BRPI0720529A2

BRPI0720529A2 - Processos para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose, e para produzir um produto de fermentação do material, e, usos de um composto, e, de uma amidase, e de uma anidrase.

Info

Publication number: BRPI0720529A2
Application number: BRPI0720529-5A
Authority: BR
Inventors: Jason W Holmes; Randy Deinhammer; Chee-Leong Soong
Original assignee: Novozymes North America Inc
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2014-02-04
Also published as: WO2008076738A2; US20080171370A1; EP2094907A2; EP2094907A4; WO2008076738A3

Description

“PROCESSOS PARA DESTOXIFICAR MATERIAL PRÉ-TRATADO CONTENDO LIGNOCELULOSE, E PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO DO MATERIAL, E, USOS DE UM COMPOSTO, E DE UMA AMIDASE, E DE UMA ANIDRASE”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. 119 dos pedidos provisórios U.S. n— 60/870.420 e 60/890.652, depositados em 18 de dezembro de 2006 e 20 de fevereiro de 2007, respectivamente, cujos teores são completamente aqui incorporados como referência.

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito a processo para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose. A invenção também diz respeito a processos de produzir um produto de fermentação de material contendo lignocelulose com o uso de um organismo de fermentação, incluindo um processo de destoxificação da invenção.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Por causa das reservas limitadas de combustíveis fósseis e das preocupações acerca das emissões de gases das estufas, existe um foco crescente no uso de fontes de energia renováveis. A produção dos produtos de fermentação do material contendo lignocelulose é conhecida na técnica e convencionalmente inclui o pré-tratamento, a hidrólise e a fermentação do material contendo lignocelulose. O pré-tratamento resulta na liberação, por exemplo, de fenólicos e furanos, do material contendo lignocelulose que pode irreversivelmente ligar-se às enzimas acrescentadas durante a hidrólise e a fermentação. Estes compostos podem também ser tóxicos ao metabolismo do organismo de fermentação e inibir o desempenho do organismo de fermentação.

A destoxificação pela extração do vapor foi sugerida, mas ela é uma etapa do processo adicional incômoda e dispendiosa. Foi sugerida a lavagem do material pré-tratado contendo a lignocelulose antes da hidrólise. Isto requer enormes quantidades de água, que necessitam ser removidas novamente, e isto é também dispendioso.

Consequentemente, existe a necessidade quanto ao fornecimento de processos para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose, adequados para os processos de produção do produto de fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a processos para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose. A invenção também diz respeito a processos de produzir um produto de fermentação do material contendo lignocelulose, com o uso de um organismo de fermentação, incluindo um processo de destoxificação da invenção.

No primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um processo para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose, em que o material pré-tratado contendo lignocelulose é submetido a um ou mais compostos selecionados do grupo de:

- composto capaz de se ligar a produtos pré-tratados de degradação da lignocelulose, ou

- composto capaz de se ligar a ácido acético; ou

- amidase; ou

- anidrase; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Em um segundo aspecto, a invenção diz respeito a processos

de produzir um produto de fermentação do material contendo lignocelulose, compreendendo as etapas de:

(a) pré-tratar o material contendo lignocelulose;

(b) destoxificar;

(c) hidrolisar; e

(d) fermentar com o uso de um organismo de fermentação, em que a destoxificação é realizada de acordo com um processo de destoxificação da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra as respostas de dose de amidase e ácido gálico em relação ao controle em 24 horas.

A Figura 2 mostra a concentração do ácido acético com o uso da amidase e do ácido gálico em relação ao controle.

A Figura 3 mostra as concentrações de etanol com quantidades variáveis de amidase.

A Figura 4 mostra os resultados da amidase mostrando o

elevação na produção do etanol após 24 horas de fermentação.

A Figura 5 mostra os resultados da anidrase carbônica apresentando elevação na produção do etanol após 12 horas de fermentação.

A Figura 6 mostra o efeito de anidrase carbônica sobre a produção do etanol após 24 horas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

No primeiro aspecto, a invenção diz respeito a processos de destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose adequado para produzir um produto de fermentação.

MATERIAL CONTENDO LIGNOCELULOSE

Os materiais de lignocelulose consistem principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. A estrutura da lignocelulose não é diretamente acessível à hidrólise enzimática. Portanto, a lignocelulose tem de ser pré-tratada, por exemplo por hidrólise de ácido sob condições adequadas 25 de pressão e temperatura, de modo a romper o selo da lignina e destruir a estrutura cristalina da celulose. Isto causa a solubilização das frações de hemicelulose e de celulose. A fração de celulose pode então ser hidrolisada enzimaticamente, por exemplo pelas enzimas celulolíticas, para transformar os polímero de carboidrato em açúcares de fermentação que podem ser fermentados em um produto de fermentação desejado, tal como o etanol. Opcionalmente o produto de fermentação pode ser recuperado, por exemplo, por destilação.

Qualquer material contendo lignocelulose é considerado de 5 acordo com a presente invenção. O material contendo lignocelulose pode ser qualquer material que contenha lignocelulose. Em uma forma de realização preferida, o material contendo lignocelulose contém pelo menos 30 % em peso, preferivelmente pelo menos 50 % em peso, mais preferível pelo menos 70 % em peso, ainda mais preferível pelo menos 90 % em peso, de 10 lignocelulose. Deve ser entendido que o material contendo lignocelulose pode também compreender outros constituintes tais como o material celulósico, incluindo a celulose e a hemicelulose, e pode também compreender outros constituintes tais como o material proteináceo, amido, açúcares, tais como açúcares fermentáveis e/ou açúcares não fermentáveis.

O material contendo lignocelulose é geralmente encontrado,

por exemplo, nos troncos, nas folhas, nas cascas, nas cascas secas, e sabugos de plantas, ou folhas, nos ramos e na madeira das árvores. O material contendo lignocelulose pode também ser, porém sem limitar, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, lixo sólido municipal, papel 20 refugado, e resíduos de moagem de polpa e papel. Entende-se aqui que o material que contém lignocelulose pode estar na forma de material da parede de células das plantas contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz misturada.

Em uma forma de realização preferida, o material contendo lignocelulose é constituído de fibra de milho, palha de arroz, madeira de pinheiro, lascas de madeira, álamo, bagaço de cana de açúcar, papel e resíduos do processamento de polpas.

Outros exemplos incluem a palha do milho, madeira de lei, tal como álamo e bétula, madeira macia, palha de cereais, tais como a palha do trigo, switchgrass, lixo sólido municipal (MSW), lixo orgânico industrial, papéis de escritório, ou misturas destes.

Em uma forma de realização preferida, o material contendo celulose é a palha de milho. Em outra forma de realização preferida, o material é fibra de milho.

PROCESSO PARA DESTOXIFICAR MATERIAL PRÉ-TRATADO QUE CONTÉM LIGNOCELULOSE

Quando o material contendo lignocelulose é pré-tratado, são produzidos produtos de degradação que são tóxicos em relação às enzimas e 10 aos organismos de fermentação. Estes compostos tóxicos reduzem severamente tanto os índices de hidrólise quanto os de fermentação. Os métodos para pré-tratar o material contendo lignocelulose são bem conhecidos na técnica. Exemplos dos métodos considerados são descritos abaixo na seção “Pré-tratamento”.

Observou-se que compostos selecionados podem ser usados

para destoxificar o material pré-tratado contendo lignocelulose. Estes compostos de destoxificação são capazes de se ligarem aos produtos de degradação pré-tratados de lignocelulose e/ou ao ácido acético e podem ser usados para melhorar significativamente o desempenho das enzimas, por 20 exemplo durante a etapa de hidrólise. Foi igualmente observado que o tempo de fermentação pode ser reduzido como um resultado do desempenho melhorado do organismo fermentativo durante a fermentação. Em outras palavras, a destoxificação realizada de acordo com a invenção pode resultar em um tempo de processamento mais curto do “material contendo 25 lignocelulose para o produto de fermentação”.

Além disso, os resultados correspondentes podem também ser obtidos pela adição de amidase e/ou anidrase.

Exemplos específicos dos compostos de destoxificação podem ser encontrados abaixo na seção de “Compostos de destoxificação”. Em uma forma de realização específica e preferida, o composto de destoxificação é o ácido gálico. O ácido gálico foi observado ser um composto de destoxificação adequado para ligar os fenólicos e o ácido acético. Uma teoria plausível é que o ácido gálico seja um comonômero polimérico natural; isto é, o núcleo da 5 estrutura galotanina e, portanto, é um meio natural para polimerizar fenólicos e, também, toxinas tais como o ácido acético em uma esterificação de Fischer, por exemplo com um catalisador de ácido sulfurico.

A hidrólise de ácido é um método de pré-tratamento comumente usado e, portanto, estes compostos de destoxificação podem ser adicionados durante a hidrólise de ácido de modo que eles estejam presentes quando o pH seja elevado para a fermentação.

Alternativamente, o(s) composto(s), por exemplo o ácido gálico, podem também ser adicionados em uma etapa separada em que o pH seja reduzido a um pH adequado para o(s) composto(s) de destoxificação. Depois disso, o pH pode ser ajustado a um pH adequado para fermentação, por exemplo a um pH abaixo de 7.

No primeiro aspecto, a invenção diz respeito a processos de destoxificação de material pré-tratado contendo lignocelulose, em que o material pré-tratado contendo lignocelulose é submetido a um ou mais compostos selecionados do grupo de:

- composto capaz de se ligar a ácido acético; ou

- amidase; ou

- anidrase; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

Em uma forma de realização, o composto de destoxificação contém grupos de hidroxila de radicalização e um grupo de ácido carboxílico esterificável. Em uma forma de realização preferida, o composto é o ácido gálico. Em uma forma de realização, os produtos pré-tratados de degradação da lignocelulose são os produtos de degradação da lignina e/ou os produtos de degradação da hemicelulose. Os produtos pré-tratados de degradação da lignina podem ser fenólicos por natureza.

5 Em outra forma de realização, o(s) produto(s) de degradação

da hemicelulose é(são) furanos de açúcares (tais como as hexoses e/ou as pentoses), incluindo a xilose, manose, galactose, ramanose e arabinose. Exemplos de hemiceluloses incluem o xilano, galactoglicomanano, arabinogalactano, arabinoglicuronxilano, glicuronoxilano e derivados e combinações destes.

Exemplos de compostos inibidores, isto é, produtos pré- tratados de degradação da lignocelulose, incluem o álcool benzílico 4-OH, benzaldeído 4-OH, ácido benzóico 4-OH, trimetil benzaldeído, ácido 2- furóico, ácido cumárico, ácido ferúlico, fenol, guaiacol, veratrol, pirogalolol, 15 éter monometílico de pirogalol, álcool vanilílico, vanilina, isovanilina, ácido vanílico, ácido isovanílico, ácido homovanílico, álcool veratrílico, veratraldeído, ácido verátrico, ácido gálico 2-O-metílico, álcool siringílico, siringaldeído, ácido siríngico, ácido gálico trimetílico, homocatecol, vanilina etílica, crosol, anisol p-metílico, anisaldeído, ácido anísico, ou combinações 20 destes.

O processo de destoxificação da invenção pode, preferivelmente, ser realizado em um pH abaixo de 7, preferivelmente abaixo de 6. No caso, por exemplo, do ácido gálico, um pH adequado deve ser um pH abaixo de 7, preferivelmente pH abaixo de 5, especialmente pH entre 1 e 25 3, tal como pH ao redor de 2. Em uma forma de realização preferida, a temperatura durante a destoxificação é uma temperatura adequada para o(s) composto(s) de destoxificação. Tal temperatura adequada pode ser facilmente determinada por uma pessoa habilitada na técnica.

Em outra forma de realização, o composto de destoxificação é uma amidase e/ou uma anidrase.

AMIDASES

A amidase pode ser de qualquer origem, especialmente de origem microbiana, especialmente de origem bacteriana ou fungica.

Nas formas de realização preferidas, a amidase é selecionada

do grupo consistindo de: Aminopeptidase B (EC 3.4.11.6), Citosol alanila aminopeptidase (EC 3.4.11.14), Dipeptidil-peptidase II (EC 3.4.14.2), Dipeptidil-peptidase III (EC 3.4.14.4), Dipeptidil-peptidase IV (EC 3.4.14.5), Peptidil-glicinamidase (EC 3.4.19.2), Ômega-amidase (EC 3.5.1.3), Amidase 10 (EC 3.5.1.4), Arilformamidase (EC 3.5.1.9), Penicilina amidase (EC 3.5.1.11), Aril-acilamidase (EC 3.5.1.13), Aminoacilase (EC 3.5.1.14), Nicotinamidase (EC 3.5.1.19), 5-aminopentanamidase (EC 3.5.1.30), Alquilamidase (EC 3.5.1.39), Acilagmatina amidase (EC 3.5.1.40), Formamidase (EC 3.5.1.49), Pentanamidase (EC 3.5.1.50), N- 15 carbamoilputrescina amidase (EC 3.5.1.53), Ν,Ν-dimetilformamidase (EC 3.5.1.56), Triptofanamidase (EC 3.5.1.57), N-carbamoilsarcosina amidase (EC 3.5.1.59), 4-metilenoglutaminase (EC 3.5.1.67), D-benzoilarginina-4- nitroanilida amidase (EC 3.5.1.72), Camitinamidase (EC 3.5.1.73), Arilalquil acilamidase (EC 3.5.1.76), Glutationilespermidina amidase (EC 3.5.1.78), 20 Ftalil amidase (EC 3.5.1.79), Mandelamida amidase (EC 3.5.1.86), L-Iisina- lactamase (EC 3.5.2.11), Fosfoamidase (EC 3.9.1.1), N-sulfoglicosamina sulfo-hidrolase (EC 3.10.1.1), Ciclamato sulfo-hidrolase (EC 3.10.1.2).

Em uma forma de realização preferida, a amidase é uma amidase (EC 3.5.1.4).

Em uma forma de realização preferida, a amidase é derivada

de uma cepa de Pseudomonas, preferivelmente uma cepa de Pseudomonas aeruginosa.

As amidases podem ser dosadas na faixa entre 0,01 a 100 unidades/g de substrato, preferivelmente 0,1 a 10 unidades/g de substrato, especialmente I a 5 unidades/g de substrato, tal como ao redor de 2 unidades/g de substrato ou 0,01 a 1.000 unidades/g de TS (Sólidos Totais), preferivelmente 0,1 a 500 unidades/g de TS, especialmente 1 a 100 unidades/g de TS ou de 0,01 a 100 unidades/ml, preferivelmente 0,1 a 50 unidades/ml, especialmente 0,2 a 40 unidades/ml.

Uma unidade converterá 1,0 mol de acetamida e hidroxilamina em acetoidroxamato e amônia por minuto em pH 7,2 em 37°C.

Amidases comercialmente disponíveis incluem aquela da Psudomonas aeruginosa (Sigma Chemical Co., catálogo A6691).

ANIDRASES

A anidrase pode ser de qualquer origem, incluindo de origem de mamífero, de planta e microbiana, tal como de origem bacteriana e fungica. Em uma forma de realização preferida, a anidrase é uma anidrase carbônica classificada como EC 4.2.1.1.

As anidrases carbônicas (também denominadas carbonato

desidratases) catalisam a interconversão entre o dióxido de carbono e o bicarbonato [CO2 + H2O HCO3" + H+]. Um exemplo de uma anidrase carbônica (CA) inclui aquela descoberta no sangue bovino (Meldrum e Roughton, 1933, J. Physiol. 80: 113-142). As anidrases são categorizadas em 20 três classes distintas chamadas as classes alfa, beta e gama, e potencialmente uma quarta classe, a classe delta (Bactéria, Archaea, Eukarya; Tripp et al.,

2001, J. Biol. Chem. 276: 48615-48618). Para alfa-Cas mais do que 11 isozimas foram identificadas em mamíferos. As anidrases alfa-carbônicas são abundantes em todos os tecidos de mamíferos em que eles facilitam a 25 remoção do CO2. Os beta-Cas são ubíquos nas algas e nas plantas em que eles incluem a absorção do CO2 e a fixação para a fotossíntese. As gama-Cas incluem uma da cepa Archaeon Methanosareina thermophila TM-I (Alber e Ferry, 1994, Proc. Natl. Aead. Sei. USA 91: 6909-6913) e aquelas apresentadas por Parisi et al., 2004, Plant Mol. Biol. 55: 193-207. Nos procariotas, os genes codificando todas as três classes de CA foram identificados, com as classes beta e gama predominando. Muitos procariotas contêm os genes da anidrase carbônica de mais do que uma classe, ou vários genes da mesma classe (para exame, ver Smith e Ferry, 2000, FEMS 5 Microbiol. Rev. 24: 335-366; Tripp et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 48615- 48618).

As anidrases carbônicas de mamíferos, de plantas e procarióticas (Cas de classe alfa e beta) geralmente funcionam nas temperaturas fisiológicas (37°C) ou em temperaturas mais baixas.

Em uma forma de realização preferida, a anidrase carbônica é

uma de duas anidrases carbônica estáveis no calor, a saber, a CA de classe beta (Cab) da Methanobacterium thermoautotrophieum AH (Smith e Ferry, 1999, J. Baeteriol. 181: 6247-6253) ou a anidrase carbônica da classe gama (Cam) da Methanosarcina thermophila TM-I (Alber e Ferry, 1994, Proc. 15 Natl. Aead. Sei. USA 91: 6909-6913; Alber e Ferry, 1996, J. Baeteriol. 178: 3270-3274).

Outros exemplos das anidrases carbônicas incluem as anidrases carbônicas estáveis ao calor apresentadas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID 20 NO: 12 ou do Bacillus elausii KSM-Kl6 (NCBI acesso n° Q5WD44 ou SEQ ID NO: 14) ou do Bacillus halodurans (NCBI acesso n° Q9KFW1 ou SEQ ID NO: 16 no pedido U.S. 60/887.386 (da Novozymes, que são incorporados como referência). Em uma forma de realização, a anidrase carbônica é derivada de uma cepa de Aspergillus ficuum.

Em outra forma de realização, a anidrase carbônica é derivada

de Baeillus sp. P203 depositado sob o acesso n° DSM 19153. A anidrase carbônica do Bacillus sp P203 é descrita e referida na SEQ ID NO: 4 e nos Exemplos 8 a 10 da WO 2007/019859 (Novozymes A/S), que é aqui incorporada como referência. A anidrase ou a anidrase carbônica podem ser dosadas na faixa entre 0,01 a 1.000 quilounidades/ml, preferivelmente 0,1 a 500 quilounidades/ml, especialmente 0,2 a 400 quilounidades/ml ou 0,01 a 1.000 quilounidades/g de TS (Sólidos Totais), preferivelmente de 0,1 a 500 quilounidades/g de TS, especialmente 0,2 a 400 quilounidades/g de TS.

Anidrases comercialmente disponíveis incluem uma anidrase carbônica de eritrócitos bovinos (Sigma Chemical Co., catálogo n° A3934). PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO DE MATERIAL CONTENDO LIGNOCELULOSE

No segundo aspecto, a invenção diz respeito a processos de produzir um produto de fermentação do material contendo lignocelulose.

Mais precisamente, a invenção diz respeito a processos de produção de um produto de fermentação do material contendo lignocelulose, compreendendo as etapas de:

(a) pré-tratar material contendo lignocelulose;

(b) destoxificar;

(c) hidrolisar; e

De acordo com a invenção, um ou mais compostos de destoxificação é(são) adicionado(s) ao material pré-tratado de lignocelulose na etapa (b). A etapa (b) de destoxificação e a etapa (c) de hidrólise podem ser realizadas simultânea ou seqüencialmente.

Em conformidade com a invenção, a etapa (c) de hidrólise e a etapa (d) de fermentação podem ser realizadas seqüencial ou simultaneamente. Portanto, o material pré-tratado contendo lignocelulose pode ser hidrolisado antes da fermentação ou executado como hidrólise e fermentação simultâneas (SFIF ou SHHF). Em uma outra forma de realização, as etapas (c) e (d) são realizadas como hidrólise e fermentação híbridas (HHF).

Hidrólise e fermentação simultâneas (SHF) em geral significa que a hidrólise e a fermentação são combinadas e realizadas em condições (por exemplo, temperatura e/ou pH) adequadas para o organismo de fermentação em questão.

A hidrólise e fermentação híbridas (HHF) iniciam com uma etapa separada de hidrólise e terminam com uma etapa de hidrólise e fermentação simultâneas (SHF). A etapa de hidrólise separada é uma etapa de sacarificação de celulose enzimática tipicamente realizada em condições (por exemplo, em temperatura mais elevada) adequadas, preferivelmente ótimas, para a(s) enzima(s) de hidrolisação em questão. A etapa subsequente de hidrólise e de fermentação simultâneas (SHF) é tipicamente realizada em condições adequadas para o organismo de fermentação (frequentemente em temperatura mais baixa do que na etapa de hidrólise separada).

Se o material pré-tratado contendo celulose for hidrolisado enzimaticamente, é vantajoso proceder à destoxificação antes e/ou simultaneamente com a hidrólise. Entretanto, se a hidrólise for realizada com o uso de um ou mais ácidos, isto é, a hidrólise ácida, a destoxificação será preferivelmente realizada após e/ou simultaneamente com a hidrólise ácida.

Em outra forma de realização, a etapa (b) de destoxificação pode ser realizada separadamente da etapa (c) de hidrólise e da etapa (d) de fermentação, as quais podem ser realizadas simultaneamente. Em uma outra forma de realização, todas as etapas (b), (c) e (d) são realizadas simultânea ou seqüencialmente.

COMPOSTOS DE DESTOXIFICAÇÃO

De acordo com a invenção, os compostos de destoxificação podem ser compostos selecionados do grupo de compostos capazes de se ligarem a produtos pré-tratados de degradação da lignocelulose, ou compostos capazes de se ligarem a ácido acético, ou amidase, e/ou anidrase. Os compostos podem ser usados isoladamente ou em combinação de dois ou mais deles.

Exemplos de amidases e anidrases podem ser encontrados acima nas seções “Amidases” e “Anidrases”.

Exemplos de compostos de destoxificação incluem o p-hidróxi benzaldeído, ácido p-hidróxi benzóico, ácido p-cumárico, anisaldeído, ácido anísico, catecol, ácido salicílico, ácido m-hidróxi benzóico, protocatecualdeído, ácido protocatechuico, ácido isovanílico, vanilina, álcool vanílico, ácido vanílico, álcool coniferílico, ácido ferrúlico, guaiacil glicerol, veratraldeído, ácido verátrico, ácido gentísico, siringaldeído, ácido siríngico e ácido gálico.

Deve ser entendido que o(s) composto(s) de destoxificação devem preferivelmente estar presentes junto com um catalisador para ligar e/ou polimerizar o(s) composto(s) tóxico(s). O catalisador deve de forma ideal ser o ácido sulfurico, mas pode ser também um ácido de Lewis. O pH deve ser levado a um nível de pH que resulte em um ambiente que seja adequado para que uma esterificação de Fischer ocorra. Uma pessoa habilitada na técnica deve ser capaz de determinar catalisadores e condições adequadas, por exemplo as condições de pH, que devam ser diferentes para diferentes substratos. Por exemplo, para a palha de milho, um pH entre 1 e 3, preferível ao redor de 2, deve ser adequado.

O que venha a ser um efeito de dose/concentração de um composto de destoxificação depende não apenas dos compostos em questão, mas também das condições do processo e do catalisador. Deve ser observado que os compostos, tais como o ácido gálico, que tenham um efeito inibidor quando presente no líquido proveniente do pré-tratamento, podem, quando usados em uma dose/concentração eficaz e submetidos a um catalisador adequado sob condições adequadas, funcionar como um composto de destoxificação. Uma pessoa habilitada na técnica pode facilmente determinar o que vem a ser uma dose/concentração eficaz de um composto de destoxificação.

Em uma forma de realização preferida, o composto de destoxificação usado é o ácido gálico.

O(s) composto(s) de destoxificação, preferivelmente o ácido gálico, pode(m) ser adicionado(s) a um material contendo lignocelulose ou lavado e/ou não lavado, antes, durante e/ou após o pré-tratamento na etapa (a). Em uma forma de realização preferida, o material pré-tratado contendo lignocelulose é não lavado.

O ácido gálico tem três grupos de hidroxila para formar ésteres acetílicos que, por sua vez, podem absorver o efeito inibidor do ácido acético. O ácido gálico não tem nenhuma participação na real fermentação.

Além disso, o grupo de ácido carboxílico do ácido gálico pode reagir com os compostos fenólicos da lignina e/ou de seus produtos de degradação.

Em geral, a esterificação pode ser mantida quanto o pH fica abaixo do neutro (ao redor de pH 7), preferivelmente abaixo do pH 6. Em uma forma de realização, o ácido gálico é reciclado quando o pH é levado a condições levemente alcalinas, assim reduzindo o éster acetílico a ácido acético e retomando o ácido gálico a seu estado natural.

Em uma forma de realização, o(s) composto(s) de destoxificação é(são), preferivelmente, ácido gálico, é(são) dosados em uma concentração abaixo dos 1000 mM, tal como entre 0,001 a 1000 mM, preferivelmente abaixo de 100 mM, tal como entre 0,001 a 100 mM, mais preferível abaixo de 10 mM, tal como entre 0,00 IalO mM, ou especialmente abaixo de 1 mM, tal como entre 0,001 a 1 mM. PRÉ-TRATAMENTO O material contendo lignocelulose é pré-tratado na etapa (a) antes de ser hidrolisado e fermentado seqüencial ou simultaneamente. O objetivo do pré-tratamento é separar e/ou liberar celulose, hemicelulose e/ou lignina, e deste modo melhorar o índice de hidrólise enzimática. Os métodos de pré-tratamento, tais como a oxidação úmida e o pré-tratamento alcalino, atingem a lignina, enquanto diluem ácido, e a auto-hidrólise atinge a hemicelulose. A explosão de vapor é um exemplo de um pré-tratamento que atinge a celulose.

De acordo com a invenção, a etapa de pré-tratamento (a) pode ser uma etapa de pré-tratamento convencional conhecida na técnica. O pré- tratamento pode ter lugar em uma pasta aquosa. O material contendo lignocelulose pode estar presente durante o pré-tratamento em uma quantidade entre 10 a 80 % em peso, preferivelmente entre 20 a 70 % em peso, especialmente entre 30 a 60 % em peso, tal como ao redor de 50 % em peso.

TRATAMENTO QUÍMICO E MECÂNICO

O material contendo lignocelulose pode, de acordo com a invenção, ser química e/ou mecanicamente pré-tratado antes da hidrólise e/ou da fermentação. O tratamento mecânico (frequentemente referido como tratamento físico) pode ser usado isoladamente ou em combinação com a hidrólise subsequente ou simultânea, especialmente a hidrólise enzimática, para promover a separação e/ou a liberação da celulose, da hemicelulose e/ou da lignina.

O pré-tratamento químico e/ou mecânico pode ser realizado antes da hidrólise e/ou da fermentação. Alternativamente, o tratamento químico e/ou mecânico é realizado simultaneamente com a hidrólise, tal como simultaneamente com a adição de uma ou mais enzimas celulolíticas, ou outras atividades enzimáticas mencionadas abaixo, para liberar os açúcares fermentáveis, tais como a glicose e/ou a maltose. Em uma forma de realização da invenção, o material pré- tratado contendo lignocelulose é lavado antes da destoxificação na etapa (b). A lavagem pode melhorar a fermentabilidade, por exemplo, do material contendo lignocelulose hidrolisado de ácido diluído, tal como, por exemplo, a palha de milho.

PRÉ-TRATAMENTO QUÍMICO

A expressão “tratamento químico” refere-se a qualquer pré- tratamento químico que promova a separação e/ou a liberação da celulose, da hemicelulose e/ou da lignina. Exemplos de pré-tratamentos químicos adequados incluem o pré-tratamento com, por exemplo, ácido diluído. Além disso, a oxidação úmida é também considerada um pré-tratamento químico.

Preferivelmente, o pré-tratamento químico é o tratamento de ácido, mais preferível um tratamento de diluição contínua e/ou de ácido suave, tal como o tratamento com ácido sulfürico, ou outro ácido orgânico, tal como o ácido acético, o ácido cítrico, o ácido tartárico, o ácido succínico, ou misturas destes. Outros ácidos podem também ser usados. Tratamento de ácido suave significa, no contexto da presente invenção, que o pH do tratamento se situa na faixa de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 3. Em uma forma de realização específica, a concentração de ácido situa-se na faixa de 0,1 a 2,0 % em peso de ácido, preferivelmente de ácido sulfürico. O ácido pode ser misturado ou colocado em contato com o material a ser fermentado de acordo com a invenção, e a mistura pode ser mentida em uma temperatura na faixa de 160 a 220°C, tal como de 165 a 195°C, por períodos variando de minutos a segundos, por exemplo 1 a 60 minutos, tal como 2 a 30 minutos ou 3 a 12 minutos. Além disso os ácidos fortes, tal como o ácido sulfürico, podem ser aplicados para remover a hemicelulose. Isto intensifica a digestibilidade da celulose.

As técnicas de oxidação úmida envolvem o uso de agentes de oxidação, tais como agentes de oxidação com base em sulfito, ou coisa parecida. Exemplos de pré-tratamentos de solventes incluem o tratamento com DMSO (Sulfóxido de Dimetila) ou coisa parecida. O pré-tratamento químico é geralmente realizado por 1 a 60 minutos, tal como de 5 a 30 minutos, mas pode ser realizado por períodos de tempo mais curtos ou mais longos, dependentes do material a ser pré-tratado.

PRÉ-TRATAMENTO MECÂNICO

Como usado no contexto da presente invenção, a expressão “pré-tratamento mecânico” refere-se a qualquer tratamento mecânico (ou físico) que promova a separação e/ou a liberação da celulose, da hemicelulose e/ou da lignina, do material contendo lignocelulose. Por exemplo, o pré- tratamento mecânico inclui vários tipos de moagem, irradiação, vaporização/explosão de vapor, e hidrotermólise.

O pré-tratamento mecânico inclui a trituração (redução mecânica do tamanho das partículas). A trituração inclui a moagem seca, a moagem úmida e a moagem de bolas vibratórias. O pré-tratamento mecânico pode envolver alta pressão e/ou alta temperatura (explosão de vapor). Em uma forma de realização da invenção, alta pressão significa pressão na faixa de 300 (2,07 MPa) a 600 psi (4,14 MPa), preferivelmente 400 (2,76 MPa) a 500 psi (3,45 MPa), tal como ao redor de 450 psi (3,105 MPa). Em uma forma de realização da invenção, alta temperatura significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a 300°C, preferivelmente de cerca de 140 a 235°C. Em uma forma de realização preferida, o pré-tratamento mecânico é um processo de bateladas, sistema hidrolisante de pistola de vapor que utiliza alta pressão e alta temperatura como definido acima. Um Sunds Hydrolyzer [disponível da Sunds Defibrator AB (Suécia)] pode ser usado com esta finalidade. PRÉ-TRATAMENTO QUÍMICO E MECÂNICO COMBINADOS

Em uma forma de realização preferida, tanto o pré-tratamento químico quanto o mecânico são realizados envolvendo, por exemplo, tanto o tratamento diluído ou de ácido suave quanto o tratamento de altas temperatura e pressão. Os pré-tratamentos químico e mecânico podem ser realizados seqüencial ou simultaneamente, conforme desejado.

Consequentemente, em uma forma de realização preferida, o material contendo lignocelulose é submetido a pré-tratamento tanto químico quanto mecânico para promover a separação e/ou a liberação da celulose, da hemicelulose e/ou da lignina.

Em uma forma de realização preferida, o pré-tratamento é realizado como uma etapa diluída e/ou de explosão de vapor de ácido suave. HIDRÓLISE

Antes e/ou simultaneamente com a fermentação, o material pré-tratado contendo lignocelulose pode ser hidrolisado de modo a romper o selo de lignina e destruir a estrutura cristalina da celulose. O conteúdo de sólidos secos durante a hidrólise pode situar-se na faixa de 5 a 50 % em peso, preferivelmente de 10 a 40 % em peso, preferivelmente de 20 a 30 % em peso. A hidrólise pode ser realizada como um processo de batelada alimentado, em que o material pré-tratado contendo lignocelulose (substrato) é alimentado gradualmente, por exemplo, a uma solução de hidrólise contendo a enzima.

Em uma forma de realização da invenção, a destoxificação tem lugar antes ou durante a hidrólise.

Em uma forma de realização preferida, a hidrólise é realizada enzimaticamente. De acordo com a invenção, o material pré-tratado contendo lignocelulose pode ser hidrolisado por uma ou mais hidrolases (classe EC 3 de acordo com a Nomenclatura Enzimática), preferivelmente uma ou mais carboidrases selecionadas do grupo consistindo de celulase, hemicelulase, amilase, tal como a alfa-amilase, a enzima geradora de carboidratos, tal como a glicoamilase. Uma protease pode também estar presente. A alfa-amilase, a glicoamilase e/ou coisa parecida podem estar presentes durante a hidrólise e/ou a fermentação, quando o material de partida contendo lignocelulose pode incluir algum amido.

A(s) enzima(s) usadas para a hidrólise é(são) capaz(es) de converter direta ou indiretamente os polímeros de carboidratos em açúcares fermentáveis que possam ser fermentados em um produto de fermentação desejado, tal como o etanol.

Em uma forma de realização preferida, a carboidrase tem uma atividade de enzima celulolítica. Carboidrases adequadas são descritas na seção “Enzimas” abaixo.

Os polímeros de hemicelulose podem ser decompostos pelas hemicelulases e/ou pela hidrólise ácida, para liberar seus cinco e seis componentes de açúcar de carbono. Os seis açúcares de carbono (hexoses), tais como a glicose, galactose, arabinose e manose, podem facilmente ser fermentados, por exemplo, em etanol, acetona, butanol, glicerol, ácido cítrico, ácido fumárico, etc., por organismos de fermentação adequados, incluindo a levedura. Preferida para a fermentação do etanol é a levedura da espécie de Saccharomyces cerevisiae, preferivelmente as cepas que são resistentes em relação aos altos níveis de etanol, isto é, até, por exemplo, cerca de 10, 12 ou % ou mais, em volume, de etanol, tal como 20 % em volume.

Em uma forma de realização preferida, o material pré-tratado contendo lignocelulose é hidrolisado com o uso de uma hemicelulase, preferivelmente uma xilanase, esterase, celobiase, ou combinação destas.

A hidrólise pode também ser realizada na presença de uma combinação de hemicelulases e/ou celulases, e opcionalmente uma ou mais das outras atividades enzimáticas mencionadas na seção “Enzima”, abaixo.

O tratamento enzimático pode ser realizado em um ambiente aquoso adequado sob condições que possam facilmente ser determinadas por uma pessoa habilitada na técnica. Em uma forma de realização preferida, a hidrólise é realizada em condições ótimas para a(s) enzima(s) em questão. As condições de tempo, temperatura e pH adequadas do processo podem facilmente ser determinadas por uma pessoa habilitada na técnica da presente invenção. Preferivelmente, a hidrólise é realizada em uma temperatura entre 25 e 70°C, preferivelmente entre 40 e 60°C, especialmente ao redor de 50°C. O processo é preferivelmente realizado em um pH na faixa de 3 a 8, preferivelmente pH de 4 a 6, especialmente ao redor de pH 5. Preferivelmente, a hidrólise é realizada entre 8 e 72 horas, preferivelmente entre 12 e 48 horas, especialmente ao redor de 24 horas.

De acordo com a invenção, a hidrólise na etapa (b) e a fermentação na etapa (c) pode ser realizada simultaneamente (processo SHF) ou seqüencialmente (processo HHF).

FERMENTAÇÃO

De acordo com a invenção, o material pré-tratado (e hidrolisado) contendo lignocelulose é fermentado por pelo menos um organismo de fermentação capaz de fermentar açúcares fermentáveis, tais como a glicose, xilose, manose, galactose e/ou arabinose, direta ou indiretamente, em um produto de fermentação desejado.

A fermentação é preferivelmente contínua por 24 horas a 96 horas, em particular 35 a 60 horas.

Em uma forma de realização, a fermentação é realizada em uma temperatura entre 20 a 40°C, preferivelmente 26 a 34°C, em particular ao redor de 32°C. Em uma forma de realização, o pH é de 3 a 6, preferivelmente ao redor de 4 a 5.

É considerada uma hidrólise e fermentação simultâneas (SHF) em que não exista nenhum estágio de retenção separado para a hidrólise, significando que a(s) enzima(s) de hidrólise e o organismo de fermentação são adicionados juntos. Quando a fermentação é realizada simultaneamente com a hidrólise, a temperatura situa-se de preferência entre 30°C e 35°C, e mais preferível entre 31°C e 34°C, tal como ao redor dos 32°C. Um programa de temperatura compreendendo pelo menos dois estágios de retenção em diferentes temperaturas pode ser aplicado de acordo com a invenção.

O processo da invenção pode ser realizada como uma batelada ou como um processo contínuo.

RECUPERAÇÃO

Subsequente à fermentação, o produto de fermentação pode ser separado do caldo de fermentação. O caldo pode ser destilado para se extrair o produto de fermentação, ou o produto de fermentação pode ser extraído do caldo de fermentação por técnica de microfiltração ou de filtração de membrana. Alternativamente, o produto de fermentação pode ser recuperado por extração. Os métodos de recuperação são bem conhecidos na técnica. PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO

O processo da invenção pode ser usado para produzir qualquer produto de fermentação. Produtos de fermentação especialmente considerados incluem álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glicônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, FI2 e CO2); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios.

Produtos também considerados incluem os produtos consumíveis da indústria de álcool, por exemplo cerveja e vinho; produtos da indústria de laticínios, por exemplo produtos lácteos fermentados, produtos da indústria de couro e produtos da indústria de tabaco. Em uma forma de realização preferida, o produto de fermentação é um álcool, especialmente o etanol. O produto de fermentação, tal como o etanol, obtido de acordo com a invenção, pode preferivelmente ser usado como combustível. Entretanto, no caso do etanol, ele pode ser também usado como etanol potável. ORGANISMO DE FERMENTAÇÃO A expressão “organismo de fermentação” refere-se a qualquer organismo, incluindo os organismos bacterianos e fúngicos, adequados para produzir um produto de fermentação desejado. Os organismos de fermentação especialmente adequados de acordo com a invenção são capazes de fermentar, isto é, converter açúcares tais como a glicose, direta ou indiretamente, no produto de fermentação desejado. Exemplos de organismos de fermentação incluem os organismos fúngicos, tais como a levedura. Leveduras preferidas incluem as cepas do gênero Saccharomyces, em particular a cepa de Saccharomyees eerevisíae ou de Saccharomyees uvarum; uma cepa de Piehia, em particular Piehia stipitis ou Piehia pastoris; uma cepa do gênero Candida, em particular uma cepa de Candida utilis, Candida arabinofermentans, Candida diddensii, Candida sonorensis, Candida shehatae, Candida tropiealis ou Candida boidinii. Outra levedura considerada inclui a cepa de Hansenula, em particular a Hansenula polymorpha ou a Hansenula anômala; cepas de Kluyveromyces, em particular Kluyveromyces marxianus ou Kluyveromyces fagilis, e as cepas de Schizosaceharomyees, em particular Schizosaccharomyces pombe.

Os organismos de fermentação bacteriana preferidos incluem as cepas de Eseheriehia, em particular Eseheriehia eoli, as cepas de Zymomonas, em particular Zymomonas mobilis, as cepas de Zymobaeter, em particular Zymobaeter palmae, as cepas de Klebsiella, em particular Klebsiella oxytoea, as cepas de Leueonostoe, em particular Leueonostoe mesenteroides, as cepas de Clostridium, em particular Clostridium butyrieum, as cepas de Enterobaeter, em particular Enterobaeter aerogenes, e as cepas de Thermoanaerobaeter, em particular Thermoanaerobaeter BGlLl (Appl. Mierbiol. Bioteeh. 77: 61-86) e Thermoanaerobaeter ethanolieusm, Thermoanaerobaeter thermosaeeharolytieum, ou Thermoanaerobacter mathranii. As cepas de Lactobacillus são também consideradas como sendo cepas de Corynebacterium glutamieum R, Bacillus thermoglueosidasius e Geobacillus thermoglueosidasius.

Em uma forma de realização, o organismo de fermentação é um organismo de fermentação de açúcar C6, tal como uma cepa, por exemplo, de Saccharomyees eerevisiae.

Com relação especial à fermentação dos materiais derivados de lignocelulose, os organismos de fermentação de açúcar C5 são considerados. A maior parte dos organismos de fermentação de açúcar C5 também fermentam os açúcares C6. Exemplos de organismos de fermentação de açúcar C5 incluem as cepas de Piehia, tais como as da espécie Piehia stipitis. As bactérias de fermentação de açúcar C5 são também conhecidas. Igualmente algumas cepas de Saccharomyees eerevisiae fermentam açúcares C5 (e C6). Exemplos de cepas geneticamente modificadas de Saccharomyees spp que são capazes de fermentar açúcares C5 incluem aquelas referidas, por exemplo, em Ho et al., 1998, Applied and Environmental Microbiology, pp. 1852-1859 e em Karhumaa et al., 2006, Mierobial Cell Faetories 5:18.

Em uma forma de realização, o organismo de fermentação é adicionado ao meio de fermentação de modo que o organismo de fermentação viável, tal como a levedura, contados por mililitros de meio de fermentação,

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situa-se na faixa de 10 a 10 , preferivelmente de 10 a 10 , especialmente cerca de 5 x 10 .

Leveduras comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, as leveduras RED STAR® e ETHANOL RED® (disponíveis das Fermentis/Lesaffre, USA), FALI (disponível da Fleischmann's Yeast, USA), as leveduras fresca SUPERSTART e THERMOSACC® (disponíveis da Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM AFT e XR (disponíveis da NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND (disponível da Gert Strand AB, Suécia), e FERMIOL (disponível da DSM Specialties). ENZIMAS Não obstante não especificamente mencionado no contexto de um processo da invenção, deve ficar entendido que a(s) enzima(s) é(são) usada(s) em uma “quantidade eficaz”.

ATIVIDADE DE CELULASES OU CELULOLÍTICA

As expressões “atividade celulolítica” ou “atividade de celulases”, como aqui usadas, são entendidas como compreendendo enzimas tendo atividade de celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91), por exemplo, celobio- hidrolase I e/ou celobio-hidrolase II, bem como atividade de endo-glicanase (EC 3.2.1.4) e/ou atividade de beta-glicosidase (EC 3.2.1.21). Ver as seções pertinentes abaixo com outra descrição de tais enzimas.

Pelo menos três categorias de enzimas são importantes para converter a celulose em açúcares fermentáveis: endoglicanases (EC 3.2.1.4) que cortam as cadeias de celulose ao acaso; celobio-hidrolases (EC 3.2.1.91) que clivam as unidades de celobiosil das extremidades da cadeia de celulose e as beta-glicosidases (EC 3.2.1.21) que convertem a celobiose e as celodextrinas solúveis em glicose. Entre estas três categorias de enzimas envolvidas na biodegradação da celulose, as celobio-hidrolases parecem ser as enzimas chaves para degradar a celulose cristalina natural.

A atividade celulolítica pode, em uma forma de realização preferida, estar na forma de uma preparação de enzimas de origem fúngica, tal como de uma cepa do gênero Trichoderma, preferivelmente uma cepa de Trichoderma reesei; uma cepa do gênero Humicola, tal como uma cepa de Humieola insolens; ou uma cepa de Chrysosporium, preferivelmente uma cepa de Chrysosporium lueknowense.

Na forma de realização preferida, a preparação de enzima celulolítica contém uma ou mais das seguintes atividades: celulase, hemicelulase, atividade intensificadora da enzima celulolítica, atividade de beta-glicosidade, endoglicanase ou celubio-hidrolase. Em uma forma de realização preferida, a preparação de enzima celulolítica é uma composição referida no pedido U.S. n° 60/941.251, que é aqui incorporado como referência.

Em uma forma de realização preferida, a preparação da enzima celulolítica compreendendo um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica, preferivelmente um polipeptídeo da família GH61A, de preferência aqueles apresentados na WO 2005/074656 (Novozymes). A preparação da enzima celulolítica pode ainda compreender beta-glicosidase, tal como a beta-glicosidase derivada de uma cepa dos gêneros Trichoderma, Aspergillus ou Penicillium, incluindo a proteína de fusão tendo atividade de beta-glicosidade apresentada no pedido U.S. n° 60/832.511 ou no pedido U.S. n° 11/781.151 (Novozymes). Em uma forma de realização preferida, a preparação da enzima celulolítica pode também compreender uma enzima CBH II, preferivelmente a celobio-hidrolase II (CEL6A) de Thielavia terrestris (CEL6A). Em outra forma de realização, a preparação de enzima celulolítica pode também compreender enzimas celulolíticas; preferivelmente aquelas derivadas de Trichoderma reesei ou de Humicola insolens.

A preparação da enzima celulolítica pode também compreender um polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica (GH61A) apresentada na WO 2005/074656; uma celobio-hidrolase, tal como a celobio-hidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A), uma beta-glicosidase (por exemplo a proteína de fusão apresentada no pedido U.S. n2 60/832.511) e as enzimas celulolíticas, por exemplo, derivadas de Trichoderma reesei.

Em uma forma de realização preferida, a composição celulolítica compreendendo um polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica (GH61A) apresentada na WO 2005/074656; uma beta-glicosidase (por exemplo, a proteína de fusão apresentada nos pedidos U.S. n~ 60/832.511 ou 11/781.151), e a preparação de enzimas celulolíticas, por exemplo derivadas de Trichoderma reesei. Em outra forma de realização preferida, a composição celulolítica compreendendo polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica (GH61A) apresentada na WO 2005/074656; uma beta-glicosidase (a proteína de fusão apresentada no pedido U.S. n° 60/832.511, e a preparação de enzimas celulolíticas derivadas de Trichoderma reesei.

Em uma forma de realização a composição de enzima celulolítica é o produto comercialmente disponível CELLUCLAST® 1,5L ou CELLUZYME® (Novozymes A/S, Dinamarca).

A atividade celulolítica ou de celulase pode ser dosada na faixa de 0,1 a 100 FPU por grama de sólidos totais (TS), preferivelmente 0,5 a 50 FPU por grama de TS, especialmente 1 a 20 FPU por grama de TS. ENDOGLICANASE (EG)

O termo “endoglicanase” significa um endo-l,4-(l,3; 1,4)- beta-D-glican-2-glicano-hidrolase (E.C. n° 3.2.1.4), que catalisa a endo- hidrólise das articulações 1,4-beta-D-glicosídicas na celulose, derivados de celulose (tais como a carboximetil celulose e a hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em glicanos beta-1,3 misturados, tais como os beta-D- glicanos ou xiloglicanos de cereais, e outro material de plantas contendo componentes celulósicos.

A atividade de endoglicanase pode ser determinada com o uso da hidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268.

Em uma forma de realização preferida, as endoglicanases podem ser derivadas de uma cepa do gênero Trichoderma, preferivelmente uma cepa de Trichoderma reesei; uma cepa do gênero Humicola, tal como uma cepa de Humicola insolens; ou uma cepa de Chrysosporium, preferivelmente uma cepa de Chrysosporium lucknowense. CELOBIO-HIDROLASE (CBH)

O termo “celobio-hidrolase” significa uma celobio-hidrolase de 1,4-beta-D-glicano (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de articulações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celooligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glicose beta-1,4-ligada, liberando celobiose das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia.

Exemplos de celobio-hidrolases são mencionados acima,

incluindo CBH I e CBH II de Trichoderma resee\ Humicola insolens, e CBH

II de celobio-hidrolase de Thielavia terrestris (CEL6A).

A atividade de celobio-hidrolase pode ser determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 10 47: 273-279 e por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288. O método de Lever et al. é adequado para avaliar a hidrólise da celulose em palha de milho, e o método de van Tilbeurgh et al. é adequado para determinar a atividade da celobio-hidrolase sobre um derivado dissacarídeo fluorescente.

BETA-GLICOSIDASE

Uma ou mais beta-glicosidases ou “celobiase” pode estar presente para hidrólise.

O termo “beta-glicosidase” significa uma glico-hidrolase de beta-D-glicosídeo (E.C. 3.2.1.21), que catalisa a hidrólise dos resíduos terminais de beta-D-glicose não redutores com a liberação de beta-D-glicose. Para os fins da presente invenção, a atividade da beta-glicosidase é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al.,

2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66, exceto que condições diferentes foram empregadas como aqui descrito. Uma unidade de atividade de beta- glicosidase é definida como 1,0 micromol de p-nitrofenol produzido por minuto em 50°C, pH 5, de p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo 4 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM, 0,01 % de TWEEN® 20.

Em uma forma de realização preferida, a beta-glicosidase é de origem fúngica, tal como uma cepa dos gêneros Trichoderma, Aspergillus ou Penicillium. Em uma forma de realização preferida, a beta-glicosidase é um derivado de Trichoderma reesei, tal como a beta-glicosidase codificada pelo gene bgll (ver a Figura I da EP 562003). Em outra forma de realização preferida, a beta-glicosidase é derivada de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com o Exemplo 22 da WO 02/095014) ou Aspergillus niger (ver, por exemplo, 1981, JAppl. 3: 157-163).

ENZIMAS HEMICELULOLÍTICAS

De acordo com a invenção, o material contendo lignocelulose pode ainda ser submetido a uma ou mais enzimas hemicelulolíticas, por exemplo uma ou mais hemicelulases.

A hemicelulose pode ser decomposta pelas hemicelulases e/ou pela hidrólise ácida para liberar seus cinco e seis componentes de açúcar de carbono.

Em uma forma de realização da invenção, o material derivado de lignocelulose pode ser tratado com uma ou mais hemicelulases.

Qualquer hemicelulase adequada para uso em hidrolisar hemicelulose, preferivelmente em xilose, pode ser usada. Hemicelulases preferidas incluem as xilanases, arabinofuranosidases, acetil xilano enterase, feruloil esterase, glicuronidases, endo-galactanase, manases, endo ou exo arabinases, exo-galactanases, pectinases, xiloglicanases, e misturas de duas ou mais destas,

Preferivelmente, a hemicelulase para uso na presente invenção é uma hemicelulase de exo-ativação e, mais preferível, a hemicelulase é uma hemicelulase de exo-ativação que tem a capacidade de hidrolisar a hemicelulose sob condições ácidas de pH abaixo de 7, preferivelmente pH de 3 a 7. Um exemplo de hemicelulase adequado para uso na presente invenção inclui a VISCOZYME® (disponível da Novozymes A/S, Dinamarca).

Em uma forma de realização, a hemicelulase é uma xilanase. Em uma forma de realização, a xilanase pode preferivelmente ser de origem microbiana, tal como de origem fungica (por exemplo, Trichoderma, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Fusarium) ou de uma bactéria (por exemplo, Bacillus). Em uma forma de realização preferida, a xilanase é 5 derivada de um fungo filamentoso, preferivelmente derivado de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatu; ou uma cepa de Humicola, de preferência Humicola lanuginosa. A xilanase pode preferivelmente ser uma endo-l,4-beta-xilanase, mais preferível uma endo-l,4-beta-xilanase de GHlO ou GHl 1. Exemplos de xilanases comerciais incluem as SHEARZYME e 10 BIOFEED WHEAT® da Novozymes A/S, Dinamarca.

As arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) catalisam a hidrólise de resíduos não redutores terminais de alfa-L-arabinofuranosídeo em alfa-L- arabinosídeos.

As galactanases (EC 3.2.1.89), as arabinogalactano endo-1,4- beta-galactosidases, catalisam a endo-hidrólise das articulações 1,4-D- galactosídicas nos arabinogalactanos.

As pectinases (EC 3.2.1.15) catalisam a hidrólise das articulações 1,4-alfa-D-galactosidurônicas em pectato e outros galacturonanos.

As xiloglicanases catalisam a hidrólise de xiloglicano.

A hemicelulase pode ser adicionada em uma quantidade eficaz para hidrolisar a hemicelulose, tal como nas quantidades de cerca de 0,001 a 0,5 % em peso dos sólidos totais (TS), mais preferível de cerca de 0,05 a 0,5 % em peso dos TS.

As xilanases podem ser adicionadas nas quantidades de 0,001

a 1,0 g/kg de substrato de DM (matéria seca), preferivelmente nas quantidades de 0,005 a 0,5 g/kg de substrato de DM, e mais preferível de 0,05 a 0,10 g/kg de substrato de DM. ATIVIDADE DE INTENSIFICAÇÃO CELULOLÍTICA A expressão “atividade de intensificação celulolítica” é aqui definida como uma atividade biológica que intensifica a hidrólise de um material derivado de lignocelulose por proteínas tendo atividade celulolítica. Para os fins da presente invenção, a atividade de intensificação celulolítica é determinada pela medição do aumento nos açúcares redutores ou no aumento do total de celobiose e glicose da hidrólise de um material derivado de lignocelulose, por exemplo material pré-tratado contendo lignocelulose mediante proteína celulolítica sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína total/g de celulose em PCS (palha de milho pré-tratada), em que a proteína total é compreendida de 80 a 99,5 % p/p de proteína celulolítica/g de celulose em PCS e 0,5 a 20 % p/p de proteína de atividade de intensificação celulolítica por 1 a 7 dias em 50°C, em comparação com uma hidrólise de controle com igual carga de proteína total sem atividade de intensificação celulolítica (1 a 50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS).

Os polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica intensifica a hidrólise de um material derivado de lignocelulose catalisado por proteínas tendo atividade celulolítica pela redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para se alcançar o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 0,1 vez, mais preferível pelo menos 0,2 vez, mais preferível pelo menos 0,3 vez, mais preferível pelo menos 0,4 vez, mais preferível pelo menos 0,5 vez, mais preferível pelo menos 1 vez, mais preferível pelo menos 3 vezes, mais preferível pelo menos 4 vezes, mais preferível pelo menos 5 vezes, mais preferível pelo menos 10 vezes, mais preferível pelo menos 20 vezes, ainda mais preferível pelo menos 30 vezes, mais preferível pelo menos 50 vezes, e ainda o mais preferível pelo menos 100 vezes.

Em uma forma de realização preferida, a hidrólise e/ou a fermentação é realizada na presença de uma enzima celulolítica em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de intensificação. Em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo tendo atividade de intensificação é um polipeptídeo da família GH61A. A WO 2005/074647 apresenta polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica e seus polinucleotídeos de Thielavia terrestris. A WO 2005/074656 apresenta um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica e um seu polinucleotídeo de Thermoascus aurantiacus. A Publicação do Pedido U.S. n° 2007/0077630 apresenta um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica e um seu polinucleotídeo de Trichoderma reesei.

Uma enzima celulolítica pode ser adicionada para hidrolisar o material pré-tratado contendo lignocelulose. A celulase pode ser dosada na faixa de 0,1 a 100 FPU por grama de sólidos totais (TS), preferivelmente 0,5 a 50 FPU por grama de TS, especialmente 1 a 20 FPU por grama de TS.

ALF A-AMILASE

De acordo com a invenção, uma alfa-amilase pode ser usada. Em uma forma de realização preferida, a alfa-amilase é uma alfa-amilase ácida, por exemplo alfa-amilase ácida fungica ou alfa-amilase ácida bacteriana. A expressão “alfa-amilase ácida” significa uma alfa-amilase (E.C. 3.2.1.1) que,adicionada em uma quantidade eficaz, tem atividade ótima em um pH na faixa de 3 a 7, preferivelmente de 3,5 a 6, ou mais preferível na faixa de pH 5 a 6.

ALFA-AMILASE BACTERIANA

De acordo com a invenção, a alfa-amilase bacteriana é preferivelmente derivada do gênero Baeillus.

Em uma forma de realização preferida, a alfa-amilase de Baeillus é derivada de uma cepa de B. Iicheniformis, B. amyloliquefaeiens, B. subtilis or B. stearothermophilus, mas pode também ser derivada de outros Baeillus sp. Exemplos específicos de alfa-amilases consideradas incluem a alfa-amilase de Baeillus lieheniformis mostrada na SEQ ID NO: 4 na WO 99/19467, a alfa-amilase de Baeillus amyloliquefaciens SEQ ID NO: 5 na WO 99/19467, e a alfa-amilase de Baeillus stearothermophilus mostrada na SEQ ID NO: 3 na WO 99; 19467 (todas as seqüências por este meio incorporados como referência). Em uma forma de realização da invenção, a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60 %, de preferência de pelo menos 70 %, mais preferível pelo menos 80 %, ainda mais preferível pelo menos 90 %, tal como pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % a qualquer uma das seqüências apresentadas nas SEQ ID NOS: 1, 2 ou 3, respectivamente, na WO 99/19467.

A alfa-amilase de Baeillus pode também ser uma variante e/ou híbrido, especialmente uma descrita em qualquer dentre as WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059 e WO 02/10355 (todos os documentos aqui incorporados como referência). Variantes de alfa- amilase especificamente consideradas são apresentadas nas Patentes U.S. n— 6.093.562, 6.297.038 e 6.187.576 (aqui incorporadas como referência) e incluem as variantes da alfa-amilase de Baeillus stearothermophilus (alfa- amilase BSG) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos nas posições Rl79 a Gl82, preferivelmente uma deleção dupla apresentada na WO 1996/023873 - ver, por exemplo, a página 20, linhas IalO (aqui incorporadas como referência), preferivelmente correspondente a delta (181-182) em comparação com a seqüência de aminoácidos de alfa-amilase BSG do tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: 3 descrita na WO 99/19467, ou deleção dos aminoácidos Rl 79 e Gl 80 com o uso da SEQ ID NO: 3 na WO 99/19467 quanto à numeração (cuja referência é aqui incorporada como referência). Ainda mais preferidas são as alfa-amilases de Baeillus, especialmente a alfa-amilase de Baeillus steatothermophilus, as quais têm uma deleção dupla correspondente a delta(181-182) e ainda compreendem uma substituição N193F (também denotada 1181* + G182* + N193F) em comparação com a seqüência de aminoácidos de alfa-amilase BSG do tipo selvagem apresentada na SEQ ID NO: 3 descrita na WO 99/19467. ALFA-AMILASE HÍBRIDA BACTERIANA

Uma alfa-amilase híbrida especificamente considerada 5 compreende 445 resíduos de aminoácidos C-terminais da alfa-amilase de Baeillus licheniformis (mostrado na SEQ ID NO: 4 da WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da alfa-amilase derivada de Baeillus amyloliquefaciens (mostrados na SEQ ID NO: 5 da WO 99/19467), com uma ou mais, especialmente todas, da seguinte substituição:

IO G48 A+T49I+G107 A+H156 Y+A181T+N190F+I201F+A209V

+Q264S (com o uso da numeração de Baeillus licheniformis na SEQ ID NO:

4 da WO 99/19467). Também preferidas são as variantes tendo uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras estruturas de alfa-amilase de Baeillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou 15 deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferivelmente as deleções El78 e Gl79 (com o uso da numeração da SEQ ID NO: 5 da WO 99/19467).

ALFA-AMILASE FÚNGICA

As alfa-amilases fiíngicas incluem as alfa-amilases derivadas de uma cepa do gênero Aspergillus, tais como as alfa-amilases de Aspergillus oryzae, Aspergillus niger e Aspergillis kawaehii.

Uma alfa-amilase fungica ácida preferida é uma alfa-amilase semelhante a Fungamyl, que é derivada de uma cepa de Aspergillus oryzae. De acordo com a presente invenção, a expressão “alfa-amilase semelhante a 25 Fungamyr indica uma alfa-amilase que apresenta uma alta identidade, isto é, mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 %, mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 %, mais do que 99 %, ou mesmo 100 % de identidade com a parte madura da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 na WO 96/23874. Outra alfa-amilase ácida preferida é derivada de uma cepa Aspergillus niger. Em uma forma de realização preferida, a alfa-amilase fungica ácida é aquela de A. niger apresentada como “AMYAASPNG” no banco de dados Swiss-prot/TeEMBL sob o número de acesso primário P56271 e descrito na WO 89/01969 (Exemplo 3). Uma alfa-amilase fungica ácida comercialmente disponível derivada de Aspergillus niger é SP288 (disponível da Novozymes A/S, Dinamarca).

Outras alfa-amilases do tipo selvagem consideradas incluem aquelas derivadas de uma cepa dos gêneros Rhizomucor e Meripilus, de preferência uma cepa de Rhizomucorpusillus (WO 2004/055178 incorporada como referência) ou Meripilus giganteus.

Em uma forma de realização preferida, a alfa-amilase é derivada de Aspergilus kawachii e apresentada por Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81: 292-298, iiMolecular-Cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachiF; e ainda como EMBL: AB008370.

A alfa-amilase fúngica pode também ser uma enzima do tipo selvagem compreendendo um domínio de ligação de amido (SBD) e um domínio catalítico de alfa-amilase (isto é, não híbrido), ou uma variante deste. Em uma forma de realização, a alfa-amilase do tipo selvagem é derivada de uma cepa de Aspergillus kawachii.

ALFA-AMILASE HÍBRIDA FÚNGICA

Em uma forma de realização preferida, a alfa-amilase ácida fúngica é uma alfa-amilase híbrida. Exemplos preferidos de alfas-amilases híbridas fungicas incluem aquelas apresentadas na WO 2005/003311 ou na Publicação do Pedido U.S. n° 2005/0054071 (Novozymes) ou no pedido U.S. n° 60/638.614 (Novozymes), que são aqui incorporados como referência. Uma alfa-amilase híbrida pode compreender um domínio catalítico (CD) de alfa-amilase e um domínio/módulo de ligação a carboidrato (CBM), tal como um domínio de ligação a amido, e um ligante opcional.

Exemplos específicos de alfa-amilases híbridas consideradas incluem aquelas apresentadas nas Tabelas 1 a 5 dos exemplos, no pedido U.S. n° 60/638.614, incluindo a variante Fungamyl com o domínio catalítico JAl 18 e SBD de Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 100 no pedido U.S. n2 60/638.614), alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de AMG de Athelia rolfsii e SBD (SEQ ID NO: 101 no pedido U.S. n° 60/638.614), alfa- amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glicoamilase de Aspergillus niger e SBD (que é apresentada na Tabela 5 como uma combinação das seqüências de aminoácidos SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 96 no pedido U.S. n2 11/316.535) ou como V039 na Tabela 5 da WO 2006/069290, e alfa-amilase de Meripilus giganteus com ligante de glicoamilase de Athelia rolfsii e SBD (SEQ ID NO: 102 no pedido U.S. n° 60/638.614). Outras alfa-amilases híbridas especificamente consideradas são quaisquer daquelas listadas nas Tabelas 3, 4, 5 e 6 do Exemplo 4 do pedido U.S. n° 11/316.535 e na WO 2006/069290 (aqui incorporados como referência).

Outros exemplos específicos da alfa-amilases híbridas consideradas incluem aqueles apresentados na Publicação do Pedido U.S. n° 2005/0054071, incluindo aqueles apresentados na Tabela 3 na página 15, tal como a alfa-amilase de Aspergillus niger com o ligante de Aspergillus kawachii e o domínio de ligação de amido.

São também consideradas as alfa-amilases que apresentam uma alta identidade a qualquer das alfa-amilases acima mencionadas, isto é, mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 %, mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 %, mais do que 99 %, ou mesmo 100 % de identidade às seqüências de enzimas maduras. Uma alfa-amilase ácida pode, de acordo com a invenção, ser adicionada em uma quantidade de 0,1 a 10 AFAU/g de DS, preferivelmente 0,10 a 5 AFAU/g de DS, especialmente 0,3 a 2 AFAU/g de DS ou 0,001 a 1 FAU-F/g de DS, preferivelmente 0,01 a 1 FAU-F/g de DS.

5 PRODUTOS COMERCIAIS DE ALFA-AMILASE

As composições comerciais preferidas contendo alfa-amilase incluem MYCOLASE da DSM, BAN®, TERMAMYL® SC, FUNGAMYL®, LIQUOZYME® X e SAN® SUPER, SAN® EXTRA L (Novozymes A/S) e CLARASE® L-40.000, DEX-LO®, SPEZYME® FRED, SPEZYME® AA e 10 SPEZYME® DELTA AA, SPEZYME XTRA® (Genencor Int., USA), FUELZYME® (da Verenium Corp., USA); e a alfa-amilase fungica ácida vendida sob o nome comercial de SP288 (disponível da Novozymes A/S, Dinamarca).

ENZIMA GERADORA PA FONTE DE CARBOIDRATOS A expressão “enzima geradora da fonte de carboidratos” inclui

a glicoamilase (sendo geradora de glicose), a beta-amilase e a amilase maltogênica (sendo geradoras da maltose). Uma enzima geradora da fonte de carboidratos é capaz de produzir um carboidrato que pode ser usado como uma fonte de energia pelo(s) organismo(s) de fermentação em questão, por 20 exemplo quando usada em um processo da invenção para produzir um produto de fermentação, tal como o etanol. O carboidrato gerado pode ser convertido direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado, preferivelmente no etanol. De acordo com a invenção, uma mistura de enzimas geradoras de fonte de carboidrato pode ser usada. Misturas 25 especialmente consideradas são as misturas de pelo menos uma glicoamilase e uma alfa-amilase, especialmente uma amilase ácida, ainda mais preferida uma alfa-amilase fúngica ácida. A relação entre a atividade da alfa-amilase fúngica ácida (AFAU) para a atividade da glicoamilase (AGU) (AFAU para AGU) pode, em uma forma de realização da invenção, ser de pelo menos 0,1, em particular de pelo menos 0,16, tal como na faixa de 0,12 a 0,50 ou mais, ou entre 0,1 e 100, em particular entre 2 e 50, tal como na faixa de 10 a 40. GLICOAMILASE

Uma glicoamilase usada de acordo com a invenção pode ser 5 derivada de qualquer fonte adequada, por exemplo derivada de um microorganismo ou de uma planta. As glicoamilases preferidas são de origem fungica ou bacteriana, selecionadas do grupo consistindo de glicoamilases de Aspergillus, em particular glicoamilase Gl ou G2 de A. niger (Boel et al., 1984, EMBO J. 3 (5): 1097-1102), ou variantes desta, tais como aquelas 10 apresentadas nas WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (da Novozymes, Dinamarca); a glicoamilase de A. awamori apresentada na WO 84/02921, A glicoamilase de/l oryzae (Agric. Biol. Chem., 1991, 55 (4): 941- 949), ou as variantes dos seus fragmentos. Outras variantes de glicoamilase de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A 15 e G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. y.301: 275-281); ligações dissulfeto, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704; e introdução de resíduos Pro nas posições A435 e S436 (Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.

Outras glicoamilases incluem a glicoamilase de Athelia rolfsii

(anteriormente denotada Corticium rolfsii) (ver a Patente U.S. n° 4.727.026 e Nagasaka et al., 1998, iiPurifieation and properties of the raw-starch- degrading glueoamylases from Cortieium rolfsii, Appl MicrobiolBiotechnor 50: 323-330), glicoamilases de Talaromyees, em particular derivada de 25 Talaromyees emersonii (WO 99/28448), Talaromyees leyeettanus (Patente U.S. rr 32.153), Talaromyees duponti, Talaromyees thermophilus (Patente U.S. n° 4.587.215).

As glicoamilases bacterianas consideradas incluem as glicoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolytieum (EP 135.138), e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831) e Trametes cingulata apresentada na WO 2006/069289 (as quais são aqui incorporadas como referência).

As glicoamilases híbridas também são consideradas de acordo com a invenção. Exemplos de glicoamilases híbridas são apresentados na WO 2005/045018. Exemplos específicos incluem a glicoamilase híbrida apresentada nas Tabelas 1 e 4 do Exemplo 1 (cujos híbridos são aqui incorporados como referência).

São também consideradas as glicoamilases que apresentam 10 uma alta identidade a qualquer das glicoamilases acima mencionadas, isto é, mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 %, mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 %, mais do que 99 % ou mesmo 100 % de identidade para com as seqüências de enzimas maduras.

Composições comercialmente disponíveis contendo

glicoamilase incluem as AMG 200L; AMG 300L; SAN® SUPER, SAN® EXTRA L, SPIRIZYME® PLUS, SPIRIZYME® FUEL, SPIRIZYME® B4U, SPIRIZYME® ULTRA e AMG® E (da Novozymes A/S); OPTIDEX® 300, GC480® e GC147® (da Genencor Int., USA); AMIGASE® e AMIGASE® 20 PLUS (da DSM); G-ZYME® G900, G-ZYME® e G990 ZR (da Genencor Int.).

As glicoamilases podem, em uma forma de realização, ser adicionadas em uma quantidade de 0,02 a 20 AGU/g de DS, preferivelmente

0,1 a 10 AGU/g de DS, especialmente entre 1 a 5 AGU/g de DS, tal como 0,1 a 2 AGU/g de DS, tal como 0,5 AGU/g de DS.

BETA-AMILASE

Uma beta-amilase (EC 3.2.1.2) é o nome tradicionalmente dado à amilase maltogênica exo-atuantes, que catalisa a hidrólise das articulações 1,4-alfa-glicosídicas na amilose, na amilopectina e nos polímeros de glicose relacionados. As unidades de maltose são sucessivamente removidas das extremidades da cadeia não redutora de uma forma em etapas, até que a molécula seja degradada ou, no caso da amilopectina, até que um ponto da ramificação seja alcançado. A maltose liberada tem a configuração anomérica beta, daí o nome de beta-amilase.

As beta-amilases têm sido isoladas de várias plantas e microorganismos (Fogarty e Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology 15: 112-115). Estas beta-amilases são caracterizadas por terem temperaturas ótimas na faixa de 40°C a 65°C, e pH ótimo na faixa de 4,5 a 7. Uma beta- 10 amilase comercialmente disponível da cevada é a NOVOZYM® WBA da Novozymes A/S, Dinamarca, e a SPEZYME® BBA 1500 da Genencor Int., USA.

AMILASE MALTOGÊNICA

A amilase pode também ser uma alfa-amilase maltogênica. 15 Uma “alfa-amilase maltogênica” (1,4-alfa-malto-hidrolase glicano, EC 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar a amilose e a amilopectina em maltose na configuração alfa. Uma amilase maltogênica da cepa de Baeillus stearothermophilus NCIB 11837 acha-se comercialmente disponível da Novozymes A/S. Alfa-amilases maltogênicas são descritas nas Patentes U.S. 20 n~ 4.598.048, 4.604.355 e 6.162.628, as quais ficam por este meio aqui incorporadas como referência.

A amilase maltogênica pode, em uma forma de realização preferida, ser adicionada em uma quantidade de 0,05 a 5 mg de proteína total/grama de DS, ou 0,05 a 5 MANU/g de DS.

PROTEASES

A protease pode ser qualquer protease, tal como a de origem microbiana ou de plantas. Em uma forma de realização preferida, a protease é uma protease ácida de origem microbiana, preferivelmente de origem fungica ou bacteriana. Proteases adequadas incluem as proteases microbianas, tais como as proteases fúngicas e bacterianas. Proteases preferidas são as proteases ácidas, isto é, as proteases caracterizadas pela capacidade de hidrolisar proteínas sob condições ácidas abaixo de pH 7.

5 As proteases fúngicas ácidas consideradas incluem as

proteases fungicas derivadas de Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Penicillium, Sclerotium e Torulopsis. Especialmente consideradas são as proteases derivadas de Aspergillus niger (ver, por exemplo, Koaze et al., 1964, Agr. Biol. Chem. 10 Japan, 28: 216), Aspergillus saitoi (ver, por exemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soe. Japan, 28: 66), Aspergillus awamori (Hayashida et al., 1977, Agrie. Biol. Chem. 42(5): 927-933, Aspergillus aeuleatus (WO 95/02044) ou Aspergillus oryzae, tal como a protease pepA; e proteases ácidas de Mueor pusillus ou Mueor miehei.

Consideradas são também as proteases neutras ou alcalinas, tal

como a protease derivada de uma cepa de Baeillus. Uma protease particular considerada para a invenção é derivada de Baeillus amyloliquefaeiens e tem a seqüência obtenível em Swissprot com o número de Acesso P06832. Também consideradas são as proteases tendo pelo menos 90 % de identidade à 20 seqüência de aminoácidos obtenível em Swissprot com o número de Acesso P06832, tal como pelo menos 92 % de identidade.

Ainda consideradas são as proteases tendo pelo menos 90 % de identidade à seqüência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 1 na WO 2003/048353, tal como 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou particularmente pelo menos 99 % de identidade.

Igualmente consideradas são as proteases semelhantes à papaína, tais como as proteases dentro da E.C. 3.4.22.* (protease de cisteína), tais como as EC 3.4.22.2 (papaína), EC 3.4.22.6 (quimopapaína), EC 3.4.22.7 (asclepaina), EC 3.4.22.14 (actinidaína), EC 3.4.22.15 (catepsina L), EC 3.4.22.25 (glicila endopeptidase) e EC 3.4.22.30 (caricaína).

Em uma forma de realização, a protease é uma preparação de protease derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como a Aspergillus oryzae.

Em outra forma de realização, a protease é derivada de uma cepa de Rhizomueor, preferivelmente Rhizomueor mehei. Em outra forma de realização considerada, a protease é uma preparação de protease, preferivelmente uma mistura de uma preparação proteolítica derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, e uma protease derivada de 10 uma cepa de Rhizomueor, preferivelmente Rhizomueor mehei.

As proteases de ácido aspártico são descritas, por exemplo, em Handbook of Proteolytie Enzymes, Editado por Barrett. Rawlings e Woessner, Academic Press, San Diego, 1998, Capítulo 270). Exemplos adequados da protease de ácido aspártico incluem, por exemplo, aqueles apresentados em 15 Berka et al., 1990, Gene 96: 313; Berka et al., 1993, Gene, 125: 195-198; e Gomi et al., 1993, Biosei. Biotech. Bioehem. 57: 1095-1100, os quais são aqui incorporados como referência.

A protease pode estar presente em uma quantidade de 0,0001 a

1 mg de proteína enzimática por grama de DS, preferivelmente 0,001 a 0,1 20 mg de proteína enzimática por grama de DS. Alternativamente, a protease pode estar presente em uma quantidade de 0,0001 a 1 LAPU/g de DS, preferivelmente 0,001 a 0,1 LAPU/g de DS e/ou 0,0001 a 1 mAU-RH/g de DS, preferivelmente 0,001 a 0,1 mAU-RH/g de DS, ou nas quantidades de 0,1 a 1000 AU/kg de DS, preferivelmente 1 a 100 AU/kg de DS e o mais 25 preferível 5 a 25 AU/kg de DS.

USO

No terceiro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de um ou mais dos compostos listados na seção acima “Compostos de destoxificação”, tal como especialmente o ácido gálico ou uma amidase (por exemplo, aquelas listadas acima), e anidrase (por exemplo aquelas listadas acima) para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose.

A destoxifícação pode ser uma etapa separada ou integral em um processo de produção de produtos de fermentação da invenção.

A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ficar limitada

no escopo pelas formas de realização específicas aqui apresentadas, uma vez que estas formas de realização são apresentadas como ilustrações dos vários aspectos da invenção. Pretende-se que quaisquer formas de realização equivalentes se situem dentro do escopo desta invenção. De fato, várias 10 modificações da invenção além daquelas aqui apresentadas e descritas se tomarão evidentes àqueles habilitados na técnica, a partir da descrição supra. Pretende-se que tais modificações também se situem dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de divergências o presente relatório descritivo, incluindo as definições, assumirá o controle.

Várias referências são aqui citadas, cujas descrições são aqui

incorporadas como referência em suas totalidades.

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação da Levedura: Levedura de Vermelho de Etanol RED STAR® secada por congelamento, reidratada em meio de 10 x YP por 30 minutos em 32°C. Ela foi dosada nas fermentações em uma dose de 0,2 g/litro.

Ácido Gálico:

Sigma G7384 - (ácido 3,4,5-triidroxibenzóico)

Amidase: amidase de Pseudomas aeruginosa (Sigma, Produto

ne A6691)

Anidrase Carbônica:

anidrase carbônica de eritrócitos bovinos (pó liofilizado, > 2.500 W-A unidades/mg de proteína) Produto da Signa n° C3934 Preparação Celulolítica A:

Composição celulolítica compreendendo um polipeptídeo atividade de intensificação celulolítica (GH61A) apresentada na WO 2005/074656; uma beta-glicosidase (proteína de fusão apresentada no pedido 5 U.S. n° 60/832.511), e preparação de enzimas celulolíticas derivadas de Trichoderma reesei. A Preparação de Celulase A é apresentada no pedido U.S. n° 60/941.251 (incorporado como referência).

MÉTODOS

Determinação da Identidade O relacionamento entre duas seqüências de aminoácidos ou

entre duas seqüências de nucleotídeos é descrito pelo parâmetro “identidade”.

O grau de identidade entre duas seqüências de aminoácidos pode ser determinado pelo método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151- 153) com o uso do programa LASERGENE® MEGALIGN® (DNASTAR, 15 Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros múltiplos de alinhamento: penalidade de descontinuidade de 10 e penalidade de extensão da abertura de 10. Os parâmetros de alinhamento aos pares são Ktuplo=I, penalidade de descontinuidade=^, windows=5 e diagonais=5.

O grau de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos 20 pode ser determinado pelo método de Wilbur-Lipman (Wilbur e Lipman, 1983, Proeeedings of the National Aeademy of Science USA 80: 726-730) com o uso do programa LASERGENE® MEGALIGN® (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de identidade múltiplos: Penalidade de descontinuidade de 10 e penalidade de 25 extensão da abertura de 10. Os parâmetros de alinhamento aos pares são Ktuplo=3, penalidade de descontinuidade=3 e windows=20.

ATIVIDADE DE GLICOAMILASE (AGU)

A Unidade de Glicoamilase Novo (AGU) é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto sob as condições padrão de 37°C, pH 4,3, substrato: maltose 23,2 mM, tampão: acetato 0,1 M, tempo de reação de 5 minutos.

Um sistema autoanalisador pode ser usado. Mutarrotase é adicionada ao reagente de glicose desidrogenase de modo que qualquer alfa- 5 D-glicose presente seja transformado em beta-D-glicose. A glicose desidrogenase reage especificamente com a beta-D-glicose na reação acima mencionada, formando NADH, que é determinada com o uso de um fotômetro de 340 nm como uma medida da concentração original da glicose.

Incubação de AMG : Substrato: maltose 23,2 mM Tampão: acetato 0,1 M pH: 4,30 ± 0,05 Temperatura de incubação: 37°C ± 1 Tempo de reação: 5 minutos Faixa de atuação da enzima: 0,5 a 4,0 AGU/ml Reacão a cor: GlucDH 430 U/litro Mutarrotase: 9 U/litro NAD: 0,21 mM Tampão: fosfato 0,12 M, NaCl 0,15 M pH: 0,60 ± 0,05 Temperatura de incubação: 37°C ± 1 Tempo de reação: 5 minutos Comprimento de onda: 340 nm Um dossiê (EB-SM-0131.02/01 descrevendo em mais detalhes

este método analítico acha-se disponível da Novozymes A/S, Dinamarca, o qual fica aqui incluído como referência.

ATIVIDADE DA ALFA-AMILASE (KNU)

A atividade da alfa-amilase pode ser determinada com o uso 15 de fécula de batata como substrato. Este método baseia-se na decomposição da fécula de batata modificada pela enzima, e a reação é seguida pela mistura das amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente, uma cor azul enegrecida é formada, mas durante a decomposição do amido a cor azul enfraquece e gradualmente se transforma em marrom avermelhado, o que é comparado com um padrão de vidro colorido.

Uma unidade de alfa-amilase Kilo Novo (KNU) é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é, em 37°C ± 0,05; Ca2+ 0,0003 M; e pH 5,6) dextrina 5260 mg de substância seca de amido Merck Amylum solúvel.

Um dossiê EB-SM-0009.02/01 descrevendo este método analítico em mais detalhes acha-se disponível sob pedido à Novozymes A/S, Dinamarca, dossiê este que é aqui incluído como referência.

ATIVIDADE DE ALFA-AMILASE ÁCIDA (AFAU)

Quando usada de acordo com a presente invenção, a atividade de uma alfa-amilase ácida pode ser medida em FAU-F [Fungai Alpha- Amylase Unit (Unidade de Alfa-Amilase Fúngica)] ou em AFAU (Unidades de Alfa-Amilase Fúngica Ácida).

DETERMINAÇÃO DA FAU-F

A Unidade de Alfa-Amilase Fúngica (Fungamyl) é medida em relação a um padrão enzimático de uma intensidade declarada.

Condições de Reação Temperatura 37°C PH 7,15 Comprimento de onda 405 nm Tempo de reação 5 minutos Tempo de medição 2 minutos Um dossiê (EB-SM-0216.02) descrevendo o método padrão em mais detalhes, acha-se disponível, mediante solicitação, da Novozymes A/S, Dinamarca, dossiê esse que é aqui incluído como referência. ATIVIDADE DE ALFA-AMILASE ÁCIDA (AFAU)

A atividade de alfa-amilase ácida pode ser medida em AFAU (Unidades de Alfa-Amilase Fúngica Ácida), as quais são determinadas em relação a um padrão enzimático. I AFAU é definida como a quantidade de enzima que degrada 5,260 mg de matéria seca de amido por hora, sob as condições padrão mencionadas abaixo. A alfa-amilase ácida, uma endo-alfa-amilase (1,4-alfa-D- glican-glicano-hidrolase, E.C. 3.2.1.1), hidrolisa as ligações alfa-1,4- glicosídicas nas regiões internas da molécula de amido para formar dextrinas e oligossacarídeos com diferentes comprimentos de cadeia. A intensidade da 5 cor formada com iodo é diretamente proporcional à concentração do amido. A atividade de amilase é determinada com o uso de colorimetria reversa como uma redução na concentração do amido sob as condições analíticas especificadas.

ALFA-AMILASE

AMIDO + IODO ----------------> DEXTRINAS + OLIGOSSACARÍDEOS

40’, pH 2,5

λ = 590 nm

azul/violeta t = 23 segundos descoloração

Condições padrão/condições de reação

Substrato: Amido solúvel, aprox. 0,17 g/litro

Tampão: Citrato, aprox. 0,03 M

Iodo (I2): 0,03 g/litro

CaCl2: 1,85 mM

pH: 2,50 ± 0,05

Temperatura de incubação 40°C Tempo de reação 23 segundos

Comprimento de onda: 590 nm Concentração enzimática: 0,025 AFAU/ml

Faixa de operação da enzima:0,01 a 0,04 AFAU/ml.

Um dossiê EB-SM-0259.02/01 descrevendo este método analítico em mais detalhes, acha-se disponível, mediante solicitação à Novozymes A/S, Dinamarca, dossiê este que é aqui incluído como referência. MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DE CELULASE COM O USO DO ENSAIO DE PAPEL DE FILTRO (ENSAIO DE FPU)

I. Fonte do Método

1.1.0 método é apresentado em um documento intitulado “Medição das Atividades de Celulase” por Adney, B. e Baker, J., 1996, Laboratory Analytical Procedure, LAP-006, National Renewable Energy Laboratory (NREL). Baseia-se no método da IUPAC para medir a atividade de celulase (Ghose, T. K., Measurement of Cellulae Aetivities, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 257-268.

2. Procedimento

2.1. O método é realizado como descrito por Adney e Baker, acima, exceto quanto ao uso de placas de 96 reservatórios para leitura dos valores da absorbância após o desenvolvimento da cor, como descrito abaixo.

2.2. Tubos de Ensaio de Enzimas:

2.2.1 Uma tira de papel de filtro enrolada (#1 Whatman; 1x6 cm; 50 mg) é adicionada ao fundo de um tubo de teste (13x10 mm).

2.2.2 Ao tubo é acrescentado 1,0 ml de tampão de citrato de sódio 0,05 M (pH 4,80).

2.2.3 Os tubos contendo o papel de filtro e tampão são incubados por 5 minutos, em 50°C (± 0,1 °C) em um banho de água de circulação.

2.2.4 Em seguida à incubação, 0,5 ml de diluição de enzima em tampão de citrato é adicionado ao tubo. As diluições de enzima são projetadas para produzir valores levemente acima e abaixo do valor alvo de 2,0 mg de glicose.

2.2.5 Os conteúdos dos tubos são misturados por turbilhonamento suave por 3 segundos.

2.2.6 Após o turbilhonamento, os tubos são incubados por 60 minutos em 50°C (± 0,1 °C) em um banho de água de circulação.

2.2.7 Imediatamente em seguida aos 60 minutos de incubação, os tubos são removidos do banho de água, e 3,0 ml de reagente DNS são adicionados a cada tubo para interromper a reação. Os tubos são turbilhonados por 3 segundos para misturar. 2.3 Branco e Controles

2.3.1 Um branco reagente é preparado pela adição de 1,5 ml de tampão de citrato a um tubo de teste.

2.3.2 Um controle de substrato é preparado pela colocação de uma tira de papel de filtro enrolada no fundo de um tubo de teste, e adição de

1.5 ml de tampão de citrato.

2.3.3 Controles de enzimas são preparados para cada diluição de enzimas pela mistura de 1,0 ml de tampão de citrato com 0,5 ml da diluição de enzimas apropriadas.

2.3.4 O branco reagente, o controle de substrato e os controles

de enzimas são ensaiados da mesma maneira que os tubos de ensaio das enzimas, e concluídos entre si.

2.4 Padrões de Glicose

2.4.1 Uma solução de estoque de glicose de 100 ml (10,0 mg/ml) é preparada, e alíquotas de 5 ml são congeladas. Antes do uso, as

alíquotas são descongeladas e turbilhonadas até mistura.

2.4.2 As diluições da solução de estoque são feitas em tampão de citrato como segue:

Gl = 1,0 ml de estoque + 0,5 ml de tampão = 6,7 mg/ml = 3,3

mg/0,5 ml

G2 = 0,75 ml de estoque + 0,75 ml de tampão = 5,0 mg/ml =

2.5 mg/0,5 ml

G3 = 0,5 ml de estoque + 1,0 ml de tampão = 3,3 mg/ml =1,7

mg/0,5 ml

G4 = 0,2 ml de estoque + 0,8 ml de tampão = 2,0 mg/ml =1,0

mg/0,5 ml

2.4.3 Tubos padrão de glicose são preparados pela adição de

0,5 ml de cada diluição a 1,0 ml de tampão de citrato.

2.4.4 Os tubos padrão de glicose são ensaiados da mesma maneira que os tubos de ensaio de enzimas, e concluídos entre si. 2.5 Desenvolvimento da Cor

2.5.1 Em seguida aos 60 minutos de incubação e adição de DNS, os tubos são todos fervidos juntos por 5 minutos, em um banho de água.

2.5.2 Após a fervura, eles são imediatamente esfriados em um banho de água gelada.

2.5.3 Quando frios, os tubos são brevemente turbilhonados, e a polpa é deixada sedimentar-se. Depois cada tubo é diluído pela adição de 50 microlitros do tubo a 200 microlitros de ddH20 em uma placa de 96 reservatórios. Cada reservatório é misturado, e a absorbância é lida em 540 nm.

2.6 Cálculos (os exemplos são fornecidos no documento de

NREL)

2.6.1 Uma curva padrão da glicose é preparada por representação gráfica da concentração de glicose (mg/0,5 ml) quanto aos quatro padrões (G1 a G4) versus A540. Esta é ajustada com o uso da regressão linear (Prism Software), e a equação para a linha é usada para determinar a glicose produzida para cada um dos tubos de ensaio de enzimas.

2.6.2 Um gráfico da glicose produzida (mg/0,5 ml) versus diluição total da enzima é preparado, com o eixo dos Y (diluição enzimática) estando em uma escala logarítmica.

2.6.3 Uma linha é traçada entre a diluição da enzima que produziu logo acima de 2,0 mg de glicose e a diluição que produziu logo abaixo daquela. Desta linha, foi determinada a diluição de enzima que teria produzido exatamente 2,0 mg de glicose.

2.6.4 As Unidades de Papel de Filtro/ml (FPU/ml) são calculadas como segue:

FPU/ml = 0,37/diluição de enzima produzindo 2,0 mg de

glicose MÉTODO DE ENSAIO DA PROTEASE - AU(RH) A atividade proteolítica pode ser determinada com hemoglobina desnaturada como substrato. No método de Anson-Hemoglobin para a determinação da atividade proteolítica, a hemoglobina desnaturada é digerida, e a hemoglobina não digerida é precipitada com ácido tricloroacético (TCA). A quantidade do produto solúvel no TCA é determinada com o reagente fenol, o qual dá uma cor azul com tirosina e triptofano.

Uma Unidade de Anson (AU-RH) é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é, 25°C, pH 5,5 e tempo de reação de 10 minutos), digere a hemoglobina em um índice inicial tal que é liberada por minuto uma quantidade de produto solúvel em TCA que dá a mesma cor do reagente de fenol como um miliequivalente de tirosina.

O método de AU(RH) é descrito em EAL-SM-0350 e é disponível da Novozymes A/S, Dinamarca, sob pedido.

ATIVIDADE PROTEOLÍTICA (AU)

A atividade proteolítica pode ser determinada com hemoglobina desnaturada como substrato. No método de Anton-Hemoglobin para a determinação da atividade proteolítica, a hemoglobina desnaturada é digerida, e a hemoglobina não digerida é precipitada com ácido tricloroacético (TCA). A quantidade do produto solúvel de TCA é determinada com o reagente de fenol, o qual dá uma cor azul com a tirosina e o triptofano.

Uma Unidade de Anson (AU) é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é, 25°C, pH 7,5, e tempo de reação de

minutos), digere a hemoglobina em segundo um índice inicial tal que é liberada por minuto uma quantidade do produto solúvel em TCA que a mesma cor do reagente de fenol como um miliequivalente de tirosina.

Um dossiê AF 4/5 descrevendo o método analítico em mais detalhes, acha-se disponível mediante pedido à Novozymes A/S, Dinamarca, dossiê este que fica aqui incluído como referência.

MÉTODO DE ENSAIO DA PROTEASE (LAPU)

1 Unidade de Peptidase de Amino Leucina (LAPU) é a quantidade de enzima que decompõe 1 microM de substrato por minuto nas seguintes condições: 26 mM de L-leucina-p-nitroanilida como substrato, tampão Tris 0,1 M (pH 8,0), 37°C, tempo de reação de 10 minutos.

A LAPU é descrita no EB-SM-0298.02/01, disponível da Novozymes A/S (Dinamarca) sob pedido.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA AMILASE MALTOGÊNICA

(MANU)

Uma MANU (Maltogenic Amylase Novo Unit) pode ser definida como a quantidade de enzima necessária para liberar um micromol de maltose por minuto em uma concentração de 10 mg de substrato de maltotriose (Sigma M 8378) por ml de tampão de citrato 0,1 M, pH 5,0 em 37°C por 30 minutos.

DEFINIÇÃO DA UNIDADE DA AMIDASE (UNIDADES SIGMA)

Uma unidade converterá 1,0 micromol de acetamida e hidroxilamina em acetoidroxamato e amônia por minuto, em pH 7,2 a 37°C. DEFINIÇÃO DA UNIDADE DA ANIDRASE CARBÔNICA (UNIDADES SIGMA)

Uma unidade de Wilbur-Anderson (W-A) fará com que o pH de um tampão Trizma 0,02 M desça de 8,3 para 6,3 por minuto, em 0°C. (Uma unidade de W-A é essencialmente equivalente a uma unidade de Roughton-Booth.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

PRÉ-TRATAMENTO DA PALHA DE MILHO COMPLETAMENTE PRÉ- TRATADA NÃO LAVADA (fuwPCS)

Vapor de ácido diluído explodido com palha (PCS) foi diluído com água e ajustado a pH 5,0 com NH4OH. O nível de sólidos totais (TS) foi de 15 % em peso. Esta amostra foi então sacarificada por 63 horas em 50°C com a Preparação Celulolítica A. Penicilina foi adicionada em uma taxa de 1 g/litro, foi adicionado também antes da sacarificação o tampão de citrato em 5 uma taxa de 50 ml de tampão de citrato I M por 100 ml de substrato. Em seguida à etapa de sacarificação, a amostra foi filtrada através de um sistema de filtro de vácuo Nalgene de 0,2 mícron (Produto 8-0000-43-0803) para remover os sólidos e usada para fermentação. A fuwPCS foi então pipetada em tubos centrífugos cônicos de 15 ml estéreis separados contendo um

pequeno orifício de ventilação de CO2.

DOSAGEM (ÁCIDO GÁLICO)

O pH foi ajustado a cerca de 2 com o uso de H2SO4; o ácido gálico foi dosado nas concentrações de 2 mM (GaA-L) e em 10 mM (GaA- H). O ácido gálico foi preparado por sonicação de 1,99 mg de ácido gálico em 15 100 ml de água deionizada. O caldo foi deixado repousar em 20°C durante a noite e depois reajustado a pH 5 com o uso de NaOH antes de se adicionar levedura.

DOSAGEM (AMIDASE)

A dosagem quanto à amidase foi realizada pelo tratamento com 5,6 Unidades/5 g de substrato (AMD-L) e também 56 Unidades/5 g de substrato (AMD-H). As amostras tratadas com amidase foram levadas a um pH de 7 com NaOH e deixadas repousar em um forno em uma temperatura de 37°C por 18 horas, como um pré-tratamento.

FERMENTAÇÃO

As fermentações foram realizadas em tubos centrífugos

plásticos cônicos estéreis de 15 ml, em 32°C por 48 horas, em pH 5,0. Um total de 5 gramas de amostra foi fermentado para cada tratamento. Os tratamentos foram desenvolvidos em triplicata. ANALÍTICO As amostras de fermentação foram coletadas após 24 hortas para a dose de levedura de 0,2 g/litro, e analisadas quanto ao ácido acético e o etanol com o uso de um Sistema de HPLC de Agilent com uma coluna analítica BIO-RAD Aminex HPX-87H e uma coluna de proteção de recarga BIO-RAD Cation H.

RESULTADOS

RESULTADOS DE 24 HORAS. A Figura 1 mostra os resultados médios do etanol obtidos para a dose de levedura após 24 horas. Sob estas condições, o nível de etanol obtido para as amostra de controle é muito baixo (cerca de 2 g/litro), sugerindo que os inibidores estejam afetando negativamente o metabolismo da levedura. Os resultados em 24 horas mostraram a amidase dando rendimentos médios de 21,8 g/litro de etanol para a dose baixa, e de

23,6 g/litro para a dose elevada. O ácido gálico apresentou 19,4 g/litro para a dose baixa e 17,8 g/litro para a dose elevada. O ácido gálico também apresentou uma queda significativa na quantidade de ácido acético presente na fermentação (ver a Figura 2).

EXEMPLO 2

ANIDRASE CARBÔNICA E AMIDASE

SACARIFICACÂO PA PALHA DE MILHO PRÉ-TRATADA

Palha de milho (PCS) explodida de vapor ácido diluído foi diluída com água e ajustada a pH 5,0 com NH4OH. O nível de sólidos totais (TS) foi de 16 %. Esta amostra foi então sacarificada por 72 horas em 50°C com a Preparação Celulolítica A. Penicilina e tampão de citrato foram também adicionados antes da sacarificação. Em seguida à etapa de sacarificação, a amostra foi filtrada para remover os sólidos e o filtrado foi usado para a fermentação. A fuwPCS foi então pipetada em tubos centrífugos cônicos de 15 ml, estéreis separados contendo um pequeno orifício de ventilação de CO2. PREPARAÇÃO DA LEVEDURA A levedura de Vermelho de Etanol RED STAR® secada por congelamento foi reidratada em meio IOx YP por 30 minutos em 32°C. Ela foi dosada nas fermentações em uma dose de 0,2 g/litro. DOSAGEM/DESTOXIFICAÇÃO

PCS não lavado, filtrado, foi destoxificado por 19 horas com o uso das condições ótimas para cada enzima. Para a amidase, o pH da fuw/PCS foi primeiro ajustado até 7,0 com o uso de NaOH, a amidase foi adicionada nas dosagens testadas, e os tubos foram incubados em 37°C. O pH da FuwPCS foi então reajustado e 5,0 com o uso de H2SO4 antes da fermentação. Quanto à anidrase carbônica, o pH foi deixado em 5,0, a enzima foi adicionada e os tubos foram incubados em 37°C. Todas as enzimas foram diluídas com água deionizada antes da dosagem. As faixas de dosagem para cada enzima foram como segue, em unidades/ml da solução final para a amidase e quilounidades/ml para a anidrase carbônica.

Amidase 7,0/3 7°C 0,3-1,1-5,4-16,1 (quilounidades/ml) 1,0-3,9-19,6-58,5 (unidades/g de TS) Anidrase Carbônica 5,0/37°C 0,7-3,3-16,6-33,3 (unidades/ml) Anidrase 4,9-24-121-243 (quilounidades/g de TS FERMENTAÇÃO

Um total de 3,5 gramas de amostra foi fermentado para cada

tratamento e o pH inicial para todas as fermentações foi de 5,0. Os tratamentos foram desenvolvidos em triplicata. O nível de TS final foi de 13,7 % em peso. Estas fermentações foram desenvolvidas em uma temperatura mais elevada de 37°C.

RESULTADOS

As amostras de fermentação foram coletadas após 12 e 24 horas e analisadas quanto ao etanol, com o uso de um Sistema de HPLC Agilent com uma coluna analítica BIO-RAD Aminex HPX-87H e uma coluna de proteção de recarga BIO-RAD Cation-H. Os resultados são apresentados nas Figuras 3 a 6. Os resultados quanto à amidase mostram um efeito significativo de reforço sobre a produção do etanol pela levedura para todas as doses de enzima testadas tanto após as 12 horas quanto as 24 horas de 5 fermentação. Os resultados da anidrase carbônica mostram efeitos significativos de reforço para a dose mais elevada da enzima tanto após as 12 horas quanto as 24 horas de fermentação.

Claims

1. Processo para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose, caracterizado pelo fato de que o material pré-tratado contendo lignocelulose é submetido a um composto selecionado do grupo consistindo de: (a) composto capaz de se ligar a produtos pré-tratados de degradação da lignocelulose; (b) composto capaz de se ligar a ácido acético; (c) amidase; e - anidrase; ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o(s) composto(s) de destoxificação é(são) capaz(es) de ligar produtos pré-tratados de degradação da lignina e/ou produtos de degradação da hemicelulose.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a hemicelulose é selecionada do grupo consistindo de xilano, galactoglicomanano, arabinogalactano, arabinoglicuronxilano, glicuronoxilano e derivados e combinações destes.

4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a amidase é selecionada do grupo de Aminopeptidase B (EC 3.4.11.6), Citosol alanila aminopeptidase (EC3.4.11.14), Dipeptidil-peptidase II (EC 3.4.14.2), Dipeptidil-peptidase III (EC3.4.14.4), Dipeptidil-peptidase IV (EC 3.4.14.5), Peptidil-glicinamidase (EC3.4.19.2), Ômega-amidase (EC 3.5.1.3), Amidase (EC 3.5.1.4), Arilformamidase (EC 3.5.1.9), Penicilina amidase (EC 3.5.1.11), Aril- acilamidase (EC 3.5.1.13), Aminoacilase (EC 3.5.1.14), Nicotinamidase (EC 3.5.1.19), 5-aminopentanamidase (EC 3.5.1.30), Alquilamidase (EC 3.5.1.39), Acilagmatina amidase (EC 3.5.1.40), Formamidase (EC 3.5.1.49), Pentanamidase (EC 3.5.1.50), N-carbamoilputrescina amidase (EC 3.5.1.53), Ν,Ν-dimetilformamidase (EC 3.5.1.56), Triptofanamidase (EC 3.5.1.57), N- carbamoilsarcosina amidase (EC 3.5.1.59), 4-metilenoglutaminase (EC3.5.1.67), D-benzoilarginina-4-nitroanilida amidase (EC 3.5.1.72), Camitinamidase (EC 3.5.1.73), Arilalquil acilamidase (EC 3.5.1.76), Glutationilespermidina amidase (EC 3.5.1.78), Ftalil amidase (EC 3.5.1.79), Mandelamida amidase (EC 3.5.1.86), L-lisina-lactamase (EC 3.5.2.11), Fosfoamidase (EC 3.9.1.1), N-sulfoglicosamina sulfo-hidrolase (EC 3.10.1.1), Ciclamato sulfo-hidrolase (EC 3.10.1.2).

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a anidrase é uma anidrase carbônica.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é realizado em um pH abaixo de 7, preferivelmente abaixo de 6, especialmente entre 1 e 3, tal como ao redor de pH 2.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o composto para destoxificar o material pré-tratado contendo lignocelulose contém grupos hidroxila de radicalização e um grupo de ácido carboxílico esterificável.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o composto de destoxificação tem um grupo de ácido carboxílico que pode reagir com compostos fenólicos de lignina e/ou seus produtos de degradação.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o composto de destoxificação é ácido gálico.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que um catalisador se acha presente junto com o composto de destoxifícação, durante a destoxificação.

11. Processo para produzir um produto de fermentação do material contendo lignocelulose, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) pré-tratar o material contendo lignocelulose; (b) destoxificar; (c) hidrolisar; (d) fermentar com o uso de um organismo de fermentação, em que a destoxificação na etapa (b) é realizada como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um ou mais compostos de destoxificação são adicionados ao material lignocelulósico pré-tratado, na etapa (b).

13. Processo de acordo com as reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a destoxificação na etapa (b) e a hidrólise na etapa (c) são realizadas simultânea ou seqüencialmente.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que a destoxificação na etapa (b) é realizada separadamente, e a hidrólise na etapa (c) e a fermentação na etapa (d) são realizadas simultaneamente.

15, Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que todas as etapas (b), (c) e (d) são realizadas simultaneamente.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que o material contendo lignocelulose é química e/ou mecanicamente pré-tratado na etapa (a).

17. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ácido gálico, uma amidase e/ou uma anidrase é(são) usado(s) como composto(s) de destoxificação, preferivelmente pela adição antes, durante ou após o pré-tratamento na etapa (a).

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações .11a 17, caracterizado pelo fato de que a hidrólise na etapa (c) e a fermentação na etapa (d) são realizadas simultaneamente (processo SHF) ou seqüencialmente (processo HHF).

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações11a 18, caracterizado pelo fato de que o produto da fermentação é um álcool, preferivelmente etanol.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações11a 19, caracterizado pelo fato de que um catalisador se acha presente junto com o composto de destoxificação.

21. Uso de um composto contendo grupos de hidroxila de radicalização e um grupo de ácido carboxílico esterificável, caracterizado pelo fato de ser para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto é ácido gálico.

23. Uso de uma amidase, caracterizado pelo fato de ser para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose.

24. Uso de uma anidrase, caracterizado pelo fato de ser para destoxificar material pré-tratado contendo lignocelulose.