Glu Asn
Gly Ala Ser Ser 60
Lys Gln Asp Lys 75
Pro Leu Asn Glu 90
Asn Glu Ser Glu 105
Pro Glu Gly Asp
His Asn Leu Ser 140
Ser Pro Asp Thr 155
Lys Ile His Gln 170
Cys Ser Phe Asp 185
Ser Val Gln Ile
Phe Asn Ile Val 220
Ile Lys Asn Leu 235
Asn Pro Gln Asn
Leu Leu Leu Cys 15
Thr Glu Thr Gln 30
Leu Cys Thr Val 45
Asn Cys Ser Leu
Lys Ile Ala Pro 80
Arg Ile Cys Leu 95
Lys Pro Ser Ile 110
Pro Glu Ser Ala 125
Tyr Met Lys Cys
Asn Tyr Thr Leu 160
Cys Glu Asn Ile 175
Leu Thr Lys Val 190
Met Val Lys Asp 205
Pro Leu Thr Ser
Ser Phe His Asn 240
Phe Ile Ser Arg 245 250 255
Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His
260 265 270
Asn Val Phe Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu
275 280 285
Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro
290 295 300
Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys 305 310 315 320
Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile
325 330 335
Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile Thr Met Leu Leu Ile Val
340 345 350
Pro Val Ile Val Ala Asp Ala Ile Ile Val Leu Leu Leu Tyr Leu Lys
355 360 365
Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile Pro Asp Pro Gly Lys Ile
370 375 380
Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp Asp Thr Leu His Trp Lys 385 390 395 400
Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys Glu Glu Thr Asp Ser Val
405 410 415
Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser Gln 420 425
<210 > 126 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0 > 126
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 25 30 Asp Gly Asn 35
Pro Arg Arg 50
Asp Arg Phe 65
Ser Arg Val
Thr His Trp
<210> 127 <211> 20 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <4 0 0 > 127
Met Ala Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly
10 15
Phe Ala Ser Pro 20
<210 > 128 <211> 329 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 128
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
40 45
Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
70 75 80
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Pro Pro 100 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
<210> 129
<211> 360
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 129
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag gttctggctt caacattaaa gacacctata tacactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatgataa tattaaatat 180 gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctacagctca acagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatctgag 300 gaaaattggt acgacttttt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 360 <210 > 130 <211> 120 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 130
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 131 <211> 19 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 131
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
10 15
Val Asn Ser
<210> 132
<211> 336
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 132
gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca ggtctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120
tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatt 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatattccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210 > 133
<211> 112
<212 > PRT
<213> Mus musculus
<4 0 0 > 133
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210 > 134 <211> 19 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <400> 134
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
10 15
Ser Ser Ser
<210 > 135 <211> 429 <212 > DNA <213 > Mus <400> 135 atggctgtcc gtgcagctga tgcaccgtct
musculus
tggcattact aggagtcagg cagggttctc
cttctgcctg acctggcctg attaaccggc
gtaacattcc gtggcgccct tatggtgtaa
caagctgtat cacagagcct actgggttcg
cctttcccag gtccatcaca ccagcctcca ggaaagggtc tggagtggct gggaataatt tggggtgatg gaagcacaga ctataattca 240 gctctcaaat ccagactgat catcaacaag gacaactcca agagccaagt tttcttaaaa 300 atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc aggtacttct gtgccagaga taagactttt 360 tactacgatg gtttctacag gggcaggatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 420 gtctcctca 429
<210 > 136 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 136
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 40 45
Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ile Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Lys Thr Phe Tyr Tyr Asp Gly Phe Tyr Arg Gly Arg Met Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 137 <211> 124 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <400> 137
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
40 45
Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Leu Ile Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Lys Thr Phe Tyr Tyr Asp Gly Phe Tyr Arg Gly Arg Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210 > 138 <211> 387
<212> DNA
<213> Mus musculus <4 0 0 > 138
atgaacacga gggcccctgc tgagttcctt gggttcctgt tgctctggtt tttaggtgcc 60
agatgtgatg tccagatgat tcagtctcca tcctccctgt ctgcatcttt gggagacatt 120
gtcaccatga cttgccaggc aagtcagggc actagcatta atttaaactg gtttcagcaa 180
aaaccaggga aagctcctaa gctcctgatc tttggtgcaa gcaacttgga agatggggtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tagatatggg acaaatttca ctctcaccat cagcagcctg 300
gaggatgaag atatggcaac ttatttctgt ctacagcata gttatctccc gtggacgttc 360
ggtggcggca ccaaactgga aatcaaa 387
<210> 139
<211> 107 < 212 > PRT <213> Mus musculus <400> 139
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
40 45
Phe Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asn Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp 65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
< 210 > 140 <211> 22 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <4 0 0 > 140
Met Asn Thr Arg Ala Pro Ala Glu Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Trp
10 15
Phe Leu Gly Ala Arg Cys 20
<210> 141
< 211> 329
< 212 > PRT
<213 > Homo sapiens <4 0 0 > 141 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 142 <211> 417 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 142
atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag 60 gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 120 tgcacaggtt ctggcttcaa cattaaagac acctatatac actgggtgaa gcagaggcct 180 gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atgataatat taaatatgac 240 ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctaccta 300 cagctcaaca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctag atctgaggaa 360 aattggtacg acttttttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 417 <210> 143 <211> 139
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 143
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile 40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp 65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210 > 144 <211> 393
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 144
atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcaggt ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagattagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tattccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393
<210> 145 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0 > 145
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125
Glu Ile Lys 130 <210> 146 <211> 417 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 146
atggattgga cctggcgcat cctgttcctg gtggccgctg ccaccggcgc tcactctcag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaggtg aagaagcctg gcgcttccgt gaaggtgtcc 120 tgtaaggcct ccggcttcaa catcaaggac acctacatcc actgggtgcg gcaggctccc 180 ggccagcggc tggagtggat gggccggatc gatcctgcca acgacaacat caagtacgac 240 cccaagtttc agggccgcgt gaccatcacc cgcgatacct ccgcttctac cgcctacatg 300 gagctgtcta gcctgcggag cgaggatacc gccgtgtact actgcgcccg ctccgaggag 360 aactggtacg acttcttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtcctct 417 <210> 147 <211> 144 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 147
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile
40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp 65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Ser Cys Arg 130 135 140
< 210 > 148 <211> 396
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <4 0 0 > 148
atgcggctgc ccgctcagct gctgggcctg ctgatgctgt gggtgcccgg ctcttccggc gacgtggtga tgacccagtc ccctctgtct ctgcccgtga ccctgggcca gcccgcttct atctcttgcc ggtcctccca gtccatcgtg cactccaacg gcaacaccta cctggagtgg 180 tttcagcaga gacccggcca gtctcctcgg cggctgatct acaaggtgtc caaccgcttt 240 tccggcgtgc ccgatcggtt ctccggcagc ggctccggca ccgatttcac cctgaagatc 300 agccgcgtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgct tccagggctc ccacatccct 360 tacacctttg gcggcggaac caaggtggag atcaag 3 96
<210> 149 <211> 132 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 149
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro 10 15
Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 25 30
Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
40 45
Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg 50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110
Cys Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Val Glu Ile Lys
130
<210 > 150 <211> 417 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 150
atggagctgg gcctgtcttg ggtgttcctg gtggctatcc tggagggcgt gcagtgcgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg cggcggactg gtgcagcctg gcggctctct gcggctgtct 120 tgcgccgctt ccggcttcaa catcaaggac acctacatcc actgggtgcg gcaggctccc 180 ggcaagggcc tggagtgggt ggcccggatc gatcctgcca acgacaacat caagtacgac 24 0 cccaagttcc agggccggtt caccatctct cgcgacaacg ccaagaactc cctgtacctc 300 cagatgaact ctctgcgcgc cgaggatacc gccgtgtact actgcgcccg gagcgaggag 360 aactggtacg acttcttcga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtcctct 417 <210> 151 <211> 139 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <400> 151
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu 10
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
25
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 35 40
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln
50 55
Glu Trp Val Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn 65 70
Pro Lys Phe Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser
85 90
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
Val Ala Ile
Gly Gly Gly
Ala Ser Gly 45
Ala Pro Gly 60
Asp Asn Ile 75
Arg Asp Asn Ala Glu Asp
Leu Glu Gly 15
Leu Val Gln 30
Phe Asn Ile
Lys Gly Leu
Lys Tyr Asp 80
Ala Lys Asn 95
Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135
<210 > 152 <211> 405 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 152
atggatatgc gcgtgcccgc tcagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gcgcggagcc 60 cgctgcgata tccagatgac ccagtcccct tcttctctgt ccgcctctgt gggcgatcgc 120 gtgaccatca cctgtcggtc ctcccagtcc atcgtgcact ccaacggcaa cacctacctg 180 gagtggtatc agcagaagcc cggcaaggcc cctaagctgc tgatctacaa ggtgtccaac 240 cgcttttccg gcgtgccttc tcggttctcc ggctccggct ccggcaccga tttcaccctg 300 accatctcct ccctccagcc cgaggatttc gccacctact actgcttcca gggctcccac 360 atcccttaca cctttggcgg cggaaccaag gtggagatca agcgt 405
<210> 153
<211> 135 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 153
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu
10
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
Leu Trp 15
Ser Ser Ser Ser Gln Ser Ile 50
Gln Lys Pro 65
Arg Phe Ser Asp Phe Thr Tyr Tyr Cys
115
Thr Lys Val
130 <210 > 154 <211> 360 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <4 0 0 > 154
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120 cccggcaagg gcctggagtg gatcggccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctcgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360 <210> 155 <211> 120 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<22 0 >
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <400> 155
Val His Ser Asn Gly Asn 55
Gly Lys Ala Pro Lys Leu 70
Gly Val Pro Ser Arg Phe 85
Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105
Phe Gln Gly Ser His Ile 120
Glu Ile Lys Arg 135
Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln 60
Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn
75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 90 95
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr 110
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 125 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210 > 156 <211> 360 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <4 0 0 > 156
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 6 0 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180 gaccccaagt tccagggcaa ggccaccatc tctcgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360
<210 > 157 < 211> 120 <212> PRT <213> Seqüência artificial
< 22 O >
<223> Pepitldio sinteticamente gerado <400> 157
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 360
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 158
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60
tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180
gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctgccgaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360 <210> 159 <211> 120 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 159
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 160 <211> 360 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 160
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtgggccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctcgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360 <210> 161 <211> 120 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 0 0 > 161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 HO
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 162 <211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 162
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60
tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180
gaccccaagt tccagggcaa ggccaccatc tctgccgaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300
gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360
<210> 163 <211> 120 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 164 <211> 360
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 164
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120 cccggcaagg gcctggagtg gatcggccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctgccgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360 <210> 165 <211> 120
< 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <4 00 > 165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 166 <211> 360 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <4 0 0 > 166
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 12 cccggcaagg gcctggagtg ggtgggccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 18 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctgccgaca acgccaagaa ctccctgtac 24 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 30 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 36 <210 > 167 <211> 120 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 167
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn 65 70 75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr 100 105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 168 <211> 360
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucIeotide
<4 00 > 168
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggcccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctcgcgaca acgccaagaa ctccgcctac 240 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360 <210> 169 <211> 120 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 169
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
Ser Leu Tyr 80
Tyr Tyr Cys 95
Trp Gly Gln 110 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 HO
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
< 210 > 170
< 211> 360 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <4 0 0 > 170
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 12 cccggcaagg gcctggagtg ggtgggccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 18 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctgccgaca acgccaagaa ctccgcctac 24 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 30 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 36
< 210 > 171 <211> 120 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
< 22 0 >
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <4 0 0 > 171 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
< 210 > 172 <211> 360 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 172
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcgccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120 cccggcaagg gcctggagtg gatcggccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctgccgaca acgccaagaa ctccgcctac 240 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct 360
<210> 173 <211> 120 <212 > PRT <213> Seqüência artificial
< 22 O >
<223> Pepitldio sinteticamente gerado <400> 173
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 174 <211> 360
< 212 > DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <400> 174
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc tctgcggctg 60 tcttgcaccg gctccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gcggcaggct 120 cccggcaagg gcctggagtg gatcggccgg atcgatcctg ccaacgacaa catcaagtac 180 gaccccaagt tccagggccg gttcaccatc tctgccgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ctccagatga actctctgcg cgccgaggat accgccgtgt actactgcgc ccggagcgag 300 gagaactggt acgacttctt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctct <210 > 175 <211> 120 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitxdio sinteticamente gerado <400> 175
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Glu Asn Trp Tyr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 176 <211> 450 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223 > Pepitidio sinteticamente gerado <400> 176
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5
Ser Leu Arg Leu Ser 20
Tyr Ile His Trp Val 35
Gly Arg Ile Asp Pro 50
Gln Gly Arg Phe Thr 65
Leu Gln Met Asn Ser 85
Ala Arg Ser Glu Glu 100
Gly Thr Leu Val Thr 115
Phe Pro Leu Ala Pro 130
Leu Gly Cys Leu Val 145
Trp Asn Ser Gly Ala 165
Leu Gln Ser Ser Gly 180
Ser Ser Ser Leu Gly 195
Pro Ser Asn Thr Lys 210
Lys Thr His Thr Cys 225
Pro Ser Val Phe Leu 245
Ser Arg Thr Pro Glu
10
Cys Ala Ala Ser Gly Phe 25
Arg Gln Ala Pro Gly Lys 40
Ala Asn Asp Asn Ile Lys 55
Ile Ser Ala Asp Asn Ala 70 75
Leu Arg Ala Glu Asp Thr 90
Asn Trp Tyr Asp Phe Phe 105
Val Ser Ser Ala Ser Thr 120
Ser Ser Lys Ser Thr Ser 135
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 150 155
Leu Thr Ser Gly Val His 170
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 185
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 200
Val Asp Lys Lys Val Glu 215
Pro Pro Cys Pro Ala Pro 230 235
Phe Pro Pro Lys Pro Lys 250
Val Thr Cys Val Val Val
15
Asn Ile Lys Asp Thr 30
Gly Leu Glu Trp Ile 45
Tyr Asp Pro Lys Phe 60
Lys Asn Ser Ala Tyr 80
Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Asp Tyr Trp Gly Gln 110
Lys Gly Pro Ser Val 125
Gly Gly Thr Ala Ala 140
Pro Val Thr Val Ser 160
Thr Phe Pro Ala Val 175
Val Val Thr Val Pro 190
Asn Val Asn His Lys 205
Pro Lys Ser Cys Asp 220
Glu Ala Leu Gly Ala 240
Asp Thr Leu Met Ile 255
Asp Val Ser His Glu 260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly Lys
450
<210> 177 <211> 219 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Pepitidio sinteticamente gerado <4 0 0 > 177 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
< 210 > 178 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178
Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly
10 15
Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu
25 30
Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys
40 45
Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80
Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala
85 90 95
Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala
100 105 110
Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu
115 120 125
Gly Arg Phe Asn
130 <210> 179 <211> 13 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 179
Met Ala Leu Leu Leu Thr Met Val Ile Ala Leu Thr Cys
10
<210> 180 <211> 12 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 180
Leu Gly Gly Phe Ala Ser Pro Ser Pro Val Pro Pro 10
<210> 181 <211> 17 <212 > PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 181
Ser Pro Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Lys Glu Leu Ile Glu
10 15
Glu
<210> 182 <211> 19 <212 > PRT
<213> Macaca fascicularis <4 0 0 > 182
Thr Ala Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn
10 15
Gln Lys Ala
<210> 183 <211> 22 <212 > PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 183
Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn
10 15
Leu Thr Ala Gly Val Tyr 20
< 210 > 184 <211> 21
< 212 > PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 184
Ile Asn Leu Thr Ala Gly Val Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile
10 15
Asn Val Ser Gly Cys 20
<210> 185 <211> 21 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 185
Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg
10 15
Met Ile Asn Gly Phe 20
<210> 186 <211> 18 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 186
Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu Arg
10 15
Val Arg
<210 > 187 <211> 20 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <4 0 0 > 187
Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu
10 15
Val His Leu Lys 20 <210 > 188 <211> 19 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 188
Phe Val Lys Asp Leu Leu Val His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly
10 15
Gln Phe Asn
<210 > 189
< 211> 396 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Synthetically generated oligonucleotide <4 0 0 > 189
atgcggctgc ccgctcagct gctgggcctg ctgatgctgt gggtgcccgg ctcttccggc 60 gacgtggtga tgacccagtc ccctctgtct ctgcccgtga ccctgggcca gcccgcttct 120 atctcttgcc ggtcctccca gtccctggtg tactccgacg gcaacaccta cctgaactgg 180 ttccagcaga gacccggcca gtctcctcgg cggctgatct acaaggtgtc caaccgcttt 240 tccggcgtgc ccgatcggtt ctccggctcc ggcagcggca ccgatttcac cctgaagatc 300 agccgcgtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgct tccagggctc ccacatccct 360 tacacctttg gcggcggaac caaggtggag atcaag 3 96
<210> 190
<211> 132
<212 > PRT
<213> Seqüência artificial <22 0 >
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 190
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro 10 15 Gly Ser Ser
Val Thr Leu 35
Leu Val Tyr 50
Pro Gly Gln 65
Ser Gly Val
10
Thr Leu Lys
Cys Phe Gln 115
Val Glu Ile
130 <210 > 191 <211> 336 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 191
gatgttgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggaga gccagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgtg catagtaatg gaaacaccta cctggaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgct ttcaaagttc acatgttcct 300 ctcaccttcg gtcaggggac caagctggag atcaaa 336
<210 > 192 <211> 112 <212> PRT
Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro
25 30
Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser
40 45
Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg
55 60
Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe
70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110
Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 120 125
Lys <213> Seqüência artificial <220>
<223> Pepitídio sinteticamente gerado <400> 192
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 193
< 211 > 329 <212 > PRT
<213> Homo sapiens <220 >
<221> MUTAGEN <222> 116 . .
< 220 >
<221> MUTAGEN <222 > 119 <4 0 0 > 193
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 10 15
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 25 30
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
40 45
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 65 70 75 80
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275
Tyr Ser Lys
290 Phe Ser Cys 305
Lys Ser Leu
<210> 194 <211> 132 <212> PRT < 213 > Homo <400> 194 Met Ala Leu 1
Phe Ala Ser
Ile Glu Glu 35
Asn Gly Ser 50
Ala Ala Leu 65
Lys Thr Gln
Gly Gln Phe
Gln Phe Val 115
Gly Arg Phe
130 <210 > 195 <211> 113
280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
sapiens
Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly
10 15
Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu 25 30
Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys
40 45
Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys
55 60
Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu
70 75 80
Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala
85 90 95
Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110
Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 120 125
Asn <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Pro Gly Pro Val Pro 1 5
Leu Val Asn Ile Thr 20
Met Val Trp Ser Ile 35
Glu Ser Leu Ile Asn 50
Arg Met Leu Ser Gly 65
Ser Ser Leu His Val 85
Lys Asp Leu Leu Leu 100
Asn
Pro Ser Thr Ala Leu Arg 10
Gln Asn Gln Lys Ala Pro 25
Asn Leu Thr Ala Gly Met 40
Val Ser Gly Cys Ser Ala 55
Phe Cys Pro His Lys Val 70 75
Arg Asp Thr Lys Ile Glu 90
His Leu Lys Lys Leu Phe 105
Glu Leu Ile Glu Glu 15
Leu Cys Asn Gly Ser 30
Tyr Cys Ala Ala Leu 45
Ile Glu Lys Thr Gln 60
Ser Ala Gly Gln Phe 80
Val Ala Gln Phe Val 95
Arg Glu Gly Arg Phe 110
<210 > 196
<211> 10
<212 > PRT
<213> Mus musculus
<400> 196
Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr
10
<210 > 197
<211> 15
<212 > PRT
<213> Mus musculus
<4 0 0 > 197
Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Lys Ser Leu Met His 10 15
<210> 198
<211> 118
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 198
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr
25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser 115
< 210 > 199 <211> 111
< 212 > PRT
<213> Mus musculus <400> 199
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
25 30
Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 200
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser < 210 > 201 <211> 9 <212 > PRT <213> Mus musculus <4 0 0 > 201
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr 1 5
<210> 202 <211> 6
< 212 > PRT
<213> Mus musculus <400> 202
Ile Ser Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 203 <211> 16
< 212 > PRT <213> Mus musculus <400 > 203
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 10 15
<210> 204 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 204
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaaac ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt agctatgcca tgtcttgggt tcgtcagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtaacac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctatacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcacg acttgatggt 300 tactactttg gatttgctta ctggggccaa gggactctgg tcgctgtctc t 351
<210 > 205 <211> 354 <212 > DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> partially humanized antibody heavy chain <400> 205
gaggtcaagc tggtggagtc agggggaggc ttagtgcaac ctggagggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt agctatgcca tgtcttgggt tcgtcaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtaacac ctactatcca 180 gacagcgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaagaacag cctatacctg 240 caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcacg acttgatggt 300 tactactttg gatttgctta ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 206 <211> 354 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
60 120 <220>
<223> fully humanized antibody heavy chain <400> 206
gaggtccagc tggtggagtc agggggaggc ttagtgcaac ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt agctatgcca tgtcttgggt tcgtcaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtaacac ctactatcca 180
gacagcgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaagaacag cctatacctg 240
caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcacg acttgatggt 300
tactactttg gatttgctta ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 207
<211> 354 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> fully humanized antibody heavy chain <40 0 > 207
gaggtccagc tggtggagtc agggggaggc ttagtgaaac ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt agctatgcca tgtcttgggt tcgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagtg gtggtaacac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaagaacag cctatacctg 240 caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcacg acttgatggt 300 tactactttg gatttgctta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354
< 210 > 208 <211> 118 <212> PRT
<213> Mus musculus <4 0 0 > 208
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 209 <211> 118 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> partially humanized antibody heavy chain <4 0 0 > 209
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr
25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 210 <211> 118 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> fully humanized antibody heavy chain <400> 210
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr
25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 211 <211> 118 <212 > PRT
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<223> fully humanized antibody heavy chain <4 0 0 > 211 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr
25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Gly Tyr Tyr Phe Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 212 <211> 111 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> fully humanized antibody light chain <4 0 0 > 212
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
25 30
Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 213
<211> 111
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 213
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
25 30
Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 214 <211> 111 < 212 > PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> partially humanized antibody light chain <400> 214
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
25 30
Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 215 <211> 111 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> fully humanized antibody light chain <400> 215
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
25 30
Gly Lys Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110
<210> 216 <211> 107 <212> PRT
<213 > Homo sapiens <400> 216
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 217 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 217
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaaac ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt agctatgcca tgtcttgggt tcgtcagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtaacac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctatacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcacg acttgatggt 300 tactactttg gatttgctta ctggggccaa gggactctgg tcgctgtctc t 351 <210> 218 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 218
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtttaat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240 cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 219 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 219
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtttaat gcactggtac 120 cagcagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240 cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210 > 220 <211> 333 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <2 2 0 >
<223> partially humanized antibody light chain <4 0 0 > 220
gacatccagc tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtctgat gcactggtat 120 cagcagaaac cagggaaagc tcctaagctc ctgatctatc gtgcatccaa cctggaatct 180 ggcgtcccat caaggttcag tggcagtgga tctcgcacag atttcactct caccatcagc 240 agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac tactgtcagc aaagtaatga ggatccctgg 300 accttcggcg gagggaccaa ggtagagatc aaa 333
<210> 221 <211> 333 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> fully humanized antibody light chain <400> 221
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtctgat gcactggtat 120 cagcagaaac cagggaaagc tcctaagctc ctgatctatc gtgcatccaa cctggaatct 180 ggcgtcccat caaggttcag tggcagtgga tctggcacag atttcactct caccatcagc 240 agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac tactgtcagc aaagtaatga ggatccctgg 300 accttcggcg gagggaccaa ggtagagatc aaa 333
<210> 222 <211> 351 <212 > DNA <213> Mus musculus <400> 222
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaaac ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcatt agctatgcca tgtcttgggt tcgtcagact 120 ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtaacac ctactatcca 180 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctatacctg 240 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcacg acttgatggt 300 tactactttg gatttgctta ctggggccaa gggactctgg tcgctgtctc t 351
<210> 223 <211> 333
<212 > DNA
<213> Seqüência artificial <22 0 > <223> fully humanized antibody light Chain <400> 223
gacatcgtgc tcactcagtc tccagcttct ttggctgtgt ctccagggca gagggccacc 60
ataacctgca aagccagtga aagtgttgat aattatggca aaagtttaat gcactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccattaat 240
cctgtggagg ctaatgatac tgcaaactat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa ggtggaaata aaa 333 <210> 224
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 224
Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro 20 25 30
Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser He Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met 35 40 45
Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu 50 55 60
Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys He Pro Glu Asn Asn Gly 65 70 75 80
Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala 85 90 95
Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys 100 105 HO
Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn 115 120 125
Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser 130 135 140
Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala 145
Val Asn Ile Trp
Val Thr Tyr Leu 180
Ser Gly Ile Ser 195
Asn Thr Thr Trp 210 Asn Ile Cys
225
150
Ser Glu Asn Asp Pro 165
Glu Pro Ser Leu Arg 185
Tyr Arg Ala Arg Val 200
Ser Glu Trp Ser Pro 215
155
Ala Asp Phe Arg Ile 170
Ile Ala Ala Ser Thr 190
Arg Ala Trp Ala Gln 205
Ser Thr Lys Trp His 220
160 Tyr Asn 175
Leu Lys Cys Tyr Asn Ser

Claims (43)

1. Método de tratamento ou prevenção de uma desordem ou condição associada à IL-13 em um indivíduo, compreendendo administração ao indivíduo, como um tratamento de intervalo único, um antagonista de IL- v13 e/ou antagonista de IL-4 em uma quantidade eficaz para reduzir ou retar- dar o início ou recorrência de um ou mais sintomas da desordem ou condi- ção.
2. Método da reivindicação 1, em que o tratamento de intervalo único é uma dose única do antagonista de IL-4 e/ou do antagonista de IL-4.
3. Método da reivindicação 1, em que o tratamento de intervalo único consiste essencialmente de duas ou três doses do antagonista de IL- 13 e/ou do antagonista de IL-4 dentro de uma semana ou menos a partir da dose inicial.
4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a administração de um antagonista de IL-13 e/ou de um antagonista de IL-4 ocorre antes de qualquer manifestação detectável dos sintomas da desor- dem ou condição.
5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a administração do antagonista de IL-13 e/ou de um antagonista de IL-4 ocorre após uma manifestação parcial dos sintomas da desordem ou condição.
6. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o antagonista de IL-13 e/ou antagonista de IL-4 é administrado ao indivíduo antes da exposição a um agente que provoca ou exacerba a desordem ou condição associada à IL-13.
7. Método da reivindicação 6, em que o antagonista de IL-13 e/ou antagonista de IL-4 é administrado antes da exposição sazonal a um alergênio.
8. Método da reivindicação 4 ou 5, em que o antagonista de IL- 13 e/ou antagonista de IL-4 é administrado antes da repetição de um surto ou episódio da desordem ou condição associada a IL-13.
9. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o antagonista de IL-13 e/ou antagonista de IL-4 é administrado em qualquer momento entre 1 e 5 dias antes ou após exposição ao agente de provocação ou exacerbante.
10. Método da reivindicação 6 ou 9, em que o agente que provo- ca ou exacerba a desordem associada à IL-13 é selecionado a partir do gru- po composto de um alergênio, um poluente, um agente tóxico, uma infecção e estresse.
11. Método das reivindicações 1 a 10, em que os sintomas da desordem ou condição associada à IL-13 compreendem um ou mais de: ní- veis de IgE aumentados, aumento da liberação de histamina, aumento nos níveis de eotaxina ou um sintoma respiratório.
12. Método da reivindicação 11, em que o sintoma respiratório compreende um ou mais de: respiração com dificuldade, chiado, tosse, res- piração curta e/ou dificuldade de executar atividades diárias normais.
13. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o indivíduo é um adulto humano, um adolescente, ou uma criança que tem, ou em risco de ter, desordem ou condição associada à IL-13.
14. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a desordem ou condição associada à IL- 13 é uma desordem ou condição inflamatória, respiratória, alérgica ou autoimune.
15. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a desordem ou a condição associada à IL-13 são escolhidas a partir de uma ou mais de: desordens relacionadas à IgE, desordens atópicas, dermatite atópica, urticária, eczema, rinite alérgica, enterogastrite alérgica, asma, do- ença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e/ou condições envolvendo infla- mação das vias aéreas, eusinofilia, fibrose e produção excessiva de muco.
16. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a desordem ou a condição associada à IL-13 é escolhida a partir de uma ou mais de: condições autoimunes da pele, dermatite atópica, doença intestinal inflamatória (Dll), colite ulcerativa, doença de Crohn, cirrose, carcinoma he- patocelular, escleroderma, tumores, cânceres, leucemia, glioblastoma, Iinfo- ma, infecções virais e/ou fibrose do fígado.
17. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o tratamento de intervalo único compreende uma dose do antagonista de IL- 13 em uma quantidade de aproximadamente 1 a 3 mg/kg.
18. Método da reivindicação 17, em que o antagonista de IL-13 é administrado por inalação, por injeção ou oralmente.
19. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o antagonista de IL-13 e/ou o antagonista de IL-4 inibe ou reduz uma ou mais atividades biológicas de IL-13 ou IL-4, ou um receptor de IL-13 ou um receptor de IL-4.
20. Método da reivindicação 19, em que as atividades biológicas são escolhidas a partir de uma ou mais de: indução da expressão de CD23, produção de IgE por células B humanas, fosforilação de um fator de transcri- ção, ativação da proteína STAT6, eusinofilia induzida pelo antígeno in vivo; broncoconstrição induzida pelo antígeno in vivo e/ou hiperreatividade das vias aéreas induzida pela droga in vivo.
21. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que o antagonista de IL-13 e/ou antagonista de IL4 é uma molécula de anticorpo que se liga a IL-13, IL-13R, IL-4 ou IL-4Ra; uma forma solúvel do IL-13R ou IL-4Ra; uma muteína de IL-13 ou IL-4 que se liga ao receptor corresponden- te, mas não ativa substancialmente o receptor; uma pequena molécula inibi- dora de STAT6; um inibidor de peptídeo; ou um inibidor da expressão de ácido nucleico.
22. Método da reivindicação 21, em que o IL-13R é um IL-13Ra2 ou um IL-13Ra1.
23. Método da reivindicação 21, em que o antagonista de IL-13 reduz a formação de um complexo escolhido a partir de IL-13/IL-13Ra1, IL- 13/IL-4Ra, IL-13, IL-13/IL-13Ra1/IL-4Ra; ou IL-13/IL13Ra2.
24. Método da reivindicação 21, em que o antagonista de IL-4 reduz a formação de um complexo escolhido a partir de IL-4/IL-4Ra, IL-4/γ comum, ou IL-4/IL-4Ra/Y comum.
25. Método da reivindicação 21, em que a molécula de anticorpo é um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a IL-13 ou IL-13R, ou IL-4 ou IL-4R.
26. Método da reivindicação 21, em que a molécula de anticorpo se liga a IL-13 com um Kd de menos de 1CT7 M, e tem uma ou mais das se- guintes propriedades: (a) o domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina com- preende uma CDR3 de cadeia pesada que se diferencia por menos de 3 substituições de aminoácido de uma CDR3 de cadeia pesada do anticorpo monoclonal MJ2-7 (SEQ ID NO:17), mAb 13.2 (SEQ ID NO:196) ou C65 (SEQ ID NO: 123); (b) o domínio variável da cadeia leve da imunoglobulina compre- ende uma CDR1 da cadeia leve que se diferencia por menos de 3 substitui- ções de aminoácido de uma CDR de cadeia leve correspondente do anticor- po monoclonal MJ2-7 (SEQ ID NO: 18), mAb 13.2 (SEQ ID NO: 197) ou C65 (SEQ ID NO: 118); (c) o domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina com- preende uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência nu- cleotídica que hibridiza sob condições de alta estringência com o comple- mento da seqüência nucleotídica que codifica um domínio variável da cadeia pesada de V2.1 (SEQ ID NO:71), V2.3 (SEQ ID NO:73), V2.4 (SEQ ID NO:74), V2.5 (SEQ ID NO:75), V2.6 (SEQ ID NO:76), V2.7 (SEQ ID NO:77), V2.11 (SEQ ID N0:80), ch13.2 (SEQ ID N0:204), hl3.2vl (SEQ ID N0:205), hl3.2v2 (SEQ ID N0:206) ou hl3.2v3 (SEQ ID N0:207); (d) o domínio variável da cadeia leve da imunoglobulina compre- ende uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüência nucleo- tídica que hibridiza sob condições de alta estringência com o complemento da seqüência nucleotídica que codifica um domínio variável de cadeia leve de V2.11 (SEQ ID NO:36) ou hl3.2v2 (SEQ ID NO:212); (e) o domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina com- preende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada de V2.1 (SEQ ID NO:71), V2.3 (SEQ ID NO:73), V2.4 (SEQ ID NO:74), V2.5 (SEQ ID NO:75), V2.6 (SEQ ID NO:76), V2.7 (SEQ ID NO:77), V2.11 (SEQ ID N0:80); ch13.2 (SEQ ID N0.208), hl3.2vl (SEQ ID N0:209), h13.2v2 (SEQ ID N0:210) ou h13.2v3 (SEQ ID NO:211); (f) a seqüência do domínio variável da cadeia leve da imunoglo- bulina é pelo menos 90% idêntica a um domínio variável de cadeia leve de V2.11 (SEQ ID NO:36) ou hl3.2v2 (SEQ ID NO:212); (g) a molécula de anticorpo compete com mAb MJ2-7, mAb13.2 ou C65 para se ligar à IL-13 humana; (h) a molécula de anticorpo contata com um ou mais resíduos de aminoácido de IL-13 selecionados a partir do grupo composto dos resíduos 116, 117, 118, 122, 123, 124, 125, 126, 127, e 128 de SEQ ID NO:24 ou SEQ ID NO:178, (i) a molécula de anticorpo contata com um ou mais resíduos de IL-13 selecionados a partir do grupo composto dos resíduos 81 a 93 e 114 a 132 da IL-13 humana (SEQ ID NO: 194), ou selecionado a partir do grupo composto de: Glutamato na posição 68 [49], Asparagina na posição 72 [53], Glicina na posição 88 [69], Prolina na posição 91 [72], Histidina na posição 92 [73], Lisina na posição 93 [74], e Arginina na posição 105 [86] de SEQ ID NO:194 [posição na seqüência madura; SEQ ID NO:195]; (j) a seqüência do domínio variável da cadeia pesada tem a mesma estrutura canôníca que mAb MJ2-7, mAb 13.2 ou C65 nas alças hi- pervariáveis 1, 2 e/ou 3; (k) a seqüência do domínio variável da cadeia leve tem a mesma estrutura canônica que mAb MJ2-7, mAb 13.2 ou C65 nas alças hipervariá- veis 1, 2 e/ou 3; e (I) a seqüência do domínio variável da cadeia pesada e/ou a se- quência do domínio variável da cadeia leve têm regiões conservadas FR1, FR2, e FR3 dos segmentos de VH codificados por genes da linhagem ger- minativa DP-54 e DPK-9 respectivamente ou uma seqüência pelo menos 95% idêntica aos segmentos de VH codificados por genes da linhagem ger- minativa DP-54 e DPK-9; e (m) confere um efeito protetor pós-injeção contra exposição ao antígeno de Ascaris em um modelo de ovelha pelo menos 6 semanas após a injeção.
27. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que o antagonista de IL-13 e o antagonista de IL-4 são administrados em combi- nação simultaneamente ou seqüencialmente.
28. Método da reivindicação 27, em que o antagonista de IL-13 e o antagonista de IL-4 são coformulados.
29. Método da reivindicação 27, em que o antagonista de IL-13 e o antagonista de IL-4 são administrados em combinação com outros agentes terapêuticos escolhidos a partir de um ou mais de: esteróides inalados, ago- nistas beta, antagonistas de Ieucotrienos ou receptores de leucotrieno, inibi- dores de IgE1 inibidores de PDE4, xantinas, drogas anticolinérgicas, inibido- res de IL-5, inibidores de eotaxina/CCR3 ou anti-histamínicos.
30. Composição ou uma formulação de dose compreendendo um antagonista de IL-13 e um antagonista de IL-4, em que o antagonista de IL4 é selecionado a partir do grupo composto de uma molécula de anticorpo que se liga a IL-4 ou IL-4Ra; uma forma solúvel de IL-4Ra; uma muteína de IL-4; uma pequena molécula inibidora de STAT6; um inibidor de peptídeo; ou um inibidor da expressão de ácido nucleico, e o antagonista de IL-13 é uma molécula de anticorpo que compete com mAb MJ2-7, mAb13.2 ou C65 para ligação à IL-13 humana, ou um fragmento solúvel de um IL-13Ra2.
31. Método para detectar a presença de IL-13 em uma amostra in vitro, compreendendo fornecimento de uma primeira molécula de anticorpo anti-IL-13 imobilizada em um suporte; fornecimento de uma amostra obtida a partir de um indivíduo após exposição do indivíduo a uma segunda molécula de anticorpo anti-IL- 13; contatar a amostra com o primeiro anticorpo anti-IL-13, sob con- dições que permitam a ligação da IL-13 à primeira molécula de anticorpo anti-IL-13 imobilizado a ocorrer; e detectar IL-13 na amostra em relação a um valor de referência, em que o primeiro e segundo anticorpo anti-IL13 se ligam a epítopos diferen- tes em IL-13.
32. Método da reivindicação 31, em que a primeira molécula de anticorpo anti-IL-13 se liga à IL-13 substancialmente livre, e não se liga substancialmente à IL-13 ligada à segunda molécula de anticorpo anti-IL-13.
33. Método da reivindicação 31, em que a primeira molécula de anticorpo anti-IL-13 se liga à IL-13 substancialmente livre e IL-13 ligada a uma segunda molécula de anticorpo anti-IL-13.
34. Método da reivindicação 31, em que a detecção da presença de IL-13 ligada à primeira molécula de anticorpo anti-IL-13 imobilizado é rea- lizada usando uma terceira molécula de anticorpo anti-IL-13 marcada, ou agente marcado que reconhece o complexo de IL-13 na primeira ou segunda molécula de anticorpo.
35. Método da reivindicação 31, em que uma modificação no nível de IL-13 ligada à primeira molécula de anticorpo anti-IL-13 na amostra em relação a uma amostra controle é indicativa da presença da IL-13 na amostra.
36. Método da reivindicação 35, em que a modificação é um aumento no nível de IL-13 na amostra em relação a um nível pré- determinado, em que o dito aumento é indicativo da inflamação aumentada no pulmão.
37. Método da reivindicação 31, em que a amostra é uma amos- tra biológica selecionada a partir do grupo composto de uma amostra de so- ro, uma amostra de plasma, uma amostra de tecido e uma biópsia.
38. Método para avaliação da eficácia de um agente de ligação antagonístico à IL-13, na redução de inflamação pulmonar em um indivíduo, compreendendo: detecção dos níveis de IL-13 não ligada e/ou ligada a um agente de ligação antagonístico à IL-13 em uma amostra de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 31 a 37, em que uma modificação nos níveis de IL-13 não ligada e/ou ligada em relação a uma amostra de referên- cia é indicativa da eficácia do agente de ligação antagonístico à IL-13.
39. Método da reivindicação 38, compreendendo avaliação adi- cional de uma modificação em um ou mais níveis de eotaxina em uma amos- tra, liberação de histamina por basófilos, títulos de IgE1 ou avaliação das modificações nos sintomas do indivíduo.
40. Método da reivindicação 38 ou 39, em que uma redução dos níveis de IL-13 não ligada e/ou ligada a um agente de ligação antagonístico à IL-13, ou um aumento no nível de IL-13 ligada ao agente de ligação anta- gonístico é indicativo que o agente de ligação antagonístico à IL-13 está re- duzindo efetivamente a inflamação pulmonar no indivíduo.
41. Conjunto compreendendo um antagonista de IL-13 e/ou an- tagonista de IL-4 para uso em qualquer uma das reivindicações 1 a 29 com instruções de uso como em um tratamento de intervalo único em tratamento ou prevenção de uma desordem ou condição associada à IL-13.
42. Composição para uso em um método de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 29.
43. Uso de uma composição que compreende um antagonista de IL-13 e/ou um antagonista de IL-4 na produção de um medicamento para tratamento ou prevenção como um tratamento de intervalo único de uma desordem ou condição associada à IL-13.
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