BRPI0721003B1

BRPI0721003B1 - Composições e uso

Info

Publication number: BRPI0721003B1
Application number: BRPI0721003-5A
Authority: BR
Inventors: Gary W. Zlotnick
Original assignee: Wyeth
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2020-08-18
Also published as: JP2010512792A; CA2673515C; TW200844226A; BRPI0721003B8; AU2007338690A1; US20110189187A1; CA2673515A1; AU2007338690B2; US8574597B2; AR064642A1; WO2008079372A9; CN101631858A; CL2007003771A1; BRPI0721003A2; WO2008079372A2; MX2009006760A; EP2094294A2; WO2008079372A3

Abstract

polinucleotídeo; vetor; célula recombinante; polipeptídeo; anticorpo; composição; composição preparada por um processo; uso da composição; método para preparar uma composição; método para preparar uma composição de anticorpo; método para induzir uma resposta imune em um mamífero; e método para prevenir ou tratar meningite bacteriana em um mamífero. a presente invenção refere a se a proteínas de neisseria orf2086, proteínas com reação cruzada que podem ser isoladas a partir de cepas naturais ou preparadas de forma recombinante, incluindo suas partes imunogênicas, seus equivalentes biológicos, anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica a seqüências precedentes e seqüências de ácidos nucléicos que codificam cada uma das precedentes, bem como o uso das mesmas em composições imunogênicas que são eficazes contra infecção por neisseria meningitidis sorogrupo b.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a proteínas de Neisseria ORF2086 (subfamília A e subfamília B) , que podem ser isoladas a partir de cepas bacterianas tais como aquelas da espécie Neisseria, incluindo as cepas de Neisseria meningitidis (sorogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z e 29E), Neisseria gonorrhoeae e Neisseria lactamica, bem como as partes imunogênicas e/ou equivalentes biológicos das ditas proteínas. A presente invenção refere—se também a anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica às ditas proteínas, partes imunogênicas e/ou equivalentes biológicos. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotídeos isolados que compreendem sequências de ácidos nucléicos que codificam qualquer uma das seguintes proteínas, partes imunogênicas, e equivalentes biológicos e/ou anticorpos. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a composições imunogênicas e seu uso para prevenir, tratar e/ou diagnosticar infecção meningocócica causada por N. meningitidis, e particularmente doença meningocócica causada por N. meningitidis sorogrupo B, bem como métodos para preparar as ditas composições. Esta invenção refere-se a formas recombinantes e também formas isoladas a partir de uma fonte natural, abem como as formas lipidadas e nâo- lipidadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A meningite meningocócica é uma doença devastadora que pode matar crianças e adultos jovens dentro de horas, apesar da disponibilidade de antibióticos (Pizza et al.r 2000, Science 287:1816-1820). A meningite se caracteriza como uma inflamação de meninge que resulta em uma cefaléia intensa, febre, perda de apetite, intolerância à luz e som, rigidez dos músculos, especialmente no pescoço, e em casos graves, convulsões, vômito e delirio, levando à morte. Os sintomas da meningite meningocócica aparecem repentinamente e culminam em septicemia com sua erupção hemorrágica cutânea característica. Um rápido diagnóstico e tratamento imediato com grandes doses de antibióticos são criticos caso haja qualquer possibilidade de sobrevivência ("Bantam Medical Dictionary", Terceira Edição 302).

[0003] A meningite meningocócica é causada por Neisseria meningitidis (o meningococo) , uma bactéria gram- negativa capsulada que foi classificada em vários sorogrupos patogênicos, incluindo A, B, C, D, W-135, X, Y, Z e 29E. As cepas do sorogrupo B de N. meningitidis são uma principal causa de doença meningocócica no mundo inteiro. Por exemplo, relata-se na literatura médica que o sorogrupo B é responsável por cerca de 50% da meningite meningocócica em recém-nascidos que residem nos Estados Unidos e Europa. Não existe nenhuma vacina atualmente para prevenir doença meningocócica causada por N. meningitidis sorogrupo B.

[0004]Desenvolver uma composição imunogênica para a prevenção de doença meningocócica do sorogrupo B tern sido um desafio para os pesquisadores desde o trabalho de Goldschneider et al. trinta anos atrás (Goldschneider et al., 1969, J. Exp. Med 129 (6) :1307-26; Goldschneider et al, 1969, J. Exp. Med 129 (6) :1327-48; Gotschlich et al.,1969, J, Exp. Med. 129 (6) :1385-95; and Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129(6):1367-84 . Diferentemente da doença do sorogrupo A, que virtualmente desapareceu da América do Norte depois da Segunda Guerra Mundial (Achtman, M., 1995, Trends in Microbiology 3(5):186-92), a doença causada por organismos dos sorogrupos B e C permanece endêmica em grande parte do mundo economicamente desenvolvido. A incidência da doença varia entre <1/100.000 onde a doença endêmica é rara e 200/100.000 em populações de alto risco durante a epidemia.

[0005] As vacinas desenvolvidas baseadas em conjugados de polissacarideos foram desenvolvidas contra N. meningitidis sorogrupos A e C parecem ser eficazes em prevenir a doença. Atualmente, uma composição imunogênica feita de polissacarideo capsular dos sorogrupos A, C, Y, e W-135 está disponivel (Ambrosch et al., 1983, "Immunogenicity and side-effects of a new tetravalent", Bulletin of the World Health Organization 61 (2):317-23. Entretanto, esta composição imunogênica elicia uma resposta imune independente de células T, não é eficaz em crianças jovens, e não proporciona nenhuma cobertura para cepas do sorogrupo B, que causam pelo menos 50% da doença meningocócica.

[0006] Outros também tentaram desenvolver composições imunogênicas usando polissacarideos capsulares. Recentemente, composições imunogênicas para a doença do sorogrupo C, preparadas conjugando material capsular do sorogrupo C para proteinas, foram licenciadas para uso na Europa. Entretanto, a cápsula do sorogrupo B pode ser inadequada como uma vacina candidata porque o polissacarideo da cápsula é constituído de ácido polissiálico que porta uma similaridade com grupamentos carboidrato em tecidos neurais humanos em desenvolvimento. Este grupamento açúcar é reconhecido como um auto-antígeno, e é assim sendo, deficientemente imunogênico em humanos.

[0007] Proteinas de membrana externa (OMP's) foram desenvolvidas como antigenos alternativos de vacinas para a doença do sorogrupo B. A ligação de anticorpos monoclonais às duas regiões variáveis de PorA define o esquema de soro-subtipagem para meningococos. As proteínas PorA, assim, servem como os antigenos de soro-subtipagem (Abdillahi et al., 1988, Microbial Pathogenesis 4(1) :27 —32) para cepas meningocócicas e estão sendo ativamente investigadas como componentes de uma composição imunogênica do sorogrupo B (Poolman, 1996, Adv. Exp. Med. Biol. 397:73- 7) , pois elas eliciam anticorpos bactericidas (Saukkonen, 1987, Microbial Pathogenesis 3(4):261-7). Acredita-se que os anticorpos bactericidas sejam um indicador de proteção e qualquer candidata a composição imunogênica nova deve eliciar estes anticorpos funcionais.

[0008] Estudos em humanos, bem como animais, indicam que a soro-subtipagem do antígeno, PorA, elicia anticorpos bactericidas. Entretanto, a resposta imune à Por A é genericamente específica do soro-tipo. Particularmente, os dados da soro-subtipagem indicam que uma composição imunogênica feita de PorA's pode requerer uma PorA para cada soro-subtipo a ser coberto por tal composição imunogênica, talvez algo tanto quanto seis a nove. Portanto, 6-9 PorA's serão necessárias para cobrir 70-80% de cepas do sorogrupo B. Assim sendo, a natureza variável desta proteina requer uma composição de vacina polivalente para proteger contra um número suficiente de isolados clinicos dos soro-subtipos meningocócicos.

[0009] Desenvolver uma composição imunogênica para meningococos sorogrupo B foi tão dificil que recentemente vários grupos seqüenciaram os genomas de cepas que representam ambos sorogrupos A e B para auxiliar a identificar novas candidatas a composições imunogênicas (Tettelin, 2000, Science, 287(5459):1809-15; Pizza et al., 2000, Science 287:1816-1820). Identificar novas candidatas a composições imunogênicas, mesmo com o conhecimento do genoma de neisséria, é um processo desafiador para o qual algoritmos matemáticos adequados não existem atualmente. De fato, um relatório recente indica que apesar de identificar centenas de estruturas de janela aberta ("ORFs"), que contêm dominios de alcance de membrana (membrane spanning domains), problemas com a expressão, purificação, e superficie indutora reativa, e anticorpos funcionalmente ativos, levaram os pesquisadores a apenas sete candidatas a composição imunogênica meningocócica do sorogrupo B. Vide ibidem. Uma delas era conhecida anteriormente.

[0010] Consequentemente, permanece existindo uma necessidade de se obter composições imunogênicas que (1) eliciam anticorpos bactericidas para múltiplas cepas de neisséria; (2) reagem com a superficie de múltiplas cepas; (3) conferem proteção passiva contra um desafio vivo; e/ou (4) impedem a colonização.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Uma modalidade da presente invenção fornece um polinucleotideo que compreende: (a) uma sequência de nucleotideos que tem pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência a qualquer uma das sequências numeradas com número ímpar de SEQ ID NOS: 1-11; ou (b) uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência a qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:2-12.

[0012] Uma outra modalidade da presente invenção fornece um vetor que compreende um polinucleotideo da presente invenção.

[0013] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece uma célula recombinante que compreende um vetor da presente invenção.

[0014] Mais outra modalidade da presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende: (a) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS: 2-12; (b) uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência de nucleotideos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das sequência numeradas com número ímpar de SEQ ID NOS:1-11; (c) pelo menos uma parte imunogênica de uma sequência de aminoácidos descrita em (a) ou (b) ; ou (d) pelo menos um equivalente biológico de uma sequência de aminoácidos descrita em (a) ou (b) ou uma parte imunogênica descrita em (c).

[0015] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece um anticorpo que compreende qualquer um entre : (a) um polipeptideo que se liga de forma imunogênica com um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:2-12; ou (b) pelo menos uma parte imunogênica do polipeptideo descrito em (a); ou (c) pelo menos um equivalente biológico do polipeptideo descrito em (a) ou um fragmento imunogênico descrito em (b).

[0016] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece uma composição que compreende um polinucleotideo, vetor, célula recombinante, polipeptideo ou anticorpo da presente invenção.

[0017] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece uma composição que compreende: (a) um primeiro polinucleotideo que compreende uma seqüência de nucleotideos que tem pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência a qualquer uma das sequências numeradas com número impar de SEQ ID NOS: 1-5 ou pelo menos cerca de 95% identidade de seqüência a uma seqüência de nucleotideos que codifica uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:2-6; e (b) um segundo polinucleotideo que compreende uma seqüência de nucleotideos que tem pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência a qualquer uma das sequências numeradas com número impar de SEQ ID NOS:7-11 ou pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência a uma seqüência de nucleotideos que codifica a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:8-12.

[0018] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece uma composição que compreende: (a) um primeiro polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência a qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:2-6; e (b) um segundo polipeptideo que compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência a qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:8-12.

[0019] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece uma composição preparada por um processo que compreende isolar e purificar a partir da espécie Neisseria ou preparar de forma recombinante qualquer um entre: (a) um polipeptideo que compreende a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:2-12; (b) um polipeptideo codificado por um polinucleotideo que compreende a seqüência de ácidos nucléicos de qualquer uma das sequências numeradas com número impar de SEQ ID NOS:1-11; (c) pelo menos uma parte imunogênica do polipeptideo descrito em (a) ou (b) ; ou (d) pelo menos um equivalente biológico do polipeptideo descrito em (a) ou (b) ou um fragmento imunogênico descrito em (c).

[0020] Ainda outra modaOlidade da presente invenção fornece o uso de uma composição da presente invenção na preparação de um medicamento para induzir uma resposta imune em um mamifero.

[0021] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece o uso de uma composição da presente invenção em um medicamento eficaz contra meningite bacteriana em um mamifero.

[0022] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece um método para preparar uma composição que compreende expressar em uma célula hospedeira uma sequência de ácidos nucléicos que codifica qualquer um dos polipeptideos aqui descritos.

[0023] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece um método para preparar uma composição de anticorpo, compreendendo recuperar anticorpos a partir de um animal depois de introduzir no animal uma composição que compreende qualquer uma das proteinas, partes imunogênicas ou equivalentes biológicos aqui descritos.

[0024] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece um método para induzir uma resposta imune em um mamifero, compreendendo administrar ao mamifero uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições da presente invenção.

[0025] Ainda outra modalidade da presente invenção fornece um método para prevenir ou tratar meningite bacteriana em um mamifero, compreendendo administrar ao mamifero uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] A Figura IA representa um gel de SDS- PAGE que representa das duas principais proteinas das frações protéicas obtidas a partir dos experimentos para identificar extrato de proteina da membrana de neisséria, que é capaz de eliciar anticorpos bactericidas contra cepas heterólogas.

[0027] A Figura 1B representa os resultados dos experimentos da identificação das duas principais proteinas por análise de componentes TMAE Flow Through por digestão com protease e seqènciamento do terminal N em fase reversa.

[0028] A Figura 2 representa o esquema de purificação e o esquema de homogeneidade como determinados por SDS-PAGE de rLP2086.

[0029] A Figura 3 representa os resultados dos experimentos da identificação das duas principais proteinas e uma proteína secundária por análise de componentes de TMAE Flow Through por LC-MS/MS e a SDS-PAGE correspondente.

[0030] A Figura 4 é um gel de SDS-PAGE da expressão recombinante da proteína 2086.

[0031] A Figura 5 é um diagrama esquemático do plasmídeo pPX7340, como descrito nos exemplos deste relatório descritivo.

[0032] A Figura 6 é um diagrama esquemático do plasmídeopPX7328, como descrito nos exemplos deste relatório descritivo.

[0033] A Figura 7 é um diagrama esquemático do plasmídeo pPX7343, como descrito nos exemplos deste relatório descritivo.

[0034] A Figura 8 ilustra regiões do terminal N do gene 2086 de várias cepas.

[0035] A Figura 9A é o fluxograma que ilustra as etapas preliminares na identificação de um componente imunogênico em uma cepa de neisséria.

[0036] A Figura 9B é u fluxograma que ilustra as etapas finais na identificação de um componente imunogênico em uma cepa de neisséria.

[0037] A Figura 10A é um diagrama esquemático do promoter induzivel de pBAD arabinose que direciona a expressão da proteina de fusão P4 sinal/ORF2086 para expressar uma forma lipidada de rP2086 como descrito nos exemplos deste relatório descritivo.

[0038] A Figura 10B é um diagrama esquemático do vetor pET9a-T7 para a expressão recombinante de ORF2086 multilipidada.

[0039] A Figura 11A é uma fotografia que representa os lisados de células integrais de E. coli B que expressa a proteina

[0040] A Figura 11B ilustra os lisados de células integrais De E. coli B que expressa a proteina rP2086.

[0041] A Figura 12 é uma árvore filogenética que ilustra uma organização das subfamilias e grupos de proteinas ORF2086 de acordo com uma implementação da presente invenção.

[0042] A Figura 13 é uma ilustração gráfica de dados de ELISA de células integrais para antissoros de rLP2086 Subfamília A.

[0043] A Figura 14 é uma ilustração gráfica dos dados de ELISA de células integrais para antissoros de rLP2086 Subfamilia B.

[0044] A Figura 15 é uma ilustração gráfica dos resultados do estudo de misturação de rLP2086 Titulações WCE.

[0045] A Figura 16 é uma ilustração gráfica dos resultados do estudo da misturação de rLP2086/rPorA - Titulações WCE.

[0046] A Figura FIG. 17 é uma Western Blot que ilustra a reatividade de antissoros de rLP2086 do camundongo lisados de células integrais de N. meningitidis P2086 Subfamilia B.

[0047] A Figura 18 é uma Western Blot que ilustra a reatividade de antissoros de rLP2086 do camundongo para lisados de células integrais de N. meningitidis P2086 Subfamilia A e N. lactamica.

SUMÁRIO DE SEQUÊNCIAS

[0048] SEQ ID NO:1 sequência de ácidos nucléicos que codifica a sequência de aminoácidos para a proteina 2086 madura da cepa CDC1135 quando combinada com uma sequência lider nativa.

[0049] SEQ ID NO: 2 sequência de aminoácidos para a proteina 2086 madura de cepa CDC1135 preparada usando uma sequência lider nativa.

[0050] SEQ ID NO:3 sequência de ácidos nucléicos para a sequência de aminoácidos que codifica a sequência de aminoácidos para a proteina 2086 madura de CDC1135 quando combinada com uma sequência lider P4.

[0051] SEQ ID NO: 4 sequência de aminoácidos para a proteina 2086 madura da cepa CDC1135 preparada usando uma sequência lider P4.

[0052] SEQ ID NO: 5 sequência de aminoácidos que codifica uma sequência de aminoácidos para a proteina 2086 madura da cepa CDC1135.

[0053] SEQ ID NO: 6 sequência de aminoácidos para a proteína madura da cepa CDC1135.

[0054] SEQ ID NO:7 seqüência de ácidos nucléicos que codifica um seqüência de aminoácidos para a proteína 2086 madura da cepa CDC1127 quando combinada com uma seqüência líder nativa.

[0055] SEQ ID NO: 8 seqüência de aminoácidos para a proteína 2086 madura da cepa CDC1127 preparada usando uma seqüência líder nativa.

[0056] SEQ ID NO:9 seqüência de ácidos nucléicos que codifica a seqüência de aminoácidos para a proteína 2086 madura de CDC1127 quando combinada com uma seqüência líder P4.

[0057] SEQ ID NO:10 seqüência de aminoácidos para a proteína 2086 madura da cepa CDC1127 preparada usando uma seqüência líder P4.

[0058] SEQ ID NO:11 seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma seqüência de aminoácidos para a proteína 2086 madura da cepa CDC1127.

[0059] SEQ ID NO:12 seqüência de aminoácidos para a proteína 2086 madura da cepa CDC1127.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0060] A presente invenção fornece proteínas de Neisseria ORF2086 ("proteínas 2086"), incluindo proteinas da 2086 Subfamília A e proteínas 2086 Subfamília B. Cada uma das proteínas 2086 é uma proteína que pode ser isolada a partir de cepas de neisséria nativas, incluindo as cepas de Neisseria meningitidis (sorogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z e 29E), Neisseria gonorrhoeaer e Neisseria lactamica. As proteinas 2086 podem ser preparadas também usando tecnologia recombinante.

[0061] De acordo com várias modalidades, a presente invenção fornece as proteinas 2086, suas partes imunogênicas, e/ou seus equivalentes biológicos, anticorpos que se ligam de forma imunoespecifica a qualquer um dos precedentes, e polinucleotideos que compreendem sequências de ácidos nucléicos que codificam qualquer um dos precedentes. A presente invenção inclui composições, composições imunogênicas e seu uso em prevenir, tratar e/ou diagnosticar infecção meningocócica, e particularmente doença meningocócica causada por N. meningitidis, bem como métodos para preparar as ditas composições. As proteinas 2086 neste caso incluem formas recombinantes e formas isoladas a partir de uma fonte natural, bem como formas lipidadas e não-lipidadas.

[0062] A presente invenção fornece inesperadamente e vantajosamente composições que (1) eliciam anticorpos bactericidas para múltiplas cepas de neisséria, tais como as cepas de N. meningitidis, N. gonorrhoeae, e/ou N. lactamica; (2) reagem com a superfície de múltiplas cepas; (3) conferem proteção passiva contra um desafio vivo; e/ou (4) impede a colonização, bem como métodos para usar as ditas composições e métodos para preparar as ditas composições. Várias modalidades da invenção serão descritas abaixo.

[0063] Como aqui descrito, candidatas a novas composições imunogênicas, baseadas na proteina da Espécie Neisseria ORF2086 (também referida como "proteina 2086" ou "proteina ORF2086", aqui utilizadas de forma intercambiável, ou P2086 as proteinas não-lipidadas e LP2086 para a versão lipidada das proteinas) isoladas a partir de AZ. meningitidis foram identificadas combinando fracionamento de células, extração diferencial com detergentes, purificação de proteinas, com a preparação de antissoros, e um ensaio de atividade bactericida, utilizando múltiplas cepas. Como uma alternativa a composições imunogênicas e diagnósticas descritas nas referências citadas acima, esta invenção refere-se a composições e métodos para tratar e/ou prevenir infecção meningocócica através do uso de proteínas, suas partes imunogênicas e seus equivalentes biológicos, bem como genes que codificam os ditos polipeptídeos, partes e equivalentes, e anticorpos que se ligam de forma imunoespecífica aos mesmos.

[0064] Como aqui utilizado, o termo "inespecífico de cepa" refere-se à característica de um antígeno para eliciar uma resposta imune contra mais do que uma cepa de N. meningitidis (por exemplo, cepas meningocócicas heterólogas). O termo "com reação cruzada", como aqui utilizado, é usado de forma intercambiável com o termo "inespecífico de cepa". O termo "antígeno imunogênico inespecífico de cepa de N. meningitidis", como aqui utilizado, descreve um antígeno que pode ser isolado a partir de N. meningitidis, embora ele possa ser isolado também a partir de outra bactéria (por exemplo, outras cepas de neisséria, tais como cepas gonocócicas, por exemplo), ou preparado usando tecnologia recombinante.

[0065] As proteínas 2086 da presente invenção incluem proteínas lipidadas e não-lipidadas. Além disso, a presente invenção contempla também o uso proteínas imaturas ou pré-proteínas que correspondem a cada proteina como compostos ou composições intermediárias.

[0066] A presente invenção fornece também anticorpos que se ligam de forma imunoespecifica aos agentes imunogênicos precedentes, de acordo com implementações da invenção. Além disso, a presente invenção refere-se a polinucleotideos isolados que compreendem sequências de ácidos nucléicos qualquer um dos precedentes. Adicionalmente, a presente invenção fornece composições e/ou composições imunogênicas e seu uso em prevenir, tratar e/ou diagnosticar meningite meningocócica, particularmente doença meningocócica do sorogrupo B, bem como métodos para preparar as ditas composições.

[0067] As composições da presente invenção são altamente imunogênicas e capazes de eliciar a produção de anticorpos bactericidas. Estes anticorpos têm reação cruzada com as cepas meningocócicas heterólogas de sorogrupo, sorotipo e soro-subtipo. Conseqüentemente, as presentes composições superam as deficiências de tentativas de vacinas de N. meningitidis anteriores apresentando a capacidade de eliciar anticorpos bactericidas cepas de neisséria heterólogas. Assim sendo, entre outras vantagens, a presente invenção fornece composições imunogênicas que podem ser formuladas com menos componentes para eliciar proteção comparável com agentes usados anteriormente. As composições ou agentes imunogênicos neste caso (por exemplo, polipeptideos, partes imunogênicas ou fragmentos, e equivalentes biológicos, etc., sem limitação) podem ser usadas isoladamente ou em combinação com outros antigenos ou agentes para eliciar proteção imunológica contra infecção e doença meningocócica, bem como para eliciar proteção imunológica contra infecção e/ou doença causada por outros patógenos. Isto simplifica o desenho ode uma composição imunogênica para uso contra infecção meningocócica, reduzindo o número de antigenos necessários para proteção contra múltiplas cepas. De fato, a proteina 2086 purificada reduzirá dramaticamente e inesperadamente o número de proteinas necessárias para proporcionar cobertura imunogênica apropriada das cepas responsáveis por doença meningocócica. A proteina 2086 pode ser expressada de forma recombinante em E. coli como uma lipoproteina, que é a forma do tipo selvagem da proteina, em níveis muito mais altos do que nos meningococos nativos.

[0068] Os seguintes pedidos de patente internacionais publicados são aqui incorporados como referência em sua totalidade: PCT/US02/32369 (publicado como WO 03/063766 em 7 de agosto de 2003) e PCT/US04/11901 (publicado como WO 04/094596 em 4 de novembro de 2004).

[0069] Embora a proteína 2086 não esteja presente em grandes quantidades em cepas do tipo selvagem, ela é um alvo para anticorpos bactericidas. Estes anticorpos, diferentemente daqueles produzidos em resposta às PorA's, são capazes de exterminar cepas que expressam soro-subtipos heterólogos.

[0070] Os anticorpos para a proteína 2086 também protegem passivamente ratos recém-nascidos contra desafio com meningococos. A expressão recombinante de proteína 2086 permite o uso da proteína 2086 como uma composição imunogênica para a prevenção de doença meningocócica. Todas as candidatas a composições meningocócicas imunogênicas em ensaios clínicos foram misturas complexas de preparações de proteínas de membrana externa que contêm muitas diferentes proteínas. A proteína PorA, que proporciona especificidade de soro-subtipo, requererá a inclusão de 6 a 9 variantes em uma composição imunogênica para proporcionar cerca de 70-80% de cobertura de doença relacionada a soro-subtipos. Em contraste, está aqui claramente demonstrado que antissoros para uma única proteína 2086 isoladamente é capaz de exterminar representantes de seis soro-subtipos responsáveis por cerca de 65% dos isolados da doença na Europa Ocidental e nos Estados Unidos. Portanto, a proteína 2086 purificada tem o potencial para reduzir o número de proteínas necessárias para proporcionar cobertura adequada de composições imunogênicas dos soro-subtipos responsáveis pela doença meningocócica.

PROTEÍNAS, PARTES IMUNOGÊNICAS E EQUIVALENTES BIOLÓGICOS

[0071] As proteínas 2086 fornecidas pela presente invenção são proteínas ou polipeptídeos isolados. O termo "isolado" significa alterado pela mão do Homem a partir do estado natural. Caso uma composição ou substância "isolada" ocorra na natureza, ela foi mudada ou removida do seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polipeptideo ou um polinucleotídeo naturalmente presente em um animal vivo não é "isolado," mas o mesmo polipeptideo ou polinucleotídeo separado dos materiais coexistentes do seu estado natural é "isolado", como o termo é aqui empregado. Consequentemente, como aqui utilizado, o termo "proteína isolada" engloba proteínas isoladas a partir de uma fonte natural e proteínas preparadas usando tecnologia recombinante, bem como essas proteínas quando combinadas com outros antigenos e/ou aditivos, tais como carteadores, tampões, adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, etc., por exemplo.

[0072] De acordo com uma modalidade da presente invenção, as proteinas 2086 se caracterizam por serem imunogênicas, não-patogênicas e inespecificas de cepas. As proteinas 2086 são altamente variáveis, e assim sendo, podem sofrer inserções, substituições e/ou deleções de residues de aminoácidos, sem comprometer a imunogenicidade das proteinas. As proteinas 2086 podem ser divididas em duas subfamilias, Subfamilia A e Subfamilia B.

[0073] As proteinas 2086 da Subfamilia A compreendem uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:2-6 ou uma seqüência de aminoácidos codificada por um polinucleotideo que compreende a seqüência de nucleotideos de qualquer uma das sequências numeradas com número impar de SEQ ID NOS:1-5. As proteinas 2086 da Subfamilia B compreendem uma seqüência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:8-12 ou uma seqüência de aminoácidos codificada por um polinucleotideo que compreende uma seqüência de nucleotideos de qualquer uma das sequências numeradas com número impar de SEQ ID NOS:7-11.

[0074] Uma seqüência de polipeptideo da invenção pode ser idêntica à seqüência de referência (por exemplo, numerada com número par de SEQ ID NOS:2-12), isto é, 100% idêntica, ou ela pode incluir um número de alterações de aminoácidos em comparação com a seqüência de referência, de tal modo que a identidade % seja menor do que 100%. Tais alterações incluem pelo menos uma deleção, substituição de aminoácidos, incluindo substituição ou inserção conservativa e não-conservativa. As alterações podem ocorrer nas posições do terminal amino ou carboxila da sequência de polipeptídeo referencial ou qualquer lugar entre aquelas posições terminais, intercaladas individualmente entre os aminoácidos da seqüência de aminoácidos referencial ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de aminoácidos referencial.

[0075] Assim sendo, a invenção fornece também proteinas que têm identidade de seqüência a sequências de aminoácidos contidas na Listagem de Sequências (isto é, sequências numeradas com números pares de SEQ ID NOS:2-12). De acordo com várias modalidades da presente invenção, a proteina 2086 tem uma seqüência maior do que a identidade de pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9% ou mais a qualquer uma das sequências de aminoácidos numeradas com números pares de SEQ ID NOS:2-12. Elas incluem mutantes e variantes alélicas sem limitação.

[0076] Em modalidades preferidas da invenção, as proteinas 2086 ou outros polipeptideos 2086 (por exemplo, partes imunológicas e equivalentes biológicos) geram anticorpos bactericidas para cepas homólogas e pelo menos uma cepa heteróloga de meningococos. Especificamente, os anticorpos para os polipeptideos 2086 protegem passivamente ratos recém-nascidos contra desafio, tais como intranasais, com meningococos. Em outras modalidades preferidas, os polipetideos 2086 apresentam tal proteção para ratos recém-nascidos para cepas homólogas e pelo menos uma cepa heteróloga. O polipeptídeo pode ser selecionado entre o Sumário de Sequências acima, como enunciado nas sequências numeradas com números pares de SEQ ID NOS: 2-12, ou o polipeptideo pode ser qualquer fragmento imunológico ou equivalente biológico dos polipeptídeos listados. De preferência, o polipeptideo é selecionado entre qualquer uma das sequências numeradas com números pares de SEQ ID NOS: 2-12 no Sumário de Sequências acima.

[0077] Esta invenção refere-se também a variantes alélicas ou outras variantes dos polipeptideos 2086, que são equivalentes biológicos. Os equivalentes biológicos apropriados devem apresentar capacidade para (1) eliciar anticorpos bactericidas para cepas homólogas e pelo menos uma cepa heteróloga de neisséria e/ou cepa gonocócica; (2) reagir com a superficie de cepas homólogas e pelo menos uma cepa heteróloga de neisséria e/ou cepa gonocócica; (3) conferem proteção passiva contra um desafio vivo; e/ou (4) impedem colonização.

[0078] Os equivalentes biológicos apropriados têm pelo menos cerca de 95 %, 96%, 97% 98%, 99% ou 99,9% de similaridade a um dos polipeptideos 2086 aqui especificados (isto é, as sequências numeradas com números pares de SEQ ID NOS: 2-12), desde que o equivalente seja capaz de eliciar substancialmente as mesmas propriedades imunogênicas que uma das proteinas 2086 desta invenção.

[0079] Alternativamente, os equivalentes biológicos têm as mesmas propriedades imunogênicas que uma das proteinas 2086 nas sequências numeradas com números pares de SEQ ID NOS: 2-12. De acordo com modalidades da presente invenção, os equivalentes biológicos têm as mesmas propriedades imunogênicas que as sequências numeradas com números pares de SEQ ID NOS: 2-12.

[0080] Os equivalentes biológicos são obtidos gerando variantes e modificações nas proteinas desta invenção. Estas variantes e modificações das proteinas são obtidas alterando as sequências de aminoácidos por inserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos. A seqüência de aminoácidos é modificada, por exemplo, por substituição para criar um polipeptideo que tem qualidades substancialmente iguais ou melhoradas. Um meio preferido para introduzir alterações compreende fazer mutações predeterminadas da seqüência de ácidos nucléicos da seqüência do polipeptideo por mutagênese direcionada a sitio.

[0081] As modificações e mudanças podem ser feitas na estrutura de um polipeptideo da presente invenção e ainda assim obter uma molécula que tem imunogenicidade de N. meningitidis. Por exemplo, sem limitações, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos, incluindo substituição não-conservativa e conservative, em uma seqüência sem perda apreciável de imunogenicidade. Devido ao fato de que é a capacidade interativa e a natureza de um polipeptideo que definem a atividade funcional biológica do polipeptideo, inúmeras substituições de aminoácidos podem ser feitas em uma seqüência do polipeptideo (ou, evidentemente, sua seqüência codificadora do DNA subjacente) e contudo obter um polipeptideo com propriedades similares. A presente invenção contempla quaisquer mudanças do da estrutura dos presentes polipeptideos, bem como as sequências de ácidos nucléicos retém imunogenicidade. Os versados nessas técnicas seriam prontamente capazes de modificar os polipeptideos e polinucleotídeos descritos, consequentemente, baseados nas orientações aqui fornecidas.

[0082] Por exemplo, certas regiões variáveis foram identificadas, nas quais a substituição ou deleção é permissível. A seqüência de consenso de 2086, como discutido anteriormente, apresenta regiões conservadas e não-conservadas da família 2086 de proteínas de acordo com uma implementação da presente invenção.

[0083] Ao fazer tais mudanças, quaisquer técnicas conhecidas pelos versados nessa área podem ser utilizadas. Por exemplo, sem pretender limitar-se a isto, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropático de aminoácidos em conferir função biológica interativa em um polipeptídeo é genericamente entendida nessas técnicas (Kyte et al. 1982. J. Mol. Bio. 157:105-132).

[0084] A substituição de aminoácidos similares pode ser feita também na base do caráter hidrofílico, particularmente quando o polipeptídeo ou peptídeo equivalente funcional biológico criado desta forma é intencionado para uso em modalidades imunológicas. A patente n2 US 4.554.101, aqui incorporada como referência, afirma que o maior caráter hidrofílico médio local de um polipeptídeo, conforme ditado pelo caráter hidrofílico dos seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com sua imunogenicidade, isto é, com a propriedade biológica do polipeptídeo.

[0085] Os equivalentes biológicos de um polipeptideo podem ser preparados também usando mutagêse direcionada a sitio. A mutagênese especifica de sitio é uma técnica útil na preparação de polipeptideos de segunda geração, ou polipeptideos ou peptideos equivalentes biologicamente funcionais, derivados das suas sequências, através de mutagênese especifica do DNA subjacente. Tais mudanças podem ser desejáveis quando as substituições de aminoácidos são desejáveis. A técnica proporciona ainda uma fácil capacidade para preparar e testar variantes de sequências, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações que se precedentes, introduzindo uma ou mais mudanças das sequências de nucleotideos no DNA. A mutagênese especifica de sitio permite a produção de mutantes através do uso de sequências de oligonucleotideos especificas que codificam a seqüência do DNA da mutação desejada, bem como um número suficiente nucleotideos adjacentes, para produzir uma seqüência iniciadora de tamanho suficiente e complexidade de seqüência para formar um duplex estável em ambos lados da junção de deleção que está sendo atravessada. Tipicamente, um iniciador de cerca de 17 a 25 nucleotideos de comprimento é preferido, com cerca de 5 a 10 residues em ambos lados da junção da seqüência que está sendo alterada.

[0086] Em geral, a técnica de mutagênese especifica de sitio é bem conhecida nessa área. Como deve ser avaliado, a técnica emprega tipicamente um vetor de fago que pode existir na forma monofilamentar e filamento duplo. Tipicamente, a mutagênese direcionada a sitio, de acordo com a presente invenção, é realizada primeiramente obtendo um vetor monofilamentar que inclui dentro da sua seqüência uma seqüência de DNA que codifica a totalidade ou uma parte da seqüência de polipeptideo de N. meningitidis selecionada. Um iniciador de oligonucleotideo portador da seqüência mutada desejada é preparado (por exemplo, sinteticamente) . Este iniciador é então anelado para o vetor monofilamentar, e estendido pelo uso de enzimas tais como DNA polimerase I de E. coli (fragmento Klenow), para completar a sintese do filamento portador da mutação. Assim sendo, é formado um heterodúplex no qual um filamento codifica a seqüência não-mutada original e o segundo filamento porta a mutação desejada. Este vetor heterodúplex é então usado para transformar células apropriadas tais como células de E. coli, e são selecionados clones que incluem vetores recombinantes que portam a mutação. Kits disponíveis comercialmente vêm com todos reagentes necessários, exceto os iniciadores de oligonucleotideos.

[0087] Os polipeptideos 2086 incluem qualquer proteína ou polipeptideo que compreende substancial similaridade de seqüência e/ou equivalência biológica a uma proteina 2086 que tem uma seqüência de aminoácidos de uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS 2-12. Além disso, um polipeptideo 2086 da invenção não está limitado a uma fonte específica. Assim sendo, a invenção fornece a detecção e isolamento genérico dos polipeptideos a partir de uma série de fontes. Além disso, os polipeptideos 2086 podem ser preparados de forma recombinante, bem como dentro do conhecimento destas técnicas, baseado nas orientações aqui fornecidas, ou de qualquer outra maneira sintética, como é do conhecimento nessas técnicas.

[0088] Contempla-se na presente invenção que um polipeptídeo 2086 pode ser vantajosamente clivado em fragmentos para uso em análise estrutural ou funcional adicional, ou na geração de reagentes tais como polipeptideos relacionados a 2086 e anticorpos específicos para 2086. Isto pode ser realizado tratando polipeptideos de N. meningitidis polipeptideos purificados e não- purificados com uma peptidase tais como endoproteinase glu- C (Boehringer, Indianapolis, IN) . O tratamento com CNBr é outro método pelo qual fragmentos de peptideos podem ser produzidos a partir de polipeptideos 2086 de N. meningitidis naturais. Técnicas recombinantes também podem ser usadas para produzir fragmentos específicos de uma proteína 2086.

[0089] "Variante", como o termo é aqui utilizado, é um polinucleotideo ou polipeptídeo que difere de um polinucleotideo ou polipeptídeo referencial, respectivamente, mas retém as propriedades essenciais. Uma variante típica de um polinucleotideo difere em seqüência de nucleotideos de outro polinucleotideo referencial. As mudanças na seqüência de nucleotideos da variante podem ou não alterar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotideo referencial. As mudanças de nucleotideos podem resultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncamentos de aminoácidos no polipeptídeo codificado pela seqüência referencial, como discutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídeo difere em seqüência de aminoácidos de outra de polipeptídeo referencial. Genericamente, as diferenças são limitadas de variante seja proximamente similares no todo e, em muitas regiões, idênticas (isto é, biologicamente equivalentes). Um polipeptideo variante referencial podem diferir na seqüência de aminoácidos em uma ou mais substituições, adições, deleções em qualquer combinação. Um residuo de aminoácido substituido ou inserido pode ou não ser um codificado pelo código genético. Uma variante de um polinucleotídeo ou polipeptideo pode ser um de ocorrência natural, tal como uma variante alélica, ou ela pode ser uma variante que não é conhecida como de ocorrência natural. As variantes que não ocorrem de forma natural de polinucleotideos e polipeptideos podem ser fabricadas por técnicas de mutagênese ou sintese direta.

[0090] 0 termo "identidade", como conhecido nessas técnicas, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptideo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeo, determinada comparando as sequências. Nessas técnicas, "identidade" significa também o grau de semelhança entre as sequências de polipeptideo ou polinucleotídeo, conforme seja o caso, determinada pela equivalência entre filamentos dessas sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser calculadas facilmente por métodos conhecidos, incluindo, porém sem limitações, aqueles descritos em "Computational Molecular Biology", Lesk, A. M., editor, Oxford University Press, New York, 1988; "Biocomputing: Informatics and Genome Projects", Smith, D. W., editor, Academic Press, New York, 1993; "Computer Analysis of Sequence Data", Parte I, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., editores, Humana Press, New Jersey, 1994; "Sequence Analysis in Molecular Biology", von Heinje, G., Academic Press, 1987; e "Sequence Analysis Primer", Gribskov, M. e Devereux, J., editores, M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Os métodos preferidos para determinar a identidade são desenhados para dar a maior equivalência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade estão codificados em programas de computador disponíveis para o público. Os métodos de programas de computador para determinar identidade e similaridade entre duas sequências incluem, porém sem limitações, o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al 1984), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S. F. , et al., 1990). O programa BLASTX está disponível para o público na NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., 1990). 0 algoritmo de Smith Waterman conhecido também pode ser usado para determinar a identidade.

[0091] A título exemplificativo, sem pretender limitar-se a isto, uma seqüência de aminoácidos da presente invenção pode ser idêntica às sequências referenciais, numeradas com número par SEQ ID NOS: 2-12; isto é, 100% idênticas, ou pode incluir inúmeras alterações de aminoácidos em comparação com a seqüência referencial, de tal modo que % identidade seja menos do que 100%. Tais alterações são selecionadas no grupo que consiste em pelo menos uma deleção, substituição de aminoácido, incluindo substituição conservativa e não-conservativa, ou inserção, e onde as ditas alterações podem ocorrer nas posições dos terminais amino ou carboxila da seqüência de polipeptideo referencial ou alhures entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre os aminoácidos na seqüência referencial ou em um ou mais grupos contiguos dentro da seqüência referencial. 0 número de alterações de aminoácidos para uma dada % de identidade é determinado multiplicando o número total de aminoácidos em sequências numeradas com número par SEQ ID NOS:2-12 pela porcentagem numérica da identidade percentual respectiva (dividido por 100) e depois subtraindo esse produto do dito número total de aminoácidos em qualquer seqüência numerada com número par SEQ ID NOS:2-12, ou: na = xa-(xa*y),

[0092] onde na é o número de alterações de aminoácidos, xa é o número total de aminoácidos em sequências numeradas com número par ID NOS:2-12, e y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85% etc., e onde qualquer produto não número inteiro de xa e y é arredondado para baixo até o número inteiro mais próximo antes de subtrai-lo de xa.

[0093] Em modalidades preferidas, o polipeptídeo acima é selecionado entre as proteinas enunciadas nas sequências numeradas com número par SEQ ID NOS 2-12, tal como forma madura processada de uma proteina 2086. As proteinas 2086 ou equivalentes, etc. podem ser lipidadas ou não-lipidadas.

[0094] ORF 2086 é expressável em E. coli com a seqüência sinalizadora nativa ORF 2086. Entretanto, é desejável encontrar meios para melhorar a expressão de proteinas. De acordo com uma modalidade da presente invenção, uma seqüência líder produz uma forma lipidada da proteina. Por exemplo, o texto que se segue descreve o uso da seqüência sinalizadora da proteina não-tipável P4 de Haemophilus influenzae para intensificar a expressão.

[0095] O processamento de lipoproteinas bacterianas começa com a sintese de um precursor ou pró- lipoproteína que contém uma seqüência sinalizadora, a qual o, por sua vez, contém um sitio de processamento/modificação de lipoproteina de consenso. Esta lipoproteina atravessa inicialmente o sistema See comum da membrana interna de bactérias gram-negativas ou na membrana de bactérias gram-positivas. Depois de colocada na membrana pelo sistema Sec, a pró-lipoproteina é clivada pela peptidase sinalizadora II no sitio de consenso e o residuo de cisteina do terminal N exposto é glicerado e acilado. Hayashi et al. 1990. "Lipoproteins in bacteria", J. Bioenerg. Biomembr. Junho; 22 (3):451-71; Oudega et al. 1993. "Escherichia coli SecB, SecA, and SecY proteins are required for expression and membrane insertion of the bacteriocin release protein, a small lipoprotein", J. Bacteriol. Março; 175(5):1543-7; Sankaran et al. 1995. "Modification of bacterial lipoproteins", Métodos Enzymol. 250:683-97.

[0096] Em bactérias gram-negativas, o transporte da proteina lipidada para a membrana externa é mediado por um sistema transportador singular ABC com especificidade de membrana, dependendo de um sinal selecionador na posição 2 da lipoproteina (Yakushi et al. 2000). Um novo transportador ABC que medeia o destacamento de proteinas modificadas com lipideo das membranas (Nat. Cell Biol, abril; 2(4):212-8).

[0097] A fusão com lipoproteinas bacterianas e suas sequências sinalizadoras foi usada para exibir proteinas recombinantes sobre a superfície de bactérias (patentes n— US 5.583.038 e 6.130.085, "Exchanging lipoprotein signal sequences can increase the production of the lipoprotein", De et al. (2000)). A purificação e caracterização de adesina A superficial pneumocócica palmitoilada de Streptococcus pneumoniae expressada em Escherichia coli. Vaccine. 6 de março 6; 18(17):1811-21.

[0098] A lipidação bacteriana de proteinas é conhecida por aumentar ou modificar a resposta imunológica a proteinas (Erdile et al. 1993, "Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA", Infect. Immun. Janeiro; 61(l):81-90; Snapper et al. 1995, "Bacterial lipoproteins may substitute for cytokines in the humoral immune response to T cell-independent type II antigens", J. Immunol. 15 de dezembro; 155(12):5582-9. Entretanto, a expressão de lipoproteinas bacterianas pode ser complicada pela severidade do processamento (Pollitt et al., 1986), "Effect of amino acid substitutions at the signal peptide cleavage site of the Escherichia coli major outer membrane lipoprotein", J. Biol. Chem. 5 de fevereiro; 261(4):1835-7; Lunn et al. 1987, "Effects of prolipoprotein signal peptide mutations on secretion of hybrid prolipo- beta-lactamase in Escherichia coli" J. Biol. Chem. 15 de junho; 262(17):8318-24; Klein et al. 1988, "Distinctive properties of signal sequences from bacterial lipoproteins" Protein Eng. abril; 2(l):15-20. A expressão bacteriana de lipoproteinas é complicada também por outros problemas tais como toxicidade e baixos níveis de expressão, Gomez et al. 1994, "Nucleotide The Bacillus subtilis lipoprotein LplA causes cell lysis when expressed in Escherichia coli", Microbiology, agosto; 140 (parte 8):1839-45; Hansson et al. 1995, "Expression of truncated and full-length forms of the Lyme disease Borrelia outer surface protein A in Escherichia coli", Protein Expr. Purif. fevereiro; 6(1):15- 24; Yakushi et al. 1997, "Lethality of the covalent linkage between mislocalized major outer membrane lipoprotein and the peptidoglycan of Escherichia coli", J. Bacteriol. maio; 179(9):2857-62.

[0099] A bactéria não-tipável Haemophilus influenzae expressa uma lipoproteina designada P4 (conhecida também como proteína "e"). A forma recombinante da proteina P4 é altamente expressada em E. coli usando a seqüência sinalizadora P4 (patente n2 OS 5.955.580). Quando a seqüência sinalizadora nativa P4 é substituída pela seqüência sinalizadora nativa ORF 2086 em um vetor de expressão em E. coli, o nível de expressão de ORF2086 é aumentado.

[0100] Este conceito de usar a seqüência sinalizadora heteróloga P4 para aumentar a expressão é extensível a outras lipoproteinas bacterianas. Particularmente, a análise de genomas bacterianos leva à identificação de muitas ORFs como sendo de possível interesse. Tentar expressar cada ORF com sua seqüência sinalizadora nativa em uma célula hospedeira heteróloga, tal como E. coli, gera uma série de problemas inerentes usando uma série de sequências sinalizadoras, incluindo estabilidade, compatibilidade, e assim por diante. Para minimizar estes problemas, a seqüência sinalizadora P4 é usada para expressar cada ORF de interesse. Como descrito acima, a seqüência sinalizadora P4 melhora a expressão ORF 2086 heteróloga. Um vetor de expressão é construído deletando a seqüência sinalizadora nativa da ORF de interesse, e ligando a seqüência sinalizadora P4 à ORF. Uma célula hospedeira apropriada é então transformada, transfectada ou infectada com o vetor de expressão, e a expressão da ORF é aumentada em comparação com a expressão que usa a seqüência sinalizadora nativa da ORF.

[0101] A forma não-lipidada é produzida proteína sem a seqüência líder original ou por uma seqüência líder que é substituída com uma parte da seqüência que não especifica um sítio para acilação de ácido graxo em uma célula hospedeira.

[0102] As várias formas das proteínas 2086 desta invenção são aqui referidas como proteína "2086", a menos que diferentemente assinalado. Além disso, "polipeptideo 2086" refere-se às proteínas 2086, bem como partes imunogênicas ou equivalentes biológicos delas, como assinalado acima, a menos que diferentemente especificado.

[0103] A proteína 2086 de N. meningitidis isolada e purificada de comprimento inteiro tem um peso molecular aparente de cerca de 28 a 35 kDa, medido em um gel de poliacrilamida a 10% a 20% de SDS (SDS-PAGE) . Mais especificamente, esta proteína tem um peso molecular de cerca de 26.000 a 30.000 dáltons, medido por espectrometria de massas.

[0104] De preferência, os polipeptideos 2086 e ácidos nucléicos que codificam esses polipeptideos são usados para impedir ou melhorar infecção causada por N. meningitidis e/ou outras espécies.

ANTICORPOS

[0105] As proteínas da invenção, incluindo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2-12, seus fragmentos, e seus análogos, ou células que os expressam, também são usadas como imunógenos para produzir anticorpos imunoespecíficos para os polipeptideos da invenção. A invenção inclui anticorpos para polipeptideos imunoespecíficos e o uso de tais anticorpos para detectar a presença de N. meningitidis, proporcionar proteção passiva ou medir a quantidade ou concentração dos polipeptideos em uma célula, um extrato de células ou tecidos, ou um fluido biológico.

[0106] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, e anticorpos anti-idiotípicos. Os anticorpos policlonais são populações heterogênicas de moléculas de anticorpos derivados dos soros de animais imunizados com um antígeno. Os anticorpos monoclonais são uma população substancialmente homogênea de anticorpos para antigenos específicos. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por métodos conhecidos por versados nessas técnicas, por exemplo, Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495-497 e patente n2 US 4.376.110. Tais anticorpos podem ser qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD e qualquer subclasse deles.

[0107] Os anticorpos quiméricos são moléculas, cujas partes diferentes são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aquelas que têm região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os anticorpos quiméricos e os métodos para sua produção são conhecidos nessas técnicas (Cabilly et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3273-3277; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855; Boulianne et al., 1984, Nature 312:643-646; Cabilly et al. , pedido de patente europeu n2 125023 (publicado em 14 de novembro de 1984); Taniguchi et al., pedido de patente europeu n2 171496 (publicado em 19 de fevereiro de 1985); Morrison et al., pedido de patente europeu n2 173494 (publicado em 5 de março de 1986); Neuberger et al., pedido de patente PCT n2 WO 86/01533 (publicado em 13 de março de 1986); Kudo et al., pedido de patente europeu n2 184187 (publicado em 11 de junho de 1986); Morrison et al., pedido de patente europeu n2 173494 (publicado em 5 de março de 1986); Sahagan et al., 1986, J. Immunol. 137:1066-1074; Robinson et al., PCT/US86/02269 (publicado em 7 de maio de 1987); Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:214-218; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043). Estas referências são aqui incorporadas como referência em sua totalidade.

[0108] Um anticorpo anti-idiotipico (anti-Id) é um anticorpo que reconhece determinantes singulares genericamente associados com o sitio de ligação de antigeno de um anticorpo. Um anticorpo anti-Id é preparado imunizando um animal da mesma espécie e tipo genético (por exemplo, cepa de camundongo) que a fonte do anticorpo monoclonal com o anticorpo monoclonal para o qual um anti- Id está sendo preparado. O animal imunizado reconhecerá e responderá aos determinantes idiotipicos do anticorpo imunizador, produzindo um para estes determinantes isotipicos (to anticorpo anti-Id).

[0109] Consequentemente, os anticorpos monoclonais gerados contra os polipeptideos da presente invenção podem ser usados para induzir anticorpos anti-Id em animais apropriados. As células do baço desses camundongos imunizados podem ser usadas para produzir hibridomas anti-Id que secretam anticorpos anti-Id monoclonais. Além disso, os anticorpos anti-Id podem ser acoplados a um carreador como hemocianina de lapa (KLH) e usados para imunizar camundongos BALB/c adicionais. Os soros destes camundongos conterão anticorpos anticorpos anti-Id que têm as propriedades de ligação do mAb final especifico para epitopo de R-PTPase. Os anticorpos anti-Id têm assim seus epítopos idiotipicos, ou "idiótopos" estruturalmente similares ao epitopo que está sendo avaliado, tais como polipeptideos de Streptococcus pyogenes.

[0110] O termo "anticorpo" significa também incluir moléculas intactas, bem como fragmentos tais como Fab, anticorpos de cadeia única e outros fragmentos que reconhecem antigenos de anticorpos que são capazes de ligação de antígeno. Os fragmentos Fab carecem do fragmento Fc de anticorpo intacto, depuram mais rápida da circulação, e podem ter menos ligação inespecífica de tecido do que um anticorpo intacto (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316- 325) . Deve-se avaliar que Fab e outros fragmentos dos anticorpos úteis na presente invenção podem ser usados para a detecção de polipeptideos de N. meningitidis polipeptideos de acordo com os métodos para moléculas de anticorpos intactos.

[0111] Os anticorpos desta invenção, tais como mos anticorpos anti-idiotipicos ("anti-Id"), podem ser empregados em um método para o tratamento ou prevenção de infecção por Neisséria em hospedeiros mamiferos, que compreende a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de anticorpo, especifico para um polipeptideo como descrito acima. O anticorpo anti-Id pode ser usado também como um "imunógeno" para induzir uma resposta imune em ainda outro animal, produzindo um assim denominado anticorpo anti-anti-Id. O anti-anti-Id pode ser idêntico em termos isotópicos ao mAb original que induziu o anti-Id. Assim sendo, usando anticorpos para os determinantes idiotipicos de um mAb, é possivel identificar outros clones que expressam anticorpos com especificidade idêntica.

[0112] Os anticorpos são usados de uma série de maneiras, por exemplo, para confirmação que uma proteína é expressada, ou para confirmar onde uma proteína é expressada. O anticorpo marcado (por exemplo, marcação fluorescente para FACS) pode ser incubado com bactérias intactas e a presença do marcador sobre a superficie bacteriana confirma a localização da proteína, por exemplo.

[0113] Os anticorpos gerados contra os polipeptideos da invenção podem ser obtidos administrando os polipeptideos ou fragmentos portadores do epítopo, análogos, ou células a um animal, usando protocolos rotineiros. Para preparar anticorpos monoclonais, qualquer técnica que fornece anticorpos produzidos por culturas contínuas de linhagens de células é usada.

POLINUCLEOTÍDEOS

[0114] Da mesma forma que com as proteinas da presente invenção, um polinucleotideo da presente invenção pode compreender uma seqüência de ácidos nucléicos que é idêntica a qualquer uma das sequências referenciais numeradas com número impar SEQ ID NOS: 1-11, que é 100% idêntica, ou pode incluir até um número de alterações de nucleotideos em comparação com a seqüência referencial. Tais alterações são selecionadas mo grupo que consiste em pelo menos uma deleção, substituição de nucleotideos, incluindo transição e transversão, ou inserção, e onde as ditas alterações podem ocorrer nas posições dos terminais 5' ou 3' da seqüência referencial de nucleotideos ou em qualquer lugar entre estas posições terminais, intercaladas individualmente entre os nucleotideos na seqüência referencial ou em um ou mais grupos contiguos dentro da seqüência referencial. O número de alterações de nucleotideos é determinado multiplicando o número total de nucleotideos em qualquer uma das sequências numeradas com número impar SEQ ID NOS:1-11 pela porcentagem numérica da respectiva identidade percentual (dividido por 100) e subtraindo esse produto do dito número total de nucleotideos na dita seqüência.

[0115] A titulo exemplificativo, sem pretender se limitar a isto, um polinucleotideo isolado de N. meningitidis que compreende uma seqüência de polinucleotideo que tem pelo menos 95% de identidade a qualquer seqüência de ácidos nucléicos numeradas com número impar SEQ ID NOS: 1-11; uma sua variante degenerada ou um seu fragmento, onde a seqüência de polinucleotideo pode incluir até nn alterações de ácidos nucléicos na região inteira de polinucleotídeo das sequências de ácidos nucléicos numeradas com número ímpar SEQ ID NOS:1-11, onde nn é o número máximo de alterações e é calculado pela fórmula: nn = xn-(xn-y),

[0116] na qual xn é o número total de ácidos nucléicos de qualquer uma das sequências numeradas com número ímpar SEQ ID NOS:1-11 e y tem um valor de 0,95, onde qualquer produto não inteiro de xn é arredondado para baixo até o número inteiro mais próximo antes de subtrair desse produto xn. Evidentemente, y pode ter também um valor de 0,95 para 95%, etc. As alterações de uma seqüência de polinucleotídeo que codifica os polipeptideos que compreendem sequências de aminoácidos de qualquer uma numerada com número par SEQ ID NOS:2-12 pode criar mutações nonsense, missense ou frameshift nesta seqüência codificadora, e desta forma, alterar o polipeptideo codificado pelo polinucleotídeo após tais alterações.

[0117] Certas modalidades da presente invenção referem-se a polinucleotideos (aqui referidos como "2086" ou "polinucleotideos ORF2086") que codificam as proteínas 2086 e anticorpos fabricados as proteínas 2086. Em modalidades preferidas, um polinucleotídeo isolado da presente invenção é um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotideos que tem pelo menos cerca de 95% de identidade a uma seqüência de nucleotideos escolhida entre uma das sequências numeradas com número ímpar SEQ ID NOS:1-11, uma sua variante degenerada, ou um fragmento dela. Como aqui definido, o termo "variante degenerada" é definido como um polinucleotídeo que difere da seqüência de nucleotideos ilustrada nas sequências numeradas com número impar SEQ ID NOS:1-11 (e fragmentos dela) devido à degeneração do código genético, mais ainda assim codifica a essa proteina 2086 (por exemplo, as sequências numeradas com número par SEQ ID NOS: 2-12) que aquela codificada pela seqüência de nucleotideos ilustrada nas sequências numeradas com número impar SEQ ID NOS: 1-11.

[0118] Em outras modalidades, o polinucleotideo é um complemento a uma seqüência de nucleotideos escolhida entre uma das sequências numeradas com número impar SEQ ID NOS: 1-11, uma sua variante degenerada, ou um fragmento dela. Em ainda outras modalidades, o polinucleotideo é selecionado no grupo que consiste em DNA, DNA cromossômico, cDNA e RNA e compreende ainda nucleotideos heterólogos.

[0119] Deve-se avaliar que os polinucleotídeos 2086 podem ser obtidos a partir de fontes naturais, sintéticas ou semi-sintéticas; além disso, a seqüência de nucleotideos pode ser uma seqüência de ocorrência natural, ou ela pode ser relacionada por mutação, incluindo substituições de bases individuais ou múltiplas, deleções, inserções e inversões, para uma seqüência de ocorrência natural, desde que sempre que uma molécula de ácido nucléico que compreende essa seqüência seja capaz de ser expressada como polinucleotideo 2086 imunogênico, como descrito acima. A molécula de ácido nucléico pode ser RNA, DNA, de filamento único ou filamento duplo, linear ou uma forma circular fechada de forma covalente. A seqüência de nucleotideos pode ter sequências de controle da expressão adjacentes a ela, sendo tais sequências de controle derivadas de uma fonte heteróloga. Genericamente, a expressão recombinante da seqüência de ácidos nucléicos desta invenção usará uma seqüência de códons interruptores, tal como TAA, na extremidade da seqüência de ácidos nucléicos.

[0120] A invenção inclui também polinucleotideos capazes de hibridizar sob condições de severidade reduzida, mais preferivelmente condições severas, e com a maior preferência, condições altamente severas, para polinucleotideos aqui descritos. Os exemplos de condições severas estão indicadas na Tabela de Condições de Severidade abaixo: condições altamente severas são aquelas que são pelo menos tão severas quanto, por exemplo, as condições A-F; as condições severas são pelo menos tão severas quanto, por exemplo, as condições G-L; e as condições de severidade reduzida são pelo menos tão severas quanto, por exemplo, as condições M-R. TABELA I CONDIÇÕES DE SEVERIDADE

bpT: 0 comprimento do híbrido é aquele previsto para a região ou regiões hibridizadas dos polinucleotideos em hibridização. Quando um polinucleotídeo é hibridizado para um polinucleotídeo-alvo com seqüência desconhecida, o comprimento do híbrido é presumido como sendo aquele do polinucleotídeo que está sedo hibridizado. Quando os polinucleotideos com seqüência conhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado alinhando as sequências dos polinucleotideos e identificando a região ou regiões de ótimas complementaridades de sequências. tampãoH: SSPE (IxSSPE é NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, e EDTA 1,25 mM, pH 7,4) pode ser substituído por SSC (IxSSC é NaCl 0,15 M e citrato de sódio 15 mM) nos tampões de hibridização e lavagem; as lavagens são realizadas por 15 minutos depois de completada a hibridização. TB até TB; A temperatura de hibridização prevista para ser menor do que 50 pares de bases de comprimento deve ser 5- 10EC menor do que a temperatura de fusão (Tra) do híbrido, onde Tm é determinada de acordo com as equações que se seguem. Para híbridos com menos do que 18 pares de bases de comprimento, Tm(EC) = 2(n° de bases A + T) + 4 (n2 de bases G + C) . Para híbridos com entre 18 e 49 pares de bases de comprimento, Tm(EC) = 81,5 + 16,6 (logio[Na+]) + 0,41 (% de G+C) - (600/N), onde N é o número de bases no híbrido, e [Na*] é a concentração de ions de sódio no tampão de hibridização ([Na+] para lxSSC = 0,165 M) .

[0121] Os exemplos adicionais de condições de severidade para a hibridização de polinucleotídeos são fornecidos em Sambrook, J., E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 e 11; e "Current Protocols in Molecular Biology", 1995, F.M. Ausubel et al., editores, John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3-6.4, aqui incorporados como referência.

[0122] A invenção fornece também polinucleotídeos que são completamente complementares a estes polinucleotídeos e fornece também sequências antisense. As sequências antisense da invenção, referidas também como oligonucleotídeos antisense, incluem sequências geradas internamente e administradas externamente que bloqueiam a expressão de polinucleotídeos que codificam os polipeptideos da invenção. As sequências antisense da invenção compreendem, por exemplo, cerca de 15-20 pares de bases. As sequências antisense podem ser desenhadas, por exemplo, para inibir a transcrição por impedir a ligação de promotores a uma seqüência a montante não-traduzida ou impedindo a tradução de um transcrito que codifica um polipeptídeo da invenção impedindo o ribossoma de se ligar.

[0123] Os polinucleotideos da invenção são preparados de muitas maneiras (por exemplo, por síntese química, a partir de bibliotecas de DNA, a partir do organismo em si) e podem assumir várias formas (por exemplo, monofilamentares, de filamento duplo, vetores, sondas, iniciadores). O termo "polinucleotideo" inclui DNA e RNA, e também seus análogos, tais como aqueles que contêm esqueletos modificados.

[0124] De acordo com outras implementações da presente invenção, os polinucleotideos da presente invenção compreendem uma biblioteca de DNA, tal como uma biblioteca de DNAc.

PROTEÍNA DE FUSÃO

[0125] A presente invenção refere-se também a proteínas de fusão. Uma "proteína de fusão" refere-se a uma proteína codificada por dois genes fundidos, frequentemente não-relacionados ou seus fragmentos. Por exemplo, as proteínas de fusão que compreendem várias partes da região constante de moléculas de imunoglobulina, junto com outra proteína imunogênica ou parte dela. Em muitos casos, empregar uma região Fc de imunoglobulina como uma parte de uma proteinase fusão é vantajoso para uso em terapia e diagnóstico que resulta em, por exemplo, melhores propriedades farmacocinéticas (vide, por exemplo, o documento n2 EP 0 232 262 Al). Por outro lado, para alguns usos seria desejável ser capaz de deleter a parte Fc depois que a proteina de fusão foi expressada, detectada e purificada. Os polinucleotídeos 2086 da invenção são usados para a produção recombinante de polipeptideos da presente invenção, o polinucleotideo pode incluir a seqüência codificadora para o polipeptideo maduro, em si, ou a seqüência codificadora para o polipeptideo maduro em estrutura de leitura com outras sequências codificadoras, tais como aquelas que codificam uma seqüência líder ou secretória, uma seqüência de pré-, ou pró- ou pré-pró- proteina, ou outras partes do peptideo de fusão. Por exemplo, uma seqüência marcadora que facilita a purificação de um polipeptideo 2086 ou polipeptideo fundido pode ser codificado (vide Gentz et al., 1989, aqui incorporado como referência em sua totalidade). Assim sendo, está contemplada em uma implementação da presente invenção a preparação de polinucleotídeos que codificam polipeptideos de fusão, permitindo a purificação com His-tag de produtos da expressão. O polinucleotideo pode conter também sequências não-codificadoras 5' e 3' , tais como sequências transcritas não-traduzidas, sinais de divisão e poliadenilação. Tal polipeptideo fundido pode ser produzido por uma célula hospedeira transformada/transfectada ou infectada ou infectada com um veiculo de clonagem de DNA recombinante como descrito abaixo e ele pode ser subseqüentemente isolado da célula hospedeira para fornecer o polipeptideo fundido substancialmente isento de outras proteinas de células hospedeiras.

COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS

[0126] Um aspecto da presente invenção fornece composições imunogênicas que compreendem pelo menos uma das proteinas 2086 ou um ácido nucléico que codifica as ditas proteínas. Os precedentes têm a capacidade para (1) eliciar anticorpos bacterianos para múltiplas cepas; (2) reagir com a superficie de múltiplas cepas; (3) conferir proteção passiva contra um desafio vivo; e/ou (4) impedir a colonização. A formulação dessas composições imunogênicas é bem conhecida pelos versados nessas técnicas. Em certas modalidades, as composições da invenção incluem um carreador e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os carreadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem qualquer um e todos solventes, meios de dispersão, cargas, carreadores sólidos, soluções aquosas, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção convencionais, e similares. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem, por exemplo, um ou mais entre água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerina, etanol e similares, bem como combinações deles. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades diminutas de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida na prateleira ou a eficácia do anticorpo. A preparação e uso de carreadores farmacêuticos farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecidos nessas técnicas. Exceto à medida que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições imunogênicas da presente invenção está contemplado. De acordo com certas modalidades da presente invenção, o carreador farmaceuticamente aceitável é um proteina carreadora.

PROTEÍNAS CARREADORAS

[0127] As proteínas carreadoras que não atóxicas, e não-reatogênicas e obteníveis em quantidade e pureza suficientes. As proteínas carreadoras devem ser suscetíveis em procedimentos de conjugação padronizados. Em uma modalidade específica da presente invenção, CRM197 é usada como proteína carreadora.

[0128] CRM197 (Wyeth, Sanford, NC) é uma variante atóxica (isto é, toxóide) da toxina de difteria isolada partir de culturas de Corynebacterium diphtheria cepa C7 (βl97) desenvolvida em casaminoácidos e meio baseado em extrato de levedura. CRM197 é purificada através de ultrafiltração, precipitação com sulfato de amónio, e cromatografia de troca iônica. Outro método para obter CRM197 está descrito na patente n- US 4.925.792. Alternativamente, CRM197 é preparada de forma recombinante de acordo com a patente n2 US 5.614.382. Outros toxóides de difteria também são apropriados para uso como proteínas carreadoras.

[0129] Em outras modalidades, uma proteína carreadora da invenção é peptidase C5a (SCP) estreptocócica enzimaticamente inativa (SCP) (por exemplo, uma ou mais das variantes de SCP descritas nas patentes n— US 6.270.775, 6.355.255 e 6.951.653).

[0130] Outras proteínas carreadoras apropriadas incluem toxinas bacterianas inativadas tais como toxóide de tétano, toxóide de pertussis, toxóide de cólera (por exemplo, CT E29H, descrita na publicação da patente internacional PCT n2 WO 2004/083251), LT de E. coli, ST de E. coli, proteina DnaK de E. coli, e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. As proteínas da membrana externa bacteriana tais como o complexo de membrana externa c (OMPC), porinas, proteínas ligantes de transferrina, toxina pneumolisina (por exemplo, patente n- US 5.565.204), toxóide pneumolisina (por exemplo, publicação PCT internacional n2 WO 2005/108580), proteína de superfície pneumocócica A (PspA), proteína adesina pneumocócia (PsaA), ou proteína D de Haemophilus influenzae, também podem ser usadas. As proteínas de choque térmico bacteriano, tais como hsp-70 micobacteriana também podem ser usadas. Outras proteínas, tais como as proteínas SdrG de Staphylococcus epidermidis, proteínas ligantes de Site e ferrocromo, e proteínas de Staphylococcus aureus ClfA, ClfB e FnbA também podem ser usadas. Ainda outras proteínas, tais como ovalbumina, hemocianina de lapa (KLH), glutationa S- transferase (GST), albumina de soro bovino (BSA), galactocinase (galK), ubiquitina, β-galactosidase, proteina de influenza NS1, ou derivado de da proteína de tuberculina (PPD) também podem ser usadas como proteinas carreadoras. Partículas semelhantes a vírus, por exemplo, do rotavirus VP6 ou do bacteriófago Qβ, também podem ser usadas.

ADJUVANTES

[0131] As composições imunogênicas aqui descritas compreendem também, em certas modalidades, um ou mais adjuvantes. Um adjuvante é uma substância que intensifica a resposta imune quando administrada junto com um imunógeno ou antígeno. Inúmeras citocinas ou linfocinas demonstraram ter atividade imune modulatória, e assim sendo, são úteis como adjuvantes, incluindo, porém sem limitações, as interleucinas 1-a, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (vide, por exemplo, patente n2 US 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e suas formas mutantes); os interferons-α, β e y; fator estimulante de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (vide, por exemplo, patente n2 US 5.078.996 e Número de Acesso ATCC 39900); fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF); fator estimulante de colônias de granulócitos (G-CSF); e os fatores de necrose tumoral α e β. Ainda outros adjuvantes que são úteis com as composições imunogênicas aqui descritas incluem quimiocinas, incluindo, sem limitações, MCP-1, MIP-lα, MIP- lβ, e RANTES; moléculas de adesão, tais como uma selectina, por exemplo, L-selectina, P-selectina e E-selectina; moléculas semelhantes a mucinas, por exemplo, CD34, GlyCAM- 1 e MadCAM-1; um membro da familia de integrinas, tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e pl50.95; um membro da superfamilia de imunoglobulinas, tais como PECAM, ICAMs, por exemplo, ICAM- 1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3; moléculas co-estimulantes tais como CD40 e CD40L; fatores de crescimento, incluindo fator do crescimento vascular, fator do crescimento de nervos, fator de crescimento de fibroblastos, fator de crescimento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1, e fator do crescimento endotelial vascular; moléculas receptoras incluindo Fas, receptor do TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, e DR6; e Caspase (ICE).

[0132] Os adjuvantes apropriados usados para intensificar uma resposta imune incluem ainda, sem limitações, MPL™ (lipídeo A monofosforilado 3-O-desacilado, Corixa, Hamilton, MT) , que está descrito na patente n- US 4.912.094. São também apropriados para uso como adjuvantes os análogos de lipídeo A sintéticos ou compostos de fosfato de amino-alquil-glicosamina (AGP), ou seus derivados ou análogos, que estão disponíveis na Corixa (Hamilton, MT), e que estão descritos na patente n- US 6.113.918. Um desses AGPs é 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-etila 2-Desoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoil-aminoj-b-D-glicopiranosideo, que é conhecido também como 529 (conhecido anteriormente como RC529). Este adjuvante 529 é formulado como uma forma aquosa (AF) ou como uma emulsão estável (SE) .

[0133] Ainda outros adjuvantes incluem muramil-peptídeos, tais como N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2- (1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etil- amina (MTP-PE); emulsões óleo em água, tal como MF59 (publicação internacional PCT n2 WO 90/14837) (contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (contendo opcionalmente várias quantidades de MTP-PE), formuladas em partículas sub micrométricas usando um microfluidizador tal como o mictofluidizador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA)), e SAF (contendo 10% Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado com Pluronic e thr-MDP, microfluidizado em uma emulsão submicrométrica ou turbilhonado para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior); adjuvante de Freund incompleto (IFA); sais de alumínio (alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio; Amphigen; Avridine; L121/esqualeno; D-lactídeo- polilactídeo/glicosídeo; polióis Pluronic; killed Bordetella exterminada; saponinas, tal como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) , descrita na patente n- US 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Austrália), descrita na patente n2 US 5.254.339, e complexos imunoestimulantes (ISCOMS); Mycobacterium tuberculosis; lipopolissacrídeos bacterianos; polinucleotídeos sintéticos tais como oligonucleotídeos que contêm um modelo CpG (por exemplo, patente n2 US 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Áustria), descrito nas patentes européias n— 1.296.713 e 1.326.634; uma toxina pertússis (PT) ou mutante dela, uma toxina de cólera ou mutante dela (por exemplo, publicações internacionais PCT n— WO 00/18434, WO 02/098368 e WO 02/098369); ou uma toxina termicamente lábil de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, PT- K9/G129; vide, por exemplo, publicações internacionais PCT n22 WO 93/13302 e WO 92/19265.

MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[0134] Tais composições imunogênicas podem ser administrados por via parenteral, por exemplo, por injeção, seja subcutânea ou intramuscular, bem como por via oral ou intranasal. Os métodos para imunização intramuscular são descritos por Wolff et al. e por Sedegah et al. Outros modos de administração empregam formulações orais, formulações pulmonares, supositórios, e aplicações transdérmicas, por exemplo, sem limitações. As formulações orais incluem, por exemplo, aquelas empregadas normalmente excipientes, como por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e similares, sem limitações.

[0135] As composições imunogênicas desta invenção podem ser distribuídas na forma de ISCOMS (complexos imunoestimulantes), ISCOMS que contém CTB, lipossomas ou encapsuladas em compostos tais como acrilatos ou poli(DL-lactideo-co-glicosideo) para formar microsferas com um tamanho apropriado para adsorção. As proteínas desta invenção podem ser também incorporadas em emulsões em óleo.

MÚLTIPLOS ANTÍGENOS

[0136] Os agentes imunogênicos, incluindo proteínas, polinucleotideos e equivalentes da presente invenção podem ser administrados como único imunógeno ativo em uma composição imunogênica, ou alternativamente, a composição pode incluir outros imunógenos ativos, incluindo outros polipeptideos de Neisseria sp., ou proteínas imunologica-mente ativas de um ou mais patógenos microbianos (por exemplo, vírus, príon, bactéria, ou fungo, sem limitações) ou polissacarídeo capsular. As composições podem compreender uma ou mais proteínas desejadas, fragmentos ou compostos farmacêuticos como desejado para uma indicação escolhida. Da mesma maneira, as composições desta invenção, que empregam um ou mais ácidos nucléicos na composição imunogênica, podem incluir também ácidos nucléicos que codificam o mesmo grupo diverso de proteínas, como assinalado acima.

[0137] Qualquer composição imunogênica multiantigênica ou polivalente está contemplada pela presente invenção. Por exemplo, as composições da presente invenção podem compreender combinações de duas ou mais proteinas 2086, uma combinação de proteina 2086 com uma ou mais proteinas Por A, uma combinação de proteína 2086 com meningococo sorogrupo A, C, Y e polissacarideos W135 e/ou conjugados de polissacarideos, uma combinação de proteina 2086 com combinações de meningococo e pneumococo, ou uma combinação de qualquer um dos precedentes em uma forma apropriada para distribuição pela mucosa. Os versados nessas técnicas seriam facilmente capazes de formular tais composições multiantigênicas ou polivalentes.

[0138] A presente invenção contempla também esquemas de imunização múltipla, onde qualquer composição útil contra um patógeno pode ser combinada nela ou com ela a composição da presente invenção. Por exemplo, sem limitações, um paciente pode receber administração da composição imunogênica da presente invenção outra composição imunológica para imunizar contra S. Pneumoniae, como parte de um esquema de imunização múltipla. Os versados nessas técnicas seriam facilmente capazes de selecionar composições imunogênicas par auso em conjunto com as composições imunogênicas da presente invenção com o propósito de desenvolver e implementar esquemas de imunização múltipla.

[0139] As modalidades específicas desta invenção referem-se ao uso de um ou mais polipeptideos desta invenção, ou ácidos nucléicos que codificam a mesma, em uma composição ou como parte de um esquema de tratamento para a prevenção ou melhora de infecção por S. pneumoniae. Pode-se combinar os polipeptideos 2086 ou polinucleotídeos 2086 com qualquer composição imunogênica para uso contra infecção por S. pneumoniae. Pode-se combinar também os polipeptideos 2086 ou polinucleotideos 2086 com qualquer outra vacina meningocócica baseada em proteina ou polissacarideo.

[0140] Os polipeptideos 2086, fragmentos e equivalentes podem ser usados como parte de uma composição imunogênica conjugada, onde uma ou mais proteinas ou polipeptideos são conjugados a uma proteina carreadora, para gerar uma composição que tem propriedades imunogênicas contra vários sorotipos e/ou contra várias doenças. Alternativamente, um dos polipeptideos 2086 pode ser usado como uma proteina carreadora para outros polipeptideos imunogênicos.

[0141] A presente invenção refere-se também a um método para induzir respostas imunes em um mamifero, compreendendo a etapa de fornecer ao dito mamifero uma composição imunogênica desta invenção. A composição imunogênica é uma composição que é antigênica no animal ou humano tratado, de tal modo que a quantidade imunologicamente eficaz do(s) polipeptídeo(s) contido nessa composição provoque a resposta imune desejada contra infecção por N. meningitidis. As modalidades preferidas referem-se a um método para o tratamento, incluindo melhora ou prevenção de infecção por N. meningitidis em um humano, compreendendo administrar a um humano uma quantidade imunologicamente eficaz da composição.

[0142] A frase "quantidade imunologicamente eficaz," como aqui utilizada, refere-se à administração dessa quantidade a um hospedeiro mamifero (de preferência, humano) , seja em uma única dose ou como parte de uma série de doses, suficiente para pelo menos causar a resposta imune do individuo tratado para gerar uma resposta que reduz o impacto clinico da infecção bacteriana. Isto pode ficar na faixa entre um decréscimo minimo no ônus bacteriano até prevenção da infecção. Idealmente, o individuo tratado não deve apresentar as mais sérias manifestações clinicas da infecção bacteriana. A quantidade da dosagem pode variar, dependendo das condições especificas do individuo. Esta quantidade pode ser determinada em ensaios rotineiros ou de outra forma por meios conhecidos pelos versados nessas técnicas.

[0143] Outro aspecto especifico da presente invenção refere-se a usar como a composição imunogênica um vetor ou plasmideo que expressa uma proteina desta invenção, ou uma parte imunogênica dela. Consequentemente, como um outro aspecto, esta invenção fornece um método para induzir uma resposta imunológica em um mamifero, tal método compreende fornecer a um mamifero um vetor ou plasmideo que expresse pelo menos um polipeptideo isolado 2086. A proteina da presente invenção pode ser administrada ao mamifero utilizando-se um vetor vivo, em particular, utilizando-se bactérias recombinantes, virus ou outros agentes vivos, que contenham o material genético necessário para a expressão do polipeptideo ou porção imunológica como um polipeptideo externo.

[0144] De acordo com uma implementação adicional da presente invenção, proporciona-se um método destinado ao diagnóstico de meningite bacteriana em um mamifero, sendo que tal método compreende: detectar a presença de complexos imunes no mamifero ou em uma amostra tecidual do dito mamífero, sendo que o dito mamífero ou a dita amostra tecidual encontram-se em contato com uma composição de anticorpo que compreende anticorpos que se aglutinam, de maneira imunoespecífica, a pelo menos um polipeptideo que compreende a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas com número par de SEQ ID NOS:2-12; onde o mamífero ou amostra tecidual encontra- se em contato com a composição de anticorpo sob condições adequadas para a formação dos complexos imunes.

VETORES VIRAIS E NÃO-VIRAIS

[0145] Os vetores preferenciais, particularmente para ensaios celulares in vitro e in vivo, consistem em vetores virais, tais como lentivírus, retrovirus, herpes vírus, adenovirus, adenovirus associado, vírus da varíola, baculovírus, e outros vírus recombinantes com tropismo celular desejável. Portanto, um ácido nucléico que codifica uma proteína 2086 ou fragmento imunogênico da mesma pode ser introduzido in vivo, ex vivo, ou in vitro utilizando-se um vetor virai ou através da introdução direta de DNA. A expressão em tecidos alvo pode realizada manipulando-se o vetor transgênico em células específicas, tal como um vetor virai ou receptor ligante, ou utilizando- se um promotor tecido-específico, ou ambos. A administração de genes alvo é descrita na Publicação PCT No. WO 95/28494, cuja descrição encontra-se aqui incorporada em sua totalidade a título de referência.

[0146] Os vetores virais comumente utilizados em procedimentos de manipulação e terapia in vivo ou ex vivo são vetores à base de DNA e vetores retrovirais. Os métodos para construção e utilização de vetores virais são conhecidos na técnica (por exemplo, Miller and Rosman, BioTechniques, 1992, 7:980-990). De preferência, os vetores virais são defectives em replicação, ou seja, os mesmos são incapazes de se replicarem, de forma independente, na célula alvo. De preferência, o virus defective em replicação consiste em um virus minimo, isto é, retém apenas as sequências de seu genoma que sejam necessárias para encapsular o genoma com a finalidade de produzir partículas virais.

[0147] Os vetores virais de DNA incluem um virus de DNA atenuado ou defective, mas não se limitam a, virus herpes simples (HSV), papiloma virus, virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, adenovirus associado (AAV), e similares. Preferem-se os virus defectives que sejam total ou quase totalmente isentos de genes virais. 0 virus defectivo não se torna infective após a introdução em uma célula. O uso de vetores virais defectives permite uma administração às células em uma área localizadas especifica, sem a preocupação de que o vetor possa infectar outras células. Portanto, um tecido especifico pode ser manipulado de forma especifica. Exemplos de vetores particulares incluem, mas não se limitam a, um vetor do virus herpes defectivo 1 (HSV1) (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 1991, 2:320-330), vetor do virus herpes defectivo isento de um gene glicoprotéico L, ou outros vetores do virus herpes defectivo (Publicações PCT Nos. WO 94/21807 e WO 92/05263); um vetor do adenovirus atenuado, tal como o vetor descrito por Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest., 1992, 90:626-630; consulte também La Salle et al., Science, 1993, 259:988-990); e um vetor do adenovirus associado defective (Samulski et al., J. Virol., 1987, 61:3096-3101; Samulski et al., J. Virol., 1989, 63:3822-3828; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 1988, 8:3988-3996), estando cada um desses aqui incorporados em suas totalidades a titulo de referência.

[0148] Várias companhias produzem, comercialmente, vetores virais que incluem, mas não se limitam a, Avigen, Inc. (Alameda, CA, EUA; vetores AAV), Cell Genesys (Foster City, CA, EUA; retrovirais, adenovirais, vetores AAV, e vetores lentivirais), Clontech (vetores retrovirais e baculovirais), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA, EUA; vetores adenovirais e AAV), Genvec (vetores adenovirais), IntroGene (Leiden, Holanda; vetores adenovirais), Molecular Medicine (vetores retrovirais, adenovirais, AAV, e herpes virais), Norgen (vetores adenovirais), Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vetores lentivirais), e Transgene (Strasbourg, França; vetores da variola, adenovirais, retrovirais e lentivirais), aqui incorporados em sua totalidade a titulo de referência.

[0149] Vetores Adenovirais. Os adenovirus são vírus de DNA eucariótico que podem ser modificados de modo a administrar, de modo eficaz, um ácido nucléico da presente invenção a uma variedade de tipos de células. Existem vários sorotipos de adenovirus. Entre esses sorotipos, se dá preferência, no escopo da presente invenção, à utilização de adenovirus humanos do tipo 2 ou do tipo 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou adenovirus de origem animal (consulte a Publicação PCT No. WO 94/26914). Esses adenovirus de origem animal que podem ser usados no escopo da presente invenção incluem adenovirus de origem canina, bovina, murina (exemplo: Mavl, Beard et al., Virology, 1990, 75-81), ovina, porcina, aviária e símia (exemplo: SAV) . De preferência, o adenovirus de origem animal consiste em um adenovirus canino, com mais preferência, um adenovirus CAV2 (por exemplo, Manhattan ou cepa A26/61, ATCC VR-800, por exemplo). Descreveram-se vários adenovirus defectives em replicação e mínimos vetores adenovirais (Publicações PCT Nos. WO 94/26914, WO 95/02697, WO 94/28938, WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697, WO 96/22378) . Os adenovirus recombinantes defectives em replicação de acordo com a invenção podem ser preparados através de qualquer técnica conhecida pelos indivíduos versados na técnica (Levrero et al., Gene, 1991, 101:195; Publicação Européia No. EP 185 573; Graham, EMBO J., 1984, 3:2917; Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36:59). Os adenovirus recombinantes são recuperados e purificados utilizando-se técnicas biológicas moleculares padrão, que são bem conhecidas pelos indivíduos versados na técnica.

[0150] Adenovirus Associados. Os adenovirus associados (AAV) consistem em vírus de DNA com tamanho relativamente pequeno que podem se integrar, de maneira estável e sítio específica, ao genoma das células que eles infectam. Os mesmos são capazes de infectar um amplo espectro de células sem induzir quaisquer efeitos no crescimento, morfologia ou diferenciação celular, e não aparentam estar envolvidos em patologias humanas. O genoma AAV foi clonado, sequenciado e caracterizado. Descreveu-se o uso de vetores derivados a partir de AAVs para transferir genes in vitro e in vivo (consulte as Publicações PCT Nos. WO 91/18088 e WO 93/09239; as Patentes U.S. Nos. 4.797.368 e 5.139.941; a Publicação Européia No. EP 488 528). Os AAVs recombinantes defectives em replicação de acordo com a invenção podem ser preparados co-transfectando-se um plasmideo contendo a seqüência de ácido nucléico de interesse flanqueada por duas regiões de repetições terminais invertidas (ITR) AAV, e um plasmideo que transporta os genes de encapsidação AAV (genes rep e cap) , em uma linhagem celular que é infectada por um virus herpes humano (por exemplo, um adenovirus). Os AAV recombinantes produzidos são, então, purificados por técnicas padrão.

[0151] Vetores Retrovirais. Em outra implementação da presente invenção, o ácido nucléico pode ser introduzido em um vetor retroviral, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. No. 5.399.346; Mann et al., Cell, 1983, 33:153; nas Patentes U.S. Nos. 4.650.764 e 4.980.289; Markowitz et al., J. Virol., 1988, 62:1120; na Patente U.S. No. 5.124.263; nas Publicações Européias Nos. EP 453 242 e EP 178 220; Bernstein et al., Genet. Eng.,1985, 7:235; McCormick, BioTechnology, 1985, 3:689; Na Publicação PCT No. WO 95/07358; e Kuo et al., Blood, 1993, 82:845, estando cada uma dessas aqui incorporadas em sua totalidade a titulo de referência. Os retrovirus consistem em virus integrantes que infectam células divisoras. O genoma do retrovirus inclui dois LTRs, uma sequência de encapsidação e três regiões de codificação (gag, pol e env) . Nos vetores retrovirais recombinantes, os genes gag, pol e env são, em geral, excluidos, totalmente ou em parte, e substituídos por uma sequência de ácido nucléico construídos a partir de diferentes tipos de retrovirus, tais como, HIV, MoMuLV ("vírus da leucemia murina de Moloney" MSV ("vírus do sarcoma murino de Moloney"), HaSV ("vírus do sarcoma de Harvey"); SNV ("vírus da necrose esplénica"); RSV ("vírus do sarcoma de Rous") e vírus de Friend. Descreveram-se linhagens celulares empacotadoras adequadas na técnica anterior, em particular, a linhagem celular PA317 (Patente U.S. No. 4.861.719); a linhagem celular PsiCRIP (Publicação PCT No. WO 90/02806) e a linhagem celular GP+envAm-12 (Publicação PCT No. WO 89/07150). Além disso, o vetores retrovirais recombinantes podem conter modificações nos LTRs para anular a atividade transcripcional, assim como sequências de encapsidação extensivas que podem incluir uma parte do gene gag (Bender et al., J. Virol., 1987, 61:1639). Os vetores retrovirais recombinantes são purificados através de técnicas padrão conhecidas pelos indivíduos versados na técnica.

[0152] Os vetores retrovirais podem ser construídos de modo a funcionarem como partículas infecciosas ou se submeterem a uma única rodada de transfecção. No primeiro caso, o vírus é modificado de modo que retenha todos seus genes a exceção dos responsáveis pelas propriedades de transformação oncogênica, e expresse o gene heterólogo. Os vetores virais não-infecciosos são manipulados de modo a destruírem o sinal de empacotamento virai, porém, com a finalidade de reterem os genes estruturais necessários para empacotar os vírus co- introduzidos geneticamente modificados de modo a incluírem o gene heterólogo e os sinais de empacotamento. Portanto, as partículas virais produzidas não são capazes de produzir virus adicionais.

[0153] Os vetores retrovirais também podem ser introduzidos por virus de DNA, que permitem um ciclo de replicação retroviral e amplificam a eficácia de transfecção (consulte as Publicações PCT Nos. WO 95/22617, WO 95/26411, WO 96/39036 e WO 97/19182).

[0154] Vetores Lentivirais. Em outra implementação da presente invenção, os vetores lentivirais podem ser usados como agentes destinados à administração direta e expressão prolongada de um transgene em vários tipos de tecido, incluindo o tecido cerebral, retinal, muscular, hepático e sanguineo. Os vetores podem transduzir, de modo eficaz, células divisoras e não- divisoras nesses tecidos, e realizam uma expressão a longo prazo do gene de interesse. Para um revisão, consulte, Naldini, Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9:457-63; consulte, também, Zufferey, et al., J. Virol., 1998, 72:9873-80). As linhagens celulares empacotadoras lentivirais estão disponiveis e são genericamente conhecidas na técnica. Essas linhagens facilitam a produção de vetores de alta titulação destinados à terapia genética. Um exemplo consiste em uma linhagem celular empacotadora lentiviral do pseudo-tipo VSV-G induzivel por tetraciclina que pode gerar partículas virais em titulações maiores que 106 IU/mL durante pelo menos de 3 a 4 dias (Kafri, et al., J. Virol., 1999, 73: 576-584). O vetor produzido pela linhagem celular induzivel pode ser concentrado, conforme a necessidade, com a finalidade de transduzir, de modo eficaz, células não- divisoras in vitro e in vivo.

[0155] Vetores Não-Virais. Em outra implementação da presente invenção, o vetor pode ser introduzido in vivo por lipofecção, como DNA descoberto, ou através de agentes de facilitação de transfecção (peptideos, polimeros, etc.). Podem-se utilizar lipídeos catiónicos sintéticos para preparar lipossomos destinados à transfecção in vivo de um gene que codifica um marcador (Feigner, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1987, 84:7413-7417; Feigner and Ringold, Science, 1989, 337:387- 388; consulte Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85:8027-8031; Ulmer et al., Science, 1993, 259:1745-1748). Descrevem-se compostos e composições lipídicas úteis para transferência de ácidos nucléicos nas Publicações de Patente PCT Nos. WO 95/18863 e WO 96/17823, e na Patente U.S. No. 5.459.127. Os lipídeos podem ser quimicamente acoplados a outras moléculas por propósitos manipulação (consulte Mackey, et. al., supra). Os peptideos manipulados, por exemplo, hormônios ou neurotransmissores, e proteínas, tais como anticorpos, ou moléculas não- peptídicas podem ser quimicamente acoplados aos lipossomos.

[0156] Outras moléculas também são úteis para facilitar a transfecção de um ácido nucléico in vivo, tal como um oligopeptídeo catiônico (por exemplo, Publicação de Patente PCT No. WO 95/21931), peptideos derivados de proteínas aglutinantes de DNA (por exemplo, Publicação de Patente PCT No. WO 96/25508), ou um polímero catiônico (por exemplo, Publicação de Patente PCT No. WO 95/21931).

[0157] Também é possível introduzir o vetor in vivo, como um plasmideo de DNA descoberto. Os vetores de DNA descoberto por propósitos de vacina ou terapia genética podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas através de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, utilização de uma pistola de gene, ou utilização de um transportador de vetor de DNA (por exemplo, Wu et al., J. Biol. Chem., 1992, 267:963-967; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 1988, 263:14621- 14624; Pedido de Patente Canadense No. 2.012.311; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, 88:2726-2730). Podem-se utilizar, também, abordagens de administração de DNA mediadas por receptor (Curiel et al., Hum. Gene Ther. , 1992, 3:147-154; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 1987, 262:4429- 4432). As Patentes U.S. Nos. 5.580.859 e 5.589.466 descrevem a administração de sequências de DNA exógenas, isentas de agentes de facilitação de transfecção, em um mamifero. Recentemente, descreveu-se uma técnica de transferência de DNA in vivo de alta eficácia e voltagem relativamente baixa, denominada eletrotransferência (Mir et al. , C.P. Acad. Sei., 1988, 321:893; Publicações PCT Nos. WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175). Consequentemente, as modalidades adicionais da presente invenção se referem a um método de induzir uma resposta imune em um ser humano que compreenda administrar ao dito ser humano uma quantidade de uma molécula de DNA que codifica um polipeptideo 2086 da presente invenção, opcionalmente como um agente de facilitação de transfecção, sendo que o dito polipeptideo, quando expresso, retém a imunogenicidade e, quando incorporado em uma composição imunogênica e administrado em um ser humano, fornece proteção sem induzir uma doença de alta susceptibilidade mediante a subsequente infecção do ser humano com patógeno Neisseria sp., tal como N. meningitidis. Os agentes de facilitação de transfecção são conhecidos na técnica e incluem bupivicaina, e outros anestésicos locais (consulte, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.739.118) e poliaminas catiônicas (conforme publicado no Pedido de Patente Internacional WO 96/10038), cujas descrições encontram-se aqui incorporadas a titulo de referência.

[0158] A presente invenção refere-se, também, a um anticorpo, que pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal, especifico para os polipeptideos 2086 conforme descrito acima. Esses anticorpos podem ser produzidos através de métodos que sejam bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica.

SISTEMAS DE PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO BACTERIANA

[0159] A presente invenção proporciona, também, uma molécula de DNA recombinante, tal como um vetor ou plasmideo, que compreende uma sequência de controle de expressão tendo sequências promotoras e sequências iniciadoras e uma seqüência nucleotidica que codifica um polipeptídeo da presente invenção, sendo que a sequência nucleotidica está localizada na posição 3' em relação às sequências promotoras e iniciadoras. Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona um veiculo para clonagem de DNA recombinante de expressão de um polipeptídeo 2086 que compreende uma sequência de controle de expressão tendo sequências promotoras e sequências iniciadoras, e uma sequência nucleotidica que codifica um polipeptídeo 2086, sendo que a sequência nucleotidica está localizada na posição 3' em relação às sequências promotoras e iniciadoras. Em um outro aspecto, proporciona-se uma célula hospedeira que contém um veículo para clonagem de DNA recombinante e/ou uma molécula de DNA recombinante conforme descrito acima. As sequências de controle de expressão e combinações de veículo de célula hospedeira/clonagem adequadas são bem conhecidas na técnica, e encontram-se descritas a título de exemplo, em Sambrook et al. (1989).

[0160] Visto que os veículos para clonagem de DNA recombinante e/ou células hospedeiras que expressam um polipeptideo a desejada da presente invenção foram construídos transformando-se, transfectando-se ou infectando-se tais veículos de clonagem ou células hospedeiras com plasmídeos contendo o polinucleotideo 2086 correspondente, os veículos de clonagem ou células hospedeiras são cultivados sob condições de modo que os polipeptideos sejam expressos. O polipeptideo é, então, isolado substancialmente isento de componentes contaminadores de célula hospedeira através de técnicas bem conhecidas pelos indivíduos versados na técnica.

[0161] Os exemplos a seguir servem para demonstrar as modalidades preferenciais da presente invenção. Deve-se avaliar, por parte dos indivíduos versados na técnica, que as técnicas descritas nos exemplos que seguem as técnicas representadas pelos inventores funcionam bem na prática da invenção, e, portanto, podem ser consideradas como parte constituinte dos modos preferenciais destinados a sua prática. No entanto, os indivíduos versados na técnica devem, em vista da presente descrição, avaliar que muitas alterações podem ser realizadas nas modalidades específicas descritas e obtêm, ainda, um resultado parecido ou similar sem que se divirja do espírito e escopo da presente invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE UM EXTRATO DE PROTEÍNA DE MEMBRANA DE neissÉRIA CAPAZ DE eliciAR anticorpos BACTERICIDAS contra CEPAS HETERÓLOGAS:

[0162] Reportando-se à Tabela II abaixo, foram mostradas as preparações de proteína de membrana externa depletada por LOS (oligossacarídeo lipídico) eliciando anticorpos bactericidas. Geralmente, esses anticorpos são direcionados ao PorA da cepa respectiva. As preparações de membrana externa depletada por LOS pertencentes a cepa meningocócica 8529 do sorogrupo B (B:15:Pl.7b,3) são incomuns desta maneira porque elas eliciam, de forma inesperada, os anticorpos bactericidas contra várias cepas heterólogas. TABELA II ATIVIDADE BC DE ANTI-SOMPS CONTRA DIFERENTES CEPAS DE N.MENINGITIDIS

[0163] Com a finalidade de facilitar o isolamento e caracterização do(s) antigeno(s) responsável(is) pela eliciaçâo dos anticorpos bactericidas heterólogos, buscou-se identificar qual detergente extraiu otimamente o(s) antígeno(s)

CEPAS E CONDIÇÕES DE CULTURA.

[0164] A cepa de N. meningitidis 8529 proveniente de um frasco congelado foi colocado sobre uma placa GC. (A cepa meningocócica 8529 foi obtida junto à RIVM, Bilthoven, The Netherlands) . A placa foi incubada a 36C/5%CÜ2 durante 7,5 horas. Utilizaram-se várias colônias para inocular um frasco contendo 50 mL de meio de Frantz modificado + suplemento GC. O frasco foi incubado em um agitador de ar a 36°C e agitado em 200 RPM durante 4,5 horas. Utilizaram-se 5 mL para inocular um frasco de Fernbach contendo 450 mL de meio de Frantz modificado + suplemento GC. O frasco foi incubado em um agitador de ar a 36°C e agitado em 100 RPM durante 11 horas. Utilizaram-se todos os 450 mL para inocular 8,5 L de meio de Frantz modificado + suplemento GC em um fermentador de 10 L. Composição do Meio de Frantz Modificado:

[0165] Controlaram-se os seguintes parâmetros durante a fermentação: Temperatura = 36°C; pH = 7,4; Oxigênio Dissolvido = 20%. Adicionaram-se várias gotas de anti-espumante P-2000 com a finalidade de controlar a formação de espuma. A cultura foi desenvolvida até uma fase estacionária. As células foram colhidas por centrifugação em OD650 = 5,25. Dm total de 100 a 300 gramas de pasta de célula úmida é, tipicamente, colhido a partir de ~8,5L de cultura.

[0166] Purificação parcial das frações de proteina de membrana externa contra os meningococos que eliciam os anticorpos bactericidas heterólogos:

[0167] Suspenderam-se 100 gms peso úmido de células, até um volume cinco vezes o peso úmido, com lOmM HEPES-NaOH, pH 7,4, ImM Na2EDTA e lisados através da passagem por um microfluidizador 110Y equipado com uma câmara a ~18.000 psi. O lisado celular foi clarificado e o envelope celular isolado por centrifugação em 300.000 x g durante 1 hora a 10°C. Os envelopes celulares foram lavados 2X com a mesma solução tampão através da suspensão com um homogenizador seguida pela centrifugação conforme descrito acima. Os envelopes celulares foram, então, extraídos com 320mL de 1% (p/v) Triton X-100 em lOmM HEPES-NaOH, pH 7,4, ImM MgCla- Reportando-se à Tabela III abaixo, os resultados das extrações detergentes diferenciais sequenciais que utilizaram Triton X-100 e Zwittergent 3-14 seguidos pela imunização do camundongo, permitiu-se que fosse determinado que os extratos de Triton extraíssem otimamente o(s) candidato(s) de interesse. Este extrato de Triton X-100, que elicia a resposta do anticorpo bactericida contra quatro entre cinco cepas listadas na Tabela III, foi, então, fracionado através de focalização isoelétrica preparativa (IEF) em uma unidade BioRad Rotophor. As concentrações anfólitas eram iguais a 1% pH 3-10 misturadas com 1% pH 4-6. Conforme mostrado na Tabela III, descobriu- se que várias frações eliciam uma resposta bactericida heteróloga. As frações obtidas a partir de IEF, que foram focalizadas na faixa de pH de 5,5 a 7,8, eliciaram uma resposta heteróloga a maioria das cepas conforme determinado pelo ensaio bactericida. As frações IEF acumuladas foram concentradas e os anfólitos removidos por precipitação de etanol. Obteve-se uma purificação adicional absorvendo-se algumas proteínas obtidas na faixa de pH de cerca de 5,5 a 7,8 em uma coluna de troca de ânions e comparando-se a atividade bactericida obtida após a imunização do camundongo com as proteínas absorvidas e não- absorvidas. Reportando-se novamente à Tabela II, embora muitas proteínas tenham sido absorvidas à resina de troca de ânions, as proteínas que não foram absorvidas pela coluna eliciaram mais anticorpos bactericidas heterólogos. TABELA III

NT: não testado *0 isolado clínico 539 é uma cepa homóloga a 8529, isolada a partir da mesma epidemia

[0168] Conforme mostrado na Figura IA, duas proteínas principais estiveram presentes na fração não- absorvida conforme determinado por SDS-PAGE. Com a finalidade de identificar essas proteínas, realizaram-se dois tipos de análise. Uma análise era analisar a degradação proteolítica limitada (consulte a Figura FIG. IA e a Figura IB) seguida pelo isolamento de peptideos e sequenciamento protéico direto. A outra análise era realizar SDS-PAGE seguido por excisão de gel, digestão proteolitica, e LC-MS/MS (Cromatografia Liquida Acoplada à Espectrometria de Massas), (consulte a Figura 3) com a finalidade de obter as informações espectrais de massa nos componentes das preparações de interesse. (Consulte os métodos de mapeamento e sequenciamento peptidico descritos posteriormente nesta seção).

[0169] Analisou-se a seqüência genômica N. meningitidis A Sanger utilizando-se os métodos e algoritmos descritos em Zagursky and Russell, 2001, BioTechniques, 31:636-659. Esta análise exploratória produziu mais de 12.000 Quadros de Leitura Aberta (ORFs) possiveis. Tanto os dados sequenciais diretos como os dados espectrais de massa descritos acima indicaram que os principais componentes da fração não-absorvida eram produtos de vários ORFs presentes em uma análise do banco de dados de Sanger. As três proteinas predominantes identificadas através desta metodologia correspondem aos ORFs 4431, 5163 e 2086, (consulte as Figuras 1B e 3).

[0170] Muito embora o ORF 4431 tenha sido a proteina mais predominante identificada nas frações, os anticorpos de ratos ao 4431 recombinante lipidado não são bactericidas e não oferecem uma resposta protetora em um modelo animal. A análise adicional do ORF 5163 encontra-se em progresso.

[0171] O segundo componente mais predominante das preparações descritas no presente documento corresponde ao produto de ORF 2086.

[0172] Métodos de Imunogenicidade:

[0173] Preparação de Anti-Soro:

[0174] Exceto onde notado, as composições/vacinas de proteinas foram formuladas com 25pig da proteina total e foram adjuvantadas com 20/.ig QS-21. Administrou-se uma dose de 0,2mL através de injeção subcutânea (rump) em um camundongo fêmea Swiss-Webster com de 6 a 8 semanas de idade na semana 0 e 4. Colheram-se amostras de sangue na semana 0 e 4, e realizou-se uma retirada final de sangue na semana 6.

[0175] Ensaio Bactericida:

[0176] Os ensaios bactericidas foram realizados essencialmente conforme descrito (Consulte Mountzouros and Howell, 2000, J. Clin. Microbiol. 38 (8):2878-2884). As titulações bactericidas dependentes de anticorpos mediadas por complemento para o SBA foram expressas como o inverso da maior diluição do soro de teste que exterminou > 50% das células alvo introduzidas nos ensaios (titulação BC50) -

[0177] Métodos utilizados para identificar a proteina 2086:

[0178] Clivagem de Brometo de Cianogênio e Sequenciamento Direto de Fragmentos:

[0179] Clivagem de Brometo de Cianogênio da Fração Não-Absorvida por Troca de Ânions (AEUF). A AEUF foi precipitada com etanol gelado a 90% e solubilizada com lOmg/mL de brometo de cianogênio em ácido fórmico a 70% em uma concentração de proteina de Img/mL. A reação foi realizada de um dia pra o outro em temperatura ambiente no escuro. Os produtos clivados foram secos através de vácuo de alta velocidade, e o pélete foi solubilizado com TX-100 HE/0,1% reduzido. 0 SDS-PAGE seguido pelo sequenciamento de aminoácido N-terminal foi utilizado para identificar os componentes desta fração.

[0180] Digestão por Protease /fase reversa/seqüenciamento de aminoácidos N-terminais para identificar os componentes:

[0181] A AEUF foi digerida por GluC (V8), LysC ou ArgC. A razão entre proteína e enzima foi de 30|_ig de proteína e Ipig de enzima. A digestão foi realizada a 37°C de um dia para o outro. A mistura de proteína digerida (30 g.g) passou por uma coluna Aquapore RF-300 de sete microns e eluída com um gradiente de 10-95% de acetonitrila em ácido trifluoroacético a 0,1%, e os picos foram coletados manualmente. Realizou-se, também, uma amostragem padrão isenta de proteínas, e os picos desta foram subtraídos do cromatograma amostrai. Os picos que ocorrem apenas na amostra foram analisados em um espectrômetro de massa, e essas amostras que fornecem uma massa clara foram analisadas por sequenciamento de aminoácidos N-terminal.

[0182] Sequenciamento de aminoácido N- terminal:

[0183] Para bandas cortadas de um blot, a amostra de proteína foi transferida de um gel SDS para uma membrana de PVDF, colorida com Negro de Amida (10% de ácido acético, 0,1% de negro de amida em água deionizada) e descolorida em 10% de ácido acético. A banda protéica desejada foi então cortada de todas as dez vias utilizando- se um bisturi limpo com metanol ou faca mini-Exacto e colocada no cartucho de reação do Sequenciador de Proteína Applied Biosystems 477A. Para sequenciamento direto de amostras em solução, o cartucho Prosorb foi montado e o PVDF umedecido com 60 p.L de metanol. O PVDF foi lavado com 50 gL de água deionizada e a amostra (50 piL) foi carregada com PVDF. Após 50 p.L de água deionizada serem usados para lavar a amostra, o PVDF Prosorb foi perfurado, seco e colocado no cartucho de reação do Sequenciador de Proteína Applied Biosystems 477A. Para ambos os métodos, o Sequenciador N-terminal Applied Biosystems foi então executado sob condições de blot ótimas durante 12 ou mais ciclos (1 ciclo Blank, 1 ciclo Standard e 10 ou mais ciclos para identificação de resíduo desejada) e a detecção de aminoácido-PTH foi realizada no Analisador de PTH Applied Biosystems 120A. Os ciclos foram coletados tanto em um registrador de sinais analógicos como digitalmente através do software de instrumento. A atribuição do aminoácido foi realizada utilizando os dados analógicos e digitais por comparação de um conjunto padrão de aminoácidos-PTH e seus respectivos tempos de retenção sobre o analisador (os resíduos de cisteína foram destruídos durante a conversão e não foram detectados). Múltiplas informações de sequência podem ser obtidas a partir de um único resíduo e atribuições primárias versus secundárias foram realizadas com base na intensidade de sinal. LC-MS/MS

[0184] As amostras de proteína purificadas por IEF foram adicionalmente analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS. As proteínas foram visualizadas por coloração com azul de Coomassie, e as bandas de interesse foram cortadas manualmente, então reduzidas, alquiladas e digeridas com tripsina (Promega, Madison, WI) in situ utilizando um robô de digestão triptica em gel automático (1). Após a digestão, os extratos peptidicos foram concentrados a um volume final de 10-20 gL utilizando um Savant Speed Vac Concentrator (ThermoQuest, Holdbrook, NY).

[0185] Os extratos peptidicos foram analisados em uma HPLC em fase reversa com microeletronebulização automática. Em suma, a interface da microeletronebulização de uma agulha tipo spray de silica fundida com Picofrit, 50 cm de comprimento por 75 um ID, diâmetro de orificio de 8um (New Objective, Cambridge MA) embalado com 10 um de microesferas em fase reversa C18 (YMC, Wilmington, NC) a um comprimento de 10 cm. A agulha Picofrit foi montada em um suporte de fibra óptica (Melies Griot, Irvine, CA) mantida em uma base feita em casa posicionada na frente do detector de espectrômetro de massa. A parte posterior da coluna foi medida através de uma liga de titânio para fornecer uma conexão elétrica à interface e electrospray. A liga foi conectada com um comprimento de tubagem de capilar de silica fundida (ESC) a um amostrador automático FAMOS (LC- Packings, San Francisco, CA) que foi conectado a uma bomba solvente HPLC (ABI 140C, Perkin-Elmer, Norwalk, CT). A bomba solvente HPLC distribuiu um fluxo de 50 gL /min que foi reduzido para 250 nL/min utilizando um "tê" de divisão PEEK microtight (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) , e então distribuiu ao amostrador automático utilizando uma linha de transferência FSC. A bomba LC e amostrador automático foram controlados utilizando seus programas de usuário internos. As amostras foram inseridas em frascos de amostrador automático de plástico, vedadas e injetadas utilizando uma alça de amostragem de 5p.L.

[0186] Espectrometria de massas HPLC Microcapilar:

[0187] Os peptideos extraídos de digestões em gel foram separados pelo sistema HPLC com microeletronebulizaçâo utilizando um gradiente de 50 minutos de 0-50% de solvente B (A: 0,lM HOAc, B: 90% MeCN/0,lM HOAc). As análises peptídicas foram realizadas em um espectrômetro de massas de captura de ions Finnigan LCQ (ThermoQuest, San Jose, CA) que opera em uma voltagem de spray de 1,5 kV, e utilizando uma temperatura capilar aquecida de 150 °C. Os dados foram obtidos em modo automático MS/MS utilizando o software de aquisição de dados com o instrumento. O método de aquisição inclui triagem 1 MS (375-1200 m/z) seguido por triagens MS/MS dos 3 principais ions mais abundantes na triagem MS. As funções de exclusão dinâmica e exclusão de isótopo foram empregadas para aumentar o número de ions peptídicos que foram analisados (configurações: 3 amu = extensão de exclusão, 3 min = duração de exclusão, 30 segs - duração de pré- exclusão, 3 amu = largura de exclusão de isótopo) . A análise automática de MS/MS foi realizada utilizando o algoritmo de computador SEQUEST incorporado no pacote de análise de dados Finnigan Bioworks (ThermoQuest, San Jose, CA) que utiliza o banco de dados de proteínas derivadas do genoma completo de N. meningitidis (junto a Sanger). Os resultados do estudo são ilustrados na Figura 3.

EXEMPLO 2 CLONAGEM DE P2086 (RLP2086) LIPIDADA RECOMBINANTE:

[0188]A.) Sequência Líder Nativa:

[0189] Materiais de fonte:

[0190] O gene ORF de 2086 foi amplificado por PCR a partir de um isolado clinico de uma cepa Neisseria meningitidis do sorogrupo B designada 8529. O sorogrupo, sorotipo e soro-subtipo dessa cepa são mostrados entre parênteses; 8529 (B:15, Pl:7b,3). Essa cepa meningocócica foi recebida junto à The RIVM, Bilthoven, The Netherlands.

[0191] Amplificação por PCR e Estratégia de Clonagem:

[0192] Uma inspeção visual de ORF de 2086 indicou que esse gene possui uma sequência de sinal de lipoproteina potencial. Uma análise adicional utilizando um algoritmo de Lipoproteina proprietário Modelo Oculto de Markov confirmou que ORF de 2086 contém uma sequência de sinal de lipoproteina. Para expressar P2086 de maneira recombinante em uma conformação do tipo mais nativo, iniciadores de oligonucleotídeo foram designados para amplificar o gene de comprimento total com a sequência de sinal de lipoproteina intacta e se baseiam em uma análise da sequência Sanger de N. meningitidis A ORF 2086. O gene de 2086 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) [ABI 2400 thermal cycler, Applied Biosystems, Foster City, CA] da cepa 8529 N. meningitidis. O produto amplificado no tamanho correto foi ligado e clonado em pCR2.1-TOPO (Invitrogen). O DNA de plasmideo foi digerido por restrição com Ndel e BamHI, purificado em gel e ligado ao vetor pET-27b(+) (Novagen).

[0193] Os iniciadores de oligonucleotídeo descritos aqui, foram sintetizados em um sintetizador de oligonucleotídeo PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, Foster City CA, utilizando química de β- Cianoetilfosforamidita, Applied Biosystems, Foster City CA.

[0194] Expressão de lipoproteina rLP2086 utilizando uma sequência líder nativa:

[0195] Com referência agora à Figura 5, o plasmideo pPX7340 foi transformado/transfectado ou infectado em células hospedeiras BLR(DE3) pLysS (Life Sciences). Um transformante foi selecionado e inoculado em 50 mL de Terrific Broth contendo 2% de glicose, canamicina (30|ig/mL) , cloranfenicol (30|ig/mL) e tetraciclina (12pg/mL). O OD600 da cultura noturna era 6,0. A cultura noturna foi diluída em 1 litro de Terrific Broth com 1% de glicerol e os mesmos antibióticos. 0 CD600 de partida era 0,4. Após 2 horas o OD600 era 1,6 e uma amostra pré- induzida foi obtida. As células equivalentes a um OD600=1 foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido. O pélete celular total foi ressuspenso em 150p.L de tampão Tris-EDTA e 150jiL de tampão de amostra 2x SDS-PAGE. IPTG foi adicionado a uma concentração final de ImM. Após 3,5 horas uma amostra pós-induzida foi obtida como descrito e analisado em SDS-PAGE (Veja Figura 4).

[0196] Purificação de rLP2086:

[0197] A rLP2086 foi solubilizada a partir de E. coli após a extração de detergente diferencial. Ao contrário de P2086 em seu ambiente nativo, a rLP2086 não foi significativamente solubilizada por Triton X-100 ou Zwittergent 3-12. O volume de rLP2086 foi solubilizado com sarcosil, indicando que esse interage com os componentes externos da membrana de E. coli de maneira diferente que esse faz em N. meningitidis. Uma vez solubilizada a rLP2086 foi purificada de maneira similar à proteina nativa pelo fato de muitas proteinas de E. coli contaminantes poderem ser removidas por adsorção em uma resina de troca aniônica em pH 8. Apesar de serem maiores que metade de uma unidade de pH acima de seu pi teórico, a rLP2086 permaneceu não- adsorvido em pH 8. A purificação adicional foi realizada por adsorção de rLP2086 em uma resina de troca catiônica em pH 4,5.

[0198] A homogeneidade de rLP2086 é mostrada na Figura 2 após SDS-PAGE. A massa de rLP2086 foi determinada por análise espectral de massas MALDI-TOF como 27.836. Essa massa se difere da massa teórica de 27.100 por 736, que aproxima a massa da modificação lipidica N- terminal comum a lipoproteinas bacterianas. Tanto a nativa como a rLP2086 parecem ser as lipoproteinas externas de membrana. Tentativas com o sequenciamento N-terminal foram bloqueadas e isso é compatível com a modificação terminal.

[0199] Métodos de Purificação:

[0200] Os péletes congelados de células BLR DE3 pLysS que expressam P2086 foram ressuspensos em lOmM de HEPES-NaOH/lmM de EDTA/l|ig/mL de inibidor da protease Pefabloc SC (Roche) pH 7,4 (HEP) em 20mL/g de peso celular úmido e lisados por microfluidizador (Microfluidics Corporation Model 110Y). O lisado celular foi centrifugado em 150.000 x g durante uma hora. O pélete foi lavado duas vezes com HEP e centrifugado duas vezes e o pélete de membrana resultante foi congelado durante a noite. O pélete foi solubilizado com lOmM de HEPES-NaOH/lmM de MgCl2/l%TX- 100 pH 7,4 durante 30 minutos seguido por centrifugação em 150.000 x g durante 30 minutos. Isso foi repetido três vezes. 0 pélete de membrana foi lavado como acima duas vezes com 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de Zwittergent 3- 12 pH 8, seguido por duas lavagens de 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de Zwittergent 3-14 pH 8 e 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de Zwittergent 3-14/ 0,5M de NaCl pH 8.

[0201] A rLP2086 foi então solubilizada com 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de sarcosil pH 8. Esse extrato de sarcosil foi ajustado para 1% de Zwittergent 3- 14 (Z3-14) e dialisado duas vezes contra um excesso de 30 vezes de 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de Z3-14. O extrato de rLP2086 dialisado foi precipitado com 90% de etanol para remover o sarcosil restante, e solubilizado com 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de Z3-14 pH 8 (TEZ) . O material insolúvel foi removido por centrifugação, o sobrenadante passou por uma coluna de cromatografia de troca aniônica, e a rLP2086 foi coletada na fração livre. O material livre foi então dialisado duas vezes contra um excesso de 30 vezes de 25mM de NaAc/1% de Z3-14 pH 4,5, e passou por uma coluna de cromatografia de troca catiônica. A rLP2086 foi eluida com um gradiente de 0-0,3M de NaCl e analisada por SDS-PAGE (coloração com Coomassie). O grupo de rLP2086 foi determinado para ser 84% puro por densitometria a laser.

[0202] Reatividade de Superfície e Atividade Bactericida de Anti-soro para Subfamilia B de rLP2086.

[0203] Com referência à Tabela VII, o anti- soro para rLP2086 purificada da cepa 8529 da Subfamilia B, demonstrou a reatividade de superfície para todas as dez cepas de 2086 da Subfamilia B testadas por ELISA de células integrais. A atividade bactericida foi detectada contra nove de dez cepas 2086 da Subfamília B que expressam os antigenos do soro-subtipo heterólogo, PorAs. Essas cepas são representativas de cepas que causam doenças meningocócicas do sorogrupo B por toda a Europa Ocidental, as Américas, Austrália e Nova Zelândia. A única cepa que não foi exterminada no ensaio bactericida, 870227, reagiu fortemente com o soro anti-rLP2086 (Subfamília B) por ELISA de células integrais, indicando que essa cepa expressa uma proteína com epítopos em comum à P2086.

[0204] As cepas 2086 da Subfamília A listadas na Tabela VII, também foram testadas para reatividade de superfície por ELISA de células integrais. Parece que duas dentre três dessas cepas possuem um nível muito baixo de reatividade, indicando que algumas cepas 2086 da Subfamília A podem não apresentar reatividade cruzada com anticorpos elevados para Subfamília B de rLP2086. 0 procedimento de amplificação por PCR usado para identificar o gene de 2086 da Subfamília B da cepa 8529 também foi realizado em cepas 870446, NMB e 6557. Nenhum produto amplificado por PCR de 2086 da Subfamília B foi detectado.

[0205] Métodos de Imunogenicidade:

[0206] Preparação de anti-soro:

[0207] As vacinas foram formuladas como anteriormente descrito no Exemplo 1. Entretanto, uma dose de 10 p.g foi usada.

[0208] Ensaio imunossorvente ligado à enzima de células integrais (ELISA):

[0209] As suspensões de células integrais de N. meningitidis foram diluídas a uma densidade óptica de 0,1 em 620nm em 0,01M de fosfato estéril, 0,137M de NaCl, 0,002M de KC1 (PBS). A partir dessa suspensão, 0,1mL foi adicionado a cada poço de placas de 96 poços Nunc Bac T (Cat# 2-69620). As células foram secas sobre as placas em temperatura ambiente durante três dias, então foram revestidas, invertidas e armazenadas a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (0,01M de Tris- HC1, 0,139M de NaCl/KCl, 0,1% de dodecilpoli(oxietilerenoglicoléter)n n=23 (Brij-35®, disponível junto à ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware), pH 7,0-7,4). As diluições de anti-soro foram preparadas em PBS, 0,05% de Tween-20/Azida e 0,lmL foi transferido para as placas revestidas. As placas foram incubadas durante duas horas a 37°C. As placas foram lavadas três vezes em tampão de lavagem. IgG AP de cabra anti-camundongo (Southern Biotech) foi diluido em 1:1500 em PBS/0,05% de Tween-20, 0,lmL foi adicionado a cada poço, e as placas foram incubadas a 37°C durante duas horas. As placas foram lavadas (como acima). A solução de substrato foi preparada ao diluir p-nitrofenil fosfato (Sigma) em 1M de dietanolamina/0,5mM de MgCl2 a lmg/mL. 0 substrato foi adicionado à placa em 0,lmL por poço e incubado em temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi interrompida com 50p.L /poço de 3N de NaOH e as placas foram lidas em 405nm com 690nm de referência.

[0210] B.) Sequência lider P4:

[0211] Amplificação por PCR e Estratégia de Clonagem:

[0212] Para otimizar a expressão de rLP2086, o gene 2086 foi clonado atrás da sequência de sinal P4 não- tipável de Haemophilus influenzae (Green et al., 1991). Os iniciadores utilizados para clonagem de lipoproteina são listados na Tabela IV e são identificados por números de composto: 5658, 5660, 6473, 6543 e 6385. A ORF de 2086 foi amplificada a partir da cepa 8529 B N. meningitidis utilizando iniciadores com os seguintes números de composto 5658 e 5660. A ORF 2086 foi amplificada a partir da cepa CDC1573 N. meningitidis do sorogrupo B utilizando iniciadores com os seguintes números de composto 6385 e 5660. A ORF 2086 foi amplificada a partir da cepa 2996 N. meningitidis do sorogrupo B utilizando iniciadores com os seguintes números de composto 6473 e 6543. Os iniciadores N-terminal (5' ) foram designados para serem homólogos à região madura do gene 2086 (começando no residuo de serina na posição de aminoácido 3 logo a jusante da cisteina). O sitio de restrição BamHI (GGATTC) foi incorporado na extremidade 5' de cada iniciador N-terminal e resultou na inserção de um resíduo de glicina na proteína madura na posição 2 de aminoácido. Os iniciadores C-terminal (3') foram designados para serem homólogos à extremidade C- terminal do gene 2086 e incluíram o códon Stop bem como um sítio Sphl para propósitos de clonagem. O fragmento amplificado de cada cepa B N. meningitidis foi clonado em um vetor intermediário e analisado por análise de sequência.

[0213] O DNA de plasmídeo de clones corretos foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Sphl (New England Biolabs, (NEB) ) . Um vetor designado pLP339 (fornecido pelo cessionário dos requerentes) foi selecionado como o vetor de expressão. Esse vetor utiliza a cadeia principal pBAD18-Cm (Beckwith et al., 1995) e contém a sequência de sinal de lipoproteina P4 e gene P4 de Haemophilus influenzae não-tipável (Green et al., 1991). 0 vetor pLP339 foi parcialmente digerido com a enzima de restrição BamHI e então submetido à digestão de Sphl. Os fragmentos 2086 amplificados (BamHI/Sphl) foram ligados separadamente no vetor pLP339 (BamHI/Sphl parcial) . Essa estratégia de clonagem coloca o gene 2086 maduro atrás da sequência de sinal de lipoproteina P4. O sitio BamHI permanece na junção de clonagem entre a sequência de sinal P4 e o gene 2086 (veja a construção de plasmideo mostrada na Figura 7). Um exemplo da sequência na junção de clonagem de BamHI é mostrado a seguir:

[0214] [Sequência de sinal P4]— TGT GGA TCC - [sequência de ácido nucléico 2086 madura restante]

[0215] [Sequência de sinal P4]- Cys Gly Ser - [sequência de aminoácido 2086 madura restante]

[0216] Com referência á Figura 7, cada fragmento amplificado foi clonado em um Vetor pBAD18-Cm modificado contendo a sequência lider P4. A fermentação foi realizada em BLR pPX7343 E. coli recombinante que expressa rP4LP2086 (2086 recombinante lipidado P4) para tentar aumentar a densidade celular adicionando glicose adicional. O fermentador foi carregado com 10L de meio M9 Minimal completo, de acordo com Sambrook, suplementado com 1% de glicose.

[0217] A concentração inicial de glicose no fermentador é 45g/L. O fermentador foi inoculado em OD inicial de ~0,25. Em ~OD 25, 20g/L de glicose adicional foram adicionados. A cultura foi induzida com 1% de arabinose em depleção de glicose em OD 63,4. A fermentação continuou até 3 horas após a indução. As amostras foram guardadas em t=0, 1, 2, 3 após a indução e a proteina quantificada utilizando BSA. Em t = 3, a produção de proteina é -0,35 g/L, e 7% da proteina celular total. Um total de 895 gramas de pasta celular úmida foi colhido de -10 L de cultura.

[0218] A purificação de rP4LP2086 foi realizada utilizando os mesmos métodos descritos acima no Exemplo 2, seção A.

[0219] Os iniciadores de oligonucleotideo descritos aqui, foram sintetizados em um sintetizador de oligonucleotideo PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, Foster City CA, utilizando quimica de β- Cianoetilfosforamidita, Applied Biosystems, Foster City CA. Os iniciadores usados para amplificação por PCR das famílias do gene 2086 ORF são listados na Tabela IV, que mostra exemplos não-limitadores de iniciadores da presente invenção. TABELA IV INICIADORES Composto N2 Iniciador SÍTIOS DE RESTRIÇÃO

EXEMPLO 3 GENÉTICA DE DeSENVOLVIMENTO PARA PROTEÍNA 2086 MADURA

[0220] não-lipidaDA:

[0221] Para avaliar adicionalmente a imunogenicidade da proteína 2086, foram realizadas uma clonagem e expressão da forma não-lipidada de P2086.

[0222] Amplificação por PCR de gene da ORF 2086:

[0223] O gene de 2086 de várias cepas pode ser amplificado com os iniciadores, como descrito em PCT/US02/32369 (publicado como WO 03/063766 em 7 de agosto de 2003) e PCT/US04/11901 (2086 WO 04/094596 em 4 de novembro de 2004) que estão aqui incorporados a título de referência.

[0224] As características desses iniciadores incluem, um sítio de restrição BglII sintético em cada iniciador, um sítio de restrição Ndel sintético nos números de composto 6406 e 6474 e códons de terminação em todas as três estruturas de leitura estão presentes nos números de composto 5135 e 6605. Os números de iniciador 6406 e 6474 amplificam o gene 2086 com um ATG (Met) fundido com o segundo códon amino terminal (ACG) representando uma única substituição de aminoácido (substitui TGC Cys) do polipeptideo 2086 maduro.

[0225] O vetor de clonagem por PCR é TOPO- PCR2.1, Invitrogen, Valencia, CA.

[0226] O vetor usado para expressar a proteina 2086 não-lipidado é pET9a de Novagen, Madison, WI.

[0227] A cepa de clonagem E.coli é ToplO, Invitrogen, Carlsbad, CA.

[0228] A cepa de expressão E. coli é BLR(DE3)pLysS, Novagen, Madison, WI.

[0229] O meio de cultura para propósitos de clonagem é liquido Terrific Broth ou agar, de acordo com Sambrook et al., com 1% de glicose estéril substituido por glicerol, e o antibiótico adequado (ampicilina ou canamicina).

[0230] A purificação de plasmideo ocorre com Qiagen Spin Miniprep Kit (Valencia, CA).

[0231] Preparação da cepa de produção ou linhagem celular para expressão de 2086 não-lipidada:

[0232] O gene de 2086 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) [AmpliTaq and ABI 2400 thermal cycler, Applied Biosystems, Foster City, CA] a partir de DNA cromossômico derivado da cepa 8529 meningocócica. A amplificação por PCR do gene de 2086 utilizou dois iniciadores de oligonucleotideo em cada reação identificados por números de composto 6474 e 5135. O produto de PCR de 2086 amplificado foi clonado no vetor de clonagem TOPO-PCR2.1 e selecionado em agar Terrific Broth suplementado com 100 |.ig/ml de ampicilina e 20 pg/ml de X- Gal. Colônias brancas foram selecionadas e desenvolvidas. 0 DNA plasmidico foi preparado utilizando um kit Qiagen miniprep e os plasmídeos foram examinados para a inserção do fragmento de PCR. Os plasmídeos de inserção de PCR foram submetidos ao sequenciamento de DNA (Big Dye chemistry em um sequenciador ABI377, Applied Biosystems, Foster City, CA) .

[0233] Os plasmídeos que apresentam a sequência de DNA correta foram digeridos com a enzima de restrição BglII e o fragmento de BglII foi purificado em gel utilizando um kit de purificação GeneClean II (BiolOl, Carlsbad, CA). O fragmento de BglII purificado foi clonado no sítio BamHI do vetor de expressão pET9a. Os clones pET9a/2086 foram selecionados em placas de meio Terrific Broth suplementado com 30 pg/ml de canamicina. Os clones resistentes à canamicina se desenvolveram e o DNA plasmidico DNA miniprep foi preparado. Os plasmídeos foram examinados para a orientação adequada do gene 2086 no sítio BamHI. Os plasmídeos corretamente orientados representam uma fusão do T7-antígeno com a terminação amino do gene 2086 (rP2086T7). Essas fusões de gene rP2086T7 foram transformadas em BLR(DE3)pLysS, selecionadas em placas de Terrific Broth/Kan, se desenvolveram em Terrific Broth e induzidas a expressar a proteína de fusão rP2086T7 com 1 mM de IPTG (isopropil β-D-tiogalactopiranosideo). A proteína de fusão rP2086T7 foi expressa em altos níveis.

[0234] Esses plasmídeos de fusão foram então submetidos a uma digestão de restrição de Ndel, que deleta o T7-antígeno e liga o gene de 2086 maduro diretamente ao ATG inicial proporcionado pelo vetor. Esses plasmídeos deletados Ndel foram transformados em células ToplO e selecionados em placas de Terrific Broth/Kan. Os clones candidatos foram desenvolvidos e o DNA plasmidico miniprep foi preparado. O DNA plasmidico foi submetido ao sequenciamento de DNA para confirmar a deleção e a integridade da sequência de gene 2086. Esses plasmideos são representados pelo mapa de plasmideo designado pPX7328 (Figura 6) . Os plasmideos que representam a sequência de DNA correta foram transformados ern BLR(DE3)pLysS, selecionados em placas de Terrific Broth/Kan, desenvolvidos em Terrific Broth e induzidos a expressar a proteina 2086 com IPTG. O vetor pET9a não conseguiu expressar a proteina 2086 madura, na cepa BLR(DE3)pLysS, quando o T7-Tag for removido.

[0235] Produção de proteina 2086 não-lipidada:

[0236] O DNA plasmidico purificado foi usado para transformar a cepa de expressão de BLR(DE3)pLysS. As células BLR(DE3)pLysS que transportam os plasmideos são resistentes à canamicina e podem ser induzidas a expressar altos niveis de proteina PorA através da adição de 1 mM de IPTG. A proteina de fusão rP2086T7 pode ser expressa como corpúsculos de inclusão insolúveis na linhagem celular E.coli BLR(DE3)pLysS em -40% de proteina total. Essa proteina de fusão purificada foi usada para imunizar os camundongos e niveis significativos gerados de anticorpos bactericida contra uma cepa meningocócica heteróloga. (Veja a Tabela V)

[0237] Mutagênese genética de 2086 não- lipidada :

[0238] A mutagênese de iniciador PCR foi realizada sobre a extremidade 5' do gene de 2086. Os estudos de expressão estão avançando para determinar se o T7-Tag pode ser removido enquanto exibe os altos niveis de expressão de rP2086T7 madura.

[0239] Purificação de rP2086T7 não-lipidada:

[0240] As células de E. coli BLR(DE3)pLysS que expressam rP2086T7 não-lipidada foram lisadas por microfluidizador em lOmM de Hepes-NaOH/5mM de EDTA/lmM de Pefabloc SC pH 7,4. O lisado celular foi então centrifugado em 18.000xg durante 30 minutos. O pélete de corpúsculo de inclusão foi lavado três vezes com 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de TritonX-100 pH 8 seguido por centrifugação a cada momento em 24.000xg durante 30 min. O pélete de corpúsculo de inclusão foi então lavado duas vezes com 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/1% de Zwittergent 3-14 pH 8 seguido por centrifugação a cada momento em 24.000xg durante 15min. O pélete de corpúsculo de inclusão foi então solubilizado com 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/4M de Uréia pH 8 durante duas horas seguido por centrifugação para remover o material insolúvel. O sobrenadante (rP2086T7 solubilizada) foi dividido em quatro amostras iguais. Uma amostra foi ajustada para 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/250mM de NaCl/2M de Uréia pH8 (sem detergente) , uma foi ajustada para 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/250mM de NaCl/2M de Uréia/1% de Triton hidrogenado X-100 pH8 (TX-100), uma foi ajustada para 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/250mM de NaCl/2M de Uréia/1% de Zwittergent 3-12 pH8 (Z3-12), e uma foi ajustada para 50mM de Tris-HCl/5mM de EDTA/250mM de NaCl/2M de Uréia/1% de Zwittergent 3-14 pH8 (Z3-14) utilizando soluções de estoque. Para remover a uréia, as amostras foram dialisadas para finalização contra o respectivo tampão sem uréia. As amostras foram então dialisadas para finalização contra o respectivo tampão sem uréia e 60mM de NaCl para reduzir a concentração de NaCl. 0 material insolúvel foi removido por centrifugação em 2.000xg durante 15 minutos, e o sobrenadante resultante (rP2086T7 renovelada) foi usado para experimentos adicionais. A homogeneidade de rP2086T7 foi identificada como 91-95%, como determinado utilizando SDS-PAGE colorido com Coomassie e densitometria a laser.

[0241] Procedimento de Imunogenicidade - Como descrito no Exemplo 2

[0242] Essa proteina de fusão purificada foi usada para imunizar os camundongos e niveis significativos gerados de anticorpos bactericidas contra uma cepa meningocócica heteróloga. (Veja Tabela V abaixo): TABELA V TITULAÇÕES BACTERICIDAS DE ANTICORPO DE CAMUNDONGO ELEVADOS PARA RP2086T7

(* soros de controle positivo gerados por imunização de camundongos com rLP2086)

EXEMPLO 4 DESENVOLVIMENTO DE CLONES QUIMÉRICOS DE

[0243] A regiao N-terminal do gene 2086 da cepa CDC-1573 contém um segmento repetido não presente no gene de 2086 das cepas 8529 e 2996 (veja Figura 8). Parece que esse segmento repetido é responsável por niveis aumentados de expressão proteína recombinante 2086 de dois sistemas de expressão baseados em E.coli (pET e pBAD). O nível de expressão de proteína recombinante do gene CDC- 1573 2086 foi significativamente melhor nos sistemas de expressão pET e pBAD como comparado com os niveis de expressão recombinante do gene 2086 com cepas 8529 e 2996 utilizando os mesmos sistemas. A região N-terminal do gene 2086 de todas as três cepas é relativamente homóloga, exceto nesse segmento repetido. Portanto, é lógico assumir que a fusão de CDC-1573 N-terminação com os genes 2086 das cepas 8529 e 2996, que os níveis de proteína recombinante 2086 expressos a partir desses genes irão aumentar quando utiliza-se os sistemas pET e pBAD.

[0244] Materiais e Métodos:

[0245] O DNA cromossômico das cepas 8529 e 2996 foi purificado e usado como um modelo para amplificação por PCR do gene quimérico 2086. Os iniciadores de PCR com os números de composto 6721 e 5135 foram usados para amplificar o gene quimérico 2086 da cepa 8529 e iniciadores de PCR com os números de composto 6721 e 6605 foram usados para amplificar o gene quimérico 2086 da cepa 2996. Os produtos de PCR foram clonados diretamente no vetor PCR2.1 TOPO de Invitrogen e então examinados por análise de sequência de DNA para identificar um gene quimérico intacto 2086. Esse gene foi então clivado a partir do vetor PCR2.1 com BglII e o fragmento BglII foi inserido no sítio BamHI do plasmideo pET9a. As inserções de plasmideo foram examinadas para a orientação adequada e então submetidas a uma digestão de Ndel. Os fragmentos lineares Ndel foram ligados uns aos outros para realizar a deleção de um pequeno fragmento de Ndel contendo a sequência T7-tag contribuída pelo vetor pET9a. Essa deleção liga diretamente o promotor T7 à extremidade 5' do gene quimérico 2086. O plasmideo deletado Ndel foi transformado na cepa E.coli BL21(DE3) e as colônias resistentes à canamicina foram examinadas para expressão de proteina quimérica 2086 com indução de IPTG.

[0246] Estudos iniciais indicam que o gene quimérico de 2086 da cepa 2996 expressa cerca de duas vezes mais que a proteina recombinante, como comparado com o gene 2996/2086 nativo quando expresso no sistema pET9a. 0 sistema pBAD ainda não foi testado.

[0247] Embora apenas um experimento seja realizado, os dados indicam que há uma utilidade aumentada do gene quimérico de 2086. A geração de fusões CDC-1573 N- terminal com os genes de 2086 das cepas 8529 e 2996 proporciona uma expressão de proteina 2086 recombinante aumentada.

EXEMPLO 5 TRIAGEM POR PCR 2086 DE CEPAS DE N. meningitidis:

[0248] A fim de determinar a conservação do gene 2086 entre isolados clinicos, a ampliação por PCR foi realizada nas 88 cepas de N. meningitidis.

[0249] A identificação de PCR inicial de ORF 2086 utilizou iniciadores listados na Tabela IV (vide Exemplo 2 acima) identificados pelos números de composto: 4623, 4624 e 4625. Estes iniciadores foram projetados com base na sequência N. meningitidis de sorogrupo A do Sanger. Para facilitar a triagem de um grande número de cepas, os iniciadores internos foram projetados para o gene 2086. Um total de 88 cepas de N. meningitidis foram examinadas por PCR com o iniciadores 2086 internos recentemente projetados identificados pelos números de composto 5005 e 5007. Com estes iniciadores os requerentes foram capazes de identificar o gene 2086 de 63 das 88 (~70%) cepas de N. meningitidis, (vide Tabela VIA).

[0250] As regiões expandidas que circundam o gene 2086 na sequência N. meningitidis sorogrupo A do Sanger e sequência 2V. meningitidis sorogrupo B do TIGR foram examinadas e alinhadas. Os iniciadores foram projetados para corresponder às regiões a montante e a jusante do gene 2086. O propósito foi utilizar estes iniciadores para aplicação maior que os genes 2086 de comprimento total a partir de uma variedade de cepas de N. meningitidis para comparação de sequência. A ampliação por PCR de uma cepa (6557), que os números de composto6470 e 6472 resultou em um baixo rendimento de produto. O produto ampliado de cepa 6557 foi clonado e o DNA de plasmideo foi submetido à análise de sequência. Os resultados indicaram um novo tipo de gene 2086 com variabilidade de sequência maior que a previamente vista. 0 gene 2086 da cepa 6557 era ~75% idêntico ao teor de aminoácido para as outras cepas seqüenciadas. De forma interessante, a cepa 6557 era um dos 30% de cepas que foram previamente testadas negativas por triagem por PCR 2086 descrita acima.

[0251] Os iniciadores internos específicos foram projetados. Estes iniciadores foram usados para examinar o gene 2086 mais variável em -30% de cepas que foram previamente testadas negativas por triagem por PCR 2086. Todas as cepas de N. meningitidis (n = 88) disponíveis foram examinadas por PCR com estes iniciadores 2086 recentemente identificados (identificados por números de composto 64 95 e 64 96. Apenas -30% das cepas de N. meningitidis que foram previamente testadas negativas por PCR para 2086 foram PCR positivas neste exame. O conjunto de genes ampliados a partir das cepas PCR previamente negativas (~30%) deve representar um novo tipo de gene 2086 ou uma segunda família de genes 2086 e, no presente documento, são designadas como Subfamília A 2086. O conjunto de genes 2086 ampliados a partir de -70% de cepas com os iniciadores 8529 derivados é designado como Subfamília B.

[0252] As cepas de N. meningitidis usadas para os estudos de ampliação por PCR foram selecionadas a partir das seguintes tabelas, Tabela VIA e Tabela VIB. As cepas listadas nas tabelas são proporcionadas como exemplos de cepas de N. meningitidis além daquelas previamente descritas no presente documento, sem limitação. As cepas listadas na Tabela VIA são classificadas na Subfamília A de proteína 2086 e as cepas listadas na Tabela VIB são classificadas na Subfamília B de proteína 2086. As cepas listadas em cada tabela são agrupadas por sorosubtipo. As cepas são disponíveis a partir das seguintes quatro fontes, conforme indicadas na tabela: MPHL-Manchester Public Health Laboratory, Manchester, UK; RIVM, Bilthoven, The Netherlands; University of Iowa, College of Medicine, Department of Microbiology, Iowa City, IA; e Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C. TABELA VIA

Outras cepas são prontamente disponíveis como isolados a partir de indivíduos infectados.

EXEMPLO 6 REATIVIDADE DE ANTI-SORO RLP2086 CONTRA CEPAS MENINGOCÓCICAS:

[0253] A seguinte tabela, Tabela VII, mostra a capacidade reativa cruzada e de proteção cruzada do rLP2086, conforme descrito acima. Conforme indicado na tabela, o rLP2086 foi processado e analisado usando uma variedade de técnicas que inclui titulações de ELISA (WCE) de célula completa, ensaios bactericidas (BCA) e ensaios em Rato Recém Nascido (IR) para determinar a reatividade de superfície de célula bacteriana de um anticorpo policlonal criada contra a proteína 2086. TABELA VII REATIVIDADE DE ANTI-SORO RLP2086-8529 CONTRA MÚLTIPLAS CEPAS MENINGOCÓCICAS

+ maior que redução de 10 vezes em bacteremia - menor que redução de 10 vezes em bacteremia

EXEMPLO 7

[0254] Diversas construções para expressar a proteina ORF2086 foram preparadas. A tabela a seguir, Tabela VIII, é uma tabela de construção r2086 que é proporcionada para o propósito de mostrar os exemplos e ilustrar uma implementação da presente invenção, sem limitação da mesma. TABELA VIII SUMÁRIO DE CONSTRUÇÃO R208 6

EXEMPLO 8

[0255] Estudos adicionais com proteinas de membrana externa depletadas LOS identificaram cepas adicionais que produzem proteina(s) de membrana externa diferentes de PorA que foram capazes de obter anticorpos bactericidas em cepas que expressam sorosubtipos heterólogos. A seguir, descreve-se adicionalmente os estudos que identificam as proteinas adicionais de acordo com uma modalidade da presente invenção e, especificamente, lipoproteinas de membrana externa, que podem reduzir o número de proteinas requerido em uma composição imunogênica meningocócica. Estes estudos adicionais suplementam os estudos descritos nos exemplos anteriores.

[0256] 0 fracionamento subcelular, a extração de detergente diferencial, focalização isoelétrica e cromatografia de troca iônica foram usados em conjunção com os ensaios de imunização e bactericidas contra múltiplas cepas que identificam pequenos grupos de proteinas de interesse. O sequenciamento direto dos componentes principais indicou que os N-terminais foram bloqueados. As sequências de proteina interna foram obtidas pelo sequenciamento direto de polipeptideos derivados de digestões quimicas e proteoliticas. A sequência genômica de uma cepa meningocócica de grupo A foi descarregada a partir do Centro Sanger e analisada pelo grupo de Bioinformática que usa os algoritmos existentes e proprietários para criar um banco de dados investigável. Os dados de sequência de peptideo indicaram que ORF2086 era de interesse. Os iniciadores baseados neste orf foram usados em PCR o gene P2086 da cepa 8529. A análise da sequência de gene, o fato de que o N-terminal foi bloqueado e sua localização subcelular indicaram que P2086 é uma proteina de membrana externa lipidada (LP2086). rLP2086-8529 e variantes de outras cepas meningocócicas foram expressas de forma recombinante como lipoproteinas em E.coli que sequência de sinal H. influenzae P4. Estas proteinas recombinantes foram isoladas das membranas de E.coli através da extração de detergente diferencial, purificadas usando cromatografia de troca iônica, e usadas para imunizar camundongos. O anti-soro LP2086 de camundongo foi capaz de facilitar a atividade bactericida contra diversas cepas de Sorosubtipo diferentes de N.meningitidis. A análise adicional dos Pgenes 2086s a partir de muitas cepas de N. meningitidis mostrou que estas sequências caem em dois grupos designados como Subfamilia A e Subfamilia B (Vide Figura 12). O anti-soro criado contra as proteinas de Subfamilia B era bactericida contra nove cepas que expressam as proteinas de Subfamilia B, e uma cepa que expressa uma proteina de Subfamilia A. O anti-soro de subfamilia A era bactericida contra as cepas de Subfamilia A. Uma mistura de um rPorA e um rLP2086 obteve os anticorpos complementares que estendem a cobertura de vacina além da induzida por cada proteina sozinha.

[0257] Estas observações levam às seguintes conclusões. Os antigenos rLP2086 são capazes de obter anticorpos bactericidas contra cepas meningocócicas que expressam proteinas PorAs heterólogas e P2086 heterólogas. A familia P2086 de antigenos pode ser uma vacina útil ou imunogênica, sozinha ou em combinação com outros antigenos neisseriais.

[0258] A seguir, descreve-se o estudo anterior em detalhes. Uma mistura complexa de proteinas de membrana externa (sOMPs) foi encontrada para produzir anticorpo bactericida PorA independente contra cepas que expressam as proteinas PorA heterólogas. Um processo de extração de detergente diferencial, focalização isoelétrica e cromatografia de troca iônica seguida pela imunização de camundongo foram usados para seguir os componentes imunologicamente ativos.

[0259] Em cada etapa, o soro foi analisado para a reatividade de superficie e atividade bactericida contra diversas cepas que contêm antigenos de Sorosubtipo que são representativos da epidemiologia mundial de doença meningocócica.

[0260] Este processo de separação e imunização foi usado para identificar um novo candidato imunogênico reativo cruzado para N. meningitidis de Grupo B.

[0261] A geração de cepas deficientes PorA - O local cromossômico porA foi clonado em pPX7016 plasmideo a partir da cepa 2996. No plasmideo o promotor porA, a caixa S/D e os primeiros códons 38 N-terminal foram excluidos e substituídos com um cassete de expressão KanR independente. Os plasmideos foram linearizados com enzimas de restrição e naturalmente transformados nas cepas de Sorosubtipo PI:5,2; PI:9; PI:7,16; PI:15; PI:4; PI:3 & PI:10. Transformantes resistentes a canamicina foram selecionados e examinados para a perda de PorA pelos monoclonais específicos de Sorosubtipo em um ELISA.

[0262] Ensaio Bactericida: Vide Mountzourous, K.T. e Howell, A.P. Detection of Complement-Mediated Anticorpo-Dependent Bactericidal Activity in a Flourescence-Based Serum Bactericidal Assay for Group B Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol. 2000;38:2878- 2884 .

[0263]Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima de Célula Completa (ELISA): As suspensões de célula completa de AL meningitidis foram diluídas em uma densidade óptica de 0,1 a 620nm em 0,01M de fosfato estéril, 0,137M de NaCl, 0,002M de KC1 (PBS). A partir desta suspensão, 0,lmL foram adicionados em cada poço de Nunc Bac T de placa de 96 poços (Cat# 2-69620). As células foram secas em placas a 37°C de um dia para o outro, então, foram cobertas, invertidas e armazenadas a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (0,01M Tris-HCl, 0,139M de NaCl/KCl, 0,1% Brij-35, pH 7,0 a 7,4). As diluições de anti-soro foram preparadas em PBS, 0,05% Tween-20/Azida e 0,lmL foi transferido para as placas revestidas e incubadas durante duas horas a 37°C. As placas foram lavadas três vezes em tampão de lavagem. IgG AP de cabra anti-camundongo (Southern Biotech) foi diluído em 1:1500 em PBS/0,05% de Tween-20, 0,lmL foi adicionada em cada poço, e as placas foram incubadas a 37°C durante duas horas. As placas foram lavadas (conforme acima). A solução de substrato foi preparada ao diluir p-nitrofenil fosfato (Sigma) em dietanolamina a lmg/ml. 0 substrato foi adicionado à placa a 0,lmL por poço e incubado a temperatura ambiente durante uma hora. A reação foi interrompida com 50ul/poço de 3N NaOH e as placas foram lidas em 405nm com referência de 690nm.

[0264] Indução PorA Recombinante: As cepas BLR(DE3)/pET9a foram desenvolvidas de um dia para o outro a 37°C em HySoy Broth (Sheffield Products) suplementadas com Kan-30 e 2% de glicose. Durante a manhã as culturas 0/N foram diluídas 1/20 em HySoy Broth Kan-30 e 1% de glicerol e desenvolvidas a 37°C durante 1 hora. Estas culturas foram induzidas pela adição de IPTG até uma concentração final de ImM. As culturas foram desenvolvidas durante 2 a 3 horas adicionais e, então, colhidas.

[0265] Purificação PorA Recombinante: O rPorA foi solubilizado a partir de corpos de inclusão de E. coli com 8M de Ureia, e redobrado através de diálise contra o tampão que não contém uréia. O rPorA redobrado foi, então, concentrado através da diafiltração e o tampão trocado pela coluna G25 NaPO4 a pH6. O rPorA dialisado foi, então, executado em uma coluna de troca de cátion (S Fractogel) e produzido com 1M de NaCl.

[0266] Os sOMPs a partir da cepa 8529 (P1.7- 2,3) produziram a atividade bactericida independente PorA em camundongos contra cepas que expressam sorosubtipos heterólogos. A tabela a seguir, Tabela IX, mostra a atividade bactericida nas cepas estudadas. TABELA IX

[0267] Preparação de sOMPs: As membranas de N. meningitidis foram extraidas com TX-100, Zwittergent 3-14, e Zwittergent 3-14+0,5M de NaCl. Os sOMPs referidos acima foram solubilizados no extrato de Zwittergent 3-14/0,5M de NaCl. A extração é realizada usando técnicas bem conhecidas para as pessoas versadas na técnica, por exemplo, vide patente U.S. número 6.355.253 que se encontram incorporadas no presente documento a título de referência.

[0268] Imunogenicidade: Camundongos Swiss- Webster fêmeas foram imunizados com 25ug de proteína total adjuvante com 20ug de QS-21 nas semanas 0 e 4. Uma exsanguinação e análise de dados foram feitas na semana 6.

[0269] 1 Titulações bactericidas (BC50) representados como recíprocos à diluição de anti-soro que reduz a contagem de célula viável em 50%. O soro de camundongo normal da semana 0 tiveram titulações BC50 < 25 [0270] 2 NST = Sem Sorosubtipo

[0270] 2 NST = Sem Sorosubtipo

[0271] As tabelas a seguir, Tabela X e Tabela XI, mostram o resumo de purificação e caracterização para lipidado recombinante P2086 (rLP2086) tanto para a Subfamília A como Subfamília B.

[0272] Purificação de Subfamília A rLP2086 TABELA X

[0273] Purificação de Subfamília B rLP2086 TABELA XI

[0274] Método de Purificação: Todas as variantes foram solubilizadas a partir de membranas de E. coli com TX-100 (exceto rLP2086-8529 que foi solubilizado com Sarcosil ou Uréia). A purificação adicional foi obtida com uma combinação de cromatografia de troca aniônica (TMAE), exclusão de tamanho e/ou troca catiônica (S Fractogel) em um tampão de Tris-HCl ou NaPO4.

[0275] 1 Homologia de aminoácido quando comparada com P2086 da cepa 8529

[0276] 2 Pureza quando determinada por SDS- PAGE e densitometria a laser de banda manchada de Coomassie coloidal (Simply Blue stain)

[0277] Imunogenicidade de um elemento de Subfamilia B, rLP2086-8529, testado contra cepas homólogas e heterólogas

[0278] A Tabela XII abaixo mostra a imunogenicidade de um elemento de Subfamília B, rLP2086- 8529, testado contra cepas homologas e heterólogas TABELA XII

[0279] Procedimento de Vacinação: Camundongos Swiss-Webster fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram imunizados com 10ug de rLP2086-8529+20ug QS-21 na semana 0 e na semana 4. A análise de dados foi realizada na exsanguinaçâo na semana 6.

[0280] a Homologia de aminoácido de P2086 quando comparada com rLP2086-8529

[0281] b Titulações de ponto final expressas como recíprocos à diluição em absorbância =0,1

[0282] c Titulações BC50 representadas como recíprocas à diluição de anti-soro que reduz a contagem de célula viável em 50%. O soro de camundongo normal na semana 0 apresentou titulações BC50 < 10.

[0283] A Tabela XIII mostra a imunogenicidade de um elemento de Subfamilia B, rLP2086-2996, testada contra cepas homologas e heterólogas. TABELA XIII

[0284] Procedimento de Vacinação: Camundongos Swiss-Webster fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram imunizados com 10ug rLP2086-2996+20ug QS-21 na semana 0 e na semana 4. A análise de dados foi realizada na exsanguinação na semana 6.

[0285] a Homologia de aminoácido de P2086 quando comparada com rLP2086-2996

[0286] b Titulações de ponto final expressas como reciprocas à diluição em absorbância =0,1

[0287] c Titulações Bactericidas BC50 representadas como reciprocas à diluição de anti-soro que reduz a contagem de célula viável em 50%. O soro de camundongo normal na semana 0 apresentou titulações BC50 < 10.

[0288] A Tabela XIV abaixo mostra que o anti- soro em rLP2086 e rPorA é complementar quando misturado e analisado para a atividade bactericida. TABELA XIV

[0289] Procedimento de Vacinação: Camundongos Swiss-Webster fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram imunizados com 10ug rLP2086-8529/20ug QS-21, ou 15ug rPorA/lOOug MPL na semana 0 e na semana 4 . A análise de dados foi realizada na exsanguinação na semana 6.

[0290] a Titulações bactericidas ( BC50) representados como recíprocos à diluição anti-soro que reduz a contagem de célula viável em 50%. O soro de camundongo normal na semana 0 apresentou titulações BC50 < 10.

[0291] A tabela a seguir, Tabela XV, mostra que as misturas de Subfamílias rLP2086 e dois rPorAs obtiveram anticorpo bactericida em camundongos. TABELA XV

[0292] Procedimento de Vacinação: Camundongos Swiss-Webster fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foram imunizados com 10ug de cada + 20ug QS-21 na semana 0 e na semana 4. A análise de dados foi realizada na exsanguinação na semana 6.

[0293] a Titulações bactericidas ( BC50) representadas como reciprocas à diluição anti-soro que reduz a contagem de célula viável em 50%. 0 soro de camundongo normal na semana 0 apresentou titulações BC50 < 10.

[0294] bSfA - Subfamilia A, SfB - Subfamilia B

[0295] c Controle monovalente relevante: anti- soro rLP2086-8529, rLP2086-2996, rPl.5-1,2-2 ou rPl.22-1,14- 1

[0296] A seguir, resume-se os resultados dos estudos descritos acima. O anti-soro anti-rLP2086 é bactericida contra 13/16 cepas de teste. Onze cepas que expressam diferentes sorosubtipos são exterminadas pelo anti-soroP2086. A atividade bactericida de e anti-soro rLP2086 é complementar ao anti-soro rPorA. As misturas de P2086 e PorA produziram anticorpos bactericidas complementares em camundongos. A extração de detergente diferencial, purificação e imunização em conjunção com um ensaio de anticorpo funcional contra muitas cepas podem ser usados para identificar novos candidatos de vacina. P2086 foi identificado como um candidate de vacina que produz anticorpo bactericida contra cepas heterólogas tanto em P2086 como em rPorA. Deste modo, a familia 2086 de proteinas pode ser uma vacina útil sozinha ou em combinação com outros antigenos neisseriais.

EXEMPLO 9

[0297] As cepas meningocócicas de diversos sorogrupos foram examinadas por PCR para a presença do gene 2086 ORF. Em última análise, mais de cem cepas meningocócicas foram examinadas.

[0298] Dois conjuntos de iniciadores de PCR internos específicos para as regiões variáveis C-terminal foram utilizados para discriminar entre as sequências gene de Subfamília A e B. A presença de um produto ampliado PCR de aproximadamente 350 bp indicou que a sequência de gene 2086 estava presente no cromossomo. Todas as cepas produziram um único produto PCR do tamanho esperado. As sequências de nucleotídeo de gene ORF de comprimento completo 2086 foram determinadas, alinhadas (DNAStar MegAlign) e usadas para gerar uma árvore filogenética.

[0299] Os genes 2086 foram expressos de maneira recombinante como uma lipoproteina rLP2086 em um sistema promotor induzivel por arabinose pBAD ou como uma proteína não lipidada rP2086 em um sistema pET induzivel. Estas proteínas recombinantes foram expressas em E.coli B. A proteína recombinante purificada foi usada para imunizar os camundongos e o anti-soro de camundongo foi examinado em suas titulações IgG de soro e sua atividade bactericida contra uma variedade de cepas meningocócicas heterólogas.

[0300] ORF 2086 foi ampliado por PCR a partir de: células meningocócicas completas, DNA cromossômico purificado ou modelos de DNA de plasmideo.

[0301] Os genes ORF 2086 foram clonados no vetor pLP339, que funde a sequência lider Haemophilus P4 à extremidade 5 dos genes ORF 2086. A cepa de E.coli BLR foi usada como a cepa hospedeira para a expressão recombinante da forma lipidada de rP2086 a partir de clones pBAD/ORF 2086. (Vide Figura 10A) . O promotor induzivel por arabinose pBAD aciona a expressão da proteina de fusão P4 sinal/ORF 2086 para expressar uma forma lipidada de rP2086. Os Pgenes 2086 desprovidos de uma sequência de sinal foram clonados em um vetor pET9a através do promotor de fago altamente ativo T7. A cepa E.coli BL21(DE3) foi usada como a cepa hospedeira para a expressão recombinante de uma forma não lipidada de ORF 2086 a partir de clones pET9a/ORF 2086. O lisógeno DE3 em cepa de E.coli BL21 pode ser induzido a expressar a polimerase T7 RNA sob o controle do promotor lacUV5 através da adição de IPTG. Vide, WCE; FEMS Micro. Lett., 48 (1987) 367-371 e BCA; J. Clin. Microbiol., 38 (2000) 2878-2884.

[0302] O gene ORF2086 foi clonado e sequenciado a partir de diferentes cepas de N. meningitidis. As sequências de nucleotideo foram alinhadas (DNAStar MegAlign) e usadas para gerar uma árvore filogenética. Esta árvore revela duas subfamilias distintas da sequência de nucleotideo de gene ORF 2086. As duas subfamilias de genes são similares às suas extremidades 5', porém, contêm variação considerável próxima às suas extremidades 3'. Embora pareçam ter variabilidade significativa, certas regiões chaves do gene são altamente homólogas entre as diferentes cepas. Sem ter intenção de se ater à teoria, estas regiões conservadas podem proporcionar continuidade funcional para a proteina e podem ser indicativas de epitopes protetoras cruzadas a ser exploradas como alvos de vacine.

[0303] O gene 2086 foi clonado a partir de diversas cepas meningocócicas de sorogrupo B e expresso com e sem a sequência de sinal de lipidação. A forma não lipidada fundida ao T7-Tag expressa no teor mais alto. A sequência T7-Tag pode proporcionar a estabilidade para o mRNA e aumentar significativamente o teor de polipeptideo traduzido. Esta proteina de fusão surge para depositar nos corpos de inclusão e pode ser purificada e prontamente redobrada com protocolos conhecidos. As formas lipidadas e não lipidadas de P2086 são expressas em aproximadamente 5 a 8% da proteina celular total, com a exceção das fusões T7- Tag, que expressam rP2086 como aproximadamente 50% da proteina total. A forma não lipidada da proteina surge para ser solúvel e localizada no citoplasma. A forma lipidada da proteina surge para ser associada às frações de membrana e é solubilizada com detergente. A proteina em sua forma nativa lipidada pode ter a estrutura terciária superior para a apresentação de antigeno e/ou o lipidio fixado pode atuar como um adjuvante que estimula uma maior resposta imunogênica.

[0304] Todas as cepas N. meningitidis B testadas surgem para ter um gene tipo 2086. Pelo menos duas familias do gene 2086 são representados. 2086 homólogos foram identificados pela triagem PCR a seguir:

[0305] N. meningitidis B, C, W135, Y

[0306] N. lactamica

[0307] N. gonorrhoeae FA1090

[0308] Diversos genes ORF 2086 foram clonados e expressos de maneira recombinante

[0309] As versões lipidadas de P2086 foram expressas a partir de diversas cepas meningocócicas.

[0310] Estas proteinas recombinantes foram purificadas e usadas para vacinar camundongos.

[0311] O anti-soro resultante é bactericida.

[0312] As versões não lipidadas de P2086 foram expressas a partir de diversas cepas.

[0313] rLP2086 produz de maneira coerente uma resposta imune maior que rP2086.

[0314] rLP2086 também exibe atividade bactericida aperfeiçoada contra cepas meningocócicas homólogas e heterólogas.

EXEMPLO 11

[0315] A seguir, demonstra-se adicionalmente que o P2086 é expresso em cepas neisseriais e proporciona exemplos específicos adicionais da expressão P2086 em diversas cepas.

[0316] Os lisados de célula foram preparados com células a partir de culturas de placa re-suspensas no tampão de amostra SDS e aquecidos a 98 °C durante quatro minutos. As amostras foram carregadas a ~30-50ug de proteina total por poço em 10-20% de géis pré-moldados (ICN) e executadas a 175V. Os géis foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose que foi, então, bloqueada durante 30 minutos com 5% de leite em pó em Tris-salina tamponada (Blotto). 0 anticorpo primário usado era um pool de anti-soro policlonal criado contra variantes individuais rLP2086 em camundongos.

[0317] Referindo-se às Figuras 17 e 18, um Western Blot mostra a reatividade de anti-soro de camundongo rLP2086 em lisados de célula completa de Subfamilia A e B P2086. Para o blot de lisado de célula de Subfamilia A, o anti-soro usado foi criado contra rLP2086- 2996, -870446 e-250771 com rLP2086-250771 diluído em 1/500 em Blotto e os outros diluídos em 1/1000 em Blotto. Para o blot de lisado de célula de Subfamilia B, o usado foi criado contra rLP2086-8529 (diluído em 1/1000 em Blotto), - CDC1573. -M982 e 880049 (estes três diluídos em 1/500 em Blotto). O anti-soro e o blot primário foram incubados a 4°C de um dia para o outro. O blot foi lavado, um AP de cabra anti-camundongo secundário foi adicionado em 1/500 em Blotto, e o blot foi incubado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Após a lavagem, o blot foi desenvolvido usando o Sistema de Substrato de Fosfatase de Membrana BCIP/NBT (KPL).

BIBLIOGRAFIA

[0318] As referências aqui citadas acima estão assinaladas abaixo e são aqui incorporadas como referência em sua totalidade: 1. 1997. Case definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. CDC. 2. 1995 Sambrook, J. and D. W. Russell. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., New York. 3. 1994. Griffin, A. M. and Griffin, H. G., ed., Computer Analysis of Sequence Data, Part I. Humana Press, New Jersey. 4. 1993. Smith, D. W.. ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects. Academic Press, New York 5. 1991. Gribskov, M. and Devereux, J., ed. Sequence Analysis Primer. Stockton Press, New York. 6. 1988. Lesk, A. M., ed. Computational Molecular Biology. Oxford University Press, New York. 7. Abdillahi, H., and J. T. Poolman. 1988, Neisseria meningitidis group B serosubtyping using monoclonal anticorpos in whole-cell ELISA. Microbial Pathogenesis 4(1):27-32. 8. Achtman, M. 1995. Epidemic spread and antigenic variability of Neisseria meningitidis. Trends in Microbiology 3 (5):186-92. 9. Alm, R. A., L. S. Ling, D. T. Moir, B. L. King, E. D. Brown, P. C. Doig, D. R. Smith, B. Noonan, B. C. Guild, B. L. deJonge, G. Carmel, P. J. Tummino, A. Caruso, M. Uria-Nickelsen, D. M. Mills, C. Ives, R. Gibson, D. Merberg, S. D. Mills, Q. Jiang, D. E. Taylor, G. F. Vovis, and T. J. Trust. 1999. Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori [published erratum appears in Nature 1999 Feb 25; 397 (6721) :719]. Nature. 397:176-80. 10. Altschul, S. F., T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, and D. J. Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-402. 11. Anderson, T. F. 1951. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Trans N Y Acad Sci. 13:130-134. 12. Ambrosch, F., G. Wiedermann, P. Crooy, and A. M. George. 1983. Immunogenicity and side-effects of a new tetravalent meningococcal polysaccharide vaccine. Bulletin of the World Health Organization 61(2):317-23. 13. Benson, G. 1999. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids Res. 27:573-80. 14. Carillo, H., D. Lipman, and J. Siam. 1988. Applied Math 48:1073. 15. Chen, C. C., and P. P. Cleary. 1989. Cloning and expression of the streptococcal C5a peptidase gene in Escherichia coli: linkage to the type 12 M protein gene. Infect. Immun. 57:1740-1745. 16. Chmouryguina, I., A. Suvorov, P. Ferrieri, and P. P. Cleary. 1996. Conservation of the C5a peptidase genes in group A and B streptococci. Infect. Immun. 64:2387-2390. 17. Cockerill, F. R., 3rd, R. L. Thompson, J. M. Musser, P. M. Schlievert, J. Talbot, K. E. Holley, W. S. Harmsen, D. M. Ilstrup, P. C. Kohner, M. H. Kim, B. Frankfort, J. M. Manahan, J. M. Steckelberg, F. Roberson, and W. R. Wilson. 1998. Molecular, serological, and clinical features of 16 consecutive cases of invasive streptococcal disease. Southeastern Minnesota Streptococcal Working Group. Clin Infect Dis. 26:1448-58. 18. Courtney, H. S., Y. Li, J. B. Dale, and D. L. Hasty. 1994. Cloning, sequencing, and expression of a fibronectin/fibrinogen-binding protein from group A streptococci. Infect Immun. 62:3937-46. 19. Cserzo, M., E. Wallin, I. Simon, G. von Heijne, and A. Elofsson. 1997. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface método. Protein Engineering. 10:673-6. 20. Cunningham, M. W., and A. Quinn. 1997. Immunological crossreactivity between the class I epitope of streptococcal M protein and myosin. Adv Exp Med Biol. 418:887-92. 21. Dale, J. B., R. W. Baird, H. S. Courtney, D. L. Hasty, and M. S. Bronze. 1994. Passive protection of mice contra group A streptococcal pharyngeal infection by lipoteichoic acid. J Infect Dis. 169:319-23. 22. Dale, J. B., M. Simmons, E. C. Chiang, and E. Y. Chiang. 1996. Recombinant, octavalent group A streptococcal M protein vaccine. Vaccine. 14:944-8. 23. Dale, J. B., R. G. Washburn, M. B. Marques, and M. R. Wessels. 1996. Hyaluronate capsule and surface M protein in resistance to opsonization of group A streptococci. Infect Immun. 64:1495-501. 24. Eddy, S. R. 1996. Hidden Markov models. Cur Opin Struct Bio. 6:361-5. 25. Ellen, R. P., and R. J. Gibbons. 1972. M protein-associated adherence of Streptococcus pyogenes to epithelial surfaces: prerequisite for virulence. Infect Immun. 5:826-830. 26. Eng, J. K., A. L. McCormack, and J. R. Yates, 3rd. 1994. An approach to correlate tandem mass- spectral data of peptides with amino-acid-sequences in a protein database. Am Soc Mass Spectrometry. 5:976-89. 27. Fischetti, V. A., V. Pancholi, and 0. Schneewind. 1990. Conservation of a hexapeptide sequence in the anchor region of surface proteins from gram-positive cocci. Mol Microbiol. 4:1603-5. 28. Fogg, G. C., and M. G. Caparon. 1997. Constitutive expression of fibronectin binding in Streptococcus pyogenes as a result of anaerobic activation of rofA. J Bacteriol. 179:6172-80. 29. Foster, T. J., and M. Hook. 1998. Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Trends Microbiol. 6:484-8. 30. Fraser, C. M., S. Casjens, W. M. Huang, G. G. Sutton, R. Clayton, R. Lathigra, 0. White, K. A. Ketchum, R. Dodson, E. K. Hickey, M. Gwinn, B. Dougherty, J. F. Tomb, R. D. Fleischmann, D. Richardson, J. Peterson, A. R. Kerlavage, J. Quackenbush, S. Salzberg, M. Hanson, R. van Vugt, N. Palmer, M. D. Adams, J. 31. Gocayne, J. C. Venter, and et al. 1997. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi [see comments]. Nature. 390:580-6. 32. Goldschneider, I., E. C. Gotschlich, and M. S. Artenstein. 1969. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral anticorpos. Journal of Experimental Medicine 129(6):1307-26. 33. Goldschneider, I., E. C. Gotschlich, and M. S. Artenstein. 1969. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine 129(6):1327-48. 34. Gotschlich, E. C., I. Goldschneider, and M. S. Artenstein. 1969. Human immunity to the meningococcus. IV. Immunogenicity of group A and group C meningococcal polysaccharides in human volunteers. Journal of Experimental Medicine 129 ( 6):1367-84. 35. Gotschlich, E. C., I. Goldschneider, and M. S. Artenstein. 1969. Human immunity to the meningococcus. V. The effect of immunization with meningococcal group C polysaccharide on the carrier state. Journal of Experimental Medicine 129(6):1385-95. 36. Green, B.A., Farley, J.E., Quinn-Dey, T., Deich, R.A., and Zlotnick, G.W.. 1991. The e (P4) Outer Membrane Protein of Haemophilus influenzae: Biologic Activity of Anti-e Serum and Cloning and Sequencing of the Structural Gene. Infect. Immun. 59: 3191-3198. 37. Guzman, L-M, Belin, D. , Carson, M.J., Beckwith, J. 1995. Tight Regulation, Modulation, and High- Level Expression by Vectors Containing the Arabinose PBAD Promoter. J. Bacteriology 177:4121-4130. 38. Hacker, J., G. Blum-Oehler, I. Muhldorfer, and H. Tschape. 1997. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Mol Microbiol. 23:1089-97. 39. Hanski, E., and M. Caparon. 1992. Protein F, a fibronectin-binding protein, is an adhesion of the group A streptococcus Streptococcus pyogenes. Proc Natl Acad Sci., USA. 89:6172-76. 40. Hanski, E., P. A. Horwitz, and M. G. Caparon. 1992. Expression of protein F, the fibronectin- binding protein of Streptococcus pyogenes JRS4, in heterologous streptococcal and enterococcal strains promotes their adherence to respiratory epithelial cells. Infect Immun. 60:5119-5125. 41. Hernandez-Sanchez, J., J. G. Valadez, J. V. Herrera, C. Ontiveros, and G. Guarneros. 1998. lambda bar minigene-mediated inhibition of protein synthesis involves accumulation of peptidyl-tRNA and starvation for tRNA. EMBO Journal. 17:3758-65. 42. Huang, T. T., H. Malke, and J. J. Ferretti. 1989. The streptokinase gene of group A streptococci: cloning, expression in Escherichia coli, and sequence analysis. Mol Microbiol. 3:197-205. 43. Hynes, W. L., A. R. Dixon, S. L. Walton, and L. J. Aridgides. 2000. The extracellular hyaluronidase gene (hylA) of Streptococcus pyogenes. FEMS Microbiol Lett. 184:109-12. 44. Hynes, W. L. , L. Hancock, and J. J. Ferretti. 1995. Analysis of a second bacteriophage hyaluronidase gene from Streptococcus pyogenes: evidence for a third hyaluronidase involved in extracellular enzymatic activity. Infect Immun. 63:3015-20. 45. Isberg, R. R., and G. Tran Van Nhieu. 1994. Binding and internalization of microorganisms by integrin receptors. Trends Microbio. 2:10-4. 46. Jones, K. F., and V. A. Fischetti. 1988. The importance of the location of anticorpo binding on the M6 protein for opsonization and phagocytosis of group A M6 streptococci. J Exp Med. 167:1114-23. 47. Kihlberg, B. M., M. Collin, A. Olsen, and L. Bjorck. 1999. Protein H, an antiphagocytic surface protein in Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 67:1708-14. 48. Koebnik, R. 1995. Proposal for a peptidoglycan-associating alpha-helical motif in the C- terminal regions of some bacterial cell-surface proteins [letter; comment]. Molecular Microbiology. 16:1269-70. 49. Kuipers, 0. P., H. J. Boot, and W. M. de Vos. 1991. Improved site-directed mutagenesis método using PCR. Nucleic Acids Res. 19:4558. 50. Kyte, J., and R. F. Doolittle. 1982. A simple método for displaying the hydropathic character of a protein. Journal of Molecular Biology 157:105-132. 51. Landt, 0., H. P. Grunert, and 0. Hahn. 1990. A general método for rapid site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction. Gene 96:125-128. 52. Loessner, M. J., S. Gaeng, and S. Scherer. 1999. Evidence for a holin-like protein gene fully embedded out of frame in the endolysin gene of Staphylococcus aureus bacteriophage 187. J Bacteriol. 181:4452-60. 53. Lukashin, A. V., and M. Borodovsky. 1998 . GeneMark.hmm: new solutions for gene finding. Nucleic Acids Res. 26:1107-15. 54. Lukomski, S., C. A. Montgomery, J. Rurangirwa, R. S. Geske, J. P. Barrish, G. J. Adams, and J. M. Musser. 1999. Extracellular cysteine protease produced by Streptococcus pyogenes participates in the pathogenesis of invasive skin infection and dissemination in mice. Infect Immun. 67:1779-88. 55. Madore, D. V. 1998. Characterization of immune response as an indicator of Haemophilus influenzae type b vaccine efficacy. Pediatr Infect Dis J. 17:S207-10. 56. Matsuka, Y. V., S. Pillai, S. Gubba, J. M. Musser, and S. B. Olmsted. 1999. Fibrinogen cleavage by the Streptococcus pyogenes extracellular cysteine protease and generation of anticorpos that inhibit enzyme proteolytic activity. Infect Immun. 67:4326-33. 57. Mazmanian, S. K., G. Liu, H. Ton-That, and 0. Schneewind. 1999. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall. Science. 285:760-3. 58. McAtee, C. P., K. E. Fry, and D. E. Berg. 1998. Identification of potential diagnostic and vaccine candidates of Helicobacter pylori by "proteome" technologies. Helicobacter. 3:163-9. 59. McAtee, C. P., M. Y. Lim, K. Fung, M. Velligan, K. Fry, T. Chow, and D. E. Berg. 1998. Identification of potential diagnostic and vaccine candidates of Helicobacter pylori by two-dimensional gel electrophoresis, sequence analysis, and serum profiling. Clin Diagn Lab Immunol. 5:537-42. 60. McAtee, C. P-, M. Y. Lim, K. Fung, M. Velligan, K. Fry, T. P. Chow, and D. E. Berg. 1998. Characterization of a Helicobacter pylori vaccine candidate by proteome techniques. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 714:325-33. 61. Mejlhede, N., J. F. Atkins, and J. Neuhard. 1999. Ribosomal -1 frameshifting during decoding of Bacillus subtilis cdd occurs at the sequence CGA AAG. J. Bacteriol. 181:2930-7. 62. Molinari, G., S. R. Talay, P. Valentin- Weigand, M. Rohde, and G. S. Chhatwal. 1997. The fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes, Sfbl, is involved in the internalization of group A streptococci by epithelial cells. Infect Immun. 65:1357-63. 63. Mountzouros, K. T., and A. P. Howell. 2000. Detection of complement-mediated anticorpo-dependent bactericidal activity in a fluorescence-based serum bactericidal assay for group B Neisseria meningitidis. J. Clin. Microbiol. 38 (8) :2878-2884. 64. Nakai, K., and M. Kanehisa. 1991. Expert system for predicting protein localization sites in gramnegative bacteria. Proteins. 11:95-110. 65. Navarre, W. W., and 0. Schneewind. 1999. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol Mol Biol Rev. 63:174-229. 66. Nielsen, H., J. Engelbrecht, S. Brunak, and G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering. 10:1-6. 67. Nizet, V., B. Beall, D. J. Bast, V. Datta, L. Kilburn, D. E. Low, and J. C. De Azavedo. 2000. Genetic locus for streptolysin S production by group A streptococcus. Infect Immun. 68:4245-54. 68. Nordstrand, A., W. M. McShan, J. J. Ferretti, S. E. Holm, and M. Norgren. 2000. Allele substitution of the streptokinase gene reduces the nephritogenic capacity of group A streptococcal strain NZ131. Infect Immun. 68:1019-25. 69. Olmsted, S. B., S. L. Erlandsen, G. M. Dunny, and C. L. Wells. 1993. High-resolution visualization by field emission scanning electron microscopy of Enterococcus faecalis surface proteins encoded by the pheromone-inducible conjugative plasmid pCFlO. J Bacteriol. 175:6229-37. 70. Park, J., and S. A. Teichmann. 1998. DIVCLUS: an automatic método in the GEANFAMMER package that finds homologous domains in single- and multi-domain proteins. Bioinformatics. 14:144-50. 71. Parkhill, J., M. Achtman, K. D. James, S. D. Bentley, C. Churcher, S. R. Klee, G. Morelli, D. Basham, D. Brown, T. Chillingworth, R. M. Davies, P. Davis, K. Devlin, T. Feltwell, N. Hamlin, S. Holroyd, K. Jagels, S. Leather, S. Moule, K. Mungall, M. A. Quail, M. A. Rajandream, K. M. Rutherford, M. Simmonds, J. Skelton, S. Whitehead, B. G. Spratt, and B. G. Barrell. 2000. Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491 [see comments]. Nature. 404:502-6. 72. Pierschbacher, M. D., and E. Ruoslahti. 1987. Influence of stereochemistry of the sequence Arg-Gly- Asp-Xaa on binding specificity in cell adhesion. J Biol Chem. 262:17294-8. 73. Pizza, M., V. Scarlato, V. Masignani, M. M. Giuliani, B. Arico, M. Comanducci, G. T. Jennings, L. Baldi, E. Bartolini, B. Capecchi, C. L. Galeotti, E. Luzzi, R. Manetti, E. Marchetti, M. Mora, S. Nuti, G. Ratti, L. Santini, S. Savino, M. Scarselli, E. Storni, P. Zuo, M. Broeker, E. Hundt, B. Knapp, E. Blair, T. Mason, H. Tettelin, D. W. Hood, A. C. Jeffries, N. J. Saunders, D. M. Granoff, J. C. Venter, E. R. Moxon, G. Grandi, and R. Rappuoli. 2000. Identification of vaccine candidates contra serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing. Science 287(5459):1816-20. 74. Podbielski, A., A. Flosdorff, and J. Weber- Heynemann. 1995. The group A streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genes. Infect Immun. 63:9-20. 75. Poolman, J. T. 1996. Bacterial outer membrane protein vaccines. The meningococcal exemplo. Advances in Experimental Medicine & Biology 397:73-7. 76. Proft, T., S. Louise Moffatt, C. J. Berkahn, and J. D. Fraser. 1999. Identification and Characterization of Novel Superantigens from Streptococcus pyogenes. J Exp Med. 189:89-102. 77. Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev. 57:50-108. 78. Quinn, A., K. Ward, V. A. Fischetti, M. Hemric, and M. W. Cunningham. 1998. Immunological relationship between the class I epitope of streptococcal M protein and myosin. Infect Immun. 66:4418-24. 79. Reda, K. B., V. Kapur, D. Goela, J. G. Lamphear, J. M. Musser, and R. R. Rich. 1996. Phylogenetic distribution of streptococcal superantigen SSA allelic variants provides evidence for horizontal transfer of ssa within Streptococcus pyogenes. Infect Immun. 64:1161-5. 80. Sambrook, J., and D. W. Russell. 2001. Molecular cloning a laboratory manual, Third ed, vol. 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 81. Salzberg, S. L., A. L. Delcher, S. Kasif, and 0. White. 1998. Microbial gene identification using interpolated Markov models. Nucleic Acids Res. 26:544-8. 82. Saukkonen, K., H. Abdillahi, J. T. Poolman, and M. Leinonen. 1987. Protective efficacy of monoclonal anticorpos to class 1 and class 3 outer membrane proteins of Neisseria meningitidis B:15:Pl.16 in infant rat infection model: new prospects for vaccine development. Microbial Pathogenesis 3(4):261-7. 83. Sedegah et al. 1994. Immunology. 91, 9866- 9870. 84. Sonnenberg, M. G., and J. T. Belisle. 1997. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65:4515-24. 85. Sonnhammer, E. L., S. R. Eddy, and R. Durbin. 1997. Pfam: a comprehensive database of protein domain families based on seed alignments. Proteins. 28:405- 20. 86. Stevens, D. L. 1995. Streptococcal toxicshock syndrome: spectrum of disease, pathogenesis, and new concepts in tratamento. Emerg Infect Dis. 1:69-78. 87. Stockbauer, K. E., L. Magoun, M. Liu, E. H. Burns, Jr., S. Gubba, S. Renish, X. Pan, S. C. Bodary, E. Baker, J. Coburn, J. M. Leong, and J. M. Musser. 1999. A natural variant of the cysteine protease virulence factor of group A streptococcus with an arginine-glycine-aspartic acid (RGD) motif preferentially binds human integrins alphavbeta3 and alphallbbeta3 Proc Natl Acad Sci., USA. 96:242-7. 88. Tettelin, H., N. J. Saunders, J. Heidelberg, A. C. Jeffries, K. E. Nelson, J. A. Eisen, K. A. Ketchum, D. W. Hood, J. F. Peden, R. J. Dodson, W. C. Nelson, M. L. Gwinn, R. DeBoy, J. D. Peterson, E. K. Hickey, D. H. Haft, S. L. Salzberg, 0. White, R. D. Fleischmann, B. A. Dougherty, T. Mason, A. Ciecko, D. S. Parksey, E. Blair, H. Cittone, E. B. Clark, M. D. Cotton, T. R. Utterback, H. Khouri, H. Qin, J. Vamathevan, J. Gill, V. Scarlato, V. Masignani, M. Pizza, G. Grandi, L. Sun, H. 0. Smith, C. M. Fraser, E. R. Moxon, R. Rappuoli, and J. C. Venter. 2000. Complete genome sequence of Neisseria meningitidis serogroup B strain MC58. Science 287(5459):1809-15. 89. Ton-That, H., G. Liu, S. K. Mazmanian, K. F. Faull, and 0. Schneewind. 1999. Purification and characterization of sortase, the transpeptidase that cleaves surface proteins of Staphylococcus aureus at the LPXTG motif. Proc Natl Acad Sei USA. 96:12424-12429. 90. von Heinje, G. 1987. Sequence Analysis in Molecular Biology. Academic Press, New York. 91. Weldingh, K. , I. Rosenkrands, S. Jacobsen, P. B. Rasmussen, M. J. Elhay, and P. Andersen. 1998. Twodimensional electrophoresis for analysis of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate and purification and characterization of six novel proteins. Infect Immun. 66:3492-500. 92. Wolff et al. 1990. Science. 247, 1465-1468. 93. Yutsudo, T., K. Okumura, M. Iwasaki, A. Hara, S. Kamitani, W. Minamide, H. Igarashi, and Y. Hinuma. 1994. The gene encoding a new mitogenic factor in a Streptococcus pyogenes strain is distributed only in group A streptococci. Infection and Immunity. 62:4000-4004. 94. Zagursky, R.J. and D. Russell. 2001. Bioinformatics: Use in Bacterial Vaccine Discovery. BioTechniques. 31:636-659.

[0319] A invenção que está agora sendo descrita, como deve ficar evidente para os versados nessas técnicas, que muitas mudanças e modificações podem ser feitas nela em fugir do espirito ou âmbito da como aqui enunciada. 0 relatório descritivo precedentes descreve modalidades preferidas da presente invenção junto com inúmeras alternativas possiveis. Estas modalidades, entretanto, são meramente a titulo exemplificativo e a invenção não está restrita a elas.

Claims

1. Composição caracterizada por compreender o polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das sequências pares da SEQ ID NOS: 2 a 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida composição compreender adicionalmente um adjuvante, selecionado do grupo que consiste em monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado, sal de alumínio, complexo imunoestimulador, oligonucleotideo e toxóide.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida composição compreender adicionalmente um polissacarídeo.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição compreender adicionalmente pelo menos 1 PorA, PorB, proteína de ligação à transferrina, ou uma proteína opaca (proteína de opacidade) (Opc).

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptídeo ser não lipidado.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptídeo ser codificado pela sequência de ácido nucleico de qualquer uma das sequências numeradas ímpares da SEQ ID NOS: 1-11.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências numeradas pares da SEQ ID NOS: 2-6.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o polipeptídeo ser codificado pela sequência de ácidos nucléicos de qualquer uma das sequências numeradas ímpares da SEQ ID NOS: 1-5.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptideo compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências pares de SEQ ID NOS: 8-12 .

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o polipeptideo ser codificado pela sequência de ácidos nucléicos de qualquer uma das sequências numeradas ímpares da SEQ ID NOS: 7-11.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptideo ter um peso molecular de 26.000 a 30.000 Daltons, conforme medido por espectroscopia de massa.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptideo ter um peso molecular de 28- 35 kDa como medido em um gel de poliacrilamida SDS a 10% -20%.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptideo ser não-lipidado.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o polipeptideo ser uma proteína recombinante.

15. Composição imunogênica caracterizada por compreender um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12.

16. Uso da composição imunogênica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 caracterizado por servir para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta imune em um mamífero.

17. Uso da composição imunogênica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 caracterizado por servir para a preparação de um medicamento eficaz contra meningite bacteriana em um mamífero.