BRPI0720841A2 - Anticorpos para cd200r - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS PARA CD200R".

Referência a Pedidos Cruzados Relacionados

Este pedido reivindica o benefício de prioridade sob 35 USC 119(e) de pedido de patente provisório US número de série.: 60/876.618 de- positado em 22 de dezembro de 2006, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se geralmente a compostos de liga- ção específicos para CD200R inibitório humano e usos dos mesmos. Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos que reconhecem o CD200R inibitório humano (receptor de CD200) e modulam sua atividade, particularmente em distúrbios inflamatórios e autoimunes .

Antecedentes da Invenção

O sistema imune funciona para proteger indivíduos de agentes infectivos, por exemplo, bactérias, organismos multicelulares, e vírus, assim como de câncer. Este sistema inclui vários tipos de células Iinfoides e mie- loides, como os monócitos, macrófagos, células dendríticas (DCs), eosinófi- los, células T, células B, e neutrófilos. Estas células Iinfoides e mieloides com frequência produzem proteínas de sinalização conhecidas como citoci- nas. A resposta imune inclui inflamação, isto é, o acúmulo de células imunes sistemicamente ou em um local particular do corpo. Em resposta a um agen- te infectivo ou substância estranha, as células imunes secretam citocinas que, por sua vez, modulam proliferação de células imunes, desenvolvimento, diferenciação, ou migração. A resposta imune pode produzir conseqüências patológicas, por exemplo, quando ela envolve inflamação excessiva, como nos distúrbios autoimunes (ver, por exemplo, Abbas et aí. (eds.) (2000) Celu- lar and Molecular Imunology, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA; Oppe- nheim e Feldmann (eds.) (2001) Citocine Reference, Academic Press, San Diego, CA; von Andrian e Mackay (2000) New Engi J. Med. 343:1020-1034; Davidson e Diamond (2001) New Engl. J. Med. 345:340-350).

As células mieloides (isto é, macrófagos, células dendríticas (DC), neutrófilos, células-tronco, e eosinófilos) desempenham papéis impor- tantes na manutenção de inflamação crônica (Kinne, R. W., et al (2000) Artri- te Res. 2:189-202; Kiefer, R. B. et al (2001) Progr. Neurobiol. 64:109-127; 0’Shea, J. J. et al (2002) Nat. Rev. Imunol. 2:37-45; Hamid1 Q. et al (2003) J.

Alergic Clin. Imunol. 111: S5-S12; Liu1 H. et al (2004) Rheum Dis. Clin. North Am. 30:19-39). Elas podem ser reguladas através de interações célula-célula que disparam conjuntos em correspondência de ativação em receptores ini- bitórios, além de serem reguladas por fatores secretados (Barclay, A.N. et al

(2002) Trends in Imunol. 23: 285-290). A regulação de atividade de células

mieloides por contato célula-célula direto permite um controle mais localiza- do do que mediado por citocinas. A interação CD200-CD200R também pro- vê uma interação regulatória de contato célula-célula para células mieloides. A glicoproteína amplamente expressada CD200 está intimamente relaciona- da estruturalmente às moléculas co-estimulatórias de células T CD80 e

CD86 e é geneticamente ligada às mesmas no cromossomo humano 3 e cromossomo camundongo 16 (McCaughan, G. W. (1987) Imunogenetics 25::133-135; Borriello, F. et al (1998) Mamm. Genome 9:114-118). Estrutu- ralmente, CD200 contém dois domínios de superfamília Ig (IgSF) em um ar- ranjo V/C2 típico (Clark, M.J. et al (1985) EMBO J 4:113-118).

O CD200R é expressado na superfície de células mieloides hu-

manas e de camundongo, como macrófagos, DCs1 neutrófilos, e células- tronco, e também em células T (Wright, G. J. et al (2000) Immunity 12:233- 242; Wright, G. J. et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046). CD200R é estrutu- ralmente relacionada com CD200, localizado no mesmo cromossomo, os

genes provavelmente evolvidos por duplicação de genes (Wright, G. J. et al

(2003) J. Imunol 171:3034-3046). No entanto, CD200R é distinto de CD200 e mostra uma causa citoplásmica mais longa contendo três resíduos de tiro- sina conservados, um dos quais está contido em um motivo NPXY (Wright, G. J. et al (2000) Immunity 12:233-242; Wright, G. J. et al (2003) J. Imunol

171:3034-3046). Quando da ligação de anticorpo ligando ou agonista,, CD200R é fosforilado sobre a tirosina do motivo NPXY e subsequentemente liga as proteínas adaptadoras Dokl e Dok2. Fosforilação destas proteínas adaptadoras recruta SHIP e RasGAP1 que subsequentemente inibe as vias de ativação Ras/MAPK (Zhang, S. et al. 2004, J. Imunol. 173:6786-6793).

O receptor CD200 (CD200R) foi agora clonado a partir de várias espécies, incluindo ratos, camundongos, humanos e vários primatas não humanos. CD200R está localizado em cromossomo humano 3q12-13 e em cromossomo camundongo 16 e ambos CD200R humano e camundongo mostrando graus elevados de similaridades em seqüência e estrutura (Wri- ght, G. J. et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046). Além de CD200R, quatro genes relacionados foram identificados no camundongo (Wright, G. J. et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046). Estes genes foram chamados CD200RL (tipo CD200R), e foram mostrados estar associados com a proteína adapta- dora ativante, DAP12 (Lanier, L.L. (1998) Nature 39::703). DAP12 é requeri- do para expressão na superfície da célula destes receptores e para a trans- dução de sinal. Dap12 é uma proteína adaptadora ativante potente que con- tém um motivo de ativação com base em tirosina imune clássico (ITAM), e assim os genes CD200RL de camundongo são genes ativantes mieloides. As células-tronco de camundongo expressam estes receptores CD200RL ativantes e elas podem ser disparadas usando anticorpos específicos do receptor para gerar respostas de desgranulação potentes similares em mag- nitude às observadas com ativação de Fc^RI. Apesar destes genes de membro da família CD200R terem sido chamados de tipo CD200R com base na homologia de seqüência para o domínio extracelular de CD200R, eles não ligam CD200 e atualmente o(s) ligante(s) para estes receptores adicio- nais permanecem desconhecidos Hatherly D. et al (2005) J Imunol 175(4):2469-74). Além disso, algumas cepas exogâmicas de camundongos expressam CD200RLe, um membro da família CD200R com homologia para CD200R (Hatherly D. et al (2005) Journal of Imunology 175: 2469-2474). Em contrastes com a família CD200R de camundongo, o genoma humano mos- trou somente dois membros da família CD200R: CD200R e CD200RLa (Wri- ght, G. J. et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046)

Existe a necessidade para agonistas do CD200R inibitório hu- mano, como anticorpos monoclonais inibitórios CD200R anti-humanos, para uso no tratamento de distúrbios humanos, com distúrbios inflamatórios ou autoimunes . Estes agonistas irão preferivelmente demonstrar uma baixa imunogenicidade em indivíduos humanos, permitindo a administração repe- tida sem respostas imunes adversas.

5 Sumário da Invenção

A presente invenção geralmente provê compostos de ligação específicos para CD200R inibitório humano e usos dos mesmos. Mais espe- cificamente, a invenção provê anticorpos que especificamente reconhecem o CD200R inibitório humano e tendo uma ou mais propriedades desejáveis, 10 incluindo atividades agonistas, afinidades de ligação elevadas, boa farmaco- cinética e baixa antigenicidade em indivíduos humanos. A invenção também provê métodos de uso dos anticorpos da presente invenção no tratamento de doenças.

Assim, em uma modalidade a presente invenção provê um com- posto de ligação, por exemplo, uma molécula de anticorpo ou fragmento de ligação da mesma, que especificamente liga o receptor CD200R inibitório humano e ativa o CD200R inibitório humano. Em algumas modalidades, o composto de ligação compreende pelo menos um domínio variável de ca- deia leve (Vl) de anticorpo e pelo menos um domínio variável de cadeia pe- sada (Vh) de anticorpo, ou fragmentos de ligação destes domínios, em que o domínio Vl compreende pelo menos um número especificado de regiões de determinação de complementaridade (CDRs) tendo uma seqüência selecio- nada dentre SEQ ID N-: 1-18, e o domínio Vh compreende pelo menos um número especificado de CDRs tendo uma seqüência selecionada dentre SEQ ID N-: 19-36, em que o número especificado é um, dois ou três. O nú- mero especificado de CDRs pode ser igual ou diferente para os domínios variáveis de cadeia leve e pesada em qualquer dado composto de ligação. Em outra modalidade, os CDRs de domínio Vl são selecionados dentre SEQ ID N-: 1, 2 e 3. Em ainda outra modalidade, os CDRs de domínio Vh são selecionados dentre SEQ ID N-: 19, 20 e 21. Em outra modalidade os CDRs de domínio Vl são selecionados dentre RASKNIRSYLA (SEQ ID N0 55), SEQ ID N0: 2 e SEQ ID N0: 3 e os CDRs de domínio Vh são selecionados dentre SEQ ID N-: 19, 20 e 21. Em outra modalidade, os CDRs de domínio Vl são selecionados dentre SEQ ID N-: 16, 17 e 18 e os CDRs de domínio Vh são selecionados dentre SEQ ID N-: 34, 35 e 36. Em uma outra modali- dade, as seqüências dos domínios Vl e Vh são as seqüências de SEQ ID 5 N-: 42 e 48, respectivamente. Em ainda uma outra modalidade as seqüên- cias dos domínios Vl e Vh são as seqüências de SEQ ID N-: 56 e 57 res- pectivamente (ver figura 9). Em uma modalidade preferida, o composto de ligação CD200R ativa a atividade inibitória do receptor CD200R inibitório humano.

Em outras modalidades, o composto de ligação compreende pe-

lo menos um domínio Vl e pelo menos um domínio VH, ou fragmentos de ligação destes domínios, em que o domínio Vl compreende um, dois ou três CDRs tendo uma seqüência selecionada dentre SEQ ID N-: 1-18, e o domí- nio Vh compreende um, dois ou três CDRs tendo uma seqüência seleciona- 15 da dentre SEQ ID N-: 19-36. Em outra modalidade, a seqüência dos domí- nios Vl e Vh são as seqüências de SEQ ID N-: 42 e 48, respectivamente. Em ainda uma outra modalidade as seqüências dos domínios Vl e Vh são as seqüências de SEQ ID N-: 56 e 57 respectivamente. Em outra modalidade, o composto de ligação tem os mesmos CDRs que o anticorpo codificado 20 pelo vetor de expressão depositado junto ao American Tissue CuIture Col- Iection (ATCC) (Manassas, VA USA) em 6 de dezembro de 2006 e tendo N0 de Acesso ATCC PTA-8067. Em outra modalidade, o composto de ligação tem os mesmos CDRs como o anticorpo produzido a partir do hibridoma

tendo N0 de Acesso ATCC_, depositado como cepa

HC809.14F12.6.DX248.3 em dezembro_, 2007.

Em uma outra modalidade, o composto de ligação compreende pelo menos um domínio Vl e pelo menos um domínio VH, ou fragmentos de ligação destes domínios, em que o domínio Vl compreende um, dois ou três CDRs tendo uma seqüência selecionada dentre SEQ ID N-: 37-42, e o do- 30 mínio Vh compreende um, dois ou três CDRs tendo uma seqüência selecio- nada dentre SEQ ID N25: 43-48.

Em várias outras modalidades, a presente invenção provê um composto de ligação que liga a CD200R inibitório humano que tem domínios Vl e Vh com pelo menos 95%, 90%. 85%, 80%, 75% ou 50% de homologia de seqüência com as seqüências de SEQ ID N-: 42 e 48, respectivamente. Em outras modalidades, a presente invenção provê um composto de ligação 5 que liga a CD200R inibitório humano que tem domínios Vl e Vh com pelo menos 95%, 90%. 85%, 80%, 75% ou 50% de homologia de seqüência com as seqüências de SEQ ID N-: 56 e 57, respectivamente. Em outras modali- dades o composto de ligação da presente invenção compreende domínios Vl e Vh tendo até 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de ami- 10 noácidos conservativas com referência às seqüências de SEQ ID N-: 42 e 48, respectivamente. Em outra modalidade, o composto de ligação da pre- sente invenção é um anticorpo tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada com até 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de aminoácidos conservativas com referência às seqüências de SEQ ID N-: 49 e 50, respec- 15 tivamente. Em outra modalidade, o composto de ligação da presente inven- ção é um anticorpo tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada com até 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de aminoácidos conservati- vas com referência às seqüências de SEQ ID N-: 56 e 57, respectivamente.

Em uma modalidade, o composto de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, por exemplo, um anticorpo fragmento sele- cionado dentre o grupo consistindo de Fab, Fab’, Fab’-SH, Fv, scFv, F(ab’)2, e um diacorpo. Em uma modalidade, o composto de ligação da presente in- venção é anticorpo huDX182 compreendendo uma cadeia leve tendo uma seqüência de SEQ ID N0: 49 e uma cadeia pesada tendo uma seqüência de SEQ ID N0: 50. Em outra modalidade, o composto de ligação é o anticorpo maduro produzido a partir do vetor de expressão tendo N0 de Acesso ATCC PTA-8067 (huDX182 com seqüência de sinal em plasmídeo pACD200RV1) depositado 6 de dezembro de 2006 com ATCC (Manassas, VA USA). Em outra modalidade, o composto de ligação tem os mesmos CDRs como o anticorpo produzido a partir do hibridoma tendo N0 de Acesso

ATCC_, depositado como cepa HC809.14F12.6.DX248.3 em

de dezembro de 2007. Em uma modalidade, o composto de ligação da presente inven- ção compreende uma região constante de cadeia pesada, por exemplo uma região constante humana, como γ1, γ2, γ3, ou γ4 região constante humana de cadeia pesada ou uma variante da mesma. Em outra modalidade, o com- 5 posto de ligação compreende uma região constante de cadeia leve, por e- xemplo uma região constante de cadeia leve humana, como região de ca- deia leve humana Iambda ou kappa ou variante da mesma.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a ácido nucleico iso- lado, por exemplo DNA, codificando um composto de ligação da presente invenção, por exemplo um anticorpo (ou fragmento de ligação do mesmo) que liga a CD200R inibitório humano. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica um composto de ligação compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia leve (Vl) de anticorpo e pelo menos um domínio variável de cadeia pesada (Vh) de anticorpo, ou fragmentos de ligação des- tes domínios, em que o domínio Vl compreende pelo menos um número es- pecificado de regiões de determinação de complementaridade (CDRs) tendo uma seqüência selecionada dentre SEQ ID N-: 1-18, e o domínio Vh com- preende pelo menos um número especificado de CDRs tendo uma seqüên- cia selecionada dentre SEQ ID N-: 19-36 em que o número especificado é um, dois ou três.

Em outra modalidade, o ácido nucleico isolado codifica as se- qüências de região variável de cadeia leve e pesada de SEQ ID N-: 42 e 48, respectivamente. Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico isolado codi- fica anticorpo huDX182 compreendendo uma cadeia leve tendo uma se- 25 quência de SEQ ID N0: 49 e uma cadeia pesada tendo uma seqüência de SEQ ID N0: 50. Em outra modalidade, o ácido nucleico isolado codifica as seqüências de região variável de cadeia leve e pesada de SEQ ID N-: 41 e 47, respectivamente. Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico isolado codifica um anticorpo huDX248 compreendendo uma cadeia leve tendo uma 30 seqüência de SEQ ID N0: 56 e uma cadeia pesada tendo uma seqüência de SEQ ID N0: 57. Em algumas modalidades o ácido nucleico isolado codifica tanto uma cadeia leve como uma cadeia pesada em uma molécula de ácido nucleico única, e em outras modalidades as cadeias leve e pesada são codi- ficadas em duas ou mais moléculas separadas de ácido nucléico. Em outra modalidade os ácidos nucléicos ainda codificam uma seqüência de sinal. Em uma modalidade os ácidos nucléicos são SEQ ID NOS. 52 e 54.

5 Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a vetores

de expressão compreendendo os ácidos nucléicos isolados da invenção, em que o ácido nucleico é operativamente ligado a seqüências de controle que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedeira é transfectada com o vetor. Em uma modalidade, o vetor de expressão tem N0 10 de Acesso ATCC PTA-8067 (huDX182 em plasmídeo com seqüência de si- nal em plasmídeo pACD200RV1) depositado em 6 de dezembro de 2006 com ATCC (Manassas, VA USA). Em outra modalidade, o composto de liga- ção tem os mesmos CDRs como o anticorpo produzido a partir do hibridoma

tendo N0 de Acesso ATCC_, depositado como cepa

HC809.14F12.6.DX248.3 em_dezembro de 2007.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a uma célula hospe- deira compreendendo um vetor de expressão da presente invenção. A in- venção ainda refere-se a métodos de produzir um composto de ligação da presente invenção compreendendo cultivar a célula hospedeira abrigando 20 um vetor de expressão codificando o composto de ligação no meio de cultu- ra, e isolando o composto de ligação da célula hospedeira ou meio de cultu- ra.

A invenção refere-se também a compostos de ligação, como an- ticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos, que ligam ao mesmo epíto- 25 po em receptor CD200R inibitório humano como anticorpos huDX182, DX182, DX185, DX 178, DX184 ou DX248, por exemplo anticorpos que são capazes de bloquear de modo cruzado a ligação de qualquer um destes an- ticorpos da presente invenção.

A invenção refere-se a compostos de ligação, como anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos, que são específicos para CD200R inibitório humano e capazes de ativar as atividades inibitórias do CD200R inibitório humano e tem constantes de dissociação de equilíbrio (Kd) de 1000, 500, 100, 50, 20, 10, 5, 2 pM ou menos (isto é, maior afinidade). Esta invenção refere-se também a compostos de ligação, como anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos, que são específicos para CD200R inibi- tório humano e que inibem a desgranulação de células-tronco com um IC50 5 de 5000, 2000, 1000, 500 pM em um teste de desgranulação de células - tronco.

A invenção refere-se também a métodos de tratamento de indi- víduos, incluindo indivíduos humanos, em necessidade de tratamento com os compostos de ligação de CD200R inibitório humano da presente inven- ção. Estes indivíduos podem ter um distúrbio inflamatório ou autoimune, co- mo artrite reumatoide (RA), osteoartrite, artrite reumatoide, osteoporose, fi- brose inflamatória (por exemplo, escleroderma, fibrose do pulmão, e cirrose), distúrbios de intestino inflamatório (por exemplo, Doença de Crohn, colite ulcerativa e doença de intestino inflamatório), asma (incluindo asma alérgi- ca), alergias, COPD, esclerose múltipla, psoríase, uveite e câncer. Estes métodos de tratamento ainda podem compreender a administração de um ou mais adicionais agentes terapêuticos, como agentes imunossupressivos ou agentes anti-inflamatório. A título de exemplo, e não limitação, RA, psorí- ase, asma, e alergia e uveite são tratados pelos métodos descritos aqui. Em uma modalidade particularmente preferida, asma e alergia são tratados pe- los métodos descritos aqui.

Em uma outra modalidade, a invenção provê métodos de trata- mento compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamen- te eficaz quantidade de um anticorpo para CD200R inibitório anti-humano ou 25 fragmento de ligação em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos. A título de exemplo, e não limitação, um ou mais agentes tera- pêuticos incluem IL-23, IL-1 β, IL-6 e TGF-β (ver, por exemplo, Veldhoen (2006) Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat Rev. Imunol. 6(4):329-333) ou uma combinação. Em várias modalidades, um ou mais outros agentes 30 terapêuticos são administrados antes, concorrentemente com, ou após o anticorpo para CD200R inibitório anti-humano ou fragmento.

A invenção refere-se também a composições e formulações dos compostos de ligação da presente invenção, compreendendo o composto de ligação e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, e opcional- mente um ou mais agentes imunossupressivos ou anti-inflamatórios.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1 mostra alinhamentos dos domínios variáveis de cadeia

leve para os anticorpos anti-humano de rato CD200R DX182 (SEQ ID N0 37), DX185 (SEQ ID N0: 38), DX178 (SEQ ID N0: 39), DX184 (SEQ ID N0 40), e o anticorpo anti-humano de rato humanizado CD200R (SEQ ID N0 42). DX248 é um CD200R inibitório anticino de camundongo (SEQ ID N0 10 41). CDRs são indicados. Numeração é de acordo com Kabat et al. (1991) "Sequences of Proteins of Imunological Interest", U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242, 5a., Ed., referido aqui como “Kabat et al. (1991)”.

Figura 2 mostra alinhamentos dos domínios variáveis de cadeia 15 pesada para os anticorpos CD200R anti- humano de rato DX182 (SEQ ID N0: 43), DX185 (SEQ ID N0: 44), DX178 (SEQ ID N0: 45), DX184 (SEQ ID N0: 46), e anticorpo anti- humano de rato humanizado CD200R (SEQ ID N0: 48). DX248 é um CD200R inibitório anticino de camundongo (SEQ ID N0: 47). CDRs são indicados. Numeração é de acordo com Kabat et al. (1991).

Figura 3 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID N0: 49) da

cadeia leve de anticorpo para CD200R inibitório anti-humano humanizado (huDX182).

Figura 4 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID N0: 50) da cadeia pesada de do anticorpo para CD200R inibitório anti-humano humani- zado (huDX182).

Figura 5A e 5B mostram uma seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N°: 52) codificando um peptídeo de sinal e a cadeia leve do anticorpo pa- ra CD200R inibitório anti-humano humanizado (huDX182).

Figuras 6A, 6B e 6C mostram uma seqüência de ácido nucleico (SEQ ID N0: 54) codificando um peptídeo de sinal e a cadeia leve do anticor- po para CD200R inibitório anti-humano humanizado (huDX182).

Figura 7 mostra os efeitos dos anticorpos CD200R anti-humanos DX176, DX177, DX178, DX182 e DX184 em um teste de desgranulação de células-tronco.

Figura 8 mostra os efeitos do anticorpo CD200R anti-humano humanizado (huDX182) em um teste de desgranulação de células-tronco e a ligação de huDX182.

Figura 9 ilustra seqüências para um domínio variável pesado (SEQ ID N0: 57) e leve (SEQ ID N0: 56) para um DX248 humanizado.

Figuras 10A e 10B mostram os efeitos de anticorpos CD200R anticino de camundongo DX248 e DX182 em um teste de desgranulação de células-tronco e a ligação de anticorpo CD200R anticino de camundongo e DX182.

Figura 11 mostra expressão de CD200R em células-tronco de cinomolgo cultivadas usando DX182 (anti-huCD200R). As células-tronco de cinomolgo cultivadas, derivadas de sangue periférico foram coloridas com 15 anticorpo de controle, DX49 (controle de isotipo para um estudo in vivo), CD117 (receptor de fator de células- tronco), DX182 (anti-huCD200R) e DX80 (FceRI).

Figura 12 mostra que DX182 a desgranulação induzida por célu- la-tronco de cinomolgo cultivada FcsRI. As células-tronco de cinomolgo cul- 20 tivadas foram incubadas com anticorpo de controle de isotipo, DX49 ou anti- corpo anti-huCD200R, DX182 e então disparadas com um anticorpo anti- FceRI para induzir a desgranulação. Em um modo dependente de dose, DX182 inibiu a desgranulação de células-tronco induzidas disparando o re- ceptor FceRI.

Figura 13 mostra o alinhamento de seqüência de aminoácido de

genes CD200R e CD200RLa de humanos e primata não humano. Os dia- mantes indicam a posição de resíduos de cisteína em domínio extracelular que são importantes para a expressão na superfície das células dos recepto- res.

Figura 14 mostra que DX182 liga a CD200RLa de cinomolgo.

CD200RLa de cinomolgo foi clonado e transfectado em células-tronco de camundongo ou células Baf/3 de camundongo contendo Dap12 humano. Estes transfectantes foram então coloridos com anticorpo de controle de iso- tipo ou DX182 (anti-huCD200R). Ambos os transfectantes mostraram forte coloração com o anticorpo DX182 indicando que DX182 era capaz de reco- nhecer CD200RLa de cinomolgo.

Figura 15 mostra cynoCD200RLa é uma cadeia de polipeptídeo

única que faz par com Dap 12. As células-tronco de camundongo transfecta- do com CD200RLa de cinomolgo foram imunoprecipitadas com anticorpo de controle ou DX182. DX182 imunoprecipitou CD200RLa de cinomolgo a partir destes transfectantes. Western blotting para Dap12 mostra que CD200RLa de cinomolgo é associado com esta promotor adaptadora de sinal.

Figura 16 mostra DX182 induz a desgranulação de células- tronco de camundongo expressando CD200RLa de cinomolgo. As células- tronco de camundongo transfectados com CD200RLa de cinomolgo foram incubadas com DX182 e testadas para desgranulação de células-tronco. DX182 induziu uma desgranulação potente de células-tronco.

Descrição Detalhada

I. Definições

Para que a invenção seja mais prontamente entendida, alguns termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. Salvo 20 especificamente descrito em contrário em algum ponto neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados aqui tem o significado comumente entendido por um versado na técnica à qual a invenção perten- ce.

Como usado aqui, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares de palavras como "o" , “a,” e "um", "uma" incluem suas referên- cias em plural correspondentes salvo se o contexto claramente ditar de outra forma.

"Ativação,” “estimulação,” e “tratamento,” como se aplica a célu- las ou a receptores, pode ter o mesmo significado, por exemplo, activação, estimulação, ou tratamento de uma célula ou receptor com um ligando, salvo indicado de outra forma pelo contexto ou explicitamente. “Ligante” engloba Iigandos natural e sintético, por exemplo, citocinas, variantes de citocina, análogos, muteínas, e compostos de ligação derivados de anticorpos. “Li- gando” também engloba moléculas pequenas, por exemplo, miméticos de peptídeo de citocinas e miméticos de peptídeo de anticorpos. “Ativação” po- de fazer referência a ativação de células como regulado por mecanismos 5 internos, assim como fatores externos ou ambientais. “Resposta,” por exem- plo, de uma célula, tecido, órgão ou organismo, engloba uma mudança no comportamento bioquímico ou fisiológico, por exemplo, concentração, densi- dade, adesão ou migração dentro de um compartimento biológico, taxa de expressão de genes, ou diferenciação de estado, onde a mudança está cor- 10 relacionada com a activação, estimulação, ou tratamento, ou com mecanis- mos internos como programação genética.

“Atividade” de uma molécula pode descrever ou fazer referência a uma ligação da molécula a um Iigante ou a um receptor, para atividade catalítica; para a capacidade de estimular a expressão do gene ou a sinali- 15 zação, diferenciação ou maturação da célula; para atividade antigênica, para a modulação de atividades de outras moléculas e semelhantes. “Atividade” de uma molécula também pode fazer referência à atividade na modulação ou na manutenção de interações célula-a-célula, por exemplo, adesão, ou atividade na manutenção da estrutura de uma célula, por exemplo, membra- 20 nas da célula ou citoesqueleto. “Atividade” também pode significar atividade específica, por exemplo, [atividade catalítica]/[mg proteína], ou [atividade imunológica]/[mg proteína], concentração em um compartimento biológico, ou outros. “Atividade” pode fazer referência à modulação de componentes dos sistemas imunes inatos o adaptativos. “Atividade proliferativa” engloba 25 um atividade que promove, que é necessária para, ou que é especificamente associada com, por exemplo, divisão celular normal, assim como câncer, tumores, displasia, transformação de célula, metástase, e angiogenese.

“Administração” e “tratamento,” como se aplica a um indivíduo animal, humano, experimental, célula, tecido, órgão, ou fluido biológico faz referência ao contato de um fármaco, terapêutico, agente diagnóstico, ou composição exógenos ao animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão, ou fluido biológico. “Administração” e “tratamento” pode fazer referência, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pes- quisa e experimental. Tratamento de uma célula engloba contato de um rea- gente para a célula, assim como o contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. “Administração” e “tratamento” 5 também significa tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composto de ligação, ou por outra célula. “Tra- tamento,” como se aplica a um indivíduo humano, veterinário, ou de pesqui- sa refere-se a um tratamento terapêutico, profilítico ou medida preventivas, para aplicações diagnosticas e de pesquisa. “Tratamento” como se aplica a 10 um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, ou célula, tecido, ou ór- gão, engloba o contato de um CD200R inibitório humano agonista para um indivíduo humano ou animal, uma célula, tecido, compartimento fisiológico ou fluido fisiológico. “Tratamento de uma célula” também engloba situações onde o CD200R inibitório humano agonista contata o receptor CD200R inibi- 15 tório humano, por exemplo, na fase de fluido ou fase coloidal mas também em situações onde o agonista não contata a célula ou o receptor.

"Tratar" ou "tratamento" significa administrar um agente terapêu- tico, como uma composição contendo qualquer um dos compostos de liga- ção da presente invenção, internamente ou externamente a um paciente 20 tendo um ou mais sintomas de doença para os quais o agente conhecia ati- vidade terapêutica. Tipicamente, o agente é administrado em uma quantida- de eficaz para aliviar um ou mais sintomas de doença no paciente ou popu- lação tratada, ou por indução da regressão ou por inibição da progressão deste(s) sintoma(s) por qualquer grau clinicamente mensurável. A quantida- 25 de de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença em particular (também referido como a "quantidade terapeuticamen- te eficaz" pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, ida- de, e peso do paciente, e a capacidade do fármaco para elicitar uma respos- ta desejada no paciente. Onde o sintoma da doença foi aliviado pode ser 30 testado por qualquer medida clínica tipicamente usada por médicos ou outro agente de saúde versado para avaliar a severidade ou progressão do estado deste sintoma. Apesar de uma modalidade da presente invenção (por exem- pio, um método de tratamento ou artigo de fabricação) poder não ser efetivo para aliviar o(s) sintoma(s) de doença-alvo em cada paciente, ela deve alivi- ar o(s) sintoma(s) de doença alvo em um número estatisticamente significan- te de pacientes, como determinado por qualquer teste estatístico conhecido 5 na arte como o teste t de Student, o teste do X2-, o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste de Kruskal-Wallis (teste Η), o teste de Jonckheere- Terpstra e o teste de Wilcoxon.

Como usado aqui, o termo "anticorpo" refere-se a qualquer for- ma de anticorpo que demonstra a atividade biológica desejada. Assim, ele é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre, mas não é limitado, a anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bi-específicos). Como usado aqui, os termos “fragmento de liga- ção de CD200R inibitório antihumano ou “fragmento de ligação” de um anti- corpo (o “anticorpo parental”) engloba um fragmento ou um derivado de um anticorpo, tipicamente incluindo pelo menos uma das porções das regiões variáveis ou de ligação a antígeno (por exemplo, um ou mais CDRs) do anti- corpo parental, que retém pelo menos alguma da especificidade de ligação do anticorpo parental. Exemplos de fragmentos de ligação de anticorpos, incluem, mas não são limitados, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacor- pos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única, por e- xemplo, sc-Fv; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Tipicamente, um fragmento de ligação ou derivado retém pelo menos 10% de sua atividade de ligação de CD200R inibitório humano quan- do a atividade é expressada em uma base molar. Preferivelmente, um frag- mento de ligação ou derivado retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais da afinidade de ligação de CD200R inibitório humano como o anticorpo parental. Também pretende-se que o fragmento de ligação de CD200R inibitório humano possa incluir substituições de aminoácidos conservativas (referidas como “variantes conservativas” do anticorpo) que não alteram substancialmente sua atividade biológica. O termo “composto de ligação” refere-se a tanto anticorpos como os fragmentos de ligação dos mesmos.

Um "fragmento Fab" está compreendido de uma cadeia leve e o Ch 1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação dissulfeto com outra molécula de 5 cadeia pesada.

Uma região "Fe" contém dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios Ch2 e Ch3 de um anticorpo. Os dois fragmen- tos de cadeia pesada são mantidos junto por duas ou mais ligações dissulfe- to e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.

Um "fragmento Fab"' contém uma cadeia leve e uma porção de

uma cadeia pesada que contém o domínio Vh e o domínio C h1 e também a região entre os domínios ChI e C h2, de modo que uma ligação dissulfeto intercadeia pode ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois frag- mentos Fab1 para formar uma molécula de F(ab') 2·

Um fragmento "F(ab')2M contém duas cadeias leves e duas ca-

deias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios ChI e Ch2, de modo que uma ligação dissulfeto intercadeia é formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab') 2 assim é composto de dois fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.

A "região Fv" compreende as regiões variáveis de ambas as ca- deias pesadas e leves, mas falta as regiões constantes.

O termo anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" refere-se a fragmentos de anticorpo compreendendo os domínios Vh e Vl de um anti- 25 corpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptí- deo única. Geralmente, o polipeptídeo Fv ainda compreende um Iigante de polipeptídeo entre os domínios Vh e Vl que permite que o scFv forme da es- trutura desejada para a ligação do antígeno. Para um estudo sobre scFv, ver Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, 30 Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315. Ver tam- bém a Publicação de pedido de patente internacional WO 88/01649 e Pat. U.S. 4.946. 778 e 5.260.203. Um "anticorpo de domínio" é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo somente a região variável de uma ca- deia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns casos, du- as ou mais regiões Vh são covalentemente unidas com um Iigante de peptí- 5 deo para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões Vh de um anticorpo de domínio bivalente podem marcar o mesmo ou diferentes antí- genos.

Um "anticorpo bivalente" compreende dois sítios de ligação de antígeno. Em alguns casos, os dois sítios de ligação têm as mesmas especi- ficidades de antígeno. No entanto, anticorpos bivalentes podem ser biespecí- ficos (ver abaixo).

Como usado aqui, salvo especificado em contrário, um anticorpo para “CD200R inibitório anti-humano” refere-se a um anticorpo que é criado contra o CD200R inibitório humano ou variante do mesmo, ou qualquer frag- mento antigênico do mesmo. Em uma modalidade preferida, o “anticorpo para CD200R inibitório anti-humano é um anticorpo agonista que ativa a ati- vidade inibitória do CD200R inibitório humano. Exemplos da atividade inibitó- ria do CD200R inibitório humano incluem, mas não são limitadas à inibição da desgranulação de células-tronco e secreção de citocinas, inibição de ma- crófago e apresentação de antígeno de células dendríticas e secreção de citocina. Anticorpos para CD200R inibitório anti-humanos refere-se também a anticorpos criados contra o CD200R cino- inibitório (por exemplo, ver figura 13) ou variante do mesmo, ou fragmento antigênico do mesmo e que tam- bém liga o CD200R inibitório humano. Em uma modalidade preferida, o anti- corpo para CD200R inibitório anti-humano criado contra o CD200R cino- inibitório é um anticorpo agonista que ativa a atividade inibitória do CD200R inibitório humano. Exemplos da atividade inibitória do CD200R inibitório hu- mano incluem, mas não são limitadas a, inibição de desgranulação de célu- las-tronco e secreção de citocina, inibição de macrófago e apresentação de antígeno de células dendríticas e citocina.

O termo "monoclonal anticorpo", como usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancial- mente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a po- pulação são idênticos exceto pelas mutações possíveis de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades pequenas. Os anticorpos mono- clonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um epítopo antigê- 5 nico único. Em contraste, as preparações convencionais de anticorpos (poli- clonais) tipicamente incluem uma multitude de anticorpos dirigidos contra (ou específicos) para diferentes epítopos. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substan- cialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser construído como reque- 10 rendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente in- venção podem ser feitos pelo método hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, ou podem ser feitos por métodos de DNA re- combinante (ver, por exemplo, patente US. 4.816.567). Os " anticorpos mo- 15 noclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fagos usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por exemplo. Ver também Presta (2005) J. Alergia Clin. Imunol. 116:731.

Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anti- 20 corpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia pesa- da e/ou leve é idêntica com ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) ca- deia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos 25 derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos destes anticorpos, desde que eles de- monstrem a atividade biológica desejada. (Pat. U.S. N0 4.816.567; e Morri- son et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 81: 6851-6855).

Como usado aqui, um “anticorpo quimérico” é um anticorpo ten- do o domínio variável de um primeiro anticorpo e domínio constante de um segundo anticorpo, onde os primeiro e segundo anticorpos são de espécies diferentes. Tipicamente, os domínios variáveis são obtidos de um anticorpo de um animal experimental (o “anticorpo parental”), como um roedor, e as seqüências de domínio constante são obtidas de anticorpos humanos, de modo que o anticorpo quimérico resultante será menos provável de elicitar uma resposta imune adversa em um indivíduo humano do que o anticorpo 5 de roedor parental.

Os anticorpos monoclonais aqui também incluem anticorpos de domínio único camelizados. Ver, por exemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sei. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Imunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; Pat. U.S. N0 6.005.079, que são aqui 10 incorporados por referência em suas totalidades). Em uma modalidade, a presente invenção provê anticorpos de domínio único compreendendo dois domínios Vh com modificações de modo que os anticorpos de domínio único são formados.

Como usado aqui, o termo "diacorpos" refere-se a fragmentos pequenos de anticorpo com dois sítios de ligação a antígeno, cujos fragmen- tos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectados a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (Vh-Vl ou Vl-Vh). Ao usar um Iigante que é muito curto para permitir a for- mação de pares entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a formar par com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno. Os diacorpos são descritos mais com- pletamente em, por exemplo, EP 404.097; WO 93/11161; e Holliger et al. (1993) Proc. NatL Acad. Sei. USA 90: 6444-6448. Para uma revisão de vari- antes de anticorpo engenheirados, ver geralmente Holliger e Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

Como usado aqui, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a formas de anticorpos que contêm seqüências de anticorpos tanto humanos como não humanos (por exemplo, murino, ratos. Em geral, o anticorpo hu- manizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e 30 tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente to- dos dos laços hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana, e todos ou substancialmente todos das regiões de armação (FR) são os de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humani- zado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina humana (Fe).

Os anticorpos da presente invenção também incluem anticorpos com regiões Fc modificadas (ou bloqueadas) de modo a prover funções de efetuador alteradas. Ver, por exemplo, Pat. U.S. N0 5.624.821; W02003/086310; W02005/120571; W02006/0057702. Esta modificação pode ser usada para melhorar ou suprimir várias reações do sistema imune, com efeitos benéficos possíveis em diagnóstico e terapia. Alterações da re- gião Fc incluem mudanças de aminoácido (substituições, deleções e inser- ções), glicosilação ou desglicosilação, e adição de Fc múltiplo. As mudanças para o Fc também podem alterar a meia-vida de anticorpos em anticorpos terapêuticos, permitindo uma dosagem menos freqüente e assim conveniên- cia aumentada e uso diminuído de material. Ver Presta (2005) J. Alergia Clin. Imunol. 116:731 a 734-35.

O termo “anticorpo completamente humano” refere-se a um anti- corpo que compreende apenas seqüências de proteína de imunoglobulina humana. Um anticorpo completamente humano pode conter cadeias de car- boidrato murino se produzido em um camundongo, em uma célula de ca- 20 mundongo, ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Similarmente, "anticorpo de camundongo" refere-se a um anticorpo que compreende apenas seqüências de imunoglobulina de camundongo. Alter- nativamente, um anticorpo completamente humano pode conter cadeias de carboidrato de rato se produzido em um rato, em uma célula de rato, ou em 25 um hibridoma derivado de uma célula de rato. Similarmente, "anticorpo de rato" refere-se a um anticorpo que compreende apenas seqüências de imu- noglobulina de rato.

Como usado aqui, o termo "região hipervariável" refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação do antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementaridade" ou "CDR" (isto é, resí- duos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve e resíduos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CD- RH3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al. (1991) Seqüências de Proteins of Imunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) e/ou os resíduos de um "laço hipervariá- 5 vel" (isto é, resíduos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) e 91-96 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) e 96-101 (CDRH3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk (1987) J. Moi Biol. 196: 901-917). Como usado aqui, o termo resíduos de "armação" ou "FR" refere-se aos resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos 10 de região hipervariável definidos aqui como resíduos CDR.

“Substância de ligação” refere-se a uma molécula, molécula pe- quena, macromolécula, anticorpo, um fragmento ou análogo do mesmo, ou receptor solúvel, capaz de ligação ao alvo. "Substância de ligação” também pode fazer referência a um complexo de moléculas, por exemplo, um com- 15 plexo não covalente, a uma molécula ionizada e a uma molécula covalente- mente ou não covalentemente modificada, por exemplo, modificada por fos- forilação, acilação, reticulação, ciclização, ou clivagem limitada, que é capaz de ligar a um alvo. "Substância de ligação” também pode fazer referência a uma molécula capaz de ligação em combinação com um estabilizador, exci- 20 piente, sal, tampão, solvente, ou aditivo. “Ligação” pode ser definida como uma associação da substância de ligação com um alvo onde a associação resulta em redução no movimento Browniano normal da substância de liga- ção, em casos onde a substância de ligação pode ser dissolvida ou colocada em suspensão em solução.

"Variantes conservativamente modificadas' ou "substituição con-

servativa" refere-se a substituições de aminoácidos em uma proteína com outros aminoácidos tendo características similares (por exemplo, carga, ta- manho de cadeia lateral, hidrofobicidade/ hidrofilicidade", conformação de estrutura dorsal e rigidez, etc.). de modo que as mudanças podem ser feitas 30 com frequência sem alterar a atividade biológica da proteína. Os versado na técnica irá reconhecer que, geralmente, substituições de aminoácido unido em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Bio- Iogy ofthe Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a. Ed.)). Além disso, substituições de aminoácidos estruturalmente ou funcionalmente simi- lares são menos prováveis de interromper a atividade biológica. Várias mo- 5 dalidades dos compostos de ligação da presente invenção compreendem cadeias de polipeptídeos com seqüências que incluem até O (sem mudan- ças), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 ou mais substituições de aminoá- cidos conservativas quando comparadas com as seqüências de aminoácido específicas aqui descritas, por exemplo, SEQ ID N-: 2, 4, 5, ou 6. Como u- 10 sado aqui, a frase “até X” substituição de aminoácidos conservativas inclui 0 substituições e qualquer número de substituições até e incluindo X substitui- ções. Estas substituições exemplares são feitas o mais preferivelmente de acordo com o especificado na tabela 2 como a seguir:

TABELA 1

Substituições de aminoácidos conservativas exemplares

Resíduo original Substituição conservativa Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys; His Asn (N) Gin; His Asp (D) Glu; Asn Cys (C) Ser; Ala Gln (Q) Asn Glu (E) Asp; Gln Gly (G) Ala His (H) Asn; Gln He (I) Leu; Val Leu (L) lie; Val Lys (K) Arg; His Met (M) Leu; He; Tyr Phe (F) Tyr; Met; Leu Pro (P) Ala Ser (S) Thr Resíduo original

Substituição conservativa

Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V)

Tyr; Phe Trp; Phe He; Leu

Ser

Os termos "consiste essencialmente em", ou variações como

"consistem essencialmente em" ou "consistindo essencialmente em," como usado em todo o relatório e reivindicações indica a inclusão de quaisquer elementos descritos ou grupo de elementos e a inclusão opcional de outros 5 elementos de natureza similar ou diferente da dos elementos descritos, que não mudam materialmente as propriedades básicas ou novas do regime de dosagem, método, ou composição especificados. Como um exemplo não limitativo, um composto de ligação que consiste essencialmente em uma seqüência de aminoácido descrita pode também incluir um ou mais aminoá- 10 cidos que não afetam materialmente as propriedades do composto de liga- ção.

Ihorar ou evitar um sintoma ou sinal da condição média. A quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diag- nóstico. Uma quantidade eficaz para um paciente em particular ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores como a condição sendo trata- da, a saúde geral do paciente, a via de método e dose de administração e a severidade dos efeitos laterais (ver, por exemplo, Pat. U.S. N0 5.888.530 ex- pedida para Netti, et al.). Uma quantidade eficaz pode ser uma dose máxima ou protocolo de dosagem que evita efeitos laterais significantes ou efeitos tóxicos. O efeito irá resultar em uma melhora da medida ou parâmetro diag- nóstico por pelo menos 5%, geralmente por pelo menos 10%, mais geral- mente pelo menos 20%, o mais geralmente pelo menos 30%, preferivelmen- te pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, o mais preferi- velmente pelo menos 60%, idealmente pelo menos 70%, mais idealmente pelo menos 80%, e o mais idealmente pelo menos 90%, onde 100% é defi- nido como o parâmetro diagnóstico mostrado por um indivíduo normal (ver,

Quantidade eficaz" engloba uma quantidade suficiente para me- por exemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinicai Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinicai Practice, Urch Publ., London, UK).

“Exógeno” refere-se a substâncias que são produzidas fora de 5 um organismo, célula, ou corpo humano, dependendo do contexto. “Endó- geno” refere-se a substâncias que são produzidas dentro de uma célula, or- ganismo, ou corpo humano, dependendo do contexto.

"Homologia" refere-se a uma similaridade de seqüência entre duas seqüências de polinucleotídeos ou entre duas seqüências de polipeptí- deos. Quando a posição em ambas as duas seqüências comparadas é ocu- pada pela mesma base ou subunidade de monômero de aminoácido, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocu- pada por adenina, então as moléculas são homólogas a esta posição. A por- centagem de homologia entre as duas seqüências é uma função do número de correspondências ou posições homólogas compartilhadas pelas duas seqüências divididas pelo número de posições comparadas x 100. Por e- xemplo, se 6 de 10 das posições em duas seqüências são correspondidas ou homólogas quando as seqüências são otimamente alinhadas, então as duas seqüências são 60% homólogas. Geralmente, a comparação é feita quando duas seqüências são alinhadas para dar uma homologia percentual máxima.

"Condição imune" ou "distúrbio imune" engloba, por exemplo, inflamação patológica, ou distúrbio inflamatório, e um distúrbio autoimune ou doença. "Condição imune" refere-se também a infecções, infecções persis- 25 tentes e condições proliferativas, como câncer, tumores, e angiogênese, in- cluindo infecções, tumores, e cânceres que resistem à erradicação pelo sis- tema imune. “Condição cancerosa" inclui, por exemplo, câncer, células de câncer, tumores, angiogênese, e condições pré-cancerosas, como displasia.

"Distúrbio inflamatório” significa um distúrbio ou condição patoló- gica onde a patologia resulta, no todo ou em parte, de, por exemplo, uma mudança no número, mudança na taxa de migração, ou mudança na ativa- ção de células do sistema imune. As células do sistema imune, incluem, por exemplo, células T, células B, monócitos ou macrófagos, células apresen- tando antígeno (APCs), células dendríticas, microglia, células NK, células NKT, neutrófilos, eosinófilos, células-tronco, ou qualquer outra célula especi- ficamente associada com a imunologia, por exemplo, células endoteliais ou 5 epiteliais produzindo citocinas.

“Composto de ligação isolado” refere-se ao estado de purifica- ção de um composto de ligação e neste contexto significa que a molécula é substancialmente isenta de outras moléculas biológicas, como ácidos nuclei- cos, proteínas, lipídeos, carboidratos ou outro material, como resíduos celu- 10 lares e meios de crescimento. Geralmente, o termo “isolado" não se destina a fazer referência a uma ausência completa deste material ou a uma ausên- cia de água, tampões, sais, salvo se eles estiverem presentes em quantida- de que substancialmente interferem com o uso experimental ou terapêutico do composto de ligação, como descrito aqui.

"Molécula de ácido nucleico isolada" significa um DNA ou RNA

de origem genômica, mRNA, cDNA, ou sintética ou alguma combinação dos mesmos, que não é associada com toda ou uma porção de um polinucleotí- deo em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, ou é ligado a um polinucleotídeo ao qual ele não é ligado na natureza. Para fins desta 20 descrição, deve-se entender que "uma molécula de ácido nucleico compre- endendo" uma seqüência de nucleotídeo particular não encontra cromosso- mos intactos. As moléculas de ácido nucleico isoladas "compreendendo" seqüências de ácido nucleico especificadas podem incluir, além das se- qüências especificadas, seqüências de codificação para até dez ou até 25 mesmo vinte ou mais de outras proteínas ou porções da mesma, ou podem incluir seqüências regulatórias operativamente ligadas que controlam a ex- pressão da região de codificação das seqüências de ácido nucleico recita- das, e/ou podem incluir seqüências de vetor.

A frase "seqüências de controle" refere-se a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação ligada ope- rativamente em um organismo hospedeiro particular. As seqüências de con- trole que são apropriadas para procarióticos, por exemplo, incluem um pro- motor, opcionalmente uma seqüência de operador, e um sítio de ligação de ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas como usando promoto- res, sinais de poliadenilação e intensificadores.

Um ácido nucleico é "ligado operativamente" quando ele é colo- cado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretório é ligado operati- vamente a DNA para um polipeptídeo se ele for expressado como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo, um promotor ou intensi- ficador é ligado operativamente a uma seqüência de codificação se ele afe- tar a transcrição da seqüência, ou um sítio de ligação de ribossoma é ligado operativamente a uma seqüência de codificação se ele for posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operativamente" significa que as seqüências de DNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretório, contíguas e em fase de leitura. No entanto, intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de res- trição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores de oligonu- cleotídeos sintéticos ou Iigantes são usados de acordo com prática conven- cional.

Como usado aqui, as expressões "célula", "linhagem de células", 20 e "cultura de células" são usadas de modo interpermutável e todas estas designações incluem progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "célu- las transformadas" incluem a célula do indivíduo primário e culturas deriva- das dos mesmos sem relação ao número de transferências. Também enten- de-se que a progênie pode não ser precisamente idêntica em teor de DNA 25 devido às mutações deliberadas ou inadvertentes. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como triada para a célula origi- nalmente transformada é incluída. Onde designações distintas são pretendi- das, será evidente do contexto.

Como usado aqui, "reação de cadeia polimerase" ou "PCR" refe- re-se a um procedimento ou técnica em que quantidades diminutas de um pedaço específico de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificados como descritos em, por exemplo, Pat. U.S. N0 4.683.195. Geralmente, informação de seqüência a partir das extremidades da região de interesse ou além das necessidades a serem disponíveis, de modo que os iniciadores de oligonu- cleotídeos podem ser projetados; estes iniciadores serão idênticos ou simila- res em seqüência a filamentos opostos do gabarito a ser amplificado. Os 5 nucleotídeos 5' terminais dos dois iniciadores podem coincidir com as extre- midades do material amplificado. PCR pode ser usado para amplificar se- qüências de RNA específicas, seqüências de DNA específicas do DNA ge- nômico total, e cDNA transcrito a partir de RNA celular total, bacteriófago ou seqüências de plasmídeo, etc. Ver, geralmente Mullis et al. (1987) Cold S- 10 pring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR Technology (Stockton Press, N.Y.). Como usado aqui, PCR é considerado como sendo um, mas não o único, exemplo de um método de reação de polimerase de ácido nucleico para amplificar uma amostra de teste de ácido nucleico com- preendendo o uso de um ácido nucleico conhecido como um iniciador e uma 15 polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar uma peça específica de ácido nucléico.

Como usado aqui, o termo “seqüência de linhagem germinal" refere-se a uma seqüência de seqüências de DNA de imunoglobulina não rearranjada. Qualquer fonte apropriada de imunoglobulina não rearranjada pode ser usada.

"Inibidores e "antagonistas" ou "ativadores" e "agonistas" refe- rem-se a moléculas inibitórias ou ativantes, respectivamente, por exemplo para a ativação de, por exemplo, um ligante, receptor, cofator, um gene, cé- lula, tecido ou órgão. Um modulador de, por exemplo, um gene, um receptor, 25 um ligante, ou uma célula, é uma molécula que altera a atividade do gene, receptor, ligante ou célula, onde atividade pode ser ativada, inibida ou alte- rada em suas propriedades regulatórias. O modulador pode atuar sozinho, ou pode usar um cofator, por exemplo, uma proteína, íon de metal, ou molé- cula pequena. Os inibidores são compostos que diminuem, bloqueiam, pre- 30 vinem, retardam a ativação, inativam, dessensibilizam, ou regulam de modo negativo, por exemplo, um gene, proteína, ligante, receptor, ou célula. Os ativadores são compostos que aumentam, ativam, facilitam melhoram a ati- vação, sensibilizam, ou regulam de modo positivo, por exemplo um gene, proteína, ligante, receptor ou célula. Um inibidor também pode ser definido como um composto que reduz, bloqueia, ou inativa uma atividade constituti- va. Um "agonista" é um composto que interage com uma marcação para 5 causar ou promover um aumento na ativação da marcação. Um "antagonis- ta" é um composto que se opõe às ações de um agonista. Um antagonista evita, reduz, inibe, ou neutraliza a atividade de um agonista. Um antagonista também pode evitar, inibir ou reduzir atividade constitutiva de uma marca- ção, por exemplo, um receptor de marcação, mesmo onde não se tem ago- 10 nista identificado. A título de exemplo e não limitação, um anticorpo de ago- nista é um anticorpo que pode ativar a atividade inibitória do CD200R inibitó- rio humano.

Para examinar a extensão de inibição, por exemplo, amostras ou testes compreendendo uma dada, por exemplo, proteína, gene, célula, ou organismo, são tratados com um ativador ou inibidor em potencial e são comparados a amostras de controle sem o inibidor. Amostras de controle, isto é, amostras não tratadas com antagonista, recebem um valor de ativida- de relativa de 100%. A inibição é alcançada quando o valor de atividade rela- tivo ao controle é cerca de 90% ou menos, tipicamente 85% ou menos, mais tipicamente 80% ou menos, o mais tipicamente 75% ou menos, geralmente 70% ou menos, mais geralmente 65% ou menos, o mais geralmente 60% ou menos, tipicamente 55% ou menos, geralmente 50% ou menos, mais geral- mente 45% ou menos, o mais geralmente 40% ou menos, preferivelmente 35% ou menos, mais preferivelmente 30% ou menos, ainda mais preferivel- mente 25% ou menos, e o mais preferivelmente menos do que 25%. Ativa- ção é obtida quando o valor de atividade relativo ao controle é cerca de 110%, geralmente pelo menos 120%, mais geralmente pelo menos 140%, mais geralmente pelo menos 160%, com frequência pelo menos 180%, com maior frequência pelo menos 2 vezes, com a maior frequência pelo menos 2,5 vezes, geralmente pelo menos 5 vezes, mais geralmente pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 20 vezes, mais preferivelmente pelo me- nos 40 vezes, e o mais preferivelmente acima de 40 vezes maior. Os pontos finais na ativação ou inibição podem ser monitorados como a seguir. A inibição e resposta ao tratamento, por exemplo, de uma célula, fluido fisiológico, tecido, órgão e indivíduo humano ou animal, podem ser monitoradas por um ponto final. O ponto final pode compreender uma 5 quantidade predeterminada ou porcentagem de, por exemplo, indícios de inflamação, oncogenicidade, ou desgranulação ou secreção de células, co- mo a liberação de uma citocina, oxigênio tóxico, ou uma protease. O ponto final pode compreender, por exemplo, uma quantidade predeterminada de fluxo ou transporte de íons; migração de células; adesão de células; prolife- 10 ração de células; potencial para metástase; diferenciação de células; e mu- dança em fenótipo; por exemplo mudança em expressão de gene com rela- ção a inflamação, apoptose, transformação, ciclo celular, ou metástase (ver, por exemplo, Knight (2000) Ann. Clin. Lab. Sei. 30:145-158; Hood e Cheresh (2002) Nature Rev. Cancer 2:91-100; Timme, et al. (2003) Curr. Drug Tar- 15 gets 4:251-261; Robbins e Itzkowitz (2002) Med. Clin. North Am. 86:1467- 1495; Grady e Markowitz (2002) Annu. Rev. Genomies Hum. Genet. 3:101- 128; Bauer, et al. (2001) Glia 36:235-243; Stanimirovic e Satoh (2000) Brain PathoL 10:113-126).

Um ponto final de inibição é geralmente 75% do controle ou me- 20 nos, preferivelmente 50% do controle ou menos, mais preferivelmente 25% do controle ou menos, e o mais preferivelmente 10% do controle ou menos. Geralmente, um ponto final de ativação é pelo menos 150% do controle, pre- ferivelmente pelo menos duas vezes o controle, mais preferivelmente pelo menos quatro vezes o controle, e o mais preferivelmente pelo menos dez 25 vezes o controle.

“Ligante” refere-se, por exemplo, a uma molécula pequena, pep- tídeo, polipeptídeo, e membrana associada ou molécula ligada à membrana, ou complexo dos mesmos, que podem atuar como um agonista ou antago- nista de um receptor. “Ligante” também engloba um agente que não é um 30 agonista ou antagonista, mas que pode ligar ao receptor. Além disso, “ligan- te” inclui um ligando ligado à membrana que foi mudado, por exemplo, por métodos químicos ou recombinantes a uma versão solúvel do ligando ligado à membrana. Por convenção, onde um ligando é ligado à membrana em uma primeira célula, o receptor geralmente ocorre em uma segunda célula. A segunda célula pode ter a mesma ou uma diferente identidade como a primeira célula. Um ligante ou receptor pode ser completamente intracelular, 5 isto é, que pode residir no citosol, núcleo ou algum outro compartimento in- tracelular. O ligante ou receptor pode mudar seu local, por exemplo, de um compartimento intracelular para a face externa da membrana de plasma. O complexo de um ligante e receptor é chamado um “complexo ligante recep- tor.” Onde um ligante e receptor estão envolvidos em uma via de sinalização, 10 o ligante ocorre em uma posição a montante e o receptor ocorre em uma posição a jusante da via de sinalização.

“Molécula pequena” é definida como uma molécula com um pe- so molecular que é menor do que 10 kDa, tipicamente menor do que 2 kDa, preferivelmente menor do que 1 kDa, e o mais preferivelmente menor do que 15 cerca de 500 Da. As moléculas pequenas incluem, mas não são limitadas a moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas, moléculas orgânicas contendo um componente inorgânico, moléculas compreendendo um átomo radioativo, moléculas sintéticas, miméticos de peptídeo e miméticos de anticorpo. Como uma terapêutica, uma molécula pequena pode ser mais permeável às célu- 20 las, menos suscetível à degradação, e menos apta a elicitar uma resposta imune do que as moléculas grandes. As moléculas pequenas, como miméti- cos de peptídeos de anticorpos e citocinas, assim como toxinas de molécula pequena, já foram descritas (ver, por exemplo, Casset, et al. (2003) Bio- chem. Biophys. Res. Commun. 307:198-205; Muyldermans (2001) J. Biote- 25 chnol. 74:277-302; Li (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1256; Apostolopoulos, et al. (2002) Curr. Med. Chem. 9:411-420; Monfardini, et al. (2002) Curr. Pharm. Des. 8:2185-2199; Domingues, et al. (1999) Nat. Struct. Bioi 6:652- 656; Sato e Sone (2003) Biochem. J. 371:603-608; Patente U.S. N0 6.326.482 expedida para Stewart, etal).

Liga “especificamente” ou “seletivamente”, quando fazendo refe-

rência a um ligante/receptor, anticorpo/antígeno, ou outro par de ligação, indica uma reação de ligação que é determinativa da presença da proteína em uma população heterogênea de proteínas e outros biológicos. Assim, sob condições designadas, um ligante especificado liga a um receptor parti- cular e não liga em uma quantidade significante a outras proteínas presentes na amostra. A título de exemplo, o anticorpo, ou composto de ligação deri- 5 vado do sítio de ligação de antígeno de um anticorpo, do método contempla- do liga a seu antígeno, ou uma variante ou muteína do mesmo, com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior, preferivelmente pelo menos dez vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 20 vezes maior, e o mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com qual- 10 quer outro antígeno. Em uma modalidade preferida, o anticorpo terá uma afinidade que é maior do que cerca de 109 M'a, como determinado, por e- xemplo, por análise de Scatchard (Munsen et al. (1980) Analyt. Biochem. 107:220-239). A título de exemplo, e não limitação, condições designadas podem englobar um teste em que a população heterogênea de proteínas e 15 outros biológicos são todos derivados da mesma espécie. Também a título de exemplo, e não limitação, o anticorpo ou composto de ligação derivado do sítio de ligação a antígeno de um anticorpo especificamente ou seletiva- mente liga o CD200R inibitório anti-humano, mas não liga especificamente ou seletivamente o CD200RLa humano mudado por CYS (ver, por exemplo, 20 figura 9 e Exemplo 13) ou proteína de fusão de CD200RLa humano (domínio extracelular de CD200RLa humano fusionado à porção Fe de IgGI humano, ver, por exemplo, Exemplo 13).

Como usado aqui, o termo “agente imunomodulatório” refere-se a agentes naturais ou sintéticos que suprimem ou modulam uma resposta imune. A resposta imune pode ser resposta humoral ou celular. Os agentes imunomodulatório englobam agentes imunossupressivos ou anti- inflamatórios.

“Agentes imunossupressivos”, “fármacos imunossupressivos”, ou “imunossupressores” como usado aqui são terapêuticas que são usadas em terapia imunossupressiva para inibir ou prevenir a atividade do sistema imu- ne. Clinicamente, são usados para prevenir a rejeição de órgãos transplan- tados e tecidos (por exemplo, medula óssea, coração, rim, fígado) e/ou no tratamento de doenças autoimunes ou doenças que são mais provavelmente de origem autoimune (por exemplo artrite, miastenia gravis, Iupus eritema- toso sistêmico, colite ulcerativa, esclerose múltipla). Os fármacos imunossu- pressivos podem ser classificados como: glucocorticoides; citostáticos;

5 anticorpos (modificadores da resposta biológica); fármacos atuando sobre imunofilinas, outros fármacos incluindo agentes quimioterapêuticos conheci- dos usados no tratamento de distúrbios proliferativos. Para esclerose múlti- pla, em particular, os anticorpos da presente invenção podem ser adminis- trados em conjunto com uma nova classe de terapêuticos de tipo de porção 10 de ligação à mielina, conhecidos como copaxonas.

“Agentes anti-inflamatórios” ou “fármacos anti-inflamatórios” refe- rem-se a tanto terapêuticos esteroidais como não esteroidais. Os esteroides, também conhecidos como corticosteroides, são fármacos que se parecem muito com cortisol, um hormônio produzido naturalmente por glândulas a- 15 drenais. Os esteroides são usados como o tratamento principal para algu- mas condições inflamatórias, como: vasculite sistêmica (inflamação de vasos sanguíneos), e miosite (inflamação de músculo). Os esteroides também po- dem ser usados seletivamente para tratar condições inflamatórias como : artrite reumatoide (artrite inflamatória crônica ocorrendo nas juntas de ambos 20 os lados do corpo), Iupus eritematoso sistêmico (uma doença generalizada causada por função do sistema imune anormal) síndrome de Sjõgren (um distúrbio crônico que causa olhos secos e boca seca).

Os fármacos anti-inflamatórios não esteroidais, geralmente a- breviados como NSAIDs, são fármacos com efeitos analgésicos, antipiréti- 25 cos e anti-inflamatórios - eles reduzem a dor, febre e inflamação. O termo "não esteroidal' é usado para distinguir estes fármacos de esteroides, que (dentre uma ampla faixa de outros efeitos) tem uma ação anti-inflamatória, depressora de eicosanoide similar. NSAIDS são geralmente indicados para o alívio sintomático das seguintes condições:: artrite reumatoide; osteoartrite; 30 artropatias inflamatórias (por exemplo, espondilite anquilosante, artrite psiriá- tica, síndrome de Reiter); gota aguda, dismenorréia, dor de osso metastáti- co, dor de cabeça e enxaqueca, dor pós-operação, dor suave-a-moderada devido a inflamação e dano do tecido; pirexia, e cólica renal. NSAIDs inclu- em salicilatos, ácidos arilalcanóicos, ácidos 2-arilpropiônicos (profenos), áci- do N-arilantranílicos (ácido fenâmicos), oxicams, coxibs e sulfonanilidas.

Os fármacos antirreumáticos modificadores da doença 5 (DMARDs) podem ser administrados, com frequência em combinação com NSAIDs. DMARDs comumente receitados incluem hidroxicloroqui- na/cloroquina, metotrexato, terapia com ouro, sulfasalazina, e azatioprina.

II. Anticorpos específicos para CD200R inibitório humano.

A presente invenção provê anticorpos para CD200R inibitório 10 anti-humano e usos dos mesmos para tratar vários distúrbios inflamatórios, imunes e proliferativos, incluindo artrite reumatoide (RA), osteoartrite, artrite reumatoide osteoporose, fibrose inflamatória (por exemplo, escleroderma, fibrose do pulmão, e cirrose), distúrbios do intestino inflamatório (por exem- plo, Doença de Crohn, colite ulcerativa e doença de intestino inflamatório), 15 asma (incluindo asma alérgica), alergias, COPD, esclerose múltipla, psoría- se, uveite e câncer.

Qualquer método apropriado para gerar anticorpos monoclonais pode ser usado para gerar o anticorpo para CD200R inibitório anti-humanos da presente invenção. Por exemplo, um animal recipiente pode ser imuniza- 20 do com uma forma ligada ou não ligada (por exemplo, de ocorrência natural) do CD200R inibitório humano, ou um fragmento do mesmo. Qualquer méto- do apropriado de imunização pode ser usado. Estes métodos podem incluir adjuvantes, outros imunoestimulantes, imunizações de reforço repetidas, e o uso de uma ou mais vias de imunização.

Qualquer forma apropriada do CD200R inibitório humano pode

ser usada como imunogene (antígeno) para a geração do anticorpo não hu- mano específico para o CD200R inibitório humano, cujo anticorpo pode ser triado para atividade biológica. O imunogene elicitante pode ser CD200R inibitório humano de comprimento completo ou peptídeos do mesmo englo- 30 bando epítopos únicos ou epítopos múltiplos. O imunogene pode ser usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes intensificadores da imunogenicidade conhecidos na técnica. O imunogene pode ser purificado e uma fonte natural ou produzido em uma célula geneticamente modificada. DNA codificando o imunogene pode ser de origem genômica ou não genô- mica (por exemplo, cDNA). DNA codificando imunogene pode ser expressa- do usando vetores genéticos apropriados, incluindo mas não limitados a ve- 5 tores adenovirais, vetores virais adenoassociados, vetores baculovirais, plas- mídeos e vetores não virais como lipídeos catiônicos. As seqüências para CD200R humano podem ser encontradas, por exemplo, na US2006/0084121, Wright GJ et al (2003) 171(6):3034-3046 (aqui incorpora- dos por referência em sua totalidade) e figura 13. A título de exemplo e não 10 limitação, a forma ou longa ou curta do receptor inibitório humano pode ser usada como o imunogene (antígeno). Os números de acesso ao Genbank para a forma curta do receptor inibitório humano e a forma longa do receptor inibitório humano são AF283760 e AF283760 respectivamente. A forma cur- ta do CD200R inibitório humano é também provida na figura 13.

Em uma modalidade alternativa CD200R inibitório de primata

não humano, como o cino-CD200R inibitório (ver figura 13), pode ser usado como um imunogene (antígeno) para a geração de anticorpo não humano específico para o CD200R inibitório humano, cujo anticorpo pode ser triado para atividade biológica. O imunogene elicitante pode ser CD200R inibitório 20 cíno de comprimento completo ou peptídeos do mesmo englobando epítopos únicos ou epítopos múltiplos. O imunogene pode ser usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes intensificadores da imunogenicidade conhecidos na técnica. O imunogene pode ser purificado de uma fonte natu- ral ou produzido em uma célula geneticamente modificada. DNA codificando 25 o imunogene pode ser de origem genômica ou não genômica (por exemplo, cDNA). DNA codificando imunogene pode ser expressado usando vetores genéticos apropriados, incluindo mas não limitados a vetores adenovirais, vetores virais adenoassociados, vetores baculovirais, plasmídeos e vetores não virais como lipídeos catiônicos.

Qualquer método apropriado pode ser usado para elicitar uma

resposta de anticorpo com as propriedades biológicas desejadas, por exem- plo para ativar a atividade inibitória do CD200R inibitório humano. Em algu- mas modalidades, anticorpos são criados em hospedeiros mamíferos como camundongos, roedores, primatas, seres humanos, etc. Técnicas para pre- parar os anticorpos monoclonais podem ser encontradas em, por exemplo, Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Imunology (4a. ed.) Lange Medicai Publications, Los Altos, CA, e referências citadas ai; Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY. Assim, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por várias técnicas bem conhecidas do versado na técnica. Tipicamente, células do baço de um animal imunizado com um antígeno desejado são imortalizadas, comumente por fusão com uma célula de mieloma. Ver Kohler e Milstein (1976) Eur. J. Imunol. 6:511-519. Os métodos alternativos de imortalização incluem trans- formação com Virus Epstein Barr, oncogenes, ou retrovírus, ou outros méto- dos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Doyle et al. (eds.) (1994 e su- plementos periódicos) CELL AND Tissue Culture: Laboratory Procedu- res, John Wiley and Sons, New York, NY. Colônias que surgem de células imortalizadas únicas são triadas para a produção de anticorpos da desejada especificidade e afinidade para o antígeno. O rendimento de anticorpos mo- noclonais produzidos por tais células pode ser melhorado por várias técni- cas, incluindo injeção na poço peritoneal de um hospedeiro vertebrado.

Outras técnicas apropriadas envolvem a seleção de bibliotecas de anticorpos em vetores de fago ou similares. Ver, por exemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); e Ward et al., Nature 341:544-546 (1989). Os anticorpos da presente invenção podem ser usados sem modificação, 25 por exemplo, como o anticorpo de roedor parental, ou com modificações pa- ra facilitar seu uso como agentes terapêuticos em indivíduos humanos, como anticorpo quiméricos ou humanizados. Em algumas modalidades, os anti- corpos serão rotulados, covalentemente ou não covalentemente, com una substância que provê um sinal detectável. Uma ampla variedade de rótulos e 30 técnicas de conjugação são conhecidas e relatadas extensivamente tanto na literatura científica como de patente. Os rótulos apropriados incluem radio- nuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimioluminescentes, partículas magnéticas, e similares. As paten- tes ensinando o uso de tais rótulos incluem Patentes U.S. N— 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; e 4.366.241. Tam- bém, imunoglobulinas recombinantes podem ser produzidas, ver Cabilly Pa- 5 tente U.S. N0 4.816.567; e Queen et al. (1989) Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 86:10029-10033; ou feitas em camundongos transgênicos, ver Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; também ver as tecnologias de Abgenix e Medarex.

Anticorpos contra fragmentos predeterminados de CD200R inibi- 10 tório humano podem ser criados por imunização de animais com conjugados do fragmento predeterminado de CD200R inibitório humano com proteínas veículo. Os anticorpos monoclonais são preparados a partir de células secre- tando o desejado anticorpo. Estes anticorpos podem ser triados por ligação CD200R inibitório humano normal ou defeituoso. Estes anticorpos monoclo- 15 nais irão geralmente ligar com pelo menos um KcJ de cerca de 1 μΜ, mais

geralmente pelo menos cerca de 300, 30, 10, ou 3 nM, preferivelmente pelo menos cerca de 300, 100, 30, 10, 3, ou 1 pM. Devido à relação inversa dos valores de KcJ e afinidade, referências à ligação com um dado Kd “ou menor”

refere-se uma ligação com uma afinidade que é pelo menos tão elevada co- mo o valor numérico descrito, isto é com um KcJ que é pelo menos tão baixo,

como o valor citado. As afinidades de ligação podem ser determinadas por ELISA, ou por métodos de espectroscopia de ressonância de plasmon de superfície Biacore® (ver Exemplo 4), KinExA (ver Exemplo 3), ECL. Os anti- corpos não humanos apropriados também podem ser identificados usando os testes biológicos descritos no Exemplo 5, infra.

Um método exemplar de produzir anticorpos para CD200R inibi- tório anti-humano da presente invenção é descrito no Exemplo 2.

III. Humanização de anticorpos específicos para CD200R inibitó- rio humano

Qualquer anticorpo não humano apropriado pode ser usado co-

mo uma fonte para a região hipervariável de um anticorpo para CD200R ini- bitório anti- humano da presente invenção. As fontes para anticorpos não humanos incluem, mas não são limitadas a, roedores (por exemplo, camun- dongo, rato), Lagomorphs (incluindo coelhos), vacas e primatas não huma- nos. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas huma- nas (anticorpo recipiente) em que os resíduos de região hipervariável do re- 5 cipiente são substituídos por resíduos de região hipervariável de uma espé- cie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato, coelho ou pri- mata não humano tendo a especificidade e afinidade desejadas. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são en- contrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador, como as modifica- 10 ções feitas para ainda refinar o desempenho do anticorpo da atividade bioló- gica desejada. Para outros detalhes, ver Jones et al. (1986) Nature 321: 522- 525; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.

Métodos para engenheirar recombinantemente e produzir anti- corpos foram descritos , por exemplo, por Boss et al. (Pat. U.S. N0 4.816.397), Cabilly et al. (Pat. U.S. N0 4.816.567), Law et al. (Publicação de pedido de patente europeia N0 438 310) e Winter (pedido de patente euro- péia N0 239 400).

As variantes de seqüência de aminoácido de anticorpos para 20 CD200R inibitório anti- humano humanizados da presente invenção podem ser preparadas por introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas no DNA de CD200R inibitório anti- humano humanizado, ou por síntese de pep- tídeo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao construto final, desde que o construto final possuía as 25 características desejadas. As mudanças de aminoácido também podem alte- rar o processamento pós-translacional do anticorpo para CD200R inibitório anti-humano humanizado, como mudança do número ou posição dos sítios de glicosilação.

Um método utilizável para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo para CD200R inibitório anti-humano humanizado que são locais preferidos para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina" Cunningham e Wells (1989) Science 244: 1081-1085. Um grupo de resíduos de marcação é identificado (por exemplo, resíduos carregados co- mo Arg, Asp1 His1 Lys, e Glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para alterar a interação dos aminoácidos com CD200R inibitório humano. Os re- 5 síduos mostrando sensibilidade funcional para substituições de alanina são então refinados por introdução de outras substituições de aminoácidos. Em uma modalidade, o efeito de mutações em um dado códon alvo é determi- nado por varredura de alanina ou mutagênese aleatória seguida por análise da atividade e ligação das variantes de anticorpo para CD200R inibitório an- 10 ti-humano humanizado resultantes.

As inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões ami- no- e/ou carbóxi terminais na faixa de comprimento de um resíduo para poli- peptídeos contendo cem ou mais resíduos, assim como inserções intrasse- quência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inser- 15 ções terminais incluem anticorpo para CD200R inibitório anti-humano huma- nizado com um resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fusionado a uma etiqueta de epítopo. Outras variantes incluem a fusão de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida no soro de um anticorpo para o N- ou C-término.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoá-

cido. Estas variantes têm, pelo menos, um resíduo de aminoácido na molé- cula de anticorpo para CD200R inibitório anti-humano humanizado removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese substitucional incluem os laços hipervariáveis, mas as 25 alterações de FR são também contempladas. Os resíduos de região hiperva- riável ou resíduos de FR envolvidos na ligação de antígeno são geralmente substituídos em um modo relativamente conservativo.

Outras variantes de aminoácido do anticorpo alteram o padrão de glicosilação original do anticorpo, por exemplo por eliminação de uma ou mais porções de carboidratos e/ou adição de um ou mais sítios de glicosila- ção. Glicosilação de anticorpos é tipicamente ou N-Iigada ou O-ligada. N- Iigada refere-se à fixação da porção de carboidrato para a cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto proli- na, são as seqüências de reconhecimento para a fixação enzimática da por- ção carboidrato para a cadeia lateral de asparagina. A presença de uma 5 destas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glico- silação potencial. A glicosilação O-Iigada envolve a fixação de N- acetilgalactosamina, galactose, ou xilose em um hidroxiaminoácido, o mais comumente serina ou treonina, apesar de 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também poderem ser usada.

Os sítios de glicosilação podem ser adicionados aos anticorpos

da presente invenção por inserção de uma ou mais das seqüências de tri- peptídeos acima mencionadas (para sítios de glicosilação N-ligados), ou adi- ção de um ou mais resíduos de serina ou treonina (para sítios de glicosila- ção O-ligados).

Moléculas de ácido nucleico codificando variantes de seqüência

de aminoácidos de anticorpo específico para CD200R inibitório humano hu- manizado são preparadas por vários métodos bem conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de seqüências de aminoácidos de ocorrência 20 natural), ou por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese de PCR, ou mutagênese de cassete.

Comumente, as variantes de seqüências de aminoácidos do an- ticorpo para CD200R inibitório antí-humano humanizado terão uma seqüên- cia de aminoácidos tendo pelo menos 50% aminoácido identidade de se- 25 quência com as seqüências de aminoácido de anticorpo humanizado origi- nais de ou a cadeia pesada ou leve, preferivelmente pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, e o mais preferivelmente pelo menos 95%. Identidade ou homo- Iogia com relação a esta seqüência é definida aqui como a porcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência de candidato que são idênticas com 30 os resíduos de CD200R inibitório anti-humano humanizado quando as se- qüências são otimamente alinhadas (isto é, após o alinhamento das seqüên- cias e introdução dos espaços, se necessário, para alcançar uma identidade de seqüência percentual máxima) e não considerando quaisquer substitui- ções conservativas como parte da identidade de seqüência. Nenhuma den- tre as extensões, deleções ou inserções N-terminais, C-terminais, ou inter- nas na seqüência de anticorpo é considerada como afetando a identidade de seqüência ou homologia.

O anticorpo humanizado pode ser selecionado dentre qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE. Em uma mo- dalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgG. Qualquer isotipo de IgG pode ser usado, incluindo IgGi, IgG2, lgG3, e IgG4. Variantes dos isotipos de IgG 10 são também contemplados. O anticorpo humanizado pode compreender se- qüências de mais do que uma classe ou isotipo. A otimização das seqüên- cias de domínio constante necessárias para gerar a atividade biológica dese- jada é prontamente alcançada por triagem dos anticorpos nos testes biológi- cos descritos abaixo nos exemplos.

Do mesmo modo, qualquer classe de cadeia leve pode ser usa-

da nos compostos e métodos aqui presentes. Especificamente, capa, Iamb- da, ou variantes dos mesmos são utilizáveis nos presentes compostos e mé- todos.

Qualquer porção apropriada das seqüências de CDR a partir do 20 anticorpo não humano pode ser usada para criar os anticorpos humanizados da presente invenção. As seqüências de CDR podem ser mutagenizadas por substituição, inserção ou deleção, apesar destas mutações poderem ser mí- nimas devido à necessidade de manter a afinidade e especificidade de liga- ção de CD200R inibitório humano. Tipicamente, pelo menos 75% dos resí- 25 duos de CDR de anticorpo humanizado irão corresponder aos dos resíduos CDR não humanos, com maior frequência 90%, e o mais preferivelmente mais do que 95%, e com frequência 100%.

Qualquer porção apropriada das seqüências de FR do anticorpo humano pode ser usada. As seqüências de FR podem ser mutagenizadas por substituição, inserção ou deleção de, pelo menos, um resíduo de modo que a seqüência de FR é distinta da seqüência de anticorpo humano e não humano empregada. Contempla-se que estas mutações devam ser mínimas. Tipicamente, pelo menos 75% dos resíduos de anticorpo humanizado irão corresponder aos dos resíduos de FR humanos, mais frequentemente 90%, e o mais preferivelmente acima de 95%.

São também contemplados os anticorpos quiméricos ou frag- 5 mentos dos mesmos, desde que eles demonstrem a atividade biológica de- sejada (Pat. U.S. N0 4.816.567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad Sei. USA 81: 6851-6855). Como notado acima, os anticorpos quiméricos típicos compreendem seqüências de domínio constante de anticorpos de uma es- pécie ligada ao domínio variável de um anticorpo específico de antígeno ob- 10 tido a parir de espécies diferentes.

Os compostos de ligação da invenção podem compreendem an- ticorpos biespecíficos. Como usado aqui, o termo “anticorpos biespecíficos” refere-se a um anticorpo, tipicamente um anticorpo monoclonal, tendo espe- cificidade de ligação para pelo menos dois epítopos antigênicos diferentes. Em uma modalidade, os epítopos são do mesmo antígeno. Em outra moda- lidade, os epítopos são de dois diferentes antígenos. Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são bem conhecidos. Por exemplo, anticorpos bies- pecíficos podem ser produzidos recombinantemente usando a coexpressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina. Ver, por e- xemplo, Milstein et al. (1983) Nature 305: 537-39. Alternativamente, anticor- pos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Ver, por exemplo, Brennan, et al. (1985) Science 229: 81. Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos de fragmentos bi-específicos. Ver, por exemplo, Hollin- ger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber, et al., J. Imunol. 152: 5368 (1994).

Um método exemplar de humanizar os anticorpos para CD200R inibitório humano anti-humanos da presente invenção é descrito no Exemplo 2.

V. Caracterização de anticorpos específicos para CD200R inibi- tório humano

Os métodos descritos aqui foram usados para gerar anticorpos monoclonais imunorreativos com CD200R inibitório humano, como descritos em maiores detalhes nos Exemplos 1 e 2. Figuras 1 e 2 mostram os alinha- mentos de seqüência de regiões variáveis das cadeias leves e pesadas, res- pectivamente, de vários anticorpos para CD200R inibitório anti-humano da presente invenção. As regiões de CDR são indicados e a numeração é de 5 acordo com Kabat et al. (1991).

Um plasmídeo contendo as seqüências de ácido nucleico codifi- cando as cadeias leve e pesada de CD200R inibitório anti- humano foi depo- sitado de acordo com o Tratado de Budapeste em 6 de dezembro de 2006, junto ao ATCC (Manassas, Virginia, USA) sob Número de Acesso PTA- 10 8067. As seqüências de ácido nucleico codificando as cadeias leve e pesada e também codificando peptídeos de sinal são em um plasmídeo único opera- tivamente ligadas ao promotor de citomegalovírus (CMV). Os plasmídeos também contêm um cDNA DHFR operativamente ligado a uma repetição de terminal longo de vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV-LTR) pa- 15 ra a amplificação de plasmídeo e um gene higromicina B operativamente ligado ao promotor TK para seleção em células de mamíferos. A título de exemplo, o plasmídeo pode ser usado para transfectar uma linhagem de cé- lulas de mamífero dhfr ~ para expressão de uma proteína recombinante. Os exemplos de linhagens de células de mamíferos dhfr incluem mas não são 20 limitadas a CHO-DXB11 e DG44.) . Em uma modalidade, o composto de ligação é o anticorpo maduro produzido a partir do vetor de expressão tendo N0 de Acesso ATCC PTA-8067 (huDX182 com seqüência de sinal em plas- mídeo pACD200RV1) depositado 6 de dezembro de 2006 junto ao ATCC (Manassas, VA USA).

Em outra modalidade, o composto de ligação tem os mesmos

CDRs como o anticorpo produzido a partir do hibridoma tendo N0 de Acesso

ATCC_, depositado como cepa HC809.14F12.6.DX248.3 em

_, de dezembro de 2007.

Os CDRs de cadeia leve e pesada dos anticorpos da presente invenção são providos nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. A título de e- xemplo e não limitação, os CDRs de domínio Vl são selecionados dentre SEQ ID N-: 1, 2 e 3 e os CDRs de domínio Vh são selecionados dentre SEQ ID N-: 19, 20 e 21. Também a título de exemplo, e não limitação, os CDRs de domínio Vl são selecionados dentre RASKNIRSYLA (SEQ ID N°: 55), SEQ ID N0: 2 e SEQ ID N0: 3 e os CDRs de domínio Vh são selecionados dentre SEQ ID N-: 19, 20 e 21. A título de exemplo e não limitação, os C- 5 DRs de domínio Vl são selecionados dentre SEQ ID N-: 16, 17 e 18 e os CDRs de domínio Vh são selecionados dentre SEQ ID N-: 34, 35 e 35.

Tabela 2: CDRs de cadeia leve

Anti CDRL1 CDRL2 CDRL3 corpo huDX182 KASKNIRSYLA (SEQ ID SGSTLHS QQHHEYPLT No.:l) (SEQ ID No.:2) (SEQ ID No. :3) DX182 KASKNIRSYLA (SEQ ID SGSTLHS QQHHE YPLT No.:4) (SEOID No.:5) (SEQ ID No. :6) DX185 KAGKNINTNLA (SEQ ID SGSTLQS QQHNEFPLT No.:7) (SEQ ID No.:8) (SEOID No.:9) DX178 KASKN1SKYLA (SEQ ID SGSTLQS QQHNEFPLT (SEQ No.: 10) (SEQ ID No.: 11) IDNo.:12) DX184 KASQNVGSNVD (SEQ ID KASNRYT MQSLSFPYT No.: 13) CSEOID No.:14) (SEO ID No.: 15) DX248 QASQGTSINLN (SEQ ID S ANNLED LQITYLP WT No.: 16) (SEQ ID No.: 17) (SEO ID No.: 18) Tabela 3: CDRs de cadeia pesada

Anti CDRH1 CDRH2 CDRH3 corpo huDX182 G YTITSG YDW S YTNYGGSTNYKPSLGS YNEYKS YIYD WYFDF (SEO ID No.:19) (SEQ ID No.:20) (SEQ ID No.:21) DX182 GYTITS GYDW S YTNYGGSTNYKPSLGS YNE YKSYIYD WYFDF (SEQ ID No.:22 ) (SEO ID No.:23 ) (SEQ ID No.:24) DX185 GYTTTSGYDWS YTNYSGSTVYNPSLRS FEASNTYLYD WYFDF (SEQ ID No.:25 ) (SEQ ID No.26 ) (SEQ ID No.:27) DX178 GFTITSGYDWS YIGFSGSTVYNPSLNS SFVQNTFIYD WFFDF (SEQ ID No.:28 ) (SEQ DD No.:29 ) (SEQ ID No.:30) DX184 GFSLTN-NGVS AISSGGGTFYNSALKS DGD-----WDWYFDF (SEQ ID No.:31 ) (SEO ID No.:32) (SEQ ID No.:33) Anti CDRH1 CDRH2 CDRH3 corpo DX248 GYTFTS-YWMH NIYPGSGSTNYDEKFKS GTG----------AY (SEQ (SEQ ID No.:34) (SEO ID No.:35) ID No.:36) Seqüências são providas para as regiões de Vl e Vh humaniza- das e o anticorpo humanizado, huDX182 (SEQ ID N-: 42 e 48 respectiva- mente). Estas variáveis de domínio humanizado podem ser usadas para cri- ar anticorpos quiméricos de comprimento completo ou humanizados por adi- 5 ção das seqüências de domínio constante apropriadas.

Em uma modalidade da presente invenção, cadeias leves e pe- sadas de anticorpo huDX182 são criadas anexando os domínios constantes humanos (domínio constante de cadeia leve capa humana e de IgGI huma- no, respectivamente) para o C-término do humanizado Vl (SEQ ID N0: 42) e 10 regiões Vh (SEQ ID N0: 48). Seqüências de huDX182 cadeias leves e pesa- das são providas na SEQ ID N-: 49 e 50.

Em outra modalidade, anticorpos humanizados de comprimento completo são criados por substituição de resíduos de armação (isto é, os resíduos de aminoácido no domínio variável que não fazem parte de um CDR) dos anticorpos de formas quiméricas com seqüências de armação da linhagem germinal humana, como descrito em maiores detalhes no Exemplo

2. Os anticorpos resultantes retêm somente as seqüências de CDR dos anti- corpos de rato, com os domínios constantes e seqüências de armação subs- tituídos por seqüências derivadas humanas. As cadeias leves e pesadas 20 maduras de comprimento completo para anticorpo humanizado huDX182, excluindo seqüências de sinal, são providas em SEQ ID N-: 49 e 50 (Figu- ras 3 e 4), respectivamente.

Em uma outra modalidade, as cadeias leves e pesadas de com- primento completo dos anticorpos humanizados da presente invenção são 25 clonadas para ter um peptídeo de sinal em seu N-término para facilitar a se- creção de células quando o anticorpo é produzido. Em uma modalidade, uma seqüência de sinal de 19 aminoácidos é adicionada a ambas as cadei- as leve e pesada do anticorpo DX182 humanizado. As seqüências de DNA das cadeias leves e pesadas de comprimento completo de DX182 humani- zado, com seqüência de sinal adicionada, são providas em SEQ ID N-: 52 e 54 (Figuras 5A e 5B, Figuras 6A, 6B e 6C). Estas seqüências de DNA po- dem ser clonadas e expressadas em qualquer vetor de expressão apropria- 5 do para a produção dos anticorpos humanizados da presente invenção. Em outras modalidades, seqüências de sinal são adicionadas que são diferentes das seqüência de sinal específica provida, dependendo do método de pro- dução pretendido dos anticorpos. Estas seqüências de sinal podem ser obti- das da literatura científica, por exemplo Choo et al.(2005) “SPdb - a signal 10 peptide database,” BMC Bioinformatics 6:249. As seqüências de aminoácido de cadeias leves e pesadas de comprimento completo de DX182 humaniza- do, com seqüência de sinal adicionada, são providas em SEQ ID N-: 51 e 53 (Figuras 5A e 5B, Figuras 6A, 6B e 6C).

Em ainda outras modalidades, domínios constantes diferentes 15 podem ser anexados às regiões de Vl e Vh humanizadas aqui providas. Por exemplo, se um uso pretendido particular de um anticorpo (ou fragmento) da presente invenção fosse chamado para as funções de efetuador alteradas, um domínio constante de cadeia pesada diferente de IgGI pode ser usado. Apesar dos anticorpos de IgGI proporcionarem uma meia-vida longa e para 20 as funções de efetuador, como ativação complementar e citotoxicidade celu- lar dependente de anticorpo, estas atividades podem não ser desejáveis pa- ra todos os usos do anticorpo. Em tais casos, um domínio constante de lgG4, por exemplo, pode ser usado.

V. Afinidade e atividade biológica de Anti-CD200R humanizado Anticorpos tendo as características aqui identificadas como sen-

do desejáveis em um anticorpo para CD200R inibitório anti-humano humani- zado podem ser triadas para a atividade biológica inibitória i n vitro, in vivo, ou por medida da afinidade de ligação. Para triar os anticorpos que ligam ao mesmo epítopo em CD200R inibitório humano ligado por um anticorpo de 30 interesse (por exemplo, aqueles que ativam a função inibitória do receptor inibitório), um teste de bloqueio cruzado de rotina pode ser realizado como descrito in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- tory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente, o mapeamento de epítopos pode ser realizado para determinar se o anticorpo liga a um epítopo de interesse, por exemplo, como descrito em Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394. As afinidades de anticorpo (por exemplo, para 5 CD200R humano) podem ser determinadas usando métodos padrão, inclu- indo os descritos nos Exemplos 3 e 4. Os anticorpos humanizados preferidos são aqueles que ligam CD200R inibitório humano com um valor Kd de não mais do que cerca de 100 nM (1x10'7 M); preferivelmente não mais do que cerca de 10nM; mais preferivelmente não mais do que cerca de 1n M. Ainda 10 mais preferidas são as modalidades em que os anticorpos têm valores de Kd de não mais do que cerca de 200 pM (2x10"10 M), 100 pM, 50 pM, 20 pM, 10 pM, 5pM ou mesmo 2 pM.

Os anticorpos, e fragmentos dos mesmos, utilizáveis nos pre- sentes compostos e métodos incluem, mas não são limitados a anticorpos biologicamente ativos, e fragmentos. Como usado aqui, o termo “biologica- mente ativo" refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é ca- paz de ligar o epítopo antigênico desejado e exercer direta ou indiretamente um efeito biológico (por exemplo, ativar a atividade inibitória do receptor de CD200R inibitório humano). Como usado aqui, o termo “específico” refere-se à ligação seletiva do anticorpo para o epítopo do antígeno-alvo. Os anticor- pos podem ser testados para especificidade de ligação por comparação da ligação a CD200R inibitório humano, com a ligação a antígeno irrelevante ou mistura de antígenos sob um dado conjunto de condições. Como um exem- plo, um anticorpo é considerado como sendo específico se ele ligar a um CD200R inibitório humano com uma afinidade de pelo menos 10 vezes, e preferivelmente 50 vezes maior do que sua afinidade para um antígeno irre- levante ou mistura de antígenos. Por exemplo, Como usado aqui, um anti- corpo que “especificamente liga” a uma proteína de fusão compreendendo o domínio extracelular do CD200R inibitório humano e a porção Fe de IgGI humano, não liga a porção de Fe do IgGI sozinho ou quando ela é fusionada em uma proteína diferente de CD200R inibitório humano. Também a título de exemplo, e não limitação, o anticorpo ou composto de ligação derivado do sítio de ligação a antígeno de um anticorpo utilizável nos métodos da in- venção especificamente ou seletivamente liga o CD200R inibitório humano mas não liga especificamente ou seletivamente o CD200RLa humano mu- dado com CYS (ver, por exemplo, figura 9 e Exemplo 13) ou uma proteína 5 de fusão de CD200RLa humano (domínio extracelular de CD200RLa huma- no fusionado à porção Fe de IgGI humano, ver por exemplo 13).

V. Produção de anticorpo

Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucleico codificando é isolado e inserido em um vetor replicável para outra clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA codificando o anticorpo mo- noclonal é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos con- vencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são ca- pazes de ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes do ve- tor geralmente incluem, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: a seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marca- dores, um elemento intensificador, um promotor e uma seqüência de termi- nação de transcrição. Em uma modalidade, ambas as cadeias leve e pesada do anticorpo inibitório anti-humano humanizado da presente invenção são expressadas a partir do mesmo vetor, por exemplo, um plasmídeo ou um vetor adenoviral.

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica. Em uma modalidade, anticorpos são expressados em células de mamíferos ou insetos em cultura, como células 25 de ovário de hamster chinês CHO), células 293 de rim embriônico humano (HEK), células NSO de mieloma de camundongo, células de rim de hamster chinês (BHK), células ovarianas de Spodoptera frugiperda (Sf9). Em uma modalidade, anticorpos secretados a partir de células CHO são recuperados e purificados por métodos de cromatografia padrão, como proteína A, troca 30 catiônica, troca aniônica, interação hidrofóbica, e cromatografia de hidroxia- patita. Os anticorpos resultantes são concentrados e armazenados em 20 mM acetato de sódio, pH 5.5. Em outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são produzidos em levedura de acordo com métodos descritos no W02005/040395. Brevemente, os vetores codificando as cadeias leve e pe- sada individuais de um anticorpo de interesse são introduzidas em diferentes células de leveduras haploides, por exemplo, diferentes "mating types" da levedura Pichia pastoris, cujas células de leveduras haploides são autótrofos opcionalmente complementares. As células de leveduras haploides trans- formadas podem ser então acasaladas ou fusionadas para dar uma célula de levedura diploide capaz de produzir tanto a cadeias pesadas como as leves. A cepa diploide é então capaz de secretar o anticorpo biologicamente ativo e completamente montado. Os níveis de expressão relativos das duas cadeias podem ser otimizados, por exemplo, por uso de vetores de diferente número de cópia, usando promotores transcripcionais de diferentes resistên- cias, ou induzindo a expressão a partir de promotores indutíveis dirigindo a transcrição dos genes codificando uma ou ambas as cadeias.

Em uma modalidade, as cadeias pesadas e leves respectivas de uma pluralidade de diferentes anticorpos para CD200R inibitório anti- humano (os anticorpos “originais”) são introduzidas nas células de leveduras haploides, para criar uma biblioteca de cepas de leveduras haploides de "o- ne mating type" expressando uma pluralidade de cadeias leves, e uma bibli- otecas de cepas de leveduras haploides de um "mating type" diferente ex- pressando uma pluralidade de cadeias pesadas. Estas bibliotecas de cepas haploides podem ser reunidas (ou fusionadas como esferoplastos) para pro- duzir uma série de células de leveduras diploides expressando uma bibliote- ca combinatorial de anticorpos composta de várias permutações possíveis de cadeias leves e pesadas. A biblioteca combinatorial de anticorpos pode ser então triada para determinar se qualquer um dos anticorpos tem proprie- dades que sejam superiores (por exemplo, maior afinidade para CD200R inibitório anti-humano) com relação aos anticorpos originais. Ver, por exem- pio, W02005/040395.

Em outra modalidade, anticorpos da presente invenção são anti- corpos de domínio humano em que as porções de um domínio variável de anticorpo são ligadas em um polipeptídeo de peso molecular de aproxima- damente 13 kDa. Ver, por exemplo, Publicação de Pat. U.S. N0 2004/0110941. Estes agentes de domínio único, de baixo peso molecular, proporcionam várias vantagens em termos de facilidade de síntese, estabili- 5 dade e via de administração.

VI. Composições farmacêuticas e administração Para preparar as composições farmacêuticas ou estéreis dos anticorpos anti-huCD200R da presente invenção, o anticorpo é misturado com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Ver, por exem- pio, Remington1S Pharmaceuticai Sciences e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).

Formulações de agentes terapêuticos e diagnósticos podem ser preparadas por mistura de veículos fisiologicamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores na forma de, por exemplo, pós liofilizados, suspensões, 15 soluções aquosas, ou suspensões (ver, por exemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of terapeutics, McGraw- Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dek- 20 ker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Ta- belats, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner e Kotkoskie

(2000) Excipient Toxicity and Safety, Mareei Dekker, Inc., New York, NY). Em uma modalidade, anticorpos para CD200R inibitório anti-humanos da 25 presente invenção são diluídos em uma apropriada concentração na solução de acetato de sódio com pH 5-6, e NaCI ou sacarose é adicionado para toni- cidade. Os agentes adicionais, como polysorbate 20 ou polysorbate 80, po- dem ser adicionados para melhorar a estabilidade.

A toxicidade e eficácia terapêutica das composições de anticor- po, administradas sozinhas ou em combinação com outro agente, podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de cé- lulas ou animais experimentais, por exemplo, para determinação de LD50 (a dose letal para 50% da população) e o ED5O (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entre os efeitos tóxicos e terapêu- ticos é o índice terapêutico (LD5o/ ED50). Anticorpos demonstrando índices terapêuticos elevados são os preferidos. Os dados obtidos a partir destes 5 testes de cultura de células e estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosa- gem deste composto está preferivelmente na faixa de concentrações de cir- culação que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar nesta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a 10 via de administração.

O modo de administração não é particularmente importante. As vias apropriadas de administração incluem administração oral, retal, trans- mucosal, ou intestinal; liberação parenteral, incluindo injeção intramuscular, subcutânea, intramedular assim como injeções intratecal, intraventricular 15 direta intravenosa, intraperitoneal, intranasal, ou intraocular. Administração pode ser realizada em vários modos convencionais, como ingestão oral, ina- lação, insuflação, aplicação tópica ou cutânea, transdérmíca, subcutânea, intraperitoneal, parenteral, intra-arterial ou injeção intravenosa. A administra- ção intravenosa para o paciente é preferida.

Alternativamente, pode-se administrar o anticorpo em um local

em vez de um modo sistêmico, por exemplo, via injeção do anticorpo direta- mente em uma junta artrítica ou lesão induzida por patógeno caracterizada por imunopatologia, com frequência em um depot ou formulação de libera- ção sustentada. Além disso, pode-se administrar o anticorpo em um sistema 25 de liberação de fármaco marcado no alvo, por exemplo, em um Iipossoma revestido com um anticorpo específico de tecido, marcando o alvo de, por exemplo, junta artrítica ou lesão induzida por patógeno caracterizada por imunopatologia. Os Iipossomas serão marcados em e absorvidos seletiva- mente pelo tecido afetado.

O regime de administração depende de vários fatores, incluindo

a taxa de turnover de soro ou tecido do anticorpo terapêutico, o nível de sin- tomas, a imunogenicidade do anticorpo terapêutico, e a acessibilidade das células alvo na matriz biológica. Preferivelmente, o regime de administração libera anticorpo terapêutico suficiente para efetuar melhora no estado de do- ença-alvo, enquanto simultaneamente minimizando efeitos laterais indeseja- dos. Consequentemente, a quantidade de biológico liberado depende, em parte, do anticorpo terapêutico particular e a severidade da condição sendo tratada. Guia sobre a seleção de doses apropriadas de anticorpos terapêuti- cos é disponível ver, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Artrite, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Sla- mon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

Determinação da dose apropriada é feita pelo médico clínico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou presumidos na técni- ca para efetuar o tratamento. Geralmente, a dose começa com uma quanti- dade um pouco menor do que a dose ótima e é aumentada por incrementos 20 pequenos a seguir até o efeito desejado ou ótimo ser obtido com relação a qualquer efeito lateral negativo. Medidas diagnosticas importantes incluem as de sintomas de, por exemplo, a inflamação ou nível de citocinas inflama- tórias produzidas. Preferivelmente, um agente biológico que será usado é derivado da mesma espécie como o animal marcado para tratamento, assim 25 minimizando uma resposta inflamatória, autoimune ou proliferativa ao rea- gente. No caso de indivíduos humanos, por exemplo, anticorpos quiméricos, humanizados e completamente humanos são preferidos.

Anticorpos, fragmentos de anticorpo e citocinas podem ser pro- vidos por infusão contínua, ou por doses administradas, por exemplo, diari- amente, 1-7 vezes por semana, semanalmente, bissemanalmente, mensal- mente, bimensalmente etc. Doses podem ser providas intravenosamente, subcutaneamente, topicamente, oralmente, nasalmente, retalmente, intra- muscularmente, intracerebralmente, intraespinalmente, ou por inalação. A dose total semanal é geralmente pelo menos 0,05 pg/kg peso corporal, mais geralmente pelo menos 0,2 pg/kg, 0,5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg,

0,25 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg ou mais (ver, por exemplo, Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427- 434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, etal. (1999) J. NeuroL Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer I- munol. Imunother. 52:133-144). Doses também podem ser providas para obter uma concentração no alvo predeterminada de anticorpo para CD200R inibitório anti-humano no soro do indivíduo, como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 pg/ml ou mais. Em outras modalidades, um anticorpo humanizado de CD200R inibitório anti-humano da presente invenção é administrado subcu- taneamente ou intravenosamente, em uma base semanalmente, bisema- nalmente ou “a cada 4 semanas” a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 ou 2500 mg/ indivíduo.

Como usado aqui, “inibir” ou “tratar” ou “tratamento” inclui um adiamento do desenvolvimento dos sintomas associados com um distúrbio e/ou uma redução na severidade dos sintomas de tal distúrbio. Os termos ainda incluem melhorar sintomas não controlados ou indesejados existentes, 20 evitar sintomas adicionais, e melhorar ou prevenir as causas subjacentes de tais sintomas. Assim, os termos denotam que um resultado benéfico foi con- ferido a um indivíduo vertebrado com um distúrbio, doença ou sintoma, ou com o potencial para desenvolver tal distúrbio, doença ou sintoma.

Como usado aqui, os termos “quantidade terapeuticamente efi- 25 caz”, “dose terapeuticamente eficaz” e “quantidade eficaz” referem-se a uma quantidade de um composto de ligação de CD200R inibitório humano da invenção que, quando administrado sozinho ou em combinação com agente terapêutico adicional a uma célula, tecido, ou indivíduo, é eficaz para preve- nir ou melhorar um ou mais sintomas de uma doença ou condição ou a pro- 30 gressão desta doença ou condição. Uma dose terapeuticamente eficaz ainda refere-se à quantidade do composto de ligação suficiente para resultar em melhora dos sintomas, por exemplo, tratamento, cicatrização, prevenção ou melhora da condição médica relevante, ou um aumento na taxa de tratamen- to, cicatrização, prevenção ou melhora de tais condições. Quando aplicada a um ingrediente ativo individual, administrado sozinho, uma dose terapeuti- camente eficaz refere-se a este ingrediente sozinho. Quando aplicada em 5 uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz refere-se às quantida- des combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, sejam administrados em combinação, em série ou simultaneamente. Uma quantidade eficaz de um agente terapêutico irá resultar em uma melhora de uma medida diagnostica ou parâmetro em pelo menos 10%; geralmente por 10 pelo menos 20%; preferivelmente pelo menos cerca de 30%; mais preferi- velmente pelo menos 40%, e o mais preferivelmente por pelo menos 50%.

Métodos para a coadministração com um segundo agente tera- pêutico, por exemplo, citocina, outro anticorpo terapêutico, esteroide, agente quimioterapêutico, ou antibiótico são bem conhecidos do versado na técnica, 15 ver, por exemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of therapeutics, 10aed., McGraw-HiII, New York, NY; Poole e Peterson (eds.) (2001) Pharmaeotherapeuties for Advanced Praeti- ce: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner e Longo (eds.) (2001) Caneer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Wil- 20 Iiams & Wilkins, Phila., PA. A composição farmacêutica da invenção também contém agentes imunossupressivos ou imunomoduladores. Qualquer agente imunossupressivo pode ser empregado, incluindo mas não limitado a agen- tes anti-inflamatórios, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus (isto é, FK- 506), sirolimus, interferons, receptores de citocina solúveis (por exemplo, 25 sTNRF e slL-1R), agentes que neutralizam a atividade de citocina (por e- xemplo, inflixmab, etanercept), micofenolato mofetil, 15-deoxispergualina, talidomida, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexato e similares. A composição farmacêutica também pode ser empregada com outras modalidades terapêuticas como fototerapia e radiação.

Os compostos de ligação de CD200R inibitório humano da pre-

sente invenção também podem ser usados em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos. A título de exemplo e não limitação, os com- postos de ligação da presente invenção podem ser administrados concorren- temente com citocinas ou quimiocinas, assim como antes ou após antago- nistas (de outras citocinas (por exemplo anticorpos), incluindo mas não limi- tados a, IL-10, IL-23, IL-1 β, IL-6 e TGF-β. Ver, por exemplo, Veldhoen (2006) 5 Immunity 24:179-189; Dong (2006) Nat. Rev. Imunol. 6(4):329-333

VII. Usos

A presente invenção provê métodos para usar anticorpos para CD200R inibitório anti-humano engenheirados para o tratamento e diagnós- tico de distúrbios inflamatórios e condições, assim como distúrbios autoim- 10 munes e proliferativos, incluindo artrite reumatoide (RA), osteoartrite, artrite reumatoide osteoporose, fibrose inflamatória (por exemplo, escleroderma, fibrose do pulmão, e cirrose), distúrbios de intestino inflamatório (por exem- plo, Doença de Crohn, colite ulcerativa e doença de intestino inflamatório), asma (incluindo asma alérgica), alergias, COPD, esclerose múltipla, psoría- 15 se, uveite e câncer.

Muitas modificações e variações desta invenção podem ser fei- tas sem sair do espírito e escopo, como será evidente para o versado na técnica. A invenção, como definida pelos termos das reivindicações anexas, junto com o escopo completo de equivalentes ao qual as reivindicações se 20 referem. As modalidades específicas aqui descritas, incluindo os seguintes exemplos, são oferecidos a título de exemplo apenas, e não limitam, por seus detalhes, o escopo da invenção.

Exemplo 1

Métodos Gerais

Os métodos padrão em biologia molecular são descritos (Mania-

tis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook e Russell (2001) Mo- lecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San 30 Diego, CA). Os métodos padrão também aparecem em Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY1 que descreve a clonagem de células bacterianas e mutagê- nese de DNA (Vol. 1), clonagem em células de mamíferos e levedura (Vol. 2), glicoconjugados e expressão de proteína (Vol. 3), e bioinformática (Vol. 4).

Métodos para a purificação de proteína incluindo imunoprecipita- ção, cromatografia, eletroforese, centrifugação, e cristalização são descritos (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wi- Iey and Sons, Inc., New York). Análise química, modificação química, modifi- cação pós-translacional, produção de proteínas de fusa, glicosilação de pro- teínas são descritos (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2000) Current Proto- cols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausub- el, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Pro- ducts for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Phar- macia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Produ- ção, purificação, e fragmentação de anticorpos monoclonais e policlonais são descritos (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Imunology; Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow e Lane (1999) Using Antibodi- es, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow e Lane, supra). As técnicas padrão para a caracterização de interações Iigan- do/receptor são disponíveis (ver, por exemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Imunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).

Os anticorpos monoclonais, policlonais, e humanizados podem ser preparados (ver, por exemplo, Sheperd e Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann e Dubel (eds.) 25 (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow e Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Imu- nol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Imunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Bioi Chem. 272:10678- 30 10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote e Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Pat. U.S. N0 6.329.511).

Uma alternativa à humanização consiste em usar bibliotecas de anticorpo humano exibidas sobre bibliotecas de anticorpo humano ou fagos em camundongos transgênicos (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom e Chames (2000) Imunol. Today 5 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Dispiay.A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al.

(1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Aca- demic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

Os anticorpos de cadeia única e diacorpos são descritos (ver,

por exemplo, Malecki et al. (2002) Proc. Nati Acad. Sei. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson e Kortt (1999) J. Imunol. Methods 231:177-189; e Pat. U.S. N0 4,946,778). Os anticorpos bifuncionais são pro- 15 vidos (ver, por exemplo, Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Imunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segai, et al. (2001) J. Imunol. Me- thods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Trau- 20 necker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; e Pat. U.S. Nos. 5.932.448, 5.532.210, e 6.129.914).

Os anticorpos biespecíficos são também providos (ver, por e- xemplo, Azzoni et al. (1998) J. Imunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Imunol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. 25 (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Imunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Imunol. 17:875).

Purificação de antígenos não é necessária para a geração de anticorpos. Os animais podem ser imunizados com células contendo o antí- geno de interesse. Os esplenócitos podem ser então isolados dos animais imunizados, e os esplenócitos podem fundir com uma linhagem de células mileomas para produzir um hibridoma (ver, por exemplo, Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Pres-

ton et al., supra', Kaithamana et al. (1999) J. Imunol. 163:5157-5164).

Anticorpos irão geralmente ligar com pelo menos um KcJ de cer- ca de 10'6 M, tipicamente pelo menos 10'7 M, mais tipicamente pelo menos 5 10'8 M, preferivelmente pelo menos cerca de 10*9 M, e mais preferivelmente pelo menos 10'10 M, e o mais preferivelmente pelo menos 10'11 M (ver, por exemplo, Presta et al. (2001) Thromb. Haemost. 85:379-389; Yang et al.

(2001) Crit. Rev. OncoL Hematol. 38:17-23; Carnahan et al. (2003) Clin. Cancer Res. (Suppl.) 9:3982s-3990s).

Anticorpos podem ser conjugados, por exemplo, a moléculas de

fármacos pequenas, enzimas, lipossomas, polietileno glicol (PEG). Anticor- pos são utilizáveis para fins terapêutico, diagnósticos, kit ou outros, e inclu- em anticorpos copulados, por exemplo, a corantes, radioisótopos, enzimas, ou metais, por exemplo, ouro coloidal (ver, por exemplo, Le Doussal et al. 15 (1991) J. Imunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Imunol. 160:3891- 3898; Hsing e Bishop (1999) J. Imunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Imunol. 168:883-889).

Métodos para citometria de fluxo, incluindo classificação de célu- las ativadas por fluorescência (FACS), são disponíveis (ver, por exemplo, 20 Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principies for Clinicai Laboratory Practi- ce, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, Ptd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Os reagentes fluorescentes apropriados para modificar ácidos nucleicos, incluindo inciadores e sondas de ácido nucléico, 25 polipeptídeos e anticorpos, para uso, por exemplo, como reagentes diagnós- ticos, são disponíveis (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Pro- bes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

Métodos padrão de histologia do sistema imune são descritos (ver, por exemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopa- thology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, e Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-HiII, New York, NY). Os pacotes de software e bases de dados, para dterminar, por exemplo, fragmento antigênicos, seqüências líder, duplicação de proteína, domínios funcionais, sítios de glicosilação, e alinhamentos de seqüência, são disponíveis (ver, por exemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, 5 lnc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Appli- cations Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von 10 Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

Exemplo 1

Anticorpos monoclonais para CD200R inibitório anti-humano de rato

Anticorpos monoclonais para CD200R inibitório humano foram obtidos como a seguir. Ratos Lewis fêmeas com oito semanas de idade 15 (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana, USA) receberam uma série de injeções de uma proteína de fusão imunogênica compreendendo o domí- nio extracelular do CD200R de receptor inibitório humano fusionado à por- ção Fe de IgGI humano (ver, Wright et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046, aqui incorporado por referência em sua totalidade). Os resíduos extracelula- 20 res foram subclonados em sítio Xho 1 de um plasmídeo de expressão de pCDM8.lg modificado (E.E. Bates et al (1998) Mol. Imunol. 35:513). Proteína foi produzida após a transfecção ou infecção de 293T ou 293FT como des- crito em Cherwinski et al (2005), J. Imunol. 174:1348). As injeções foram dadas em dias 0, 14, 32, 46, e 83.

A injeção de dia 0 foi uma injeção subcutânea (sc) de 50 pg de

proteína de fusão de Fc CD200R-lgF1 humano em adjuvante completo de Freund. Nos dias 14, 32 e 46, os ratos receberam injeções ip de 25 pg de proteína de fusão Fc de CD200R - IgGI humano em adjuvante incompleto de Freund. No dia 83, a injeção foi uma combinação de uma injeção ip de 20 30 pg de proteína de fusão Fc de CD200R IgGI humano em adjuvante incom- pleto de Freund e uma injeção intravenosa (iv) na veia da cauda de proteína de fusão Fc de CD200R - IgGI humano em solução salina. Um sangramento de teste foi realizado no dia 53. A fusão dos esplenócitos do rato foi realizada no dia 87, usando 1,6 X 108 esplenócitos e 1,8 X 108 células mieloma divididos em trinta placas de 96 poços, dando um total de 1,13 X 105 células totais por poço.

A triagem primária dos anticorpos monoclonais resultantes (mi-

lhares) foi realizada por ELISA indireta em proteína de fusão Fc de CD200R - IgGI humano. As triagens secundárias nos anticorpos resultantes incluíram a coloração específica de CD200R humano expressando transfectantes e células-tronco humanas cultivadas humanas. As experiências subsequentes 10 foram realizadas para confirmar que os anticorpos candidatos foram capazes de ligar a CD200R humano expressando células-tronco e que os anticorpos foram usados em vários fins terapêuticos, diagnósticos, e/ou de pesquisa. Esta triagem pode ser feita usando testes de ligação (como ELISA indireto ou ELISA sanduíche), por teste de atividade in vitro ou por teste de atividade 15 in vivo, cujos exemplos são dados aqui.

DX176, DX177 e DX178 foram gerados em HC612 Dx182 e DX184 foi gerado em HC618.

Uma proteína de fusão cino - CD200R inibitória (domínio extra- celular do CD200R inibitório cino fusionado na porção Fe de IgGI humano) foi usada como o imunogene em camundongos fêmeas Bafb/c para gerar o anticorpo para CD200R anticino de camundongo DX248 utilizando o método acima. O CD200R anticino de camundongo (DX248) foi gerado em HC809.

O hibridoma tendo N0 de Acesso ATCC_, depositado como cepa

HC809.14F12.6.DX248.3 em .... de dezembro de 2007. O isotipo do anticor- po produzido é camundongo IgGI-capa.

Exemplo 2

Humanização de anticorpos para CD200R inibitório anti-humano de rato

A humanização de anticorpo monoclonal para CD200R inibitório anti-humano de rato huDX182 foi realizada essencialmente como descrito nos WO 2005/047324 e WO 2005/047326, cujas descrições são aqui incor- poradas por referência em suas totalidades. Brevemente, os domínios cons- tantes humanos foram usados para substituir os domínios constantes paren- tais (rato), e seqüências de linhagem germinal humana homólogas às se- qüências de domínio variável de rato foram selecionados e usados para pro- ver uma armação humana para os CDRs de rato, como descrito em maiores detalhes abaixo.

Procedimento para seleção de seqüências de armação de linha-

gem germinal humana

As seguintes etapas foram usadas na seleção de seqüências de armação de linhagem germinal apropriada na humanização dos anticorpos para CD200R inibitório anti-humano da presente invenção.

1) Domínios Vl e Vh não humanos de seqüência e clone e de-

terminação de seqüência de aminoácido

Cadeia pesada

2) Comparar a seqüência de Vh não humana com um grupo de cinco seqüências de aminoácido de linhagem germinal Vh ; uma representa-

tiva de subgrupos IGHV1 e IGHV4 e três representativas de subgrupo I- GHV3. Os subgrupos Vh são listados em M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclatu- re of the Human Imunoglobulin Heavy (IGH) Genes", Experimental and Clini- cai Imunogenetics1 18:100-116. Comparação das cinco seqüências de linha- gem germinal é realizada como a seguir:

A) Designar os números de resíduo de seqüência Vh não huma-

na de acordo com Kabat et al. (1991).

B) Alinhar a seqüência Vh não humana com cada uma das cinco seqüências de linhagem germinal humana. Porque os genes V somente compreendem resíduos de Vh 1-94, somente estes resíduos são considera-

dos no alinhamento.

C) Delinear as regiões de determinação de complementaridade (CDR) e armação (FR) na seqüência. CDR e FR são definidos como uma combinação das definições providas em Kabat et al. (1991) (Id.) e Chothia e Lesk (1987) "Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Imuno-

globulins", Journal of Molecular Biology, 196:901-917.A definição é assim: Vh CDR1 = 26-35, CDR2 = 50-65, CDR3 = 95-102.

D) Para cada posição de resíduo listado abaixo (Tabela 4), de- signar um escore numérico em cada posição de resíduo para a qual as se- quencias não humana e humana são IDÊNTICAS:

Tabela 4

Resíduo N0 Escore Fundamento 2 4 Afeta CDR-H 1,3* 4 3 Afeta CDR-H1,3 24 3 Afeta CDR-H1 26 4 Afeta CDR-H1* 27 4 Afeta CDR-H 1,3* 29 4 Afeta CDR-H1* 34 4 Afeta CDR-H1* 2 Interface VhA/l 37 2 Interface VH/VL 39 2 Interface VH/VL 44 2 Interface VH/V|_ 45 2 Interface VH/VL 47 4 Interface Vh/Vl, CDRL3 48 3 Afeta CDR-H2 49 3 Afeta CDR-H2 50 2 Interface V hA/l 51 3 Afeta CDR-H2 58 2 Interface VH/VL 59 3 Afeta CDR-H2 60 2 VH/VL interface 63 3 Afeta CDR-H2 67 3 Afeta CDR-H2 69 3 Afeta CDR-H2 71 4 Afeta CDR-H2* 73 3 Afeta CDR-H1 76 3 Afeta CDR-H1 78 3 Afeta CDR-H1 Resíduo N0 Escore Fundamento 91 2 Interface VH/VL 93 3 Afeta CDR-H3 94 4 Afeta CDR-H3* max 89 * Notado como afetando a conformação de CDR em C. Chothia et ai. (1989) "Conformations of Imunoglobulin Hypervariable Regions", Nature 342:877- 883.

E) Adicionar todos os escores de posição de resíduo. A sequên- 5 cia de linhagem germinal do aceitador é a com o maior escore total. Em um caso onde duas ou mais seqüências de linhagem germinal tem escores idên- ticos, então:

1) Dentre as seguintes posições de resíduo, adicionar 1 ao total para cada posição onde as seqüências não humana e humana são IDÊNTI-

CAS: 1, 3, 5-23, 25, 36, 38, 40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79-90, 92 (máximo 49).

2) A seqüência de linhagem germinal do aceitador é uma com o maior escore total. Se duas ou mais seqüências de linhagem germinal têm escores idênticos, qualquer uma é aceitável como o aceitador.

Cadeia leve

III) Se a seqüência Vl for um membro da subclasse capa de Vl, comparar a seqüência de Vl não humana a um grupo de quatro seqüências de aminoácido de linhagem germinal Vl capa humana. O grupo de quatro é composto de um representante de cada um dos quatro subgrupos de Vl hu- 20 manos estabelecidos, listados em Barbie e Lefranc (1998) "The Human Imu- noglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Ex- perimental and Clinicai Imunogenetics, 15:171-183, e M.-P. Lefranc (2001) "Nomenclature of the Human Imunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experi- mental and Clinicai Imunogenetics, 18:161-174. Os quatro subgrupos tam- 25 bém correspondem aos quatro subgrupos listados em Kabat et al. (1991) em pp. 103-130. Comparação com as quatro seqüências de linhagem germinal é realizada como a seguir: A) Designar os números de resíduo de seqüência Vl não huma- na de acordo com Kabat et al. (1991).

B) Alinhar a seqüência de Vl não humana com cada uma das cinco seqüências de linhagem germinal humana. Porque os genes V somen-

te compreendem resíduos de Vl 1-95, somente estes resíduos são conside- rados no alinhamento.

C) Delinear as regiões de determinação de complementaridade (CDR) e armação (FR) na seqüência. CDR e FR são definidos como uma combinação das definições providas em Kabat et al. (1991) {!d.) e Chothia e

Lesk (1987) "Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Imuno- globulins", Journal of Molecular Biology, 196:901-917.A definição é assim: Vl CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56, CDR3 = 89-97.

D) Para cada posição de resíduo listado abaixo (Tabela 4), de- signar um escore numérico em cada posição de resíduo para a qual as se-

quências não humana e humana são IDÊNTICAS:

Tabela 5

Resíduo N0 Escore Fundamento 2 4 Afeta CDR-L1,3* 4 3 Afeta CDR-L1,3 4 Afeta CDR-L1* 29 4 Afeta CDR-L1,3* 33 4 Afeta CDR-L1,3* 34 2 Interface VLA/H 36 2 Interface VL/VH 38 2 Interface VL/VH 43 2 Interface VL/Vh 44 2 Interface VL/VH 46 4 Interface VL/VH, CDR-H3 47 3 Afeta CDR-L2 48 4 Afeta CDR-L2* 49 2 Interface Vl/Vh 55 2 Interface Vl/Vh Resíduo N0 Escore Fundamento 58 3 Afeta CDR-L2 62 3 Afeta CDR-L2 64 4 Afeta CDR-L2* 71 4 Afeta CDR-L1* 87 2 Interface Vl/Vh 89 2 Interface VL/VH 90 4 Afeta CDR-L3* 91 2 Interface Vl/Vh 94 2 Interface V|_/VH 95 4 Afeta CDR-L3* * Notado como afetando a conformação de CDR em C. Chothia et al. "Con- formations of Imunoglobulin Hypervariable Regions", Nature 342:877-883, 1989.

E) Adicionar todos os escores de posição de resíduo. A sequên- cia de linhagem germinal do aceitador é a com o maior escore total. Em um caso onde duas ou mais seqüências de linhagem germinal tem escores idên- ticos, então:

1) Dentre as seguintes posições de resíduo, adicionar 1 ao total para cada posição onde as seqüências não humana e humana são IDÊNTI-

CAS: 1, 3, 5-23, 35, 37, 39-42, 57, 59-61, 63, 65-70, 72-86, 88.

2) A seqüência de linhagem germinal do aceitador é uma com o maior escore total. Se duas ou mais seqüências de linhagem germinal tem escores idênticos, qualquer uma é aceitável como o aceptor.

Se a seqüência Vl for um membro da subclasse Iambda de VL, um procedimento análogo é realizado usando as seqüências de aminoácido de linhagem germinal Iambda Vl a partir das fontes da literatura citadas aci- ma.

Humanização de anticorpos para CD200R inibitório anti-humano

Com relação à modificação dos domínios constantes, os domí- nios variáveis leve e pesado de anticorpo huDX182 (CD200R inibitório anti- humano de rato) foram clonados e fusionado a uma cadeia leve capa huma- na (domínio CL) e cadeia pesada de IgGI humano (CH1-gancho-CH2-CH3), respectivamente. Esta combinação dos domínios variáveis de rato e domí- nios constantes humanos compreende uma versão quimérica de anticorpo huDX182.

5 Com relação à modificação das regiões de armação dos domí-

nios variáveis, a seqüência de aminoácido do domínio Vh de anticorpo DX182 foi comparada a um grupo de cinco seqüências de aminoácido de linhagem germinal Vh humana; uma representativa de subgrupos IGHV1 e IGHV4 e três representativas de subgrupo IGHV3. Os subgrupos Vh são Iis- 10 tados em M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Imunoglobulin Heavy (IGH) Genes," Experimental and Clinicai Imunogenetics, 18:100-116, 2001. Anticorpo 16C10 apresentou o maior escore contra a linhagem germinal de cadeia pesada humana DP-71 em subgrupo IV.

A seqüência Vl de DX182 foi a subclasse capa. Esta seqüência foi comparada a um grupo de quatro seqüências de aminoácido de linhagem germinal Vl capa humana. O grupo de quatro é composto de um represen- tante de cada um dos quatro subgrupos de Vl humanos estabelecidos, rela- cionados em V. Barbie & M.-P. Lefranc, "The Human Imunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segments", Experimental and Clinicai Imunogenetics, 15:171-183, 1998 e M.-P. Lefranc, "Nomenclature of the Human Imunoglobulin Kappa (IGK) Genes", Experimental and Clinicai Imunogenetics, 18:161-174, 2001. Os quatro subgrupos também correspon- dem aos quatro subgrupos listados em Kabat et al. (1991) em páginas 103- 130. Anticorpo DX182 apresentou o maior escore contra linhagem germinal de cadeia leve humana Z-012 em subgrupo II.

Uma vez que as seqüências de armação de linhagem germinal desejadas foram determinadas, foi gerado um plasmídeo codificando as ca- deias pesada e leve variáveis humanizadas de comprimento completo. A substituição de resíduos de armação humana em vez dos resíduos de arma- 30 ção do anticorpo DX182 de rato parental pode ser vista de modo equivalente que o enxerto dos CDRs de DX182 de rato sobre as seqüências de armação humana. O anticorpo resultante é referido aqui como “hu DX182 wt”, com o “wt” designado a presença dos mesmos CDRs com o DX182 de rato paren- tal, como distinto dos CDRs otimizados.

Ambos os domínios variáveis de cadeia leve e pesada foram otimizados em códons, sintetizados e inseridos sobre os domínios constan- 5 tes, de modo a prover uma expressão potencialmente ótima. A otimização de códons, que pode melhorar a expressão de anticorpos clonados é pura- mente opcional.

As seqüências de aminoácidos das cadeias leve e pesada de anticorpo humanizado DX182 são providas em figuras 3 e 4 respectivamen- te, e em SEQ ID N-: 49 e 50. Visando clareza com relação à nomenclatura, é importante reconhecer que o sistema de numeração Kabat inclui designa- ções de resíduo de aminoácido não numéricas (por exemplo, resíduos de Vh 83a, 83b, 83c) de modo a acomodar variações nos comprimentos de CDRs e regiões de armação dentre os vários anticorpos. Apesar deste sistema de numeração ser vantajoso ao permitir uma fácil referência aos resíduos de aminoácido correspondentes dentre os vários anticorpos com CDRs de dife- rentes comprimentos, isto pode resultar em conflito de designações para resíduos de aminoácidos específicos quando comparados com numeração de se sequencial-numérica estrita (por exemplo Listagens de Seqüência). As designações de resíduo de aminoácido são feitas com referência à listagem de seqüência relevante, salvo de outra forma notado, por exemplo por refe- rência a “numeração Kabat”.

SEQ ID N-: 50 e 49 não incluem um peptídeo de sinal N termi- nal e representam a forma madura da proteína. Uma forma madura da prote- ína representa uma proteína sem a seqüência de sinal. SEQ ID N-: 51 e 53 incluem um peptídeo de sinal N terminal.

figura 9 é uma ilustração exemplar domínios leves e pesados humanizados para o anticorpo DX248.

Exemplo 3

Determinação da constante de dissociação de equilíbrio (Kd) pa-

ra anticorpos para CD200R inibitório anti- humano usando tecnologia Kinexa As constantes de dissociação de equilíbrio (Kd) para anticorpos para CD200R inibitório anti-humano foram determinadas usando o instru- mento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, Idaho, USA). KinExA usa o princípio do método de teste de exclusão cinética com base na medida da concentração de anticorpo não complexado em uma mistura de anticor- 5 po, antígeno e complexo anticorpo - antígeno. Ver, por exemplo, Darling e Brault (2004) Assay Drug Dev. Technol. 2(6):647-57. A concentração do an- ticorpo livre é medida por exposição da mistura a um antígeno imobilizado em fase sólida para um período de tempo muito breve. Na prática, isto é ob- tido fluindo a mistura antígeno-anticorpo em fase de solução além das partí- 10 cuias revestidas com antígeno aprisionadas em uma célula de fluxo. Os da- dos gerados pelo instrumento são analisados usando software feito por en- comenda. As constantes de equilíbrio são calculadas usando uma teoria ma- temática com base nas seguintes considerações:

1. A ligação seguinte a equação de ligação reversível para equi-

líbrio:

kon [Ab] [Ag] = koff [AbAg], onde K0 = K3f1Ikon

2. Anticorpo (Ab) e antígeno (Ag) ligam 1:1 e anticorpo total se igual ao complexo antígeno-anticorpo (AbAg) mais o anticorpo livre.

3. O sinal do instrumento está linearmente relacionado com a concentração de anticorpo livre.

A análise KinExA foi realizada em vários anticorpos para CD200R inibitório anti-humano de rato, variantes humanizadas dos mesmos, e variantes de seqüência destes anticorpos humanizados. Uma proteína de fusão consistindo no domínio extracelular do CD200R receptor inibitório hu- 25 mano fundida à porção Fe de IgGI de humano (ver, Wright et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046, aqui incorporado por referência em sua totalidade) foi usado tanto em fases imobilizadas como em solução para cada determi- nação de KinExA. As partículas de poli(metil-metacrilato) (PMMA) (98 mi- cron) foram revestidas com CD200R-lg humano biotinilado de acordo com 30 Sapidyne “Protocol for coating PMMA particles with biotinylated Iigands ha- ving short or nonexistent Iinker arms.” Todos os procedimentos experimen- tais foram feitos de acordo com o manual KinExA 3000. Todos os ciclos fo- ram feitos em duplicata.

As condições para KinExA são providas em Tabela 6.

Tabela 6

Protocolo Kinexa volume da amostra: 2 ml taxa de fluxo da amostra: 0,25 ml/min volume do rótulo 1 ml taxa de fluxo do rótulo: 0,25 ml/min conc. de anticorpo: 0,05 nM maior conc. de antígeno 40 nM menor conc. antígeno: 40 pM As diluições em série de duas vezes do antígeno foram prepara- das e misturadas com o anticorpo em concentração constante. A mistura foi incubada durante 2 horas a 25 0C para equilibrar.

TABELA 7

_Valores de Kd Determinados por KinExA_

mAb para CD200R inibitório anti-humano de rato Kd(pM) DX182 56 DX185 126 DX178 628 DX177 507 DX184 26 DX176 833,8 Exemplo 4

Determinação da constate de dissociação de equilíbrio (Kd) para anticorpos para CD200R inibitório anti-humano de rato usando tecnologia Biacore

As atividades de ligação cinética de anticorpos para CD200R inibitório anti- humano contra uma proteína de fusão consistindo no domínio extracelular do CD200R de receptor inibitório humano fusionado à porção de 15 Fe de IgGI de humano (ver, Wright et al (2003) J. Immunol 171:3034-3046, aqui incorporado por referência em sua totalidade) foram medidas por res- sonância de plasmon de superfície usando um sistema BIAcore 3000 (BIA- core AB1 Upsalla, Suécia). O formato de teste usou a proteína de fusão cap- turada por IgG Fcy anti-humano com uma titulação de anticorpo anti- huCD200R na fase móvel. Aproximadamente 5000RUs de IgG anti-humano de cabra, Fragmento Affinipure F(ab’)2, fragmento Fcy específico (Jackson 5 ImunoResearch, Cat N0 109-006-098) foram imobilizados em um Chip Sen- sor CM5 (tipo de pesquisa, BR-1000-14) via química de copulação de amina. O tampão HBS-EP (BR-1001-88) foi usado como o tampão de ciclagem em uma taxa de fluxo de 5pL/min. Cada ciclo de análise foi precedido por cargas novas do chip com huCD200R. O anticorpo anti-huCD200R em concentra- 10 ções variadas (133 e 13,3 nM) foi injetado sobre superfícies de huCD200R capturadas em uma taxa de fluxo de 5pL/min. Após cada ciclo de injeção, a superfície do chip CM5 foi regenerado usando uma série de soluções (solu- ção 10mM HCI e 10mM Glicina pH 1,5) a uma taxa de fluxo de 50 pL/min.

Os sensorgramas de ligação de subtração de fundo foram usa- dos para analisar a constante de associação (ka) e dissociação (kd) de taxa e a constante de dissociação de equilíbrio KD. Os conjuntos de dados resul- tantes foram configurados com um modelo de análito correspondente usan- do o software usando BIAevaIuation (versão 4.0.1).

Tabela 8

_Valores Kd Determinados por Biacore_

mAb de CD200R inibitório anti-humano de rato Kd(pM) DX182 24 DX185 202 DX178 1620 DX177 1680 DX184 1930 DX176 7110 Exemplo 5

Teste de desgranulação de células tronco para anticorpos para CD200R inibitórios anti-humano de rato

A capacidade dos anticorpos para CD200R inibitório anti- humano de rato para ativar o e CD200R inibitório humano foi medida em um bioteste de desgranulação de células-tronco de murinos. Uma linhagem de células-tronco de murinos derivada de medula óssea foi transfectada para expressar o CD200R inibitório humano e a capacidade dos anticorpos para inibir a desgranulação de células-tronco avaliada.

5 Materiais e Métodos

Linhagem de células-tronco: A linhagem de células-tronco de murinos foi derivado da medula óssea de camundongos C57BL6 (Wright, G.J. et al., 2003, J. Imunol. 171:3034). cDNA codificando o CD200R humano de comprimento completo foi subclonado no vetor de expressão retroviral 10 pMXneo (provido por T. Kitamura, University of Tokyo, Tokyo, Japão). DNA plasmídeo foi transfectado em linhagem de células de embalagem de vírus ecotropic Phoenix (provida por Gary Nolan, Stanford University, Stanford, CA), e os vírus obtidos foram usados para infectar as células-tronco de mu- rinos, que foram subsequentemente selecionadas em meios contendo 1 15 mg/ml G418 (método em Onishi, M.et al., 1996, Exp. Hematoi 24:324). Após 1-2 semanas em condições de seleção de fármaco, as células foram anali- sadas por citometria de fluxo para expressão do receptor sobre a superfície da célula usando anticorpos específicos do receptor.

Teste de desgranulação: Anticorpos: DX176, DX177, DX178, DX184, DX185, DX182 e lgG2a de rato (anticorpo de controle de isotipo, Pharminogen #553926). Estímulo: DX89 um CD200RLa anticamundongo (CD200R ativante de murinos)

Titulações de anticorpos anti-CD200R ou controle de isotipo fo- ram feitos em uma placa de fundo plano de 96 poços em 50 ul de meio de 25 teste (RPMI, 1%BSA, 25 mM Hepes). As células-tronco de murinos expres- sando huCD200R (DT762) foram giradas e recolocadas em suspensão em 4X106/ml, 50 ul/ poço foram adicionados às titulações de anticorpos e incu- bados durante 20 min, temperatura ambiente. O anticorpo DX89 estimulante (CD200Rla ativante anti-murino, Zhang, S et al (2004) J. Immunol. 173:6786) 30 foi então adicionado em 50 ul/poço de modo que a concentração final foi de 0,1 ug/ml. Células foram cultivadas a 37°, 5% CO2 durante 1 h. No final do período de estimulação, 20 ul foram removidos de cada poço e transferidos para 60 ul 1,3 mg/ml substrato de beta-hexosaminidase (4-nitrofeniN-acetil- b-D-glucosaminida, Sigma N9376). A reação de sobrenadante/substrato pre- cedida por 3,5 hora, 37°C. Reação foi parada pela adição de 0,2M glicina, pH 10,7 e OD405-650 foi medido usando uma leitora de microplaca (Molecu- 5 Iar Devices, Sunnyvale, CA) para avaliar a extensão de desgranulação. Re- sultados são providos em figura 7.

IC50 para um anticorpo para CD200R inibitório anti-humano de interesse é a concentração do anticorpo requerida para inibir o nível de des- granulação de células-tronco a cerca de 50% do nível observado na ausên- cia de qualquer anticorpo adicionado para CD200R inibitório anti-humano. Exemplo 6

Teste de desgranulação de células-tronco para anticorpo para CD200R inibitório anti-humano de rato humanizado

As células-tronco de camundongos expressando CD200R hu- mano foram usadas para avaliar a capacidade de DX182 humanizado para inibir a desgranulação. O DX182 humanizado foi também avaliado para a capacidade de ligar a células como medido por citometria de fluxo.

Materiais e métodos:

Células: linhagem de células-tronco de murinos derivadas de medula óssea transfectadas para expressar CD200R humano (DT762).

Anticorpos: PAB 1219, CD200R anti-humano de rato PAB 1337, DX182 humano recombinante PAB 1337, DX182 humano recombinante, fármaco em bruto PAB 1336, (PAB 1337 diluído)

lgG2a de rato, anticorpo de controle de isotipo, Pharmingen

#553926

Estímulo: CD200RLa anticamundongo DX89 (CD200R ativante

de murinos)

Teste de desgranulação: O teste de desgranulação foi feito co- mo descrito no Exemplo 5. Titulações de anticorpos anti-CD200R ou controle de isotipo foram feitos em uma placa de fundo plano de 96 poços em 50 ul de meio de teste (RPMI, 1% BSA, 25 mM Hepes). As células-tronco de ca- mundongos expressando huCD200R (DT762) foram giradas e recolocadas em suspensão em 4X106/ml, 50 ul/ poço foram adicionados às titulações de anticorpos e incubados durante 20 min, temperatura ambiente. O anticorpo DX89 estimulante foi então adicionado em 50 ul/poço de modo que a con- 5 centração final foi de 0,1 ug/ml. Células foram cultivadas a 37°, 5% CO2 du- rante 1 h. No final do período de estimulação, 20 ul foram removidos de cada poço e transferidos para 60 ul 1,3 mg/ml substrato de beta-hexosaminidase (4-nitrofeniN-acetil-b-D-glucosaminida, Sigma N9376). A reação de sobrena- dante/substrato precedida por 3,5 horas, 37°C. Reação foi parada pela adi- 10 ção de 0,2M glicina, pH 10,7 e OD405-650 foi medido para avaliar a exten- são de desgranulação. Resultados são providos em figura 8.

Citometria de fluxo. A ligação de anticorpos anti-CD200R a célu- las expressando Cd200R foi avaliada por citometria de fluxo. As células DT762 foram incubadas com 10 ug/ml anticorpo, 5X105 células em 100 ul de 15 meio de teste (D-PBS, 1% BSA, 0,05% NaN3), 30 min, 4°C. As células foram lavadas e incubadas com 10 ug/ml PE anti-rato de cabra (Caltag R40004-3) para DX182 de rato ou PE anti-humano de cabra (Caltag H10104) para rhuDX182, 50 ul/ amostra, 20 min, 4°C. As células foram lavadas 2X após a coloração, recolocadas em suspensão em 250 ul e analisadas usando 20 FACSCaIiber e software anexo (B-D Biosciences). Os resultados são mos- trados em figura 8, como medido para avaliar a extensão de desgranulação. Resultados são providos em figura 7.

Exemplo 7

Teste de desgranulação de células tronco para anticorpo para CD200R inibitório anticino de camundongo (DX248)

As células-tronco de murinos expressando CD200R humano (DT762) foram usadas para avaliar a capacidade de DX182 humanizado ini- bir a desgranulação. O DX182 humanizado foi também avaliado para a ca- pacidade de ligar a células como medido por citometria de fluxo.

O teste de desgranulação foi feito como descrito no Exemplo 5.

Anticorpos usados (e números de lote) foram: CD200R anti-humano de rato, DX182, PAB 1219; DX182 humano recombinante, fármaco em bruto, PAB 1337, SCH1372391; SCH1372391 formulado (PAB 1337 diluído), PAB 1336; lgG2a de rato, anticorpo de controle de isotipo, Pharmingen #553926.

A ligação de anticorpos anti-CD200R a células DT762 foi avalia- da por citometria de fluxo. As células DT762 foram incubadas com 10 ug/ml 5 de anticorpo, células 5X105 em 100 ul de meio de teste (D-PBS, 1% BSA, 0,05% NaN3), 30 min, 4°C. Células foram lavadas e incubadas com 10 ug/ml PE antirrato de cabra (Caltag R40004-3) para DX182 de rato ou PE anti- humano de cabra (Caltag H10104) para rhuDX182, 50 ul/amostra, 20 min, 4°C. As células foram lavadas 2X após colorir, recolocadas em suspensão 10 em 250 ul, e analisadas usando o software FACSCaIiber e anexos (BD Bios- ciences). Resultados são mostrados em figura 8. As células não coloridas e de controle de isotipo são representadas pelos histogramas à esquerda do gráfico e os histogramas de DX182 são mostrados distantes à direita do grá- fico.

Uma proteína de fusão de CD200R inibitório humano foi usada

como o imunogene em camundongos Balb/c para gerar o anticorpo DX248 para CD200R anticino de camundongo usando o mesmo método como des- crito em Exemplo 1. Os métodos de desgranulação e citometria de fluxo fo- ram como descritos no Exemplo 5. Anticorpos (e números de lotes) usados 20 foram: CD200R anti-humano de rato, DX182, PAB 1219; CD200R anticino- molgo de camundongo, DX248, PAB 766, lgG2a de rato, anticorpo de con- trole de isotipo, Pharmingen #553926; IgGI de camundongo, anticorpo de controle de isotipo. DX248 ligou a células (figura 10B) e inibiu a desgranula- ção (figura 10A).

Exemplo 8

Determinação da constante de dissociação de equilíbrio (Kd) pa- ra anticorpos para CD200R inibitório de rato e humano usando tecnologia Biacore

As atividades de ligação cinética de anticorpos para CD200R inibitório anti-humano contra uma proteína de fusão consistindo no domínio extracelular do CD200R receptor inibitório humano fusionado à porção Fc de IgGI humano (ver, Wright et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046, aqui incor- porado por referência em sua totalidade) foram medidas por ressonância de plasmon de superfície usando um sistema BIAcore 3000 (BIAcore AB, Up- salla, Suécia). O formato de teste usou a proteína de fusão capturada por IgG Fcy anti-humano com uma titulação de anticorpo anti-huCD200R na fase 5 móvel. Aproximadamente 5000RUs de IgG anti-humano de cabra, Fragmen- to Affinipure F(ab’)2, fragmento Fcy específico (Jackson ImunoResearch, Cat. N0 109-006-098) foram imobilizados em um Chip Sensor CM5 (tipo de pesquisa, BR-1000-14) via química de copulação de amina. O tampão HBS- EP (BR-1001-88) foi usado como o tampão de ciclagem em uma taxa de 10 fluxo de 5pL/min. Cada ciclo de análise foi precedido por cargas novas do chip com huCD200R. O anticorpo anti-huCD200R em concentrações varia- das na faixa de 0,82 a 600 nM (7 pontos de diluição) foi injetado sobre su- perfícies de huCD200R capturadas em uma taxa de fluxo de 30 μΙ_/ min. A- pós cada ciclo de injeção, a superfície do chip CM5 foi regenerada usando 15 uma série de soluções (solução 10mM Glicina pH 1,5 e 25 mM NaOH) a uma taxa de fluxo de 75 pL/min.

Os sensorgramas de ligação de subtração de fundo foram usa- dos para analisar a constante de associação (ka) e dissociação (kd) de taxa e a constante de dissociação de equilíbrio KD. Os conjuntos de dados resul- tantes foram configurados com um modelo de análito bivalente usando o software BIAevaIuation (versão 4.0.1).

Tabela 9

Valores Kd Determinados por Biacore

mAb de CD200R inibitório anti-humano de rato Kd(pM) DX182 760 DX248 6 Exemplo 9

DX182 reconhece CD200R de cinomolgo

Materiais e métodos: As células-tronco de cinomolgo foram cultivadas a par- tir de células mononucleares de sangue periférico na presença de fator de células-tronco humanas e IL-6 humano. Após três meses de incubação, es- tas culturas eram 95% de células-tronco expressando CD117 e FceRI. As células-tronco foram cultivadas por 2 semanas adicionais em IL-4 humano e IgE humano para carregar e iniciar o FceRI expressado sobre a superfície das células destas células.

Citometria de fluxo: As células-tronco de cinomolgo foram incu- 5 badas com 10 ug/ml anticorpo, células 5X105 em 100 ul de meio de teste (D- PBS, 1% BSA, 0,05% NaN3), 30 min, 4°C. As células foram lavadas e incu- badas com 10 ug/ml PE antirrato de cabra (Caltag R40004-3) para DX182 de rato, DX49 de rato ou PE anticamundongo de cabra (Caltag M30004) para anti-CD117 e FceRI, 50 ul/amostra, 20 min, 4°C. As células foram lavadas 10 2X após coloração, recolocadas em suspensão em 250 ul, e analisadas u- sando FACSCaIiber e software anexo (B-D Biosciences). Os resultados são mostrados em figura 11.

Teste de desgranulação: Titulações de anticorpos anti-CD200R (CX182) foram feitas em uma placa de fundo plano de 96 poços em 50 ul de meio de teste (RPMI, 1%BSA, 25 mM Hepes). As células-tronco de cinomol- gos expressando CD200R foram giradas e recolocadas em suspensão em 4X106/ml, 50 ul/ poço foram adicionados às titulações de anticorpos e incu- bados durante 20 min, temperatura ambiente. As células foram então lava- das nas placas duas vezes e reticuladas com antirrato de cabra (10 ug/ml). O anticorpo estimulante, anti-FceRI, foi então adicionado em 50 ul/poço de modo que a concentração final foi de 80 ng/ml. O anticorpo de controle de isotipo foi usado na concentração máxima de 50 ug/ml. As células foram cul- tivadas a 37°, 5% CO2 durante 1 h. No final do período de estimulação, 50 ul foram removidos de cada poço e a desgranulação foi quantificada por medi- da da liberação de triptase específico de células-tronco nos sobrenadantes como previamente publicado (Journal of Imunology, 2005, 174: 1348-1356). Os resultados são mostrados em figura 12.

Exemplo 10

Experimentos com cinomolgo alérgicos a ascaris O seguinte resume um experimento envolvendo o tratamento de

dois macacos Cynomolgus desafiados para Ascaris com 0 DX182 inibitório anti-humano de rato. Subsequente ao desafio com Ascaris os dois macacos alérgicos tratados com o anticorpo para CD200R anti-humano de rato mos- traram um aumento rápido pronunciado na resistência das vias aéreas e uma queda na pressão sanguínea e aumentada taxa cardíaca.

Os macacos cinomolgo mostraram uma hipersensibilidade alér- gica natural à inalação do antígeno de Ascaris. Inalação de antígeno de As- caris produz uma bronco-constrição dependente de células- tronco imediata que pode ser medida em 10-20 minutos após a exposição ao antígeno no aerossol.

Em experiências in vitros, DX182 e hu DX182 ligaram CD200R Cynomolgus e inibiram a desgranulação de macaco Cynomolgus de respos- tas a células-tronco mediadas via o e ΡοξΡΙ..

A farmacocinética (PK) e toxicidade de anticorpo DX182 a uma concentração de 8 mg/kg i.v. foi avaliada em um corte pequeno de macacos Cynomolgus alérgicos e não alérgicos (2 alérgicos, 2 não alérgicos) antes da inalação do antígeno de Ascaris. O PK de DX182 mostrou uma meia-vida de

1,3 dia. DX182 (8 mg/kg i.v.) foi bem tolerado e não mostrou indicações ad- versas evidentes de toxicidade cardiovascular ou sistêmica em macacos não desafiados com o antígeno.

O efeito do anticorpo DX182 em broncoconstrição foi avaliado em macacos Cynomolgus alérgicos. Os macacos alérgicos a Ascaris recebe- ram ou Dx182 (10 macacos) ou anticorpo de controle de isotipo (10 maca- cos) a 8 mg/kg i.v. 48 horas antes da exposição ao antígeno do aerossol, e foram subsequentemente monitorados para aumentada resistência das vias aéreas devido à broncoconstrição alérgica. No começo da fase de exposição ao antígeno, o estudo foi terminado porque, quando da exposição por inala- ção ao antígeno, dois macacos tratados com DX182 mostraram um aumento rápido pronunciado na resistência das vias aéreas, e uma queda na pressão sanguínea com aumentada taxa cardíaca. Os macacos recebendo o anticor- po de controle de isotipo não mostraram respostas fisiológicas inesperadas. Exemplo 11

Genes CD200R E Cd200RLa em Humano e cino

Expressão de um gene CD200RLa em macacos cinomolgos: a análise de alinhamento de seqüência de genes de CD200RLa de primata humano e não humano demonstrou que os genes de CD200RLa de maca- cos cinomolgo e Rhesus mantiveram as duas cisteínas críticas que estão ausentes nos genes de CD200RLa humano e de chipanzé. A inclusão des- tas cisteínas na seqüência de CD200RLa cinomolgo sugeriu que este gene pode gerar uma proteína de superfície de célula funcional capaz de formar pares com Dap12 e transmitir um sinal de ativação potente se disparada de modo apropriado. Os alinhamentos de seqüência são mostrados em figura 13.

Abaixo apresenta-se uma seqüência de codificação de ácido

nucleico de

CD200R humano e seqüência de proteína e uma seqüência de proteína e ácido nucleico de CD200RLa humano.

* CD200R HUMANO

ATGCTCTGCCCTTGGAGAACTGCTAACCTAGGGCTACTGTTGATTTTGACTATCTTCTTAGTGGCCGCTTCAAGCA

GTTTATGTATGGATGAAAAACAGATTACACAGAACTACTCGAAAGTACTCGCAGAAGTTAACACTTCATGGCCTGT

AAAGATGGCTACAAATGCTGTGCTTTGTTGCCCTCCTATCGCATTAAGAAATTTGATCATAATAACATGGGAAATA

ATCCTGAGAGGCCAGCCTTCCTGCACAAAAGCCTACAGGAAAGAAACAAATGAGACCAAGGAAACCAACTGTACTG

ATGAGAGAATAACCTGGGTCTCCAGACCTGATCAGAATTCGGACCTTCAGATTCGTCCAGTGGCCATCACTCATGA

CGGGTATTACAGATGCATAATGGTAACACCTGATGGGAATTTCCATCGTGGATATCACCTCCAAGTGTTAGTTACA

CCTGAAGTGACCCTGTTTCAAAACAGGAATAGAACTGCAGTATGCAAGGCAGTTGCAGGGAAGCCAGCTGCGCAGA

TCTCCTGGATCCCAGAGGGCGATTGTGCCACTAAGCAAGAATACTGGAGCAATGGCACAGTGACTGTTAAGAGTAC

ATGCCACTGGGAGGTCCACAATGTGTCTACCGTGACCTGCCACGTCTCCCATTTGACTGGCAACAAGAGTCTGTAC

ATAGAGCTACTTCCTGTTCCAGGTGCCAAAAAATCAGCAAAATTATATATTCCATATATCATCCTTACTATTATTA

TTTTGACCATCGTGGGATTCATTTGGTTGTTGAAAGTCAATGGCTGCAGAAAATATAAATTGAATAAAACAGAATC

TACTCCAGTTGTTGAGGAGGATGAAATGCAGCCCTATGCCAGCTACACAGAGAAGAACAATCCTCTCTATGATACT

ACAAACAAGGTGAAGGCATCTCAGGCATTACAAAGTGAAGTTGACACAGACCTCCATACTTTATAA

* CD200R Humano

mlcpwrtanlgllliltiflvaassslcmdekqitqnyskvlaevntswpvkmatnavlccppialrnliiitwei

ILRGQPSCTKAYRKETNETKETNCTDERITWVSRPDQNSDLQIRPVAITHDGYYRCIMVTPDGNFHRGYHLQVLVT PEVTLFQNRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPEGDCATKQEYWSNGTVTVKSTCHWEVHNVSTVTCHVSHLTGNKSLY IELLPVPGAKKSAKLYIPYIILTIIILTIVGFIWLLKVNGCRKYKLNKTESTPWEEDEMQPYASYTEKNNPLYDT TNKVKASEALQSEVDTDLHTL * CD200RLa Humano

ATGTCAGCTCCAAGATTACTGATTTCCATCATTATCATGGTGTCTGCTTCAAGTAGTTCATGCATGGGTGGAAAGC AGATGACACAGAACTATTCAACAATTTTTGCAGAAGGTAACATTTCACAGCCTGTACTGATGGATATAAATGCTGT GC TTTGTTGCCCTCCTATCGCATTAAGAAATTTGATCATAAT AACATGGGAAATAATCCTGAGAGGCCAGCCTTCC TGCACAAAAGCCTACAAGAAAGAAACAAATGAGACCAAGGAAACCAACTGTACTGTTGAGAGAATAACCTGGGTCT CTAGACCTGATCAGAATTCGGACCTTCAGATTCTTCCGGTGGACACCACTCATGACGGGTATTACAGAGGCATAGT GGTAACACCTGATGGGAATTTCCATCGTGGATATCACCTCCAAGTGTTAGTTACACCCGAAGTGAACCTATTTCAA AGCAGGAATATAACTGCAGTATGCAAGGCAGTTACAGGGAAGCCAGCTGCCCAGATCTCCTGGATCCCAGAGGGAT

ctattcttgccactaagcaagaatactggggcaatggcacagtgacggttaagagtacatgcccctgggagggcca

CAAGTCTACTGTGACCTGCCATGTCTCCCATTTGACTGGCAACAAGAGTCTGTCCGTAAAGTTGAATTCAGGTCTC

agaacctcaggatctccagcgttgtccttactgatcattctttatgtgaaactctctctttttgtggtcattctgg

tcaccacaggatttgttttcttccagaggataaatcatgtcagaaaagttctttaa

* CD200RLa Humano

MSAPRLLISIIIMVSASSSSCMGGKQMTQNYSTIFAEGNISQPVLMDINAVLCCPPIALRNLIIITWEII

LRGQPSCTKAYKKETNETRETNCTVERITWVSRPDQNSDLQILPVDTTHDGYYRGIWTPDGNFHRGYHL

qvlvtpevnlfqsrnitavckavtgkpaaqiswipegsilatkqeywgngtvtvkstcpweghkstvtch

VSHLTGNKSLSVKLNSGLRTSGSPALSLLIILYVKLSLFWXLVTTGFVFFQRINHVRKVL

Apresenta-se abaixo uma seqüência codificando ácido nucleico

para o CD200RLa mudado por CYS humano e uma seqüência de proteína para CD200RLa mudado por CYS humano. CD200RLa mudado por CYS foi obtido por mutagênese sítio-dirigida de CD200RLa humano. Iniciadores utili- zados na mutagênese sítio-dirigida são os seguintes: ACGGGTATTACAGATGCATAGTGGTAACAC;

GTGTTACCACTATGCATCTGTAATACCCGT;CAGAGGGATCTATTTGTGCCACTAAG

CAAG;CTTGCTTAGTGGCACAAATAGATCCCTCTG.

O

* CD200RLa-Cvs-mut Humano

ATGTCAGCTCCAAGATTACTGATTTCCATCATTATCATGGTGTCTGCTTCAAGTAGTTCATGCATGGGTGGAAAGC

AGATGACACAGAACTATTCAACAATTTTTGCAGAAGGTAACATTTCACAGCCTGTACTGATGGATATAAATGCTGT

GCTTTGTTGCCCTCCTATCGCATTAAGAAATTTGATCATAATAACATGGGAAATAATCCTGAGAGGCCAGCCTTCC

TGCACAAAAGCCTACAAGAAAGAAACAAATGAGACCAAGGAAACCAACTGTACTGTTGAGAGAATAACCTGGGTCT

CTAGACCTGATCAGAATTCGGACCTTCAGATTCTTCCGGTGGACACCACTCATGACGGGTATTACAGATGCATAGT

GGTAACACCTGATGGGAATTTCCATCGTGGATATCACCTCCAAGTGTTAGTTACACCCGAAGTGAACCTATTTCAA

AGCAGGAATATAACTGCAGTATGCAAGGCAGTTACAGGGAAGCCAGCTGCCCAGATCTCCTGGATCCCAGAGGGAT

CTATTTGTGCCACTAAGCAAGAATACTGGGGCAATGGCACAGTGACGGTTAAGAGTACATGCCCCTGGGAGGGCCA

CAAGTCTACTGTGACCTGCCATGTCTCCCATTTGACTGGCAACAAGAGTCTGTCCGTAAAGTTGAÁTTCÂGGTCTC

AGAACCTCAGGATCTCCAGCGTTGTCCTTACTGATCATTCTTTATGTGAAACTCTCTCTTTTTGTGGTCATTCTGG

TCACCACAGGATTTGTTTTCTTCCAGAGGATAAATCATGTCAGAAAAGTTCTTTAA * CD200RLa-Cvs-mut Humano

msaprllisiiimvsasssscmggkqmtqnystifaegnisqpvlmdinavlccppialrnliiitweiilrgqps

CTKAYKKETNETKETNCTVERITWVSRPDQNSDLQILPVDTTHDGYYRCIWTPDGNFHRGYHLQVLVTPEVNLFQ

SRNITAVCKAVTGKPAAQISWIPEGSICATKQEYWGNGTVTVKSTCPWEGHKSTVTCHVSHLTGNKSLSVKIiNSGL

RTSGSPALSLLIILYVKLSLFWILVTTGFVFFQRINHVRKVL

Os seguintes iniciadores foram usados para obter o CD200RLa de cino a partir de bibliotecas de cDNA de células tronco: CAAATGCACACTTTAGGAAAGATG e

CTTCCTClTrAAAGAGAlTiTCTG. Os seguintes iniciadores foram u- sados para obter o cDNA de CD200R inibitório de cino a partir de uma biblio- teca de cDNA de pulmão de cino: ATGCTCTGCCCTfGGAGAAC e AGAGTCCAACAACTTATAAAGT.

*CD200RLa de cino

ATGTCAGCTTCAAGATTACTGATCTCCATCATTATCATGGTGTCTGCTTCAAGTAGTTCATGTATGGATGGAAAGC

AGATGACACAGAATTATTCAAAAATGTCTGCAGAAGGTAACATTTCACAGCCTGTACTGATGGATACAAATGCTAT

GCTTTGTTGCCCTCCTATTGAGTTCAGAAATTTGATCGTAATAGTATGGGAAATAATCATAAGAGGCCAGCCTTCC

TGCACAAAAGCCTACAGGAAAGAAACAAATGAGACCAAGGAAACCAACTGTACTGATAAGAGAATAACCTGGGTCT

CCACACCTGATCAGAATTCGGACCTTCAGATTCACCCAGTGGCCATCACTCATGACGGATATTACAGATGCATAAT

GGCAACTCCTGATGGGAATTTCCATCGTGGCTATCACCTCCAAGTGTTAGTTACACCTGAAGTGACCCTGTTTCAA

AGCAGGAATAGAACTGCAGTATGCAAGGCAGTTGCAGGGAAGCCAGCTGCTCAGATCTCCTGGATCCCAGCGGGGG

ATTGTGCCCCTACTGAGCATGAGTACTGGGGCAATGGCACAGTGACTGTTGAGAGTATGTGCCACTGGGGGGACCA

CAATGCGTCTACCGTGACCTGCCATGTCTCCCATTTGACTGGCAACAAGAGTCTGTACATAAAGTTGAATTCAGGT

CTCAGAACCTCAGGATCTCCAGCGTTGGACTTACTGATCATTCTTTATGTGAAACTCTCTCTTTTTGTGGTCATTC

TGGTCACCACAGGATTTGTTTTCTTCCAGAGGATAAATTATGTCAGAAAATCTCTTTAA

*CD200RLa de cino

MSASRLLISIIIMVSASSSSCMDGKQMTQNYSKMSAEGNISQPVLMDTNAMLCCPPIEFRNLIVIVWEIIIRGQPS CTKAYRKETNETKETNCTDKRITWVSTPDQNSDLQIHPVAITHDGYYRCIMATPDGNFHRGYHLQVLVTPEVTLFQ SRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPAGDCAPTEHEYWGNGTVTVESMCHWGDHNASTVTCHVSHLTGNKSLYIKLNSG LRTSGSPALDLLIILYVKLSLFWILVTTGFVFFQRINYVRKSL

*CD200R de cino

ATGCTCTGCCCTTGGAGAACTGCTAATCTAGGGCTACTGTTGATTTTGGCTGTCTTCTTAGTGGCTGCTTCAAACA

GTTTATGTATGGATGAAAAACAGATTACACAGAACCÁCTCAAAAGTACTCGCAGAAGTTAACATTTCATGGCCTGT

ACAGATGGCTAGAAATGCTGTGCTTTGTTGCCCTCCTATTGAGTTCAGAAATTTGATCGTAATAACATGGGAAATA ATCCTAAGAGGCCAGCCTTCCTGCACAAAAACCTACAGGAAAGACACAAATGAGACCAAGGAAACCAACTGTACTG ATGAGAGAATAACCTGGGTCTCCACACCTGATCAGAATTCAGACCTTCAGATTCACCCAGTGGCCATCACTCATGA CGGGTATTACAGATGCATAATGGCAACTCCTGATGGGAATTTCCATCGTGGATATCACCTCCAAGTGCTAGTTACA CCTGAAGTGACCCTGTT TG AAAGCAGGAATAGAACTGCAGTATGCAAGGCAGTTGCAGGGAAGCCAGC TGCGCAGA TCTCCTGGATCCCAGCGGGGGATTGTGCCCCTACTGAGCAAGAGTACTGGGGCAATGGCACAGTGACTGTTAAGAG TACATGCCACTGGGAAGGCCACAATGTGTCTACCGTGACCTGCCATGTCTCCCATTTGACTGGCAACAAGAGTCTG TACATAGAGCTACTTCCTGTTCCAGGTGCCAAAAAATCAGCAAAATTATATATGCCATATGTCATCCTTACTATTA TTATTTTGACCATCGTGGGATTCATTTGGTTATTGAAAATCAGTGGCTGCAGAAAATATAATTTGAATAAAACAGA ATCTACTTCAGTTGTTGAGGAGGATGAAATGCAGCCCTATGCCAGCTACACAGAGAAAAACAATCCTCTCTATGAT ACTACAAACAAGGTGAAAGCGTCTCAGGCATTACAAAGTGAAGTTGGCACAGACCTCCATACTTTATAA *CD200R de cino

MLC PWRTANLGLLLILAVFLVAASNSLCMDEKQITQNHSKVL AEVNISWPVQMARNAVLCCPPIEFRNLIVITWEI ILRGQPSCTKTYRKDTNETKETNCTDERITWVSTPDQNSDLQIHPVAITHDGYYRCIMATPDGNFHRGYHLQVLVT PEVTLFESRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPAGDCAPTEQEYWGNGTVTVKSTCHWEGHNVSTVTCHVSHLTGNKSL YIELLPVPGAKKSAKLYMPYVILTIIILTIVGFIWLLKISGCRKYNLNKTESTSWEEDEMQPYASYTEKNNPLYD TTNKVKASQALQSEVGTDLHTL

Transfecção de Células-tronco de Camundongo com o CD200RLa de cino- molgo: a capacidade do anticorpo DX182 para CD200R anti-humano de rato 5 para ligar ao CD200RLa ativante de cinomolgo foi avaliada por citometria de fluxo. Uma linhagem de células-tronco de murinos da linhagem de células pre-B célula Ba/F3 (provida por T. Kitamura, University of Tokyo1Tokyo, Ja- pão) foi transfectada para expressar o CD200RLa de cino usando métodos descritos no Exemplo 5. Para a expressão da proteína CD200RLa em BaF/3, 10 foi necessário coexpressar a molécula DAP12 de sinalização (Lanier1L.L et al, 1998, Nature 391:703) contendo um epítopo FLAG no N término para permitir a detecção usando um anticorpo anti-FLAG. Na ausência de um parceiro de formação de pares, DAP12 etiquetado com FLAG permanece dentro do citoplasma de Ba/F3. No entanto, se os receptores de associação 15 de DAP12 estiverem presentes, eles podem formar pares com DAP12 atra- vés das interações de resíduos de carga oposta nos domínios transmembra- nas, resultando no epítopo FLAG aparecendo sobre a superfície da célula. As células-tronco de camundongos expressam DAP12 endógeno que pode se associar com as proteínas CD200RLa de espécies diferentes. A introdu- 20 ção do gene CD200RLa de cino em células-tronco de camundongo e células Ba/F3-DAP12 confirmou que esta proteína pode ser expressada sobre a su- perfície celular de células e que foi reconhecida pelo anticorpo DX182 para CD200R anti-humano. Resultados são mostrados na figura 14.

A associação do receptor expressado na superfície da célula 25 CD200RLa de cino com a molécula DAP12 do adaptador de sinalização foi confirmada por bioquímica. A superfície de célula das células-tronco expres- sando CD200RLa de cino foi rotulada com biotina usando EZ-ligação sulfo- N-hidroxi-succinimida-biotina (Pierce). As células foram lavadas com D-PBS então Iisadas em 1% digitonina (Cabiochem), 0,12% triton X-100, 150 mM 30 NaCI, 20 mM trietanolamina, contendo inibidores de protease (mistura de inibidor de protease completo; Roche Molecular Biochemicals). Lisados fo- ram centrifugados 12.000 x g durante 20 minutes a 4°C. Imunoprecipitações foram feitas por incubação de Iisados pré-depurados com 1-2 pg de DX182 anti-CD200R ou controle de isotipo (lgG2a de rato, BD Pharmingen, 5 #553926) e contas sefarose de proteína A e proteína G. As contas foram lavadas e as proteínas eluídas foram resolvidas sobre géis 4-20% Tris- glicina (Invitrogen/Novex) e transferidas para Immobilon-P (Millipore). Mem- branas foram bloqueadas em 5% BSA, 0,1% Tween-20 em TBS (10 mM Tris1 pH 8,0, 150 mM NaCI) então blotted com estrepavidina-HRP (Amersham Bi- 10 osciences), lavadas em TBS, 0,1% Tween-20, visualizadas após incubação da membrana em substrato quimioluminescente Super Signal West dura (Pi- erce) e então exposto para formar película. DAP12 não forma rótulo na su- perfície da célula com biotina devido a seu domínio extracelular curto, assim a membrana foi sondada com um anticorpo DAP12 para anticamundongo de 15 coelho, seguido por proteína A-HRP (Amersham Biosciences), e visualiza- dos como descrito acima. DAP12 foi encontrado nas imunoprecipitações de DX182 confirmando a associação com CD200RLa ativante de cino. Resulta- dos são mostrados em figura 15.

DX182 foi demonstrado como sendo um ativador de CD200RLa 20 de cinomolgo expressado em células-tronco de murinos por indução da des- granulação de resposta de células-tronco. O teste de desgranulação foi feito como descrito no Exemplo 5 usando as células-tronco de murinos expres- sando CD200RLa de cino descrito no exemplo 11. Resultados são mostra- dos em figura 16.

Falta de expressão de CD200RLa em células mieloides e macró-

fagos humanos. O genoma humano tinha somente dois membros da família CD200R: CD200R e CD200RLa (Wright, G. J. et al (2003) J. Imunol 171:3034-3046). Similar ao gene CD200RLa de camundongo, CD200RLa humano contém um resíduo carregado na seqüência de transmembrana su- 30 gerindo o potencial para interagir com DAP12 e transmitir um sinal de ativa- ção. Apesar dos genes CD200RLa de camundongo serem prontamente ex- pressados em mais células macrófagos/mieloides e facilmente transfectáveis em linhagens de células de camundongo contendo Dap12, CD200RLa hu- mano demonstrou níveis de transcrição extremamente baixos em células macrófagos/mieloides humanas e foi incapaz de expressão na superfície da célula em linhagens de células transfectáveis contendo Dap12.

5 Como mostrado na figura 13, CD200RLa humano e de chipanzé

faltam dois resíduos de cisteína conservados em todos os outros membros da família de CD200R. Sem ser limitado por teoria, acredita-se que a inca- pacidade do CD200Rla humano para formar um receptor funcional foi devido à mutação de dois resíduos de cisteína no domínio extracelular para os resí- 10 duos de glicina ou isoleucina. Mutação do gene huCD200RLa para codificar as duas cisteínas que estavam faltando na seqüência genômica permitiram a expressão do receptor de CD200RLa humano na superfície da célula em associação com Dap12.

A determinação de se os anticorpos anti-CD200R ligam para 15 proteínas CD200RLa humano, CD200R de cino e CD200RLa de cino foi feita por ELISA ou citometria de fluxo. As proteínas de fusão consistindo em do- mínio extracelular de CD200RLa humano fusionado à região de Fe de IgGI humano foram feitas em que dois resíduos (glicina e isoleucina) foram mu- dados para cisteínas para tornar a proteína mais similar à de CD200RLa de 20 cinomolgo e rhesus e às proteínas CD200R de humano e cino (ver figura 13). As proteínas foram expressadas como descrito em Exemplo 5. A forma de tipo selvagem da proteína também foi feita mas a expressão foi conside- ravelmente reduzida comparada com a proteína mudada por CYS.

Similarmente, o cDNA de CD200RLa humano de comprimento completo contendo os resíduos de tipo selvagem ou mudado por CYS foi gerado. Os cDNAs foram clonados em vetor retroviral pMXpie e introduzidos em células Ba/F3 expressando DAP12 humano como descrito em Exemplo

11.0 vetor pMXpie é similar ao vetor pMXneo (ver Exemplo 5) mas tem se- qüências IRES-GFP adicionais inseridas 3’ da seqüência de codificação permitindo a detecção do vetor codificando proteínas por fluorescência. O gene de resistência à neomicina é substituído com o gene de resistência à puromicina e as células são selecionado para fármacos usando 1 ug/ml pu- romicina (Sigma-Aldrich).

A forma mudada por CYS do receptor foi expressada sobre a superfície da célula como detectado por coloração FACS usando o anticorpo M2 de epítopo anti-FLAG (Sigma-Aldrich). O receptor de tipo selvagem não 5 foi detectado na superfície da célula.

DX182 não liga ao CD200RLa humano de tipo selvagem ou mu- dado por CYS quando expressado como uma proteína de fusão usando um protocolo ELISA indireto padrão. DX182 também falhou em ligar a células Ba/F3 expressando CD200RLa humano mudado por CYS na superfície da célula.

Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo inibitório anti-humano da invenção especificamente liga o Receptor CD200R inibitório humano mas não liga especificamente o CD200RLa humano mudado por CYS ou uma proteína de fusão de CD200RLa humano (domínio extracelular 15 de CD200RLa humano fusionado à porção Fe de IgGI de humano, e, por exemplo Exemplo 13).

Métodos de expressar CD200R e CD200RLa (CYS forma muda- da) são descritos aqui acima. A título de exemplo, e não limitação, a especi- ficidade da ligação de um anticorpo anti-CD200R pode ser avaliada pelos testes descritos acima. Resultados para DX182, DX248, DX185, Dx178, DX184 e DX176 são mostrados na tabela abaixo.

Anticorpo Ligação a Ligação a Ligação a ci- Bloqueia liga¬ huCD200RLa cinoCD200R noCD200RLa ção do Iigante DX182 Não Sim Sim Sim DX248 Não Sim Não Não feito DX185 Não Sim Sim Sim DX178 Não Não Não Sim DX184 Não Sim Sim Sim DX176 Não Não Não Sim Citação das publicações ou documentos acima não se destina a ser uma admissão de que qualquer parte acima é técnica anterior pertinente, nem que constitui qualquer admissão com relação aos conteúdos ou data destas publicações ou documentos. Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual, pedido de patente ou patente, fosse especificamente e individu- almente indicado como sendo incorporado por referência. Listagem de Seqüência

<110> Schering Corporation Presta, Leonard G.

Cherwinski, Holly M.

Phillips, Joseph H.

<120> ANTICORPOS PARA CD200R

<130> BP06564

<140> PCT/US 2007/026202

<141> 20-12-2007

<150> US 60/876,618

<151> 22-12-2006

<160> 63

<170> Patente em versão 3.4

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 1

Lys Ala Ser Lys Asn He Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<4 00> 2

Ser Gly Ser Thr Leu His Ser 1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<4 00> 3 Gln Gln His His Glu Tyr Pro Leu Thr I 5

<210> 4 <211> 11 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 4

Lys Ala Ser Lys Asn He Arg Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<4 00> 5

Ser Gly Ser Thr Leu His Ser 1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 6

Gln Gln His His Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 7

Lys Ala Gly Lys Asn He Asn Thr Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 7 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 8

Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 9 <211> 9 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 9

Gln Gln His Asn Glu Phe Pro Leu Thr 1 5

<210> 10 <211> 11 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 10

Lys Ala Ser Lys Asn He Ser Lys Tyr Leu Ala 15 10

<210> 11 <211> 7 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 11 Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser 1 5

<210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12

Gln Gln His Asn Glu Phe Pro Leu Thr I 5

<210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Asp 15 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 14

Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 15

Met Gln Ser Leu Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5

<210> 16 <211> 11 <212> PRT

<213> camundongo <400> 16

Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser He Asn Leu Asn 15 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT <213> camundongo <400> 17

Ser Ala Asn Asn Leu Glu Asp I 5

<210> 18

<211> 9 <212> PRT <213> camundongo <400> 18

Leu Gln Ile Thr Tyr Leu Pro Trp Thr 1 5

<210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <4 00> 19

Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Ser 15 10

<210> 20 <211> 16 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 20

Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Gly Ser

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 21

Tyr Asn Glu Tyr Lys Ser Tyr Ile Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Phe 15 10 15 <210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 22

Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Ser 15 10

<210> 23 <211> 16 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 23

Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Gly Ser 15 10 15

<210> 24

<211> 15 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 24

Tyr Asn Glu Tyr Lys Ser Tyr Ile Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Phe 15 10 15

<210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 25

Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Ser 15 10

<210> 26 <211> 16

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 26

Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 15 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 27

Phe Glu Ala Ser Asn Thr Tyr Leu Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5 10 15

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<4 00> 28

Gly Phe Thr Ile Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Ser 15 10

<210> 29 <211> 16 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 29

Tyr Ile Gly Phe Ser Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro Ser Leu Asn Ser 15 10 15

<210> 30

<211> 15 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 30

Ser Phe Val Gln Asn Thr Phe Ile Tyr Asp Trp Phe Phe Asp Phe 15 10 15

<210> 31 <211> 10 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 31

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn Gly Val Ser 15 10

<210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 32

Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Phe Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 15 10 15

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 33

Asp Gly Asp Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Phe

1 5 10

<210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> camundongo <400> 34

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 15 10

<210> 35 <211> 17

<212> PRT

<213> camundongo <400> 35 Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe Lys 15 10 15

Ser

<210> 36

<211> 5 <212> PRT <213> camundongo <400> 36 10 Gly Thr Gly Ala Tyr 1 5

<210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 37

Glu Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Thr Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Asn Ile Arg Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu His Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 38

<211> 108 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 38

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Lys Ala Gly Lys Asn Ile Asn Thr Asn 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Ala Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Val Leu Ile 35 40 45

His Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Phe Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 39 <211> 108 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 39

Asp Val Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Asn Ile Ser Lys Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Arg Leu Leu Ile 35 40 45

Cys Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Phe Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 40 <211> 102 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Phe Met Ser Ile Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn 20 25 30

Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Ala 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Leu Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Ser Gly Ala Gly Thr 100

<210> 41 <211> 90 <212> PRT <213> camundongo <400> 41

Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Ala Asn Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp 65 70 75 80

Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln 85 90

<210> 42 <211> 109

<212> PRT <213> Artificial <220>

<223> região de cadeia leve variável humanizada DX182 <400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asn Ile Arg Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105

<210> 43

<211> 124

<212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 43

Glu Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly 20 25 30

Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu

50 55 60

Gly Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Ser Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Tyr Asn Glu Tyr Lys Ser Tyr Ile Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110

Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 44

<211> 124

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 44

Glu Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Phe Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly 20 25 30

Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Met Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Arg Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Ala Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Phe Glu Ala Ser Asn Thr Tyr Leu Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp

100 105 110

Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 45 <211> 124 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus <4 00> 45

Glu Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 15 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Phe Thr Ile Thr Ser Gly 20 25 30

Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp 35 40 45

Met Gly Tyr Ile Gly Phe Ser Gly Ser Thr Val Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60

Asn Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ala Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys 85 90 95

Ala Lys Ser Phe Val Gln Asn Thr Phe Ile Tyr Asp Trp Phe Phe Asp 100 105 110

Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 46

<211> 118

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus <400> 46

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln I 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30

Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Phe Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Gly Asp Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 114 <212> PRT

<213> camundongo <400> 47

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110

Ser Ala

<210> 48 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> região de cadeia pesada ■ variável humanizada DXl 8 2 <400> 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Ser 20 25 30 Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Pro Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Ala Arg Tyr Asn Glu Tyr Lys Ser Tyr Ile Tyr Asp Trp Tyr Phe 100 105 110 Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 49

<211> 214

<212> PRT <213> Artificial <220>

<223> cadeia leve humanizada DX182 <400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asn Ile Arg Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Gly Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Glu Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly'Gln “Gly Tfrr ' Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 -

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 50

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia pesada humanizada DX182 <400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Ser Gly 20 25 30

Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu

50 55 60

Gly Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 _ 70 - 75 - - 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Tyr Asn Glu Tyr Lys Ser Tyr Ile Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp 100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro - - - - - 325- - - - “ 330 ' 335'

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450

<210> 51 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> cadeia leve humanizada DX182 com peptideo de sinal <400> 51 Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala 1 5 10 15 Met Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Lys Asn Ile 35 40 45 Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 - Leu. Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu~ His Ser Gly ' Val Pró Ser Arq 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85- - - 90 - - 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln HiS His Glu 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu 195

Lys Val Tyr Ala Cys Glu 210

Thr Lys Ser Phe Asn Arg 225 230

<210> 52 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> cadeia leve humanizada DX182 com peptideo de sinal <400> 52

atggctccag tgcagctgct ggggctgctg gtgctgttcc tgccagccat gagatgtgat 60 atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcctctg tgggcgacag agtgaccatc 120 acctgcaagg ccagcaagaa catccggagc tacctggcct ggtatcagca gaagccaggg 180 aaggccccta agctgctgat ctattctggc tccaccctgc actctggggt gccatccagg 240 ttcagcggca gcggctctgg gacagacttc accctgacca tcagcagcct gcagcctgag 300 gacttcgcca cctactactg tcagcagcac cacgagtatc cactgacctt cggccagggc 360 accaaggtgg agatcaagcg tacggtggct gcaccatctg tgttcatctt ccctccatct 420 gatgagcagc tgaagtctgg aactgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggat aacgccctcc agagcggcaa ctcccaggag 540 agcgtgacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca tcagggcctg 660 agcagccccg tgacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aa 702 <210> 53

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadeia pesada humanizada DX182 com peptideo de sinal

<4 00> 53

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 200 205

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 215 220

Gly Glu Cys Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys • I 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Thr Ile 35 40 45

Thr Ser Gly Tyr Asp Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly 50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Tyr Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Lys 65 70 75 80

Pro Ser Leu Gly Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95

Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asn Glu Tyr Lys Ser Tyr Ile Tyr Asp Trp 115 120 125

Tyr Phe. Asp Phe Trp Gly Gln GlyThr Leu Val Thr Val Ser Ser AÍa 130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 145 150 155 160

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 165 170 175

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 180 185 190

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 195 200 205

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 210 215 220

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 225 230 235 240

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 255 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 .

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

<210> 54 <211> 1422

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> cadeia pesada humanizada DX182 com peptideo de sinal <400> 54

atggctgtgc tggggctgct gttctgcctg gtgacattcc caagctgtgt gctgtcccag 60 gtgcagctgc aggaatctgg acccggactg gtgaagcctt ccgaaacact gagcctgaca 120 tgtacagtgt ctggctacac aatcaccagc ggctacgact ggagctggat cagacagcca 180 cctggcaagg ggctggagtg gatcggctat atcaactacg gcggatccac caactacaag 240 ccttccctgg gcagcagagt caccatctcc gtggacacat ccaagaacca gtttagcctg 300 aagctgagca gcgtgacagc cgctgacacc gccgtgtatt actgtgccag atacaacgag 360 tacaagagct acatctacga ctggtacttc gacttctggg gccagggcac cctggtgacc 420 gtgtccagcg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga 1422 <210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<4 00> 55 Arg Ala Ser Lys Asn Ile Arg Ser Tyr Leu Ala 10

15

<210> 56 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> domínio de cadeia variável leve huDX24 8 <400> 56 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Tyr Ser Ala Asn Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 - 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Thr Tyr Leu Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 80

100 <210> 57 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> domínio de <400> 57 105

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110

Ser Ser

<210> 58

<211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58

Met Ser Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser IleHe Ile Met Val Ser Ala 15 10 15

Ser Ser Ser Ser Cys Met Gly Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser 20 25 30

Thr Ile Phe Ala Glu Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Ile 35 40 45

Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile 50 55 60

Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala 65 70 75 80

Tyr Lys Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Val Glu

85 90 95

Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile 100 105 110

Leu Pro Val Asp Thr Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ile Val Val 115 120 125

Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val 130 135 140

Thr Pro Glu Val Asn Leu Phe Gln Ser Arg Asn Ile Thr Ala Val Cys 145 150 155 160

Lys Ala Val Thr Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu 165 170 175

Gly Ser Ile Leu Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val 180 185 190

Thr Val Lys Ser Thr Cys Pro Trp Glu Gly His Lys Ser Thr Val Thr 195 200 205

Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Ser Val Lys Leu

210 215 220

Asn Ser Gly Leu Arg Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Ser Leu Leu Ile 225 230 ~ 235 240

Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr Thr 245 250 255

-20 Gly Phe Val Phe Phe Gln Arg Ile Asn His Val Arg Lys Val Leu 260 265 270

<210> 59 <211> 271 <212> PRT <213> Chimpanzé <400> 59

Met Ser Ala Pro Arg Leu Leu Ile Ser Ile Ile Ile Met Val Pro Ala 15 10 15

Ser Ser Ser Ser Cys Met Gly Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser

20 25 30

Thr Ile Phe Ala Glu Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Thr 35 40 45 f 112

Asn Ala Val Leu Cys Cys Thr Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile 50 55 60

Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala 65 70 75 80

Tyr Lys Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Ala Glu

85 90 95

Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile 100 105 110

Arg Pro Val Asp Thr Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ile Val Val 115 120 125

Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val 130 135 140

Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Ser Trp Asn Arg Thr Ala Val Cys 145 150 155 160

Lys Ala Val Thr Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu

165 170 175

Gly Ser Ile Leu Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val 180 185 190

Thr Val Lys Ser Thr Cys Pro Trp Glu Gly His Lys Ser Thr Val Thr 195 200 205

Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Ser Val Lys Val 210 215 220

Asn Ser Gly Leu Arg Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Ser Leu Leu Ile 225 230 235 240

Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr Thr

245 250 255

Gly Phe Val Phe Phe Gln Arg Ile Asn His Val Arg Lys Val Leu 260 265 270

<210> 60 <211> 272 <212> PRT <213> Rhesus <400> 60

Met Ser Ala Ser Arg Leu Leu Ile Ser Ile Ile Ile Met Val Ser Ala I 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Cys Met Asp Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser

20 25 30

Lys Met Ser Ala Glu Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Thr 35 40 45

Asn Ala Met Leu Cys Cys Pro Pro Ile Glu Phe Arg Asn Leu Ile Leu 50 55 60

Ile Val Trp Glu Ile Ile Ile Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala

65 70 75 80

Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Lys 85 90 95

Arg Ile Thr Trp Val Ser Thr Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile

100 105 110

His Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Ala 115 120 125

Thr Pro Asp Gly Asn Phe His His Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val 130 135 140

Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Ser Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys 145 150 155 160

Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Ala 165 170 175

Gly Asn Cys Ala Pro Thr Glu His Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val 180 185 190

Thr Val Glu Ser Met Cys His Trp Gly Asp His Asn Ala Ser Thr Val 195 200 205

Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Lys 210 215 220

Leu Asn Ser Gly Leu Arg Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Asp Leu Leu 225 230 235 240

Ile Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr 245 250 255

Thr Gly Phe Val Phe Phe Gln Arg íle Ásn Tyr Val Arg Lys Ser Leu . 260 265 270

<210> 61 <211> 272

<212> PRT

<213> macaco cinomolgo <4 00> 61

Met Ser Ala Ser Arg Leu Leu Ile Ser Ile Ile Ile Met Val Ser Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Cys Met Asp Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser 20 25 30

Lys Met Ser Ala Glu Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Thr 35 40 45

Asn Ala Met Leu Cys Cys Pro Pro Ile Glu Phe Arg Asn Leu Ile Val 50 55 60

Ile Val Trp Glu Ile Ile Ile Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala 65 70 75 80.

Tyr Arg Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Lys 85 90 95

Arg Ile Thr Trp Val Ser Thr Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile 100 105 110

His Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Ala 115 120 125

Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val 130 135 140

Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Ser Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys 145 150 155 160

Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Ala 165 170 175

Gly Asp Cys Ala Pro Thr Glu His Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val 180 185 190 Thr Val Glu Ser Met Cys His Trp Gly Asp His Asn Ala Ser Thr Val 195 200 205

Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Lys 210 215 220

Leu Asn Ser Gly Leu Arg Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Asp Leu Leu 225 230 235 240

Ile Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr 245 250 255

Thr Gly Phe Val Phe Phe Gln Arg Ile Asn Tyr Val Arg Lys Ser Leu 260 265 270

<210> 62 <211> 326 <212> PRT

<213> macaco cinomolgo

<4 00> 62

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu 1 5 10 15

Ala Val Phe Leu Val Ala Ala Ser Asn Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys 20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn His Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Ile Ser 35 40 45

Trp Pro Val Gln Met Ala Arg Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile 50 55 60

Glu Phe Arg Asn Leu Ile Val Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly 65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Asn Glu Thr Lys 85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Thr Pro Asp 100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile His Pro Val Ala Ile Thr His Asp Gly 115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Ala Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly 130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Glu Ser 145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala 165 170 175

Gln Ile Ser Trp Ile Pro Ala Gly Asp Cys Ala Pro Thr Glu Gln Glu 180 185 190

Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu 195 200 205

Gly His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly 210 215 220

Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys 225 230 235 240

Ser Ala Lys Leu Tyr Met Pro Tyr Val Ile Leu Thr Ile Ile Ile Leu 245 250 255

Thr Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Lys Ile Ser Gly Cys Arg Lys 260 265 ' 270

Tyr Asn Leu Asn Lys Thr Glu Ser Thr Ser Val Val Glu Glu Asp Glu 275 280 285

Met Gln Pro Tyr Ala Ser Tyr Thr Glu Lys Asn Asn Pro Leu Tyr Asp 290 295 300

Thr Thr Asn Lys Val Lys Ala Ser Gln Ala Leu Gln Ser Glu Val Gly 305 310 315 320

Thr Asp Leu His Thr Leu

325

<210> 63

<211> 325

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ile Phe Leu Val Ala Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys 20 25 30

Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser 35 40 45

Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile 50 55 60

Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly 65 70 75 80

Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys 85 90 95

Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp 100 105 110

Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Thr Val Ala Ile Thr His Asp Gly 115 120 125

Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg Gly 130 135 140

Tyr His Leu Gln Val Leu Val'Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn 145 150 155 160

Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala 165 170 175

His Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr 180 185 190

Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu Val 195 200 205

His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly Asn 210 215 220

Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser 225 230 235 240

Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr 245 250 255

Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Lys Val Asn Gly Cys Arg Lys Tyr 260 265 270 Lys Leu Asn Lys Thr Glu Ser Thr Pro Val Val Glu Glu Asp Glu Met 275 280 285

Gln Pro Tyr Ala Ser Tyr Thr Glu Lys Asn Asn Pro Leu Tyr Asp Thr 290 295 300

Thr Asn Lys Val Lys Ala Ser Glu Ala Leu Gln Ser Glu Val Asp Thr 305 310 315 320

Asp Leu His Thr Leu 325

Claims (40)

1. Composto de ligação que liga a um CD200R inibitório hu- mano, compreendendo: pelo menos uma região variável de cadeia leve de anticorpo, ou fragmento de ligação da mesma, tendo pelo menos um número especificado de seqüências CDR selecionadas dentre o grupo consistindo de SEQ ID N-:1-18 e ; e : RASKNIRSYLA (SEQ ID N0: 55), pelo menos uma região variável de cadeia pesada de anticorpo, ou fragmento de ligação da mesma, tendo pelo menos um número especifi- cado de seqüências CDR selecionadas dentre o grupo consistindo de SEQ ID Nss: 19-36, em que o número especificado é um.

2. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que o número especificado é dois.

3. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que o número especificado é três.

4. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 3, em que a região variável de cadeia leve compreende as seqüências CDR de SEQ ID N-: 1, 2 e 3 e em que a região variável de cadeia pesada compre- ende as seqüências CDR de SEQ ID N-: 19, 20 e 21 ou em que a região variável de cadeia leve compreende as seqüências CDR de SEQ ID N-: 16,17 e 18 e em que a região variável de cadeia pesada compreende as se- qüências CDR de SEQ ID N-: 34, 35 e 36.

5. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 3, em que a região variável de cadeia leve compreende as seqüências CDR de SEQ ID N-: RASKNIRSYLA (SEQ ID N°:155), 2 e 3; e em que a região variável de cadeia pesada compreende as seqüências CDR de SEQ ID N-:19, 20 e 21.

6. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 4, em que a região variável de cadeia leve compreende a seqüência de SEQ ID N0: 42 tendo até dez substituições conservativas e em que a região variável de cadeia pesada compreende a seqüência de SEQ ID N0: 48 tendo até dez substituições de aminoácidos conservativas ou em que a região variável de cadeia leve compreende a seqüência de SEQ ID N0: 56 tendo até dez substi- tuições conservativas e em que a região variável de cadeia pesada compre- ende a seqüência de SEQ ID N0: 57 tendo até dez substituições de ami- noácidos conservativas

7. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 6, em que o composto de ligação é um anticorpo compreendendo: uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID N0: 42; e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID N0: 48 ou N0: 56; e N0:57 uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID

8. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 4, em que a cadeia leve consiste essencialmente na formà madura de SEQ ID N0: 51 tendo até dez substituições conservativas e a cadeia pesada consiste essencialmente da forma madura de SEQ ID N0: 53 tendo até dez substi- tuições conservativas.

9. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 4, em que a cadeia leve consiste essencialmente de SEQ ID N0: 49 tendo até dez substituições conservativas e a cadeia pesada consiste essencialmente de SEQ ID N0: 50 tendo até dez substituições conservativas ou em que a ca- deia leve consiste essencialmente de SEQ ID N0: 56 tendo até dez substi- tuições conservativas e a cadeia pesada consiste essencialmente de SEQ ID N0: 57 tendo até dez substituições conservativas.

10. Composto de ligação que liga a humano um CD200R inibitó- rio humano, em que o composto de ligação compreende a região variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% homologia para SEQ ID N0: 42 e a região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% homologia para SEQ ID N0: 48 ou em que o composto de ligação compreende a região variável de cadeia leve tendo pelo menos 90% homologia para SEQ ID N0: 41 e a região variável de cadeia pesada tendo pelo menos 90% homologia para SEQ ID N0: 47.

11. Ácido nucléico isolado codificando pelo menos uma dentre uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada do composto de ligação como definido na reivindicação 3.

12. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 11, em que a seqüência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve é SEQ ID N0: 42 e a seqüência de aminoácido de uma região variável de cadeia pe- sada é SEQ ID N0: 48 ou em que a seqüência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve é SEQ ID N0: 42 e a seqüência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada é SEQ ID N0: 48.

13. Vetor de expressão compreéndendo o ácido nucléico como definido na reivindicação 11, ligado operativamente a seqüências de controle que são reconhecidas por uma célula hospedeira quando a célula hospedeira é transfectada com o vetor.

14. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 13, em que o vetor de expressão tem Número de Acesso ATCC PTA-8067 (huDX182 com a seqüência de sinal em plasmídeo pACD200RV1) deposi- tado em 6 de dezembro de 2006.

15. Célula hospedeira compreendendo o vetor como definido na reivindicação 14.

16. Método de produzir um polipeptídeo compreendendo: cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 15, em meio de cultura sob condições em que a seqüência de ácido nucléico é expressada, assim produzindo polipeptídeos compreendendo as regiões va- riáveis de cadeia leve e pesada; e recuperar os polipeptídeos da célula hospedeira ou meio de cul- tura.

17. Anticorpo anti-CD200R inibitório humano, em que a seqüên- cia de anticorpo maduro é codificada pelo vetor de expressão como definido na reivindicação 14.

18. Anticorpo que é capaz de ligação de bloqueio cruzado do composto de ligação como definido na reivindicação 17 para CD200R inibitório humano em um teste de bloqueio cruzado.

19. Anticorpo que liga ao mesmo epítopo em um CD200R inibitó- rio humano como o epítopo que é ligado ao anticorpo huDX182.

20. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que o composto de ligação é um anticorpo monoclonal humanizado.

21. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que o composto de ligação é um anticorpo monoclonal completamente hu- mano.

22. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 21, em que o composto de ligação é um anticorpo monoclonal humanizado agoni- sta.

23. Método de tratamento de um indivíduo humano, compre- endendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de ligação que liga a um CD200R inibitório humano e ativa a atividade inibitória de CD200R inibi- tório humano, em que o composto de ligação compreende uma região variá- vel de cadeia leve de anticorpo e regiões variáveis de cadeia pesada de an- ticorpo, em que a região variável de cadeia leve compreende SEQ ID N0: 42 e a região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID N0: 48 ou em que o composto de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo e regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo, em que a região variável de cadeia leve compreende SEQ ID N°: 41 e a região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID N°: 47.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o com- posto de ligação é um anticorpo monoclonal.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o in- divíduo humano tem um distúrbio inflamatório ou autoimune.

26. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o in- divíduo humano tem artrite reumatoide.

27. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o in- divíduo humano tem asma.

28. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o in- divíduo humano tem uveíte.

29. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o in- divíduo humano tem uma alergia.

30. Método de acordo com a reivindicação 23, ainda compre- endendo a administração de outro agente imunossupressivo ou anti- inflamatório.

31. Composição compreendendo: um composto de ligação que liga a CD200R inibitório humano e ativa o receptor inibitório humano, em que o composto de ligação compre- ende uma região variável de cadeia leve de anticorpo e regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo, em que a região variável de cadeia leve com- preende SEQ ID N0: 42 e a região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID N0: 48; e um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente ou um composto de ligação que liga a CD200R inibitório humano e ativa o receptor inibitório humano, em que o composto de ligação compre- ende uma região variável de cadeia leve de anticorpo e regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo, em que a região variável de cadeia leve com- preende SEQ ID N0: 41 e a região variável de cadeia pesada compreende SEQ ID N0: 47

32. Composição de acordo com a reivindicação 31, ainda com- preendendo outro agente imunossupressivo ou anti-inflamatório.

33. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 4 ou 5, ainda compreendendo a região constante de cadeia pesada, em que a ca- deia pesada região constante compreende a região constante de cadeia pe- sada humana γ1, γ2, γ3, ou γ4 ou uma variante da mesma.

34. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 33, compreendendo uma região constante de cadeia pesada humana γ1 ou uma variante da mesma.

35. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 4 ou 5, ainda compreendendo uma região constante de cadeia leve, em que a regi- ão constante de cadeia leve compreende uma região constante de cadeia leve kappa humana.

36. Composto de ligação de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o composto de ligação é um fragmento de anticorpo selecionado dentre o grupo consistindo de Fab1 Fab’, Fab’-SH, Fv1 scFv, F(ab’)2, e um diacorpo.

37. Composto de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, em que o composto de ligação ativa o CD200R inibitório humano.

38. Composto de ligação que liga a um CD200R inibitório hu- mano, compreendendo os mesmos CDRs como o anticorpo produzido a par- tir do hibridoma tendo número de acesso ATCC PTA-_, deposi- tado como cepa HC809.1423.6.DX248.3 em_de dezembro de 2007.

39. Hibridoma tendo número de acesso ATCC PTA-_, depositado como cepa HC809.14F12.6.DX248.3 em_de dezembro de 2007.

40. Composto de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 31-44, em que o composto de ligação é um anticorpo mono- clonal agonista.