BRPI0720596A2 - Métodos in vitro para a indução e manutenção de linhagens celulares vegetais em suspensão como células individuais com paredes celulares intactas e para a transformação das mesmas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS IN VITRO PARA A INDUÇÃO E MANUTENÇÃO DE LINHAGENS CELULA- RES VEGETAIS EM SUSPENSÃO COMO CÉLULAS INDIVIDUAIS COM PAREDES CELULARES INTACTAS E PARA A TRANSFORMAÇÃO DAS MESMAS".

Referência Cruzada a Pedido Relacionado

Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório de núme- ro de série 60/878.028, protocolado em 29 de dezembro de 2006.

Campo da Invenção

A invenção refere-se em parte ao campo da propagação de li- nhagens celulares vegetais, incluindo métodos para a propagação de células vegetais em suspensão como células individuais.

Antecedentes da Invenção

Was duas últimas décadas aconteceu uma rápida emergência da tecnologia de engenharia genética de vegetais acompanhada de grandes avanços no desenvolvimento de processos de cultivo celular vegetal em grande escala para a produção de metabólitos secundários úteis. Desde 1995 (Moffat, 1995; Ma et ai, 2003), tais cultivos em suspensões de células vegetais são cada vez mais usados como sistema celular hospedeiro valioso para a expressão de proteínas recombinantes.

Tecidos calosos ou suspensões induzidos pela auxina, a despei- to da sua origem em tecidos individuais, em geral contêm células com uma variedade de fenótipos. Assim, linhagens transgênicas desenvolvidas a partir de tais tipos celulares são via de regra altamente heterogêneas e apresen- tam níveis de expressão inconsistentes. Clones produtores de muitos meta- bólitos secundários úteis foram obtidos, portanto, de protoplastos individuais, isto é, a um clone celular com grande capacidade de produção de shikonin preparado a partir de protoplastos do Lithospermum erythrorhizon (Maeda et ai, 1983).

Até o momento, foi necessário formar protoplastos para desa- gregar células não apenas para a seleção de células, mas também para a transformação mediada por eletroporação/PEG de células vegetais cultiva- das. A preparação de protoplastos tem sido necessária para o isolamento de clones celulares individuais de tecidos vegetais. Contudo, é em geral difícil os protoplastos regenerarem suas paredes normais, uma vez que protoplas- tos isolados geralmente têm seu desenvolvimento interrompido e relutam em 5 se dividir (Hahne e Hoffmann, 1984). Em muitos estudos de protoplastos cultivados, o primeiro e maior polissacarídeo gerado foi a calose, que é composta de 1,3-,8-glicopiranoses (Klein et ai, 1981).

Plantas feridas ou estressadas frequentemente secretam mas- sas desse glicano nos espaços periplásmicos (Currier, 1957). Durante os 10 estágios iniciais da regeneração da parede, a ligação entre a celulose e os xiloglucanos não é tão forte como em plantas intactas (Hayashi et ai, 1986). Uma vez que a organização macromoIecular do xiloglucano e da celulose nas paredes celulares primárias parece ser responsável pela força e exten- sibilidade (Hayashi e Maclachlan, 1984), o acúmulo de xiloglucano assim 15 como de celulose ao redor dos protoplastos parece ser fundamental para a sua divisão e potencial de crescimento. Esse pré-requisito interrompe a divi- são do protoplasto, aumentando assim o tempo de regeneração em células normais com as características celulares das linhagens de origem.

Um desafio técnico que perdura, portanto, no campo do cultivo 20 de células vegetais, é isolar células individuais viáveis que possam ser clo- nadas a partir de tecido vegetal em cultura (Bourgin, 1983; Tabata et ai, 1976). Em cultivos em suspensão, agregados celulares não uniformes sem- pre se formam e cada um de tais agregados contém até centenas de células. Nada se sabe sobre as ligações entre essas células agregadas e não houve 25 relatos identificando uma única enzima que possa dissociar agregados celu- lares e mantê-los como células individuais in vitro com paredes celulares intactas.

O papel da pectina nas propriedades adesivas das células foi sugerido em vários relatos, mas tal conexão foi estabelecida um tanto mais recentemente (Bouton et ai, 2002). Além disso, fortes reduções das proprie- dades adesivas celulares foram relatadas (Sterling et ai, 2006).

Os mutantes qual-1 apresentaram células de raiz individuais destacadas (Bouton et ai, 2002). O teor reduzido de pectina foi corroborado ainda por experimentos de imunofluorescência com anticorpos contra epíto- pos pécticos específicos. Essas observações sugerem que a enzima codifi- cada pode estar envolvida na síntese de polissacarídeos pécticos e indica- 5 ram claramente que a pectina está envolvida nas propriedades adesivas das células vegetais.

Assim, a interrupção da síntese da pectina de maneira a remo- ver as propriedades celulares adesivas pode facilitar a separação das célu- las. Foi relatado que o isolamento de células com tratamentos enzimáticos 10 de dose única de degradação da pectina (Naill, 2005) auxiliam no isolamento de células individuais em cultivos de células de Taxus em suspensão. Tais células individuais de Taxus são usadas para selecionar linhagens clonais de elite com níveis mais altos de produção de taxol. Este método, entretanto, não é útil na manutenção de células individuais em suspensão na presença 15 contínua da enzima no meio. Além disso, o mais alto rendimento de células individuais com tais tratamentos enzimáticos de tão curta duração foi de a- penas 17,1% a 34,4% (Naill, 2005). O tratamento contínuo com pectinase em suspensões de arroz resultou apenas em agregados em solução finos a concentrações de 0,005%, mas não ajudou a manter a suspensão como cé- 20 lulas individuais (Lee et ai, 2004). Tratamentos prolongados com combina- ção de enzimas, pectinase e celulase por mais do que 8 horas resultaram em Iise celular (Naill, 2005).

Relatou-se que a separação celular em culturas de células de soja em suspensão é aumentada na presença da colchicina (Umetsu et ai, 25 1975). Para fins de separação celular, o alcalóide foi adicionado ao meio de cultura a concentrações mais baixas (0,1-1,0 mM) do que aquelas usadas na produção de poliploidia cromossômica (5-20 mM). Apesar disso, a colchicina inibe a mitose em células vegetais e animais (Lewin, 1980). A colchicina se liga à tubulina e impede a montagem dos microtúbulos. Assim, para obter a 30 separação celular, a concentração da colchicina e o tempo de tratamento com ela deveriam ser tão baixos quanto possível.

Alcalóides como a colchicina têm sido usados para a sincroniza- ção do crescimento em cultivos de células humanas aos quais os alcalóides são geralmente adicionados a 0,5 mM e as células em geral têm seu cresci- mento no prazo de poucas horas, antes da mitose. Ainda que o efeito morfo- gênico seja bastante similar àquele visto em células animais, células vege- 5 tais podem se dividir durante o crescimento na presença de colchicina a 0,1 mM (Umetsu at ai, 1975). A viabilidade celular diminuiu após 4 dias de culti- vo de células de soja em suspensão em 1 mM de colchicina. Além disso, apenas 44,8% das células eram viáveis nestes tratamentos, mas foi possível mantê-las se dividindo, ao contrário do ocorrido com células animais.

Foi investigado o uso de inibidores da despolimerização da tubu-

Iina ou de oligossacarídeos na manutenção de células individuais em sus- pensão de cultivos vegetais in vitro. A literatura tem algumas informações desde 1975 sobre o uso de colchicinas para a separação celular; ver a se- ção de referências, abaixo. Inibidores de tubulina como herbicidas também foram investigados.

A produção de eventos transgênicos de elite e sua recuperação dependem intensamente do desenvolvimento tecnologias capacitadoras. Os métodos atualmente à disposição para a transformação de agregados celu- lares em suspensão são métodos mediados pelo Agrobacterium e pelo 20 Whiskers. Métodos envolvendo o Agrobacterium apresentam uma taxa de integração basal de até 67-90%, o que torna este processo muito ineficiente, enquanto a transformação mediada por WHISKERS® não funciona como processo de alta capacidade de produção (HTP). O método mediado pelo PEG é sempre usado com protoplastos e os protoplastos do tabaco, ainda 25 que fáceis de transformar, não são se adéquam facilmente a processos de transformação HTP devido a problemas com a regeneração das paredes celulares.

A técnica parece se silenciar no que refere-se a protocolos para transformações baseadas em cultivos de células individuais em suspensão. Há diversos relatos de protocolos baseados em protoplastos, mas estes, diferentemente das suspensões de células individuais de células vegetais, não possuem paredes celulares, como discutido abaixo. Breve Sumário

A presente invenção proporciona métodos simples e consisten- tes para decompor agregados celulares em células individuais com paredes celulares primárias intactas. A revelação a seguir discute a separação celular 5 de agregados celulares em suspensão cultivados em meio contendo enzi- mas causadoras da degradação da pectina ou compostos despolimerizado- res da tubulina, incluindo a colchicina.

A presente invenção também se refere a novos usos de compos- tos para tais fins.

Um aspecto da presente invenção se refere à transformação das

células isoladas em questão. Tais processos simplificam e integram proces- sos de transformação e seleção baseados em células individuais em proces- sos de trabalho de geração de eventos transgênicos e transplastômicos. A presente invenção também elimina restrições técnicas e produz linhagens

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15 transgênicas sem marcadores e de expressão uniforme que apresentam alta capacidade de produção para atender a várias necessidades das platafor- mas de saúde animal, biofarmacêutica e proteção de traços e plantações. Breve Descrição das Figuras

Figura 1: isolamento de células JTNT1 individuais com paredes

20 celulares intactas em tratamentos contínuos com pectoliase subcultivadas no meio por 7 dias.

A - suspensão normal de BY2; B - mesmo que A, mas com as células coloridas com I2KI para demonstrar a agregação das células; CeD - células separadas após 6 dias de tratamento enzimático contínuo; EeF-

25 células individuais separadas com e sem coloração com I2KI. Nota-se a divi- são celular normal (F).

Figura 2: viabilidade das células BY2 após 6 dias de tratamento contínuo com pectoliase (células tratadas com FDA e IP) e a produção de células individuais.

A: agregados de células BY2; B: células BY2 em 1 ml de inóculo

em pectoliase no meio por 5 dias; C: 6 ml de inóculo com enzima no meio no dia 5; D, E e F: fotos por microscópio de C; G: aglomerados de controle com variante da célula BY2 desenvolvida em BAP e sacarose a 12%; Hei: célu- las individuais de G após tratamento enzimático contínuo por 5 dias. Células coloridas em FDA e IP. Note as células mortas em Pl coloridas em vermelho.

Figura 3: indução de suspensão de células individuais de trata- 5 mentos de 7 dias com adição de colchicina ao meio a partir de suspensões de agregados de células BY2 e de tabaco Xanthi.

A: agregado normal de células BY2 em suspensão (colorido com calcofluor); B: suspensão de células BY2 individuais em 1 mM de colchicina por 7 dias; C: o mesmo que B1 mas aumentado para mostrar células indivi- 10 duais com paredes celulares intactas; D: agregados celulares de Xanthi; E: agregados de Xanthi em suspensão tratados por 7 dias em 0,5 mM de col- chicina. Nota-se a liberação parcial de células individuais em 0,5 mM; F: cé- lulas individuais de Xanthi separadas em 1 mM de colchicina.

Figura 4: liberação de células individuais com paredes celulares intactas em tratamentos com colchicina a partir de agregados de células de tabaco BY2 e Xanthi em suspensão.

A: agregados normais de BY2 em suspensão; B: suspensão de células BY2 individuais em 1 mM de colchicina por 7 dias; CeD: recupera- ção de células de volta em agregados após remoção da colchicina (4 dias 20 após subcultivo com 1 ciclo de cultivo de tratamento com colchicina); E: a- gregados de Xanthi em suspensão; F: agregados de Xanthi em suspensão tratados por 7 dias em 1 mM de colchicina. Notam-se as células individuais liberadas nos cultivos de BY2 e Xanthi e a presença da parede celular intac- ta na presença do alvejante óptico calcoflúor. (Todas amostras tratadas com 25 calcoflúor a 0,1 % e examinadas ao microscópio fluorescente Leica).

Figura 5: liberação de células individuais viáveis com paredes celulares intactas em tratamentos com colchicina da variante BY2 do tabaco (aclimatadas em meio com sacarose a 12%) e agregados de Orelha-de- Macado em suspensão.

A: agregados de BY2-V normais em suspensão; B: visão apro-

ximada dos agregados não-tratados; C, D e E: indução de células BY2 indi- viduais em suspensão em 1 mM de colchicina por 7 dias (células sob maqni- ficação de 10x, 20x e 40x); F: indução de células individuais em suspensão de Orelha-de-Macaco em 1 mM de colchicina, tratamento de 7 dias. Todas as amostras tratadas com FDA e Pl e examinadas sob microscópio fluores- cente Leica. Nota-se a alta viabilidade das células vistas aqui na coloração com FDA e com pouquíssimas células coloridas em vermelho pelo PI.

Figura 6: efeito do DAS-PMTI-1, um derivado patenteado do metilindol da Dow Agrosciences (DAS) e potente herbicida inibidor dos mi- crotúbulos sobre o crescimento das células NT1 do tabaco. As células foram cultivadas na ausência ou presença de 25 ou 50 nM de DAS-PMTI-1 em 10 meio NT1B com glicerol a 3% como fonte exclusiva de carbono. Todos os valores de peso úmido representam a média de ± 0,18 das amostras repli- cadas.

Figura 7: produção de células individuais e de colônias a partir das linhagens em suspensão DAS GAD1762-034.

Figuras 8A, 8B e 8C: cultivo por 2-6 semanas de colônias a par-

tir de células DAS GAD1762-034 individuais.

Figura 9: amostras coletadas a 7 e 13 dias para mais de 4 ciclos de subcultivo e análises de expressão realizadas. Os dados de expressão foram postos em gráfico.

Figura 10: células BY2 individuais isoladas com o DAS-PMTI-1.

Uma concentração de 20-50 nM foi usada para produzir células individuais após 5 dias de subcultivo. Nota-se que as células são células individuais (o partem extremidades sobrepostas) e que a imagem foi feita sob microscópio de contraste por interferência diferencial acoplado a um sistema de imagens confocal.

Figura 11: expressão da YFP (plasmídeo UbilO-YFP) após 72h de tratamento com PEG. Uma das pequenas células filhas (em divisão) no plano de foco mostra a expressão da GFP, indicando que a expressão podia ser estável.

Figura 12: esquerda - tecido de controle não-tratado inibido por

100 mg/l de canamicina; direita - célula individual derivada de provável iso- lado transplastômico em crescimento no meio de seleção. Figura 13: produção de linhagens clonais a partir de suspensões de células individuais de cenoura. O crescimento de gramado no meio M plaqueado com agregados em suspensão não tratados (painel A). O cresci- mento de colônias separadas no meio plaqueado com as células individuais 5 (painel B).

Figura 14: tratamento com 0,5-1 mM de colchicina em meio lí- quido e cultivos analisados a 14 dias após o início do subcultivo (final do se- gundo ciclo de subcultivo). A: as células individuais são liberadas dos agre- gados; B: agregado com células agrupadas de maneira compacta coloridas 10 com coloração vital FDA; CeD: células individuais coloridas com FDA libe- radas em tratamento com 1 e 0,5 mM, respectivamente, após filtragem da suspensão (mediante filtros com poros de 100 um de diâmetro); EeF: visão mais aproximada das células de D.

Figura 15: curva de crescimento das células JTNT1 individuais em resposta aos IMIs.

Descrição Detalhada

A capacidade de isolar e cultivar células individuais tem numero- sas aplicações possíveis. Por exemplo, os métodos aqui descritos têm utili- dade no aperfeiçoamento de processos relacionados com a produtividade de culturas de células vegetais para aplicações ligadas à saúde animal.

Dessa maneira, os métodos da presente invenção são úteis para aumentar a eficiência de processos relacionados com produtos baseados em células vegetais ligados à saúde animal e à biofarmacêutica. Modalida- des da presente invenção podem auxiliar na seleção de clones de elite de 25 linhagens celulares transgênicas, como na inicialização de cultivos celulares em minissuspensão, na minimização da variação lote a lote, para desenvol- ver Protocolos de Operação Padrão (POPs) para sistemas de transformação baseados em células individuais para minimizar ou eliminar células não- transgênicas em agregados. Em suma, aspectos desta invenção são úteis 30 na seleção de processos HTP (processos de alta capacidade de produção) ligados à saúde animal e programas de aperfeiçoamento de linhas celulares hospedeiras. A presente invenção também exemplifica e permite o desenvol- vimento posterior de testes baseados em células individuais e processos de seleção de células para identificar células de expressão estável com base na expressão de RNA conjugada com sondas fluorescentes de resfriamento celular.

Tais células individuais também são úteis em análises temporá- rias de recombinação homóloga sítio-direcionadas no lugar do sistema tem- porário atual com base em protoplastos. Suspensões de milho Black Mexi- can Sweet (BMS) e de canola, por exemplo, podem proporcionar sistemas 10 individuais para tais aplicações. Assim, a recombinação homóloga direcio- nada, por exemplo, pode ser usada em modalidades da presente invenção. Este tipo de tecnologia é o tema, por exemplo, do WO 03/080809 A2 e do pedido publicado correspondente (USPA 20030232410) que se refere ao uso de dedos de zinco para fins de recombinação direcionada. O uso de re- 15 combinases (cre-lox e flp-frt, por exemplo) também é conhecido na técnica.

Sistemas de expressão vegetais in vitro podem ser usados na produção de proteínas recombinantes úteis nos campos farmacêutico e da saúde animal. Uma vantagem-chave de tais sistemas de expressão vegetais é que eles são eucarióticos por natureza — possuem sistemas endomem- 20 branosos e vias de secreção similares aos das células de mamíferos. Por- tanto, proteínas complexas são em geral dobradas eficientemente e monta- das com modificações pós-tradução apropriadas.

Outro benefício de sistemas de produção vegetais é o potencial para aumento da escala. Quantidades virtualmente ilimitadas de proteínas 25 recombinantes podem ser cultivadas seja em tecido verde contido, seja em instalações industriais de grande escala usando-se sistemas de fermentação ou biorreatores após a seleção de clones de expressão de elite e expansão de tais linhagens celulares de expressão homogênea.

Duas estratégias para a produção de células individuais são aqui exemplificadas. Ambas foram bem-sucedidas na separação de células indi- viduais viáveis. Contudo, o método com colchicina é preferido ao método de degradação enzimática na obtenção de um grande volume de suspensão de células individuais com paredes celulares intactas pelo menos em dois tipos celulares em suspensão. O método enzimático apresentou não apenas inibi- ção do crescimento celular, mas também um grau de mortalidade maior. A- lém disso, quando células viáveis foram plaqueadas no meio sob a forma de 5 gel sem remoção ou lavagem do meio usado, as células morreram e não foi observado crescimento de colônias. Recomenda-se que o uso de tais sus- pensões de células individuais produzidas pelo método de degradação en- zimática pode ser usado, mas precisa ser mais otimizado.

Em contraste, a adição de inibidores da tubulina, como a colchi- cina, testados neste estudo, parece ser muito útil na separação das células vegetais e na seleção de células individuais. Este método é simples, na me- dida em que envolve apenas a adição de um volume apropriado de colchici- na ao meio líquido durante o estágio de subcultivo. Isto será uma ferramenta fundamental que será de grande importância para uma dada suspensão em processo tal como a inicialização de cultivos em minissuspensão com inócu- lo uniforme de células altamente viáveis como células iniciais. A técnica po- deria aumentar a eficácia das transformações mediadas por eletroporação, Whiskers® e Agrobacterium. Tal preparado de células individuais poderia ser usado também para isolar clones de elite de linhagens produtoras de proteí- nas recombinantes a partir dos agregados transgênicos em suspensão.

Ainda que o método com protoplastos tenha sido usado no iso- lamento de células individuais, o método com colchicina em questão é mais fácil e mais poderoso. Células individuais obtidas por meio dele são mais estáveis do que os protoplastos devido à presença das paredes e não exi- 25 gem a regeneração das paredes celulares. As células têm paredes com composição normal da rede de xiloglicanos/celulose (Hayashi e Maclachlan, 1984). Elas não produzem calose durante a expansão e a separação celular, tal como verificado nas observações nas quais células de muda de pinheiro, alongando-se na presença da colchicina, não apresentam espessamento 30 anormal das paredes, mas se alargam radialmente (Itoh, 1976). O cresci- mento das células é normal após o subcultivo em meio sem colchicina, en- quanto a maioria dos protoplastos tem seu desenvolvimento interrompido e relutam em se dividir (4). As células cultivadas com colchicina podem apre- sentar certo grau de poliploidia. As concentrações de colchicina usadas nes- te estudo (0,1-1,0 mM), contudo, foram 10 a 100 vezes menores do que as necessárias (5-20 mM) para a indução da poliploidia. A recuperação de célu- 5 Ias individuais foi muito melhor com o método com colchicina do que com protoplastos (Hayashi e Yoshida, 1988). As células em questão podem ser submetidas a testes adicionais com citometria de fluxo para avaliação do nível de poliploidia e da estabilidade do genoma. Além disso, níveis aumen- tados de ploidia poderiam proporcionar o benefício adicional de aumento do 10 nível de proteínas recombinantes mediante os maiores números de cópias das células transformadas.

A atividade da galacturonana apresentou funções biológicas de separação celular em células de soja em suspensão e ela é descrita como oligossacarina, uma vez que apresentou tais funções (Albersheim e Darvill, 15 1985). Assim, o ácido galacturônico também é testado nessas células em suspensão para se obter separação celular sem qualquer alteração na ploi- dia caso seja observada qualquer alteração da ploidia induzida pela colchici- na nas suspensões de células individuais aqui descritas. Portanto, o uso di- reto da galacturonana e outras oligossacarinas similares continua a ser ava- 20 liado para se comparar a eficiência da separação celular pela eliminação das propriedades adesivas das células. Assim, a presente invenção proporciona métodos simples que são reproduzíveis e consistentes por várias rodadas de ciclos de suspensão celular, enquanto as células mantêm ao mesmo tempo estabilidade genômica.

Um composto preferido aqui exemplificado é o DAS-PMTI-1. Es-

te composto parece ser muito potente (-100-1000X do que a colchicina no que refere-se ao efeito sobre o crescimento dos cultivos). Após 7 dias de tratamento, há considerável morte celular em uma concentração de 0,5 mM, mas quando esses cultivos são subcultivados na ausência do DAS-PMTI-1, 30 as células em suspensão se recuperaram como células individuais com bai- xa frequência após 2 semanas. Maior otimização pode ser realizada para que sejam determinadas as concentrações preferidas deste composto de- pendendo das aplicações preferidas (tais como tipos de células e afins) para a separação de células individuais. Outros inibidores IMI com funções seme- lhantes podem ser usados nas separações celulares em questão mediante suspensão da síntese da pectina. À Iuz da presente revelação, inibidores IMI adicionais e análogos dos mesmos podem ser testados e selecionados pela sua eficácia na produção e manutenção de células individuais.

A estrutura química do DAS-PMTI-1, também conhecido como etil éster de ácido 4-cloro-1,5-difenil-1H-pirazol-3-ilóxi)-acético é como se- gue:

o

Um gênero preferido de compostos para uso de acordo com a

presente invenção são compostos tipo DAS-PMTI-1. Tais compostos podem estar em conformidade com a estrutura geral proporcionada acima e incluem derivados funcionais (para uso de acordo com a presente invenção) e análo- gos dos mesmos.

Segue abaixo uma fórmula química geral de alguns inibidores

conhecidos da microtubulina para uso de acordo com a presente invenção. Enquanto o DAS-PMTI-1 é uma modalidade preferida, praticamente qual- quer agente inibidor da microtubulina pode ser usado de acordo com a pre- sente invenção. Em algumas modalidades preferidas, um ou mais membros 20 do gênero diarilpirazol a seguir são usados em combinação com a colchici- na:

Al em que

X - CO2R5 CH2CO2R3 CH2CH2CO2R5 (CH2)3CO2R, OCH2CO2R, OCH(CH3)CO2R, OC(CH3)2CO2R5 CH2OCH2CO2R5 CH2CH(CO2CH2CH3)CO2Rs ou 0CH(C02CH2CH3)C02R Y = CN, Cl, Br, F5 ou NO2

Ari = fenila não-substituída, piridina não-substituída, 1,3 fenila substituída, 1,3 piridina substituída, substituída por halogênio ou CN 5 Ar2 = fenila não-susbstituída, piridina não-substituída, 1,3 fenila

substituída, 1,3 piridina substituída, substituída por halogênio ou CN R = H ou 1-5 carbonos de éster linear ou ramificado Assim, cultivos de células vegetais individuais em suspensão foram produzidas usando-se inibidores dos microtúbulos que podem ser mantidos por pelo menos dois ciclos de subcultivo. Essas suspensões de células individuais são únicas na medida em que apresentam paredes celu- lares intactas, ainda que existam separadamente umas das outras.

Uma planta "transgênica", célula vegetal e similares (a não ser que de outra maneira especificado), uma planta completa, um cultivo de cé- lulas vegetais, uma linhagem de células vegetais, um cultivo de tecido vege- tal, planta inferior, cultivo de células vegetais de monocotiledônea, cultivo de células vegetais de dinocotiledônea ou progênie dos mesmos derivam de uma célula vegetal transformada (ou protoplasto ou afim) que contém DNA exógeno, introduzido por técnicas de laboratório, não originalmente presente em uma célula vegetal nativa não-transgênica da mesma espécie. Os termos "planta transgênica" e "planta transformada" foram algumas vezes usados na técnica como sinônimos para definir uma planta cujo DNA contém uma molécula de DNA exógeno. Uma planta transgênica pode ser estavelmente transformada para conter DNA exógeno que funcione dentro e seja incorpo- rado no DNA genômico da planta ou ser uma planta transgênica que foi transformada por vetores de base viral e expressa temporariamente o DNA exógeno.

"Isolado" e "purificado" implicam a "mão do homem" e podem se aplicar a polinucleotídeos e a proteínas. Um polinucleotídeo clonado é um polinucleotídeo isolado, por exemplo.

Métodos de transformação. Testou-se a transformação nuclear e com plastídeos dessas células individuais usando-se Agrobacterium polieti- Ienoglicol (PEG) para a transformação nuclear e para o bombardeio biolístico 5 como objetivo de transformação com plastídeos. Em tentativas de transfor- mação nuclear, foram demonstradas a inserção do DNA do plasmídeo e a expressão temporária da proteína fluorescente amarela. Na transformação com plastídeos, células foram recuperadas e a estabilidade da transforma- ção foi demonstrada por análise por PCR. Isolados de células transplastômi- 10 cas foram expandidos e estão sendo analisados em busca do marcador se- letivo, expressão do marcador nptll por ELISA.

A metodologia de transformação aqui descrita pode ser aplicada a processos relacionados com a saúde animal. Contudo, a transformação com base em células individuais por meio de novos meios de inserção, inclu- 15 indo inserção mediante nanopartículas podem também proporcionar aborda- gens únicas para a transformação de plantas de cultivo além da multiplicida- de dos tipos celulares usados na produção de proteínas recombinantes.

O desenvolvimento da transformação da célula individual em questão por meio de métodos de PEG e/ou eletroporação torna as células individuais com paredes celulares intactas tão conformáveis quanto sistemas de células bacterianas/de mamíferos e também é útil em sistemas de trans- formação de alta produtividade para aqueles tipos celulares.

A capacidade de transformar células individuais tem diversas aplicações possíveis. Por exemplo, os métodos delineados aqui têm utilida- 25 de no aperfeiçoamento de processos relacionados à produtividade de culti- vos de células vegetais para aplicações relacionadas com a saúde animal. Mais uma vez, os processos em questão são úteis para o aumento da efici- ência dos processos referentes à saúde e biofarmacêutica animal no caso de produtos baseados em células vegetais. Os processos em questão po- 30 dem também auxiliar na seleção de clones de elite em linhagens celulares vegetais. Tais aplicações podem ser usados na inicialização de cultivos celu- lares em mini-suspensão com a finalidade de diminuir a variação de expres- são de lote a lote e para desenvolver um POP para minimizar ou eliminar as células não-transgênicas ou a presença de eventos múltiplos em agregados.

Como discutido na seção Antecedentes da Invenção, métodos envolvendo o Agrobacterium são muito ineficazes e a transformação media- 5 da pelo WHISKERS® não serve como processo de alta produtividade. O mé- todo mediado pelo PEG é usado com protoplastos. Ainda que os protoplas- tos do tabaco sejam fáceis de transformar, eles não são facilmente confor- máveis a processos de transformação HTP devido aos problemas da rege- neração da parece celular.

Em contraste, a presente invenção proporciona uma parede ce-

lular intacta. O processo mediado pelo PEG é o primeiro relato de uma célu- la individual com parede celular intacta. Os presentes métodos são altamen- te eficientes. Além disso, esse processo elimina a integração basal usando na transfecção plasmídeos purificados de fragmentos. Um protocolo de 15 transformação rápida envolvendo células vegetais individuais tal como a Se- paração Celular Ativada por Fluorescência (FACS) seria ideal para miniaturi- zação e automação de processos para selecionar eventos apropriados com custo, recursos e prazos reduzidos. Isso poderia melhorar drasticamente os processos atuais de seleção de agregados de calose ou em suspensão me- 20 diante a seleção das células transformadas através de separadores de célu- las e da determinação de eventos de elite de expressão homogênea para desenvolvimento posterior mediante pesquisa industrial ou linhas de produ- ção.

Assim, o presente processo proporciona elementos fundamen- tais para o desenvolvimento da pesquisa e desenvolvimento de bioproces- sos, para a seleção HTP no caso de necessidades referentes à saúde ani- mal e aperfeiçoamento de linhagens de células hospedeiras, por exemplo.

A presente invenção permite desenvolvimentos posterior de aná- lises baseadas em células individuais e de processos para a seleção de cé- lulas com o objetivo de identificar células de expressão estável com base na expressão do RNA conjugada com sondas fluorescentes de resfriamento celular. Tais células individuais são também úteis na análise temporária e/ou estável do Gene de Interesse (GEI) para plataformas de proteção de traços e cultivos.

A não ser quando especificamente indicado ou implicado, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um(a)" conforme aqui utilizados.

Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações aqui referidas ou citadas estão incorporadas por referência na íntegra na medida em que não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório.

EXEMPLO 1 - materiais e métodos

Células BY2 cultivadas em suspensão foram obtidas do tabaco do Japão e mantidas em meio LSBY2 em um ciclo de 7 dias. Suspensão de Orelha-de-Macaco e tabaco Petite Havana foram iniciados a partir de calose 15 iniciada em suspensões de DAS e Xanthi obtidas sob a forma de amostra do Professor Jack Wildholm, da UIUC, llinois. Células JT-NT1 em suspensão, obtidas da Universidade de Washington, mantidas em meio NT1B em um ciclo de 7 dias, foram usadas apenas no estudo da enzima de degradação da pectina para separar as células em células individuais. As células foram 20 cultivadas em frascos agitados a 25-28°C no escuro em agitadores orbitais a 150 rpm. A colchicina foi obtida da Fluka, o DAS-PMTI-1 (Martin et al.,2001; Smith et al., 2001) foi obtido da DAS CRS e as enzimas para degradação da pectina (pectoliase Y e pectinase) da Sigma. Os concentrados dos dois des- polimerizadores da tubulina usados nesta investigação foram dissolvidos em 25 DMSO para preparar 0,5 M de solução-estoque. A concentração testada tan- to no caso da enzima pectinase quanto da enzima pectoliase estava na faixa de 0,0005% a 0,005%. As linhagens celulares de tabaco em suspensão NT-

1 e BY-2, por exemplo, são apropriadas para a prática da presente invenção. As células BY-2 estão comercialmente disponíveis de acordo com Nagata et al., por exemplo (Nagata, T., Nemoto, Y. e Hasezawa S. [1992], Tobacco BY-2 cell Iine as the "HeLa" cell in the biology of higher plants. Intl. Rev. Cy- tol. 132: 1-30). As células NT-1 foram originalmente desenvolvidas a partir da Nicotiana tabacum L.cv. Bright Yellow 2 (BY-2). A linhagem celular NT-1 é amplamente utilizada e prontamente disponível. Qualquer linhagem celular de tabaco em suspensão é, contudo, consistente com a prática da invenção. Vale notar que as origens da linhagem celular NT-1 são obscuras. Ademais, 5 a linhagem celular parece variar e ser dada a alterações em resposta às condições de cultivo. As células NT-1 apropriadas para uso nos exemplos abaixo estão disponíveis na American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC 74840. Ver também a Patente US 6.140.075.

EXEMPLO 2 - observações microscópicas A expansão e a separação celulares foram observadas por mi-

croscopia óptica (microscopia Nomarski e de campo escuro). As células es- féricas e as células individuais foram contadas com um hemacitômetro para determinação do grau de expansão e separação celular, respectivamente. O número de células nos agregados foi determinado mediante tratamento com 15 5% (peso/volume) de trióxido de cromo por 16 h e contagem das células (Henshaw et al., 1966). A viabilidade celular foi determinada pela coloração das células (Yokoyama et al., 1997) com diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídio (IP) em um microscópio fluorescente (fotomicroscópio Zeiss). Para determinar a presença das paredes celulares nestes cultivos de 20 células individuais usou-se alvejante óptico. O calcoflúor, obtido da Sigma, que é um corante fluorescente específico para a celulose, foi usado neste estudo e a formação de complexos de celulose-calcofluor foi observada me- diante microscopia de fluorescência (fotomicroscópio Zeiss). O calcoflúor (Sigma Chemical Co., St. Louis1 MO) foi preparado como uma solução a 25 0,1% (peso/volume) em tampão PBS e armazenado no escuro em tempera- tura ambiente (Kwok et al., 2003). Antes do uso, o corante de calcoflúor foi centrifugado a 15.000 g por 2 minutos para a remoção de precipitados. Uma gota ou duas de solução de calcoflúor foram adicionadas às células separa- das. Após 2 ou 3 minutos à temperatura ambiente, a suspensão celular foi 30 lavada com água e submetida à contracoloração com 0,1% de azul de Evan (Sigma, E-2129) em TBS (pH 7,2) por 1 min à temperatura ambiente e ob- servada em microscópio ultravioleta a uma amplitude de onda de 395 a 415 nm (luz de observação de 455 nm). A parede celular apareceu como halos ovais branco-azulados ou turquesa.

EXEMPLO 3 - resultados de tratamentos contínuos com adição ao meio de pectinase e pectoliase 5 Suspensões de células de tabaco Petite Havana, BY2 e NT1

foram usadas para investigar o efeito de enzimas causadoras da degradação da pectina, a pectinase e a pectoliase, em diferentes concentrações. As sus- pensões de JT-NT1 de fato responderam melhor a tratamentos com pectina- se e a suspensão de BY2 respondeu melhor à pectoliase do que à outra en- zima. Contudo, houve mortalidade celular, visualizada sob a forma de colo- rações vitais e inibição do crescimento dos tipos celulares. O volume de inó- culo de células no estágio de subcultivo foi aumentado até 12 vezes para uma produção apropriada das células individuais. As células PH (Petite Ha- vana) e BY2 puderam ser cultivadas por pelo menos 7 dias em cultivo com pectoliase. O cultivo contínuo dessas células em baixa concentração da en- zima pectoliase (3 unidades ativas) pareceu ser prejudicial. Essas células, no sexto dia de cultivo, produziram numerosas células individuais quando o volume de inóculo era de 6 ml (volume inicial de inóculo na fase estacioná- ria) e cultivadas em 50 ml de meio fresco junto com a enzima. Essas células, quando testadas com FDA e IP após 6 dias de cultivo, demonstraram um número mais alto de células individuais viáveis (Figuras 1 e 2). O cresci- mento da suspensão foi drasticamente afetado nos tratamentos enzimáticos e subcultivar as células no mesmo meio contendo enzima pareceu ser preju- dicial. Recomenda-se que as células poderiam ser tratadas em meio fresco por um período máximo de 7 dias de cultivo e que elas deveriam ser então transferidas para o meio sem a enzima para recuperar o crescimento. Na melhor das hipóteses, esse método poderia ser usado para a seleção de clones transgênicos de elite nos agregados heterogêneos ou para iniciar cul- tivos em suspensão de alta capacidade de produção com volume celular uniforme.

Figura 1: isolamento de células individuais com paredes celula- res intactas a partir de células JTNT1 em suspensão em tratamentos contí- nuos com pectoliase com subcultivo no meio por 7 dias.

A - suspensão normal de células BY2; B - o mesmo que A, mas com as células coloridas com I2KI para mostrar a agregação das células; C e D - células separadas após 6 dias de tratamento enzimático contínuo; E e 5 F- células individuais separadas com e sem coloração com I2KI. Nota-se a divisão celular normal (F).

Figura 2: viabilidade das células BY2 após 6 dias de tratamento contínuo com pectoliase (células tratadas com FDA e IP) e a produção de células individuais.

A: agregados de células BY2; B: células BY2 em 1 ml de inóculo

em pectoliase no meio por 5 dias; C: 6 ml de inóculo com enzima no meio no dia 5; D, E e F: fotos por microscópio de C; G: aglomerados de controle com variante da célula BY2 desenvolvida em BAP e sacarose a 12%; Hei: célu- las individuais de G após tratamento enzimático contínuo por 5 dias. Células 15 coloridas em FDA e IP. Note as células mortas em Pl coloridas em vermelho. EXEMPLO 4 - efeitos das colchicinas sobre o crescimento de células BY2, NT1, Petite Havana (PH)1 Xanthi (Xan) e de Orelha-de-Macaco (JM) em suspensão.

Após 7 dias de cultivo o número de células de BY2, Xan e JM respondeu a concentrações de 0,5 mM e 1mM de colchicinas (Figuras 3, 4 e 5). Contudo, um alto número de células individuais em suspensão foi visto em 1 mM de células BY2 e de células JM em suspensão. Foi significativo notar que o desenvolvimento das células JM foi afetado drasticamente mes- mo em 0,5 mM de colchicina e que o crescimento não pôde ser recuperado mesmo após uma semana adicional de cultivo no mesmo meio. Isso indica que a divisão celular é inibida pela colchicina em células de JM e que con- centrações mais baixas precisam ser testadas para maior otimização da se- paração celular sem redução da densidade ou do crescimento da cultura. O interessante é que tal inibição do crescimento não foi observada em células BY2 em suspensão que puderam ser cultivadas continuamente por pelo me- nos 14 dias na presença de 1 mM de colchicina. Inchamento celular foi ob- servado primeiramente no terceiro dia e as células desenvolveram formas esféricas à medida que o cultivo continuou com células BY2 em suspensão. Uma vez que as células esféricas foram gradualmente liberadas dos agre- gados, presumiu-se que a separação celular era acompanhada por expan- são. Havia quantidades aproximadamente iguais de células BY2 no meio contendo 1 mM de colchicina após 7 dias, como nos cultivos de controle. Quando as células cultivadas por 7 dias em 1 mM de colchicina foram sub- cultivadas em um meio sem colchicina, a capacidade de crescimento como agregados não foi completamente recuperada. Em vez disso, -90% das cé- lulas em suspensão foram vistas como células individuais intactas. A expan- são e a separação celulares também ocorreram parcialmente em agregados celulares em suspensão de todas as outras suspensões celulares testadas em meio contendo 0,5 mM de colchicina. Há resposta de inibição do cresci- mento celular nas suspensões de células JT-NT1 e JM. As células NT1 em suspensão registraram quase 50% de redução do crescimento em 1 mM de colchicina.

Entre estas células, células grandes segregadas foram observa- das semelhantes àquelas de células da raiz epidérmica separadas relatadas nos mutantes qual-1 da pectina (Bouton, 2002). Segregação parcial de célu- las semelhante com formato esférico foi observada em todos os tipos de 20 suspensão celular testados com o DAS-PMTI-1. Contudo, o crescimento ce- lular foi afetado muito significativamente na suspensão tratada com DAS- PMTI-1 em uma concentração de 0,5 mM. Experimentos posteriores podem ser realizados para aperfeiçoar as condições da separação celular com este composto e minimizar a inibição do crescimento celular. Conforme demons- 25 trado por testes de coloração com FDA e PI, há alto grau de viabilidade celu- lar nas suspensões de células BY2 e JM testadas. As células eram muito arredondadas e muitas apresentavam uma projeção semelhante a um bico, indicando a extensão da parede celular das células ativas, possivelmente antes da divisão celular. As células separadas eram grandes, expandidas, e 30 tinham um formato esférico típico do protoplasto. Coloração por calcoflúor foi usada para determinar a presença ou ausência de paredes celulares intac- tas. A Figura 4 mostra a clara presença de parede celular ao redor dessas células arredondadas. A observação dessas células sob o condensador de campo escuro do microscópio mostrou uma espessa parede celular ao redor da célula (Figura 3, painel C). Essas células individuais eram resilientes nos cultivos agitados, uma vez que não havia células mortas devido à ausência 5 da pectina e à presença de células grandes, como observado no teste de coloração vital (Figura 5). Um percentual muito alto de células saudáveis foi observado neste painel. Portanto, é possível usar essas células nos cultivos agitados ou em placas de microtitulação como inóculos com número preciso de células.

Figura 3: indução de suspensão de células individuais de trata-

mentos de 7 dias com adição de colchicina ao meio a partir de suspensões de agregados de células BY2 e de tabaco Xanthi.

A: agregado normal de células BY2 em suspensão (colorido com calcoflúor); B: suspensão de células BY2 individuais em 1 mM de colchicina 15 por 7 dias; C: o mesmo que B, mas aumentado para mostrar células indivi- duais com paredes celulares intactas; D: agregados celulares de Xanthi; E: agregados de Xanthi em suspensão tratados por 7 dias em 0,5 mM de col- chicina. Nota-se a liberação parcial de células individuais em 0,5 mM; F: cé- lulas individuais de Xanthi separadas em 1 mM de colchicina.

Figura 4: liberação de células individuais com paredes celulares

intactas em tratamentos com colchicina a partir de agregados de células de tabaco BY2 e Xanthi em suspensão.

A: agregados normais de BY2 em suspensão; B: suspensão de células BY2 individuais em 1 mM de colchicina por 7 dias; CeD: recupera- 25 ção de células de volta em agregados após remoção da colchicina (4 dias após subcultivo com 1 ciclo de cultivo de tratamento com colchicina); E: a- gregados de Xanthi em suspensão; F: agregados de Xanthi em suspensão tratados por 7 dias em 1 mM de colchicina. Note as células individuais libe- radas nos cultivos de BY2 e Xanthi e a presença da parede celular intacta na 30 presença do alvejante óptico calcoflúor. (Todas amostras tratadas com cal- cofluor a 0,1% e examinadas ao microscópio fluorescente Leica).

Figura 5: liberação de células individuais viáveis com paredes celulares intactas em tratamentos com colchicina da variante BY2 do tabaco (aclimatadas em meio com sacarose a 12%) e agregados de Orelha-de- Macado em suspensão.

A: agregados de BY2-V normais em suspensão; B: visão apro- 5 ximada dos agregados não-tratados; C, D e E: indução de células BY2 indi- viduais em suspensão em 1 mM de colchicina por 7 dias (células sob magni- ficação de 10x, 20x e 40x); F: indução de células individuais em suspensão de Orelha-de-Macaco em 1 mM de colchicina, tratamento de 7 dias. Todas as amostras tratadas com FDA e Pl e examinadas sob microscópio fluores- 10 cente Leica. Nota-se a alta viabilidade das células vistas aqui na coloração com FDA e com pouquíssimas células coloridas em vermelho pelo IP. EXEMPLO 5: produção de células individuais e a influência do DAS-PMTI-1 em meio contendo glicerol como única fonte de carbono

O presente exemplo proporciona outra discussão no que refere- se um novo meio de cultivo com glicerol e o efeito do DAS-PMTI-1 em baixa concentração e as características do cultivo. Os presentes resultados são muito significativos, uma vez que houve relatos anteriores na literatura de que o glicerol mitiga os efeitos da colchicina sobre a ruptura dos microtúbu- Ios da soja; assim, a técnica ensinava a evitar o uso de glicerol nos meios destinados às presentes aplicações. Ver, por ex., Hayashi e Yoshida, 85 PNAS 2618-22 (1988). Além disso, os presentes dados referentes ao glicerol são novos no que refere-se a células vegetais e tais resultados não foram previamente relatados. Três diferentes genótipos de cultivos rápidos de ta- baco foram cultivados de maneira bem-sucedida por vários meses usando- se glicerol a 3% como a única fonte de carbono.

Esse exemplo também proporciona uma curva de crescimento que representa o comportamento do cultivo em duas diferentes concentra- ções de DAS-PMTI-1 em comparação com o tratamento nulo.

Diversas classes de compostos que provocam ruptura dos mi- crotúbulos produzem células individuais. Os compostos incluem agentes que rompem ou inibem os microtúbulos (compostos que se ligam à a- e à β- tubulina) classificados como (i) dinitroanilinas (colchicinas, orizalina, triflurali- na, cloralina) e (ii) N-fenilcarbamatos tais como benzamida, pronamida, ami- da fosfórica, amiprofosmetil (Morejohn e Foskett1 1986; Akashi et al., 1988), assim como os antifúngicos benzamida e zaralamida (Young, 1991), (iii) os fármacos anticâncer paclitaxel (Morejohn e Foskett, 1986), vincristina e vim- blastina e (iv) outros compostos que rompem os microtúbulos e/ou afetam as propriedades da parede celular, tais como os inibidores da síntese de celulo- se e os inibidores do citoesqueleto, tais como o alumínio e a cumarina tam- bém têm testados sua capacidade de produzir células individuais com a for- mação de poucos ou nenhum micronúcleo. Os microtúbulos corticais e mitó- ticos têm diferente sensibilidades e combinações em comparação com os compostos de diferentes classes listados acima ou de uma das classes, mas rompem seletivamente os túbulos na medida em que a divisão celular não é afetada. A propriedade adesiva da célula será, contudo, suficientemente rompida para se levar as células ao estado individual e mantê-las nele sem nenhuma ou com pouca instabilidade genômica.

Foram examinados os efeitos dos inibidores de microtúbulos (I- Ml) sobre o crescimento do tabaco em cultivo em suspensão. Células da fase estacionária do dia 7 (1 ml) foram transferidas para o meio (50 ml) em frascos agitados de 250 ml (Bokros et al., 1993) contendo diferentes concen- 20 trações de 25 a 1000 nM) de IMI e foram cultivadas por 7 dias, no escuro, a 25°C. Tanto os frascos de controle quanto aqueles contendo IMI continham uma concentração final de 0,5 - 0,1% (v/v) de DMSO. O crescimento desses químicos foi avaliado em meio EP12 no caso das células BY2 e em meio NT1B no caso das células BTI-NT1, no qual a fonte de carbono é substituído 25 por glicerol a 3%. A resposta dessas células foi comparada usando-se meio com a mesma composição, mas com sacarose a 3% como fonte de carbono. O meio com glicerol foi usado uma vez que se sabe que o glicerol é um es- tabilizador dos microtúbulos e que as células de tabaco aclimatadas ao glice- rol a 3% não apresentam fenóis quando sob estresse.

A intervalos de 1 dia, amostras de células em tréplica (0,5 ml)

foram sedimentadas mediante curta centrifugação em tubos de microcentri- fugação tarados e os pesos úmidos foram determinados. Os resultados a- presentados na Figura 6 mostram que após um intervalo de 2 dias, as célu- las de controle cresceram rapidamente por 4 dias e então entraram em fase estacionária por volta do dia 6. As células de tabaco cultivadas com 25 nM de DAS-PMTI-1 apresentaram cinética de crescimento similar àquelas do 5 cultivo de controle. Entretanto, os pesos úmidos dessas culturas eram ligei- ramente maiores do que os controles durante a fase estacionária, sugerindo um favorecimento do crescimento com 50 nM de DAS-PMTI-1. As células cultivadas com 0,5-1,0 mM de DAS-PMTI-1 apresentaram inibição completa e morte celular no prazo de 3 dias do início do cultivo mediante exame das 10 células tratadas com FDA e iodeto de propídio sob microscópio fluorescente. Os dados demonstram que o crescimento das células de tabaco é inibido próximo ao limiar de 50 nM, mas concentrações acima de 100 nM causam inibição da mitose e morte celular.

Em contraste com a colchicina, uma dinitroanilina de baixa po- tência para a produção de células individuais, que a uma concentração de 0,25-0,5 mM é eficaz, o DAS-PMTI-1 é muito eficaz em concentrações tão baixas quanto 5-25 nM mesmo na presença do glicerol como fonte de car- bono total tanto no caso das células NT1 quanto no caso das BY2. A faixa de concentração de 25 nM não é eficaz apenas na liberação de células indi- viduais, mas também muito eficiente ao não diminuir a taxa de crescimento das células por um período de 10 dias (Figura 6). De fato, há um ligeiro au- mento da biomassa na fase estacionária do crescimento devido ao fato de essas células individuais sofrerem expansão. As observações microscópi- cas, contudo, não revelaram a presença de micronúcleos nessas células individuais.

Figura 6: efeitos do DAS-PMTI-1 sobre o crescimento das célu- las de tabaco NT1. As células foram cultivadas na ausência ou na presença de 25 ou 50 nM de DAS-PMTI-1 em meio NT1B com glicerol a 3% como fon- te exclusiva de carbono. Todos os valores de peso úmidos representam mé- dias ± 0,18 das células replicadas.

O status de célula individual das células produzidas mediante DAS-PMTI-1 foi analisado sob microscópio confocal e foi claramente confir- mado que se tratava de células individuais, uma vez que se descobriu que elas não estavam unidas.

EXEMPLO 6 - desconvolução de linhagens transgênicas em suspensão e produção de linhagem clonal 5 As suspensões de tabaco normalmente contêm células em a-

gregados ou pequenos aglomerados e são altamente heterogêneas. As célu- las em cultivo podem ser geneticamente idênticas (população homogênea) ou podem apresentar alguma variação genética (população heterogênea). Uma população homogênea de células derivadas de uma única célula de 10 origem é chamada clone. Portanto, todas as células de uma população clo- nal são geneticamente idênticas e altamente homogêneas em termos do caráter celular. As suspensões de células de tabaco BY2 e NT1 são rotinei- ramente utilizadas como sistemas-modelo em muitos laboratórios.

Essas células são prontamente transformadas após a remoção da parede celular (Mathur e Koncz, 1998) seja diretamente mediante bom- bardeio com partículas, seja mediante cocultivo com Agrobacterium tumefa- ciens (An, 1985; Klein et al., 1988; Rempel e Nelson, 1995). Ainda que a transformação das BY2 mediada pelo A. tumefaciens seja realizada rotinei- ramente em muitos laboratórios, descobrimos que a eficácia na obtenção de calos transgênicos varia entre experimentos e depende principalmente da qualidade do cultivo de células BY2. A sincronização de células BY-2 nas fases M e no início da fase G1 origina suscetibilidade 10x maior na transfor- mação estável mediada pelo A. tumefaciens do que células no estágio G2. Além disso, a cepa de Agrobacterium LBA4404 que expressa constitutiva- mente o gene virG (van der Fits et al., 2000) é 2 a 5 vezes mais eficaz na geração de calos transgênicos. Normalmente, cerca de 500 calos transgêni- cos podem ser obtidos de 4 ml de células BY-2 cocultivadas com esta cepa de Agrobacterium, permitindo que programas de seleção de fenótipo sejam realizados. Contudo, os aglomerados ou agregados das linhagens celulares transformadas parecem ter múltiplos eventos transgênicos heterogêneos. Como resultado, há níveis de expressão inconsistentes de um lote de cultivo para o outro. O método com células individuais é empregado na desconvolu- ção da mistura quimérica de células do aglomerado e separá-la em células individuais para identificar eventos clonais. Células individuais produzidas das linhagens de tabaco NT1 em suspensão transgênicas e quiméricas (GAD1762-034) transformadas com o gene marcador seletivo PAT (figuras 7 e 8).

Figura 7: produção de células individuais e de colônias a partir de linhagens celulares DAS GAD1762-034. Figuras 8A, 8B e 8C: cultivo de 2-6 semanas de colônias de células DAS GAD1762-034 individuais.

Cerca de 20 colônias separadas foram selecionadas aleatoria- 10 mente e expandidas em meio de seleção fresco. Linhagens em suspensão foram produzidas a partir dessas colônias e linhagens de cultivo rápido obti- das mediante 6 ciclos de cocultivo de 7 dias cada. A produção de biomassa dessas colônias era consideravelmente uniforme entre as linhagens e pro- duziram 19 linhagens para posteriores análises de proteína.

As amostras foram coletadas nos dias 7 e 13 para mais de 4 ci-

clos de cocultivo e análises de expressão foram realizadas. Os dados de expressão obtidos foram postos em um gráfico (figura 9).

Fica claro a partir da análise dos dados que havia possibilidade de obter diversas linhagens clonais com expressão bem delimitada em di- 20 versos ciclos de cultivo em comparação com a linhagem agregada de con- trole em suspensão n° 34. Além disso, a sublinhagem 17 teve desempenho melhor do que a linhagem de controle em níveis de expressão, indicando que esse processo seleciona a linhagem clonal de elite dentro da população e que o aperfeiçoamento posterior da desconvolução poderia ajudar na ob- 25 tenção de linhagens de elite de expressão uniforme.

EXEMPLO 7 - transformações de cultivos de células individuais em suspen- são

Materiais e métodos

Preparação das células vegetais: três a quatro dias antes da transformação, um cultivo em suspensão de 1 semana de idade é subculti- vado em meio fresco mediante transferência de 2 ml de cultivo de NT1 ou de BY2 em 40 ml de meio NT1B ou LSBY2 em um frasco de 250 ml. A concen- tração dos inibidores de microtúbulos (IMI) foi usada como descrito acima para produzir células individuais. As células individuais foram coletadas ou 4 ou 7 dias após o tratamento inicial com IMI.

Figura 10: células individuais das células BY2 isoladas com 5 DAS-PMTI-1, um derivado do metilindol patenteado da DAS e potente herbi- cida inibidor dos microtúbulos. Uma concentração de 20-50 ml foi usada pa- ra produzir células individuais após 5 dias de subcultivo. Nota-se que as cé- lulas são células individuais (o par tem extremidades sobrepostas) e a ima- gem foi obtida sob microscópio de contraste por interferência diferencial a- 10 copiado a um sistema de imagem confocal.

Quando as células BY2 individuais foram processadas através do citômetro Beckman Flow1 havia 658.250 células viáveis/ml de meio, célu- las viáveis com um diâmetro médio de 10,43 um e um volume de 593,8 um3.

Preparação do Agrobacterium. O construto com a cepa de A- 15 grobacterium tumefaciens LBA4404 contendo o gene YFP (pDAB4613) é armazenado em glicerol a 50% a -80°C. Uma alíquota de 20-500 μΙ do culti- vo concentrado, contendo o vetor de expressão, é usada para iniciar uma cultura líquida diretamente mediante adição de 20-500 μΙ a 30 ml de meio líquido YEP contendo 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de peptona, 5 g/l 20 de NaCI, 10 g/l de sacarose e 50 mg/l de espectinomicina. Realizou-se em seguida incubação por 18-20 horas no escuro a 28°C e centrifugação a 150- 200 rpm até a cultura atingir uma densidade de cerca de 1,5 a OD600.

Cocultivo de células individuais para transformação nuclear: no momento da transformação, 1,0 ml de suspensão de Agrobacterium é 25 adicionado a um frasco contendo 40 ml da suspensão de células de tabaco individuais de 4 a 7 dias de idade (pré-lavadas no meio para remover qual- quer IMI) e misturada por pipetagem para cima e para baixo 5 vezes com uma pipeta de 10 ml. A suspensão uniforme é então transferida em alíquotas de 250 ml para placas de 24 poços embaladas em parafilme e cultivadas no 30 escuro a 25°C sem agitação por 3 dias. Uma alíquota de cerca de 50 μΙ de suspensão foi testada mediante colocação na lâmina do microscópio e bus- ca da expressão temporária da proteína fluorescente amarela (YFP). Tratamento com PEG/DNA de células individuais para trans- formação nuclear: suspensões de agregados de células JT-NT1 foram tra- tadas com 1 mM de concentração final de colchicina (FIuka) em meio NT1B no início do subcultivo e cultivadas por 7 dias a 125 rpm em um agitador or- 5 bital. As suspensões foram cultivadas a 25°C. Ao final do sétimo dia, 1 ml (0,6 OD600) das células individuais foram coletadas do frasco e colocadas em um tudo estéril de 14 ml. 10 ml de meio MaMg (para a composição, ver a Tabela 1, abaixo)foram adicionados e realizou-se centrifugação por 5 min a ~1.000 rpm._

Tabela 1: composição do meio MaMg (transformação mediada pelo PEG) Meio MaMg Volume total do meio Concentração estoque 100 ml MES 0,1 g Manitol 7,3 g MgCI2 15 mM 1,5 ml pH 5,5 O líquido foi decantado e as células ressuspendidas em 300 μΙ

de MaMg. -50 ml de DNA de plasmídeo foram adicionados. A essa mistura de células individuais e DNA, foram adicionados 300 μΙ de PEG 3350 (PEG 3350 a 40% peso/volume, 0,4 M de manitol, 0,1 M de Ca (NO3)2 pH 5-6 fi- nal), misturados lenta e suavemente. Procedeu-se à incubação das células 15 individuais e a mistura de DNA e PEG a temperatura ambiente por 20 minu- tos e então foram adicionados 10 ml de W5 (meio para lavagem) e fez-se agitação por 5 min a -1000 rpm. O líquido foi decantado e foram adiciona- dos 2 ml de meio líquido de base (NT1B) e a suspensão celular foi transferi- da para uma placa de múltiplos poços. Diversas réplicas puderam assim ser 20 transferidas para os poços de placas de 24 poços. Procedeu-se ao teste por 20-24 horas da expressão transitória de YFP mediante a coleta de um volu- me de 50 μΙ da suspensão celular em uma lâmina de microscópio e posterior exame sob microscópio fluorescente com um filtro apropriado (excitação 500/20 nm, diacromo, emissão 535/30 nm).

Eombardeio biolístico das células individuais para a trans- formação com plastídeos: as células BY2 foram tratadas em 20-50 nM de DAS-PMTI-1 em meio EP a 12% para aumentar o número de plastídeos e com 2,4-D ou com a adição de BAP para aumentar o tamanho do plastídeos por 7 dias. Ao final do sétimo dia as células individuais foram coletadas e 2 5 ml da suspensão foram transferidos para o filtro de papel. As células foram mantidas no meio LS BY2 em forma gel por 2 horas para dessecação. Fo- ram bombardeadas cinco placas de linhagens celulares individuais deficien- tes de 2,4-D e cinco placas de linhagens tratadas com BAP. Essas células foram tratadas com 50 nM de DAS-PMTI-1 por 2 semanas e na 3a semana 10 elas foram tratadas com 20 nM de DAS-PMTI-1. As células estavam em bom estado e relativamente saudáveis.

As células foram bombardeadas com pDAB3969 em partículas de ouro de 0,6 pm de acordo com o protocolo padrão usando-se o canhão biolístico (BioRad). Elas foram transferidas para o LS-BY2 com sacarose a 12% + 100 mg/l de canamicina e a seleção foi realizada após dois dias de recuperação em meio sem o agente de seleção.

Resuitados e Discussão

Tentativas de transformação nuclear. As tentativas de transformação com PEG (figura 11) e Agrobacterium (figura 3) claramente mostraram frequên- cias de expressão similares. Em uma alíquota de 50 ml de células analisada, havia 2-3 células que expressavam a YFP. Assim, há uma célula transfor- mada em cada lote de 10.970 células individuais, o que indica de maneira geral que o processo pode não ser muito eficiente. É provável que não tenha havido remoção da colchicina residual. Em um experimento paralelo, as cé- lulas foram revividas em colônias mais rápido e com mais saúde e com mai- or frequência de colônias. Isso indica que uma etapa de lavagem aumenta a frequência de transformação em experimentos de otimização. Caso apenas um evento seja selecionado de uma célula individual, haverá pelo menos 50- 60 células transformadas por ml de células individuais em uma placa de mi- crotitulação em ambos esses métodos de transformação. Contudo, as condi- ções de transformação podem ser mais aperfeiçoadas e colônias adicionais, transformadas de maneira estável, podem ser isoladas. Figura 11: expressão da YFP (plasmídeo UbilO-YFP) após 72 horas de tratamento com PEG. Uma das células filhas (em divisão) no plano de foco apresenta expressão de GFP, indicando que a expressão podia ser estável.

Transformação com plastídeo: após 6 semanas de cultivo, 5 co- lônias em crescimento ativo foram identificadas no meio de seleção. Entre- tanto, as células de controle não tratadas foram mortas na seleção com 100 mg/l de canamicina (figura 12). As colônias em crescimento ativo foram a- mostradas e analisadas por PCR para determinar a integração dos plasmí- deos. Duas de cada 5 colônias apresentam produtos de PCR claros, indi- cando que o transgene está integrado nos plastídeos.

Figura 12, esquerda: tecido de controle não tratado com 100 mg/l de canamicina; direita: célula individual derivada de provável isolado transplastômico em crescimento no meio de seleção.

Experimentos adicionais estão sendo realizados para refinar os protocolos de transformação nuclear e com plastídeos de alta capacidade de produição.

Experimentos de transformação adicionais estão sendo realiza- dos para aperfeiçoar o protocolo para o posterior desenvolvimento de um protocolo de transformação HTP e estrutura livre (usando plasmídeos purifi- cados de fragmentos) para novas pesquisas de bioprocessamento e desen- volvimento.

EXEMPLO 8 - aclimatação de culturas em suspensão em meio com glicerol Materiais e métodos

Condicionamento dos cultivos para sincronização. De ma- neira a melhorar a sincronização, todas os cultivos foram continuados por 2 semanas sem subcultivo, seguido de diluição de 1 ml do cultivo antigo em meio fresco. As células não-diferenciadas e em divisão foram contadas após este subcultivo (foi observado um índice amitótico de até 40%), enquanto as células diferenciadas que não se encontravam em processo de divisão foram observadas após 10 dias de cultivo. Amostras de 0,5 ml de suspensão foram usadas para procedimentos de protuberância total. Cultivos celulares

Células brilhantes amarelas 2 (BY-2) cultivadas a longo prazo em meio LSGS-BY2 (Apêndice I) e células NT1 assim como células de taba- co em suspensão de curto prazo Petite Havana (PH) foram cultivadas em 5 meio LSG-BY-2 (Apêndice II) ou em meio G-NT1 (Apêndice III). Todos os meios tinham glicerol como fonte de carbono substituta no lugar da sacaro- se, exceto no caso dos cultivos regulares de BY2, nos quais o meio conti- nha, além do glicerol, sacarose a 1%. Os cultivos em suspensão foram diluí- dos em intervalos semanais (1 ml da cultura antiga em 50 ml de meio fresco) 10 em frascos de Erlenmeyer de 250 ml. A suspensão celular foi agitada em um agitador giratório a 100 rpm e mantida a 25°C no escuro. Vos et al., "Micro- tubules become more dynamic but not shorter during preprophase band for- mation: a possible ‘Search-and-Capture’ mechanism for microtubule translo- cation," Cell Motil Cystoskeleton 57: 246-258, 2004).

Características dos cultivos celulares cultivados em meio

com glicerol

Em geral, o crescimento dos cultivos foi reduzido em compara- ção com os cultivos de controle contendo açúcar. Quando o nível inicial de inóculos do cultivo aumenta, contudo, obtêm-se taxas de crescimento nor- 20 mais. As células eram saudáveis e era possível continuar a cultivá-las sem que surgisse a coloração marrom típica observada nas células em cultivos de controle com açúcar. As células cultivadas nos cultivos com glicerol apre- sentavam uma agregação maior de células nas unidades de suspensão em comparação com suas contrapartes cultivadas com açúcar. Estas células 25 foram usadas nos experimentos para testar os compostos IMI na eliminação das propriedades adesivas das células das subunidades agregadas, uma vez que o glicerol diminui a estabilidade das membranas.

Apêndice I

O meio LSGS-BY2 consiste em macro- e microssais de Mura- shige e Skoog (Murashige e Skoog, 1962) suplementados com 30 ml de gli- cerol (v/v) e 10 g de sacarose (p/v), 100 mg/l de mioinositol, 200 mg/l de KH2PO4, 1 mg/l de tiamina e 0,2 μΙ de 2,4-ácido diclorofenoxiacético. O meio é ajustado para um pH de 5,8 antes da autoclavagem.

Apêndice Il

O meio LSG-BY2 consiste em macro- e microssais de Murashige e Skoog (Murashige e Skoog, 1962) suplementados com 30 ml de glicerol 5 (v/v), 100 mg/l de mioinositol, 200 mg/l de KH2PO4, 1 mg/l de tiamina e 0,2 Mg/l de 2,4-ácido diclorofenoxiacético. O meio é ajustado para um pH de 5,8 antes da autoclavagem.

Apêndice Ill

O meio G-NT1 consiste em macro- e microssais de Murashige e Skoog (Murashige e Skoog, 1962) suplementados com 30 ml de glicerol (v/v), 100 mg/l de mioinositol, 180 mg/l de KH2PO4, 1 mg/l de tiamina e 2 mg/l de 2,4-ácido diclorofenoxiacético. O meio é ajustado para um pH de 5,8 antes da autoclavagem.

EXEMPLO 9 - produção de células individuais a partir de cultivos em sus- pensão da dicotiledônea (tabaco (BY2, NT1, Petite Havana, Xanthi)), cenou- ra (Daucus carota L. ssp. sativus cv Sativa).

Cuitivos de cenoura em suspensão

Cultivos de calose de cenoura foram iniciados a partir de plantas Daucus carota L. ssp. sativus cv Sativa mantidas in vitro. Explantes isolados da folha do pecíolo foram cultivados em meio semissólido (Mashayekhi- Nezamabadi, 2000). Os cultivos em suspensão foram iniciados a partir da calose mediante transferência de 50 mg de calos friáveis para 1,5 ml de meio LSBY2 (Apêndice I) em uma placa de 24 poços. As suspensões com crescimento mais rápido foram então transferidas para frascos com 1 ml de suspensão em 35 ml de meio líquido LSBY2. Os cultivos foram mantidos em Iuz difusa em um ciclo de subcultivo de 7 dias. Esses cultivos eram regene- ráveis e as unidades de suspensão eram volumosas com células arranjadas de forma compacta. Quando tratadas com 0,5 mM a 1mM de colchicina ou com 25 nM a 0,5 mM de DAS-PMTI-1 ((éster etil de 4-cloro-1,5 difenil-1 H- pirazol-3 ilóxi)-ácido acético) no estágio de iniciação da suspensão do sub- cultivo, as células das unidades se separam e são liberadas no meio no ter- ceiro dia a partir do início do cultivo. Os cultivos celulares apresentavam produção homogênea de células individuais em tratamentos com colchicina, mas com DAS-PMTI-1 apresentaram produção de células individuais apenas com formatos celulares variados, em vez de arredondados. As células apre- sentavam paredes celulares intactas, conforme analisado mediante colora- 5 ção com calcoflúor sob microscópio fluorescente.

Produção de linhagem clonal de suspensões celulares individuais da cenoura

A suspensão de células individuais na fase estacionária de cres- cimento, 7 dias após o início do cultivo em tratamentos com 0,5 M de colchi- cina foram diluídas usando-se meio LSBY2 fresco a 0,6 OD660. Um cultivo de células individuais diluído de 1,5 ml foi plaqueado em meio M (Apêndice II) em placas de Petri de 15 x 100 e espalhado usando-se o anel. Agregados de cenoura em suspensão não-tratados também foram diluídos na mesma den- sidade e plaqueados de igual maneira para comparação das respostas de crescimento entre esses cultivos. Após 4 semanas de cultivo no escuro, as placas com as células individuais produziram diversas colônias separadas, indicando que linhagens cionais podiam ser obtidas a partir dessas células. A suspensão não-tratada, contudo, apresentou crescimento de calose na superfície da placa (figura 13). Assim, é possível demonstrar que as células isoladas da cenoura podiam produzir colônias derivadas de células individu- ais para produzir linhagens clonais.

Figura 13: produção de linhagens clonais a partir de suspensões de células individuais de cenoura. O crescimento no meio M plaqueado com agregados em suspensão não tratados (painel A). O crescimento de colônias separadas no meio plaqueado com as células individuais (painel B).

EXEMPLO 10 - produção de células individuais a partir de cultivos de mo- nocotiledônea em suspensão (milho, arroz (T309), Capim do Pomar, trigo (Anza))

Cultivos de células de milho clorofírico totipotente (totipotent chloro- phyllous)

Os cultivos fotoautótrofos de milho foram iniciados e mantidos em ciclos de cultivos de 7 dias (Jayakumar et al., 2005). Os cultivos foram tratados durante o período de subcultivo ou com 25 nM a 0,5 mM de DAS- PMTI-1 ((éster etil 4-cloro-1,5 difenil-1H-pirazol-3 ilóxi)-ácido acético) ou 10 nM a 0,5 mM de trifluralina para separar células individuais dos agregados. A colchicina é ativa apenas em concentrações acima de 0,5 mM até uma faixa 5 de 1 mM e libera células individuais (figura 14). As unidades de suspensão de milho estão compactadas em agregados celulares rígidos em compara- ção com as células de dicotiledônea analisadas. As células de milho verde, contudo, apresentavam as unidades em suspensão mais duras e os trata- mentos apresentaram até 50% de células viáveis liberadas em 7 dias que 10 podiam ser separadas seja mediante curtas centrifugações a 100 rpm, seja mediante filtração através de telas com poros variando de 75 a 100 uM de diâmetro.

Figura 14: tratamento com 0,5-1 M de colchicina em meio líquido e cultivos analisados 14 após o início do subcultivo (final do segundo ciclo de 15 subcultivo). A: as células individuais são liberadas dos aglomerados; B: a- gregado celular compacto colorido com coloração vital FDA; CeD: células individuais coloridas com FDA liberadas em tratamentos com 1 mM e 0,5 mM, respectivamente, após filtração da suspensão (com filtros com poros de 100 um de diâmetro); EeF: visão mais aproximada das células individuais 20 de D.

Cultivos em suspensão de capim do pomar e arroz (T309)

Calose de Campim do pomar e de T309 foram iniciadas a partir de sementes maduras (coleção de sementes DAS) em meio semissólido. Os cultivos em suspensão foram iniciados a partir desta calose derivada de se- 25 mentes usando-se o protocolo descrito por Fauquet et al., 1996. Os cultivos celulares em suspensão foram mantidos em um ciclo de subcultivo de 7 dias em frascos agitados a 150 rpm no escuro. Compostos IMI similares àquelas descritas no caso do milho (acima) foram utilizados em uma faixa de concen- tração semelhante. Células individuais de capim do pomar e de arroz foram 30 liberadas 3-5 dias após o início do cultivo.

Cultivo em suspensão de trigo (cv. Anza)

Calose de trigo Anza foi iniciada em meio MS2-D Trigo (Apêndi- ce III) a partir do tecido do escutelo. Os tecidos de escutelo foram isolados de tecidos esterilizados e embebidos e a calose induzida a partir de diferen- tes tecidos foi transferida para meio MS-2D Trigo (Apêndice III). Uma linha- gem celular de crescimento rápido foi isolada e submetida a subcultivo pos- 5 terior por 7 anos em um ciclo de subcultivo de 7 dias em meio líquido MS2D e mantida por longo prazo (7 anos). Para a produção de células individuais os cultivos foram primeiro aclimatados em meio líquido NB dicamba (Apên- dice IV). Cultivos de trigo Anza puderam ser condicionados a produzir sus- pensões de qualidade neste meio com unidades de agregação com tamanho 10 uniforme. Fez-se adição de colchicina, trifluralina ou DAS-PMT1-1 aos inocu- Iados no estágio de iniciação do subcultivo no meio em uma faixa de con- centração de 25 nM a 1mM. A suspensão liberou células individuais no meio a partir de 3 dias após o início do cultivo. As células individuais eram peque- nas e uniformes.

Apêndice I

O meio LSBY2 consiste em macro- e microssais de Murashige e Skoog (Murashige e Skoog, 1962) suplementados com 30 g de sacarose (p/v), 100 mg/l de mioinositol, 200 mg/l de KH2PO4, 1 mg/l de tiamina e 0,2 μΙ/I de 2,4-ácido diclorofenoxiacético. O meio é ajustado para um pH de 5,8 20 antes da autoclavagem. O volume da suspensão no 7o dia de cultivo na fase estacionária foi usado para iniciar os cultivos. Um volume de 1ml de inóculos de suspensão de cenoura foi transferido para 50 ml de meio LSBY2 e então os cultivos foram colocados em agitadores a 150 rpm no escuro a 28°C. Os compostos IMI foram adicionados junto com o meio fresco no ciclo de inicia- 25 ção do cultivo.

Apêndice Il

O meio M consiste em sais basais LS e vitaminas B, 30 g de gli- cose, 1 uM de 2,4-D e de cinetina e o meio foi ajustado para pH 5.8 antes de 8 gm/l de ágar nobre serem adicionados ao meio. O meio é então autoclava- do e despejado em placas de Petri de 15 x 100.

Apêndice Ill

O meio MS2D consiste de sais MS (Murashige e Skoog, 1962) e vitaminas de Eriksson suplementados com 2 mg de 2,4-D, 0,5 mg de tiami- na, 30 g de sacarose, 400 mg de mioinositol, 400 mg de hidrolisado de case- ína. Os cultivos foram autoclavados após ajuste do pH do meio em 5,8. Os cultivos em suspensão foram rotineiramente subcultivados em intervalos de 5 7 dias (6 ml dos inóculos iniciais de suspensão usada em 54 ml de meio fresco) e cultivados com agitação a 150 rpm no escuro a 28°C. Sob estas condições, as populações celulares se encontravam sempre em crescimento exponencial entre 2 e 6 dias após a inoculação. Para que o meio em gel in- duzisse a calose a partir do escutelo da semente madura, o meio MS2D con- 10 tinha um componente adicional de gelrite a 2,5 g/l adicionado após ajuste do pH.

Apêndice IV

O meio NB Dicamba consiste em sais basais NB, 30 g/l de saca- rose, 100 mg/l de mioinositol, 300 mg/l de hidrolisado de caseína, 1,7 ml/l de L-prolina (2,5 M), 500 mg/l de L-glutamina e 6,6 mg/l de Dicamba. O meio é ajustado para pH 5,8 antes de ser esterilizado por filtração.

EXEMPLO 11 - produção de células individuais de cenoura e transformação genética mediada por Si-C Whiskers de cultivos de células individuais de cenoura

Iniciação de suspensões de células individuais de cenoura

Uma linhagem criopreservada de cenoura regenerável (D2-40- 018) foi descongelada e cultivada em meio Linsmeier-Skoog (LS) (Nagata, T., Nemoto, Y. e Hasezawa, S. (1992). Os sais do meio foram obtidos da Phyto Technology Laboratories, número de catálogo N0 L689. Uma linhagem 25 em suspensão em crescimento ativo foi estabelecida em uma semana e a linhagem de manutenção foi subcultivada mediante transferência de 2ml de PCV para 58 ml de meio de suspensão LSBY2 a 28°C em um agitador orbi- tal (lnnova-3300) a 125 rpm sob Iuz difusa em um ciclo de cultivo de 7 dias. Para a produção de células individuais, 1 ml de VCM de suspensão de ce- 30 noura na fase estacionária foi adicionado a 30 ml de meio de suspensão LS com 1 mM de colchicina (Sigma, número de catálogo #C3915) e fez-se culti- vo por 7 dias. As células individuais foram produzidas de 3-7 dias de cultivo, estando prontas para os experimentos de transformação. As células indivi- duais de cenoura podiam ser mantidas na fase estacionária por até 28 dias mediante diluição dos cultivos no 14° dia pela adição de 60 ml de meio líqui- do LS BY2 fresco.

5 Transformação genética mediada por Whiskers® de células individuais de cenoura

Células individuais produzidas em meio LSBY2 com 1 mM de colchicina foram observadas no 4o dia e no 11° dia após o início do cultivo. As células individuais apresentam muita atividade e viabilidade, conforme 10 determinado por coloração com diacetato de fluoresceína. Eventos de calose expressando a proteína amarela fluorescente foram observados na colônia derivada de células individuais 10 dias e 25 dias após seleção em placas com glufosinato de amônio.

Transformação genética de células individuais de cenoura

Um protocolo de transformação WHISKERS® modificado [Petoli-

no, Welter e Cai (2003). Molecular Methods of Plant Analysis, Vol. 23, 147- 158, Capítulo 9, Genetic Transformation of Plants, ISBN 3540002928] foi usado no experimento de transformação. Os experimentos foram iniciados com a transferência de 25 ml de suspensão de células individuais de cenou- 20 ra, no dia 4 e no dia 11 após o tratamento das células individuais e do início da cultura, para garrafas de centrifugação IEC de 250 ml (Fischer Scientific1 número de catálogo #05-433B). As transformações foram realizadas median- te a adição de 8,1 ml de suspensão Whiskers recém-preparada (Silar SC-9, Advanced Composite Materials Corp, Greer, SC) e 170 ug de pDAB3831 25 contendo iniciador AtUbiIO do gene PAT e iniciador CSVMS do gene YFP. Cada transformação consistiu em uma garrafa que foi colocada no mistura- dor de tintas modificado (Red Devil Equipment Co, Minneapolis, MN) e agi- tada a alta velocidade por 10 segundos, após o que as células foram recolo- cadas em um frasco de recuperação de 500 ml e 100 ml de meio líquido 30 LSBY2 foram adicionados. As células foram deixadas para se recuperar por uma hora em um agitador giratório a 125 rpm a 28°C.

Após a recuperação, alíquotas de 3 ml de suspensão celular fo- ram uniformemente despejadas em discos de filtros de papel estéreis de 55 mm número 4 (Whatman International Ltd.) em um funil de Büchner e o meio líquido foi aspirado. Os filtros de papel com células foram então colocados em placas de Petri de 60 x 20 mm contendo meio LSBY-B15 semissólido 5 com 15 mg/l de glufosinato de amônio e Ágar TC a 0,8% como agente gelifi- cador. As placas foram encubadas a 28°C no escuro. Após 10 dias, eventos expressando GFP foram removidos do filtro de papel e colocados em placas individuais de LSBY2-B15 semi-sólido. Os filtros e células remanescentes foram transferidos para meio LSBY2-B15 semi-sólido e incubados no escuro 10 a 28°C.

Análises de eventos de colônias de células individuais

Possíveis eventos transgênicos uniformemente fluorescentes sob um microscópio fluorescente invertido Leica 25 dias após o início dos experimentos de transformação foram analisados para a proteína funcional 15 marcadora selecionável PAT por meio de um teste ELISA sensível usando o "EnviroLogix LibertyLink® PAT/pat Plate Kit''. O EnviroLogix LibertyLink® PAT/pat Plate Kit é um teste ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) tipo "intercalado". O tecido caloso foi colocado em um tubo de microcentrifu- gação e 250 ul de tampão de extração foram adicionados. O tampão de ex- 20 tração foi o PBS (Fisher, número de catálogo BP665-1) e Tween -20 a

0,05% (Sigma-Aldrich, número de catálogo P-1379). O tecido foi moído à mão com um pilão pequeno no tubo de microcentrifugação. A extração de amostra foi centrifugada a 11.000 rcf por um minuto e o sobrenadante foi usado no ELISA nas seguintes diluições: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 e 1:64. 25 Os métodos ELISA foram seguidos como indicado no Envirologix Kit, núme- ro de catálogo AP014. No teste, as extrações de amostra foram adicionadas aos poços de teste recobertos com anticorpos contra a PAT do gene pat. Quaisquer resíduos presentes no extrato de amostra se ligam aos anticorpos e são então detectados pela adição do anticorpo PAT/pat marcado com en- 30 zima (peroxidase de rábano). Após uma simples etapa de lavagem, os resul- tados da análise são visualizados mediante uma etapa de desenvolvimento de cor; esta é proporcional à concentração de PAT/pat no extrato de amos- tra.

O resultado mostrou que o tecido do controle negativo, a uma taxa de amostragem de 143 mg/250 ul de tampão de extração, não produziu um valor no ELISA PAT. O evento 001B a uma taxa de amostragem de 63 5 mg/250 ul produziu um valor de ELISA de 83 ng/ml, o que eqüivale a 330 pg de PAT por mg de calose e, assim, indicou um evento de fluorescência bri- lhante de fato transformado tanto por PhiYFP fluorescente na faixa esperada assim como com o gene marcador selecionável por PAT.

EXEMPLO 12 - classe química dos inibidores de microtúbulos e produção de células vegetais individuais

O paralelismo entre os microtúbulos e as microfibrilas representa uma resposta relacionada a um princípio polarizador desconhecido mais do que uma relação causai (Emons et al., 1992). Isso é sustentado por vários exemplos nos quais a maioria das células na zona de maturação da raiz do 15 milho (Zea mays) sob estresse por água (Zea mays) apresenta arranjos de microtúbulos em hélices orientadas à direita, mas microfibrilas nas hélices orientadas à esquerda (Baskin et al., 1999). De maneira similar, o mutante Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), organização de microtúbulos 1, apresen- ta arranjos de microtúbulos aberrantes, mas, aparentemente, microfibrilas 20 alinhadas de maneira inalterada (Himmelspach et al., 2003; Sugimoto et al., 2003). As suspensões de células individuais dos experimentos apresentam resposta de crescimento similar àquela do controle, no qual o peso seco aumenta no ciclo de subcultivo das células, indicando que as células se divi- dem na concentração mais baixa de inibidores da microtubulina (IMIs), a 25 despeito do fato de que possuem células que apresentam o crescimento iso- trópico com expansão radial. Além disso, mediante a alteração da composi- ção do meio, é possível ver a placa equatorial de tais células individuais com crescimento isotrópico fotografado, o que dá sustentação adicional ao fato de que essas células de fato estão se dividindo em baixas concentrações de 30 IMIs. Assim, as células vegetais tratadas com baixas concentrações de um inibidor de microtúbulos e mantidas em níveis ótimos no meio poderiam a- presentar uma população substancial de microtúbulos corticais inalterada. Isso permitiria que as células individuais continuassem o processo normal de criação de paredes celulares, incluindo a formação de fragmoplastos, o que é um importante pré-requisito da divisão celular.

Para inibir parcialmente o funcionamento dos microtúbulos e se- lecionar compostos que sejam seletivos no rompimento deles em baixas concentrações, diferentes classes de compostos foram analisados. A intera- ção dos IMIs com a tubulina vegetal foi bem caracterizada (Hugdahl e More- john, 1993). Ainda assim, todos os inibidores apresentam efeitos inespecífi- cos (Vaughn e Lehnen, 1991). Portanto, neste exemplo uma comparação de classes de inibidores de microtúbulos com químicas diferentes foi avaliada para identificar compostos que poderiam sustentar o crescimento de células individuais sem efeitos inespecíficos. Há compostos, tais como o clorprofam, que inibem, como é conhecido, o alongamento a concentrações mais baixas do que as necessárias para estimular a expansão radial, à medida que eles afetaram microtúbulos mitóticos mais ativamente do que os corticais (Hoff- man e Vaughn, 1994). Assim, um objetivo deste trabalho foi selecionar com- postos que em concentração baixa ótima reteriam microtúbulos corticais su- ficientes para realizar a função celular normal e manter, ao mesmo tempo, o crescimento isotrópico produzindo nenhum ou poucos efeitos inibitórios i- nespecíficos.

A colchicina é um derivado da tropolona cuja estrutura estereo- química e modo de ação estão bem estabelecidos (Keats e Mason, 1981; Margolis e Wilson, 1977; Raugh e Wilson, 1980; Murgulis, 1974), e ela previ- ne a formação de microtúbulos a partir de dímeros da tubulina. A propizami- 25 da e outras benzamidas agem no fuso nuclear de células vegetais (Akashi et al, 1988; Bartels P. G. e Hilton J. L., 1973; Carlson et al., 1975) e foram de- senvolvidas como herbicidas de pré-emergência eficazes em gramíneas a- nuais e ervas daninhas de folha larga (Aya et al., 1975). O uso de amidas fosfóricas é similar ao de herbicidas de dinitroanilina, incluindo a orizalina 30 (SurfIan) e a trifluralina (TrefIan) (Ashton e Crafts, 1981). A trifluralina é um dos representantes mais conhecidos da família de herbicidas contendo dini- troanilina; ela destrói os microtúbulos veqetais, mas é ineficaz em células animais (Hess e Bayer1 1974); Hess e Bayer1 1977). As piridinas têm um a- nel de benzeno com um dos carbonos substituído por um nitrogênio. Há di- versas piridinas substituídas que são usadas como herbicidas. Pertencem a este grupo o dithiopyr (Dimension®) e o thiazopyr (Visor®). O dithiopyr é um 5 material de pré- e pós-emergência usado apenas sobre a turfa para controlar uma ampla variedade de ervas daninhas. Ele é frequentemente formulado com outros herbicidas e em fertilizantes. O thiazopyr é um composto de pré- emergência seletivo que funciona bem com praticamente todas as ervas da- ninhas e em uma ampla variedade de cultivos, incluindo cítricos, algodão, 10 milho, amendoim, soja e batata. Assim1 as piridinas parecem ser inibidores da formação dos microtúbulos em seu funcionamento.

Materiais e métodos

Cultivos em suspensão de tabaco JTNT1. Os cultivos em suspensão de células de tabaco JTNT1 foram mantidos mediante o subculti- vo de 1 ml de volume corpuscular médio (VCM) em 20 ml de meio de tabaco (sais MS, mioinositol, tiamina HCI (1 mg/ml), fosfato de potássio dibásico (anidro), MES, 2,4-D (10 mg/ml) e glicerol a 3% (meio NT1B). A linhagem celular foi subcultivada a cada 7 dias e expandida conforme necessário para o teste. 1 M de sacarose inibiu tanto a taxa quanto a dimensão da polimeri- zação da tubulina vegetal induzida pelo taxol (Bokros et al., 1993). A investi- gação da polimerização da tubulina vegetal na presença de 1 M de sacarose (tanto APM, amiprofosmetil, quanto orizalina) produziu uma diminuição con- centração-dependente do comprimento dos microtúbulos vegetais (Morejohn e Fosket, 1984; Morejohn et al., 1987). Além disso, a sacarose estabiliza os microtúbulos pré-formados, tornando o exame dos efeitos dos IMIs sobre os microtúbulos pré-formados inviável. Além disso, a sacarose aumenta subs- tancialmente a viscosidade da solução e a polimerização da tubulina é alte- rada pelo menos em parte pelas taxas menores de difusão dos dímeros e polímeros. Assim1 era importante ter pouca ou nenhuma sacarose no meio de produção das células individuais. Dessa maneira, uma nova linhagem JTNT1 aclimatada ao glicerol foi desenvolvida para este estudo.

Para os tratamentos, as Iinhaqens em suspensão foram prepa- radas com 1 ml de volume celular médio (VCM) em 20 ml de meio mexendo- se com frequência para permitir uma boa distribuição das células (uma vez que os agregados em suspensão tendem a se sedimentar) e então transferi- das para os poços de placas de microtitulação de 24 poços. Cada um dos 24 5 poços continha 1 ml de suspensão JTNT1. As placas de 24 poços foram mantidas em Innova 4900 Multienvironmental Shaker com presilhas e arreios especiais para permitir o empilhamento de até 6 placas. As placas foram giradas a uma velocidade de 130 rpm e a 25°C no escuro.

em dimetilsulfóxido (DMSO) para proporcionar soluções estoque de 0,5 M. Um ml de suspensão JTNT1 (1 ml de meio de tabaco PCV/20) foi adicionado a cada poço das placas de 24 poços. A cada poço um químico individual foi adicionado para se alcançar a concentração desejada (a 1 μΜ, 3 μΜ e 10 μΜ). Permitiu-se que os cultivos crescessem por 7 dias no Innova Shaker. A 15 cada dia medidas de turbidez foram feitas em cada poço usando-se um SpectraMax M2e Molecular Device (configurado em 600 de absorção com 5 leituras tomadas por poço). No dia 7, as células foram observadas com o microscópio invertido confocal Leica 5000 em busca da formação de células individuais e da viabilidade celular.

Produção de células individuais. Cada composto foi dissolvido

Amiprofosmetil (APM)

F

F

dithiopyr (±)-4S, 5R-4-NITRO-5-(2,3,4-trimetoxifenil)ciclohexeno (trimetoxifenilciclohe- xeno)

Produção de eventos clonais de calose mediante células BY2 individuais em meio LSBY2 com glicerol. Células de tabaco BY2 (Nagata et al., 1992) foram transformadas com pDAB1590 mediante um pro- tocolo modificado descrito por Shaul et al., 1996, e selecionado no LSBY15 após 4 dias de cocultivo. O evento de calose expressando a proteína verde fluorescente foi recuperado e a calose foi mantida em meio LSBY2 B15. No prazo de um mês um evento de calose cresceu vários centímetros em diâ- metro e um pedaço pequeno, mas de fluorescência brilhante (aglomerado de ~2 a 5 mm2), foi transferido para meio sólido fresco para manter as células supridas com nutrientes em agente de seleção fresco e para selecionar ca- lose expressando GFP de maneira homogênea. Um pedaço de 500 mg de calose foi transferido para 50 ml de LSBY-GIy-BI5, um meio líquido LSBY2 modificado com glicerol a 3% e sacarose a 1% como fonte de carbono em um frasco agitado de 250 ml (130 rpm a 25°C no escuro). A cada semana, um volume celular médio de 0,5 ml (VCM) de células era usado para iniciar um cultivo em suspensão. Assim, calose e agregados em suspensão ex- pressando a proteína verde fluorescente (GFP) foram mantidos respectiva- mente em um ciclo de um mês e de 7 dias.

Produção de células individuais expressando a GFP. Células individuais foram produzidas pela adição de uma concentração de 1 uM do composto DDP (difenilpirazol) durante a iniciação do ciclo de cultura de 7 dias no meio LSBY2-Gly-B15 junto com a adição de 0,5 ml de volume celular médio (VCM) de agregados em suspensão expressando a GFP na fase es- tacionária. Alternativamente, 25 ml de agregados em suspensão foram trans- feridos para 25 ml de meio de suspensão LSBY-GIy-BI 5 fresco mediante a adição de 50 ul de 1 M de solução estoque de difenilpirazol dissolvidos em 5 DMSO para proporcionar uma concentração final de 1 uM na suspensão. Assim, células individuais puderam ser produzidas em um ciclo muito mais curto, de apenas 3,5 dias. O meio LSBY215 sempre contém 15 mg/l de glu- fosinato de amônio para fins de seleção.

A GFP foi expressada como uma proteína quimérica em células 10 individuais por toda a duração dos ciclos de cultivo de 3,5 ou 7 dias e se en- contravam em localizações subcelulares, enquanto a expressão da GFP dos construtos quiméricos foi observada em células vivas mediante epifluores- cência convencional com um microscópio Leica assim como microscópios de escaneamento confocal a laser Zeiss Axiovision. A expressão foi vista em 15 muitos dos compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo e os filamentos citoplasmáticos.

Resultados e discussão

As células estavam muito saudáveis nos meios de cultivo de ta- baco contendo glicerol e os aglomerados de células eram muito evidentes. As células mostravam bom aumento da biomassa em um período de 7 dias, ainda que tenha havido uma redução de ~50% da biomassa em comparação com o controle com açúcar. Os cultivos de controle também tinham DMSO a

0,1% para garantir que não houvesse efeito induzido pelo DMSO. A adição de 1 uM de éster etil l4-cloro-1,5-difenil-1H-pirazol-3-ilóxi-ácido acético (dife- 25 nilpirazol) seja ao meio contendo sacarose, seja ao meio contendo glicerol, não reduziu significativamente a biomassa das células em comparação com os respectivos controles, indicando que ocorre crescimento ativo de células individuais similar ao do controle na presença do difenilpirazol. A curva de crescimento é semelhante quando os cultivos passaram por 2 subciclos ou 30 3,5 dias. A produção de células individuais no meio com glicerol também demonstra elevados números de células viáveis em comparação com o con- trole. Diversos outros compostos incluindo a trifluralina, a orizalina e os compostos da classe dos estabilizadores dos microtúbulos tais como o Taxol tiveram estudada sua eficácia na produção de células individuais a partir de cultivos em suspensão de células de tabaco JTNT1 cultivados em 5 meio NT1B com glicerol a 3% como única fonte de carbono. Estes foram a colchicina, o N-1(1,1-dimetilpropinil)3-clorobenzamida, a propizamida e a trifluralina. Nestes estudos, os compostos diferiram na sua eficácia para pro- duzir células individuais e na inclinação da curva dose-resposta. A Orizalina, assim como os outros compostos testados, aumentou o diâmetro das células 10 individuais em pelo menos 4 vezes e apresentou uma concentração de satu- ração cerca de 10 vezes acima do limiar. A colchicina aumentou o diâmetro em 5 vezes e teve curva de dose-resposta mais íngreme, o que indica que esses dois compostos podem ser preferíveis para o trabalho com altas do- sagens.

As concentrações necessárias para produzir células individuais

estavam na faixa de 50 uM e 2 mM para a colchicina e entre 10 nM e 100 uM para a propizamida e a N-1(1,1-dimetilpropinil)3-clorobenzamida. Entre- tanto, as concentrações de orizalina e trifluralina para a produção ótima de células individuais variou entre 100 nM e 1 mM. Contudo, em altas concen- trações esses compostos aumentaram a síntese de proteínas, a divisão de plastídeos e de mitocôndrias ocorreu nas células tratadas, levando à forma- ção de células gigantes de até 300 uM de diâmetro com poliploidia nuclear, como visto em células de cenoura cultivadas por 21 dias. Esses resultados sugerem que a inibição da mitose é o efeito fundamental desses compostos nas altas concentrações estudadas. Assim, pareceu importante manter não apenas a concentração ótima de IMIs, mas também a química do composto (que apresentará função muito seletiva sobre os túbulos e não a função não- seletiva similar à função de divisão celular). Em conformidade com este obje- tivo, outros compostos estão descritos abaixo além do difenilpirazol descrito acima.

Agregados de BY2 em suspensão foram observados: em meio LSBY2 com açúcar; células BY2 individuais em divisão produzidas em 1 uM de difenilpirazol mostrando a placa equatorial em meio LSBY2; células transgênicas BY2 GFP após deconvolução e evento de colônia de células individuais clonais no meio LSBY2-15 em forma de gel.

Sumário da produção de células de tabaco BY2 individuais em meio 5 LSBY2 contendo glicerol. As células individuais produzidas em 1 uM de difenilpirazol a partir de agregados em suspensão apresentavam núcleos únicos com um ou dois nucléolos em 90% das células em cultivo de 3,5 dias. Essas células podiam ser plaqueadas em uma placa com LSBY2 em forma de gel com ágar TC a 0,8% e 15 mg/l de glufosinato de amônio como agente 10 de seleção uma vez que o plasmídeo pDAB1590 usado para transformar os agregados em suspensão tinha o PAT como marcador seletivo. As células foram diluídas no meio líquido em diluição de 1:4 e plaqueadas no meio em gel e evento clonal selecionado a 21 dias após o plaqueamento.

No que refere-se ao amiprofosmetil (APM), quando ele foi adi- 15 cionado às suspensões de JTNT1, células individuais foram formadas na concentração de 1-10 μΜ; a concentrações mais altas há notável redução do crescimento e inibição da divisão celular. Células redondas separadas po- dem ser vistas nas imagens de 1 μΙ e 3 μΙ de APM comparadas com o con- trole apenas com DMSO. As células de tabaco JTNT1 eram de saudável cor 20 amarela e cresciam bem na presença de 1 μΜ e 3 μΜ de APM. A viabilidade celular, conforme medição por coloração com diacetato de fluoresceína e iodeto de propídio, demonstrou viabilidade de até 70%.

Mais uma vez, foi observado que o APM induziu a produção de células de tabaco JTNT1 individuais em meio contendo glicerol. Os agrega- dos de JTNT1 em suspensão de controle foram observados em meio com glicerol e DMSO a 0,1%; células individuais de JTNT1 foram observadas em meio NT1B contendo glicerol com 1,3 e 10 uM de APM.

O dithiopyr pertence à classe dos herbicidas com piridina substi- tuída que rompem os microtúbulos. Quando adicionadas às suspensões de JTNT1 a concentrações de 1 μΜ, 3μΜ e 10 μΜ, as células individuais foram formadas usando concentrações de 1 μΜ e 3μΜ (imagens E e F), mas a concentração de 10 μΜ apresentou células individuais (e a concentração de células foi pequena). As células de tabaco eram saudáveis, estavam em crescimento e eram de cor amarela usando-se o dithiopyr em todas as con- centrações testadas. A viabilidade celular após o tratamento com 1μΜ e 3μΜ de dithiopyr foi de 70-80%, indicando uma maior viabilidade.

5 Um mimético da colchicina (Evans et al., 2003), (±)-4S,5R-4-

nitro-5-(2,3,4-trimetoxifenil)-ciclohexeno (trimetoxifenilciclohexeno), teve sua eficiência na produção de células individuiais testada nas culturas de tabaco JTNT1. Enquanto houve um leve alvejamento das células (elas eram de um amarelo ligeiramente mais claro), as células cresceram muito bem na placa. 10 Esse químico promoveu a formação de células individuais a 1 μΜ, 3 μΜ e 10 μΜ. As células eram redondas e a viabilidade celular em todos os níveis va- riou entre 80-90%. A inibição do crescimento celular é mais ou menos similar entre as concentrações testadas e as células eram saudáveis com alta viabi- lidade e menos citotoxidade.

Assim, a produção induzida de células individuais de tabaco

JTNT1 foi observada em meio contendo glicerol em concentração de 10 uM de de trimetoxifenilciclohexeno.

Supercélulas individuais. Agregados de células de cenoura em suspensão podiam ser cultivados em 1 mM de colchicina em 60 ml de meio 20 líquido LSBY2 e mantidos no mesmo meio por até 28 dias. O crescimento após o segundo subcultivo declina após 14 dias, mas as células continuam a crescer para formar supercélulas individuais vivas e saudáveis (mas que a- presentam grandes núcleos lobados, indicando a ocorrência de poliploidia nuclear). Supercélulas individuais de cenoura com vários núcleos foram ob- 25 servadas em células de 21 dias de idade com 1 mM de colchicina contínua em meio LSBY2.

Conclusão. O crescimento celular nestes níveis de teste foi ob- servado visualmente, mediante o peso seco (medido apenas no dia 7) e lei- turas de turbidez. A figura 15 mostra as leituras de turbidez tomadas em um 30 período de 7 dias. As leituras de turbidez se referiram a placas contendo a- penas o meio (com glicerol a 3%) e o inibidor de microtúbulos a concentra- ções de 1 μΜ, 3 μΜ e 10 μΜ. Enquanto os controles apresentaram os me- Ihores padrões de crescimento, como esperado, nenhum dos químicos tes- tados fez com que as linhagens celulares morressem a taxas de 1μΜ e 3μΜ. As células em todos os tratamentos experimentaram um aumento da taxa de crescimento por volta do mesmo ponto temporal (dia 3) e o volume celular 5 ainda estava aumentando no dia 7. Isso mostra que as células tratadas qui- micamente permaneceram viáveis por pelo menos 7 dias.

Referências do exemplo 12:

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21. Vaughn, K. C., Lehnen L. P. Jr (1991). Weed Sci 39: 450-457. EXEMPLO 13 - uma investigação comparativa da estrutura subcelular, cito- gênese e da instabilidade genômica molecular de células individuais produ- zidas com IMIs

A estabilidade genômica aproximada de plantas derivadas de tecidos em cultivos foi estudada no nível citogênico em várias espécies ve- getais (Shoyana et al., 1995; Zoriniants et al., 2003). No que refere-se à es- tabilidade de plantas derivadas de embriões, estudos citogênicos revelaram observações contrastantes. Odake et al. (1993) relataram duplicação cro- mossômica (de diplóide para tetraplóide) em 66,7% e 100% das plantas de- rivadas de embriões de Asparagus officinalis L. obtidas de meio solidificado e meio líquido de goma gelana, respectivamente. Em contraste, Mamiya et al. (2001) não relataram alterações de ploidia durante a embriogênese so- mática na A. officinalis. Auxinas sintéticas tais como o 2,4-D (2,4- diclorofenóxi-ácido acético) e ANA (ácido naftaleno acético) usadas em mei- os de cultura foram relatadas como associadas a variações somaclonais (Karp, 1989; Philips etal., 1994). De fato, uma redução da ploidia foi relatada tanto no sistema de embriogênese somática com cenoura (Ronchi et al., 1992) quanto com álamo (Rugh et al., 1993) nos quais o 2,4-D tinha sido usado. Inibidores da microtubulina (IMIs) também aumentaram a ploidia em células vegetais. A concentração e a classe do composto IMi, contudo, de- terminam a natureza da ploidia ou sua ausência. Por exemplo, a orizalina induz a poliploidia nuclear em células TBY2, mas a propizamida em concen- trações similares não o faz (Ehsan et al., 1999). De igual maneira, a exposi- ção de longo prazo de células de cenoura em suspensão induz a poliploidia nuclear em concentrações mais altas de colchicina. As células de cenoura em suspensão apresentaram poliploidia nuclear em células individuais culti- vadas com 1 mM de colchicinas após 14-21 dias de tratamento contínuo. A frequência de tais níveis de ploidia, entretanto, é muito menor em cultivos de até 14 dias ou menos e menos 1%, o que é similar aos resultados relatados para suspensões de controle cultivadas com auxina (Karp, 1989; Phillips et al., 1994). Entre os compostos testados neste estudo, não obstante, o etil éster ácido 4-clor-1,5-difenil-1H-pirazol-3-ilóxi)-acético e o 4S,5R-4-nitro-5- (2,3,4-trimetoxifenil)ciclohexeno apresentaram produção eficiente de células individuais com percentual baixo ou nulo de ploidia nuclear em 14 dias de tratamento contínuo.

De qualquer maneira, o processo de indução de células indivi- duais a partir de agregados celulares usando-se tais IMIs de baixa citotoxici- dade ainda poderia alterar os padrões de expressão genética de células in- dividuais com um padrão diferente de expressão genética. Sabe-se que a metilação do DNA dispara conseqüências indesejáveis, o que leva à varia- ção somaclonal in vitro. Além disso, os IMIs induzem alterações que poderi- am resultar em variações ou instabilidades moleculares. Um percentual po- limórfico de 1,09% foi relatado em duplicidades cromossômicas induzidas pela colchicina em tetraplóides de Eragrostis curvula (Mecchia et al., 2007). O nível de concentração de colchicina usado para tratar as sementes de E. curvula foi de 0,05%. Um objetivo do presente estudo foi avaliar a estabilida- de genômica das células individuais de JTNT1 produzidas em 1 uM de éster etil ácido 4-cloro-1,5-difenil-1H-pirazol-3-ilóxi)-acético.

Diversas abordagens moleculares tais como AFLP, RAPD (rapid amplified polymorhic DNA) RFLP (restriction fragment Iength polymorphism) foram tentadas para identificar e medir o nível de variação somaclonal em 20 plantas derivadas de tecidos em cultivo (Devarumath et al., 2002; Martins et al, 2004; Sanchez-Teyer et al., 2003; Hale e Miller, 2005). A despeito da me- todologia utilizada, contudo, apenas uma pequena porcentagem (muito me- nor do que 1%) do genoma pode ser testado não importa o quanto prolífica seja a técnica (em termos do número de Ioci amostrados). Das diversas téc- 25 nicas disponíveis, a AFLP é a mais altamente multiplexada, normalmente com 50-100 Ioci testados por par de iniciadores. Acredita-se que esses Ioei estejam espalhados de maneira mais ou menos aleatória por todo o genoma e, assim, a AFLP oferece as melhores chances de detecção de alterações induzidas pelo cultivo de tecidos. Ademais, a AFLP é também uma das téc- 30 nicas moleculares mais robustas para a identificação de cultivares e análise de variabilidade (Hale e Miller, 2005). Assim, esse método de avaliação foi escolhido para uso neste estudo. Materiais e Métodos

Iniciação de células individuais de tabaco JTNT1 e coleta de amostras. Células individuais de tabaco JTNT1 foram iniciadas em dois meios diferentes, NT1B com sacarose a 3% (NTIB-Sac) e NT1B com glice- rol a 3% (NTIB-GIy) em um ciclo de cultivo de 3,5 dias. Os cultivos foram iniciados mediante a adição de 12,5 ml de agregados em suspensão em cul- tivos em fase estacionária mantidos nos respectivos meios de cultivo e trans- feridos para 12,5 ml de meio de cultura fresco em frascos agitados de 125 ml contendo 1 uM de éster etil ácido 4-cloro-1,5-difenil-1H-pirazol-3-iIóxi)- acétivo (difenilpirazol). Os frascos foram fechados com um tampão de es- puma e cultivados em um agitador orbital a 130 rpm no escuro a 25-28°C. Os cultivos foram subcultivados a cada 3,5 dias até um período de 14 dias. Quatro amostras (células cultivadas em Sac/Gly e os cultivos de controle em meio Sac/Gly com DMSO a 0,2%) dos cultivos foram coletadas a cada 3,5 dias mediante centrifugação da suspensão a 3.000 rpm por 5 minutos. As amostras foram imediatamente Iiofilizadas para impedir a oxidação celular de maneira a minimizar qualquer efeito deletério sobre as amostras introduzidos após a coleta. As células individuais foram coloridas com coloração nuclear Hoechst por uma hora e observadas ao microscópio em busca de qualquer anomalia nuclear por até dois ciclos de cultivo.

Caracterização citológica das células individuais

Viabilidade celular e parede celular. Células JTN1 individuais estabelecidas foram coloridas com FUN1 (F-7030, Molecular Probes, Invitro- gen Inc), uma coloração para células que é usada em testes de viabilidade 25 na levedura e que contém duas sondas fluorescentes coloridas. A terceira calcofluor White M2R, que colore a parede celular, foi usada para colorir as células. No caso das células individuais de JTNT1, 20 μιτι de coloração FUN1 foram adicionados e a cultura foi incubada à temperatura ambiente por 20 minutos. 1 ml de meio de cultivo fresco foi adicionado para lavar o 30 excesso de corante e fez-se centrifugação a 3.000 rpm. O sobrenadante foi descartado. As células foram examinadas e imagens foram registradas em um microscópio Zeiss ApoTome. Membrana plasmática. As células JTNT1 foram incubadas com 5 μηι de FM4-64 (coloração estiril) por 5 minutos e lavadas com meio fresco. O cultivo foi centrifugado a 3.000 rpm e meio fresco foi adicionado. As célu- las foram visualizadas em um microscópio Zeiss ApoTome.

Núcleo. As células individuais foram coloridas com coloração

nuclear Hoechst por uma hora e observadas em um Zeiss ApoTome para verificação de qualquer anomalia até dois ciclos de cultivo. Coloração cristal de violeta também foi utilizada como uma coloração nuclear vital para a ob- servação da estrutura nuclear para fins de caracterização da ploidia.

Citoesqueleto. As falotoxinas se ligam a filamentos de actina.

Alex Fluor 488 Phalloidin (A12379, Invitrogen Inc) foi utilizada para colorir as células individuais. 6,6 um de Alex fluor foram adicionados às células indivi- duais e procedeu-se a incubação por 30 minutos seguida de visualização ao microscópio.

Avaliação molecular da estabilidade genômica

Extração de DNA. O DNA genômico de amostras representati- vas foi coletado a 3,6; 7; 10,5 e 14 dias. Cultivos Sac e Gly juntos com os controles (10 amostras) foram extraídos usando-se o protocolo CTAB (ver Apêndice-Exemplo 12). O DNA foi quantificado com coloração PicoGreen® 20 da Molecular Probes, Inc (Eugene, Oregon). Cada poço de uma placa de microtitulação continha 90 μΙ de 200x picogreen combinados com 10 μΙ de amostra de DNA em diluição de 40x ou de acordo com os padrões de DNA Lambda (0; 2,5; 5 e 10 ng/μΙ). As placas foram agitadas por curto período usando-se um agitador de placas padrão e a fluorescência foi lida (excitação 25 -480 nm, emissão -520 nm) usando-se um fluorômetro Spectra Max Gemi- niXS da Molecular Devices (Sunnyvale, Califórnia). Cada amostra foi quanti- ficada em triplicata e uma média dos três resultados foi usada nas diluições subsequentes. As concentrações de DNA de amostra foram diluídas até uma diluição de trabalho de 91 ng/μΙ com água estéril.

Análise AFLP. Análises por Amplified Fragment Length Poly-

morphism (AFLP) foram realizadas usando-se uma modificação do protocolo de Vos et al. (1995), como descrito em Bryan et al. (2000). A enzima de res- trição de 6 pb EcoRI foi usada em combinação com a enzima de restrição de 4 pb Msel. Iniciadores AFLP para EcoRI marcados por fluorescência e a iniciadores AFLP para Msel não marcados foram obtidos da Applied Biosys- tems (Foster City, Califórnia). A análise AFLP foi realizada usando-se o A- FLP Plant Mapping Protocol da Applied Biosystems mediante a reação de amplificação seletiva com uma modificação. A modificação foi que as rea- ções de digestão/ligação foram incubadas a 37°C durante a noite. Os produ- tos seletivamente amplificados foram diluídos duas vezes em água deioniza- da esterilizada. 0,5 ul do produto diluído foi combinado com 5 ul de tampão de carregamento (5 ul de GeneScan 500 bp LIZ tamanho padrão misturados com 500 ul de formamida ABI HiDi). As amostras foram analisadas em um analisador de DNA AB3730XL com matriz espectral G5-RCT usando-se as condições padrão. Os dados foram então importados para o GeneMapper® versão 4.0 (Applied Biosystems, 2005). Os alelos receberam um valor numé- rico de acordo com o tamanho do fragmento de PCR.

Resultados e discussão

Citologia e outras avaliações subcelulares das células individuais

Parede e divisão celular. Durante o cultivo das células, ocorrem crescimento e diferenciação e a forma e a estrutura das células dependem da parede celular. As células individuais apresentaram crescimento isotrópi- co com um aumento de 3 a 10 vezes do tamanho apresentando como resul- tado uma célula tipicamente redonda. Para entender a estrutura da parede celular, foi usado calcofluor (um agente alvejante que tem afinidade de liga- ção com as celuloses). Nas células individuais, uma nítida parede circular foi observada. A parede celular é uma estrutura dinâmica que tem um importan- te papel na determinação da forma da célula e na interação com fatores am- bientais. Ainda que a maioria das células individuais observadas tenha apre- sentado uma célula esférica, foi possível ver células em divisão com uma placa equatorial. O ganho de peso seco é outra indicação de que a divisão celular está ocorrendo dentro dessas células individuais. Após 14 dias de cultivo em IMI, caso as células individuais fossem transferidas para meio sem IMI as células reconstituíam o agregado em suspensão, mostrando a reversibilidade do crescimento anisotrópico.

Membrana plasmática. A membrana plasmática é um dos impor- tantes componentes da célula. Ela envolve todo o conteúdo da célula. Ela delineia a parede celular e proporciona o último filtro entre o interior da célula e o ambiente. Colorantes FM de estiril anfifílico são úteis no estudo da or- ganização das organelas e do transporte vesicular em células eucarióticas vivas (Boite etal., 2004). Inicialmente, os corantes FM localizam a membra- na plasmática (MP) e então sofrem endocitose. O FM4-64 (uma coloração fluorescente seletiva para a membrana) colore a membrana plasmática e então se internaliza em outras organelas celulares (Ueda et al., 2001). Após minutos de coloração, a fluorescência das células individuais foi observada na membrana plasmática e verificou-se a inexistência de defeitos estruturais. Em amostras individuais nas quais 100 nM de Isoxaben são usados para remover a rede celulósica, o FM4-64 apresentou extensa vesiculação na superfície. A membrana apresentou endocitose ativa em 5 minutos.

Núcleo. Relata-se que a organização nuclear da célula vegetal tratada com IMI é complexa e demonstrou-se que a poliploidia nuclear é co- mum em altas concentrações. As amostras foram examinadas até 7 dias em concentrações de 1 uM de difenilpirazol e trimetoxifenilciclohexeno. A estru- 20 tura das organelas nucleares foi analisada mediante o uso de vários coran- tes (Hoechst 3325). No caso da JTNT1, as células individuais contêm um núcleo único com um ou dois nucléolos em concentrações de 1 uM de dife- nilpirazol e trimetoxifenilciclohexeno em cultivos de 3,5 dias. Contudo, altas concentrações desses compostos levam à formação de células gigantes de 25 até 150-300 uM de diâmetro com poliploidia nuclear, como visto no caso das células de cenoura cultivadas por 21 dias. Esses resultados sugerem que a inibição da mitose é o efeito fundamental desses compostos nas altas con- centrações estudadas. Assim, é importante manter não apenas a concentra- ção ótima de IMIs, mas também a química do composto, o que terá função 30 muito seletiva sobre os túbulos e não a função não-seletiva similar à função de divisão celular.

Citoesqueleto. O citoesqueleto consiste em diversas proteínas estruturais tais como as F-actinas e tubulinas, que estão envolvidas na inte- gridade estrutural da célula. A dinâmica in vivo do citoesqueleto foi estudada usando-se Alexa Fluor 488 verde fluorescente conjugado com actina (A12373), que é mais brilhante e menos dependente do pH. Os microtúbulos 5 e os filamentos de actina são estruturas essenciais para a manutenção da estrutura do citoesqueleto em células vegetais no que refere-se ao seu cres- cimento, diferenciação e sobrevivência (Kost et al., 2002). As células indivi- duais coloridas com faloidina apresentaram o citoesqueleto de filamentos de actina e não houve posicionamento incorreto dos filamentos, uma vez que a 10 estrutura celular era normal.

Análise molecular. A análise AFLP envolveu 10 combinações de iniciadores com base no uso da EcoRI (uma enzima de restrição insensível à metilação). Dois dos pares de iniciadores (p6 e p10) não conseguiram ampli- ficar e dois dos pares de iniciadores (3p e 8p) não apresentaram diferenças 15 em nenhum dos fragmentos. O número de fragmentos claramente separa- dos para os pares de iniciadores 1 p, 2p, 3p, 4p, 5p, 7p, 8p, 9p foi 47, 39, 31, 42, 47, 32 7 e 46, respectivamente. Nenhum polimorfismo AFLP foi detecta- do entre as amostras tratadas com as combinações de pares de iniciadores insensíveis à metilação (isto é, EcoRI-MseI) exceto as amostras de JTNT1 20 (4o ciclo de subcultivo) cultivadas por 14 dias com glicerol. Em contraste, nenhum fragmento polimórfico foi identificado em todas as outras amostras de cultivos tratados com glicose. As amostras tratadas com sacarose não apresentaram polimorfismo em qualquer dos fragmentos para qualquer das combinações de pares de iniciadores testadas. Como esperado, não houve 25 diferenças nas amostras de células individuais por pelo menos 3 ciclos de subcultivo. Contudo, no 4o ciclo de subcultivo o polimorfismo em culturas tratadas com glicerol pode se dever à presença contínua do composto além do estresse imposto pela falta de sacarose (que parece ter disparado a ins- tabilidade). A diferença do cultivo de células de JTNT1 individuais que não 30 apresentava polimorfismo sugere que a fonte de carbono simples glicerol, ainda que sua capacidade de estabilizar os microtúbulos seja conhecida, pode não ser capaz de sustentar muitas funções celulares, especialmente na 10

15

presença prolongada de um inibidor da microtubulina (IMI). De qualquer ma- neira, tratamentos de células individuais poderiam ser preparados de manei- ra bem-sucedida na faixa de concentração testada com difenilpirazol por pe- lo menos 4 ciclos de subcultivo sem problemas de instabilidade genômica.

Fotos de 2 exemplos de polimorfismo para o iniciador 5p foram tiradas. O subcultivo 4 teve uma inserção de fragmento de 130 pb e uma deleção de fragmento de 131 pb.

Os perfis AFLP envolvendo o uso de enzimas EcoRI e A7?sel in- sensíveis à metilação com combinação de par de iniciadores foram determi- nados. Todas as amostras para 4 ciclos de subcultivo foram monomórficas, enquanto o perfil de glicerol no 4o ciclo de subcultivo foi polimórfico em vá- rios toei.

Tabela 2: esta tabela proporciona detalhes de combinações de pares de ini- ciadores AFLP usados e os números de bandas correspondentes observa- das. Sac-X: células individuais em meio ΝΤΙΒ-Sacarose; Gly-X: células indi- viduais em meio ΝΤΙΒ-Glicerol; Cont-Sac: agregados em suspensão de cé- lulas JTNT1 de controle em sacarose; Cont-Gly: agregados em suspensão

Comb. de iniciado- res

Seqüência de iniciado- res (5’ a 3’)

Número de bandas polimórficas Cont Cont 3,5 d 3,5 d 7 d 7 d 10,5 d 10,5 14 d 14 d Sac Gly Sac Gly Sac Gly Sac d Gly Sac Gly Combinação EcoRI/Msel

ip AC/CAG n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 5 2p AGC/CAG n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 10 3p AGC/CTG n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 0 4p ACT/CTT n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 5 5p ACT/CAG n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 3 6p ACT/CTG n/a n/a 7p ACC/CAG n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 4 8p ACC/CTG n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 0 9p ACA/CAG n/a n/a 0 0 0 0 0 0 0 7 10p ACA/CTG n/a n/a Total 34 Avaliação genética molecular da uniformidade. O polimorfismo AFLP (entre o 4o ciclo subcultivado de suspensão de células individuais cul- tivadas com glicerol para 9 combinações de iniciadores dentre as 10 utiliza- das) foram vistas neste estudo. Toda a variabilidade observada refere-se a 5 fragmentos gerados usando-se EcoRI/Msel. Um aumento do status da meti- lação durante o cultivo do tecido foi relatado anteriormente no caso da calo- se do tomate, em comparação com as folhas (Smulders et al., 1995) e com regenerantes de tecido em cultivo da ervilha (Cecchini et al., 1992). Assim, para melhor avaliar a variação baseada na metilação, avaliações posteriores

com a combinação PStl/Msel sensível à metilação pode ser conduzida. Apêndice - Exemplo 13

Protocolo CTAB de extração DNA de suspensão de células de taba- co/tecidos calosos

1. Separe -25 mg de tecido Iiofilizado em um tudo Eppendorf de

2 ml.

2. Coloque uma esfera de aço inoxidável no tubo com o tecido e agite em um Geno Grinder ou misturador de tintas por aproximadamente 1 minuto (Geno-grinder ajustado para 500 batidas/min). Remova a esfera e bata o tubo gentilmente para reduzir a aglomeração do tecido.

3. Acrescente 1 ml de tampão de extração e bata o tubo gentil-

mente para reduzir a aglomeração do tecido e coloque o tecido no tampão; incube, enquanto mistura gentilmente sobre as laterais por 2 horas a 65°C. Resfrie até a temperatura ambiente (-10 minutos).

Tampão de extração (250 ml)

Tris-HCI 25 ml NaCI 29,2 g Na EDTA 12,5 ml CTAB 6,25 g PVP 3,75 g

Áaua (adicionar até obter o volume final de 250 mh 4. Adicione 0,75 ml de 25:24:1 fenol/clorofórmio/álcool isoamil, pH 8, ao tampão de extração e agite manualmente com suavidade por 5 min. Centrifugue por 5 minutos a 10.000 rpm para separar as fases. Transfira cui- dadosamente a fase aquosa para um novo tubo.

5. Repita a etapa 4 usando 24:1 clorofórmio/octanol em vez da

mistura alcoólica fenol/clorofórmio/álcool isoamil.

6. Adicione isopropanol ao sobrenadante em igual volume e dei- xe em repouso por 1 hora à temperatura ambiente.

7. Centrifugue os tubos por 10 minutos a 10.000 rpm e despeje o

sobrenadante tomando cuidado para manter o peletizado no fundo do tubo.

8. Acrescente 0,5 ml de etanol a 70% e mistura de RNase para lavar o peletizado de DNA e centrifugue por 1 min a 10.000 rpm (Rna- se/etanol 1:1000).

9. Despeje cuidadosamente o sobrenadante e repita a etapa a-

penas com uma lavagem com etanol a 70%. Seque completamente o peleti- zado deixando-o descansar a temperatura ambiente por 3 horas ou submeta as amostras ao Rotovap por ~5 minutos.

10. Quanto não houver mais gotículas de álcool, dissolva o pele- tizado em 0,2 ml de tampão Tris EDTA 1x preaquecido a 65°C. Deixe as

amostras descansarem por uma noite à temperatura ambiente para ressus- pendê-las totalmente.

11. Na manhã seguinte, agite os tubos suavemente para mistu- rar o conteúdo. Submeta as amostras a gel de agarose para verificar a de- gradação e a presença de RNA e faça quantificação.

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EXEMPLO 14 - transformação com plastídeos de células BY2 individuais de tabaco

Iniciação de células individuais em preparação da transformação com plastídeos

Quatro mililitros de suspensão de células BY2 de tabaco (na fa-

se de crescimento estacionária mantidas em um ciclo de 7 dias) foram adi- cionados e 26 ml de meio fresco composto seja por Meio A [sais LS (Phyto- Technology Laboratories, L689), 120 g/l de sacarose, 1 mg/l de ácido nicotí- nico, 1 mg/l de piridoxina HCI, 10 mg/l de tiamina HCI e 20 nM de difenilpira- zol (DPP)] ou Meio B [sais LS, 120 g/l de sacarose, 1 mg/l de ácido nicotíni- co, 1 mg/l de piridoxina HCI, 10 mg/l de tiamina HCI, 2,5 mg/l de benzilami- 5 nopurina (BAP) e 20 nM de DPP] contidos em um frasco agitado de 125 ml com um tampão de espuma. Os frascos foram colocados em um agitador giratório a uma velocidade de 125 rpm, no escuro, a uma temperatura de 28°C por 7 dias.

Experimento de transformação

Os experimentos de transformação foram iniciados mediante a

diluição de cultivo em suspensão de células BY2 (cultivado como descrito acima) com meio fresco a uma OD650 de 1,0. Para cada alvo de transforma- ção, 1,5 ml de suspensão diluída foram pipetados em um filtro de papel esté- ril colocado no topo de um dispositivo para filtração a vácuo. As células em 15 suspensão foram depositadas de maneira uniforme sobre a superfície do filtro de papel. O filtro de papel e as células foram transferidos para um meio de bombardeio [sais basais MS, vitaminas B5, 18,2 g/l de manitol, 18,2 g/l de sorbitol, 30 g/l de sacarose, 1 mg/l de BAP, 0,1 mg/l de 1-ácido naftalenoa- cético (ANA), 8 g/l de Ágar TC (P/iytoTechnology Laboratories, A175).

Construto de plasmídeo para a transformação de células individuais

O construto de DNA usado neste exemplo foi designado pDAB3969. Os elementos do construto eram flanqueados por seqüências 16S trnl e trnA do genoma do cloroplasto do tabaco. Dois genes, aphA-6 e nptll foram usados como marcadores seletivos guiados pelo gene Prrn mais 25 o gene 10 do fago T7 e promotores PpsbA, respectivamente. O gene 10 do fago T7 também guia o gene de interesse, o TurboGFP.

Bombardeio biolístico das células BY2 individuais

As células permaneceram em meio de bombardeio por 4 horas antes do bombardeio. Os alvos preparados foram bombardeados com um Bio-Rad PDS-1000/He Delivery System. Partículas de ouro (0,4 pm, Inbio Gold, Melbourne, Austrália) foram preparadas e o DNA foi precipitado sobre a sua superfície de acordo com os método padrão. As placas-alvo foram bombardeadas a 7,584 MPa (1100 psi), junto com vácuo de mercúrio de 71,12 cm (28 polegadas) e a 9cm de distân- cia da tela de retenção. As placas foram então postas de lado por um dia, para recuperação. Os filtros de papel e tecidos foram então transferidos para 5 o Meio C [sais LS, 120 g/l de sacarose, 170 mg/l de fosfato de potássio, mo- nobásico, anidro, 0,6 mg/l de tiamina-HCI, 0,2 mg/l de 2,4-D, 8 g/l de ágar TC e 100 mg/l de canamicina] e deixados na placa de seleção original até o surgimento de colônias resistentes. Quando colônias resistentes se desen- volveram até o diâmetro de 4-5 mm, elas foram isoladas em placas individu- 10 ais com o Meio C em gel e expandidas até estarem grandes o bastante para serem amostradas para análise por PCR.

Resultados e discussão

As linhagens de células BY2 foram cultivadas em Meio A e Meio B por 7 dias. Cinco placas-alvo foram preparadas a partir das células culti- 15 vadas em Meio A e cinco placas adicionais foram preparadas a partir das células cultivadas no Meio B. Esses dois meios foram projetados para pro- duzir amiloplastos aumentados mediante incremento do teor de sacarose, remoção da auxina ácido 2,4-diclorofenoxi acético (2,4-D) e, no meio B, pela adição da citoquinina BAP (1, 2). Os amiloplastos aumentados serviram co- 20 mo alvos por laser da transformação biolística. Ambos os meios que conti- nham 20 nM de DPP produziram células individuais. As placas bombardea- das produziram 3 colônias resistentes à canamicina a partir das células tra- tadas do Meio A e 2 colônias resistentes a partir das células tratadas com o Meio B.

Amostras de cada colônia foram colhidas para análise molecular. O DNA foi extraído com o protocolo DNAsey e as alíquotas foram analisadas por PCR usando-se os seguintes conjuntos de iniciadores: _

Nome do iniciador Seqüência do iniciador MAS394 TATGCT GCGTT CGGGAAGGAT GAA conjunto 2 MAS395 GATT AAAAAG AAT AAACAT CCGAT G MAS396 TTGCCTAAGAGAGAGGATGCATCGGA conjunto 3 MAS397 TTGTCTGTTGTG CCCAGTC ATAG C Nome do iniciador Seqüência do iniciador MAS398 TGATATT G CT GAAGAG CTT GGCGG conjunto 4 MAS399 TTGGTGTAGCCGCCGTTGTTGATG MAS400 TGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGC conjunto 5 MAS401 GGCTATGCCATCCTAAGGTGCTGC Segmentos amplificados com iniciadores do construto de

transformação. O iniciador MAS401 insere no plastídeo de tabaco nativo 83 pares de bases além da extremidade do flanco trnA e demonstra a integra- ção no genoma do plastídeo.

As reações de PCR para os conjuntos de iniciadores 2, 3,4 e 5

produziram reações positivas para todas as cinco amostras. O DNA de célu- las BY2 de tipo selvagem (não-transformadas) em suspensão e o controle vegetal de tabaco não produziram quaisquer bandas. Assim, os resultados de PCR indicam a presença de todos os três transgenes e a integração no genoma do plastídeo. Listagem de seqüências

<110> Dow AgroScience LLC

Jayakumarf Pon Samuel Beringer, Jeffrey R.

Schmitzer, Paul

Burroughs, Frank Garisson, Robbi Ainley, William Michael Samboju, Narasimha Chary <120> "MÉTODOS IN VITRO PARA A INDUÇÃO E MANUTENÇÃO DE LINHAGENS CELULARES VEGETAIS EM SUSPENSÃO COMO CÉLULAS INDIVIDUAIS COM PAREDES CELULARES INTAC- TAS E PARA A TRANSFORMAÇÃO DAS MESMAS".

<130> DAS-140XC1 PCT

PCT/US2007/088970 <14 0> 60/878, 028 <141> 2006-12-29 <160> 8

<170> Patente versão 3.3 <210> 1 <211> 24

<212> DNA

<213> iniciador para MAS394 <4 00> 1

tatgctgcgt tcgggaagga tgaa 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Iniciador para MAS395

<4 00> 2

gattaaaaga ataaacatcc gatg 24

<210> 3

<211> 24 <213> Iniciador para MAS396 <400> 3

ttgcctaaga gaggatgcat cgga <210> 4 <211> 24 <212> DNA

<213> Iniciador para MAS397 <4 00> 4

ttgtctgttg tgcccagtca tagc

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Primer MAS398

<4 00> 5

tgatattgct gaagagcttg gcgg <210> 6 <211> 24 <212> DNA

<213> Primer MAS399 <4 00> 6

ttggtgtagc cgccgttgtt gatg <210> 7 <211> 24 <212> DNA

<213> Primer MAS400 <4 00> 7

tggagtacca gcacgccttc aagc <210> 8 <211> 24 <212> DNA

<213> Primer MAS401 <400> 8

ggctatgcca tcctaaggtg ctgc 24

Claims (19)

1. Célula vegetal individual, isolada, compreendendo uma pare- de celular intacta.

2. Método para produzir uma célula como definida na reivindica- ção 1, compreendendo tal método o cultivo de células vegetais compreen- dendo paredes celulares intactas em meio contendo glicerol e um agente separador do grupo consistindo de uma enzima causadora da degradação da pectina e um composto despolimerizador da tubulina.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, sendo o meio men- cionado um meio líquido e estando as células mencionadas em uma sus- pensão.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, sendo o agente se- parador mencionado um composto despolimerizador da tubulina.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, sendo o composto despolimerizador da tubulina mencionado selecionado do grupo consistindo de colchicina e dinitroanilina.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, estando o composto despolimerizador da tubulina mencionado em conformidade com a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 68</formula> na qual X = CO2R, CH2CO2R. CH2CH2CO2R5 (CH2)3CO2R5 OCH2CO2R, OCH(CH3)CO2R, OC(CH3)2CO2R. CH2OCH2CO2R, CH2CH(CO2CH2CH3)CO2R5Ou OCh(CO2Ch2Ch3)CO2R Y = CN, CL Br, Fsou NO2 Ah = fenila substituída, piridina não substituída, 1-3fenila substi- tuída ou 1-3 piridina substituída ou substituída por halogênio ou CN Ar2 = fenila não-substituída, piridina não-substituída, 1-3 fenila substituída, 1-3 piridina substituída ou substituída por halogênio ou CN e R = H ou éster de 1-5 carbono linear ou ramificado

7. Método de acordo com a reivindicação 4, sendo o composto despolimerizador da tubulina mencionado é o etil éster de ácido 4-cloro-1,5- difenil-1 H-pirazol-3-ilóxi)- acético.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, sendo o composto despolimerizador da tubulina <formula>formula see original document page 69</formula>

9. Método de acordo com a reivindicação 2, sendo o agente se- parador uma enzima selecionada do grupo consistindo de pectinase e pecto- liase.

10. Célula de acordo com a reivindicação 1, sendo a célula indi- vidual e isolada mencionada selecionada do grupo consistindo de uma célula algácea, uma célula de dicotiledônea, uma célula de monocotiledônea, uma célula vascular Iowever e uma célula não vascular.

11. Método para transformar uma célula como definida na reivin- dicação 1, compreendendo tal método a preparação de uma célula isolada com o método da reivindicação 2, a transformação de tal célula com um po- Iinucleotideo heterólogo e a seleção de uma célula transformada.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, sendo que a eta- pa de seleção mencionada utiliza seleção sem marcadores.

13. Cultura de células cultivadas de uma célula como definida na reivindicação 1, expressando-se tais células uniformemente.

14. Célula de acordo com a reivindicação 1, sendo tal célula transgênica.

15. Célula de acordo com a reivindicação 1, sendo tal célula transplastômica.

16. Método de acordo com a reivindicação 2, sendo tal método um processo de alta capacidade de produção.

17. Método de acordo com a reivindicação 10, sendo a etapa de transformação mencionada conduzida usando-se um método selecionado do grupo consistindo de polietilenoglicol, eletroporação, biolística e nanopartícu- las.

18. Célula de acordo com a reivindicação 1, sendo tal célula in- dividual e isolada mencionada selecionada do grupo consistindo de uma cé- lula de tabaco, uma célula de cenoura, uma célula de milho e uma célula de orelha-de-macaco.

19. Método de acordo com a reivindicação 2, sendo o meio mencionado selecionado do grupo consistindo em um gel e um meio semis- sólido.