BRPI0720647A2 - Processos de seleção e produção de toxinas modificadas, conjugados contendo toxinas modificadas e usos dos mesmos - Google Patents

Processos de seleção e produção de toxinas modificadas, conjugados contendo toxinas modificadas e usos dos mesmos Download PDF

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BRPI0720647A2
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BR
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rip
disease
conjugate
chemokine
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BRPI0720647-0A
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Hongsheng Su
Philip J Coggins
John R Mcdonald
Laura M Mcintosh
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Osprey Pharmaceuticals Usa Inc
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Description

"MÉTODOS DE SELEÇÃO E PRODUÇÃO DE TOXINAS MODIFICADAS, CONJUGADOS CONTENDO TOXINAS MODIFICADAS E USOS DOS MESMOS"
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE E PEDIDOS CORRELATOS
É reivindicada prioridade com relação ao Pedido Provisório US Número de Série 60/965.977, depositado em 22 de agosto de 2007, de Hongesheng Su, Philip J. Coggins, John R. McDonald e Laura M. Mclntosh, intitulado "METHODS OF SELECTING AND PRODUCING M0DIFICATED T0XINS, CONJUGATES CONTAINING M0DIFICATED TOXINS, AND USES THEREOF," e com relação ao Pedido Provisório US Número de Série 60/878.166, depositado em 29 de dezembro de 2006 de Hongesheng Su, Philip J. Coggins, John R. McDonald e Laura M. Mclntosh, intitulado "METHODS OF SELECTING AND PRODUCING MODIFICATED TOXINS, CONJUGATES CONTAINING MODIFICATED TOXINS, AND USES THEREOF."
Este pedido também se refere ao Pedido US número de série 09/360.242, depositado em 22 de julho de 1999, agora Patente US número 7.157.418 intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SEC0NDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER 20 INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS" que reivindica o beneficio de prioridade de acordo com 35 U.S.C. §120 como uma continuação-em-parte do Pedido PCT número PCT/CA99/00659, depositado em 21 de julho de 1999 pela Osprey Pharmaceuticals Limited, McDONALD, John R. e 25 COGGINS, Philip J. intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS" e reivindica o beneficio de prioridade de acordo com 35 U.S.C. §119 (e) com relação ao Pedido Provisório US Número de Série 60/155.186, depositado 30 em 22 de julho de 1998 de John R. McDonald e Philip J. Coggins, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SEC0NDARY TISSUE DAMAGE." Este pedido também se refere ao Pedido US Número de Série 09/453.851, agora
Patente US Número 7.166.702, depositado em 2 de dezembro de 1999, de John R. McDonald e Philip J. Coggins, intitulado 5 "CYTOTOXIC CONJUGATES COMPRISING A CHEMOKINE RECEPTOR TARGETING AGENT" que é uma divisão do Pedido US Número de Série 09/360.242, agora Patente US Número 7.157.418. Este pedido também se refere ao Pedido US número de série 09/792.793, agora Patente US Número 7.192.736, depositado 10 em 22 de fevereiro de 2001, intitulado "NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING CYTOTOXIC CONJUGATES THAT CONTAINS A CHEMOKINE RECEPTOR TARGETING AGENT" que é uma divisão do Pedido US Número de Série 09/360.242 e Pedido US Número de Série 09/453.851.
Este pedido também se refere ao Pedido US número
de série 10/375.209, agora abandonado, depositado em 24 de fevereiro de 2003, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS" que é uma continuação do Pedido 20 US número de série 09/792.793, Pedido US número de série 09/453.851 e Pedido US número de série 09/360.242.
Este pedido também se refere ao Pedido US número de série 11/361.977, depositado em 24 de fevereiro de 2006, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARY 25 TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS AND DISORDERS" que é uma continuação do Pedido US Número de Série 10/375.209, Pedido US Número de Série 09/792.793, Pedido US Número de Série 09/453.851 e Pedido US Número de Série 09/360.242.
Quando permitido, a matéria de cada um dos
pedidos citados e patentes citados acima é incorporada como referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO São providos métodos para seleção e identificação de toxinas modificadas que possuem toxicidade reduzida. Também são providas toxinas modificadas que possuem toxicidade reduzida e conjugados contendo tais toxinas modificadas. São também providos métodos para produção de tais toxinas modificadas ou conjugados. Os conjugados são usados nos métodos para tratamento de doenças associadas à proliferação, migração e atividade fisiológica das células envolvidas nas respostas inflamatórias.
HISTÓRICO
As respostas inflamatórias são mediadas por células de defesa imune e células residentes de tecido associado que se acumulam no sítio de lesão ou trauma do tecido para livrar o corpo dos agentes exógenos (por exemplo, micróbios) e agentes endógenos (por exemplo, clones de célula cancerígena) indesejados ; para limpar os fragmentos celulares e participar na cura do tecido e das feridas. Infelizmente, os mecanismos moleculares envolvidos nestes processos reparatórios (inflamatórios) devido, por exemplo, à ativação inadequada de leucócitos, podem iniciar lesão secundária do tecido que, por sua vez, contribui para a patogênese e patologia persistente das várias doenças inflamatórias e imunomoduladoras.
Os mecanismos moleculares e mediadores celulares e químicos envolvidos na lesão secundária do tecido são semelhantes, se não idênticos, na maioria das respostas inflamatórias dos seres humanos. Consequentemente, várias terapêuticos foram desenvolvidas para tratar tais doenças inflamatórias e imunomoduladoras por ter como alvo estes mecanismos moleculares e/ou outros mediadores comuns. Por exemplo, foram desenvolvidos terapêuticos que tem como alvo eventos bioquímicos simples e específicos que ocorrem no nível celular (por exemplo, ações citotóxicas dos aminoácidos excitatórios ou espécies reativas ao oxigênio) envolvidos com o processo patofisiológico de tais doenças inflamatórias e imunomoduladoras. Estão incluídos em tais terapêuticos os esteróides, tais como, porém não limitado metilprednisolona e seu derivado sintético de 21 aminoesteróides (lazaróide) (por exemplo, trisilazad) que atuam como seqüestradores de radical livre do oxigênio. Efeitos colaterais benéficos dos esteróides são impedidos por efeitos colaterais debilitantes, de modo que o tratamento com esteróide a longo prazo não é uma opção clínica viável.
Terapêuticos também vêm sendo desenvolvidas para tratar doenças inflamatórias por ter como alvo mediadores inflamatórios específicos (isto é, citocinas, fatores de crescimento ou seus receptores) induzidos e/ou envolvidos nos processos patofisiológicos. Incluídos entre tais terapêuticos estão o Remicade® (infliximab, um anticorpo que neutraliza o fator de necrose tumoral (TNF)-a), Enbrel® (etanercept, um receptor solúvel de TNFa) e anticorpos que neutralizam vários fatores de crescimento incluindo fibroblastos básicos e fatores de crescimento endotelial vascular (McDonald e outros, (2001) IDrugsr 4:427-442). Embora sendo específicos, todos tais terapêuticos focam um componente simples envolvido na patologia da doença. Consequentemente, tais terapêuticos apenas fornecem benefícios parciais ou temporários, devido à natureza compensadora da resposta inflamatória e da existência de outras citocinas inflamatórias e fatores de crescimento que participam do processo patológico.
Vêm sendo desenvolvidas terapêuticos que fornecem uma abordagem mais compreensiva para tratar doença inflamatória e outras condições apresentando um componente imunomodulador, por ter como alvo os mediadores celulares da doença. Estão incluídas entre tais substâncias terapêuticas alvejadas para células aquelas que contêm uma fração de toxina e que são capazes de entrar em uma ou mais células por meio de vários mecanismos resultando na eliminação da(s) célula(s). Exemplos de tais moléculas são qualquer um dos estabelecidos nos Pedidos US Números de Série 09/360.242, 09/453.851 e 09/792.793, agora Patentes US números 7.166.702, 7.157.418 e 7.192.736. Tais conjugados podem ser projetados para ter como alvo específica e previsivelmente tipos de célula associados à patologia de doença e consequentemente são úteis para tratamento de doenças. Conjugados de proteína de fusão são produzidos nas células hospedeiras. A fração da proteína nos conjugados, contudo, limita a produção eficiente destas moléculas. Embora tais moléculas sejam conhecidas e disponíveis, existe a necessidade de se produzir de forma eficaz, grandes quantidades para larga disseminação e seu uso. Consequentemente, entre os objetivos no presente documento, se encontra o de fornecer métodos para a produção mais eficiente de toxinas e de conjugados contendo as toxinas.
SUMÁRIO
O presente documento provê métodos para a produção de moléculas terapêuticas e uso dos conjugados de toxina modificada para ter como alvo mediadores celulares associados à patologia de doenças inflamatórias ou imunomoduladoras ou condições. Especificamente, são providos polipeptídeos de toxina modificada, conjugados contendo os polipeptídeos de toxina modificada e métodos para geração e preparação de polipeptídeos de toxina modificada. Os polipeptídeos de toxina modificada (e/óu conjugados contendo os mesmos) exibem toxicidade reduzida nas células hospedeiras nas quais eles são expressos, permitindo expressão de níveis mais altos em comparação aos polipeptídeos de toxina não modificados desta forma. As modificações ocorrem na seqüência de aminoácido primária do polipeptídeo.
São providos métodos de seleção ou identificação de uma proteína de inativação de ribossomo modificada (RIP), ou sua porção ou fragmento ativo, que são identificados em virtude da expressão em uma célula hospedeira ou células. Especificamente, os métodos selecionam as RIPs que apresentam toxicidade reduzida para a célula hospedeira em comparação à proteína da RIP de partida empregada nos métodos de seleção no presente documento. Na prática dos métodos providos no presente documento, um ácido nucléico codificando uma RIP, ou sua porção ativa, é introduzido na(s) célula(s) hospedeira(s), as células crescem, as células que crescem são isoladas e dentre as células que crescem, é isolada uma célula expressando a RIP. Os métodos providos no presente documento podem ser realizados, tal que, as células crescem em meio que não contém um modulador seletivo, por exemplo, um análogo de adenina, tal como 4-aminopirazolo[3,4- d] pirimidina(4-APP) . Os métodos providos no presente documento podem incluir, adicionalmente, a etapa de expansão das células que expressam uma RIP. Em um exemplo; a RIP expressa na célula isolada é identificada, isolada ou purificada. A RIP pode ser identificada por sua seqüência ou seu peso molecular. Em alguns casos, a RIP pode ser identificada por sequenciamento. Também são providas as RIPs produzidas pelos métodos.
Em alguns exemplos do método, as células côm ácido nucléico codificando uma RIP crescem na presença de um modulador seletivo. O modulador seletivo pode ser um inibidor da RIP, por exemplo, um análogo de adenina. 0 análogo de adenina pode ser 4-aminopirazolo[3, 4- d]pirimidina(4-APP) . Quando se utiliza um modulador seletivo, tal como um inibidor da RIP, por exemplo, um 5 análogo de adenina tal como 4-APP, a concentração é escolhida, tal que, a mesma não seja tóxica às células hospedeiras. Em alguns aspectos, a concentração é escolhida para inibir a toxicidade da RIP na célula hospedeira. Em um exemplo, a inibição da toxicidade é suficiente para 10 aumentar a quantidade da RIP expressa em comparação à ausência do inibidor da RIP, análogo a adenina ou 4-APP.. Por exemplo, a toxicidade da RIP é inibida em 0,1%, 0,5%·, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100%. Quando o inibidor de RIP for 4-APP, a 15 concentração de inibidor empregada nos métodos no presente documento será de cerca de ou será 0,1 mM a cerca de ou 5/0 mM. Para outros inibidores, concentrações apropriadas podem ser determinadas empiricamente ou por referência ao 4-APP. Em alguns exemplos, a concentração de 4-APP está entre 20 cerca de ou é 0,1 a 2,3, ou 4 mM, ou é 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,9, ou I mM. Em outros exemplos, a concentração de 4-APP é de cerca de ou é 0,5 mM.
Consequentemente são providos métodos para a seleção de toxinas com toxicidade reduzida e também métodos 25 para a produção de toxinas com toxicidade reduzida. O método de seleção identifica toxinas que apresentam uma toxicidade reduzida. Tais toxinas, normalmente, não são expressas, quando ácidos nucléicos codificando as mesmas são introduzidos nas bactérias para expressão, porém, de 30 modo geral, são expressas em níveis baixos. O método de seleção procura as toxinas que são expressas, e então expande as células que expressam toxinas com toxicidade reduzida para permitir expressão. Também são providos métodos de produção que se constituem em outro meio de selecionar mutantes por crescimento das células na presença de um inibidor, tal como 4-APP, tipicamente uma forma de dose baixa de 4-APP, que adicionalmente inibe o nivel alto de toxicidade, e resulta na produção de toxina e também mutantes que lidam bem com a toxicidade, porém não tanto como o tipo selvagem.
Assim o método de seleção permite a identificação de toxinas com toxicidade reduzida. Tais toxinas modificadas podem ser produzidas em niveis mais altos que o tipo selvagem. Nos métodos de produção, as toxinas, tipo selvagem ou modificadas podem ser expressas na presença de 4-APP (geralmente concentrações mais altas que as empregadas nos métodos de seleção) de modo a tornar as toxinas menos tóxicas. Se uma toxina modificada identificada no método de seleção já for menos tóxica que o tipo selvagem, a presença de 4-APP limitará adicionalmente a toxicidade, de modo que mais poderá ser produzido em comparação ao tipo selvagem ou o mutante na ausência de 4- APP ou que uma concentração mais baixa de 4-APP sendo empregada. Em todos os casos, toxicidade suficiente é mantida para tornar as mesmas citotóxicas para uso nos métodos. As toxinas são tão tóxicas que, mesmo com uma grande redução na sua toxicidade, tal como redução a 1% da toxicidade, elas são suficientemente tóxicas para ús métodos no presente documento.
Em um aspecto, os métodos providos no presente documento são tais que a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Em outro aspecto, a célula hospedeira empregada nos métodos no presente documento é uma célula procariótica, por exemplo, E. coli.
Nos métodos providos no presente documento, a RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida pode ser uma RIP do tipo I ou seu fragmento ativo. Por exemplo, a RIP empregada nos métodos no presente documento inclui, porém não está limitada a diantina 30, diantina 32, licnina, saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-4, saporina-5, saporina-6, saporina-7, saporina-8, saporina-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, briodina II, clavina, colicina-1, colicina-2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, alfa-cirilowina, beta-cirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, Proteína Antiviral Mirabilis (MAP), MAP-30, alfa-momorcarina, beta- momorcarina, tricosantina, TAP -29, tricocirina, RIP I de cevada, RIP II de cevada, tritina, RIP de linho, RIP 3 de milho, RIP 9 de milho, RIP X de milho, asparina-1 ou asparina 2.
Em outros exemplos do método provido no presente documento, a RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida é uma RIP do tipo II, sua subunidade catalítica ou seu fragmento ativo. Por exemplo, a RIP empregada nos métodos no presente documento inclui, porém não es'cá limitada a toxina Shiga (Stx), toxina II tipo Shiga (Stx2), volkensina, ricina, nigrina-CIP-29, abrina, vircumina, modecina, ebulitina-α, ebulitina-/3, ebultina-γ òu porrectina. Em um aspecto, o ácido nucléico introduzido codifica subunidade A da RIP ou seu fragmento ativo. Em outro aspecto, o ácido nucléico introduzido codifica subunidade Al (SAl) da Toxina Shiga da RIP. A SAl pode ser truncada. Por exemplo, a SAl pode ser truncada por deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos adjacentes nos términos N ou C. Em outro exemplo, a SAl pode ser modificada por substituição de Cys com outro aminoácido tal como Ser. Exemplos de ácidos nucléicos introduzidos nas células hospedeiras nos métodos providos no presente documento são moléculas de ácido nucléico que codificam uma SAl apresentando uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24. Por exemplo, a SAl pode ser codificada por uma molécula de ácido nucléico contendo bases cuja seqüência é estabelecida na SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25.
Nos métodos providos no presente documento, a RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida pode ser conjugada em um ligante para formar um conjugado de ligante-toxina. A RIP e o ligante no conjugado podem ser ligados diretamente através de uma ligação covalente ou iônica. Por exemplo, a RIP e o ligante podem ser unidos através de um ligante tal como um peptídeo, polipeptideo ou um aminoácido. Exemplo de um ligador é um ligador Ala-Met. Tipicamente, o conjugado de ligante-toxina é uma proteína de fusão.
0 ligante no conjugado de ligante-toxina pode ser um agente alvo de receptor de quimiocina, uma citocina não quimiocina, um hormônio, um fator de crescimento, um anticorpo específico para um receptor de superfície celular, um ligante da superfamília de TNF, e um ligante de receptor de reconhecimento de padrão (PRR). Em um exemplo, o ligante é um fator de crescimento tal como VEGF. Em outro exemplo, o ligante é um agente alvo de receptor de quimiocina tal como uma quimiocina, ou um fragmento da quimiocina, ou um anticorpo que se liga especificamente a um receptor de quimiocina ou um fragmento de um anticorpo, no qual o fragmento se liga ao receptor de quimiocina. Onde o ligante for um anticorpo, ele pode ser um anticorpo monoclonal, ou seu fragmento específico de antigeno. Exemplos de anticorpos monoclonais são aqueles que são específicos para um antigeno incluindo, porém não limitados a (DARC), D6, CXCR-I, CXCR-2, CXCR-3A, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CXCR6, CXCR7, CCR-I, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CCRlO, CX3CR-1 e XCRl.
Em um exemplo adicional, ο ligante é uma quimiocina. Exemplos de quimiocinas no conjugado de 5 ligante-toxina conforme usado nos métodos no presente documento incluem, porém não estão limitados a, proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-I), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, proteína-1 quimiotática de eosinófilos (Eotaxina-I), Eotaxina-2, Eotaxina-3, fator-ΐβ derivado estromal, SDF-la, 10 SDF-2, proteína Ia inibidora de macrófago (ΜΙΡ-Ια), ΜΙΡ-1β, ΜΙΡ-1γ, MIP-2, MIP-2a, ΜΙΡ-2β, MIP-3, ΜΙΡ-3β, MIP-3a, MIP- 4, MIP-5, proteína Secretada e Expressa em Célula T Normal de Ativação Regulada (RANTES), interleucina-8 (IL-8), proteína α regulada de crescimento (GRO-α), proteína 10 15 induzível por interferon (IP-IO) , quimiocina derivada de macrófago (MDC), proteína 2 quimiotática de granulócito (GCP-2), proteína de ativação de neutrófilo derivada de epitélio (ENA-78), proteína básica de plaqueta (PBP), monocina induzida por gama interferon (MIG), fator 4 de 20 plaqueta (PF-4), quimiocina I CC de hemofiltrado (HCC-I), quimiocina regulada por ativação e timo (TARC), Iinfotactina, lungcína, CIO, quimiocina expressa no fígado (LEC), exodus-2 (SLC), quimiocina expressa no timo (TECK), quimiocina que atrai a célula T (CTACK), quimiocina 25 epitelial associada às mucosas (MEC), motivo l-β simples C (SCM-Ιβ), célula T alfa quimioatrativa induzível por interferon (I-TAC) e quimiocina expressa na mama e rins (BRAK), fractalcina e quimiocina 1 atrativa em célula B (BCA-I), e espécies alélicas ou suas variantes. Em um 30 exemplo, a quimiocina é qualquer uma dentre MCP-1, Eotaxina-1, SDF-Ιβ, GRO-α, ΜΙΡ-Ιβ, IL-8, IP-10, MCP-3, MIP- 3a, MDC, MIP-Ia e BCA-I e suas variantes de espécies ou variantes alélicas. Em outro exemplo, a quimiocina é MCP-1. Exemplo de um ácido nucléico codificando um conjugado de ligante-toxina é uma molécula de ácido nucléico codificando um conjugado de ligante-toxina apresentando a seqüência de resíduos de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 40. Entre tal molécula de ácido nucléico estão aquelas são aquelas apresentando a seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 37 ou SEQ ID NO: 39.
Em um aspecto dos métodos no presente documento, a RIP identificada contém uma mutação em comparação à RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida. Nos métodos providos no presente documento, a RIP identificada é avaliada quanto a sua toxicidade. A toxicidade pode ser avaliada por ensaios incluindo, porém não limitado a um ensaio de síntese de proteína, um ensaio de depurinação, e um ensaio de crescimento/viabilidade da célula. Tipicamente, a RIP identificada mantém toxicidade em comparação à RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida. A RIP identificada mantém 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de toxicidade.
Também são providas nos métodos do presente documento etapas adicionais para produção da RIP identificada. Tais métodos incluem introdução de uma molécula de ácido nucléico codificando a RIP identificada, ou seu fragmento ativo dentro da(s) célula(s) hospedeira (s), incubação das células na presença de um inibidor da RIP, onde a quantidade de inibidor da RIP é selecionada para diminuir a toxicidade do polipeptídeo da RIP; e crescimento das células sob condições, nas quais a RIP ou seu fragmento ativo é produzida. A RIP pode ser purificada, tal que, geralmente, a quantidade da RIP expressa ou purificada ou ambas seja maior que na ausência do inibidor da RIP. Os métodos providos no presente documento também podem incluir uma etapa adicional para preparação de um conjugado contendo a RIP identificada. Nos métodos providos no presente documento, os métodos também incluem sintetização da RIP identificada ou conjugado contendo a RIP identificada.
É também provido no presente documento um método para aumentar a produção de uma proteina de inativação de ribossomo (RIP) ou seu fragmento ativo. Tais métodos permitem a produção eficiente das RIPs ou conjugados contendo RIPs, por exemplo, para provisão de uma fonte viável de tais conjugados para uso como substâncias terapêuticas. Nos métodos de produção no presente documento, ácido nucléico codificando uma RIP ou seu fragmento ativo, é introduzido em uma célula hospedeira. As células são incubadas na presença de um inibidor da RIP, tal que, a quantidade de inibidor da RIP é selecionada para diminuir a toxicidade da RIP. Nos métodos de produção aumentada no presente documento, as células crescem sob condições onde a RIP ou seu fragmento ativo é produzida. Em um aspecto, o método de produção inclui uma etapa onde a RIP é purificada. Tipicamente, a quantidade da RIP expressa ou purificada ou ambas é maior que na ausência do inibidor da RIP.
Nos métodos de produção providos no presente documento, a RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida pode ser uma RIP do tipo I ou seu fragmento ativo. Por exemplo, a RIP empregada nos métodos no presente documento inclui, porém não está limitados a diantina 30, diantina 32, licnina, saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-4, saporina-5, saporina-β, saporina-7, saporina-8, saporina-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, briodina II, clavina, colicina-1, colicina-2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, 19K- PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, alfa-cirilowina, beta-cirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, Proteína Antiviral Mirabilis (MAP), MAP-30, alfa-momorcarina, beta- momorcarina, tricosantina, TAP-29, tricocirina, RIP I de cevada, RIP II de cevada, tritina, RIP de linho, RIP 3 de milho, RIP 9 de milho, RIP X de milho, asparina-1 ou asparina 2.
Em outros exemplos do método de produção provido no presente documento, a RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida é uma RIP do tipo II, sua subunidade catalítica ou seu fragmento ativo. Por exemplo, a RIP empregada nos métodos no presente documento inclui, porém não está limitada a toxina Shiga (Stx), toxina II tipo Shiga (Stx2), volkensina, ricina, nigrina-CIP-29, abrina, vircumina, modeccina, ebulitina-a, ebulitina-β, ebultina-γ, ou porrectina. Em um aspecto, o ácido nucléico introduzido codifica a subunidade A da RIP ou seu fragmento ativo. Em outro aspecto, o ácido nucléico introduzido codifica a subunidade Al (SAI) da Toxina Shiga da RIP. A SAl pode ser truncada. Por exemplo, a SAl pode ser truncada por deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos adjacentes nos términos N ou C.
Em um aspecto, a RIP, por exemplo, uma SAI, codificada pelo ácido nucléico introduzido é modificada. Em um exemplo, a SAl pode ser modificada por substituição de Cys com outro aminoácido tal como Ser. Em outro exemplo, a SAl é modificada por substituição de uma ou ambas as posições 38 ou posição 219 com referência às posições dos aminoácidos em uma SAl apresentando uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22. Por exemplo, a substituição do aminoácido pode corresponder a L38R e/ou V219A. Em um exemplo, a substituição de aminoácido corresponde a V219A. Exemplos de ácidos nucléicos introduzidos nas células hospedeiras nos métodos providos no presente documento são moléculas de ácido nucléico que codificam uma SAl apresentando uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 28. Por exemplo, a SAl pode ser codificada por uma molécula de ácido nucléico contendo nucleotídeos cuja seqüência é estabelecida na SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29.
Nos métodos de produção providos no presente documento, o inibidor da RIP é um análogo de adenina. Por exemplo, o análogo de adenina é 4-aminopirazolo[3,4- d]pirimidina(4-APP). Geralmente, nos métodos de produção no presente documento, a concentração do inibidor da RIP, análogo de adenina ou 4-APP é escolhida, tal que, ela é eficaz para diminuir a toxicidade da RIP em ou cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%. Quando o inibidor de RIP for 4- APP, a concentração empregada nos métodos no presente documento será de cerca de ou será de 1 mM a cerca de ou de 40,0 mM. Em um exemplo, a concentração de 4-APP está entre cerca de ou é de 2,0 mM, 3,0 mM, 4,0 mM, 5,0 mM, 6,0 mM, 7,0 mM, 8,0 mM, 9,0 mM, 10,0 mM, 15,0 mM ou 20,0 mM.
Em um aspecto nos métodos de produção providos no presente documento a produção é realizada nas células hospedeiras eucarióticas. Em outro aspecto, a produção é realizada nas células hospedeiras procarióticas, por exemplo, E. coli.
Nos métodos de produção no presente documento, um agente de indução pode ser empregado nos métodos de produção, tal que, o polipeptideo da RIP seja expresso após indução com um agente de indução. O agente de indução pode ser IPTG. 0 inibidor da RIP empregado nos métodos de produção no presente documento pode ser acrescentado antes, durante e/ou após a adição do agente de indução.
Em alguns aspectos, os métodos de produção no presente documento são usados para aumentar a produção de um conjugado contendo uma RIP. Em tais métodos, a molécula de ácido nucléico que codifica a RIP inclui uma seqüência de nucleotídeos codificando um ligante, pelo qual a molécula codifica um conjugado de ligante-toxina. A RIP e o ligante no conjugado podem ser ligados diretamente através de uma ligação covalente ou iônica. Por exemplo, a RIP e o ligante podem ser unidos através de um ligador tal como um peptídeo, polipeptídeo ou um aminoácido. Exemplo de um ligador é um ligador Ala-Met; o Met podendo ser incluído no códon de partida no polipeptídeo ligado. Tipicamente, o conjugado de ligante-toxina é uma proteína de fusão.
São providos conjugados que contêm um ou mais agentes alvo de receptor, tal como ter como alvo o receptor-quimiocina ligado, tanto diretamente quanto através de um ligador, a um ou mais agentes alvejados. Especificamente, os conjugados providos no presente documento contêm os seguintes componentes: (agente alvo de receptor)n, (L)q, e (agente alvejado)m onde pelo menos um agente alvo de receptor, tal como um ligante de receptor ou anticorpo específico para o receptor ou uma porção eficaz do ligante ou anticorpo é(são) ligada(s) diretamente ou através de um ou mais ligadores (L) a pelo menos um agente alvejado. L se refere a um ligador. Qualquer associação apropriada entre os elementos do conjugado é contemplada, á medida que os conjugados resultantes interajam com um receptor alvejado, tal que, a internalização de um agente alvejado associado seja efetuada. Nos conjugados providos no presente documento, o agente alvejado é uma toxiria modificada, tal como uma RIP modificada ou seu fragmento tóxico. A toxina ou fragmento é modificado em sua seqüência de aminoácido primária, tal que, ele seja menos tóxico às células hospedeiras nas quais é expresso para produção que na sua forma não modificada. As toxinas ou conjugados são modificados pelos métodos providos no presente documento.
As variáveis nem são números inteiros de 1 ou maior e q é 0 ou qualquer número inteiro. As variáveis n, q e m são selecionadas, tal que, o conjugado resultante interage com o receptor alvejado e um agente alvejado é 10 internalizado por uma célula para a qual ele foi alvejado. Tipicamente, n está entre 1 e 3; 1 é 0 ou mais, dependendo do número de agentes alvejados e alvo ligados e/ou funções do ligador, q é geralmente 1 a 4; m é 1 ou mais, geralmente 1 ou 2. Quando mais de um agente alvejado estiver presente 15 em um conjugado, os agentes alvejados podem ser os mesmos ou diferentes. De modo semelhante, quando mais de um agente de alvejamento de receptor estiver presente nos conjugados, eles podem ser os mesmos ou diferentes.
Os conjugados providos no presente documento podem ser produzidos como proteínas de fusão, podem ser acoplados quimicamente ou incluir uma porção da proteína de fusão e uma porção quimicamente ligada ou qualquer combinação destes. Para fins pretendidos no presente documento, o agente alvo de receptor é qualquer agente, tipicamente um polipeptídeo, que especificamente interage com um receptor, tal como receptores de quimiocina em leucócitos ativados e que, mediante interação com o receptor, internalizam um agente alvejado ligado ou de outra forma associado, tal como, uma toxina, que se destina a ser internalizada pela célula alvejada.
0 ligante no conjugado de ligante-toxina pode ser um agente alvo de receptor de quimiocina, uma citocina não quimiocina, um hormônio, um fator de crescimento, um anticorpo específico para um receptor de superfície celular, um ligante da superfamília de TNF, e um ligante de receptor de reconhecimento de padrão (PRR) . Em um exemplo, o ligante é um fator de crescimento tal como VEGF. Em outro 5 exemplo, o ligante é um agente alvo de receptor de quimiocina tal como uma quimiocina, ou um fragmento da quimiocina, ou um anticorpo que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, ou um fragmento de um anticorpo, onde o fragmento se liga ao receptor de quimiocina. Quando 10 o ligante for um anticorpo, ele pode ser um anticorpo monoclonal ou seu fragmento específico de antígeno. Exemplos de anticorpos monoclonais são aqueles que são específicos para um antígeno selecionado incluindo, porém não limitado ao, (DARC), D6, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3A, 15 CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR- 4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CCR10, CX3CR-1 e XCRl.
Em um exemplo adicional, o ligante é uma quimiocina. Exemplos de quimiocinas nos conjugados de 20 ligante-toxina usados nos métodos no presente documento incluem, porém não estão limitados à proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, proteína 1 quimiotática de eosinófilos (Eoxatina-I), Eotaxina-2, Eotaxina-3, fator-ΐβ derivado estromal, SDF-la, 25 SDF-2, proteína Ia inibidora de macrófago (ΜΙΡ-Ια), ΜΙΡ-1β, ΜΙΡ-Ιγ, MIP-2, MIP-2a, ΜΙΡ-2β, MIP-3, ΜΙΡ-3β, MIP-3a, MIP- 4, MIP-5, proteína Secretada e Expressa em Célula T Normal, Regulada em Ativação (RANTES), interleucina-8 (IL-8), proteína α regulada de crescimento (GR0- α) , proteína 10 30 induzível por interferon (IP-10), quimiocina derivada de macrófago (MDC), proteína 2 quimiotática de granulócito (GCP-2), proteína 78 de ativação de neutrófilo derivada de epitélio (ENA-78), proteína básica de plaqueta (PBP), monocina induzida por gama interferon (MIG), fator 4 de plaqueta (PF-4), quimiocina I CC de hemofiltrado (HCC-I), quimiocina regulada por ativação e timo (TARC), linfotactina, lugcina, CIO, quimiocina expressa no fígado (LEC), exodus-2 (SLC), quimiocina expressa no timo (TECK) , quimiocina atrativa de célula T cutânea (CTACK), quimiocina de epitélio associada à mucosa (MEC), motivo l-β simples C (SCM-Ιβ), quimioatrativo alfa célula T induzível por interferon (I-TAC), quimiocina expressa na mama e rins (BRAK), fractalcina e quimiocina 1 atrativa de célula B (BCA-I) e suas variantes alélicas e de espécies. Em um exemplo, a quimiocina é qualquer uma dentre MCP-1, Eotaxina-I, SDF-Ιβ, GRO-a, MIP-Ιβ, IL-8, IP-10, MCP-3, MIP- 3a, MDC, MIP-Ia e BCA-I e suas variantes alélicas e de espécies. Em outro exemplo, a quimiocina é MCP-1.
A fração da toxina no conjugado de ligante-toxina pode ser a toxina Shiga, seu fragmento cataliticamente ativo ou seu fragmento ativo. Por exemplo, a fração da proteína no conjugado de ligante-toxina produzida nos 20 métodos no presente documento pode ser SAI. A fração da proteína, tal como SAI, no conjugado de ligante-toxina pode ser uma toxina modificada. Exemplo de um ácido nucléico codificando um conjugado de ligante-toxina produzido nos métodos no presente documento é uma molécula de ácido 25 nucléico codificando um conjugado de ligante-toxina apresentando a seqüência de resíduos de aminoácido estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, ou 67. Entre as moléculas de ácido nucléico estão aquelas possuindo a 30 seqüência estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO:41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 ou 66.
São providas toxinas modificadas,
especificamente, RIP modificadas, que exibem toxicidade reduzida em comparação aos materiais de partida, que são as RIPs, que incluem RIPs do tipo selvagem e variantes. Estão incluídas entre tais toxinas RIP modificadas ou seus conjugados, quaisquer identificadas nos métodos no presente documento.
Entre as toxinas modificadas providas no presente documento estão o polipeptídeo da Toxina Shiga modificada ou seu fragmento ativo que possui uma ou mais modificações de aminoácido em uma Toxina Shiga, suas variantes de espécies ou variantes alélicas, porção cataliticamente ativa das mesmas ou seu fragmento ativo, tal que a modificação confira toxicidade reduzida. Em um exemplo, uma ou mais modificações de aminoácido são substituições de uma ou ambas as posições correspondendo às posições 38 e/ou 219 com referência às posições do aminoácido na subunidade da Toxina Shiga Al (SAl) apresentando uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22. As toxinas Shiga modificadas providas no presente documento possuem pelo menos cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%', 98%, 99% de identidade de seqüência com relação ao polipeptídeo apresentando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22 e que inclui modificações at Ioci correspondendo às posições dos aminoácidos 38 e/ou 219. Entre as modificações nas posições 38 e/ou 219 estão aquelas correspondendo a L38R e/ou V219A. As toxinas Shiga modificadas incluem subunidade A. Por exemplo, as toxinas Shiga modificadas podem incluir apenas uma SAl da toxina Shiga ou seu fragmento ativo. A SAl pode ser truncada. Por exemplo, a SAl truncada pode ser truncada por deleção de 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos adjacentes nos términos N ou C. Exemplos de Toxinas Shiga modificadas são aquelas apresentando uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NOS: 26 ou 28, ou é sua variante de espécie ou variante alélica.
Também são providos no presente documento os conjugados contendo um agente alvejado que é uma proteína de inativação de ribossomo modificada (RIP), tal como qualquer RIP modificada identificada nos métodos no presente documento. Também são providos conjugados contendo um agente alvejado que é uma Toxina Shiga modificada ou seu fragmento ativo, tal como qualquer Toxina Shiga modificada conforme observado acima. Os conjugados também contêm um agente alvo, ou sua porção, o que facilita a ligação do conjugado a um receptor de superfície celular resultando na internalização do agente alvejado nas células portando o receptor.
Entre tais conjugados estão aqueles possuindo os componentes que se seguem: (agente alvo)n, (L)q, e (agente alvejado)m, onde L é um ligador para ligação do agente alvo ao agente alvejado, o agente de alvejamento é qualquer fração que se liga seletivamente a um receptor de superfície celular, m e n, que são selecionados independentemente, são pelo menos 1, e q é 0 ou mais, à medida que o conjugado resultante se liga ao receptor alvejado, ele é internalizado e libera o agente alvejado. Tipicamente, o conjugado resultante se liga a um receptor que interage com e internaliza um agente alvo, pelo qual o(s) agente(s) alvejado(s) é(são) internalizado (s) em uma célula portando o receptor. Em alguns casos onde o conjugado contém uma pluralidade de agentes alvejados, ós agentes alvejados são os mesmos ou diferentes. Tipicamente, os agentes alvejados são todos formas modificadas da toxina RIP. Também, quando o conjugado contiver uma pluralidade de agentes alvo, os agentes alvo serão os mesmos ou diferentes. Em um exemplo, m e n, que são selecionados independentemente são 1-6. Em outro exemplo, q é 1, n é 2 e m é 1.
Nos conjugados providos no presente documento, o agente alvo inclui um agente alvo de receptor, tal como, porém não limitado a um agente alvo de receptor de quimiocina, uma citocina não quimiocina, um hormônio, um fator de crescimento, um anticorpo especifico para um receptor de superfície celular, um ligante da superfamília de TNF, e um ligante de receptor de reconhecimento de padrão (PRR) . Em um exemplo, o ligante é um fator de crescimento tal como VEGF. Em outro exemplo, o ligante é um agente alvo de receptor de quimiocina tal como uma quimiocina ou um fragmento da quimiocina ou um anticorpo que se liga especificamente a um receptor de quimiocina, ou um fragmento de um anticorpo, onde o fragmento se liga ao receptor de quimiocina. Onde o ligante é um anticorpo, este pode ser um anticorpo monoclonal, ou seu fragmento específico de antígeno. Exemplos de anticorpos monoclonais são aqueles que são específicos para um antígeno incluindo, porém não limitados ao (DARC), D6, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3A, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CXCR6, CXCR7, CCR-I, CCR-2A, CCR- 2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CCR10, CX3CR-1 e XCRl.
Em um exemplo adicional, o ligante é uma quimiocina. Exemplos de quimiocinas nos conjugados de ligante-toxina providos no presente documento incluem, porém não estão limitados a proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, proteína 1 quimiotática de eosinófilos (Eoxatina-1), Eotaxina-2, Eotaxina-3, fator-ΐβ derivado estromal, SDF-Ια, SDF-2, proteína Ia inibidora de macrófago (ΜΙΡ-Ια), MIP-Ιβ, MIP- 1γ, MIP-2, MIP-2a, ΜΙΡ-2β, MIP-3, ΜΙΡ-3β, MIP-3a, MIP-4, MIP-5, proteína Secretada e Expressa em Célula T Normal, Regulada em Ativação (RANTES), interleucina-8 (IL-8), proteína α regulada de crescimento (GRO-α), proteína 10 induzível por interferon (IP-10), quimiocina derivada de macrófago (MDC) , proteína 2 quimiotática de granulócito 5 (GCP-2), proteína 78 de ativação de neutrófilo derivada de epitélio (ENA-78), proteína básica de plaqueta (PBP), monocina induzida por gama interferon (MIG), fator 4 de plaqueta (PF-4), quimiocina I CC de hemofiltrado (HCC-I), quimiocina regulada por ativação e timo (TARC), 10 Iinfotactina, lugcina, CIO, quimiocina expressa no fígado (LEC), exodus-2 (SLC), quimiocina expressa no timo (TECK), quimiocina atrativa de célula T cutânea (CTACK), quimiocina de epitélio associada à mucosa (MEC), motivo l-β simples C (SCM-Ιβ) , quimioatrativo alfa célula T induzível por 15 interferon (I-TAC), quimiocina expressa na mama e rins (BRAK), fractalcina e quimiocina 1 atrativa de célula B (BCA-I) e suas variantes alélicas e de espécies. Em um exemplo, a quimiocina é qualquer uma dentre MCP-1', Eotaxina-I, SDF-Ιβ, GRO-a, MIP-Ιβ, IL-8, IP-10, MCP-3, MIP- 20 3a, MDC, MIP-Ia e BCA-I e suas variantes alélicas e de espécies. Em outro exemplo, a quimiocina é MCP-1.
0 agente alvo nos conjugados providos no presente documento se liga especialmente a um ou mais receptores de superfície celular em um ou mais células efetoras imunes oü 25 outras células associadas a uma resposta imune ou inflamatória. Em um exemplo, a célula efetora imune ou células é um leucócito. Em outro exemplo, as outras células associadas com uma resposta imune ou inflamatória são células residentes de tecido (TRC). As células alvejadas 30 pelos conjugados providos no presente documento incluem, porém não estão limitados aos monócitos, macrófagos, células dendríticas, células T, células B, eosinófilos, basófilos, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK) e neutrófilos. Incluídos entre os macrófagos estão os macrófagos de tecido, tais como, macrófagos alveolares, micróglia e células de Kupffer. Incluídas entre as células dendríticas estão as células dendríticas imaturas, as células dendríticas maduras e células de Langerhans. Incluídas entre as células as células T estão as células CD4+ (tais como, células Thl, Th2 ou Thl7) e células T CD8+. Incluídas entre as TRC estão as células mesangiais, células gliais, células endoteliais, células epiteliais, células tumorais, fibroblastos e sinoviócitos. As células alvejadas pelos conjugados podem ser ativadas. Por exemplo, a ativação da célula pode induzir a expressão de um ou mais receptores de superfície celular alvejados pelos conjugados.
Entre os conjugados providos no presente documento, estão aqueles que tem como alvo receptores de superfície celular que se ligam a uma ou mais quimiocinas. Tais receptores de quimiocina incluem, porém não estão limitados ao CXCR1, CXCR2, CXCR3A, CXCR3B, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CCR1, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, XCRl e CX3CR-1. A ligação do conjugado ao receptor de quimiocina promove a internalização do conjugado dentro da célula portando o receptor.
Nos conjugados providos no presente documento o agente alvo e agente alvejado ou seu fragmento ativo, são unidos através de uma ligação covalente ou iônica. Por exemplo, uma RIP modificada e o ligante no conjugado podém ser unidos diretamente através de uma ligação covalente ou iônica. Em alguns casos, a RIP e o ligante podem ser unidos através de um ligador tal como um peptideo, polipeptídeo, aminoácido ou ligador químico. Exemplo de um ligador é um ligador Ala-Met. Exemplo de um ligador também inclui, porém não está limitado ao aminobenzoato de N-succinimidil(4- iodoacetil) , aminobenzoato de sulfosuccinimidila(4- iodoacetil), 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-
piridilditio)tolueno, hexanoato de 6-(a-metil-a-
(piridilditiol)-toluamido) sulfosuccinimidila, propionato de N-succinimidil-3-(-2-piridilditio), hexanoato de succinimidil 6(3(-(-2-piridilditio)-proprionamido),
hexanoato de sulfosuccinimidil 6(3(-(-2-piridilditio)- propionamido), hidrazida de 3-(2-piridilditio)-propionila, reagente de Ellman, ácido diclorotriazínico e S-(2— tiopiridil)-L-cisteina.
São providos no presente documento conjugados possuindo uma seqüência de aminoácidos estabelecida em qualquer SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 ou 67.
Também são providas composições farmacêuticas contendo quaisquer conjugados da toxina modificada providos no presente documento, tal como qualquer uma apresentando uma SAl modificada. As composições farmacêuticas contêm excipientes farmaceuticamente aceitáveis, e podem ser formuladas para qualquer via de administração apropriada, incluindo, porém não limitada à administração sistêmica, oral, nasal, pulmonar, local e tópica. Também são providos kits contendo qualquer uma das composições farmacêuticas, um dispositivo para administração da composição e, opcionalmente, instruções para administração.
Também são providas moléculas de ácido nucléico codificando qualquer um dos conjugados providos no presente documento. Também são providos plasmideos contendo as moléculas de ácido nucléico e células contendo as moléculas de ácido nucléico ou plasmideos.
É também provido no presente documento um método de ter como alvo uma toxina em uma célula. Tal método inclui administração de um conjugado, tal como a uma amostra de indivíduo. 0 conjugado que é administrado contém uma toxina modificada, tal como qualquer uma provida no presente documento, e um agente alvo de receptor de superfície celular, tal como um ligante. A célula alvejada 5 expressa o receptor de superfície celular para o agente alvo.
0 presente documento provê um método de tratamento de indivíduos apresentando uma doença ou transtorno imune ou inflamatório. No método de tratamento, 10 uma composição farmacêutica contendo qualquer um dos conjugados providos no presente documento é administrada a um indivíduo e tal que a composição inibe a proliferação, migração ou atividade fisiológica das células inflamatórias que promovem lesão secundária do tecido.
É também provido no presente documento um método
de inibição de uma doença ou transtorno em um animal ou indivíduo ou tratamento de um animal ou indivíduo apresentando uma doença ou transtorno, tal como, uma doença ou transtorno que é uma condição imune ou inflamatória associada com respostas inflamatórias e/ou lesão secundária do tecido associada à ativação, proliferação e migração de uma ou mais células por administração de um conjugado, tal como qualquer conjugado provido no presente documento. No método, o conjugado se liga a um ou mais receptores de superfície celular expressos em uma ou mais células resultando na internalização do agente alvejado nas células portando o receptor, pelo que inibindo a ativação, proliferação ou migração de uma ou mais células. Em um exemplo, o tratamento é de um mamífero. Em outro exemplo, o tratamento é de um ser humano.
Nos métodos, uma ou mais células podem ser uma célula efetora imune ou outra célula associada à condição imune ou inflamatória. Em um exemplo, a célula efetora imune é um leucócito. Em outro exemplo, a outra célula associada à condição imune ou inflamatória se constitui em células residentes de tecido (TRC). As células incluem, porém não estão limitadas aos monócitos, macrófagos,
células dendríticas, células T, células B, eosinófilos, basófilos, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK) e neutrófilos. Incluídos entre os macrófagos estão os macrófagos de tecido, tais como, macrófagos alveolares, micróglia, ou células Kupffer. Incluídas entre as células 10 dendríticas estão as células dendríticas imaturas, células dendríticas maduras ou células de Langerhans. Incluídas entre as células T estão CD4+ (tais como células Thl, Th2 ou Thl7) e células T CD8+. Incluídas entre as TRC estão as células mesangiais, células gliais, células, epiteliais, 15 células tumorais, fibroblastos e sinoviócitos. Em alguns casos, uma ou mais células são ativadas, tais como, por exemplo, receptores de superfície celular expressos nas células são regulados positivamente.
Em um aspecto do método de inibição de uma doença ou transtorno no presente documento, o conjugado inibe a ativação, proliferação ou migração de uma ou mais células envolvidas em uma doença ou transtorno tal como, porém não limitado a lesão ao CNS (sistema nervoso central), doenças inflamatórias do sistema nervoso central, transtornos neurodegenerativos, doença cardíaca, doenças inflamatórias oculares, doenças inflamatórias da pele, doenças inflamatórias do intestino, doenças inflamatórias da articulação, doenças inflamatórias renais ou hepáticas, doenças inflamatórias pulmonares, doenças inflamatórias nasais, doenças inflamatórias sistêmicas, doenças inflamatórias e correlatas na obesidade, doenças inflamatórias da tireóide, respostas inflamatórias associadas a infecções bacterianas ou virais, cânceres, e doença mediada por angiogênese.
Em um exemplo, as doenças inflamatórias do sistema nervoso central e/ou transtornos neurodegenerativos 5 incluem, porém não estão limitados à lesão de cabeça fechada, leucoencefalopatia, coriomeningite, meningite, adrenoleucodistrofia, demência complexa por AIDS, doença de Alzheimer, síndrome de Down, síndrome de fadiga crônica, encefalite, encefalomielite, encefalopatias espongiformes, 10 esclerose múltipla, doença de Parkinson e lesão/trauma na medula espinhal (SCI). Em outro exemplo, a doença cardíaca é aterosclerose. Doenças inflamatórias oculares incluem, porém não estão limitadas a retinopatia diabética proliferativa, vitreoretinopatia proliferativa, retinite, 15 esclerite, escleroirite, coroidite e uveíte. Doenças inflamatórias da pele incluem, porém não estão limitadas a psoríase, eczema e dermatite. A doença inflamatória dos intestinos pode incluir, porém não se limita a colite crônica, doença de Crohn e colite ulcerativa. A doença 20 inflamatória das articulações inclui, porém não se limita'a artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite reumatóide e espondilartropatias, tais como, espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriática, espondilite, espondilartropatias não
diferenciadas e síndrome de Behcet. A doença inflamatória renal ou hepática inclui, porém não se limita a glomerulonefrite, Nefropatia IgA e lúpus nefrite. A doença inflamatória pulmonar inclui, porém não se limita a síndrome de angústia respiratória aguda, doença 30 eosinofílica pulmonar, pneunomia eosinofílica crônica, pneumonia eosinofílica aguda, broncoconstrição, displasia broncopulmonar, eosinofilia broncoalveolar, doenças broncopulmonares alérgicas, aspergilose, pneumonia e doença pulmonar fibrótica. Doenças inflamatórias nasais incluem, porém não estão limitadas a polipose, sinusite e rinite. A doença inflamatória da tireóide inclui, põem não está limitada a tireoidite. Os cânceres incluem, porém não estão limitados aos gliomas, ateromas carcinomas,
adenocarcinomas, granulomas, glioblastomas, granulomatose, linfomas, leucemias, cânceres pulmonares, melanomas, mielomas, sarcomas, sarcoidose, microgliomas, meningiomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, câncer gástrico ou 10 estomacal incluindo câncer gastrintestinal, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer coloretal, carcinoma do endométrio e uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal ou dos rins, 15 câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma do pênis e câncer da cabeça e pescoço.
Em um aspecto, a doença ou transtorno selecionado é uma doença renal, lesão da medula espinal ou uma doença ou transtorno de hipersensibilidade do tipo retardado.
No método de tratamento ou inibição de uma doença ou transtorno no presente documento, o agente alvo do conjugado inclui, porém não se limita a MCP-1, Eotaxina-1, SDF-Iβ, GRO-α, MIP-Ιβ, IL-8, IP-10, MCP-3, MIP-3a, MDC, 25 MIP-Ια, e BCA-1, e suas variantes de espécies ou variantes alélicas, e o agente alvejado é uma Toxina Shiga modificada. Em um exemplo, o agente alvo é MCP-1. Exemplos de conjugados incluem, porém não estão limitados a LPMlc, LPMld, LPM2, LPM3, LPM4, LPM5, LPM6, LPM7, LPM8, LPM9, 30 LPMlO e LPMll. Tais conjugados apresentam uma seqüência de aminoácidos estabelecida em qualquer SEQ ID NO: 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 ou 67, respectivamente.
í Por exemplo, a doença pode ser esclerose múltipla (MS) . Para tais modalidades, as células alvejadas são aquelas que expressam receptores que são regulados positivamente em MS. Por exemplo, células alvejadas incluem 5 aquelas que expressam receptores selecionados dentre, por exemplo, um ou mais, tal como, um ou pelo menos dois de CCL1-8, CXCL8-13, CCRl-3,5,6 e CXCRl-3,4. 0 conjugado para tratamento de MS contém um agente alvo, tal como uma quimiocina ou seu fragmento suficiente para ligação e 10 internalização de agentes ligados (diretamente ou indiretamente) , que se liga e é internalizado por tais receptores. Consequentemente, por exemplo, os conjugados podem conter uma quimiocina ou seu fragmento suficiente para ligação e internalização por um receptor para tal; e a 15 quimiocina, por exemplo, é selecionada dentre, por exemplo, 1-309, MCP-1, MIP-Ioí, MIP-Ιβ, RANTES, MCP-3, MCP-2, IL-8, MIG, IP-10, I-TAC, SDF-la, SDF-Ιβ, BCA-1, uma Eotaxina, MCP-4, MCP-5, CIO, LEC e MIP-lb2. Um exemplo de tais conjugados é o LPMld.
Em um exemplo dos métodos no presente documento,
o agente alvo do conjugado contém um PF-4 ou suas variantes de espécies ou variantes alélicas, e a doença ou condição é uma doença mediada por angiogênese. Em outro exemplo, o agente alvo do conjugado é um VEGF ou suas variantes de 25 espécies ou variantes alélicas, e a doença ou condição é uma doença mediada por angiogênese.
DESCRIÇÃO DETALHADA Visão Geral A. Definições
B. Proteínas de Inativação de Ribossomo (RIPs),
Seleção, Expressão e Produção das Mesmas
C. Proteínas de Inativação de Ribossomo (RIPs) e Métodos de Ação 1. Exemplos das RIPs Toxina Shiga
2. Inibidores da Toxina RIP
4-APP e outros Análogos de Adenina
D. Métodos de Seleção de Toxinas Modificadas ou Seus Conjugados
1. Proteinas RIP Candidatas ou Seus Conjugados
2. Introdução das RIPs ou Seus Conjugados nas Células Hospedeiras
a. Transfecção
b. Transformação
c. Eletroporação
3. Expressão, Seleção e Identificação
4. Avaliação da Atividade
a. Ensaios da Síntese da Proteína
b. Ensaios de Depurinação
c. Ensaios de Crescimento da Célula/ Sobrevivência/Ensaios de Viabilidade
E. Exemplos de Toxinas Modificadas Toxinas da SAl Modificada
F. Agentes Alvo e Seus Conjugados
1. Agentes Alvo
a. Quimiocinas
i. Ligantes
ii. Receptores de Quimiocina
iii. Perfil Celular da Quimiocina/Receptor da Quimiocina
iv. Exemplos de Agentes Alvo da Quimiocina
b. Citocinas diferentes de Quimiocina
c. Frações de Ligante de Anticorpo
d. Outros Agentes Alvo e Alvos Receptores Fatores de Crescimento 2. Frações de Ligador
a. Exemplos de Ligadores
i. Reagentes de Reticulação Heterobifuncionais
ii. Ligadores Cliváveis por Ácido, Fotocliváveis e Sensíveis ao Calor
iii. Outros Ligadores para Conjugação Química
iv. Ligadores de Peptídeo
3. Exemplos de Conjugados Moduladores de População de Leucócito (LPM)
G. PREPARAÇÃO DE TOXINAS RIP MODIFICADAS E SEUS
CONJUGADOS
1. Métodos de Geração e Clonagem de Polipeptídeos da Toxina ou Conjugados Contendo Polipeptídeos da Toxina
2. Produção de Conjugados Contendo Proteínas de Fusão e Sistemas de Expressão
a. Plasmideos e Células Hospedeiras para Expressão
i. Sistemas de Expressão de Célula Bacteriana
ii. Sistemas de Expressão de Célula de Inseto
iii. Sistemas de Expressão de Célula de Levedura
iv. Sistemas de Expressão de Célula de Plantas
v. Sistemas de Expressão de Célula de Mamífero
b. Purificação
3. Produção de Conjugados Químicos
H. Métodos para Aumentar a Produção de Polipeptídeos
da RIP ou Seus Conjugados Métodos Adicionais para Aumentar a Produção de Proteína
I. Ensaios in vivo e in vitro para Medir a Atividade das Toxinas ou Seus Conjugados
1. Ensaios de Atividade in vitro
a. Ensaios de Toxicidade com Base na Célula
b. Ensaios de Ligação de Receptor e Internalização
c. Ensaios de Quimiotaxia
2. Modelos de Animais in vivo para Teste de Conj ugados
a. Lesão à Medula Espinal (SCI)
b. Lesão Cerebral Traumática e Acidente Vascular
c. Doença de Alzheimer
d. Esclerose Múltipla
e. Artrite e Doença Autoimune
f. Doenças Inflamatórias Pulmonares
g. Inflamação após Terapia Gênica
h. Angiogênese
i. Crescimento de Tumor
j. Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) k. Doença Renal I. Hipersensibilidade J. Formulação e Administração das Composições Contendo Toxinas e Seus Conjugados K. Métodos de Tratamento das Doenças e Transtornos Empregando Toxinas ou Seus Conjugados
1. O Sistema de Defesa Hospedeiro Imune e
Inflamação
a. Inflamação Homeostática
b. Inflamação Patológica
2. Terapêuticas Candidatas e suas Limitações 3. Conjugados de Ligante-Toxina (isto é, LPMs)
Seleção de Conjugado de Ligante-Toxina para Tratamento de Doenças ou Transtornos Selecionados
Seleção e Projeto de Moduladores da População de Leucócitos
4. Exemplos de Doenças
a. Câncer
b. Doença Renal
c. Lesão à Medula Espinal (SCI)
d. Hipersensibilidade
e. Infecção por HIV e AIDS e infecções por
Outros Agentes Patogênicos
f. Doença Inflamatória das Articulações e
Doença Autoimune
g. Doença Pulmonar
h. Outras Doenças Mediadas por Lesão
Secundária do Tecido
5. Terapias de Combinação L. Exemplos
A. DEFINIÇÕES
A menos que de outra forma definidos, todos os termos técnicos e científicos empregados no presente documento apresentam o mesmo significado que é geralmente entendido por um versado na técnica a qual esta invenção se refere. Todas Patentes, Pedidos de Patente, Pedidos Publicados e Publicações, seqüências do Genbank, bases de dados, sites da web e outros materiais publicados referidos através de toda esta descrição, a menos que de outra forma observado, são incorporados como referência em sua totalidade. No caso de haver várias definições para os termos no presente documento, as definições nesta seção prevalecerão. Quando for feita referência a um URL ou outro identificador ou endereço, fica entendido que tais identificadores podem mudar e informações especificas na internet podem ir e vir, porém informações equivalentes podem ser encontradas buscando na internet. Referências às mesmas evidenciam a disponibilidade e disseminação pública de tais informações.
Conforme usado no presente documento, toxina (também referida como uma citotoxina) se refere a uma molécula tal como um polipeptídeo ou medicamento, que quando internalizado em uma célula inibe função celular, tal como por inibição do crescimento celular e/ou proliferação. A toxina pode inibir a proliferação ou ser tóxica às células. Qualquer molécula que, quando internalizada por uma célula interfere ou altera prejudicialmente o metabolismo celular ou de qualquer modo inibe o crescimento ou proliferação celular está incluída no âmbito deste termo, incluindo, porém não limitado às moléculas cujos efeitos tóxicos são mediados quando transportadas para dentro da célula e também aquelas cujos efeitos tóxicos são mediados na superfície da célula. Várias citotoxinas são conhecidas e incluem aquelas que inibem a síntese da proteína e aquelas que inibem a expressão de determinados genes essenciais para o crescimento ou sobrevivência celular. As toxinas incluem aquelas que resultam na morte celular e aquelas que inibem
o crescimento celular, proliferação e/ou diferenciação ou de outra forma alteram prejudicialmente o metabolismo celular. Por exemplo, as toxinas incluem, porém não estão limitados as proteínas de inativação do ribossomo (RIPs). As RIPs, quando da internalização em uma célula, alteram o metabolismo ou expressão gênica na célula, regulam ou alteram a síntese da proteína, inibem a proliferação, exterminam a célula ou de outra forma afetam prejudicialmente a célula. Para fins no presente documento, uma toxina, por exemplo, uma proteína da RIP, tal como uma proteína RIP modificada provida no presente documento, é um agente alvejado. As toxinas inibem o crescimento e proliferação ou interferem ou alteram prejudicialmente o metabolismo celular ou de qualquer modo das células hospedeiras nas quais elas são expressas quando as células são cultivadas sob condições padrão ou normais para tais células.
Conforme usado no presente documento, crescimento sob condições padrão com referência às células hospedeiras se refere às condições nas quais tais células normalmente crescem para expressar proteínas codificadas ou proteínas recombinantes.
Conforme usado no presente documento, proteína de inativação de ribossomo (RIP) se refere a uma classe de proteínas expressas nas plantas e bactérias que são inibidores potentes da síntese da proteína eucariótica e procariótica. As RIPs também degradam o DNA celular quando da importação para os núcleos. As RIPs são N-glicosidases ou polinucleotídeo:adenosina glicosidases e são capazes de inativar substratos de ácido nucléico ribossômico e não ribossômico.
Conforme usado no presente documento, referência aos polipeptídeos de RIP se refere a qualquer polipeptídeo que exibe atividade da N-glicosidase e inativa ribossomos. Estes incluem polipeptídeos isolados de fontes naturais bem como aqueles fabricados sinteticamente, tal como por métodos recombinantes, por síntese química ou qualquer método. Eles também incluem variantes, tipo selvagem, variantes de espécie e variantes alélicas. Exemplos de RIPs incluem, porém não estão limitados a quaisquer RIPs do tipo
I ou tipo II incluindo, porém não limitadas a toxina Shiga incluindo toxina Shiga I (Stxl), Stx2, Saporina 6, RIP I de cevada, RIP II de cevada, Gelonina, Ricina A, Momordina I, Momordina II, Briodina I, Briodina II, Pap-S, Lufina, Tricosantina, Clavina, Abrina-a, RIP 3 de milho, RIP 9 de milho, RIP X de milho, Tritina, MAP, Diantina 30, Nigrina
b, Nigrina I, Ebulina, fragmentos citotoxicamente ativos destas toxinas e outras RIPs conhecidas dos versados na técnica. Polipeptídeos da RIP também englobam variantes e ouras formas modificadas, tal como muteínas dos polipeptídeos da RIP. Tipicamente variantes e formas modificadas possuem atividade da N-glicosidase. Variantes incluem, por exemplo, variantes de espécies e alélicas e também aquelas com inserções ou deleções de resíduos de aminoácidos. Seqüências exemplares de proteínas da RIP são qualquer uma que inclui resíduos de aminoácidos possuindo uma seqüência de aminoácido estabelecida em qualquer SEQ ID NOS: 1, 5, 89-111 bem como variantes de espécies e/ou variantes alélicas e homólogos e suas versões modificadas que possuam pelo menos 40, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou mais de identidade de sequencia, especificamente qualquer uma que mantenha atividade da N- glicosidase. Variantes de RIP exemplares incluem qualquer uma conhecida na técnica ou aquelas providas no presente documento, tal como uma proteína da RIP apresentando qualquer uma ou mais variações de aminoácido conforme estabelecido nas SEQ ID NOS: 3, 6-21, 162-169.
Conforme usado no presente documento, uma "atividade funcional" ou "atividade" de um polipeptídeo da RIP se refere a qualquer atividade exibida por um polipeptídeo da RIP que possa ser avaliada. Tais atividades podem ser testadas in vitro e/ou in vivo e incluem, porém não estão limitadas à atividade de N-gliocosidase e/ou atividade de polinucleotídeo:adenosina glicosidade incluindo atividade de RNAase e DNAase. Outras atividades incluem, porém não estão limitadas a atividade de superóxido dismutase, atividade de fosfolipase, atividade de quitinase e atividade antiviral. Ensaios para determinar atividade dos polipeptídeos da RIP, suas formas modificadas ou seus conjugados, são conhecidos dos versados na técnica. Por exemplo, a atividade pode ser avaliada por ensaio quanto a síntese da proteína, depurinação e/ou crescimento/viabilidade celular. Além disto, a atividade de polinucleotídeo:adenosina glicosidase pode ser avaliada, por exemplo, por purificação do DNA das células tratadas com um polipeptídeo da RIP e visualização por coloração com brometo de etídio. Exemplos dos ensaios para avaliação da atividade de um polipeptídeo da RIP, tal como um polipeptídeo da SAl modificada, ou seus conjugados são estabelecidos presente documento ou descritos nos Exemplos
2 a 5.
Conforme usado no presente documento, um fragmento ativo (usado intercambiavelmente com uma porção ativa) de uma toxina se refere a um fragmento que possui 20 uma atividade, tal como uma atividade tóxica ou uma atividade catalítica. Consequentemente é feita referência aos fragmentos de toxina cataliticamente ativos, tais como RIPs, e fragmentos que mantém atividade da toxina. Onde é provida uma toxina modificada, tal como uma toxina Shiga, o 25 fragmento ativo inclui uma modificação.
Conforme usado no presente documento, polipeptídeos da toxina variante, tais como RIPs variantes, se referem coletivamente às RIPs antes da modificação para reduzir toxicidade conforme descrito no presente documento. 30 Toxina variante é qualquer forma daquele polipeptídeo que difere de uma forma do tipo selvagem e inclui variantes de espécies e/ou variantes alélicas, polipeptídeos codificados por variantes de splicing e/ou formas modificadas, especificamente variantes com alterações na estrutura primária. Variantes incluem aquelas que contêm deleção, substituição ou adição de aminoácidos em comparação a uma forma do tipo selvagem da proteína. Por exemplo, variantes da SAl incluem aquelas que contêm mutações de aminoácido ou são truncadas em comparação a SAl do tipo selvagem correspondendo aos aminoácidos 1-251 do domínio A maduro estabelecido na SEQ ID NO: 5, bem como suas variaçõés alélicas ou de espécies. Exemplos de truncagens são as variantes 1 e variantes 2 estabelecidas nas SEQ ID NOS: 22 e 24, respectivamente.
Conforme usado no presente documento, variantes de espécies se referem às variações nos polipeptídeos entre espécies diferentes, incluindo espécies bacterianas diferentes, tais como, Escherichia e Shigella.
Conforme usado no presente documento, variantes alélicas se referem às variações nas proteínas entre elementos das mesmas espécies.
Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo da RIP não modificado se refere a uma proteína de partida que é selecionada para modificação. O polipeptídeo alvo de partida pode ser de ocorrência natural, forma do tipo selvagem de um polipeptídeo. Além disso, o polipeptídeo alvo de partida pode ter sido previamente alterado ou mutado, tal que ele difere da isoforma do tipo selvagem nativo, põem não obstante é referido no presente documento como uma proteína alvo não modificada de partida em relação às proteínas subsequentemente modificadas produzidas no presente documento. Assim, as proteínas conhecidas por terem sido modificadas para ter um aumento ou diminuição desejado em uma atividade ou propriedade específica em comparação a uma proteína de referência não modificada, podem ser usadas como proteína alvo não modificada de partida. Para fins no presente documento, um polipeptídeo da RIP não modificada inclui o polipeptídeo da RIP sozinho, ou seu fragmento ativo, ou conjugados contendo um polipeptídeo da RIP ou seu fragmento ativo.
Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo da RIP "modificada" ou "mutante" se refere a um polipeptídeo da RIP que possui uma ou mais modificações na seqüência primária, em comparação à proteína de partida de referência ou polipeptídeo não modificado, tal como um polipeptídeo do tipo selvagem ou outro polipeptídeo da RIP de partida incluindo variantes alélicas, ou de espécies particulares e outras variantes. A modificação ou mutação altera a toxicidade (isto é, a capacidade de alterar o metabolismo ou expressão gênica na célula, regular ou alterar a síntese da proteína, inibir a proliferação, exterminar a célula ou de outra forma afetar prejudicialmente a célula). Consequentemente, uma RIP modificada ou mutante contém mutações, incluindo inserções e deleções de resíduos de aminoácidos em qualquer RIP, pelo que toxicidade é reduzida em comparação à RIP de partida. Uma ou mais mutações incluem uma ou mais substituições de aminoácidos, inserções, deleções e quaisquer combinações da mesma. Um polipeptídeo da RIP modificada pode apresentar 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais posições modificadas. De modo geral, estas mutações alteram a toxicidade e/ou uma ou mais outras atividades do polipeptídeo da RIP. Tal modificação inclui aquela identificada nos métodos de seleção no presente documento. Além de conter modificações que alteram a toxicidade do polipeptídeo, um polipeptídeo da RIP modificada também pode conter outras modificações. Um polipeptídeo da RIP modificada apresenta, tipicamente, 60%', 70%, 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com relação à seqüência correspondente de aminoácidos de um polipeptídeo da RIP não modificada de partida ou do tipo selvagem.
Conforme usado no presente documento, Toxina Shiga se refere a um polipeptídeo da RIP originalmente isolado da bactéria, especificamente elementos do gênero Shigella e outros gêneros correlatos, tais como, Shigella dysenteriae. Toxina Shiga é uma proteína de múltiplas subunidades constituída de uma subunidade A que se torna clivada em Al e A2 para formar uma fração da Toxina Shiga Al (SAl) ativa e cinco subunidades B. As subunidades B são ligadas à fração A2 e são necessárias para entrada da Toxina Shiga nas células (Sandvig and van Deurs, EMBO J., 19: 5943-50, 2000). Nos conjugados no presente documento, as subunidades B são substituídas com um agente alvo para entrada em uma célula. Consequentemente, os conjugados incluem a subunidade da toxina, especificamente subunidade A, e mais especificamente, o fragmento cataliticamente ativo (SAl) ou seu fragmento ativo. Uma seqüência precursora exemplar de uma subunidade A da Toxina Shiga é estabelecida na SEQ ID NO: Iea seqüência madura é estabelecida na SEQ ID NO: 5. O fragmento Al cataliticamente ativo (SAl) corresponde aos aminoácidos 1- 251 da seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 5 e o fragmento A2 corresponde aos aminoácidos 252-293 da seqüência estabelecida na SEQ ID NO:5.
As toxinas Shiga também exibem variações alélicas e de espécie. Exemplos de Toxinas Shiga incluem aquelas produzidas pelas espécies Shlgella e variantes de espécies e variantes alélicas, tais como, porém não limitado a Shigella dysenteriae, E. coli, Citrobacter freundii, Aeromononas hydrophila, Aeromononas caviae e Enterobacter cloacae. Seqüências exemplares do precursor ou forma madura das cadeias A das várias Toxinas Shiga são estabelecidas em qualquer SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 7-21. Outras variantes na cadeia A da Toxina Shiga são estabelecidas na SEQ ID NO: 6.
Conforme usado no presente documento, "subunidade enzimática" ou "subunidade cataliticamente ativa" ou "subunidade ativa" de um polipeptídeo da RIP se refere à porção do polipeptídeo que media uma atividade tóxica. A atividade tóxica pode ser qualquer propriedade ou atividade do polipeptídeo, como devido à atividade inibidora contra rRNA em virtude de uma atividade da N-glicosidase ou depurinação de DNA, mRNA ou DNA viral ou RNA viral. Por exemplo, para toxina Shiga, a porção ativa é a subunidade Al (SAl) , que é ativada por clivagem da subunidade A nos fragmentos Al e A2. Consequentemente, uma porção ativa da cadeia A da Toxina Shiga é a subunidade Al também referida como SAl.
Porções ativas das Toxinas Shiga, bem como de qualquer RIP, são conhecidas ou podem ser identificadas empiricamente empregando ensaios de atividade in vitro ou in vivo que avaliam a atividade (vide, por exemplo, Stirpe e outros, Bio/Technology 10:405-12, 1992; e Sandvig e Van Deurs, Physiol. Rev. 76:949-66, 1996; Stirpe e Battelli, Cell MolLife Sci., 63: 1850-66, 2006). As subunidades A dás RIPs exemplares são estabelecidas na Tabela 3 no presente documento, e/ou são conhecidas ou seriam identificadas pór um versado na técnica.
Conforme usada no presente documento, "sua porção ativa" ou "seu fragmento ativo" de uma toxina RIP se refere a um polipeptídeo que contém pelo menos o mínimo de resíduos de aminoácidos para manifestar a atividade tóxica. Tipicamente uma porção ativa contém aminoácidos conjugados de um polipeptídeo da RIP, tal como a porção mínima da subunidade A ou subunidade Al, necessária para prover uma atividade tóxica. Fragmentos ativos e o mínimo de resíduos de aminoácidos podem ser empiricamente determinados por produção e truncagens de teste de um ou ambos os términos N ou C de uma subunidade A ou subunidade Al de polipeptídeo da RIP para determinar aquele que mostra uma atividade. A atividade pode ser avaliada por vários ensaios descritos no presente documento ou conhecidos na arte incluindo, porém não limitados aos ensaios de síntese de proteína, ensaios de depurinação ou ensaios de crescimento/viabilidade celular. A atividade pode ser qualquer porcentagem de atividade (mais ou menos) de polipeptídeo de comprimento completo, incluindo, porém não limitado a 1% da atividade, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de atividade em comparação ao polipeptídeo completo.
Tipicamente, um fragmento ativo de uma toxina RIP é um fragmento truncado onde cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos nos términos N ou C da cadeia A do polipeptídeo estão faltando. Fragmento:s ativos exemplares da subunidade SAl cataliticamente ativa ou seu fragmento ativo de uma Toxina Shiga são estabelecidos na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24.
Conforme usada no presente documento, toxicidade se refere à capacidade de uma molécula, incluindo um peptídeo, proteína, substância química ou outra molécula para alterar o metabolismo ou expressão gênica na célula, regular ou alterar a síntese da proteína, inibir proliferação, extermina a célula ou de outra forma afetar prejudicialmente a célula. Para fins no presente documento, com relação às RIPs, toxicidade se refere à capacidade de uma RIP, sua subunidade ou fragmento de, quando da internalização em uma célula, alterar o metabolismo ou expressão gênica na célula, regular ou alterar a sintese da proteína, inibir proliferação, exterminar a célula ou de outra forma afetar prejudicialmente a célula. Por exemplo, polipeptídeos da RIP, ou seus conjugados, exibem toxicidade celular através de várias atividades incluindo, porém não limitado a sua atividade da N-glicosidase e/ou atividade da polinucleotídeo:adenosina glicosidade.
Conforme usada no presente documento, atividade da N-glicosidase se refere às enzimas de polipeptídeo que clivam ligações N-glicosídicas de nucleotídeo. Os polipeptídeos de RIP exibem atividade de glicosidade por remoção de um resíduo de adenina específico do RNAr ribossômico. Tal atividade resulta na inibição da síntese da proteína e subsequente morte celular por prevenção da ligação de fatores de alongamento ao ribossomo.
Conforme usados no presente documento, resíduos correspondentes se refere aos resíduos que ocorrem em locais alinhados. Polipeptídeos correlatos ou variantes são alinhados por quaisquer métodos conhecidos dos versados na técnica. Tais métodos tipicamente maximizam emparelhamentos e incluem métodos, tais como, alinhamentos manuais e por emprego de vários programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos dos versados na técnica. Por alinhamento da seqüências de polipeptídeos, um versado na técnica pode identificar resíduos correspondentes, empregando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Por exemplo, um versado na técnica reconhece que as posições referidas de uma cadeia A da toxina de Shiga madura estabelecida na SEQ ID NO: 5 diferem em vinte e dois resíduos de aminoácido quando comparadas a uma cadeia A da toxina Shiga precursora estabelecida na SEQ ID NO: 1, devido à presença de uma seqüência de sinal. Assim, o aminoácido na posição vinte e três da SEQ ID NO: 1 "corresponde ao" primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 5. Adicionalmente, um versado na técnica também pode empregar resíduos de aminoácidos conservados como guias para encontrar resíduos de aminoácidos entre seqüências humanas e não humanas. As posições correspondentes também podem se basear em alinhamentos estruturais, por exemplo, usando alinhamentos estimulados pelo computador da estrutura da proteína. Em outros exemplos, as regiões correspondentes podem ser identificadas. Um versado na técnica também pode empregar resíduos de aminoácido conservados como guias para encontrar resíduos de aminoácidos correspondentes entre seqüências humanas e não humanas.
Conforme usado no presente documento, "seqüência primária" se refere à seqüência de resíduos de aminoácido em um polipeptídeo.
Conforme usados no presente documento, os termos "homologia" e "identidade" são usados intercambiavelmente, porém homólogos para proteínas podem incluir alterações de aminoácido conservadoras. Em geral, para identificar posições correspondentes, as seqüências de aminoácidos são alinhadas de modo que o emparelhamento de ordem mais alta é obtido (vide, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo e outros (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Conforme usado no presente documento, "identidade de sequencia" se refere ao número de aminoácidos idênticos (ou bases de nucleotídeo) em uma comparação entre um teste e um polipeptídeo de referência ou polinucleotídeo. Polipeptídeos homólogos se referem a um número predeterminado de resíduos de aminoácidos homólogos ou idênticos. Homologia inclui substituições de aminoácidos conservadores bem como resíduos idênticos. A identidade da seqüência pode ser determinada por programas de algoritmo de alinhamento padrão usados com penalidades por gap padrão estabelecidas pelos fornecedores individualmente. Moléculas de ácido nucléico homólogas se referem a um número predeterminado de nucleotídeos idênticos ou homólogos. Homologia inclui substituições que não alteram o aminoácido codificado (isto é, "substituições silenciosas") bem como resíduos idênticos. Moléculas de ácido nucléico substancialmente homólogas hibridizam tipicamente com estringência moderada ou com estringência alta todas ao longo do comprimento do ácido nucléico ou ao longo de pelo menos cerca de 7 0%, 80% ou 90% do comprimento completo da molécula de ácido nucléico de interesse. Também são contempladas as moléculas de ácido nucléico que contêm códons degenerados no lugar dos códons na molécula de ácido nucléico de hibridização ou na molécula com uma identidade de seqüência específica. Para determinação da homologia das proteínas, aminoácidos conservadores podem ser alinhados bem como aminoácidos idênticos; neste caso, a porcentagem de identidade e e de homologia varia. Se qualquer uma das duas moléculas de ácido nucléico tiver seqüências de nucleotídeo (ou quaisquer dois polipeptídeos apresentarém seqüências de aminoácido) existem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticas" que podem ser determinadas usando algoritmos de computador conhecidos, tais como, o programa "FAST A", usando, por exemplo, os parâmetros padrão como em Pearson e outros Proc. Natl. Acad.. Sei. USA 85: 2444 (1988) (outros programas incluem o pacote de programas GCG (Devereux, J. e outros, Nueleic 5 Aeids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. e outros, J. Molee. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego (1994), and Carillo e outros, SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)) . Por exemplo, a função BLAST 10 do National Center for Biotechnology Information database pode ser usado para determinar identidade. Outros programas comercialmente ou publicamente disponíveis incluem prograrha DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) e o programa da University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap" (Madison 15 WI)) . A porcentagem de homologia ou identidade das proteínas e/ou moléculas de ácido nucléico pode ser determinada, por exemplo, por comparação da informação de seqüência usando um programa de computador GAP (por exemplo, Needleman e outros J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), 20 conforme revisto por Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Em resumo, um programa GAP define a similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são semelhantes, dividido pelo número total de símbolos na mais curta das duas 25 seqüências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluem: (1) uma matriz de comparação unitária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação pesada de Gribskov e outros Nuel'. Aeids Res. 14: 6745 (1986), conforme descrito por Schwartz 30 e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada gap e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada gap; e (3) nenhuma penalidade para gaps de extremidade.
Conforme usado no presente documento, o termo "identidade" representa uma comparação entre um teste e um polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência. Em um exemplo não limitante, "pelo menos 90% idêntico a" se refere à porcentagens de identidade de 90 a 100% em relação aos polipeptídeos de referência. A identidade em um nível de 90% ou mais é indicativa do fato de que, presumindo-se que para fins de exemplif icação, um comprimento de polinucleotídeo de referência e de teste de 100 aminoácidos são comparados, não mais de 10% (isto é, 10 de 100) dos aminoácidos no polipeptídeo de teste diferem daqueles polipeptídeos de referência. Comparações semelhantes podêm ser obtidas entre polinucleotídeos de teste e de referência. Tais diferenças podem ser representadas como mutações de ponto distribuídas de modo aleatório por todo o comprimento de uma seqüência de aminoácido ou elas podem ser agrupadas em um ou mais locais de comprimento variado até o máximo permitido, por exemplo, diferença de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de ácido nucléico ou aminoácido. Ao nível das homologias ou identidades acima de cerca de 85-90%, o resultado deveria ser independente do conjunto de parâmetros de programa e gap; tais níveis mais altos de identidade podem ser avaliados prontamente, frequentemente sem se basear no software.
Conforme usado no presente documento, também é entendido que o termo "substancialmente idêntico" ou "semelhante" varia com o contexto conforme entendido pelos versados na técnica relevante, porém que aqueles versados na técnica podem avaliar. Conforme usado no presente documento, um "método de seleção" se refere a qualquer método onde uma proteína é identificada com base em um atributo, propriedade ou atividade específica. Para os fins do presente documento, 5 os polipeptídeos da RIP ou seus fragmentos ativos identificados no método de seleção no presente documento incluem aqueles que mostram uma toxicidade reduzida em comparação a uma proteína não modificada ou de partida.
Conforme usada no presente documento, produção 10 por métodos recombinantes se refere ao emprego de métodos de DNA recombinante para expressar um polipeptídeo recombinante. Tais métodos são bem conhecidos de um versado na técnica e tipicamente incluem métodos de biologia molecular para expressar proteínas codificadas por DNA 15 clonado.
Conforme usado no presente documento, "rendimento aumentado" se refere à quantidade de uma RIP produzida, tal como, mg/L ou uma quantidade absoluta, com referência à quantidade de uma RIP produzida na presença de um inibidor da RIP em comparação à ausência do inibidor da RIP.
Conforme usada no presente documento, "isolada" com referência às células, se refere à separação de uma célula, colônia de células ou população de células para longe das outras colônias de células ou populações de 25 células. O isolamento pode ser efetuado por qualquer procedimento que separa as células, tal como, condições de galvanização, técnicas de purificação, tais como o uso de microesferas magnéticas, características celulares específicas, tais como, granularidade ou outras técnicas 30 semelhantes. Por exemplo, o isolamento pode ser efetuado por galvanização ou dispersão de uma amostra de uma cultura de célula, tal como uma cultura de célula bacteriana sobre uma superfície de nutriente Agar, sob condições onde cada célula viável cresce e forma uma colônia de células. As condições de galvanização podem ser otimizadas, tal como por diluição da cultura celular, de modo que uma colônia simples de células é detectada como uma colônia separada. As células ou colônias de células podem ser coletadas individualmente ou selecionadas como uma célula simples.
Conforme usado no presente documento, "isolada(o)" com referência a uma molécula de ácido nucléico ou polipeptídeo ou outra biomolécula significa que o ácido nucléico ou polipeptídeo se separou do ambiente genético do qual o polinucleotídeo ou ácido nucléico ou célula foi obtido. Também pode significar alterado do estado natural. Por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é "isolado", porém o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado" conforme o termo é empregado no presente documento. Assim, um polipeptídeo ou polinucleotídeo produzido e/ou contido dentro de uma célula hospedeira recombinante é considerado isolado. Também pretendidos como um "polipeptídeo isolado" ou um "polinucleotídeo isolado" são os polipeptídeos ou polinucleotídeos que foram parcial ou substancialmente purificados de uma célula hospedeira recombinante ou de uma fonte nativa. Por exemplo, uma versão produzida recombinantemente de um composto pode ser substancialmente purificada por um método de uma etapa descrito em Smith e outros, Gene, 67:31-40 (1988). Os termos isolado e purificado podem ser usados intercambiavelmente.
Assim, "isolado" significa que o ácido nucléico está livre das seqüências de codificação daqueles genes que, no genoma de ocorrência natural do organismo (se houver), flanqueiam imediatamente o gene codificando o ácido nucléico interesse. DNA isolado pode ser de filamento simples ou filamento duplo e pode ser DNA genômico, DNAc, DNA híbrido recombinante ou DNA sintético. Pode ser idêntico a uma seqüência de DNA de partida ou pode diferir de tal seqüência por deleção, adição ou substituição de um ou mais nucleotídeos.
Conforme usado no presente documento, preparações "purificadas" fabricadas de células biológicas ou hospedeiras significam pelo menos a pureza de um extrato celular contendo o DNA indicado ou proteína incluindo um extrato bruto do DNA ou proteína de interesse. Por exemplo, no caso de uma proteína, uma preparação purificada pode ser obtida seguindo-se uma técnica individual ou uma série de preparações ou técnicas bioquímicas e o DNA ou proteína de interesse pode estar presente em vários graus de pureza nestas preparações. Os procedimentos podem incluir, porém não estão limitados ao fracionamento do sulfato de amônio, filtração de gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, centrifugação por gradiente de densidade e eletroforese.
Conforme usada no presente documento, uma preparação de DNA ou proteína que é "substancialmente pura" ou "isolada" se refere a uma preparação substancialmente isenta de materiais de ocorrência natural com os quais tal DNA ou proteína está normalmente associado na natureza e geralmente contém 5% ou menos de outros contaminantes.
Conforme usado no presente documento, um extrato de célula que contém o DNA ou proteína de interesse se refere a uma preparação de homogenato ou preparação isenta de célula obtida das células que expressam a proteína OU contêm o DNA de interesse. O termo "extrato celular" se destina a incluir meio de cultura, especialmente meio de cultura gasto do qual as células foram removidas. Conforme usado no presente documento, um "agente seletivo" ou "agente de seleção" se refere a qualquer fator ao qual as células ou populações de células são sensíveis ou suscetíveis e que, em virtude da sensibilidade podem se usados para identificar as células que exibem resistência ao agente ou aos efeitos do agente nas células. Tipicamente, os agentes de seleção são empregados em combinação com os sistemas de expressão para selecionar os polipeptídeos expressos que conferem resistência à célula hospedeira ao agente seletivo específico. Exemplos de agentes seletivos são os antibióticos.
Conforme usado no presente documento, um "agente de modulação de seleção" ou "modulador de seleção" ou "agente que modula seleção" se refere a qualquer fator Ou agente usado em um método de seleção que aperfeiçoa ou aumenta a capacidade de selecionar um atributo específico, propriedade ou atividade, tal como um atributo, propriedade ou atividade de um polipeptídeo recombinante. Para os fins no presente documento, um agente que modula a seleção pode ser empregado nos métodos de seleção para aperfeiçoar a seleção dos polipeptídeos da RIP ou seus fragmentos ativos, que exibem toxicidade alterada. Exemplos de moduladores de seleção são inibidores de RIP. Por exemplo, um inibidor da RIP, tal como um análogo de adenina, diminui ou facilita a toxicidade de um polipeptídeo da RIP a uma célula hospedeira, pelo que permitindo expressão da RIP na célula hospedeira. O modulador de seleção escolhido, sua concentração e tempo de incubação são fatores que podem influenciar a capacidade de um modulador de seleção de melhorar a capacidade de selecionar um atributo, propriedade ou atividade específico. Os moduladores de seleção assim diferem dos agentes de seleção. Conforme usado no presente documento, um "agente de indução" se refere a qualquer fator que é empregado para iniciar expressão da proteína recombinante em uma célula hospedeira. Fatores que podem ser empregados como indutores incluem, porém não estão limitados as alterações na temperatura ou administração de moléculas pequenas, peptídeos ou polipeptídeos. A escolha do agente de indução depende da célula hospedeira empregada para expressão da proteína recombinante e do promotor específico usado para expressar a proteína. Um versado na técnica está familiarizado com vários agentes de indução. Por exemplo, no sistema de expressão pET, a T7 RNA polimerase necessária para expressão gênica está sob o controle do promotor T7 induzível por IPTG. A expressão da proteína não ocorre nas células hospedeiras, tipicamente, células E. coli BL21(DE3), transformadas com um vetor pET contendo um gene clonado, até indução por IPTG.
Conforme usado no presente documento, um inibidor da RIP é qualquer substância química, tal como um peptídeo, polipeptídeo, oligonucleotídeo ou outra molécula ou condição, que inibe a atividade de um polipeptídeo da RIP. Tipicamente, os inibidores da RIP incluem qualquer um que iniba a atividade da N-glicosidase de um polipeptídeo da RIP. Consequentemente, os inibidores da RIP são qualquer agente, polipeptídeo ou outra molécula que reduza a atividade de um polipeptídeo da RIP. Tais agentes são conhecidos e incluem qualquer um que reduza a atividade de um polipeptídeo da RIP. Exemplo de um inibidor da RIP é 4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina (4-APP).
Conforme usado no presente documento, "eficaz para inibir a toxicidade de um polipeptídeo da RIP" quando se refere a um inibidor da RIP significa que na presença do inibidor, um polipeptídeo da RIP não mantém ou mantém pouca atividade ou sua atividade é reduzida quando incubado na presença do inibidor da RIP. Por exemplo, um polipeptídeo da RIP cuja toxicidade seja inibida exibe uma redução de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% na toxicidade em comparação à atividade tóxica do polipeptídeo da RIP na ausência do inibidor da RIP.
Conforme usado no presente documento, "mantém atividade tóxica" se refere a um polipeptídeo da RIP ou sua porção ativa que exibe uma atividade de um polipeptídeo da RIP, cuja atividade é tipicamente reduzida em comparação a um tipo selvagem, de partida ou forma de referência de um polipeptídeo da RIP. Para fins no presente documento, uma atividade é mantida se for suficiente o bastante para exibir uma atividade tóxica contra um ribossomo, DNA, RNAm, RNAt ou célula hospedeira alvo. Por exemplo, um polipeptídeo da RIP ou sua porção ativa mantém uma atividade se mostrar pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de atividade em comparação a um tipo selvagem, de partida ou polipeptídeo da RIP de referência. Uma RIP ou outra toxina pode exibir uma redução substancial na atividade, mesmo para menos de 1% de sua atividade original, à medida que o conjugado contendo tal RIP for eficaz para tratamento.
Conforme usado no presente documento, um conjugado se refere às moléculas providas no presentfe documento que incluem uma ou mais frações alvo ligadas direta ou indiretamente a um ou mais agentes alvejados que são toxinas RIP modificadas. Estes conjugados são também referidos no presente documento como conjugados de ligante- toxina e incluem, por exemplo, moduladores da população de leucócitos (LMPs). Tais conjugados incluem proteínas de fusão, aquelas produzidas por conjugados químicos e aquelas produzidas por outro método, pelo qual, pelo menos uma toxina modificada é ligada, direta ou indiretamente a um agente alvo, pelo qual por ligação a um receptor de superfície celular a toxina é internalizada na célula alvejada.
Conforme usado no presente documento, um modulador de população de leucócito (LPM) é um conjugado de ligante-toxina onde o agente alvo é uma porção de polipeptídeo que é suficiente para ter como alvo o conjugado a um ou mais receptores de quimiocina expressos em uma célula, pelo que efetuando a internalização de um agente alvejado ligado ou de outra forma associado. De modo geral, a porção de polipeptídeo de um LPM é um ligante, fragmento, variantes de espécies ou alélicas ou de splicing, de quimiocina que tem como alvo o conjugado a um ou mais receptores de quimiocina. Tipicamente, através dos receptores de quimiocina expressos na superfície da célula, tal conjugado é alvejado para um ou mais do que um leucócito.
Conforme usada no presente documento, uma proteína de fusão se refere a um polipeptídeo que contém pelo menos dois componentes de polipeptídeo, tal como uma fração alvo (isto é, uma quimiocina) e um agente alvejado, a toxina, e opcionalmente um ligador de peptídeo ou polipeptídeo. Tais proteínas podem ser produzidas por expressão de um ácido nucléico codificando o conjugado nas células hospedeiras.
Conforme usado no presente documento, um agente alvejado é qualquer agente que é destinado à internalização por ligação a uma fração alvo, conforme definido no presente documento e que, quando da internalização, de algum modo altera ou afeta o metabolismo celular, crescimento, atividade, viabilidade ou outra propriedade ou característica da célula. Os agentes alvejados no presente documento são as toxinas modificadas. Exemplos de agentes alvejados providos no presente documento são SAl ou seus 5 fragmentos ativos, incluindo polipeptídeos da SAl modificados.
Conforme usado no presente documento, ter como alvo um agente alvejado significa direcionar o mesmo a uma célula que expressa um receptor selecionado por ligação do 10 agente a uma fração alvo. Quando da ligação ao receptor o agente alvejado ou agente alvejado ligado à fração de ligação do receptor é internalizado pela célula.
Conforme usada no presente documento, "célula imune" ou "célula efetora imune" se refere a qualquer 15 célula que ajuda a defender o corpo contra doença infecciosa e materiais estranhos como parte do sistema imune. Tais células incluem aquelas encontradas no sangue, no sistema linfático e em outros tecidos do corpo. Estes incluem, porém não estão limitados aos leucócitos e outras 20 células residentes no tecido, tais como, células de Kupffer, micróglia, macrófago alveolar ou outra célula imune associada ao tecido.
Conforme usado no presente documento, leucócito se refere a um leucócito que desempenha um papel no sistema 25 de defesa imune do corpo hospedeiro. Os leucócitos incluem, porém não estão limitados aos monócitos, macrófagos, células dendríticas, mastócitos, células exterminadoras naturais, granulócitos (basófilos, eosinófilos,
neutrófilos) , e linfócitos (Linfócitos BeT).
Conforme usada no presente documento, célula
residente no tecido (TRC) se refere às células especializadas que residem em ou são específicas aos tecidos ou órgãos particulares. Muitas células residentes de tecido desempenham um papel nas defesas imunes do corpo, especificamente com relação ao tecido especifico. Incluídas entre tais TRC estão as células de Kupffer do fígado, micróglia do cérebro e os macrófagos alveolares do pulmão.
Conforme usadas no presente documento, células ativadas com referência às células imunes ou leucócitos se referem às células que, mediante estímulo, exibem um perfil de expressão gênica alterado em comparação às células que não foram estimuladas. Tipicamente, tais células secretam ou produzem ou regulam positivamente a expressão de mediadores de polipeptídeo ou peptídeo ligados a superfície da célula ou solúveis, tais como, mediadores inflamatórios ou outros imunes, por exemplo, citocinas, quimiocinas ou outras proteínas mensageiras químicas ou receptores para tais, cuja expressão ou produção é maior que antes da estimulação.
Conforme usado no presente documento, um agente alvo se refere a qualquer polipeptídeo ligante unindo 'a célula ou porção da mesma que se liga a uma célula alvejada por ligação a um receptor de superfície celular seguido por internalização do mesmo. Um agente alvo é qualquer agente que facilita a internalização da fração alvejada. Consequentemente é qualquer agente que se liga a um receptor de superfície de célula endocítica. As frações alvo podem incluir qualquer polipeptídeo, sua porção, que se liga a qualquer receptor celular ou ligante celular, à medida que o polipeptídeo é internalizado pela célula seguindo-se a ligação à molécula de superfície celular. Por exemplo, as frações alvo incluem, porém não estão limitadas aos anticorpos, fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e outros. Exemplos de agentes alvo são aqueles agentes que tem como alvo os receptores de quimiocina. Conforme usados no presente documento, receptores de quimiocina se referem aos receptores que interagem especificamente com um elemento de ocorrência natural da familia da quimiocina de proteínas e transportam a mesma para uma célula portando tais receptores. Estas incluem, porém não estão limitadas aos receptores (CXCR1-7, incluindo CXCR3A e CXCR3B) aos quais as quimiocinas CXC se ligam e os receptores (CCRl-IO, incluindo CCR2A e CCR2B) aos quais as quimiocinas CC se ligam e quaisquer outros receptores aos quais qualquer quimiocina se liga especificamente e facilita a internalização de um agente alvejado ligado.
Conforme usado no presente documento, um agente alvo de receptor de quimiocina se refere a qualquer molécula ou ligante que se une especificamente a um receptor de quimiocina em uma célula e efetua a internalização de um agente alvejado ligado ou de outra forma associado. As frações de ligação do receptor de quimiocina incluem, porém não estão limitadas a qualquer polipeptídeo que seja capaz de ligação a uma proteína da superfície da célula a qual uma quimiocina seria alvejada e seja capaz de facilitar a internalização de uma proteína de fusão contendo um ligante dentro da célula. Tais polipeptídeos incluem quimiocinas, anticorpos ou seus fragmentos, à medida que o polipeptídeo se liga a um ou mais receptores de quimiocina e efetua internalização de qualquer agente alvejado ligado. A identificação dos fragmentos ou porções de um polipeptídeo, tal como, uma quimiocina ou anticorpo, que é eficaz na ligação a um ou mais receptores de quimiocina e internalização dos agentes alvejados ligados pode ser realizada empiricamente, por teste, por exemplo, de um fragmento ligado a um agente citotóxico e procurando o extermínio da célula usando qualquer um dos ensaios para isto descritos no presente documento ou conhecidos dos versados na técnica. Consequentemente, um agente de alvejamento de receptor de quimiocina inclui todos os peptídeos caracterizados e designados como quimiocinas, que incluem, porém não limitado às classes descritas no presente documento e versões truncadas e porções dos mesmos que sejam suficientes para dirigir um agente alvejado ligado a üm receptor de superfície de célula ou proteína para qual a quimiocina de comprimento completo se liga especificamente e para facilitar ou permitir a internalização pela célula na qual ou receptor ou proteína está presente.
Conforme usado no presente documento, o termo "citocina" se refere aos polipeptídeos que incluem interleucinas, quimiocinas, linfocinas, monocinas, fatores estimuladores de colônias, fatores de crescimento, adipocinas e proteínas associadas ao receptor e seus fragmentos funcionais. Para fins no presente documento, citocinas não quimiocinas se referem a todas as citocinas, mais tipicamente às citocinas clássicas e não incluem as quimiocinas, que possuem atividades quimioatrativas e outras não geralmente exibidas por outras citocinas (clássicas). Contudo, as quimiocinas, conforme reconhecido pelos versados na técnica e discutidas no presente documento a seguir são uma classe distinta de polipeptídeos.
Conforme usadas no presente documento, quimiocinas se referem a uma família de proteínas pequenas secretadas de células que ■ promovem o movimento ou quimiotaxia das células próximas. Algumas quimiocinas são consideradas pró-inflamatórias e podem ser induzidas durante uma resposta imune enquanto outras são consideradas homeostáticas. Tipicamente, as quimiocinas exercem sua função quimioatrativa e outras funções por ligação a um ou mais receptores de quimiocina. As quimiocinas incluem proteínas isoladas de fontes naturais bem como aquelas fabricadas sinteticamente, por meio recombinante ou por síntese química. Quimiocinas exemplares (estabelecidas na SEQ ID NOs: 112-161) incluem, porém não estão limitadas a MCP-1, Eotaxina, SDF-Ιβ, GRO-a, MIP-Ιβ, IL-8, IP-10, MCP-3, MIP-3a, MDC, MIP-Ia, BCA-I, GCP-2, ENA-78, PBP, MIG, PF-4, PF-4varl, SDF-2, MCP-2, MCP-4, MIP-4, ΜΙΡ-3β, MIP-2a, MIP- 2β, MIP-5, HCC-I, RANTES, Eotaxina-2, TARC, 1-309, Linfotactina, Lungcina, CIO, MIP-Ιγ, MCP-5, LEC, Exodus-2, MIP-3, TECK, Eotaxina-3, CTACK, MEC, SCM-Iβ, I-TAC, BRAK, SR-PSOX, Fractalcina, LD78-β, MIP-lb2 e outras conhecidas dos versados na técnica. Referências as quimiocinas incluem, tipicamente, formas monoméricas de tais quimiocinas. As quimiocinas também incluem formas diméricas e outras multiméricas.
As quimiocinas englobam variantes ou muteínas das quimiocinas que possuem a capacidade de ter como alvo um agente alvejado ligado à células portando quimiocina- recetor. As muteínas das quimiocinas também são contempladas como agentes alvo para uso nos conjugados. Tais muteínas podem também apresentar alterações conservadoras de aminoácido, tais como aquelas estabelecidas abaixo na tabela que se segue. Ácidos nucléicos codificando tais muteínas, a menos que modificados por substituição de códons degenerados, hibridizam sob condições de pelo menos baixa estringência em relação ao DNA, geralmente estringência alta em relação ao DNA codificando uma proteína do tipo selvagem. As muteínas e modificações das proteínas também incluem, porém não estão limitados às variações alélicas e de espécies menores e inserções ou deleções de resíduos. Exemplos de variantes de quimiocina são estabelecidos nas SEQ ID NOs: 170-191. Substituições conservadoras e não conservadoras de aminoácidos são conhecidas dos versados na técnica e podem ser realizadas geralmente, sem alterar a atividade da 5 molécula resultante. Os versados nesta técnica reconhecerão que, em geral, substituições de aminoácido simples em regiões não essenciais de um polipeptideo substancialmente não alteram a atividade (vide, por exemplo, Watson e outros, Molecular Biology of the Gene, 4a Edição, 1987, The 10 Benjamin/Cummings Pub. co. , p.224). Tais substituições podem ser realizadas de acordo com aquelas estabelecidas a seguir:
TABELA 1
Residuo Original Substituição Conservadora
Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys Asn (N) Gin; His Cys (C) Ser; aminoácido neutro Gln (Q) Asn Glu (E) Asp Gly (G) Ala; Pro His (H) Asn; Gln He (I) Leu; Val Leu (L) He; Val Lys (K) Arg; Gin; Glu Met (M) Leu; Tyr; He Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) Ile; Leu Outras substituições também são permitidas e podem ser determinadas empiricamente de acordo com substituições conservadoras ou não conservadoras conhecidas. Qualquer tal modificação do polipeptídeo pode 5 ser efetuada por qualquer meio conhecido dos versados na técnica.
Conforme usado no presente documento, uma porção de uma quimiocina se refere a um fragmento ou pedaço da quimiocina que é suficiente, tanto sozinho quanto como um dimero com outro fragmento ou um monômero de quimiocina para ligar a um receptor de quimiocina para internalização de um agente alvejado ligado. Vários ensaios ín vitro para identificação das quimiocinas e atividade da quimiocina, especificamente atividades da quimiocina, são conhecidos dos versados na técnica (vide, por exemplo, Walz e outros (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:755 para identificar quimiotaxia dos neutrófilos; Larsen e outros (1989) Science 243:1464 e Carr e outros (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91:3652 para ensaiar quimiotaxia dos linfócitos; vide também, Pedido PCT Internacional Número WO 99/33990, que descreve vários ensaios e exemplifica meios para identificar quimiocinas). Tais ensaios podem ser usados para identificar quimiocinas, quimiocinas modificadas e seus fragmentos ativos. Ensaios de ligação, conforme descritos no presente documento e conhecidos dòs versados na técnica podem ser empregados para identificar frações que reconhecerão, especificamente, receptores de quimiocina e ensaios citotóxicos que podem ser usados para identificar aqueles que também internalizam agentes alvejados associados ou ligados.
Conforme usado no presente documento, ácido nucléico codificando um peptideo ou polipeptídeo de quimiocina se refere a qualquer um dos fragmentos de ácido nucléico estabelecidos no presente documento como codificando tais peptídeos, a quaisquer fragmentos de ácido nucléico conhecidos dos versados na técnica, qualquer fragmento de ácido nucléico que codifica uma quimiocina que se liga a um receptor de quimiocina e é internalizado através desse e pode ser isolado de uma biblioteca de células humanas usando qualquer um dos fragmentos de ácido nucléico precedentes como uma sonda ou qualquer fragmento de ácido nucléico que codifica quaisquer dos peptideos de quimiocina conhecidos incluindo aqueles estabelecidos nas SEQ ID NOs: 112-161, 170-191 e qualquer fragmento de DNA que possa ser produzido de quaisquer dos fragmentos de ácido nucléico precedentes por substituição dos códons degenerados. Fica entendido que, uma vez que a seqüência de aminoácido completa de um peptídeo, tal como um peptídeo de quimiocina e um fragmento nucléico codificando tal peptideo estejam disponíveis aos versados na técnica, é rotina substituir os códons degenerados e produzir quaisquer dos fragmentos nucléicos possíveis que codificam tal peptídeo. É também geralmente possível sintetizar ácidos nucléicos codificando tais peptídeos com base na seqüência de aminoácido.
Conforme usado no presente documento, um ligador é um peptídeo ou outra molécula que liga um agente alvo (isto é, polipeptídeo da quimiocina) ao agente alvejado. O ligador pode ser unido através do 'término N ou C ou um residente interno próximo, tipicamente dentro de cerca de aminoácidos, de cada término de um agente alvejado, se o agente for um polipeptídeo ou peptídeo. Tipicamente, quando o agente alvejado for uma quimiocina., ligação, no presente documento, estará no término C. Os ligadores usados no presente documento podem servir meramente para ligar os componentes ao conjugado, para aumentar a disponibilidade intracelular, estabilidade do soro, especificidade e solubilidade do conjugado ou prover flexibilidade aumentada ou alivio do impedimento estérico no conjugado. Por exemplo, a especificidade ou disponibilidade intracelular 5 do agente alvejado pode ser conferida por inclusão do ligador que é um substrato para determinadas proteases, tal como, uma protease que está presente em níveis mais altos nas células tumorais que as células normais.
Conforme usado no presente documento, peptídeo e/ou polipeptídeo significa um polímero onde os monômeros são resíduos de aminoácidos que são ligados em conjunto através de ligações amida, alternativamente referidos como um polipeptídeo. Quando os aminoácidos são alfa- aminoácidos, tanto o isômero óptico L quanto o isômero óptico D podem ser usados, os isômeros L sendo os preferidos. Adicionalmente, aminoácidos não naturais, tais como, beta-alanina, fenilglicina e homoarginina são considerados como estando incluídos. Aminoácidos geralmente encontrados que não são codificados por genes podem também ser empregados nas quimeras de ligante-toxina providas aqui, embora os aminoácidos preferidos sejam aqueles não codificáveis.
Conforme usado no presente documento, os "aminoácidos" que ocorrem nas várias seqüências de 25 aminoácido aparecendo aqui são identificados de acordo com suas abreviaturas de três letras ou uma letra bem conhecidas (vide Tabela 1). Os nucleotídeos, que ocorrem em vários fragmentos de DNA, são designados com as designações de uma letra padrão empregadas rotineiramente na técnica.
Conforme usado no presente documento, um
"aminoácido" é um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo ácido carboxílico. Um polipeptídeo contém dois ou mais aminoácidos. Para os fins aqui, os aminoácidos incluem vinte aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos não naturais e análogos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos onde o carbono alfa possui uma cadeia lateral).
Conforme usado no presente documento, "resíduo de aminoácido" se refere a um aminoácido formado quando da digestão química (hidrólise) de um polipeptídeo em suas ligações de peptídeo. Os resíduos de aminoácido descritos no presente documento estão, geralmente, na forma isomérica "L". Os resíduos na forma isomérica "D" podem ser substituídos por qualquer resíduo de aminoácido L, à medida que a propriedade funcional desejada for mantida pelo polipeptídeo. NH2 se refere a um grupo amino livre presente no término amino de um polipeptídeo. COOH se refere ao grupo carbóxi livre presente no término carboxila de um polipeptídeo. Mantendo a nomenclatura do polipeptídeo padrão descrita em J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) e adotada no 37 C.F.R. §§. 1.821 - 1.822, abreviaturas para resíduos de aminoácidos são mostradas na Tabela 2.
TABELA 2: Tabela de Correspondência
Símbolo I Letra 3 Letras AMINOÁCIDO Y Tyr Tirosina G Gly Glicina F Phe Fenilalanina M Met Metionina A Ala Alanina S Ser Serina I Ile Isoleucina L Leu Leucina T Thr Treonina V Val Valina P Pro Prolina K Lys Lisina H His Histidina Q Gln Glutamina E Glu Ácido glutâmico Z Glx Glu e/ou Gln W Trp Triptofano R Arg Arginina D Asp Ácido Aspártico N Asn Asparaginas B Asx Asn e/ou Asp C Cys Cisteína X Xaa Desconhecido ou outro Todas as seqüências de resíduos de aminoácidos representadas no presente documento por uma fórmula possuem uma orientação da esquerda para a direita na direção convencional do término amino para o término carbóxi. Além disso, a frase "resíduo de aminoácido" é definida amplamente para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência (Tabela 2) e aminoácidos modificados, não naturais e incomuns, tais como aqueles referidos no 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados ao presente documento como referência. Adicionalmente, deve ser observado que um traço no começo ou final de uma seqüência de resíduo de aminoácido indica uma ligação de peptídeo a uma seqüência adicional de um ou mais resíduos de aminoácido ou a um grupo de término amino tal como, NH2 ou a um grupo de término carboxila, tal como, COOH.
Conforme usado no presente documento, "aminoácidos de ocorrência natural" se referem aos 20 aminoácidos L que ocorrem nos polipeptídeos. Conforme usado no presente documento, o termo "aminoácido não natural" se refere a um composto orgânico que possui uma estrutura semelhante à de um aminoácido natural, porém que foi modificada estruturalmente para 5 imitar a estrutura e reatividade de um aminoácido natural. Aminoácidos que ocorrem não naturalmente assim incluem, por exemplo, aminoácidos ou análogos de aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos de ocorrência natural e incluem, porém não estão limitados aos D-isostereômeros de aminoácidos. 10 Aminoácidos não naturais exemplares são conhecidos daqueles versados na técnica.
Conforme usado no presente documento, vetor ou plasmideo se refere aos elementos separados que são empregados para introduzir DNA heterólogo nas células para 15 expressão do DNA heterólogo ou para replicação do DNA heterólogo clonado. A seleção e o uso de tais vetores e plasmídeos são bem conhecidos dos versados na técnica.
Conforme usada no presente documento, expressão se refere ao processo pelo qual o ácido nucléico é 20 transcrito no RNAm e traduzido nos peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o ácido nucléico for derivado do DNA genômico, a expressão pode, se uma célula hospedeira eucariótica apropriada ou organismo for selecionado, incluir splicing do RNAm.
Conforme usado no presente documento, vetor de
expressão inclui vetores capazes de expressar fragmentos de DNA que estão em ligação operativa com seqüências reguladoras, tais como, regiões promotoras, que são capazes de efetuar expressão de tais fragmentos de DNA. Assim, um 30 vetor de expressão se refere a uma construção de DNA ou RNA recombinante, tal como, um plasmideo, um fago, um vírus recombinante ou outro vetor que, quando da introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão do DNA clonado. Vetores de expressão apropriados são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem aqueles qüe são replicáveis nas células eucarióticas e/ou procarióticas e aqueles que permanecem epissômicos ou podem se integrar ao genoma da célula hospedeira.
Conforme usado, o termo "codificação de seqüência de nucleotídeo para expressão de" um polipeptídeo se refere a uma seqüência que, mediante transcrição e tradução subsequente do RNAm resultante, produz um polipeptídeo.
Conforme usado no presente documento, o termo
"seqüências de controle de expressão" se refere às seqüências de ácido nucléico que regulam a expressão de uma seqüência de ácido nucléico as quais ela é operativamente ligada. As seqüências de controle de expressão são operativamente ligadas a uma seqüência de ácido nucléico quando as seqüências de controle de expressão controlam e regulam a transcrição e, como apropriado, tradução da seqüência de ácido nucléico. Assim, as seqüências de controle de expressão podem incluir promotores, melhoradores, terminadores de expressão, um códon de partida (isto é, ATG) na frente de um gene de codificação de proteína, sinais de splicing para introns e manutenção do quadro de leitura correto de um gene de codificação de proteína para permitir a tradução apropriada do RNAm, e códons de parada. Além disto, as seqüências de DNA codificando um polipeptídeo indicador fluorescente, tal como, proteína fluorescente verde ou azul, podem ser incluídas a fim de selecionar clones positivos (isto é, aquelas células hospedeiras expressando o polipeptídeo desejado) .
Conforme usadas no presente documento, "células hospedeiras" são células nas quais um vetor pode ser propagado e seu ácido nucléico expresso. 0 termo também inclui qualquer progênie da célula hospedeira em questão. Fica entendido que toda progênie pode não ser idêntica à célula de origem, uma vez que pode haver mutações que ocorrem durante a replicação. Tal progênie está incluída quando o termo "célula hospedeira" for empregado.
Conforme usado no presente documento, sinal de secreção se refere a uma região de peptídeo dentro da proteína precursora que dirige a secreção da proteína precursora do citoplasma do hospedeiro para dentro do espaço periplásmico ou para o meio de crescimento extracelular. Tais sinais podem se encontrar tanto no término amino quanto no término carbóxi da proteína precursora. 0 sinal de secreção preferido é ligado ao término amino e pode ser heterólogo à proteína à qual é ligado. Tipicamente, as seqüências de sinal são clivadas durante o trânsito através da via de secreção celular. A clivagem não é essencial ou precisa ser colocada precisamente à medida que a proteína secretada mantém sua atividade desejada.
Conforme usada no presente documento, transfecção se refere à absorção do DNA ou RNA por uma célula hospedeira. A transformação referida neste processo realizada de modo que o DNA é replicável, tanto como elemento extracromossômico quanto como parte do DNA cromossômico do hospedeiro. Os métodos e meios para efetuar a transfecção e transformação são bem conhecidos dos versados nesta técnica (vide, por exemplo, Wigler e outros (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1373-1376; Cohen e outros (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:2110).
Conforme usado no presente documento, o termo "fragmento funcional" se refere a um polipeptídeo que possui uma atividade que pode ser identificada através de um ensaio funcional definido e que é associado a uma alteração biológica, morfológica ou fenotipica específica em uma célula ou mecanismo celular ou atividade celular.
Conforme usada no presente documento, atividade se refere a qualquer atividade de um polipeptídeo exibida in vitro e/ou in vivo.
Conforme usada no presente documento, atividade biológica se refere às atividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam mediante administração in vivo de um composto, tal como os conjugados providos no presente documento, composição ou outra mistura. Atividade biológica, assim, engloba efeitos terapêuticos e atividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. Tal atividade biológica, contudo, pode ser definida com referência às atividades in vitro específicas, conforme medidas em um ensaio definido. Assim, por exemplo, referência no presente documento à atividade biológica de um monômero ou dímero de quimiocina, ou seu fragmento, ou outra combinação ou monômeros de quimiocina e fragmentos, se refere à capacidade da quimiocina de se ligar às células portando receptores de quimiocina e internalizar um agente ligado. Tal atividade é tipicamente analisada in vitro por ligação da quimiocina (dímero, monômero ou fragmento) a um agente citotóxico, tal como uma subunidade Al da Shiga modificada, contato das células portando receptores de quimiocina, tais como, leucócitos, com o conjugado e avaliando a proliferação ou crescimento celular. Tal atividade in vitro extrapolaria para atividade in vivo. Vários modelos de animal são referidos e descritos no presente documento.
Conforme usado no presente documento, o termo biologicamente ativo ou referência à atividade biológica de um conjugado constituído de um agente alvo, tal como um conjugado contendo uma quimiocina e um agente alvejado, tal como uma subunidade Al da Shiga modificada, se refere, neste exemplo, à capacidade de tal polipeptídeo de inibir enzimaticamente a síntese da proteína por inativação dos ribossomas tanto in vivo quanto in vitro ou de inibir o crescimento das ou as células exterminadoras mediante internalização do polipeptídeo contendo toxina pelas células. Tal atividade biológica ou citotóxica pode ser avaliada por qualquer método conhecido dos versados na técnica incluindo, porém não limitado aos ensaios in vitro que medem a síntese da proteína e os ensaios in vivo que avaliam a citotoxicidade por medição do efeito de um composto de teste na proliferação celular ou na síntese da proteína. Contudo, especificamente preferidos são os ensaios que avaliam a citotoxicidade nas células alvejadas.
Conforme usado no presente documento, se ligar especificamente a um receptor alvejado significa se ligar com uma afinidade suficiente ao receptor para efetuar a internalização. Tipicamente a ligação é com uma afinidade (Ka) de IO7 L/mol, IO8 L/mol maior.
Conforme usado no presente documento, se ligar a um receptor se refere à capacidade de um ligante de reconhecer especificamente e especialmente se ligar ou detectavelmente se ligar, conforme ensaiado por ensaios in vitro padrão, a tais receptores. Por exemplo, a ligação mede a capacidade do conjugado de quimiocina, monômero de quimiocina ou outro agente alvo do receptor de quimiocina de reconhecer um receptor de quimiocina nas células conhecidas para expressar tais receptores de quimiocina. Tais células incluem linhagens celulares ou vários subtipos de células de leucócitos primários, tais como, porém não limitado a micróglia, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, células exterminadoras naturais, células B, mastócitos, células dendríticas e células T ou outras células residentes de tecido ou formas ativadas de tais células usando ensaios de ligação de ligante-receptor bem descritos, ensaios de quimiotaxia, análise histopatológica, citometria de fluxo e análise de 5 microscopia confocal e outros ensaios conhecidos dos versados na técnica e/ou exemplificados no presente documento.
Conforme usada no presente documento, uma cultura significa uma propagação de células em um meio que leva ao 10 seu crescimento e todas suas subculturas. O termo subcultura se refere a uma cultura de células desenvolvida de células de outra cultura (cultura de fonte) ou qualquer subcultura da cultura de fonte, independente do número de subculturas que tenham sido realizadas entre a subcultura 15 de interesse e a cultura de fonte. O termo "para cultura" se refere ao processo pelo qual tal cultura propaga.
Conforme usada no presente documento, uma composição se refere a qualquer mistura de dois ou mais produtos ou compostos (por exemplo, agentes, moduladores, 20 reguladores, etc.). A mesma pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, formulações aquosas, não aquosas ou quaisquer de suas combinações.
Conforme empregado no presente documento, uma combinação se refere a qualquer associação entre dois ou mais itens.
Conforme usada no presente documento uma quantidade eficaz de um composto para tratamento de uma doença específica é uma quantidade que é suficiente para melhorar ou de algum modo reduzir os sintomas associados à 30 doença. Tal quantidade pode ser administrada como uma dosagem única ou pode ser administrada de acordo com um regime, pelo qual é eficaz. A quantidade pode curar a doença, porém, tipicamente, é administrada a fim de melhorar os sintomas da doença. A administração repetida pode ser necessária para obter a melhora desejada dos sintomas.
Conforme usados no presente documento, sais, 5 ésteres ou outros derivados farmaceuticamente aceitáveis dos conjugados incluem quaisquer sais, ésteres ou derivados que podem ser prontamente preparados pelos versados na técnica empregando métodos conhecidos para tal derivação e que produzem compostos que podem ser administrados aos 10 animais ou seres humanos sem efeitos tóxicos substanciais e que são tanto farmaceuticamente ativos quanto promedicamentos.
Conforme usado no presente documento, tratamento significa qualquer maneira pela qual os sintomas de uma 15 condição, transtorno ou doença são melhorados ou de outra forma beneficamente alterados. 0 tratamento também engloba qualquer uso farmacêutico das composições no presente documento.
Conforme usado no presente documento, a melhora 20 dos sintomas de um transtorno especifico por administração de uma composição farmacêutica especifica se refere a qualquer abrandamento, se permanente ou temporário, duradouro ou transitório que pode ser atribuído ou associado à administração da composição.
Conforme usado no presente documento, o termo
"indivíduo" se refere a um animal, incluindo um mamífero, tal como um ser humano.
Conforme usado no presente documento, um paciente se refere a um indivíduo humano.
Conforme usado no presente documento, o termo
"anticorpo" conforme usado no presente documento inclui moléculas intactas, bem como seus fragmentos funcionais, tais como, Fab, F(ab')2, e Fv que são capazes de ligação do determinante epitópico. Estes fragmentos de anticorpo funcional mantêm alguma capacidade de se ligar seletivamente com seu receptivo antígeno ou receptor e são definidos como se segue:
(I) Fab, o fragmento que contém um fragmento de
ligação-antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão do anticorpo integral com a enzima papaína para render uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada;
(2) Fab', o fragmento de uma molécula de
anticorpo que pode ser obtido por tratamento do anticorpo integral com pepsina, seguido por redução, para render uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab' são obtidos por molécula de anticorpo;
(3) F(ab')2, o fragmento do anticorpo que pode
ser obtido por tratamento do anticorpo integral com a enzima pepsina sem redução subsequente; F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos por duas ligações de dissulfeto;
(4) Fv, definido como um fragmento construído
geneticamente contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressa como duas cadeias; e
(5) Anticorpo de cadeia simples ("SCA"), uma molécula construída geneticamente contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, unida por um ligador de polipeptídeo apropriado como uma molécula de cadeia única geneticamente fundida.
Os métodos para fabricação destes fragmentos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, incorporado ao presente documento como referência). Conforme usado no presente documento, o termo "epítopo" significa qualquer determinante antigênico em um antígeno ao qual o paratopo de um anticorpo se liga. Determinantes epitópicos contêm agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como, aminoácidos ou cadeias laterais de carboidrato e geralmente possuem características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas.
Conforme usado aqui, as formas singulares "um, uma" e "o, a" incluem as referências ao plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, referência ao composto, "compreendendo um domínio extracelular" inclui compostos com um ou vários domínios extracelulares.
Conforme usadas no presente documento, faixas e quantidades podem ser expressas como "cerca de" um valor ou faixa específica. Porém também incluem a quantidade exata. Conseqüentemente, "cerca de 5 bases" significa "cerca de 5 bases" e também "5 bases".
Conforme usado no presente documento, "opcional” ou "opcionalmente" significa que o evento ou circistância subsequentemente descrito ocorre ou não e que a descrição inclui momentos onde o evento ou circustância ocorrem e momentos onde não ocorre. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo é substituído ou não substituído.
Conforme usadas no presente documento, as abreviaturas para quaisquer grupos de proteção, aminoácidos e outros compostos são, a menos que de outra forma indicado, de acordo com seu uso comum, abreviaturas reconhecidas ou a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (1972) Biochem., 11:942-944. B. Proteínas de Inativação de Ribossomo (RIPs), Seleção, Expressão e Produção das Mesmas
São providos métodos para seleção, identificação, purificação e/ou isolamento das toxinas da proteina de inativação de ribossomo (RIP) com toxicidade reduzida, as RIPS modificadas resultantes, e método de RIPs de expressão e RIPS modificadas e seus conjugados. A toxicidade é suficientemente reduzida para aumentar a expressão da proteína, porém toxicidade suficiente permanece para que a RIP exiba o efeito terapêutico (inibição ou extermínio das células) . Uma vez que as RIPs são tão tóxicas, uma redução na atividade de 10-, 100-, 1.000 vezes ou mais substancialmente não impacta no emprego da toxina como uma toxina nos conjugados para inibição ou extermínio das células ou afeta o metabolismo celular.
Os métodos providos no presente documento empregam inibidores de RIP, tal como 4-aminopirazolo [3,4- d] -pirimidina (4-APP), para modular a seleção das toxinas RIP e para aumentar sua produção com alto rendimento. Também são providos conjugados de ligante-toxina contendo toda ou parte de uma RIP modificada suficiente para exercer atividade tóxica, por exemplo, qualquer uma provida no presente documento. As RIPs modificadas, selecionadas e conjugados contendo RIPs modificadas exibem menos toxicidade às células hospedeiras resultando em um rendimento aumentado do produto da proteína seguindo sua expressão. 0 rendimento aumentado está associado à toxicidade menos inerente e/ou inibição da atividade com 4- APP conforme observado e descrito em detalhes no documento a seguir.
As RIPs são toxinas que promovem toxicidade celular e morte por depurinação de RNA ribossômico eucariótico e procariótico (RNAr) resultando na inibição da síntese da proteína. De modo geral, as RIPs incluindo ricina e Toxina Shiga possuem atividade tóxica contra ribossomos eucarióticos. Algumas RIPs, contudo, podem atacar ribossomos eucarióticos e procarióticos. Estas 5 incluem, por exemplo, toxina Shiga, que exibe toxicidade na direção das células de E.coli (Skinner and Jackson, Microb. Pathol, 24:117-22, 1998; Suh e outros (1998) Biochemistry 37: 9394-8). Assim, a expressão das RIPs, e, portanto, a produção de suas proteínas de alto rendimento e 10 frequentemente dificultada por efeitos citotóxicos das RIPs tanto em uma ou ambas as células hospedeiras procariótica ou eucariótica empregadas para expressão da proteína recombinante da mesma.
Em razão da toxicidade geral das RIPs em relação 15 às células eucarióticas, RIPs, ou conjugados contendo RIPs são tipicamente produzidos em E.coli. Estas incluem, por exemplo, fusões com saporina, proteína antiviral da erva- do-cancro, ou toxina Shiga como a fração da toxina. Geralmente, níveis relativamente baixos de expressão são 20 obtidos. Em alguns casos, isso se deve a um sistema promotor permeável que libera uma quantidade suficiente de toxina para interferir com a viabilidade da célula. Estratégias para otimizar a expressão tem sido empregadas.
Geralmente, os sistemas de indução são empregados 25 para suprimir a expressão até as células hospedeiras terem crescido suficientemente. Isto permite meios hermeticamente controlados que permitem crescimento suficiente das células transformadas ocorrendo antes da indução da toxina começar a exterminar a cultura hospedeira, pelo qual, limitando a 30 produção total da toxina RIP. Por exemplo, um método padrão para a produção das toxinas ou conjugados da mesma é através da expressão sob o controle de um promotor tardio T7 nas células de E.coli BL21(DE3) transformadas após indução por isopropil β-D-tiogalactosido (IPTG). Sob este sistema, a expressão das RIPs ou seus conjugados, foi adicionalmente otimizada usando células bacterianas BL21(DE3)pLysS, o que reprime fortemente a expressão do vetor pET na ausência de indução (Joshi e outros (2005), Prot. Exp. Purif., 39:189-198). Em ambos os sistemas, a proteina resultante permanece intracelular em associação com os corpos de inclusão e requer procedimentos de renaturação e desnaturação mediante purificação (Barth e outros (2000) App Environ. Microbiol, 66:1572-1579). Outros sistemas de indução também foram usados. Por exemplo, o gene para a Proteina Antiviral Mirabilis (MAP) foi expresso sob o controle de um promotor regulado de temperatura, pelo qual, a expressão do gene da MPA é induzida por elevação da temperatura da cultura de 30 a 420C na fase Iog de \88- 10992. Freqüentemente, mesmo usando tais sistemas induzíveis, as RIPs podem ser tóxicas às células hospedeiras. Em alguns casos, nenhum transformante pode ser obtido ou os transformantes crescem muito fracamente, o que indica que o sistema induzível está vazando e/ou que a fração da toxina dos produtos pode ser responsável pelo extermínio das células hospedeiras.
Outras estratégias também foram empregadas para aumentar a expressão e/ou rendimento da proteína ativa. Em um exemplo, o vetor de expressão pode ser designado para obter secreção do produto da proteína prontamente do citosol do hospedeiro para reduzir os efeitos tóxicos nos ribossomos da célula hospedeira. Por exemplo, para E.coli secretar uma proteína é necessário uma seqüência de sinal. OmpA é uma proteína de membrana externa principal em E.coli que é produzida em grandes quantidades e secretada por E.coli (Habuka e outros (1990) J. Biol. Chem., 265:10988- 10992). Consequentemente, a secreção e produção da proteína de MAP foi obtida por ligação operativa da seqüência de sinal de E.coli CtnpA à MP de codificação de seqüência. Em outros casos, RIPs ou conjugados contendo RIPs, foram expressos usando outros sistemas de expressão bacteriana, tais como, por exemplo, os que dirigem a expressão periplásmica da toxina. Em contraste com o citoplasma bacteriano, o periplasma bacteriano é um ambiente de não redução que permite formação de ligação de dissulfeto necessária para a conformação nativa de algumas proteínas. Embora esta estratégia possa ser benéfica para algumas proteínas que requeiram formação de ligação de dissulfeto, a insolubilidade da proteína no ambiente periplásmico pode afetar o rendimento da proteína e pelo qual, requer o uso de solutos compatíveis durante a expressão e purificação (Barth e outros (2000) App Environ. Mierabiol, 66:1572- 1579). RIPs, ou conjugados contendo RIPs, também foram expressos na levedura Pichia pastoris, embora isto requeira um projeto e construção de novo dos genes sintéticos para otimizar a expressão heteróloga na levedura (Gurkan e outros (2005) Microbial Cell Faetories, 4:33).
Embora combinações de cada uma das estratégias acima sejam algumas vezes ou de certa forma eficazes, dependendo da RIP ou célula hospedeira usada, em muitos casos as células hospedeiras continuam a ser suscetíveis aos efeitos tóxicos das RIPs. Em tais casos, outras estratégias vêm sendo empregadas na tentativa de expressar e produzir toxinas de células hospedeiras, embora cada uma tenha suas limitações. Por exemplo, Fabrini e outros (FASEB J. 14:391-398 (2000)) propuseram o emprego de anticorpos anti-RIP como agentes neutralizantes nas células eucarióticas para proteger os ribossomos hospedeiros da inativação, enquanto ainda permitindo que a maioria do polipetídeo sintetizado seja secretado em uma forma biologicamente ativa. Embora anticorpos neutralizantes anti-saporina (SAP) tenham sido empregados na geração de um conjugado de saporina, tal estratégia requer a expressão constitutiva e estável de fragmentos de anticorpo anti-RIP nas células hospedeiras. Assim, o presente documento provê métodos para produzir RIPs ou conjugados de ligante-toxina contendo RIPs, para superar estas limitações tirando vantagem do mecanismo da N-glicosidase pelo qual RIPs mediam seus efeitos tóxicos nas células hospedeiras procarióticas e eucarióticas. A adenina e seus vários análogos são capazes de inibir atividade de RIP conforme medida por inativação de ribossomo in vitro incluindo, por exemplo, inibição de 4-aminopirazolo [3,4-d]-pirimidina (4-APP) (Brigotti e outros (2000) Nucleic Acids Res., 28: 2383-8; Brigotti e outros (2000) Life Sei, 68:331-6). É reconhecido, no presente documento, que o emprego dos análogos de adenina (por exemplo, 4-APP) pode ser usado na seleção dos clones de expressão celular, por exemplo, clones bacterianos, e na expressão em grande escala das toxinas e moléculas do conjugado de ligante-toxina incluindo, por exemplo, moduladores da população de leucócito (LPMs).
Os métodos providos no presente documento são projetados para 1) selecionar toxinas RIP modificadas que exibem toxicidade reduzida para células hospedeiras, enquanto ainda mantendo atividade tóxica suficiente, a seleção podendo ser modulada na presença de análogos dé adenina e 2) expressão das toxinas RIP modificada selecionadas ou conjugados contendo as toxinas RIP modificadas nas células hospedeiras, na presença de um ou mais análogos da adenina. Tais métodos permitem à identificação das toxinas RIP modificadas, que podem ser testadas para identificar aquelas que mantêm atividade tóxica suficiente contra ribossomos da célula hospedeira alvo. Adicionalmente, são providos no presente documento métodos que permitem expressão em larga escala e geração de toxinas RIP e conjugados contendo as toxinas RIP, na presença de um ou mais inibidor da RIP, tal como, 4-APP. Consequentemente, os métodos permitem a identificação das toxinas RIP modificadas que podem ser empregadas no projeto dos conjugados de ligante-toxina contendo toxinas RIP modificadas que exibem citotoxicidade reduzida para a cepa bacteriana expressando o hospedeiro e pelo que, fornecem uma estratégia de expressão viável para a produção de quantidades maiores do produto para uso nos estudos pré-clínicos e clínicos. A adequabilidade dos conjugados de ligante-toxina modificados para tratar doenças e transtornos, tais como, estados de doença inflamatória associados à proliferação, migração e/ou atividade fisiológica das células que promovem respostas inflamatórias incluindo lesão secundária ao tecido pode ser avaliada usando ensaios in vitro e in vivo que avaliam uma atividade ou atividade biológica.
C. Proteínas de Inativação de Ribossomo (RIPs) e Métodos de Ação
As proteínas de inativação de ribossomo (RIPs) são uma classe de proteínas expressas nas plantas, fungos e bactérias que são inibidores potentes das sínteses das proteínas eucariótica e procariótica via um mecanismo conservado. RIPs são N-glicosidases ou
polinucleotídeo:adenosina glicosidases e são capazes de inativar substratos de ácido nucléico ribossômico e não ribossômico. As RIPs são classificadas em dois grupos. RIPs do tipo I (também denominadas holo-RIPs; isto é, tricosantina e lufina) possuem uma cadeia de polipeptídeo única de aproximadamente 30 kDa possuindo atividade de inativação de ribossomo. RIPs do tipo II (também denominadas quimero-RIPs; isto é, ricina, abrina, bem como toxinas bacterianas, tais como, toxina Shiga) contêm duas ou mais cadeias ou espécies de polipeptídeo, indicadas A (geralmente uma subunidade única) e B (única ou múltiplas subunidades) , ligadas por uma ligação de dissulfeto. A cadeia B das RIPs do tipo II é necessária para entrada celular, porém pode ser substituída por um polipeptídeo que efetua a entrada celular. Existem também exemplos de outras RIPs que não se encontram na família nem do tipo I nem do tipo II. Estas são denominadas RIPs do tipo I de duas cadeias que contém apenas uma cadeia A, porém requerem processamento proteolítico e as proteínas RIP do tipo III que são proteínas estrutural e funcionalmente relacionadas à RIP de cevada JIP60 (Peumans e outros (2001) The FASEB Journal, 15: 1493).
As cadeias B das RIPs do tipo II se ligam aos receptores contendo galactose na superfície celular e permitem que as cadeias A entrem no citoplasma onde inativam os ribossomos. Tipicamente, as RIPs do tipo II são sintetizadas como um pré-pró-polipeptídeo que contém cadeias A e B. Seguindo-se ter como alvo o pré-pró- polipeptídeo no retículo endoplásmico (ER), a seqüência de sinal é clivada para render um pró-polipeptídeo. No ER, a proteína sofre formação de ligação de dissulfeto entre as duas cadeias, e a N-glicosilação ocorre. O pró-polipeptídeo é transportado através do complexo de Golgi nos corpos de proteína onde ele é proteoliticamente clivado por uma endopeptidase dentro dos corpos da proteína. A endopeptidase divide o pró-polipeptídeo em uma cadeia A e uma cadeia B ou cadeias que permanecem ligadas por uma ligação de dissulfeto simples. 0 processamento das RIPs desta maneira assegura que as toxinas evitem o envenenamento de seus próprios ribossomos de célula hospedeira, tal como por vazamento no citosol, durante a síntese e transporte.
A atividade tóxica das RIPs requer internalização da subunidade catalítica no citosol de uma célula hospedeira. A entrada da célula das RIPs do tipo II é facilitada pela(s) subunidade(s) B, considerando-se que as RIPs do tipo I, que não são especificamente reconhecidas por hematógenos, células de tecido intrínseco e residentes em tecido são menos eficientes em sua atividade tóxica que as RIPs do tipo II. Uma variedade de mecanismos de entrada de célula existe para internalização incluindo, porém não limitado as endocitoses dependentes de clatrina e independentes de clatrina, endocitose independente de caveolae e macropinocitose. Além disso, quando da entrada nas células, as toxinas são transportadas para o citosol através de diversos mecanismos (Sandvig e outros (2005) Gene Therapy, 12: 865-872). Uma vez dentro do citosol, RIPs catalisam a depurinação de ribossomos pelo qual interrompendo a síntese da proteína.
RIPs do tipo Iea cadeia A das RIPs do tipo II são responsáveis pela atividade enzimática destas toxinas por inibição da síntese da proteína por remoção da adenina específica de 28 S RNAr de ribossomos eucarióticos e procarióticos. Geralmente, RIPs do tipo II são consideradas ativas apenas contra ribossomos eucarióticos, enquanto RIPs do tipo I são ativas contra ribossomos eucarióticos e procarióticos. Algumas RIPs do tipo II, tais como, por exemplo, Toxina Shiga (STX), também inibem ribossomos procarióticos (Skinner e outros (1998), Microbial Pathogenesis, 24: 117-122).
A atividade tóxica das RIPs, tanto de cadeia única (tipo I) ou de duas cadeias (tipo II, mediada através da cadeia A) é mediada por atividade de N-glicosidase das proteínas. Esta atividade enzimática resulta na remoção de uma adenina da adenosina em uma posição precisa (A4324 no caso de fígado de rato 28S RNAr, A266o de RNAr de E.coli) em um tetraloop GAGA universalmente conservada da RNAr principal, também denominada Ioop de alfa-sarcina/ricina (vide, por exemplo, Endo e outros (1987) J. Biol. Chem., 262:8128; Barbieri e outros (1993) Biochim. Biophys. Acta., 1154:237; Sandvig e outros (2001) Toxicon, 39: 1629-1635; Ippoliti e outros (2004) The Italian Journal of Biochemistry, 53: 92; Stirpe and Battelli, Cell Mol Life Sei, 63: 1850-66, 2006) . A remoção da base de adenina resulta na incapacidade do ribossomo de ligar o fator de alongamento 2 e assim terminação da tradução do RNA. A seqüência GAGA está presente nos ribossomos procarióticos e eucarióticos.
A atividade enzimática das toxinas RIP é mediada pela interação da cadeia catalítica com proteínas ribossômicas. A interação com a adenina ocorre em uma fenda de sítio ativo das proteínas de toxina. As diferenças na ligação do substrato entre as toxinas se devem, talvez, às diferenças de aminoácido na fenda do sítio ativo. Por exemplo, embora os dados de cristalografia de raios-X mostrem que a fenda do sítio ativo entre as subunidades A de Stx e ricina sejam semelhantes, existem pelo menos sete resíduos invariáveis no sítio ativo destas proteínas (Brigotti e outros (2000) Nucleie Aeids Research, 28:2383- 2388) . Adicionalmente, acredita-se que as diferenças na especificidade do substrato entre células eucarióticas e procarióticas entre as toxinas sejam devidas às capacidades de diferença das RIPs de interagirem com diferentes proteínas ribossômicas. Por exemplo, as proteínas do fígado de rato L9 e LlOe são os alvos de ligação da cadeia A da ricina, enquanto a proteína ribossômica L3 é o fator de ligação da proteina antiviral erva-do-cancro (PAP). L3 é uma proteína ribossômica altamente conservada, que explica a ampla especificidade de PAP na direção dos ribossomos de espécies diferentes (Peuman e outros (2001) The FASEB Journal, 15: 1493-1496). A remoção da adenina resulta em uma alteração conformacional de RNAr e impede a ligação do fator de alongamento 2. Assim, ribossomos depurinados são incapazes de alongar a cadeia de peptídeo nascente.
Além da inativação dos ribossomos e inibição da síntese da proteína, RIPs também possuem outras funções devido a sua interação com outros substratos além de RNAr. As RIPs podem depurinar DNA, RNAm e polinucleotídeos virais (Ippoliti e outros (2004) The Italian Journal of Biochemistry, 53: 92; Parikh e outros (2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4:523-543). Consequentemente, além da atividade de N-glicosidase, RIPs demonstraram possuir atividade de polinucleotídeo:adenosina glicosidase devido a sua capacidade de desadenilar polinucleotídeos contendo adenina, DNA de filamento simples, DNA de filamento duplo e RNAm. Por exemplo, foi reportado que as RIPs degradam DNA superespiralado (vide, por exemplo, Li e outros (1991) Nucleic Aeid Res., 22:6309; Ling e outros (1994) FEBS Lett., 345:143; Roncuzzi e outros (1996) FEBS Lett.> 392:16) e fragmento de DNA genômico (Bagga e outros (2003) J. Biol. Chem., 278:4813-4820). Além disso, algumas RIPs liberam mais de um resíduo de adenina dos ribossomos (Barbieri e outros (1992) Biochem. J, 286:1), atuam nas espécies de RNA diferentes de RNA ribossômico, incluindo RNAs virais ou também atuam em poli (A) e em DNA (Barbieri e outros (1994) Nature, 372:624; Stirpe e outros (1996) FEBS Lett., 382:309; Picard e outros (2005) J. Biol. Chem., 280:20069-20075). Adicionalmente, várias RIPs mostraram inibir o processamento de extremidade 3' e atividades de transferência de filamento de HIV-I integrase que, por sua vez, inibe a inserção do genoma viral no genoma da célulã hospedeira (Au e outros, FEBS Lett, 471: 169-72, 2000). Conseqüentemente, a propagação viral é inibida. Assim, algumas RIPs exibem atividade antiviral além ou ao invés da inibição da síntese da proteína através da inativação dos ribossomos (Parikh e outros (2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4:523-543; Erice e outros (1993) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37: 835-838). Assim, muitas, se não todas as RIPs possuem uma ou mais dentre atividade de N-glicosidase, atividade de RNase, atividade de DNase e outras atividades, tais como, porém não limitado a superóxido dismutase, atividade de fosfolipase, atividade de quitinase e atividade antiviral (Park e outros (2004) Planta, 219:1093-1096; Bagga e outros (2003) J. Biol. Chem., 278:4813-4820; Parikh e outros (2004) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4:523-543; Au e outros, FEBS Lett> All: 169-72, 2000).
1. RIPs Exemplares
Toxinas exemplares usadas nos métodos providos no presente documento para seleção de toxinas modificadas com toxicidade reduzida, tais como, para produção de toxinas aperfeiçoadas ou seus conjugados, ou na geração de conjugados de ligante-toxina, podem ser qualquer toxina que exiba toxicidade celular devido à atividade enzimática da N-glicosidase através da depurinação de RNAr. Tais toxinas são conhecidas dos versados na técnica e tipicamente incluem a família das toxinas RIP. Por exemplo, mais de 40Ò RIPs foram propostas, das quais mais de 50 RIPs do tipo I e RIPs do tipo II foram seqüenciadas e/ou clonadas (Peumans e outros (2001) The FASEB Journal, 15: 1493). RIPs do tipo I exemplares incluem, porém não estão limitadas a diantina 30, diantina 32, licnina, saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-4, saporina-5, saporina-6, saporina-7, saporina-8, saporina-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C., mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, colicina-1, colicina-2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, alfa-cirilowina, beta-cirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, MAP-30, alfa- momorcarina, beta-momorcarina, tricosantina, TAP-29, tricocirina, RIP de cevada, tritina, RIP de linho, RIP de 5 milho, asparina-1 e asparina 2. Exemplos de RIPS do tipo II incluem, porém não estão limitados a volkensina, ricina, toxina Shiga, nigrina-CIP-29, abrina, vircumina, modecina, ebulitina-a, ebulitina-β, ebultina-γ e porrectina. De modo geral, a cadeia A ou seu fragmento ativo é suficiente para 10 a atividade enzimática das RIPs do tipo II.
A discussão dos vários polipeptídeos da toxina RIP não pretende limitar o escopo das modalidades providas- É entendido que qualquer polipeptídeo da RIP conhecido de um versado na técnica ou subseqüentemente identificado é 15 contemplado nos métodos providos no presente documento. Os versados na técnica estão familiarizados com a identificação e caracterização funcional das toxinas RIP. Uma lista de polipeptídeos da toxina RIP exemplares e sua SEQ ID NO correspondente é estabelecida na Tabela 3.
TABELA 3: Toxinas RIP exemplares
Toxina RXP Sinônimos OniProt Seqüên¬ Subunidade SEQ NO: cia de enzimática ID sinal (isto é, NO: cadeia A) Cadeia A da StxA; StxI; Stxl; P10149 1-22 23-315 1 toxina Shiga Subunidade A da toxina I (Stx) tipo Shiga; SLT-A; SLT-I; SLT-I; subunidade A da Verotoxina I; VTl Subunidade A da StxA2; Stx2A; subunidade P09385 1-22 23-319 3 toxina II tipo A da Verotoxina 2; VT2; Shiga (Stx2) SLT-IIA; SLT2 Saporina 6 SAP-6; SO-6 P20656 1-24 25-277 89 RIP I da cevada Inibidor I da síntese da P22244 1-280 90 proteína; RIP30 RIP II da cevada Inibidor II da síntese P04399 1-280 91 da proteína; RIP30A Gelonina GEL P33186 1-26 47-297 92 Ricina A P02879 1-35 36-302 93 Momordina I α-momorcarina; a-MMC P16094 1-23 24-269 94 Momordina II P29339 1-23 24-286 95 Briodina I BDl P33185 1-23 24-270 96 Briodina II BD2 P98184 1-21 22-282 97 Pap-S Proteína S antiviral de P23339 1-261 98 erva-de-cancro Lufina Lufina-a Q00465 1-19 20-277 99 Tricosantina a-tricosantina; a-TCS P09989 1-23 24-270 100 Clavina P49074 1-27 28-177 101 Abrina-a P11140 1-251 102 RIP 3 do milho CRIP3 P25891 1-300 103 RIP 9 do milho CRIP9 P25892 1-304 104 RIP X do milho P28522 1-16 17-161 105 Tritina Trig7; RIP do trigo Q07810 1-275 106 MAP P21326 1-28 29-278 107 Diantina 30 DAP-3O P24476 1-23 24-293 108 Nigrina b Aglutinina V; SNAV P33183 1-25 26-297 109 Nigrina I Q8GT32 1-25 26-274 110 Ebulina Ebul Q9AVR2 1-25 26-298 111 Toxina Shiga
As toxinas Shiga (STX) são uma família de proteínas RIP que são produzidas por bactérias. As toxinas
Shiga são classificadas em três grupos diferentes. A toxina Shiga (Stx) é produzida por Shigella dysenteriae e é uma proteína RIP do tipo II contendo uma subunidade A enzimática de 32-kDa (StxA), não covalentemente associada a um anel de cinco subunidades B de 7,7 kDa (StxB) . Stx é idêntica na seqüência de aminoácidos à toxina 1 tipo Shiga (Stx 1, também denominada Verotoxina, SLTl ou VTl) , produzida por E.coli. Os precursores da cadeia A de Stx e Stxl possuem 315 aminoácidos de comprimento (estabelecidos na SEQ ID NO: 1) e contêm uma seqüência de sinal de 22 aminoácidos de comprimento correspondendo aos aminoácidos 1-22 da SEQ ID NO: I. A cadeia A de Stx/Stxl madura possui 2 93 aminoácidos de comprimento correspondendo aos aminoácidos 23-315 da SEQ ID NO: 1 e é estabelecida na SEQ ID NO: 5. A terceira Stx é a toxina 2 tipo Shiga (Stx2, também denominada Verotoxina 2, SLT2 ou VT2), que exibe diferenças de seqüência comparadas à Stx e Stxl. O precursor da cadeia A de Stx2 possui 319 aminoácidos de comprimento (estabelecido na SEQ ID NO: 3) e contém uma seqüência de sinal de 22 aminoácidos de comprimento correspondendo aos aminoácidos 1-22 da SEQ ID NO: 3. A cadeia A Stx2 madura possui 297 aminoácidos de comprimento correspondendo aos aminoácidos 23-319 da SEQ ID NO: 3. As subunidades B de Stx/Stxl e Stx2 possuem 8 9 aminoácidos de comprimento (estabelecido na SEQ ID NOs: 2 e 4, respectivamente). As toxinas tipo Shiga também foram reportadas como sendo produzidas em Citrobacter freundii, Aeromononas hydrophila, Aeromononas caviae e Enterobacter cloacae (Sandvig e outros (2001) Toxiconr 39: 1629-1635).
A cadeia A de Stx (StxA) possui um fragmento A enzimaticamente ativo que contém uma ligação dissulfeto interna formada entre C242 e C261 da seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 5 (correspondendo a C264 e C283, respectivamente da seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 1). A seqüência 248Arg-Val-Ala-Arg251 na SEQ ID NO: 5, que está localizada em uma Ioop entre as duas cisteinas, é reconhecida por tripsina ou pela protease furina celular. A furina é encontrada na rede trans golgi (TGN) e nos endossomas e provavelmente cliva StxA durante seu processamento pós-translacional. Tripsina ou furina cliva StxA na lateral de término COOH de Arg251 na seqüência estabelecida na SEQ ID NO:5, separando a cadeia A em fragmentos Al e A2 (Sandvig e outros (2001) Toxiconr 39: 1629-1635; Garred e outros (1995) J. Biol. Chem., 270: 10817-10821). Consequentemente, o fragmento Al clivado de Stx (SAl) corresponde aos aminoácidos 1 a 251 e o fragmento A2 de Stx (SA2) corresponde aos aminoácidos 252-293 da seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:5. A clivagem da furina ativa o fragmento Al (SAl). 0 domínio Al permanece associado às subunidades A2/B devido à ligação de dissulfeto entre C242 e C261 até o transporte através de ER onde a ligação de dissulfeto é reduzida e o fragmento Al é permitido retrotranslocar para o citosol (LaPointe e outros (2005) J. Biol. Chem., 280:23310-8). O fragmento Al de Stx é 6 a 400 vezes mais ativo que a proteína Stx intacta (Suh e outros (1998) Biochemistryf 37:9394-9398). Como tal, SAl contém a atividade enzimática de RIP e é responsável pela inibição da síntese da proteína por depurinação de 28S RNA da subunidade ribossômica 60S. Os primeiros 239 aminoácidos da cadeia Al representam a região mínima cataliticamente ativa do domínio de RIP de StxAl (LaPointe e outros (2005) J. Biol. Chem., 280:23310- 8). As truncagens de SAl mantendo a atividade catalítica incluem, por exemplo, a seqüência de SAl variante 1 estabelecida na SEQ ID NO: 22 e codificada por uma seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 23 e uma seqüência de variante 2 estabelecida na SEQ ID NO: 24 e codificada por uma seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO:25.
Como outras RIPs, a subunidade SAl ativa de Stx ataca ribossomos eucarióticos; contudo, também apresenta atividade contra ribossomos bacterianos. Por exemplo, vários grupos reportaram que o crescimento das células dé E.coli é reduzido na presença de SAl (vide, por exemplo, Skinner e outros (1998,) Microbial Pathogenesis, 24:117-122; Suh e outros (1998) Biochemistry, 37:9394-9398). A atividade tóxica de SAl em células procarióticas requer expressão da toxina no citoplasma, tal como devido à ausência de sua seqüência de sinal nativa; nenhuma toxicidade mediada por Stx é observada nas células seguindo-se a exportação de SAl para o periplasma por suá seqüência de sinal. A atividade tóxica de SAl nas células procarióticas é comparável à sua atividade tóxica nas células eucarióticas. Outras RIPs também tem como alvo células procarióticas, incluindo, por exemplo, as RIPs de 5 planta, PAP e MAP, embora na maioria dos casos, a atividade tóxica de tais RIPs de planta seja cerca de 100 vezes mais eficaz contra ribossomos eucarióticos (Suh e outros (1998) Biochemistryf 37:9394-9398). Em contraste, outras RIPs, tais como RTA (a subunidade enzimática da ricina) mostram 10 nenhuma toxicidade na direção das células procarióticas.
2. Inibidores da Toxina RIP
São conhecidos inibidores ou podem ser identificados os que inativam as RIPs tóxicas. Os estudos de tais inibidores forneceram conhecimentos sobre a 15 estrutura do sítio ativo das toxinas. Além disto, existe um interesse na identificação e desenvolvimento dos inibidores de RIP por várias razões, incluindo, porém não limitado aos fins de diagnóstico, antídotos para envenenamento ou como agentes profiláticos e terapêuticos nas infecções 20 desencadeadas por bactérias expressando RIP (Brigotti é outros (2000) Life Sciences, 68:331-336, Pedido de Patente US número 6.562.969). Alguns inibidores da RIP tem como alvo a atividade de N-glicosidase conservada de toxinas RIP. Estão incluídos entre os inibidores da toxina RIP os 25 inibidores de oligonucleotídeo específicos para RIP, tais como, aptâmeros de RNA (vide, por exemplo, Hesselberth e outros (2000) J. Biol. Chem., 275:4 937-4 942; Hirao e outros (2000) J. Biol. Chem., 275:4943-4948), anticorpos específicos para RIP e/ou isômeros de adenina incluindo, 30 por exemplo, adenina, 4-aminopirazolo[3, 4-d]pirimidina (4- APP) e outros isômeros semelhantes (Pallanca e outros (1998) Biochimica et Biophysiea Aetaf 1384:277-284; Brigotti e outros (2000) Nueleie Aeids Research, 28: 2383- 2388; Brigotti e outros (2000) Life Sci;, 68: 331-6; Pedido de Patente US número 6.562.969).
4-APP e Outros Análogos de Adenina
Adenina é uma base no substrato natural para 5 toxinas RIP (isto é, a primeira base de adenina na seqüência de Ioop de GAGA). Consequentemente, adenina e seus análogos inibem a atividade tóxica da RIP (Pallanca e outros (1998) Biochimica et Biophysiea Aetar 1384: 277-284; Brigotti e outros (2000) Nueleie Aeids Research, 28:2383- 10 2388; Brigotti e outros (2000) Life Sci., 68 331-6) por agir como um inibidor da atividade da RNA N-glicosidase. Tipicamente, um análogo de adenina inclui qualquer composto bicíclico fundido onde um dos anéis é 6-aminopirimidina e o outro anel é um anel heterocíclico de 5 elementos que 15 contém pelo menos dois átomos de carbono adjacentes incluindo, porém não limitado ao pirrole, pirazole, imidazole, triazole, oxazole, isoxazole, tiazole, isotiazole, furano e tiofeno. Tipicamente, fusão dos anéis ocorre entre os átomos de carbono nas 4a e 5a posições da 20 6-aminopirimidina e quaisquer dois átomos de carbono adjacentes do anel de 5 elementos, em cada modo dé anexação. Isto inclui, por exemplo, adenina propriamente cujo anel de 5 elementos está na configuração de imidazol. A estrutura da adenina é como se segue:
NH2
Adenina
Adicionalmente, tais análogos também incluem qualquer um com rearranjos dos átomos de nitrogênio do anel de 5 elementos a partir de imidazol para a configuração de pirazol incluindo, por exemplo, 4-APP e base de formicina, que apenas difere no modo de anexação da 6-aminopirimidina ao anel de pirazol de 5 elementos (vide, por exemplo, Brigotti e outros (2000) Life Sci., 68:331-6). Nas adições, os inibidores providos no presente documento incluem o ribonucleosideo e análogos do desoxiribonucleosídeo da base da formicina A, tal como, análogos de 5'mono-, 5' di-, 5' tri e 3' monofosfato de ribonucleotídeo das bases de formicina A, bem como os análogos de 5'mono-, 5' di-, 5' tri e 3' monofosfato de desoxiribonucleotídeos da formicina A ou qualquer outro composto semelhante ou conhecido, tal como, qualquer subsequentemente identificado com relação aos mesmos (vide, por exemplo, Pedido de Patente US número 6.562.969). As estruturas de 4-APP e da base de formicina A são como se segue:
conservada de toxinas RIP, adenina e os análogos da adenina, tais como, 4-APP, exibem capacidade diferenciais de proteger os ribossomos da inativação por RIPs (Pallanca e outros (1998) Biochimica et Biophysiea Aetar 1384:277- 284; Brigotti e outros (2000) Nueleie Aeids Research, 28:2383-2388; Brigotti e outros (2000) Life Sci., 68: 331- 6) . Por exemplo, 4-APP é um forte inibidor de Stx, momordina e outras RIPs de planta, porém exibe pouca inibição da ricina. Adicionalmente, 4-APP exibe atividade inibidora maior em Stx que a adenina, contudo, 4-APP e adenina apresentam atividade inibidora com relação à
4-aminopirazolo Base de formicina A [3,4-d]pirimidina(4-APP)
A despeito da atividade da N-glicosidase momordina da toxina RIP. Também, a adenina protege os ribossomos da inativação pela ricina, considerando-se que 4-APP apresenta pouca ação inibidora na atividade tóxica da ricina. Consequentemente, as toxinas RIP diferem em suas capacidades de serem inibidas por vários isômeros de adenina indicando que as toxinas RIP não compartilham uma fenda de ligação de sítio ativo comum. A atividade inibidora dos isômeros de adenina na atividade da RIP é conhecida (Pallanca e outros (1998) Biochimica et Biophysiea Aetar 1384:277-284; Brigotti e outros (2000) Nueleie Aeids Research, 28:2383-2388; Brigotti e outros (2000) Life Sci., 68:331-6) ou pode ser determinada por um versado na técnica tal como por determinação da atividade da RNA N-glicosidase (isto é, atividade da RIP) da toxina na presença do inibidor.
Conforme descrito em detalhes a seguir, os inibidores da RIP, tais como, adenina e seus análogos incluindo, por exemplo, 4-APP, podem ser empregados nos métodos para selecionar formas modificadas de RIPs e também 20 podem ser usados nos métodos para aperfeiçoar a produção de uma toxina RIP ou seu conjugado, tal como qualquer toxina RIP modificada provida no presente documento ou identificada por métodos de seleção providos no presenté documento.
D. Métodos de Seleção de Toxinas Modificadas ou
Seus Conjugados
O presente documento provê métodos de seleção de toxinas RIP modificadas que exibem citotoxicidade reduzida com relação às células que expressam hospedeiro. Nos 30 métodos neste documento, foi verificado que, em razão da toxicidade das RIPs às células hospedeiras específicas, a RIP é frequentemente expressa em níveis baixos em uma cultura de células, mesmo sob condições nas quais ela é de forma final tóxica a todas, ou substancialmente todas as células. Tipicamente, as RIPs são expressas uma vez que uma quantidade requerida precisa exibir toxicidade às células, algumas células podem se tornar resistentes aos efeitos tóxicos das RIPs, e, conforme mostrado no presente documento, as RIPs mutam. Como resultado, em uma cultura de células contendo ácidos nucléicos codificando uma RIP, a RIP é expressa, porém em níveis relativamente baixos.
Conseqüentemente, os métodos são providos para selecionar e identificar aquelas toxinas RIP produzidas por células hospedeiras sob condições onde a proteína RIP de partida não é produzida ou é produzida em níveis baixos. Para realizar os métodos providos no presente documento, um ácido nucléico codificando uma forma não modificada ou de partida de uma toxina RIP é introduzido em uma célula hospedeira, a célula hospedeira pode cresce, as células que crescem são isoladas e aquelas toxinas RIP que são expressas nas células são identificadas e testadas quanto à atividade, tal como, por exemplo, atividade da N- glicosidase e/ou outras atividades da RIP incluindo, porém não limitado à atividade da RNase, atividade de DNase, atividades de superóxido dismutase e fosfolipase. Em alguns exemplos, seleção é adicionalmente realizada na presença de um modulador de seleção, tal como um inibidor da RIP.
De modo geral, tais toxinas RIP identificadas são modificadas quando comparadas à proteína RIP de partida e, em virtude da modificação, a toxina RIP possui uma atividade alterada, tal como, uma atividade tóxica alterada ou outra atividade, em comparação à toxina RIP de partida. Geralmente, a toxicidade do polipeptídeo da RIP modificada é reduzida. Em alguns exemplos, o polipeptídeo da RIP modificada identificado nos métodos de seleção no presente documento não exibe atividade tóxica. Tipicamente, contudo, uma toxina RIP modificada ou seu conjugado, mantém 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% da atividade tóxica em comparação com a forma do tipo selvagem da toxina, ou seu conjugado. Em virtude da atividade citotóxica mantida, os conjugados contendo tais toxinas modificadas podem ser projetados para ter como alvo células específicas, pelo qual, resultando no extermínio da célula alvejada ou células mediante internalização do conjugado. Por exemplo, conforme descrito em detalhes a seguir, os conjugados contendo uma toxina RIP modificada podem ser usados nos métodos de tratamento de várias doenças ou transtornos por ter como alvo uma ou mais células ou populações de células envolvidas no processo da doença. Tais toxinas modificadas podem também ser usadas nos métodos para expressar e produzir toxinas RIP ou seus conjugados, pelo qual, permitindo a produção de proteína com alto rendimento.
1. Proteínas RIP Candidatas ou Seus Conjugados
Geralmente, uma vez que muitas proteínas RIP exibem atividade tóxica em relação às células procarióticas e/ou eucarióticas elas inibem a síntese da proteína por ribossomos celulares, não podendo ser expressas em níveis altos em alguns ou todos os sistemas de células hospedeiras. São fornecidos no presente documento métodos para reduzir a toxicidade das RIPs de modo que elas possam ser expressas em níveis mais altos, porém ainda exibam toxicidade suficiente para serem usadas terapeuticamente nos conjugados que empregam RIPs. Estão incluídos os conjugados das Patentes US números 7.166.702, 7.157.418 e 7.192. 736 bem como os conjugados de citocinas, tais como, fatores de crescimento, incluindo FGF, VEGF, EGF e outros.
Nos métodos providos no presente documento, é produzida uma toxina RIP ou seu conjugado que exibe uma toxicidade reduzida em uma célula hospedeira. Tais toxinas RIP modificadas ou seus conjugados são desta forma menos tóxicos às células. A seleção das proteínas RIP ou seus conjugados, que são modificadas para exibir toxicidade reduzida, permite a expressão de tal toxina pelas células hospedeiras e rendimentos aperfeiçoados. Consequentemente, tal método permite a geração das toxinas RIP ou seus conjugados que podem ser produzidos efetiva e eficazmente e pelo qual, podem ser usados nos métodos para tratar doenças ou transtornos para os quais eles são projetados.
As proteínas RIP a serem modificadas pelo método de seleção provido no presente documento podem ser qualquer proteína RIP ou qualquer polipeptídeo contendo uma proteína RIP ou sua porção ativa que, sob condições de crescimento normais ou do tipo padrão não é expresso ou é expresso em níveis baixos em uma célula hospedeira devido à atividade tóxica contra os ribossomos da célula hospedeira. As proteínas são modificadas e então, sob as mesmas condições, são expressas em níveis mais altos. A proteína RIP candidata para seleção inclui forma variante ou do tipo selvagem de uma proteína da RIP do tipo selvagem ou suas porções ativas exibindo atividade tóxica, incluindo variantes alélicas ou de espécies e isoformas de uma proteína RIP que não foi selecionada pelos métodos no presente documento.
Incluídas entre tais proteínas RIP estão quaisquer estabelecidas na Tabela 3 acima, tais como, quaisquer que possuam uma seqüência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 5, 89-111, especificamente a porção ativa da cadeia A de tais proteínas RIP, tal como a cadeia Al da toxina Shiga (isto é, SAI), ou qualquer seu fragmento ativo. Por exemplo, uma proteína de partida usada nos métodos providos no presente documento pode ser qualquer uma que seja truncada em sua cadeia A ou cadeia Al, porém que ainda exiba atividade catalítica. Também incluído como uma proteína de partida nos métodos providos no presente documento se encontra qualquer polipeptídeo contendo uma forma variante de uma proteína RIP, tal como sua variante alélica ou variante de espécie. Exemplos de variantes de proteínas RIP são estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOS: 6, 9-21 ou 162-169. Conjugados contendo tais proteínas ligadas a um agente alvo também são providos.
Também estão incluídos nos métodos aqui como uma proteína de partida os conjugados contendo qualquer toxina RIP citada acima, ou uma porção ativa de tal toxina RIP, ligada direta ou indiretamente a outra fração de polipeptídeo. Por exemplo, tais conjugados incluem conjugados de ligante-toxina, incluindo aqueles onde a toxina RIP é ligada direta ou indiretamente a uma quimiocina, citocina, anticorpo, fator de crescimento ou outra tal proteína de ligante que seja capaz de se ligar a um receptor de superfície de proteína. Tipicamente, tais conjugados são codificados por uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína de fusão.
Proteínas RIP exemplares usadas como proteínas de partida nos métodos providos aqui incluem SAl, por exemplo, possuindo ma seqüência de aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 1-251 da SEQ ID NO: 5, ou suas truncagens, tais como uma SAl possuindo uma seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 22 (isto é, SAl variante 1) ou SEQ ID NO: 24 (isto é, SAl variante 2), respectivamente ou suas variantes de espécies ou variantes alélicas. Exemplos de tais conjugados são qualquer um contendo qualquer fração de SAl citada acima, onde a fração de SAl é ligada direta ou indiretamente a um ligante ou outra molécula de ligação de receptor de célula. Por exemplo, tais conjugados incluem conjugados de quimiocina (isto e, moduladores da população de leucócitos) tal como estabelecido e descrito nas Patentes US números 7.166.702, 7.157.418 e 7.192.736. Estes incluem, por exemplo, um possuindo uma quimiocina de MCP-I ligada à SAI. Uma seqüência exemplar de um conjugado de MCP-I-SAl ligado a uma proteína RIP de SAl variante 1 (isto é, LPMla) é estabelecida na SEQ ID NO: 38 e é codificada por uma seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 37. Uma seqüência exemplar adicional de um conjugado MCP-I-SAl ligado a uma proteína RIP de SAl variante 2 (isto é, LPMlb) é estabelecida na SEQ ID NO: 40 e é codificada por uma seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO:39.
2. Introdução das RIPs ou Seus Conjugados nas Células Hospedeiras
Ácidos nucléicos codificando uma proteína RIP de partida desejada ou seu conjugado são introduzidos em qualquer célula hospedeira desejada. Tipicamente, uma célula hospedeira escolhida no método de seleção é uma que seja suscetível aos efeitos tóxicos da proteína RIP de partida ou seu conjugado, tal que a síntese da proteína da célula hospedeira seja abolida ou significativamente prejudicada por expressão da RIP na célula hospedeira: Estão incluídas entre as células hospedeiras para uso nos métodos de seleção qualquer célula procariótica incluindo, porém não limitada a qualquer célula bacteriana, tal como, E.coli. Também estão incluídas entre as células hospedeiras quaisquer células eucarióticas incluindo, porém não limitadas às leveduras, tais como, Pichia pastoris, oócitos Xenopus e células de mamíferos, tais como, por exemplo, Vero, Hep2, Chang, A549, C0S-1, e células HeLa. Na decisão de uma célula hospedeira apropriada para uso nos métodos de « 100/372
seleção no presente documento, a influência de uma proteína RIP ou seu conjugado, na expressão da proteína recombinante na célula hospedeira pode ser determinada por vários métodos descritos no presente documento a seguir ou 5 conhecidos dos versados na técnica. Ensaios para avaliar os efeitos na síntese da proteína incluem, por exemplo·, ensaios de depurinação (isto é, liberação de adenina), ensaios da síntese de proteína isenta de célula, tais como, lisado de reticulócito de coelho, ou ensaio de síntese de 10 proteína de lisado de germe de trigo ou ensaios de crescimento/viabilidade de célula. Por exemplo, por emprego de tais ensaios, é conhecido que SAl apresenta atividade tóxica significativa para ribossomos eucarióticos e procarióticos (Suh e outros (1998) Biochemistry, 37: 9394). 15 Consequentemente7 em um exemplo, a seleção de uma forma modificada de SAl ou sua forma ativa é realizada nas células eucarióticas. Em outro exemplo, a seleção de uma forma modificada de SAl ou sua porção ativa, é realizada nas células bacterianas, tais como, E. coli. Várias cepas 20 hospedeiras de E.coli estão disponíveis e incluem, porém não estão limitadas às células BL21(DE3) ou BL21(DE3)pLysS.
Uma molécula de ácido nucléico codificada por uma proteína RIP de partida ou seu conjugado para uso nos métodos no presente documento, pode ser produzida ou 25 isolada por qualquer método conhecido na técnica incluindo isolamento a partir de fontes naturais, geração de técnicas de DNA recombinante padrão, tais como, através de procedimentos de clonagem padrão de células, tecidos e organismos e por outros métodos recombinantes e por métodos 30 incluindo etapas in silico, métodos sintéticos e quaisquer métodos conhecidos dos versados na técnica. Tais moléculas de ácido nucléico podem incluir seqüências adicionais, tais como, seqüências de enzimas de restrição, ligadores, marcadores ou outras seqüências. Exemplos de moléculas de ácido nucléico incluem quaisquer codificando uma proteína RIP, suas formas ativas, ou suas variantes tais como, quaisquer codificando um polipeptídeo estabelecidas nas SEQ 5 ID NOS: 1, 3, 5, 7-22, 24, 89-111 ou 162-169 ou quaisquer codificando um conjugado contendo qualquer tal proteína RIP. Seqüências de ácido nucléico exemplares incluem, por exemplo, seqüências de uma forma variante 1 ou variante 2 da SAI, tal como estabelecido na SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID 10 NO: 25, respectivamente. Outras seqüências de ácido nucléico exemplares incluem seqüências codificando um conjugado tal como, por exemplo, um conjugado de uma quimiocina tal como MCP-I ligado a uma variante da SAl. Por exemplo, seqüências de ácido nucléico codificando um 15 conjugado LPMla ou LPMlb podem ser usadas nos métodos providos no presente documento e incluem as seqüências estabelecida na SEQ ID NO:37 e 39, respectivamente.
Tipicamente, uma molécula de ácido nucléico usada para introduzir células hospedeiras com seqüências para 20 seleção e expressão de uma proteína RIP modificada ou seu conjugado estão na forma de um vetor de expressão incluindo aquelas possuindo seqüências de controle de expressão operativamente ligadas a uma seqüência de ácido nucléico codificando a expressão do polipeptídeo. Tais vetores de 25 expressão são descritos em detalhes abaixo no presente documento. 0 vetor apropriado pode ser escolhido dependendo da célula hospedeira e/ou quaisquer elementos de transcrição/tradução desejados, incluindo, por exemplo, promotores constitutivos e induzíveis, elementos 30 melhoradores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. Em um exemplo, sistemas de expressão induzíveis são usados nos métodos no presente documento os quais permitem crescimento ótimo das células hospedeiras antes da expressão da toxina. Exemplo de um sistema induzivel em E.coli são os vetores pET, tal como, o plasmideo pET9c, que estão sob controle de um promotor tardio T7 e requerem indução por IPTG. Em outros exemplos, podem ser escolhidas as células hospedeiras usadas para expressão da codificação dos ácidos nucléicos introduzidos que propriamente também portam componentes adicionais que otimizam a expressão da toxina. Por exemplo, quando a célula hospedeira for E.coli, uma linhagem de célula BL21(DE3)pLysS pode ser usada a qual reprime fortemente a expressão do promotor T7 (tal como um vetor pET) na ausência de indução, em comparação às células hospedeiras parentais BL21(DE3) que podem vazar.
Moléculas de ácido nucléico codificando proteínas RIP, suas formas ativa ou seus conjugados podem ser introduzidas em uma célula hospedeira por qualquer método conhecido dos versados na técnica. Tais métodos são escolhidos dependendo da célula escolhida e incluem, porém não estão limitados a transfecção, transformação, eletroporação e qualquer outro método apropriado. Em alguns casos, DNA também pode ser introduzido nas células por transdução usando vetores virais. Tipicamente, quando da introdução do DNA nas células bacterianas, os métodos de transformação ou eletroporação são usados.
a. Transfecção
A transfecção pode ser usada para introduzir um ácido nucléico na célula eucariótica ou procariótica. A transfecção pode ser obtida por várias metodologias, porém tipicamente envolve a abertura de "orifícios" transitórios na célula para permitir a entrada do DNA, o que então se torna transitoriamente expresso na célula hospedeira. Exemplos de metodologias para introdução do DNA por transfecção incluem, porém não estão limitados aos métodos de fosfato de cálcio, lipofecção e abordagens de pistola de; gene. Por exemplo, na abordagem de lipofecção, o DNA é incluído nos lipossomas ou por emprego de reagentes de lipídeo-cátion que são então capazes de se fundir com a membrana celular liberando o DNA dentro da célula. Exemplos 5 de lipídeos catiônicos incluem, porém não estão limitados à Lipofectina (Life Technologies, Inc., Burlington, Ont.)(l:l (peso/peso) formulação do lipídeo catiônico - cloreto de N- [1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N, N, N-trimetilamônio (DOTMA) e dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE)); LipofectAMINE (Life 10 Technologies, Burlington, Ont, vide Patente US número 5.334.761) (3:1 (peso/peso) formulação de lipídeo policatiônico - trifluoracetato de 2,3-dioleiloxi-N- [2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-l-propanaminio (DOSPA) e dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE),
LipofectAMINE PLUS (Life Technologies, Burlington, Ont; vide Patentes US números 5.334.761 e 5,736,392; vide, também Patente US número 6.051.429) (LipofectAmine e reagente Plus), LipofectAMINE 2000 (Life Technologies, Burlington, Ont.; vide também Pedido Internacional PCT 20 número WO 00/27795) (Lipídeo catiônico), Effectene (Qiagen, Inc., Mississauga, Ontario) (formulação de lipídeo não lipossômico), Metafectene (Biontex, Munich, Alemanha) (Lipídeo policatiônico), Eu-fectins (Promega Biosciences, Inc., San Luis Obispo, CA) (lipídeos catiônicos etanólicos 25 números 1 a 12: C52H106N6O4. 4CF3CO2H, C88H178N8O4S2. 4CF3CO2H, C40H84NO3P. CF3CO2H, C50H103N7O3. 4CF3CO2H, C55H116N8O2. 6CF3CO2H, C49H102N6O3. 4CF3CO2H, C44H89N5O3. 2CF3CO2H, C100H206N12O4S2. 8CF3CO2H, C162H330N22O9.13CF3CO2H, C43H88N4O2. 2CF3CO2H, C43H88N4O3. 2CF3CO2H, C4IH78NOeP) ; Cytofectene (Bio-Rad, Hercules, CA ) (mistura 30 de um lipideo catiônico e um lipídeo neutro), GenePORTER (Gene Therapy Systems Inc., San Diego, CA) (formulação de um lipídeo neutro (Dope) e um lipídeo catiônico) e FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) (Reagente não lipossômico à base de lipídeo de múltiplos componentes) .
b. Transformação
A transformação é distinguida da transfecção pelo fato do DNA introduzido ser incorporado ao genoma da célula por expressão do material genético. Tipicamente, os vetores de expressão que são usados para transformação estável possuem um marcador selecionável, tal como, por exemplo, resistência a antibiótico, o que permite seleção e manutenção das células transformadas. A transformação requer a transferência do DNA para a célula que é obtida nas células que são naturalmente competentes ou que são tornadas competentes para absorção do DNA através das membranas das células ou membranas. O cloreto de cálcio é um método usado para tornar as células, tais como, células de E.coli, mais competentes. Seguindo-se o choque térmico das células bacterianas, elas são induzidas a entrarem no DNA. A transformação não é limitada à bactéria, porém pode também ser realizada na levedura, plantas e células de mamíferos incluindo células tronco embrionárias. Os métodos de transformação são bem conhecidos (vide, por exemplo, Mello e outros (1995) Methods Cell Biol, 48:451-82).
c. Eletroporação
A eletroporação abre temporariamente os poros em uma membrana externa da célula por emprego dos campos elétricos de rotação pulsada. Os métodos e aparelhos usados para eletroporação in vitro e in vivo são bem conhecidos (vide, por exemplo, Patentes US números 6.027.488, 5.993.434, 5.944.710, 5.507.724, 5.501.662, 5.389.069, 5.318.515). Protocolos padrão podem ser empregados.
3. Expressão, Seleção e Identificação
A introdução das células hospedeiras em uma, molécula de DNA resulta na ampliação do produto gênico e,. desta forma, permite que sejam expressas múltiplas cópias do gene. Uma vez que as toxinas RIP de partida ou seus conjugados usados nos métodos de seleção no presente documento são normalmente tóxicas à célula hospedeira escolhida, amplificação e expressão das proteínas de partida tipicamente não ocorre, por exemplo, devido à morte celular. Consequentemente, os métodos providos no presente documento utilizam a toxicidade normal das proteínas de partida como um método de seleção para selecionar aquelas formas modificadas da proteína que exibem menos toxicidade à célula hospedeira e são desta forma expressas. Tipicamente, tais proteínas expressas são modificadas em sua seqüência primária por uma ou mais mutações de aminoácido que tornam a proteína menos tóxica. Em alguns casos, as proteínas expressas são modificadas através da truncagem da seqüência de aminoácido em comparação á proteína de partida, o que torna a proteína menos tóxica. Na maioria dos sistemas de expressão de célula hospedeira, o gene codificando a toxina RIP modificada pode ser obtido em grandes quantidades por crescimento dos transformantes, isolamento das moléculas de DNA recombinante dos transformantes e, quando necessário, recuperando o gene inserido do DNA recombinante isolado.
Em alguns exemplos, um agente ou agentes adicionais são adicionados ao método de seleção a fim de modular a seleção para otimizar a recuperação de uma toxina RIP modificada ou seu conjugado. Tais moduladores de seleção são, tipicamente, qualquer um que reduz a atividade tóxica da toxina RIP ou seu conjugado. Por exemplo,· qualquer inibidor RIP pode ser usado para modular a seleção. Qualquer inibidor da toxina RIP conhecido por um versado na técnica ou seqüencialmente identificado ao mesmo, que possa inativar uma toxina RIP pode ser empregado nos métodos providos no presente documento. Tipicamente, tais inibidores da toxina RIP são qualquer um que inibe a atividade tóxica por ter como alvo, por exemplo, a atividade N-glicosidase conservada das toxinas RIP. Outros inibidores da toxina RIP podem ser escolhidos que tem como alvo qualquer uma ou mais outras atividades da RIP incluindo, porém não limitada a atividade RNAse, atividade DNAse e atividades superóxido dismutase e fosfolipase. Para fins no presente documento, qualquer inibidor da RIP, tal como adenina ou seu análogo pode ser empregado nos métodos neste documento, à medida que o inibidor exibe uma atividade inibidora contra a forma de partida da toxina RIP, por exemplo, a forma do tipo selvagem da toxina RIP ou seu fragmento ativo. Por exemplo, 4-APP pode ser usado nos métodos aqui para selecionar uma RIP modificada incluindo, porém não limitado a SAl modificada, saporina, momordina ou briodina (Brigotti e outros (2000) Life Sciences, 68:331- 336) . Tipicamente, 4-APP é usado nos métodos no presente documento para selecionar uma SAl modificada. Foi também contemplado que outros inibidores podem ser usados para selecionar uma SAl modificada.
A quantidade de inibidor da RIP usada nos métodos de seleção pode ser determinada empiricamente com base em seus efeitos conhecidos na atividade tóxica da proteina RIP ou seu conjugado. É importante que o inibidor da RIP usado nos métodos no presente documento seja propriamente não tóxico à célula hospedeira especifica, que a toxicidade seja conhecida ou possa ser determinada por um versado na técnica dependendo da célula hospedeira escolhida. Adicionalmente, para garantir que um inibidor da RIP module eficazmente a seleção de uma toxina RIP modificada ou seu conjugado, uma concentração do inibidor da RIP é escolhida tal que ela iniba a atividade tóxica da proteina de partida. Tipicamente, uma concentração do inibidor da RIP é escolhida, tal que, a proteina RIP de partida mantém alguma atividade na presença do inibidor da RIP, pelo qual, permitindo algum grau de pressão seletiva ou modulação do inibidor a RIP no método de seleção. Geralmente, uma concentração do inibidor da RIP é escolhida que inibe pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da atividade tóxica de uma toxina RIP, ou seu conjugado, porém menos de 100% da atividade tóxica. Vários ensaios conhecidos de um versado na técnica podem ser usados para testar os efeitos das várias concentrações dos inibidores da RIP nas atividades das células hospedeiras ou proteínas RIP.
Tipicamente, nos métodos de seleção no presente documento, um inibidor da RIP, tal como, por exemplo, A- APP, é adicionado para modular a seleção a cerca de ou a 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 nM, 0,7 nM, 0,8mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,5 nM, 2,0 nM, 3,0 mM, 4,0 mM, 5,0 mM, 6,0 mM, 7,0 mM, 8,0 mM, 9,0 mM, 10,0 mM ou mais, à medida que o inibidor é propriamente não tóxico a uma célula hospedeira escolhida. É entendido que a concentração do inibidor da RIP escolhido pode variar dependendo da célula hospedeira escolhida ou das condições usadas para expressão recombinante. Por exemplo, exemplos de uma concentração escolhida de 4-APP para uso nos métodos de seleção aqui em um sistema de expressão da célula de E.coli estão em ou são de cerca de 0,2 a 0,8 mM, geralmente de 0,5 mM de inibidor.
0 inibidor da RIP pode ser adicionado antes, durante ou após tratamento das células hospedeiras com a toxina RIP da proteína de partida ou seu conjugado. Em alguns exemplos, o inibidor da RIP é adicionado a uma cultura liquida ou meio, tal como, por exemplo, a um meio de cultura celular. Em outros exemplos, o inibidor de RIP é adicionado a um meio capaz de solidificar, tal como um Agar sólido. Por exemplo, um inibidor da RIP, tal como, por exemplo, 4-APP, pode ser adicionado ao Agar de caldo Luria 5 (LB) para a geração de placas de Agar contendo o inibidor da RIP. 0 inibidor da RIP pode ser usado como um modulador seletivo sozinho ou pode ser usado na presença de outros moduladores seletivos ou agentes seletivos, tais como, porém não limitado a outros inibidores da RIP ou 10 antibióticos conferindo resistência antibiótica.
As toxinas modificadas selecionadas dos transformantes da célula hospedeira podem ser ampliados para facilitar a identificação da toxina RIP modificada, selecionada ou seu conjugado. Tais métodos incluem técnicas 15 de DNA recombinante geral e são rotina para os versados na técnica. 0 vetor dos transformantes da célula hospedeira contendo o DNA da toxina modificada pode ser isolado para permitir purificação da proteína selecionada. Por exemplo, seguindo-se a transformação das células hospedeiras de 20 E.coli com uma proteína de partida da RIP conforme estabelecido acima, os tranformantes da célula crescem como clones individuais que podem ser isolados, tal como, por coleta individual de uma colônia e crescimento da mesma por purificação do plasmideo usando qualquer método conhecido 25 dos versados na técnica e, caso necessário, podem ser preparados em grandes quantidades, tal como, por exemplo, usando Midi Kit de Purificação de Plasmideo (Qiagen). 0 plasmideo purificado pode ser usado para sequenciamento do DNA de modo a identificar a seqüência da toxina modificada 30 ou pode ser usado para transfeccionar para qualquer célula para expressão adicional e produção, tal como, porém não limitado ao sistema de expressão procariótico ou eucariótico. Em alguns exemplos, uma PCR de uma ou duas etapas pode ser realizada para ampliar a seqüência selecionada, que pode ser subclonada em um vetor de expressão de escolha. Os iniciadores da PCR podem ser projetados para facilitar a subclonagem, tal como por inclusão da adição de sítios de enzima de restrição.
Seguindo-se a expressão e produção adicionais das toxinas selecionadas em qualquer sistema de expressão de célula desejado, o meio condicionado contendo o polipeptídeo da toxina RIP ou seu conjugado pode ser testado nos ensaios de atividade ou pode ser usado para purificação adicional. Tipicamente, qualquer expressão adicional e produção da toxina RIP modificada, selecionada ou seu conjugado é realizado na presença de um inibidor da RIP. Tal método é descrito em detalhes a seguir na Seção G para produção aperfeiçoada das toxinas RIP ou seus conjugados.
4. Avaliação da Atividade
Toxinas RIP modificadas ou seus conjugados, selecionadas nos métodos providos aqui podem ser testadas para determinar se, seguindo-se a seleção, elas mantêm a atividade tóxica contra os ribossomos da célula hospedeira. Tipicamente, tais toxinas modificadas são selecionadas porque elas exibem uma atividade tóxica reduzida em comparação a uma proteína RIP de partida ou seu conjugado. Geralmente, contudo, as toxinas modificadas selecionadas mantêm alguma atividade da proteína da toxina de partida. Toxinas RIP modificadas ou seus conjugados providas aqui, mantêm 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade tóxica em comparação à forma de referência ou de partida da toxina ou seu conjugado. Exemplos de ensaios podem ser quaisquer ensaios que testam uma atividade de um polipeptídeo da RIP incluindo, por exemplo, ensaios que avaliam a atividade da N-glicosidase, atividade da DNAse, atividade da RNAse ou outras atividades. Qualquer método conhecido de um versado na arte pode ser empregado para avaliar a atividade tóxica de uma proteína RIP ou seu conjugado e tipicamente inclui qualquer ensaio que efetue atividade de N-glicosidase da proteína RIP. Ensaios exemplares para avaliar a atividade tóxica de qualquer toxina RIP ou seu conjugado incluindo formas modificadas de tais toxinas são descritos a seguir.
a. Ensaios da Sintese da Proteina
A atividade das toxinas RIP ou seus conjugados, tal como qualquer RIP modificada, incluindo, por exemplo, qualquer toxina modificada identificada no método de seleção provido no presente documento, pode ser medida para determinar os efeitos da toxina na tradução usando um ensaio de síntese de proteína. Tais ensaios são rotina e são conhecidos de um versado na técnica. Exemplo de tal ensaio é o ensaio de lisado de reticulócito de coelho. Tipicamente, o ensaio de reticulócito de coelho contém ou é suplementado com componentes necessários para a transcrição e tradução eficientes, tais como, íons magnésio e potássio e NTPs. Um RNA molde também é adicionado o qual é a fonte da proteína sintetizada. Tal ensaio permite a transcrição e tradução in vitro acoplada das proteínas dos ribossomos do coelho que podem ser detectadas. Em um método, a detecção pode ser obtida através da incorporação da radioatividade,· tal como, [3H]Leu, [35SJMet ou [35S]Met-Cys que é incorporada à proteína sintetizada e pode ser medida seguindo-se a precipitação com ácido tricloroacético (TCA; Baas e outros (1992) The Plant Cell, 4: 225-234; Zhao e outros (2005) Journal of Microbiology, 54: 1023-1030). Em outro método, a luciferase DNA pode ser usada como o molde, que é então, detectada usando um luminômetro. Exemplos dé sistemas de lisado de reticulócito de coelho são aqueles vendidos pela Promega incluindo, por exemplo, os TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Sistemas de Lisado de Reticulócito Acoplado). Tal ensaio é descrito no Exemplo 2. O ensaio pode ser adaptado para ser empregado com outros sistemas de tradução incluindo lisados de reticulócito de trigo e milho ou pode ser adaptado nas reações de tradução contendo lisados de célula intacta ou ou lisados reconstruídos de várias frações de sobrenadante e ribossomos purificados ou poliribossomos (Baas e outros (1992) The Plant Celll 4:225-234). Em alguns métodos, o ensaio pode ser adaptado para avaliar os efeitos na síntese da proteína nas células integrais, onde a detecção da síntese da proteína pode ser facilitada por luciferase expressa por adenovírus (Zhao e outros (2005) Journal of Microbiology, 54:1023-1030). Além disso, análise cinética e curvas de resposta de dose podem ser realizadas para determinar a atividade relativa da toxina conforme determinada pela concentração da toxina necessária para fornecer metade da resposta máxima (RIC50).
b. Ensaios de Depurinação
A atividade de toxinas RIP ou seus conjugados, tal como qualquer RIP modificada, incluindo, por exemplo, qualquer toxina modificada identificada no método de seleção provido no presente documento, pode ser determinada em um ensaio de depuração. A depurinação mediada por RIP da subunidade de ribossomo grande de RNA aumenta a suscetibilidade da estrutura de açúcar-fosfato à hidrólise no sítio de depurinação (Turner e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 94:3866-3871). Seguindo-se o tratamento com anilina, a hidrólise pode ser observada tipicamente por liberação de um fragmento pequeno. Assim, os ribossomos podem ser tratados na presença ou ausência de concentração aumentada da toxina, o RNA extraído e tratado com anilina e analisado por eletroforese em gel. Os fragmentos podem ser visualizados por coloração com brometo de etidio (Turner e outros (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., 94:3866-3871; Hartley e outros (1991) FEBS, 290: 1:65-68). O percentual de depurinação pode ser determinado por varreduras de negativos de fotografias dos géis de RNA (vide por exemplo, Taylor e outros (1994) The Plant Journal, 5:827-835).
c. Crescimento da Célula/Sobrevivência/Ensaios de Viabilidade
A atividade das toxinas RIP ou seus conjugados, tal como qualquer RIP modificada, incluindo, por exemplo, qualquer toxina modificada identificada no método de seleção provido no presente documento, pode ser determinada por avaliação direta dos efeitos no crescimento da célula. Em tal ensaio, qualquer célula procariótica ou eucariótica pode ser introduzida com DNA codificando uma toxina, tal como, na forma de um vetor de expressão apropriado. Alternativamente, qualquer célula procariótica eucariótica pode ser administrada diretamente com polipeptideo da RIP ou seu conjugado, tal como, por exemplo, um conjugado ligante-toxina. Qualquer célula pode ser testada, incluindo, porém, não limitado a qualquer célula primária, tal como, diretamente obtida de um indivíduo, isto é, do sangue, soro ou outra fonte de tecido. Incluídos entre tais células estão quaisquer subtipos de leucócitos ou seus leucócitos ativados. As linhagens de célula também podem ser usadas nos ensaios para avaliar a toxicidade dos polipeptídeos da RIP ou seus conjugados. Exemplos de uma linhagem de célula são células THP-I, U251 ou HT-29.
0 crescimento da célula pode ser monitorado por avaliação da proliferação da célula, viabilidade da célula ou sobrevivência da célula. 0 crescimento pode ser
ou um monitorado com o tempo e na presença ou ausência de concentrações crescentes da toxina. Por exemplo, o crescimento da célula pode ser monitorado por contagem das células em um Contador Coulter, medição da densidade óptica das células com o tempo (Suh e outros (1998) Biochemistry, 37:9394-9398), usando um corante de DNA, tal como MTT que é reduzido por células vivas para formar cristais de formazano púrpura insolúveis que podem ser medidos (Arora e outros (1999) Câncer Research, 59: 183-188; McDonald e outros (2001) IDrugs, 4:427-442) ou por emprego de um corante tal como azul tripano que é excluído das células viáveis, porém não das células mortas (McDonald e outros (2001) IDrugsr 4:427-442). Em outro exemplo, a viabilidade da célula pode ser avaliada por medição da quantidade de ATP liberado no meio de cultura da célula. Exemplo de tal ensaio é o Kit de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo™ (Promega, Madison WI) tal como é descrito, por exemplo, no Exemplo 5. Mediante Iise das células com a mistura de reação de ATP (fornecida pelo fabricante como Reagente CellTiter-Glo®) , ATP aciona a oxigenação da luciferina resultando em um sinal luminescente que é proporcional às concentrações de ATP nos poços. Isto é diretamente proporcional ao número de células viáveis na cultura.
E. Exemplos de Toxinas Modificadas
São providos no presente documento polipeptídeos da toxina RIP modificada ou seus conjugados que exibem atividade tóxica reduzida em comparação a um polipeptídeo da RIP do tipo selvagem. Por exemplo, um polipeptídeo da toxina RIP modificada ou seu conjugado, exibe 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade tóxica em comparação à forma de referência ou de partida da toxina ou seu conjugado. Em virtude da toxicidade reduzida, tais polipeptídeos da toxina RIP modificada são expressos por células hospedeiras e podem ser purificados, isolados e/ou identificados das mesmas. As toxinas modificadas ou seus conjugados exibem toxicidade reduzida em relação às células eucarióticas ou procarióticas. Geralmente, as toxinas RIP modificadas ou seus conjugados exibem toxicidade reduzida com relação às células bacterianas, tais como, E.coli, desta forma, permitindo uma fonte da toxina que pode ser usada nos métodos de produção em E.coli.
Tipicamente, tais polipeptídeos da toxina RIP modificada ou seus conjugados mantêm uma ou mais atividades da forma de partida ou do tipo selvagem da proteína (isto é, polipeptídeo não modificado). Por exemplo, os polipeptídeos da toxina RIP modificada ou seus conjugados mantêm pelo menos ou cerca de 0,5%, 1%, 1.5%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais atividade de uma ou mais do que uma atividade da RIP em comparação ao polipeptídeo da RIP do tipo não modificado ou selvagem ou seu conjugado. As atividades de um polipeptídeo da RIP incluem, porém não estão limitadas a qualquer uma ou mais dentre atividade da N-glicosidase, atividade de polinucleotídeoradenosina glicosidase incluindo atividade de RNAse e atividade de DNAse, atividade de superóxido dismutase, atividade de fosfolipase, atividade de quitinase e atividade antiviral. A atividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo e pode ser comparada à atividade do polipeptídeo da RIP de partida.
Em alguns exemplos, tais polipeptídeos da RIP modificada são identificados nos métodos de seleção no presente documento tal como em virtude de sua expressão por uma célula hospedeira em comparação a um polipeptídeo da RIP de partida ou um conjugado de polipeptídeo contendo um polipeptideo da RIP, que não é expresso pela célula hospedeira ou é expresso em níveis baixos. Conforme é descrito acima, tais polipeptídeos da toxina RIP modificada são identificados seguindo-se introdução de um ácido nucléico codificando um polipetídeo da RIP de partida ou do tipo selvagem, por exemplo, qualquer ácido nucléico codificando um polipeptideo da RIP conforme estabelecido na Tabela 3, ou um seu fragmento ativo, seguido por seleção e identificação dos polipeptídeos da RIP expressos. Em alguns exemplos, os polipeptídeos da toxina RIP modificada providos aqui são identificados seguindo-se a expressão de uma toxina a partir de uma célula hospedeira introduzida com ácido nucléico codificando uma toxina RIP de partida ou sua porção ativa. Em outros exemplos, os polipeptídeos da toxina RIP modificada providos no presente documento são identificados seguindo-se a expressão de um polipeptideo conjugado da toxina RIP (isto é, conjugado de ligante- toxina) de uma célula hospedeira que é introduzido com um conjugado de partida codificando um polipeptideo contendo uma toxina RIP ou sua porção ativa. Tipicamente, tal conjugado é uma proteína de fusão, pelo que, permitindo a introdução de uma molécula de ácido nucléico codificando a proteína de fusão na célula.
Empregando os métodos descritos no presenté documento, a modificação específica no polipeptideo da RIP expresso pode ser identificada, tal como, por exemplo, por sequenciamento do polipeptideo. Tipicamente, as modificações identificadas nos métodos no presente documento incluem quaisquer que possam alterar a seqüência primária do polipeptideo não modificado e incluem, porém não estão limitadas a qualquer uma ou mais substituições dé aminoácido, deleções de aminoácido e/ou truncagens de aminoácido. Por exemplo, modificações incluem qualquer uma ou mais mutações de aminoácido na seqüência primária ou truncagem da seqüência primária ou quaisquer de suas combinações. Consequentemente, as modificações dos resíduos de aminoácido em um polipeptídeo da RIP ou seu fragmento ativo podem ser identificadas as quais conferem toxicidade de célula reduzida em virtude de uma alteração na seqüência primária do polipeptídeo.
A(s) modificação(ões) identificada(s) no método de seleção no presente documento em um polipeptídeo da RIP expresso pode(m) ser realizada(s) em posição(ões) correspondendo a qualquer proteína alvo, por exemplo, qualquer polipeptídeo correlato, tal como, porém não limitado a qualquer espécie alélica, forma truncada ou outra variante do polipeptídeo da RIP expresso. Tais modificações podem ser realizadas por técnicas de DNA recombinantes padrão, tais como, as que são rotina para um versado na técnica. Qualquer método conhecido na arte para efetuar a mutação de qualquer um dos aminoácidos em uma proteína alvo pode ser empregado. Os métodos incluem mutagênese direcionada ao sítio padrão (usando, por exemplo, um kit, tal como o QuikChange disponível na Stratagene) de codificação de moléculas de ácido nucléico ou por métodos de síntese de polipeptídeo de fase sólida.
Além disto, qualquer polipeptídeo da RIP modificado, identificado nos métodos no presente documento ou gerado com base em uma modificação identificada nos métodos no presente documento pode ser empregado para gerar uma proteína de fusão ou conjugado. Por exemplo, um conjugado de ligante-toxina pode ser gerado possuindo a fração de toxina modificada como o agente alvejado (vide Seção F a seguir) ligado direta ou indiretamente a qualquer fração que tem como alvo um receptor de superfície de célula para sua internalização. Tais conjugados podem ser gerados por técnicas de DNA recombinante de rotina. Por exemplo, conjugados podem ser gerados usando enzimas de restrição e metodologias de clonagem para subclonagem de rotina dos componentes conjugados desejados. Qualquer polipeptideo modificado gerado, incluindo qualquer conjugado possuindo uma modificação identificada nos métodos de seleção no presente documento mantém atividade tóxica. Tais polipeptideos modificados geralmente mantêm ou exibem qualquer uma ou mais atividades da RIP. A atividade tóxica e outras atividades dos conjugados podem ser testadas.
Outras modificações que se encontram ou não na seqüência primaria do polipeptideo também podem ser incluídas em um polipeptideo da RIP modificada ou seu conjugado, tal como, porém não limitado a adição de uma fração de carboidrato, a adição de uma fração de polietileno glicol (PEG), a adição de um domínio Fc, etc. Por exemplo, tais modificações adicionais podem ser feitas para aumentar a estabilidade ou meia vida da proteína. Toxinas da SAl Modificada
Exemplos de toxinas RIP providos no presente documento são formas modificadas da SAI, incluindo modificações em qualquer forma ativa da mesma, por exemplo; qualquer forma truncada da mesma, à medida que ô polipeptideo truncado exibe uma atividade da RIP e suas variantes de espécies ou variantes alélicas. Por exemplo,' um polipeptideo da SAl modificada pode incluir qualquer uma ou mais modificações em uma variante truncada da SAI, tal como é estabelecida na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24 ou suas variantes de espécies ou variantes alélicas. Toxinas da SAl modificada podem ser truncadas ou podem expressar mutações de aminoácido em comparação à toxina da SAl de partida empregada nos métodos de seleção. Tipicamente, tais toxinas modificadas mantêm uma ou mais atividades em comparação ao polipeptídeo da SAl de partida. Consequentemente, tais polipeptídeos da SAl modificada podem ser usados nos métodos para melhorar a produção de um polipeptídeo da SAl e/ou podem ser usados nas proteínas dè fusão para gerar proteínas de conjugado contendo o polipeptídeo da SAl modificada.
Os polipeptídeos da SAl modificada podem ser identificados nos métodos de seleção no presente documento. Em um exemplo, o polipeptídeo da SAl modificada pode ser identificado seguindo-se a introdução do ácido nucléico codificando um polipeptídeo da SAl ou seu fragmento ativo. Por exemplo, a seleção de um polipeptídeo da SAl modificada pode ser obtida seguindo-se a introdução do ácido nucléico codificando um polipeptídeo da SAl variante 1, tal como é estabelecida na SEQ ID NO: 22. Em outro exemplo, a seleção de um polipeptídeo da SAl modificada pode ser obtida seguindo-se a introdução do ácido nucléico codificando um polipeptídeo da SAl variante 2. A SAl variante 2 é uma forma da SAl obtida para não possuir os cinco aminoácidos do término C (CHHHA) em comparação à SAl variante 1 estabelecida na SEQ ID NO: 22, de modo a evitar dimerização induzida por cisteína. A seqüência de aminoácidos da SAl variante 2 é estabelecida na SEQ ID NO: 24 e codificada por uma seqüência de ácido nucléico estabelecida na SEQ ID NO: 25.
Em alguns casos, a seleção de um polipeptídeo da SAl modificada pode ser obtida seguindo-se a introdução do ácido nucléico codificando um conjugado contendo um polipeptídeo da porção da SAI. Os conjugados podem incluir qualquer conjugado de ligante-toxina ou outro conjugado, à medida que o conjugado contém um polipeptídeo da SAl ou seu fragmento ativo. Por exemplo, conjugados de quimiocina descritos nas Patentes US números 7.166.702, 7.157.418 e 7.192.736 podem ser empregados como uma proteína de partida para identificar formas modificadas de um polipeptídeo da SAl variante 1 (estabelecida na SEQ ID NO: 22 e codificada por uma seqüência de ácido nucléico estabelecida na SEQ ID NO: 23) . Em um exemplo, um polipeptídeo LPMla é empregado como uma proteína de partida, que é um conjugado da quimiocina MCP-I ligado indiretamente ao polipeptídeo da SAl variante 1. 0 conjugado LPMla é estabelecido na SEQ ID NO: 38 e codificado por uma seqüência de ácido nucléico estabelecida na SEQ ID NO: 37. Em outro exemplo, um conjugado contendo a quimiocina MCP-I ligada a uma forma variante 2 da SAI pode ser usado como uma proteína não modificada de partida, também denominada LPMlb no presente documento. 0 conjugado LPMlb é estabelecido na SEQ ID NO: 40 e codificado por uma seqüência de ácidos nucléicos estabelecida na SEQ ID NO:39.
0 presente documento provê uma toxina da SAl modificada que contém uma mutação de aminoácido na posição 38, correspondendo à posição 38 dos polipeptídeos da SAl variante estabelecida na SEQ ID NO: 22. Por exemplo, modificações de aminoácido podem corresponder à posição L38. Uma mutação de aminoácido exemplar na SAl identificada nos métodos providos no presente documento corresponde à modificação L38R em um polipeptídeo da SAl variante, tal como estabelecida na SEQ ID NO: 22. Em alguns exemplos, a mutação L38R correspondente é identificada ou realizada em outras formas da variante SAI, incluindo variantes de espécies ou variantes alélicas. Por exemplo, uma mutação L38R correspondente pode ser realizada em uma seqüência de SAl variante 2 estabelecida na SEQ ID NO: 24. Uma toxina da SAl exemplar possuindo uma mutação de aminoácido de L38R é estabelecida na SEQ ID NO: 26 e codificada por uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 27-. Essa SAl modificada também é denominada variante 1 mutante (também denominada variante 3) no presente documento. O polipeptideo da SAl variante 1 mutante pode ser usado para gerar conjugados da toxina adicionais, que podem ser usados, por exemplo, para tratar doença ou transtornos, para os quais o conjugado é projetado. Adicionalmente, o polipeptideo da SAl variante 1 mutante pode ser empregado nos métodos para aperfeiçoar a produção da SAl ou seus conjugados.
Em outro exemplo, o presente documento provê uma toxina da SAl modificada que contém uma mutação de aminoácido na posição 219, correspondendo à posição 219 de polipeptideos da SAl variante estabelecida na SEQ ID NO: 22. Por exemplo, modificações de aminoácidos podem corresponder a posição V219. Uma mutação de aminoácido exemplar na SAl identificada nos métodos providos no presente documento corresponde à modificação de V219A em um polipeptideo da SAl variante estabelecida na SEQ ID NOS: 22. Em alguns exemplos, a mutação V219A correspondente é identificada ou realizada em outras formas da SAl variante, incluindo variantes de espécies ou variantes alélicas. Por exemplo, uma mutação V219A correspondente pode ser realizada em uma seqüência variante 2 da SAl estabelecida na SEQ ID NO: 24. Um polipeptideo exemplar da SAl modificada possuindo uma mutação de aminoácido da V219A é estabelecido na SEQ ID NO: 28 e codificado por uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 29. Esta SAl modificada é também denominada variante 2 mutante (também denominada variante 4) no presente documento. O polipeptideo da SAl variante 2 mutante pode ser empregado para gerar conjugados de toxina adicionais, que podem ser usados, por exemplo, nos métodos para tratar uma doença ou transtornos para os quais é designado. Adicionalmente, o polipeptideo da SAl variante 2 mutante pode ser empregado nos métodos para aperfeiçoar a produção de SAl ou seus conjugados.
Além disso, quaisquer mutações identificadas em
um polipeptideo da RIP modificada nos métodos de seleção no presente documento podem ser combinadas. Por exemplo, um polipeptideo da SAl modificada, ou seu conjugado, pode ser gerado possuindo uma modificação de L38 e V219, correspondendo às posições em uma SAl variante estabelecida em qualquer SEQ ID NO: 22. Tal modificação pode ser feita à posição correspondente em qualquer polipeptideo da SAI, tal como um polipeptideo SAl estabelecido na SEQ ID NO: 22 ou 24, respectivamente, suas variantes de espécies ou variantes alélicas ou qualquer outra variante de SAl conhecida dos versados na técnica. Adicionalmente, qualquer uma das mutações identificadas nos polipeptideos da RIP modificada no método de seleção no presente documento pode ser combinada com quaisquer outras mutações no polipeptideo da RIP conhecida dos versados na técnica ou subseqüentemente identificada com o mesmo. Tipicamente, qualquer tal combinação mutante em um polipeptideo da RIP ou seu conjugado, exibe toxicidade reduzida a uma célula hospedeira comparada a uma forma de partida ou do tipo selvagem de um polipeptideo da RIP, ainda mantém 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade tóxica em comparação à forma de partida ou de referência da toxina ou seu conjugado.
F. Agentes Alvo e Seus Conjugados São providos no presente documento conjugados
contendo toxinas do polipeptideo da RIP ou seus fragmentos ativos, ligados direta ou indiretamente a uma ou mais frações ou agentes, tais como qualquer fração química, de polipeptídeo ou peptídeo ou suas porções. Tipicamente, as toxinas para uso nos conjugados providos no presente documento são aquelas contendo qualquer variante da toxina RIP, incluindo qualquer variante da toxina RIP modificada. Tais toxinas modificadas incluem qualquer toxina RIP modificada provida no presente documento ou identificada empregando os métodos de seleção providos no presente documento, tal como, por exemplo, uma toxina da SAl modificada ou variantes alélicas ou seus fragmentos. Incluída entre tal SAl modificada se encontra uma SAl variante 1 modificada (isto é, variante 3) ou uma SAl variante 2 mutante (isto é, variante 4) identificada nos métodos de seleção no presente documento.
Tipicamente, uma toxina RIP modificada é ligada direta ou indiretamente a um agente alvo, incluindo qualquer agente que tem como alvo o conjugado a um ou mais tipos de célula por ligação seletiva a um receptor de superfície de célula (isto é, referido no presente documento como conjugados de ligante-toxina). Consequentemente, qualquer polipeptídeo ou molécula que se liga a um receptor de superfície de célula e é internalizado por uma célula se destina ao uso no presente documento. Tais agentes alvo incluem, porém não estão limitados aos fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, anticorpos, e hormônios ou variantes alélicas, muteínas ou seus fragmentos à medida que o agente alvo é internalizado por um receptor de superfície de célula. Adicionalmente, os conjugados providos no presente documento podem incluir, opcionalmente, componentes adicionais, tais como, por exemplo, porém não limitado às seqüências ou frações adicionais para facilitar a clonagem, expressão, modificação pós-traducional, purificação, detecção e administração. Estas incluem, por exemplo, seqüências de enzima de restrição, seqüências de códon de parada ou partida traducionais, marcadores His ou outros tais componentes. Por exemplo, um códon de metionina de partida ou seqüência Kozak pode ser adicionado à seqüência de ácido nucléico de codificação para permitir ou melhorar a tradução do polipeptideo maduro ou de um polipeptideo fragmentado. Adicionalmente, conforme descrito acima na Seção D, qualquer molécula de ácido nucléico que codifica um conjugado de ligante-toxina contendo um agente alvo ligado a um agente alvejado, tal como uma subunidade SAl ou sua porção ativa, pode ser empregado para classificar variantes do agente alvejado, tal como uma SAl modificada conforme descrito acima e nos Exemplos no presente documento. 1. Agentes Alvo
Geralmente, os conjugados da toxina RIP modificada providos no presente documento contêm um agente alvo que tem como alvo o conjugado em relação a um receptor ou receptores em uma célula ou uma população de células envolvida na patologia de vários processos de doença. Dependendo da doença ou transtorno, tais células são células ativadas que são uma função da doença, bem como o processo da doença ou são células espectadoras que sustentam o processo da doença. Consequentemente, ter como alvo estes receptores e as células que expressam estes receptores permite que a terapia seja Afeita sob medida' a uma doença especifica e também ao progresso da doença. Consequentemente, conjugados providos no presente documento podem ser empregados como substâncias terapêuticas no tratamento de várias doenças.
Por exemplo, os conjugados providos no presente documento incluem ligante-toxina que contêm uma fração alvo que se liga aos receptores nos tipos de células especificas envolvidos na resposta imune, incluindo vários subtipos de leucócitos nas doenças inflamatórias. Por exemplo, como um componente dos conjugados providos no presente documento, uma fração alvo pode incluir um ligante que tem como alvo um ou mais receptores de superfície celular expressos nas células do sistema imune, tal como, qualquer célula da linhagem de leucócito ou outras células residentes no tecido, incluindo nas células ativadas envolvidas nos processos das doenças. Exemplos dos tipos de células que podem ser alvejadas no presente documento pelos conjugados incluem, porém não estão limitados aos leucócitos incluindo, porém não limitados aos monócitos, macrófagos incluindo macrófagos de tecido, tais como, micróglia do cérebro, células de Kupfer do fígado ou macrófagos alveolares do pulmão, células B, células T incluindo células Thl e Th2, basófilos, eosinófilos, células dendríticas incluindo células dendríticas maduras ou imaturas e células de Langerhans, mastócitos, células exterminadoras naturais, e neutrófilos. Outros exemplos de tipos de células que podem ser alvejados no presente documento incluem plaquetas, astrócitos, células endoteliais, neurônios, células epiteliais e células adiposas.
a. Quimiocinas
São providos no presente documento conjugados
pelo que o agente alvo empregado no conjugado de ligante- toxina é selecionado da família das quimiocinas. De modo a apreciar o uso de uma quimiocina como um agente alvo nos conjugados no presente documento, será útil um entendimento da função e interação dos ligantes de quimiocina e seus receptores. A discussão que se segue fornece tal base.
As quimiocinas são uma família de quarenta ou mais proteínas pequenas que tipicamente são secretadas por células e estimulam a ativação e/ou migração ("quimiotaxia") de células sensíveis próximas, tipicamente leucócitos, que expressam receptores de quimiocina cognatos. Em conjunto, as quimiotaxias tem como alvo o espectro total de subtipos de leucócitos; individualmente cada um tem como alvo uma parte do espectro. Embora algumas quimiocinas sejam constitutivas e estejam envolvidas nas respostas imunes homeostáticas, muitas quimiocinas são denominadas quimiocinas inflamatórias e são induzidas de uma ampla variedade de células em resposta à infecção bacteriana, virus e outros agentes estimuladores.
As quimiocinas possuem várias atividades biológicas. Elas foram inicialmente isoladas por sua capacidade de estimular a migração e ativação de leucócitos. As quimiocinas em associação com as moléculas de adesão recrutam subconjuntos de leucócitos para sítios específicos de inflamação e lesão de tecido. Por exemplo, as quimiocinas funcionam principalmente como
quimioatrativos através da estimulação dos receptores de quimiocina expressos em uma variedade de leucócitos incluindo aqueles em imunidade inata, pelo qual recrutando monócitos, neutrófilos e outras células efetoras do sangue para sítios de infecção ou lesão e também aqueles na imunidade adaptiva incluindo recrutamento dos linfócitos para sítios de reações imunes. Geralmente, as quimiocinas e expressão receptora da quimiocina são regulados positivamente na doença, com as quimiocinas atuando de um modo autócrino ou parácrino (Glabinski e outros (1995) Int. J. Dev. Neurosci., 13:153-65; Furie and Randolph (1995) Am. J. Pathol., 146:1287-301; Benveniste E. N. (1997) J. Mol. MecL., 75:165-73; Schall e outros (1994) Current Biolr 6: 865-73; Taub e outros (1994) Ther. Immunol., 1:229-46; Baggliolini e outros (1994) Adv. Immunol., 55:97-179; and Haelens e outros (1996) Immunobiol, 195: 499-521; Taub> Cytokine Growth Factor Res., 7:355-76, 1996; Dong e outros, Eur. J. Dermatol., 13:224-30, 2003; Pastore e outros, Eur. J. Dermatolf 14:203-8, 2004: Charo and Ransohoff, N Eng J Med., 354:610-21, 2006).
As quimiocinas também induzem ativação das células, incluindo, porém não limitado ao micróglia e macrófagos. Assim, acredita-se que as quimiocinas induzam a produção e liberação das espécies reativas em oxigênio, enzimas de degradação e citocinas inflamatórias e tóxicas de várias populações de leucócitos. Além disto, as citocinas mostraram regular a proliferação do progenitor hematopoiético negativo e várias quimiocinas CXC podem regular a angiogênese. As quimiocinas também desempenham um papel nas muitas doenças que envolvem destruições do tecido inflamatório, tais como síndrome de angústia respiratória de adulto, infarto do miocárdio, artrite reumatóide e aterosclerose.
As quimiocinas foram originalmente denominadas, por exemplo, de acordo com suas funções ou origens. A denominação mais comum para um dado ligante é empregada o texto no presente documento. A nomenclatura sistemática recente foi adotada a qual utiliza o nome do grupo da quimiocina seguido por um número. Por exemplo, a proteína quimioatrativa do monócito de ligantes (MCP)-I e intercleucina (IL)-8 são sistematicamente referidas como CCL2 e CXCL8, respectivamente. Seus receptores são referidos como CCR2 e CXCR1/2, respectivamente (Tabela χ e 7; Bacon, e outros, J. Interferon Cytokine Res., 22: 1067- 8, 2002; Murphy, Pharmacol. Rev, 54: 227-9, 2002; Murphy e outros, Pharmacol. Rev., 52: 145-76, 2000). As quimiocinas e os receptores da quimiocina são referidos no presente documento intercambiavelmente com referência a nomenclatura comum e sistemática. Dada uma denominação, um versado na técnica sabe ou poderia determinar as denominações correspondentes.
i. Ligantes
As quimiocinas, conforme citadas acima, são uma superfamilia de citocinas quimioatrativas secretadas, induziveis, pequenas (aproximadamente cerca de 6 a cerca, de 14 kDa) que atuam primariamente nos subtipos de leucócito. Os ligantes de quimiocina possuem entre 15 e 50% de identidade em suas estruturas primárias, porém é sua estrutura tridimensional conservada altamente compartilhada que é a responsável pela ligação e ativação do receptor. Ά superfamilia é dividida em quatro subfamílias com base na posição (ou existência) de quatro resíduos de cisteína conservados nas seqüências primárias. Três dos grupos contêm quatro cisteínas, o outro grupo não. Os grupos são definidos pelo arranjo das duas primeiras cisteínas. Se as duas primeiras cisteínas forem separadas por um aminoácido simples elas serão membros da família CXC (também denominada alfa); se as cisteínas forem adjacentes, elas serão classificadas na família CC (também denominada beta); se as cisteínas forem separadas por três aminoácidos CX3C, elas serão membros do terceiro grupo (também denominado delta). 0 quarto grupo de quimiocinas, C ou gama, contém duas cisteínas, correspondendo a primeira e terceira cisteínas nos outros grupos.
A análise estrutural demonstra que a maior parte das quimiocinas funciona como monômeros e que as duas regiões necessárias para a ligação do receptor residem dentro dos primeiros 35 aminoácidos do término N flexível do polipeptídeo maduro (Clark-Lewis e outros (1995) J. Lekocyte Biolf 57:703-11; Beall e outros (1996) Biochem. J. 313:633-40; e Steitz e outros (1998) FEBS Lett 430:158-64). Os dímeros das quimiocinas podem ser formados, esta formação variando entre as quimiocinas. A formação dos dímeros ocorre tipicamente em concentração alta na solução (Baggiolini e outros (2001) J. Int. Med., 250:91-104). Os dímeros, contudo, dissociam mediante diluição e os monômeros constituem a molécula biologicamente ativa.
Em geral, os elementos da alfa quimiocina preferivelmente são ativos nos neutrófilos e linfócitos T e as beta quimiocinas são ativas nos monócitos, macrófagos, eosinófilos e linfócitos T. Adicionalmente, vários elementos das subfamílias das alfa e beta quimiocinas são ativas nas células dendríticas, que são células migratórias que exibem propriedades de apresentação de antígeno potentes seguindo-se sua ativação e maturação das células fagocíticas imaturas e acredita-se participem na patofisiologia das muitas doenças inflamatórias (por exemplo, Xu e outros, J. Leukoc. Biol, 60: 365-71, 1996; e Sozzani e outros, J. Immunol, 159: 1993-2000, 1997; Hashimoto e outros, J Dermatol Sci, 44: 93-9, 2006; van Rijt e outros, J. Exp. Medr 201: 981-91, 2005). Uma quarta quimiocina do tipo CX3C humana referida como fractalcina foi recentemente reportada (Bazan e outros, Naturer 555:640-4, 1997; Imai e outros, Cellt 91:521-30, 1997; Mackay, Curr. Biol 7: R384-6, 1997). Diferente das outras quimiocinas, a fractalcina existe na membrana e formas solúveis. A forma solúvel é um quimioatrativo potente para monócitos e células Τ. 0 receptor de superfície da célula para esta quimiocina é denominado CX3CR1. Deve ser observado que pode haver diferenças sutis entre a natureza química e os efeitos fisiológicos das quimiocinas derivadas de diferentes espécies (Baggliolini e outros, Adv. Immunolr 55:97-179, 1994; and Haelens e outros, Immunobiolr 195:499- 521, 1996). A tabela 4 estabelece quimiocinas exemplares incluindo sinônimos para as mesmas e exemplos das SEQ ID Nos. Adicionalmente, a Tabela 4 estabelece a seqüência de sinal e posições de aminoácido codificando as quimiocinas maduras com referência às posições na respectiva SEQ ID NO. Deve ser observado que a descrição das posições dos aminoácidos é apenas ilustrativa e não se destina a limitar o escopo das modalidades providas. Fica entendido que os polipeptideos e suas descrições são teoricamente derivados com base na análise da homologia e alinhamentos com polipeptideos semelhantes. Assim, o local exato pode variar e não é necessariamente o mesmo para cada polipeptideo. As variantes alélicas ou de espécies das quimiocinas também são conhecidas. Exemplos de variações alélicas nas quimiocinas exemplares são estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOS: 170-191.
TABELA 4: Exemplos de Ligantes de Quimiocina
Quimlocina Sinônimos UniProt NO: Seqüência de sinal Quimiocina Madura SEQ ID NO: MCP-I (Proteina-1 quimioatrativa de monócito) CCL2; Citocina induzivel pequena A2; MCAF; Proteína secretora de monócito JE; HCll; SCYA2 P13500 1-23 24-99 11 2 Eotaxina (Proteína quimiotática eosinófila) CCLll; Citocina induzivel pequena Ali; SCYA 11 P51671 1-23 24-97 11 3 SDF-Ιβ(Fator 1 derivado de célula estromal) CXCL12; Fator de estimulação do crescimento de célula pré-B(PBSH); hlRH P48061 1-21 22-93 11 4 GRO-a (proteína alfa regulada do crescimento) CXCLl; Atividade de estimulação do crescimento de melanoma (MGSA); Proteína 3 de ativação de neutrófilo (NAP-3); SCYBl P09341 1-34 35-107 11 5 Quxmiocina Sinônimos UniProt NO: Seqüência de sinal Quimiocina Madura SEQ ID NO: ΜΙΡ-1β (proteína 1-beta inflamatória de macrófago) CCL4; Citocina induzível pequena A4; proteína 2 de ativação de célula T; ACT-2; PAT 744; H400; SIS-γ; Proteína 1 gene de ativação de linfócito (LAG-I); HC21; proteína secretada de linfócito T G-2 6; SCYA4 P13236 1-23 24-92 11 6 IL-8 (Interleucina-8) CXCL8; Fator quimiotático de neutrófilo derivado de monócito (MDNCF); fator quimiotático de célula T; proteína 1 de ativação de neutrófilo (NAP-I); Proteína 3-10C; Proteína 1 quimiotática de granulócito (GCP-I); Peptídeo de ativação de neutrófilo derivado de monócito (MONAP); Emoctacina P10145 1-20 21-99 117 IP-IO (Proteína 10 induzível por interferon) CXCL 10; Citocina induzível pequena BlO; Proteína induzida por interferon-gama de 10 kDa; Y-IP10; SCYBlO P02778 1-21 22-98 118 MCP-3 (Proteína 3 quimiotática de monócito) CCL7; Citocina induzível pequena A7; NC28; SCYA7 P80098 1-23 24-99 119 MIP-3a (Proteína 3 alfa inflamatória de macrófago) CCL20; Citocina induzível pequena A20; Quimiocina regulada por ativação e fígado (LARC); Beta quimiocina exodus- 1; SCYA20 P78556 1-26 27-96 120 , MDC (Quimiocina derivada de macrófago) CCL22; Citocina induzível pequena A22; Proteína 1 quimiotática de célula T estimulada (STCP-I); SCYA22 000626 1-24 25-93 121 MIP-Ia (Proteína 1-alfa inflamatória de macrófago) CCL3; Citocina induzível pequena A3; Proteína alfa LD78 de linfócito tonsilar; proteína reguladora de comutação GO/Gl 19-1 (proteína GOSl9); SIS-β; PAT 464, 1; SCYA3 P10147 1-23 24-92 122 BCA-I (Quimiocina 1 atrativa de célula B) CXCLl3; Citocina induzível pequena Bl3; Quimioatrativo de linfócito B; CXC quimiocina BLC; ANGIE; SCYB13 043927 1-22 23-109 123 Quimiocina Sinônimos UniProt NO: Seqüência de sinal Quimiocina Maduca SEQ ID NO: GCP-2 (Proteína 2 quimiotática de granulócito) CXCL6; Citocina induzível pequena B6; Quimiocina alfa 3 (CKA-3); SCYB6 P80162 1-37 38-114 124 ENA-78 (Proteína 78 de ativação de neutrófilo derivada de epitélio) CXCL5; Citocina induzível pequena B5; SCYBS P42830 1-36 37-114 125 PBP (Proteína básica de plaqueta) CXCL7; Citocina induzível pequena B7; Fator de crescimento derivado de leucócito (LDGF); Fator de crescimento derivado de macrófago (MDGF); Peptídeo III de ativação de tecido conjuntivo (CTAP-III); Fator IV de plaqueta de baixa afinidade (LA-PF4); TC-2; β-tromboglobulina; Peptídeo 2 de ativação de neutrófilo (NAP-2); SCY B7 P02775 1-34 35-128 126 MlG (Monócito induzido por interferon gama) CXCL9; Citocina induzível pequena B9; SCYB9 Q07325 1-22 23-125 127 PF-4 (Fator 4 de plaqueta) CXCL4; Oncostatina A; Ironplact; SCYB4 P02776 1-31 32-101 128 PF-4varl (Variante de fator 4 de plaqueta) CXCL4L1; PF4alt; PF4V1; SCYB4V1 P10720 1-30 31-104 129 SDF-2 (Fator 2 derivado de célula estromal) Q99470 1-18 19-211 130 MCP-2 (Proteína 2 quimiotática de monócito) CCL8; Citocina induzível pequena A8; HCl 4; SCYAlO; SCYA8 P80075 1-23 24-99 131 MCP-4 (Proteína 4 quimiotática de monócito) CCL13; Citocina induzível pequena A13; CK-beta-10; NCC-I; SCYA13 Q99616 1-16 17-98 132 MIP-4 (Proteína 4 inflamatória de macrófago) CCL18; Citocina induzível pequena A18; Quimiocina regulada por ativação e pulmonar(PARC); Quimiocina 1 CC associada a ativação de macrófago alternativa (AMAC-I); Quimiocina 1 de célula dendrítica (DC-CKl) P55774 1-20 21-89 133 Quimiocina Sinônimos UniProt NO: Seqüência de sinal Quimiocina Madura SEQ ID NO: ΜΙΡ-3β (Proteína 3-beta inflamatória de macrófago) CCLl9; Citocina induzivel pequena A19; EBll- quimiocina de ligante (ELC); Beta quimiocina exodus-3; CK β-ll; SCYAl9 Q99731 1-21 22-98 134 MIP-2a (Proteína 2-a inflamatória de macrófago) CXCL2: Proteína beta regulada de crescimento (GRO-β); GR02; GROB; SCYB2 P19875 1-34 35-107 135 MIP-2 β (Proteína 2-beta inflamatória de macrófago) CXCL3; Proteína gama regulada de crescimento (GRO-γ); GR03; GROG; SCYB3 P19876 1-34 35-107 136 MIP-5 (Proteína 5 inflamatória de macrófago) CCL15; Citocina induzivel pequena A15; Quimiocina CC-2; HCC- 2; NCC-3; MIP-16; Leueotaetina; LKN-1; Mrp-2b; SCYA15 Ql6663 1-21 22-113 137 HCC-I (Quimiocina 1 de hemofiltrado CC) CCL14; Citocina induzivel pequena Al 4; Quimiocina CC-l/CC-3; HCC-1/11CC-3; NCC-2; SCYAl4 Q16627 1-19 20-93 138 RANTES (Célula T expressa, e secretada, regulada por ativação, normal) CCL5; Citocina induzivel pequena A5; SIS-δ; Proteína específica para célula T P228 (TCP228); SCYA5 P13501 1-23 24-91 139 Eotaxina-2 (Proteína 2 quimiotática eosinófila) CCL24; Citocina induzivel pequena A24; Fator 2 inibidor de progenitor de mielóide (MPIF-2); CK-β- 6; SCYA24) 000175 1-26 27-119 140 TARC (Quimiocina regulada por ativação e timo) CCL17; Citoeina induzivel pequena A17; SCYA17 Q92583 1-23 24-94 141 Proteína 1-309 secretada por linfócito T CCLl; Citocina induzivel pequena Al; SCYA 1 P22362 1-23 24-96 142 Linfotactina XCLl; Citocina induzivel pequena Cl; Citocina SCM-I; ATAC; Linfotaxina; SCM-I- alfa; XC ligante 1 de quimiocina; SCYCl P47992 1-21 22-114 143 Lungcina CXCLl5; Citocina induzivel pequena B15; SCYB 15 Q9WVL17 1-25 26-167 144 Quimxocina Sinônimos UniProt NO: Seqüência de sinal Quimiocina Madura SEQ XD NO: ClO CCL6; Citocina induzivel pequena A6; SCYA6 P27784 1-21 22-116 145 ΜΙΡ-Ιγ (Proteína 1-gama inflamatória de macrófago) CCL9; CCL10; Citocina induzivel pequena A9; Proteína 2 relacionada à proteína inflamatória de macrófago (MRP-2); CCF18: SCYA9; SCYAlO P51670 1-21 22-122 146 MCP-5 (Proteína 5 quimiotática de monócito) CCL12; Citocina induzivel pequena A12; Quimiocina relacionada à MCP-I; SCYA12 Q62401 1-22 23-104 147 LEC (Quimiocina expressa no fígado) CCLl6; Citocina induzivel pequena A16; Quimiocina induzivel IL-10; Monotactina-1 (MTN-I); HCC-4; NCC-4; Quimioatrativo de linfócito e monócito (LMC); LCC-1; ILINCK; SCYAl6 015467 1-23 24-120 148 Exodus-2 CCL21; Quimiocina induzivel pequena A21; 6Ckine; Quimiocina de tecido-Iinfóide secundária (SLC); SCYA21 000585 1-23 24-134 149 MIP-3 (Proteína 3 inflamatória de macrófago) CCL23; Citocina induzivel pequena A23; Fator 1 inibidor do progenitor de mielóide (MPIFl); CK-beta-8; CKB-8; SCYA23 P55773 1-21 22-120 150 TECK (Quimiocina expressa no timo) CCL25; Citocina induzivel pequena A25; SCYA25 015444 1-23 24-150 151 Eotaxina-3 CCL2 6; Citocina induzivel pequena A26; Proteína 4-alfa inflamatória de macrófago (ΜΙΡ-4-alfa); Quimiocina-I de estroma timico (TSC-I); IMAC; SCYA2 6 Q9Y258 1-23 24-94 152 CTACK (Quimiocina atrativa de célula T cutânea) CCL27; Citocina induzivel pequena A27; ILC; IL-Il Local R-alfa quimiocina; Skinkine; ESkine; SCYA27 Q9Y4X3 1-24 25-112 153 MEC (Quimiocina de epitélio associada a mucosa) CCL28; Citocina induzivel pequena A28; CCKl; SCYA28 Q9NRJ3 1-19 20-127 154 Quimiocina Sinônimos UniProt NO: Seqüência de sinal Quimiocina Maduca SEQ ID NO: SCSI-Iβ (Motivo-1 beta Simples C) XCL2; Ligante 2 de quimiocina XC; SCM-lb; SCYC2 Q9UBD3 1-21 22-114 155 I-TAC (Quimioatrativo alfa de célula T induzível por interferon) CXCLll; Citocina induzível pequena Bl 1; Proteína 9 induzível interferon-gama (IP- 9); H174; β-Rl; SCYB9B; SCYBll 014625 1-21 22-94 156 BRAK (Quimiocina expressa nos rins e mama) CXCL 14; Citocina induzível pequena B14; Bolecina; NJAC; SCYB14 095715 1-22 23-99 157 SR-PSOX (Receptor depurador para fosfatidilserina e lipoproteina de baixa densidade oxidada) CXCLI6; Citocina induzível pequena Bl 6; SCYBl6 Q9H2A7 1-29 30-254 158 Fractalcina CX3CL1; Citocina induzível pequena Dl; Neurotactina; Quimiocina ancorada em membrana CX3C; FKN; SCYDl 035188 1-24 25-395 159 LD78-P CCL3L1; Citocina induzível pequena A3-tipo 1 ; Proteína beta de linfócito tonsilar LD78; Proteína reguladora de comutação G0/G1 19-2 (Proteína G0S19-2); PAT 464,2; SCYA3L1 P16619 1-23 24-93 160 MIP-lb2 (Proteína inflamatória de macrófago-lb2) CCL4L1; Ligante de quimiocina CC 4L1 Q8NHW4 1-23 24-92 161
ii. Receptores de Quimiocina
Quimiocinas mediam suas atividades através dos receptores de superfície de célula semelhante à rodopsina, de sete transmembranas, acoplada a proteína G. Tipicamente, as quimiocinas CXC se ligam a um ou mais dos sete receptores de CXC (CXCR1, 2, 3A, 3B, 4, 5, 6), enquanto as quimiocinas CC se ligam a um ou mais dos onze receptores de CC (CCR1, 2A, 2B, 3-10). Outros receptores de quimiocina incluem XCRl, CX3CR, D6, CKX-CKR e Duffy (também conhecidos como receptor de antígeno Duffy para quimiocinas ou DARC). DARC, D6 e CKX-CKR são receptores depuradores de quimiocina que podem unir os ligantes de quimiocina de todos os quatro grupos (Hansell e outros, Biochem Soc Trans., 34:1009-13, 2006; Locati e outros, Cytokine Growth Factor Rev., 16: 679-86, 2005). Exemplos de receptores de quimiocina incluem, porém não estão limitados ao receptor de antigeno de Duffy para quimiocinas (DARC), CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3A, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CXCR-6, CXCR-7, CCR-1, CCR-2A, CCR- 2B, CCR-3, CCR-Af CCR-5, CCR-6, CCR-Ir CCR-8, CCR-9, CCR10, CX3CR-1, XCRl, D6 e outros receptores de quimiocina.
A ligação do receptor de quimiocinas às suas células alvejadas é uma área de investigação complexa e muito envolvente. Geralmente, os receptores se unem aos vários ligantes em um modo de sobreposição e complexo. As células inflamatórias expressam tipicamente vários receptores de quimiocina e, mais de uma quimiocina pode se ligar a um receptor. Por exemplo, o receptor de beta quimiocina CCR3 se liga não apenas a MCP-3, MCP-4 e RANTEs, porém, também às três outras quimiocinas CC, Eotaxina, Eotaxina-2 e Eotaxina-3 (He e outros, Naturet 385: 645-49, 1997; Jose e outros, J. Exp. Med., 179: 881-7, 1994; Jose e outros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 205: 788-94, 1994; Ponath e outros, J. Clin. Invest., 97: 604-12, 1996; Daugherty e outros, J. Exp. Med. 183: 2349-54, 1996; e Forssman e outros, J. Exp. Med., 185: 2171-6, 1997). Eotaxina, Eotaxina-2 e -3 são especificas para CCR3 (Ponath e outros, J. Clin. Invest., 97: 604-12, 1996; Daugherty e outros, J. Exp. Med. 183: 2349-54, 1996; e Forssman e outros, J. Exp. Med., 185: 2171-6, 1997; Kitaura e outros, J Biol Chem., 274: 27975-80, 1999). Um segundo exemplo é o coreceptor de alfa-quimiocina CXCR4 (fusina) HIV. Várias isoformas do fator derivado de célula estromal da quimiocina (SDF) incluindo SDF-la, SDF-Ιβ e SDF-2 foram identificados, os quais se ligam especificamente ao seu receptor, que está presente nos vários subconjuntos das células inflamatórias e são atrativos de célula MNP altamente potentes (Ueda e outros, J. Biol. Chem., 272: 24966-70, 1997; Yi e outros, J. Virol., 72: 772- 7, 1998; Shirozu e outros, Genomicsf 28: 495-500, 1995; Shirozu e outros, Genomics, 37: 273- 80, 1996; Bleul e outros, J. Exp. Med., 184: 1101-9, 1996; Tanabe e outros, J. Immunol. 159: 905-11, 1997; e Hamada e outros, Gene, 176: 211-4, 1996; Yu e outros, Gene 374: 174-9, 2006).
Em alguns exemplos, a ligação das quimiocinas aos receptores específicos é afetada pela presença ou ausência de motivos de aminoácido específicos, tais como, por exemplo, um motivo ELR tripeptídeo (Glu-Leu-Arg). A ligação do receptor de CXC é afetada por tal motivo. As quimiocinas positivas ELR geralmente se ligam ao receptor CXCR2, são angiogênicas e preferivelmente tem como alvo os neutrófilos. Em contraste, as quimiocinas negativas ELR se ligam ao CXCR3 e 5 são antiangiogênicas e preferivelmente tem como alvo linfócitos T, células NK, células dendríticãs imaturas (IDC) e células endoteliais ativadas. A quimiocina negativa ELR SDF-Ιβ(CXCR4) bem como algumas quimiocinas CC incluindo MCP-I (CCR2) também são angiogênicas (Strieter e outros (2005) Cytokine Growth Factor Res., 16:593-609; Salcedo e outros (2000) Blood 96: 34-40). As quimiocinas também se ligam à heparina da superfície da célula e glicosaminoglicanos de um modo que se acredite facilitar a manutenção de gradiente necessária para ativação e transporte de leucócito (extravasamento) da circulação no tecido inflamado (Schall e outros, Current Biol., 6: 865- 73, 1994; e Tanaka e outros, Immunology Today, 14: 111-15, 1993; Neel e outros, Cytokine Growth Factor Rev., 16:637- 58, 2005; Johnson e outros, Biochem. Soe. Trans., 32: 366- 77, 2004).
A tabela 5 estabelece a quimiocina/ especificidades agonísticas da quimiocina para quimiocinas exemplares e seus receptores. Deve ser observado que determinadas quimiocinas mostraram se ligar aos receptores de quimiocina diferentes em um modo antagonistico. Os dados apresentados na Tabela 5 se referem aos seres humanos. Podem haver diferenças de espécie entre as especificidades do receptor de quimiocina e as quimiocinas podem apresentar diferentes afinidades para diferentes receptores. Consequentemente, conjugados específicos para espécies, bem como específicos para receptor podem ser preparados. Podem existir também diferenças alélicas nos receptores entre os elementos de uma espécie e, caso necessário, conjugados específicos para alelo podem ser preparados. Além disso, espécies diferentes expressam homólogos de quimiocinas humanas. Por exemplo, TCA-3 é o homólogo de murina de 1-309 humana. (I. Goya e outros (1998) J. Immunol., 160: 197 5- 81).
TABELA 5: Exemplos de Especificidades de
Receptor-Ligante de Quimiocina
Ligante de Quimiocina Receptores de Quimiocina MCP-I (Proteína-1 quimioatrativa de monócito) CCR2; D6 Eotaxina (Proteína quimiotática de eosinófilo) CCR3; CCR5 SDF-Iβ (Fator 1 derivado de célula estromal) CCR4, CXCR7 GRO-α (Proteína alfa regulada de crescimento) CXCR2; CXCRl; Duffy MIP-Ιβ (Proteína 1-beta inflamatória de macrófago) CCR5; D6 IL-8 (Interleucina-8) CXCRl; CXCR2; Duffy IP-IO (Proteína-10 induzível por interferon) CXCR3A; CXCR3B MCP-3 (Proteína 3 quimiotática de monócito) CCRl; CCR2; CCR3 MIP-3a (Proteína 3 alfa inflamatória de macrófago) CCR6 MDC (Quimiocina derivada de macrófago) CCR4 Lxgante de Quimiocxna Receptores de Quimiocina MIP-Ia (Proteína 1-alfa inflamatória de macrófago) CCRl; CCR5 BCA-I(Quimiocina 1 atrativa de célula B) CXCR5 GCP-2 (Proteína 2 quimiotática de granulócito) CXCRl; CXCR2 ENA-78 (Proteína 78 de ativação de neutrófilo derivada de epitélio) CXCR2 MIG (Monocina induzida por interferon gama) CXCR3A; CXCR3B SDF-2 (Fator 2 derivado de célula estromal) Desconhecido MCP-2 (Proteína 2 quimiotática de monócito) CCRl; CCR2; CCR3; CCR5; D6 MCP-4 (Proteína 4 quimiotática de monócito) CCRl; CCR2; CCR3; D6 MIP-4 (Proteína 4 inflamatória de macrófago) Desconhecido ΜΙΡ-3β (Proteína 3-beta inflamatória de macrófago) CCR7; CCRll MIP-2oí (Proteína 2-alfa inflamatória de macrófago) CXCR2 ΜΙΡ-2β (Proteína 2-beta inflamatória de macrófago) CXCR2 MIP-5 (Proteína 5 inflamatória de macrófago) CCRl; CCR3; D6 HCC-I (Quimiocina 1 de hemofiltrado CC) CCRl; CCR5; D6 RANTES (Célula T expressa, e secretada, regulada por ativação, normal) CCRl; CCR3; CCR5; Duffy; D6 Eotaxina-2 (Proteína 2 quimiotática de eosinófilo) CCR3 TARC (Quimiocina regulada por ativação e timo) CCR4 Proteína 1-309 secretada por linfócito T CCR8; Duffy Linfotactina XCRl Lungcina Desconhecido ClO CCRl ΜΙΡ-Ιγ (Proteína 1-gama inflamatória de macrófago) CCRl MCP-5 (Proteína quimiotática de monócito 5) CCR2; CCR3 LEC (Quimiocina expressa no fígado) CCRl; CCR2; CCR5; CCR8 Exodus-2 CCR7; CCRll MIP-3 (Proteína 3 inflamatória de macrófago) CCRl TECK (Quimiocina expressa pelo Timo) CCR9; CCRll Eotaxina-3 CCR3 CTACK (Quimiocina atrativa de célula T cutânea) CCRlO MEC (Quimiocina de epitélio associada à mucosa) CCRlO SCM-Iβ (Motivo 1-beta simples C) XCRl I-TAC (Quimioatrativo de célula T alfa induzível por interferon) CXCR3A; CXCR3B BRAK (Quimiocina expressa nos rins e mama) Desconhecido Ligante de Quimiocina Receptores de Quimiocina SR-PSOX (Receptor depurador para fosfatidilserina e lipoproteína de baixa densidade oxidada) CXCR 6 Fractalcina CX3CR1 ]Λ378-β CCR5; D6 MIP-lb2 (Proteína lb2 inflamatória de macrófago) CCR5
iii. Perfil Celular da Quimiocina/Receptor da
Quimiocina
Cada receptor de quimiocina possui uma especificidade de leucócito distinta, embora as várias especificidades de leucócito-receptor da quimiocina possam se sobrepor consideravelmente (vide, por exemplo, Tabela 6). Por exemplo, subtipos de receptor distintos específicos para a mesma quimiocina e a mesma função podem ser coexpressos na mesma célula. Adicionalmente, os ligantes de quimiocina distintos atuando em receptores separados na mesma célula podem induzir a mesma resposta celular. Adicionalmente, ligantes de quimiocina diferentes podem èe ligar a um receptor comum e induzem respostas celulares diferentes na célula alvejada. A maioria das quimiocinas se liga aos receptores expressos nos leucócitos, especificamente leucócitos ativados, embora alguns receptores de quimiocina possam ser expressos em outros tipos de célula, tais como, várias células residentes de tecido, por exemplo, hemácias, plaquetas, astrócitos, células endoteliais, neurônios, células epiteliais, células adiposas e células micróglia do cérebro. A tabela 6 inclui uma lista exemplar não exaustiva dos receptores de quimiocina e estabelece um conjunto exemplar de subtipos de leucócito e outros tipos de células que são conhecidos por expressar cada receptor de quimiocina sob várias circunstâncias de doença e saudáveis.
TABELA 6 - Especificidades do Receptor de Quimiocina-Leucócito Receptor de Quimiocina. Subtipo(s) de Leucóoito CCRl Célula NK; Célula T; IDC; MNP; ΤΑΜ; Basófilo; Eosinófilo; PMN; Plaqueta CCR2 Célula NK; Célula B; Célula T; IDC; MNP; Basófilo; PMN CCR3 Célula T; Th2; MDC; Basófilo; Eosinófilo; Plaqueta; Mac CCR4 Timócito; Célula NK; Célula T; Th2; IDC; MDC; MNP; Basófilo; Plaqueta CCR5 Timócito; Célula NK; Célula B; Célula T; Thl; IDC; MDC; MNP; GC; ΤΑΜ; Adipócito CCR6 Célula B; Célula T; IDC CCR7 Célula B; Célula T; MDC CCR8 Timócito; Célula B; Célula T; Th2; IDC; MDC; MNP CCR9 Timócito; Célula T; MDC; MNP CCRlO Célula T CXCRl MNP; PMN; MaC; Astrócito CXCR2 MNP; Eosinófilo; PMN; MaC CXCR3A Célula NK; Célula B; Célula T; Thl; MaC CXCR3B Célula NK; Célula B; Célula T CXCR 4 Timócito; Célula B; Célula T; IDC; MDC; MNP; GC; PM; Plaqueta; Adipócito; Astrócito CXCR5 Célula B; Célula T; Astrócito CXCR6 Célula NK; Célula T XCRl Célula NK; Célula T CX3CR1 Célula NK; Célula T; MNP; PMN; Astrócito
Legenda: NK = exterminador natural; Thl = célula
T auxiliar do tipo 1; Th2 = célula T auxiliar do tipo 2; IDC = célula dendritica imatura; MDC = célula dendritica madura; MNP = fagócito mononuclear (monócitos, macrófagos e micróglia); GC = célula gigantes (macrófago fundido multinucleado); TAM = macrófago associado a tumor; PMN = neutrófilo polimononuclear; MaC = mastócito. Observação: A tabela acima representa uma lista exemplar, não exaustiva dos tipos de célula que expressam receptores de quimiocina específicos.
Cada tipo de célula possui um perfil de receptor de quimiocina que é semelhante a uma impressão digital ou "quimioimpressão" que depende do tipo de célula específico, tipo de função, tipo de tecido, estado da doença e tipo de doença, estado de desenvolvimento do tipo de célula, estado de ativação dos receptores celulares e o ambiente extracelular, incluindo tipos de célula circundante e moléculas. Por exemplo, as células de linhagem monocitica tendem a estar associadas aos receptores de CXCR4 e CCR1-3 e 5; eosinófilos e basófilos com CCR1-3 e CXCR3 e 4; PMN com CXCRl, 2 e CCRl; células B com CCR1-7 e CXCR3-5; as células Thl com CXCR3 e CCR5 e finalmente, as células Th2 com CCR2, 3, 4 e 8 (por exemplo, Baggiolini, J. Intern. Med., 250: 91-104, 2001).
Em geral, as afinidades de ligação, especificidades e a distribuição diferencial dos subtipos de receptor através das células alvejadas determina a contribuição que uma dada quimiocina fará ao processo inflamatório. O perfil biológico de uma dada quimiocina determinada em um ajuste pode não ser verdade em outra, mais especialmente se a taxa e o estado de ativação das células alvejadas alterarem durante trauma ou doença. Consequentemente, o perfil biológico de uma dada quimiocina, se necessário, pode ser estabelecido em uma base de caso a caso. Por exemplo, os efeitos da proteína-3 quimiotática de monócito (MCP-3) são semelhantes aos de MCP-1, porém o precedente se liga a uma faixa mais ampla de células e receptores. Além da expressão de receptor diferente em células diferentes, os números do receptor expressos nas superfícies da célula podem variar. Por exemplo, CCRl e CCR2 são expressos na taxa de 3.000 receptores por monócito e linfócito, considerando-se que existem cerca de 50.000 receptores CCR3 nos eosinófilos (Borish and Steinke, J Allergy Clin Immunol., 111:S460- 75,2003). Tais diferenças podem ter implicações na direção da migração e tempos de resposta. Por exemplo, a alta densidade de CXCR4 nas células T se correlaciona à morte mais rápida induzida por HIV, e uma densidade mais alta de receptores incluindo CCR2 e CCR4 está associada ao recrutamento de células T alveolares em pacientes com asma alérgica (Kallinich e outros (2005) Clin. Exp. Allergy 35, 26-33; Lelievre e outros (2004) AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 1230-43).
Da mesma forma, os perfis do receptor dá quimiocina freqüentemente alteram até que o trauma ou doença continue. Os eixos do receptor/ligante da quimiocina são classificados como constitutiva/homeostática, induzivel/inflamatória ou ambos (vide, por exemplo, Tabela 7). Portanto, os ligantes da quimiocina inflamatória e seus receptores não são necessariamente expressos até o aparecimento da doença ou trauma. Por exemplo, células quiescentes rapidamente mudarão e reguralão positivamente a expressão do receptor uma vez ativadas (por exemplo, Ghirnikar, e outros (2000) Neurosci. Res. 59:63-73: Henneken e outros (2005) Artrite Res. Ther. 7: R1001-13; Klitgaard e outros (2004) Acta. Ophthalmol. Scand. 82: 179- 83; McDonald e outros (2001) IDrugs 4: 427-42). A identidade de uma quimioimpressão também depende dos tipos e abundância de mediadores inflamatórios e não inflamatórios no meio (por exemplo, Porcheray e outros (2006) Virology 349: 112-20; Stout and Suttles (2004) J. Leukoc. Biol. 76: 509-13; Sozzani (2005) Cytokine Growth Factor Res. 16: 581-92; Mantovanni e outros, Trends Immunolr 25: 677-86, 2004; Ben-Baruch, Câncer Metastasis Rev., 2006, publicados antes da impressão). A Tabela 7 estabelece perfis de expressão exemplares dos eixos de quimiocina/receptor como uma conseqüências da função sob condições homeostáticas ou inflamatórias. TABELA 7: Membranas da Superfamília da Quimiocina de Ligantes e Receptores
Nome Sistêmico Ligante Receptor(es) Função Exemplar Quimiocinas CC CCLl 1-309 CCR8 Inflamatória CCL2 MCP-I CCR2 Inflamatória CCL3 MIP-Ia CCRl, CCR5 Inflamatória CCL4 MIP-Iβ CCR5 Inflamatória CCL5 RANTES CCRl, CCR3, CCR5 Inflamatória CCL6 Desconhecido Desconhecido Desconhecida CCL7 MCP-3 CCRl, CCR2, CCR3 Inflamatória CCL8 MCP-2 CCR3, CCR2 Inflamatória CCL9 Desconhecido Desconhecido Desconhecida CCLlO Desconhecido Desconhecido Desconhecida CCLll Eotaxina CCR3 Inflamatória CCL12 Desconhecido CCR2, CCR3 Desconhecida CCL13 MCP-4 CCR2, CCR3 Inflamatória CCL14 HCC-I CCRl Desconhecida CCL15 HCC-2 CCRl, CCR3 Desconhecida CCLl 6 HCC-4, LEC CCRl, CCR2, CCR5 Desconhecida CCL17 TARC CCR4 Inflamatória/Homeostática CCL18 DC-CKl Desconhecido Homeostática CCLl 9 ΜΙΡ-3β CCR7 Homeostática CCL20 ΜΙΡ-3α CCR 6 Inflamatória/Homeostática CCL21 SCL CCR7 Homeostática CCL22 MDC CCR4 Inflamatória/Homeostática CCL23 MPIF-I CCRl Desconhecida CCL24 MPIF-2 CCR3 Inflamatória CCL25 TECK CCR9 Homeostática CCL2 6 Eotaxina-3 CCR3 Inflamatória CCL27 CTACK CCRlO Homeostática CCL28 MEC CCRlO Inflamatória/Homeostática Quimiocinas C XCLl Linfotactina XCRl Desconhecida XCL2 SCMI-a XCRl Desconhecida Quimiocinas CXC CXCLl GROa CXCR2 Inflamatória CXCL2 GRO β CXCR2 Inflamatória CXCL3 GROy CXCR2 Inflamatória CXCL4 PF4 CXCR3A Desconhecida CXCL5 ENA-78 CXCR2 Desconhecida CXCL6 GCP-2 CXCRl, CXCR2 Desconhecida CXCL7 NAP-2 CXCR2 Desconhecida CXCL8 IL-8 CXCRl, CXCR2 Inflamatória CXCL 9 MIG CXCR3B Inflamatória CXCLlO 1P-10 CXCR3B Inflamatória CXCLll I-TAC CXCR3B Inflamatória CXCL12 SDF-la, SDF-1 β CXCR4, CXCR7 Desconhecida CXCL13 CXCLl4 CXCL15 CXCLl6 CX3CL1
BCA-I
BRAK
Desconhecido Desconhecido Desconhecido CXCR6 Fractalcina CX3CR1
CXCR5
Desconhecido
Homeostática Homeostática Desconhecida Inflamatória Inflamatória
Fica entendido que a Tabela
7 é apenas exemplar e
que a expressão de diferentes pares de quimiocina/receptor depende de vários fatores, tais como, porém não limitado ao estágio ou gravidade de uma doença. Por exemplo, determinados subtipos de leucócito podem não estar presentes até uma condição clinica ter alcançado um estágio especifico. Também, a expressão do receptor pode mudar. Por exemplo, os receptores de quimiocina antes da lesão por contusão na medula espinal dos ratos não são detectados. Δ expressão de CCR2, CCR3, CCR5, CCRlO e CXCR4 foi diferencialmente regulada positivamente de modo dependente do tempo de um dia após lesão a 14 dias após lesão (Ghirnikar, e outros (2000) Neurosci. Res., 59:63-73).
desempenham papéis proeminentes em doenças especificas. Por exemplo, o eixo MCP-1/CCR2 é importante em uma ampla faixa de doenças que inclui, porém não está limitada a artrite, asma, aterosclerose, restenose, esclerose múltipla, lesão a medula espinal (SCI) , cânceres e várias classes de doença renal crônica (CKD). Em outro exemplo, SDF-ip/CXCR4 é relevante na artrite e em vários cânceres incluindo câncer ovariano, da próstata, mama e cerebral. Em outro exemplo, os eixos MIG, IP-10, 1-TAC/CXCR3A são relevantes na rejeição ao transplante de órgão, diabetes do tipo 1, glomerulonefrite proliferativa (GN) e esclerose múltipla. Em outro exemplo, Eotaxina, Eotaxina-2 e Eotaxina-3/CCR3 são eixos importantes na asma, pneumonia eosinófila, esofagite e doenças inflamatórias da pele.
Na maioria dos casos, múltiplos ligantes de quimiocina e receptores de quimiocina são expressos em
Determinados
eixos
de ligante/receptor estados de doença específicos (por exemplo, Mantovani (1999) Immunol. Today 20: 254-7; Borish and Steinke (2003) J Allergy Clin. Immunolr 111: S460-75; Charo and Ransohoff, N Engl J Med. , 354:610-21, 2006). Por exemplo, em um modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) de esclerose múltipla (MS), células T podem expressar CCR5, CCR2 e CXCR3 (Matsui e outros (2002) J. Neuroimmunolr 128: 16-22). Em outro exemplo, em estudos de transmigração da barreira sangue cérebro (BBB) in vitro, o eixo MCP-1/CCR2 é importante para extravasamento do CNS de CCR2 expressando MNP e células T, embora as células T possam expressar CCR2, CCR5 e CXCR3 (Mahad e outros (2006) Brain 129:212-23; Callahan e outros (2004) J. Neuroimmunol., 153: 150-7). Assim, quando do estudo de doenças específicas ou tramas os perfis espaciais, temporais, biológicos e clínicos de qualquer dado eixo ou eixos de ligante/receptor podem ser estabelecidos na escolha do agente ou agentes alvo para o conjugado de toxina.
Além desta complexidade, nas condições patológicas, as células imunes e células residentes de tecido (TRC) contribuintes podem sofrer mudanças profundas no fenótipo e podem expressar receptores de quimiocina que não estão normalmente associados ao tipo de célula específico. Por exemplo, a despeito de uma preferência de quimiocina CXC por PMN, a quimioatração de PMN profunda por quimiocinas CC MPC-I e MIP-Ia ocorreu em um modelo de rato de vasculite séptica e um modelo murino de sepse (Johnston e outros (1999) J. Clin. Invest. 103:1269-76; Speyer e outros (2004) Am. J. Pathol. 165: 2187-96). As alterações do receptor também ocorrem na doença em MNP, linfócitos T e MaC. Elas podem ser induzidas para expressar CXCRl e CXCR2 em microambientes inflamatórios específicos (Smith e outros (2005) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289: H1976-84; Lippert e outros (2004) Exp. Dermatol. 13: 520-5). Eosinófilos freqüentemente expressam CCR2 funcional o receptor cognato para MCP-I (Dunzendorfer (2001) J. Allergy Clin. Immunol 108: 581-7).
iv. Exemplos de Agentes Alvo da Quimiocina Ligantes de quimiocina empregados nos conjugados de ligante-toxina providos no presente documento tipicamente são qualquer quimiocina com especificidade para pelo menos um receptor de quimiocina, porém tipicamente mais de um receptor de quimiocina, expresso em uma ou mais célula efetora imune, incluindo leucócitos ou outras células efetoras de contribuição, envolvidas no processo imunomodulador ou inflamatório, tal como, inflamação patológica, que promove lesão secundária do tecido. Tais receptores são geralmente elementos da superfamilia da proteína G acoplados, sete de domínio de transmembrana, receptores semelhantes a rodopsina, , incluindo, porém não limitados a, por exemplo, um ou mais do receptores conhecidos na técnica como receptor de antígeno Duffy para quimiocinas (DARC), D6, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3A, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CXCR-6, CXCR-7, CCR-I, CCR-2A, CCR-2B, CCR- 3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-Ir CCR-8, CCR-9, CCR10, CX3CR- 1, XCRl e outros receptores de quimiocina. Em alguns exemplos, a quimiocina selecionada para uso como um agente alvo em um conjugado provido no presente documento pode se ligar a um receptor específico, considerando-se que, em outros exemplos, a quimiocina selecionada pode ser ligar a mais de um receptor. Além disso, uma quimiocina selecionada para uso como um agente alvo em um conjugado pode exibir sobreposição e especificidades de receptor diferentes com outras quimiocinas (vide, por exemplo, Tabela 5).
Incluídos entre tais ligantes de quimiocina estão os estabelecidos na Tabela 4 acima, incluindo quaisquer quimiocinas alfa e beta e outros subgrupos semelhantes de quimiocinas. Mais especificamente, as quimiocinas presentemente preferidas para uso como a fração ligante proteinácea nos conjugados de ligante-toxina incluem, porém não estão limitadas às alfa-quimiocinas conhecidas na técnica como, IL-8; proteína 2 quimiotática de granulócito (GCP-2); oncogene-α relacionado ao crescimento (GRO-α) GRO- β e GRO-γ; peptídeo-78 de ativação de neutrófilo derivado da célula epitelial (ENA-78); peptídeo III de ativação de tecido conjuntivo (CTAP III; peptídeo-2 de ativação de neutrófilo (NAP-2); monocina induzido por interferon-γ (MIG); proteína 10 induzível por interferon (IP-10, que possui ações quimioatrativas potentes primariamente, porém não exclusivamente para neutrófilos e células T) ; fatores derivados de célula estromal SDF-la, SDF-Ιβ e SDF-2; as beta-quimiocinas conhecidas na técnica como as proteínas quimiotáticas de monócito MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, , MCP-5; as proteínas inf lamatórias de macrófagos MIP-Ioí, ΜΙΡ-1β, ΜΙΡ-1γ, MIP-2, ΜΙΡ-2α, ΜΙΡ-2β, ΜΙΡ-3α, ΜΙΡ-3β, MIP- 4, e ΜΙΡ-5; quimiocina derivada de macrófago (MDC); quimiocina 1 humana (HCC-I) ; RANTES; Eotaxina 1; Eotaxina 2; Eotaxina-3; TARC; SCYA17 e 1-309; quimiocina-1 de célula dendrítica (DC-CK-I); a γ-quimiocina, linfotactina; a forma solúvel da fractalcina quimiocina CX3C (que são quimioatrativas primariamente porém não exclusivamente para monócitos, macrófagos, eosinófilos e células T) ; e outros conhecidos dos versados na técnica; e quaisquer proteína sintéticas ou modificadas projetadas para se ligarem aos receptores de quimiocina. As quimiocinas podem ser isoladas de fontes naturais usando métodos de rotina ou expressas usando ácido nucléico codificando a quimiocina. As quimiocinas biologicamente ativas foram expressas recombinantemente em E.coli(por exemplo, aquelas comercialmente disponíveis na R&D Systems, Minneapolis, MN) .
Exemplos de outros agentes alvo de quimiocinâ incluem qualquer que liga e/ou ativa uma ou mais célulâá imunes, tais como, quaisquer células que promovem lesão secundária ao tecido, tais como, por exemplo, receptores depuradores LDL acilado 1 e 2, e os receptores para LDL, lipoproteína-1 de densidade muito baixa (VLDL-I), VLDL-2, glicoproteína 330/megalina, proteína relacionada ao receptor de lipoproteína (LRP) , alfa-2-macroglobulina,- sorLA-1. Uma proteína associada ao receptor especificamente útil, como ainda não denominada, possui um peso molecular de cerca de 39.000 Dalton e se liga e modula a atividade das proteínas, tal como, elementos da família de receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL).
Fica entendido que outras quimiocinas são conhecidas e que tais quimiocinas e receptores específicos para as mesmas podem ser identificados e, onde necessário, produzidos e empregados para produzir conjugados conforme descrito no presente documento. Conforme descrito em detalhes a seguir, as doenças para as quais os conjugados resultantes podem ser empregados podem ser determinadas pela especificidade e populações de células pelas quais os receptores para as mesmas são expressos e também podem ser determinadas empiricamente empregando modelos in vitro e in vivo conhecidos dos versados na técnica incluindo aqueles exemplificados, descritos e/ou referidos no presente documento.
b. Citocinas Diferentes da Quimiocinâ
Conjugados que incluem citocinas clássicas que são citocinas diferentes da quimiocinâ que ligam aos receptores da citocina específicos nos tipos de célula envolvidos na lesão secundária do tecido, incluindo qualquer que também expresse receptores de quimiocinâ/ também podem ser usados no conjugado provido no presente documento e nos métodos de geração dos conjugados providos no presente documento. Os conjugados que incluem tais citocinas clássicas vêm sendo usados para terapias, tratamentos de cânceres por ter como alvo as células tumorais. Pretende-se no presente documento, que as citocinas sejam selecionadas por sua capacidade de se ligarem às células portando receptor de quimiocina, tais como leucócitos que infiltram tumores e outras células associadas às respostas inflamatórias indesejáveis.
Embora as quimiocinas sejam ostensivamente classificadas como citocinas, elas são uma classe distinta das proteínas. Sua classificação como citocinas é mais histórica que atual. Quando novas proteínas são descobertas elas são denominadas, por exemplo, após sua atividade de origem ou sua fonte celular. Assim, anteriormente pensava- se que as citocinas fossem hormônios ou foram denominadas fatores de crescimento. Em razão das citocinas compartilharem muitas propriedades com os hormônios e os fatores de crescimento, a distinção se constituiu e ainda hoje é uma área nebulosa. Por exemplo, em um artigo de revisão (vide, por exemplo, Wells e outros (1996) Ann Rev Biochem (55:609-34) a frase "hormônio
hematopoiéticos/citocinas" é usada (uma referência à similaridade das atividades biológicas com os vários fatores de estimulação de colônia) para descrever as citocinas. Algumas atividades da citocina originalmente foram isoladas dos linfócitos e células monocíticas e foram denominados linfocinas e monocinas, respectivamente. Quando foi concluído que estas moléculas representam um amplo espectro de atividades e eram derivadas de vários tipos de células o termo "citocina" foi criado. As citocinas clássicas (proteínas de 12-40 kDa) incluem interferons (IFNs), fatores de necrose de tumor (TNFs) e interleucinas (assim denominadas porque sua atividade inclui comunicação entre leucócitos), fatores de crescimento hematopoiético, hormônio de crescimento, fator neurotrófico ciliar e outros. Estas citocinas regulam a proliferação e diferenciação de muitos tipos diferentes de células através dos receptores de citocina da classe I estruturalmente homólogos. Os receptores da classe I são tipicamente compostos de duas cadeias de polipeptídeo, uma subunidade específica de ligante e uma subunidade de transdução de sinal β. Esta classe de receptores pode ser subdividida na base de uma subunidade idêntica e a utilidade de uma terceira subunidade. Os interferons atuam através de um conjunto estruturalmente distinto de receptores de classe II (α, β e γ) . Existe agora uma família emergente de receptores de TNF distintos.
Os receptores de citocina geralmente sinalizam através da via de sinal intracelular JAK/STAT, porém também podem sinalizar através de outras cascatas de sinalização. Significativamente, nenhuma das citocinas, tais como, interleucinas, que se liga a estes receptores se liga: a qualquer um dos receptores de quimiocina estruturalmente distintos (descritos acima) e nenhum ligante de quimiocina se liga a qualquer um dos receptores de citocina descritos acima.
Consequentemente, referência às citocinas diferentes da quimiocina significa englobar citocinas clássicas. As citocinas diferentes da quimiocina que são úteis como frações de ligante para ter como alvo conjugados nos receptores das células, por exemplo, as células que também portam receptores da quimiocina, incluem, porém não se limitam ao polipeptídeo II de ativação de monócito endotelial (EMAP-II), fator de estimulação de colônia (CSF), granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF), granulócito-CSF (G-CSF), macrófago-CSF (M-CSF), interleucina-1 (IL-I), IL- la, IL-lb, interleucina-2 (IL-2) , interleucina-3 (IL-3) '·, interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL-β), interleucina 7 (IL-7), interleucina 8 (IL-8), interleucina 10 (IL-10), interleucina 12 (IL-12), interleucina 13 (IL-13), interleucina 15 (IL-15), interleucina 18 (IL-18), interferon alfa (IFNa) , interferon beta (IFNp) , interferon gama (IFNy), interferon omega (IFNco) , interferon tau (IFNx) , fator I de indução de interferon gama (IGIF), ligante Flt-3, eritropoetina (EPO), fator de necrose tumoral (TNF), um ligante de indução de proliferação (APRIL), ligante CD40, ligante CD30, ligante CD27, ligante fas, ligante 4-IBB, LIGHT, HVEM, TWEAK, GITRL, ligante de indução de apoptose relacionada ao TNF (TRAIL), citocina induzida por ativação relacionada ao TNF (TRANCE), ligante 1 expresso em leucócito relacionado ao ligante de apoptose e TNF (TALL-I) que se ligam às famílias dos receptores da citocina nas células envolvidas em uma resposta inflamatória, tal como nas células de promoção de lesão secundária no tecido.
Exemplos de receptores de citocina para ter como alvo por qualquer citocina diferente da quimiocina providos no presente documento incluem, porém não estão limitadas aos receptores da família da hematopoietina (por exemplo, receptores para IL-2 a IL-7 e GM-CSF), receptores da família interferon (por exemplo, receptores para IFNa, IFNp e IFNy), e receptores família de Fator de Necrose Tumoral (por exemplo, receptores para TNFa, linfotoxina, ligante Fas, LIGHT, BTLA, ligante CD40, ligante 4-IBB, ligante OX- 40 e outros incluindo, porém não limitado a qualquer receptor de TNF (TNFR), tal como, porém não limitado ao TNFRl, TNFR2, LtpR, Fas, CD40, CD27, D30, 4-1ΒΒ, 0X40, DR3, DR5, e HVEM).
c. Frações de Ligante de Anticorpo
0 agente alvo no conjugado de ligante-toxina também pode ser um anticorpo, especificamente um anticorpo monoclonal ou seu fragmento funcional, que é especifico para um receptor expresso na superfície das células envolvidas na resposta inflamatória, especificamente um receptor de quimiocina, receptor de citocina e outrds receptores expressos nas células que expressam receptores de quimiocina. É preferido que o anticorpo monoclonal seja específico para um receptor de quimiocina, por exemplo, CCR-I, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CCR-IO, CXCR-I, CXCR-2, CXCR-3Ά, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CXCR-6, DARC, XCRl, CX3CR-1, e outros tais receptores.
Em alguns casos, o anticorpo pode ser específico para um receptor de citocina diferente da quimiocina, tal como, por exemplo, um receptor para qualquer uma ou mais das citocinas EMAPIIf GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-If IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-13. Conjugados contendo estes anticorpos podem ser usados para ter como alvo as células que expressam os receptores de citocina alvejados. Tais células incluem células envolvem em lesão secundária ao tecido. As células alvejadas também podem expressar um ou mais receptores de quimiocina.
Exemplos não limitantes de anticorpos monoclonais que podem ser empregados nos conjugados incluem, porém não estão limitados ao MAC-I, MAC-3, ED-1, ED-2, ED-3 e anticorpos monoclonais contra os antígenos que se seguem CD5, 14, 15, 19, 22, 34, 35, 54 e 68; 0X4, 6, 7, 19 e 42; Ber-H2, BR96, Fib75, EMB-11, HLA-DR, LN-1, e aglutinina-1 de rícino comum. Os fragmentos de anticorpo podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão em E.coli do DNA codificando o fragmento. Os fragmentos do anticorpo podem ser obtidos por digestão de pepsina ou papaina de anticorpos integrais por métodos convencionais.· Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem sés produzidos por clivagem enzimática dos anticorpos com pepsina para prover um fragmento 5S indicado F(ab')2. Este fragmento pode ser adicionalmente clivado empregando um agente de redução de tiol e opcionalmente um grupo de bloqueio aos grupos de sulfidrila resultantes da clivagem das ligações de dissulfeto, para produzir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Alternativamente, uma clivagem enzimática usando pepsina produz dois fragmentos Fab' monovalentes e um fragmento Fc diretamente (vide, por exemplo, 4.036.945 e 4.331.647 e referências contidas no presente documento, as referências também sendo incorporadas aqui em sua totalidade como referência; vide, também, Porter, R.R., (1959) Biochem. J., 73: 119-126)-, Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como, separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalentes, adicionalmente clivagem dos fragmentos e outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser usados, à medida que os fragmentos liguem-se ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
Fragmentos Fv contêm uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode não ser covalente, conforme descrito em Inbar e outros (1972) Proc. Nat'1 Acad. Sei. U.S.A. 69:2659-62. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfeto intermolecular ou reticuladas por substâncias químicas, tais como, glutaraldeído. Tipicamente, os fragmentos Fv contêm cadeias VH e VL conectadas por um ligador peptidico. Estas proteínas de ligação de antigeno de cadeia simples (sFv) são preparadas por construção de uma molécula de ácido nucléico codificando os domínios VH e VL conectados por um oligonucleotídeo. A construção resultante é inserida em um vetor de expressão, que é introduzido em uma célula hospedeira, tal como, E.coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma cadeia de polipeptídeo única com um peptídeo ligador ligando em ponte os dois domínios V. Os métodos para produção de sFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow and Filpula (1991) Methodsr 2:97-105; Bird e outros (1988) Science 242:423-426; Pack e outros (1993) Bio/TechnoIogy 11:1271-77; e Ladner e outros, Patente US número 4.946.778). Outra forma de um fragmento de anticorpo é um
peptídeo codificando uma região de determinação de complementaridade simples (CDR). Os peptídeos de CDR ("unidades de reconhecimento mínimo") podem ser obtidos por construção de genes codificando as CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, usando uma reação da cadeia da polimerase para sintetizar a região variável de RNA das células de produção de anticorpo (vide, por exemplo, Larrick e outros (1991) Methodsr 2:106-10; e Orlandi e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:3833-3837).
Anticorpos que se ligam a um receptor de quimiocina ou receptor de citocina diferente da quimiocina em uma célula promotora de lesão secundária ao tecido podem ser preparados usando um polipeptídeo intacto ou fragmento biologicamente funcional contendo peptídeos pequenos de interesse como o antigeno imunizante. 0 polipeptídeo ou um peptídeo usado para imunizar um animal (derivado, pòr exemplo, de DNAc traduzido ou síntese química) pode ser conjugado a uma proteína veiculo, caso desejado. Veículos geralmente usados que são quimicamente acoplados ao peptídeo incluem, porém não são limitados à hemocianina de Megathura crenulata (KLH), tiroglobulina, albumina de soro bovino (BSA) e toxóide tetânica. 0 peptídeo acoplado é então empregado para imunizar o animal (por exemplo, um camundongo, um rato ou um coelho).
A preparação de anticorpos monoclonais é bem conhecida na arte (vide, por exemplo, Kohler e outros (1975) Nature 256:495-7; e Harlow e outros, em: Anticorpos: a Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Pub., 1988). Em resumo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por injeção em um camundongo de uma composição contendo um antígeno, verificando a presença de produção de anticorpos por remoção de uma amostra do soro, remoção do baço para obter os linfócitos B, fusão dos linfócitos B com as células de mieloma para produzir hibridomas, clonagem dos hibridomas, seleção dos clones positivos que produzem anticorpos para o antígeno e isolamento dos anticorpos das culturas de hibridoma. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados das culturas de hibridoma por várias técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia de afinidade com Sepharose da proteína A, cromatografia de exclusão por tamanho e cromatografia de troca iônica e são bem conhecidas dos versados na técnica (vide, por exemplo, Pharmacia Monoclonal Antibody Purification Handbook (por exemplo, Cat. # 18-1037-46)).
Anticorpos também podem ser derivados de anticorpos primatas sub-humanos. Tal método para elevar os anticorpos terapeuticamente úteis em babuínos é conhecido dos versados na técnica (vide, por exemplo, Goldenberg e outros (1991) Pedido PCT Internacional Publicado número WO 91/11465 e Losman e outros (1990) Int. J. Câncer, 46:310- 314). Anticorpos terapeuticamente úteis podem ser derivadóâ de anticorpo monoclonal "humanizado"·. Tais métodos e anticorpos são conhecidos. Por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados são produzidos por transferência de regiões de determinação de coplementariedade de camundongo de cadeias variáveis pesadas e leves de imunoglobulina de camundongo para um domínio variável humano e então, substituindo os resíduos humanos nas regiões de estruturâ das contrapartes de murino. O emprego de componentes de anticorpo derivados de anticorpos monoclonais humanizados alivia os problemas em potencial associados . à imunogenicidade das regiões constantes de murino. As técnicas gerais para clonagem de domínios variáveis de imunoglobulinas de murino são descritas, por exemplo, por Orlandi e outros (1989) Proc. Nat Ί Acad. Sei. USA 86:3833^- 7, que é incorporado ao presente documento em sua totalidade como referência. As técnicas para produção de anticorpos monoclonais humanizados são descritas, por exemplo, por Jones e outros (1986) Nature 321:522-5; Riechmann e outros (1988) Nature 332:323-7; Verhoeyen e outros (1988) Science 239:1534- 6; Carter e outros (1992) Proc. NatΊ Acad. Sei. USA 89:4285-9; Sandhu (1992) Crit. Rev. Biotech. 12:437-62; e Singer e outros (1993) J. Immunol. 150:2844-67).
Tecnologia anti-idiotipo pode ser empregada para produzir anticorpos monoclonais que mimetizam um epítopo. Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-idiotípico fabricado para um primeiro anticorpo monoclonal terá ,um domínio de ligação na região hipervariável que é a "imagem" do epítopo ligado pelo primeiro anticorpo monoclonal.
d. Outros Agentes Alvos e Alvos Receptores Os conjugados providos no presente documento podem conter qualquer agente alvo que tem como alvo o conjugado a um receptor de superfície de célula. Além dos agentes alvo mencionados acima incluindo quimiocinas, citocinas e anticorpos, tais agentes alvo também incluem, por exemplo, porém não estão limitados aos fatores de crescimento, hormônios e outros ligantes ou variantes alélicas, muteínas ou seus fragmentos, à medida que o agente alvo é internalizado por um receptor de superfície de célula ao qual ele se liga. Tais agentes alvo podem ser empregados para gerar um conjugado de ligante-toxina usando os métodos providos no presente documento. Adicionalmente, tais agentes alvos podem ser empregados para construir um conjugado de ligante-toxina contendo um agente alvo ligado direta ou indiretamente às toxinas modificadas ou variantes de toxina, incluindo as variantes da SAl modificada providas no presente documento.
Exemplos de agentes alvo incluem, porém não estão limitados ao fator transformador do crescimento beta (TGF- β) , fator de início de alongamento de Leishmania (LEIF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), anfiregulina, neuregulina-1, neuregulina-2, neuregulina-3 ou neuregulina-4, fatores de crescimento incluindo fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de crescimento de fibroblasto, (FGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de crescimento de nervos (NGF), fator de crescimento de placenta (PlGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), betacelulina (BTC), midcina, inibina, fator de crescimento do endotélio, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) neurotrofina-2 (NT-2), neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), neurotrofina- (NT-5), fator neurotrófico derivado de linhagem de célula glial (GDNF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), pleiotrofina, fator de célula tronco (SCF), oncostatina M, fator derivado de neurônio motor e sensorial (SMDF), fator inibidor de leucemia (LIF), substância inibidora Müllerianá (MIS) , cardiotrofina-1, trombopoietina, angiopoietiilã;p activina, proteína morfogênica óssea (BMP), APMl, hormônio" do crescimento (GH), leptina e prolactina e variantes alélicas, muteínas ou seus fragmentos. Também estão incluídos como agentes alvo os receptores de reconhecimento de agente patogênico (PRRs) que participam na fagocitose ou endocitose dos agentes patogênicos. Por exemplo, outros agentes alvejados exemplares incluem moléculas que tem como alvo o receptor de manose (MR), Dectina-I e receptores para colectinas ou proteínas semelhantes à colectina incluindo, porém não limitadas aos receptores para proteína A de agente tensoativo (SP-A), proteína D de agente tensoativo, lectina de ligação de manose (MBL) ou proteína Iq de complemento (Clq). Agentes alvo preferidos -são polipeptídeos que, quando ligados aos receptores são internalizados na célula.
Os conjugados de ligante-toxina gerados empregando tais agentes alvo podem ser empregados para tratar qualquer doença ou transtorno possuindo um componente celular envolvido em sua patologia. Preferidos entre tais doenças ou transtornos estão quaisquer que possuem componentes celulares patológicos, o qual os componentes celulares expressem um ou mais receptores de superfície celular que possam ser alvejados. Outras doenças e transtornos também são contemplados, especificamente doenças angiogênicas incluindo, porém não limitadas ao câncer e retinopatias, tais como, retinopatias oculares ou diabéticas, tais como, através de ter como alvo as células endoteliais envolvidas na angiogênese. Fatores de Crescimento
Fatores de crescimento que se ligam aos receptores de superfície de célula endociticos nos tipos de célula envolvidos na inflamação e/ou lesão secundária do tecido também podem ser empregados as agentes alvo para o conjugado provido no presente documento e podem ser empregados nos métodos providos no presente documento. Tais fatores de crescimento também podem ser empregados como agentes alvo para ter como alvo células envolvidas nas doenças angiogênicas incluindo cânceres e outras doenças, tais como, doenças oculares ou vários estados inflamatórios crônicos, através de ter como alvo um conjugado de ligante- toxina nas células endoteliais. Fatores de crescimento, tais como, por exemplo, fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) ou qualquer versão modificada do mesmo incluindo aquelas possuindo substituições de aminoácido-,·- deleções, inserções ou adições podem ser usados para ter como alvo frações de toxina alvo nos tipos de célula específicos, à medida que mantenham a capacidade de se ligar aos receptores e ser internalizados (vide, por exemplo, Pedidos de Patente US números 2004/0166565 e US 20010031485). Consequentemente, tais fatores de crescimento podem ser empregados para construir um conjugado de ligante-toxina contendo um fator de crescimento ligado direta ou indiretamente às toxinas modificadas ou variantes de toxinas, incluindo as variantes Al da toxina Shiga modificada fornecidas no presente documento. Os tipos de célula alvejados podem incluir, por exemplo, células do endotélio envolvidas na angiogênese, que é um processo de crescimento de novos vasos sangüíneos freqüentemente associado ao crescimento do tumor e estados inflamatórios crônicos. A angiogênese é um processo muito controlado de crescimento dos novos vasos sangüíneos (vide por exemplo,· Folkman & Shing (1992) J. Biol. Chem., 267:10931-4; Hanahan (1997) Science, 277:48-50, quanto a revisões). Em circunstâncias normais, a angiogênese ocorre apenas durante o desenvolvimento embriônico, cura de ferida e desenvolvimento do corpo lúteo. A angiogênese ocorre em um grande número de patologias, tais como, crescimento de tumor sólido e metástase, várias doenças oculares, estados inflamatórios crônicos e lesões isquêmicas (vide, Folkman (1995) Nat. Med., 1:27-31, quanto a revisão). Assim, o crescimento de células endoteliais apresenta alvos únicos para tratamento de várias patologias maiores.
As proteínas VEGF são uma família de glicoproteínas diméricas secretadas que são reguladores positivos da angiogênese (por exemplo, Cross and Claesson- Welsh, Trends Pharmacol Sci., 22: 201-7, 2001). Proteínas VEGF exemplares incluem, porém, não estão limitadas a, VEGF-A (UniProt NO:P15692), VEGF-B (UniProt NO:P49765), VEGF-C (UniProt NO:P49767), VEGF-D (UniProt N0:043915), e PGF (fator de crescimento da placenta, proteína relacionada à VEGF; UniProt NO:Q53XY6), e suas variantes de "splicing", variantes alélicas ou variantes de espécies. Exemplos de polipeptídeos precursores de VEGF-A são estabelecidos na SEQ ID NOs: 204-210 e inclui um peptídeo de sinal de 26 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 1-2 6 das SEQ ID NOS:204-206 e, como resultado do "splicing" alternativa, polipeptídeos maduros de comprimento variado. Por exemplo, polipeptídeos VEGF-A maduros podem apresentar 206, 189, 183, 165, 148, 145 ou 121 aminoácidos de comprimento. Os polipeptídeos precursores de VEGF-B são estabelecidos nas SEQ ID Nos: 211 e 212 e incluem um peptídeo de sinal de 21 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 1-21 das SEQ ID NOs: 211 e 212 e polipeptideos maduros que apresentam 186 e 167 aminoácidos de comprimento e correspondem aos aminoácidos 22-207 da SEQ ID NO: 211 e 22-188 da SEQ ID NO:212, respectivamente. 0 polipeptideo precursor para VEGF-C é estabelecido na SEQ ID NO: 213 e inclui um peptideo de sinal de 31 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 1-31 da SEQ ID NO: 213, duas seqüências de pró- peptideo correspondendo aos aminoácidos 32-111 e 228-419 da SEQ ID NO: 213, e um polipeptideo de 116 aminoácidos maduros correspondendo aos aminoácidos 112-227 da SEQ ID NO: 213. 0 polipeptideo precursor para VEGF-D é estabelecido na SEQ ID NO: 214 e inclui um peptideo de sinal de 21 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 1-21 da SEQ ID NO: 214, duas seqüências de pró-peptideo correspondendo aos aminoácidos 22-88 e 206-354 da SEQ ID NO: 214, e um polipeptideo de 117 aminoácidos maduros correspondendo aos aminoácidos 89-205 da SEQ ID NO: 214. 0 polipeptideo precursor para PGF é estabelecido na SEQ ID NO: 215.
A ação de VEGF nas células endoteliais é mediada pelos receptores de tirosina cinase, VEGFR-I (flt-1), VEGFR-2 (KDR/flk-1) e relacionados ao VEGFR-I. Estes receptores são preferivelmente expressos nas células do endotélio. Os receptores são proteínas da transmembrana tirosina cinase de intervalo simples que pertencem a superfamília da imunoglobulina e contêm sete loops semelhantes a Ig no domínio extracelular e compartilham homologia com o receptor para fator de crescimento derivado de plaqueta. A ligação de VEGF a estes receptores induz a dimerização do receptor seguido por fosforilação da tirosina dos domínios SH2 e SH3 no dímero. 0 complexo KDR/flk-1-VEGF é então internalizado através de endocitose mediada por receptor. Assim, uma vez que pode ser internalizada por células expressando seu receptor ou receptores, qualquer proteína VEGF, tal como qualquer uma descrita no presente documento, pode servir como um agente alvo em um conjugado contendo um polipeptídeo da RIP modificada, tal como um polipeptídeo da SAl modificada Ou seu fragmento ativo.
2. Frações de Ligador
Na preparação dos conjugados providos no presente documento, a toxina RIP, tal como, por exemplo, uma toxina da SAl modificada provida no presente documento, é ligada direta ou indiretamente a um agente alvo. Por exemplo, conjugados providos no presente documento incluem os componentes que se seguem: (agente alvo)n, (L)q e (agente alvejado)m, onde L é um ligador para união do agente alvo à toxina; o agente alvo é qualquer fração que se liga e é internalizada por um receptor expresso em uma superfície de célula; m e n, que são selecionados independentemente, são pelo menos 1; e q é O ou mais, à medida que o conjugado resultante se liga ao receptor alvejado é internalizado e libera o agente alvejado. A ligação dos componentes no conjugado pode ser realizada por qualquer método presentemente conhecido na arte para anexação de duas frações, à medida que a anexação da fração do ligador ao ligante proteináceo não impede substancialmente a união do ligante proteináceo à célula alvo, isto é, a um receptor na célula alvo ou impede substancialmente a internalização ou metabolismo do ligante-toxina, de modo a diminuir a toxicidade da toxina RIP modificada para a célula alvo. A ligação pode ser qualquer tipo de ligação incluindo, porém não limitada às ligações iônica e covalente e qualquer outro associado suficientemente estável, pelo qual, o agente alvejado (por exemplo, uma toxina RIP modificada) será internalizado por uma célula na qual o conjugado é alvejado.
0 agente alvo, tal como uma quimiocina, é opcionalmente ligado à toxina RIP modificada ou seu fragmento ativo, via um ou mais ligadores. A fração do ligador é selecionada, dependendo das propriedades desejadas. Por exemplo, o comprimento da fração do ligador pode ser escolhido para otimizar a cinética e especificidade da união do ligante incluindo quaisquer alterações conformacionais induzidas por união do ligante ao receptor alvo. A fração do ligador seria longa e flexível o suficiente para permitir que a fração de ligante proteináceo e o receptor de célula alvo interajam livremente. Se o ligante for muito curto ou muito rígido, pode haver impedimento estérico entre a fração de ligante proteináceo e a toxina da célula. Se a fração de ligante for muito longa, a toxina da célula pode ser proteolisada no processo de produção ou pode não liberar seu efeito tóxico para a célula alvo de forma eficaz. Os ligadores, tais como, ligadores químicos podem ser anexados aos ligantes purificados usando vários protocolos conhecidos na técnica (vide Pierce Chemicals "Solutions, Cross-Iinking of Proteins: Basic Concepts and Strategies," Seminar #12, Rockford, IL).
a. Exemplos de Ligadores
Qualquer ligador conhecido dos versados na técnica pode ser empregado no presente documento. Geralmente, um conjunto diferente de ligadores será usado nos conjugados que são proteínas de fusão de ligadores nos conjugados produzidos quimicamente. Ligadores e ligações que são apropriados para conjugados ligados quimicamente incluem, porém não estão limitados às ligações de dissulfeto, ligações de tioéter, ligações de dissulfeto impedidas e ligações covalentes entre os grupos reativos livres, tais como, grupos amina e tiol. Estas ligações são produzidas usando reagentes heterobifuncionais para produzir grupos tiol reativos em um ou ambos os polipeptideos e então reagindo os grupos tiol em um polipeptideo com grupos tiol reativos ou grupos amina aos quais os grupos maleimida reativos ou grupos tiol podem ser anexados ao outro. Outros ligadores incluem ligadores cliváveis por ácido, tais como, propano bismaleimideotoxiy- conjugados de transferrina instável em ácido e diidrazida de ácido adípico que seriam clivados em compartimentos intracelulares acídicos; ligadores reticulados que são clivados mediante exposição ao UV ou luz visível e ligadores, tais como, vários domínios, tais como, CHI, CH2 e CH3 a partir da região constante de IgGl humano (vide* Batra e outros (1993) Molecular Immunol. 30:379-386). Em algumas modalidades, vários ligadores podem ser incluídos de modo a tirar vantagem das propriedades desejadas de cada ligador. Os ligadores químicos e ligadores de peptídeo podem ser inseridos por acoplamento covalente do ligador ao agente alvo do receptor de quimiocina e da toxina RIP modificada. Os agentes heterobifuncionais, descritos abaixo, podem ser usados para efetuar tal acoplamento covalente. Os ligadores de peptídeo podem também ser ligados por expressar DNA codificando o ligador e agente alvo, ligador e toxina RIP modificada, ou ligador, toxina RIP modificada e agente alvo como uma proteína de fusão. Os ligadores flexíveis e ligadores que aumentam a solubilidade dos conjugados são contemplados para uso; tanto sozinhos como com outros ligadores também são contemplados no presente documento. Os ligadores podem ser qualquer fração apropriada para associação a uma toxina RIP modificada e um agente alvo. Tais frações incluem, porém não estão limitadas as ligações peptidicas; ligações de aminoácido e peptídeo, tipicamente contendo entre um e cerca de 60 aminoácidos; ligadores químicos, tais como reticuladores cliváveis heterobifun.cionais. Outros ligadores incluem, porém não estão limitados aos peptídeos e outras frações que reduzem impedimento· estérico entre a toxina RIP modificada e o agente alvo, substratos de enzima intracelular, ligadores que aumentam a flexiblidade do conjugado, ligantes que aumentam a solubilidade do conjugado, ligadores que aumentam a estabilidade do soro do conjugado, ligadores fotocliváveds e ligadores cliváveis em ácido. i. Reagentes de Reticulação Heterobifunctionais
Vários reagentes de reticulação
heterobifurucionais que são empregados para formar ligações covalentes entre grupos amino e tiol ou para introdução de grupos tiol em proteínas são conhecidos dos versados na técnica Cvide, por exemplo, the PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993, que descreve a preparação e uso de tais reagentes e provê uma fonte comercial para tais reagentes; vide, também, pòr exemplo, Ciumber e outros (1992) Bioconjugate Chem. 3:397- 401; Thorpe e outros (1987) Câncer Res. 47:5924-5931; Gordon e outros (1987) Proc. Natl. Acad Sei. 84:308-312; Walden e outros (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson e outros (1978) Biochem. J. 173: 723-737; Mahan e outros (1987) Anal. Biochem. 162:163-170; Wawryznaczak e outros (1992) Br. J. Câncer 66:361-366; Fattom e outros (1992) Iiifection & Immun. 60:584-589; os reagentes para reticulação estão disponíveis: Pierce Chemical Company, Rockford, IL; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Os grupos funcionais que podem ser empregados para reticulação incluem aminas primárias, sulfidrilas, carbonilas, carboidratos e ácidos carboxilicos. Grupos exemplares para uso nos reagentes de· reticulação heterobifuncionais incluem, porém não estão' limitados as azidas de arila, maleimidas, carboiimidaé·','-- ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), hidrazidas, ésteres PFP, fosfinas de hidroximetila, psoralenos, imidoésteres, dissulfetos de piridila, isocianatos e vinil sulfonas. Reagentes de reticulação heterobifuncionais podem ser usados para formar ligações covalentes entre os agentes alvo, tais como, por exemplo, uma quimiocina e uma toxina RIP modificada. Um reticulador heterobifuncional exemplar contem dois grupos reativos: um reagindo com grupo amina primária (por exemplo, N-hidróxi succinimida) e o outro reagindo com um grupo tiol (por exemplo, dissulfeto de piridila, maleimidas, halogênios, etc.). Através do grupo reativo de amina primária, o reticulador pode reagir com o(s) resíduo (s) de lisina de um polipeptídeo e através do grupo reativo de tiol, o reticulador, já amarrado à primeira proteína, reage com o resíduo de cisteína (grupo sulfidrila livre) do outro polipeptídeo. Reagentes de reticulação heterobifuncionais exemplares incluem, porém não estão limitados ao N-succinimidil-3-(2-
piridilditio)propionato (SPDP; ligador de dissulfeto); 6- [3-(2-piridilditio)propionamido] hexanoato de
sulfosuccinimidil (sulfo-LC-SPDP); succinimidiloxicarbonil- metilbenzila tiossulfato (SMBT, ligador de dissulfato impedido), 6-[3-(2-piridilditio)propionamido] hexanoato de succinimidil (LC-SPDP); 4-(N-maleimidometil)ciclohexano^l carboxilato de sulfosuccinimidila (sulfo-SMCC); 3— (2 — piridilditio) butirato de succinimidila (SPDB, ligador de ligação de dissulfeto impedido); 2-(7-azido-4- metilcoumarin-3-acetamido) etil-1,3'-ditiopropionato de sulfosuccinimidila (SAED) ; 7-azido-4-metilcoumarin^3- acetato de sulfosuccinimidila (SAMCA); 6-[alfa-metil-alfa- (2-piridildito)toluamido] hexanoato de sulfosuccinimidila (sulfo-LC-SMPT); 1, 4-di[3'- (2'-
piridilditio)propionamido]butano (DPDPB); 4-succinimidil- oxicarbonil-metil-(2-piridiltio)tolueno (SMPT, ligador de dissulfato impedido); 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2- piridilditio)tolueno; sulfosuccinimidil-6[-metil-(2-
piridilditio)toluamido]hexanoato (sulfo-LC-SMPT); éster m- maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); éster m- maleimidobenzoil-N-hidroxissulfosuccinimida (sulfo-MBS); N- succinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (SIAB; ligador de tioéster); sulfosuccinimidil(4-iodoacetil)amino benzoato (sulfo-SIAB); succinimidil-4(p-maleimidofenil)butirato
(SMPB); sulfosuccinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato
(sulfo-SMPB); hidrazida de azidobenzoila (ABH); hidrazida de 3-(2-piridilditio)-propionila; reagente de Ellman; ácido diclorotriazinico, S-(2-tiopiridil)-L-cisteina. Compostos de ligação bifuncionais exemplares adicionais são descritos, por exemplo, nas Patentes US números 5.349.066. 5.618.528, 4.569.789, 4.952.394 e 5.137.877.
ii. Ligadores Cliváveis por Ácido, Fotocliváveis e Sensíveis ao Calor Ligadores cliváveis por ácido, fotocliváveis e
ligadores sensíveis ao calor também podem ser empregados, especificamente quando for necessário clivar a toxina RIP modificada para permitir que a mesma seja mais prontamente acessível à reação. Muitos grupos cliváveis são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Jung e outros (1983) Biochem. Biophys. Acta 761:152 162; Joshi e outros (1990) J. Biol. Chem. 265: 14518 14525; Zarling e outros (1980) J. Immunol. 124: 913 920; Bouizar e outros (1986) Eur. J. Biochem. 155: 141 147; Park e outros (1986) J Biol. Chem. 261: 205 210; Browning e outros (1989) J. Immunol. 143: 1859-1867). Além disso, uma ampla faixa de grupos ligadores bifuncionais cliváveis se encontra comercialmente disponível de fornecedores, tais como, Pierce.
Ligadores cliváveis por ácido incluem, porém não estão limitados ao propano bismaleimidotóxi; e ligadores de diidrazida de ácido adípico (vide, por exemplo, Fattom e outros (1992) Infection & Immun. 60:584-589) e os conjugados de transferrina instáveis em ácido que contêm uma porção suficiente de transferrina para permitir a entrada na via de ciclagem de transferrina intracelular (vide, por exemplo, Welhoner e outros (1991,) J. Biol. Chem. 266:4309-4314).
Ligadores fotocliváveis são ligadores que são
clivados quando da exposição à luz (vide, por exemplo, Goldmacher e outros (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107), pelo qual liberando o agente alvejado quando da exposição à luz. Ligadores fotocliváveis que são clivados quando da exposição à luz são bem conhecidos (vide, por exemplo, Hazum e outros (1981) em Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16°, Brunfeldt, K (Ed) , pp. 105-110, que descreve o uso de um grupo nitrobenzila como um grupo de proteção fotoclivável por cisteína; Yen e outros (1989) Makromol. Chem 190:69-82, que descreve copolímeros fotocliváveis solúveis em água incluindo copolímero hidroxipropil- metacrilamida, copolímero de glicina, copolímero de fluoresceína e copolímero de metil-rodamina; Goldmacher e outros (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107, que descreve um reticulador e reagente que sofre degradação fotolítica quando da exposição à luz próxima a UV (350 nm); e Senter e outros (1985) Photochem. Photobiol 42:231-237, que descreve reagentes de reticulação de cloreto de nitrobenziloxicarbonila que produzem ligações
fotocliváveis). Tais ligadores teriam uso especifico no tratamento de condições dermatológicas ou oftálmicas que podem ser expostas à luz usando fibras óticas. Após administração do conjugado, o olho ou pele ou outra parte do corpo pode ser exposta à luz, resultando na liberação da toxina RIP modificada do conjugado. Tais ligantes fotocliváveis são úteis em conexão com protocolos de diagnóstico nos quais é desejável remover o agente alvo para permitir o rápido desaparecimento do corpo do animal.
iii. Outros Ligadores para Conjugação Química
Outros ligadores incluem ligadores de tritila,
especificamente, grupos tritila derivatizados para gerar um gênero de conjugados que fornece a liberação de agentes terapêuticos em vários graus de acidez ou alcalinidade. A flexibilidade assim fornecida pela capacidade de preselecionar a faixa de pH na qual o agente terapêutico será liberado permite a seleção de um ligante com base nas diferenças fisiológicas conhecidas entre os tecidos que precisam de liberação de um agente terapêutico (vide, por exemplo, Patente US número 5.612.474). Por exemplo, a acidez dos tecidos tumorais parece ser inferior aquela dos tecidos normais.
iv. Ligadores de Peptideo
As frações de ligador podem ser os peptideos. Os
ligadores de peptideo podem ser empregados nas proteínas de fusão e também nos conjugados ligados quimicamente. 0 peptideo possui, tipicamente, cerca de 2 a cerca de 60 resíduos de aminoácido, por exemplo, cerca de 5 a cerca de 40 ou cerca de 10 a cerca de 30 resíduos de aminoácidos. 0 comprimento selecionado dependerá de fatores, tais como, o uso para o qual o ligador é incluído. O ligante proteináceo se une com especificidade a receptor (es) em uma ou mais células alvo e é absorvido pela(s) célula(s) alvo(s). De modo a facilitar a passagem do conjugado ligante-toxina para a célula alvo, é presentemente preferido que o tamanho do conjugado de ligante-toxina não seja maior que o que pode ser absorvido pela célula alvo de interesse. Geralmente, o tamanho do conjugado de ligante-toxina dependerá de sua composição. No caso do conjugado de ligante-toxina conter um ligador químico e uma toxina química (isto é, ao invés de um proteináceo), o tamanho do ligante-toxina geralmente será menor quando o conjugado de ligante-toxina for uma proteína de fusão. Ligadores peptídicos podem ser convenientemente codificados por ácido nucléico e incorporados às proteínas de fusão quando expressos em uma célula hospedeira, tal
como, E.coli.
Os ligadores de peptídeo são vantajosos quando o
agente alvo é proteináceo. Por exemplo, a fração do ligador pode ser uma sequencia de aminoácido espaçadora flexível, tal como aquela conhecida em uma fonte de anticorpo de cadeia simples. Exemplos de tais frações de ligador conhecidas incluem, porém não estão limitadas a GGGGS (SEQ ID NO: 192), (GGGGS)n (SEQ. ID NO: 193), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO: 194), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ. ID NO: 195), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 196), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 197), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 198), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO: 199), SRSSG (SEQ. ID NO: 200), SGSSC (SEQ ID N0:201). Um ligador sensível a tripsina toxina da Diphtheria apresentando a seqüência AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM (SEQ ID NO: 202) também é útil.
Alternativamente, a fração de ligador de peptídeo pode ser VM ou AM (SEQ ID NO: 34) ou apresentar a estrutura descrita pela fórmula: AM(G2 a 4S)XAM onde X é um número inteiro de 1 a 11 (SEQ ID NO: 203).Frações de ligação adicionais são descritas, por exemplo, em Huston e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-5883; Whitlow, M., e outros (1993) Protein Engineering 6:989-995; Newton e outros (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber e outros (1992) Bioconj. Chem. 3:397-401; Ladurner e outros (1997) J. Mol. Biol. 273:330-337; e Patente US número 4.894.443.
Outros ligadores incluem, porém não estão limitados aos substratos de enzima, tais como, substrato de catepsina B, substrato de catepsina D, substrato de tripsina, substrato de trombina, substrato de subtilisina, substrato de Fator Xa e substrato de enterocinase; ligadores que aumentam a solubilidade, flexibilidade e/ou capacidade de clivagem intracelular inclui ligadores, tais como, (glymser)n e (sermgly)n, nos quais m é 1 a 6, geralmente 1 a 4, e tipicamente 2a4enéla30oula e tipicamente 1 a 4 (vide, por exemplo, Pedido PCT Internacional número W096/06641, que fornece ligadores exemplares para uso nos conjugados). Em algumas modalidades, vários ligadores podem ser incluídos a fim de tirar vantagem das propriedades desejadas de cada ligador.
3. Exemplos de Conjugados Moduladores de População de Leucócito (LPM)
Conjugados de ligante-toxina exemplares incluem conjugados de LPM, que contém uma quimiocina ligada direta ou indiretamente a uma variante Al da toxina Shiga (SAI), tal como, por exemplo, qualquer uma das variantes SAl descritas no presente documento. Tipicamente, tais conjugados contêm uma porção madura do polipeptídeo de quimiocina ou uma porção do polipeptídeo que pode se ligar ao receptor. Opcionalmente, quando a ligação for indireta, a molécula de ácido nucléico que codifica o conjugado pode conter uma seqüência codificando um polipeptideo de ligador entre o polipeptideo de agente alvo de quimiocina e a fração alvejada da variante de SAI, tal como, por exemplo, um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34; tecnicamente, Met é o códon de partida da toxina Shiga para expressão bacteriana). Em alguns exemplos, moléculas de ácido nucléico adicionais podem se adicionadas ao ácido nucléico que codifica o conjugado de ligante-toxina ou podem ser ligadas ao conjugado de ligante-toxina por outros meios, tal como por um ligador químico, para facilitar a purificação, expressão, clonagem ou detecção. Por exemplo, os sítios da enzima de restrição podem ser construídos em uma ou ambas as extremidades 3' e 5' da molécula de ácido nucléico para facilitar a clonagem. Em tal exemplo, um sítio de restrição NdeI nas posições 1-6 e um sítio de restrição BamHI nas posições 967-972 foram construídos na molécula de ácido nucléico conforme estabelecido nas SEQ
ID NOs: 37 e 39.
Entre os conjugados de LPM providos no presente
documento se encontra um conjugado de um polipeptideo de quimiocina de MCP-I madura ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga variante 1 (SAl) como o agente alvejado. Por exemplo, conforme descrito no Exemplo provido, o conjugado de LPMla contém um polipeptideo da MCP-I madura (estabelecido na SEQ ID NO: 69) ligado aos resíduos 23-2 68 do polipeptideo da subunidade SAl contendo o domínio de inativação do ribossomo (RIP) referido no presente documento como variante 1 de SAI; correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22). -O polipeptideo de MCP-I e o polipeptideo da SAl são ligados indiretamente através do ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) para produzir um polipeptideo de fusão de ligante:ligador:toxina. Um ácido nucléico exemplar que codifica o polipeptideo de LPMla é estabelecido na SEQ ID NO:37. O polipeptideo de LPMla codificado é estabelecido na SEQ ID NO: 38.
Também, entre os conjugados de LPM providos no presente documento está um conjugado de um polipeptideo de quimiocina de MCP-I madura ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga variante 2 (SAI) como o agente alvejado. Por exemplo, conforme escrito nos Exemplos providos, o conjugado de LPMlb contém um polipeptideo de MCP-I madura (estabelecido na SEQ ID NO: 69) ligado ao polipeptideo de subunidade Al da toxina Shiga truncado (referido no presente documento como variante 2 da SAI, correspondendo à seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 24). O polipeptideo de MCP-I e o polipeptideo da SAl variante 2 são ligados indiretamente através de um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) para produzir um polipeptideo de fusão de ligante:ligador:toxina. Um ácido nucléico exemplar que codifica o polipeptideo de LPMlb é estabelecido na SEQ ID NO: 39, onde os nucleotideos 7-966 codificam o polipeptideo de conjugado de ligante-toxina e nucleotideos 964-966 codificam um códon de parada construído. O polipeptideo de LPMlb codificado estabelecido na SEQ ID NO: 4 0 contém 320 aminoácidos de comprimento e contém um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por um MCP-I maduro (aminoácidos 2- 77), um ligador Ala-Met (aminoácidos 78-99) e uma subunidade de variante 2 da SAl (aminoácidos 80-320).
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado de um polipeptideo de quimiocina MCP-I madura ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) variante 1 mutante (também denominada variante 3) como o agente alvejado, que é um polipeptideo da SAl modificado identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPMlc contém um polipeptídeo de MCP-I madura (estabelecido na SEQ ID NO: 69) ligado a um polipeptideo de subunidade Al da toxina Shiga mutante (referida no presente documento como variante 3 da SAI, correspondendo à seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26) . 0 polipeptideo de MCP-I e a variante de polipeptideo da SAl são ligados indiretamente através de um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) para produzir um polipeptideo de fusão de ligante:ligador:toxina. A variante 3 da SAl apresenta uma mutação de L para R na posição 38 com relação ao polipeptideo da SAl do tipo selvagem maduro estabelecido na SEQ ID NO: 22. Conforme descrito nos Exemplos, LPMlc foi gerado em uma classificação para formas modificadas da porção da SAl do conjugado de LPMla (SEQ ID NO:38). Um ácido nucléico exemplar que codifica o polipeptideo de LPMlc é estabelecido na SEQ ID NO: 41. 0 polipeptideo de LPMlc codificado é estabelecido na SEQ ID NO: 42.
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado de um polipeptideo de quimiocina de MCP-I madura ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) variante 2 mutante (também denominada variante 4) como o agente alvejado, que é um polipeptideo SAl modificado identificado nos métodos de seleção do presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPMld contém um polipeptideo de quimiocina de MCP-I madura (estabelecido na SEQ ID NO: 69) ligado a um polipeptideo de subunidade Al da toxina Shiga mutante (referida no presente documento como variante 4 da SAI, correspondendo à sequencia de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) . 0 polipeptideo de MCP-I e a variante de polipeptideo da SAl são ligados indiretamente através de um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) para produzir um polipeptideo de fusão de ligante:ligador:toxina. A variante 4 da SAl apresenta uma mutação V para A na posição 219 com relação ao polipeptideo da variante 2 da SAl truncado maduro estabelecido na SEQ ID NO: 24. Conforme descrito nos Exemplos, LPMld foi gerado em uma classificação para variantes da porção SAl do conjugado de LPMlb (SEQ ID NO: 40) . Um ácido nucléico exemplar que codifica o polipeptideo de LPMld é estabelecido na SEQ ID NO: 43. O polipeptideo de LPMld codificado é estabelecido na SEQ ID NO: 44.
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina Eotaxina ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Por exemplo, conjugado de LPM2 contém um polipeptideo da Eotaxina madura (correspondendo aos aminoácidos 24-97 da seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 113) ligado a um polipeptideo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34). Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM2 são estabelecidos nos nucleotideos 7-960 da SEQ ID NO: 45, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 958-960. 0 polipeptideo LPM2 codificado e estabelecido na SEQ ID NO: 46 contém 318 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma Eotaxina madura (aminoácidos 2-7 5), um ligador Ala-Met (aminoácidos 76-77) e uma subunidade 4 variante da SAl (aminoácidos 78-318).
Outro LPM exemplar provido no presente documento que é um conjugado da quimiocina Eotaxina ligado a subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado é LPM12. 0 polipeptideo da Eotaxina 10
empregado no LPM 12 apresenta a mesma sequencia de aminoácidos que a Eotaxina em LPM2, contudo devido às diferenças no modo em que eles foram sintetizados (vide Exemplo 3), suas seqüências de ácido nucléico diferem. Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM 12 são estabelecidos nos nucleotideos 7-960 da SEQ ID NO: 65, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 958-960. 0 polipeptídeo de LPM12 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 4 6 contém 318 aminoácidos de comprimento possuindo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma Eotaxina madura (aminoácidos 2-75), um ligador Ala-Met (aminoácidos 76-77), e uma subunidade de variante 4 da SAl (aminoácidos 78-318) .
Outro LPM exemplar provido no presente documento
é um conjugado da quimiocina de SDF-Ιβ ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptídeo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPM3 contém um polipeptídeo da SDF-Ιβ madura (correspondendo 'aos aminoácidos 22-93 da seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 114) ligado a um polipeptídeo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) . Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM3 são estabelecidos nos nucleotideos 7-954 da SEQ ID NO: 47, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 952-954. 0 polipeptídeo de LPM3 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 48 contém 316 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por um SDF-Ιβ maduro
30 (aminoácidos 2-73), um ligador Ala-Met (aminoácidos 74-75) e uma subunidade de variante 4 da SAl (aminoácidos 76-316).
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina de GRO-α ligada direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptídeo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPM4 contém um polipeptídeo da GRO-α madura(correspondendo aos aminoácidos 35-107 do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 115) ligado a um polipeptídeo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) . Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM4 são estabelecidos nos nucleotídeos 7-957 da SEQ ID NO: 49, incluindo um códon de parada construído nos nucleotídeos 955-957. O polipeptídeo de LPM4 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 50 contém 317 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma GRO-α madura (aminoácidos 2-74), um ligador Ala-Met (aminoácidos 75-76), e lima subunidade da variante 4 da SAl (aminoácidos 77-317) .
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina de ΜΙΡ-Ιβ ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAl) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptídeo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de L PM 5 contém um polipeptídeo de MIP-Ιβ madura (correspondendo aos aminoácidos 24-92 do polipeptídeo estabelecido na SEQ. ID NO: 116) ligado a um polipeptídeo da variante 4 da S^l (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34). Exemplos de tal seqüência de LPM5 são nucleotideos 7-945, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 943-945, da seqüência de ácido nucléico estabelecida na SEQ ID NO: 51. 0 polipeptídeo de LPM5 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 52 contém 313 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma MIP-Ιβ madura (aminoácidos 2-70), um ligador Ala-Met (aminoácidos 71-72) e uma subunidade da variante 4 da SAl (aminoácidos 73-313).
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina IL-8 ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptídeo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPM6 contém um polipeptídeo da IL-8 madura (correspondendo aos aminoácidos 21-99 do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 117) ligado a uma seqüência de variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34). Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM6 são estabelecidos nos nucleotideos 7-969 da SEQ ID NO: 53, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 967-969. 0 polipeptídeo de LPM6 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 54 contém 321 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma IL-8 madura (aminoácidos 2-78), um ligador Ala-Met (aminoácidos 79-80) e uma subunidade da variante 4 da SAl (aminoácidos 81-321). Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina IP-IO ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptideo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPM7 contém um polipeptideo da IP-IO madura (correspondendo .,aos aminoácidos 22-98 do polipeptideo estabelecido na SEQ ID NO: 118) ligado a um polipeptideo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) . Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM7 são estabelecidos nos nucleotideos 7-969 da SEQ ID NO: 55, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 967-969. O polipeptideo de LPM7 codificado estabelecido na SEQ ID NO. 56 contém 321 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma IP-IO madura (aminoácidos 2-78), um ligador Ala-Met (aminoácidos 79-80), e uma subunidade variante 4 da SAl (aminoácidos 81-321).
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina MCP-3 ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptideo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPM8 contém um polipeptideo da MCP-3 madura (correspondendo aos aminoácidos 24-99 do polipeptideo estabelecido na SEQ ID NO: 119) ligado a um polipeptideo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) . Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM8 são estabelecidos nos nucleotideos 7-966 da SEQ ID NO: 57, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 964-966. O polipeptídeo de LPM8 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 58 contém 320 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma MCP-3 madura (aminoácidos 2-77), um ligador Ala-Met (aminoácidos 78-79), e uma subunidade da variante 4 da SAl (aminoácidos 80-320).
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina MIP-3a ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptídeo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPM9 contém um polipeptídeo da MIP-3a madura (correspondendo ,aos aminoácidos 27-96 do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 120) ligado a um polipeptídeo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) . Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM9 são estabelecidos nos nucleotideos 7-948 da SEQ ID NO: 59, incluindo um códon de parada construído nos nucleotideos 946-948. O polipeptídeo de LPM9 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 60 contém 314 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma MIP-3a madura (aminoácidos 2-71), um ligador Ala-Met (aminoácidos 72-7.3), e uma subunidade da variante 4 da SAl (aminoácidos 74-314).
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina MDC ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptideo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPMlO contém um polipeptideo da MDC madura (correspondendo aos aminoácidos 25-93 do polipeptideo estabelecido na SEQ ID NO: 121) ligado a um polipeptideo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34).. Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPMlO são estabelecidos nos nucleotideos 7-945 da SEQ ID NO: 61, incluindo um códon de parada construído nos amino nucleotideos 943-945. 0 polipeptideo de LPMlO codificado estabelecido na SEQ ID NO: 62 contém 313 aminoácidos de comprimento contendo iam resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma MDC madura (aminoácidos 2-70), um ligador Ala-Met (aminoácidos 71- 72), e uma subunidade de variante 4 da SAl (aminoácidos 73- 313) .
Outro LPM exemplar provido no presente documento
é um conjugado da quimiocina MIP-Ia ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAl) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptideo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado LPMll contém ' um polipeptideo da MIP-Ia madura (correspondendo aos aminoácidos 24-92 do polipeptideo estabelecido na SEQ ID NO: 122) ligado a um polipeptideo da variante 4 da 'SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34) . Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPMll são estabelecidos nos nucleotideos 7-945 da SEQ ID NO: 63, incluindo um códon de parada construído nos nucleotídeos 943-945. 0 polipeptídeo de LPMll estabelecido na SEQ ID NO: 64 contém 313 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma MIP-Ia madura (aminoácidos 2-70), um ligador Ala-Met (aminoácidos 71-72), e uma subunidade da variante 4 da SAl (aminoácidos 73-313).
Outro LPM exemplar provido no presente documento é um conjugado da quimiocina BCA-I ligado direta ou indiretamente a uma subunidade Al da toxina Shiga (SAI) modificada como o agente alvejado. Em um exemplo, a subunidade SAl modificada é o polipeptídeo da SAl variante 4 identificado nos métodos de seleção no presente documento. Por exemplo, o conjugado de LPMl3 contém um polipeptídeo de BCA-I madura (correspondendo aos aminoácidos 23-109 do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO: 123) ligado a um polipeptídeo da variante 4 da SAl (correspondendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28) via um ligador Ala-Met (SEQ ID NO: 34). Exemplos de uma molécula de ácido nucléico que codifica LPM13 são estabelecidos nos nucleotídeos 7-999 da SEQ ID NO: 66, incluindo um códon de parada construído nos nucleotídeos 997-999. 0 polipeptídeo de LPM13 codificado estabelecido na SEQ ID NO: 67 contém 331 aminoácidos de comprimento contendo um resíduo de metionina de partida 5' (na posição 1 do aminoácido) seguido por uma BCA-I madura (aminoácidos 2-88), um ligador Ala-Met (aminoácidos 89-90), e uma subunidade da variante 4 da SAl (aminoácidos 91-331).
G. Preparação de Toxinas RIP Modificadas e Seus
3 0 Conj ugados
Conjugados de ter como alvo as frações ligadas aos agentes alvejados podem ser preparados tanto por conjugação química, tecnologia de DNA recombinante ou combinações de expressão recombinante e conjugação química.
Os métodos do presente documento podem ser empregados para
preparar e usar conjugados de qualquer agente alvo com
qualquer agente alvejado, tal como uma toxina RIP, tanto
diretamente quanto através de ligadores conforme descrito
no presente documento. 0 agente alvo e agente alvejado
podem ser ligados em qualquer orientação e mais de um
agente alvo e/ou agente alvejado podem estar presentes ém
um conjugado. Os métodos no presente documento são
exemplificados com referência específica aos conjugados
contendo um agente alvo, tal como uma quimiocina e um
agente alvejado, tal como um polipeptídeo Al da toxina Shiga.
Adicionalmente, são providos no presente documento métodos para expressão e produção de polipeptídeos recombinantes. Tais métodos podem ,ser empregados para expressar toxinas modificadas ou variantes de toxina, providas no presente documento tanto sozinhas quanto como um conjugado de proteína de fusão (isto é, conjugado de ligante-toxina RIP) com um agente alvo selecionado, tal como uma quimiocina. Nos exemplos, onde o agente alvejado, tal como toxina modificada provido no presente documento, e o agente alvo são expressos como peptídeos individuais, os conjugados do agente alvejado modificado com o agente alvo podem ser gerados através de meios químicos conforme discutido no presente documento.
1. Métodos de Geração e Clonagem de Polipeptídeos da Toxina, ou Conjugados Contendo Polipeptídeos da Toxina
Ácidos nucléicos codificando uma toxina modificada, oü um conjugado contendo uma toxina modificada, incluindo conjugados de ligante-toxina, podem ser clonados ou isolados usando quaisquer métodos conhecidos disponíveis na técnica para clonagem e isolamento das moléculas de ácido nucléico. Por exemplo, conjugados contendo proteínas de fusão quiméricas de um agente alvo ou ligante e um ou mais agentes alvejados podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas de síntese da proteína se a sequencia de ácido nucléico do agente alvo ou agente alvejado forem conhecidas ou síntese química das moléculas de DNA que codificam o agente alvo selecionado ou agente alvejado. Alternativamente, se a sequencia de ácido nucléico do agente alvo ou agente alvejado forem desconhecidos, a sequencia pode primeiro ser determinada empregando métodos bem conhecidos, tais como, porém não limitado a classificação das bibliotecas, incluindo classificação de hibridização do ácido nucléico, classificação com base no anticorpo e classificação com base na atividade. Tais métodos de classificação também podem ser usados para obter sequencias de ácido nucléico que codificam uma proteína específica quando apenas uma porção da sequencia de aminoácido for conhecida.
Métodos para ampliação de ácidos nucléicos podem ser empregados para isolar moléculas de ácido nucléico codificando um agente alvo e/ou um agente alvejado, incluindo, por exemplo, métodos de reação em cadeia, da polimerase (PCR). Um ácido nucléico contendo material pode ser empregado como um material de partida do qual um agente alvo ou molécula de ácido nucléico codificando o agente alvejado pode ser isolado. Por exemplo, preparação de DNA e RNAm, extratos de célula, extratos de tecido, amostras de fluido (por exemplo, sangue, soro, saliva), amostras de indivíduos saudáveis e/ou doentes podem ser usadas nos métodos de ampliação. Bibliotecas de ácido nucléico também podem ser empregadas como uma fonte de material de partida. Os iniciadores podem ser projetados para ampliar a molécula desejada. Por exemplo, os iniciadores podem ser designados com base nas sequencias expressas das quais uma molécula de toxina ou ligante (isto é, quimiocina) é gerada. Os iniciadores podem ser designados com base em uma retro- tradução de uma sequencia de aminoácido conhecida especifica. As moléculas de ácido nucléico geradas por ampliação podem ser sequenciadas e confirmadas para codificação da molécula.
Alguns dos genes que codificam um agente de alvo ou agente alvejado são comercialmente disponíveis. Por exemplo, moléculas de ácido nucléico codificando quimiocinas ou toxinas de células estão disponíveis. Uma vantagem da obtenção dos genes comercialmente disponíveis é que as sequencias geralmente foram otimizadas para expressão em hospedeiros, tais como, E.coli. Um polinucleotídeo codificando uma proteína, peptídeo ou polinucleotídeo de interesse pode ser produzido usando tecnologia de síntese de ácido nucléico. Métodos de manipulação de uma molécula de DNA incluindo, porém não limitado à clonagem em vetores, mutagênese de resíduos de ácido nucléico e adição ou deleção de resíduos de ácido nucléico,
são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para gerar toxinas RIP modificadas ou conjugados de ligante-toxina RIP providos no presente documento.
Em
uma modalidade, a toxina RIP-ligante quimérico é produzida como uma proteína de fusão. A proteína de fusão pode ser produzida por tecnologia de ácido nucléico recombinante onde um polipeptídeo simples inclui uma fração alvo, tal como uma quimiocina, sendo ligada diretamente a um agente alvejado proteináceo, tal como uma toxina da célula. Alternativamente, as proteínas podem ser separadas por uma distância para assegurar que a proteína forme estruturas secundárias e terciárias apropriadas. . As sequencias de ligador apropriadas (1) adotarão uma conformação estendida flexível, (2) não exibirão propensão para desenvolvimento de uma estrutura secundária ordenada que possa interagir com os domínios funcionais do polipeptídeo de fusão e (3) possuirão caráter hidrofóbico mínimo ou carregado que possam promover interação com os domínios de proteína funcional. A fração alvo pode estar posicionada no término amino em relação à fração da toxina da célula no polipeptídeo. Um exemplo de tal proteína de fusão apresenta a estrutura generalizada: (término amino) Agente Alvo: Ligador de Peptídeo: Toxina (término carbóxi). Alternativamente, a fração alvo pode ser posicionada no término carbóxi em relação à fração da toxina da célula dentro da proteína de fusão, por exemplo, possuindo a estrutura generalizada: (término amino) Toxina:Ligador de peptídeo:Agente alvo (término carbóxi).
Também são contempladas no presente documento as proteínas de fusão que contêm seqüências de aminoácido adicionais nos terminais amino e/ou carbóxi, tais como sequencias para marcadores de epítopo ou outras frações que facilitam a purificação da proteína. Por exemplo, podem ser empregados marcadores de polihistidina que podem facilitar processos, tais como, clonagem, expressão, modificação pós- traducional, purificação, detecção e administração podem ser empregadas. Em alguns casos onde existe mais de uma toxina RIP, mais de um ligador ou mais de um ligante, os genes podem ser arranjados em qualquer ordem, contanto que a atividade desejada do agente alvo ou agente alvejado não seja eliminada.
As proteínas de fusão podem ser preparadas usando técnicas convencionais de corte de enzima e ligação de fragmentos das sequencias desejadas. Por exemplo, as seqüências desejadas podem ser sintetizadas usando um sintetizador de oligonucleotídeo, isolado do DNA de uma célula de origem que produz a proteína por digestão da enzima de restrição apropriada ou obtida de uma fonte alvo, tal como uma célula, tecido, vetor ou outra fonte alvo, por PCR de DNA genômico com iniciadores apropriados. Em um exemplo, os conjugados de toxina, tais como qualquer conjugado de ligante-toxina provido no presente documento contendo uma fração de toxina modificada, podem ser gerados por rodadas sucessivas de ligação de seqüências alvo de DNA, em um vetor no sítio de recombinação construído. ; Os produtos digeridos podem ser subclonados em um vetor para manipulação recombinante adicional de uma seqüência, tal como para criar uma fusão com outra seqüência de ácido nucléico já contida dentro de um vetor ou para a expressão de uma molécula alvo.
Em alguns casos, a ampliação da PCR pode ser empregada como um meio para obter quantidades suficientes do produto digerido. Os iniciadores da PCR usados na ampliação da PCR podem também ser construídos para facilitar a ligação operativa das seqüências de ácido nucléico. Por exemplo, a extensão 5' complementar de não molde pode ser adicionada aos iniciadores para permitir uma variedade de manipulações de pós ampliação do produto da PCR sem efeito significativo na ampliação propriamente. Por exemplo, esta extensão 5' pode incluir sítios de restrição, sequencias promotoras, sequencias ligadoras de enzima de restrição, uma seqüência de sítio de clivagem de protease ou seqüências para marcadores de epítopo. Em um exemplo, com o fim de criar uma seqüência de fusão, seqüências que podem ser incorporadas a um iniciador incluem, por exemplo, uma seqüência codificando um marcador myc, marcador his, ou
Ί
outro marcador de epítopo pequeno, tal que o produto da PCR efetivamente contém uma fusão de uma seqüência de ácido nucléico de interesse com um marcador de epítopo. Em outro exemplo, a incorporação de sítios de enzima de restrição a um iniciador pode facilitar a subclonagem do produto de ampliação em um vetor que contém um sítio de restrição compatível, tal como por provisão de extremidades aglutinantes para ligação de uma seqüência de ácido nucléico. A subclonagem dos produtos ampliados da PCR múltipla em um vetor simples pode ser usada como uma estratégia para ligar operativamente ou fundir seqüências de ácido nucléico diferentes. Outros métodos para subclonagem dos produtos da PCR em vetores incluem clonagem de extremidade cega, clonagem de TA, clonagem independente de 1 igação e clonagem In vivo.
Antes da subclonagem de um produto da PCR contendo sítios de enzima de restrição expostos em um vetor, tal como para criação de uma fusão com uma seqüência de interesse, é algumas vezes necessário decompor um produto da PCR digerido daqueles que permanecem sem corte. Em tais exemplos, a adição de marcadores fluorescentes na extremidade 5' de um iniciador pode ser acrescentada antes da PCR. Isto permite a identificação dos produtos digeridos uma vez que aqueles que foram digeridos com sucesso terão perdido o rótulo fluorescente quando da digestão. Em alguns momentos, o uso dos produtos da PCR ampliada contendo sítios de restrição para subclonagem subsequente dentro de um vetor para geração de uma seqüência de fusão pode resultar na incorporação das seqüências ligadoras de enzima de restrição no produto da proteína de fusão. De modo geral, tais seqüências ligadoras são curtas e não prejudicam a função de um polipeptídeo à medida que as seqüências são operativamente ligadas.
2. Produção de Conjugados Contendo Proteínas de Fusão e Sistemas de Expressão A molécula de ácido nucléico codificando uma toxina ou seu conjugado, tais como quaisquer conjugados de ligante-toxina providos no presente documento pode ser provida forma de um vetor que contém a molécula de ácido nucléico. Um exemplo de tal vetor é um plasmideo. Muitos vetores de expressão são disponíveis e conhecidos dos versados na técnica e podem ser usados para expressão de um polipeptideo da toxina, incluindo conjugados da toxina. A escolha do vetor de expressão pode ser influenciada pela escolha do sistema de expressão hospedeiro. Em geral,, os vetores de expressão podem incluir promotores transcricionais e opcionalmente melhoradores, sinais translacionais e sinais de terminação transcricionais e translacionais. Os vetores de expressão que são usados para transformação estável tipicamente possuem um marcador selecionável que permite seleção e manutenção das células transformadas. Em alguns casos, uma origem de replicação pode ser usada para ampliar o número de cópias do vetor. Além dis so, muitos vetores de expressão oferecem tanto um marcador de epítopo de término N ou término C adjacente ao sítio de clonagem múltipla, de modo que qualquer proteína resultante expressa do vetor tenha um marcador de epítopo inserido na estrutura com a sequencia de polipeptideo.
A proteína de fusão pode ser produzida usando técnicas bem conhecidas, onde uma célula hospedeira é transfectada com um vetor de expressão contendo seqüências de controle de expressão ligados operavelmente a uma molécula de ácido nucléico codificando a proteína de fusão a ser expressa (Molecular Cloning A Laboratory Manual, Sambrook e outros, eds., 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989). DNA codificando uma toxina, de modo geral, na forma de uma proteína de fusão contendo um ligante unido direta ou indiretamente a uma toxina modificada, tal como qualquer um dos conjugados de ligante- toxina providos no presente documento, é transferido para dentro de célula hospedeira para expressão. Polipeptideos de toxina, incluindo conjugados de ligante-toxina, podem ser expressos em qualquer organismo apropriado para produzir as quantidades necessárias e forma do polipeptídeo necessário para administração e tratamento. De modo geral, qualquer tipo de célula que pode ser construído para expressar DNA heterólogo e apresenta uma via secretora é apropriado. Hospedeiros de expressão incluem organismos procarióticos e eucarióticos, tais como, E.coli, levedura, plantas, células de inseto, células de mamíferos, incluindo linhagens de células humanas e animais transgênicos. Hospedeiros de expressão podem diferir em seus níveis de produção de proteína, bem como nos tipos de modificações pós-translacionais que estão presentes nas proteínas expressas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser feita com base nestes e outros fatores, tais como, considerações reguladoras e de segurança, custos de produção, da necessidade e métodos de purificação.
a. Plasmideos e Células Hospedeiras para
Expressão
A construção dos vetores de expressão que contém uma molécula de ácido nucléico que codifica a variante da toxina RIP ou um conjugado da variante do ligante-toxina RIP provido no presente documento e a expressão do ácido nucléico nas células transfectadas envolve o uso de técnicas de clonagem molecular bem conhecidas na arte. Tais métodos incluem a construção de vetores de expressão contendo uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo operavelmente ligado aos sinais de controle transcricional/translacional apropriados. Estes métodos também incluem técnicas de ácido nucléico recombinante in vitro (por exemplo, DNA ou RNA), técnicas sintéticas e recombinação in vivo/recombinação genética (vide, por exemplo, técnicas descritas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook e outros, eds. , 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 e 2, Ausubel, e outros eds., Current Protocolsr 1987-1994; John Wiley and Sons, Inc., 1994-1999; e Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Vols I- IV, Pouwels, e outros, eds., e Supplements therein, Elsevier, N. Y., 1995-1998).
Moléculas de ácido nucléico recombinantes para expressão do polipeptideo de interesse nas células hospedeiras estarão na forma de um vetor de expressão, que inclui seqüências de controle de expressão operativamente ligadas a uma molécula de ácido nucléico codificando o polipeptideo. Os métodos para obtenção da transferência estável, de modo que o ácido nucléico estranho seja mantido continuamente no hospedeiro são também conhecidos na técnica. A transformação de uma célula hospedeira com ácido nucléico recombinante pode ser realizada por técnicas convencionais como é bem conhecido dos versados na técnica.
Vários sistemas de vetor de expressão-hospedeiro podem ser usados para expressar a variante da toxina RIP Ou proteína do conjugado variante de ligante-toxina RIP. Estes incluem, porém não estão limitados aos microorganismos, tais como, bactérias, transformados com DNA de plasmídeo recombinante, DNA bacteriófago, ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo a molécula de ácido nucléico que codifica a variante da toxina RIP ou conjugado variante de ligante-toxina RIP; levedura transformada com vetores de expressão de levedura recombinante contendo a molécula de ácido nucléico que codifica a variante da toxina RIP ou conjugado da variante ligante-toxina RIP; sistemas de célula de planta infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus mosaico da couve- flor, CaMV; vírus mosaico do tabaco, TMV) ou vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo de Ti) contendo a molécula de ácido nucléico que codifica a variante da toxina RIP ou conjugado da variante ligante- toxina RIP; sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo a molécula de ácido nucléico que codifica a variante da toxina RIP ou conjugado variante de ligante-toxina RIP; ou sistemas de células de animais transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante contendo a molécula de ácido nucléico que codifica a variante da toxina RIP ou conjugado da variante ligante-toxina RIP ou infectado com vetores de expressão do vírus recombinante (por exemplo, vírus de DNA ou RNA, tais como, porém não limitados aos retrovírus, adenovírus e vaccinia vírus) contendo a molécula de ácido nucléico que codifica a variante da toxina RIP ou conjugado variante de ligante-toxina RIP ou sistemas de célula de animal transformados construídos para expressão estável da variante da toxina RIP ou conjugado da variante ligante- toxina RIP.
Dependendo do sistema de hospedeiro/vetor usado, qualquer de vários elementos de transcrição e tradução apropriados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos melhoradores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. podem ser ligados operavelmente ao ácido nucléico codificando a variante da toxina RIP ou conjugado variante de ligante-toxina RIP no vetor de expressão (vide, por exemplo, Bitter e outros, Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Por exemplo, quando um sistema bacteriano é empregado, os promotores induzíveis, tais como, por exemplo, porém não limitado a Pl de bacteriófago S, PLAC, Ptrp, Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac) ou T7, pode ser empregado. Em outro exemplo, quando um sistema de célula de mamífero for empregado, os promotores derivadores do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneina) ou de vírus de mamífero (por exemplo, os retrovírus de repetição de terminal longa, o adenovírus de promotor tardio ou o promotor do vírus vaccinia 7,5K) podem ser usados. Os promotores produzidos por ácido nucléico recombinante ou técnicas sintéticas também podem ser usados para prover transcrição da molécula de ácido nucléico inserida codificando a variante da toxina RIP ou conjugado variante de ligante-toxina RIP.
Quando o hospedeiro for procariótico, tal como E. coli, células competentes que são capazes de absorção de DNA (isto é, transformação) poderão ser preparadas de células por procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser colhidas após fase de crescimento exponencial e subseqüentemente tratadas por um método de CaCl2. Alternativamente, MgCl2 ou RbCl podem ser empregados. A transformação também pode ser realizada após formação de um protoplasto de uma célula hospedeira ou por eletroporação. De modo geral, um hospedeiro procariótico é empregado como a célula hospedeira.
Quando o hospedeiro é uma célula eucariótica, métodos de transfecção de moléculas de ácido nucléico recombinante incluem formação de coprecipitados de fosfato de cálcio e procedimentos mecânicos convencionais, tais como, microinjeção, eletroporação e inserção de plasmídeo encapsulado em lipossomas. Outro método de transferência de ácido nucléico envolve o uso de um vetor virótico eucariótico, tal como um vírus 40 de símio (SV40), adenovírus, vaccinia vírus, papiloma vírus bovino ou vetor parvovírus autônomo recombinante (por exemplo, conforme descrito na Patente US número 5.585.254) para infectar transitoriamente ou transformar as células eucarióticas e expressar a proteína (Eukaryotic Viral Vectorsf Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). As células eucarióticas também podem ser cotransfectadas com uma molécula de ácido nucléico codificando a variante da toxina RIP ou polipeptídeo de conjugado da variante do ligante- toxina RIP e uma segunda molécula de ácido nucléico codificando um fenótipo selecionável, tal como, gene timidina cinase do Herpes simplex. Alternativamente, a molécula de ácido nucléico codificando a variante da toxina RIP ou polipeptídeo de conjugado de variante do ligante- toxina RIP e a molécula de ácido nucléico codificando um fenótipo selecionável estão presentes no mesmo vetor ou plasmídeo.
Sistemas de expressão eucariótica podem permitir a ocorrência de modificações pós translacionais adicionais de proteínas de mamíferos expressas. Tais células possuem o maquinário celular para processamento pós translacional, do transcrito primário, se for desejado. Tais modificações incluem, porém não estão limitadas à glicosilação, fosforilação e farnesilação. Tais linhagens de células hospedei ras podem incluir, porém não estão limitadas ao CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, Jurkat, HEK-293 e WI38.
i. Sistemas de Expressão de Célula Bacteriana
Nos sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo dos atributos desejados do sistema. Por exemplo, quando grandes quantidades da variante da toxina da RIP ou proteína do conjugado da variante de ligante-toxina RIP devem ser produzidas, vetores que dirigem a expressão dos níveis altos da variante da toxina RIP ou produtos da proteína de conjugado da variante de ligante-toxina da RIP que são prontamente purificados podem ser desejáveis. Aqueles que são construídos para conter um sítio de clivagem para ajudar na recuperação do polipeptídeo expresso são preferidos. Excelentes resultados podem e devem ser obtidos usando vários vetores comercialmente disponíveis, incluindo pET 11a, b, c ou d (Novagen, Madison, WI).
Plasmídeos especificamente preferidos para transformação das células de E.coli incluem os vetores de expressão de pET (vide, por exemplo, Patente US número 4.952.496; disponível na NOVAGEN, Madison, WI; vide, também literatura publicada pela Novagen descrevendo o sistema). Tais plasmídeos incluem pET Ilc e/ou pET 11a, que contêm o promotor T71ac, terminador T7, o operador de E.coli Iac induzível, e o gene repressor lac; pET 12a-c, que contém o promotor T7, terminador T7, e o sinal de secreção de E.coli ompT; e pET 15b (Novagen, Madison, WI), que contém uma sequencia líder His-Tag™ (Seq. ID NO. 40) para uso na purificação com uma coluna His e um sítio de clivagem de trombina que permite a clivagem seguindo-se a purificação sobre a coluna; a região promotora de T7-lac e o terminador T7.
Ácido nucléico codificando um agente de alvejamento, tal como uma quimiocina, ligado a um agente alvejado com e sem ligadores, e outras tais construções, podem ser inseridos nos vetores pET, tais como, vetores de expressão pET 11c, pET-lla, e pET-15b expressão (NOVAGEN, Madison, WI), para expressão intracelular ou periplásmica da variante da toxina RIP ou proteínas de conjugado da variante de ligante-toxina RIP. Alternativamente, o agente alvejado ou agentes de alvejamento podem ser inseridos nos vetores pET e expressos individualmente. Outros plasmídeos incluem os plasmídeos ρKK, especificamente pKK 223-3, que contém o promotor TAC (disponível na Pharmacia; vide também, Brosius e outros (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 6929; Ausubel e outros Current Protocols in Molecular Biology; e Patentes US números 5.122.463, 5.173.403, 5.187.153, 5.204.254, 5.212.058, 5.212.286, 5.215.907, 5.220.013, 5.223.483, e 5.229.279), que contém o promoter tac. 0 plasmídeo pKK foi modificado por inserção de um cassete de resistência à canamicina com as extremidades aglutinantes EcoRI (adquirido na Pharmacia; obtido na pUC4K (vide, por exemplo, Vieira e outros (1982) Gene 19:259-268; e Patente US número 4.719.179) no gene marcador de resistência à ampicilina.
Outros vetores preferidos incluem, porém não
estão limitados ao vetor de expressão induzivel por pPL- lambda e o vetor de promotor tac pDR45 (vide, por exemplo, Patentes US números 5.281.525, 5.262.309, 5.240.831, 5.231.008, 5.227.469, 5.227.293,; disponível na Pharmacia P.L. Biochemicals, vide; também Mott, e outros (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:88; e De Boer e outros (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 80:21); e vetores de baculovírus, tal como, um vetor pBlueBac (também denominado ρJVETL e seus derivados; vide, por exemplo, Patentes US números 5.278.050, 5.244.805, 5.243.041, 5.242.687, 5.266.317, 4.745.051 e 5.169.784), incluindo pBlueBac III. Outros vetores incluem, porém não estão limitados aos plasmídeos pIN-IIIompA, tal como pIN-IIIompA2 (vide, por exemplo, Patente US número 4.575.013 e Duffaud e outros (1987) Meth. Enzymology 153:492-507). Os plasmídeos pIN- IIIompA incluem um sítio de inserção para DNA heterólogo ligado no quadro de leitura transcricional com fragmentos funcionais derivados do gene de lipoproteína de E.coli. Os plasmídeos também incluem um fragmento de DNA que codifica o peptídeo de sinal da proteína ompA de E.coli, posicionado, tal que o polipeptídeo desejado é expresso com o peptídeo de sinal ompA em seu término amino, pelo que, permitindo a secreção eficiente através da membrana citoplásmica. Os plasmídeos incluem, adicionalmente, DNA codificando um segmento específico do operador-promotor de Iac de E.coli que é posicionado na orientação apropriada para expressão transcricional do polipeptídeo desejado, bem como um gene IacI de E.coli funcional separado codificando a molécula repressora associada que, na ausência do indutor de operon Iacr interage com o operador-promotor Iac para prevenir transcrição do mesmo. A expressão do polipeptídeo desejado está sob controle do promotor de lipoproteína (Ipp) e do operador-promotor Iacr embora a transcrição do promotor seja normalmente bloqueada pela molécula repressora. O repressor é seletivamente inativado por meio de uma molécula indutora, pelo que, induzindo a expressão transcricional do polipeptídeo desejado a partir de ambos os promotores.
A proteína repressora pode ser codificada pelo plasmídeo contendo a construção ou um segundo plasmídeo que contém um gene codificando uma proteína-repressora. A proteína-repressora é capaz de reprimir a transcrição de um promotor que contém sequencias de nucleotídeos a qual a proteína-repressora se liga. 0 promotor pode ser desreprimido por alteração das condições fisiológicas da célula. A alteração pode ser realizada por adição ao meio de crescimento de uma molécula que inibe, por exemplo, a capacidade de interação com o operador ou com as proteínas reguladoras ou outras regiões do DNA ou por alteração, da temperatura dos meios de crescimento. As proteínas- repressoras preferidas incluem, porém não estão limitadas ao repressor de E.coli IacI sensível à indução de IPTG, ao repressor cI857 sensível à temperatura. 0 repressor de E.coli IacI é preferido.
Em determinadas concretizações, as construções também incluem uma sequencia terminadora de transcrição. As regiões promotoras e terminadoras de transcrição são cada uma independentemente selecionadas dos mesmos genes ou de genes diferentes. Em algumas concretizações, o fragmento de DNA é replicado nas células bacterianas, tais como,, em E.coli. O fragmento de DNA também inclui, tipicamente, uma origem bacteriana de replicação, para garantir a manutenção do fragmento de DNA da geração a geração das bactérias. Desta forma, grandes quantidades de fragmento de DNA podem ser produzidas por replicação nas bactérias. Origens bacterianas preferidas de replicação incluem, porém não estão limitadas às origines de replicação de fl-ori e colEl.
Hospedeiros bacterianos exemplares contêm cópias cromossômicas de DNA codificando T7 RNA polimerase operativamente ligadas a um promotor induzível, tal como o promotor de IacUV (vide, Patente US número 4.952.496). Tais hospede iros incluem, porém não estão limitados aos lisogenos E.coli cepas HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMSl74(DE3) e BL21(DE3). A cepa BL21(DE3) é a preferida. As cepas pLys fornecem níveis baixos de T7 lilozima, um inibidor natural da T7 RNA polimerase. Os hospedeiros bacterianos preferidos são as células de inseto Spodoptera frugiperda (células sf9; vide, por exemplo, Luckow e outros (1988) Biotechnology 6:47-55 e Patente US número 4.745.051).
Sistemas de expressão empregando hospedeiros bacterianos são facilmente graduáveis para produção de proteína em pequena ou grande escala. Para produção de proteína em grande escala, os métodos, tais como de fermentação em batelada, podem ser empregados para expressar proteínas recombinantes, tais como, toxinas RIP modificadas ou conjugados de ligante-toxina RIP providos no presente documento. Exemplos de métodos de fermentação em batelada são conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, nos Exemplos providos no presente documento. Por exemplo, células hospedeiras bacterianas que contêm vetores de expressão, tais como, vetor pET transportando uma molécula de ácido nucléico que codifica uma toxina RIP ou conjugado de ligante-toxina RIP provido no presente documento, podem ser desenvolvidas em recipientes, tais como, fermentadores, para fermentação em batelada. Tipicamente, tais fermentadores são usados para crescimento de bactérias em 5 a 100 litros ou mais de cultura líquida. A cultura líquida usada para crescimento é tipicamente uma cultura de meios enriquecidos padrão, que podem opcionalmente conter componentes adicionais que melhoram o crescimento das bactérias e/ou produção da proteína expressa. Por exemplo, inibidores da toxina RIP, tal como 4-APP, podem ser adicionados à cultura para melhorar o crescimento das bactérias que expressam toxinas de RIP ou proteínas de conjugado de ligante-toxina RIP. Conforme descrito no presente documento, a adição de 4-APP inibe ás atividades da toxina da toxina RIP expressa nas célulás bacterianas hospedeiras, pelo que, permitindo maior produção da proteína. Para expressão da proteína quando empregando vetores induzíveis, tais como, vetor pET, Um agente de indução (por exemplo, IPTG) é tipicamente adicionado à cultura por um período de tempo, uma vez que a cultura alcança uma densidade específica de crescimento. A concentração do agente de indução e período de tempo de indução podem ser determinados empiricamente ou experimentalmente empregando métodos bem conhecidos na técnica para determinação das condições de crescimento ótimas para expressão da proteína. Os métodos para purificação das proteínas expressas das células hospedeiras bacterianas são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, solubilização com um homogeneizador em um tampão de solubilização apropriado, tal como, uma solução de desnaturação forte (por exemplo, cloridrato de guanidina/solução de uréia) que inclui opcionalmente um detergente, seguido por purificação de coluna. Um método exemplar para purificação das toxinas RIP e conjugados de ligante-toxina RIP é fornecido nos Exemplos no presente documento.
ii. Sistemas de Expressão de Célula de Inseto
üm sistema de expressão alternativo que pode ser
empregado para expressar variante da toxina RIP ou proteína de conjugado de variante de ligante-toxina RIP é um sistema de inseto. Em um tal sistema, vírus de poliidrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é usado para expressar genes estranhos. 0 vírus se desenvolve nas células Spodoptera frugiperda. O ácido nucléico codificando a variante, da toxina RIP ou conjugado de variante de ligante-toxina RIP pode ser clonado nas regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vírus e colocado sob controle de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor da poliedrina). A inserção de sucesso do ácido nucléico codificando a variante da toxina RIP ou conjugado de variante de ligante- toxina RIP resultará na inativação do gene de poliedrina e produção do vírus recombinante não incluído (isto é, falta do vírus de revestimento proteináceo codificado pelo gene de poliedrina). Estes vírus recombinantes são então usados para infectar as células de Spodoptera frugiperda onde o gene inserido é expresso (vide, por exemplo, Patente US número 4 . 215.051) .
Para as células hospedeiras, os vetores de baculovirus, tias como, um vetor pBlueBac (também denominado ρJVETL e seus derivados), especificamente pBlueBac III, (vide, por exemplo, Patentes US números 4.745.051, 5.242.687, 5.243.041, 5.244.805, 5.266.317, 5.270.458, 5.278.050 e 5.169.784 e Pedido PCT Publicado WO 93/10139; disponível na Invitrogen, San Diego) também podem ser empregados para expressão do polipeptideos. O vetor pBlueBacIII é um vetor promoter duplo e prove a seleção dos recombinantes por classificação azul/branco conforme este plasmídeo contém o gene de p-galactosidase (IacZ) sob o controle do promotor ETL reconhecível de inseto e é induzível com IPTG. A construção do DNA introduzido no vetor de baculovirus pBlueBac III é operavelmente ligada ao promotor de poliedrina para gerar o plasmídeo de expressão, que é então cotransfectado com vírus do tipo selvagem nas células de inseto Spodoptera frugiperda (células sf9; vide, por exemplo, Luckow e outros (1988) Biotechnology 6: 47-55 e Patente US número 4.745.051). As placas viróticas menos oclusão de azul são selecionadas e a placa purificada e classificada quanto à presença da molécula de DNA codificando a proteína do conjugado por qualquer metodologia padrão, tal como, Western blots usando antisoros apropriados ou Southern blots usando uma sonda apropriada. O vírus recombinante purificado e selecionado é então cotransfectado, tal como por transfecção com CaPO4 ou lipossomas, nas células Spodoptera frugiperda (células sf9) com o baculovirus do tipo selvagem e crescem em frascos de cultura de tecido ou em culturas de suspensão.
iii. Sistemas de Expressão de Célula de Levedura Outro sistema de expressão que pode ser usado para expressar a variante da toxina RIP ou proteína de conjugado de variante ligante-toxina RIP é a levedura. Na levedura, vários vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis podem ser empregados. Tais vetores são bem conhecido (vide, por exemplo, técnicas descritas . em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook e outros, eds., 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989; Bitter, e outros (1987) Methods in Enzymol. 153: 516-544; Bitter e outros (1987) Methods in Enzymolf 152: 673- 684; Rothstein, DNA Cloning, Vol. II, Glover, D.M., ed. , IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern e outros, eds., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982). Um promotor constitutivo de levedura tal como, ADH ou LEU2 ou um promoter induzível, tal como GAL pode ser empregado (vide, por exemplo, Rothstein, DNA Cloning, Vol. II, Glover, D.M., ed., IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986). Alternativamente, vetores que promovem a integração das sequencias de DNA estranho no cromossoma de levedura podem ser usados.
iv. Sistemas de Expressão de Célula de Plantas
Outro sistema de expressão que pode ser empregado para expressar a variante da toxina RIP ou proteína de conjugado de variante de ligante-toxina RIP é um sistema de célula de planta. Nos casos onde os vetores de expressão de planta são empregados, a expressão de uma molécula de DNA codificando uma proteína de conjugado pode ser acionada por qualquer número de promotores. Por exemplo, promotores viróticos, tais como, promotores 35S RNA e 19S RNA de CaMV (vide, por exemplo, Brisson e outros, (1984) Nature 310: 511-514) ou o promotor da proteína de revestimento para TMV (vide, por exemplo, Takamatsu e outros (1987) EMBO J. 6: 307-311) pode ser empregado; alternativamente, promotores de planta, tais como, a subunidade pequena de RuBisCO (vide por exemplo, Coruzzi e outros (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 e Broglie e outros (1984) Science 224: 838-843); ou promotores de choque térmico, por exemplo, soja hspl7.5-E ou hspl7.3-B (vide por exemplo, Gurley, e outros (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565) podem ser empregado. Estas construções podem ser introduzidas nas células de planta usando plasmideos Ti, plasmideos Ri, vetores de virus de planta, transformação de DNA direta, microinjeção, eletroporação, entre outras técnicas. Para revisões de tais técnicas vide, por exemplo, Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biologyf Academic Press, NY, Secção VIII, pp. 421-463 e Plant Molecular Biologyl 2a Ed., Covet, S.N., Ed., Ch. 7-9, Blackie, Londres 1988.
v. Sistemas de Expressão de Célula de Mamífero Outro sistema de expressão que pode ser empregado para expressar a variante da toxina RIP ou proteína de conjugado de variante de ligante-toxina RIP é um sistema de célula de mamífero. As construções de expressão podem ser transferidas para as células de mamíferos por infecção virótica, tal como adenovírus ou vaccínia vírus ou por transferência direta de DNA, tais como, lipossomas, fosfato de cál cio, DEAE-dextrano e por meios físicos, tais como, eletroporação e microinjeção. Os vetores de expressão para células de mamíferos incluem, tipicamente, um sítio de capeamento de RNAm, uma caixa TATA, uma sequencia de início translacional (seqüência de consenso Kozak) e elementos de poliadenilação. Tais vetores freqüentemente incluem melhoradores de promotor transcricional para expressão de alto nível, por exemplo, o melhorador de promotor SV40, o promotor de citomegalovírus humano (CMV) e a repetição de terminal longo do vírus de sarcoma Rouss (RSV). Os melhoradores de promotor são ativos em muitos tipos, de células, Os promotores de tipo de célula e tecido e regiões melhoradoras também podem ser usados para expressão. Exemplos de regiões melhoradoras/promotoras incluem, porém não estão limitadas aquelas dos genes, tais como, elastase I, insulina, imunoglobulina, virus tumoral mamário de camundongo, albumina, alfa-fetoproteina, alfa-1-
antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadeia-2 leve de miosina e controle de gene de hormônio de liberação gonadotrópica. Os marcadores selecionáveis podem ser empregados para selecionar e manter as células com a construção de expressão. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem, porém não estão limitados a higromicina B fosfotransferase, adenosina desaminase, xantina-guanina fosforibosil transferase, aminoglicosido fosfotransferase, diidrofolato reductase e timidina cinase. A fusão com as moléculas de sinalização de superfície de célula, tais como, TCR-ζ e FceRI-Y pode direcionar a expressão das proteínas a um estado ativo na superfície da célula.
Muitas linhagens de célula estão disponíveis para expressão em mamíferos incluindo células de camundongos, ratos, humanos, macacos, galinhas e hamsters. Linhagens de células exemplares incluem, porém não estão limitadas às CHO, VERO, BHK, HT1080, MDCK, W138, Balb/3T3, HeLa, MT2, NOS de camundongo (não secretora) e outras linhagens de células de mieloma, linhagens de células de hibridoma e heterohibridoma, células RPMI 1788, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, EBNA-I, e células HKB (vide por exemplo Patentes US números 5.618.698, 6.777.205). Linhagens de células também estão disponíveis adaptadas aos meios isentos de soro que facilitam a purificação das proteínas secretadas dos meios de cultura de célula (por exemplo, EBNA-I, Pham e outros, (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42).
Sistemas de células de mamíferos que utilizam vírus recombinantes ou elementos viróticos para direcionar expressão podem ser construídos. Por exemplo, quando se emprega vetores de expressão de adenovírus, ácido nucléico codificando variante da toxina RIP ou conjugado de variante ligante-toxina RIP podem ser ligados a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e seqüência líder tripartide. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma de adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma virótico (por exemplo, região El ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar codificação de ácido nucléico de variante da toxina RIP ou conjugado de variante de ligante-toxina RIP os hospedeiros infectados (por exemplo, vide Logan and Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 3655-3659). Alternativamente, o promotor 7.5K do vaccínia vírus pode ser empregado (vide por exemplo, Mackett e outros (1982; Proc. Natl. Acad. Sei. USAr 79: 7415-7419; Mackett e outros (1984) J. Virol. 49: 857-864, 1984; and Panicali e outros (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79: 4927-4931). De interesse específico são os vetores com base no papiloma vírus bovino que possuem a capacidade de replicar como elementos extracromossômicos (Sarver, 'e outros, Mol. Cell. Biol. 1: 486-96, 1981). Pouco após a entrada deste DNA nas células do camundongo, o plasmídeo replica em cerca de 100 a 200 cópias por célula. A transcrição do DNAc inserido não requer integração do plasmídeo ao cromossoma do hospedeiro, pelo que, rendendo um nível alto de expressão. Estes vetores podem ser ossos para expressão estável por inclusão de um marcador selecionável no plasmídeo, tal como o gene neo. Alternativamente, o genoma retrovirótico pode ser modificado por uso como um vetor capaz de introduzir e direcionar a expressão da variante da toxina RIP ou conjugado de variante de ligante-toxina RIP nas células hospedeira (Cone and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 57:6349-6353, 1984). Expressão de alto nivel também pode ser obtida usando promotores induziveis incluindo, porém não limitado ao promotor de metalotioneina IIa e promotores de choque térmico.
Para produção com alto rendimento e por longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Ao invés de utilizar vetores de expressão que contêm origens viróticas de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNAc codificando a variante da toxina RIP ou proteína de conjugado de ligante- toxina RIP controlada por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, melhorador, seqüências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo em seus cromossomas e cresçam para formar foci que por sua vez podem ser clonados e expandidos nas linhagens de células. Por exemplo, seguindo-se a introdução do DNA estrangeiro, as células construídas podem ser desenvolvidas por 1-2 dias em um meio enriquecido e então são comutadas em meios seletivos. Vários sistemas de seleção podem ser usados incluindo, porém não limitado aos genes de timidina cinase e vírus Herpes simplex (Wigler e outros, Celll 11:223-32, 1977), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska e Szybalski (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 48: 2026-30) e adenina fosfo- ribosiltransferase (Lowy e outros (1980) Cell 22:817-31) que podem ser empregados nas células tk~, hgprt" ou aprt", respectivamente. Também, a resistência antimetabolito pode ser usada como a base de seleção de dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler e outros (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 3567-70; O'Hare e outros (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8: 1527-31, 1981); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan and Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072-6; neo, que confere resistência ao aminoglicosideo G-418 (Colberre- Garapin e outros (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14); e higro, que confere resistência aos genes da higromicina (Santerre e outros (1984) Gene 30: 147-56). Recentemente, genes estáveis adicionais foram descritos, a saber TrpB, os quais permitem que as células empreguem indol no lugar do triptofano; hisD, que permite que as células empreguem histinol no lugar de histidina (Hartman and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8047-51); e ODC (ornitins dedearboxilase) que confere resistência ao inibidor de ornitina descarboxilase, 2-(difluormetil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue and Coffino (1983) J. Biol. Chem. 258: 8384- 8388).
b. Purificação
Técnicas para isolamento e purificação das toxinas RIP modificadas ou conjugados de ligante-toxina RIP das células hospedeiras dependem das células hospedeiras escolhidas e dos sistemas de expressão. Para as moléculas secretadas, as proteínas são geralmente purificadas dos meios de cultura após remoção das células. Para expressão intracelular, as células podem ser lisadas e as proteínas purificadas do extrato. Quando os organismos transgênicos, tais como, plantas transgênicas e animais são empregados para expressão, os tecidos ou órgãos podem ser usados como 1)
material de partida para fabricar um extrato de célula lisado. Adicionalmente, a produção de animal transgênico pode incluir a produção de polipeptideos em leite ou ovos, que podem ser coletados e caso necessário, adicionalmente as proteínas podem ser extraídas e adicionalmente purificadas usando métodos padrão na arte.
Em alguns exemplos, antes da purificação, Os meios condicionados contendo o polipeptídeo de fusão secretado, incluindo conjugados de ligante-toxina, podem ssr obtidos. Os meios condicionados podem ser testados na forma pura. Em outros exemplos, os meios condicionados podem ser clarificados e/ou concentrados. A clarificação pode ser por centrifugação seguido por filtração. A concentração pode ser por qualquer método conhecido de um versado na técnica, tal como, por exemplo, usando membranas de fluxo tangencial ou empregando filtros de sistema de célula agitados. Vários cortes de separação de peso molecular (MW) podem ser usados para o processo ·, de concentração. Por exemplo, um corte de separação de 10.000 MW pode ser usado.
Toxinas RIP modificadas ou conjugados de ligante- toxina RIP produzidos tanto por procariotes quanto eucariotes podem ser afetadas por emprego de técnicas de purificação de proteína padrão conhecidas na técnica incluindo, porém não limitado a SDS-PAGE, diferencial precipitação, diafiltração, ultrafiltração,
eletrofocalização de coluna, eletrofocalização de leito plano, filtração em gel, isotacoforese, fracionamento por tamanho, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia líquida de alto desempenho, cromatografia de quelato, cromatografia de absorção, cromatografia de troca iônica (por exemplo, catiônica, aniônica), cromatografia de interação hidrófoba e cromatografia de exclusão molecular. Técnicas de purificação por afinidade também podem ser usadas para aperfeiçoar a eficiência e pureza das preparações. Por exemplo, o uso de anticorpos monocloiiais ou policlonais, receptores e outras moléculas que ligam toxinas RIP modificadas ou conjugados de ligante-toxina RIP podem ser usados na purificação por afinidade. As construções de expressão podem também ser construídas para adicionar um marcador de afinidade como um epitopo myc, fusão GST ou His6 e purificado por afinidade com anticorpo myc, resina de glutationa e resina-Ni, respectivamente com relação a uma proteina. A pureza pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica incluindo eletroforese de gel e coloração e técnicas espectrofotométricas.
Seguindo-se a transformação, grandes quantidades de proteína podem ser isoladas e purificadas de acordo com os métodos convencionais. Por exemplo, um lisado pode ser preparado do hospedeiro de expressão e a proteína desejada (por exemplo, uma variante de ligante-toxina RIP) purificada usando HPLC, cromatografia de exclusão, eletroforese de gel, cromatografia de afinidade ou outras técnicas de purificação. A proteína purificada geralmente será de cerca de 80% a cerca de 90% pura e pode ser constituída e incluir 100% de pureza. Pureza significa livre de outras proteínas, bem como fragmentos celulares.
Em alguns exemplos, um método de purificação selecionado pode afetar a estrutura da proteína e assim etapas de preparação adicionais são necessárias seguindo-se a purificação para gerar a proteína recombinante desejada. Por exemplo, algumas proteínas expressas necessitam de remultificação das técnicas de purificação que se seguem que empregam condições de desnaturação fortes. Os métodos para remultiplicação das proteínas são conhecidos na técnica e podem incluir, por exemplo, diálise, na presença de níveis baixos de agente de redução (vide, por exemplo, Exemplo 4) .
3. Produção de Conjugados Quimicos
De modo a efetuar a conjugação química no presente documento, o agente de alvejamento é ligado através de um ou mais ligadores selecionados ou diretamente ao agente alvejado. A conjugação química pode ser empregada se o agente alvejado e o agente de alvejamento forem expressos como polipeptídeos separados e deve ser usada se o agente alvejado for diferente do peptídeo ou proteína, tal como um ácido nucléico ou um medicamento não peptídico. Qualquer meio conhecido dos versados na técnica para conjugar quimicamente frações selecionadas pode ser empregado. Vários métodos são descritos no presente documento e incluem, porém não estão limitados aos agentes de reticulação, tais como, compostos de reticulação homo e heterobifuncionais.
As moléculas de ácido nucléico codificando as variantes de toxina RIP ou agentes de alvejamento também podem ser modificadas para facilitar a conjugação química pós-translacional do agente alvejado, tal como uma variante da toxina RIP modificada provida no presente documento, com relação ao agente de alvejamento. Por exemplo, as moléculas de ácido nucléico que codificam a variante da toxina RIP ou agente de alvejamento podem ser fundidas às moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos ligadores que podem se ligar a toxina RIP ao agente de alvejamento seguindo-se a expressão e, opcionalmente, purificação da toxina RIP e do agente de alvejamento. Em outro exemplo, as moléculas de ácido nucléico que codificam as variantes da toxina RIP ou agentes de alvejamento podem ser modificadas para mutar códons específicos para gerar aminoácidos nos polipeptídeos que podem ser usados como sítios para modificação química e anexação dos polipeptídeos, tais como ligadores, para conjugação. Mais especificamente, por remoção e/ou introdução de um resíduo de aminoácido contendo um grupo de anexação à fração ligadora é possível adaptar especificamente o polipeptídeo, de modo a tornar -a molécula mais suscetível à conjugação da fração ligadora de escolha (vide, por exemplo, Publicação de Patente US número 20060252690).
H. Métodos para Atimentar a Produção de Polipeptídeos da RIP ou Seus Conjugados
O presente documento provê um método para aumentar a produção de uma toxina RIP expressa recombinantemente ou conjugado ligante-toxina RIP ou suas variantes por redução da atividade tóxica da toxina RIP, a fim de permitir que o hospedeiro produza quantidades aumentadas de polipeptídeo tóxico. Em tais métodos, uma toxina RIP, ou seu conjugado, tal como qualquer um provido neste documento, pode ser produzido conforme descrito, por exemplo, na Seção G acima, e na presença de um ou mais inibidor RIP. Qualquer inibidor da toxina RIP conhecido de um versado na técnica ou subsequentemente identificado' no presente documento, que possa inativar uma toxina RIP pode ser usado nos métodos providos no presente documento. Conforme descrito no presente documento, inibidores da toxina RIP exemplares incluem, por exemplo, inibidores de oligonucleotídeo específicos de RIP, tais como, aptâmeros RNA, anticorpos específicos de RIP e/ou isômeros de adenina incluindo, por exemplo, adenina, 4-aminopirazolo[3,4- djpirimidina(4-APP) e outros isômeros semelhantes. Para os métodos providos no presente documento, tipicamente, tais inibidores da toxina RIP são qualquer um que iniba a atividade tóxica por alvejamento da atividade de N- glicosidase conservada das toxinas RIP. Para os finst no presente documento, qualquer inibidor da RIP, tal como, adenina ou qualquer análogo da mesma, pode ser empregado nos métodos no presente documento, à medida que o inibidor exiba uma atividade inibidora contra a toxina da RIP ou seu 5 conjugado. Consequentemente, um inibidor da RIP, tal como, 4-APP, pode ser usado nos métodos no presente documento para produção da proteína de uma toxina da RIP, um conjugado de ligante-toxina RIP ou suas variantes, incluindo, porém não limitado a uma SAl modificada, 10 saporina, momordina ou briodina.
A escolha do inibidor da RIP usado no método para aperfeiçoar a produção provido no presente documento depende do número de fatores incluindo, porém não está limitado a escolha da célula hospedeira empregada para 15 expressão da proteína recombinante e o polipeptídeo da RIP específica a ser expresso. A especificidade dos inibidores da RIP para um dado polipeptídeo da RIP é conhecida ou pode ser determinada com base nos ensaios de rotina para avaliar a toxicidade de um polipeptídeo da RIP. Uma discussão da 20 especificidade do inibidor da RIP é descrita no presente documento. Por exemplo, com base na especificidade dos análogos de adenina conhecidos e testados, 4-APP é um candidato para uso nos métodos no presente documento, para expressão e produção aperfeiçoada da toxina Shiga, 25 incluindo a porção SAl, seus fragmentos ativos e seus conjugados. Especificamente, 4-APP pode ser empregado nos métodos de produção aperfeiçoada no presente documento para aumentar o rendimento de qualquer polipeptídeo de SAl modificado provido no presente documento ou qualquer 30 conjugado do mesmo, tal como, por exemplo, qualquer conjugado de LPM provido no presente documento.
A quantidade de inibidor da RIP usada nos métodos de expressão de polipeptídeo pode ser determinada empiricamente com base em seus efeitos conhecidos na atividade tóxica de uma toxina RIP, um conjugado de ligante-toxina RIP ou sua variante. É importante que o inibidor RIP usado nos métodos no presente documento seja propriamente não tóxico à célula hospedeira especifica, que a toxicidade seja conhecida ou possa ser determinada por um versado na técnica, dependendo da célula hospedeira escolhida. Consequentemente, nos métodos de expressão no presente documento, tipicamente um inibidor da RIP, tal como, por exemplo, 4-APP, é adicionado a cerca de ou em 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM,
0,9 mM, 1,0 mM, 1,5 mM, 2,0 mM, 3,0 mM, 4,0 mM, 5,0 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 nM, 40 mM, 50 mM ou mais à medida que o inibidor seja propriamente não tóxico à célula hospedeira escolhida. Fica entendido que a concentração do inibidor da RIP escolhido pode variar dependendo da célula hospedeira escolhida, das condições usadas para expressão recombinante, do periodo de duração da incubação com o inibidor, do inibidor da RIP especifico escolhido e/ou da toxina da RIP especifica ou conjugado de ligante-toxina qüe está sendo produzido.
Em um exemplo, a concentração de inibidor de RIP pode ser determinada empiricamente por realização de um experimento de resposta de dose e avaliação da quantidade de proteina expressa em cada concentração do inibidor. Por exemplo, o Exemplo 4 do presente documento descreve um experimento exemplar para a determinação de uma concentração ótima de 4-APP a ser usada na produção de vários LPMs por avaliação dos perfis de expressão dos vários LPMs por Coloração de Comoassie Blue seguindo-se a expressão na presença de concentrações aumentadas de 4-APP. Conforme exemplificado no Exemplo 4, os resultados mostram algumas diferenças no nivel do polipeptídeo expresso entre os diferentes conjugados de LPM na presença de concentrações aumentadas de 4-APP. Para determinar a concentração do inibidor da RIP a ser usada no método de produção, poderia ser realizado um experimento semelhante 5 usando qualquer polipeptídeo da RIP ou seu conjugado e qualquer inibidor da RIP, tal como, por exemplo, 4-APP, de modo a determinar a concentração do inibidor da RIP que fornece expressão máxima da proteína. Por exemplo, LPMld é expressa em níveis máximos em ou ao redor de 10 mM ou mais 10 de 4-APP, enquanto LPM7 é expresso em níveis máximos na presença de ou a cerca de 2,0 mM ou mais de 4-APP. De modo geral, os conjugados de LPM, tais como aqueles contendo um ligante de quimiocina unido direta ou indiretamente a uma fração de SAl modificada de variante 4 são produzidos nós 15 métodos descritos no presente documento, na presença de ou de cerca de 2,0 mM, 3,0 mM, 4,0 mM, 5,0 mM, 10,0 mM ou 20 mM de 4-APP.
0 inibidor da RIP pode ser adicionado antes, durante ou após transformação das células hospedeiras com o 20 ácido nucléico que codifica uma toxina RIP, um conjugado de ligante-toxina ou sua variante. No caso onde um agente de indução é usado para induzir a expressão da proteína, o inibidor da RIP pode ser adicionado antes, durante e/ou após introdução do agente de indução nas células 25 hospedeiras. Por exemplo, um inibidor da RIP pode ser adicionado em uma concentração simples antes do agente de indução ser adicionado. Em outro exemplo, um inibidor da RIP pode ser adicionado em uma concentração simples, antes do agente de indução ser adicionado e o meio pode ser 30 suplementado com inibidor da RIP adicional durante ou após indução com o agente de indução. Em alguns casos, as concentrações do inibidor da RIP adicionado ao sistema de expressão podem variar em diferentes estágios de acordo com o sistema de expressão específico empregado. Por exemplo, conforme exemplificado no Exemplo 4, o inibidor da RIP 4- APP foi adicionado às células de E.coli transformadas·com ácido nucléico codificando um LPM em uma concentração de
2,0 mM durante um período de crescimento noturno inicial do conjugado de ligante-toxina, contudo, 4-APP adicional foi acrescentado durante a incubação com o agente de indução até uma concentração superior a 10 vezes. Conforme exemplificado no Exemplo 4, as concentrações do inibidor da RIP usado, e a temporização da administração do inibidor da RIP, podem ser otimizadas dependendo do sistema de expressão específico empregado.
Um ou mais de um inibidor da RIP pode ser empregado nos métodos no presente documento para aperfeiçoar a produção de uma toxina RIP, ou seu conjugado. Além disso, outros métodos para aperfeiçoar a expressão da proteína recombinante e produção, tais como, quaisquer um descritos acima, podem também ser usados nos métodos no presente documento. Por exemplo, qualquer método conhecido na técnica que possa ter sido usado para aumentar a expressão e produção de um polipeptídeo da RIP ou seu conjugado pode ser realizado na presença ou ausência de um inibidor da RIP, tal como, 4-APP.
Métodos Adicionais para Aumentar a Produção de
Proteína
Além do aumento da produção de um polipeptídeo da RIP ou conjugado de ligante-toxina por uso de um inibidor da RIP, tal como 4-APP durante expressão e produção da proteína, outros métodos também podem ser empregados. Métodos para aperfeiçoar expressão e produção de polipeptídeos, tal como qualquer polipeptídeo da RIP ou seu conjugado provido no presente documento, incluem qualquer método conhecido na técnica. 0 uso de tais métodos depende do sistema de expressão empregado para gerar o polipeptídeos (por exemplo, bacteriano, levedura, mamíferos, insetos, plantas, etc.) e pode envolver modificação dos fatores, tais como, escolha dos vetores de expressão (por exemplo, para expressão regulada ou constitutiva), condições de crescimento das células hospedeiras ou parâmetros de indução da proteína. Os métodos de purificação conforme mencionados acima para isolamento dos polipeptídeos expressos das células hospedeiras (por exemplo, métodos de Iise da célula hospedeira e separação da proteína) podem também ser otimizados por variações conhecidas na técnica para aperfeiçoar a quantidade de proteína gerada. Exemplos de métodos adicionais para aperfeiçoar a produção são discutidos a seguir.
As condições de crescimento das células hospedeiras podem ser alteradas, por exemplo, por vários métodos incluindo, porém não limitado as alterações no pH, temperatura, teor atmosférico (por exemplo, concentração de oxigênio e dióxido de carbono), teor dos meios, incluindo osmolaridade, concentrações de nutrientes (por exemplo, glicose e outros açúcares, minerais e fosfatos ou outros íons) ou presença de outras moléculas que afetam o crescimento no hospedeiro (por exemplo, antibióticos, compostos antiviróticos ou antimicrobianos, inibidores da proteína, etc.). Modificações nas condições de crescimento podem também ser feitas para diminuir a produção das moléculas inibidoras, tais como, sulfatos, que podem afetar a expressão da proteína (vide, por exemplo, Patente US número 6.68 6.180).
Parâmetros de indução podem ser alterados, por exemplo, por alterações na concentração do agente de indução (por exemplo, IPTG ou outra molécula indutora, temperatura, teor de oxigênio, etc.), periodo de tempo de indução, temperatura de indução, concentração das células hospedeiras no periodo de tempo de indução e influência do histórico do hospedeiro nos níveis de expressão.
A escolha das células hospedeiras também pode afetar os níveis da produção de proteína. Por exemplo, estão disponíveis cepas bacterianas que diferem , em históricos genéticos as quais podem afetar a produção da proteína. Tais diferenças incluem, porém não estão limitadas às mutações nas proteinases (por exemplo, Ion e ompT), recombinases (por exemplo, recA) ou endonucleases (por exemplo, endA), mutações que aperfeiçoam a formação da ligação de dissulfeto e multiplicação da proteína (por exemplo, trxB/gor), presença de DE3 lisogens para expressão acionada por promotor T7 (por exemplo, LysE ou LysS) e mutações que afetam o controle da indução da proteína (por exemplo, IacZY ou Iaclq) ou utilização do açúcar da célula hospedeira. As células hospedeiras podem conter também cópias de genes RNAt ratos para aperfeiçoar o reconhecimento dos códons raros na sequencia de ácido nucléico codificando o polipeptídeo.
Outro método para alterar os níveis de expressão de um polipeptídeo provido no presente documento é modificar o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou alterar o vetor de expressão que contém a molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo. Conforme descrito no presente documento e conhecido na técnica, muitos vetores estão disponíveis para a expressão dos polipeptídeos providos no presente documento, incluindo as variantes da toxina RIP e variantes de ligante-toxina RIP providas no presente documento. Os métodos para aperfeiçoar a produção dos polipeptídeos providos no presente documento incluem seleção de um vetor com propriedades, tais como, porém não limitado a um promotor forte para nível alto de expressão, um promotor regulável para controlar a temporização da expressão, um promotor constitutivo para expressão contínua, ou um promotor estável para expressão de longa duração. 0 uso de um vetor que permita altos níveis de expressão de proteína e regulação controlada é preferido para expressão das proteínas tóxicas, tal como as variantes da toxina RIP e as variantes de ligante-toxina RIP providas no presente documento. Exemplos de tais vetores são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, vetores pET, conforme descrito no presente documento e nos Exemplos, vetores com promotores regulados anaerobicamente (por exemplo, nirB) e vetores induzíveis por L-rhamnose, que são expressos por D-glicose (vetores de pET são comercialmente disponíveis da Novagen; Debinski e outros, (1991) Mol. Cell. Biol. 11:3: 1751-1753; Debinski and Pastan (1992) Cancer Res. 52: 5379 5385; Debinski e outros (1992) J. Clin. Invest. 90:405-411; Oxer e outros (1991) Nucl. Acids Res. 19(11) 2889-2892; Giacalone e outros {2006) Blotechniques 40 (3): 355-363).
0 ácido nucléico codificando o polipeptídeo também pode ser modificado para conter mutações nos códons que codificam os aminoácidos do polipeptídeo, tal que, os códons que são raros no hospedeiro no qual o polipeptídeo deve ser expresso são mutados nos códons que são mais comuns no hospedeiro, sem alterar o aminoácido codificado. 0 emprego de um códon mais utilizado para um hospedeiro específico pode aperfeiçoar a produção do polipeptídeo por aperfeiçoamento da taxa de tradução do polipeptídeo. As freqüências de uso do códon para hospedeiros específicos, tais como, hospedeiros bacterianos, são conhecidas na técnica e podem ser usadas para gerar aminoácidos otimizados que codificam os polipeptídeos providos no presente documento.
I. Ensaios in vivo e in vitro para Medir a Atividade dos Conjugados de Toxina
De modo geral, os conjugados de ligante-toxina
providos no presente documento exibem a atividade tóxica contra uma ou mais células hospedeiras e/ou exibem uma ou mais outras atividades, tais como, em virtude de sua capacidade de alvejar e se ligar a um receptor de 10 superfície de célula. Como tal, os conjugados são terapêuticos candidatos. Caso necessário, os conjugados podem ser avaliados usando ensaios in vitro e in vivo para monitorar e identificar uma atividade de um conjugado de toxina e para selecionar conjugados que exibem tal 15 atividade. Os ensaios in vitro para testar qualquer conjugado provido no presente documento incluem qualquer ensaio para determinar se o conjugado revela atividade na direção das populações alvejadas de célula hospedeira específicas. Tais atividades incluem, porém não estão 20 limitadas aos ensaios de toxicidade, incluindo ensaios de toxicidade com base em célula, ensaios de ligação de receptor, ensaio de internalização de célula e ensaios de quimiotaxia. Adicionalmente, vários modelos de animais in vivo são conhecidos ou podem ser designados para avaliar os 25 efeitos de uma toxina específica em um modelo de doença específico.
1. Ensaios de Atividade in vitro
a. Ensaios de Toxicidade com Base na Célula Os conjugados providos no presente documento podem ser testados quanto a sua atividade tóxica com relação às células hospedeiras, tal como devido a sua atividade de N-glicosidase. Os ensaios para testar a atividade tóxica são descritos em detalhes na Seção D acima e incluem, porém não estão limitados aos ensaios para avaliar a sintese das proteínas, depuração dos ribossomas e o crescimento celular ou viabilidade da célula hospedeira. Por exemplo, a célula hospedeira escolhida para avaliação 5 da atividade tóxica pode ser uma conhecida por expressar o receptor alvejado. Tais células podem incluir aquelas obtidas diretamente de um indivíduo, isto é, do sangue, soro ou outra fonte de tecido, ou qualquer linhagem, de célula conhecida por expressar um receptor de superfície de 10 célula. Tais células incluem células ativadas. As células podem ser ativadas in vitro por qualquer número de estímulos e/ou podem ser obtidas diretamente de um indivíduo possuindo uma doença ou transtorno especificamente qualquer doença inflamatória ou transtorno 15 caracterizado por leucócitos ativados ou outro tipo de célula. Exemplos de tipos de célula que podem ser testados nos ensaios de atividade tóxica incluem, porém não estão limitados a qualquer célula imune incluindo, porém ,não limitado aos monócitos, macrófagos (incluindo macrófagos 20 alveolares, micróglia, células de Kupffer), células dendríticas (incluindo células dendríticas maduras e imaturas ou células de Langherans), células T, (incluindo CD4 positivas, tais como, porém não limitado as células Thl e/ou Th2, ou CD8 positivas), células B, eosinófilos, 25 basófilos, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK) , neutrófilos, e células endoteliais ou suas formas ativadas. Outras células que podem ser testadas quanto a toxicidade com relação a um conjugado de ligante-toxina incluem, por exemplo, células cancerígenas ou linhagens de 30 células cancerígenas, tais como, células U251, HT-29 ou THP-I. Conforme descrito acima, a sobrevivência celular (ou morte celular) das células pode ser determinada, por exemplo, pela capacidade de liberar ATP no meio de cultura, ί
pela capacidade das células de reduzir MTT de corante vital e/ou através da capacidade de excluir o corante azul de tripano.
b. Ensaios de Ligação de Receptor e Internalização
Conjugados de ligante-toxina, tal como qualquer conjugado da toxina de quimiocina, por exemplo, qualquer LPM provido no presente documento contendo uma fração de SAl modificada são projetados para alvejar um receptor de 10 superfície de célula em uma ou mais células hospedeiras alvejadas. A ligação do conjugado da toxina a tais receptores de superfície de célula pode ser avaliada diretamente por avaliação da ligação de um conjugado da toxina às células. Em alguns exemplos, a ligação dos 15 conjugados de toxina aos monócitos, macrófagos (incluindo macrófagos alveolares, micróglia), células T (incluindo células Thl e Th2), células B, eosinófilos, basófilos, células dendríticas, células de Kupffer, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e células 20 endoteliais podem ser determinados. Caso desejado, as células podem ser ativadas primeiro com qualquer agente de ativação conhecido a fim de induzir a expressão de um receptor, tal como ocorre frequentemente sob condições inflamatórias e patogênicas observadas em várias doenças e 25 transtornos, antes da realização dos experimentos de ligação. As células testadas podem ser linhagens de célula ou células primárias derivadas de qualquer doador apropriado isoladas diretamente do doador ou cultivadas por um longo período sob condições que induzem o fenótipo 30 celular apropriado. Em alguns experimentos, os ensaios competitivos podem ser empregados com o ligante não conjugado cognato para avaliar a atividade do conjugado da toxina em comparação ao ligante. Por exemplo, se o conjugado da toxina LPMld for testado (contendo a quimiocina MCP-I conjugada a uma SAl modificada), MCP-I sozinha pode ser usada nos ensaios de competição.
Em um exemplo, a capacidade dos conjugados da toxina de se ligarem a uma célula hospedeira conhecida para expressar um receptor de célula específico pode ser avaliada por marcação do conjugado com qualquer agente detectável conhecido, tal como, porém não limitado a uma fração fluorescente, uma fração de radioatividade ou um polipeptídeo marcador (isto é, marcador Flag, His, myc). Por exemplo, os conjugados de toxina podem ser marcados com uma fração fluorescente, tal como, isotiocianato de fluoresceína (FITC). Concentrações crescentes de conjugado de toxina marcado com FITCC podem ser adicionadas a qualquer tipo de célula desejado e incubadas a 40C por um período de tempo designado, por exemplo, 30 minutos ou 1 hora. Quando da lavagem das células para remover qualquer conjugado de toxina não ligado, a fluorescência ligada da célula pode ser medida por citometria de fluxo. Em alguns casos, a afinidade de ligação do conjugado da toxina pode ser determinada por comparação da afinidade de ligação de um ligante ao conjugado de ligante-toxina por divisão da concentração do conjugado da toxina pela concentração do ligante que fornece valores fluorescentes médios iguais nas medições de citometria de fluxo (vide, por exemplo, Thompson e outros (2001) Protein Engineering, 14: 1035- 1041). Adicionalmente, caso desejado, a capacidade do conjugado da toxina de ser internalizado pelas células pode ser avaliada por comparação da fluorescência a 40C versus 37°C. 0 tempo de incubação pode ser ajustado para garantir que os conjugados da toxina não sejam tóxicos às células durante a incubação a 370C. Outros métodos para avaliar a ligação e internalização são conhecidos dos versados na técnica e incluem, porém não estão limitados ao uso de radioatividade, ELISAs com base em célula e outros tais ensaios.
c. Ensaios de Quimiotaxia
Conjugados de toxina, especificamente qualquer um ou mais dos conjugados de toxina da quimiocina, tal como, qualquer conjugado de LPM provido no presente documento contendo uma fração de SAl modificada podem ser testados quanto a sua capacidade de modelar a quimiotaxia das células usando ensaios de quimiotaxia convencionais. Tal determinação se correlaciona à capacidade da quimiotaxia de se ligar ao receptor de quimiocina cognato. Em tais ensaios, a migração dos leucócitos, incluindo leucócitos ativados, pode ser induzida por quimiocinas e medida por contagem de células que migram através de um filtro usando um ajuste de rotina de câmara Boyden (vide, por exemplo, McDonald e outros (2001) IDrugsr 4: 427-442). Por exemplo, qualquer célula desejada, incluindo porém não limitado aos monócitos, macrófagos (incluindo macrófagos alveolares, micróglia), células T (incluindo células Thl e Th2), células B, eosinófilos, basófilos, células dendríticas, células de Kupffer, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e células endoteliais podem ser colocados em placas no poço superior de uma câmara Boyden modificada. Tais células podem ser linhagens de células ou podem ser células primárias de qualquer doador apropriado isoladas diretamente do doador ou cultivadas por um prazo longo sob condições que induzam o fenótipo celulár apropriado. As câmaras inferiores da câmara Boyden apresentam, tipicamente, meio de cultura contendo a quimiocina de ligante. Em alguns casos, determinadas células são constitutivamente ativas e podem migrar sem qualquer estímulo exógeno específico. Tais células incluem, por exemplo, células THP-I. Consequentemente, se as células THP-I forem usadas nos ensaios de quimiotaxia, nenhuma quimiocina exógena será necessária e os efeitos do conjugado de quimiocina podem ser comparados às células 5 ativadas presentes na câmara inferior através da migração e das células inativas que permanecem na parte superior da câmara (McDonald e outros (2001) IDrugs, 4: 427-442). Um ou ambos os poços superior e inferior da câmara Boyden podem ser tratados com várias concentrações do conjugado da 10 toxina de quimiocina. Seguindo-se a incubação por um periodo de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas ou mais, o número de células em cada poço da câmara (ou presente no filtro) pode sér determinado. Os efeitos do conjugado da toxina ■ de 15 quimiocina nas células em cada uma das respectivas câmaras podem ser determinados e comparados aos dos poços de controle que não contêm o conjugado de toxina. A ausência das células em uma ou ambas as câmaras e/ou a ausência de migração das células ativas na câmara inferior indica que o 20 conjugado da toxina de quimiocina é ativo contra a população de células alvo.
2. Modelos de Animais in vivo para Teste de
Conjugados
Os conjugados providos no presente documento, tal 25 como qualquer polipeptídeo conjugado para uma SAl modificada ou sua porção ativa incluindo, por exemplo, qualquer conjugado da LPM provido no presente documento contendo uma fração de SAl modificada podem ser usados para tratar doenças nas quais as quimiocinas e/u seus receptores 30 estão envolvidos ou implicados. Conjugados específicos para doenças específicas são descritos no presente documento. Um versado na técnica pode, caso necessário, testar conjugados em modelos bem conhecidos para confirmar ou identificar conjugados para uso para indicações especificas. Os modelos de doenças em animais são bem conhecidos. Tais modelos incluem qualquer modelo animal de doenças inflamatórias, especificamente doenças envolvendo leucócitos ativados ou células que expressam receptores de quimiocina em determinados estados de doença são contemplados no presente documento como sendo tratados com um conjugado de ligante- toxina. 0 ensaio da atividade dos conjugados de toxina em tais modelos animais pode confirmar a atividade e/ou identificar aqueles conjugados de toxina apropriados para tratamento de uma doença ou condição especifica contemplada no presente documento.
Os conjugados de ligante-toxina providos no presente documento, incluindo qualquer conjugado de LPM contendo uma fração" de SAl modificada podem também se testados em modelos de doenças para os quais outros conjugados foram usados, tais como, por exemplo, o modelo de xenoenxerto de camundongo para identificar atividade antitumor (vide, por exemplo, Beitz e outros (1992) Cancer Research 52:227-230; Houghton e outros (1982) Cancer Res. 42:535-539; Bogden e outros (1981) Cancer (Philadelphia) 48:10-20; Hoogenhout e outros (1983) Int. J. Radiat. Oncolr Biol. Phys. 9:871-879; Stastny e outros (1993) Caneer Res. 53:5740-5744).
Os modelos animais para selecionar candidatos para tratamento de mamíferos são bem conhecidos e são vários modelos reconhecidos. Além disto, os papéis das células imunes ativadas naqueles estados de doença foram demonstrados. Modelos exemplares de tais doenças e condições incluem, porém não estão limitados aos que se encontram na discussão a seguir.
a. Lesão à Medula Espinal (SCI)
Modelos para teste e demonstração da atividade dos conjugados no presente documento para tratamento de SCI are conhecidos dos versados na técnica. Exemplos de referências que fornecem e utilizam modelos de animais com SCI que podem ser empregados para testar conjugados de ligante-toxina, tais como conjugados de LPM contendo uma fração de SAl modificada, incluem, porém não estão limitados às referências que se seguem estabelecidas no presente documento.
Bennett e outros (1999), Espasticidade em ratos com lesão na medula espinal sacral, J. Neurotrauma 16:69- 84, provê um modelo de rato com espasticidade muscular que é minimamente interrompida, não interferindo com as funções da bexiga, intestinos ou locomotora. As transecções espinais foram realizadas no nivel sacral S2 e, assim, apenas afetaram a musculatura da cauda. Após a transecção espinal, os músculos da cauda ficaram inativos por 2 semanas. Seguindo-se este periodo inicial, hipertonia, hiperreflexia e clônus se desenvolveram na cauda, e cresceram mais pronunciadamente com o tempo. Estas alterações foram avaliadas no rato em alerta, uma vez eu a causa é prontamente acessível e fácil de ser manipulada. 0 estiramento muscular ou estímulo cutâneo da cauda produziram espasmos musculares e aumentos marcantes no tônus muscular, conforme medido com registros de força e eletromiográficos. Quando a cauda não estava contida, espasmos espontâneos ou extensor e flexor induzidos por reflexo enrolaram a cauda. 0 movimento durante os espasmos frequentemente disparava clônus ao final da cauda. Os pelos da cauda e pele se mostraram hiper reflexivos ao toque leve, sendo retirados rapidamente ao contato e por vezes o clônus se sucedida por contato repetido da causa sobre uma superfície. Os reflexos musculares segmentados da cauda, por exemplo, reflexos de Hoffman (reflexos H) foram medidos antes e após espinalização e aumentaram significativamente 2 semanas a pós transecção. Estes resultados indicam que os ratos com espinal sacral desenvolveram sintomas de espasticidade nos músculos da cauda com características semelhantes às vistas nos músculos dos membros de seres humanos com lesão da medula espinal e assim fornecem uma preparação conveniente para estudo desta condição.
Taoka e outros (1998), Lesão a medula espinal no rato, Prog Neurobiol 56:341-58, fornece uma revisão dos mecanismos patológicos da lesão a medula espinal induzida por trauma em ratos para desenvolvimento adicional de novas estratégias terapêuticas. A lesão a medula espinal induzida por trauma é uma conseqüência de um insulto físico inicial e um processo de lesão progressiva subsequente que envolve vários eventos patoquímicos conduzindo à destruição do tecido; o último processo, portanto, sendo um alvo do tratamento farmacológico. Recentemente, os neutrófilòs ativados mostraram estar implicados no último processo de lesão à medula espinal em ratos. Os neutrófilòs ativados danificam as células endoteliais por liberação dos mediadores inflamatórios, tais como, elastase de neutrófilo e radicais livres de oxigênio. A adesão dos neutrófilòs ativados à célula endotelial também desempenharia um papel na lesão da célula endotelial. Esta lesão da célula endotelial poderia, por sua vez, induzir perturbações microcirculatórias conduzindo à isquemia da medula espinal. Alguns agentes terapêuticos que inibem a ativação do neutrófilo aliviam as perturbações motoras observadas no modelo de rato de lesão da medula espinal. Metilprednisolona (MPS) e glanglidiosido GMl, que são os únicos dois agentes farmacológicos corrente e clinicamente disponíveis para tratamento da lesão à medula espinal aguda, não inibem a ativação do neutrófilo neste modelo de rato. Tomadas em conjunto, estas observações suscitam a possibilidade de que outros agentes farmacológicos que inibem ativação do neutrófilo usados em conjunto com MPS ou gangliosido GMl possam ter um efeito sinergístico no tratamento de lesão à medula espinal traumática em seres humanos.
Carlson e outros (1998), Resposta inflamatória aguda na lesão espinal seguido por lesão por impacto, Exp Neurol 151:77-88, examina a distribuição rostral-caudal dos neutrófilòs e macrófagos/micróglia em 4, 6, 24 e 48 horas após lesão por contusão à medula espinal TlO do rato (peso de 10 g, queda de 50 mm). Os neutrófilòs foram localizados predominantemente nas regiões necróticas, com um curso de tempo que teve máxima em 24 horas, conforme medido com ensaios de atividade de mieloperoxidase (MPO). A máxima mais aguda da atividade de MPO estava localizada entre 4 mm rostral e caudal em relação à lesão. Macrófagos/micróglia foram visualizados com anticorpos contra EDI e OX-42. Várias células com uma morfologia fagocítica estavam presentes por 24 horas, com um número maior por 48 horas. Estas células estavam predominantemente localizadas dentro da matéria cinza e matéria branca do funículo dorsal. 0 número de células declinou gradualmente através de 6 mm rostral e causai em relação à lesão. Coloração com OX-42 também revelou micróglia reativa com processos cegos, especialmente em níveis distantes da lesão. 0 número de macrófagos/micróglia estava significativamente
correlacionado à quantidade de lesão do tecido em cada nível.
Expressão da citocina pró-inflamatória e de RNAm da quimiocina quando da lesão à medida espinal experimental em camundongos: um estudo de hibridização in situ, Bartholdi e outros (1997) Eur J Neurosci 9:1422-38, descreve um estudo do padrão de expressão das citocinas pró-inflamatórias e quimioatrativas em um modelo de lesão à medula espinal experimental em camundongos. A hibridização in situ mostra que os transcritos para citocinas pró- inflamatórias TNF alfa e IL-I bem como quimiocinas MIP-Ia e MIP-Ιβ são supraregulados dentro da primeira hora seguindo- se a lesão. Nesta fase anterior, a expressão das citocinas pró-inflamatórias é restrita às células nas vizinhanças da área de lesão provavelmente células CNS residentes. Embora TNF alfa seja expresso em uma janela de tempo muito estreita, IL-I pode ser detectada em uma segunda fase em um subconjunto de granulócitos polimorfonucleares que migram para a medula espinal ao redor de 6 horas. A mensagem para as quimiocinas MIP-Ia e -β é expressa em um modo generalizado na matéria cinza da medula espinal total ao redor de 24 horas e novamente se restringe ao infiltrado celular no sitio de lesão em 4 dias seguindo-se a lesão.“Os dados indicam que as células de CNS residentes, mais provavelmente células micróglia e não células inflamatórias periféricas, são a principal fonte para citocina e RNAms de quimiocina. 0 padrão de citocina definido observado indica que os eventos inflamatórios mediante lesionamento do CNS são muito bem controlados. A expressão muito precoce das mensagens de citocina e quimiocina pró-inflamatórias pode representar um elemento importante de recrutamento das células inflamatórias.
A análise morfométrica dos vasos sanguíneos na lesão à medula espinal experimental crônica: hipervascularidade e recuperação da função, Blight e outros (1991), J Neurol Sci 106:158-74, provê um método de trauma da medula espinal em porquinhos da índia, com base na compressão a um conjunto de espessura ajustada, que foi descrito anteriormente. As lesões por compressão da medula torácica inferior foram produzidas em 11 porquinhos da índia adultos anestesiados e o resultado monitorado, usando sucessivos testes comportamentais e morfometria da lesão em 2-3 meses. Este relatório descreve alterações na vascularidade da medula espinal, com base em análise microscópica de seções transversais plásticas de 1 mícron através do centro da lesão. A densidade média do vaso sanguíneo nestas lesões oi aproximadamente duas vezes aquela encontrada nas regiões equivalentes de medulas espinais não lesionadas, normais e a hipervascularidade da matéria branca estendeu-se pelo menos por quatro segmentos da medula espinal no sentido do crânio e da cauda a partir do centro da lesão. A distribuição do diâmetro capilar foi significativamente deslocada para valores maiores e espaços perivasculares maiores circundaram a maior parte dos capilares e vasos pré e pós-capilares. A extensão da hipervascularidade não estava correlacionada com a gravidade total da lesão, porém houve uma correlação positiva e significativa entre a densidade dos vasos sanguíneos nos 400 micra externos da matéria branca e perda secundária da função neurológica abaixo da lesão, vista entre um dia e oito semanas após a lesão. Estes dados indicam que a hipervascularização da lesão está relacionada aos mecanismos patológicos na lesão da medula espinal, possivelmente respostas inflamatórias, que sâo relativamente independentes da lesão mecânica primária, porém mais proximamente conectadas à perda e recuperação da função.
Níveis aumentados de ácido quinolínico de excitotoxina na medula espinal seguindo-se lesão por contusão, Blight e outros (1993), Brain Res 632:314-6, mostra que os produtos de fagócitos inflamatórios contribuem em potencial para patologia secundária seguindo- se trauma à medula espinal e apresenta um estudo quantificando os níveis da neurotoxina e produto de macrófagos ativados, ácido quinolínico (QUIN) na medula espinal torácica inferior de porquinhos da índia adultos, 5 dias após breve lesão por compressão. No sítio lesionado (T13), elevações nos níveis QUIN de tecido (> 10 vezes) acompanharam aumentos proporcionais na atividade ,de indoleamina-2,3 dioxigenase (> 2 vezes) e as concentrações de L-cinurenina (>2,5 vezes). Em contrate, nenhuma alteração significativa ocorreu nas duas regiões não lesionadas examinadas em comparação aos controles, a saber, medula espinal cervical (C2) e ao córtex somatossensor.
Forbes e outros (1994), Inibição da adesão de neutrófilo não impede lesão isquêmica à medula espinal, Aiin Thorac Surg 58:1064-8, acredita em modelos animais para mostrar que a paraplegia pode ocorrer após oclusão aórtica transitória como uma conseqüência da isquemia primária à medula espinal ou lesão durante o período de reperfusão. Nos modelos animais de isquemia/reperfusão, existe evidência de que a lesão de reperfusão pode ser modulada parcialmente pelos neutrófilòs. A eficácia da aderência dos neutrófilòs bloqueando o anticorpo monoclonal de murinos (MAb 60.3) foi avaliada na isquemia da medula espinal/reperfusão em coelhos. A isquemia da medula espinal foi realizada por oclusão com cateter de balão da aorta infrarenal. A avaliação neurológica foi classificada como normal, déficit neurológico parcial ou paralisia completa. 0 monitoramento eletrofisiológico com potenciais provocados somatossensorialmente foram usados para determinar o período de tempo ótimo da oclusão. Os animais foram tratados aleatoriamente com 2 mg/kg de Mab intravenoso 60,3 (n = 8) ou solução de salmoura (n = 9) com o investigador sem conhecimento do tratamento. Os tempos de oclusão medidos não foram diferentes entre os grupos (controle 32, + /- 3,6 minutos versus MAb, 32,4 +/- 6,0 minutos). Cinco (55%) animais tratados com salmoura e quatro (50%) tratados com MAb 60,3 ficaram paraplégicos. Os animais com paraparese inicial todos progrediram para paraplegia flácida dentro de 24 horas. O estudo conclui que a lesão à medula espinal após oclusão aórtica transitória depende do complexo de glicoprotéica CD11/CD18 do neutrófilo. A lesão neste experimento pode ocorrer durante a isquemia e assim pode não depender dos neutrófilòs ou reperfusão.
Liu e outros (1997), Apoptose neuronal e glial após lesão traumática à medula espinal, J. Neurosci 17:5395-406, examina as medulas espinais de ratos submetidos à lesões traumáticas de gravidade branda à moderada. Dentro de minutos após impacto de queda de peso brando (um peso de 10 g caindo a 6,25 mm), os neurônios na área de impacto imediata mostraram uma perda das substâncias Nissl citoplásmica. Nos próximos 7 dias, esta área de lesão expandiu e cavitou. Os neurônios positivos de desoxiuridina trifosfato-biotina mediados por
desoxinucleotidil transferase terminal (tdT) abreviados (TUNEL) foram observados primariamente restringidos à área de lesão maior 4-24 horas após a lesão, com uma presença máxima de 8 horas após a lesão. Gliais positivas-TUNEL estavam presentes em todos os estágios estudados entre 4 horas e 14 dias, com uma presença máxima dentro da área de lesão 24 horas após a lesão. Sete dias após a lesão, uma segunda onda de células gliais positivas-TUNEL foi observada na matéria branca periférica à lesão e se estendendo pelo menos vários milímetros para fora do centro da lesão. Apoptose como um mecanismo foi evidenciada por microscopia de elétron, bem como, por coloração nuclear com corante Hoechst 33342 e por exame do DNA preparado do sítio de lesão. Adicionalmente, injeções intraperitoneais repetidas de cicloeximida, começando imediatamente após uma lesão por queda de peso a 12,5 mm produziu uma redução substancial na evidência histológica de lesão à medula e na disfunção motora avaliada 4 semanas mais tarde. Os dados sustentam a hipótese de que a apoptose dependente da síntese da proteína ativa contribui para a morte da célula neuronal e glial, bem como para a disfunção neurológica induzia por insultos traumáticos de gravidade leve· a moderada à medula espinal do rato.
Resultados exemplares de um conjugado de LPM em um modelo de lesão da medula espinal são estabelecidos ho Exemplo 8, que mostra resultados exemplares de LPMld em um modelo de lesão da medula espinal. Outros LPMs, tais como, qualquer provido no presente documento contendo uma quimiocina conjugada a SAl modificada, também podem ser testados em ensaios semelhantes. Tais resultados demonstram que LPMs podem ser usados como terapêuticos candidatos para tratamento da lesão da medula espinal.
b. Doenças Neurodegenerativas Incluindo Lesão Cerebral Traumática e Acidente Vascular
Modelos para testar e demonstrar a atividade dos conjugados no presente documento para tratamento de doençás neurodegenerativas, tais como, lesão cerebral traumática e acidente vascular são conhecidos dos versados na técnica. São fornecidos exemplos de referências que fornecem e empregam modelos animais de doenças neurodegenerativos, tais como, lesão cerebral traumática e acidente vascular. Tais modelos podem ser empregados para confirmar ou identificar conjugados de ligante-toxina, tais como conjugados de LPM contendo uma fração de SAl modificadà, incluindo, porém não estão limitados às referências que se seguem estabelecidas presente documento. Ghirnikar e outros (1996), Expressão da quimiocina em lesão cerebral em ferida por estocada em rato, J. Neurosci Res 46:727-33 descreve que a lesão traumática ao sistema nervoso central (CNS) de mamífero adulto resulta em astrogliose reativa e na migração de células hematógenas para o tecido neural danificado. As quimiocinas são reconhecidas como mediadores de alterações inflamatórias que ocorrem seguindo-se a lesão. A expressão de MCP-I foi demonstrada em trauma no cérebro de ratos (Berman e outros (1996) J Immunol 156:3017-3023). Usando um modelo de ferida por estocada para lesão mecânica, a expressão de duas outras quimiocinas: RANTES e ΜΙΡ-Ιβ no cérebro de ratos foi estudada. A lesão com ferida por estocada foi caracterizada por gliose disseminada e infiltração de células hematógenas. Coloração imuno- histoquímica relevou a presença de RANTES e ΜΙΡ-Ιβ no cérebro lesionado. RANTES e ΜΙΡ-Ιβ foram ambos expressos difusamente no tecido necrótico e foram detectados no primeiro dia após a lesão (dpi). Estudos de marcação dupla mostraram que ΜΙΡ-Ιβ porém não RANTES foi expresso por astrócitos reativos próximo ao sítio de lesão. Além disto, coloração com ΜΙΡ-Ιβ foi também detectada nos macrófagos no sítio de lesão. A expressão inicial das quimiocinas esteve proximamente correlacionada com o aparecimento de células inflamatórias no CNS lesionado, indicando que RANTES e ΜΙΡ- Ιβ poderiam desempenhar um papel nos eventos inflamatórios da lesão cerebral traumática. Este estudo também demonstrou expressão de ΜΙΡ-Ιβ nos astrócitos reativos seguindo-se trauma ao CNS dos ratos.
Wang e outros (1998), Expressão prolongada da proteína-10 induzível por interferon no córtex isquêmico após oclusão permanente da artéria cerebral mediana em ratos, J Neurochem 71:1194-204, investigam o papel de IP-10 no acidente vascular focal e estudam expressão temporal de RNAm de IP-IO após oclusão da artéria cerebral média no rato por meio de análise Northern. A expressão de RNAm de IP-IO após acidente vascular focal demonstrou perfil bifásico único, com um aumento marcante nas 3 horas (4,9 vezes em relação ao controle; p 0,01), um nivel máximo em 6 horas (14,5 vezes, p 0,001) após oclusão da artéria central média e uma segunda indução de onda 10-15 dias após lesão isquêmica (aumento de 7,2 e 9,3 vezes por 10 e 15 dias, respectivamente; p 0,001). A hibridização in situ confirmou a expressão induzida de RNAm de IP-10 e revelou sua distribuição espacial após acidente vascular focal. Estudos imuno-histoquimicos demonstraram a expressão de peptídeo IP-10 nos neurônios (3-12 horas) e células astrogliais (6 horas a 16 dias) da zona isquêmica. Uma ação quimiotática dependente de dose de IP-10 nas células gliais C6 e anexação melhorada dos neurônios granulares cerebelares dos ratos foram demonstradas. Os dados indicaram que a isquemia induz IP-10, que desempenha um papel pleiotrópico no recrutamento prolongado dos leucócitos, migração/ativação do astrócito e anexação/brotamento de neurônios após acidente vascular focal.
Galasso e outros (1998), Lesão cerebral excitotóxica estimula a expressão do receptor de quimiocina CCR5 em ratos neonatais, Am J Pathol 153:1631-40, avalia o impacto de injeções intra hipocampo de NMDA na expressão de CCR5 em ratos 7 dias após o nascimento. A reação da cadeia da polimerase de transcrição reversa revelou um aumento na expressão de RNAm de CCR5 no hipocampo 24 horas após o lesionamento e análise de hibridização in situ demonstrou que RNAm de CCR5 foi expresso no hipocampo lesionado e regiões adjacentes. Análise Western blot demonstrou proteína CCR5 aumentada nos extratos de tecido do hipocampo 32 horas após o lesionamento. Estudos de imunocitoquímica complementar identificaram infiltração de
micróglia/monócitos e neurônios lesionados como as principais células imunorreativas a CCR5. Estes resultados fornecem evidência de que a lesão excitotóxica aguda regula a expressão de CCR5.
Vannucci e outros (1999), Modelo de rato de lesão cerebral hipóxica-isquêmica, J Neurosci Res 55:158-63, utilize modelo de rato imaturo para obter discernimentos 10 quanto á patogênese e gerenciamento da lesão cerebral hipóxica-isquêmica. O modelo apresenta ligação de uma artéria carótida comum seguido por hipóxia sistêmica. 0 insulto produz lesão cerebral hipóxica-isquêmica permanente limitada ao hemisférico cerebral ipsilateral à oclusão da 15 artéria carótida. Este modelo é empregado nas investigações para identificar estratégias terapêuticas para prevenir ou minimizar lesão cerebral hipóxica-isquêmica.
c. Doenças Neurodegenerativas - Doença de Alzheimer (AD)
Modelos para testar e demonstrar a atividade dos
conjugados no presente documento para tratamento de doenças neurodegenerativas, tal como (AD), são conhecidos dos versados na técnica. São providos exemplos de modelos animais de tais doenças. Estes modelos podem ser empregados 25 para confirmar ou identificar os conjugados para uso no tratamento de doenças neurodegenerativas, tais como, doença de Alzheimer, que podem ser usados para testar conjugados de ligante-toxina, tais como, conjugados de LPM contendo uma fração de SAl modificada, incluindo, porém não limitado 30 à referência que se segue estabelecida no presente documento.
Hauss-Wegrzyniak e outros (1998), Neuroinflamação crônica em ratos reproduz componentes da neurobiologia da doença de Alzheimer, Brain Res 780:294-303, descreve que .os processos inflamatórios desempenham um papel na patogênese das alterações degenerativas e prejuízos cognitivos associados à doença de Alzheimer e descreve o uso de lipopolissacarídeo (LPS) da parede celular das bactérias gram-negativas para produzir inflamação crônica, global, dentro do cérebro de ratos jovens. A infusão crônica de LPS (0,25 pg/h) no quarto ventrículo por quatro semanas produziu (1) um aumento no número de proteína ácida fibrilar glial-astrócitos ativados positivos e micróglia reativa positiva OX-6 distribuídos através de todo o cérebro, com o maior aumento ocorrendo dentro do lóbulo temporal, especificamente o hipocampo, (2) uma indução nos níveis da interleucina-1 beta, fator-alfa de necrose de tumor e RNAm da proteína precursora de beta-amiloide dentro da região do prosencéfalo basal e hipocampo, (3) a degeneração dos neurônios pirimidais CA3 do hipocampo e (4) um prejuízo significativo na memória espacial conforme determinado por comportamento de alternação espontânea diminuída no labirinto-T.
Vários outros modelos de doença de Alzheimer, incluindo roedores obtidos geneticamente para expressar a forma mutada de um gene humano envolvido na produção de Αβ nas famílias com doença de Alzheimer de início precoce são conhecidos e disponíveis aos versados na técnica.
d. Esclecose Múltipla
A esclerose múltipla (MS) é uma doença inflamatória do sistema nervoso central (CNS) caracterizada por áreas localizadas de desmielinação. As respostas imunes aos antígenos de mielina contribuem para o processo da doença. MS é uma doença autoimune crônica, heterogênea, caracterizada por inflamação marcante, perda do escudo de mielina do oligodendrócito, neurodegeneração, gliose e perda do axônio (vide, por exemplo, Brack, W. & Stadelmann,
C. Neurol Sci 24 Suppl 5, S265-7 (2003); Brack, W. & Stadelmann, C, Curr Opin Neurol 18, 221-4 (2005) ; Fox, E. J., Neurology 63, S3-7 (2004); Fox, R.J. & Ransohoff, 5 R.M, Trends Immunol 25, 632-6 (2004); Hendriks, J.J., Teunissen, C.E., de Vries, H.E. & Dijkstra, CD. Brain Res Brain Res Rev 48, 185-95 (2005); Prat, A. & Antel, J., Curr Opin Neurol 18, 225-30 (2005); Liu, L., Callahan, M.K., Huang, D. & Ransohoff, R.M., Curr Top Dev Biol 68, 149-81 10 (2005); Mahad, D. e outros, Ernst Schering Res Found Workshop, 59-68 (2004)). A doença afeta aproximadamente
400.000 pessoas na América do Norte e 2,5 milhões em todo mundo (vide, por exemplo, Cross, A.H. & Stark, J.L., Immunol Res 32, 85-98 (2005); Hafler, D. A., J Clin Invest 113, 788-94 (2004); Sindern, E., Front Biosci 9, 457-63
(2004); e Steinman, L., Neuron 24, 511-4 (1999)). O início se dá normalmente entre 20-40 anos de idade, porém existem formas de MS atípicas incluindo casos de início precoce (menos de 18 anos de idade) e tardia (após 50 anos de
idade) que apresentam desafios de prognóstico e diagnóstico diferenciados (vide, por exemplo, Krupp, L.B. & Macallister, W.S., Curr Treat Options Neurol 7, 191-199
(2005); Martinelli, V., Rodegher, M., Moiola, L. & Comi,
G., Neurol Sci 25 Suppl 4, S350-5 (2004); Stadelmann, C. &
Brack, W., Neurol Sei 25 Suppl 4, S319-22 (2004); Stadelmann, C. e outros, Brain 128, 979-87 (2005)).
Aproximadamente 85% dos casos comuns começam com episódios de reincidência-remitência das modalidades sensoriais deterioradas incluindo visão prejudicada, 30 cegueira temporária e coordenação motora. Isto pode progredir para uma doença progressiva secundária. Outra forma de MS é denominada MS progressiva primária. As recaídas continuam a ocorrer até a fase neurodegenerativa acontecer (vide, por exemplo, Bruck, W. & Stadelmann, C, Neurol Sci 24 Suppl 5, S265-7 (2003); Bruck, W. . & Stadelmann, C, Curr Opin Neurol 18, 221-4 (2005) ; Fox, E. J., Neurology 63, S3-7 (2004); Fox, RJ. & Ransohoff,
R.M., Trends Immunol 25, 632-6 (2004); Steinman, L., Curr Opin Immunol 13, 597-600 (2001); e Zaffaroni, M., Neurol Sci 24 Suppl 5, S279-82 (2003)). Componentes imunes, genéticos e ambientais (tais como, virus, bactérias) estão implicados na etiologia da MS (vide, por exemplo, 10 Zaffaroni, M., Neurol Sci 24 Suppl 5, S279-82 (2003)).
Uma marca da patologia da MS são as placas de matéria branca ou lesões através de todo CNS incluindo a medula espinal (vide, por exemplo, Bruck, W. & Stadelmann,
C, Neurol Sei 24 Suppl 5, S265-7 (2003); Mahad, D. e outros, Ernst Schering Res Found Workshopr 59-68 (2004);
Fawcett, J. W. & Asher, R. A. , Brain Res Bull 49, 377-91
(1999) ; e Zhang, Y. e outros, J Clin Immunol 25, 254-64 (2005)). Os grupos de leucócito mais populosos nas lesões ativas crônicas são de macrófagos CCR2+/CCR3+/CCR5+/CXCR3+ 20 ativados. Outras células incluem células B, células T e micróglia com um padrão de expressão de receptor semelhante. Os ligantes cognatos para estes receptores são produzidos nos astrócitos circundando a lesão e os grupos leucócito participantes (vide, por exemplo, Banisor, I., 25 Leist, T.P. & Kalman, B., J Neuro-inflammation 2, 7 (2005); Cartier, L., Hartley, O., Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42 (2005); Galimberti,
D., Bresolin, N. & Scarpini, E., Expert Rev Neurother 4, 439-53 (2004) ; e Putheti, P. e outros, Eur J Neurol 10,
529-35 (2003) ) . Uma vez no CNS, os grupos de leucócitos causam lesão imune através de um armazenamento de substâncias nocivas incluindo espécies de nitrogênio e oxigênio reativas; MMP; leucotrienos; produção de autoanticorpos e liberação de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. Isto por sua vez causa lesão aos axônios, formação de lesão e morte da célula neuronal e de oligodendrócito.
1) Modelo EAE
No modelo EAE, a doença desmielinizante é induzida em camundongos. Monócitos, macrófagos, microglia e células T ativadas são responsáveis pela lesão ao tecido. Embora o modelo neste caso seja agudo (semelhante a MS progressiva crônica oposta a reincidência-remitência) é em essência antes da exacerbação, existe uma supraregulação,de CCR2 (o receptor, por exemplo, para LPMld; a sequencia de aminoácidos do polipeptídeo de LPMld é estabelecida na SEQ ID NO: 44) naqueles grupos de leucócito, infiltração de CNS e doença. Consequentemente, o modelo evidencia tratamentos aplicáveis a todos os tipos de MS. Uma referência exemplar que provê e utiliza modelos animais de esclerose múltipla que pode ser usada para testar conjugados de ligante- toxina, tal como conjugados de LPM contendo uma fração de SAl modificada, inclui, porém não está limitada a Liu e outros (1998), Nat Med 4:78-83, que descreve o uso de um modelo roedor com encefalomielite autoimune experimental (EAE) para estudo da MS. Os dados mostrando a eficácia dos conjugados providos no presente documento no modelo de EAE são providos no Exemplo 10.
2) Leucócitos Envolvidos na MS
Em vários estudos, os macrófagos e micróglia são essenciais na patologia da MS humana e no modelo de EAE. DC, MAC e células B também têm seu papel (Cross, A.H. & 30 Stark, J.L., Immunol Res 32, 85-98 (2005); Zhang, Y. e outros, J Clin Immunol 25, 254-64 (2005); Mouzaki, A., Tselios, T., Papathanassopoulos, P., Matsoukas, I. & Chatzantoni, K., Curr Neurovasc Res 1, 325-40 (2004); Heppner, F.L. e outros, Nat Med 11, 146-52 (2005); Huitinga, I. e outros, Clin Exp Immunol 100, 344-51 (1995); Polfliet, M.M. e outros, J Neuroimmunol 122, 1-8 (2002) ; Behi, M.E. e outros, Immunol Lett 96, 11-26 (2005);
Theoharides, T.C. & Cochrane, D.E., J Neuroimmunol 146, 1- 12 (2004); Chavarria, A. & Alcocer-Varela, J., Autoimmun Rev 3, 251-60 (2004); Kouwenhoven, M. e outros, J Neuroimmunol 126, 161-71 (2002); Greter, M. e outros, Nat Med 11, 328-34 (2005)). As células micróglia são ativadas e 10 proliferam antes do início da EAE (vide, por exemplo, Ponomarev, E.D., Shriver, L.P., Maresz, K. & Dittel, B.N., J Neurosci Res 81, 374-89 (2005)). A desativação de micróglia e macrófago e esgotamento de célula T e MNP melhora a gravidade da EAE (vide, por exemplo, Heppner, 15 F.L. e outros, Nat Med 11, 146-52 (2005); Huitinga, I. e outros, Clin Exp Immunol 100, 344-51 (1995); Polfliet, M.M. e outros, J Neuroimmunol 122, 1-8 (2002); Rajan, A. J., Asensio, V.C., Campbell, LL. & Brosnan, C.F., J Immunol 164, 2120-30 (2000); Rajan, A.J., Klein, J.D. & Brosnan, 20 CF. J Immunol 160, 5955-62 (1998); Bauer, J. e outros, Glia 15, 437-46 (1995); Kotter, M.R., Zhao, C, van Rooijen, N. & Franklin, R. L, Neurobiol Dis 18, 166-75 (2005) ; e Tran,
E.H., Hoekstra, K., van Rooijen, N., Dijkstra, CD. & Owens, T., J Immunol 161, 3767-75 (1998)). Estudos mostraram que 25 os macrófagos periféricos são articulados para sua ativação das células T e desenvolvimento de EAE (vide, por exemplo, Polfliet, M.M. e outros, J Neuroimmunol 122, 1-8 (2002); Deloire, M.S. e outros, Mult Scler 10, 540-8 (2004); Imrich, H. & Harzer, K., J Neural Transm 108, 379-95 30 (2001); Raivich, G. & Banati, R., Brain Res Brain Res Rev 46, 261-81 (2004)). O esgotamento das célula B com Rituxan (anti-CD20 Abm) nos pacientes com MS resultou em aperfeiçoamento clínico significativo (vide, Stuve, 0. e outros, Arch Neurol 62, 1620-3 (2005)). O esgotamento de PMN em EAE inibe a fase efetora da doença. Pacientes com PMN e MS expressam altos níveis de vários antígenos de superfície de célula o que está ligado a exacerbação da doença (vide, por exemplo, McColl, S.R. e outros, J Immunol 161, 6421-6 (1998); Ziaber, J. e outros, Mediators Inflamm 7, 335-8 (1998)). Estudos em camundongos indicam que PMN de CNS são supressores potentes das respostas da célula T para mielina e antígenos adjuvantes e um caso recente de enutropenia autoimune foi reportado em paciente masculino com MS (Kozuka, T. e outros, Intern Med 42, 102-4 (2003); e Zehntner, S.P. e outros, J Immunol 174, 5124-31 (2005)).
Micróglia altamente ativada, MNP perivascular e infiltração de MNP desempenham vários papéis na MS. Fora os seus papéis inflamatórios destrutivos por liberação de substâncias tóxicas, eles apresentam antígenos que infiltram células T para promover respostas de célula T específicas para mielina e recrutamento adicional das células T e macrófagos através das quimiocinas (vide, por exemplo, Deng, X. & Sriram, S., Curr Neurol Neurosci Rep 5, 239-44 (2005); Behi, M.E. e outros, Immunol Lett 96, 11-26 (2005); Raivich, G. & Banati, R., Brain Res Brain Res Rev 46, 261-81 (2004); Nelson, P.T., Soma, L.A. & Lavi, E., Ann Med 34, 491-500 (2002); Zhang, S.C., Goetz, B.D., Carre, J.L. & Duncanr I.D., GHa 34, 101-9 (2001); Izikson, L., Klein, R.S., Luster, A.D. & Weiner, H.L., Clin Immunol 103, 125-31 (2002)). Os macrófagos também estão envolvidos na patologia de degeneração na MS. Os infiltrados celulares estão associados à perda dos axônios nas lesões de MS (vide, por exemplo, Hendriks, JJ., Teunissen, C.E., de Vries, H.E. & Dijkstra, CD., Brain Res Brain Res Rev 48, 185-95 (2005)). MNP fagocitócica e micróglias destroem ós escudos de axônios da mielina, o que conduz as disfunções nos pacientes (vide, por exemplo, Cartier, L., Hartley, 0., Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42 (2005); Raivich, G. & Banati, R., Brain Res Brain Res Rev 46, 261-81 (2004); e Smith, M.E., van der Maesen, 5 K. & Somera, F. P., J Neurosci Res 54, 68-78 (1998)). Micróglia pode induzir a morte da célula neuronal e inibem o crescimento em excesso do neurito, bem como corpos apoptóticos neuronais de fagocitose (vide, por exemplo, Munch, G. e outros, Exp Brain Res 150, 1-8 (2003) ; e 10 Stolzing, A. & Grune, T., Faseb J 18, 743-5 (2004)).
DC derivadas de monócito, células B, MaC; e astrócitos ativados também estão envolvidos na patologia de MS (vide, por exemplo, Zhang, Y. e outros, J Clin Immunol 25, 254-64 (2005); Behi, M.E. e outros, Immunol Lett 96, 15 11-26 (2005); Chavarria, A. & Alcocer-Varela, J., Autoimmun Rev 3, 251-60 (2004); Corcione, A. e outros, Autoimmun Rev
4, 549-54 (2005); e Zang, Y.C. e outros, Mult Scler 10, 499-506 (2004)). Astrócitos ativados liberam várias quimiocinas e outros mediadores para atraírem os leucócitos 20 aos sítios de inflamação (vide, por exemplo, Ambrosini, E. e outros, J Neuropathol Exp Neurol 64, 706-15 (2005); Andjelkovic, A.V., Kerkovich, D. & Pachter, J.S., J Leukoc Biol 68, 545-52 (2000) ; Krumbholz, M. e outros, J Exp Med 201, 195-200 (2005)). MaC liberam proteases que causam 25 permeabilidade vascular e facilitam deposição de fibrina nas lesões (vide, por exemplo, Theoharides, T.C. & Cochrane, D.E., J Neuroimmunol 146, 1-12 (2004); Pedotti, R., De Voss, J.J., Steinman, L. & Galli, S.J., Trends Immunol 24, 479-84 (2003)). DC apresentam antígenos que 30 faclitam a ativação da célula Tea progressão da doença (vide, por exemplo, Greter, M. e outros, Nat Med 11, 328-34 (2005)). Tecido linfóide ectópico é evidente nos sítios de inflamação nas meninges de pacientes com MS. As meninges de tais pacientes contêm B, T, plasma e células DC, o que representa uma etapa na manutenção da autoimunidade humoral e exacerbação da doença (vide, por exemplo, Serafini, B., Rosicarelli, B., Magliozzi, R., Stigliano, E. & Aloisi, F., Brain Pathol 14, 164-74 (2004)).
Além de MNP, as células T, Ig e complexos imunes, as células B também ocorrem nas lesões da MS. Mais de 70% das lesões ativas contêm complemento e anticorpos (vide, por exemplo, Cross, A.H. & Stark, J.L. Immunol Res 32, 85- 10 98 (2005) ) . Células B secretando anticorpos clonalmente expandidas e centroblastos são encontrados em pacientes com CSF e MS (vide, por exemplo, Zhang, Y. e outros, J Clin Immunol 25, 254-64 (2005); Ziemssen, T. & Ziemssen, F., Autoimmun Rev 4, 460-7 (2005); Corcione, A. e outros, 15 Autoimmun Rev 4, 549-54 (2005) ; e Corcione, A. e outros, Proc Natl Acad Sci USA 101, 11064-9 (2004)). Mais de 90% dos pacientes com MS possuem Ig oligoclonal intratecal e quantidades aumentadas de anticorpos no CSF, o que se correlaciona com episódios mais graves de MS (vide, por 20 exemplo, Cross, A.H. & Stark, J.L., Immunol Res 32, 85-98 (2005)). Acredita-se que as células B sejam derivadas de um centro germinal de CNS; o cérebro provê um microambiente favorável para sobrevivência de longo prazo, proliferaçãp e a formação de estruturas linfóides ectópicas. As células B 25 fabricam anticorpos para proteínas de mieloma (aumentando a opsonização da mielina) apresentam antígeno e moléculas coestimuladoras para células T e aumentam o recrutamento de leucócitos. Um estudo verificou que uma proporção de células B em circulação não está permanentemente inativada, 30 porém está continuamente ativada e se torna a causa dos ataques autoimunes (vide, por exemplo, Gauld, S.B., Benschop, R.J., Merrell, K.T. & Cambier, J.C., Nat Immunol 6, 1160-7 (2005) ) . As células B na MS podem ser ativadas conforme se diferenciam dentro do CNS.
3) Quimiocinas na MS
O sistema de mensagens de ligantes e receptores de quimiocina desempenha papéis articulados na patologia de EAE e MS. O sistema coordena o tráfego, infiltração de CNS e funções inflamatórias aberrantes de uma faixa de subtipos de leucócito nestas doenças autoimunes. Várias quimiocinas e seus receptores foram identificados nas lesões de esclerose múltipla incluindo CCL-1-8, CXCL8-13, CCRl-3,5 e CXCRl-3, 4 (vide, por exemplo Banisor, L, Leist, T.P. & Kalman, B., J Neuroinflammation 2, 1 (2005); Carrier, L., Hartley, O., Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42 (2005); Galimberti, D., Bresolin, N. & Scarpini, E., Expert Rev Neurother 4, 439-53 (2004); Putheti, P. e outros, Eur J Neurol 10, 529-35 (2003) ; e Raivich, G. & Banati, R., Brain Res Brain Res Rev 46, 261- 81 (2004) ) . Por exemplo, CCR1, 2, 5 e 6 e CXCR3 ocorrem em células T CD3+ e CCR1, 2, 3 e 5 e CXCR3 em macrófagos espumosos e micróglia ativada em lesões de MS (vide, por exemplo, Banisor, I., Leist, T.P. & Kalman, B., J Neuroinflammation 2, 7 (2005); Cartier, L., Hartley, O., Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42 (2005); Galimberti, D., Bresolin, N. & Scarpini, E., Expert Rev Neurother 4, 439-53 (2004); Putheti, P. e outros, Eur J Neurol 10, 529-35 (2003); Raivich, G. & Banati, R., Brain Res Brain Res Rev 46, 261-81 (2004); Malamud, V. e outros, J Neuroimmunol 138, 115-22 (2003); Pedotti, R., De Voss, J.J., Steinman, L. & Galli, S. J., Trends Immunol 24, 479-84 (2003); Serafmi, B., Rosicarelli,
B., Magliozzi, R., Stigliano, E. & Aloisi, F., Brain Pathol 14, 164-74 (2004); Corcione, A. e outros, Proc Natl Acad Sci USA 101, 11064-9 (2004); Gauld, S.B., Benschop, R.J., Merrellf Κ.Τ. & Cambier, J.C., Nat Immunol 6, 116,0-7 (2005); Bartosik-Psujek, Η. & Stelmasiak, Z., Eur J Neurol 12, 49-54 (2005)).
CCL2 e CXCLlO derivados de astrócito foram demonstrados nos estudos de EAE. Estas quimiocinas desencadeiam respostas imunes neurais adicionais e contribuem para o recrutamento de leucócitos da periferia (vide, por exemplo, Galimberti, D., Bresolin, N. & Scarpini, E., Expert Rev Neurother 4, 439-53 (2004); Huang, D. e outros, Immunol Rev 177, 52-67 (2000); Jee, Y., Yoon, W.K., Okura, Y., Tanuma, N. & Matsumoto, Y., J Neuroimmunol 128, 49-57 (2002)). CCL2/CCR2 e CXCL9/10/11 /CXCR3 estão entre os alvos para intervenção terapêutica de sua distribuição nos tipos de células de leucócito patológicas e sua freqüente detecção nos estudos de MS e EAE. Os eixos de quimiocina CCL2/CCR2 desempenham um papel na migração transendotelial de MNP e células T no CNS e estão implicados na lesão e rompimento da barreira sangue-cérebro (BBB) (vide, por exemplo, Chavarria, A. & Alcocer-Varela, J Autoimmun Rev 3, 251-60 (2004); Mahad, D. e outros, Brain
(2005); Dzenko, K.A., Andjelkovic, A.V., Kuziel, W.A. & Pachter, J.S., J. Neurosci 21, 9214-23 (2001); Dzenko, K.A., Song, L., Ge, S., Kuziel, W.A. & Pachter, J.S., Microvasc Res (2005); Stamatovic, S.M. e outros, J Cereb 25 Blood Flow Metab 25, 593-606 (2005); Minagar, A. & Alexander, J.S., Mult Seler 9, 540-9 (2003)). CCL2 aumenta a permeabilidade de BBB por alterar as junções herméticas entre as células endoteliais através de CCR2 (Stamatovic,
S.M. e outros, J Cereb Blood Flow Metab 25, 593-606 (2005)). A entrada de MNP também altera a permeabilidade por secreção de CCL2 e então migra para o CNS. MMP derivado de célula T e MNP também estão associados ao rompimento e colapso da BBB e ajudam na transmigração da célula (vide, por exemplo, Abraham, M., Shapiro, S., Kami, A., Weiner,
H.L. Miller, A., J Neuroimmunol 163, 157-64 (2005); Avolio,
C. e outros, J Neuroimmunol 136, 46-53 (2003); Karabudak, R. e outros, J Neurol 251, 279-83 (2004); Uccelli7 A.,
Pedemonte, E., Narciso, E. & Mancardi, G., Neurol Sci .24 Suppl 5, S271-4 (2003); Brundula, V., Rewcastle, N.B., Metz, L.M., Bernard7 CC. & Yong7 V.W., Brain 125, 1297-308 (2002); Sellebjerg, F. & Sorensen, T.L., Brain Res Bull 61, 347-55 (2003); Vos, CM., van Haastert, E.S., de Groot, CJ., 10 van der VaIk7 P. & de Vries, H.E., J Neuroimmunol 138, 106-
14 (2003)). CXCR3+ marca as células T para tráfego para BBB7 porém é a expressão de CCR2 nestas células que permite a diapedese (vide, Mahad, D. e outros, Brain (2005); Callahan, M.K. e outros, J Neuroimmunol 153, 150-7 (2004), 15 que descreve infraregulação de CCR2 nas células T e monócitos após travessia da BBB) . O par de quimiocinas CCL2/CCR2 está envolvido na permeabilidade da BBB e um aumento significativo no eixo CCL2/CCR2 nos vários tipos de leucócito no parênquima de CNS e dentro das lesões é 20 observado (Mahad, DJ. & Ransohoff7 R.M., Semin Immunol 15, 23-32 (2003). Além disso, o eixo CCL2/CCR2 é observado nas lesões dos cérebros com MS, no sangue e no CSF dos pacientes (vide, Banisor, I., Leist, T.P. & Kalman, B.,. J Neuroinflammation 2,(2005); Cartier, L., Hartley7 0.7 25 Dubois-Dauphin7 M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rév 48, 16-42 (2005); Putheti7 P. e outros, Eur J Neurol 10, 529-35 (2003); e Mahad, D.J. & Ransohoff, R.M., Semin Immunol 15, 23-32 (2003))). A expressão do receptor varia com o tempo uma vez que as quimioimpressões são temporais e 30 espaciais e alteram de acordo com o microambiente prevalecente (Karpus, W.J. & Ransohoff, R.M. J Immunol 161, 2667-71 (1998)). Os monócitos atravessam a BBB que eles infraregulam, então reexpressam CCR2 conforme amadurecem e se diferenciam nos macrófagos. Isto é evidenciado nos estudos com biópsias de MS pós-morte mostrando baixos níveis de CCR2, CCR3 e CCR5 expressos por células de micróglia através do tecido de CNS de controle. Nas lesões 5 de MS ativas e crônicas, CCR2, CCR3 e CCR5 ocorrem como macrófagos espumados e micróglia ativada. CCR2 e CCR5 também estão presentes em grande número de leucócitos de infiltração e existe um pequeno número de linfócitos CCR3 positivos (vide, por exemplo, Simpson, J. e outros, J 10 Neuroimmunol 108, 192-200 (2000)) . De modo semelhante, CXCR3 e CCR5 são potencialmente expressos em células Thl (produtoras de citocina pró-inflamatória) e
significativamente suprareguladas no sangue periférico durante reincidências de MS. Os níveis dos receptores caem conforme os pacientes evoluem para remitência (Mahad, D. J., Lawry, J., Howell, SJ. & Woodroofe, M.N., Mult Scler»9, 189-98 (2003)). A expressão de CXCL10 é supraregulada no CSF de pacientes com MS e está espacialmente associada com a desmielinação nas seções de tecido do CNS muito correlacionadas à expressão deste receptor, CXCR3 (vide, por exemplo, Sorensen, T.L. e outros, J Neuroimmunol 1?7, 59-68 (2002)). Evidência adicional da participação de CCL2/CCR2 na desmielinação autoimune vem dos estudos com EAE. Foi verificado que CCL2 é altamente expresso no CNS, e 2 5 o tratamento anti-CCL2 bloqueia reincidência da doença em camundongos. Estudos com camundongos CCR2"1- mostram que CCL2/CCR2 é importante para o desenvolvimento de EAE (Fife, B.T., Huffnagle, G.B., Kuziel, W. A. & Karpus, W. J., J Exp Med 192, 899-905 (2000); Izikson, L., Klein, R.S., Charo, I.F., Weiner, H. L. & Luster, A.D., J Exp Med 192, 1075-80
(2000) ) . Uma vacina de DNA CCL2 protegeu os animais de desenvolverem EAE e a supraregulação de CCL2 e CCR2 estava proximamente associada à fase de reincidência da doença (Jee, Y., Yoon, W.Κ., Okura, Y., Tanuma, N. & Matsumoto, Y., J Neuroimmunol 128, 49-57 (2002); Youssef, S. e outros, J Immunol 161, 3870-9 (1998)). CCL2 mostrou causar encefalopatia quando expressa cronicamente em camundongos mostrando que a quimiocina pode induzir formação de lesão (Huang, D. e outros, Faseb J 19, 761-72 (2005)).
As quimiocinas CXCL9/10/11 e seu receptor CXCR3 cognato também desempenham um papel em EAE e MS (vide, por exemplo, Liu, L., Callahan, M.K., Huang, D. & Ransohoff, R.M., Curr Top Dev Biol 68, 149-81 (2005); Cartier, L., Hartley, O., Dubois-Dauphin, M. & Krause, K.H., Brain Res Brain Res Rev 48, 16-42 (2005); Sorensen, T.L. e outros, J Neuroimmunol 127, 59-68 (2002); Mahad, D.J., Lawry, J., Howell, SJ. & Woodroofe, M.N., Mult Scler 9, 189-98 (2003); e Lazzeri, E. & Romagnani, P., Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 5, 109-118 (2005). Na MS, o equilíbrio inflamatório está a favor das células Thl (produtoras de citocina pró-inflamatória) que estão associadas à expressão de CXC3 e CCR5 opostas ao ambiente das células Th2 (produtoras de citocina antiinflamatória) e que expressam caracteristicamente CCR3, 4 e 8 (vide, por exemplo, Mouzaki, A., Tselios, T., Papathanassopoulos, P., Matsoukas, I. & Chatzantoni, K., Curr Neurovasc Res 1, 325- 40 (2004); Teleshova, N. e outros, J Neurol 249, 723-9 (2002) ; e Misu, T. e outros, J Neuroimmunol 114, 207-12
(2001)). Células T expressando CXCR3 e CCR5 são significativamente enriquecidas no CSF MS em comparação ao sangue. As células CCR5+/CCR3“ estão ausentes de CSF indicando que CCR5 não é responsável pelo tráfego de célula T para o CSF sozinho (vide, por exemplo, Kivisakk, P. e outros, Clin Exp Immunol 129, 510-8 (2002); e Sorensen, TX. e outros, . J Clin Invest 103, 807-15 (1999)). Em um modelo de inflamação, tratamento anti-CXCR3 melhorou a migração de célula Thl para o tecido inflamado, demonstrando que CXCR3 é um receptor necessário para o tráfego (vide, por exemplo, Xie, J.H. e outros, J Leukoc Biol 73, 771-80 (2003); e Sindern, E., Patzold, T., Ossege, L.M., Gisevius, A. & 5 Malinj, J.P., J Neuroimmunol 131, 186-90 (2002)). Nas lesões MS ativas, CXCL9 e CXCL10 são expressas por macrófagos e por astrócitos circundando a lesão. CXCR3 é expressa nas células T e nos astrócitos dentro da lesão. IFN-γ derivado de célula Thl estimula as células a expressarem os 10 quimioatrativos a continuarem o recrutamento das células T para o CNS (Simpson, J. e outros, J Neuroimmunol 108, 192- 200 (2000)). CXCR3 e ligantes cognatos foram estudados em vários modelos de EAE. Este eixo desempenha um papel nos modelos EAE específicos e espécies de roedores. Em um 15 estudo, camundongos CXCL-10 nulo exibiram a expressão, gravidade e histopatologia como o grupo de controle. O estudo concluiu que CXCL10 não era necessário para o tráfego, porém determinou o limite diminuído de suscetibilidade a doença na periferia em comparação aos 20 controles (Klein, R.S. e outros, J Immunol 172, 550-9 (2004); Oppenheim, JJ. e outros, J Leukoc Biol 77, 854-61 (20 05)). CXCR3 também é expressa em pelo menos uma porcentagem dos grupos de leucócito discutidos acima (Sorensen, T.L. e outros, J Clin Invest 103, 807-15 (1999); 25 Oppenheim, JJ. e outros, J Leukoc Biol 77, 854-61 (2005); Kuipers, H.F. e outros GHa (2005); Foley, J.F. e outros, J Immunal 174, 4892- 900 (2005)). Por exemplo, os pacientes apresentaram alta expressão de CXCR3 e CCR5 nas células B no CSF e sangue, respectivamente, em MS ativa em relação 30 aos controles (Sorensen, T.L., Roed, H. & Sellebjerg, F., J Neuroimmunol 122, 125-31 (2002)). Astrócitos de camundongos e seres humanos e micróglia expressam o receptor e sofrem quimiotaxia em resposta aos ligantes cognatos in vitro (vide, por exemplo, Biber, K. e outros, Neuroscience 112, 487-97 (2002)). Consequentemente, estes receptores, entre outros, podem ser alvejados por seleção apropriada de um conjugado provido no presente documento por seleção de um que alveja um ou mais destes receptores (vide Tabelas, Exemplos e descrição no presente documento).
4) Substâncias Terapêuticas na MS
Metilprednisolona, Interferons e Copaxona tornam lenta a progressão da reincidência-remitência da doença. Medicamentos imunossupressores incluem novantrona, azatioprina, metotrexato e ciclofosfamida foram usados na MS progressiva primária e secundária (Tabela 5) . Nenhum medicamento (exceto para "ill-fated ' Campath") modificou definitivamente o curso da doença (vide, por exemplo, Galimberti, D., Bresolin, N. & Scarpini, E., Expert Rev Neurother 4, 439-53 (2004); e Leary, S. M. & Thompson, AJ., CNS Drugs 19, 369-76 (2005)). Estudos sobre esgotamento de leucócito e boa patologia e remissão induzidas por esgotamento de leucócito Campath (a despeito da toxicidade) apresentam bom prognóstico para despovoamento de leucócitos mediado por quimiocina (vide, por exemplo, Coles, AJ. e outros, Ann Neurol 46, 296-304 (1999); Moreau, T. e outros, Lancet 344, 298-301 (1994)). 0 sistema mensageiro da quimiocina pode servir como um alvo terapêutico robusto para MS. Uma vez que muitos subtipos de leucócito ativos em MS expressam CCR2 e/ou CXCR3, os conjugados que alvejam tais receptores, tais como, LPM7 ou LPMld e outrós exemplificados aqui, podem ser usados para ou no tratamento da MS. Outros conjugados que alvejam qualquer ou combinações de duas ou mais CCL1-8, CXCL8-13, CCRl-3,5, 6 e CXCR1-3, 4 podem ser empregados.
e. Artrite e Doença Autoimune Modelos para testar e demonstrar a atividade dos conjugados no presente documento para o tratamento de doenças autoimunes, tais como, artrite, lúpus e MS, discutidas acima são conhecidos dos versados na técnica. Exemplos de referências que fornecem e utilizam modelos animais de artrite e doença autoimune, os modelos podendo ser empregados para testar conjugados de ligante-toxina, tais como, conjugados de LPM contendo uma fração de SAl modificada incluem, porém não estão limitados às referências que se seguem conforme estabelecidas no presente documento.
Barnes e outros (1998), Anticorpo policlonal direcionado contra RANTES humano alivia a doença no modelo de artrite induzida por adjuvante em rato Lewis, J Clin Invest 101:2910-9, descreve que a artrite induzida por adjuvante (AIA) é um dos muitos modelos animais de artrite reumatóide, uma doença caracterizada por infiltrado celular de linfócito T e de macrófago. Barnes e outros caracterizam o desenvolvimento deste modelo de doença com relação à expressão da quimiocina e mostram que os niveis aumentados de duas quimiocinas, RANTES, um linfócito T e quimioatrativo de monócito e KC (o homólogo de camundongos da GRO-α humana), um quimioatrativo para neutrófilòs, foram encontrados no sangue integral e na articulação. Os níveis de MIP-Ια, outro quimioatrativo de linfócito T e monócito ficaram inalterados através de todo o curso da doença no sangue integral e apenas se elevaram ligeiramente na articulação. A expressão de RANTES desempenha um papel importante na doença, uma vez que um anticorpo policlonal a RANTES aliviou muito os sintomas em animais induzidos a AIA e foi verificado ser eficaz como tratamento com indometacina, um antiinflamatório não esteróide. Os anticorpos policlonais tanto a MIP-Ia quanto KC foram ineficazes.
Weinberg, A. D. (1998), Anticorpos para OX-40 (CD134) podem identificar e eliminar células T autoreativas: implicações para doença autoimune humana, Mol Med Today 4:76-83, descreve que as células T CD4 + especificas de autoantígeno estavam implicadas com o tipo de célula causativo em: esclerose múltipla, artrite reumatóide, uveite autoimune, diabetes melito, doença dos intestinos inflamados e doença de hospedeiro versus enxerto. Weinberg também descreve o uso de doenças autoimunes induzidas experimentalmente para desenvolvimento de uma terapia eficaz que apaga as células T autoreativas no sítio de destruição do tecido autoimune.
Schrier e outros (1998), 0 papel das quimiocinas e citocinas em um modelo de reativação da artrite em ratos induzido por injeção com paredes de células estreptococos, J Leukoc Biol 63:359-63, fornecem um estudo do papel das quimiocinas em um modelo animal de artrite. Injeção intraarticular de antígeno na parede da célula de estreptococos (SCW) seguido por desafio intravenoso em artrite monoarticular mediada por célula T em ratos Lewis fêmeas. Estudos iniciais mostraram que esta resposta de reativação ao antígeno de SCW intravenoso depende da presença da interleucina-1 (IL-I) e fator alfa de necrose tumoral (TNF-alfa) e que a fase anterior de intumescimento depende do neutrófilo. 0 esgotamento do neutrófilo ou imunização passiva com anticorpos para P-selectiva ou MIP-2 reduziu a intensidade do edema do tornozelo e o influxo de neutrófilòs. Após os primeiros dias, a resposta artrítica é mediada primeiramente por células mononucleares. Os tecidos da articulação mostraram supraregulação de RNAm para MCP-I, o que seria inibido, em parte, por anti-IL-4; tratamento: de ratos com anticorpos para IL-4 ou MCP-I suprimiu significativamente o desenvolvimento do edema do tornozelo e evidência histopatológica da inflamação. Os anticorpos para interferon-gama ou IL-IO não tiverem efeito. O tratamento com anti-MCP-1 também suprimiram influxo das células T marcadas na articulação do tornozelo. Estes dados indicaram que a fase dependente mononuclear tardia da artrite induzida por SCW nos ratos Lewis fêmea requer citocinas que supraregulam MCP-1, que por sua vez facilitaria o recrutamento e extravazamento das células mononucleares na articulação.
Oppenheimer-Marks e outros (1998), Interleucina é produzida pelas células endoteliais e aumenta a migração transendotelial das células T in vitro e no modelo de artrite reumatóide humana-camundongo SCID in vivo, J Clin Invest 101:1261-72, examinam a capacidade das células endoteliais (EC) de produzirem IL-15 e a capacidade de IL-
de influenciar a migração transendotelial das células T. As células endoteliais da veia umbilical humana expressam RNAm de IL-15 e proteína. IL-15 derivada endotelial melhorou a migração transendotelial das células T conforme evidenciado pela inibição deste processo por bloqueio monoclonal dos anticorpos para IL-15. IL-15 melhorou a migração transendotelial das células T por ativação da capacidade de ligação da molécula de adesão de integriha LFA-I (CDlla/CDl8) e também aumentou a motilidade da célula T. Além disso, IL-15 induziu a expressão da molécula de ativação anterior CD69. A importância de IL-15 na regulação da migração das células T in vivo foi documentada pela sua capacidade de melhorar o acúmulo das células T humanas transferidas de forma adotada no tecido sinovial da artrite reumatóide enxertado nos camundongos SCID deficientes imunes. Estes resultados demonstram que EC produz IL-15, que desempenha um papel no estímulo das células T para extravasar no tecido inflamatório.
Kasama e outros (1995), Expressão da interleucina-10 e regulação da quimiocina durante a evolução da artrite induzida por colágeno do tipo II em murinos, J Clin Invest 95:2868-76, estudaram a expressão e contribuição das quimiocinas específicas, MIP-Ia e MIP-2 e da interleucina 10 (IL-10) durante a evolução da artrite induzida por colágeno do tipo II (CIA). Níveis detectáveis da proteína citocina quimiotática para MIP- Ia e MIP-2 foram primeiro observados entre os dias 32 e 36, após desafio inicial com colágeno do tipo II, enquanto aumentos em IL-IO foram encontrados entre os dias 36 e 44. Camundongos CIA passivamente imunizados com anticorpos direcionados tanto contra MIP-Ia ou MIP-2 demonstraram, um retardo no início da artrite e uma redução da gravidade da artrite. Os camundongos CIA recebendo neutralização de anticorpos anti-IL-10 demonstraram uma aceleração do início e um aumento na gravidade da artrite. Tratamento anti-IL-10 aumentou a expressão de MIP-Ia e MIP-2, bem como aumentou a atividade da mieloperoxidase (MPO) e infiltração do leucócito nas articulações inflamadas. Estes dados indicam que MIP-Ia e MIP-2 desempenham um papel no início e manutenção, enquanto IL-10 parece desempenhar um papel regulador durante o desenvolvimento da artrite experimental.
Keffer e outros (1991), Camundongos transgênicos expressando fator de necrose tumoral humano: um modelo genético previsível de artrite, Embo J 10:4025-31, fornecem linhagens de camundongo transgênicas portando e expressando transgenes de fator de necrose tumoral humano modificado 3' e do tipo selvagem (hTNF-alfa, caquectina), mostram que expressão gênica de hTNF específica de macrófago e sensível a endotoxina, correta pode ser estabelecida nos camundongos transgênicos e apresentam evidência de que a região 3' do gene hTNF estaria envolvida na transcrição específica do macrófago. Os camundongos transgênicos portando transgenes de hTNF modificados 3' mostram padrão desregulado de expressão e desenvolvem poliartrite inflamatória crônica. Keffer e outros mostram os camundongos transgênicos que desenvolveram artrite previsivelmente representam um modelo genético pelo qual a patogênese e tratamento desta doença em seres humanos pode ser adicionalmente investigada.
Sakai e outros (1998), Eliminação em potencial .do sinóvio reumatóide por indução da apoptose usando um modelo in vivo de artrite reumatóide, Artrite Rheum 41:1251-7, investigam se apoptose mediada por Fas apresenta potencial como uma estratégia terapêutica na artrite reumatóide (RA) por emprego de um modelo de RA onde o tecido de RA humano é enxertado em camundongo SCID. 0 tecido sinovial reumatóide fresco incluindo cartilagem da articulação foi enxertado subcutaneamente nas costas dos camundongos SCID. Seis semanas após o enxerto, anticorpo monoclonal anti-Fas foi injetado intraperitonealmente. Alterações apoptóticas relacionadas ao tempo causadas por anticorpo monoclonal anti-Fas no sinóvio enxertado foram avaliadas por histoquímica de marcação de extremidade do corte. Trinta e seis horas após a injeção, alterações apoptóticas difusas foram observadas nos sinóvios enxertados. Quatro semanas após a injeção, o tecido sinovial reumatóide havia diminuído.
Smith e outros (1999), Tratamento com Diacerhein reduz a gravidade da osteoartrite em modelo de deficiência cruciata canina de osteoartrite, Artrite Rheum 42:545-54, descrevem o modelo canino de osteoastrite (AO) . OA foi induzida em 20 cães mestiços adultos por transeção do ligamento cruciato anterior do joelho esquerdo. 0 modelo foi usado para testar tratamentos para AO.
f. Doenças Inflamatórias Pulmonares
Modelos para testar e demonstrar a atividade dos conjugados no presente documento para tratamento de doenças inflamatórias pulmonares são conhecidos dos versados na técnica. Exemplos de referências que fornecem e utilizam modelos animais de doenças inflamatórias pulmonares que podem ser empregados para testar conjugados de ligante- toxina, tais como, conjugados de LPM contendo uma fração _de SAl modificada incluem, porém não são limitados às referências que se seguem, estabelecidas no presente documento.
Kumagai e outros (1999), Inibição das metaloproteinases de matriz impede inflamação das vias aéreas induzida por alergeno em um modelo de asma em murino, J Immunol 162:4212-4219, investigam o papel dos MMPs na patogênese da asma brônquica, usando um modelo de asma alérgica em murino. Usando este modelo, foi reportada uma liberação aumentada de MMP-2 e MMP-9 nos fluidos de lavagem broncoalveolar após inalação de Ag nos camundongos sensibilizados com OVA, acompanhada por infiltração de linfócitos e eosinófilos. A administração de inibidor de tecido de metaloproteinase-2 às vias aéreas inibiu a infiltração induzida por Ag dos linfócitos e eosinófilos na parede das vias aéreas e lúmen, reduziu a hipersensibilidade das vias aéreas induzida por Ag e aumentou o número de eosinófilos e linfócitos no sangue periférico. A inibição da infiltração celular ao lúmen e vias aéreas foi observada também com o inibidor de tecido de metaloproteinaes-1 e inibidor de metaloproteinase de matriz sintética. Os dados indicam que MMPs, especialmente MMP-2 e MMP-9 são importantes para a infiltração das células inflamatórias e a indução da hipersensibilidade das vias aéreas, que são aspectos patofisiológicos da asma brônquica.
Griffiths-Johnson e outros (1997), Modelos animais com asma: papel das quimiocina, Methods Enzymol 288:241-66, descrevem inúmeras quimiocinas que foram descobertas através do uso de (1) bioensaio de sobrenadantes de cultura de célula in vitro e exsudados in vivo de modelos animais de inflamação e (2) técnicas de biologia molecular. Existe evidência em estudos animais e clínicos de que os eosinófilos são células efetoras importantes na asma. Griffiths-Johnson e outros identificam dois alvos para prevenir o recrutamento de eosinófilos para o pulmão: IL-5 e seu receptor; que são importantes em vários aspectos da biologia do eosinófilo; e eotaxina e seu receptor, CCR3. O receptor da eotaxina é expresso em números altos nos eosinófilos, porém não nos leucócitos e parece ser o detector principal do eosinófilo para eotaxina e outras quimiocinas tais como, MCP-4. Eotaxina e CCR3 que nocauteiam os camundongos permitirão a avaliação dos mediadores envolvidos na asma, bem como teste das modalidades terapêuticas específicas.
Campbell e outros (1998), Papel temporal das quimiocinas em um modelo murino de hiperatividade das vias aéreas induzida por alergeno de barata e eosinofilia, J Immunol 161:7 047-53, provê um modelo de murino de doença aérea induzida por alergeno de barata e avalia mecanismos específicos da resposta, que lembra asma humana atópica. As respostas alérgicas neste modelo incluem eosinófilos das vias aéreas específicas de alergeno e alterou significativamente a fisiologia das vias aéreas, o que se correlaciona diretamente com a inflamação. Papéis específicos para quimiocinas CC durante estes estágios, cóm MIP-Ia sendo um atrativo de eosinófilo importante durante o estágio primário e eotaxina durante o estágio de redesafio secundário são identificados. Estes modelos mostram ■ a avaliação dos mediadores envolvidos em ambos os estágios de desafio de alergeno de barata, bem como o teste das modalidades terapêuticas especificas.
Piguet e outros (1989), Fator de necrose tumoral/caquectina desempenham um papel na pneumopatia induzida por bleomicina e fibrose, J Enp Med 170:655-63 e Schrier e outros (1983), Os efeitos da mutação nua (nu/nu) da fibrose pulmonar induzida por bleomicina. Uitia avaliação bioquímica, Am Rev Respir Dis 127:614-617, descreve um modelo de fibrose pulmonar de camundongos.
Steinhauser e outros (1999), IL-IO é um mediador principal de lesão induzida por sepsia na defesa do hospedeiro contra bactérias no pulmão, J Immunol 162:392- 399, descreve um modelo de pneumonia aeruginosa por Pseudomonas induzida por sepsia em murino para explorar o mecanismo da imunossupressão associada à sepsia. Camundongos CD-I sofreram tanto ligação cecal usando punção com agulha de calibre 26 (CLP) quanto cirurgia falsa, seguido por administração intratecal (i.t.) de P.aeruginosa ou salmoura. A sobrevivência dos camundongos que sofreram CLP após 24 horas da administração i.t. de salmoura foi P. aeruginosa foi de 58% e 10% respectivamente, considerando- se que 95% dos animais que sofreram cirurgia falsa seguido por administração de P. aeruginosa sobreviveram. A mortalidade aumentada no grupo de CLP/P aeruginosa foi atribuída ao desaparecimento bacteriano pulmonar muito prejudicado e no desenvolvimento precoce de bacteremia por P. aeruginosa. A administração i.t. das bactérias aos camundongos operados com CLP, porém não com cirurgia falsa resultou em acúmulo intrapulmonar de neutrófilos. 260/'372 Adicionalmente, ο desafio com a P. aeruginosa nos camundongos sépticos resultou em um deslocamento relativo na direção da produção melhorada de IL-IO no pulmão, concomitante com uma tendência na direção de IL-12 diminuída. A administração i.p., porém, não i.t. de IL-IO Abs fornecida imediatamente antes do desafio com P. aeruginosa nos camundongos sépticos aperfeiçoou significativamente a sobrevivência e desaparecimento das bactérias dos pulmões dos animais sépticos que receberam administração de P. aeruginosa. Finalmente, os macrófagos alveolares isolados de animais sofrendo de CLP exibiram uma lesão marcada na capacidade die ingestão e extermínio de P. aeruginosa ex vivo e este defeito foi parcialmente revertido pela neutralização in vivo de IL-IO. Coletivamente, estas observações indicam que a resposta séptica prejudica substancialmente a imunidade inata do pulmão à P. aeruginosa e este efeito é mediado por IL-IO produzida endogenamente.
g. Inflamação Após Terapia Gênica
São conhecidos os modelos para confirmação ,ou identificação dos conjugados no presente documento para tratamento de inflamação, incluindo inflamação após terapia gênica. Por exemplo, Muruve e outros (1999), Terapia gênica adenovirótica conduz à indução rápida das múltiplas quimiocina e lesão hepática aguda dependente de neutrófilo in vivo, Hum Gene Ther 10:9 65-7 6, estudos de mecanismos moleculares pelos quais os adenovírus deficientes de replicação induzem lesão aguda e inflamação dos tecidos infectados, o que limita seu uso para terapia gênica humana. Para caracterizar esta resposta, a expressão da quimiocina foi avaliada em camundongos DBA/2 seguindo-se a administração intravenosa de vários vetores adenoviróticos. Administração de adCMVbeta gal, adCMV-GFP, ou FG140 intravenosa e rapidamente induziu um padrão consistente de expressão da quimiocina C-X-C e C-C no fígado do camundongo em um modo dependente de dose. Uma hora após a infecção com 10(10PFU de adCMVbeta gal, os níveis hepáticos de RNAm MIP- 5 2 foram aumentados >60 vezes em relação à linha de base. Os níveis de RNAm de MCP-I e IP-IO foram também aumentados imediatamente seguindo-se infecção com vários vetores adenoviróticos, máxima em 6 horas com expressão >25 e >100 vezes, respectivamente. A indução precoce de RANTES e RNAm 10 MIP-Ιβ por vetores adenoviróticos também ocorreu, porém, a um grau inferior. A indução das quimiocinas ocorreu independentemente da expressão gênica virótica uma vez que as partículas adenoviróticas inativadas por psoraleno produziram um padrão idêntico de transcrição gênica da 15 quimiocina dentro das primeiras 16 horas da administração. A expressão das quimiocinas correlacionou-se conforme o esperado com o influxo dos neutrófilos e células CDllb+ nos fígados dos animais infectados. Em titulações altas, todos os vetores adenoviróticos causaram necrose hepática 20 significativa e apoptose seguindo-se administração sistêmica ao camundongo DBA/2. Para investigar o papel dos neutrófilos na lesão hepática induzida por adenovírus, os animais foram pré-tratados com anticorpos anti-MIP-2 neutralizantes ou esgotados de neutrófilos. O antagonismo 25 de MIP-2 e esgotamento dos neutrófilos cada um e ambos resultaram em níveis de soro ALT/AST reduzidos e atenuação da lesão hepática induzida por adenovírus, confirmando histologicamente que esta lesão precoce é amplamente devida à produção de quimiocina e recrutamento de neutrófilos. Os 30 resultados clarificam a resposta imune precoce contra a replicação dos vetores adenoviróticos deficientes e indicam a estratégia para prevenir a inflamação mediada por adenovírus e lesão do tecido por interferência com quimiocina ou função de neutrófilo.
h. Angiogênese
Os conjugados providos no presente documento podem alvejar células que são suprareguladas em angiogênese e processos envolvidos no presente documento. Referências exemplares que fornecem e utilizam modelos animais de
I
angiogênese para confirmação ou identificação dos conjugados de ligante-toxina, tais como, conjugados de LPM contendo uma fração SAl modificada, incluem, porém não estão limitados às referências que se seguem.
Folkman e outros (1987), Fatores angiogênicos, Science 235:442-7, estabelecem o papel da angiogênese e fatores, tais como, fator do crescimento de fibroblasto ácido e básico, angiogenina e fatores de crescimento alfa e beta de transformação e seu significado no entendimento da regulação do crescimento no sistema vascular. Quando avaliados de acordo com os alvos, os fatores se encontram em dois grupos: aqueles que atuam diretamente nas células endoteliais vasculares para estimular a locomoção ou mitose, e aqueles que atuam indiretamente por mobilização das células hospedeiras (por exemplo, macrófagos) para liberar fatores de crescimento do endotélio. Além de sua presença nos tumores sofrendo neovascularização, os mesmos peptídeos angiogênicos são encontrados em muitos tecidos normais onde a neovascularização não esta ocorrendo. Isto índia que a expressão fisiológica dos fatores angiogênicos é muito regulada. Além da angiogênese persistente induzida pelos tumores, parece que uma variedade de doenças não neoplásticas, que se pensava anteriormente não estivessem correlacionadas, podem ser consideradas como "doenças angiogênicas" uma vez que elas são dominadas pelo crescimento patológico dos vasos sanguíneos capilares. Leibovich e outros (1987), Angiogênese induzida por macrófago é mediada por fator-alfa de necrose tumoral, Nature 329:630-632, descrevem que os macrófagos são importantes na indução do crescimento de novos vasos sanguíneos durante a cura da ferida, inflamação e crescimento de tumor e investigam isto por estudo da formação dos vasos sanguíneos capilares na córnea de ratos e no desenvolvimento da membrana corioalantóica de galinhas.
Koch e outros (1992), Interleucina-8 como um mediador derivado de macrófago da angiogênese, Science 258:1798-1801, descrevem que os fatores angiogênicos produzidos por monócitos/macrófagos estão envolvidos na patogênese dos transtornos inflamatórios crônicos por angiogênese persistente. 0 papel da interleucina-8 (IL-8,), que é quimiotática para linfócitos e neutrófilos, foi mostrado como sendo potencialmente angiogênico quando implantada na córnea de ratos e induz proliferação e quimiotaxia das células endoteliais da via umbilical humana. Os dados indicam um papel para a IL-8 derivada de macrófago nos transtornos dependentes da angiogênese, tais como, artrite reumatóide, crescimento de tumor e cura de ferida.
i. Crescimento de Tumor
Os conjugados providos no presente documento (tais como, conjugados de fator de crescimento-toxina, conjugados de receptor de ErbB e outros) podem ser usados para o tratamento de tumores, tais como por alvejamento de receptores de tumor e/ou células envolvidas na tumorigênese, incluindo angiogênese. 0 recrutamento das células envolvidas na angiogênese e inflamação está associado ao crescimento e desenvolvimento do tumor. As referências que se seguem descrevem estas relações e aqueles modelos animais para identificação das terapias para tumor, angiogênese e inibidores de resposta inflamatória que são conhecidos dos versados na técnica. Estas referências evidenciam a disponibilidade dos modelos 5 animais para estudo das terapêutica para inibição do crescimento tumoral e células associadas ao mesmo. Os conjugados de ligante-toxina providos no presente documento, incluindo conjugados de LPM contendo uma fração de SAl modificada podem ser usados em tais modelos para 10 avaliar os efeitos no crescimento tumoral.
Phillips e outros (1994), Fator transformador do crescimento-proteína de fusão de exotoxina alfa-Pseudomonas (TFG-alfa-PE38) tratamento de glioma subcutâneo e xenoenxertos de meduloblastoma em camundongos atímicos, 15 Cancer Res 54:1008-15, exploram o diferencial de expressão do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), que é ampliado e superexpresso em muitos gliomas malignos e outros tumores cerebrais primários, porém é baixo ou indetectável no cérebro normal para terapia tumoral do 20 cérebro alvejado usando toxina recombinante TFG-alfa- exotoxina Pseudomonas, TFG-alfa-PE38 usando camundongos nus portando xenoenxertos subcutâneos de glioblastoma ou meduloblastoma. O modelo de xenoenxerto pode ser útil para estudo dos conjugados alvejando receptor de quimiocina para 25 tratamento das respostas inflamatórias e alvejamento das células envolvidas no desenvolvimento do tumor.
Debinski e outros (1994), Receptores de interleucina-4 expressos em células tumorais podem servir como um alvo para terapia anticâncer usando exotoxina 30 Pseudomonas quimérica, Int J Cancer 58:744-748, reportam o uso de proteínas quiméricas compostas de IL4 humano (hIL4) e duas formas mutantes diferentes de uma toxina bacteriana potente, exotoxina A Pseudomonas (PE) em um modelo de xenoenxerto de tumor sólido humano. As duas toxinas quiméricas, denominadas hIL4-PE4E e hIL4-PE38QQR, mostraram atividades específicas antitumor dependentes de dose e dependentes de hIL4R.
Husain e outros (1998), Regressão complete do xenoenxerto de tumor de glioblastoma humano estabelecido por terapia com toxina interleucina 4, Cancer Res 58:3649-
;}
53, mostram o uso de um conjugado da toxina IL-4 para tratamento alvejado dos tumores de flanco de glioblastoma em camundongos nus. Kreitman e outros (1998), Acúmulo de uma imunotoxina recombinante em um tumor in vivo: menos de 1.000 moléculas por célula são suficientes para respostas completas, Cancer Res 58:968-975, também demonstram uso deste modelo.
McDonald e outros (2001), O potencial terapêutico das proteínas de fusão de toxina-quimiocina, I Drugs 4:427- 442, relatam que SDF-ip-SAl (SAI tipo selvagem) retarda o crescimento dos tumores de carcinoma do cólon HT-29 em dois modelos de xenoenxerto de camundongo separados. SDF-ip-SAl também erradicou recentemente a formação intratumoral de vasos sanguíneos conforme evidenciado pela falta de vasos em seção transversal nos tumores tratados versus tumores 'de controle.
Exemplos de resultados de um conjugado de LPM no modelo de crescimento de tumor são estabelecidos no Exemplo 9, que mostra os resultados dos experimentos testando LPMld em um modelo de xenoenxerto de crescimento tumoral. Outros LPMs, tais como quaisquer providos no presente documento contendo uma quimiocina conjugada a uma SAl modificada podem ser testados em ensaios semelhantes. Tais resultados demonstram que LPMs podem ser usados como agentes terapêuticos candidatos para o tratamento do câncer e angiogênese. j. Virus da Imunodeficiência Humana (HIV) e Outros Virus
Conjugados com frações de toxina podem alvejar células infectadas com virus, tais como, porém não limitados ao HIV, hepatite A, B, e/ou C, e outros vírus que infectam cronicamente as células. 0 modo de ação pode ser através dos efeitos das toxinas no metabolismo celular. Além disso, as toxinas, tais como, toxina Shiga e a toxina Shiga modificada e fragmentos ativos providos no presente documento são adenosina glicosidases de polinucleotídeo que depuram polinucleotídeos, incluindo RNA e DNA, incluindo ácidos nucléicos viróticos. Consequentemente, os conjugados que são alvejados para receptores expressos nas células infectadas viralmente podem tratar infecção virótica.
Por exemplo, os conjugados providos no presente documento podem ser empregados para alvejar células infectadas com HIV e destruir ácido nucléico virótico e/ou inibir ou exterminar as células. Algumas referências exemplares que fornecem e usam modelos animais de HIV que podem ser empregados para testar conjugados de ligante- toxina, tais como, conjugados de LPM contendo uma SAl modificada incluem, porém não estão limitados às referências que se seguem. Westmoreland e outros (1998), Expressão de receptor de quimiocina nas células residentes e inflamatórias no cérebro de macacos com encefalite por vírus da imunodeficiência simiana, Am J Pathol 152:659-665, descrevem que uma correlação entre infiltrados de monócito/macrófago no cérebro e doença neurológica existe e que as quimiocinas e receptores de quimiocina podem desempenhar papéis na neuropatogênese de HIV e descrevem seu padrão de expressão no modelo de encefalite por HIV em macaco reso infectado com SIV. A expressão elevada das quimiocinas MIP-Ia, MIP-Ιβ, RANTEs e IP-IO nos cérebros dos macacos com encefalite SIV foi demonstrada e neste estudo os receptores de quimiocina correspondentes CCR3, CCR5, CXCR3 e CXCR4 foram expressos nos infiltrados perivasculares nestes mesmos tecidos. Além disto, CCR3, CCR5 e CXCR4 foram detectados nas subpopulações dos neurônios piramidais neocorticais e do hipocampo e nas células gliais nos cérebros encefalíticos e normais. Os dados e resultados indicam que múltiplas quimiocinas e seus receptores contribuem para recrutamento de monócito : e linfócito para o cérebro na encefalite SIV. Adicionalmente, a expressão de coreceptores de HIV/SIV conhecida nos neurônios indica um mecanismo possível pelo que HIV ou S1IV pode interagir diretamente com estas células, interrompendo sua função fisiológica normal e contribuindo para a patogênese do complexo de demência por AIDS.
Tyor e outros (1993), Um modelo de encefalite por vírus da imunodeficiência humana em camundongos SCI, Proe Natl Acad Sci USA 90:8658-62, provê um modelo animal de complexo de demência associada ao HIV para ajudar no desenvolvimento de tratamentos para a mesma. Os camundongos com imunodeficiência combinada grave (camundongos SCID) que aceitam xenoenxertos sem rejeição foram inoculados intracerebralmente com células mononucleares de sangue periférico humano e HIV. Uma a quatro semanas após inoculação, os cérebros destes camundongos continham macrófagos humanos (alguns dos quis eram antígeno p24 HIV positivo), células multinucleadas ocasionais e gliose raiando por coloração imunocitoquímica. Macrófagos humanos também eram frequentemente positivos para fator de necrose tumoral tipo alfa e ocasionalmente para interleucina 1 e VLA-4. As culturas destes cérebros para HIV foram positivas. De modo geral, os macrófagos humanos não estavam presentes nos cérebros dos camundongos de controle, nem houve gliose significativa. HIV não foi recuperado de camundongos que receberam HIV apenas intracerebralmente. Patologicamente, este modelo de encefalite por HIV ,em camundongos SCI lembra encefalite por HIV em seres humanos 5 e os dados indicam que a ativação dos macrófagos por infecção com HIV resulta em seu acúmulo e persistência no cérebro e no desenvolvimento de gliose. Este modelo de encefalite por HIV provê discernimentos na patogênese e tratamento deste transtorno.
Toggas e outros (1994), Lesão ao sistema nervoso
central produzido por expressão do gene gpl20 de revestimento de HIV-I em camundongos transgênicos, Nature 367:188-193, provê camundongos transgênicos que expressam gpl20 em seus cérebros e usaram estes camundongos para 15 estudar o papel de gpl20 nos neurônios e células gliais observadas nos seres humanos. As alterações observadas nos cérebros dos camundongos transgênicos lembram anormalidades nos cérebros dos seres humanos infectados com HIV-I. A gravidade da lesão correlacionou-se positivamente com o 20 nível no cérebro da expressão de gpl20. Estes resultados forneceram evidência in vivo de que gpl20 desempenha um papel na lesão ao sistema nervoso associada ao HIV-I. Isto facilita a avaliação e desenvolvimento das estratégias terapêuticas objetivadas nas interações HlV-cérebro.
Wykrzykowska e outros (1998), Regeneração precoce
dos progenitores tímicos em macacos resos infectados cóm vírus da imunodeficiência simiana, J Exp Med 187:17 67-1778, usando o modelo de SlV/macaco da ADIS, podemos examinar ós efeitos precoces da SIV no timo.
Krucker e outros (1998) Camundongos transgênicos
com expressão cerebral da proteína gpl20 revestimento do tipo 1 do vírus da imunodeficiência humana tipo 1, mostraram alterações divergentes em potenciação de curto e longo prazo em hipocampo CAI, Neuroscience 83:691-700, estudos com camundongos transgênicos expressando constitutivamente gpl20 acionada por proteina ácida fibrilar glial por astrócitos cerebrais que mostram alterações neuronais e gliais lembrando anormalidades nos cérebros humanos infectados do tipo 1 do vírus da imunodeficiência humana.
Power e outros (1998), Neurovirulência em gatos neonatais infectados com vírus da imunodeficiência felina é cepa virótica específica e dependente da supressão imune sistêmica, J Virol 72:9109-15, provê um modelo animal de HIV e seu papel na supressão imune. O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um lentivírus que causa supressão imune e doença neurológica em gatos. Para determinar a extensão na qual diferentes cepas de FIV causaram doença neurológica, FIV VICSF e Petaluma foram comparados em ensaios ex vivo e in vivo. Ambos os vírus infectaram e replicaram em macrófago e culturas de célula glial mistas em níveis semelhantes, porém VICSF induziu significativamente doença neuronal maior em relação à Petaluma em um ensaio de neurotoxicidade. Os animais infectados com VICSF mostraram retardo de desenvolvimento neurológico comparado aos infectados com Petaluma e animais não infectados. Razões de aspartato de n-acetila/creatinina no grupo VICSF foram comparadas aos outros grupos. Tratamento com ciclosporina A de animais infectados com Petaluma causou retardo de desenvolvimento neurológico e razões de aspartato de N-acetila/creatina reduzidas no cérebro. As contagens de células CD4(+) e CD8(+) reduzidas foram observadas no grupo infectado com VICSF em comparação aos grupos infectados com Petaluma e não infectado. Estas verificações indicam que o retardo de desenvolvimento neuronal e lesão neuronal são específicos para cepa de FIV, porém que a supressão imune sistêmica também é um determinante importante da neurovirulência induzida por FIV.
Modelos para outras infecções viróticas são conhecidos e podem ser empregados para confirmar atividade antivirótica para outros virus.
k. Doença Renal
Os conjugados providos no presente documento podem ser empregados para tratamento de doenças renais. 10 Modelos animais de doença renal podem ser empregados para testar conjugados de ligante-toxina, tais como, conjugados de LPM contendo a SAl modificada. Tais modelos animais incluem aqueles que imitam doenças renais crônicas humanas diferentes (CKDs), que são bem caracterizadas. Um exemplo 15 de referência que revisa vários modelos de CKD bem caracterizados, incluindo doença anti-GBM, e sua relevância para a doença humana é Durvasula e Shankland (Methods Mol Med., 86: 47-66, 2003) .
Por exemplo, glomerulonefrite induzida por anti- Thy-I no rato como um modelo de glomerulonef rite mesangioproliferativa humana foi completamente descrita (vide Jefferson e Johnson (1999) J. Nephrol. 12:297-307; Westerhuis e outros (2000) Am. J. Pathol, 156: 303-10). Em resumo, os ratos recebem injeção com anticorpo antitimócito que se liga às células mesangiais glomerulares (MGCs) e conduz à mesangiolise dependente de complemento. A mesangiolise termina por volta do dia 2 sendo seguida por proliferação de MGCs e hipercelularidade máxima por volta dos dias 5-7. Após isto, as MGCs sofrem apoptose até o modelo se decompor propriamente. Durante a fase proliferativa, existe uma alteração no fenótipo da MGC que está associada à deposição das proteínas de matriz extra celular (ECM) um indicador precoce da fibrose. Nos primeiros minutos existe uma supraregulação dos mediadores inflamatórios solúveis incluindo a quimiocina MCP-I que se correlaciona a um influxo de leucócitos, de modo mais importante os macrófagos. Acredita-se que os macrófagos contribuam para a mensagiolise na fase precoce por produção de nitrogênio reativo e espécies de oxigênio. Acredita-se que na última fase eles contribuam para a proliferação da MGC e produção de ECM através da produção de citocinas e fatores de crescimento incluindo TGF-β profibrótico. Os números de macrófagos alcançam máxima entre cerca de 2 e 4 e diminuem gradualmente após isto. Foi mostrado que a neutralização de MCP-I neste modelo melhora a infiltração de macrófagos, produção de TGF-β e sintese das proteínas de ECM. Em outro estudo, o esgotamento dos macrófagos com lipossomas clodronato resultou em uma redução marcante da expansão da matriz mesangiana.
Resultados exemplares de um conjugado de LPM em um modelo de doença renal são estabelecidos no Exemplo 6, que mostra os resultados de experimentos testando LPMld .êm um modelo de glomerulonefrite induzida por anti-Thy-1. ,Os resultados mostram que LPMld provê proteção renal em vários dos parâmetros fisiológicos testados. Outros LPMs, tais como qualquer dos providos no presente documento contendo uma quimiocina conjugada a uma SAl modificada, também podem ser testados nos ensaios semelhantes. Tais resultados demonstram que LPMs podem ser usados como agentes terapêuticos candidatos para tratamento de doença renal.
1. Hipersensibilidade
Algumas referências exemplares que fornecem e utilizam modelos animais de hipersensibilidade, que podem ser usados para testar conjugados de ligante-toxina, tais como, conjugados de LPM contendo uma SAl modificada, incluem, porém não estão limitados às referências que se seguem estabelecidas no presente documento. & hipersensibilidade do tipo retardada do camundongo (MDTH)) foi inicialmente desenvolvida para prover um teste para hipersensibilidade de contato. A mesma foi adaptada pa:r;a classificar a supressão da resposta imune modulada por célula T e é geralmente usada como um modelo de doenç.a inflamatória crônica (Staite e outros, (1996) Blood 88: 2973-2979).
Por exemplo, em vários modelos e especificamente;, o modelo de camundongo de dermatite de contato alérgica induzida por oxazalona (OXA) foi empregado para identificar medicamentos antiinflamatórios e imunomoduladores (Chapman e outros, (1986) Am. J. Dermatopathol. 130-8). Os camundongos sensíveis à oxazolona sofreram uma resposta inflamatória reprodutível e mensurável quando uma solução de oxazolona foi aplicada diretamente à orelha. Linfáticcos T dérmicos específicos de hapteno (uma mistura de célulias Thl e Th2) e macrófagos foram disparados para liberar citocinas e quimiocinas pró-inf lamatórias. Houve tariibèm ativação de neutrófilos e infiltração embora estes números fossem baixos. Outros estudos de modelo DTH mostraram cgue neutrófilos podem regular direta ou indiretamente o recrutamento das células T por liberação de citocinas e quimiocinas. Dentro de horas, a orelha intumesce e os leucócitos começam a infiltrar o tecido extravascular. A espessura da orelha e infiltração celular alcançaram mástima em 24 horas e houve declínio gradual para os níveis de linha de base em vários dias. As orelhas dos camundomcgos aumentaram de peso com o influxo de leucócitos e prodwção de exsudado.
Os resultados exemplares de um conjugado de LPM em um modelo de hipersensibilidade são apresentados no Exemplo 7, que mostra os resultados dos experimentos que testaram LPMlc e LPMld em um modelo de hipersensibilidade. A maior parte dos subtipos de leucócitos envolvidos no inchaço da orelha no modelo de MDTH expressam CCR2, o receptor alvo para MCP-I, dentre outros receptores de quimiocina. Portanto os conjugados de MCP-I-SAl (LPMl) contendo uma SAl modificada foram selecionados para ter como alvo estas células para eliminação. Os resultados exemplificam que as variantes LPMlc e LPMld de MCP-I-SAl (LPMl) foram eficazes no tratamento de hipersensibilidade e que LPMlc e LPMld têm potências diferentes consistentes com a sua atividade tóxica conforme apresentadas (vide, por exemplo, no Exemplo 3) . Outros LPMs tais como os dados no presente documento contendo uma quimiocina conjugada a uma SAl modificada, também podem ser testados em ensaios análogos. Qualquer conjugado de LPM pode ser testado qualquer conjugado de LPM conhecido como tendo como alvo um receptor de superfície celular, tal como qualquer receptor de superfície celular expresso em um ou mais leucócitos envolvidos em hipersensibilidade. Portanto, tais resultados demonstram que LPMs podem ser usados como produtos terapêuticos candidatos para o tratamento de hipersensibilidade.
J. Formulação e Adminis-tração das Composições Contendo Toxinas e Seus Conjugados
As composições para uso no tratamento de transtornos associados com respostas inflamatórias patofisiológicas, incluindo lesão secundária do tecido e estados mórbidos associados, assim como outras doenças são dados no presente documento. Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente efetiva de um conjugado de ligante-toxina que contém um agente direcionado, tal como, por exemplo, uma quimiocina ou fragmento ativo seu, e uma toxina RIP, conforme descrita no presente documento. Outros conjugados conhecidos dos versados na técnica também são visados podem ser modificados de modo tal, que a fração toxina é substituída com as toxinas propostas pela presente invenção, e as composições que contêm tais conjugados também são contempladas.
Concentrações efetivas para o tratamento de uma condição ou doença de um ou mais conjugados de ligante- toxina, tais como, por exemplo, os LPMs propostos na presente invenção, ou derivados 'seus farmaceuticamente 10 aceitáveis são misturados com um veículo farmacêutico adequado para administração sistêmica, tópica ou local. Os compostos estão incluídos em uma quantidade efetiva para. o tratamento do transtorno selecionado. A concentração de composto ativo na composição dependerá das taxas de 15 absorção, inativação e excreção do composto ativo, do programa de dosagem, e da quantidade administrada assim como de outros fatores conhecidos dos versados na técnica.
Os veículos farmacêuticos adequados para a administração dos conjugados e para os métodos propostos ;no 20 presente documento incluem quaisquer tais veículos conhecidos dos versados na técnica como sendo adequados para o modo específico de administração. Além disso, os compostos podem ser formulados como o único ingrediente ativo farmaceuticamente aceitável na composição ou podem 25 ser combinados com outros ingredientes ativos.
A quantidade ou dose precisa do agente terapêutico administrado depende do conjugado específico, da via de administração, e de outras considerações como esta. Ele pode ser administrado em um veículo de liberação 30 lenta, tal como, sem limitação, em microesfer^s, lipossomas, micropartículas, nanopartículas e carbono coloidal. Tipicamente, uma dosagem terapeuticamente efetiva deve produzir uma concentração sérica do ingrediente ativo que varia de aproximadamente 0,1 ng/mL a aproximadamente 50-100 yg/mL. As composições farmacêuticas tipicamente devem prover uma dosagem de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 100-2000 mg do conjugado, dependendo do conjugado selecionado por quilograma de peso corporal por dia. Tipicamente, para o tratamento intravenoso ou sistêmico deve ser suficiente uma dosagem diária de aproximadamente 0,05 a 0,5 mg/kg. A aplicação local deve proporcionar aproximadamente 1 ng até 100 yg, tipicamente de aproximadamente 1 yg a aproximadamente 10 yg, por administração de dosagem única. Deve ficar subentendido que a quantidade a ser administrada será uma função do conjugado selecionado, da indicação a ser tratada e possivelmente dos efeitos secundários que serão tolerados. As dosagens podem ser empiricamente determinadas usando-se modelos reconhecidos para cada transtorno.
O ingrediente ativo pode ser administrado de uma única vez ou pode ser dividido em uma serie de doses menores ou ser administrado a intervalos de tempo. Deve ficar subentendido que a dosagem e a duração precisas do tratamento são uma função do tecido que estiver sendo tratado e podem ser empiricamente determinados usando-se protocolos de teste conhecido ou por extrapolação de dados de testes in vivo ou in vitro. Deve-se observar que as concentrações e os valores de dosagem também podem variar com a idade do indivíduo tratado. Deve ficar ainda subentendido que para qualquer paciente específico, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados com o decorrer do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que estiver administrando ou supervisionando a administração das composições e que ós limites de concentração apresentados no presente documento são exemplares. O composto pode ser suspenso em uma forma micronizada ou outra qualquer adequada ou pode ser derivado para produzir um produto ativo mais solúvel ou para produzir uma prodroga. A forma da mistura resultante 5 depende de uma série de fatores, incluindo o modo destinado de administração e a solubilidade do composto no veículo selecionado. A concentração efetiva é suficiente para melhorar a condição alvo e pode ser empiricamente determinada. Para se formular uma composição, a fração de 10 peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou de outro modo qualquer misturada em um veículo selecionado a uma concentração efetiva, de modo que a condição alvo seja aliviada ou melhorada.
Para a administração interna local, tal como 15 intramuscular, parenteral ou intra-articular, os compostos são geralmente formulados em forma de uma solução ou suspensão em um meio de base aquosa, tal como solução salina isotonicamente tamponada ou são combinados com um suporte biocompatível ou bioadesivo destinado a 20 administração interna.
As misturas resultantes podem ser soluções, suspensões, emulsões ou outras tais misturas e podem ser formuladas em forma de mistura aquosa, cremes, géis, unguentos, emulsões, soluções, elixires, loções, 25 suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, pulverizações, supositórios, ataduras ou de qualquer outra formulação adequada para a administração sistêmica, tópica ou local.
Os veículos farmacêuticos e cosméticos adequados para a administração dos compostos propostos na presente invenção incluem qualquer um de tais veículos conhecidos dos versados na técnica como sendo adequados para o modo específico de administração. Além disso, os compostos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou pode ser combinado com outros ingredientes ativos. 0 composto ativo é incluído no veículo em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos tóxicos sérios sobre o indivíduo tratado. A concentração efetiva pode ser determinada empiricamente testando-se os compostos usando- se sistemas in vitro e in vivo, incluindo os modelos animais descritos no presente documento.
As soluções ou suspensões usadas para a aplicação local podem incluir qualquer um dos seguintes componentes: um diluente estéril, tal como água para injeção, solução salina, óleo fixado, polietileno glicol, glicerina, propileno glicol ou outro solvente sintético; agentes antimicrobianos, tais como álcool benzílico e metil parabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico e bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etileno diamino tetracético (EDTA); tampões, tais como acetatos, citratos e fosfatos; e agentes para o ajuste da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. As preparações líquidas podem ser acondicionadas em ampolas, seringas descartáveis ou em frascos com doses múltiplas feitos de vidro, plástico ou outro material adequado. Os veículos adequados podem incluir solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato [PBS], e as suspensões e soluções podem conter agentes espessantes e solubilizantes, tais como glicose, polietileno glicol e polipropileno glicol e suas misturas. As suspensões lipossômicas também podem ser adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica.
Os agentes terapêuticos para uso nos métodos podem ser administrados por qualquer via conhecida dos versados na técnica, mas sem limitação, tópica, intra- articular, intracisternal, intra-ocular, intraventricular, intratecal, intravenosa, intramuscular, intraperitonial, intradérmica, intratraqueal, assim por qualquer combinação de quaisquer dois ou mais deles.
A via mais adequada para a administração variará, dependendo do estado mórbido a ser tratado, do local da condição inflamatória, por exemplo. Os modos de administração incluem, sem limitação, tópica, local, intra- articular, intracisternal, intra-ocular, intraventricular, intratecal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, intraperitonial, intradérmica, esterotática e por uma combinação de quaisquer dois ou mais deles. Para o tratamento de SCI e de outras condições inflamatórias do SNC, por exemplo, a administração local, incluindo a administração ao fluido do SNC ou para o cérebro (intratecal, intraventricular ou intracisternal, por exemplo) proporciona a vantagem de que o agente terapêutico pode ser administrado a uma cnn alta sem risco de complicações que podem acompanhar a administração sistêmica de um agente terapêutico. Alternativamente, a administração pode ser por inoculação esterotática no cérebro, tal como, por exemplo, no tratamento de tumores. De modo análogo, para o tratamento de doenças inflamatórias das articulações, pode ser empregada a administração local por injeção do agente terapêutico na articulação inflamada (isto é, por meio intra-articular, intravenoso ou subcutâneo). Como um outro exemplo, um estado mórbido associado com uma condição inflamatória da pele pode ser tratada com vantagem pela administração tópica do agente terapêutico, formulado em forma de um creme, gel ou unguento, por exemplo. Para o tratamento de um estado mórbido associado com uma condição inflamatória do pulmão, a via preferida para a administração do agente terapêutico pode ser por inalação em um aerossol, ou intratraquealmente.
Portanto, os conjugados podem ser administrados por qualquer via adequada, por via oral parenteral (intravenosa, intraperitonial, intramuscular, intradérmica, por exemplo, por injeção subcutânea ou por infusão ou implante) , por via nasal, ou via pulmonar, vaginal, retal, sublingual ou tópica, em forma liquida, semiliquida ou sólida e são formulados de um modo adequado para cada via de administração. Os modos preferidos de administração dependem da indicação tratada. As indicações Dermatológicas e oftalmológicas serão tipicamente tratadas localmente; ao passo que tumores e SCI e outros transtornos como eles, serão tipicamente tratados por modo de administração sistêmico, intradérmica, intramuscular, esterotático ou outros. A administração pode ser por injeção (usando-se meio intravenoso ou subcutâneo, por exemplo), mas poderia ser também por infusão continua para uma administração lenta ou programada (usando-se dispositivos de liberação lenta ou minibombas tais como bombas osmóticas, por exemplo, ou adesivos dérmicos).
0 agente terapêutico é administrado em uma quantidade efetiva. As quantidades efetivas para o uso terapêutico dependerão, naturalmente, da gravidade <Ja doença e do peso e estado geral do paciente assim como da via de administração. A administração local do agente terapêutico tipicamente exigirá uma dosagem menor do que qualquer modo de administração sistêmica, embora a concentração local do agente terapêutico possa ser mais elevada, em alguns casos, depois da administração local do que poderia ser obtida com segurança por administração sistêmica. Como pacientes individuais podem apresentar uma ampla variação em gravidade de sintomas e cada agente terapêutico tem a suas características terapêuticas únicas, cabe ao clínico determinar a resposta de um paciente ao tratamento e fazer a dosagem variar de acordo. As dosagens usadas in vitro podem proporcionar diretrizes úteis quanto às quantidades úteis para a administração in situ da composição farmacêutica, e modelos animais podem ser usados, em alguns casos, para se determinar as dosagens efetivas para o tratamento de transtornos específicos. Em geral, no entanto, para a administração local, contempla-se que uma quantidade efetiva do agente terapêutico se encontrará em uma quantidade dentro dos limites de aproximadamente 0,1 picogramas (pg) até aproximadamente 1 ng por kg de peso corporal. Diversas considerações para se chegar a uma quantidade efetiva são descritas, por exemplo, em Goodman e GilmaniS: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a. ed., Pergamon Press, 1990; e RemingtoniS Pharmaceutical Sciences, 17a. ed. , Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990; e nos estudos de Mantyh e outros, (1997) Science 278: 275-79, envolvendo a injeção intratecal de um ligante neuronal específico-toxina.
Em uma concretização das composições e métodos propostos no presente documento, o agente terapêutico é administrado localmente em um veículo de administração por liberação lenta, encapsulado em um sistema de dispersão coloidal, por exemplo, ou em cristais estabilizados em polímero. Sistemas de dispersão coloidal úteis incluem nanocápsulas, microesferas, e sistemas à base de lipídios, incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. 0 sistema coloidal atualmente preferido é um lipossoma ou microesfera. Os lipossomas são vesículas com membranas artificiais que são úteis como veículos de administração por liberação lenta quando injetados ou implantados. Alguns exemplos de conjugados de lipidios- polímeros e lipossomas são divulgados na patente US No. 5.631.018 que é incorporada ao presente documento a titulo de referência integralmente. Outros exemplos de veículos de fornecimento por liberação lenta são matrizes de hidrogel biodegradáveis (Patente US Número 5.041.292), conjugados de polímeros-dendríticos (patente US No. 5.714.166) e lipossomas multivesiculares (Depofoam (R), Depotech, San Diego, CA) (Patentes US Números 5.723.147 e 5.766.627). Um tipo de microesfera adequado para o encapsulamento de agentes terapêuticos para a injeção local (no tecido subdermal, por exemplo) consiste em microesferas de poli(D,L)lactídeo, conforme descrito em D. Fletcher (1997) Anesth. Analg. 84: 90-94.
Além de fornecer uma dose terapêutica efetiva ao sítio do trauma e reduzir a possibilidade de toxicidade sistêmica, a administração local também reduz a exposição do produto terapêutico a processos degradantes, tais como a 20 degradação proteolítica e à intervenção imunológica por meio de respostas antigênicas e imunogênicas. A derivação da droga com monometóxi-poli(etileno glicol), por exemplo, também pode reduzir a probabilidade dos inconvenientes citados acima. Tem sido relatado que a PEGilação de 25 produtos terapêuticos aumenta a resistência a proteólise; aumento da meia vida plasmática e redução da antigenicidade e imunogenicidade. Exemplos de metodologias de PEGilação são dados por Lu e Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res., 43:127-138; Lu e Felix (1993) Peptide Res., 6:142-6; 30 Felix e outros (1995) Int. J. Peptide Res., 46:253-64; Benhar e outros (1994) J. Biol. Chem., 269:13398-404; Brumeanu e outros (1995) J. Immunol, 154:3088-95. As composições propostas no presente documento contêm ainda um ou mais adjuvantes que facilitam o fornecimento, tal como, sem limitação, veículos inertes ou sistemas de dispersão coloidal. Exemplos representativos e não limitantes de tais veículos inertes podem ser selecionados de água, álcool isopropílico, fluorcarbonos gasosos, álcool etílico, polivinil pirrolidona, propileno glicol, um material produtor de gel, álcool estearílico, ácido esteárico, espermacete, monooleato de sorbitano, metil celulose, assim como uma combinação adequada de dois ou mais deles.
Uma composição proposta no presente documento também pode ser formulada em forma de uma suspensão estéril injetável, de acordo com métodos conhecidos usando-se agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação estéril injetável também pode ser uma solução ou suspensão estéril injetável em um diluente ou solvente não tóxico aceitável do ponto de vista parenteral, em forma de uma solução em 1-4, butanodiol, por exemplo. Óleos estéreis fixados são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para tal fim pode ser empregado qualquer óleo suave fixado, incluindo, sem limitação, mono ou diglicerídeos sintéticos, ácidos graxos (incluindo ácido oléico), óleos vegetais que ocorrem naturalmente, tais como óleo de gergelim, óleo de coco, óleo de amendoim, óleo de caroço de algodão e outros óleos, ou veículos graxos sintéticos, tais como oleato de etila. Tampões, conservantes, antioxidantes e ingredientes adequados podem ser incorporados conforme a necessidade.
As composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um veículo comestível e podem ser formados em comprimidos ou confinados em cápsulas de gelatina. Para os fins de administração terapêutica oral, o composto ativo ou os compostos ativos podem ser incorporados a excipientes e usados na forma de comprimidos, cápsulas ou trociscos. Podem ser incluídos, como parte da composição, agentes aglutinantes e materiais adjuvantes farmaceuticamente compatíveis.
Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza análoga; um aglutinante, tal como celulose microcristalina, goma tragacanto e gelatina; um excipiente tal como amido e lactose, um agente desintegrante tal como, sem limitação, ácido algínico e amido de milho; um lubrificante tal como, sem limitação, estearato de magnésio; um deslizante, tál como, sem limitação, dióxido de silício coloidal; um agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; e um agente aromatizante tal como hortelã, salicilato de metila e aromatizante de frutas.
Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, além do material do tipo acima, um veículo líquido tal como óleo graxo. Além disso, formas de dosagem unitária podem conter diversos outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, tais como revestimentos com açúcar e outros agentes entéricos, por exemplo. Os conjugados também podem ser administrados em forma de um componente de um elixir, suspensão xarope, bolacha, goma de mascar ou semelhantes. 0 xarope pode conter, além do composto ativo, sacarose com um agente adoçante e determinados conservantes, corantes e colorantes e sabores.
Os materiais ativos também podem ser misturados com outros materiais ativos que não prejudicam a ação desejada ou com materiais que suplementam a ação desejada, tais como cisplatina para o tratamento de tumores. Finalmente, os compostos podem ser acondicionados como artigos de fabricação contendo material de acondicionamento, um ou mais conjugados ou composições conforme propostos no presente documento acondicionados em 5 materiais de embalagem e um rótulo que mostra a indicação para a qual o conjugado é destinado.
K. Métodos de Tratamento de Doenças e Transtornos Empregando Toxinas ou Seus Conjugados
São propostos no presente documento métodos de se 10 usar qualquer um dos conjugados de ligante-toxina propostos, incluindo os contendo uma fração RIP modificada tal como uma SAl modificada para o tratamento de doenças ou transtornos para os quais o conjugado de ligante-toxina é destinado. Devido ao direcionamento específico do receptor 15 dos conjugados às células que expressam o receptor alvo, as composições e métodos propostos no presente documento permitem a administração seletiva, deliberada e subliminar do agente terapêutico às células que armam a resposta à lesão ou doença. 0 direcionamento dos conjugados a células 20 envolvidas nos processos patofisiológicos de doenças imunomoduladores e inflamatórias e outros traumas permite uma internalização dos conjugados, mediada por receptor facilitando assim a toxicidade celular mediada por toxina e a eliminação dos componentes celulares patológicos.
Portanto, são propostos no presente documento
métodos de uso de conjugados para o tratamento de doenças e condições inflamatórias ou imunes. Para se apreciar o uso de tais conjugados no tratamento de tais doenças ou condições, é necessário uma compreensão do sistema imune e 30 da participação de células patológicos para a exacerbação de tal doença, assim como uma discussão das limitações dos produtos terapêuticos candidatos atuais. A discussão abaixo proporciona tais antecedentes necessários à discussão da seleção e uso dos conjugados de ligante-toxina, tais como aqueles que contêm uma toxina modificada no tratamento de doenças exemplares.
1. O Sistema de Defesa Hospedeiro Imune e
Inflamação
0 sistema imune pode ser dividido nos setores inato e adaptativo que em conjunto conferem uma imunovigilância e um sistema de defesa do hospedeiro intactos. 0 sistema inclui diversas populações heterogêneas de leucócitos que incluem, sem limitação, monócitos ou macrófagos (a que se refere em conjunto como fagócitòs mononucleares (MNP-s), neutrófilos (neutrófilos
polimorfonucleares, PMN), células T, células B, eosinófilos, basófilos, células exterminadoras naturais (NK) , células dendríticas (DCs), e mastócitos (MaCs)). 0 sistema imune inato se baseia em células que reagem imediatamente contra entidades invasoras tais como os micróbios e inclui MNPs, células dendriticas, neutrófilos e células NK. 0 sistema imune adaptativo inclui células TeB que necessitam ser ativadas por células apresentadoras de antígenos, especialmente de células dendríticas, a fim de atingir invasores específicos de hospedeiro. As células das respostas imunes inata e adaptativa trabalham em conjunto com células residenciais teciduais (TRC; tais como células epiteliais, por exemplo) a fim de manter um equilíbrio homeostático em muitos processos específicos a órgãos incluindo a embriogênese, angiogênese, tráfico de linfócitos, cicatrização de ferimentos, reparo de tecidos, remoção de detritos celulares e outros agentes indesejáveis tais como micróbios, vírus ou clones de células cancerígenas (vide, por exemplo Esche e outros, J. Invest. Dermatol., 125: 615-28, 2005; Chaturvedi e outros, Indian J. Med. Res., 124: 23-40, 2006; Bunde, J. Exp. Med. 2 01: 1031-6, 2005; Krishnaswamy e outros, Methods Mol. Biol. 315: 13-34, 2005; Martin e Leibovich, Trends Cell Biol., 15: 599-607, 2005; Kim, Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord., 4: 343-61, 2004; Moser e Willimann, Ann. Rheum. Dis. 63 (supl. 2): 84-9, 2004; Hoebe e outros, Wat. Immunol., 5: 971-4, 2004; Schaerli e outros, J. Exp. Med., 199: 1265-75, 2004; Olson e Miller, J. Immunol. 173: 3916- 24, 2004; Middleton e outros, Blood, 100: 3853-60, 2002; Beyer e outros, Glia 31: 262- 66, 2000).
a. Inflamação Homeostática
A inflamação homeostática é um processo bioquímico multifatorial que é orquestrado e perpetuado por TRCs ativadas e células ativadas de linhagem de leucócitos com um papel crucial do sistema de mensagens de quimiocinas. Os fatores solúveis liberados das células lesadas e moribundas, os complexos imunes ou antígenos carregados complexos tais como lipopolissacarídeos (LPS) bacterianos e proteínas do invólucro viral trabalhando através do sistema de complemento e receptor de "toll" são desencadeadores comuns de ativação e recrutamento de leucócitos. Em resposta a esse processo, os leucócitos sofrem alterações fenotípicas profundas que incluem a supraregulação das moléculas de adesão celular (CAMs) e de citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias para produzir o tráfico e a comunicação com outros grupos de leucócitos. Uma vez no sítio de invasão, os leucócitos produzem um armamento de mediadores citotóxicos. As espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, enzimas proteolíticas e icosanóides destroem os micróbios e fungos invasores que sofrem fagocitose, principalmente pelos macrófagos e PMN. Nos sítios de ferimento, fatores de crescimento (GFs) derivados de leucócitos (especialmente macrófagos), por exemplo, que incluem o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e GF de fibroblastos (FGF) facilitam a angiogênese. Os fatores profibróticos tais como o fator de crescimento transformador beta, TGF-β, facilitam a formação de cicatriz e a cicatrização do ferimento (Krishnaswamy e outros (2005) Methods Mol. Biol. 315: 13-34; Puneet e outros (2005) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288: L3-15; Taylor e outros (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 901- 44; Byrne e outros (2005) J. Cell Mol. Med. 9: 777-94; Carroll (2004) Nat. Immunol. 5: 981-6; Iwasaki e Medzhitov (2004) Nat. Immunol. 5: 987-95; Martin e Leibovich (2005) Trends Cell Biol. 15: 599-607; Liu e Pope (2004) Rheum. Dis. Clin. North. Am30: 19-39; Stark e outros (2005) Immunity, 22: 285-94; Gordon (2003) Nat. Rev. Immunol, 3: 23-5; Borish e Steinke (2003) J. Allergy Clin. Immunol, 111: S460-75; Cross e Claesson-Welsh (2001) Trends Pharmacol. Scir 22, 201-7; Trautmann, e outros (2000) J Pathol, 190: 100-6). Geralmente, tais mediadores imunes gerados por leucócitos ativados são protetores, mas em determinadas situações patológicas eles podem se tornar nocivos e perpetuar a doença.
b. Inflamação Patológica
As respostas inflamatórias são mediadas por células de defesa imunes que se acumular no sítio da lesão ou trauma tecidual para livrar o corpo de agentes exógenos 25 indesejáveis (micróbios, por exemplo) ou de agentes endógenos (clones de células cancerígenas, por exemplo); para eliminar os detritos celular e para participar em cicatrização tecidual e de ferimentos. Infelizmente, os mecanismos moleculares envolvidos nestes processos 30 reparadores (inflamatórios) podem iniciar uma lesão secundária do tecido, o qual, por sua vez, contribui para a patogênese e patologia persistente de uma série de doenças inflamatórias. Os mecanismos moleculares e os mediadores celulares e químicos envolvidos na lesão secundária do tecido são semelhantes, quando não idênticos, na maioria das doenças inflamatórias do ser humano. Em situações patológicas induzidas pela ativação de um grande número de 5 estímulos que incluem, sem limitação, vírus, bactérias, parasitas, citocinas pro-inflamatórias, quimiocinas, hipoxia, isquemia, proteinúria (proteína na urina), produtos finais de glicação avançada (AGE), auto- anticorpos, nucleotídeos sistêmicos, complemento, complexos 10 imunes, imunoglobulinas e poluentes ambientais tais como fumaça de cigarros, por exemplo, podem levar à ativação de células incluindo, sem limitação, uma variedade de leucócitos e TR incluindo células gliais do SNC, células mesangiais (MC) dos rins e células endoteliais de muitos 15 órgãos. Os estímulos podem ser o(s) fato(es) iniciador(es) da doença, mas as TRC e os leucócitos inflamatórios são os soldados de patologia mórbida. As TRC e os leucócitos residentes expressam e secretem, dentre outros, elementos das superfamílias de citocinas, quimiocinas e fatores de 20 crescimento, que facilitam a ativação, infiltração e proliferação de leucócitos nos sítios de inflamação. As quimiocinas específicas e outras moléculas pro- inf lamatórias liberadas pelas TRC de qualquer tecido dado definem o infiltrado de leucócitos específico em qualquer 25 doença ou trauma dado (Lindemans e outros (2006) Clin. Exp. Immunol, 144:409-17; Puneet e outros (2005) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288: L3-15; Boyle, JJ. (2005) Curr. Vase. Pharmacol. 3: 63-8; Liu e Pope (2004) Rheum. Dis. Clin. North. Am., 30: 19-39; Tetley (2002) Chest 121: 1565- 30 1595; de Leeuw e outros, (2005) Ann. N. Y. Acad. Sei. 1051: 362-71; Drinda, e outros (2005) Rheumatol. Int. 25: 411-3; Raivich e Banati (2004) Brain Res. Brain Res. Rev., 46: 261-81; Tokarska-Rodak e outros (2004) Ann. Agric. Environ. Med. 11: 227-31; Hou e outros (2004) J. Am. Soc. Nephrol., 15: 1889-96; Hayashida e outros (2001) Arthritis Res. 3: 118-26; Garcia-Ramallo e outros, (2002) J. Immunol. 169: 6467-73; Kim e outros (2002) Blood 100: 11-6; Perez de Lema
(2001) J. Am. Soc. Nephrol, 12: 1369-82; Barnes e outros, Eur. Respir. J. 22: 672-88, 2003; Luster e outros, Nat. Immunol., 6: 1182-90, 2005; Charo e Ransohoff, N. Eng. J. Med., 354: 610-21, 2006).
Quais os mediadores inflamatórios, tais como citocinas, quimiocinas e receptores de cognatos que são precisamente empregados na inflamação patológica depende do subtipo de leucócito exato envolvido do tecido ou órgão em questão e do estágio da lesão ou doença. Além disso, a liberação de mediadores inflamatórios pode levar a ciclos patológicos que se perpetuam. As citocinas e quimiocinas perpetuam a sua própria produção, por exemplo, e são liberadas de leucócitos por meio de mecanismos autócrinos e parácrinos. Eles também induzem a sintese e a liberação dos compostos citotóxicos das células que eles têm como alvo. Além das neurotoxinas, leucócitos residentes e infiltrantes liberam as mesmas moléculas usadas para fins homeostáticos para mediar o dano tecidual. As citocinas e quimiocinas induzem a expressão de moléculas de adesão celular (CAMs) e antígenos da superfície celular (incluindo receptores de citocinas e de quimiocinas) nos diversos tipos de células incluindo leucócitos, células endoteliais, gliais e cancerígenas. As CAMs e os glicosaminoglicanos (GAGs) são essenciais para o tráfico de células (ou migração) não somente em circunstância homeostáticas, mas também em condições inflamatórias patológicas incluindo metástase do câncer. A supraregulação dos anticorpos da superfície celular contribui para a ativação celular que contribui para uma produção adicional de mediadores inflamatórios. Além disso, a composição do meio micro-ambiental dos fatores inflamatórios afeta os fenótipos de diferentes células. Sabe-se, por exemplo, que os neutrófilos expressam receptores de CXC, mas em determinados casos como lesão aguda séptica do pulmão e lesão por reperfusão eles expressam receptores de CC incluindo CCR2.
Uma infiltração, ativação (crônica) e proliferação (número aumentado) excessivamente zelosas de subtipos de leucócitos relativamente específicos a doença foi categoricamente demonstrada como subjacente à imunopatologia de uma ampla faixa de centenas de diferentes condições clínicas, doenças e traumas (vide, por exemplo, Tabela 6, Tabela 7). As variações específicas a tecido são principalmente uma questão de subgrupos diferentes de leucócitos ocupando o papel principal, tal como as micróglia, por exemplo, nos estágios iniciais da inflamação do SNC; eosinófilos, células Th2 e mastócitos (MaCs) em inflamação alérgica do pulmão; e macrófagos, células Thl e MaCs em doenças renais crônicas (CKDs). Além disso, os mediadores solúveis derivados de leucócitos tais como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o fator de crescimento de transformação β (TGF-β) são reguladores de outros processos patológicos tais como a angiogênese e fibrose, respectivamente. A importância de números absolutos de leucócitos e processo em doença/processo de inflamação crônica é subclassificada por estudos recentes que mostram que mulheres pós-menopausa com altas contagens de células leucócitos têm um risco de 40-50% mais lato de ataques cardíacos, acidentes vasculares e morte do que mulheres com baixas contagens (Cushman, Arch. Intern. Med. 165: 487-8, 2005; Margolis, e outros, Arch. Intern. Med. 165: 500-8, 2005). Os macrófagos alveolares representam um papel na patogênese de doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) . Os pacientes com COPD têm um aumento de até 10 vezes em números de MNP nas vias aéreas, parênquima pulmonar, fluido de lavagem blonquioalveolar e no esputo em comparação com os controles. De modo análogo, paciente com 5 enfisema apresentaram um aumento de 2 5 vezes em número de MNP no tecido e no espaço alveolar (Tetley, Chest 1212: 156S-159S, 2002). Os estudos de transferência adotivas mostraram que os números aumentados de macrófagos glomerulares era correlacionado com proteinúria induzida 10 por macrófagos (um marcador de lesão renal), proliferação celular glomerular e hipercelularidade. Além disso, existe uma correlação entre o número de subtipos de leucócitos e a gravidade e progresso de um número de doenças diversas. Ikezumi, e outros, Kidney Int., 63: 83-95, 2003; Brightling 15 e outros, N. Engl. J. Med. 346: 1699-705, 2002; Panzer .e outros, Transplantation 78: 1341-50, 2004). A Tabela 8 abaixo apresenta referências que dão base ao papel de diversos leucócitos na patologia de uma variedade de doenças e transtornos. A Tabela 9 apresenta populações de 20 leucócitos exemplares e outras células imunes ou células residentes teciduais envolvidas na patologia de uma série de doenças.
TABELA 8: Leucócitos na Patologia de Doenças
Doença/T Exemplos de Referências rauma Doenças Haringman e outros, Ann. Rheum. Dis., 6S: 294-300, 2006; Artrí¬ Adamopoulos e outros. J. Pathol., 208 35-43, 2006; Ma e ticas Pope, Curr. Pharm. Des., 11: 569-580, 2005; Haringman e outros, Ann. Rheum. Dis., 63: 1186-94, 2004; Koch, Arthritis. Rheum., 52: 710-21, 2005. Câncer, Angio- gênese & Metas- tase
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Doenças
Sistêmi-
cas
Hussein e outros, J. Clin. Pathol., 58: 178-84, 2005; Carulli e outros, Arthritis Rheum., 52: 3772-82, 2005; Cancello e Clement, BJOG, 113: 1141-7, 2006; Tsiligianni e outros. BMC Pulm., Med., 5: 8, 2005; Hansen. e outros, Arthritis Rheum., 52: 2109-19, 2005; Zampieri e outros. Ann. N.Y. Acad. Sei, 1051: 351-61, 2005; Uzun, Chest 127: 2243-53, 2005. Rejeição Hoffmann e outros. Nephrol. Dial. Transplant., 21: 1373-81, de 2006; Nicod, Proc. Am. Thorac. Soc., 3: 444-9, 2006; Wyburn Trans¬ e outros, Transplantation 80: 1641-7, 2005; Perez-Simon e plantes outros, Drugs 66; 1041-57, 2006; Ruster e outros, Clin. Nephrol., 61: 30-9, 2004; Belperio e outros, Semin. Crit. Care. Med., 24: 499-530, 2003. Doenças Aries e outros, IMAJ., 7: 768-73, 2005; Foell e outros, J. vascula¬ Pathol., 204: 311-6, 2004; Ishibashi, e outros Circ. Res., res 194: 1203-10, 2004; Wagner e outros, Clin. Exp. Rheumatol., 21: 185-92, 2003; Falk e Jennette. J. Nephrol., 17 (Suppl 8): 83-9, 2004. Obesida¬ Neels e Olefsky. J. Clin. Invest., 116: 33-5, 2006; de Weisberg e outros, J. Clin. Invest., 116: 115-24, 2006; Fantuzzi, J. Allergy. Clin. Immunol., HS: 911-9, 2005; Martinovic e outros, Circ. J., 69: 1484-9, 2005; Weisberg e outros. J. Clin. Invest., 112: 1196-808, 2003) TABELA 9: Exemplos de Tipos de Células Leucócitos em Doenças Humanas
Doença/Traiima Exemplos de Subtipos de Leucócitos Cânceres (todos órgãos) Crescimento geral, angiogênese ΤΑΜ, T, Eosinófilos, B, e metástase MaC, PMN, DC, Basófilos Câncer de mama TAM, DC,’ T, PMN, B Glioma TAM, PMN, DC Câncer de rins TAM, PMN Câncer de ovário MNP, T, NK, MaC Doenças Cardiovasculares Aterosclerose MNP, T, PMN Infarto do miocárdio MNP, PMN, T, MaC Restenose MNP, T, Eosinófilos Doenças Crônicas dos Rins Nefropatia diabética MNP, T, PMN, MaC Glomerulonefrite MNP, PMN, T, MaC, DC Nefropatia IgA MNP, T, PMN, MaC, DC, B Lúpus Nefrite MNP, T, PMN, B, DC, MaC Doenças do Sistema Nersovo Central e Traumas Doença de Alzheimer MNP, T, PMN Esclerose múltipla MNP, T, Thl, PMN, B Lesão Cerebral Traumática MNP, T, PMN Lesão à Medula Espinal MNP, T, PMN Encefalopatias espongiformes MNP, T, B, DC Acidente vascular MNP, T, PMN, DC, MaC Doenças Oculares Conj untivite MNP, T, MaC, Eosinófilos, B Vitreoretinopatia MNP, PMN, T proliferativa Retinite e Irite MNP, PMN, B, T Uveite MNP, T, PMN, DC HlV e AIDS Doença dos Intestinos Inflamados Doença de Crohn DC, T, MN, B, MaC, Eosinófilos, PMN Colite ulcerativa MNP, T, B, DC, Eosinofilos, MaC, PMN Gastroenterite eosinófila Eosinófilos, Th2, MaC, B, PMN Doenças das Articulações Gota MNP, PMN, T, Eosinófilos Osteoartrite MNP, B, T, PMN, DC Osteoporose MNP, T Artrite reumatóide MNP, DC, PMN, B, T Doenças do Figado Doenças Pulmonares Lesão aguda do pulmão PMN, MNP, T, MaC Sindrome de angústia PMN, MNP, T, GC, MaC respiratória aguda Asma Eosinófilos, MNP, B, Th2, MaC, NK Doença pulmonar obstrutiva MNP, T, PMN, DC, MaC, crônica Eosinófilos Fibrose cistica PMN, MNP, Eosinófilos, MaC, T, B Enfisema MNP, PMN, T, MaC, Eosinófilos Pneumonia eosinofilica Eosinófilos, MNP, MNP, T, GC Fibrose pulmonar PMN, T, Eosinófilos, MNP, MaC Doenças da Pele Dermatite MNP, DC, T, MaC, Eosinófilos, B, PMN Eczema MNP, T, DC, MaC, Basófilos T, MNP, DC, MaC, Basófilos, Eosinófilos Psoriase PMN Doenças Sistêmicas Doença de Behcet PMN, T, B, MNP, Basófilos, MaC Sarcoidose MNP, PMN, T, Eosinófilos, NK, GC, MNP, T, Eosinófilos, MNP, DC, B, Basófilos Escleroderma NK Septicemia PMN, MNP, T Sindrome de Sjogren T, B, MNP, DC, MaC, PMN Lúpus eritematoso sistêmico PMN, T, MaC, B, MNP, DC, Basófilos Obesidade MNP, T, MaC, Adipócitos Transplante Doença de hospedeiro versus MNP, T, DC, MaC, enxerto Eosinófilos, PMN, B Rejeição de enxerto/órgão MNP, T, DC, Mac, Eosinófilos, NK, B Doenças Vasculares Arterite de célula gigante GC, MNP, T, DC Hipertensão MNP, PMN, T, Basófilos Veias de varicose MaC, MNP, DC, T Vasculitides T, PMN, MNP, Eosinófilos, GC Obesidade MNP, T, PMN Legenda: B = célula B; T = célula T; NK = célula
exterminadora natural; Th2 = célula T auxiliar do tipo 2; DC = célula dendrítica; MNP = fagócitos mononucleares (monócitos, macrófagos e micróglia); GC = célula gigante (macrófago fundido multinucleado); TAM = macrófago associado a tumor; PMN = neutrófilo polimononuclear; MaC = mastócito.
2. Terapêutcas Candidatas
Diversas abordagens direcionadas à interferência nas atividades celulares, incluindo, por exemplo, atividades de leucócitos patológicos e células cancerígenas, foram e estão sendo exploradas. Um problema freqüentemente encontrado nestes muitos agentes é uma falta de especificidade. Os agentes imunossupressores tais como corticosteróides ciclofosfamida e azatioprina, por exemplo, foram usados para o tratamento de doenças inflamatórias, no entanto os efeitos imunossupressores não específicos destas drogas têm diversos inconvenientes. Em primeiro lugar, a defesas do hospedeiro é comprometida e pode produzir 5 infecções que colocam a sua vida em risco e uma incidência aumentada de tumores devido a uma falta de imunovigilância. Em segundo lugar, a toxicidade direta a órgão e a destruição de processos metabólico são comuns (vide, por exemplo, Ingelfinger e Schwartz, N. Engl. J. Med. 353: 836- 10 9, 2005; Siegal e Sands, Ailment Pharmacol. Ther, 22: 1-16, 2005; Duncan e Wilkes, Proc. Am. Thorac. Soc, 2: 449-55, 2005; Perez-Simon e outros, Drugs 66:1041-57, 2006). Outras abordagens vêm sendo também empregadas para se aumentar a especificidade e assim reduzir os efeitos colaterais das 15 drogas. Os modificadores de resposta biológica (BRMs), por exemplo, incluindo antagonistas de receptores de citocinas e de quimiocinas; anticorpos anti-ligantes de citocinas e de quimiocinas; moléculas anti-adesão celular (CAMs), reagentes anti-GAG e moléculas que interferem nos trajetos 20 de transdução de sinal intracelular foram desenvolvidos (vide, por exemplo, Johnson e outros (2004) Biochem. Soc. Trans., 32: 366-77; Johnson e outros (2004) J. Immunol., 173: 5776-85; Eis e outros (2004) Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 52:164-72; McDonald e outros (2001) Drugs., 4: 427- 25 42; Ribeiro e Horuk (2005) Pharmacol. Ther. 107: 44-58; Wong (2005) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 264-71; de Boer (2005) Drug Discov. Today 10: 93 105; Haringman e Tak (2004) Arthritis Res. Ther., 6:93-7; Barber e outros (2005) Nat. Med. 11: 933-5; Camps e outros (2005) Nat Med 11: 936- 30 43; Schon e outros (2003) J. Invest. Dermatol., 121: 951- 962) .
BRMs, no entanto têm limitações no tratamento de doença devido à natureza compensatória, pleiotrópica e heterogênea das diversas redes e cascatas empregadas nas respostas imunes homeostáticas e inflamatórias. Consequentemente, uma das razões para as limitações do uso de BRMs no tratamento de doença é divido à redundância e a 5 conversa cruzada da maquinaria de sinalização celular, incluindo a redundância entre receptores celulares e mediadores solúveis envolvidos em doenças. Há uma grande quantidade de redundância em mediadores envolvidos em inflamação, por exemplo, tal como, por exemplo, por membros 10 dos sistemas de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento.
Tipicamente as células imunes podem expressar receptores diversos para mediadores de ligantes solúveis.e cada receptor pode responder a mais de um ligante solúvel. 15 As quimiocinas MIP-Ια, RANTES e LEC, por exemplo, se ligam a CCR5, mas também se ligam a CCRl; CCRl e CCR3; e CCRl e CCR2, respectivamente (veja Tabela 5) . Portanto, os antagonistas a CCR5 não interferem na ligação de MIP-Ια, RANTES e LEC a CCRl, CCR2 e/ou CCR3, e continuam a exercer 20 efeitos inflamatórios (vide, por exemplo, Matsui e outros,
(2002) J. Neuroimmunol. 128: 16-22). Em um outro exemplo, a inibição da quimiocina MCP-I para reduzir a infiltração de macrófagos pro meio de CCR2 na doença não é um terapêutico ótimo, uma vez que outras quimiocinas também usam CCR2 25 incluindo, por exemplo, MCP-3, MCP-2, MCP-5, MCP-4 e LEC e macrófagos expressam outros receptores de quimiocinas além de CCR2 (vide, por exemplo, a Tabela 5). Fujinaka e outros (J. Am. Soc. Nephrol., 8: 1174-8 (1997)), por exemplo, demonstraram que um anticorpo neutralizador a MCP-I reduzia 30 os números de monócitos e macrófagos e proteinúria nos glomérulos quando tratando o paciente a 4 dias, no entanto, depois de 8 dias o tratamento anti-MCP-1 não reduziu a infiltração celular, a excreção de proteína urinária ou a formação de crescente. Assim, neste sistema, os macrófagos foram ativados, não somente por MCP-I, mas também por outros fatores que contribuíam para a lesão glomerular. Além dos outros ligantes de CCR2, por exemplo, os macrófagos também expressam CCRl, CCR3, CCR5 e CCR8 e em alguns casos CXCRl e 2, dos quais alguns, ou todos, poderiam ter sido os fatores associados com a patologia observada. O tratamento anti-MCP-1 também foi observado como não tendo nenhum efeito sobre a melhora clínica ou imuno-histológica em um teste de artrite (vide, por exemplo, Haringman e outros, (2006) Arthritis Rheum., 54: 2387-92) .
Portanto, a maioria dos produtos terapêuticos candidatos têm como alvo um, mas não todos dos mediadores bioquímicos liberados ou ativados por leucócitos, ou então eles destroem um subtipo específico de leucócito numa falsa premissa de que um único tipo de célula é somente responsável por uma doença dada, o que raramente o caso, se não nunca. Uma abordagem mais abrangente ao tratamento de doença, transtornos, ou trauma consiste na eliminação de componentes celulares, tais como leucócitos incluindo leucócitos patológicos e/ou TRCs, envolvidos na patologia da doença. Existe uma correlação entre números e uma atividade aumentada de leucócitos e a gravidade da doença e parâmetros patológicos medidos (vide, por exemplo, Wada e outros (1996); Zoja e outros (1996); e Chiang e outros (1996); Nikolic-Paterson e Atkins, Nephrol. Dial. Transplant., 16 (Supl. 5): 3-7, 2001). A eliminação de leucócitos patológicos tais como leucócitos ativados, por exemplo, abole a produção de mediadores inflamatórios e moléculas tóxicas e reduz o trânsito de leucócitos que é responsável pela exacerbação de muitas doenças. Exemplares de tais terapêuticos candidatos são conjugados de ligante- toxina, especialmente os conjugados que têm como alvo receptor de quimiocina que têm como alvo leucócitos ativados. Portanto tais conjugados são terapêuticos candidatos para doenças com um componente inflamatório ou que compartilham uma patologia inflamatória subjacente.
3. Conjugados de Ligante-Toxina
Os conjugados de ligante-toxina já foram gerados e são conhecidos aqueles que têm com alvo especificamente uma ou mais de uma população de células envolvidas na patologia de um desenho. São incluídos nestes, conjugados de toxinas de quimiocinas, tais como os descritos no Pedidos US números de série 09/360.242; 09/453.851; e 09/792.793, agora Patentes US números 7.166.702, 7.157.418 e 7.192.736. Tais conjugados têm como alvo um, e tipicamente mais de um tipo de célula, por reconhecimento por um ou mais de um receptor de superfície celular específico e são internalizados levando à destruição da célula por meio da fração toxina. Usando-se tais conjugados de toxinas foi demonstrado que uma erradicação específica e criteriosa de leucócitos e de outras células, incluindo leucócitos patológicos, pode ser eficaz no tratamento de doenças (vide, por exemplo, McCarron e outros (2005), Mol. Interv., 5: 368-80; Pastan e outros (2006), Nat. Rev. Cancer 6: 559-65; Frankel e outros (2003), Semin. Oncol., 30: 545-57; Pastan (2003), Immunol. Ther. 52: 338-41; Kreitman, (2006) AAPS. J., 8: E532-51; Carter (2006), Nat. Rev. Immunol., 6: 343-57; Cohen (2005) Med. Gen. Med., 7: 72; Edwards e outros (2004) N. Engl. J. Med. 350: 2572-81; Zeisberger e outros (2006) Br. J. Cancer, 95: 272-81; Cross e outros, J. Neuroimmunol. Aug. 10, 2006, (publicado na Internet); Cailhier e outros (2005), J. Immunol, 114: 2336- 42; van Roon e outros (2005) Ann. Rheum. Dis. 64: 865-70; Sfikakis e outros (2005) Arthritis Rheum., 52: 501-13; Nikolic-Paterson e Atkins (2001) Nephrol. Dial. Transplant., 16: Supl 5, 3-7; Rajan e outros (1998), J. Immunol. 160: 5955-62; Hu e outros (1997) Cell Immunol., 111: 26-34; Schuh e outros (2003) Eur. J. Immunol, 33: 5 3080-90; Taoka e outros (1997), Neuroscience 79:1177-82; Wolff e outros, (2004) J. Vasc. Surg., 39: 878-88; Duffield e outros, Am. J. Pathol, 167: 1207-19, 2005).
São propostos na presente invenção conjugados de ligante-toxina contendo um polipeptideo da toxina RIP. Os conjugados podem ser usados para tratar uma variedade de doenças e transtornos para os quais é projetado o conjugado que contém as toxinas RIP sem modificação. Conforme foi discutido acima, estes conjugados de ligante-toxina modificados exigem uma toxicidade reduzida a células hospedeira, permitindo, deste modo, uma produção com alto rendimento da toxina. A produção aumentada de tais conjugados modificados de ligante-toxina é vantajosa para seu uso como terapêuticos candidatos e como terapêuticos para o tratamento de doenças e transtornos alvo. Os conjugados de ligante-toxina modificados, incluindo aqueles que contém uma SAl modificada podem ser usados para eliminar células ou inibir de outro modo qualquer o seu crescimento ou alterar o seu metabolismo. As células alvo são aquelas envolvidas na patologia de doenças ou transtorno, de células envolvidas em inflamação, angiogênese ou cânceres, por exemplo.
Dentre os conjugados que contém as toxinas modificadas encontram-se conjugados de ligante de quimiocina-toxina, designadas moduladores da população de 30 leucócitos (LPMs). Conforme será descrito abaixo, os LPMs são projetados para erradicar leucócitos patológicos ativados (inflamatórios) e outras células ou para alterar o seu metabolismo por meio da exploração dos receptores de quimiocina extremamente regulados expressos nestas células. A fração ligante do LPM é responsável para conseguir entrar nas células por meio de um receptor de quimiocinas cognato. As células que expressam o receptor adequado de quimiocina absorverão a molécula LPM que inclui uma toxina que inibe o crescimento das células, destrói as células ou altera o seu metabolismo de outro modo qualquer, tal como por degradação do ácido nucléico viral ou por interferência na síntese das proteínas. Como as células patológicas são removidas ou inibidas ou destxiuídas, há cada vez menos comunicação entre células envolvidas no processo mórbido e os mediadores pro- inf lamatórios deixam de ser sintetizados. Portanto, os estímulos múltiplos envolvidos nos diferentes processos de inflamação ou outros processos mórbidos (angiogênese onde as células alvo são células endoteliais tais como aquelas que expressam VEGFR) são concomitantemente interrompidos.
Os métodos propostos no presente documento permitem a geração e o isolamento de toxinas modificadas tais como RIPs, ou de conjugados contendo tais toxinas, que são menos tóxicas às célula(s) hospedeira(s) em que elas são produzidas para uso em conjugados ou produzidas em forma de conjugados. Portanto, podem ser produzidas quantidades mais altas. Como as toxinas são tão potentes, uma redução de toxicidade de um fator de 10, de um fator de 100 até mesmo de um fator de 1000 ou mais não produz impacto sobre o· seu uso nos conjugados terapêuticos. Qualquer conjugado conhecido dos versados na técnica ou preparado pelos versados na técnica que contiver uma toxina, especiaLmente uma toxina RIP, pode ser modificado pelos métodos da presente invenção ou por substituição da toxina por uma toxina modificada proposta no presente documento. Muitos tais conjugados são conhecidos. Eles incluem os das patentes US Nos. assim como conjugados de citocinas, tais como conjugados de fatores de crescimento e anticorpos e outros agentes que têm polipeptideos como alvo.
São incluídos dentre os conjugados de ligante- toxina aqueles que tem um ligante ligado, tal como uma quimiocina ou fragmento ativo seu, direta ou indiretamente a formas truncadas de SAl tais como, por exemplo, uma variante 1 ou 2 de SAl conforme descrito no presente documento. Exemplares de tais conjugados são LPMla e LPMlb, apresentados nas SEQ ID NO: 38 e 40, respectivamente. Mais especificamente conjugados contendo ligação de um ligante de quimiocina a uma SAl modificada, incluindo, sem limitação, qualquer SAl modificada identificado nos métodos da presente invenção, tais como uma variante 1 mutante de SAl (isto é a variante 3) ou uma variante mutante 2 (isto é a variante 4) da fração SAI, ou qualquer outra SAl modificada que se sabe ou que se descobriu que apresenta uma toxicidade reduzida. Exemplares de tais LPM para uso nos métodos do tratamento da presente invenção são qualquer um dos conjugados de PM apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, ou 66.
Qualquer célula ou células podem ser alvo de conjugados de ligantes propostos no presente documento 25 desde que a(s) célula(s) expresse(m) um ou mais receptores de superfície celular que interagem com o conjugado de ligante-toxina, resultando assim na internalização do conjugado. Qualquer tal célula que expressar um ou mais receptores de quimiocina, por exemplo, pode servir de alvo 30 ligando-se o agente que tem como alvo o receptor de quimiocina à toxina modificada. Conjugados exemplares são propostos no presente documento, e incluem qualquer uma ou mais das moléculas LPM propostas na presente invenção. Incluídos dentre as células alvo são leucócitos ou outras células imunes, especialmente leucócitos ativados e células imunes, tais como, sem limitação, monócitos, macrófagos (inclusive macrófagos alveolares, micróglia, células de kupffer), células dendríticas (incluindo células dendríticas imaturas ou maduras e células de Langerhan), células T (incluindo positivas para CD4 tais como, sem limitação, células Thl e/ou Th2, ou células positivas para CD8), células B, eosinófilos, basófilos, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK) e neutrófilos. Além disso, são incluídas quaisquer células residenciais teciduais (TRC), tais como células mesangiais, células gliais, células endoteliais, células epiteliais, células tumorais, fibroblastos, adipócitos, astrócitos, e/ou sinoviócitos. A expressão dos receptores de quimiocina nas células pode ser constitutiva ou pode ser induzível, tal como devido à ativação das células. Tipicamente leucócitos quiescentes ou leucócitos empenhados em outras funções não são alvo de LPMs tais como qualquer uma proposta na presente invenção (McDonald e outros IDrugs, 4: 427-42, 2001). Geralmente, LPMs são específicos a quimiocinas induzíveis, tais como aquelas quimiocinas que são supra- reguladas sobre células ativadas devido a condições inflamatórias ou outras que podem se tornar patológicas e exacerbar as manifestações de diversas doenças ou transtornos. Portanto, somente os leucócitos ativados ou outros TRC ativados contendo os receptores de quimiocinas alvo são usados.
Por exemplo, em muitos casos, para se iniciar e sustentar um processo mórbido (câncer, por exemplo) ou uma resposta inflamatória, as células envolvidas são ativadas e supra-regulam a sua expressão de receptores de superfície celular para uma variedade de ligantes. Como os receptores envolvidos em trauma e doença estão freqüentemente supra- regulados, fica aumentada a probabilidade dos agentes terapêuticos serem internalizados pelas células corretas,. Assim, ter-se como alvo receptores celulares supra- regulados em processos mórbidos aumenta a especificidade de um conjugado de toxina dada para o tratamento de uma doença ou transtorno específico.
Exemplos de doenças ou de transtornos tratados rio presente invenção são aqueles que têm um componente celular imune ou inflamatório associado com a patologia da doença, tais como os discutidos nas Tabelas 8 e 9 acima. Estes incluem, por exemplo, condições tais como trauma e qualquer doença que tenha um componente alérgico, angiogênico, autoimune, inflamatório ou tumorigênico. Portanto, ter-se como alvo células ativadas, tais como, sem limitação, qualquer leucócito ativado, tal como célula efetora imune ativada e/ou qualquer célula tecidual residencial ativada ou outra célula envolvida em uma doença ou transtorno que expressa um ou mais de um receptor de quimiocina é contemplado pela presente invenção para o tratamento de uma doença ou transtorno com um conjugado de ligante-toxina, tal como qualquer conjugado de LPM proposto na presente invenção.
Qualquer doença ou transtorno, no entanto, tratado por conjugados de toxina, incluindo aqueles que têm como alvo células envolvidas em angiogênese e câncer e outras doenças, pode ser modificada substituindo-se a fração polipeptídeo da toxina com uma toxina modificada proposta na presente invenção ou pode ser modificada pelos métodos propostos na presente invenção. Terapêuticos exemplares aprovados por FDA que podem ser modificados incluem, por exemplo, Gemtuzumab-ozogamicina que é um ligante-proteína de fusão de toxina composto de um anticorpo monoclonal humanizado contra CD33; Denileukin diftitox é uma proteína de fusão composta de toxina com ligante de IL-2 humano.
Seleção de Conjugado de Ligante-Toxina para Tratamento de Doenças ou Transtornos Selecionados
Conforme discutido acima e exemplificado nas Tabelas 8 e 9, diversos tipos de células exacerbam e/ou contribuem para a patologia de uma série de doenças, transtornos e outras condições. Em uma doença ou transtorno 10 dado é possível se montar um perfil do(s) subtipo(s) de leucócito ou de outros tipos de células envolvidos, e o tipo e a distribuição dos receptores de superfície celular associados expressos. Consequentemente podem ser projetados conjugados de ligante-toxina que têm como alvo um receptor 15 de superfície celular específico, proporcionando deste modo uma concretização para entrada na célula que afeta e um mecanismo para o tratamento da doença específica. Conforme descrito no presente documento, tais conjugados de ligante- toxina geralmente incluem uma toxina RIP modificada ou uma 20 fração ativa sua, tal como uma SAl modificada, que depois da entrada em uma célula hospedeira alvo destrói a célula como um modo de tratar a doença. Portanto, a seleção de uma fração ligante escolhida para atingir uma célula hospedeira é um fator essencial para se projetar um conjugado de 25 ligante-toxina. A seleção de um conjugado de ligante-toxina para o tratamento de doença exige as seguintes etapas: 1) a seleção da doença a ser tratada; 2) a determinação de quais as células que estão presentes em excesso e/ou que contribuem para tal doença; 3) a determinação do perfil de 30 expressão dos receptores de superfície celular sobre os tipos de células selecionados; 4) a correlação da expressão do receptor de superfície celular sobre outros tipos de células que também possam estar envolvidos com a doença; 5) a escolha de um ligante para o receptor de superfície celular escolhido; e 6) a construção do conjugado de ligante-toxina.
Precisamente quais as citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e/ou seus receptores cognatos devem servir de alvo depende da(s) população(ões) de células exata(s) envolvidas em uma doença ou transtorno específico, do tecido em questão, e/ou do estágio da lesão ou doença. Foi mostrado que eixos específicos de ligante de quimiocina inflamatório/receptor, por exemplo, são expressos e proeminentes em doenças específicas. Portanto é possível se projetar drogas para doenças específicas pela escolha do ligante relevante (isto é, da quimiocina, citocina, fator de crescimento) que tem como alvo o seu receptor cognato nos subtipos de leucócitos proeminentes nas doenças e traumas específicos.
A Tabela 9 apresenta uma lista exemplar de doenças e as populações de leucócitos ou de outras células responsáveis pela patologia ou pela exacerbação de tal doença. Os versados na técnica conhecem ou podem identificar populações de células, tais como qualquer uma ou mais células apresentadas na Tabela 9, o que contribuem para o progresso da doença. 0 ataque direcionado contra qualquer uma ou mais das células envolvidas em uma doença ou transtorno por um conjugado de ligante-toxina tal como qualquer um proposto na presente invenção pode ser usado para o tratamento de doença ou transtorno. A seleção do conjugado de ligante-toxina a ser usado em tal tratamento depende da expressão dos receptores de superfície celular na célula ou na(s) população(s) de células e da especificidade de um ligante para um tal receptor (es). Os versados na técnica conhecem ou poderiam identificar os receptores expressos nos tipos de células específicos, incluindo considerações do tecido em questão ou do estado da lesão e/ou da doença. A expressão de receptor pode ser determinada em uma célula ou população de células, por exemplo, usando-se estudos de expressão rotineiros, tais como, sem limitação, citometria de fluxo ou metodologias de PCR em tempo real. As células testadas podem ser linhagens de células, células primárias cultivadas, ou células obtidas diretamente de um paciente que tem a doença òu transtorno (isto é, células obtidas do tecido, sangue ou outra fonte do paciente). De modo análogo, a especificidade de ligante-receptor pode ser avaliada usando-se ensaios de ligação rotineiros conhecidos dos versados na técnica tais como os descritos no presente documento. A ligação a ligante pode ser detectada, por exemplo, rotulando-se diretamente o ligante com fluorescência ou radioatividade para a medição direta da ligação a uma célula alvo selecionada por meio de citometria, fluorimetria ou por meios radioativos. Tipicamente tais ensaios de ligação são conduzidos a 4°C, mas também podem ser conduzidos a 370C para se determinar se o receptor de superfície celular alvo medeia endocitose e internalização do ligante especifico. Para os fins de uma fusão de conjugado-ligante, a internalização é uma consideração necessária, uma vez que a toxina deve conseguir entrar no citoplasma da célula para exercer os seus efeitos tóxicos.
A discussão abaixo descreve o projeto e a seleção de conjugados de ligante-toxina conforme exemplificados pela seleção de moduladores de população de leucócito com base nos perfis de expressão conhecidos de quimiocinas e de seus receptores cognatos. Estratégias similares são conhecidas ou poderiam ser usadas para projetar outros conjugados de ligante-toxina. A discussão tem cunho exemplar somente. O projeto de conjugados de ligante-toxina necessita de considerações especificas a doença, incluindo, por exemplo, o estágio e a gravidade da doença. Os versados na técnica poderiam projetar e testar conjugados de ligante toxina em diversos ensaios in vitro de atividade tóxica, tais como a atividade tóxica contra uma célula ou população de células específicas e ensaios in vivo de doença, tais como, sem limitação, quaisquer descritos no presente documento.
Seleção e Projeto de Moduladores da População de
Leucócitos
O projeto de um LPM direcionado ao tratamento de uma doença específica necessita da seleção do agente direcionador adequado tal como, por exemplo, um ligante(s) quimiocina. As quimiocinas para uso nos conjugados são selecionadas de acordo com a doença ou transtorno a ser tratado. Como uma primeira exigência, os leucócitos ou outras células associadas com uma doença ou condição específicas são identificadas. Conforme foi discutido no presente documento, as contribuições de diversas populações de leucócitos para a doença é conhecido (vide, por exempló, as Tabelas 8 e 9) ou podem ser determinadas. Uma segunda etapa consiste em se escolher um ligante quimiocina específico que tem como alvo um ou mais de um receptor de quimiocina expresso em uma ou mais de uma das populações de células a serem tomadas como alvo. Tais quimiocinas ligantes são escolhidas com base na especificidade de uma quimiocina para um receptor, assim como o perfil de expressão dos receptores de quimiocina em diversas células. A expressão de receptores de quimiocinas nos subtipos de leucócitos e as interações de ligante-receptor de quimiocina são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, as Tabelas 5 e 6) ou podem ser determinadas experimentalmente pelos versados na técnica. Mais especificamente, a seleção de uma quimiocina preferida para uso nos conjugados de ligante-toxina é um que tem como alvo um receptor de quimiocina que é induzido em condições inflamatórias e patológicas, mas que não é expresso em células durante a homeostase imune. A Tabela 7 apresenta, por exemplo, os perfis de receptores de quimiocinas em condições inflamatórias (isto é, patológicas) e homeostáticas. Tal tabela é exemplar somente e fica subentendido que a expressão induzida de receptores de quimiocinas é dependente de contexto e influenciada por diversos fatores, tais como, por exemplo, dos estímulos, da doença, estado ou gravidade da doença e das populações de células específicas testadas. Os versados na técnica conhecem ou podem determinar experimentalmente a expressão do perfil de quimiocina (isto é, a quimioimpressão) em uma célula ou em uma população de células durante diversas condições ou estados mórbidos. A seleção de um agente direcionado que tem atividade contra células patológicas, mas não sobre outros leucócitos inocentes ou quiescentes, assegura que as células ativadas que contribuem para o progresso da doença são tomadas como alvo para destruição.
Determinadas quimiocinas parecem ter mais influência em estados mórbidos específicos do que outras. A expressão de MCP-1, por exemplo, parece regular a encefalomielite autoimune experimental (EAE) aguda ao passo que a expressão de MIP-Ia tem correlação com a gravidade de EAE reincidente. Em um outro exemplo, o tingimento imuno- histoquímico das amostras de cérebro da doença de Alzheimer (AD) indica uma predominância da expressão de MIP-Ιβ em comparação com diversas outras quimiocinas. Assim, MIP-Ia e MIP-Ιβ seriam os ligantes preferidos para um conjugado de LPM para o tratamento de MS e doença de Alzheimer, respectivamente. Os ligantes, tais como MCP-1, IP-IO e RANTES seriam usados para o tratamento de MS humana como seus receptores cognatos CCR2, CXCR3 e CCR5,respectivamente são supra-regulados na doença. As eotaxinas 1, 2 e 3 apresentam uma alta especificidade para CCR3 que é, de preferência, expresso por eosinófilos. Portanto, os LPMs de eotaxinas podem ser usados para doenças eosinófilas (alérgicas) que incluem diversas doenças pulmonares e da pele incluindo asma, sindrome de eosinofilia-mialgiá, alergia nasal, dermatite atópica e polipose. Em um exemplo adicional PF-4 é uma quimiocina usada para ter como alvo células endoteliais e pode ser usadas para o tratamento de angiogênese ou de outras doenças angiogênicas associadas tais como transtornos oculares ou diabetes (vide, por exemplo, WO 95/12414).
Portanto, a consideração de outros fatores tais como, por exemplo, o estágio da doença, a gravidade da doença, e o tempo e duração do tratamento também influenciam a escolha de ligante quimiocina. Um LPM de quimiocina específico que apresenta um grau mais elevado de especificidade a receptor pode ser desejável em um estágio inicial da lesão secundária do tecido, onde, por exemplo, a micróglia e/ou os macrófagos estão iniciando a inflamação. A remoção destas células com um agente muito específico pode reduzir o potencial para a ativação de células circundantes que ainda são benignas. Quando são recrutados outros sub-grupos de leucócitos, no estágio intermediário ou tardio da doença, pode ser desejável um espectro mais amplo da especificidade de célula. Além disso, uma quimiocina LPM de espectro mais amplo adequadas forneceria um golpe muito forte a aquelas populações restritas de leucócitos que expressam uma multiplicidade de tipos de receptores de quimiocinas. Por exemplo, MCP-1, Eotaxina e SDF-Ιβ são exemplos de quimiocinas ligantes que apresentam um perfil de ligação muito especifico a receptor. Tais ligantes têm como alvo tipos de células muito específicos através de um subconjunto restrito de receptores disponíveis. MCP-31 e RANTES são exemplos de ligantes que têm perfis amplos de ligação a célula e a receptor. Tais ligantes de quimiocina podem ser relevantes a uma faixa única ou ampla de condições clínicas. Um ligante que tem como alvo uma faixa ampla de tipos de células usando subtipos de receptor podem ser expresso em todas as células ou somente em determinadas células. Isto é em muito uma função dos tipos de células que são específicas a uma condição dada ou comuns a uma faixa de condições.
Com base nas considerações acima, LPMs podem ser projetadas. Se uma doença pulmonar, tal como uma lesão pulmonar aguda (ALI), por exemplo, uma síndrome de angústia respiratória aguda (ARDS) ou doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) for contemplada para tratamento, os versados na técnica sabem (isto é, conforme apresentado na Tabela 9 acima) ou poderiam determinar que qualquer um ou mais dos tipos de células expressas em tais doenças incluindo PMN, MNP, células T, mastócitos, DCs imaturas ou maduras e/óu eosinófilos expressam uma ou mais de, por exemplo, CCR1, CCR2 e CCR3. Portanto, a seleção de um ligante que seja específico a um ou mais de tais receptores de quimiocinas (MCP-1, MCP-3 ou Eotaxina, por exemplo) consiste no primeiro passo na projeção de um conjugado de ligante-toxina para o tratamento de qualquer uma ou mais de ALI, ARDS ou COPD. Um segundo passo consiste em compreender a expressão de receptores de quimiocina específicos nos subtipos de leucócitos patológicos diferentes implicados na doença. Um conjugado de ligante-toxina que tem MCP-1, MCP-3 ou Eotaxina como uma fração ligante ligada direta ou indiretamente a uma RIP modificada tal como qualquer uma descoberta pelos métodos da presente invenção e/ou descrita no presente documento poderia ser contemplada para uso no 5 tratamento de doenças pulmonares. Incluído dentre tais conjugados de ligante-toxina é LPMld.
A tabela abaixo resume alguns ligantes exemplares
para uso no projeto de LPMs para o tratamento de doenças 'e condições selecionadas
TABELA 10: Exemplos de Ligante(s) e Doença Tratada Ligante(s) Doença/Condição MCP-1 e 3, RANTES, IP- Aterosclerose e Restenose 10, IL-8, GROa MCP-1 e 3, RANTES, SCI, Lesão Traumática do Cérebro, SDF-Ιβ Acidente Vascular, AD MCP-1 e 3, RANTES, IP- Esclerose Múltipla Eotaxina, RANTES, MDC, HIV MCP-1, SDF-Ιβ Eotaxina, MCP-1 e 4, Doenças Inflamatórias do Intestino MDC, IL-8, ENA-7 8 MCP-1-4, RANTES, IP- Doenças Inflamatórias das 10, MG, IL-8, ENA-7 8, Articulações (artrite, por GROa, I-TAC exemplo) Doenças Inflamatórias do Pulmão MIP-Ia, MIP-Ιβ, MCP-1, Lesões agudas do Pulmão e Fibroses 2, 3, 4, RANTES, IP- 10, IL-8, ENA-7 8 Eotaxina, MCP-4, MDC Doenças Alérgicas e Associadas com Eosinófilos MCP-1, IL-8 Doenças Inflamatórias oculares Cânceres SDF-Ιβ, IP-10, MG, IL- Glioma 8, ENA-7 8, GROa MCP-1, 3 e 4, RANTES, Mama SDF-Ιβ MCP-1, IL-8, ENA-78 Pulmão MCP-1, RANTES, IP-IO Doenças Inflamatórias dos Rins, vasculite e Rejeição de Transplantes Para tal fim, uma série de proteínas de fusão de
ligante de quimiocina e toxina (isto é, LPMs) foram projetadas para o tratamento de doenças de acordo com tipos de células predominantes envolvidos na patologia ou na agravação da doença. Os LPMs exemplares para o tratamento de doenças específicas são apresentados na Tabela 11.
TABELA 11: Exemplos de Aplicações em Doenças para Moduladores de Populações de Leucócitos
Ligante de Aplicações Clinicas Exemplares Quimiocina-Toxina MCP-I-SAlVar4 Doenças Renais, do SNC, Pulmonares, (LPMld) Cardíacas e das Articulações, Transplante Eotaxina-SAlVar4 Doenças Alérgicas pulmonares, nasais (LPM2) e da Pele SDF-^-SAl Var 4 Câncer, Doenças das Articulações e (LPM3) HIV IP-10-SAlVar4 (LPM7) Câncer, SNC, Articulações, Rins, Transplantes MCP-3-SAlVar4 (LPM8) SNC,Coração, Articulações, Rins GRO-α SAlVar4 (LPM4) Câncer e Doenças das Articulações IL-8-SAlVar4 (LPM6) Câncer, Pulmonares, Renais, das Articulações 4. Exemplos de Doenças
Os conjugados de ligante-toxina que têm como alvo
células envolvidas em patologias, tais como aquelas associadas com angiogênese aberrante, aquelas com um 5 componente inflamatório subjacente, células tumorais e outras células aberrantes, células infectadas por vírus, são conhecidos ou podem ser preparados. A doença específica a ser tratada dita o ligante (agente direcionado) ou o seu fragmento que é selecionado. Qualquer tal conjugado pode 10 incluir as toxinas modificadas propostas e descritas no presente documento (todas essas descrições são incorporadas a título de referência a esta seção assim como a todas as outras).
Exemplos de doenças ou de estados mórbidos são 15 aqueles associados com a proliferação, ativação e migração de diversos tipos de células imunes inflamatórias que incluem leucócitos e outras células contribuintes de origem epitelial ou endotelial. Estes eventos se combinam para produzir um ambiente muito agressivo e inóspito no sítio de 20 uma lesão ou doença. A biologia celular de centenas de doenças e condições, envolvendo a maioria dos sistemas orgânicos, envolvem respostas patofisiológicas
inflamatórias. Os componentes celulares de muitas destas doenças patofisiológicas são exemplificados na tabela 9 25 acima. Tais doenças e transtornos podem ser tratados com qualquer um dos conjugados de ligante-toxina, incluindo qualquer um contendo uma RIP modificada tal como uma fração SAl modificada, proposta no presente documento e/ou produzido conforme descrito no presente documento. 30 Exemplares de tais conjugados de ligante-toxina usados nos métodos do presente documento são LPMs, especialmente qualquer LPM proposto no presente documento que tenha sido projetado e selecionado para o tratamento da doença específica. Portanto, os métodos e composições propostos no presente documento são projetados para inibir 5 temporariamente ou para suprimir a atividade de subtipos de leucócitos (e/ou de outras células tais como adipócitos, astrócitos e outras) e para remover as fontes que alimentam os mecanismos inflamatórios e lesão secundária.
Exemplos de transtornos e condições incluem, sem limitação, qualquer um apresentado na Tabela 9 acima, tais como, por exemplo, doença cardiovascular incluindo acidente vascular, aterosclerose e hipertensão; doença hepática; doença pulmonar tal como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), lesão pulmonar aguda e síndrome de angústia respiratória aguda (ARDS); doença inflamatória das articulações, tal como Artrite Reumatóide e osteoartrite; hipersensibilidade aguda, doenças renais crônicas incluindo neuropatia diabética e glomerulonefrite; doenças sistêmicas tais como lúpus eritematoso sistêmico e obesidade; infecção por HIV e doenças associadas incluindo demência, encefalite e nefropatia; crescimento, neovascularização (angiogênese) e metástase de diversas formas de câncer incluindo, cânceres de todos os órgãos tais como cérebro, mama, pulmão, cânceres e câncer ovariano; doenças do sistema nervoso central incluindo doença de Alzheimer; síndrome de Down; esclerose múltipla, lesão da medula espinal; encefalopatias espongiformes; doença inflamatória dos intestinos tais como sépsis; colite ulcerativa e doença de Crohn; doenças da pele tais como eczema e psoríase; doenças oculares incluindo uveíte e retinite e irite, e vítreo- retinopatia proliferativa; e transplante tal como doença do hospedeiro versus enxerto (GVHD) e rejeição de enxerto/órgão. As descrições do envolvimento de leucócitos e de outros tipos de células na patologia de algumas destas doenças são descritos abaixo. Tais descrições se destinam a serem exemplares somente e não são limitadas a uma toxina de conjugado LPM específica ou a um conjugado de ligante- toxina específico. Os versados na técnica podem projetar e selecionar um conjugado de ligante-toxina para ser usado no tratamento de qualquer doença desejada, com base nos componentes celulares conhecidos. 0 tratamento específico e a dosagem específica podem ser determinados pelos versados na técnica. As considerações em se avaliar o tratamento incluem: a doença a ser tratada, os componentes celulares envolvidos na doença, a gravidade e o curso da doença, se a molécula é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clíniço do paciente e resposta a terapia, e o critério do clínico encarregado.
a. Câncer
Os cânceres podem ser considerados doenças inflamatórias mesmo se as células não forem de origem hematológica. As células cancerígenas apresentam muitos dos fenótipos atribuídos a subgrupos de leucócitos e por definição podem ser consideradas células inflamatórias. Elas têm a capacidade de secretar proteases e mediadores pro-inflamatórios (incluindo quimiocinas) e de conduzir a fagocitose. Além disso, as células cancerígenas expressam diversos receptores incluindo receptores de citocina, de quimiocinas, dos fatores de crescimento (GF); CAMs para facilitar a metástase; e sofrem transdiferenciação. Como um exemplo desta última, as células do carcinoma do cólon sofrem uma transição epitelial-mesenquimal com um aumento concomitante na expressão de CXCRl e CXCL8 que aumentam a motilidade e o caráter invasivo (Bates e outros (2004) Exp. Cell Res., 299: 315-24). O exame quantitativo dos infiltrados de leucócitos revelou, por exemplo, que os macrófagos associados com tumor (TAM) e linfócitos constituem até 50% da massa celular em carcinomas da mama e poderiam ser considerados discutíveis como tumorais (Elkak e outros 92005) J. Carcinog., 4:7; Leek e outros (1996) Cancer Res. 56:4625-9; Murdoch e outros (2004) Blood 104:2224-34; Queen e outros (2005) Cancer Res., 65: 8896- 904) . 0 fato de que MNP e os monócitos recrutados se diferenciam em TAM que proporcionam os fatores de crescimento e auxiliam na angiogênese e metástase comprova esta noção (vide, por exemplo, Ueno e outros (2000) Clin. Cancer Res., 6: 3282-9; Valkovic e outros (2002) Virchows Arch., 440: 583-8; referências na Tabela 8).
b. Doença Renal
Existem muitas categorias de doenças renais, algumas das quais são classificadas em subgrupos. Estas doenças incluem, sem limitação, síndrome nefrítica aguda; doença da membrana de base anti-glomerular; doença renal policística autossomal dominante; glomerulonefrite (GN), GN de anticorpo citoplasmático anti-neutrófilo; nefropatia diabética; glomerulosclerose diabética; glomerusclerose segmentai focal; síndrome de Goodpasture; nefropatia de HIV; GN crescêntica idiopática; GN idiopática; IgAN de nefropatia de IgA; GN de progresso rápido; mesanganoproliferativa por IgM; nefrite do lúpus; GN membranoproliferativa (MPGN, I, II, III); doença de alteração mínima; membranonefropatia; síndrome nefrítica; nefropatia por poliomavírus; GN pós-estreptococal; GN crescêntica rápida; rejeição de transplante renal; vasculitides renais (granulomatose de Wegener, por exemplo) e nefrite tubulointersticial. Uma pequena porcentagem de doenças renais pode e resolver, mas o trajeto mais comum é o declínio ou rápido ou lento na doença renal crônica (CKD) para a qual não há cura. Os pacientes com CKD eventualmente declinam até a insuficiência renal e doença renal de estágio terminal (ESRD). ESRD faz com que o paciente dependa do tratamento por diálise ou do transplante.
Os leucócitos e quimiocinas representam papéis centrais nas doenças renais e na rejeição de aloenxerto renal. A resposta inflamatória nas CKDs pode ser iniciada por leucócitos ativados, auto-anticorpos, imunoglobulinas de complexos imunes, espécies de DNA, nucleossomas, AGE, complemento ou uma combinação destes agentes. Um mecanismo de iniciação importante é uma lesão tubular ou glomerular mediada por anticorpo. Os anticorpos ou formam complexas com antígenos glomerulares insolúveis e/ou complexos imunes com antígenos circulantes que são eventualmente depositados no mesângio dos glomérulos. Diversas células renais e não renais são ativadas e muitos diferentes tipos de mediadores solúveis incluindo citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento profibróticos são liberados no meio. Uma vez ativados, os leucócitos infiltrante e todas as células renais intrínsecas incluindo fibroblastos; células mesangiais (MGCs); células epiteliais tubulares (TEC); podócitos; e células epiteliais parietais glomerulares (PEC) são capazes de expressar estes mesmos mediadores pro- inflamatórios. A patologia geral de CKD envolve pielonefrite (PN) ou infecção do rim; colapso da membrana de base glomerular (GBM) e membrana de base parietal (PBM|); infiltração de leucócitos; formação de crescente; fibrose; destruição dos túbulos e dos nefrônios; e glomérulos em colapso. A não ser que haja resolução ou intervenção médica, a doença progredirá com inflamação constante, lesão renal repetida, fibrose e progresso até ESRD. Os macrófagos/monócitos, as células T e MaC são os leucócitos proeminentes envolvidos em CKD. Diversas quimiocinas e seus receptores cognatos que regulam a ativação, migração e proliferação destes subtipos de leucócitos em CKDs incluem ΜΙΡ-Ια/CCRl, ENA-78/CCR5, 5 fractalcina/CX3CRl, MG/IP-10/I-TAC/CXCR3 e IL-8/CXCR1/2. Conforme foi demonstrado em estudos de modelo animal e humano, o papel de macrófagos/monócitos e de MCP-1/CCR2 em diversos tipos diferentes de CKD é central e torna este eixo de quimiocina/receptor um indicador para a intervenção 10 terapêutica (veja tabela 8 para as referências). Não existem produtos terapêuticos que tratem com sucesso todos os sintomas de CKD e poucos que o fazem sem apresentar efeitos colaterais (vide, por exemplo, Busauschina e outros, Transplant Proc, 36: 229S-233S, 2004; Slattery e 15 outros, Am. J. Pathol., 167: 395-407, 2005; Bir e outros, J. Rheumatol., 33: 185-7, 2006). Portanto existe a necessidade de uma abordagem terapêutica diferente para os CKDs, tais como a proposta no presente documento,
c. Lesão a medula espinal (SCI)
O resultado da lesão a medula espinal (SCI) é um
resultado de trauma inicial mecânico e isquêmico com a destruição da homeostase iônica celular que rapidamente seguida por lesão secundária do tecido infligido pelas ações dos subtipos de leucócitos ativados, incluindo 25 micróglia (os macrófagos residentes do SNC), produção de mediadores inflamatórios de leucócitos e cascatas inflamatórias robustas. Estas cascatas são observadas dentro de minutos e prosseguem durante diversas semanas e são seguidas por um período de recuperação parcial seguido 30 por reparo endógeno e regeneração. A lesão secundária é detectável como morte celular necrótica e apoptótica de neurônios e de oligodendrócitos; excitotoxicidade celular; destruição da barreira sangue-cérebro/sangue-espinhal; I
gliose reativa (que leva a cicatrização glial); neovascularização; desmielinação; perda de função sensorial e motora e dor crônica pós-SCI (Jones e outros (2005) Curr. Pharm. Des., 11: 1223-6; Klussman e Martin-Villalba (2005) 5 J. Mol. Med., 83: 657-71; Lee e outros (2000) Neurochem. Int., 36:417-25; McTigue e outros (1998) J. Neurosci. Res., 53: 368-76; Carlson e outros (1998) Exp. Neurol, 151: 77- 88; Bartholdi e Schwab (1997) Eur. J. Neurosci., 9: 1422- 38; Hains e Waxman (2006) J. Neurosci., 26:4308-17; 10 Abbadie, Trends Immunol., 26: 529-34, 2005). É uma combinação de necrose primária produzida pela lesão fisica inicial e eventos apoptóticos iniciados por mediadores inflamatórios derivados de leucócitos e astrogliais que levam a lesão secundária do tecido em SCI e os mecanismos 15 patológicos são análogos em uma ampla faixa de traumas e doenças do SNC incluindo, por exemplo, lesão traumática do cérebro; acidente vascular; esclerose múltipla (MS), doença de Alzheimer e demência associada com HIV (veja Tabela 8 para referências).
A lesão infamatória aguda em SCI dura diversos
dias, mas é sobreposta pelos mecanismos reparadores de SNC tais como o brotamento de axônios e uma remielinação limitada devida em parte a oligodendrócitos precursores de diferenciação. MNPs (micróglia e macrófagos) foram agora 25 identificados como facilitadores de reparo. Estas células fazem a fagocitose de células mortas e de detritos e fornecem fatores de crescimento de proteínas de matriz, neurotrofinas e citocinas que auxiliam a reparar o SNC. 0 papel duplo para MNPs na lesão e reparo é evidente em 30 outras doenças mediadas por leucócitos incluindo glomerulonefrite experimental, lesão hepática; lesão à artéria carótida e MS (Duffield e outros (2005) J. Clin. Invest. 115: 56-65; Duffield (2003) Clin. Sci 104: 27-38; Danenberg e outros (2002) Circulation 106: 599-605; Raivich e Banati (2004) Brain Res. Brain Res. Rev. 46: 261-81) . Os estudos de SCI experimentais demonstraram que a supressão temporária da atividade ou o extravasamento de MNP e a retirada do tratamento mais tarde permite que uma quantidade maior de tecido seja poupada e resultando em comportamentos melhorados. Isto é devido em parte às atividades reparadoras de MNPs e talvez células T (Jones e outros (2005) Curr. Pharm. Des., 11: 1223-36; Gris e outros
(2004) J. Neurosci. 24: 4043-51; Wells e outros (2003) Brain 126: 1628-37). A eliminação de PMN ou de macrófagos nos estágios precoces da SCI experimental mostrou resultados positivos similares. (Taoka e Okajima, Prog. Neurobiol., 56: 341-58, 1998; Popovich e outros (1999) Exp. Neurol., 158: 351-365). Existe uma expressão diferencial de ligantes de quimiocina e receptores implicados na patologia da lesão secundária do tecido em SCI que permite a identificação de receptores alvo usando-se LPMs (Glaser e outros (2004) J. Neurosci. Res., 77:701-8; Glaser e outros, (2006) J. Neurosci. Res. 84: 724-34; Ghirnikar e outros (2000) J. Neurosci. Res. 59: 63-73; McTigue e outros (1998) J. Neurosci. Res., 53: 368-76; Lee e outros, Neurochem. Int. 36: 417-25, 2000). É fato conhecido que bastam alguns axônios residuais (10-15%) para efetuar uma recuperação funcional significativa depois de SCI (Jones e outros
(2005) Curr. Pharm. Des., 11: 1223-36). Portanto, atenuando a inflamação na fase aguda é uma abordagem viável a terapia. A erradicação de leucócitos patológicos ativados é um caminho.
d. Hipersensibilidade
As reações de hipersensibilidade foram categorizadas em quatro tipos principais (e às vezes sobrepostos) (I-IV) todos os quais podem ser associados com lesão tecidual imuno-mediada. A hipersensibilidade do tipo
I (imediata) tem lugar dentro de minutos a horas da exposição a alérgenos e envolve a produção pelas células B de anticorpo IgE que medeiam a desgranulação de mastócitos 5 e basófilos. Os eosinófilos são também envolvidos. Esta reação está envolvida em diversas condições que incluem asma, dermatite atópica, eczema, conjuntivite e rinite. A hipersensibilidade do tipo II (citotóxica) é devido a ao reconhecimento pelos anticorpos ou de seus próprios 10 antígenos ou de antígenos extrínsecos sobre superfícies celulares e a mediação de citotoxicidade dependente de complemento ou citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo por macrófagos ativados e por células T exterminadoras naturais. As condições associadas 15 com esta reação incluem a síndrome de Goodpasture (pulmões e rins) e tireoidite. A hipersensibilidade mediada por complexo imune do Tipo III ocorre quando os anticorpos se ligam a antígenos próprios ou estranhos que podem se depositar nos tecidos e resultar na ativação do complemento 20 e inflamação (ativação, proliferação e infiltração de diversos subtipos de leucócitos). Esta é a patologia clássica envolvida em doenças tais como glomerulonefrite, vasculitide, lúpus eritematoso sistêmico e artrite. A hipersensibilidade do Tipo IV (retardada) mediada por 25 células geralmente leva dias para se desenvolver e não é dependente de anticorpos. Esta reação depende de diferentes subconjuntos de células T, células T citotóxicas e macrófagos que destroem aberrantemente células que têm a si mesmas como alvo complexadas com antígenos próprios ou 30 extrínsecos. Neutrófilos, eosinófilos e mastócitos estão também implicados neste tipo de reação. Esta reação é encontrada em tais condições como dermatite de contato, psoríase, doenças inflamatórias do intestino, diabetes melito insulino dependente, esclerose múltipla e artrite reumatóide. Todas as reações imunes acima envolvem o tráfego, ativação e proliferação de leucócitos aos tecidos e órgãos afetados (vide a Tabela 8 para referências).
Estudos sobre dermatite de contato identificaram diversos eixos de quimiocina responsáveis pelo recrutamento de leucócitos ativados incluindo, sem limitação, IP- 1/CXCR3, IL-8/CXCR2, RANTES/CCR5, MCP-1/CCR2, ΜΙΡ-Ια/CCRl e
5. Diferentes quimioimpressões foram identificadas para dermatite de contato alérgica, psoríase, eczema atópico e dermatite atópica. Eixos de quimiocina analogamente proeminente envolvidos em diversas formas de linfomas cutâneos de célula T, melanomas, escleroderma e esclerose sistêmica foram identificados. Isto indica que o tratamento com um LPM cuidadosamente escolhido contendo um agente que tem como alvo um receptor de quimiocina relevante seria útil para o tratamento de doenças inflamatórias de pele e cânceres (veja referências na Tabela 6).
e. Infecção por HIV e AIDS e Infecções por Outros Agentes Patogênicos
A ativação e infecção de micróglia de SNC e macrófagos infiltrantes é uma característica da patogênese de doenças induzidas por HIV. Os vírus da imunodeficiência humana (HIV) penetram em células através de determinados receptores, classicamente o receptor CD4 que são associados com um co-receptor de quimiocinas específico. CXCR4, CCR2B, CCR3, CCR5, CCR6, CCR8, CX3CR1 e outros, podem todos
atuar na capacidade de co-receptor. As cepas de HIV-I que tem afinidade para macrófagos, por exemplo, geralmente usam co-receptores CCR5, ao passo que as cepas que têm afinidade para células T geralmente usam CXCR4. Além disso, vírus com dupla afinidade podem usar como co-receptores CXCR4 e CCR5 para a entrada, ao passo que outros subconjuntos das cepas virais de HIV usam uma variedade de outros co-receptores de quimiocinas (veja Rubbert e outros, HIV Medicine 2006, capítulo 4, Hoffman e outros eds., Flying Publisher, Paris).
Em pacientes com encefalite por HIV (HIVE), CXCR-
4 é expresso sobre MNPs, sobre astrócitos e sobre uma sub-
população de neurônios colinérgicos, ao passo que CCR5 é
<í
expresso principalmente sobre MNPs. Deve se observar que a maioria de células infectadas em pacientes com HIVE (crianças e adultos) parecem ser MNPS e uma expressão aumentada de CCR5 parece estar correlacionada com a gravidade da doença. Isto indica que eventos mediados por MNP podem ser importantes, pelo menos nos estágios tardios e graves de HIVE. 0 receptor de CCR5 também é supra- regulado depois da infecção bacteriana do SNC e em um modelo de rato com lesão isquêmica do cérebro.
Uma produção aumentada de citocinas (de TNF-a, por exemplo) e de quimiocinas (RANTES, MCP-1, MIP-Ia e MIP- 1β, por exemplo) é associada com infecção por HIV. Um aumento de quimiocinas do SNC em HIV seria responsável pelo recrutamento de leucócitos periféricos e pela liberação de citocinas com efeitos citotóxicos diretos (pelo menos no caso da citocina TNF-α sobre os neurônios e oligodendrócitos e reflete com precisão a experiência no trauma ao SNC. Diversas citocinas incluindo GM-CSF, macrófago-CSF, IL-Ιβ, IL-2, IL-3, IL-6, TNF-α, e TNF-β também pode contribuir para a patogênese de doença por HIV por ativação e/ou aumento da replicação de HIV.
A lesão secundária ocorre em pacientes positivos para HIV-1, assintomáticos, pré-aidéticos (An e outros (1997) Arch. Anat. Cytol. Pathol. 45, 94-105). Estes investigadores foram capazes de detectar DNA de HIV-I em 50% dos cérebros de pacientes assintomáticos e praticamente 90% de astrogliose evidenciada. Estes pacientes também têm níveis elevados de imunomoléculas e citocinas incluindo TNF-α, IL-1, IL-4 e IL-6. O dano aos neurônios foi confirmado pela detecção de neurônios apoptóticos.
A neurotoxicidade direta e a supra-regulação do
co-receptor de CCR5 por aminoácidos excitadores derivados de MNP foram também implicados na patologia de infecção por HIV. Um aumento na atividade de óxido nítrico sintase induzível foi também detectado em micróglia infectada por 10 HIV proveniente de pacientes com AIDS. Isto indica que a produção do ácido nítrico poderia contribuir para a formação de lesões em áreas do sistema nervoso infectadas com HIV. Novamente, a patologia de encefalopatias por HIV, e pré-AIDS e AIDS plenamente desenvolvida afetando o SNC, 15 parecem imitar a lesão secundária do tecido observado em SCI e em outras doenças inflamatórias.
Foi também descoberto que algumas quimiocinas e receptores de quimiocinas também são fatores promicrobianos e facilitam doenças infecciosas (vide, Pease e outros (1998) Semin Immunol 10; 169-178). Os patógenos exploram o sistema de quimiocinas. Os receptores celulares de quimiocinas, por exemplo, são usados para entrada na célula por patógenos intracelular, incluindo HIV. Além disso, os vírus usam receptores de quimiocinas codificados por vírus para promover a proliferação das células hospedeiras. Os patógenos também subvertem o sistema de quimiocinas. Os antagonistas de quimiocinas codificados por vírus e os coletores de quimiocina codificados por vírus são conhecidos (Murphy, Nat. Immunol., 2: 116-22, 2001: Kotwal, Immunol. Today, 21: 242-8, 20000).
f. Doença Inflamatória das Articulações e Doença
Autoimune A artrite reumatóide (RA) é uma doença autoimune inflamatória caracterizada por dano crônico ao tecido conectivo e erosão óssea. A patogênese da doença inclui a infiltração de leucócitos no espaço sinovial, sua ativação, e a liberação de mediadores inflamatórios que finalmente deformam e destroem a junta afetada. A resposta real
artrítica parece ser iniciada quando as MNPs liberam
•ί
citocinas e quimiocinas proinflamatórias. TNF-α, IL-1, IL-
6, GM-CSF, e a quimiocina IL-8 se encontram em abundância no tecido das juntas proveniente de pacientes com RA e a sua fonte mais provável inclui fibroblastos sinoviais, além de MNPs. A combinação de MNPs, neutrófilos e células T com a participação de fibroblastos sinoviais e sinoviócitos, inicia uma cascata de inflamação.
Acredita-se que IL-I e TNF-α sejam responsáveis pela produção de quimiocinas na junta artrítica. Em um estudo, concentrações aumentadas destas duas citocinas induziram a expressão de IL-8 (um quimioatrativo potente de células T) e RANTES (um potente quimioatrativo de neutrófilos) em fibroblastos sinoviais humanos isolados de pacientes com artrite reumatóide (Rathanaswami e outros (1993) J. Biol. Che,. 268, 5834-9). Outros investigadores mostraram que o tecido sinovial inflamado proveniente de pacientes com RA e osteo-artríticos contém altas concentrações de MCP-1 e TNF-α e IL-I aumentaram substancialmente a expressão de RNAm desta quimiocina em sinoviócitos cultivados derivados destes exemplares. Parece que as quimiocinas provenientes de MNPs e citocina estimulavam os fibroblastos sinoviais e os sinoviócitos representam um papel na patologia de RA por facilitar o recrutamento e o extravasamento de monócitos periféricos, neutrófilos e células T. Em comum com outras doenças e condições, os leucócitos ativados liberam uma série de outros mediadores que danificam tecido. Mais especificamente as espécies de oxigênio que reagem aos derivados de leucócitos e enzimas proteolíticas (metaloproteinases de matriz, catepsina e elastase derivada de neutrófilos, por exemplo) foram implicados na iniciação e manutenção de dano tecidual em doenças inflamatórias das juntas (vide a Tabela 8 para referências).
g. Doença Pulmonar
A lesão do pulmão abrange um amplo conjunto de condições clínicas. Para os fins da presente invenção, refere-se a eles coletivamente como Doenças Inflamatórias do Pulmão (ILDs) . Uma ILD é tipicamente o resultado de um insulto específico, infecções bacterianas sistêmicas (sépsis, por exemplo), trauma (lesão isquêmica por reperfusão, por exemplo) e inalação de antígenos (toxinas tais como as da fumaça do cigarro, por exemplo) , por exemplo. As ILDs também incluem alveolite alérgica, ARDS (síndrome de angústia respiratória no adulto ou aguda), diversas formas de asma, bronquite, doença colágeno- vascular, sarcoidose pulmonar, doenças eosinófilas do pulmão, pneumonia e fibrose pulmonar. Resumindo, a patologia destas doenças e condições envolve a ativação de macrófagos, especialmente daqueles localizados nos alvéolos. Os neutrófilos, eosinófilos e as células T são ativados e recrutados para o sítio da lesão subsequente à liberação de macrófagos, e de citocinas derivadas de células endoteliais e epiteliais vizinhas e quimiocinas. As citocinas e quimiocinas específicas envolvidas incluem: GM- CSF, TNF-α, IL-1, IL-3, IL-5, IL-8, MCP-1, MCP-3, MIP-Ia, RANTES e Eotaxina.
Os leucócitos respondem às citocinas e quimiocinas proinflamatórias por liberação dos muitos mediadores de lesão tecidual secundária que incluem: proteases, espécies de oxigênio reagentes, e lipidios biologicamente ativos, e por expressão de antígenos de superfícies celular e moléculas de adesão celular. Além disso, parece que populações específicas de leucócitos representam um papel mais proeminente em algumas ILDs do que em outras. Os neutrófilos e as MNPs são contribuintes mais proeminentes para a lesão secundária em lesões agudas do pulmão tais como ARDS e diversas fibroses pulmonares; ao passo que células T e eosinófilos são os principais culpados nas doenças eosinófilas pulmonares que incluem asma alérgica, alveolite fibrosante e sarcoidose (veja Tabela 8 para referências).
h. Outras Doenças Mediadas por Lesão Secundária do Tecido
Os estados mórbidos associados a lesão secundária do tecido podem ser tratados de acordo com os métodos propostos no presente documento e usando os conjugados propostos na presente invenção assim como determinadas citocinas não quimiocinas conhecidas dos versados na técnica para o tratamento de outras condições. Estes estados mórbidos incluem, sem limitação, lesão ao SNC, doenças inflamatórias do SNC, transtornos
neurodegenerativos, doença cardíaca, doenças inflamatórias oculares, doenças inflamatórias dos intestinos, doenças inflamatórias das articulações, doenças renais ou doenças inflamatórias dos rins, doenças inflamatórias do pulmão, doenças inflamatórias nasais, doenças inflamatórias da tireóide, cânceres regulados por citocinas, e outros estados mórbidos que envolvem ou estão associados com lesão secundária do tecido.
Exemplos de doenças inflamatórias do SNC e/ou transtornos neurodegenerativos que podem ser tratados usando-se os métodos da presente invenção e conjugados propostos no presente documento, incluem, sem limitação, acidente vascular, lesão de cabeça fechada, leucoencefalopatia, coriomeningite, meningite,
5 adrenoleucodistrofia, complexo de demência por AIDS, doença de Alzheimer, Síndrome de Down, síndrome de fadiga crônica, encefalite, encefalomielite, encefalopatias espongiformes, esclerose múltipla, doença de Parkinson, lesão/trauma ‘a medula espinal (SCI), e lesão traumática cerebral; as 10 doenças cardíacas que podem ser tratadas usando-se os métodos propostos no presente documento incluem, mas sem limitação, aterosclerose, hiperplasia neointimal e restenose; as doenças inflamatórias oculares que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados propostos no 15 presente documento incluem, mas sem limitação, retinopatia proliferativa da diabetes, vitreoretinopatia proliferativa, retinite, esclerite, escleroirite, coroidite e uveíte. Exemplos de doenças inflamatórias da pele que podem ser tratadas usando-se os conjugados e métodos conforme 20 propostos no presente documento incluem, mas sem limitação, psoríase, eczema e dermatite.
Exemplos de doenças inflamatórias dos intestinos que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados propostos no presente documento incluem, mas sem limitação, 25 colite crônico, doença de Crohn e colite ulcerosa. Exemplos de doenças inflamatórias das juntas que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados propostos no presente documento incluem, sem limitação, artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite reumatóide,
espondilartropatias, tais como espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriática, espondilite, espondilartropatias não diferenciadas e síndrome de Bechet; exemplos de doenças renais e inflamatórias dos rins que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados propostos no presente documento incluem, sem limitação, glomerulonefrite, nefrite do lúpus e nefropatia de IgA. Exemplos de doenças inflamatórias do 5 pulmão que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados propostos no presente documento incluem, mas sem limitação, doença pulmonar eosinófila, pneumonia eosinófila crônica, doenças pulmonares fibróticas, pneumonia eosinófila aguda, broncoconstrição, incluindo asma, 10 displasia broncopulmonar, eosinofilia broncoalveolar, aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonia, síndrome de angústia respiratória aguda, e doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD); exemplos de doenças nasais inflamatórias que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados 15 propostos no presente documento incluem, mas sem limitação, polipose, rinite, sinusite; exemplos de doenças inflamatórias da tireóide que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados propostos no presente documento incluem, mas sem limitação, tireoidite; e exemplos de 20 cânceres regulados por citocina que podem ser tratadas usando-se os métodos e conjugados propostos no presente documento incluem, mas sem limitação, gliomas, ateromas, carcinomas, adenocarcinomas, granulomas, glioblastomas, granulomatose, linfomas, leucemias, melanomas, cânceres 25 pulmonares, mielomas, sarcomas, sarcoidose, microgliomas, meningiomas, astrocitomas, oligodendroglíomas, doença de Hodgkins, e cânceres da mama e de próstata. Outras doenças inflamatórias suscetíveis a tratamento usando os métodos e conjugados propostos no presente documento, incluem, mas 30 sem limitação, vasculite, diabetes autoimune, diabetes melito dependente de insulina, doença do hospedeiro versus enxerto (GVHD), psoríase, lúpus eritematoso sistêmico, sépsis, síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), e inflamação por lesão devida a queimaduras.
Conforme foi observado acima, estes transtornos, embora diversos, compartilham as características comuns relacionadas com a resposta inflamatória. A lesão ou trauma ao cordão espinhal, que podem ser tratados por administração a um paciente que tenha necessidade dele de uma quantidade efetiva de um agente terapêutico conforme descrito no presente é exemplar dos transtornos visados. Os tratamentos citados no presente documento são destinados a atacar os resultados adversos desta resposta que envolve a proliferação e migração de leucócitos. Os tratamentos eliminarão ou reduzirão a proliferação e migração de leucócitos e por este motivo levarão a uma melhoria de sintomas, a uma redução de eventos adversos ou outros resultados benéficos que podem aumentar a eficácia de outros tratamentos.
5. Terapias de Combinação
Os conjugados de ligante-toxina, tais como qualquer LPM proposto no presente documento podem ser usados em combinações para o tratamento das doenças indicadas. A terapia de combinação pode ser obtida por administração de um conjugado de ligante-toxina com qualquer outro agente terapêutico para o tratamento de uma doença específica. Tais agentes são conhecidos dos versados na técnica. O tratamento de combinação pode também ser efetuado usando-se moléculas compostas de dois ou mais, tais como duas quimiocinas diferentes ligadas em qualquer extremidade de uma fração de toxina. Nesse caso, estas fusões duplas de quimiocina podem incluir um ligante proveniente de cada uma das famílias de quimiocinas α e β.
L. EXEMPLOS Os exemplos abaixo estão incluídos para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito da invenção
EXEMPLO 1
Seleção de Variantes de Toxina Shiga Al (SAl)
Modificada para a Construção de LPMs
A. Clonagem e Expressão de LPMs para a Seleção de Variantes de SAl
Uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de fusão de MCP-l/Toxina de Shiga (designada LMPla) foi projetada de modo tal que a proteína de fusão se inicia com um resíduo de metionina (Met) seguida pela seqüência publicada de MCP-1 madura (apresentada em SEQ ID NO: 69, e codificada por uma seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 68), um linker Ala-Met (SEQ ID NO: 34), e resíduos 23268 da subunidade de toxina Shiga-Al contendo o domínio que inativa ribossomo (RIP) (a que se refere no presente documento como variante I SAI; correspondendo à SEQ ID NO: 22 e codificada pela seqüência de ácido nucléico apresentada em SEQ ID NO: 23) . Para facilitar a remoção e a substituição da seqüência genética nos vetores de expressão diferentes, foram incorporados sítios de restrição de endonuclease na seqüência genética nas extremidades 3' e 5' . A seqüência de LPMla foi projetada para ter um sítio de restrição de NdeI que contém
o códon inicial de metionina (SEQ ID NO: 31) na extremidade 5' e também foi projetado para ter um códon de parada seguido por um sítio de restrição de BamHI (SEQ ID NO: 33) na extremidade 3' . Uma molécula de ácido nucléico que 30 codifica LPMla foi sintetizada seguindo-se os princípios de uso de códons e otimização estrutural secundária por uma organização de serviço de síntese de DNA (Blue Heron Biotechnology, Seattle, WO) e fornecido em um plasmídeo pUC com o sitio de clonagem múltipla removido (pUC menos M, SEQ ID NO: 86) . A seqüência da molécula de ácido nucléico de LPMla e a proteína de fusão codificada são apresentadas nas SEQ ID NOs: 37 e 38, respectivamente.
Como a seqüência de variante I de SAl contida no
interior da proteína de fusão de LMPla contém um resíduo de cisteína que corresponde ao aminoácido 242 da SEQ ID NO: 22, uma outra fração truncada de SAl foi gerada para evitar a dimerização induzida por cisteína entre proteínas de fusão de LPM extremamente purificadas. Esta fração SAl (a que se refere aqui como variante 2) é desprovida de cinco aminoácidos de terminal C (CHHHA) que correspondem aos aminoácidos 242-246 da seqüência de polipeptídeo apresentada na SEQ ID NO: 22. A seqüência de aminoácidos da variante 2 de SAl é apresentada em SEQ ID NO: 24 e codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos apresentada em SEQ ID NO: 25. Uma proteína de fusão MCP-1 contendo a fração variante 2 de SAI, denominada LPMlb foi gerada. Uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica a proteína de fusão LPMlb (MCP-1-AM-SA1 (variante 2)), contendo a seqüência de variante 2 SAl foi sintetizada 'e fornecida conforme foi descrito acima para a proteína de fusão LPMla. A seqüência da molécula de ácidos nucléicos de LPMlb e a proteína codificada são apresentadas em SEQ ID NO: 39 e 40, respectivamente.
As construções resultantes LPMla e LPMlb no vetor pUC menos M foram digeridas com NdeI e BamHI para produzir um fragmento NdeI/BamHI de ~1 Kb que foi clonado em um vetor de expressão de T7, pET9c (Novagen, SEQ ID NO: 84) 30 nos sítios de Ndel/BamHI correspondentes. 0 plasmídeo pET9c contendo LPMla foi transformado na linhagem hospedeira de expressão HMS174 (DE3) pLyS (F~recAl hsdR(rKi2~
ΓΠκΐ2+) (DE3) pLysS (CamR, RifR) de acordo com as instruções do fabricante (Novagen). 0 plasmídeo pET9c contendo LPMlb foi transformado na linhagem de hospedeiro de expressão HMS174(DE3) (F”recAl hsdR (rKi2~mKi2+) (DE3) (Rifs) de acordo com as instruções do fabricante (Novagen).
B. Seleção de Mutantes
LPMla e LPMlb produzem proteínas de fusão que contêm uma fração SAl da toxina da RIP» conforme foi descrito na parte A acima. A expressão da fração de SAl é tóxica às células hospedeiras e impede a produção das 10 proteínas de fusão de LPM. Para selecionar p>ara mutantes em SAl que apresentam menor toxicidade, as construções do plasmídeo pET9c contendo LPMla ou LPMlb foram usadas para a seleção de mutação na presença ou na ausência de concentrações variáveis de 4APP (4-aminopi.razolo [3, 4 ,-d] - 15 pirimidina). Depois da transformação da construção de LPM contendo pET9c na linhagem de hospedeiras adequadas conforme descrito na parte A, as bactérias transformadas foram selecionadas sobre LB canamicina (km] a 50 pg/mL na presença ou na ausência de concentrações variáveis de 4APP. 20 Os resultados apresentados abaixo são baseados na seleção de células bacterianas transformadas por LPMla sobre LB canamicina (km) a 50 pg/mL na ausência de 4APP e na seleção de células bacterianas transformadas por LPMlb sobre LB canamicina (km) a 50 pg/mL na presença de 0,5 mM de 4APP.
2 5 1. Mutantes de LPMla
A transformação de células hospedeiras HMS17 4(DE3)pLyS com a construção de plasmídeo pET9c contendo LPMla na ausência de 4APP resultou em 82 transformantes. Todas as 82 colônias selecionadas foram 30 testadas para a expressão de LPMla e para a integridade de plasmídeo. 0 DNA de plasmídeo foi isolado dos transformantes bacterianos usando-se um procedimento padrão miniprep. A expressão da proteína de comprimento total foi confirmada por SDS-PAGE. A inserção LPMla proveniente do plasmídeo pET9c foi purificada depois de digestão om Ndel/BamHI e a inserção foi sequenciada com o iniciador T7 e o iniciador T7t para confirmar a seqüência. T7: 5' TAA, TAC, GAC, TCA, CTA, TAG, GG 3' (SEQ ID NO: 35); T7t: 5' GCT, AGT, TAT, TGC, TCA, GCG 3' (SEQ ID NO: 36).
Poucas colônias expressavam LPMl. Algumas das colônias selecionadas expressavam formas truncadas de LPMl. Uma colônia expressava um LPMl contendo uma mutação de L para R na posição 117 na fração SAl da proteína de fusão em comparação com a seqüência de LPMla apresentada na SEQ ID NO: 38 (correspondente a L38R na seqüência de aminoácidos para a variante 1 da fração SAl apresentada na SEQ ID NO: 22) . A este LPMl mutante se refere no presente documento como LPMlc. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos para LPMlc são apresentadas nas SEQ ID NOs: 41 e 42, respectivamente, e pode ser comparadas às moléculas de LPMla genitora apresentadas em SEQ ID NOs: 37 e 38. Refere- se à mutação L38R em SAl no presente documento como variante 1 mutante (também se refere a ela no presente documento como uma variante 3) e é apresentada na SEQ ID NO: 2 6 e codificada por um ácido nucléico que tem uma seqüência apresentada na SEQ ID NO: 27.
2. Mutantes de LPMlb
A transformação de células hospedeiras HMS174(DE3) com a construção de plasmídeo pET9c contendo LPMlb na presença de 0,5 mM de 4APP resultou em 10 transformantes. Todos os 10 transformantes foram selecionados, o DNA do plasmídeo foi preparado e analisado conforme descrito acima para os mutantes de LPMla.
Duas colônias selecionadas expressaram um LPMl contendo uma mutação de V em A na fração SAl na posição 298 em comparação com a seqüência de LPMlb genitora apresentada na SEQ ID NO: 40 (correspondente a V219A nas seqüências de aminoácidos para as porções variante 1 e para a variante 2 de SAl apresentadas nas SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, respectivamente. A este LPMl mutante se refere no presente documento como LPMld. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos para LPMld são apresentadas nas SEQ ID NOs: 43 e 44, respectivamente e podem ser comparadas à seqüência de LPMlb genitora apresentada nas SEQ ID NOs: 39 e 40. A mutação V219A em SAl se refere no presente documento como mutante variante 2 de mutante (a que se refere também como variante 4 no presente documento) e é apresentada na SEQ ID NO: 28, e codificada por um ácido nucléico que tem uma seqüência apresentada na SEQ ID NO: 29.
EXEMPLO 2
Comparação das Atividades de Variantes de LPMls
A conseqüência de mutações em SAl na atividade de LPMl foi avaliada por medição das atividades de LPMlc (contendo a seqüência de variante 3 de SAI) e de LPMld (contendo a seqüência da variante 4 de SAI) em um ensaio de lisado de reticulócitos de coelho (RIP). As proteínas LPMlc e LPMld foram expressas e parcialmente purificadas (veja EXEMPLO 4). As atividades destas proteínas foram avaliadás por medição da inibição da síntese da proteína usando-se um sistema de lisado de reticulócitos de coelho disponível no comércio (isto é, o ensaio RIP) projetado para testar a translação de RNA de luciferase (Promega, Madison, WI; todos os reagentes incluídos). Resumindo, as amostras de proteínas foram diluídas até 1 pg/mL e diluídas em série em etapas decimais em PBS, pH 7,4 contendo 1 mg/mL de BSA. A proteína diluída (10 pL) foi acrescentada a 5 pL de mistura de reação (a mistura de reação: 2 pL de uma solução a 1 mg/mL de RNA de luciferase; 1 pL de uma mistura de 0,1 mM de aminoácidos com a metionina excluída e de mistura de aminoácidos com a lisina excluída numa relação de 1:1; 1 pL de inibidor de ribonuclease) e 35 pL de lisado de reticulócitos de coelho. As amostras foram incubadas a 30°C durante 1,5 horas antes de se extinguir a reação por 5 incubação das amostras sobre gelo. As amostras foram diluídas a 1:25 usando-se a mistura de reação descrita acima. A mistura de reação (100 pL) foi transferida para placas de poliestireno branco de 96 poços (Corning Corporation, NY) e 100 pL de corante luminescente Bright- 10 Glo (Promega) foram acrescentados a cada reação. As placas foram analisadas usando-se um luminômetro FLUOstar pré- aquecido (20-25°C) (BMG Lab Technologies, Durham, NC). Paralelamente foram usados como controles negativos a mistura de reação somente ou um reagente inóculo, e ■ a 15 proteína RIP saporina (Sigma, St Louis, MO) foi usadas com um controle positivo. 0 controle positivo saporina consistentemente tinha valores de atividade relativa (RIC5o) na faixa de 8-12 pM. A holotoxina de shiga tem um valor RIC50 relatado de 9 pM (Skinner e Jackson (1997) J. 20 Bacteriol. 179; 1368-174). A subunidade Sa 1 Variante 4 purificada (SEQ ID NO: 28) tinha um valor RIC50 de 50 pM. LPMlc (SEQ ID NO: 42) e LPMld (SEQ ID NO: 44) tinham valores RIC50 de 5 nM e 80-100 pM, respectivamente. Com base nas atividades RIP observadas das variantes mutantes 25 testadas, novos LPMs contendo a seqüência de SAl de LPMld, que é variante 2 mutante (isto é a variante 4) de SAI, foram construídas conforme descrito no EXEMPLO 3 abaixo.
EXEMPLO 3
Construção da Genes de LPM Contendo a Variante 4
de SAl
Construiram-se LPMs 2-13 (Tabela 12) para codificar as proteínas de fusão da seqüência de quimiocina respectiva ligada por um dipeptídeo alanina-metionina à versão truncada de variante 2 mutante (isto é, a variante 4) da subunidade SAl madura de toxina da shiga (apresentada em SEQ ID NO: 28) . As seqüências que codificam LPMs 2-13 foram inseridas no plasmídeo pET9c (SEQ ID NO: 84) por dois métodos diferentes, que são descritos abaixo. Cada um dos métodos se baseava na presença de um sítio de restrição de EcoRI interno no interior da seqüência 5' da seqüência de subunidade SAl de toxina da shiga (correspondendo aos nucleotídeos 4-9, por exemplo, da seqüência de variante 1 apresentada em SEQ ID NO: 23, ou da seqüência da variante 4 apresentada em SEQ ID NO: 29), resultando em uma fração SAl desprovida do resíduo lisina de 5' que foi reconstituído pelo projeto de uma fração ligador de quimiocina contendo uma lisina codificada adjacente a um sítio de restrição de EcoRI. Todos os protocolos usados para a manipulação de plasmídeo vieram de Maniatis e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York (1982).
TABELA 12: Variantes de LPM
LPM Quimio¬ Variante SEQ ID NO: SEQ ID NO: cina de SAl (nucleotideo) (aminoácido) LPMla MCP-1 1 37 38 LPMlb MCP-1 2 39 40 LPMlc MCP-1 3 41 42 LPMld MCP-1 4 43 44 LPM2 Eotaxina 4 45 46 -1 LPM3 SDF-Ιβ 4 47 48 LPM4 GRO---oí 4 49 50 LPM5 ΜΙΡ-1β 4 51 52 LPM6 IL-8 4 53 54 LPM7 IP-IO 4 55 56 LPM8 MCP-3 4 57 58 LPM9 MIP-3a 4 59 60 LPMlO MDC 4 61 62 LPMll MIP-Ia 4 63 64 LPM12 Eotaxina 4 65 46 -1 LPMl 3 BCA-I 4 66 67 Resumindo, as seqüências da molécula de ácido
nucléico que codificam as quimiocinas usadas para a construção das LPMs 2-13 (Tabela 12) foram sintetizadas, seguindo-se os princípios de uso de códons e a otimização secundária da estrutura por uma organização de serviço de síntese de DNA (Bio S&T, Montreal) e fornecida em um plasmídeo pUC (pUC19, SEQ ID NO: 85) . Para cada gene de quimiocina, um sítio de restrição de NdeI contendo um códon de partida de metionina (SEQ ID NO: 31) foi acrescentado à extremidade 5' e uma seqüência de ligador codificando os aminoácidos Ala-Met-Lys seguida por um sítio de EcoRI (SEQ ID NO: 32) foi acrescentada à extremidade 3'. A seqüência de nucleotídeos para cada construção de quimiocina é descrita na Tabela 13 e apresentada nas seqüências 72-83. Uma segunda seqüência de eotaxina foi otimizada e fornecida por Blue Heron Biotechnology e está apresentada em SEQ ID NO: 82. Cada uma das moléculas de ácido nucléico respectiva que codifica as quimiocinas foi usada para gerar proteínas de fusão de LPM por um de dois métodos de clonagem, que são apresentados abaixo.
TABELA 13: Posições dos Nucleotídeos para os Componentes da Seqüência de Construções de Quimiocina para LPMs 2-13.
LPM Construção SEQ Sitio de Quimiocina Seqüên¬ Sitio da ID restrição madura cia de EcoRI quimiocina NO: de NdeI I ligador 2 Eotaxina 72 1-6 7-228 229-237 238-243 3 SDF-Ιβ 73 VO 7-222 223-231 232-237 I i---I 4 GRO-Oi 74 1-6 7-225 226-234 235-240 ΜΙΡ-1β 75 1-6 7-213 214-222 223-228 6 IL-8 76 1-6 7-237 238-246 247-252 7 IP-IO 77 1-6 7-237 238-246 247-252 8 MCP-3 78 1-6 7-234 235-243 244-249 9 MIP-3oí 79 1-6 7-216 217-225 226-231 MDC 80 1-6 7-213 214-222 223-228 11 MIP-Ia 81 1-6 7-213 214-222 223-228 12 Eotaxina 82 1-6 7-228 229-237 238-243 13 BCA-I 83 1-6 7-267 268-276 277-282 A. Método de Clonagem 1
Os componentes de LPMs 4-10, LPM12 e LPM13 (veja Tabela 13) foram montados em um plasmídeo pUC19 (SEQ ID NO: 85), sendo então subclonados no vetor pET9c. Resumindo, o componente Variante 4 de SAl foi gerado por digestão do vetor pET9c contendo LPMld (veja o Exemplo 1) com EcoRI e BamHI para resultar em um fragmento de DNA EcoRI/BamHI de 7 50 pb contendo o gene da Variante 4 de SAI. 0 fragmento digerido foi purificado pro gel e inserido no plasmídeo pUC19 que também tinha sido cortado nos sítios de EcoRI/BamHI correspondentes para produzir um plasmídeo pUC19BB. 0 componente da seqüência de quimiocina de LPMs 4- 10, LPM12 e LPM13 foram gerados pela digestão da quimiocina respectiva contendo o plasmídeo pUC19, conforme foi descrito acima, pela digestão com NdeI e EcoRI para produzir um fragmento Ndel/EcoRI DNA de -250 pb para cada quimiocina. Para gerar uma seqüência completa de LPM (veja tabela 12), o fragmento de quimiocina digerido foi purificado pro gel e inserido no plasmídeo pUC19BB contendo a seqüência da variante 4 de SAl que também tinha sido digerido nos sítios de restrição de NdeI e de EcoRI correspondente. pUC19BB contendo uma seqüência do gene de LPM completo foi então digerido com NdeI e BamHI para produzir um fragmento de ~1 kb, que foi purificado por gel e subclonado no plasmídeo pET9c (SEQ ID NO: 84) que também tinha sido digerido com NdeI e BamHI. Os plasmídeos foram confirmados pela expressão do LPM respectivo e sequenciados para confirmar a identidade da inserção. A Tabela 12 acima apresenta identificadores de seqüência para o ácido nucléico respectivo e os aminoácidos codificados para as variantes clonadas de LPM, os LPMs 4-10, LPM12 LPM13.
B. Método de Clonagem 2
Para se gerar as LPMs 2, 3 e 11 (veja Tabela 12), os genes de quimiocina respectivos foram diretamente inseridos no plasmídeo de expressão pET9c (SEQ ID NO: 84) usando-se o método descrito no presente documento. Em primeiro lugar, para se prevenir a digestão d vetor durante as etapas de clonagem subseqüentes, o sitio EcoRI foi removido do plasmídeo pET9c para resultar no vetor pET9DE. Resumindo, o plasmídeo pET9c foi digerido com EcoRI e as extremidades foram preenchidas com T4 DNA polimerase. 0 DNA do plasmídeo foi ligado rendendo o vetor pET9DE e transformado me células DH5a de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) . 0 DNA do plasmídeo foi isolado de transformantes bacterianos usando-se um procedimento miniprep padrão e a deleção do sítio de EcoRI no vetor pET9DE foi confirmada por digestão de restrição.
Para se clonar os genes que codificavam os LPMs 2, 3 e 11, o plasmídeo pUC19BB proveniente do método de clonagem 1 acima contendo a seqüência para o gene completo de LPMld foi digerida com NdeI de BamHI para produzir um fragmento de I kb. O fragmento foi purificado em gel e subclonado no vetor pET9DE que também tinha sido digerido com NdeI e BamHI para gerar o plasmídeo pET9DE-BB. As seqüências de quimiocina componentes dos LPMs 2, 3 e 11 foram geradas pela digestão da quimiocina respectiva 5 contendo o plasmídeo pUC19, conforme descrito acima, por digestão com NdeI e EcoRI para produzir um fragmento de DNA de Ndel/EcoRI de ~250 pb para cada quimiocina. Para se gerar uma seqüência completa de LPM (veja tabela 12), o fragmento digerido foi purificado em gel e inserido no 10 plasmídeo pET9DE-BB que tinha sido digerido no sítio correspondente de Ndel/EcoRI. A Tabela 12 acima apresenta identificadores de seqüência para o ácido nucléico respectivo e os aminoácidos codificados para as variantes clonadas de LPM, os LPMs 2, 3 e 11.
EXEMPLO 4
Exemplo e Purificação de Variantes de LPM
A. Expressão de variantes de LPM
Depois da transformação de HMS174(DE3) com um plasmídeo pET9c/LPM, o efeito de 4APP, inibidor de RIP, 20 sobre a expressão dos diferentes LPMs foi testado cultivando-se os transformantes de um dia para o outro a 370C em meio MTB (1 x meio M9 com 24 g/L de extrato de levedura, 12 g/L de triptona e 0,4% de glicerol) com 50 μς/mL de canamicina e 2 mM de 4APP. Antes da indução do LPM 25 respectivo com IPTG, as células foram subcultivadas (diluição a 1:10) no mesmo meio e cultivadas durante outras
3 horas a 37°C. As células foram induzidas por indução na presença ou ausência de I mM de IPTG e na presença de concentrações crescentes de 4APP (0, 0,1, 2, 5, 10, 15 e 20 30 mM de 4APP) durante outras 3,5 horas à mesma temperatura. Foram coletados a partir das células (veja método abaixo) corpos de inclusão contendo as proteínas de fusão de LPM. Depois da indução na presença de IPTG, as linhagens com os perfis de expressão desejados apresentaram uma faixa de expressão de -36 kD de um modo de resposta a dose de 4-APP. A identidade da proteína foi verificada por Transferência Western usando-se um anticorpo anti-SAl. Os anticorpos à 5 subunidade de SAl foram criados em coelhos a um peptídeo sintetizado de SAl (SEQ ID NO: 30) (Covance research laboratories, Denver PA) e os soros foram coletados.
A Tabela 14 apresenta a expressão relativa dos conjugados LPM, LPMld, LPM8, LPM3, LPM6 ou LPM7. Depois da expressão e coleta das proteínas de fusão de LPM das células, as proteínas foram separadas em um gel de SDS-PAGE e a proteína total foi visualizada por tingimento com azul Coomassie. A expressão em porcentagem juntamente com as curva de dose de 4-APP foi estimada por carregamento de amostras identicamente preparadas provenientes de cada uma das fermentações em frascos de agitação idênticas (0,1 a 20 mM de 4-APP). A expressão de 100% de qualquer LPM dado foi baseada na não observação de níveis aumentados de proteína sobre o gel a uma concentração dada de 4-APP. A expressão em porcentagem foi estimada por comparação visual da expressão designada como sendo de 100% com as pistas com amostras que tinham uma expressão menor e teor mais baixo de 4-APP nos caldos de fermentação. Os experimentos foram conduzidos pelo menos duas vezes. Geralmente os níveis de expressão aumentaram desde pouco a nenhuma quantidade detectável da proteína desejada a 0,1 mM de 4-APP até altos níveis a 10-20 mM de 4-APP.
TABELA 14: Níveis de Expressão de LPM com 4-APP
LPM 4-APP (mM) i 2,0 5, 0 10, 0 15, 0 \---I O LPM >5 >5 >5 70 100 LPM >5 >5 25 100 100 LPM 15 30 100 100 100 LPM >5 0 100 100 100 LPM >5 100 100 100 100 B. Produção de Proteina
Um método de fermentação descontínuo foi
desenvolvido para a produção de LPM. As células hospedeiras (HMS174(DE3)) portando um plasmídeo pET9c/LPM com a variante de SAl selecionada foram cultivadas em meio de cultura enriquecido líquido (5-100 L em um fermentador ou 400 mL em um frasco de agitação de 2,8L) a 37°C na presença de 2 mM de 4-APP. A expressão do produto foi induzida pro 1 mM de IPTG durante 3-6 horas na presença de 10 mM de 4-APP e as células foram coletadas por centrifugação. 0 grânulo de células foi homogeneizado (por meio de sonicação ou por 3-4 passagens por um homogeneizador) sendo em seguida removidos os detritos e recuperados os corpos de inclusão (Ibs) . Os Ibs foram lavados 2-3 vezes com diversos volumes de dH20. Os Ibs foram solubilizados em solução tampão contendo 6M de cloridrato de guanidina centrifugados e o sobrenadante foi submetido a diálise contra 8M de uréia. 0 LPM de partida típico produzido a partir de um fermentador ou frasco de agitação é estimado como sendo de ~1 g/L (DO60Onm ~50) e 300 mg/L (D06oonm ~7), respectivamente. A densidade ótica observada (DO) a 600 nm foi uma medição de densidade de E. coli usando-se um espectrofotômetro Ultraspec Pro. Os ácidos nucléicos foram removidos da solução de IB com 0,1% (v/v) de polietileno-imina. Depois da centrifugação o DNA adicional foi removido fazendo-se passar através de um filtro de resina de troca de ânions ou coluna (Q-sefarose-FF) que se liga a DNA residual e permite que proteínas com pontos isoelétricos elevados tais como os LPMs atravessem. 0 produto de proteína foi capturado por cromatografia de resina de troca de cátions (S-sefarose-FF ou HP) e diluído com um gradiente de NaCl na presença de uréia. A fração de passagem proveniente desta coluna contém uma pequena quantidade de fração SAl de toxina livre. As frações protéicas foram coletadas através do gradiente de 5 NaCl e analisadas por SDS-PAGE. As frações contendo LPMs foram então combinadas. O redobramento do produto foi conduzido por diálise contra 25 mM de Tris-HCl, IM de uréia, 0,5 M de L-arginina, 1 m de glutatione reduzido e
0,1 mM de glutatione oxidado a pH 8,0 durante 16-24 horas. 0 material redobrado foi então submetido a diálise no tampão de formulação (50 mM de citrato de sódio, 0,05 mM de EDTA e 20% de sacarose) e armazenado a -80°C. Este material tinha um grau de pureza acima de 80% conforme avaliado por SDS-PAGE e foi ainda mais purificado usando-se cromatografia de troca de cátions ou de interação hidrófoba, como uma etapa de polimentos antes da formulação. Outro processo empregou as mesmas etapas iniciais, mas o produto proveniente da troa de ânions inicial foi imediatamente redobrado por diluição em 25 mM de fosfato de sódio, I M de uréia, 200 mM de L-arginina, 20% (peso/volume) de sacarose, 1 mM de glutatione reduzido e 0,1 mM de glutatione oxidado a um pH de 8,0 durante 16-24 horas. O material redobrado foi então submetido a troca de cátions seguido por cromatografia de interação hidrófoba antes de ser submetido a diálise no tampão de formulação descrito acima
EXEMPLO 5 Ensaio de Citotoxicidade à Base de Células
A toxicidade de células de LPMld e de LPM12 foi medida em um ensaio de citotoxicidade à base de células. Neste ensaio, cultivaram-se células na presença ou na ausência de toxina (isto é, de proteína de LPM contendo uma fração SAI) durante um período de tempo. A quantidade de ATP na cultura depois da Iise das células serviu como um indicador mensurável de viabilidade celular.
A. Cultura Celular e Adições de Amostras
As células monocíticas THP-I foram cultivadas de acordo com as instruções do fabricante (ATCC, Manassas, VA) em meio completo contendo meio RPMI suplementado com FBS a 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) e passado duas vezes por semana para manter a densidade celular abaixo de 5 x IO5 células/mL. As células foram coletadas por centrifugação e lavadas com meio morno fresco e ressuspensas em um volume adequado de meio para se atingir uma densidade de 3-4 x IO4 células/mL para o ensaio de citotoxicidade à base de células. As células foram semeadas pro transferência de alíquotas de 100 pL da suspensão de células a cada um dos 60 poços internos de uma placa de cultura de celular de 96 poços (os poços externos foram preenchidos com meio completo somente) . Acrescentaram-se 20 μΐ, de veículo (tampão somente) e de amostras de proteína de LPMld ou LPM12 (a concentrações que variavam de 25 pg/mL a 100 pg/mL) aos poços em triplicata e misturaram-se suavemente com as células. As células foram então incubadas durante 24 horas a 37°C (CO2 a 5%) .
B. Avaliação da Citotoxicidade à Base de Células
Foi usado o kit CellTiter-Glo™ Luminescent Cell
Viability Assay Kit (Promega, Madison WIS) (seguindo-se as instruções do fabricante) para se avaliar a viabilidade celular como uma medida de citotoxicidade à base de células. Depois da Iise das células com a mistura de reação de ATP (fornecida pelo fabricante como o reagente 30 CellTiter-Glo® Reagent), ATP produz a oxigenação de luciferina resultando em um sinal luminescente que é proporcional às concentrações de ATP nos poços. Isto é diretamente proporcional ao número de células viáveis na cultura. Transferiram-se alíquotas de 100 yL da placa de células THP-I a parte A acima para as placas de cultura de fundo branco chato (Corning Corporation, NY) para permitir a medição da luminescência e permitiu que se equilibrasse durante 30 minutos antes d se acrescentar 100 pL da mistura de reação de ATP. Depois da adição da mistura de reação de ATP, o conteúdo das placas foi agitado suavemente durante segundos usando-se um ciclone para induzir a Iise das células e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos para se estabilizar o sinal luminescente. A luminescência foi medida usando-se um luminômetro FLUOstar (BMG Lab Technologies, Durham, NC). Foram preparados poços de controles correspondentes para cada proteína de LMP contendo veículo somente (tampão somente). Calcularam-se as médias de valores em triplicata e subtraiu-se a luminescência do fundo para todas as condições testadas. O teor de ATP na presença de uma proteína de fusão de LMP foi apresentado como uma porcentagem do teor de ATP na presença do controle correspondente (que foi ajustado a 100%). LPMld e LPM12 foram testados no ensaio de citotoxicidade à base de células e os resultados são apresentados na Tabela 15 e na tabela 16 respectivamente. Os resultados mostram que o teor de ATP se reduz de modo dependente de dose na presença de concentrações crescentes de LPMld, mostrando que LPMld é tóxico para as células THP-I. LPM12 também era tóxico para células Thp-I, mas somente a concentrações de 33 pg/mL ou acima delas e não foi observado nenhum efeito dependente da dosagem de LPM12 sobre estas células. 0 efeito observado de LPM12 (uma proteína de fusão contendo a quimiocina eotaxina) poderia ser devido à ausência de expressão do receptor de eotaxina, CCR3, sobre as células THP-1, e à presença de receptor de MCP-12, CCR2, sobre as células THP- 1 ao qual a eotaxina se liga a altas concentrações (Ogilvie e outros, (2001) Blood 97; 1920-1924).
TABELA 15: Toxicidade Celular de LPMld sobre Células THP-I
Concentração Porcentagem de Teor de ATP de Controle de LPM Correspondente (Tampão somente) O pg/mL 100% 2 5 pg/mL 96,02% 35 pg/mL 63, 5% 50 pg/mL 52,23% 75 pg/mL 38,83% 100 pg/mL 26,47% TABELA 16: Toxicidade Celular de LPM12 sobre Células THP-I
Concentração Porcentagem de Teor de ATP de Controle de LPM Correspondente (Tampão somente) 0 pg/mL 100% 25 pg/mL 127,87% 35 pg/mL 56,01% 50 pg/mL 81,36% 7 5 pg/mL 55,22% 100 pg/mL 61,88% EXEMPLO 6
AtividLade de LPMld em Glomerulonefrite Mesangioproliferativa Induzida por Soro Anti-Timocitico (ATS) em Ratos
O exemplo abaixo demonstra os efeitos do tratamento com LPM sobre o progresso de glomerulonefrite mesangioproliferativa induzida por soro anti-timocítico (ATS) em ratos.
A. Injeção de ATS e o Tratamento com LPMld Foi avaliado o efeito do tratamento com LPMld sobre o progresso de glomerulonefrite mesangioproliferativa induzida por ATS em ratos. Vinte e quatro ratos foram pesados e colocados em gaiolas metabólicas durante 24 horas para uma coleta de urina basal. Os volumes de urina foram registrados e a urina foi processada e quantificada para creatinina e proteína usando-se procedimentos padrão. Os ratos foram anestesiados, e foram retirados 0,5 -1,0 mL de sangue de uma veia marginal da cauda. 0 sangue foi coagulado e o soro retido para medição de nitrogênio de uréia no sangue (BUN), creatinina, e colesterol usando-se procedimentos padrão. Os ratos receberam injeções no Dia 0 de 20 mg/100 g de peso corporal de uma fração de IgG anti- timocítica (Thyl) (Probotex, San Antonio, TX) e devolvidos às suas gaiolas depois da recuperação. Os ratos foram monitorados diariamente e os seus pesos corporais e estado de saúde foram registrados. Os ratos foram divididos em três grupos de 8: dois grupos receberam injeções a cada dois dias (Dias 2, 4, 6 e 8) de LPMld a 50 e 100 pg/kg, respectivamente e o terceiro grupo recebeu injeções de veículo somente (50 mM de tampão de citrato de sódio pH 6,2 contendo 0,05 mM de EDTA) como um grupo de controle da doença a partir do dia 2 depois da administração do anticorpo. No dia 4, os ratos foram devolvidos à gaiola metabólica para uma coleta de urina no ponto médio. No dia seguinte, obteve-se sangue da vai da cauda para uma coleta de soro de ponto médio. No dia 8 os ratos foram novamente deixados nas gaiolas metabólicas para a última coleta de 24 horas de urina. Os animais estavam sadios durante todo o experimento. A taxa de filtração glomerular (conforme medida pela eliminação de creatinina da urina) de grupos tratados com LPM geralmente não diferiu dos controles, sendo somente observado um ligeiro aumento nos animais que receberam doses mais altas nos dias 5 e 9. Os níveis de BUN e de colesterol estavam todos dentro de limites normais para todos os animais. A proteína da urina foi determinada no ponto médio no estudo (coleta de urina de 24 horas nos Dias 4-5). Os ratos tratados com dose baixa e alta apresentaram reduções de 34% e de 39% em proteína urina, respectivamente, em comparação com o controle indicando que LPMld teve efeito protetor sobre a função renal.
B. Análise Histológica
No dia 9, todos os ratos foram sacrificados, coletou-se sangue e os rins foram processados para histologia. Os córtexes renais provenientes deste experimento foram fatiados em seções coronais de 2-3 mm e ou rapidamente congelados em nitrogênio líquido, colocados em formol ou colocados em metacarn e fixados de um dia para o outro a 4°C.
1. Coloração Imuno-histoquimica para Marcadores de Processo Fibrótico
As seções congeladas foram processadas usando-se anticorpos para fibronectina e actina de musculatura lisa alfa (a-SMA) (clone IST-9, Serotec, Harlan Bioproducts for Science, Indianápolis, IN e clone 1A4 de Sigma, St. Louis MO, respectivamente). A fibronectina é um marcador para deposição e síntese de matriz extracelular (ECM) e a actina de musculatura lisa alfa (α-SMA) é um marcador para células hipercelulares mesangiais submetidas a alterações fenotípicas que é um prelúdio para a deposição de ECM. A expressão de fibronectina e de α-SMA é indicadora do processo fibrótico. Para a coloração tanto de α-SMA quanto da fibronectina, os resultados são ilustrados em uma escala de 0-4, que indica zero, leve, moderato alto, e grave tingimento, respectivamente. A Tabela 17 ilustra os resultados da coloração de seções congeladas com α-SMA em forma de uma contagem média (AV) de todos os 4 ratos em um grupo. Os resultados mostram que houve uma redução da expressão de α-SMA na presença de concentrações aumentadas de LPMld. Portanto, há uma ativação reduzida de células mesangiais em rins tratados com LPMld.
TABELA 17: Nível de oí-SMA em Seções Congeladas de
Rim
Tratamento Contagem Média Contagem Média do Grupo 1 do Grupo 2 Veículo 2, 18 2,10 59 pg/kg de LPMld 1,76 2,08 100 pg/kg de LPMld 1, 69 1, 30 A Tabela 18 apresenta os resultados da coloração
de seções de rins congelados para fibronectina depois do tratamento de ratos com LPMld. Os resultados mostram uma expressão reduzida de fibronectina por tingimento imuno- histo-químico, especialmente a altas concentrações de LPMld (100 pg/kg) . Assim, há uma deposição reduzida de ECM em rins tratados com LPMld.
TABELA 18: Níveis de fibronectina de Seções
Congeladas de Rim
Tratamento Contagem Média Contagem Média do Grupo 1 do Grupo 2 Veículo 1,86 1, 98 59 pg/kg de LPMld CO 2,0 i---I 100 pg/kg de LPMld 1,49 1, 43 2. Coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) c Lesões Renais
As amostras tratadas com formolina foram processadas para avaliação por coloração com hematoxilina e eosina (H&E) de lesões renais. A coloração com H&E de seções congeladas permitiu a visualização e a avaliação global de lesões renais e da integridade e da estrutura glomerular que receberam a classificação em uma escala de 0-4 desde aparência normal até dano grave. Os resultados (Tabela 19) mostram uma presença reduzida de lesões renais em rins de ratos tratados com α-Thyl na presença de LPMld.
Não foram observadas lesões distintas no grupo de ratos tratados com 100 pg/kg de LPMld (isto é equivalente a uma classificação de 1,44). Assim, há uma redução de lesões renais e de dano estrutural em rins tratados com LPMld.
TABELA 19: Coloração com H&E de Lesões Renais em Seções Congeladas de Rim
Tratamento Contagem Média (n=4) Veiculo 2,4 59 pg/kg de LPMld 2,25 100 pg/kg de LPMld 1,44 3. Coloração Imuno-histoquimica para células Proliferantes
As amostras tratadas com metacarn foram usadas para a avaliação imuno-histoquimica do número de macrófagos 15 usando-se o anticorpo ED-I (Chemicon Corporation, Temecula, CA). Neste modelo, o número de macrófagos atinge um máximo aproximadamente no dia 5. Para a avaliação de macrófagos positivos para ED-1, o número total de macrófagos (isto é, de células positivas para ED-1) foi contado a partir de 25 20 glomérulos no dia 9. Os resultados são ilustrados na tabela 20 como números brutos de macrófagos contados em cada um dos 4 ratos em um grupo. Os resultados mostram que há uma presença reduzida de macrófagos em rins tratados com LPMld.
TABELA 20: Número de macrófagos em Glomérulos no
Dia = 9
Tratamento Número Bruto por Animal Veículo 109, 100, 120, 110 59 pg/kg de LPMld 79, 71, 63, 90 100 pg/kg de LPMld
62, 71, 68, 87
EXEMPLO 7
Atividade de LPMlc e LPMld em um Modelo Murino de Hipersensibilidade do Tipo Retardado
0 exemplo abaixo demonstra o efeito do tratamento com LPMlc e LPMld sobre o grau de resposta inflamatória a oxazolona em orelhas de camundongo.
Os efeitos de proteínas de LPM sobre uma resposta imune à base de células foram avaliados em um modelo murino de hipersensibilidade do tipo retardado (MDTH) induzida 10 pela administração do antígeno oxazolona. Foram avaliados os efeitos do tratamento com LPMlc e com LPMld sobre o grau da resposta inflamatória a oxazolona em orelhas de camundongo. 56 camundongos Balb/c fêmeas pesando -20-25 gramas foram divididos em sete grupos de tratamento 15 conforme exposto na tabela 21. Os camundongos foram sensibilizados a oxazolona a 2% (Sigma, St. Louis, MO) no dia -7 e dia -6 por aplicação de uma solução de antígeno a uma área raspada sobre o corpo. NO dia 0 os camundongos foram desafiados com uma solução de 2% de oxazolona 20 aplicada diretamente às duas orelhas. No dia 0 e no dia 1, os camundongos foram tratados com LPMlc (100 pg/kg), com LPMld (10 pg/kg ou 25 pg/kg), dexametasona (um corticosteróide anti-inflamatório,, 0,2 mg/kg (Vedco Inc, St. Joseph, MO) ou com o veículo de controle.
TABELA 21: Grupos de Tratamento de MDTH
Grupo Tratamento (n = 8) 1 Não-sensibilizado, desafiado + Veículo 2 Sensibilizado, desafiado + Veículo 3 Sensibilizado, desafiado + LPMlc 100 pg/kg 4 Sensibilizado, desafiado + LPMld 25 pg/kg 5 Sensibilizado, desafiado + LPMld 10 pg/kg 6 Sensibilizado, desafiado + Dexametasona 0,2 mg/kg 7 Não desafiado Para se avaliar o grau de resposta inflamatória a oxazolona e comparar os efeitos dos tratamentos apresentados na tabela 21, foram medidos a espessura e o peso total das orelhas. Ambas as orelhas dos camundongos foram medidas com um calibrador de precisão antes do desafio, 24 horas após o desafio e no fim do estudo (48 horas após o desafio). Além disso, as orelhas foram removidas e pesadas no fim do estudo.
0 erro médio padrão ± do peso final da orelha me gramas foi determinado. Foi usado um teste t com duas casas decimais para se analisar o significado estatístico dos resultados e todos os tratamentos com LPM deram uma redução relativa estatisticamente significativa (*p< 0,05) em largura da orelha em comparação com o grupo tratado com veículo/sensibilizado/desafiado (Grupo 2 na tabela 18), tal como o grupo tratado com o controle positivo dexametasona. A porcentagem em redução na largura da orelha em relação ao grupo tratado com veículo/sensibilizado/desafiado foi calculada para cada Grupo. A porcentagem de redução foi calculada pela fórmula: 1-[(tratado-controle
negativo)(controle positivo - controle negativo)] x 100%. Os resultados estão na tabela 22. As medições da espessura da orelha nos grupos de tratamento com LPMlc (grupo 3) e com o LPMld (grupo 4 e grupo 5) foram praticamente tão reduzidas como no grupo do tratamento com dexametasona (grupo 6) (29%).
TABELA 22: Efeitos do Tratamento com LPM no Peso da Orelha em MDTH
Grupo de Tratamento
Porcentagem de redução do peso da orelha em relação ao grupo 2 de veiculo/sensibilizado/desafiado Grupo 1: Não- 74% sensibilizado, desafiado + Veículo Grupo 2: Sensibilizado, 0% desafiado + Veículo Grupo 3: Sensibilizado, 20% desafiado + LPMlc 100 pg/kg Grupo 4: Sensibilizado, 29% desafiado + LPMld 25 pg/kg Grupo 5: Sensibilizado, 22% desafiado + LPMld 10 pg/kg Grupo 6: Sensibilizado, 28% desafiado + Dexametasona 0,2 mg/kg Grupo 7: Não desafiado 100% EXEMPLO 8
Atividade de LPMld em um Modelo de Lesão à Medula
Espinal
A. Lesão ã Medula Espinal e Administração de LPM
Um experimento com modelo de lesão à medula
espinal (SCI) foi projetado em que se administrou LPMld somente nos primeiros 1-3 dias após a lesão a fim de se quantificar a redução em populações de macrófagos e neutrófilos. Resumindo, a lesão da medula espinal foi 10 induzida do seguinte modo: camundongos CD-I adultos de 6-8 semanas de idade (Charles River Laboratories, Montreal, Quebec, Canadá) foram anestesiados com uma mistura de cetamina-xilazina (85 mg/kg e 15 mg/kg, intraperitoneal (I.P.)), respectivamente e foram submetidos a uma lesão da 15 medula espinal (SCI) por uma contusão T9/10 moderada (60 kdyne) (Infinite Horizons Impactor, Precision Systems Instrumentation, Kentucky, USA). A lesão foi bem 10
15
20
caracterizada em roedores e produz uma lesão moderada de um modo reprodutível que imita a patofisiologia de SCI humana (vide, por exemplo, Wells e outros (2003) Brain, 126: 162837). Depois da lesão, deixou-se que os camundongos se recuperassem em um cobertor quente e administraram-se 0,5 mL de solução salina para compensar pela perda de sangue e desidratação. As bexigas foram manualmente espremidas 2-3 vezes por dia até voltar a evacuação espontânea. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Comitê de Ética sobre Cuidados com Animais da universidade de Calgary atendo-se às diretrizes do Canadian Council on Animal Care.
Depois de produzida a lesão, administraram-se LPMld ou controles veiculos aos camundongos. Os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de tratamento conforme disposto na Tabela 23 abaixo.
TABELA 23
Grupo Tratamento I Um único bolo de LPMld (100 μg/kg, I.P.) 2 horas após SCI II Duas injeções de LPMld (100 μς/kg, I.P.) 2 horas e 24 após SCI III Três injeções de LPMld (100 yg/kg, I.P.) 2 horas e 24 e 48 horas após SCI IV Veículo (I.P.) 25
B. Coleta de Tecido e de Sangue para Análise de
Dados 1. Tecido Fresco
Tecido fresco foi coletado de cada um dos grupos de tratamento 24 e 48 horas após lesão SCI depois dos camundongos terem sido anestesiados, e coletou-se ~1 mL de sangue integral por punção cardíaca em 100 pL de solução de heparina. Imediatamente depois da coleta do sangue, os animais foram perfusados com PBS gelado e a medula espinal (2 cm concentrados ao redor do sitio da lesão) foi rapidamente isolada e colocada em PBS gelado. Foram então preparadas amostras de sangue e da medula espinal para citometria de fluxo.
2. Tecido Fixado
0 tecido fixado foi coletado de cada um dos grupos de tratamento aos 5 dias após a lesão SCI. Os animais foram anestesiados com uma dose letal de cetamina- xilazina, perfusados com PBS, seguido por fixação da 10 perfusão com uma solução de 4% de paraformaldeido em PBS. As medulas espinais (T6 a T13) foram removidas e pós- fixadas em 4% de paraf ormaldeido de um dia para o outro e subsequentemente crioprotegidas em 30% de sacarose. As medulas espinais foram então colocadas em blocos, 15 congeladas e armazenadas a ~70°C até serem seccionadas. Os blocos foram secionados no plano transversal a uma espessura de 20 μιη e as seções de tecido foram coletadas sobre lâminas Superfrost (Fisher Scientific, Houston, TX) organizadas em cinco séries de seções adjacentes.
2 0 3. Análise Estatistica
A análise estatística foi conduzida usando-se Software SigmaStat (SPSS, inc.). As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas usando-se uma análise de variação (ANOVA) e a análise post-hoc de Holm-Sidak 25 quando fosse aconselhável. No caso de variações desiguais, foi usado nas rodadas ANOVA de uma via de Kruskall-Wallis. As diferenças com um valor P inferior a 0,05 foram consideradas significativas.
C. Análise dos Dados 1. Citometria de Fluxo
As amostras de medula espinal provenientes de tecido fresco foram mecanicamente destruídas com um homogeneizador Dounce de vidro pequeno, e foram obtidas suspensões de células somente fazendo-se a solução passar através de uma tela de trama de arame (Sigma-Aldrich, Canadá). As amostras foram então submetidas a centrifugação a 4°C a 1.100 RPM (200 x rotação) durante 10 minutos com baixa ruptura. Os grânulos foram ressuspensos em tampão de tingimento de FBS (BD Biosciences) e foram submetidas a centrifugação (3.000 RPM durante 7 minutos, baixa ruptura a 4°C). Os grânulos foram então ressuspensos em tampão de tingimento de FBS.
As células das medulas espinais foram coloridas com anticorpos a marcadores usados para a determinação de populações de micróglia residente (CD45alto:CDllb). Para se otimizar as diluições de anticorpos, o número de células foi primeiro contado usando-se coloração com azul de tripano diluindo-se as células a 1:1 em azul tripano (10 μΐ, de azul de tripano para 10 yL de cada amostra), e contando- se o número de células usando-se um hemacitômetro. As amostras foram incubadas primeiro com Fc Block™ (CD16/CD32 (receptor FcyIII/II anti-murino de rato purificado; BD Biosciences; 0,5 mg/mL) para reduzir a ligação não específica devida à ligação do anticorpo ao receptor de Fe. Depois de incubação com bloco de Fc durante aproximadamente minutos, foram acrescentados os seguintes anticorpos monoclonais (BD Biosciences) à amostras de células para se avaliar a presença de micróglia residentes e leucócitos derivados de sangue: CDll b anti-murino de rato conjugado as R-Ficoeritrina (R-PE) (0,2 mg/mL), Ly-6G e Ly- 6C anti-murino de FITC (Gr-1;0,5 mg/mL), complexo molecular de CD3 anti-murino de FITC (0,5 mg/mL) e CD45 anti-murino de rato conjugado a proteína de clorofila-a Peridinina (PerCP) (antígeno comum a leucócito, Ly-5; 0,2 mg/mL). Para se controlar a ligação não específica e a autofluorescência, o tingimento também foi conduzido usando-se anticorpos de controle de isótipo adequado (isto é, controle de isótipo k de IgG2a de rato rotulado com PE (0,2 mg/mL); IgG2b de rato rotulado com FITC, controle isótipo k (0,5 mg/mL); e controle isótipo IgG2b de rato conjugado a PerCP (0,2 mg/mL)). Uma amostra contendo somente células foi também incluída na incubação com coloração. As células foram incubadas durante 30 minutos a
4 °C. Depois da incubação, as amostras de células foram lavadas duas vezes em tampão de tingimento de FBS e ressuspensas em formol tamponado a 1%. As amostras de células foram armazenadas a 40C e analisadas usando-se um BD FACScan (BD Biosciences).
Os resultados de citometria de fluxo foram determinados a partir de gráficos de densidade (CD45, eixo de y; CDllb, eixo de x) usando-se o software WinMDl versão 2.8 (Scripps Research Institute, Califórnia, USA) e foram comparados entre os diferentes grupos de tratamento. Usando-se o software WinMDl versão 2.8, a fluorescência média de coloração de CD45 e CDllb foi determinada para cada grupo de tratamento. A relação de leucócitos derivados do sangue em relação à micróglia residente foi determinada como uma relação dos valores de fluorescência média de CD45: CDllb. Os erros padrão da média foram também determinados para cada um dos grupos de tratamento. O resultado foi apresentado na Tabela 24. Os resultados mostram que 24 horas depois da SCI, os camundongos no Grupo
1 tratados com LPMld duas horas após SCI apresentaram uma relação reduzida de leucócitos derivados do sangue na medula espinal em comparação com os camundongos tratados com veículo somente. A análise mostra que os camundongos que receberam uma dose de LPMld duas horas após SCI revelaram que a relação de leucócitos derivados de sanguermicróglia 24 horas era significativamente reduzido (Ρ< 0,05) em comparação com os controles. Isto representa uma redução de 30% me leucócitos derivados do sangue, uma vez que os números de micróglia não foram alterados de um grupo para outro. 48 horas após SCI, a relação de células de cordão espinhal provenientes de camundongos tratados com duas doses de LPMld a 2 e 24 horas após a infecção (isto é, o grupo II) não mostraram nenhuma diferença significativa entre as relações de teste e de controle.
TABELA 24: Relação de Leucócitos derivados de
sangue para Micróglia Residente 24 a 48 horas após SCI
Tratamento N Média Erro padrão Ponto no médio (SEM) Tempo Veículo 6 2, 431 0, 317 24 horas Grupo I 6 1, 703 0, 102 24 horas Veículo 6 3, 02 0, 38 48 horas Grupo II 6 3, 619 0, 965 48 horas 2. Análise Imuno-Histoquimica para Detecção de
Micróglia/Macrófagos
0 procedimento imuno-histoquimico por
fluorescência foi conduzido em lâminas contendo seções de tecido fixado provenientes de medulas espinais lesadas após dias. As lâminas foram descongeladas, enxaguadas três vezes em PBS, e bloqueadas em soro caprino normal a 10% durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para se detectar micróglia/macrófagos, as lâminas foram incubadas com um anticorpo de coelho anti-Iba-1 (1:1000; Wako Chemicals USA, Inc.) durante duas horas à temperatura ambiente. Depois de serem três vezes lavadas em PBS, as lâminas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente com o anticorpo secundário anti-coelho caprino Alexa488 (1:1000, Molecular Probes Inc., USA) para se visualizar Iba-I. As lâminas foram então lavadas três vezes em PBS e submersas em Hoechst 33258 (1 pg/mL, Sigma-Aldrich, Canadá). Para se quantificar a ativação/recrutamento microglial/de macrófagos no interior da medula espinal lesada, foi colocado uma caixa de sobreposição (1024 x 1024 pixels) sobre imagens de seções transversais da medula 5 espinal co-focais dotadas de limiares e digitalmente capturadas contendo o sinal Iba-I usando-se o software SigmaScan Pro (SPSS Chicago, IL) . A porcentagem da área ocupada pelo sinal Iba-I foi calculada para se determinar a densidade de micróglia/macrófagos do cordão espinhal 10 usando-se o tingimento do tecido com Iba-I a 5 dias após SCI. Pelo menos duas seções provenientes do centro do sitio de lesão de cada animal foram avaliadas (n = 2-3 animais pro grupo) . 0 sinal Iba-I da média e do erro médio padrão (SEM) foi determinado e os resultados são dados nas tabelas 15 25. Os resultados mostram que os animais que receberam uma dose única de LPMld 2 horas (Grupo I) e os camundongos que receberam três doses de LPMld 2, 24 e 48 horas após SCI (Grupo III) mostraram uma redução de 40% e 60% de redução em número de células, respectivamente em comparação com 20 controles que receberam veiculo somente. Isto foi estatisticamente significativo (P < 0,05 de diferença entre os grupos de tratamento Kruskal-Wallis ANOVA de uma via em rodadas). Neste experimento, os camundongos no grupo II que receberam duas doses de LPMld 2 horas e 24 horas não 25 apresentaram nenhuma diferença significativa na porcentagem de células que eram positivas para Iba-I em comparação com as células de controle.
TABELA 25: Densidade Micróglia/Macrófagos Positivos para Iba-I (% de área) 5 dias após SCI
Tratamento n Média Erro médio padrão (SEM) Veiculo 2 12,1458 2, 822 Grupo I 3 7, 342 0, 503 Grupo II 2 13,465 1, 337 Grupo III 2 4,89 1,297 EXEMPLO 9 Atividade de LPMs em um Modelo de Xenoenxerto
Os efeitos de LPMs sobre o câncer da mama foram avaliados usando-se um modelo estabelecido de xenoenxerto 5 de tumor. Camundongos nus atimicos (nu/nu) fêmeas receberam injeções com 2,5 milhões de células (em 0,2 mL de PBS/Matrigel) da linhagem de células de carcinoma de mama dependente de estrogênio MCF-7 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA) e foram avaliados so 10 efeitos de duas moléculas de LPM sobre o crescimento do tumor.
A. LPM de SDF-Ip-SAl Var 1
Neste estudo LPM de SDF-^-SAl Var I (SEQ ID NO: 216) foi usado no regime de tratamento. Este LPM contém uma 15 quimiocina SDF-Ιβ madura ligada a uma fração SAl do tipo selvagem. A dosagem intraperitonial de 100 yg/kg de LPM SDF-Ιβ SAl Var 1 ou controle veículo começou no dia 7 depois da injeção com MCF-7 e continuou todo dia até o dia
21. Deixou-se que os tumores crescessem até o dia 31.
1. Crescimento Tumoral
Os efeitos de SDF-^-SAl Var 1 sobre o retardamento do progresso de células de carcinoma da mama MCF-7 neste modelo de xenoenxerto murino foi determinados avaliando-se o crescimento dos tumores conforme medido por 25 peso tumoral e volume tumoral. Na ausência de SDF-13~SA1 Var 1, o crescimento do tumor aumentou continuamente desde o dia 78 (a partir de aproximadamente 100 mm3) até o dia
31, atingindo um volume tumoral máximo de aproximadamente 980 mm3 no dia 28. 0 tratamento dos camundongos com LPM a uma dose de 100 yg/kg também resultou em um aumento constante no crescimento dos tumores; no entanto a intensidade de crescimento tumoral foi significativamente menor do que na ausência de LPM. Na presença de LPM, por exemplo, o crescimento tumoral máximo foi atingido no dia 5 28, no entanto o volume tumoral máximo somente atingiu aproximadamente 500 mm3. Os resultados mostram que o tratamento de camundongos com LPM resultou em uma redução estatisticamente significativa na taxa de crescimento tumoral de MCF-7. Os pesos tumorais finais dos animais de 10 teste reduziram de uma média de 35% e os volumes tumorais finais de 41,5% em relação ao controle (significativo, p <
0,05, usando-se o teste t de duas casas decimais).
2. Infiltrado Inflamatório
O exame microscópico foi usado para se determinar os efeitos de LPM de SDF-^-SAlVarl sobre o infiltrado inflamatório neste modelo. Os tumores foram excisados e seccionados dez dias depois da última dose do LPM de SDF- Ιβ-SAlVarl ter sido administrada aos camundongos (isto é, no dia 31) , e examinados ao microscópio para se avaliar o infiltrado de leucócitos ao redor da periferia dos tumores. As células foram visualizadas com tingimento com Hematoxilina e Eosina (H&E). Os resultados mostram que houve 36% menos células no tecido de animais tratados com LPM em comparação com animais tratados com veículo somente, o que foi estatisticamente significativo.
3. Coloração de CD-31
0 exame histológico permitiu a visualização da extensão de necrose intratumoral e vacuolização. Foi usado anti-CD-31 (PECAM-1 policlonal caprino (clone M-20), Santa
cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) para se visualizar PECAM-1, uma molécula de adesão celular e glicoproteína expressa nas superfícies celulares de monócitos, neutrófilos, plaquetas e uma subpopulação de células T. PECAM-1 também é expressa na superfície de células endoteliais de adultos e embrionárias. Os tumores foram excisados, seccionados e coloridos com anticorpos anti-CD-
31 dez dias depois da última dose do LPM SDF-ip-SAlVarl ter sido administrada aos camundongos (isto è, no dia 31) . Resumindo, seções de exemplares de tumores embutidos em parafina fixados com formol foram desparafinizadas e hidratadas. Um pré-tratamento de recuperação de epitopo induzido por calor em solução de Recuperação de Alvo (pH 9,0, DakoCytomation, Carpenteria, CA) foi usado antes da incubação dos anticorpos primários. A atividade de peroxidase endógena foi inibida incubando-se com H2O2 a 3%, e o tingimento não específico foi bloqueado com o bloqueador de proteína isento de soro Protein Block Serum- Free DAKO (DakoCytomation, Carpenteria, CA). A amostra foi incubada com anticorpo primário (anti-CD-31) diluído a 1:800 durante 30 minutos à temperatura ambiente. As seções de tecido foram então incubadas com imunoglobulina de coelho anti-caprina biotinilada (Vector Laboratories, Burlington, CA) diluída a 1:400 durante 30 minutos à temperatura, aplicando-se então o polímero Envision + Rabbit System Labeled de Dako, HRP (DakoCytomation, Carpenteria, CA). 0 tingimento foi revelado com DAB+ líquido (DakoCytomation, Carpenteria, CA) e contra-tingido com Hematoxilina. Alguns leucócitos (visualizados por tingimento circular sob análise histológica) e células endoteliais (visualizadas por coloração de células com um formado alongado) se coloriram positivas para CD-31. Estes resultados indicaram a presença de angiogênese no tumor em crescimento. Por outro lado, não havia nenhuma coloração de CD-31 nos tumores tratado com o LPM SDF-ip-SAlVarl indicando a ausência de macrófagos (camundongos atímicos não têm nenhuma célula T) e a ausência de vasos sangüíneos de células endoteliais intratumorais.
4. Coloração de Ki-67
0 exame histológico também foi usado para avaliar os efeitos de LPM SDF-^-SAlVarl sobre a proliferação celular neste modelo pela coloração de células com anticorpo anti-Ki-67 policlonal de coelho (Santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA) dez dias depois da última dose de LPM SDF-ip-SAlVarl ter sido administrado aos camundongos (isto é, no dia 31) . Este antígeno é expresso durante toda a fase ativa do ciclo celular (fases Gl, S, G2 e M) , mas está ausente em células em repouso (fase GO) . O antígeno Ki-67 é rapidamente degradado à medida que a célula entra no estado proliferativo, e não há nenhuma expressão de Ki-67 durante o processo de reparo de DNA. Resumindo, as seções de exemplares de tumor embutidas em parafina, fixadas com formol foram desparafinizadas e hidratadas. Um pré-tratamento de recuperação de epitopo induzido pro calor em solução Target Retrieval Solution (pH 9,0, DakoCytomation, carpenteria, CA) foi usada antes da incubação primária do anticorpo. A atividade de peroxidase endógena foi inibida pela incubação com H2O2 a 3%, e o tingimento não específico foi bloqueado com o bloqueador de proteína isento de soro Protein Block Serum-Free DAKO (DakoCytomation, carpenteria, CA) . A amostra foi incubada com anticorpo primário (anti-Ki-67) diluído a 1:200 durante minutos à temperatura ambiente. As seções de tecido foram então incubadas com imunoglobulina caprina anti- coelho biotinilada (Vector Laboratories, Burlington, CA) diluída a 1:400 durante 30 minutos à temperatura, aplicando-se então o polímero Envision + Rabbit System Labeled de Dako, HRP (DakoCytomation, Carpenteria, CA) . 0 tingimento foi revelado com DAB + líquido (DakoCytomation, Carpenteria, CA) e contra-tingido com Hematoxilina. Um grande número de células eram proliferantes nos tumores sem tratamento conforme mostrado por tingimento de Ki-67. Por outro lado os tumores tratados com LPM SDF-13-SAlVarl 5 apresentaram pouco tingimento com anti-Ki-67, indicando uma progressão reduzida do tumor. Além disso, parecia que muitas células cancerígenas tinham sofrido necrose, conforme evidenciado por vacúolos transparentes no campo.
B. MCP-I-SAlVar4 (LPMld)
Neste estudo, MCP-l-SAlVar4 (LPMld) foi usado no
regime de tratamento. A dosagem intraperitonial começou no dia 78 e os coortes receberam tanto veículo; (1) uma dose de 2 mg/kg de LPMld no dia 7; (2) 2 mg/kg de LPMld nos dias
7, 11, 15, e 21 quanto (3) 100 ym/kg de LPMld todos os dias 15 a partir do dia 7 e até o dia 21 inclusive. Deixou-se que os tumores continuassem a crescer até o dia 32. A porcentagem de alteração no peso corporal dos animais tratados entre diferentes coortes incluindo o controle não excedeu 0,5%.
Na ausência de LPMld, o crescimento tumoral
aumentou constantemente do dia 7 até o dia 32 inclusive, atingindo o volume tumoral máximo de aproximadamente 1500 mm3 no dia 32. 0 tratamento de camundongos com LPM em todos os regimes de dosagem resultou em um aumento constante no 25 crescimento tumoral; no entanto a magnitude do crescimento tumoral era significativamente menor do que na ausência de LPMld. 0 tratamento com MCP-l-SAlVar4 (LPMld) induziu uma redução estatisticamente significativa no crescimento de tumor de MCF-7 conforme medido por volume e peso tumoral. A 30 redução em crescimento tumoral para todos os grupos de tratamento com LPMld foi análoga do dia 7 até o dia 29, embora no dia 32 houvesse algumas diferenças nos efeitos dos diferentes grupos de tratamento com LPMld sobre o crescimento tumoral. Os pesos tumorais finais dos grupos 1-
3 foram reduzidos de 41, 58,6 e 36% em relação ao controle (significativo, p < 0,05, usando-se o teste t de duas casas decimais). Os volumes tumorais finais dos grupos 1-3 5 reduziram de 47,m 63 e 40,4% em relação ao controle (significativo, p < 0,05, usando-se o teste t de duas casas decimais). Este estudo indica que uma única dosagem ou uma minima repetida é suficiente para reduzir significativamente a taxa de crescimento tumoral.
Um segundo experimento de xenoenxerto de MCF-7
foi conduzido com LPMld. Os regimes de dosagem do primeiro experimento deram resultados similares. Um regime adicional de dosagem foi acrescentado quando se deixou que os tumores crescessem primeiro até - 7 00 mm3 de volume tumoral (em 15 vez de ~100 mm3) antes de se começar o tratamento com LPMld a fim de se testar se o tratamento poderia afetar grandes tumores em crescimento (com uma massa vascular mais considerável). Assim, deixou-se que so tumores crescessem até aproximadamente o dia 27 antes da administração de 20 LPMld ou do controle de veiculo. Os animais foram tratados com 100 yg/kg de LPMld por injeção intraperitonial a cada quatro dias a partir do dia 27 e até o dia 43 inclusive. O tratamento com LPMld reduziu significativamente o volume tumoral imediatamente depois da primeira injeção (p < 0,05) 25 em comparação com os controles. Esta tendência continuou até o dias 43.
EXEMPLO 10
Atividade de LPMld em Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) , um Modelo Animal de Esclerose Múltipla
Camundongos C57BL/6 fêmeas de oito a dez semanas
de idade (Jackson Laboratory, bar Harbor, Maine) foram divididos em 4 grupos (Grl-4). Para induzir EAE, os grupos
1 e 2 (n = 9) receberam injeções subcutâneas no Dia 0, na parte de trás da cauda, 100 yg de peptideo (MOG) 33-55 de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (Bernard e outros (1997) J. Mol. Med. 75: 77-18) emulsifiçados em 100 yL do adjuvante completo de Freund (Difco Laboratories, 5 Detroit, MI). Estes camundongos também receberam uma dose intraperitoneal (i.p.) de 300 ng de toxina de coqueluche liofilizada reconstituída em 200 yL de solução salina tamponada com fosfato no Dia 0 e novamente no Dia 2 (Liu e outros (1998) Nat. Med. 4: 78-83). Os Grupos 1 e 2 10 respectivamente, receberam 6 injeções diária (Dia 3-8) de LPMld (500 yg/kg) em tampão (50 mM de tampão de citrato de sódio, pH 6,2, 0,05 mM de EDTA e 10 % v/v de glicerol) ou tampão somente. Os camundongos de controle (n = 6) nos Grupos 3 e 4, respectivamente, não receberam nenhuma 15 injeção e 6 injeções diárias (D3-8) de somente 500 yg/kg de LPMld.
Os animais foram avaliados diariamente, usando-se um sistema de contagem que avalia a doença em uma escala que varia de 0 a 15 (Weaver e outros, 2005) . A contagem da 20 doença é a soma do estado da cauda e de todos os quatro membros. Para a cauda, uma contagem de 0 reflete que não há nenhum sinal, 1 representa uma cauda sei-paralisada, ao passo que uma contagem de 2 é dada a um camundongo com uma cauda totalmente paralisada. Para cada um dos membros 25 traseiros ou dianteiros, cada um avaliado separadamente, 0 significa que não há nenhum sinal, uma contagem de 1 é um andar fraco ou alterado, 2 representa paresia, ao passo que a contagem de 3 indica um membro totalmente paralisado. Assim. Um animal quadriplégico totalmente paralisado 30 atingiria uma contagem de 14. A mortalidade é igual a uma contagem de 15. Os resultados mostram que os camundongos de controle (grupos 3 e 4) não apresentaram nenhuma paralisia. 0 grupo 2, o modelo de EAE tratado com tampão, desenvolveu paralisia a partir de aproximadamente 9 dias após a injeção e aumentou linearmente até uma contagem clinica média acima de 6 no dia 14. Os animais com EAE tratados começarem a desenvolver paralisia com uma contagem média abaixo de 5 aproximadamente 4 no dia 10, que desceu para os níveis de controle (próximo de 0) no dia 12 e permaneciam ali no dia
13.
No modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) aguda de esclerose múltipla, o OPL-CCL2- 10 LPM teve um efeito dramático sobre o curso da doença. O aparecimento e a gravidade da doença foram significativamente retardados e reduzidos, respectivamente. Neste estudo, os animais foram tratados diariamente com veículo ou LPM nos dias 3-8. Os animais de controle e os de
teste apresentaram um aparecimento inicial da doença no dia 10 conforme previsto. Em seguida as contagens de gravidade clínica da doença voltaram para zero (nenhuma indicação comportamental de doença) nos animais tratados em comparação com animais de controle (que apresentaram 20 contagens de gravidade clínica de 6-10) durante os seguintes quatro dias.
Classificações Médias de Gravidade Clínica (arredondadas para próximo de 0,5 na escala)
Dia Controle (Veiculo) Animais Tratados
com LPM
1-9 0 0 2,5 LO CM 11 LD O CO *---I 12 4,5 O O 13 6, 5 0,5 14 10, 0 O t---I 10,0 3,5 16 9,5 6,5
17 9, 0 6,5
Os animais que não receberam nem injeções nem veículo somente (sem doença) tiveram uma contagem de zero em todo o teste.
EXEMPLO 11
Testou-se OPL-CCL2-LPM em um modelo de
glomerulonefrite mesangioproliferativa induzida por Soro Anti-Timocitico (ATS). Ratos machos receberam injeções de ATS no dia 0 e foram tratados por via intravenosa com veículo, 50 e 100 yg/kg da proteína recombinante Q2D do dia 10 2 até o dia 8. As coletas de urina e de sangue foram feitas antes da injeção de ATS e nos dias 5 e 9. Os animais foram sacrificados no dia 9. Não foi observado nenhum efeito relacionado com tratamento sobre o peso corporal nem sinais de toxicidade clínica. Os níveis protéicos na urina eram 15 reduzidos em animais tratados. As análises histopatológicas de seções do rim revelaram reduções máximas de 40, 36, 38 e 28% para lesões glomerulares, contagem M/M, fibronectina e actina da musculatura lisa a, respectivamente. As duas últimas proteínas eram marcadores para síntese de matriz 20 extracelular e para ativação celular mesangial, respectivamente. Estes resultados indicam um efeito protetor renal significativo neste modelo de nefrite e indicam que as toxinas de quimiocina-ligante podem ser usadas no tratamento de doenças.
Como as modificações se tornarão evidentes aos
versados na técnica, pretende-se que a presente invenção seja limitada somente pelo escopo das reivindicações apensas.

Claims (170)

1. Polipeptídeo da toxina Shiga modificada, ou seu fragmento ativo, compreendendo uma ou mais modificações de aminoácido em uma toxina Shiga, suas espécies alélicas ou variantes, seu fragmento cataliticamente ativo ou seu fragmento ativo, onde uma ou mais modificações de aminoácido são substituições de uma ou ambas as posições correspondendo às posições 38 e/ou 219 com referência às posições de aminoácido na subunidade Al da toxina Shiga (SAl) compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22.
2. Polipeptideo da Toxina Shiga modificada, de acordo com a reivindicação 1, que possui, pelo menos, cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência com relação ao polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22 e que inclui modificações at Ioci correspondendo às posições de aminoácido 38 e/ou 219.
3. Polipeptídeo da Toxina Shiga modificada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde as modificações correspondem a L38R e/ou V219A.
4. Polipeptídeo da Toxina Shiga modificada, de acordo com as reivindicações 1-3, onde a toxina Shiga compreende a subunidade A.
5. Polipeptídeo da toxina Shiga modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, onde a toxina Shiga compreende a cadeia Al da toxina Shiga (SAl) ou seu fragmento ativo.
6. Polipeptídeo da toxina Shiga modificada, de acordo com a reivindicação 5, onde a SAl é truncada.
7. Polipeptídeo da toxina Shiga modificada, de acordo com a reivindicação 6, onde a SAl truncada é truncada por deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos adjacentes no término C.
8. Polipeptídeo da toxina Shiga modificada, de acordo com a reivindicação 5-7, onde a SAl compreende uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26 ou 28, ou é uma de suas variantes de espécies ou variantes alélicas.
9. Conjugado, compreendendo: um agente alvejado que é um polipeptídeo cjia toxina Shiga modificada, conforme qualquer uma das reivindicações 1-8, ou seu fragmento ativo; e um agente alvo ou sua porção, onde o conjugado se liga ao receptor de superfície de célula, resultando na internalização do agente alvejado nas células portando o receptor.
10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 9, compreendendo os seguintes componentes: (agente de alvo)n, (L)q e (agente aivejado)m, onde: L é um ligador para ligação do agente alvo ao agente alvejado; agente alvo é qualquer fração que se liga seletivamente ao receptor de superfície de célula; m e n, que são selecionados independentemente, são pelo menos 1; e q é 0 ou mais, à medida que o conjugado resultante se liga ao receptor alvejado, seja internalizado e libere o agente alvejado; o conjugado resultante se liga a um receptor que interage e internaliza um agente alvo, pelo qual o(s) agente(s) alvejado(s) é(são) internalizado(s) em uma célula portando o receptor; e quando o conjugado contém uma pluralidade de agentes alvejados, os agentes alvejados são os mesmos ou diferentes e quando o conjugado contém uma pluralidade de agentes alvo os agentes alvo são os mesmos ou diferentes.
11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, onde m e n, que são selecionados, independentemente, são 1-6.
12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, onde qél, n é 2 e m é 1.
13. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-12, onde: o agente alvo é selecionado dentre um agente alvo de receptor de quimiocina, uma citocina diferente de quimiocina, um hormônio, um fator de crescimento, um anticorpo específico para um receptor de superfície de célula, um ligante da superfamília de TNF e um ligante de receptor de reconhecimento padrão (PRR).
14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, onde o fator de crescimento é um VEGF.
15. Conjugado, de acordo com a reivindicação 13, onde o agente alvo de receptor de quimiocina é uma quimiocina ou um fragmento de uma quimiocina que se liga a um receptor de quimiocina, ou um anticorpo que se liga especificamente a um receptor de quimiocina ou um fragmento de um anticorpo que se liga especificamente a um receptor de quimiocina.
16. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, onde o agente alvo de receptor de quimiocina é uma quimiocina.
17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16, onde a quimiocina é selecionada dentre proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-I), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, proteína-1 quimiotática de eosinófilos (Eotaxina-I)., Eotaxina-2, Eotaxina-3, fator-ΐβ derivado estromal (SDF- 1β), SDF-Ια, SDF-2, proteína Ia inibidora de macrófago (ΜΙΡ-Ια) , ΜΙΡ-1β, ΜΙΡ-Ιγ, ΜΙΡ-2, ΜΙΡ-2α, ΜΙΡ-2β, ΜΙΡ-3, ΜΙΡ-3β, ΜΙΡ-3α, ΜΙΡ-4, ΜΙΡ-5, proteína Secretada e Expressa em Célula T Normal de Ativação Regulada (RANTES), interleucina-8 (IL-8), proteína α regulada de crescimento (GRO-α), proteína 10 induzível por interferon (IP-10), quimiocina derivada de macrófago (MDC), proteína 2 quimiotática de granulócito (GCP-2), proteína 78 de ativação de neutrófilo derivada de epitélio (ENA-78), proteína básica de plaqueta (PBP), monocina induzida por gama interferon (MIG), fator 4 de plaqueta (PF-4), quimiocina I CC de hemofiltrado (HCC-I), quimiocina regulada por ativação e timo (TARC), Iinfotactina, lungcina, CIO, quimiocina expressa no fígado (LEC), exodus- 2 (SLC), quimiocina expressa no timo (TECK), quimiocina atrativa da célula T cutânea (CTACK), quimiocina de epitélio associada às mucosas (MEC), motivo l-β simples C (SCM-Ιβ), célula T alfa quimioatrativa induzível por interferon (I-TAC), quimiocina expressa em mama e rins (BRAK), fractalcina e quimiocina 1 atrativa de célula B (BCA-I), ou variantes de espécies ou variantes alélicas.
18. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, onde a quimiocina é selecionada dentre MCP-I, Eotaxina-I, SDF-Ιβ, GR0-a, MIP-Ιβ, IL-8, IP-10, MCP- 3, MIP-3a, MDC, MIP-Ia e BCA-I ou suas variantes de espécies ou variantes alélicas.
19. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-18, onde o agente alvo se liga especificamente a um ou mais receptores de superfície de célula em uma ou mais células efetoras imunes ou outras células associadas a uma resposta imune ou inflamatória.
20. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, onde uma ou mais células constituem outra célula associada a uma condição imune ou inflamatória e constituem células residentes de tecido (TRC).
21. Conjugado, compreendendo uma quimiocina selecionada dentre 1-309, MCP-1, MIP-Ia, MIP-Ιβ, RANTES, MCP-3, MCP-2, IL-8, MIG, IP-10, 1-TAC, SDF-la, SDF-Ιβ, BCA- 1, uma Eotaxina, MCP-4, MCP-5, CIO, LEC e MIP-lb2 ou seu fragmento ligado diretamente ou através de um ligador a um polipeptídeo da toxina Shiga modificada conforme qualquer uma das reivindicações 1-8 ou subunidade SAl da mesma ou seu fragmento ativo.
22. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, onde a célula efetora imune ou células se constituem em um leucócito ativado.
23. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19 ou reivindicação 22, onde as células são selecionadas dentre monócitos, macrófagos, células dendríticas, células T, células B, eosinófilos, basófilos, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK) e neutrófilos;
24. Conjugado, de acordo com a reivindicação 23, onde os macrófagos são macrófagos de tecido selecionados dentre macrófagos alveolares, micróglia e células de Kupfer.
25. Conjugado, de acordo com a reivindicação 23, onde as células dentríticas são selecionadas dentre células dendríticas imaturas, células dendríticas maduras e células de Langerhans.
26. Conjugado, de acordo com a reivindicação 23, onde as células T são selecionadas dentre células T CD4+ -e CD8+.
27. Conjugado, de acordo com a reivindicação 26, onde as células T CD4+ são células Thl ou Th2.
28. Conjugado, de acordo com a reivindicação 26, onde as células T CD4+ são células Thl7.
29. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, onde: uma ou mais células constituem outra célula associada à condição imune ou inflamatória e constituem células residentes de tecido (TRC); e as TRC são selecionadas dentre células mesangiais, células gliais, células endoteliais, células epiteliais, células tumorais, fibroblastos e sinoviócitos.
30. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-21 e 23-29, onde as células são ativadas.
31. Conjugado, de acordo com a reivindicação 30, onde ativação induz a expressão de um ou mais receptores de superfície de célula
32. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-31, onde o receptor de superfície de célula é um receptor de quimiocina selecionado dentre CXCRl, CXCR2, CXCR3A, CXCR3B, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CCR1, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR/, CCR8, CCR9, XCRl e CX3CR-1, onde: a quimiocina afeta a ligação a um receptor pelo qual o conjugado é internalizado em uma célula portando o receptor.
33. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-32, onde o agente alvo e agente alvejado ou seu fragmento ativo, são ligados diretamente através de uma ligação covalente ou iônica.
34. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-33, onde o agente alvo e agente alvejado são unidos através de um ligador.
35. Conjugado, de acordo com a reivindicação 34, onde o ligador é um peptídeo, polipeptídeo ou ligador químico.
36. Conjugado, de acordo com a reivindicação 35, onde o ligador é selecionado dentre aminobenzoato de N- succinimidil (4-iodoacetil) , aminobenzoato de sulfosuccinimidil (4-iodoacetil), 4-succinimidil- oxicarbonil-α-(2-piridilditio)tolueno, hexanoato de sulfosuccinimidil-6-(a-metil-a-(piridilditiol)-toluamido), propionato de N-succinimidil-3-(-2-pirididitio), hexanoato de succinimidil 6(3(-(-2-pirididitio)-proprionamido), hexanoato de sulfosuccinimidil 6 (3 (-(-2-pirididitio),- propionamido) , hidrazida de 3- (2-pirididitio)-propionila, reagente de ElIman, ácido diclorotriazinico e S-(2- tiopiridil)-L-cisteína.
37. Conjugado, de acordo com a reivindicação 36, onde o ligador é um peptídeo ou um aminoácido.
38. Conjugado, de acordo com a reivindicação 37, onde o ligador é um ligador Ala-Met.
39. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-38, possuindo uma seqüência de aminoácidos estabelecida em qualquer SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54,56, 58, 60, 62, 64 ou 67.
40. Molécula de ácido nucléico, compreendendo uma seqüência de nucleotideos que codifica um conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 9-39.
41. Plasmideo compreendendo a molécula de ácido nucléico conforme a reivindicação 40.
42. Célula hospedeira, compreendendo o plasmídeo conforme a reivindicação 41.
43. Composição farmacêutica compreendendo uma concentração terapeuticamente eficaz ou quantidade de um conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 9-39 em um veículo farmaceuticamente aceitável
44. Uso de um conjugado para marcar como alvo uma toxina em uma célula, onde: o conjugado contém um polipeptídeo da toxina Shiga modificada conforme qualquer uma das reivindicações 1-8 e um agente alvo de receptor de superfície de célula; e a célula expressa o receptor de superfície da célula alvejada.
45. Uso de um conjugado para formulação de um medicamento para marcar como alvo uma toxina em uma célula, onde: o conjugado contém um polipeptídeo da toxina Shiga modificada conforme qualquer uma das reivindicações 1-8 e um agente alvo de receptor de superfície de célula; e a célula expressa o receptor de superfície da célula alvejada.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 43, para uso no tratamento de uma doença ou transtorno imune áu inflamatório.
47. Uso da composição conforme a reivindicação 43, para formulação de um medicamento para tratamento de uma doença ou transtorno imune ou inflamatório.
48. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9-39, para inibição de uma doença ou transtorno, onde a doença ou transtorno é uma condição imune ou inflamatória associada às respostas inflamatórias e/ou lesão secundária do tecido associada à ativação, proliferação e migração de uma ou mais células; o conjugado se liga a um ou mais receptores c^e superfície de célula expressos em uma ou mais células resultando na internalização do agente alvejado nas células portando o receptor; o conjugado inibe a ativação, proliferação ou migração de uma ou mais células.
49. Uso de um conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 9-39 para formulação de um medicamento para inibição de uma doença ou transtorno, onde a doença ou transtorno é uma condição imune ou inflamatória associada às respostas inflamatórias e/ou lesão secundária do tecido associada à ativação, proliferação e migração de uma ou mais células; o conjugado se liga a um ou mais receptores de superfície de célula expressos em uma ou mais células resultando na internalização do agente alvejado nas células portando o receptor; o conjugado inibe a ativação, proliferação ou migração de uma ou mais células.
50. Uso ou conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 44-49, onde o conjugado inibe a ativação, proliferação ou migração de uma ou mais células envolvidas em uma doença ou transtorno selecionado dentre lesão ao CNS (sistema nervoso central), doenças inflamatórias do CNS, transtornos neurodegenerativos, doença do coração, doenças inflamatórias oculares, doenças inflamatórias dos intestinos, doenças inflamatórias das articulações, doenças inflamatórias renais ou dos rins, doenças inflamatórias da pele, doenças inflamatórias pulmonares, doenças inflamatórias nasais, doenças inflamatórias sistêmicas, doenças inflamatórias e correlatas na obesidade, doenças inflamatórias da tireóide, respostas inflamatórias associadas às infecções bacterianas ou virais, cânceres, doença autoimune e doença mediada por angiogênese.
51. Uso ou conjugado, de acordo com a reivindicação 50, onde a doença ou transtorno se constitui em doenças inflamatórias do CNS e/ou transtornos neurodegenerativos que são selecionadas dentre acidente vascular, lesão de cabeça fechada, leucoencefalopatia, coriomeningite, meningite, adrenoleucodistrofia, demência complexa por AIDS, doença de Alzheimer, síndrome de Down, síndrome de fadiga crônica, encefalite, encefalomielite, encefalopatias espongiformes, esclerose múltipla, doença de Parkinson e lesão/trauma na medula espinal (SCI).
52. Uso ou conjugado, de acordo com a reivindicação 50, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória da pele selecionada dentre psoriase, eczema e dermatite ou é doença autoimune selecionada dentre rejeição de transplante e doença do enxerto versus hospedeiro.
53. Uso ou conjugado, de acordo com a reivindicação 50, onde a doença ou transtorno é doença do coração e é aterosclerose.
54. Uso ou conjugado, de acordo com a reivindicação 50, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória ocular que é selecionada dentre retinopatia diabética proliferativa, vitreoretinopatia proliferativa, retinite, esclerite, escleroirite, coroidite e uveíte.
55. Uso ou conjugado, de acordo com a ieivindicação 50, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória dos intestinos que é selecionada dentre colite crônica, doença de Crohn e colite ulcerativa.
56. Uso ou conjugado, de acordo com a reivindicação 50, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória das articulações que é selecionada dentre artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite reumatóide e espondilartropatias.
57. Uso ou conjugado, de acordo com a reivindicação 56, onde a doença ou transtorno é espondilartropatia que é selecionada dentre espondilite ancilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriática, espondilite, espondilartropatias não diferenciadas e síndrome de Behcet.
58. Uso ou conjugado, de acordo com a reivindicação 50, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória renal ou dos rins que é selecionada dentre glomerulonefrite, Nefropatia IgA e lúpus nefrite.
59. Método de seleção de uma proteína de inativação de ribossomo modificada (RIP), ou seu fragmento ativo que possui toxicidade reduzida, compreendendo: a) introdução de uma molécula de ácido nucléico codificando uma RIP ou seu fragmento ativo na(s) célula(s) hospedeira(s); b) crescimento das células; c) isolamento das células que crescem; d) dentre as células que crescem, isolamento de uma célula que cresce e expressa uma RIP ou seu fragmento ativo, pelo qual a RIP ou fragmento contém uma modificação, em comparação aquela codificada pela molécula de ácido nucléico que é introduzida na etapa a); e e) identificação, isolamento ou purificação da RIP modificada ou seu fragmento ativo, que é expresso na célula isolada.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, onde, na etapa b) , as células crescem em meio que não contém um inibidor de RIP r.
61. Método, de acordo com a reivindicação 6Ú, onde a RIP é uma toxina Shiga e o meio no qual as células crescem não contém um análogo da adenina.
62. Método, de acordo com a reivindicação 60, onde a RIP é uma toxina Shiga e o análogo da adenina é 4- aminopirazolo[3,4-d]pirimidina (4-APP).
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-62, compreendendo, adicionalmente: após a etapa c) ou d), expansão da célula isolada que expressa uma RIP.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-63, onde a RIP modificada é identificada por sua seqüência ou seu peso molecular ou por seqüenciamento.
65. Método, de acordo com a reivindicação 59, compreendendo, adicionalmente, crescimento das células na etapa b) na presença de um modulador seletivo.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, onde o modulador seletivo é um inibidor da RIP.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, onde o inibidor da RIP é um análogo da adenina.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, onde o análogo da adenina é 4-amino-pirazolo[3, 4- d] pirimidina (4-APP)
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66-68, onde a concentração do inibidor da RIP, análogo da adenina ou 4-APP não é tóxica às células hospedeiras.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66-69, onde a concentração do inibidor da RIP, análogo da adenina ou 4-APP inibe ou reduz toxicidade da RIP na célula hospedeira.
71. Método, de acordo com a reivindicação 59, onde a inibição ou redução da toxicidade é suficiente paia aumentar a quantidade de RIP expressa em comparação à ausência do inibidor da RIP, análogo da adenina ou 4-APP.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-71, onde a toxicidade da RIP é reduzida em pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100%.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68-72, onde a concentração de 4-APP é de cerca de ou é de 0,1 mM a cerca de ou de 5,0 mM.
74. Método, de acordo com qualquer uma dás reivindicações 68-73, onde a concentração de 4-APP está entre cerca de ou é de 0,1 a 2,3 ou 4 mM ou é de cerca de ou é de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mM.
75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68-7 4, onde a concentração de 4-APP é de cerca de ou é de 0,5 mM.
76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-75, onde a célula hospedeira é uma célula eucariótica.
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-75, onde a célula hospedeira é uma célula procariótica.
78. Método, de acordo com a reivindicação 7 6, onde a célula procariótica é E. coli.
79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-78, onde a RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida é uma RIP do tipo I ou seu fragmento ativo.
80. Método, de acordo com a reivindicação 7 9, onde a RIP é selecionada dentre diantina 30, diantina 32, licnina, saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-4, saporina-5, saporina-6, saporina-7, saporina-8, saporina-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, briodina II, clavina, colicina-1, colicina-2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, alfa-cirilowina, beta-cirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, Proteína Antivirál Mirabilis (MAP), MAP-30, alfa-momorcarina, beta- momorcarina, tricosantina, TAP-29, tricocirina, RIP I de cevada, RIP II de cevada, tritina, RIP de linho, RIP 3 de milho, RIP 9 de milho, RIP X de milho, asparina-1 e asparina 2.
81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-78, onde a RIP codificada pela molécula de ácido nucléico introduzida é uma RIP tipo II, süa subunidade catalítica ou seu fragmento ativo.
82. Método, de acordo com a reivindicação 81, onde a RIP é selecionada dentre toxina Shiga (Stx), toxina II tipo Shiga (Stx2), volkensina, ricina, nigrina-CIP-29, abrina, vircumina, modecina, ebulitina-a, ebulitina-β, ebultina-γ e porrectina.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, onde a RIP compreende subunidade A ou seu fragmento ativo.
84. Método, de acordo com a reivindicação 82, onde a toxina Shiga compreende subunidade Al (SAl) ou seu fragmento ativo ou consiste na subunidade Al ou seu fragmento ativo.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, onde a SAl é truncada.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, onde a SAl é truncada por deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos adjacentes no término C.
87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-86, onde a SAl é adicionalmente modificada por substituição de Cys por outro aminoácido.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, onde o aminoácido de substituição é Ser.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-88, compreendendo, adicionalmente: a) introdução de uma molécula de ácido nucléico codificando a RIP identificada ou seu fragmento ativo na(s) célula(s) hospedeira(s); b) incubação das células na presença de um inibidor da RIP, onde a quantidade de inibidor da RIP é selecionada para diminuir a toxicidade do polipeptídeo da RIP; e c) crescimento das células em condições, pelo qual a RIP ou seu fragmento ativo é produzido; e d) purificação da RIP da etapa c).
90. Método para aumentar a produção de uma proteína de inativação de ribossomo (RIP), ou seu fragmento ativo, compreendendo: a) introdução de um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma RIP, ou seu fragmento ativo, na(s) célula(s) hospedeira (s), onde a molécula de ácido nucléico que codifica a RIP compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando um ligante, pelo qual a molécula codifica um conjugado de ligante-toxina; b) incubação das células na presença de um inibidor da RIP, onde a quantidade de inibidor da RIP é selecionada para diminuir a toxicidade da RIP; e c) crescimento das células em condições, pelo qual a RIP ou seu fragmento ativo é produzido em uma quantidade superior em relação ao crescimento na ausência do inibidor da RIP.
91. Método, de acordo com a reivindicação 90, compreendendo, adicionalmente, purificação da RIP da etapa c), pelo qual a quantidade de RIP expressa ou purificada ou ambas é superior do que na ausência do inibidor da RIP.
92. Método, de acordo com a reivindicação 90 ou reivindicação 91, onde a RIP codificada pelo ácido nucléico introduzido é uma RIP do tipo I ou seu fragmento ativo
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, onde a RIP é selecionada dentre diantina 30, diantina 32, Iicnina, saporina-1, saporina-2, saporina-3, saporina-4, saporina-5, saporina-β, saporina-7, saporina-8, saporina-9, PAP, PAP II, PAP-R, PAP-S, PAP-C, mapalmina, dodecandrina, briodina-L, briodina, briodina II, clavina, colicina-1, colicina-2, lufina-A, lufina-B, lufina-S, 19K-PSI, 15K-PSI, 9K-PSI, alfa-cirilowina, beta-cirilowina, gelonina, momordina, momordina-II, momordina-Ic, Proteína Antiviral Mirabilis (MAP), MAP-30, alfa-momorcarina, beta- momorcarina, tricosantina, TAP-29, tricocirina, RIP I de cevada, RIP II de cevada, tritina, RIP de linho, RIP 3 de milho, RIP 9 de milho, RIP X de milho, asparina-1 e asparina 2.
94. Método, de acordo com a reivindicação 90 ou reivindicação 91, onde a RIP codificada pelo ácido nucléico introduzido é uma RIP tipo II, sua subunidade catalítica ou seu fragmento ativo.
95. Método, de acordo com a reivindicação 63, onde a RIP é selecionada dentre toxina Shiga (Stx), toxina II tipo Shiga (Stx2), toxina I tipo Shiga, volkensina, ricina, nigrina-CIP-29, abrina, vircumina, modecina, ebulitina-a, ebulitina-β, ebultina-γ e porrectina.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, onde a RIP compreende subunidade A ou seu fragmento ativo.
97. Método, de acordo com a reivindicação 95, onde a toxina Shiga compreende subunidade Al (SAl) ou seu fragmento ativo.
98. Método, de acordo com a reivindicação 97, onde a SAl é truncada.
99. Método, de acordo com a reivindicação 98, onde a SAl é truncada por deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos adjacentes no término C.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-78, onde a toxina é uma toxina shiga e o inibidor da RIP é um análogo da adenina.
101. Método, de acordo com a reivindicação 7 9, onde o análogo da adenina é 4-aminopirazolo [3,4- d]pirimidina (4-APP).
102. Método, de acordo com a reivindicação 90, 100 ou 101, onde a concentração do inibidor da RIP, análogo da adenina ou 4-APP é eficaz para diminuir a toxicidade da RIP a cerca de ou em 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
103. Método, de acordo com as reivindicações 101 ou 102, onde a concentração de 4-APP está entre cerca de ou é de 2,0 mM, 3,0 mM, 4,0 mM, 5,0 mM, 6,0 mM, 7,0 mM, 8,0 mM, 9,0 mM, 10,0 mM, 15,0 mM ou 2 0,0 mM.
104. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-103, onde as células hospedeiras são eucarióticas. ■
105. Método, de acordo com qualquer uma dais reivindicações 90-103, onde as células hospedeiras são procarióticas.
106. Método, de acordo com a reivindicação 105, onde as células hospedeiras são E. coli.
107. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-106, onde um polipeptídeo da RIP é expresso após indução com um agente de indução.
108. Método, de acordo com a reivindicação 107, onde o agente de indução é IPTG.
109. Método, de acordo com as reivindicações 107 ou 108, onde o inibidor da RIP é adicionado antes, durante e/ou após a adição do agente de indução.
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-109, onde: a RIP e o ligante são unidos através de um ligador; e o ligador é um peptídeo, polipeptídeo ou um aminoácido.
111. Método, de acordo com a reivindicação 93, onde o ligador é um ligador Ala-Met.
112. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-109, onde o conjugado de ligante-toxina é uma proteína de fusão.
113. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 110-112, onde o ligante no conjugado de ligante-toxina é selecionado dentre um agente alvo de receptor de quimiocina, uma citocina diferente de quimiocina, um hormônio, um fator de crescimento, um anticorpo específico para um receptor de superfície de célula, um ligante da superfamília de TNF e um ligante de receptor de reconhecimento padrão (PRR).
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, onde o fator de crescimento é um VEGF.
115. Método, de acordo com a reivindicação 113, onde o agente alvo de receptor de quimiocina é uma quimiocina ou um fragmento d d quimiocina que se liga ao receptor de quimiocina ou um anticorpo que se liga especificamente a um receptor de quimiocina ou um fragmento do anticorpo que se liga ao receptor.
116. Método, de acordo com a reivindicação 114, onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um fragmento específico de antígeno do mesmo.
117. Método, de acordo com a reivindicação 116, onde o anticorpo monoclonal é específico para um antígeno selecionado dentre (DARC), D6, CXCR-1, CXCR-2, CXCR-3A, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CCR-1, CCR-2A, CCR-2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CCR10, CX3CR-1 e XCRl.
118. Método, de acordo com a reivindicação 117, onde o anticorpo monoclonal é específico para um antígeno selecionado dentre CXCR-6 e CXCR-7.
119. Método, de acordo com a reivindicação 115, onde o agente alvo de receptor de quimiocina é uma quimiocina ou citocina.
120. Método, de acordo com a reivindicação 115, onde o agente alvo de receptor é uma quimiocina que é selecionada dentre proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-I), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5, proteína-1 quimiotática de eosinófilos (Eotaxina-I), Eotaxina-2, Eotaxina-3, fator-ΐβ derivado estromal (SDF-Ιβ), SDF-la, SDF-2, proteína Ia inibidora de macrófago (ΜΙΡ-Ια), ΜΙΡ-1β, ΜΙΡ-1γ, MIP-2, MIP-2a, ΜΙΡ-2β, MIP-3, ΜΙΡ-3β, MIP-3a, MIP- 4, MIP-5, Proteína Secretada e Expressa em Célula T Normal de Ativação Regulada (RANTES), interleucina-8 (IL-8), proteína α regulada de crescimento (GRO-α) , proteína 10 induzível por interferon (IP-10), quimiocina derivada de macrófago (MDC), proteína 2 quimiotática de granulócito (GCP-2), proteína 78 de ativação de neutrófilo derivada de epitélio (ENA-78), proteína básica de plaqueta (PBP), monocina induzida por gama interferon (MIG), fator 4 de plaqueta (PF-4), quimiocina I CC de hemofiltrado (HCC-I), quimiocina regulada por ativação e timo (TARC), linfotactina, lungcina, CIO, quimiocina expressa no fígado (LEC) , exodus-2 (SLC) , quimiocina expressa no timo (TECK), quimiocina atrativa da célula T cutânea (CTACK), quimiocina de epitélio associada às mucosas (MEC), motivo l-β simples C (SCM-Ιβ), célula T alfa quimioatrativa induzível por inferferon (I-TAC), quimiocina expressa na mama e rins (BRAK), fractalcina e quimiocina 1 atrativa a célula B (BCA-I) e suas variantes de espécies ou variantes alélicas.
121. Método, de acordo com a reivindicação 119 ou reivindicação 120, onde a quimiocina é selecionada dentre MCP-I, Eotaxina-I, SDF-Ιβ, GRO-a, MIP-Ιβ, IL-8, IP-10, MCP- .3, ΜΙΡ-3α, MDC, ΜΙΡ-Ια, e BCA-I e suas variantes de espécies ou variantes alélicas.
122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 119-121, onde a quimiocina é MCP-I.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-122, onde RIP é uma toxina Shiga modificada ou seu fragmento ativo que inclui uma modificação.
124. Método, de acordo com a reivindicação 106, onde a toxina Shiga compreende a subunidade Al (SAl).
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-125, onde o conjugado de ligante-toxina compreende a seqüência de resíduos de aminoácidos estabelecida em qualquer uma dentre SEQ ID NO: 42, 44, 46,48, 50, 52, 54, S6, 58 , 60, 62, 64 ou 67.
126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90-125, onde o conjugado de ligante-toxina é codificado por uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência estabelecida em qualquer uma dentre SEQ ID NO: 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 ou 66.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-89, compreendendo, adicionalmente, preparação de um conjugado contendo a RIP identificada.
128. Método para marcar como alvo uma toxina em uma célula, compreendendo administração de um conjugado, onde: o conjugado contém um polipeptídeo da toxina Shiga modificada conforme qualquer uma das reivindicações 1-8 e um agente alvo de receptor de superfície de célula; e a célula expressa o receptor de superfície de célula alvejada.
129. Método para tratamento de uma doença ou transtorno imune ou inflamatório, compreendendo administração da composição conforme a reivindicação 43, onde a composição inibe a proliferação, migração ou atividade fisiológica das células inflamatórias de promoção de lesão secundária de tecido.
130. Método para inibir uma doença ou transtorno, compreendendo administração de um conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 9-39 a um animal onde: a doença ou transtorno é uma condição imune ou inflamatória associada às respostas inflamatórias e/ou lesão secundária do tecido associada à ativação, proliferação e migração de uma ou mais células; o conjugado se liga a um ou mais receptores de superfície de célula expressos em uma ou mais células resultando na intemalização do agente alvejado nas células portando o receptor; e o conjugado inibe a ativação, proliferação ou migração de uma ou mais células.
131. Método, de acordo com a reivindicação 130, onde uma ou mais células constituem uma célula efetora imune, ou outra célula associada à condição imune ou inflamatória.
132. Método, de acordo com a reivindicação 131, onde a célula efetora imune é um leucócito.
133. Método, de acordo com a reivindicação 131, onde uma ou mais células constituem outra célula associada à condição imune ou inflamatória e constituem células residentes de tecido (TRC).
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131-133, onde uma ou mais células são células efetoras imunes selecionadas dentre monócitos, macrófagos, células dendríticas, células T, células B, eosinófilos, basófilos, mastócitos, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos.
135. Método, de acordo com a reivindicação 134, onde uma ou mais células são macrófagos que são macrófagos de tecido selecionados dentre macrófagos alveolares, micróglia e células de Kupfer.
136. Método, de acordo com a reivindicação 134, onde uma ou mais células são células dendriticas que são selecionadas dentre células dendriticas imaturas, células dendríticas maduras e células de Langerhans.
137. Método, de acordo com a reivindicação 134, onde uma ou mais células são células T que são selecionadas dentre células T CD4+ e CD8+.
138. Método, de acordo com a reivindicação 137, onde as células são células T CD4+ que são células Thl ou Th2.
139. Método, de acordo com a reivindicação 133, onde as TRC são selecionadas dentre células mesangiais, células gliais, células epiteliais, células tumoraiá, fibroblastos e sinoviócitos.
140. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131-139, onde uma ou mais células são ativadas.
141. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131-140, onde o animal é um mamífero.
142. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131-140, onde o animal é um ser humano.
143. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131-140, onde o conjugado inibe a ativação, proliferação ou migração de uma ou mais células envolvidos em uma doença ou transtorno selecionada dentre lesão ao CNS (sistema nervoso central), doenças inflamatórias do CNS, transtornos neurodegenerativos, doença do coração, doenças inflamatórias oculares, doenças inflamatórias dos intestinos, doenças inflamatórias das articulações, doenças inflamatórias renais ou dos rins, doenças inflamatórias da pele, doenças inflamatórias pulmonares, doenças inflamatórias nasais, doenças inflamatórias sistêmicas, doenças inflamatórias e correlatas na obesidade, doenças inflamatórias da tireóide, respostas inflamatórias associadas às infecções bacterianas ou virais, cânceres, doença autoimune e doença mediada por angiogênese.
144. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno se constitui em doenças inflamatórias do CNS e/ou transtornos neurodegenerativos e é selecionado dentre acidente vascular, lesão de cabeça fechada, leucoencefalopatia, coriomeningite, meningite, adrenoleucodistrofia, demência complexa por AIDS, doença de Alzheimer, sindrome de Down, síndrome de fadiga crônica, encefalite, encefalomielite, encefalopatias espongiformes, esclerose múltipla, doença de Parkinson e lesão/trauma ria medula espinal (SCI).
145. Método, de acordo com a reivindicação 14 3, onde a doença ou transtorno é doença do coração e é aterosclerose.
146. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória ocular que é selecionada dentre retinopatia diabética proliferativa, vitreoretinopatia proliferativa, retinitei, esclerite, escleroirite, coroidite e uveíte. ;
147. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória dos intestinos que é selecionada dentre colite crônica, doença de Crohn e colite ulcerativa.
148. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória das articulações que é selecionada dentre artrite reumatóide juvenil, osteoartrite, artrite reumatóide e espondilartropatias.
149. Método, de acordo com a reivindicação 148, onde a doença inflamatória das articulações é espondilartropatia que é selecionada dentre espondilite ancilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriática, espondilite, espondilartropatias não diferenciadas e síndrome de Behcet.
150. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória renal ou dos rins que é selecionada dentre glomerulonefrite, nefropatia IgA e lúpus nefrite.
151. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória pulmonar que é selecionada dentre síndrome de angústia respiratória aguda, doença eosinofílica pulmonar, pneumonia eosinofílica crônica, pneumonia eosinofílica aguda, broncoconstrição, displasia broncopulmonar, eosinofilia broncoalveolar, doenças broncopulmonares alérgicas, aspergilose, pneumonia e doença pulmonar fibrótica.
152. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória nasal que é selecionada dentre polipose, sinusite e rinite.
153. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é doença inflamatória da tireóide que é tireoidite.
154. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é um câncer que é selecionado dentre gliomas, ateromas carcinomas, adenocarcinomas, granulomas, glioblastomas, granulomatose, linfomas, leucemias, cânceres pulmonares, melanomas, mielomas, sarcomas, sarcoidose, microgliomas, meningiomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, câncer gástrico ou do estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer coloretal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal ou dos rins, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma do pênis e câncer da cabeça e pescoço.
155. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde a doença ou transtorno é selecionado dentre doença renal, lesão a medula espinal e hipersensibilidade do tipo retardado.
156. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 130-155, onde o agente alvo do conjugado é selecionado dentre MCP-1, Eotaxina-1, SDF-Ιβ, GRO-α, MIP- 1β, IL-8, IP-10, MCP-3, MIP-3a, MDC, MIP-Ia, e BCA-I e suas variantes de espécies ou variantes alélicas, e o agente alvejado é uma toxina Shiga modificada ou seu fragmento ativo.
157. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 130-156, onde o agente alvo é MCP-1.
158. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 130-157, onde o conjugado é selecionado dentre LPMlc, LPMld, LPM2, LPM3, LPM4, LPM5, LPM6, LPM7, LPM8, LPM9, LPMlO e LPMll.
159. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 130-143, onde o agente alvo do conjugado é PF-4 ou suas variantes de espécies ou variantes alélicas, e a doença ou condição é uma doença mediada por angiogênese.
160. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 130-143, onde o agente alvo do conjugado é um VEGF ou suas variantes de espécies ou variantes alélicas e a doença ou condição é uma doença mediada por angiogênese.
161. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 130-144, onde o conjugado marca como alvo células envolvidas na etiologia ou patologia de MS.
162. Método, de acordo com a reivindicação 161, onde a células expressam receptores selecionados dentre um ou mais de CCL1-8, CXCL8-13, CCRl-3,5, 6 e CXCRl-3,4.
163. Método, de acordo com a reivindicação 161 ou reivindicação 162, onde o(s) conjugado(s) marca(m) como alvo, pelo menos, dois receptores selecionados dentre CCLl-8,CXCL8-13, CCRl-3,5,6 e CXCRl-3,4.
164. Método, de acordo com a reivindicação 161 ou reivindicação 162, onde: o conjugado compreende uma quimiocina ou seu fragmento suficiente para ligação e internalização por um receptor para o mesmo; e a quimiocina é selecionada dentre 1-309, MCP-1, MIP-Ia, MIP-Ιβ, RANTES, MCP-3, MCP-2, IL-8, MIG, IP-10, I- TAC, SDF-la, SDF-Ιβ, BCA-1, uma Eotaxina, MCP-4, MCP-5, CIO, LEC e MIP-lb2.
165. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 161-164, onde o conjugado é LPM7 ou LPMld.
166. Método, de acordo com a reivindicação 143, onde as doenças são doenças inflamatórias da pele selecionadas dentre psoríase, eczema e dermatite ou são doenças autoimunes selecionadas dentre rejeição de transplante e doença do enxerto versus hospedeiro.
167. Método, de acordo com qualquer uma dás reivindicações 59-89, onde a toxina é uma subunidade Al da toxina Shiga (SAl) ..
168. Método, de acordo com a reivindicação 167, onde a SAl compreende a seqüência de resíduos de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 24.
169. Método, de acordo com a reivindicação 167, onde a SAl é codificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23.
170. Método, de acordo com a reivindicação 101 ou 102, onde a concentração de 4-APP é de cerca de ou é de 1 mM a cerca de ou de 40,0 mM.
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