BRPI0720636A2

BRPI0720636A2 - Métodos para tratamento e/ou prevenção de uma doença e de uma alteração, método para a inibição e/ou a prevenção do crescimento de células de tumor no osso e sintomas relacionados com o mesmo, polipeptídeo seletivo para integrina anb3, composição fisiologicamente aceitável, polipeptídeo, método para preparar um polipeptídeo, e, polinucleotídeo

Info

Publication number: BRPI0720636A2
Application number: BRPI0720636-4A
Authority: BR
Inventors: Woei-Jer Chuang; Wen-Mei Fu; Tur-Fu Huang; Wenya Huang; Chih-Hsin Tang; Chiu-Yueh Chen
Original assignee: Univ Nat Taiwan; Dcb Usa Llc
Priority date: 2006-12-26
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2014-01-07
Also published as: US7943728B2; CA2672091A1; NZ598176A; IL199564A; WO2008088548A3; AU2007343734A2; EP2522676A3; RU2012148887A; JP2013151502A; RU2009128647A; EP2124548A4; EP2522676A2; US20080188413A1; CN101677537A; JP2016047818A; AU2007343734A1; TW200848070A; CN101677537B; JP2010514444A; TWI392738B

Description

I “MÉTODOS PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE UMA DOENÇA E DE UMA ALTERAÇÃO, MÉTODO PARA A INIBIÇÃO E/OU A PREVENÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS DE TUMOR NO OSSO E SINTOMAS RELACIONADOS COM O MESMO, 5 POLIPEPTÍDEO SELETIVO PARA INTEGRINA ANB3, COMPOSIÇÃO FISIOLOGICAMENTE ACEITÁVEL, POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA PREPARAR UM POLIPEPTÍDEO, E, POLINUCLEOTÍDEO”

Referência cruzada a pedido de patente relacionado

Este pedido reivindica o benefício, de acordo com 35 U.S.C. §119(e), do Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. n° 60/871.854 depositado em 26 de dezembro de 2006, que é incorporado aqui integralmente por referência.

Descrição da invenção Campo da invenção

A presente invenção refere-se, de uma maneira geral, a

variantes de desintegrina, e, mais especificamente, a variantes de desintegrina como antagonistas seletivos de integrina ανβ3 para o tratamento e a prevenção de doenças associadas com integrina ανβ3.

Fundamentos da invenção O osso é um tecido complexo constituído de vários tipos de

células que são continuamente submetidas a um processo de renovação e reparo denominado “remodelação óssea”. Os dois principais tipos de células responsáveis pela remodelação óssea são osteoclastos, que absorvem osso, e osteoblastos, que formam osso novo. É de conhecimento geral que a 25 remodelação óssea é regulada por vários hormônios sistêmicos (p. ex., hormônio da paratireóide, 1,25-diidróxi vitamina D3, hormônios sexuais, e calcitonina) e fatores locais (p. ex., óxido nítrico, prostaglandinas, fatores de crescimento, e citocinas) [1],

As integrinas são receptores de matriz heterodiméricos que ancoram células a substratos e transmitem sinais derivados externamente através da membrana plasmática [5]. A integrina ανβ3 está envolvida na ressorção óssea mediada por osteoclastos, tanto in vivo [6] e in vitro [7, 8]. Esta molécula de heterodímero reconhece a repetição de aminoácidos Arg- 5 Gly-Asp (RGD, SEQ ID NO: 2) contida em proteínas da matriz óssea, como a osteopontina e a sialoproteína do osso [7, 8], A integrina ανβ3 é expressa em um osteoclasto [9] e sua expressão é modulada por citocinas e esteróides ressorsivos [10]. Com base em experimentos de bloqueio, a integrina ανβ3 foi identificada como um receptor principal da adesão funcional em osteoclastos. 10 Inibidores de integrina ανβ3 reduzem a capacidade de osteoclastos em se ligarem a osso e ressorver osso [7, 11]. A integrina ανβ3 desempenha um papel importante na função de osteoclastos [7, 11, 12] e inibidores desta integrina estão sendo considerados para a prevenção da osteoporose [11], metástases osteolíticas [13] e hipercalcemia induzida por malignidade.

Há muitas doenças ósseas que estão relacionadas com a

osteólise que é mediada por osteoclastos. A osteoporose é aquela mais comum que é induzida quando a ressorção e a formação do osso não são coordenadas, e a degradação óssea supera a formação óssea. A osteoporose também é causada por outras condições, como desequilíbrio hormonal, doenças, ou 20 medicamentos (p. ex., corticosteróides ou agentes anti-epilépticos) [2]. O osso é um dos sítios mais comum de metástase por cânceres humanos como da tireóide, pulmão, próstata e mama, bem como outros cânceres [3, 4]. A osteoporose também pode resultar de deficiência de estrogênio pós- climatérica. A osteoporose secundária pode estar associada com artrite 25 reumatóide. A metástase óssea apresenta uma etapa muito particular de ressorção óssea osteoclástica que não é observada na metástase de outros órgãos. É amplamente aceito que a osteólise associada com câncer é mediada essencialmente por osteoclastos, que parecem estar ativados e que podem ser ativados indiretamente através de osteoblastos ou diretamente por produtos de tumor [4]. Adicionalmente, a hipercalcemia (concentração incrementada de cálcio no sangue) é uma complicação importante de doenças ósseas osteolíticas. Ela ocorre de forma relativamente freqüente em pacientes com uma destruição óssea extensiva, e é particularmente comum em carcinomas da mama, do pulmão, renal, ovariano, e pancreático, e também no mieloma

[4]·

Desintegrinas são uma família de peptídeos contendo RGD com baixo peso molecular que se ligam especificamente a integrinas αΙΉ)β3, α5β1, e ανβ3 expressas em plaquetas e outras células incluindo células endoteliais vasculares e algumas células de tumor [14, 15]. Adicionalmente a sua potente atividade antiplaquetas, estudos realizados em desintegrinas revelaram novos usos no diagnóstico de doenças cardiovasculares, e no projeto de agentes terapêuticos na trombose arterial, osteoporose, e crescimento de tumor relacionado com angiogênese e metástase [15], Verificou-se que a rodostomina (Rho, Rhodostomin), uma desintegrina derivada do veneno de Colloselasma rhodostoma, inibe a agregação de plaquetas in vivo e in vitro [16, 17] através de um bloqueio da glicoproteína de plaqueta αΙΠ}β3. Adicionalmente, reporta-se que a rodostomina inibe a adesão de células de carcinoma da mama e da próstata a ambas as matrizes ósseas extracelulares, não mineralizadas e mineralizadas, de uma maneira dependente da dose, sem afetar a viabilidade de células de tumor. Adicionalmente, a rodostomina inibe a migração e a invasão de células de carcinoma da mama e da próstata [18]. Também mostrou-se que a rodostomina inibe a adipogênese e a obesidade [19]. No entanto, como a rodostomina liga-se de forma não-específica a integrinas α1Ή>β3, α5β1, e ανβ3, os usos farmacêuticos da rodostomina causam sérios efeitos secundários. Por exemplo, quando se aplica rodostomina no tratamento de carcinomas, a inibição da agregação de plaquetas é um efeito secundário indesejável. Portanto, existe uma necessidade na técnica de tratar estas deficiências e inadequações, particularmente em conexão com a preparação de uma variante de desintegrina que apresenta uma seletividade específica para a integrina ανβ3.

Sumário da invenção

De acordo com a invenção, um aspecto da invenção é um polipeptídeo que é seletivo para a integrina ανβ3. O polipeptídeo apresenta reduzida ligação com a integrina αΙΙόβ3 e/ou α5β1 em comparação com uma desintegrina de tipo selvagem. O polipeptídeo é codificado por uma seqüência de nucleotídeos de desintegraina modificada que codifica uma seqüência de aminoácidos modificada, com reduzida atividade de ligação de integrina αΙΓόβ3 e/ou α5β1. O polipeptídeo pode ser peguilado ou conjugado com albumina.

A seqüência de nucleotídeos de desintegrina pode ser derivada de veneno de cobra. A desintegrina pode ser selecionada dentre rodostomina, albolabrina, applagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo que é uma variante de rodostomina, em que a rodostomina compreende a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 1.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo que compreende um aminoácido selecionado da SEQ ID NOs: de 30 a 42.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, que compreende adicionalmente, um, dois, três de quatro substituições de aminoácidos nas posições correspondentes aos aminoácidos 48, 50, 52, ou 53 da SEQ ID NO: I.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo compreendendo substituições de aminoácidos selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, Ile, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 52, e Vai, Leu, e Met na posição 53 da SEQ ID NO: 1.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo que é codificado pela seqüência de nucleotídeos selecionada das SEQ ID NOs: de 43 a 56.

Outro aspecto da invenção é polipeptídeo que apresenta uma diminuição de, pelo menos, cerca de 5, 50, ou 100 vezes da afinidade para allbp3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina. Em uma concretização da invenção, o polipeptídeo apresenta uma diminuição da afinidade de, pelo menos, cerca de 200 vezes para a integrina allbp3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina. Em outra concretização da invenção, o polipeptídeo apresenta uma diminuição da afinidade de, pelo menos, cerca de 1000 ou 2000 vezes para a integrina οϋΚ)β3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina. Em outra concretização da invenção, o polipeptídeo apresenta uma diminuição da afinidade de, pelo menos, cerca de 5, 50, 100, 1000, ou 2000 vezes para plaquetas em comparação com a rodostomina. Em outra concretização adicional da invenção, o polipeptídeo apresenta uma atividade substancialmente reduzida da prolongação do tempo de coagulação do sangue em comparação com a rodostomina e ou uma desintegrina de tipo selvagem.

Outro aspecto adicional da invenção é uma composição fisiologicamente aceitável compreendendo um polipeptídeo da invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo compreendendo

uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69.

Outro aspecto adicional da invenção é um método de usar uma variante de desintegrina para tratamento e/ou prevenção de uma doença associada com integrina ανβ3 em um mamífero incluindo um humano. O método inclui a etapa de administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante de desintegrina. O polipeptídeo empregado no método pode ser peguilado ou conjugado com albumina.

Em um aspecto da invenção, a desintegrina pode ser derivada

de um veneno de cobra, e pode ser selecionada de um dentre rodostomina, albolabrina, applagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, 10 molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

Em um aspecto da invenção, a desintegrina é rodostomina.

Em outro aspecto da invenção, a rodostomina compreende uma variante de rodostomina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

Em outro aspecto, a rodostomina compreende e [n.t.: uma] variante de unidade repetitiva RGD compreendendo um aminoácido selecionado das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

Em outro aspecto, a rodostomina compreende um aminoácido selecionado das SEQ ID NOs: de 57 a 69.

Em um aspecto da invenção, a doença associada com integrina inclui, embora sem limitação, osteoporose, crescimento de câncer ou tumor ósseo e sintomas relacionados com os mesmos, crescimento de tumor relacionado com angiogênese e metástase, metástase de tumor no osso, 25 hipercalcemia induzida por malignidade, doenças oculares relacionadas com angiogênese, doença de Paget, artrite reumática e osteoartrite.

Em outro aspecto da invenção, um polipeptídeo da invenção é usado para tratamento e/ou prevenção de uma doença ocular relacionada com angiogênese, que inclui, embora sem limitação, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, doenças de neovascularização da córnea, retinopatia de neovascularização induzida por isquemia, miopia acentuada, e retinopatia da prematuridade.

Em outro aspecto adicional da invenção, um polipeptídeo da invenção é usado para tratamento e/ou prevenção de osteoporose. A osteoporose é [] pode ser associada com uma condição patológica selecionada dentre deficiência de estrogênio pós-climatérica, osteoporose secundária, artrite reumatóide, ovariectomia, doença de Paget, câncer ósseo, tumor ósseo, osteoartrite, formação incrementada de osteoclastos, e atividade incrementada de osteoclastos. Adicionalmente, a osteoporose inclui, embora sem limitação, uma perda óssea ou osteoporose induzida por ovariectomia ou pós- climatérica.

Outro aspecto adicional da invenção é um método de usar um polipeptídeo da invenção para tratamento e/ou prevenção de uma alteração fisiológica induzida por ovariectomia em um mamífero incluindo um humano.

Outro aspecto adicional da invenção é um método de usar uma variante de desintegrina para a inibição e/ou a prevenção de crescimento de células de tumor no osso e sintomas relacionados com isto em um mamífero incluindo um humano.

Outro aspecto adicional da invenção é um método para preparar um polipeptídeo da invenção, em que o método compreende as etapas como a seguir: (a) transfectar uma célula hospedeira com um polinucleotídeo codificando referido polipeptídeo (b) crescimento de referida célula hospedeira em um meio de cultura; e isolar referido polipeptídeo. O método da invenção pode compreender adicionalmente desenvolver célula hospedeira em um meio de cultura livre de aminoácidos; e recolher sobrenadante para obter referido polipeptídeo. O método pode compreender adicionalmente adicionar metanol ao meio de cultura para induzir a expressão do polipeptídeo nas células hospedeiras. O método pode compreender adicionalmente a etapa de realizar uma cromatografia de coluna para se obter referido polipeptídeo. Em uma concretização, o método pode compreender adicionalmente a etapa de realizar uma HPLC para se obter o polipeptídeo isolado.

Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo seletivo para integrina ανβ3, em que o polipeptídeo pode ser uma variante de uma desintegrina isolada de veneno de cobra.

Em outro aspecto da invenção, a desintegrina é selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

Em outro aspecto da invenção, a desintegrina compreende

rodostomina.

Em outro aspecto da invenção, a desintegrina compreende uma variante de rodostomina compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

Em outro aspecto da invenção, o polipeptídeo compreende uma variante de unidade repetitiva RGD apresentando uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

Em outro aspecto da invenção, o polinucleotídeo compreende uma seqüência selecionada dentre SEQ ID NOs: de43a56ede78al35.

Em outro aspecto da invenção, o polinucleotídeo pode codificam o polipeptídeos com uma, duas, três de quatro substituições de aminoácidos em posições correspondentes aos aminoácidos 48, 50, 52, ou 53 da SEQ ID NO: 1.

Outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo que hibridiza em condições estringentes com um polinucleotídeo da invenção. Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza com uma seqüência de polinucleotídeos da invenção.

Estes e outros aspectos se tomarão aparentes a partir da descrição das várias concretizações a seguir, consideradas em conjunto com os desenhos a seguir, embora seja possível realizar variações e modificações aqui contidas sem se afastar do espírito e escopo dos conceitos inéditos da revelação.

Os desenhos anexos ilustram uma ou mais concretizações da invenção e, em conjunto com a descrição escrita, servem para explicar os princípios da invenção.

Objetos e vantagens adicionais da invenção serão apresentados em parte na descrição a seguir, e em parte serão óbvios a partir da descrição, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetos e vantagens da invenção serão realizados e obtidos por meio dos elementos e combinações indicadas particularmente nas reivindicações anexas.

Deve-se compreender que a descrição geral precedente e a descrição detalhada a seguir são apenas exemplares e explanatórias e não devem restringir a invenção conforme reivindicada.

Os desenhos anexos, que são incorporados aqui e constituem

uma parte desta descrição, ilustram concretizações da invenção e, em conjunto com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção. Breve descrição dos desenhos

A FIG. 1 é um gráfico que mostra menor impacto de RD e HSA-RD e ARLDDL do que proteína rodostomina sobre o tempo de sangramento em camundongos.

A FIG. 2A são fotografias de ossos trabeculares apresentando uma inibição da perda óssea trabecular induzida por ovariectomia em ratos tratados com proteína PGP. Bar = 1 mm. A FIG. 2B são fotografias de ossos trabeculares manchados com fosfatase de ácido resistente a tartarato (TRAP, Tartrate-Resistant Acid Phosphatase) apresentando inibição do aumento, induzido por ovariectomia, do número de osteoclastos em ratos tratados com proteína PGP. Bar =100 mm.

A FIG. 3 é um gráfico que mostra um inibição da ativação de osteoclastos induzida por ovariectomia em ratos tratados com proteína RD ou alendronato (tratamento com droga), efeito da concentração de marcadores de osteoclastos durante o período da retirada da droga, e reversão do aumento, induzido por ovariectomia, da atividade de osteoclastos durante a readministração com RD ou alendronato.

As FIGs. de 4A a 4D são fotografias de junta do joelho manchada com safranina-O e hematoxilina mostrando uma inibição da destruição da camada de condrócitos em ratos artríticos tratados com proteína RD. Setas indicam a camada de condrócitos.

As FIGs. de 5A a 5C são gráficos mostrando a inibição da elevação de citocinas no sangue em rato com osteoartrite tratado com proteína RD.

As FIGs. de 6A a 6C são gráficos mostrando a inibição da elevação de citocinas no sangue em camundongos com osteoartrite tratados com proteína RD.

A FIG. 7 é um gráfico que mostra uma inibição do crescimento de tumor ósseo PC-3 em camundongos SCID tratados com proteína RD, mas não com alendronato.

A FIG. 8 é um gráfico que mostra uma inibição da diminuição induzida por tumor no peso corporal em camundongos SCID tratados com proteína RD.

A FIG. 9A são fotografias apresentando um crescimento de tumor esférico visível na tíbia proximal de cada perna após a injeção intratibial de células PC-3 (mostrado por setas no quadro do meio) e uma inibição do crescimento do tumor ósseo em camundongos SCID tratados com proteína RD.

A FIG. 9B são radiografias de ossos de tíbia mostrando uma inibição da lesão óssea osteolítica induzida por células de tumor PC-3 em camundongos SCID tratados com proteína RD.

A FIG. 9C é um gráfico da quantificação dos dados na FIG. 9B mostrando uma inibição da osteólise induzida por tumor PC-3 em camundongos SCID tratados com proteína RD.

A FIG. 9D é um gráfico que mostra uma inibição do aumento, induzido por tumor PC-3, de telopeptídeos C-terminais do colágeno de tipo I em camundongos SCID tratados com proteína RD.

A FIG. 9E é um gráfico que mostra uma inibição do aumento, induzido por tumor PC-3, da concentração de cálcio no soro em camundongos SCID tratados com proteína RD ou alendronato.

A FIG. IOA é um gráfico que mostra uma inibição do crescimento de tumor ósseo MDA-MB-231 em camundongos nus tratados com proteína RD.

A FIG. IOB é um gráfico que mostra uma inibição do aumento, induzido por tumor ósseo MDA-MB-231, de telopeptídeos C- terminais do colágeno de tipo I em camundongos nus tratados com proteína RD.

A FIG. IOC é um gráfico que mostra uma inibição da hipercalcemia induzida por tumor ósseo MDA-MB-231 em camundongos nus tratados com proteína RD.

A FIG. IOD é um gráfico que mostra nenhuma alteração nas contagens de células brancas do sangue em camundongos nus injetados com células MDA-MB-231 e tratados com proteína RD.

A FIG. IOE é um gráfico que mostra nenhuma alteração nas contagens de células vermelhas do sangue em camundongos nus injetados com células MDA-MB-231 e tratados com proteína RD.

A FIG. IOF é um gráfico que mostra nenhuma alteração nas contagens de plaquetas em camundongos nus injetados com células MDA- MB-231 e tratados com proteína RD.

A FIG. IlA são fotografias mostrando uma reduzida densidade de vasos sanguíneos em tampões MATRIGEL™ de camundongos C57BL/6 tratados com proteína RD ou proteína de albumina RD (HSA-RD) em comparação com camundongos de controle não-tratados.

A FIG. IlB é um gráfico que mostra um reduzido teor de

hemoglobina em tampões MATRIGEL™ de camundongo C57BL/6 tratados com RD (diariamente RD/1 d, ou em dias alternados RD/2d) ou proteína de albumina RD (HSA-RD em dias alternados) em comparação com camundongos de controle não-tratados.

A FIG. 12A são fotografias mostrando angiogênese em um

modelo de camundongo de retinopatia da prematuridade (ROP, retinopathy of prematurity), e reduzida angiogênese em um camundongo ROP tratado com proteína RD (ROP+RD). Setas indicam perfis dos vasos sanguíneos (BVPs, blood vessel profiles).

A FIG. 12B é um gráfico que mostra reduzidos BVPs em um

modelo de camundongo de retinopatia da prematuridade (ROP) tratados com proteína RD.

A FIG. 13 A é um gráfico que mostra uma inibição da ativação de osteoclastos induzida por ovariectomia em camundongos tratados com proteína RD ou de albumina RD.

A FIG. 13B é um gráfico que mostra uma inibição da inativação da fosfatase alcalina (ALP, alkaline phosphatase) induzida por ovariectomia em camundongos tratados com proteína RD ou de albumina RD.

A FIG. 13C é um gráfico que mostra uma inibição da diminuição da BMD [densidade mineral óssea, ou BMD, Bone Mineral Density)] induzida por ovariectomia.

A FIG. 13D é um gráfico que mostra uma inibição do BMC [teor mineral ósseo, ou BMC, Bone Mineral Content)] induzida por ovariectomia.

As FIGS. de 14A a D mostram seqüências de aminoácidos SEQ ID NOs: 1, e de 57 a 69 de variantes de rodostomina.

As FIGS. de 15A a C mostram seqüências de nucleotídeos SEQ ID NOs: de 43 a 56 de variantes de rodostomina.

As FIGS. de 16A a H mostram seqüências de aminoácidos e nucleotídeos SEQ ID NOs: de 78 a 135 de variantes de desintegrina.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção é descrita de forma mais particular nos exemplos a seguir que se destinam a serem apenas ilustrativos, porque aqueles versados na técnica compreenderão que é possível realizar numerosas modificações e variações da mesma. Várias concretizações da invenção são descritas agora de forma detalhada. Como usado na descrição e nas reivindicações a seguir, o significado de “o”, “a”, e “um(a)” inclui referências plurais exceto se o contexto o determinar claramente ao contrário. Também, como usado na descrição e nas reivindicações a seguir, o significado de “em” inclui “em” e “sobre” exceto se o contexto o indicar claramente ao contrário. Adicionalmente, alguns termos usados nesta descrição são definidos abaixo de forma mais específica. Todas as referências citadas e discutidas nesta descrição são incorporadas aqui integralmente por referência e na mesma medida como se cada referência fosse incorporada individualmente por referência.

Far-se-á referência agora, de forma detalhada, às presentes concretizações (concretizações exemplares) incluídas na invenção, em que exemplos das mesmas são ilustrados nos desenhos anexos. Definições

Os termos usados nesta descrição apresentam de uma forma geral os seus significados ordinários na arte, dentro do contexto da invenção, e no contexto específico em que cada termo é usado. Determinados termos que são usados para descrever a invenção são discutidos abaixo, ou alhures na descrição, de forma a proporcionar orientação adicional para o praticante no que se refere à descrição da invenção. Proporciona-se sinônimos para determinados termos. Uma lista de um ou mais sinônimos não exclui o uso de outros sinônimos. O uso de exemplos em qualquer lugar nesta descrição, incluindo exemplos de quaisquer termos discutidos aqui, é meramente ilustrativo, e não limita de qualquer maneira o escopo e o significado da invenção ou de qualquer termo exemplificado. A invenção não é limitada a várias concretizações dadas nesta descrição.

Exceto se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como é comumente compreendido por alguém com prática na técnica a que esta invenção se refere. No caso de conflito, o presente documento, incluindo definições, terá o controle.

“Em tomo de”, “cerca de” ou “aproximadamente” devem significar geralmente 20 porcento, 10 porcento, 5, 4, 3, 2, ou 1 porcento de um dado valor ou faixa. Quantidades numéricas indicadas são aproximadas, significando que o termo “em tomo de”, “cerca de” ou “aproximadamente” pode ser inferido se não for indicado expressamente.

Os termos “polinucleotídeo”, “nucleotídeo”, “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico", “seqüência de ácido nucleico”, “seqüência de polinucleotídeos”, e “seqüência de nucleotídeos” são usados intercambiavelmente para referir a formas poliméricas de nucleotídeos de qualquer comprimento.

Os polinucleotídeos podem compreender desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e/ou seus análogos ou derivados. O termo inclui variantes. Variantes podem incluir inserções, adições, deleções, ou substitutições. Seqüências de nucleotídeos são listadas no sentido de 5' a 3’.

5 Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo”, e “proteína”, usados

intercambiavelmente para referir a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos naturalmente ocorrentes, aminoácidos codificados ou não-codificados, aminoácidos modificados quimicamente ou bioquimicamente, derivados ou projetados, 10 análogos de aminoácidos, peptidomiméticos, e depsipeptídeos, e polipeptídeos apresentando espinhas dorsais peptídicas modificadas, cíclicas, bicíclicas, depsicíclicas, ou depsibicíclicas. O termo inclui proteína de cadeia simples e também multímeros. O termo também inclui proteínas conjugadas a um marcador, como FITC, biotina, e radioisótopos, incluindo, embora sem 15 limitação, 64Cu, 67Cu, 90Y, "mTc, 111In, 124I, 125I, 131I, 137Cs, 186Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 241Am, e 244Cm; enzimas apresentando produtos detectáveis (por exemplo, luciferase, peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, e análogos); fluorescedores e marcadores fluorescentes, metais emissores de fluorescência, por exemplo, 152Eu, ou outros da série dos lantanídeos, 20 compostos eletroquimioluminescentes, compostos quimioluminescentes, por exemplo, luminol, isoluminol, ou sais de acridínio; moléculas de ligação específica, por exemplo, partículas magnéticas, microesferas, nanoesferas, e análogos. O termo também inclui peptídeos conjugada a agentes terapêuticos.

Os termos também incluem proteínas de fusão, incluindo, 25 embora sem limitação, proteínas de fusão de glutationa S-transferase (GST), proteínas de fusão com uma seqüência de aminoácidos heteróloga, como proteínas bioluminescentes, por exemplo, luciferina, ou equorina (proteína fluorescente verde), com sequências-líder heterólogas e homólogas, proteínas de fusão com ou sem radicais metionina N-terminais, proteínas peguiladas, e proteínas marcadas imunologicamente, ou marcadas com his. Referidas proteínas de fusão também incluem fusões com epítopos. Referidas proteínas de fusão podem compreender multímeros dos peptídeos da invenção, p. ex. homodímeros ou homomultímeros, e heterodímeros e heteromultímeros. O termo também inclui aptâmeros peptídicos.

O termo “hibridiza especificamente”, no contexto de um polinucleotídeo, refere-se à hibridização em condições estringentes. Condições que aumentam a estringência de reações de hibridização tanto de DNA/DNA e de DNA/RNA são amplamente conhecidas e publicadas na arte. Exemplos de condições estringentes de hibridização incluem hibridização em

4 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), a cerca de 65 a 70 °C, ou hibridização em 4 X SSC mais 50% de formamida a cerca de 42 a 50°C, seguido de uma ou mais lavagens em IX SSC, a cerca de 65 a 70°C.

O termo “ligante” refere-se a uma molécula que se liga a outra molécula, incluindo um receptor.

Uma "célula hospedeira" é uma célula individual ou cultura de células que pode ser ou que foi um recipiente de qualquer vetor(es) recombinante(s) ou polinucleotídeo. Células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente 20 completamente idêntica (quanto à morfologia ou ao complemento de DNA total) à célula parental original em virtude de alteração e/ou mutação natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células tranfectadas ou infectadas in vivo ou in vitro com um vetor recombinante ou um polinucleotídeo da invenção. Uma célula hospedeira que compreende um 25 vetor recombinante da invenção pode ser denominada uma “célula hospedeira recombinante”.

“Tratamento” abrange qualquer administração ou aplicação de medicamentos para doença em um mamífero, incluindo um humano, e inclui inibir a doença, interromper seu desenvolvimento, ou aliviar a doença, por exemplo, causando regressão, ou restaurando ou reparando uma função perdida, faltante, ou defectiva; ou estimular um processo ineficiente. O termo inclui obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado, abrangendo qualquer tratamento de uma condição patológica ou desordem em um mamífero, incluindo um humano. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completamente ou parcialmente uma desordem ou sintoma do mesmo e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para uma desordem e/ou efeito adverso atribuível à desordem. Assim, invenção proporciona tanto tratamento como também profilaxia. Ela inclui (1) prevenir a ocorrência da desordem ou a recorrência em um sujeito que pode estar predisposto à desordem, mas que ainda não é sintomático, (2) inibir a desordem, como interromper seu desenvolvimento, (3) encerrar ou terminar a desordem ou, pelo menos, seus sintomas associados, de forma que o hospedeiro não sofra mais da desordem ou de seus sintomas, como causar a regressão da desordem ou de seus sintomas, por exemplo, por meio da restauração ou do reparo de uma função perdida, faltante ou defectiva, ou estimular um processo ineficiente, ou (4) remediar, aliviar, ou melhorar a desordem, ou sintomas associados com a mesma, em que melhorar é usado em um sentido amplo para referir a, pelo menos, uma redução na magnitude de um parâmetro, como inflamação, dor, e/ou tamanho do tumor.

Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um sólido, semissólido ou carga líquida, diluente, material encapsulante, auxiliar de formulação, ou excipiente não-tóxico de qualquer tipo convencional. Um veículo farmaceuticamente aceitável é não-tóxico para recipientes nas 25 dosagens e concentrações empregadas, e é compatível com outros ingredientes da formulação.

Uma “composição” refere-se a uma mistura que contém usualmente um veículo, como um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente que é convencional na arte, e que é vantajoso para a administração em um sujeito para fins terapêuticos, diagnósticos, ou profiláticos. Ela pode incluir uma cultura de células em que o polipeptídeo ou polinucleotídeo está presente nas células ou no meio de cultura. Por exemplo, composições para administração oral podem formar soluções, suspensões, tabletes, pílulas, 5 cápsulas, formulações de liberação sustentada, enxaguantes bucais, ou pós.

“Doença” refere-se a qualquer condição, infecção, desordem, ou síndrome que requer intervenção médica ou para a qual é desejável intervenção médica. Referida intervenção médica pode incluir tratamento, diagnóstico, e/ou prevenção.

Peptídeos

Os peptídeos da invenção podem ser expressos usando-se métodos conhecidos na arte. Métodos à base de células métodos isentos de células são vantajosos para produzir peptídeos da invenção. Métodos à base de células envolvem geralmente introduzir uma construção de ácido nucleico 15 em uma célula hospedeira in vitro e cultivar a célula hospedeira em condições vantajosas para a expressão, depois colher o peptídeo, seja do meio de cultura ou da célula hospedeira, (por exemplo, rompendo a célula hospedeira), ou ambos. A invenção também proporciona métodos de produzir um peptídeo usando métodos de transcrição/tradução in vitro isentos de células, que são 20 bem conhecidos na arte.

Células hospedeiras vantajosas incluem células procarióticas ou eucarióticas, incluindo, por exemplo, células bacterianas, de levedura, fungicas, de plantas, insetos, e mamíferas.

Tipicamente, um peptídeo heterólogo, seja modificado ou não- 25 modificado, pode ser expresso por si só, como descrito acima, ou como uma proteína de fusão, e pode incluir não só sinais de secreção, mas também uma sequência-líder secretora. Uma sequência-líder secretora da invenção pode dirigir determinadas proteínas a um retículo endoplasmático (ER, endoplasmic reticulum). O ER separa as proteínas ligadas a membrana de outras proteínas. Uma vez localizadas no ER, proteínas podem ser dirigidas adicionalmente ao aparelho de Golgi para distribuição a vesículas, incluindo vesículas secretoras, a membrana plasmática, lisossomas, e outras organelas.

Adicionalmente, é possível adicionar aos peptídeos porções de peptídeos e/ou marcadores de purificação. Referidas regiões podem ser removidas antes da preparação final do polipeptídeo. A adição de porções de peptídeos a polipeptídeos para gerar secreção ou excreção, para melhorar a estabilidade, e para facilitar a purificação, entre outras razões, são técnicas familiares e rotineiras na arte. Marcadores de purificação vantajosos incluem, por exemplo, V5, poli-histidinas, avidina, e biotina. A conjugação de peptídeos a compostos, como biotina, pode ser realizada usando-se técnicas bem conhecidas na arte. (Hermanson ed. (1996) Bioconiugate Techniques; Academic Press). Peptídeos também podem ser conjugados com radioisótopos, toxinas, enzimas, marcadores fluorescentes, ouro coloidal, ácidos nucleicos, vinorelbina, e doxorrubicina usando-se técnicas conhecidas na arte. (Hermanson ed. (1996) Bioconiugate Techniques; Academic Press; Stefano et al. (2006).

Parceiros de fusão vantajosos para uso na invenção incluem, por exemplo, fetuína, albumina de soro humano, Fe, e/ou um ou mais dos seus fragmentos. Proporciona-se também proteínas conjugadas, como conjugados de polietileno glicol.

Os peptídeos da invenção também podem ser sintetizados quimicamente usando-se técnicas conhecidas na técnica (p. ex., ver Hunkapiller et al., Nature, 310:105 111 (1984); Grant ed. (1992) Synthetic 25 Peptides1 A Users Guide, W.H. Freeman e Co.; Patente dos Estados Unidos n° 6.974.884)). Por exemplo, um polipeptídeo correspondente a um fragmento de um polipeptídeo pode ser sintetizado por meio do uso de um sintetizador de peptídeos ou por meio do uso de métodos de fase sólida conhecidos na arte. Adicionalmente, se desejado, é possível introduzir aminoácidos não-clássicos ou análogos de aminoácidos químicos como uma substituição ou adição na seqüência de polipeptídeo. Aminoácidos não- clássicos incluem, embora sem limitação, os isômeros D dos aminoácidos 5 comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4- aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, omitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, 10 cicloexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos projetados, como aminoácidos de b-metila, aminoácidos de Ca-metila, aminoácidos de Na-metila, e análogos de aminoácidos em geral. Adicionalmente, o aminoácido pode ser D (dextrorrotativo) ou L (levorrotativo).

Os polipeptídeos da invenção podem ser recuperados e 15 purificados a partir de síntese química e culturas de células recombinantes por meio de métodos convencionais que incluem, embora sem limitação, sulfato de amônio ou precipitação com etanol, extração com ácido, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de 20 hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Em uma concretização, emprega-se

____r

para a purificação cromatografia líquida de alto desempenho (“HPLC”). E possível empregar técnicas bem conhecidas para redobragem de proteína, para gerar conformação ativa quando o polipeptídeo é desnaturado durante o isolamento e/ou a purificação.

Um peptídeo ou peptidomimético da invenção pode ser

modificado com, ou acoplado covalentemente a, um ou mais de uma variedade de polímeros hidrofilicos para aumentar a solubilidade e a meia- vida do peptídeo na circulação. Polímeros hidrofilicos não-proteináceos vantajosos para acoplamento a um peptídeo incluem, embora sem limitação, polialquiléteres como exemplificado por polietileno glicol e polipropileno glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polioxialquenos, álcool de polivinila, polivinilpirrolidona, celulose e derivados de celulose, dextrano, e derivados de dextrano. De uma maneira geral, referidos polímeros hidrofilicos 5 apresentam um peso molecular médio na faixa de cerca de 500 a cerca de

100.000 daltons, de cerca de 2.000 a cerca de 40.000 daltons, ou de cerca de

5.000 a cerca de 20.000 daltons. O peptídeo pode ser derivado com, ou acoplado a, referidos polímeros usando-se qualquer um dos métodos indicados por Zallipsky, S. (1995) Bioconjugate Chem., 6:150-165;

Monfardini, C., et al. (1995) Bioconiugate Chem. 6:62-69; Patentes dos Estados Unidos nums. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; 4.179.337, ou WO 95/34326.

Em algumas concretizações, um peptídeo da invenção é proporcionado em formulação com veículos, excipientes e diluentes farmaceuticamente aceitáveis, dos quais uma ampla variedade é conhecida na arte. Estes veículos, excipientes e diluentes farmacêuticos incluem aqueles listados na listagem de excipientes farmacêuticos da USP. Excipientes USP e NF, Listados por Categorias, p. 2404-2406, USP 24 NF 19, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, Md. (ISBN 1-889788-03-1). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis, como veículos, adjuvantes, suportes, ou diluentes, são facilmente obteníveis pelo público. Além disso, substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, como agentes ajustadores de pH e agentes tamponadores, agentes ajustadores da tonicidade, estabilizantes, agentes umectantes e análogos, podem ser facilmente obtidos pelo público.

Veículos vantajosos incluem, embora sem limitação, água, dextrose, glicerol, solução salina, etanol, e combinações dos mesmos. O veículo pode contêm agentes adicionais, como agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponadores de pH, ou adjuvantes que aumentam a efetividade da formulação. Veículos tópicos incluem petróleo líquido, palmitato de isopropila, polietileno glicol, etanol (95%), monolaurato de polioxietileno (5%) em água, ou lauril sulfato de sódio (5%) em água. Outros materiais, como anti-oxidantes, umectantes, estabililzadores da viscosidade, e 5 agentes similares podem ser adicionados conforme necessário. Também é possível incluir acentuadores da penetração percutânea, como Azona.

Em formas de dosagem farmacêuticas, as composições da invenção podem ser administradas em forma de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ou elas também podem ser usadas sozinhas ou em associação 10 vantajosa, bem como em combinação, com outros compostos farmaceuticamente ativos. As composições em pauta são formuladas de acordo com o modo de administração potencial.

Métodos de tratamento

Uma doença associada com integrina ανβ3 inclui, embora sem 15 limitação, osteoporose, crescimento de câncer ou tumor ósseo e sintomas relacionados com isto, crescimento de tumor relacionado com angiogênese e metástase, metástase de tumor no osso, hipercalcemia induzida por malignidade, doenças oculares relacionadas com angiogênese, doença de Paget, artrite reumática e osteoartrite.

Peptídeos da invenção podem ser administrados a um sujeito

que necessita de tratamento por injeção, sistemicamente, como por meio de injeção intravenosa; ou por meio de injeção ou aplicação no sítio relevante, como por meio de injeção direta, ou aplicação direta no sítio quando o sítio é exposto na cirurgia; ou por meio de aplicação tópica, como se a desordem for na pele, por exemplo.

Peptídeos da invenção podem ser usados como monoterapia. Alternativamente, os peptídeos da invenção podem ser usados em combinação com regimes convencionais para tratar doenças associadas com a integrina ανβ3. A administração dos agentes pode ser realizada de diversas maneiras, incluindo administração oral, bucal, nasal, retal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra- arterial, intracardíaca, intraventricular, intracraniana, intratraqueal, e intratecal, etc., ou, de outra forma, por implantação ou inalação. Assim, as composições em pauta podem ser formuladas em preparações em formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas, como tabletes, cápsulas, pós, grânulos, ungüentos, soluções, supositórios, injeções, inalantes e aerossóis. Os métodos e excipientes a seguir são meramente exemplares e de forma alguma limitantes.

Veículos excipientes vantajosos compreendem, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou análogos, e combinações dos mesmos.

Adicionalmente, se desejado, o veículo pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares, como agentes umectantes ou emulsificantes, ou agentes tamponadores de pH. Métodos eficazes de preparação de referidas formas de dosagem são conhecidos, ou serão compreensíveis por aqueles versados na arte. A composição ou formulação a ser administrada conterá, em qualquer caso, uma quantidade do agente adequado para se obter o estado desejado no sujeito que está sendo tratado.

Um peptídeo da invenção pode ser formulado em preparações para injeção por meio de dissolução, suspensão ou emulsificação dos mesmos em um solvente aquoso ou não-aquoso, como óleos vegetais ou outros óleos similares, glicerídeos de ácido alifático sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores ou propileno glicol; e se desejado, com aditivos convencionais, como solubilizantes, agentes isotônicos, agentes de suspensão, agentes emulsificantes, estabilizadores, e conservantes. Outras formulações para fornecimento oral ou parenteral também podem ser usadas, como é convencional na arte. “Desintegrinas” referem-se a uma família de polipeptídeos que podem ser purificados a partir de venenos de cobras, que contêm a seqüência arginina-glicina-ácido aspártico (sigla em inglês, RGD). Sem desejar ater-nos a qualquer teoria ou mecanismo, acredita-se que o tripeptídeo RGD liga-se com alta afinidade a integrinas para bloquear a interação de integrinas com proteínas contendo RGD. Desta forma desintegrinas bloqueiam funções adesivas e atuam como inibidores da agregação de plaquetas.

A abreviatura “Rho” significa “rodostomina”, que é uma desintegrina derivada do veneno da Colloselasma rhodostoma. A rodostomina liga-se de forma não-específica a integrinas αΙΠ)β3, α5β1 e ανβ3, e prolonga o tempo de coagulação do sangue mediante a inibição da agregação de plaquetas via o bloqueio da glicoproteína de plaquetas αΙΛβ3.

A "variante de desintegrina” ou “variante de rodostomina” refere-se a uma proteína funcionalmente ativa, ou a um polipeptídeo ou a quaisquer derivados do mesmo, compreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada ou modificada ou mutada de uma desintegrina de tipo selvagem, como rodostomina. Uma variante de rodostomina/desintegrina funcionalmente ativa pode ligar-se especificamente à integrina ανβ3 e inibir sua atividade. A variante de desintegrina ou rodostomina da presente invenção pode ser construída por meio de qualquer método vantajoso para os fins da presente invenção, e, em uma concretização, por meio de um método de mutagênese dirigida para sítio, e, em outra concretização, por meio de um método de reação em cadeia de polimerase. Variantes podem incluir inserções, adições, deleções, ou substitutições comparadas com os peptídeos- objeto. Variantes de seqüências de polipeptídeos incluem variantes polimórficas biologicamente ativas.

Peptídeos da invenção podem incluir aminoácidos naturalmente ocorrentes e não-naturalmente ocorrentes. Peptídeos podem compreender aminoácidos D, uma combinação de aminoácidos D- e L- aminoácidos, e vários aminoácidos “projetados” ou “sintéticos” (por exemplo, aminoácidos de β-metila, aminoácidos de Ca-metila, e aminoácidos de Na- metila, etc.) para proporcionar propriedades especiais. Adicionalmente, peptídeos podem ser cíclicos. Peptídeos podem incluir aminoácidos não-

5 clássicos de forma a introduzir unidades repetitivas conformacionais particulares. É possível usar qualquer aminoácido não-clássico conhecido. Análogos de aminoácidos e peptidomiméticos podem ser incorporados em um peptídeo para induzir ou favorecer estruturas secundárias específicas, incluindo, embora sem limitação, LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona- 10 6-carboxílico), um análogo de dipeptídeo indutor de volta β; análogos indutores de lâmina β; análogos indutores de volta β; análogos indutores de hélice a; análogos indutores de volta γ; análogos de volta Gly-Ala; isóstero de ligação de amida; ou tretrazol, e análogos.

Um radical desamino ou descarbóxi pode ser incorporado nas 15 pontas terminais do peptídeo, de modo que não há grupo carboxila ou amino terminal para diminuir a suscetibilidade a proteases ou para restringir a conformação. Grupos funcionais C-terminais incluem amida, alquil amida inferior, amida di (alquila inferior), alcóxi inferior, hidróxi, e carbóxi, e os seus derivados de éster inferior, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 20 O termo “IC5o”, ou “a concentração inibidora semi-máxima”

refere-se à concentração de Rho ou de sua variante que é requerida para uma inibição de 50% do seu receptor. A IC50 é uma medida de quanta Rho ou de sua variante é necessária para inibir um processo biológico em 50%, como a afinidade da variante por seu receptor.

O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” como usado

refere-se a uma quantidade que, quando administrada a um sujeito vivo, proporciona um efeito desejado sobre o sujeito vivo. Por exemplo, uma quantidade eficaz da variante de Rho ou desintegrina da invenção para administração ao sujeito vivo é uma quantidade que previne e/ou trata uma doença mediada por integrina ανβ3. A quantidade exata dependerá da finalidade do tratamento, e será discemível por alguém com prática na técnica mediante o uso de técnicas conhecidas. Como é de conhecimento geral na arte, podem ser necessários ajustes para o fornecimento sistêmico versus o 5 fornecimento localizado, idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, interação de drogas, e a gravidade da condição, e que poderão ser determinados por aqueles versados na técnica via experimentação de rotina.

O termo “antagonista de receptor” refere-se a um ligante de ligação de um receptor que inibe a função de um receptor através do bloqueio da ligação de um agonista ao receptor, ou que permite ligação de agonista, mas que inibe a capacidade do agonista em ativar o receptor.

O termo “atividade substancialmente reduzida de bloqueio do receptor de integrina αΙΠ)β3 e/ou α5β1” refere-se a uma atividade reduzida, 15 em pelo menos cinco vezes, do bloqueio do receptor de integrina allbp3 e/ou α5β1 em comparação com uma rodostomina de tipo selvagem ou outras desintegrinas. Por exemplo, para calcular a redução da atividade de bloqueio do receptor de αΙΠ)β3 e/ou α5β1, a IC50 de uma variante de rodostomina para a inibição da ligação de integrina αΙΛβ3 e/ou α5β1 a uma proteína de matriz, 20 como fibrinogênio, é comparada com a IC5o de Rho.

O termo “variante de unidade repetitiva RGD” refere-se a um peptídeo compreendendo uma modificação na seqüência de aminoácidos que abrange a seqüência RGD de uma seqüência de tipo selvagem correspondente, como a seqüência compreendendo RGD na Rodostomina. 25 Exemplos dentre “variantes de unidades repetitivas RGD” incluem 48ARGDDP53, 48PRLDMP53, 48PRIDMP53, e 48ARLDDL53.

O termo “RD” refere-se a uma variante de rodostomina apresentando uma variante de unidade repetitiva RGD 48PRLDMP53.

O termo “PGP” refere-se a uma variante de rodostamina que apresenta uma variante de unidade repetitiva RGD 48PRGDGP53.

O termo ARLDDL refere-se a uma variante de rodostamina que apresenta uma variante de unidade repetitiva RGD 48ARLDDL53.

O termo “seletividade inibidora para a integrina ανβ3 5 relativamente a receptores de allbp3 e/ou α5β1” refere-se à seletividade de ligação de uma variante para a integrina ανβ3 sobre receptores de αΙ^β3 e/ou α5β1, que é expressa como uma relação da IC5o da variante para inibição de receptores de αΙΛβ3 e/ou α5β1 relativamente àquela para inibição de receptor de ανβ3.

O termo “atividade substancialmente reduzida do

prolongamento do tempo de sangramento do sangue” refere-se a uma capacidade reduzida de inibir a coagulação do sangue de uma maneira estatisticamente significativa conforme medido por meio do experimento de tempo de sangramento descrito na descrição.

O termo “RD peguilado” refere-se a um produto de proteína

RD peguilado.

O termo “albumina-RD, ou HSA-RD” refere-se a um produto conjugado com albumina humana da proteína RD.

Sinopse da invenção

A presente invenção refere-se a variantes de desintegrina que

são antagonistas seletivos da integrina ανβ3. Variantes de desintegrina, como compostos relacionados com RD inibem potencialmente a diferenciação de osteoclastos in vitro. Elas também inibem a atividade de ressorção de osteoclastos e o aumento, induzido por ovariectomia, da formação de

osteoclastos em estudos animais. Adicionalmente, a RD inibe o crescimento de tumor da próstata humana e de células de câncer de mama no osso. A hipercalcemia induzida por malignidade também foi bloqueada eficazmente por proteínas relacionadas com RD. A doença de Paget (também conhecida como osteíte deformante) é uma desordem óssea crônica que resulta tipicamente em ossos ampliados e deformados em virtude de degradação irregular e formação de tecidos ósseos. Biofosfonatos foram aprovados para o tratamento da doença de Paget. A osteoartrite também está relacionada com o aumento da atividade de osteoclastos. Com base em mecanismo de ação semelhante, derivados de RD também deveriam ser eficazes para o tratamento destas desordens ósseas. Uma injeção intravenosa de RD ou PGP numa dose muito grande a 30 mg/kg não afetou a sobrevivência de camundongos (n=3). Adicionalmente, a administração de longo prazo de PGP (I.V., 0,5 mg/kg/dia) durante 6 semanas não afetou o nível de creatinina no soro, GOT, e GPT, sugerindo uma falta de efeitos secundários sobre o rim e o fígado. Portanto, RD e seus derivados são candidatos de droga potenciais para o tratamento de osteoporose, tumor ósseo, hipercalcemia induzida por malignidade, doença de Paget, artrite reumática, osteoartrite e doenças oculares relacionadas com angiogênese.

Muitos tipos de veneno de cobra contêm proteínas que compreendem um domínio RGD. Estas proteínas contendo domínio RGD são denominadas desintegrinas. Uma modificação na seqüência que abrange o domínio RGD resultou em uma variante de polipeptídeo muito particular com uma reduzida afinidade de ligação para outros tipos de integrinas, mas com uma seletividade aumentada para a integrina ανβ3. As variantes de desintegrina incluindo variantes de rodostomina provam que são candidatos terapêuticos potenciais para, entre outros, osteoporose, supressão de crescimento de tumor no osso, e doenças oculares relacionadas com angiogênese. Adicionalmente, variantes de desintegrina incluindo variantes de rodostomina apresentando uma região de unidade repetitiva RGD, com pelo menos uma substituição de aminoácido, podem ser ferramentas valiosas para desenvolver antagonistas seletivos da integrina ανβ3.

Um aspecto da invenção é um polipeptídeo que apresenta atividade antagonista de receptor de integrina ανβ3 e reduzida atividade bloqueadora de receptor de integrina αΙΙόβ3 e/ou α5β1 em comparação com uma desintegrina de tipo selvagem. O polipeptídeo é codificado por uma seqüência modificada de nucleotídeos de desintegrina que codifica uma seqüência de aminoácidos modificada, que resulta em um polipeptídeo apresentando atividade bloqueadora substancialmente reduzida de receptor de integrina αΙΉ)β3 e/ou α5β1. O polipeptídeo pode ser peguilado ou conjugado com albumina.

A seqüência de nucleotídeos de desintegrina pode ser derivado de veneno de cobra. De acordo com a invenção, desintegrinas incluem, embora sem limitação, albolabrina (Cryptelytrops albolabris), aplagina (Agkistrodon piscivorus piscivorus), basilicina (Crotalus basiliscus), batroxostatina (Bothrops atrox), bitistatina (Bitis arietans), cereberina (<Crotalus oreganus cerberus), cerastina (Crotalus cerastes cerastes), crotatroxina (Crotalus atrox), durissina (Crotalus durissus durissus), elegantina (Protobothrops elegans), flavoridina (Trimeresurus flavoviridis), flavostatina (Trimeresurus flavoviridis), halisina (Gloydius blomhoffi), halistatina (Gloydius halys), jararacina (Bothrops jararaca), jarastatina (.Bothrops jararaca), quistrina (Calloselasma rhodostoma), laquesina (.Lachesis muta muta), lutosina (Crotalus oreganus lutosus), molossina (Crotalus molossus molossus), salmosina (Gloydius blomhojfi brevicaudus), saxatilina (Gloydius halys), tergeminina (,Sistrurus catenatus tergeminus), trimestatina (Trimeresurus flavoviridis), trimucrina (Protobothrops mucrosquamatus), trimutase (Protobothrops mucrosquamatus), ussuristatina (Gloydius ussuriensis), viridina (Crotalus viridis).

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo isolado que é uma variante de rodostomina, em que a rodostomina compreende uma seqüência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, e a variante compreende uma variante de unidade repetitiva RGD.

Em uma concretização da invenção, a variante de unidade repetitiva RGD pode conter uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, que compreende adicionalmente, uma, duas, três de quatro substituições de aminoácidos em posições correspondentes aos aminoácidos 48, 50, 52, ou 53 da SEQ ID NO: 1.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo que é codificado [por] seqüência de nucleotídeos selecionada dentre as SEQ ID NOs: de 43 a 56.

Por exemplo, e especificamente, em outra concretização da

invenção, a variante de unidade repetitiva RGD pode compreender pelo menos uma substituição de aminoácido em um radical correspondente a Gly50

52

ou Met da unidade repetitiva RGD de tipo selvagem apresentada pela SEQ ID NO: 29. A pelo menos uma substituição de aminoácido ocorre em um radical correspondente a Leu50 da SEQ ID NO: 36-37, Ile50 da SEQ ID NO: 39, His50 da SEQ ID NO: 40, Asn52 da SEQ ID NO: 41, ou Gly52 da SEQ ID NO: 42.

Em outra concretização da invenção, a variante de unidade repetitiva RGD pode compreender pelo menos duas substituições de 25 aminoácidos nos radicais correspondentes a Pro48 e Met52, ou Met52 e Pro53 da unidade repetitiva RGD de tipo selvagem apresentada pela SEQ ID NO: 29. As pelo menos duas substituições de aminoácidos podem ser radicais correspondentes a Ala48 e Asp52 da SEQ ID NO: 30, ou Asp52 e Met53 da SEQ ID NO: 35. Em outra concretização adicional da invenção, a variante de unidade repetitiva RGD pode compreender pelo menos três substituições de aminoácidos nos radicais correspondentes a Pro48, Met52 e Pro53, ou Gly50, Met52 e Pro53 da unidade repetitiva RGD de tipo selvagem apresentada pela 5 SEQ ID NO: 29. As pelo menos três substituições de aminoácidos podem ser radicais correspondentes a Ala48, Asp52 e Val53 da SEQ ID NO: 31, Ala48, Asp52 e Leu53 da SEQ ID NO: 32, Ala48, Asp52 e Met53 da SEQ ID NO: 34, Leu50, Asp52 e Leu53 da SEQID NO: 37.

Em outra concretização adicional da invenção, a variante de 10 unidade repetitiva RGD pode compreender pelo menos quatro substituições de aminoácidos nos radicais correspondentes a Pro48, Gly50, Met52 e Pro53 da unidade repetitiva RGD de tipo selvagem apresentada pela SEQ ID NO: 29. As pelo menos quatro substituições de aminoácidos podem ser radicais correspondentes a Ala48, Leu50, Asp52eLeu53 da SEQ ID NO: 38.

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo isolado que é

codificado por um DNA apresentando uma seqüência de nucleotídeos de rodostomina modificada selecionada dentre as SEQ ID NOs: 44-56. O polipeptídeo apresenta um aumento de pelo menos cerca de 5, 50, ou 100 vezes da afinidade para αΙΠ)β3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina. 20 Em uma concretização da invenção, o polipeptídeo apresenta uma diminuição de, pelo menos, cerca de 200 vezes da afinidade para a integrina αΙΙόβ3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina. Em outra concretização da invenção, o polipeptídeo apresenta uma diminuição da afinidade de, pelo menos, cerca de 1000 ou 2000 vezes para a integrina αΙΛβ3 e/ou α5β1 em 25 comparação com a rodostomina. Em outra concretização da invenção, o polipeptídeo apresenta uma diminuição de, pelo menos, cerca de 5, 50, 100, 1000, ou 2000 vezes da afinidade para plaquetas em comparação com a rodostomina. Em outra concretização adicional da invenção, o polipeptídeo apresenta uma atividade substancialmente reduzida da prolongação do tempo de coagulação do sangue em comparação com a rodostomina ou desintegrina de tipo selvagem.

Outro aspecto adicional da invenção é uma composição fisiologicamente aceitável compreendendo um polipeptídeo da invenção e um 5 veículo farmaceuticamente aceitável.

Outro aspecto adicional da invenção é um método de usar uma variante de desintegrina para tratamento e/ou prevenção de uma doença associada com integrina ανβ3 em um mamífero incluindo um humano. O método inclui a etapa de administrar ao mamífero que disto necessita uma 10 quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. O polipeptídeo ali contido apresenta atividade antagonista de receptor de integrina ανβ3 e atividade bloqueadora de receptor de integrina αΙΠ>β3 e/ou integrina α5β1 substancialmente reduzida em comparação com uma desintegrina de tipo selvagem, e, com isto, resulta 15 no tratamento e/ou prevenção da doença associada com integrina ανβ3 no mamífero. O polipeptídeo é codificado por uma seqüência modificada de nucleotídeos de desintegrina que codifica uma seqüência modificada de aminoácidos de desintegrina, que resulta em um polipeptídeo apresentando atividade bloqueadora de receptor de integrina αΙΙόβ3 e/ou integrina α5β1 20 substancialmente reduzida. O polipeptídeo empregado no método pode ser peguilado ou conjugado com albumina.

Como descrito acima, a seqüência de nucleotídeos de desintegrina pode ser derivado de um veneno de cobra, e pode ser selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, 25 bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

Em uma concretização da invenção, o método inclui a etapa de administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável, em que o polipeptídeo compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:

1, e a variante compreende uma variante de unidade repetitiva RGD.

5 Em outra concretização da invenção, o método inclui a etapa

de administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o polipeptídeo é uma variante de rodostomina compreendendo a seqüência de aminoácidos definida pela 10 SEQ ID NO: 1, e a variante compreende uma variante de unidade repetitiva RGD apresentando uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

Em outra concretização adicional da invenção, o método inclui a etapa de administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69.

Em uma concretização da invenção, um polipeptídeo da invenção é usado para tratamento e/ou prevenção de uma doença associada 20 com integrina ανβ3, que inclui, embora sem limitação, osteoporose, crescimento de câncer ou tumor ósseo e sintomas relacionados com isto, crescimento de tumor relacionado com angiogênese e metástase, metástase de tumor no osso, hipercalcemia induzida por malignidade, doenças oculares relacionadas com angiogênese, doença de Paget, artrite reumática, e 25 osteoartrite.

Em outra concretização da invenção, um polipeptídeo da invenção é usado para tratamento e/ou prevenção de uma doença ocular relacionada com angiogênese, que inclui, embora sem limitação, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, doenças de neovascularização da córnea, retinopatia de neovascularização induzida por isquemia, miopia acentuada, e retinopatia da prematuridade.

Em outra concretização adicional da invenção, um polipeptídeo da invenção é usado para tratamento e/ou prevenção de osteoporose. A osteoporose é associada com uma condição patológica selecionada dentre deficiência de estrogênio pós-climatérica, osteoporose secundária, artrite reumatóide, ovariectomia, doença de Paget, câncer ósseo, tumor ósseo, osteoartrite, formação incrementada de osteoclastos, e atividade incrementada de osteoclastos. Adicionalmente, a osteoporose inclui, embora sem limitação, uma perda óssea ou osteoporose induzida por ovariectomia e osteoporose pós-climatérica ou perda óssea.

Outro aspecto adicional da invenção é um método de usar a uma variante de desintegrina para tratamento e/ou prevenção de alterações fisiológicas em um mamífero incluindo um humano induzidas por ovariectomia ou osteoporose pós-climatérica. O método inclui administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que apresenta atividade antagonista de receptor de integrina ανβ3 e atividade bloqueadora de receptor de integrina αΙΉ>β3 e/ou α5β1 substancialmente reduzida em comparação com uma desintegrina de tipo selvagem, e resulta, com isto, no tratamento e/ou na prevenção da alteração fisiológica induzida por ovariectomia no mamífero. O polipeptídeo é codificado por uma seqüência modificada de nucleotídeos de desintegrina que codifica uma seqüência de aminoácidos modificada resultando em referido polipeptídeo apresentando atividade bloqueadora de receptor de integrina αΙΠ)β3 e/ou α5β1 substancialmente reduzida. A seqüência de nucleotídeos de desintegrina pode ser derivada de um veneno de cobra, e pode ser selecionada de um dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

A variante de polipeptídeo usada para o tratamento e/prevenção de uma alteração fisiológica pós-climatérica ou induzida por ovariectomia no mamífero pode conter uma variante de unidade repetitiva RGD que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

Em uma concretização da invenção, o método inclui administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a variante de polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69. Em outra concretização, a variante de polipeptídeo é peguilada ou conjugada com albumina.

Outro aspecto adicional da invenção é um método de usar a uma variante de desintegrina para a inibição e/ou a prevenção de crescimento de células de tumor no osso e sintomas relacionados com isto em um mamífero incluindo um humano. O método inclui administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que apresenta atividade antagonista de receptor de integrina ανβ3 e atividade bloqueadora de receptor de integrina αΙΠ)β3 e/ou α5β1 substancialmente reduzida em comparação com uma desintegrina de tipo selvagem, e resultando com isto na inibição e/ou prevenção de crescimento de células de tumor no osso e sintomas relacionados com isto no mamífero. O polipeptídeo é codificado por uma seqüência modificada de nucleotídeos de desintegrina que codifica uma seqüência de aminoácidos modificada e resulta, assim, no fato de o referido polipeptídeo apresentar atividade bloqueadora de receptor de integrina αΙΠ)β3 e/ou α5β1 substancialmente reduzida. A seqüência de nucleotídeos de desintegrina pode ser derivada de um veneno de cobra, e pode ser selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

Os sintomas patológicos relacionados com o crescimento de células de tumor no osso incluem uma atividade incrementada de osteoclastos, uma ressorção óssea incrementada, lesão óssea, hipercalcemia, uma perda de peso corporal, e quaisquer combinações dos mesmos. O crescimento de células de tumor no osso inclui células de câncer ósseo e células de câncer que sofreram metástase originando-se de câncer da próstata, câncer de mama, câncer do pulmão, câncer renal, câncer ovariano, câncer pancreático, ou câncer mieloma.

Em uma concretização da invenção, o método inclui administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o polipeptídeo é uma variante de rodostomina, em que a rodostomina compreende a seqüência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 1, e a variante compreende uma variante de unidade repetitiva RGD. A variante de unidade repetitiva RGD pode compreender uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

Em outra concretização da invenção, o método inclui a etapa de administrar ao mamífero que disto necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo isolado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69. A variante de polipeptídeo pode ser peguilada ou conjugada com albumina.

Outro aspecto adicional da invenção é um método para preparar um polipeptídeo da invenção, em que o método compreende as etapas como a seguir: (a) transformar uma célula hospedeira com um 5 polinucleotídeo que codifica referido polipeptídeo para se obter um ou mais de um transformante; (b) selecionar um transformante apresentando uma ou mais cópias de referida construção de DNA inseridas no tansformante; (c) desenvolver o transformante em um meio de cultura para amplificar sua população de células; (d) colher células transformantes; (e) desenvolver as 10 células transformantes colhidas em um meio de cultura isento de aminoácidos; e (g) recolher sobrenadante para se obter referido polipeptídeo.

A etapa previamente indicada (e) pode compreender adicionalmente a etapa de adicionar metanol no meio de cultura para induzir a expressão de polipeptídeo nas células transformantes. Em uma concretização, 15 a etapa (g) pode compreender adicionalmente a etapa de realizar uma cromatografia de coluna para se obter referido polipeptídeo. Em uma concretização adicional, o método previamente indicado pode compreender adicionalmente a etapa de realizar uma HPLC para se obter o polipeptídeo purificado, isolado.

Estes e outros aspectos da presente invenção encontram-se

descritos abaixo de forma mais específica.

M-CSF e RANKL recombinantes humanas foram adquiridas da R&D Systems (Minneapolis, MN). Os telopeptídeos C-terminais do kit ELISA com colágeno de tipo I foram obtidos da Cross Laps (Herlev, Dinamarca). Todos os outros químicos foram obtidos da Sigma. Exemplo I

Construção de DNAs codificando rodostomina e variantes

A rodostomina foi clonada e expressa no vetor pGEX-2KS

[20] como um modelo. O DNA que codifica Rho foi constituído de códons 5 usados, de preferência, em Pichia pastoris. DNA de Rho foi amplificado por meio da reação em cadeia de polimerase (PCR) com o mesmo iniciador no- sentido 5’-GAATTCGAATTCC ATCATC ATCATC ATCAT C ATGGT A AGGAATGTGACTGTTCTT-3’ (Rho-Pic-1; SEQ ID NO: 3) que apresentou reconhecimento de Eco Rl e seis radicais histidina para facilitar a purificação. 10 O iniciador anti-sentido é 5’-CCGCGGCCGCGGTCAG TGGTATCTTGGACAGTCAGC-3 ’ ou 5 ’-CCGCGGCCGCGGTTAGTGGT ATCTTGGACAGTCAGC-3 ’ (Rho-Pic-2; SEQ ID NO: 4) com reconhecimento de Sac II e um códon de interrupção TCA (ou TTA). O produto de PCR foi purificado e, então, ligado nos sítios Eeo Rl e Sae II do 15 vetor de recombinação de levedura, pPICZaA. O plasmídio recombinante foi usado para transformar uma cepa de DH5a, e colônias foram selecionadas sobre placas de agar com LB apresentando baixo teor de sal (1% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de NaCl, 1,5% de agar a pH 7,0) e 25 μg/ml do antibiótico Zeocina.

Variantes de rodostomina foram sintetizadas e amplificadas

por meio de reação em cadeia de polimerase (PCR) usando-se uma estratégia de oligonucleotídeo superposta com iniciadores contendo sítios de restrição Eeo RI e Sac II. As seqüências de nucleotídeos de vários iniciadores usados para sintetizar ou confirmar variantes encontram-se listadas na Tabela I. A 25 proteína de fusão RD-HSA foi construída usando-se procedimentos similares. O cDNA de albumina de soro humano foi adquirido da Invitrogen, e o gene estrutura da albumina foi fundido na ponta N do gene Rho com uma seqüência de aminoácidos ligante GSGSGS (SEQ ID NO: 137) e com seis radicais histidina na ponta N.

30 Tabela I

Iniciador_Seqüência SEQ ID NO:

sentido GAATCCCAAGACTTGACATGCCAG RLD-I anti-sentido CTGGCATGTCAAGTCTTGGGATTC (SEQ ID NO: 5) RLD-2 sentido AGAATCCCAAGACACGACATGCCAGAC (SEQ ID NO: 6) RHD-I anti-sentido GTCTGGCATGTCGTGTCTTGGGATTCT (SEQ ID NO: 7) RHD-2 sentido AGAATCCCAAGAATCGACATGCCAGAC (SEQ ID NO: 8) RID-I anti-sentido GTCTGGCATGTCGATTCTTGGGATTCT (SEQ ID NO: 9) RID-2 (SEQ ID NO: 10) sentido TGTAGAATCGCTAGAGGTGACATG P48A-1 anti-sentido CATGT CACCT CTAGCGATTCTACA (SEQ ID NO: 11) P48A-2 anti-sentido GTCACCTCTTGCGATTCTACAG (SEQ ID NO: 12) RGD-2 (SEQ ID NO: 13) RGDNP-I sentido CAAGAGGTGACAACCCAGACGACAG (SEQ ID NO: 14) RGDNP-2 anti-sentido CTGTCGTCTGGGTTGTCACCTCTTG (SEQ ID NO: 15) RGDDP-I sentido CAAGAGGTGACGACCCAGACGACAG (SEQ ID NO: 16) RGDDP-2 anti-sentido CTGTCGTCTGGGTCGTCACCTCTTG (SEQ ID NO: 17) RGDGP-I sentido CAAGAGGTGACGGTCCAGACGACAGATG (SEQ ID NO: 18) RGDGP-2 anti-sentido CATCTGTCGTCTGGACCGTCACCTCTTG (SEQ ID NO: 19) RGDDL-I sentido C AAG AGGT G ACG ACCTAG ACG AC AGAT G (SEQ ID NO: 20) RGDDL-2 anti-sentido CATCTGTCGTCTAGGTCGTCACCTCTTG (SEQ ID NO: 21) RGDDM-I sentido CAAGAGGTGACGACATGGACGACAGATG (SEQ ID NO: 22) RGDDM-2 anti-sentido CATCTGTCGTCCATGTCGTCACCTCTTG (SEQ ID NO: 23) RGDDV-I sentido CAAGAGGTGACGACGTAGACGACAGATG (SEQ ID NO: 24) RGDDV-2 anti-sentido CATCTGTCGTCTACGTCGTCACCTCTTG (SEQ ID NO: 25) fator α TATTGCCAGCATTGCTGC (SEQ ID NO: 26) 5’-AOXl sentido GACTGGTTCCAATTGACAAGC (SEQ ID NO: 27) 3’-ΑΟΧ1 anti-sentido GCAAATGGCATTCTGACATCC (SEQ ID NO: 28) RLDDL-I sentido CAAGACTTGACGACCTAGAC (SEQ ID NO: 74) RLDD-2 anti-sentido GTCGTCAAGTCTTGGGATTC (SEQ ID NO: 75) RGDDL-I sentido CAAGACTTGACGACCTAGAC (SEQ ID NO: 76) ARLDD-2 anti-sentido GTCGTCAAGTCTTGCGATTC (SEQ ID NO: 77) ARGDDL sentido CAAGAGGTGACGACCTAGACGACAGATG (SEQ ID NO: 70) ARGDDL anti-sentido GTCACCTCTTGCGATTCTACAG (SEQ ID NO: 71) ARGDDM sentido CAAGAGGTGACGACATGGACGACAGATG (SEQ ID NO: 72) ARGDDM anti-sentido GTCACCTCTTGCGATTCTACAG (SEQ ID NO: 73) Nota: O iniciador fator α foi usado como um iniciador de 10

15

20

sequenciamento; iniciadores 5’-AOXl & 3’-AOXl foram usados para verificar a presença do DNA inserido.

As reações em cadeia de polimerase foram realizadas a 95°C durante 1 min, 55°C durante 1 min, depois 72°C durante 1 min durante 25 ciclos. Usou-se também uma mistura de iniciadores para gerar múltiplos sítios de mutação. Os produtos de PCR foram separados em géis de agarose a 2% e visualizados por meio de manchamento com brometo de etídeo. Os produtos de PCR desejados foram purificados e então ligados nos sítios Eco RI e Sac II do vetor de transferência de levedura pPICZa A. Usou-se o plasmídio recombinante para transformar uma cepa XLl-azul de Eseherichia eoli e colônias selecionadas sobre placas de agar contendo o antibiótico Zeocina. As colônias XLl-azul de E. eoli foram colhidas, DNA plasmídico foi isolado, e a seqüência confirmada por meio de sequenciamento do inserto. A Tabela 2 lista ID NOs de seqüências de iniciadores usados para sintetizar DNAs que codificam rodostomina e diversas variantes.

Tabela 2

Iniciadores para sintetizar DNAs que codificam rodostomina e diversas

variantes

iniciador sentido

iniciador anti- sentido

variante de rodostomina

SEQID

NO: 3 NO: 16 NO: 24 NO: 70 NO: 20 NO: 72 NO: 22 NO: 5 NO: 74 NO: 76 NO: 9 NO: 7 NO: 14 NO: 18

SEQ ID NO: 4 SEQ ED NO: 13 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 75 SEQ ED NO: 77 SEQ ED NO: 10 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 15 SEQ ED NO: 19

(Rho) 48PRGDMPm Variante 48ARGDDP53 Variante 48ARGDDV53 Variante 48ARGDDL53 Variante 48PRGDDL53 Variante 48ARGDDM53 Variante 48PRGDDM53 Variante 48PRLDMP53 Variante 48PRLDDL53 Variante 48ARLDDL53 Variante 48PRIDMP53 Variante 48PRHDMP53 Variante 48PRGDNP53

Variante 48PRGDGP

53

Exemplo 2

Expressão de proteína e purificação de rodostomina e variantes

A expressão de proteína de rodostomina e suas variantes em Pichia foi realizada de acordo com os protocolos do kit EasyComp™ de Pichia com modificações menores. Em resumo, um total de 10 μg de plasmídeos contendo DNA codificando rodostomina ou suas variantes foi purificado e digerido com Sae I para linearizar os plasmídeos. A cepa X33 de Piehia foi transformada com as construções linearizadas por meio de um método de choque com calor, usando-se um kit EasyComp™ de Piehia da Invitrogen®. O transformante integrou-se no lócus AOXl em 5’ por meio de um cruzamento simples. Usou-se PCR para analisar integrantes de Piehia para determinar se o gene Rho se havia integrado no genoma de Piehia, e células foram lisadas por meio de Lyticase (Sigma). Colônias foram selecionadas sobre placas de agar contendo YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose, e 2% de agar) e 100 μg/m 1 de Zeocina. Selecionou-se uma quantidade de clones com cópias múltiplas de inserções do gene Rho para escolher o clone apresentando a maior expressão de proteína Rho.

Rho recombinante e suas variantes foram produzidos como a seguir: Colônias selecionadas foram desenvolvidas no meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, e 2% de dextrose) contendo 100 μg/ml de Zeocina a 3O0C. Após 48 horas, células foram recolhidas por meio de centrifugação e desenvolvidas em 1 litro de meio de metanol mínimo (contendo 1,34% de base de nitrogênio com sulfato de amônio sem aminoácidos e 4 χ 10'5% de biotina). Adicionou-se um total de 1% de metanol uma vez a cada 24 horas para induzir Rho ou expressão de variante durante 2 dias. O sobrenadante foi recolhido por meio de centrifugação e dialisado duas vezes contra 5 litros de tamponador A (5 mM de EDTA, 8M de uréia e 10 mM de tamponador de fosfato de Na, pH 7,7). A solução final foi carregada em uma coluna queladora com níquel e eluída com um gradiente de 200 mM de imidazol. A rodostamina recombinante e suas variantes foram purificadas adicionalmente por meio de HPLC (HPLC Cl8 de fase invertida). A Rho recombinante purificada apresentou uma pureza superior a 95% conforme avaliado com tricina-SDS-PAGE.

Rho e suas variantes foram submetidas subsequentemente a análises de espectrometria de massa por eletropulverização para verificação do peso molecular. As seqüências de aminoácidos das unidades repetitivas RGD de Rho e variantes são mostradas na Tabela 3.

Tabela 3

SEQ Unidade repetitiva RGD e variantes da mesma Abreviatura ID NO. 2 49Arg-Gly-Asp51 49RGD51 29 48Pro-Arg-Gly-Asp-Met-Pro53 (tipo selvagem) 48PRGDMP53 48Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Pro53 48ARGDDP53 31 48Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-V al53 48ARGDDV53 32 48Ala-Arg-Gly-Asp-Asp-Leu53 48ARGDDL53 33 48Pro-Arg-Gly-Asp-Asp-Leu53 48PRGDDL53 34 48A Ia-Arg-Gly-Asp-Asp-Met53 48ARGDDM53 48Pro-Arg-Gly-Asp-Asp-Met53 48PRGDDM53 36 48Pro-Arg-Leu-Asp-Met-Pro53 48PRLDMP53 (RD)(RLD) 36 48Pro-Arg-Leu-Asp-Met-Pro53 (peguilado) *48PRLDMP53-5K 37 48Pro-Arg-Leu-Asp-Asp-Leu53 48PRLDDL53 38 48Ala-Arg-Leu-Asp-Asp-Leu53 48ARLDDL53 39 48Pro-Arg-Ile-Asp-Met-Pro53 48PRIDMP53(RID) 40 48Pro-Arg-His-Asp-Met-Pro53 48PRHDMP53 41 48Pro-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro53 48PRGDNP53 42 48Pro-Arg-Gly-Asp-Gly-Pro53 48PRGDGP53(PGP) *48PRLDMP53-5K refere-se a 48PRLDMP53 peguilado.

Exemplo 3

Efeitos da RD e seus derivados sobre o tempo de sangramento

A medição do tempo de sangramento foi realizada como a seguir: Camundongos foram anestesiados com tricloroacetaldeído (200 mg/kg), e tempo de sangramento foi medido por meio de um método descrito previamente, com modificações menores [21]. Injetou-se solução salina ou 15 proteínas intravenosamente através da veia caudal do camundongo (ICR, macho, com um peso corporal médio de 23,5 ±1,8 g). Realizou-se um corte agudo de 0,5 mm desde a ponta da cauda do camundongo 5 min após a injeção. Em seguida, a cauda foi imediatamente imersa em um béquer cheio de solução salina, mantido a 37°C, e mediu-se o tempo de sangramento.

A FIG. 1 mostra os efeitos das proteínas RD e ARLDDL sobre

o tempo de sangramento da cauda em camundongos. O tempo de sangramento da cauda foi medido 5 min após a administração intravenosa de saline, RD, 5 ARLDDL, rodostomina (0,6 mg/kg para cada) de HSA-RD (5 mg/kg). Uma injeção intravenosa de rodostomina (0,5 mg/kg) exerceu um efeito pronunciado no prolongamento do tempo de coagulação em camundongos. No entanto, ambos, RD e ARLDDL (0,5 mg/kg) que exerceram seletividade para a integrina ανβ3, somente afetaram ligeiramente o tempo de coagulação 10 em camundongos, em comparação com a rodostomina. Resultados são expressos como a média ± S.E.M [n.t.: erro médio padrão] (n=6).

Exemplo 4

Ensaio de agregação de plaquetas

Amostras de sangue venoso (9 partes) de doadores saudáveis que não haviam recebido qualquer medicação durante pelo menos duas semanas foram coletadas em 3,8% de citrato de sódio (1 parte). Amostras de sangue foram centrifugadas a 150 x g durante 10 min para se obter plasma rico em plaquetas (PRP, platelet-rich plasma) e deixadas descansar durante 5 min. e coletou-se o PRP. O plasma pobre em plaquetas (PPP, platelet-poor plasma) foi preparado a partir do sangue remanescente por meio de centrifugação a 2000x g durante 25 min. A contagem de plaquetas PPP foi medida em um analisador de hematologia e diluída a 250.000 plaquetas/μΐ. Uma solução de 190 μΐ de PRP e 10 μΐ de Rho ou de tamponador PBS foi incubada durante 5 min em um agregômetro Hema Tracer 601 a 37°C. Adicionou-se mais dez microlitros de adenosino difosfato 200 μΜ (ADP) para monitorar a resposta da agregação de plaquetas via transmissão de luz. Exemplo 5

Ensaio de inibição da adesão de células

Realizou-se ensaios de inibição da adesão de células como descrito previamente [27]. Em resumo, poços de placas de microtitulação de 96 poços Immulon-2 (Costar, Corning, E.U.A.) foram revestidos com 100 μΐ de solução salina tamponada com fosfato (PBS: 10 mM de tamponador de fosfato, 0,15M de NaCl, pH 7,4) contendo substratos a uma concentração de 5 50 a 500 nM, e isto foi incubado de um dia para o outro a 4°C. Os substratos e suas concentrações de revestimento foram fibrinogênio (Fg) 200 μg/ml, vitronectina (Vn) 50 μg/ml, e fíbronectina (Fn) 25 μg/ml. Sítios de ligação de proteína não-específica foram bloqueados por meio de incubação de cada poço com 200 μΐ de albumina de soro bovino a 1% desnaturada com calor 10 (BSA, Calbiochem) à temperatura ambiente (25°C) durante 1,5 h. A BSA desnaturada com calor foi descartada, e cada poço foi lavado duas vezes com 200 μΐ de PBS.

Células de ovário de hamster chinês (CHO, Chinese hamster ovary) expressando integrinas ανβ3 (ΟΗΟ-ανβ3) e αΙΠ}β3 (ΟΗΟ-αΙΠ}β3) 15 foram mantidas em 100 μΐ de meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM). Células de ovário de hamster chinês (CHO) expressando integrinas ανβ3 (ΟΗΟ-ανβ3) e αΙΏ)β3 (ΟΗΟ-αΙΠ}β3) foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Y. Takada (Scripps Research Institute). Células de eritroleucemia humana K562 foram adquiridas da ATCC e cultivadas no meio RPMI-1640 contendo 20 soro de bezerro fetal a 5%. Células CHO e K562 crescendo na fase Iog foram destacadas por meio de tripsinização e usadas no ensaio a 3 x IO5 e 2,5 x IO5 células/ml, respectivamente. Rho e suas variantes foram adicionadas nas células cultivadas e incubadas a 37°C, 5% de CO2 durante 15 minutos. Rho e suas variantes foram usadas como inibidores nas concentrações de 0,001-500 25 μΜ. As células tratadas foram então adicionadas na placa revestida e reagidas a 37°C, 5% de CO2 durante 1 hora. A solução de incubação foi então descartada e células não-aderidas foram removidas por meio de lavagem duas vezes com 200 μΐ de PBS. Células ligadas foram quantificadas por meio de manchamento com violeta cristal. Em resumo, o poço foi fixado com 100 μΐ de formalina a 10% durante 10 minutos e secado. Adicionou-se então cinqüenta microlitros de violeta cristal a 0,05% no poço à temperatura ambiente durante 20 minutos. Cada poço foi lavado com 200 μΐ de água destilada quatro vezes e secado. A colorização foi realizada por meio de 5 adição de 150 μΐ da solução corante (50% de álcool e 0,1% de ácido acético). A absorbância resultante foi lida a 600 nm e as leituras foram correlacionadas com o número de células aderidas. A inibição foi definida como% de inibição = 100 - [OD6oo (amostra tratada com variante de rodostomina)/ OD60O (amostra não-tratada)] x 100.

Exemplo 6

Efeitos inibitórios da RD e de seus derivados sobre as integrinas ανβ3, αΙΙβ3, e α5β!

A IC50 da RD e seus derivados sobre a ligação de integrina foi obtida por meio do ensaio de adesao de células como descrito no Exemplo 5 15 acima. Em resumo, proteínas de matriz, como fibronectina, vitronectina, ou fibrinogênio, foram revestidas numa concentração fixa sobre placas de microtitulação, como descrito no Exemplo 5, e Rho e suas variantes foram adicionadas às células expressando integrina em diferentes concentrações compreendendo de 0.001-500 μΜ para se obter uma IC50. Quanto menor a 20 IC50, tanto maior a especificidade ou potência da variante.

A modificação da unidade repetitiva RGD da Rho apresentou efeitos únicos sobre as atividades biológicas da Rho: a atividade na inibição da integrina αΙΙ^β3 ou ligação de α5β1 às proteínas de matriz foi reduzida, e a seletividade para a integrina ανβ3 foi incrementada como um resultado da 25 modificação de seqüência. A Tabela 4 mostra o resultado da IC50 para inibição da aderência de células por Rho e seus derivados. Tabela 4

Inibição da adesão de células a ECM por meio de RD e seus derivados

IC50 (nM) Variante de unidade repetitiva RGD & SEQ ID NO: allbp3 / Fg ανβ3/ Fg α5β1/ Fn 48PRGDMP53 (29) 21,0 ± 11,2 (17a) 13,0 ±5,7 (20) 256,8 ±87,5 (21) 48ARGDDP53 (30) 850,9 ±322,6 (3) 45,3 ± 17,4 (3) 5044,5 ± 1554,5 (3) 48ARGDDV53 (31) 255,2 ± 107,2 (3) 15,8 ±5,5 (3) 213,1 ±74,4 (3) 48ARGDDL53 (32) 1518,1 ±740,4(4) 41,3 ± 16,0 (5) 526,7 ± 200,3 (5) 48PRGDDL53 (33) 1224,0 ±231,2 (4) 76,0 ± 16,0 (4) 3017,0 ±801,5 (3) 48ARGDDM53 (34) 627,2 ±317,6 (3) 49,0 ± 19,2 (6) 350,8 ±81,0 (4) 48PRGDDM53 (35) 1117,8 ±379,7 (3) 211,0 ±91,3 (5) 4047,3 ± 1784,3 (4) 48PRLDMP53 (36) 2219,8 ±996,9 (6) 35,0 ± 14,1 (5) 3043,3 ± 1117,6(4) *48PRLDMP53-5K 2408,0 ± 1090,0 (2) 114,8 ±51,1 (4) >3730(3) 48PRLDDL53 (37) >5880(3) 342,3 ± 110,1(3) >5880 (4) 48ARLDDL53 (38) 59217,8 ±966,4 (3) 36,8 ± 12,8(3) 23171,0 ±925,5 (3) 48PRIDMP53 (39) >5880(2) 119,9 ± 19,7(3) >5880(3) 48PRHDMP53 (40) 2109,0 ±810,0 (3) 131,6 ±35,3(3) >5880 (3) 48PRGDNP53 (41) 185,0 ±61,7 (4) 24,8 ± 13,1 (5) 357,0 ± 80,6 (3) 48PRGDGP53 (42) 2591,0 ±572,2 (3) 204,1 ±87,0 (3) 3462,0 ± 1525,5(4) *' 48PRGDMP53 (29) refere-se à unidade repetitiva RGD da Rho e compreende uma seqüência de aminoácidos indicada pela SEQ ID NO: 29; 48PRLDMP53 5 (36) refere-se à variante de unidade repetitiva RGD da RD e compreende uma seqüência de aminoácidos indicada pela SEQ ID NO: 36. aOs números representam os números de experimentos.

As variantes de rodostomina apresentam uma afinidade muito menor por αΠΐ)β3 e/ou α5β1 em comparação com a Rho (Tabela 4). Como 10 mostrado na Tabela 4, por exemplo, a IC50 da RD (i.e., PRLDMP) na inibição de integrinas allbp3 e α5β1 aumentou mais do que 104 e 10 vezes, respectivamente, em comparação com aquela da Rho. Além disso, a IC50 da ARLDDL na inibição de integrinas allbp3 e α5β1 aumentou mais de 2000 vezes, em comparação com aquela da Rho. A IC50 da RD peguilada e RD 15 conjugada com albumina humana em sobre a ligação de αΙΠ)β3 aumentou 113,7 e 129,9 vezes, respectivamente, em comparação com aquela da Rho (Tabela 5). Portanto, as afinidades das variantes pelas plaquetas foram marcantemente reduzidas em comparação com aquelas da Rho (Tabela 5). Exemplo 7

Efeitos da RD e seus derivados sobre a osteoclastogênese

Osteoclastos são membros especializados da família de monócitos/macrófagos que se diferenciam de precursores hematopoiéticos da medula óssea. Culturas de precursores de osteoclastos na presença de M-CSF (20 ng/ml) e sRANKL (50 ng/ml) durante 8 dias induziram a formação de osteoclastos maduros grandes com multi-núcleos, que foram caracterizados pela aquisição de marcadores fenotípicos maduros, como TRAP. O método da osteoclastogênese de células hematopoiéticas da medula óssea cultivadas e os efeitos da RD e seus derivados sobre a osteoclastogênese foram investigados como a seguir.

Células de medula óssea foram preparadas removendo-se fêmures de ratos SD com de 6 a 8 semanas de vida, e lavando-se a cavidade da medula óssea com a-MEM que foi suplementado com 20 mM de HEPES e FCS inativado com calor a 10%, 2 mM de glutamina, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml). As células não-aderentes (células hematopoiéticas) foram recolhidas e usadas como precursores de osteoclastos após 24 h. Células foram semeadas a IxlO6 células/poço (0,5 ml) em placas de 24 poços na presença de RANKL solúveis recombinantes humanas (50 ng/ml) e M-CSF murinas (20 ng/ml). O meio de cultura foi substituído a cada 3 dias. A formação de osteoclastos foi confirmada por meio de um ensaio de fosfatase de ácido resistente a tartarato (TRAP, Tartrate-Resistant Acid Phosphatase) no dia 8. Em resumo, células aderentes foram fixadas com formaldeído a 10% em solução salina tamponada com fosfato durante 3 min. Após tratamento com etanol/acetona (50:50 v/v) durante 1 min, a superfície celular foi secada ao ar e incubada durante 10 min à temperatura ambiente em um tamponador de acetato (0,1 M de acetato de sódio, pH 5,0) contendo 0,01% de naftol AS-MX fosfato (Sigma) e 0,03% de sal LB violeta vermelho intenso (Sigma) na presença de 50 mM de tartarato de sódio. Células similares a osteoclastos positivas para TRAP, em cada poço, foram classificadas por contagem do numero de positivas para TRAP e de células multinucleadas contendo mais do que três núcleos.

Derivados de RD inibiram marcantemente a diferenciação de osteoclastos, que foi correlacionada com suas atividades inibidoras sobre ανβ3 (Tabela 5). Por outro lado, AKGDWN (SEQ ID NO: 138) e PRGEMP (SEQ ID NO: 139) foram menos eficazes na inibição da integrina ανβ3 e na diferenciação de osteoclastos (Tabela 5).

Tabela 5

Inibição da agregação de plaquetas, adesão celular, e osteoclastogênese por

meio de RD e seus derivados

IC50 (nM) Agregação de ανβ3 α5β1 αΙΛβ3 Osteoclastogênese plaquetas Rodostomina 83 13 257 21 5.52 ARGDDL 455 41 527 1518 8,02 PGP 283 24 4000 500 5,76 RD 433 35 3043 2220 3,32 RID 448 120 >5850 >5850 5,82 PRGDDL 396 76 3017 1224 3,15 ARLDDL 10380 37 23171 59217 --- PRPDDL (SEQ ID ,„n 188 21381 13590 NO: 140) AKGDWN 138 96637 >119000 69 78400 PRGEMP 4908 >17850 >5950 >59500 68200 RD peguilada 398 115 >5880 2408 3,88 HSA-RD 438 45 >5880 2750 6,68 Exemplo 8

Osteoporose induzida por ovariectomia

Ratos Sprague-Dawley fêmeas (3 meses de vida, de 270 a 290 g) ou camundongos ICR (4 semanas de vida, de 22 a 28 g) foram usados para este estudo. Ratos ou camundongos foram ovariectomizados (OVX) bilateralmente sob anestesia com tricloroacetaldeído, e ratos de controle foram operados simuladamente (simulação) para fins de comparação. Todos os animais foram mantidos em condições controladas à temperatura ambiente (22 ± 1 °C) e em um ciclo de luz-escuridão de 12 h. Animais foram alimentados com dieta para roedores Purina Laboratory Rodent Diet (PMI; St. Louis, MO) (0,95% de calcium) e água ad libitum. Os pesos corporais dos ratos foram registrados semanalmente.

Exemplo 9

Análise da densidade mineral óssea (BMP, Bone Mineral Density) e do teor mineral ósseo (BMC, Bone Mineral Content)

Ao término do experimento, ratos ou camundongos foram sacrificados por meio de decapitação. A tíbia e fêmur foram removidos, limpados com tecido macio, e mediu-se o comprimento e o peso da tíbia e do fêmur com um paquímetro de precisão (± 0,05 mm) como descrito por Weinreb et al. [26], Mediu-se as BMD e BMC da tíbia com um absorciômetro de raios-X de energia dupla (DEX, XR-26; Norland, Fort Atkinson, WI). Adotou-se o modo adaptado às medições de pequenos sujeitos. Ver Chih-Hsin et al., “Enhancement of Fibronectin Fibrillogenesis and Bone Formation by Basic Fibroblast Growth Factor via Protein Kinase C-Dependent Pathway in Rat Osteoblasts” [Aumento da fibrilogênese de fibronectina e da formação óssea por meio do fator de crescimento de fibroblasto básico pela via dependente da proteína quinase C em osteoblastos de rato], Mol. Pharmacol: 66: 440-449, (2004). Calculou-se um coeficiente de variação de 0,7% a partir de medições diárias da BMD em um fantasma lombar durante mais de 1 ano [22, 23], Toda a tíbia e o fêmur foram scaneados, e mediu-se as BMD e BMC com um absorciômetro.

Exemplo 10 Histofotometria do osso

Tíbias foram fixadas com formaldeído a 4% e, depois, descalcificadas com EDTA a 12% e desidratadas em uma série crescente de solução em etanol e acetona, e embutidas em parafina. Seções seriais (5 mm) foram cortadas longitudinalmente e manchadas com solução de hematoxilina- eosina de Mayer. Imagens da placa de crescimento e da tíbia proximal foram fotografadas usando-se um microscópio Olympus. O volume ósseo foi 5 medido usando-se um programa [software] de análise de imagem (Image-pro plus 3.0) na spongiosa secundária, que foi localizada sob a spongiosa primária e caracterizada por uma rede de trabéculas maiores. Para medir o numero de osteoclastos, as seções foram manchadas com fosfatase de ácido resistente a tartarato (TRAP, Tartrate-Resistant Acid Phosphatase).

Exemplo 11

Teste biomecânico de flexão de três pontos

Propriedades mecânicas de tecidos ósseos foram medidas realizando-se o teste de flexão de três pontos em um sistema de teste de material (MTS-858, MTS System Inc., Minneapolis, MN). O afastamento dos 15 dois pontos de suporte foi de 20 milímetros, e a taxa de deformação foi de 1 mm/min. Curvas de carga/deformação foram introduzidas em um computador e analisadas com o programa [software] Team 490 (versão 4.10, Nicolet Instrument Technologies Inc., Madison, WI). Mediu-se parâmetros de seção transversal a partir de fotografias e usou-se no cálculo do momento de inércia 20 de seção transversal. O momento de inércia de seção transveral foi calculado considerando-se que as seções transversais foram modeladas de forma elípitica [24]:

I = π [(ab3 x (a x 2t)(b x 2t)3) / 64 em que a é a largura da seção transversal na direção mediolateral, b é a largura da seção transversal na direção anteroposterior, e t é a média da 25 espessura cortical. Todos estes parâmetros foram obtidos usando-se o programa de imagem Image Pro Plus 3.0 para Windows (Media Cybemetics, Silver Spring, MD). A tensão máxima, tensão útil máxima, e módulo elástico (módulo de Young) foram calculados usando-se as equações a seguir [25]: σ = FLc / 41 E-F/d 3L3/48I

em que σ é tensão útil máxima, c é a distância do centro da massa (igual a Vi b como descrito acima), F é a carga aplicada (N), d é o deslocamento (mm), e L é o afastamento entre os dois pontos de suporte da armação de flexão (mm). Adicionalmente, as energias no tensão útil máxima foram medidas 5 computando-se as áreas respectivas sob a curva tensão-deformação.

Exemplo 12

Inibição da perda óssea induzida por OVX por meio de derivados de RD em camundongos

Para examinar os efeitos de derivados de RD sobre a perda óssea, induziu-se osteoporose em camundongos fêmeas por ovariectomia (OVX), como descrito no Exemplo 8. Camundongos OVX apresentaram uma diminuição de BMD e BMC do corpo total. Tratamento com derivados de RD (I.M., 1,5 mg/kg/dia alternado) ou alendronato (p.o., 1,5 mg/kg/dia alternado) durante 2 semanas inibiu a perda de BMD e BMC (Tabela 6). A concentração sanguínea do telopeptídeo C-terminal do colágeno pode refletir a atividade osteoclástica. Como mostrado na Tabela 6, derivados de RD ou alendronato também inibiram o aumento, induzido por ovariectomia, da atividade de osteoclastos (Tabela 6). Pareceu que alguns dos derivados de RD foram muito mais eficazes do que o alendronato. Adicionalmente, tratamento com RD (I.M., 1,5 mg/kg) uma vez por semana durante 2 semanas também inibiu a perda de BMD e BMC (Tabela 6). Estes dados indicam que RD e seus derivados podem inibir a osteoporose em intervalos de dosagem mais prolongados. Tabela 6

10

em camundongos BMD (g/cm2) BMC (g) telopeptídeo C-terminal da cadeia COL(l)al (ng/ml) (Dia alternado) fictício 0,095+0,001 0,649+0,011 395+11,9 OVX 0,075+0,002* 0,517+0,007* 686+12,1* OVX+RD 0,091 ±0,001§ 0,627+0,008§ 391+8,3§ OVX+PGP 0,092+0,001§ 0,621+0,006§ 372+24,2§ OVX+ARGDDL 0,093+0,001§ 0,624+0,007§ 389+16,4§ OVX+RID 0,091+0,001§ 0,622+0,004§ 391+12§ OVX+Rodostomina 0,090+0,001§ 0,619+0,006§ 397+13,6§ OVX+PRLDDL 0,091+0,002§ 0,563+0,056§ 410+25,1§ OVX+Alendronato 0,086+0,002§ 0,607+0,051§ 504+19,6§ OVX+RD peguilada 0,092+0,002§ 0,629+0,008§ 398+9,2§ (uma vez/semana) OVX+RD 0,085+0,002§ 0,5 82+0,009§ 533+27,4§ OVX+RD peguilada 0,087+0,005§ 0,595+0,009§ 538+19,8§ 15

Valores são médias ± SE.

* Comparado com o grupo de cirurgia fictícia, p<0,05 § Comparado com o grupo de OVX, p<0,05 Exemplo 13

Inibição da perda óssea induzida por ovariectomia por meio de PGO P e derivados de RD em ratos

PGP (um derivado de RD) foi selecionado para examinar mais detalhadamente a proteção contra a perda óssea induzida por ovariectomia (OVX) em ratos. Ratos fêmeas adultos (3 meses de vida) foram ovariectomizados, como no Exemplo 8, e volumes ósseos foram medidos 6 semanas após a ovariectomia, como nos Exemplos de 9 a 11. Mostrou-se que a proteína PGP inibiu tanto a diminuição do volume ósseo induzida por ovariectomia como também o aumento do número de osteoclastos.

Como mostrado na FIG. 2A, em comparação com os ratos operados simuladamente, a ovariectomia (OVX) causou uma perda significativa do osso trabecular. No entanto, tratamento com PGP (IV, 0,3 5 mg/kg/dia ou IM, 1,5 mg/kg/dia alternado) inibiu significativamente a perda do osso trabecular induzida por ovariectomia na spongiosa secundária.

Na FIG. 2B, manchamento com fosfatase de ácido resistente a tartarato (TRAP, Tartrate-Resistant Acid Phosphatasè) mostrou que osteoclastos se localizaram predominantemente em tomo do osso trabecular, e que PGP inibiu o aumento, induzido por OVX, da formação de osteoclastos.

Ratos OVX também apresentaram um aumento do peso corporal ao término do experimento. Tratamento com PGP (I.V., 0,3 mg/kg/dia ou I.M., 1,5 mg/kg/dia alternado) inibiu significativamente o aumento, induzido por OVX, do peso corporal.

Ratos também apresentaram uma diminuição do peso corporal,

BMD e BMC em ambos, fêmur e tíbia, 6 semanas após a ovariectomia (Tabela 7). Tratamento com PGP (seja I.V. ou I.M.) inibiu a redução do peso úmido, BMD e BMC de ambos, tíbia e fêmur, em ratos OVX. Histomorfometria demonstrou que a ovariectomia causou a perda de osso 20 trabecular na spongiosa secundária (FIG. 2). Tratamento com PGP reverteu marcantemente a perda do volume ósseo (FIG. 2 e Tabela 7). Adicionalmente, manchamento com TRAP demonstrou que osteoclastos se localizaram predominantemente em tomo do osso trabecular, e a OVX aumentou o número de osteoclastos. Uma administração de longo prazo de PGP 25 antagonizou a formação osteoclástica induzida por OVX (FIG. 2 e Tabela 7). O nível sérico do telopeptídeo C-terminal do colágeno reflete a atividade de osteoclastos. Verificou-se que o valor aumentou marcantemente no grupo OVX, em comparação com aquele do grupo de simulação, enquanto que tratamento com PGP antagonizou eficazmente o aumento, induzido por OVX, da atividade de osteoclastos (Tabela 7). Tabela 7

Inibição de perda óssea induzida por ovariectomia por meio da proteína PGP

em ratos Simulação (n=22) OVX (n=22) OVX+PGP(IV) OVX+PGP(IM) (n=13) (n=12) Comprimento do osso, 4,04±0,01 4,04±0,01 4,05±0,01 4,04±0,01 mm Tíbia Fêmur 3,62±0,01 3,62±0,02 3,60±0,02 3,64±0,02 Peso úmido, mg 755,5±6,3 647,5±8,5* 735,8±8,5§ 740,6±8,7§ Tíbia Fêmur 946,0±10,9 850±9,9* 904,9±10,2§ 904,0±13,5§ BMD, g/cm2 0,108±0,002 0,099±0,015* 0,109±0,002§ 0,111±0,002§ Tíbia Fêmur 0,131±0,012 0,126±0,003* 0,130±0,002§ 0,136±0,002§ BMC, g 0,301±0,011 0,269±0,011* 0,286±0,010§ 0,316±0,009§ Tíbia Fêmur 0,420±0,005 0,369±0,011* 0,422±0,013§ 0,437±0,009§ Volume ósseo,% 18,1±1,5 9,4±1,5* 14,3±1,5§ 16,8±1,8§ N.Oc/BS (No/mm) 1,77±0,09 2,06±0,17* 1,83±0,10§ 1,81±0,09§ Telopeptídeo C-terminal 230±5,1 459±18,4* 259±22,8§ 221±15,1§ do colágeno (n=5 para cada) ALP, fosfatase alcalina; N.Oc/BS, número de osteoclastos/mm de superfície

óssea.

Valores são médias ± SE.

* Em comparação com o grupo operado simuladamente, p<0,05 § Em comparação com o grupo OVX [OVX], p<0,05

Realizou-se um teste de flexão de três pontos no fêmur para examinar a atividade mecânica do osso. Em comparação com o grupo operado simuladamente, a carga máxima, carga útil máxima, módulo de Young e tensão útil máxima diminuíram em ratos OVX. Tratamento com PGP apresentou uma proteção contra a diminuição, induzida por OVX, na resistência óssea (Tabela 8). Estes resultados sugerem que drogas de proteína similares a PGP podem inibir marcantemente a perda óssea causada pela ovariectomia.

Tabela 8

Aumento das propriedades biomecânicas por meio da proteína PGP em ratos

OVX Simulação OVX (n=22) OVX+PGP (IV) OVX+PGP (n=22) (n=13) (IM) (n=12) Carga máxima, N 132,7±4,8 112,1±4,3* 123,9±4,9§ 129,8±7,9§ Carga útil máxima, N 85,5±3,7 70,4±3,1* 81,9±2,2§ 83,2±2,5§ Módulo de Young, GPa 203,7±3,6 185,5±3,3* 194,0±3,0§ 199,9±6,2§ Energia para tensão útil máxima, mJ/mm3 5,9±0,4 3,5±0,3* 4,9±0,8§ 5,1±0,9§ Valores são médias ± SE. * Em comparação com o grupo de simulação, p<0,05 § Em comparação com o grupo OVX [OVX], p<0,05 Exemplo 14 Pós-tratamento de proteína RD inibiu a ativação de osteoclastos induzida por OVX

Para examinar o efeito terapêutico dinâmico de derivados de RD sobre a atividade de osteoclastos in vivo, induziu-se osteoporose em ratos fêmeas por meio de ovariectomia, e os telopeptídeos C-terminais do colágeno de tipo I foram medidos a partir do sangue, em intervalos diferentes. Em 15 comparação com ratos operados simuladamente, a ovariectomia (OVX) causou um aumento significativo da atividade de osteoclastos. A medição do nível sérico do telopeptídeo C-terminal da cadeia COL(l)al apresentou um aumento da atividade de osteoclastos em ratos OVX. O nível de telopeptídeo C-terminal do colágeno de tipo I aumentou de um nível basal de 361 ± 25,6 20 (n=15) para 708 ± 50,7 ng/ml (n=15) 28 dias após a ovariectomia.

RD ou alendronato foi então pós-tratado um mês após a ovariectomia. O pós-tratamento com RD (I.M., 1,5 mg/kg/dia alternado) ou alendronato (p.o., 1,5 mg/kg/dia alternado) reverteu o aumento, induzido por ovariectomia, da atividade de osteoclastos, e RD foi muito mais eficaz do que o alendronato (FIG. 3). A atividade de osteoclastos recuperou-se após a retirada do tratamento com RD ou alendronato. A recuperação da atividade de osteoclastos foi muito mais rápida no grupo tratado com alendronato do que o grupo tratado com RD. No entanto, a reaplicação de RD inibiu eficazmente o 5 aumento, induzido por ovariectomia, da atividade de osteoclastos. O valor dos osteoclasto em resposta ao tratamento com RD foi muito menor do que em resposta ao tratamento com alendronato (FIG. 3). Estes resultados indicam que proteínas relacionadas com RD possuem efeitos terapêuticos sobre a perda óssea causada pela ativação osteoclástica induzida por ovariectomia.

Após o segundo período de tratamento com droga, ratos foram

sacrificados, e mediu-se BMD e BMC da tíbia e do fêmur. Como mostrado na Tabela 9, pós-tratamento de RD reverteu eficazmente o efeito de perda óssea da ovariectomia. Com relação à preservação do volume ósseo, RD foi mais eficaz do que o alendronato.

Tabela 9

Pós-tratamento de RD inibe perda óssea induzida por OVX em ratos

Simulação OVX RD Alendronato Comprimento do osso, mm Tíbia 4,04±0,03 4,05±0,03 4,01±0,03 4,02±0,05 Fêmur 3,69±0,03 3,68±0,02 3,71±0,06 3,68±0,05 Peso úmido, mg Tíbia 766,6±19,9 661±18,2* 749±20,1 § 712,1±10,1§ Fêmur 1002,6±17,4 861±10,7* 985,3±9,8§ 912,4±10,9§ BMD, g/cm2 Tíbia 0,114±0,003 0,101±0,002* 0,113±0,009§ 0,108±0,002§ Fêmur 0,137±0,002 0,121±0,002* 0,135±0,004§ 0,131±0,003§ BMC, g Tíbia 0,315±0,013 0,272±0,006* 0,299±0,011§ 0,289±0,009§ Fêmur 0,442±0,012 0,391±0,008* 0,441±0,018§ 0,401 ±0,017§ Volume ósseo,% 18,1±1,2 7,9±2,1* 16,3±2,7§ 12,1±1,3§ BMD é a sigla, em inglês, de densidade mineral óssea [Bone Mineral

Density]',

BMC é a sigla, em inglês, de teor mineral ósseo [Bone Mineral Content]. Valores são médias ± SD.

* Em comparação com o grupo de simulação, P<0,05 § Em comparação com o grupo OVX [OVX], P<0,05 RX): injeção I.M. (1,5/mg/kg/dia alternado)

Alendronato: p.o. (1,5 mg/kg/dia alternado) n=5 para cada grupo Exemplo 15

Inibição de dano de condrócitos por meio de RD em animais com osteoartrite Obteve-se um modelo animal de osteoartrite por meio de cirurgia apenas nos joelhos direitos de ratos Sprague-Dawley machos. A cirurgia envolveu transação de ligação cruzada anterior e meniscectomia mediai parcial. Após a cirurgia, proteína RD foi administrada pela via intramuscular (1,5 mg/kg/dia alternado) ou injeção local na junta (uma vez/semana) até o último dia, quando os ratos foram sacrificados 6 semanas após a cirurgia. Cada junta foi embutida em cera de parafina, seccionada e manchada com 0,1% de safranin-O e hematoxilina. Como mostrado na FIG. 4B, a camada de condrócitos na junta do joelho direito foi danificada pela artrite, e RD, tanto por injeção intramuscular (FIG. 4D) ou por aplicação local (FIG. 4C) inibiu a destruição da camada de condrócitos.

Exemplo 16

Inibição da elevação de citocinas no sangue por meio de RD no rato com osteoartrite

Gerou-se ratos com osteoartrite por meio de cirurgia como descrito acima. Seis semanas após a cirurgia, obteve-se soro para medir o 25 nível de citocinas no sangue. Como mostrado nas FIGs. de 5A a 5C, os níveis de citocinas no soro, como proteína c-reativa, IL-1β e IL-6, aumentaram em ratos osteoartríticos, e a administração de RD inibiu marcantemente a elevação de citocinas induzida pela osteoartrite. Exemplo 17 Inibição da elevação de citocinas no sangue por meio de RD em camundongos com osteoartrite

Gerou-se camundongos com osteoartrite por meio de cirurgia como descrito acima. Seis semanas após a cirurgia, obteve-se o soro para medir o nível de citocinas. Como mostrado na FIG. de 6A a 6C, os níveis de citocinas no soro, como proteína c-reativa, IL-Ib ? e IL-6, aumentaram em camundongos osteoartríticos, e a administração de RD inibiu marcantemente a elevação de citocinas induzida por osteoartrite.

Exemplo 18

Injeção intra-tibial de células de câncer de próstata ou de mama em camundongos

Usou-se camundongos com imunodeficiência combinada grave (SCID, Severe Combined Immune Deficiency) machos ou camundongos BALB/c-nu/nu machos pesando de 20 a 22 g (6 semanas de vida) criados em um isolador de animais (racks IVC) numa condição isenta de patógenos específicos (SPF, specific pathogen-free) a 22 ± 2°C. Células de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 ou células de câncer de mama humano MDA-MB-231 (IxlO6 células em 15 ml de PBS estéril) foram injetadas na medula óssea de ambas as tíbias, esquerda e direita, dos camundongos SCId ou camundongos nus no dia 1, respectivamente. No dia

11, os animais foram designados randomicamente em três grupos, e iniciou-se a administração de substâncias de teste. RD (1,5 mg/kg) foi administrada por injeção intramuscular (IM) e alendronato (1,5 mg/kg) foi administrado por meio de injeção subcutânea (SC), uma vez ao dia, num total de 15 doses (5 dias ativo, 2 dias inativo durante 3 semanas). Observou-se o peso corporal e a condição do crescimento de tumor, e isto foi registrado a cada semana durante o período experimental. Após um mês, os camundongos foram sacrificados e mediu-se o peso das pernas traseiras. O peso da perna de controle foi subtraído para refletir o peso relativo do tumor. Adicionalmente, coletou-se amostras de sangue ao término do experimento para a contagem de células sanguíneas vermelhas (RBC, red blood cells), de células sanguíneas brancas (WBC, white blood cell) e plaquetas, e para a medição dos telopeptídeos C- 5 terminais de colágeno de tipo I (CTX) e a concentração de cálcio no soro.

Para determinar a osteólise óssea, obteve-se radiografias com uma unidade geradora de raios X brandos (Young-kid Enterprise Co., Ltd., Taipei, Taiwan). Animais foram anestesiados profundamente com monoidrato de tricloroacetaldeído, posicionados numa posição em decúbito ventral sobre 10 uma películo de formação de imagem Kodak Scientific Imagingfilm (13 x 18 cm), e realizou-se a exposição aos raios-X a 45 kV durante 5 segundos. Mediu-se o grau de osteólise usando o programa [software] de análise de imagem (Image-pro plus 3.0).

Exemplo 19

Inibição do crescimento de tumor no osso e hipercalcemia

O crescimento de células de tumor no osso está relacionado com a atividade de ressorção óssea. Examinou-se desta forma o efeito da proteína RD sobre o crescimento tumoroso de células de câncer da próstata no osso. Células PC-3 (IxlO6) foram injetadas localmente nas cavidades da 20 medula óssea de ambas as tíbias de camundongos SCID. RD ou alendronato foi administrado 10 dias após a implantação de células de tumor. Administrou-se a RD a 1,5 mg/kg por via intramuscular (IM), enquanto que o alendronato foi administrado a 1,5 mg/kg por injeção subcutânea (SC), uma vez ao dia, para um total de 15 doses (5 dias ativo, 2 dias inativo durante 3 25 semanas). Calculou-se o inchaço das pernas traseiras para refletir o crescimento do tumor no dia 33. O peso corporal foi medido durante todo o período experimental. Os resultados indicaram que RD a 1,5 mg/kg causou uma inibição significativa do inchaço induzido por células de tumor nas pernas traseiras no dia 33 (43,8 ± 4,1%, n= de 21 a 22) (FIG. 7). No entanto, a administração subcutânea de alendronato a 1,5 mg/kg não inibiu o crescimento de tumor nas pernas (FIG. 7).

A FIG. 8 mostra o efeito da RD na diminuição do peso corporal em resposta ao crescimento de tumor em camundongos SCID.

Camundongos de controle não-tratados apresentaram uma diminuição do peso corporal ao término do experimento. Tratamento com RD preveniu a perda de peso corporal causada pelo crescimento do tumor. Usou-se alendronato como um controle positivo.

A FIG. 9 mostra a inibição do crescimento de tumor e lesão óssea osteolítica por RD em camundongos SCID. Para determinar a osteólise óssea obteve-se radiografias com uma unidade geradora de raios-X brandos. Na FIG. 9A, fotografias foram obtidas 33 dias após a injeção intratibial de células de células PC-3. Um tumor esférico visível desenvolveu-se da tíbia proximal. Tratamento com RD (I.M., 1,5 mg/kg/dia alternado) inibiu o crescimento do tumor. Na FIG. 9B, radiografias obtidas no dia 33 revelaram que lesões osteolíticas apareceram na tíbia injetada com células de câncer e tratamento de RD inibiu a osteólise. A FIG. 9C mostra a quantificação dos dados. A FIG. 9D mostra que RD inibiu um aumento induzido por tumor em telopeptídeos C-terminais de tipo colágeno (um marcador para a atividade de osteoclastos) usando-se um método ELISA. A FIG. 9E demonstra que RD e alendronato (1,5 mg/kg/dia alternado) também inibiu um aumento induzido por tumor na concentração de cálcio no soro (i.e., hipercalcemia).

$

: p<0,05, em comparação com o controle.

#: p<0,05, em comparação com o grupo injetado com PC-3.

O câncer de mama possui uma forte predileção para metástase

no osso. A FIG. 10 mostra uma inibição do crescimento do tumor por RD em camundongos nus. Células de câncer de mama humano MDA-MB-231 (1 x IO6) foram injetadas localmente nas cavidades da medula óssea de ambas as tíbias em camundongos nus. RD (I.M., 1 mg/kg/dia) foi administrada 10 dias após a implantação de células de tumor durante um total de 14 dias. Tratamento com RD (IM, 1,5 mg/kg/dia) durante 2 semanas inibiu o aumento induzido por MDA-MB-231 do crescimento de tumor no osso (FIG. 10A). Adicionalmente, RD também preveniu o aumento, induzido por tumor, da atividade de osteoclastos (FIG. 10B) e hipercalcemia (FIG. 10C), mas não afetou a contagem sanguínea de RBC, WBC e plaquetas (FIGs. de IOD a 10F).

*: p<0,05, em comparação com o controle.

#: p<0,05, em comparação com o grupo injetado com MDA-

MB-231.

Exemplo 20

Peguilação da proteína RD

O produto peguilado ou uma conjugação com albumina pode prolongar a duração e a diminuição da antigenicidade de uma droga de proteína. Para minimizar a antigenicidade e prolongar a duração da proteína RD, preparou-se proteína RD peguilada como a seguir: proteína RD (4 mg) em 20 mM de NaCNBH3 a pH 5 foi reagida com 5 mM de PEGk5- propionaldeído (0-Metil-0'-[2-(6-oxocaproilamino)etil]polietileno glicol 5.000)(Sigma) a 4°C durante 12 h. A proteína RD peguilada foi purificada por meio de HPLC Cl8 de fase invertida. O rendimento final da proteína RD peguilada após purificação foi superior a 60%.

Como mostrado na Tabela 6, RD peguilada inibiu a diferenciação de osteoclastos. Adicionalmente, tratamento com RD peguilada (I.M., 1,5 mg/kg, uma vez/semana) durante 2 semanas inibiu a perda de BMD e BMC (Tabela 6). Estes dados indicam que a RD peguilada não perdeu sua atividade in vivo.

Exemplo 21

Ensaios de antiangiogênese com tampão MATRIGEL™

Reportou-se que a integrina ανβ3 está relacionada com a angiogênese. Com o uso de ensaios de angiogênese em tampão de MATRIGEL™ investigou-se se a proteína RD pode inibir a angiogênese, como descrito previamente com modificações menores [32]. Em resumo, uma fração (500 μΐ) de MATRIGEL™ (Becton Dickinson Lab.) contendo 200 5 ng/ml de VEGF foi injetada subcutaneamente na região dorsal de camundongos C57BL/6 com de 6 a 8 semanas de vida. O MATRIGEL™ formou rapidamente um tampão. RD foi administrada intramuscularmente (3 mg/kg) diariamente (RD/ld) ou no dia seguinte (RD/2d ou HSA-RD) antes do sacrifício. Após 8 dias, tampões foram coletados e fotografados (FIG. 11 A). 10 Os vasos novos foram quantificados medindo-se a hemoglobina dos tampões, como uma indicação da formação de vasos sanguíneos, com o método de Drabkin e o kit de reagentes de Drabkin 525 (Sigma) (FIG. 11B). Como mostrado nas FIGs. IlA e 11B, a proteína RD foi eficaz para inibir a angiogênese usando-se ensaios de tampão de MATRIGEL™.

*:P < 0,05 versus grupo de controle.

Exemplo 22

Ensaio de ligação de radioligante: Especificidade de proteínas relacionadas com RD

Para determinar se RD e seu derivado PGP se ligam a outros receptores além da integrina ανβ3, usou-se RD e seu derivado PGP para analisar a especificidade-alvo para receptores cujos ligantes são proteínas (analisados pela MDS Pharma services, Taipei, Taiwan).

Como mostrado na Tabela 10, RD e PGP não afetaram a atividade de ligação da calcitonina, endotelina ETA, endotelina ETB, 25 insulina, leptina, canal de sódio, fator de crescimento transformante-β (TGF- B), fator de necrose de tumor (TNF) e fator de crescimento entelial vascular (VEGF, vascular endothelial growth factor) com relação a seus respectivos receptores. Isto indica que proteínas relacionadas com RD exercem atividade de ligação seletiva com relação à proteína-alvo ανβ3 in vivo.

30 Tabela 10

O ensaio de ligação de proteína PGP e RD

AIvo Inibição RD PGP Calcitonina 4% -6% Endotelina ETa 26% -3% Endotelina ETb 10% -T/o Insulina -6% -8% Leptina 1% 2% Canal de sódio (sítio 2) 2% -14% TGF-B 14% -10% TNF 4% 20% VEGF -14% 19% TGF-B: fator de crescimento transformante-B TNF: fator de necrose de tumor VEGF: fator de crescimento endotelial vascular Exemplo 23

Inibição da angiogênese por RD em um modelo de camundongo de retinopatia da prematuridade

Um modelo animal para retinopatia da prematuridade em camundongos foi gerado usando-se angiogênese induzida por via hipóxica como descrito em Wilkinson-Berka et al. [28]. Em resumo, filhotes com sete dias de vida e suas mães foram alojados em câmaras seladas contendo 75% de

O2 e ar. Camundongos permaneceram na câmara durante cinco dias (período hiperóxico, de P7 a Pl2) e, então, foram alojados ao ar ambiente durante mais sete dias (período angiogênico induzido por via hipóxica, de 12 pós-natais até

19 dias pós-natais, ou de P12 aP19). RD (2 μg) foi administrada por uma via intravítrea no dia 12 e os camundongos foram sacrificados no dia 19.

Preparou-se três seções de um dos olhos de cada animal, que foram desparafmizadas, e manchadas com hematoxilina e eosina. Contou-se os perfis de vasos sanguíneos (BVPs, blood vessel profiles) na retina interior, e incluiu-se vasos aderentes à membrana limitadora interior. A contagem foi realizada em um fotomicroscópio (Leica) com aumento de IOOx.

Como mostrado na FIG. 12A, a proteína RD inibiu a angiogênese em um modelo de retinopatia da prematuridade (ROP) em 5 camundongo. A FIG. 12B mostra BVPs reduzidos em um modelo de retinopatia da prematuridade (ROP) em camundongo tratado com proteína RD. A angiogênese foi quantificada contando-se os perfis de vasos sanguíneos (BVPs) na retina interior e estendendo para a cavidade vítrea das três seções manchadas com hematoxilina-e-eosina. O grupo ROP tratado com 10 RD (2 μg) (i.e., ROP+ RD) reduziu cerca de 46% da angiogênese em comparação com o grupo ROP tratado com veículo (ROP). (n=7 para cada grupo ROP; n=2 para grupo operado simuladamente Dados são apresentados como média ± SE.

#: p< 0,01, em comparação com o grupo de simulação.

* *: p< 0,001, em comparação com o grupo ROP.

Exemplo 24

Inibição de osteoporose induzida por ovariectomia por meio de RD conjugada com albumina

O efeito da RD conjugada com albumina sobre a osteoporose 20 foi examinado em camundongos fêmeas ovariectomizadas. Administrou-se RD conjugada com albumina de soro humano (i.e., RD-albumina) como indicado por setas nas FIGs. 13A e 13B. Os dados para RD foram incorporados nas FIGs. de 13A a 13D para comparação. Níveis séricos do peptídeo C-terminal do colágeno de tipo I e fosfatase alcalina (ALP) foram 25 medidos como indicadores da atividade de osteoclastos e osteoblastos, respectivamente. BMD e BMC também foram medidos a cada 2 semanas, como mostrado nas FIGs. 13C e 13D. Tratamento de RD-albumina (15 mg/kg/semana) reduziu marcantemente a atividades de osteoclastos, mas aumentou a atividade de ALP, de uma maneira reversível. Exemplo 25

Inibição da artrite reumatóide por meio de RD

A artrite reumatóide é uma desordem inflamatória sistêmica crônica de etiologia desconhecida, caracterizada por hiperplasia sinovial 5 invasiva que leva à destruição progressiva das juntas. Osteoclastos, derivados da linhagem de monócitos/macrófagos, desempenham um papel crucial em destruições ósseas subcondriais na artrite reumatóide. Estudos radiográficos mostraram que, na artrite reumatóide, a osteopenia do osso subcondral e a erosão óssea começam em um estágio precoce da doença, e exacerbam-se 10 gradualmente [29]. Osteoclastos ressorvedores do osso são observados na interface do osso/sinóvio erosivo [30]. Uma revisão recente discute o papel dos osteoclastos na artrite reumatóide [31]. Portanto, proteínas relacionadas com RD, que inibem marcantemente as funções dos osteoclastos, podem ser úteis para o tratamento da artrite reumatóide.

Ratos de Lewis receberam injeções intradérmicas/subcutâneas

(SC) de colágeno bovino de tipo II (2 mg/ml em adjuvante incompleto de Freund). À medida que ratos desenvolvem a doença reumatóide, eles são divididos randomicamente em diversos grupos de estudo. O tratamento é iniciado no primeiro dia quando os sinais clínicos da artrite são claramente 20 visíveis, conforme evidenciado, por exemplo, por inchaço da junta do tornozelo. Após medir o volume da pata, ratos são sacrificados, e juntas do tornozelo e do joelho são recolhidas para o exame da alteração histopatológica.

As FIGS. de 14A a D mostram seqüências de aminoácidos de 25 Rho e suas variantes, SEQ ID NOs: 1, e de 57 a 69, respectivamente. As FIGS. de 15A a C mostram seqüências de nucleotídeos de variantes de rodostomina, SEQ ID NOs: de 43 a 56. As FIGS. de 16A a H mostram seqüências de aminoácidos e nucleotídeos de variantes de desintegrina, SEQ ID NOs: de 78 a 135. A descrição precedente das concretizações exemplares da invenção foi apresentada apenas para fms de ilustração e descrição e não se destina a ser exaustiva ou a limitar a invenção às formas precisas reveladas. Muitas modificações e variações são possíveis à luz do ensinamento acima.

Aqueles versados na técnica perceberão outras concretizações

da invenção considerando a descrição e a prática da invenção aqui reveladas. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam considerados apenas como exemplares, em que um escopo e espírito verdadeiros da invenção são indicados pelas reivindicações a seguir.

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<110> CHUANG, WOEI-JER FU, WEN-MEI HUANG, TUR-FU HUANG, WENYA TANG, CHIH-HSIN CHEN, CHIU-YUEH

<120> VARIANTES DE DESINTEGRINA E USOS FARMACÊUTICOS DAS MESMAS

<130> ANC10477P00030PC

<140> PCT/US2007/026125 <141> 2007-12-21

<150> 60/871,854 <151> 2006-12-26

<160> 140

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1 <211> 68 <212> PRT

<213> Colloselasma rhodostoma <4 00> 1

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro 35 40 45 Arg Gly Asp Met Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys 50 55 60 Pro Arg Tyr His 65 <210> 2 <211> 3 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Motivo de peptídeo Sintético

<400> 2 Arg Gly Asp 1

<210> 3 <211> 55 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 3

gaattcgaat tccatcatca tcatcatcat catggtaagg aatgtgactg ttctt 55

<210> 4 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 4

ccgcggccgc ggttagtggt atcttggaca gtcagc 36

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético

<400> 5

gaatcccaag acttgacatg ccag 24

<210> 6 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 6

ctggcatgtc aagtcttggg attc 24

<210> 7 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 7

agaatcccaa gacacgacat gccagac 27

<210> 8 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético

<4 00> 8

gtctggcatg tcgtgtcttg ggattct

27 <210> 9 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 9

agaatcccaa gaatcgacat gccagac

<210> 10 <211> 27 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 10

gtctggcatg tcgattcttg ggattct

<210> 11 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 11

tgtagaatcg ctagaggtga catg

<210> 12 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 12

catgtcacct ctagcgattc taca

<210> 13 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 13

gtcacctctt gcgattctac ag

<210> 14 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 14

caagaggtga caacccagac gacag 25

<210> 15 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 15

ctgtcgtctg ggttgtcacc tcttg 25

<210> 16 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 16

caagaggtga cgacccagac gacag 25

<210> 17 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 17

ctgtcgtctg ggtcgtcacc tcttg 25

<210> 18 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 0 0> 18

caagaggtga cggtccagac gacagatg 28

<210> 19 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0> <223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético

<4 00> 19

catctgtcgt ctggaccgtc acctcttg

<210> 20 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 20

caagaggtga cgacctagac gacagatg

<210> 21 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 21

catctgtcgt ctaggtcgtc acctcttg

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético

<4 00> 22

caagaggtga cgacatggac gacagatg

<210> 23 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 23

catctgtcgt ccatgtcgtc acctcttg

<210> 24 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <2 2 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 24

caagaggtga cgacgtagac gacagatg

28

<210> 25 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 25

catctgtcgt ctacgtcgtc acctcttg 28

<210> 26 <211> 18 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético

<210> 27 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 27

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 28 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético

<210> 29 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo de rodostomina Sintético

<400> 26

tattgccagc attgctgc

18

<400> 28

gcaaatggca ttctgacatc c

21 <400> 29

Pro Arg Gly Asp Met Pro 1 5

<210> 30 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 30

Ala Arg Gly Asp Asp Pro 1 5

<210> 31 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 31

Ala Arg Gly Asp Asp Val 1 5

<210> 32 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 32

Ala Arg Gly Asp Asp Leu 1 5

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 33

Pro Arg Gly Asp Asp Leu 1 5 δ <210> 34 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 34

Ala Arg Gly Asp Asp Met 1 5

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 35

Pro Arg Gly Asp Asp Met 1 5

<210> 36

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<220>

<223> peguilação term-C opcional <4 00> 36

Pro Arg Leu Asp Met Pro 1 5

<210> 37 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 37

Pro Arg Leu Asp Asp Leu 1 5 <210> 38

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 38

Ala Arg Leu Asp Asp Leu 1 5

<210> 39 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 39

Pro Arg Ile Asp Met Pro 1 5

<210> 40 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 40

Pro Arg His Asp Met Pro 1 5

<210> 41

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 41

Pro Arg Gly Asp Asn Pro 1 5

<210> 42

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 42

Pro Arg Gly Asp Gly Pro 1 5

<210> 43 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 43

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120

gctggtaaga tctgtagaat cccaagaggt gacatgccag acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac 204

<210> 44 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 44

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt

gctggtaaga tctgtagaat cgcaagaggt

tctgctgact gtccaagata ccac

aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60 ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120 gacgacccag acgacagatg tactggtcaa 180

204

<210> 45 <211> 205 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 45

gggtaaggaa tgtgactgtt cttctccaga aaacccatgt tgtgacgctg ctacttgtaa 60

gttgagacca ggtgctcaat gtggtgaagg tttgtgttgt gaacaatgta agttctctag 120

agctggtaag atctgtagaa tcgcaagagg tgacgacgta gacgacagat gtactggtca 180 atctgctgac tgtccaagat accac 205

<210> 46 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 46

ggtaaggaat gtgactgttc ttgagaccag gtgctcaatg gctggtaaga tctgtagaat tctgctgact gtccaagata

ttctccagaa aacccatgtt

tggtgaaggt ttgtgttgtg

cgcaagaggt gacgacctag ccac

gtgacgctgc tacttgtaag 60 aacaatgtaa gttctctaga 120 acgacagatg tactggtcaa 180

204

<210> 47 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 47

ttctccagaa aacccatgtt tggtgaaggt ttgtgttgtg cccaagaggt gacgacctag ccac

gtgacgctgc tacttgtaag 60 aacaatgtaa gttctctaga 120 acgacagatg tactggtcaa 180

204

<210> 48 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 48

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120

gctggtaaga tctgtagaat cgcaagaggt gacgacatgg acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac 204

<210> 49 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 49

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt gctggtaaga tctgtagaat cccaagaggt tctgctgact gtccaagata ccac

aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60 ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120 gacgacatgg acgacagatg tactggtcaa 180

204

<210> 50 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 50

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt gctggtaaga tctgtagaat cccaagactt tctgctgact gtccaagata ccac

aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60 ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120 gacatgccag acgacagatg tactggtcaa 180

204

<210> 51 <211> 204 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 51

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120

gctggtaaga tctgtagaat cccaagactt gacgacctag acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac 204

<210> 52 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 52

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120

gctggtaaga tctgtagaat cgcaagactt gacgacctag acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac 204

<210> 53 <211> 204 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 53

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt gctggtaaga tctgtagaat cccaagaatc

aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60 ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120 gacatgccag acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac

<210> 54 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 54

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120

gctggtaaga tctgtagaat cccaagacac gacatgccag acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac 204

<210> 55 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 55

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120

gctggtaaga tctgtagaat cccaagaggt gacaacccag acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac 204

<210> 56 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 56

ggtaaggaat gtgactgttc ttctccagaa aacccatgtt gtgacgctgc tacttgtaag 60

ttgagaccag gtgctcaatg tggtgaaggt ttgtgttgtg aacaatgtaa gttctctaga 120

gctggtaaga tctgtagaat cccaagaggt gacggtccag acgacagatg tactggtcaa 180 tctgctgact gtccaagata ccac 204

<210> 57 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética <4 00> 57

Gly 1 Lys Glu Cys Asp 5 Cys Ser Ser Pro Glu 10 Asn Pro Cys Cys Asp 15 Ala Ala Thr Cys Lys 20 Leu Arg Pro Gly Ala 25 Gln Cys Gly Glu Gly 30 Leu Cys Cys Glu Gln 35 Cys Lys Phe Ser Arg 40 Ala Gly Lys Ile Cys 45 Arg Ile Ala Arg Gly 50 Asp Asp Pro Asp Asp 55 Arg Cys Thr Gly Gln 60 Ser Ala Asp Cys Pro 65 Arg Tyr His

<210> 58 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 58

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Ala 35 40 45 Arg Gly Asp Asp Val Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys 50 55 60 Pro Arg Tyr His 65

<210> 59 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 59

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Ala 35 40 45 Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His 65

<210> 60 <211> 68 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 60

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys 20 Leu Arg Pro Gly Ala 25 Gln Cys Gly Glu Gly 30 Leu Cys Cys Glu Gln 35 Cys Lys Phe Ser Arg 40 Ala Gly Lys Ile Cys 45 Arg Ile Pro Arg Gly 50 Asp Asp Leu Asp Asp 55 Arg Cys Thr Gly Gln 60 Ser Ala Asp Cys Pro Arg Tyr His

<210> 61 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 61

31u Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp

15

'ro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu

30

;er Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile

40 45

Vsp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp 55 60

Gly Lys Glu Cys Asp Cys 1 5 Ala Thr Cys Lys Leu Arg 20 Cys Glu Gln Cys Lys Phe 35 Arg Gly Asp Asp Met Asp 50 Pro Arg Tyr His 65

<210> 62 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 0 0> 62

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro 35 40 45 Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60 Pro Arg Tyr His 65

<210> 63 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 63 Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro 35 40 45 Arg Leu Asp Met Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys 50 55 60 Pro Arg Tyr His

65

<210> 64 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 64

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala

10 15

Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys

25 30

Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro

40 45

Arg Leu Asp Asp Leu Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His 65

<210> 65 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética <4 00> 65

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Ala 35 40 45 Arg Leu Asp Asp Leu Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His

65

<210> 66 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 66

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys 20 Leu Arg Pro Gly Ala 25 Gln Cys Gly Glu Gly 30 Leu Cys Cys Glu Gln 35 Cys Lys Phe Ser Arg 40 Ala Gly Lys Ile Cys 45 Arg Ile Pro Arg Ile Asp Met Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His 65

<210> 67 <211> 68 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 67

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala

10 15

Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys

25 30

Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro

40 45

Arg His Asp Met Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His 65

<210> 68 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina

sintética

<4 00> 68

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro 35 40 45 Arg Gly Asp Asn Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His 65

<210> 69 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 69

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala

10 15

Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys

20

25

30

Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro

35

40

45

Arg Gly Asp Gly Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His 65

<210> 70 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 70

caagaggtga cgacctagac gacagatg

<210> 71 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <2 2 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 71

gtcacctctt gcgattctac ag

<210> 72 <211> 28 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 72

caagaggtga cgacatggac gacagatg

<210> 73 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 73

gtcacctctt gcgattctac ag

<210> 74 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 74

caagacttga cgacctagac

<210> 75 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <400> 75

gtcgtcaagt cttgggattc

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 76

caagacttga cgacctagac

<210> 77 <211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 00> 77

gtcgtcaagt cttgcgattc

<210> 78 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética

<4 00> 78

Glu Ala Gly Glu Asp Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Leu Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Ser Phe Met Lys Lys Gly Thr Ile Cys Arg 35 40 45 Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala 50 55 60 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Leu His Ala 65 70

<210> 79 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<400> 79

gaagcgggcg aagattgcga ttgcggcagc ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc tgccgggcgc gcagtgcggc gaaggcctgt gctgcgatca gtgcagcttt 120

atgaaaaaag gcaccatttg ccgtcgtgcg cgtggcgatg atctggatga ttattgcaac 180

ggcattagcg cgggctgccc gcgtaacccg ctgcatgcg 219

<210> 80

<211> 71

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética <400> 80

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Lys Phe Met Lys Glu Gly Thr Val Cys Arg 35 40 45 Ala Arg Gly Asp Asp Val Asn Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala Gly

50 55 60

Cys Pro Arg Asn Pro Phe His 65 70

<210> 81 <211> 213 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<4 00> 81

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccggaaaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgcaaattt 120

atgaaagaag gcaccgtgtg ccgtgcgcgt ggcgatgatg tgaacgatta ttgcaacggc 180

attagcgcgg gctgcccgcg taacccgttt cat 213

<210> 82 <211> 72 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 82

Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys Asp

10 15

Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly Leu

25 30

Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Ile Lys Lys Gly Lys Ile Cys Arg Arg

40 45

Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp

50 55 60

Cys Pro Arg Asn His Phe His Ala 65 70

<210> 83 <211> 216 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética <400> 83

gcgggcgaag aatgcgattg cggcagcccg gcgaacccgt gctgcgatgc ggcgacctgc 60 aaactgcgtc cgggcgcgca gtgcgcggaa ggcctgtgct gcgatcagtg ccgttttatt 120 aaaaaaggca aaatttgccg tcgtgcgcgt ggcgataacc cggatgatcg ttgcaccggc 180 cagagcgcgg attgcccgcg taaccatttt catgcg 216

<210> 84 <211> 71 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<4 00> 84

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Thr Pro Glu Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys 35 Asp Gln Cys Arg Phe 40 Lys Gly Ala Gly Lys 45 Ile Cys Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala 50 55 60 Asp Cys Pro Arg Asn Arg Phe 65 70

<210> 85 <211> 213 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

60

180 213

<400> 85

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcacc ccggaaaacc cgtgctgcga tgcggcgacc tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120 aaaggcgcgg gcaaaatttg ccgtcgtgcg cgtggcgata acccggatga tcgttgcacc ggccagagcg cggattgccc gcgtaaccgt ttt

<210> 86 <211> 83 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<400> 86

Ser Pro Pro Val Cys Gly Asn Lys Ile Leu Glu Gln Gly Glu Asp Cys 10 15 Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Cys Gln Asp Arg Cys Cys Asn Ala Ala

25 30

Thr Cys Lys Leu Thr Pro Gly Ser Gln Cys Asn Tyr Gly Glu Cys Cys

40 45

Asp Gln Cys Arg Phe Lys Lys Ala Gly Thr Val Cys Arg Ile Ala Arg

50 55 60

Gly Asp Trp Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Gly Lys Ser Ser Asp Cys Pro 65 70 75 80

Trp Asn His

<210> 87 <211> 249 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<220>

<400> 87

agcccgccgg tgtgcggcaa caaaattctg gaacagggcg aagattgcga ttgcggcagc 60

ccggcgaact gccaggatcg ttgctgcaac gcggcgacct gcaaactgac cccgggcagc 120

cagtgcaact atggcgaatg ctgcgatcag tgccgtttta aaaaagcggg caccgtgtgc 180

cgtattgcgc gtggcgattg gaacgatgat tattgcaccg gcaaaagcag cgattgcccg 240

tggaaccat 249

<210> 88 <211> 72 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<4 00> 88

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys

1 5

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg 20

Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe 40

Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp

50 55

Asp Cys Pro Arg Asn Arg Phe His 65 70

Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys

15

Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly

30

Ile Lys Lys Gly Lys Ile Cys Arg 45

Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala 60

<210> 89 <211> 216 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética <400> 89

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

attaaaaaag gcaaaatttg ccgtcgtgcg cgtggcgata acccggatga tcgttgcacc 180

ggccagagcg cggattgccc gcgtaaccgt tttcat 216

<210> 90 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<400> 90 Glu 1 Ala Gly Glu Glu 5 Cys Asp Cys Asp Ala Ala Thr 20 Cys Lys Leu Arg Leu Cys Cys 35 Asp Gln Cys Arg Phe 40 Val Ala 50 Arg Gly Asp Trp Asn 55 Asp Asp Cys Pro Arg Asn Gly Leu Tyr

65 70

Gly Thr Pro Glu Asn Pro Cys Cys 10 15 Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly 30 Met Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg 45 Asp Thr Cys Thr Gly Gln Ser Ala

60

Gly

<210> 91 <211> 219 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<22 0>

<400> 91

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcacc ccggaaaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gatggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

atgaaaaaag gcaccgtgtg ccgtgtggcg cgtggcgatt ggaacgatga tacctgcacc 180

ggccagagcg cggattgccc gcgtaacggc ctgtatggc 219

<210> 92 <211> 72 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<400> 92

Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys Asp

10 15

Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly Leu 25 30 Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Ile 35 40 Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp 50 55 Cys Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly 65 70

Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg Pro 45

Thr Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp 60

<210> 93 <211> 216 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<400> 93

gcgggcgaag aatgcgattg cggcagcccg gcgaacccgt gctgcgatgc ggcgacctgc 60

aaactgcgtc cgggcgcgca gtgcgcggat ggcctgtgct gcgatcagtg ccgttttatt 12

aaaaaaggca ccgtgtgccg tccggcgcgt ggcgattgga acgatgatac ctgcaccggc 18 cagagcgcgg attgcccgcg taacggcctg tatggc 21

<210> 94 <211> 72 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<400> 94

Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys Asp

10 15

Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly Leu

25 30

Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Ile Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg Pro

40 45

Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Thr Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp

50 55 60

Cys Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly 65 70

<210> 95 <211> 216 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<220>

<4 00> 95

gcgggcgaag aatgcgattg aaactgcgtc cgggcgcgca aaaaaaggca ccgtgtgccg cagagcgcgg attgcccgcg

cggcagcccg gcgaacccgt

gtgcgcggat ggcctgtgct

tccggcgcgt ggcgattgga

taacggcctg tatggc

gctgcgatgc ggcgacctgc 60 gcgatcagtg ccgttttatt 12 acgatgatac ctgcaccggc 18

21 <210> 96 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<400> 96 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys 1 5 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg 20 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe 35 40 Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp 50 55 Asp Cys Pro Arg Asn Pro Phe His 65 70

Gly Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys

15

Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly

30

Ile Glu Glu Gly Ile Ile Cys Arg 45

Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Gly 60

Ala

<210> 97 <211> 219 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<22 0>

<400> 97

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccggaaaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gatggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

attgaagaag gcattatttg ccgtcgtgcg cgtggcgatg atctggatga ttattgcaac 180 ggcattagcg gcgattgccc gcgtaacccg tttcatgcg 219

<210> 98 <211> 70 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<400> 98

Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ser Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Asp Gln Cys Arg Phe Lys Lys Lys Arg Thr Ile Cys Arg Ile Ala 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Leu Ser Asn Asp Cys 50 55 60 Pro Arg Trp Asn Asp Leu 65 70 <210> 99 <211> 210 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<220>

<4 00> 99

ggcgaagaat gcgattgcgg cagcccgagc aacccgtgct gcgatgcggc gacctgcaaa 60

ctgcgtccgg gcgcgcagtg cgcggatggc ctgtgctgcg atcagtgccg ttttaaaaaa 120

aaacgtacca tttgccgtat tgcgcgtggc gattttccgg atgatcgttg caccggcctg 180 agcaacgatt gcccgcgttg gaacgatctg 210

<210> 100 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<400> 100 Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ser Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys 20 Leu Arg Pro Gly Ala 25 Gln Cys Ala Asp Gly 30 Leu Cys Cys Asp Gln 35 Cys Arg Phe Lys Lys 40 Lys Arg Thr Ile Cys 45 Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Asn Ser 65

<210> 101 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<4 0 0> 101

ggcgaagaat gcgattgcgg cagcccgagc aacccgtgct gcgatgcggc gacctgcaaa 60

ctgcgtccgg gcgcgcagtg cgcggatggc ctgtgctgcg atcagtgccg ttttaaaaaa 120

aaacgtacca tttgccgtcg tgcgcgtggc gataacccgg atgatcgttg caccggccag 180 agcgcggatt gcccgcgtaa cagc 204

<210> 102 <211> 71 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<4 00> 102 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys 1 5 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg 20 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe 35 40 Ile Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp 50 55 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe 65 70

Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys

15

Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly

30

Met Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg 45

Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala 60

<210> 103 <211> 213 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<22 0>

<400> 103

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccgggcaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtcagggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

atgaaaaaag gcaccgtgtg ccgtattgcg cgtggcgatg atatggatga ttattgcaac 180

ggcattagcg cgggctgccc gcgtaacccg ttt 213

<210> 104 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<400> 104

Glu Ala Gly Glu Asp Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro Cys Cys

10 15

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly

25 30

Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg

40 45

Met Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala

50 55 60

Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70

<210> 105 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<4 00> 105

gaagcgggcg aagattgcga ttgcggcgcg ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

atgaaagaag gcaccatttg ccgtatggcg cgtggcgatg atatggatga ttattgcaac 180 ggcattagcg cgggctgccc gcgtaacccg tttcatgcg 219

<210> 106 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<400> 106 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Thr Pro Gly Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Lys Gly Ala Gly Lys Ile Cys Arg 35 40 45 Arg Ala 50 Arg Gly Asp Asn Pro 55 Asp Asp Arg Cys Thr 60 Gly Gln Ser Ala Asp Cys Pro Arg Asn Arg Phe His Ala

65 70

<210> 107 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<400> 107

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcacc ccgggcaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

aaaggcgcgg gcaaaatttg ccgtcgtgcg cgtggcgata acccggatga tcgttgcacc 180

ggccagagcg cggattgccc gcgtaaccgt tttcatgcg 219

<210> 108 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética <4 O 0> 108

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Thr Pro Gly Asn Pro Cys Cys

10 15

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly

25 30

Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Val Cys Arg

40 45

Arg Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala

50 55 60

Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70

<210> 109 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<4 0 0> 109

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcacc ccgggcaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60 tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120 atgaaagaag gcaccgtgtg ccgtcgtgcg cgtggcgatg atatggatga ttattgcaac 180 ggcattagcg cgggctgccc gcgtaacccg tttcatgcg 219

<210> 110 <211> 68 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<400> 110

Gly Lys Glu Cys Asp Cys Ser Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys Asp Ala

10 15

Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Gly Glu Gly Leu Cys

25 30

Cys Glu Gln Cys Lys Phe Ser Arg Ala Gly Lys Ile Cys Arg Ile Pro

40 45

Arg Gly Asp Met Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys

50 55 60

Pro Arg Tyr His 65

<210> 111 <211> 204 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética <4 00> 111

ggcaaagaat gcgattgcag cagcccggaa aacccgtgct gcgatgcggc gacctgcaaa 60

ctgcgtccgg gcgcgcagtg cggcgaaggc ctgtgctgcg aacagtgcaa atttagccgt 120

gcgggcaaaa tttgccgtat tccgcgtggc gatatgccgg atgatcgttg caccggccag 180

agcgcggatt gcccgcgtta tcat 204

<210> 112 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 112

Glu 1 Ala Gly Glu Glu 5 Cys Asp Cys Gly Ala 10 Pro Ala Asn Pro Cys 15 Cys Asp Ala Ala Thr 20 Cys Lys Leu Arg Pro 25 Gly Ala Gln Cys Ala 30 Glu Gly Leu Cys Cys 35 Asp Gln Cys Arg Phe 40 Ile Lys Lys Gly Lys 45 Ile Cys Arg Arg Ala 50 Arg Gly Asp Asn Pro 55 Asp Asp Arg Cys Thr 60 Gly Gln Ser Ala Asp Cys Pro Arg Asn Gly Tyr Tyr Gly

65 70

<210> 113 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 113

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcgcg

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg

attaaaaaag gcaaaatttg ccgtcgtgcg

ggccagagcg cggattgccc gcgtaacggc

ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120 cgtggcgata acccggatga tcgttgcacc 180

tattatggc 219

<210> 114 <211> 73 <212> PRT <213> Seqüência

Artificial

<22 0>

<4 0 0> 114

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys

1 5

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg 20

Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys

15

Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Ile Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg

40 45

Val Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Thr Cys Thr Gly Gln Ser Ala

50 55 60

Asp Cys Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly 65 70

<210> 115 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 115

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gatggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

attaaaaaag gcaccgtgtg ccgtgtggcg cgtggcgatt ggaacgatga tacctgcacc 180

ggccagagcg cggattgccc gcgtaacggc ctgtatggc 219

<210> 116 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<4 00> 116

Glu Ala Gly Ile Glu Cys Asp Cys

1 5

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg 20

Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe 40

Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp

50 55

Asp Cys Pro Arg Asn Arg Phe His 65 70

Pro Cys Cys 15

Ala Asp Gly 30

Ile Cys Arg Gln Ser Ala Ala

Gly Ser Pro Glu Asn 10

Pro Gly Ala Gln Cys 25

Ile Lys Lys Gly Lys 45

Asp Arg Cys Thr Gly 60

<210> 117 <211> 219 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<22 0>

<4 00> 117

gaagcgggca ttgaatgcga ttgcggcagc tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg attaaaaaag gcaaaatttg ccgtcgtgcg ggccagagcg cggattgccc gcgtaaccgt

ccggaaaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

gatggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

cgtggcgata acccggatga tcgttgcacc 180

tttcatgcg 219 <210> 118 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<4 00> 118 Glu 1 Ala Gly Glu Glu 5 Cys Asp Cys Gly Asp Ala Ala Thr 20 Cys Lys Leu Arg Gln 25 Leu Cys Cys 35 Asp Gln Cys Arg Phe 40 Met Arg Ala 50 Arg Gly Asp Asp Leu 55 Asp Asp Gly 65 Cys Pro Arg Asn Pro 70 Phe His Ala

10

45

60

15

30

<210> 119 <211> 219 <212> DNA <213> Seqüência

Artificial

<220>

<4 00> 119

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccgggcaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtcagggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

atgaaagaag gcaccatttg ccgtcgtgcg cgtggcgatg atctggatga ttattgcaac 180

ggcattagcg cgggctgccc gcgtaacccg tttcatgcg 219

<210> 120 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 120 Glu Ala Gly Glu 1

Asp Ala Ala Thr 20

Leu Cys Cys Asp 35

Met Ala Arg Gly 50

Glu Cys Asp Cys 5

Cys Lys Leu Arg

Gln Cys Arg Phe

40

Asp Asp Met Asp 55

Gly Ala Pro Ala 10

Pro Gly Ala Gln 25

Met Lys Glu Gly

Asp Tyr Cys Asn 60

Asn Pro Cys Cys 15

Cys Ala Glu Gly 30

Thr Ile Cys Arg 45

Gly Ile Ser Ala Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala 65 70

<210> 121 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<4 00> 121

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcgcg ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

atgaaagaag gcaccatttg ccgtatggcg cgtggcgatg atatggatga ttattgcaac 180

ggcattagcg cgggctgccc gcgtaacccg tttcatgcg 219

<210> 122

<211> 73

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<4 00> 122

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys

10 15

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly

25 30

Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Lys Gly Thr Val Cys Arg

40 45

Val Ala Arg Gly Asp Trp Asn Asp Asp Thr Cys Thr Gly Gln Ser Ala

50 55 60

Asp Cys Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly 65 70

<210> 123 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<4 00> 123

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gatggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120

atgaaaaaag gcaccgtgtg ccgtgtggcg cgtggcgatt ggaacgatga tacctgcacc 180

ggccagagcg cggattgccc gcgtaacggc ctgtatggc 219

<210> 124 <211> 70 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<4 00> 124 Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ser Asn Pro Cys Cys Asp Ala 1 5 10 15 Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly Leu Cys 20 25 30 Cys Asp Gln Cys Arg Phe Lys Lys Lys Arg Thr Ile Cys Arg Ile Ala 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp Cys 50 55 60 Pro Arg Trp Asn Gly Leu 65 70

<210> 125 <211> 210 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 125

ggcgaagaat gcgattgcgg cagcccgagc aacccgtgct gcgatgcggc gacctgcaaa 60

ctgcgtccgg gcgcgcagtg cgcggatggc ctgtgctgcg atcagtgccg ttttaaaaaa 120

aaacgtacca tttgccgtat tgcgcgtggc gattttccgg atgatcgttg caccggccag 180

agcgcggatt gcccgcgttg gaacggcctg 210

<210> 126 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<4 00> 126 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys 35 Asp Gln Cys Arg Phe 40 Lys Lys Lys Arg Thr 45 Ile Cys Arg Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala 50 55 60 Asp Cys Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly

65 70

<210> 127 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<4 00> 127

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccggaaaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60 tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 120 aaaaaaaaac gtaccatttg ccgtcgtgcg cgtggcgata acccggatga tcgttgcacc 180 ggccagagcg cggattgccc gcgtaacggc ctgtatggc 219

<210> 128 <211> 73 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<400> 128

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Glu Asn Pro Cys Cys 1 5 10 15 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Lys Lys Lys Arg Thr Ile Cys Arg 35 40 45 Arg Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala 50 55 60 Asp Cys Pro Arg Asn Gly Leu Tyr Gly

65 70

<210> 129 <211> 219 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<400> 129

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcagc ccggaaaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcctgt gctgcgatca gtgccgtttt 12

aaaaaaaaac gtaccatttg ccgtcgtgcg cgtggcgata acccggatga tcgttgcacc 18

ggccagagcg cggattgccc gcgtaacggc ctgtatggc 21

<210> 130

<211> 71

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética <4 00> 130

Gly 1 Glu Glu Cys Asp 5 Cys Gly Ser Pro Gly 10 Asn Pro Cys Cys Asp 15 Ala Ala Thr Cys Lys 20 Leu Arg Pro Gly Ala 25 Gln Cys Ala Glu Gly 30 Leu Cys Cys Glu Gln 35 Cys Arg Phe Ile Lys 40 Ala Gly Thr Val Cys 45 Arg Val Ala Arg Gly 50 Asp Trp Asn Asp Asp 55 Lys Cys Thr Gly Gln 60 Ser Ala Asp Cys Pro 65 Arg Asn Gly Phe Tyr 70 Gly

<210> 131 <211> 213 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<4 00> 131

ggcgaagaat gcgattgcgg cagcccgggc aacccgtgct gcgatgcggc gacctgcaaa 60

ctgcgtccgg gcgcgcagtg cgcggaaggc ctgtgctgcg aacagtgccg ttttattaaa 120

gcgggcaccg tgtgccgtgt ggcgcgtggc gattggaacg atgataaatg caccggccag 180

agcgcggatt gcccgcgtaa cggcttttat ggc 213

<210> 132 <211> 71 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 132

Glu 1 Ala Gly Glu Glu 5 Cys Asp Cys Gly Ala 10 Pro Ala Asn Pro Cys 15 Cys Asp Ala Ala Thr 20 Cys Lys Leu Arg Pro 25 Gly Ala Gln Cys Ala 30 Glu Gly Asp Cys Cys 35 Glu Gln Cys Arg Phe 40 Val Lys Glu Gly Thr 45 Val Cys Arg Glu Ala 50 Lys Gly Asp Trp Asn 55 Asp Asp Ser Cys Thr 60 Gly Gln Ser Ala Asp 65 Cys Pro Arg Asn Gly 70 Phe

<210> 133 <211> 213 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de desintegrina sintética <4 00> 133

gaagcgggcg aagaatgcga ttgcggcgcg ccggcgaacc cgtgctgcga tgcggcgacc 60

tgcaaactgc gtccgggcgc gcagtgcgcg gaaggcgatt gctgcgaaca gtgccgtttt 120

gtgaaagaag gcaccgtgtg ccgtgaagcg aaaggcgatt ggaacgatga tagctgcacc 180

ggccagagcg cggattgccc gcgtaacggc ttt 213

<210> 134 <211> 71 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<4 00> 134

Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Ala Asn Pro Cys Cys Asp

10 15

Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Asp Gly Leu

25 30

Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Ile Lys Lys Gly Lys Ile Cys Arg Arg

40 45

Ala Arg Gly Asp Asn Pro Asp Asp Arg Cys Thr Gly Gln Ser Ala Asp

50 55 60

Cys Pro Arg Asn Arg Phe His 65 70

<210> 135 <211> 213 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<4 00> 135

gcgggcgaag aatgcgattg cggcagcccg gcgaacccgt gctgcgatgc ggcgacctgc 60

aaactgcgtc cgggcgcgca gtgcgcggat ggcctgtgct gcgatcagtg ccgttttatt 120

aaaaaaggca aaatttgccg tcgtgcgcgt ggcgataacc cggatgatcg ttgcaccggc 180

cagagcgcgg attgcccgcg taaccgtttt cat 213

<210> 136 <211> 36 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador sintético <4 0 0> 136

ccgcggccgc ggtcagtggt atcttggaca gtcagc 36

<210> 137 <211> 6 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Peptideo ligante sintético <400> 137

Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5

<210> 138 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 138

Ala Lys Gly Asp Trp Asn 1 5

<210> 139

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<4 00> 139

Pro Arg Gly Glu Met Pro 1 5

<210> 140 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <2 2 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Variante de rodostomina sintética

<400> 140

Pro Arg Pro Asp Asp Leu 1 5

Claims

1. Método para tratamento e/ou prevenção de uma doença associada com integrina ανβ3, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a um mamífero, que disto necessita, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o polipeptídeo compreende uma variante de desintegrina que é seletiva para integrina ανβ3.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a desintegrina é uma variante de uma desintegrina selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a variante de desintegrina compreende uma variante de rodostomina.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma variante de a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo é peguilado ou conjugado com albumina.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a doença associada com integrina ανβ3 é selecionada dentre osteoporose, crescimento de câncer ou tumor ósseo e sintomas relacionados com o mesmo, crescimento de tumor relacionado com angiogênese e metástase, metástase de tumor no osso, hipercalcemia induzida por malignidade, doença ocular relacionada com angiogênese, doença de Paget, artrite reumática, e osteoartrite.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a doença ocular relacionada com angiogênese é selecionada dentre degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, doenças de neovascularização da córnea, retinopatia de neovascularização induzida por isquemia, miopia acentuada, e retinopatia da prematuridade.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a doença associada com integrina ανβ3 compreende osteoporose.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que referida osteoporose é associada com uma condição patológica selecionada dentre deficiência de estrogênio pós-climatérica, osteoporose secundária, ovariectomia, doença de Paget, câncer ósseo, tumor ósseo, osteoartrite, formação incrementada de osteoclastos, e atividade incrementada de osteoclastos.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a osteoporose compreende osteoporose pós-climatérica ou perda óssea.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.

14. Método para tratamento e/ou prevenção de uma alteração fisiológica induzida por ovariectomia, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a um mamífero, que disto necessita, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o polipeptídeo compreende uma variante de desintegrina que é seletiva para integrina ανβ3.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a desintegrina é uma variante de uma desintegrina selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a variante de desintegrina compreende uma variante de rodostomina.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que referida rodostomina compreende uma variante de a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69.

20. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo é peguilado ou conjugado com albumina.

21. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.

22. Método para a inibição e/ou a prevenção do crescimento de células de tumor no osso e sintomas relacionados com o mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a um mamífero, que disto necessita, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o polipeptídeo compreende uma variante de desintegrina que é seletiva para integrina ανβ3.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a desintegrina é uma variante de uma desintegrina selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a variante de desintegrina compreende uma variante de rodostomina.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma variante da SEQ ID NO: 1.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende seqüência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NOs: de 30 a 42.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69.

28. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo é peguilado ou conjugado com albumina.

29. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que referidos sintomas compreendem um sintoma patológico selecionado dentre uma atividade incrementada de osteoclastos, ressorção óssea aumentada, lesão óssea, hipercalcemia, uma perda de peso corporal, e quaisquer combinações dos mesmos.

30. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o crescimento de células de tumor no osso inclui células de câncer ósseo, e células de câncer que sofreram metástase originando-se de um ou mais dentre câncer de próstata, câncer de mama, câncer do pulmão, câncer da tireóide, câncer renal, câncer ovariano, câncer pancreático, e câncer mieloma.

31. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.

32. Polipeptídeo seletivo para integrina ανβ3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante de uma desintegrina.

33. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a desintegrina é uma variante de uma desintegrina selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

34. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a desintegrina compreende uma variante de rodostomina.

35. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma variante da SEQ ID NO: 1.

36. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

37. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada dentre as posições48, 50,52, ou 53 da SEQ ID NO: 1.

38. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 52, e Vai, Leu, e Met na posição 53.

39. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido é na posição 50 ou 52.

40. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende substituições de aminoácidos em pelo menos duas posições selecionadas dentre posições 48,50, 52, e53 da SEQ ID NO: 1.

41. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 52, e Vai, Leu, e Met na posição 53.

42. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são nas posições 48 e 52.

43. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos encontram-se nas posições 52 e 53.

44. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende substituições de aminoácidos em pelo menos três posições selecionadas dentre posições 48, .50, 52, e53 da SEQID NO: 1.

45. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 52, e Vai, Leu, e Met na posição 53.

46. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são nas posições 48, 52, e 53.

47. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são nas posições 50, 52, e 53.

48. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende substituições de aminoácidos em pelo menos quatro posições selecionadas dentre posições 48, 15 50, 52, e 53 da SEQ ID NO: 1.

49. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 52, e Vai, Leu, e Met na posição 53.

50. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada dentre SEQ ID NOs: de 43 a 56.

51. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo apresenta uma diminuição de, pelo menos, cerca de 5, 50, ou 100 vezes da afinidade para allbp3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina.

52. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo apresenta uma diminuição de, pelo menos, cerca de 200 vezes da afinidade para allbp3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina.

53. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo apresenta uma diminuição de, pelo menos, cerca de 1000, ou 2000 vezes da afinidade para allbp3 e/ou α5β1 em comparação com a rodostomina.

54. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo apresenta uma diminuição de, pelo menos, cerca de 5, 50, 100, 1.000, ou 2.000 vezes da afinidade para plaquetas em comparação com a rodostomina.

55. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo apresenta reduzida atividade de prolongamento do tempo de coagulação do sangue em comparação com a rodostomina.

56. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo é peguilado ou conjugado com albumina.

57. Composição fisiologicamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 37 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

58. Composição fisiologicamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de acordo com a reivindicação 40 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

59. Composição fisiologicamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de acordo com a reivindicação 44 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

60. Composição fisiologicamente aceitável caracterizada pelo fato de que compreendendo o polipeptídeo de acordo com a reivindicação 48 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

61. Composição fisiologicamente aceitável, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo como definido na reivindicação 50 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

62. Composição fisiologicamente aceitável de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo é peguilado ou conjugado com albumina.

63. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 57 a 69.

64. Método para preparar um polipeptídeo como definido na reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. transfectar uma célula hospedeira com um polinucleotídeo que codifica referido polipeptídeo; b. desenvolver referida célula hospedeira em um meio de cultura; e c. isolar referido polipeptídeo.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que (b) também compreende adicionar metanol a referido meio de cultura.

66. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente desenvolver a célula hospedeira em um meio de cultura isento de aminoácidos.

67. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que (c) também compreende realizar uma cromatografia de coluna para se obter referido polipeptídeo.

68. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente realizar uma HPLC para se obter referido polipeptídeo.

69. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que referida célula hospedeira é uma célula de levedura.

70. Polinucleotídeo codificando um polipeptídeo seletivo para integrina ανβ3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante de uma desintegrina.

71. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a desintegrina é uma variante de uma desintegrina selecionada dentre rodostomina, albolabrina, aplagina, basilicina, batroxostatina, bitistatina, cereberina, cerastina, crotatroxina, durissina, elegantina, flavoridina, flavostatina, halisina, halistatina, jararacina, jarastatina, quistrina, laquesina, lutosina, molossina, salmosina, saxatilina, tergeminina, trimestatina, trimucrina, trimutase, ussuristatina, e viridina.

72. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a desintegrina compreende uma variante de rodostomina.

73. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende uma variante da SEQ ID NO: 1.

74. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que referida variante de desintegrina compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: de 30 a 42.

75. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que referida variante de rodostamina compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e compreende pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição selecionada dentre as posições48, 50,52, ou 53 da SEQ ID NO: 1.

76. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 52, e Vai, Leu, e Met na posição 53.

77. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido é na posição 50 ou 52.

78. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende substituições de aminoácidos em pelo menos duas posições selecionadas dentre posições 48,50, 52, e 53 da SEQ ID NO: 1.

79. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 52, e Yal, Leu, e Met na posição 53.

80. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são nas posições 48 e 52.

81. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são nas posições 52 e 53.

82. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende substituições de aminoácidos em pelo menos três posições selecionadas de posições 48, 50,52, e 53 da SEQ ID NO: 1.

83. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 42, e Vai, Leu, e Met na posição 53.

84. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são nas posições 48, 52, e 53.

85. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são nas posições 50, 52, e 53.

86. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende substituições de aminoácidos em pelo menos quatro posições selecionadas dentre posições 48,50, 52, e 53 da SEQ ID NO: 1.

87. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácidos são selecionadas dentre Ala na posição 48, Leu, lie, e His na posição 50, Asp, Met, e Asn na posição 42, e Vai, Leu, e Met na posição 53.

88. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma seqüência selecionada dentre SEQ ID NOs: de 43 a 56 e de 78 a 135.

89. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 37.

90. Polinucleotídeo codificando um polipeptídeo seletivo para integrina ανβ3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante de integrina e em que o polinucleotídeo codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 40.

91. Polinucleotídeo codificando um polipeptídeo seletivo para integrina ανβ3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante de integrina e em que o polinucleotídeo codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 44.

92. Polinucleotídeo codificando um polipeptídeo seletivo para integrina ανβ3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante de integrina e em que o polinucleotídeo codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 48.

93. Polinucleotídeo codificando um polipeptídeo seletivo para integrina ανβ3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante de integrina e em que o polinucleotídeo codifica o polipeptídeo como definido na reivindicação 50.

94. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que hibridiza em condições estringentes com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 73.

95. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que é codificado pelo nucleotídeo como definido na reivindicação 94.