BRPI0721660A2 - usos de um antagonista de neuropilin-2, anticorpos antinrp2b, anticorpos anti-nrp2a, composiÇço, composiÇço farmacÊutica e antagonista nrp2 - Google Patents

Abstract

INIBIÇçO DA METÁSTASE DE TUMORES POR MEIO DE ANTICORPOS DE ANTINEUROPILINA 2. A presente invenção refere-se a antagonistas de Nrp2, tais co- mo anticorpos de anti-Nrp2, e seu uso para prevenção e tratamento da metástase tumoral.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIÇÃO DA METÁSTASE DE TUMORES POR MEIO DE ANTICORPOS DE ANTI- NEUROPILINA 2". CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a antagonistas de neuropilin-2 (Nrp2), especialmente a anticorpos de anti-Nrp2, e seu uso na prevenção e tratamento da metástase tumoral. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Hoje em dia está bem demonstrado que a angiogênese está implicada na patogênese de uma variedade de distúrbios. Esses incluem tumores sólidos e metástase, ateroesclerose, fibropiasia retrolental, heman- giomas, inflamação crônica, doenças intraoculares neovascuiares tais como retinopatias proliferativas, por exemplo, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD), glaucoma neovascular, rejeição imune contra tecidos transplantados da córnea e outros tecidos, artrite reumatoide, e psoríase. Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klags- brun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); e GarnerA., "Vascular Diseases" ("Doenças Vasculares") em: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach (Patobiologia da Doença Ocular. Uma Abordagem Dinâ- mica), GarnerA., Kointworth GK1 eds., 2a Edição (Mareei Dekker, NY, 1994), págs 1625-1710.

No caso do crescimento tumoral, a angiogênese parece ser crucial para a transição de hiperplasia para neoplasia e para fornecer ali- mento para o crescimento e metástase do tumor. Folkman et al., Nature 339:58 (1989). A neovascularização permite que as células tumorais adqui- ram uma vantagem no crescimento e autonomia proliferativa se comparado às células normais. Um tumor normalmente começa como uma célula aber- rante que pode proliferar somente até um tamanho de alguns poucos milíme- tros cúbicos devido à distância dos leitos capilares disponíveis, e ele pode permanecer "hibernando" sem maior crescimento e disseminação por um longo período de tempo. Algumas células tumorais então mudam para o fe- nótipo angiogênico para ativar células endoteliais que proliferam e amadure- cem formando novos vasos sangüíneos capilares. Esses novos vasos capi- lares recém-formados não somente permitem um crescimento contínuo do tumor primário como também a disseminação e recolonização de células tumorais metastáticas. Concordantemente1 tem-se observado uma correla- ção entre densidade de microvasos em seções tumorais e a sobrevivência de pacientes no câncer de mama bem como em diversos outros tumores. Weidner et al, Engi J. Med 324:1-6 (1991); Horak et ai, Lancet 340: 1120- 1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992). O mecanismo preciso que controla a mudança angiogênica não é bem-compreendido, mas acredita-se que a neovascularização da massa celular resulta do equilíbrio líquido de uma série de estimuladores e inibidores da angiogênese (Folkman NatMed 1(1):27-31 (1995)).

É normalmente aceito que metástases sejam responsáveis pela grande maioria, estimada em 90%, das mortes causadas por tumores sóli- dos (Gupta e Massague, Cell (Célula) 127, 679-695(2006)). O processo complexo da metástase envolve uma série de etapas distintas, incluindo desprendimento de células tumorais a partir do tumor primário, o intravasa- mento de células tumorais nos vasos linfáticos ou sangüíneos, e o extrava- samento e crescimento de células tumorais em locais secundários. A análise de nódulos linfáticos regionais em muitos tipos de tumores sugere que a vasculatura linfática é uma via importante para a disseminação de cânceres humanos. Além disso, na maior parte dos carcinomas, a presença de células tumorais em nódulos linfáticos é o fator prognóstico adverso mais importan- te. Enquanto anteriormente pensava-se que tais metástases envolviam ex- clusivamente a passagem de células malignas ao longo dos vasos linfáticos preexistentes próximos a tumores, estudos experimentais recentes e relató- rios clínico-patológicos (revisados em Achen et al., Br J Câncer 94 (2006), 1355-1360 e Nathanson, Câncer (Câncer) 98, 413-423 (2003)) sugerem que a linfoangiogênese pode ser induzida por tumores sólidos e podem promover a disseminação de tumores. Esses e outros estudos recentes sugerem que alvejar os vasos linfáticos e a linfangiogênese pode ser uma estratégia tera- pêutica útil para restringir o desenvolvimento da metástase do câncer, o que teria um benefício significativo para muitos pacientes.

VEGFC1 um membro da família do fator celular endotelial vas- cular (VEGF) é um dos mediadores melhor estudados do desenvolvimento linfático. A superexpressão de VEGFC em células tumorais mostrou promo- ver linfangiogênese associada a tumor, resultando em metástase aumentada para nódulos linfáticos regionais (Karpanen et al., Faseb J 220, 1462-1472 (2001); Mandriota et al., EMBOJ 20, 672-682 (2001); Skobe et al., nAT Med 7, 192-198 (2001); Stacker et al., Nat vide Câncer (Câncer) 2, 573-583 (2002); Stacker et al., Faseb J 16, 922-934 (2002)). A expressão de VEGFC também foi correlacionada com linfangiogênese associada ao tumor e me- tástase do nódulo linfático para uma série de cânceres humanos (revisado em Achen et al., 2006, supra; além disso, o bloqueio da sinalização mediada por VEGFC mostrou suprimir a linfangiogênese tumoral e metástases do nódulo linfático em camundongos (Chen et al., Câncer Res 65, 9004-9011 (2005); He et al., J. Natl Câncer Inst 94, 8190825 (2002); Krishnan et al., Câncer Res 63, 713-722 (2003); Lin et al., Câncer Res 65, 6901-6909 (2005)).

Sabe-se que VEGFC liga pelo menos duas famílias de recepto- res da superfície celular, os receptores de tirosina quinase e os receptores de neuropilina (Nrp).

Dos três receptores de VEGF, VEGF pode ligar VEGFR2 e VEGFR3, levando à dimerização do receptor (Shinkai et al., J Biol Chem 273, 31283-31288 (1998)), à ativação de quinase e à autofosforilação (Hel- din, Cell 80, 213-223 (1995); Waltenberger et al., J Biol Chem 269, 26988- 26995 (1994)). O receptor fosforilado induz a ativação de múltiplos substra- tos levando à angiogênese e à linfangiogênese (Ferrara et al., Nat Med 9, 669-676 (2003)).

A família da neuropilina (Nrp) é composta de duas proteínas homólogas neuropilin-1 (Nrp 1) e neuropilin-2 (Nrp2). Além dos receptores VEGF, os VEGFC também se ligam a Nrp2, que foi inicialmente identificado como um receptor de semaforina classe 3 e mediador da condução de axô- nio (Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006); Soker et al., J Cell Biochem 85, 357-368 (2002)). Linhas de evidência múltiplas implicam em Nrp2 no de- senvolvimento dos sistemas vascular e linfático. Mutantes homozigotos Nrp2 mostram uma forte redução de pequenos vasos linfáticos e capilares no pré natal (Yuan et al„ Development 129, 4797-4806 (2002)). Além disso, os de- feitos vasculares e embriônicos letais dramáticos observados no camundon- go mutante Nrpl homozigoto, são aumentados pela perda da função Nrp2 que leva à Ietalidade antecipada (Takashima et al., Proc NatIAead Sei USA 99, 3657-3662 (2002)). Entretanto, o papel de Nrp2 na modulação da biolo- gia vascular de adultos e na biologia linfática, e mais especificamente na metástase, é desconhecido.

Nrps apresentam pequenos domínios intracelulares que não são conhecidos por terem qualquer atividade enzimática ou sinalizadora. Foi proposto que Nrps funcionem para aumentar a sinalização de VEGFR atra- vés de um aumento na ligação de Iigante - receptor VEGF (Favier et al., 2006, supra-, Soker et al., 2002, supra). Adicionalmente, sema3F, o Iigante semaforina de Nrp2, mostrou modular o comportamento endotelial in vitro e in vivo, (Bielenberg et al., J Clin Invest 114, 1260-1271 (2004); Favier et al., Blood 1243-1250, (2006)). Entretanto, informações recentes sugeriram uma possibilidade alternativa de que Nrps possam funcionar independentemente dos receptores VEGF ou da função semaforina de modular a migração celu- lar endotelial (EC) (Murga et al., Blood 105, 1992-1999 (2005); Pan et al., Câncer Cell (Câncer celular) 11, 53 67 (2007); Wang et al., J. Biol. Chem 278, 48848-48860 (2003)).

Anticorpos neutralizando anti-VEGF interrompem o crescimento

de uma variedade de linhagens celulares tumorais humanas em camundon- gos nús (Kim et al., Nature 362: 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. In- vest. 95: 1789-1797 (1995); Borgstrõmlet al., Câncer Res. 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Câncer Res. 56:921-924 (1996)) e também inibem a angiogênese intraocular em modelos de distúrbios retinais isquêmicos. A- damis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996). Portanto, anticorpos mo- noclonais anti-VEGF ou seus inibidores de ação VEGF são candidatos pro- missores para o tratamento de tumores e vários distúrbios neovasculares intraoculares. Tais anticorpos são descritos, por exemplo, na EP 817 648 publicada em 14 de janeiro de 1998; e no WO 98/45331 e no WO 98/45332, ambos publicados em 15 de outubro de 1998. Um dos anticorpos anti-VEGT, bevacizumab, foi aprovado pelo FDA para uso em combinação com um re- gime quimioterápico para tratar o câncer colorretal metastático (CRC) e do câncer pulmonar celular não-sam11 (NSCLC). E bevacizumab está sendo pesquisado em muitos testes clínicos que estão sendo feitos para tratamento de várias indicações de câncer.

Outros anticorpos anti-VEGT e anticorpos anti-Nrpl também são conhecidos, e descritos, por exemplo, em Liang et al., J Mol Biol 366, 815-829 (2007); Pan et al., Câncer Cell 11, 53-67 (2007, e Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)). SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, em resul- tados experimentais obtidos com um anticorpo com função bloqueadora de alta afinidade de Nrp2. Os resultados obtidos com este anticorpo indicam que Nrp2 desempenha um papel na modulação da migração celular endote- Iial linfática (LEC) e que sua função estende-se abaixo de seu papel previa- mente designado como um aumentador da ativação receptora de VEGF. Além disso, os resultados demonstram que o bloqueio de Nrp2 leva a uma inibição da linfangiogênese e a uma redução dramática no nódulo linfático e metástase do órgão distai.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um Processo para inibi- ção da migração celular endotelial linfática, compreendendo a administração a um ser mamífero com necessidade de uma quantidade eficaz de um anta- gonista de neuropilin-2 (Nrp2).

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um Processo para inibição de linfangiogênese tumoral compreendendo a administração, a um ser mamífero que comporta um tumor, de uma quantidade eficaz de antago- nista de neuropilin-2 (Nrp2). Em todas as modalidades, o indivíduo mamífero é de preferên- cia um paciente humano, tal como um paciente humano com câncer, que pode ter sido diagosticado ou pode estar com risco de desenvolver metásta- se.

Em uma modalidade, o câncer é selecionado do grupo que con- siste em carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia.

Em um outro modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer celular escamoso, câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar não-pequeno, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma es- camoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gás- trico, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervi- cal, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou car- cinoma uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer dos rins ou renal, cân- cer do fígado, câncer da próstata, câncer vulval, câncer da tireoide, carcino- ma hepático, e vários tipos de câncer da cabeça e pescoço, linfoma da célu- la B, leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crônica; distúrbio Iinfo- proliferativo pós-transplante (PTLD), proliferação vascular anormal associa- da com facomatoses, edema associado com tumores cerebrais, e síndrome de Meig.

Ainda em um outro modalidade, o linfoma da célula B é selecio- nado do grupo que consiste em linfoma não de Hodgkin folicular de baixo grau (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL folicular de grau intermediá- rio; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de alto grau de células pequenas não- clivadas; doença de NHL volumosa ; linfoma celular do manto; linfoma relati- vo a AIDS; e macroglobulinemia de Waldenstrom.

Sem limitação, o antagonista de Nrp2 pode ser um anticorpo antí-Nrp2, incluindo anticorpos anti-Nrp2B e anti-Nrp2A, tais como, por e- xemplo os anticorpos YW68.4.2, YW68.4.2.36, YW126.20, e fragmentos e variantes, tais como suas variantes de afinidade maduras. Em um outro aspecto a invenção refere-se a um anticorpo anti- Nrp2B compreendendo a seqüência de região variável de cadeia leve e/ou pesada de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em YW68.4.2, YW 68.4.2.36, e um seu fragmento ou variante.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um anticor-

po anti-Nrp2A compreendendo as seqüências da região variável de cadeia leve e/ou pesada de YW126.20, ou um seu fragmento ou variante.

A invenção ainda refere-se a uma composição compreendendo um anticorpo de quaisquer uma das reivindicações 33-38, em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de metástase tumoral com- preendendo uma quantidade eficaz de um antagonista de Nrp2 em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outros aspectos, a invenção refere-se a antagonistas de N-

rp2 para uso na prevenção ou tratamento da metástase tumoral e o uso de antagonistas de Nrp2, tais como anticorpos de anti-Nrp2 na prevenção ou tratamento da metástase tumoral. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1. Caracterização de anti-Nrp2B mAb. (A) Representação

esquemática das regiões de ligação Sema e VEGF em Nrp2 relativo às regi- ões de epitopo de anti-Nrp2B. (B) Teste ELISA demonstrando a ligação de anti-Nrp2B a hNrp2 ECD (quadrados preenchidos) e os domínios B1-B2 de hNrp2 (círculos preenchidos), mas não hNrpl ECD (quadrados abertos) ou os domínios de A1-A2 de hNrp2 (círculos abertos). (C) Bloqueio da ligação de VEGFC a Nrp2 por anti-Nrp2B. Quantidades crescentes de mAb foram pré-incubadas em placas revestidas com Nrp2 ECD humano (5pg/ml) por 1- 2 horas, seguido de adição de VEGFC (1nM) humana biotinilada pré-titrada por 15min. A porcentagem de VEGFC ligado foi detectada por conjugados de estreptavidina-HRP. (D) Bloqueio da ligação de VEGFi6S a Nrp2 por anti- Nrp2B. (E) Bloqueio da ligação de Sema3F a LECs. LECs foram incubados com meios condicionados contendo Sema3F fundidos a fosfatase alcalina (AP) (REF), na presença de ou na ausência de um anti-Nrp2B. A atividade AP derivada da ligação Sema3F-AP ligada foi detectada colorimetricamente com os mesmos tempos de revelação. Nenhuma ligação foi observada com AP (painel esquerdo). Anti-Nrp2B não bloqueou a ligação de Sema3F aos LECs (painéis médios). Nrp2 ECD foi usado como um controle positivo para o bloqueio de ligações (painel direito). Barra de escala

Figura 2. Anti-Nrp2B reduz a função VEGFC induzida in vitro e in vivo. (A) Imagens representativas da migração de LECs manchadas em resposta a 200ng/ml de VEGFC por 18 horas na presença ou ausência de anti-Nrp2B (50 pg/ml) ou VEGFR3 ECD (50 Mg/ml). (B) Quantificação de mi- gração de LEC em resposta a 200ng/ml de VEGFC (n=6 para cada condi- ção). (C) Quantificação da migração de LEC em resposta a 10ng/ml VEGFi6S na presença ou ausência de Anti-Nrp2B (50 Mg/ml) ou VEGFR3 ECD (50 Mg/ml). N=6 para cada condição. (D) Quantificação da contagem de pixels de um ensaio de microbolsa corneal descrito em (E). *p<0,05 (E) Imagens re- presentativas de córneas manchadas com LYVE-1, ilustrando os efeitos de disposição intracorneal de péletes de 150ng de VEGFC (P) e tratamento sis- têmico com anti-Nrp2B (10mg/kg duas vezes por semana) ou VEGFR3 ECD (25mg/kg duas vezes por semana). A A coloração LYVE-1 foi pseudocolori- da de vermelho para facilitar a visualização. *p<0,05; Barras de erro repre- sentam o erro-padrão da média.

Figura 3. O tratamento com Nrp2B resulta em uma redução na ativação do receptor VEGF e inibe a formação do complexo receptor N- rp2/VEGF. (A) A análise FACS do nível de Nrp2, VEGFR2 até VEGFR3 na superfície de LEC após o tratamento com o anticorpo de controle (10 Mg/ml; linha verde) ou anti-Nrp2B (10 Mg/ml) por 5 minutos (linha azul), ou 20 horas (linha vermelha). (B) Quantificação da migração de LEC em resposta a 20ng/ml HGF na presença ou ausência de anti-Nrp2B (50 pg/ml) ou VEGFR3 ECD (50 Mg/ml). N=6 para cada condição. (C) O nível de fosforilação de VEGFR2 em LECs detectado pelo teste ELISA usando anticorpos que reco- nheceram o VEGFR2 total ou tirosina-fosforilado. VEGFC (concentração conforme observado) foi adicionado por 10 minutos na presença ou ausência de anti-Nrp2B (10 Mg/ml) ou VEGFR3 ECD (10 Mg/ml) para induzir a fosforila- ção de VEGFR2, n=3 para cada condição. O nível de fosforilação de VEG- FR2 em células tratadas com anti-Nrp2B (10pg/ml) foi significantivamente diferente da estimulação de VEGFC a 200ng/ml e consistentemente situa-se entre o nível de fosforilação induzido por 175ng/nl e 150 ng/ml de VEGFC. (D) A quantificação da migração de LEC em resposta a VEGFC (concentra- ção conforme observado) na presença ou ausência de anti-Nrp2B (10 pg/ml) ou VEGFR3 ECD (10 pg/ml). Reduções significantes na migração foram ob- servadas em 50ng/ml de VEGFC ou quando bloqueados com VEGFR3 ECD. *p<0,05; Barras de erro representam o erro-padrão da média. Cada experi- mento foi repetido no mínimo três vezes. (E) CO-IP

Figura 4. Nrp2 é expresso no sistema linfático de camundongos com tumor. (A-D) Coloração LYVE-1 (coluna esquerda - vermelha) rotulando o sistema linfático, coloração Nrp2 (coluna do meio - verde) e a camada su- perior no intestino (A) e (B) linfonódulo de um camundongo adulto normal. Sinal de Nrp2 não colocaliza com sistemas linfáticos rotulados com LYVE-1 em ambos os órgãos. Células inflamatórias raras manchadas com Nrp2 es- tão presentes dentro do núcleo fibroestromal da vilosidade intestinal e dentro dos centros germinais do linfonódulo (C) em linfonódulos dos animais por- tando tumor, o sinal Nrp2 co-localiza com LYVE-1 positivamente vasos linfá- ticos que revestem as cavidades LN. Colorações adicionais de Nrp2 de célu- las inflamatórias também estão presentes. (D) Nrp2 de forte coloração tam- bém é visto em vasos linfáticos dentro de tumores 66c14. Colorações fracas de membranas também podem ser vistas em células tumorais. No segundo dia apenas os controles manchados não mostraram qualquer sinal. Áreas encapsuladas são mostradas com grande ampliação dentro de insetos. Bar- ra de escala *** para A-C e ** para D.

Figura 5. O tratamento anti-Nrp2B resulta em uma redução da metástase pulmonar no modelo de tumor 66c14. (A) Gráfico do volume mé- dio do modelo de tumor 66c14 do estudo analisado abaixo. Animais foram tratados duas vezes por semana com 10mg/kg de anticorpos anti-Nrp2B i.p. ou sem anticorpos de controle, uma vez que os tumores alcançaram um ta- manho médio de IOOmm3 e foram dosados durante todo o estudo. (B) Quan- tificação por inspeção visual do número de nódulos metastáticos por pulmão em animais de controle e tratados com anti-Nrp2B. (C) Imagens representati- vas de pulmões de animais de controle (esquerda) e tratados com anti-Nrp2B (direita). Os pulmões foram inflados antes da fixação por perfusão ventricular cardíaca direita. Os nódulos foram realçados em branco para facilitar a visu- alização. (D, E) Renderizações tridimensionais de pulmões representativos escaneados por micro-CT demonstrando nódulos metastáticos (vermelho) em animais de controle (D) e tratados com anti-Nrp2B (E). As posições da seção longitudinal (inserção superior) e a seção transversal (inserção inferi- or) são indicados respectivamente pelas linhas pretas e vermelhas pontilha- das. Esta análise confirma que a maioria dos nódulos estão na superfície dos pulmões. (F) Quantificação do número de nódulos metastáticos por pul- mão por análise micro-CT dos pulmões. (G) Análise FACS de níveis de Nrp2 na superfície de células tumorais 66c14 cultivadas in vitro. (H) Coloração H&E de um nódulo pulmonar demonstrando células tumorais metastáticas. Barras de erro representam erro-padrão da média. Barra de escala *** para Ce** para H.

Figura 6. Tratamento anti-Nrp2B resulta em uma redução da metástase pulmonar no modelo de tumor C6. (A) Gráfico do volume médio do tumor do modelo de estudo de tumor C6 analisado abaixo. Animais foram dosados duas vezes por semana i.p. com anti-Nrp2B (10mg/kg), VEGFR3 ECD (25mg/kg) ou anticorpo de controle (10mg/kg), uma vez que os tumores alcançaram um tamanho médio de IOOmm3 e foram dosados através do es- tudo. (B) Quantificação por inspeção visual do número de nódulos metastáti- cos por pulmão dos animais de controle, tratados por VEGFR3 ECD e Anti- Nrp2B. (C) Imagens representativas de pulmões de animais do controle (es- querda), tratados com VEGFR3 ECD (médio) e Anti-Nrp2B (direito) . Pul- mões foram inflados antes da fixação por perfusão ventricular cardíaca. Nó- dulos são realçados em branco para facilitar a visualização. (D) Renderiza- ções tridimensionais de pulmões representativos escaneados por micro-CT demonstrando nódulos metastáticos (vermelho) em animais de controle (es- querda) e tratados com Anti-Nrp2B (direita). As posições da seção longitudi- nal (inserção superior) e a seção transversal (inserção inferior) são indicadas pelas linhas pretas e vermelhas pontilhadas, respectivamente. Esta análise confirma que a maioria dos nódulos estão na superfície dos pulmões. (E) Análise FACS de níveis Nrp2 na superfície de células tumorais 66c14 culti- vadas in vitro. (F) Coloração H&E de um nódulo pulmonar demonstrando células tumorais metastáticas. Barras de erro representam erro-padrão da média. Barra de escala *** para Ce** para F.

Figura 7. Tratamento Anti-Nrp2B resulta em uma redução dos vasos linfáticos tumorais. (A, B) Quantificação da densidade vascular do va- so (A) conforme detectado por PECAM-1 IHC e densidade do vaso linfático (B) conforme detectado por LYVE-1 IHC em tumores 66c14 tratados com anticorpo de controle ou anti-Nrp2B. A densidade do vaso foi determinada a partir de 6 imagens representativas de cada um dos 6 tumores por grupo, avaliada pelo número de imagens para a média do número de pixels por I- magem J. (C) Imagens representativas de vasos PECAM-1 tingidos (linha superior) e LYVE-1 vasos linfáticos tingidos (linhas média e inferior) em tu- mores C6 tratados com os anticorpos de controle(coluna esquerda), VEG- FR3 ECD (coluna do meio) ou Anti-Nrp2B (coluna da direita). As áreas em caixas delineadas na linha média estão dispostas na fileira do fundo com ampliação. Quantificação vascular (gráfico superior) e linfático (gráfico inferi- or) densidade do vaso está à direita dessas imagens. (D) Tumores mancha- dos com LYVE-1 de animais tratados com Anti-Nrp2B (painéis inferiores) co- lhidos no dia 4 (colheita 1) e dia 11 (colheita 2) demonstram a interrupção dos vasos linfáticos em comparação aos animais do controle tratados (pai- néis superiores). As datas de colheita relativas às curvas de crescimento são mostradas à esquerda. Barras de erro representam erro-padrão da média. Barra de escala ***.

Figura 8. Tratamento anti-Nrp2B resulta em uma redução dos vasos linfáticos tumorais funcionais e leva a um retardo na metástase do nódulo linfático primário. (A,B ) Micro-esferas de poliestireno fluorescentes (verde) são vistas exclusivamente em vasos linfáticos rotulados por LYVE-1 IHC (vermelho) após Iinfangiografia intradérmica. A área na caixa em A é mostrada com maior amplificação em B. (C-D). Tratamento com anti-Nrp2 resulta em uma redução de azul "evans" dentro de um tumor C6 (C) (P=0,035) e 66c14 (D) (P=0,005), indicando uma redução no sistema linfáti- co funcional nesses tumores tratados. (E) Percentagem de animais com S- LNs contendo β-gal expressando células tumorais C6 em vários pontos do tempo depois do implante de tumor nas orelhas dos camundongos de con- trole (preto) e tratados com Anti-Nrp2B (vermelho). O tratamento com Anti- Nrp2B resulta em um retardo da chegada de células em SLN (p=0,006). N=7 animais por condição de tratamento por ponto no tempo.

Figura 9. Expressão de Nrp2 em diferentes malignidades hu- manas. (A-F) Dados de Affymetrix HG-U133A e microarranjos de B Gene- Chip® para a expressão de Nrp2 no adenocarcinoma no cólon normal e co- Iorectal (A)1 tecidos normais da cabeça e pescoço e carcinoma celular es- camoso da cabeça e pescoço (B)1 pâncreas normal e adenocarcinoma pan- creático (C), pele normal e melanoma maligno (D)1 carcinoma da tireoide normal e papilar (E)1 e mama normal e adenocarcinoma dutal com infiltração em Her2 (F). Cada ponto de dado representa um paciente.

Figura 10. Seqüências de aminoácido de um anticorpo anti- Nrp2B fragmentos YW68.4.2 e YW68.4.2.36 Fab.

Figura 11. Seqüência de aminoácidos de um anticorpo anti- Nrp2A anticorpo YW126. 20 fragmento Fab.

Figura 12. Alinhamento de seqüência de domínio variável de cadeia leve do anticorpo anti-Nrp2A YW126.20 com a seqüência U1 humana. Figura 13. Alinhamento de seqüência de domínio variável de

cadeia leve anti-Nrp2A YW126.20 com o anticorpo humano Ill (hum III).

Figura 1 suplementar. Análise FACS dos níveis de receptores do eixo VEGF na superfície de LECs cultivados in vitro. A análise das FACS de Nrpl, Nrp2, VEGFR1, VEGFR2 e VEGFR3 em LECs cultivados. Figura 2 suplementar Anti-Nrp2B não bloqueia a migração in-

duzida por VEGFi65-induzida por migração. (A-B) Quantificação de HUVEC (A) e LEC (B) migrando em resposta a 200ng/ml de VEGF por 18 horas na presença de ou na ausência de Anti-Nrpl81 Anti-Nrp2B (50 pg/ml) ou ambos os anticorpos (50 pg/ml). *p<0,05; barras de erro representam erro-padrão da média.

Figura 3 suplementar. Efeitos de Anti-Nrp2B na permeabilidade vascular e profileração mediada por VEGFC e sinalização intracelular asso- ciada. (A) Quantificação da proliferação de LEC induzida por 200ng/ml de VEGFC na presença de ou na ausência de Anti-Nrp2B (50 pg/ml) ou VEG- FR3 ECD (50 pg/ml) conforme determinado por incorporação de BrdU (n=6 por condição). (B) Ensaio de permeabilidade vascular na pele de camun- dongos. Imagens foram tiradas da pele do mesmo animal. Manchas azuis representam vazamento de azul de Evan da vasculatura em resposta ao for- necimento intradérmico de VEGFC após tratamento sistêmico com Anti- Nrp2B (10mg/kg) ou VEGFR3 ECD (25mg/kg). (C) Quantificação do corante azul de Evan extraído de amostras da pele no ensaio de permeabilidade. Os valores mostraram a média de 6 experimentos independentes. *p<0,05; Bar- ras de erro representam erro-padrão da média.

Figura 4 suplementar. Anti-Nrp2B não bloqueia o colapso do cone de crescimento induzido por Sema3F. (A) Imagens de cones de cres- cimento do hipocampo E 17.5 manchados com rodamina e faloidina conju- gados. Cones de crescimento de controle mostram grandes estruturas ricas em actina na ponta de cada axônio, que são reduzidas com tratamento com Sema3F. Anti-Nrp2B (50pg/ml) não bloqueia este colapso. Em contraste, N- rp2 ECD (10 ug/ml) bloqueia este colapso. (B) Controle de qualidade para imuno-histoquímica de anti-Nrp2. A imagem mostra um clone derivado de fago que reconheceu Nrp2 que trabalha em seções de IHC em seções re- cém congeladas. A expressão da proteína Nrp2 é similar à expressão de Nrp2 conforme visto na hibridização in situ (Chen et al., Neuron 19, 547-559 (1997)). Este anticorpo foi subseqüentemente usado para IHC em seções de tumores recém-congelados. (Imagens principais da barra de escala = **pm e para imagens de insetos = **pm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições Os termos "neuropilina", "NRP" ou "Nrp" são usados intercambi- alvelmente e referem-se coletivamente a neuropilin-1 (NRP1, Nrp1), neuropi- lin-2 (NRP2, Nrp2) e suas isoformas e variantes, conforme descrito em Ros- signol et al. (2000) Genomics 70:211-222. Neuropilinas são receptores não tirosina quinase de 120 a 130 kDa. Existem variantes de encaixe (splice) múltiplas NRP-1 e NRP-2 e isoformas solúveis. A estrutura básica de neuro- pilinas compreende cinco domínios: três domínios extracelulares (a1a2, b1b2 e c), um domínio de transmembrana, e um domínio citoplasmático. O domínio a1a2 é homólogo aos componentes dos complementos C1r e C1s (CUB)1 que geralmente contêm quatro resíduos de cisteína que formam duas pontes de dissufeto. O domínio b1b2 é homólogo aos fatores de coagulação V e VIII. A porção central do domínio c é designada MAM devido a sua ho- mologia a meprina, A5 e proteínas μ do receptor de tirosina fosfatase. Os domínios a1a2 e b1b2 são responsáveis pela ligação do ligante, onde o do- mínio c é crítico para homodimerização ou heterodimerização. Gu et al. (2002) J. Bioi Chem. 277:18069-76; He e Tessier-Lavigne (1997) Cell (Cé- lula) 90:739-51.

"Atividade biológica mediada por neuropilina" refere-se em geral a eventos fisiológicos ou patológicos nos quais neuropilin-1 e/ou neuropilin-2 desempenha um papel substancial. Exemplos não-limitantes de tais ativida- des são condução de axônio durante o desenvolvimento do sistema nervoso embriônico ou regeneração de neurônios, angiogênese (incluindo a modela- gem vascular), tumorgênese e metástase tumoral.

"Atividade biológica mediada por neuropilin-2" ou "Atividade bio- lógica mediada por Nrp2,"refere-se em geral a eventos fisiológicos ou pato- lógicos nos quais Nrp2 desempenha um papel substancial, tais como, por exemplo, aumento da ativação do receptor VEGF, e, em particular, a capaci- dade de modular a migração celular endotelial (EC), papel na linfangiogêne- se adulta, especialmente linfangiogênese tumoral e metástase tumoral. O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e especifi-

camente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para mutações possíveis que ocorrem naturalmente, e que podem estar presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclo- nais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigê- nico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos (policlo- nais) convencionais que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é di- rigido contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclo- nal" indica o caráter do anticorpo conforme é obtido a partir de uma popula- ção de anticorpos substancialmente homogênea, e não deve ser considera- do como requisitando a produção do anticorpo por qualquer Processo parti- cular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem empregados de a- cordo com a presente invenção podem ser preparados pelo processo de hi- bridoma descrito primeiro por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou podem ser preparados por processos recombinantes de DNA (vide, p.ex., U.S. Pa- tent No. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isola- dos das bibliotecas dos fagos dos anticorpos usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597, por exemplo.

Os anticorpos monoclonais incluem aqui especificamente "anti- corpos quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pe- sada e/ou leve é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma clas- se ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o remanescente da(s) ca- deia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes em anticor- pos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou sub- classe de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855).

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (p.ex., mu- rinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma seqüência mínima deriva- da de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humani- zados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) no qual resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primatas não-humanos contendo a es- pecificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, a região da estrutura básica Fv dos resíduos da imunoglobulina humana (FR) são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anti- corpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontra- dos no anticorpo recipiente ou no anticorpo do doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todos ou substancial- mente todos as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imuno- globulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humani- zado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imuno- globulina humana. Para maiores detalhes, vide Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Bioi 2:593-596.

Um "anticorpo dependente da espécie" é aquele que tem uma afinidade de ligação mais forte a um antígeno de uma primeira espécie ma- mífera, do que a um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, os anticorpos dependentes das espécies "se ligam-se especificamente" a um antígeno humano (isto é tem um valor de afinidade de ligação (Kd) não maior do que cerca de 1 χ 10"7 Μ, de preferên- cia não maior do que cerca de 1 χ 10"8 M, e mais preferentemente não maior do que cerca de 1 χ 10"9 Μ) mas tem uma afinidade de ligação para um ho- mólogo do antígeno de uma segunda espécie mamífera não humana que é pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes mais fraca do que sua afinidade de ligação ao antígeno humano. As espécies que dependem do anticorpo podem ser quaisquer de vários tipos de anticorpos conforme definido acima, mas de preferência é um anticorpo humanizado ou humano.

Como usado aqui, "anticorpo mutante" ou "variante de anticor- po" refere-se a uma variante da seqüência de aminoácidos dos anticorpos dependentes das espécies onde um ou mais dos resíduos de aminoácidos dos anticorpos dependentes das espécies foram modificados. Tais mutantes necessariamente possuem menos do que 100% de identidade de seqüência ou similaridade com os anticorpos dependentes das espécies. Em uma mo- dalidade preferido, o anticorpo mutante terá uma seqüência de aminoácidos contendo pelo menos 75% de identidade de seqüência de aminoácido ou similaridade com a seqüência de aminoácido do domínio variável de cadeia leve ou pesada dos anticorpos dependentes das espécies, mais preferente- mente pelo menos 80%, mais preferentemente pelo menos 85%, mais prefe- rentemente pelo menos 90%, e mais preferentemente pelo menos 95%. I- dentidade ou similaridade no que diz respeito a esta seqüência é definido aqui como a porcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candida- ta que são idênticos (p.ex. resíduo da amostra) ou similares (p.ex. resíduo de aminoácido do grupo da amostra baseado nas propriedades comuns da cadeia lateral, vide abaixo) com os resíduos de anticorpo dependentes das espécies, depois de alinhar as seqüências e introduzir os espaços, se ne- cessário, para atingir a máxima identidade de seqüência percentual. Ne- nhuma das extensões N-terminais, C-terminais, ou internas, deleções, ou inserções na seqüência do anticorpo fora do domínio da variável deve ser considerada como afetando a identidade da seqüência ou similaridade. Um anticorpo "isolado" é o que foi identificado e separado e/ou

recuperado de um componente de seu meio ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam no diagnóstico ou usos terapêuticos, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos e não-proteináceos. Em modalidades preferidos, o anticorpo será purificado (1) em mais do que 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo Processo Lowry, e mais preferentemente mais do que 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras usando "azul Coomassie blue" ou, de preferência, coloração prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Comumente, entretanto, anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

"Domínio variável do anticorpo" refere-se às porções das cadei- as leves e pesadas das moléculas de anticorpo que incluem seqüências de aminoácido de Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs; p.ex., CDR1, CDR2, e CDR3), e Regiões da estrutura básica (Framework Regions) (FRs). Vh refere-se ao domínio da variável da cadeia pesada. Vl refere-se ao domínio variável da cadeia leve. De acordo com os processos usados nesta invenção, as posições dos aminoácidos designadas como CDRs e FRs po- dem ser definidas de acordo com Kabat (Seqüências de Proteínas de Inte- resse Imunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991)). A numeração de fragmentos de ligação de anticorpos de aminoácido ou antígenos também é feita de acordo com aquela de Kabat.

O termo "Regiões Determinantes de Complementaridade (C- DRs; p.ex., CDR1, CDR2, e CDR3) refere-se ao resto dos resíduos de ami- noácido de um domínio variável de anticorpos cuja presença se faz necessá- ria para ligar o antígeno.Cada domínio da variável possui tipicamente três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região deter- minante de complementaridade pode compreender resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" conforme definido por Kabat (por exemplo sobre resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Seqüências de Proteínas de Interesse Imunológico), 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "alça hipervariável" (p..ex. sobre resí- duos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesa- da; Chotia e Lesk (1987) J. Moi Biol. 196:901-917). Em alguns casos, uma região determinante de complementaridade pode incluir aminoácidos de am- bos uma região CDR definida de acordo com Kabat e um alça hipervariável. Por exemplo, o CDRH1 do anticorpo 4D5 de cadeia pesada inclui os amino- ácidos 26 a 35.

"Regiões de estrutura básica" (aqui posteriormente denominada FR) são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos CDR. Cada domínio variável apresenta tipicamente quatro FRs identificados como FR1, FR2, FR3 e FR4. Se os CDRs são definidos de acordo com Kabat, os resíduos FR de cadeia leve são posicionados aproximadamente nos resí- duos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), e 98-107 (LCFR4) e os resíduos FR de cadeia leve são posicionados nos resíduos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), e 103-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Se os CDRs compreendem resíduos de aminoácido de alças hiper- variáveis, os resíduos FR de cadeia leve são posicionados aproximadamen- te nos resíduos 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), e 97-107 (LCFR4), nos resíduos FR de cadeia leve e de cadeia pesada, são posicio- nados aproximadamente nos resíduos 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), e 102-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Em alguns casos, quando o CDR compreende aminoácidos de ambos um CDR confor- me definido por Kabat e aqueles de um alça hipervariável, os resíduos FR serão ajustados concordantemente. Por exemplo, quando CDRH1 inclui a- minoácidos H26-H35, os resíduos FR1 de cadeia pesada estão nas posições 1-25 e os resíduos FR2 estão nas posições 36-49.

Conforme usado aqui, "conjunto códon" refere-se a um conjunto de diferentes seqüências de tripleto de nucleotídeos usados para codificar as variantes ácidas desejadas. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sin- tetizado, por exemplo, por síntese de fase sólida, incluindo seqüências que representam todas as combinações possíveis de tripletos de nucleotídeos fornecidos pelo conjunto do códon e que codificará o grupo de aminoácidos desejado. Uma forma-padrão de designação de códon é aquela do código IUB1 que é conhecido na técnica e descrito aqui. Um conjunto de códons, tipicamente, é representado por 3 letras maiúsculas em itálico, p.ex. NNK, NNS1 XYZ, DVK e outros. Um "conjunto de códons não-randômico", confor- me usado aqui, refere-se portanto a um conjunto de códons que codifica a- minoácidos selecionados que satisfazem parcialmente, de preferência com- pletamente, os critérios de seleção de aminoácidos conforme descrito aqui. A síntese de oligonucleotídeos com a "degenerescência" dos nucleotídeos selecionados em certas posições é bastante conhecida na técnica, por e- xemplo a abordagem TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103). Tais conjuntos de oligonucleotí- deos contendo certos conjuntos de códons podem ser sintetizados usando sintetizadores de ácido nucleico comerciais (disponíveis, por exemplo, na Applied Biosystems, Foster City, CA), ou podem ser comercialmente obtidos (por exemplo, na Life Technologies, Rockville, MD). Portanto, um conjunto de oligonucleotídeos sintetisados contendo um conjunto particular de códons incluirá tipicamente uma pluralidade de oligonucleotídeos com seqüências diferentes, sendo as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códons den- tro da seqüência total. Oligonucleotídeos, se usados de acordo com a inven- ção, apresentam padrões de seqüências que permitem a hibridização a um domínio variável de ácido nucleico e também podem, mas não necessaria- mente, incluir locais de enzima de restrição úteis, por exemplo, com o propó- sito de clonagem.

Um "Fragmento Fv" é um fragmento de anticorpo que contem um local de reconhecimento e ligação de antígeno completo.Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação justa, que pode ser de natureza covalente, por exemplo em scFv. É nesta conFiguração que os três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação de antígeno na superfície do dímero Vh-Vl. Coletivamente, os seis CDRs ou um subconjunto deles conferem especificidade de ligação do antígeno com o anticorpo . Entretan- to, mesmo um domínio de variável única (ou metade de um Fv compreen- dendo somente três CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar antígenos, apesar de normalmente com uma afinidade de ligação mais baixa do que todo o local de ligação.

O fragmento "Fab" contém uma variável e domínio constantes da cadeia leve e um domínio variável e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 compreendem um par de fragmentos Fab que estão, geralmente, covalentemente ligados próximo às suas terminações carbóxi por meio de cisteínas de articulação entre eles. Outras ligações químicas de fragmentos de anticorpos também são conheci- das na técnica.

Fragmentos de anticorpos "Fv" de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios Vh e Vl de anticorpo, onde esses domínios estão presentes em uma cadeia de polipetídeo única. Geralmente o polipeptídeo Fv ainda compreende um Iigante polipeptídeo entre os domínios Vh e VL, que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Mono- clonal Antibodies (A Farmacologia dos Anticorpos Monoclonais), Vol 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos pequenos de anti- corpos com dois locais de ligação de antígenos, cujos fragmentos compre- endem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH e VL). U- sando um Iigante que seja muito pequeno para permitir a associação em pares entre dois domínios da mesma cadeia, os domínios sao forçados a formar par com os domínios complementares de outra cadeia e a criar dois locais de ligação de antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, na EP 404,097; WO 93/11161; e por Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448.

A expressão "anticorpos lineares" refere-se a anticorpos descri- tos em Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). Resumidamente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd tandem (Vh-ChI- Vh-ChI ) que, junto com polipeptídeos complementares de cadeia leve, for- mam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Conforme empregado aqui, "biblioteca" refere-se a uma plurali- dade de seqüências de anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exem- plo, polipeptídeos da invenção), ou aos ácidos nucleicos que codificam es- sas seqüências, que são diferentes na combinação de aminoácidos varian- tes introduzidos nessas seqüências segundo os processos de acordo com a invenção.

"Exibição de fagos" é uma técnica na qual polipeptídeos varian-

tes são dispostos como proteínas de fusão para pelo menos uma porção de proteína de revestimento na superfície, p.ex., partículas de fagos filamento- sos. Uma utilidade da exibição de fagos está no fato de que grandes biblio- tecas de variantes de proteína randomizadas podem ser rápida e eficazmen- te ordenadas para aquelas seqüências que se ligam a um antígeno-alvo com alta afinidade. A exposição das bibliotecas de peptídeos e proteínas em fa- gos foi empregada para monitorar milhões de polipeptídeos para uns com propriedades específicas de ligação. Processos de exposição de fagos poli- valentes têm sido usados para expor pequenos polipeptídeos randômicos e pequenas proteínas através de fusões tanto para os genes Ill ou genes Vlll de fagos filamentosos. Wells e Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362, e referências citadas aqui. Em uma exposição de fagos monova- lentes, uma biblioteca de proteína ou peptídeo é fundida em um gene Ill ou uma porção dele, e expresso a baixos níveis na presença de proteínas do gene Ill do tipo selvagem, de modo que as partículas de fagos expõem uma cópia ou não expõem nenhuma cópia das proteínas de fusão. Os efeitos da avidez relativo aos fagos polivalentes são reduzidos, de modo que a seleção é à base de afinidade intrínseca e vetores de fagemídeo são usados, o que simplifica as manipulações de DNA. Lowman e Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology (Processo Um companheiro para Pro- cessos em Enzimologia) 3:205-0216.

Uma "fagemídeo" é um vetor de plasmídeo contendo uma ori- gem bacteriana de replicação, p.ex., Co1E1, e uma cópia de uma região in- tergênica de um bacteriófago. O fagemídeo pode ser empregado em qual- quer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófagos filamentosos e bacte- riófagos lambdoides. O plasmídeo, em geral, também conterá um marcador selecionável para a resistência antibiótica. Segmentos de DNA clonados nesses vetores podem ser propagados como plasmídeos. Quando células que abrigam esses vetores são fornecidas com todos os genes necessários para a produção de partículas de fago, o modo de replicação dos plamídeos muda para replicação tipo "círculo girante" para gerar cópias de um filamento do DNA do plasmídeo e pacotes de partículas de fago. O fagemídeo pode formar partículas de fago infecciosas ou não -infecciosas. Este termo inclui fagemídeos que contêm um gene de proteína de revestimento de fago, ou fragmento dele, ligado a um gene de polipeptídeo heterólogo como uma fu- são de genes, tal que o polipeptídeo heterólogo está disposto na superfície da partícula de fago.

O termo "vetor de fago" significa uma forma replicativa de duplo filamento de um bacteriófago contendo um gene heterólogo e capaz de re- plicação. O vetor de fago tem uma origem de fago de replicação permitindo a replicação de fago e a formação de partículas de fago. O fago é de preferên- cia um bacteriófago filamentoso, tal como um fago M13, f1, fd, Pf3 ou um derivado dele, ou um fago Iambdoide tal como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc., ou um derivado dele.

Conforme usado aqui, "posição acessível pelo solvente" refere- se a uma posição de um resíduo de aminoácido nas regiões variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo fonte ou fragmento de ligação de antígeno que é determinado, baseado na estrutura, conjunto de estruturas e/ou estrutura modelada do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, como potencialmente disponível para o acesso de solvente e/ou contato com uma molécula, tal como um antígeno específico de anticorpo. Essas posi- ções são tipicamente encontradas nos CDRs e no exterior da proteína. As posições acessíveis pelo solvente de um fragmento de ligação de um anti- corpo ou antígeno, conforme definido aqui, podem ser determinadas usando qualquer número de algoritmos conhecidos na técnica. De preferência, posi- ções acessíveis pelo solvente são determinadas usando coordenadas de um modelo tridimensional de um anticorpo, de preferância usando um programa de computador tal como o programa Insightll (Accelrys, San Diego, CA). Po- sições acessíveis pelo solvente também podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica, (por exemplo, Lee e Richards (1971) J. Mol. Biol 55, 379 e Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548). A determinação das posições acessíveis pelo solvente pode ser realizada por meio de um software apropriado para modelagem e informação estrutural tridimensional obtida de um anticorpo. O software que pode ser utilizado para esses propó- sitos inclui o software SYBYL Biopolimer Module (Tripos Associates). Geral- mente e preferentemente, onde um algoritmo (programa) requer um parâme- tro de tamanho de entrada do usuário, o "tamanho" de uma amostra que é empregada no cálculo é ajustado em cerca de 1,4 Angstrom ou menos de raio. Além disso, a determinação das regiões acessíveis pelo solvente e pro- cessos de área usando o software para computadores pessoais foi descrito por Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386.

Um "fator ou agente angiogênico" é um fator de crescimento que estimula o desenvolvimento de vasos sangüíneos, por exemplo, promotor de angiogênese, crescimento celular endotelial, estabilidade de vasos sangüí- neos e/ou vasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos, incluem, mas não estão limitados a, p.ex., VEGF e membros da família VEGF, PIGF, PDGF, família do fator de crescimento fibroblástico (FGFs), Iigantes TIE (an- giopoietinas), efrinas, Del-1, fatores de crescimento fibroblástico: (aFGF) ácido e (bFGF) básico, folistatina, fator estimulador da colônia de granulóci- tos (G-CSF), fator de crescimento de hepatócitos (HGF) /fator de dispersão (SF), interleuquina-8 (IL-8), leptina, midkina, neuropilinas, fator de cresci- mento placental, fator de crescimento endotelial celular derivado de plaque- tas (PD-ECGF), fator de crescimento derivado das plaquetas, especialmente PDGF-BB ou PDGFR-beta, pleiotrofina (PTN), progranulina, proliferina, fator- alfa de crescimento transformador (TGF-alpha), fator-beta de crescimento transformador (TGF-beta), fator-alfa de necrose tumoral (TNF-alfa), etc. Ele também incluiria fatores que aceleram a cura de feridas, tais como o hormô- nio do crescimento, fator -I de crescimento similar à insulina (IGF-I), VIGF, fator de crescimento epidermal (EGF)1 CTGF e membros de sua família, e TGF-alfa e TGF-beta. Vide também, p.ex., Klagsbrun e D'Amore (1991) An- nu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit e Detmar (2003) Oncogene 22:3172- 3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (p.ex., Tabela 1 listagem de fatores angio- gênicos conhecidos); e, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206.

Um "agente antiangiogênese" ou "inibidor de angiogênese" refe- re-se a uma substância de peso reduzido molecular, um polinucleotídeo, um polipeptídeo, uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticor- po, ou conjugados ou suas proteínas de fusão, que inibem a angiogênese, vasculogênese ou permeabilidade vascular indesejável, tanto diretamente quanto indiretamente. Deveria ser compreendido que o agente antiangiogê- nese inclui aqueles agentes que ligam e bloqueiam a atividade angiogênica do fator angiogênico ou seu receptor. Por exemplo, um agente antiangiogê- nico é um anticorpo ou outro antagonista ao agente angiogênico conforme definido acima, por exemplo, anticorpos de VEGF-A ou do receptor VEGF-A (p.ex., receptor de KDR ou receptor de Flt-1), inibidores anti-PDGFR tais como Gleevec® (Imatinib Mesylate). Agentes antiangiogênese também inclu- em inibidores de angiogênese nativos, por exemplo, angiostatina, endostati- na, etc. Vide, p.ex., Klagsbrun e D1Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217- 39; Streit e Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (p.ex., Tabela 3 listando uma terapia antiangiogênica em melanoma maligno); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549- 6556 (p.ex., Tabela 2 listando fatores antiangiogênicos conhecidos); e, Sato (2003) Int. J. Clin. OncoL 8:200-206 (p.ex., Tabela 1 listando agentes antian- giogênicos usados em avaliações clínicas).

O termo "VEGF" ou "VEGF-A" como empregado aqui refere-se ao fator de crescimento celular endotelial vascular humano aminoácido 165 e aos fatores de crescimento celular endotelial vascular humano correlatos aminoácido 121, aminoácido 189, e aminoácido 206, conforme descrito por Leung et al. (1989) Science 246:1306, e Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806, junto com as suas formas alélicas e processadas que ocorrem natu- ralmente. O termo "VEGF" refere-se também aos VEGFs de espécies não- humanas tais como camundongo, rato ou primatas. Algumas vezes o VEGF de uma espécie específica são indicados por termos tais como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, e etc. O termo "VEGF" também é usado para se referir a formas truncadas do polipeptídeo compreendendo aminoácidos 8 até 109 ou 1 até 109 do fator de crescimento celular endoteli- al vascular humano aminoácido 165. Referências a quaisquer formas de VEGF podem ser identificadas no presente pedido de patente, p.ex., por "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)" ou "VEGF165." As posições aminoácidas para um VEGF nativo truncado são numeradas conforme indicado na se- qüência de VEGT nativa. Por exemplo, aminoácido posição 17 (metionina) em VEGF nativo truncado está também na posição 17 (metionina) em VEGF nativo. O VEGT nativo truncado tem uma afinidade de ligação para o KDR e receptores Flt-1 comparáveis a VEGF nativo.

Um "anticorpo anti-VEGF" também é um anticorpo que se liga a VEGF com afinidade e especificidade suficientes. De preferência, o anticor- po anti-VEGF da invenção pode ser usado como um agente terapêutico al- vejando e interferindo em doenças e condições onde a atividade de VEGF está envolvida. Um anticorpo anti-VEGF usualmente não se ligará a outros homólogos de VEGF tais como VEGF-B ou VEGF-C, nem outros fatores de crescimento tais como PIGF, PDGF ou bFGF. Um anticorpo anti-VEGF pre- ferido é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epitopo que o anti- corpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709. Mais ρ referente mente o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo mono- clonal anti-VEGF recombinante humanizado gerado de acordo com Presta et al. (1997) Câncer Res. 57:4593-4599, incluindo mas não-limitado ao anticor- po conhecido como bevacizumab (BV; Avastin®).

O anticorpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", também conhecido como "rhuMAb VEGF" ou "Avastin®, é um anticorpo monoclonal anti-VEGF recombinante humanizado gerado de acordo com Presta et al. (1997) Cân- cer Res. 57:4593-4599. Ele compreende regiões de estrutura básica IgGIIt humana mutadas e regiões determinantes de complementaridade de liga- ção com antígenos do anticorpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloqueia a ligação ao VEGF humano a seus receptores. Aproximada- mente 93% da seqüência de aminoácido de Bevacizumab, incluindo a mai- oria das regiões de estrutura básica, é derivada do IgGI humano e cerca de 7% da seqüência é derivada do anticorpo murino A4.6.1. Bevacizumab tem uma massa molecular de cerca de 149.000 dáltons e é glicosilada.

Os termos "VEGFC" e "VEGF-C" são usados intercambiavel- mente, e referem-se a polipeptídeos humanos aminoácidos 419 (SwissProt: VEGFC_HUMAN P49767), e seus ortólogos mamíferos não-humanos, pri- meiramente descritos por Joukov et al., EMBO J 15, 290-98 (1996), e EM- BOJ 15, 1751 (1996).

O termo"antagonista de Nrp2" é usado aqui para se referir a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, abrogar, reduzir ou in- terferir na capacidade de Nrp2 ára ,pdiçar a migração celular endotelial linfá- tica (EC), ou linfangiogênese adulta, especialmente linfangiogênese tumoral e metátase tumoral.

Um "antagonista VEGF" refere-se a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, abrogar, reduzir ou interferir com atividades de VEGF incluindo, mas não-limitado a sua ligação com um ou mais receptores de VEGF. Antagonistas de VEGF incluem, sem limitação, anticorpos anti- VEGF e seus fragmentos de ligação com antígenos, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente a VEGF seqüestrando assim sua ligação a um ou mais receptores, anticorpos de receptor de anti-VEGF e an- tagonistas de receptor de VEGF tais como inibidores de moléculas pequenas das VEGFR tirosina quinases. O termo "antagonista VEGF," conforme usado aqui, inclui especificamente moléculas, incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpos, outros polipeptídeos de ligação peptídeos, e moléculas pequenas não peptídicas, que se ligam a neuropilin-1 e/ou neuropilin-2 (Nrp-1 e/ou Nrp-2) e são capazes de neutralizar, bloquear, inibir, abrogar, reduzir ou in- terferir com as atividades VEGF incluindo, mas não-limitado a, anticorpos anti-Nrpl e anti-Nrp2 e anticorpos de reação cruzada com Nrpl e Nrp2, já que eles são capazes de neutralizar, bloquear, inibir, abrogar, reduzir ou in- terferir com as atividades VEGF. Assim, o termo "atividades VEGF" especifi- camente inclui atividades biológicas mediadas por neuropilin (conforme aci- ma definido) de VEGF.

Um "antagonista de semaforina" refere-se a uma molécula ca- paz de neutralizar, bloquear, inibir, abrogar, reduzir ou interferir com as ativi- dades de semaforina incluindo, mas não-limitado a, sua ligação com um ou mais receptores de semaforina. Antagonistas de semaforina incluem, sem limitação, anticorpos de antissemaforina e seus fragmentos de ligação de antígeno, moléculas receptoras e derivados que se ligam especificamente a semaforina seqüestrando assim sua ligação a um ou mais receptores, recep- tor de antissemaforina e antagonistas de receptor de semaforina tais como inibidores de molécula pequena de semaforinas. O termo "antagonista de semaforina," como usado aqui, especificamente inclui moléculas, incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpos, outros polipeptídeos de ligação, peptí- deos e moléculas pequenas de não-peptídeos, que se ligam a neuropilin-1 e/ou neuropilin-2 (Nrp-1 e/ou Nrp-2) e são capazes de neutralizar, bloquear, inibir, abrogar, reduzir ou interferir com atividades de semaforina incluindo mas não-limitado a anticorpos de anti-Nrpl e anti-Nrp2 e anticorpos de rea- ção cruzada com Nrpl e Nrp2, já que eles são capazes de neutralizar, blo- quear, inibir, abrogar, reduzir ou interferir com as atividades de semaforina. Assim o termo "atividades de semaforina" inclui especificamente atividades biológicas mediadas por neuropilina (conforme definido aqui acima) de se- maforinas da classe 3. Tais atividades biológicas incluem, por exemplo, efei- to inibidor de crescimento de neurita durante o desenvolvimento do sistema nervoso embriônico e regeneração dos neurônios.

"Tratamento" refere-se a ambos o tratamento terapêutico e profi- lático ou medidas preventivas. Aqueles com necessidade de tratamento in- cluem aqueles já com distúrbio bem como aqueles nos quais o distúrbio de- ve ser evitado.

A "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria de um tal tratamento. Por exemplo, mamíferos que sofrem de ou necessitam de profi- Iaxia contra angiogênese anormal (angiogênese excessiva, inapropriada, ou não-controlada) ou permeabilidade vascular. Isto inclui distúrbios agudos ou crônicos incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífe- ro ao distúrbio em questão. Exemplos não-limitantes de distúrbios a serem tratados aqui incluem tumores malignos e benignos; não-leucemias e malig- nidades linfoides; e, em particular, metástase tumoral (câncer).

Os termos "câncer" e "cancerosos" referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não-controlado. Exemplos de câncer incluem mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. E- xemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer celular escamo- so, câncer de pulmão (incluindo câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não-pequena, adenocarcinoma do pulmão, e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou câncer de estômago (incluindo câncer gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer de fíga- do, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colorretal, endometrial ou carcinoma uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer dos rins ou renal, câncer de fígado, câncer da próstata, câncer vulval, câncer da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como o linfoma da célula B (incluindo linfoma de baixo grau /linfoma folicular não de Hodgkin1S (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL folicular de grau intermediário; NHL intermediário de grau difuso; NHL de alto grau imunoblástico; NHL não-clivado de alto grau linfoblástico; NHL celular não-clivado pequeno de alto grau; doença volumosa de NHL; Iinfoma de manto celular; Iinfoma relativo a AIDS; e macroglobulinemia de Waldens- trom); leucemia Iinfocitica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio Iinfo- proIiferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anor- mal associada a facomatoses, edema (tais como aqueles associados a tu- mores cerebrais), e síndrome de Meig.

O termo "composição antineoplástica" refere-se a uma composi- ção [util no tratamento do câncer compreendendo pelo menos um agente terapêuticamente ativo, por exemplo, "agente anticâncer". Exemplos de a- gentes terapêuticos (agentes anticâncer) incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, agentes quimioterápicos, agentes inibidores do crescimento, agentes citotóxicos, agentes usados na terapia por radiação, agentes anti- angiogênese, agentes apoptóticos, agentes antitubulínicos, e outros agentes para tratamento de câncer, tais como anticorpos anti-HER-2, anticorpos anti- CD20, um antagonista de receptor de fator do crescimento epidérmico (EG- FR) (p.ex., um inibidor de tirosina quinase), inibidor HER1/EGFR (p.ex., erlo- tinib (Tarceva®), inibidores do fator de crescimento derivados de plaquetas (p.ex., Gleevec® (lmatinib Mesilato)), um inibidor de COX-2 (p.ex., celeco- xib), interferons, citoquinas, antagonista(s) receptor(es) (p.ex., anticorpos neutralizadores) que se ligam uns com os outros, ou mais dos seguintes al- vos ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BIyS, APRIL, BCMA ou VEGF, TRAIL/Apo2, e outros agentes químicos bioativos e orgânicos, etc. Suas combinações também estão incluídas na invenção.

O termo "agente citotóxico" conforme usado aqui refere-se a uma substância que inibe ou evita a função celular e/ou causa a destruição de células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, I1311 |125 y9o e agentes quimioterápicos e toxinas, tais como toxinas enzi-

maticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra- tamento do câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem um com- posto químico útil no tratamento do câncer. Exemplos de agentes quimiote- rápicos incluem agentes de alquilação tais como o thiotepa e CITOXAN ® ciclofosfamida; sulfonatos de alquila tais como bussulfan, improssulfan e pi- possulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquone, meturedopa, e ure- dopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretaminas, trietilenomela- minas, trietilenofosforamidas, trietilenotiofosforamidas e trimetilolmelaminas; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinonas); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duo- carmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleutero- bina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitro- gênio tais como clorambucila, cloronafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloroetamina, hidrocloreto de oxido de mecloretamina, melfa- lan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, Iomus- tina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de ene- dina (p.ex.., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamai I e cali- queamicina omegaM (vide, p.ex., Agnew (1994) Cem Intl. Ed. Engl. 33:183- 186); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodrona- to; uma esperamicina; bem como cromóforos de neocarzinostatina e cromó- foros antibióticos enediinas cromoproteínas correlatas), aclacinomisinas, ac- tinomicina, autramicina, azaserine, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinais, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA® doxorubicin (inclu- indo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino- doxorubicina e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, no- galamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamici- na, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zi- nostatina, zorubicina; antimetabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pterop- terina, trimetrexato; purina análogos tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina tais como an- citabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxi- fluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios tais como calusterone, propio- nato de dromostanolone, epitiostanol, mepitiostane, testolactone; antiadre- nais tais como aminoglutetimida, mitotane, trilostane; reabastecedores de ácido fólico, tais como ácido frolínico; aceglatone; aldofosfamida glicosideo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; datraxa- to; defofamina; demecolcine; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; um epotilone; etoglucidio; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; mai- tansinoides tais como maytansine e ansamitocinas; mitoguazone; mitoxan- trone; mopidanmol; nitraerina; pentostatin; fenamet; pirarubicina; Iosoxantro- ne; ácido podofilínico; 2- etil-hidrazida; procarbazine; PSK® complexo de polissacarídeo (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rizoxina; si- zofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mi- tobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinoside ("Ara-C"); ciclo- fosfamida; tiotepa; taxoides, p.ex., TAXOL® paclitaxel (Bristol- Myers Squibb Oncology1 Princeton1 N.J.), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartícula de paclitaxel albumina-engenheirada (American Pharmaceuti- cal Partners, Schaumberg1 Illinois), e TAXOTERE® doxetaxel (Rhône- Pou- Ienc Rorer, Antony, França); cloranbucil; GEMZAR® gemcitabina; 6- tiogua- nina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxan- trone; vincristine; NAVELBINE® vinorelbine; novantrone; teniposide; edatre- xate; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (Campto- sar, CPT-11) (incluindo o regime de tratamento de irinotecano com 5-FU e leucovorina); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluormetilornitina (DM- FO); retinoides tais como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leu- covorina (LV); oxaliplatina, incluindo o regime de tratamento com oxaliplatina (FOLFOX); inibidores de PKC-alpha, Raf1 H-Ras1 EGFR (p.ex., erlotinib (Tarceva™)) e VEGF-A que reduz a proliferação celular e sais farmaceuti- camente aceitáveis, ácidos ou derivados de quaisquer elementos acima.

Também estão incluídos nesta definição agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibira ação hormonal em tumores tais como anti- estrogênio e moduladores de receptor de estrogênio seletivos (SERMs)1 in- cluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX® tamoxifeno), ralo- xifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristone, e FARESTON- toremifeno; inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimidas, ME- GASE® acetato de megestrol, AROMAS IN® exemestano, formestanie, fa- drozola, RIVISOR® vorozola, FEMARA® letrozola, e ARIMIDEX® anastrozo- la; e antiandrogenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, Ieuproli- da, e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo de 1,3-dioxolana nu- cleosídeo citosina); oligonucleotídeos de anti-sentido, particularmente aque- les que inibem a expressão de genes na sinalização de caminhos que impli- cam na proliferação celular aberrante tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras; ribozimas tais como um inibidor de expressão de VEGF (p.ex., ri- bozima ANGIOZYME®) e um inibidor de expressão HER2; vacinas tais co- mo vacinas para terapia genética, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, va- cina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inibidor 1 de to- poisomerase LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; Vinorelbina e esperami- cinas (vide U.S. Pat. No. 4.675.187), e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de quaisquer um dos acima.

O termo "pró-fármaco" conforme usado neste pedido de patente refere-se a um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceuti- camente ativa que é menos tóxica para células tumorais se comparado ao medicamento parental e é capaz de ser ativado ou convertido enzimatica- mente em uma forma parental mais ativa. Vide, p.ex., Wilman (1986) "Pro- drugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615° Encontro entre Belfast e Stella et al. (1985). "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Deiivery, Bor- chardt et al, (e<±), pp. 247-267, Humana Press. Os pré-fármacos desta in- venção incluem, mas não estão limitados a, prefármacos contendo fosfato, prefármacos contendo tiofosfatos, prefármacos contendo sulfatos, prefárma- cos contendo peptídeos, prefármacos modificados por aminoácido D, pre- fármacos glicosilados, prefármacos contendo β-lactama, prefármacos con- tendo fenóxiacetamidas opcionalmente substituídas ou prefármacos conten- do fenilacetamidas opcionalmente substituídas, 5-fluorcitosinas e outros pre- fármacos de 5-fluoruridinas que podem ser convertidos no medicamento livre de citotóxicos mais ativo. Exemplos de medicamentos citotóxicos que podem ser derivados de uma forma de pró-fármaco para uso nesta invenção inclu- em, mas não estão limitados àqueles agentes quimioterápicos descritos a- cima.

Uma "molécula pequena" é definida aqui como tendo um peso molecular abaixo de cerca de 500 Dáltons.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ela está comumente associada na fonte natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nu- cleico isolada está em forma ou ajuste diferente daquela que é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas, portanto, são distintas das moléculas de ácido nucleico como elas existem nas células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que exprime normalmente o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localidade cromossomal diferente daquela das células naturais.

A expressão "seqüências de controle" refere-se a seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificadora opera- velmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As seqüências de controle que são apropriadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação de ribossoma. Células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de poliadeniliação e intensificadores. Ácido nucleico é "ligado operavelmente" quando ele é colocado em uma relacionamento funcional com outra seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretório está ligado operavelmente a DNA para um polipeptídeo se ela é expressa como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou in- tensificador está ligado operavelmente a uma seqüência codificadora se ele afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossoma está ligado operavelmente a uma seqüência codificadora se ele está posicionado de modo a facilitar a translação. Geralmente, "ligado operavelmente" signifi- ca que as seqüências de DNA ligadas estão contíguas, e, no caso de um líder secretório, contíguo e na fase de leitura. Entretanto, intensificadores não têm que ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de restri- ção convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores oligonucleotí- deos sintéticos ou Iigantes são usados de acordo com a prática convencio- nal.

Conforme usado aqui, as expressões "célula," "linha celular," e "cultura celular" são usadas intercambiavelmente e todas essas designações incluem progênie. Portanto, as palavras "transformantes" e "células trans- formadas" incluem a célula individual primária e culturas derivadas delas sem dizer respeito ao número de transferências. Também compreende-se que nem toda a progênie é precisamente idêntica no teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progênies mutantes que têm a mes- ma função ou atividade biológica que a monitorada para a célula original- mente transformada estão incluídas. Sempre que significados distintos forem pretendidos, ficará claro a partir do contexto. Modalidades da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção é baseada nos dados ex- perimentais que demonstram que a função bloqueadora Nrp2 inibe a metás- tase tumoral.

Uma chave no processo de múltiplas etapas envolve o egresso de uma célula tumoral da massa tumoral primária. Para tumores sólidos, o sistema linfático freqüentemente fornece uma via para as células de partida. VEGF é sabidamente um modulador chave para a linfangiogênese e metás- tase em muitos modelos tumorais, e a inibição do eixo VEGF é considerada uma estratégia promissora para inibir o desenvolvimento da metástase. An- tes da presente invenção, não tinha sido atribuído à Nrp2, um coreceptor de VEGFC, um objetivo de inibição da metástase tumoral, possivelmente devido à falta de imperfeições no sistema linfático de camundongos mutantes adul- tos Nrp2.

Os estudos fundamentados na presente invenção, que são a- presentados nos exemplos abaixo, sustentam um papel importante de Nrp2 na linfangiogênese e metástase tumoral, somente em parte por modulação da sinalização de VEGFR3. Adicionalmente, os dados indicados nos exem- plos demonstram a presença de vasos linfáticos tumorais funcionais dentro de tumores e mostram que o tratamento com anti-Nrp2B resulta em uma re- dução dessas vias linfáticas funcionais.

Funções VEGFC seletivas reguladas por Nrp2. em parte através de um me- canismo de ativação independente do receptor VEGF

Indução da migração e proliferação celular são duas das fun- ções celulares centrais de VEGFC descritas até hoje (Joukov et al., Embo J 16, 3898-3911 (1997)). Portanto, a presente descoberta de que bloqueando Nrp2 com Anti-Nrp2B bloqueou-se a migração de LEC mas não a prolifera- ção (figura 2, 3) foi surpreendente. Esta seletividade foi recentemente repor- tada em experimentos de combate (knockdown) com Nrp2 siRNA, mas foi atribuída a limitações técnicas experimentais (Favier et al., Blood 108, 1243- 1250 (2006)). Os dados apresentados aqui mostram que a seletividade fun- cional de Nrp2's também foi notada in vivo, onde o tratamento anti-Nrp2B resultou em uma redução de linfangiogênese devida a VEGFC mas não a uma permeabilidade vascular (figura 2, 3). Essas observações sugerem que a inibição com anti-Nrp2B não funciona simplesmente por disrupção da sina- lização de VEGFC. Entretanto, foi determinado que o bloqueio de Nrp2 re- sultou em uma redução modesta no receptor de fosforilação VEGF (figura 3) suportando um mecanismo onde um dos papéis de Nrp2 é o de aumentar a função receptora de VEGF. Isto levantou a possibilidade de diferentes even- tos fisiológicos induzidos por VEGFC poderem requerer diferentes níveis de ativação do receptor VEGF. Assim, um decréscimo na ativação do receptor pode ser suficiente para afetar a migração, mas não a proliferação ou per- meabilidade vascular.

Para testar isto, a resposta da dosagem de VEGFC do receptor de fosforilação VEGF foi comparada com a resposta de dosagem da migra- ção LEC (figura 3). Doses de VEGFC que levam a um nível de receptor de fosforilação equivalente àquele visto com o tratamento com Anti-Nrp2B não reduziram ou inibiram a migração. Isto indicou que o decréscimo na ativação do receptor sozinho não contou para a função de efeitos de bloqueio de Anti- Nrp2B.

Por esse motivo, outros mecanismos foram investigados, pelos quais o bloqueio de Nrp2 pode afetar seletivamente a migração tal como modulação da adesão ou motilidade. O tratamento anti-Nrp2B não teve ne- nhum efeito na adesão mediada por LEC ou migração induzida por VEGFi6S (figura 2), HGF (figura 3) ou FGF-2, indicando que ele em geral não afetou a migração por disrupção da motilidade. Adicionalmente, foi proposto que se- ma3F, outro Iigante de Nrp2, possa modular LEC ou a migração de EC, a- gindo como um quimiorepelente (Bielenberg et al., J Clin Invest 114, 1260- 1271 (2004); Favieretal., Blood (Sangue) 108, 1243-1250 (2006)). Entretan- to, o anticorpo Anti-Nrp2B não inibiu ou potencializou a ligação de sema3F a Nrp2 (figura 1) ou os efeitos funcionais de sema3F em neurônios de respos- ta (figura 4 suplementar). Portanto, é improvável que a redução em VEGFC induzindo a migração por Anti-Nrp2B possa ser explicada por modulação na função sema3F.

O efeito de Anti-Nrp2B na formação do complexo receptor de Nrp2/VEGF também foi avaliado. Em contraste com Nrp1, Nrp2 forma um complexo com VEGFR2 e VEGFR3 na ausência do Iigante (Favier et al., 2006, supra: Karpanen et al., FasebJ 20, 1462-1472 (2006)). É importante o fato de que Anti-Nrp2B iniba fortemente a formação desses complexos. Esta observação, além do fato de que Nrp2 é significante por mais do que apenas o aumento da função receptora de VEGF, suporta um modelo no qual Nrp2 fornece funcionalidade adicional à migração especificamente modulada, po- tencialmente transportando um maquinário adicional ao complexo receptor VEGF.

Nrp2 desempenha um papel importante na modulação da linfangiogênese adulta.

Análise de camundongos Nrp2 KO demonstra que Nrp2 é um modulator do desenvolvimento da linfangiogênese, presumilvelmente via seu papel como um coreceptor VEGFC (Yuan et al., 2002, supra). Entretanto, esses camundongos mutantes formam linfáticos funcionais após o nasci- mento, indicando que tanto o defeito representa um retardo ao invés da ini- bição do crescimento linfático ou que há compensação funcional por outro mediador molecular. Portanto, o papel de Nrp2 na manutenção de vias linfá- ticas maduras e modulação de linangiogênese adulta não era conhecido. A análise da expressão (figura 4) não suporta o papel de Nrp2 na manutenção das vias linfáticas. De modo interessante, Nrp2 é fortemente expresso nas vias linfáticas que estão presentes em tumores e dentro dos LNs adjacentes aos tumores, sugerindo que Nrp2 pode desempenhar um papel nas vias lin- fáticas ativadas ou vias linfáticas em crescimento. Observações in vitro de- monstram que Anti-Nrp2B ié uma ferramenta eficaz na avaliação do papel de Nrp2 nesses processos. Portanto, Anti-Nrp2B foi testado in vivo usando o ensaio microbolsa corneal (figura 2). Anti-Nrp2B eficazmente bloqueou a lin- fangiogênese induzida por VEGFC, surpreendentemente equivalentemente a VEGFR3 ECD. De modo interessante, Anti-Nrp2B demonstrou função inibi- dora seletiva in vivo, mas, falhou em afetar a permeabilidade vascular indu- zida por VEGFC. Isto corresponde às observações in vitro de que Nrp2 es- pecificamente modula a migração, um processo importante para a linfangio- gênese, mas dificilmente desempenha um papel na permeabilidade vascular. Finalmente, esses animais adultos normais tratados com anti-Nrp2B demons- traram quaisquer mudanças nas vias linfáticas intestinais, confirmando que Nrp2 não desempenha um papel na manutenção das vias linfáticas madu- ras. A inibição de Nrp2 leva a uma redução nas vias linfáticas funcionais dentro do tumor e a uma redução na metástase -inibindo as células tumorais de sair da massa tumoral principal por vias linfáticas.

A inibição do eixo VEGFC, mais comumente pelo uso de VEG- FR3 ECD1 é uma das estratégias mais comumente utilizada para redução da metástase (Chen et al., 2005. supra; He et al., 2002, supra; Krishnan et al., 2003, supra; Lin et al., 2005, supra). VEGFC pode facilitar a metástase po- tencialmente por iniciação de linfangiogênese, aumentando assim a área de superfície das células tumorais em contato com LECs, modulando as propri- edades adesivas LEC ou expressão de citoquinas ou pelo aumento da per- meabilidade vascular (Alitalo e Carmeliet, Câncer Cell 1, 219-227 (2002)). Como Anti-Nrp2B modula as funções seletivas mediadas por VEGFC incluin- do a inibição de linfangiogênese adulta induzida por VEGFC, a seguir os e- feitos do bloqueio de Nrp2 na metástase foram investigados. Para minimizar variáveis confundíveis e para avaliar de forma não ambígua o papel de Anti- Nrp2B na metástase, pega-se modelos onde o bloqueio de Nrp2 não afeta o crescimento do tumor primário e ainda sacrifica-se todos os animais no mesmo espaço de tempo no estudo (Withers e Lee, Semin Radiat Oncol 16, 111-119(2006)).

Em ambos os 66c14 bem como nos modelos de tumor C6, o tratamento Anti-Nrp2B resultou em uma redução significante dos nódulos pulmonares metastáticos por inspeção visual (figura 5, 6). Isto foi confirmado pela microtécnica CT mais sensível e quantitativa (Li et al., Technol Câncer Res Treat 5, 147-155 (2006)). Comparação dos tratamentos com Anti-Nrp2B e VEGFR3 ECD não foi possível em tumores 66c14 devido a uma redução no tamanho do tumor primário com tratamento com VEGFR3. Entretanto, esta análise foi conduzida em tumores C6 já que seu tamanho não foi afeta- do pelo tratamento com VEGFR3 ECD. Como com o ensaio de microbolsa corneal (corneal micropocket assay), o tratamento com Anti-Nrp2B resultou em um bloqueio equivalente de metástase, quando comparado a VEGFR3 ECD. Análise histológica do tumor primário indicou que não foi prima- riamente afetados pelas células tumorais. Assim, avalia-se as duas vias po- tenciais metastáticas que estavam disponível para células tumorais: vasos sangüíneos e vasos linfáticos (figura 7). Tratamento com anti-Nrp2B não afe- tou a estrutura ou densidade dos vasos sangüíneos. Baseado nos dados in vitro e no microbolsa corneal in vivo, houve uma hipótese de que o bloqueio de Nrp2 deveria resultar em uma redução das vias linfáticas tumorais. O tra- tamento anti-Nrp2B reduziu dramaticamente a densidade das vias linfáticas, e novamente, a um grau equivalente ao tratamento com VEGFR3 ECD. En- tretanto, esses dois tratamentos diferem na morfologia das vias linfáticas resultantes. O tratamento com VEGFR3 ECD levou à formação de redes linfáticas esparsas alinhadas por células linfáticas de aparência linfática não saudável. O tratamento Anti-Nrp2B, por outro lado, levou ao desenvolvimento de vasos curtos e bolsas de células linfáticas com aparência saudável isola- das. Essas diferenças ainda suportam um modelo onde Nrp2 não age sim- plesmente para aumentar a ativação do receptor VEGF, mas também traz funcionalidade única para mediar a biologia de VEGFC. Esses resultados também demonstram que, para os paradigmas experimentais testados, Anti- Nrp2B age inibindo a linfangiogênese (figura 7). Entretanto, não se pode descartar o fato de que anti-Nrp2B também destrói vasos linfáticos mais es- tabelecidos dentro dos tumores.

Também busca-se determinar se as vias linfáticas intratumorais eram funcionais e, portanto, competentes em facilitar a metastase. Linfangi- ografia foi usada para identificar vias linfáticas intratumorais funcionais (figu- ra 8). A técnica usada não foi adequadamente analítica para determinar a proporção das vias linfáticas que eram funcionais. Entretanto, elas represen- tam uma pequena fração da população linfática total (Padera et al., Mol Ima- ging 1, 9-15 (2002)). Já que era possível reduzir a densidade linfática total enquanto economizávamos os vasos funcionais ( que pode ter sensibilidade diferente a Anti-Nrp2B), avalia-se os efeitos do bloqueio de Nrp2 na formação de vasos linfáticos funcionais. Anti-Nrp2B reduziu a formação de vasos fun- cionais, ligando assim mais diretamente os efeitos nas vias linfáticas tumo- rais com a redução observada na metástase.

Finalmente, para confirmar a conseqüência da redução das vias linfáticas funcionais, os efeitos de Anti-Nrp2B na metástase para SLN foram avaliados. O SLN é o primeiro tecido que as células tumorais encontram de- pois de sair do tumor por vias linfáticas. Portanto, ele representa uma das etapas iniciais na metástase em órgão distante (Stracke e Liotta, In Vivo 6, 309-316 (1992)). Como previsto, o tratamento com Anti-Nrp2B resultou em um retardo no desenvolvimento da micrometástase de SLN, consistente com a idéia de que poucas células estavam efluindo da massa tumoral primária. Isto é consistente com a evidência de que VEGFC aumenta a metástase induzindo hiperplasia linfática e aumenta o fornecimento de células cancero- sas aos linfonódulos (Hoshida et al., Câncer Research 66, 8065-8075 (2006)). Assim, o peso da evidência aponta um mecanismo pelo qual o blo- queio de Nrp2 leva a uma redução nas vias linfáticas funcionais do tumor, evitando assim que células tumorais iniciem o processo metastático de sair da massa tumoral primária. Nrp2 como um alvo de metástase.

Numerosos estudos clinico-patológicos reportaram que a ex- pressão de VEGFC e VEGFR3 correlacionam metástase de nódulos linfáti- cos e metastase distai em uma série de cânceres humanos (extensamente revisto em Stacker et al., Nat Rev Câncer,2002, supra; Stacker et al., Faseb J, 2002, supra, e He et al., 2004, supra). Entretanto, há uma informação limi- tada relativa à expressão de Nrp2 e sua relação com a metástase. De fato, só foram feitas ligações (links) entre a expressão de Nrp2 e malignidade, particularmente no câncer pancreático (Cohen et al., Biochem Biophys Res Commun 284, 395-403 (2001); Fukahi et al., Clin Câncer Res 10, 581-590 (2004)) e câncer de pulmão (Kawakami et al., Câncer 95, 2196-2201 (2002); Lantuejoul et al., J Pathol 200, 336-347(2003)). Encontrou-se similarmente que Nrp2 foi expresso em altos níveis se comparado com seus respectivos tecidos de controle, não somente no carcinoma pancreático, mas também no adenocarcinoma do cólon, carcinoma celular escamoso da cabeça e pesco- ço, melanoma, carcinoma papilar tiroidal e adenocarcinoma dutal da mama infiltrado (figura 9). Ainda mais importante, quando esses tumores foram subdivididos em grupos metastáticos e não-metastáticos, notou-se que a expressão de Nrp2 era estatisticamente maior no grupo metastático na maio- ria desse tipo de tumores. Interessantemente, todos esses tipos de tumor confirmaram linfangiogênese intratumoral, que além disso foi correlacionada com metástase dos Iinfo nódulos (Achen et al., 2006, supra\ Achen e Stacker, Int J Câncer 119, 1755-1760 (2006)). Isto indica que as descobertas experimentais discutidas possam ser extendidas a pacientes humanos com uma variedade de tipos de tumor.

Concluindo, os dados discutidos aqui e apresentados nos e- xemplos abaixo mostram que Nrp2 desempenha um papel na modulação de VEGFC levando à migração celular e fornecendo evidência de que Nrp2 po- de agir através de um mecanismo múltiplo incluindo o aumento da ativação do receptor VEGF e mecanismos independentes de sinalização do receptor VEGF. Adicionalmente, o bloqueio da função Nrp2 usando anti-Nrp2B resulta em uma redução dramática de linfangiogênese induzida por VEGFC em ca- mundongos adultos. Este tratamento também resulta em uma redução da metástase, provavelmente através de uma redução no desenvolvimento das vias linfáticas funcionais. Esses dados, junto com análise da expressão de Nrp2 em uma série de tumores humanos, sugere que Nrp2 é um alvo válido para modular a metástase. Produção de Anticorpos Anti-Nrp2

A invenção aqui inclui a produção e uso de anticorpos anti- NRP2. Métodos de exemplo para geração de anticorpos são descritos em maior detalhe nas seções seguintes.

Anticorpos anti-NRP2 são selecionados usando um antígeno NRP2 derivado de uma espécie mamífera. De preferência o antígeno é N- RP2 humano (hNRP2). Entretanto, NRP2s de outras espécies tais como NRP2murino (mNRP2) também podem ser usadas como o antígeno alvo. Os antígenos NRP2 de várias espécies mamíferas podem ser isolados de fontes naturais. Em outros modalidades o antígeno é produzido recombinantemente ou preparado usando outros processos sintéticos conhecidos na técnica.

O anticorpo selecionado terá normalmente uma afinidade sufici- entemente forte ao antígeno NRP2. Por exemplo, o anticorpo pode ligar hN- RP2 a um valor Kd de não mais de cerca de 5 nM, de preferência não mais do que cerca de 2 nM, e mais preferentemente não mais do que cerca de 500pM. Afinidades de anticorpos podem ser determinadas por um ensaio baseado na ressonância de superfície de plásmon (tais como os ensaios BIAcore conforme descrito nos Exemplos); ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA); e ensaios de competição (p.ex. RIA's), por exemplo.

Também, o anticorpo pode estar sujeito a outros ensaios de ati- vidade biológica, por exemplo, para avaliar a efetividade como uma substân- cia terapêutica. Tais ensaios são conhecidos na técnica e dependem do an- tígeno alvo e uso pretendido para o anticorpo. Exemplos incluem o ensaio de inibição HUVEC (conforme descrito nos exemplos abaixo); ensaios de inibi- ção do crescimento celular tumoral (conforme descrito em WO 89/06692, por exemplo); ensaios de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e ensaios de citotoxicidade mediada pelo complemento (CDC) (Patente US 5.500.362); e atividade agonística ou ensaios hematopoiéticos (vide WO 95/27062).

Para monitorar anticorpos que se ligam a um epitopo particular no antígeno de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tais como aqueles descritos em Antibodies, A Laboratory Manual, (Anticorpos, Um Ma- nual de Laboratório) Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado. Alternativamente, o mapeamento de epitopos, p.ex. conforme descrito em Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:1388- 1394, pode ser realizado para determinar se o anticorpo se liga a um epitopo de interesse.

Geração de Anticorpos Anti-NRP2 a partir de uma Biblioteca de Anticorpos Sintéticos

Em uma modalidade preferida, os anticorpos anti-NRP2 são se- lecionados usando uma abordagem única de exibição de fagos. A aborda- gem envolve a geração de bibliotecas de fagos de anticorpos sintéticos ba- seado em um padrão único de estrutura principal, projeto de diversidades suficientes dentro de domínios variáveis, disposição de polipeptídeos con- tendo os domínios de variável diversificados, seleção de anticorpos candida- tos com alta afinidade ao antígeno NRP alvo, e isolamento dos anticorpos selecionados.

Detalhes dos métodos de exibição de fagos podem ser encon- trados por exemplo na W003/102157 publicada em 11 de dezembro de 2003.

Em um aspecto, as bibliotecas de anticorpos podem ser geradas por mudança das posições acessíveis pelo solvente e/ou altamente diversas em pelo menos um CDR de um domínio variável de anticorpo. Alguns ou todos os CDRs podem ser mudados usando os métodos fornecidos aqui. Em alguns modalidades, pode ser preferível gerar diversas bibliotecas de anti- corpo mudando as posições em CDRH1, CDRH2 e CDRH3 para formar uma biblioteca única ou mutando as posições em CDRL3 e CDRH3 para formar um uma biblioteca única ou mudando as posições em CDRL3 e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 para formar uma biblioteca única.

Uma biblioteca de domínios variáveis de anticorpos pode ser gerada, por exemplo, contendo mutações nas posições acessíveis pelo sol- vente e/ou altamente diversas CDRH1, CDRH2 e CDRH3. Outra biblioteca pode ser gerada contendo mutações em CDRL1, CDRL2 e CDRL3. Essas bibliotecas também podem ser usadas em conjunto umas com as outras pa- ra gerar Iigantes de afinidades desejadas. Por exemplo, após uma ou mais etapas de seleção de bibliotecas de cadeia pesada para ligar a um antígeno alvo, uma biblioteca de cadeia leve pode ser substituída na população de Iigantes de cadeia pesada por outras etapas de seleção para aumentar a afinidade dos ligantes.

De preferência, uma biblioteca é criada por substituição de ami- noácidos originais com variantes de aminoácidos na região CDRH3 da regi- ão variável da seqüência de cadeia pesada. A biblioteca resultante pode conter uma pluralidade de seqüências de anticorpos, onde a diversidade da seqüência está primariamente na região da seqüência de cadeia pesada.

Em um aspecto, a biblioteca é criada no contexto da seqüência 4D5 do anticorpo humanizado, ou na seqüência da estrutura principal dos aminoácidos da seqüência 4D5 do anticorpo humanizado. De preferência, a biblioteca é criada por substituição de pelo menos resíduos 95-1 OOa da ca- deia pesada com aminoácidos codificados pelo conjunto de códons DVK, onde o conjunto de códons DVK é usado para codificar um conjunto de vá- rios aminoácidos para cada uma dessas posições. Um exemplo de um con- junto de oligonucleotídeos que é útil para a criação dessas substituições compreende a seqüência (DVK)7. Em alguns modalidades, é criada uma bi- blioteca por substituição de resíduos 95-1 OOa com aminoácidos codificados por ambos os conjuntos de códons DVK e NNK. Um exemplo de um oligo- nucleotídeo que é útil para criação dessas substituições compreende a se- quência (DVK)6 (NNK). Em outro modalidade, é criada uma biblioteca por substituição de pelo menos 95-100a resíduos com aminoácidos codificados por ambos os conjuntos de códons DVK e NNK. Um exemplo de um conjun- to de oligonucleotídeos que é útil para a criação dessas substituições com- preende a seqüência (DVK)5(NNK). Outro exemplo de um conjunto de oligo- nucleotídeos que é útil para criação dessas substituições compreende a se- qüência (MVK)6. Outros exemplos de seqüências de oligonucleotídeos apro- priadas podem ser determinados por um versado na técnica de acordo com os critérios descritos aqui.

Em um outro modalidade, diferentes projetos de CDRH3 são utilizados para isolar Iigantes de alta afinidade e para isolar Iigantes para uma variedade de epitopos. A faixa dos comprimentos de CDRH3 gerada nesta biblioteca é de 11 até 13 aminoácidos, apesar de também poderem ser gerados diferentes comprimentos destes. A diversidade de H3 pode ser expandida pelo uso de conjuntos de códons NNK, DVK e NVK1 bem como uma diversidade mais limitada na terminação N e/ou C.

A diversidade também pode ser gerada em CDRH1 e CDRH2. Os projetos das diversidades de CDR-H1 e H2 seguem a estratégia de atin- gir uma imitação do repertório de anticorpos naturais conforme descrito com modificação que tem como alvo a diversidade que se mais aproxima da di- versidade natural do projeto anterior.

Para diversidade em CDRH3, diversas bibliotecas podem ser construídas separadamene com diferentes comprimentos de H3 e depois combinadas para selecionar Iigantes para os antígenos alvo. As múltiplas bibliotecas podem ser agrupadas e selecionadas usando uma seleção de suporte sólida e métodos de seleção de solução conforme descrito anterior- mente e aqui abaixo. Estratégias múltiplas de seleção podem ser empre- gadas. Por exemplo, uma variação envolve a seleção do alvo ligado a um sólido, seguido pela seleção de um rótulo (tag) que pode estar presente no polipeptídeo de fusão (por exemplo um rótulo anti-gD tag) e seguido por ou- tra seleção do alvo ligado a sólido. Alternativamente, as bibliotecas podem ser selecionadas primeiro em um alvo ligado a uma superfície sólida, os Ii- gantes eluidos são então selecionados usando uma ligação de fase em so- lução com concentrações decrescentes de antígeno alvo. Utilizando combi- nações de diferentes métodos de seleção obtem-se uma minimização da seleção apenas das seqüências altamente expressas e obtem-se uma sele- ção de um número de diferentes clones com alta afinidade. Ligantes de alta afinidade para o antígeno alvo NRP2 podem ser

isolados das bibliotecas. Limitando-se a diversidade na região H1/H2 dimi- nui-se a degenerescência em cerca de 104 a 105 vezes, e permitindo-se maior diversidade H3 obtem-se mais Iigantes de alta afinidade. Utilizando-se bibliotecas com tipos diferentes de diversidade em CDRH3 (p.ex. utilizando DVK ou NVT) obtem-se o isolamento de Iigantes que podem se ligar a dife- rentes epitopos de um antígeno alvo.

Dos Iigantes isolados das bibliotecas ligadas em pool conforme descrito acima, verificou-se que a afinidade pode ser ainda mais aperfeiçoa- da fornecendo uma diversidade limitada na cadeia leve. Diversidade de ca- deia leve é gerada nesta modalidade conforme se segue na posição 28 de CDRL1: aminoácído 28 é codificado por RDT; a posição do aminoácido 29 é codificada por RKT; a posição de aminoácido 30 é codificada por RVW; a posição de aminoácido 31 é codificada por ANW; a posição de aminoácido 32 é codificada por THT; opcionalmente, a posição de aminoácido 33 é codi- ficada por CTG ; em CDRL2: a posição de aminoácido 50 é codificada por KBG; a posição de aminoácido 53 é codificada por AVC; e opcionalmente a posição de aminoácido 55 é codificada por GMA; em CDRL3: a posição de aminoácido 91 é codificada por TMT ou SRT ou ambos; a posição de ami- noácido 92 é codificada por DMC; a posição de aminoácido 93 é codificada por RVT; a posição de aminoácido 94 é codificada por NHT; e a posição de aminoácido 96 é codificada por TWT ou YKG ou ambos. Em um outro modalidade, é gerada uma biblioteca ou bibliote-

cas com diversidade nas regiões CDRH1, CDRH2 e CDRH3. Nesta modali- dade, a diversidade em CDRH3 é gerada usando uma variedade de com- primentos das regiões H3 e usando principalmente conjuntos de códons XYZ e NNK ou NNS. Bibliotecas podem ser formadas usando olígonucleotídeos individuais e reunidas em "pool", ou os olígonucleotídeos podem ser reuni- dos em "pool" formando um subconjunto de bibliotecas. Nas bibliotecas des- te modalidade pode-se fazer uma triagem de sólidos ligados ao alvo. Pode ser feita uma triagem de clones isolados de múltiplos tipos quanto à especifi- cidade e afinidade usando testes ELISA. Para maior especificidade, pode ser feita uma triagem dos clones segundo os antígenos alvo desejados bem co- mo outros antígenos não-alvo. Pode ser feita uma triagem daqueles Iigantes do antígeno alvo NRP1 quanto à afinidade em um teste ELISA de competi- ção de solução de ligação ou teste de competição no ponto. Ligantes de alta afinidade podem ser isolados da biblioteca utilizando conjuntos de códons XYZ preparados conforme descrito acima. Esses Iigantes podem ser pron- tamente produzidos como anticorpos ou fragmentos de ligação de antígenos em alto rendimento em cultura celular.

Em alguns modalidades, pode ser desejável gerar bibliotecas com maior diversidade de comprimentos na região CDRH3. Por exemplo, pode ser desejável gerar bibliotecas com regiões CDRH3 variando de cerca de 7 até 19 aminoácidos. Ligantes de alta afinidade isolados das bibliotecas desses mo- dalidades são prontamente produzidos em cultura de bactérias e célula eu- cariótica em alto rendimento. Os vetores podem ser projetados para remover prontamente seqüências como rótulos gD, seqüência de componente de pro- teína de revestimento viral, e/ou para adicionar em seqüências de região constantes, a produção de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de ligação de antígeno em alto rendimento.

Uma biblioteca com mutações em CDRH3 pode ser combinada com uma biblioteca contendo versões variantes dos outros CDRs1 por e- xemplo CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 e/ou CDRH2. Portanto, por exem- plo, em uma modalidade, uma biblioteca CDRH3 é combinada com uma bi- blioteca CDRL3 criada no contexto do anticorpo 4D5 humanizado com ami- noácidos variantes nas posições 28, 29, 30,31, e/ou 32 usando conjuntos de códons predeterminados. Em outro modalidade, uma biblioteca com muta- ções para o CDRH3 pode ser combinada com uma biblioteca compreenden- do as variantes CDRH1 e/ou CDRH2 dos domínios variáveis de cadeia pe- sada. Em uma modalidade, a biblioteca CDRH1 é criada com a seqüência de anticorpos 4D5 humanizada com aminoácidos variantes nas posições 28, 30, 31, 32 e 33. Uma biblioteca CDRH2 pode ser criada com a seqüência de anticopor 4D5 humanizada com aminoácidos variantes nas posições 50, 52, 53, 54, 56 e 58 usando os conjuntos de códons predeterminados. Anticorpos Mutantes Anti-NRP2

O anticorpo anti-NRP2 gerado das bibliotecas de fagos pode ser ainda modificado para gerar anticorpos mutantes com aperfeiçoadas propri- edades físicas, químicas e ou biológicas sobre o anticorpo parente. Onde o teste usado é um teste de atividade biológica, o anticorpo mutante de prefe- rência tem uma atividade biológica no ensaio da escolha que é pelo menos cerca de 10 vezes melhor, de preferência pelo menos cerca de 20 vezes melhor, mais preferentemente pelo menos cerca de 50 vezes melhor, e al- gumas vezes pelo menos cerca de 100 vezes ou 200 vezes melhor do que a atividade biológica do anticorpo parente naquele ensaio. Por exemplo, um mutante de anticorpo anti-NRP1 de preferência tem uma afinidade de liga- ção para NRP que é pelo menos cerca de 10 vezes mais forte do que, de preferência pelo menos cerca de 20 vezes mais forte, mais preferentemente pelo menos 50 vezes mais forte, e algumas vezes pelo menos cerca de 100 vezes ou 200 vezes mais forte, do que a afinidade de ligação do anticorpo anti-NRP.

Para gerar o anticorpo mutante, uma ou mais alterações dos aminoácidos (p.ex. substituições) são introduzidas em uma ou mais das re- giões hipervariáveis do anticorpo parente. Alternativamente, ou em adição, uma ou mais alterações (por exemplo substituições) de resíduos da região da cadeia principal podem ser introduzidos no anticorpo parente onde esses resultam em um aperfeiçoamento na afinidade de ligação do anticorpo mu- tante para o antígeno da segunda espécie de mamíferos. Exemplos de resí- duos da região da estrutura principal a serem modificados incluem aqueles que ligam antígenos diretamente não covalentemente (Amit et al. (1986) Science 233:747-753); interagem com/efetuam a conformação de um CDR (Chotia et al. (1987) J. Mol. Biol 196:901-917); e/ou participam na interface de Vl - Vh (EP 239 400B1). Em certos modalidades, a modificação de um ou mais de tais resíduos da estrutura principal de tal região resulta em um au- mento da afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno da segunda es- pécie de mamíferos. Por exemplo, de cerca de um até cerca de cinco resí- duos da estrutrura principal podem ser alterados neste modalidade da inven- ção. Algumas vezes, isto pode ser suficiente para produzir um anticorpo mu- tante apropriado para uso em triagens pré-clínicas, até mesmo onde nenhum dos resíduos da região hipervariável foram alterados. Normalmente, entre- tanto, o anticorpo mutante compreenderá alteração(ões) hipervariável(is) adicional(is).

Os resíduos da região hipervariável que são alterados podem ser modificados randomicamente, especialmente onde a afinidade de ligação de partida do anticorpo parente é tal que pode-se fazer prontamente a tria- gem de tais anticorpos mutantes randomicamente produzidos.

Um procedimento útil para a geração de tais anticorpos mutan- tes é denominada "mutagênese de varredura de alanina" (Cunningham e Wells (1989) Science 244:1081-1085). Aqui, um ou mais resíduo(s) da regi- ão hipervariável são substituídos por resíduo(s) de alanina ou polialanina para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno da segunda espécie de mamíferos. Aquele(s) resíduo(s) da região hipervariável que demons- tra(m) sensibilidade funcional adicional às substituições, depois são refina- dos por introdução de mais ou outras mutações nos sítios de substituição. Portanto, enquanto o sítio para introdução de uma variação na seqüência de aminoácido é predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita ser predeterminada. É feita uma triagem dos mutantes produzidos desta maneira quanto à sua atividade biológica conforme descrito aqui.

Normalmente se iniciaria com uma substituição conservadora tal como aquelas mostradas abaixo sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em uma mudança na atividade biológica (p.ex. afinidade de ligação), então mudanças mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na tabela que se segue ou ainda descrito mais abaixo com referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e é feita a triagem dos produtos.

Substituições preferidas:

Resíduo Original Substituições Exemplares Substituições Preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gln; asn Iys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gli (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg IIe(I) leu; vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norieucina; ile; vai; met; ile ala; phe Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

Modificações ainda mais substanciais nas propriedades biológicas dos anticorpos são obtidas por meio de seleção das substituições que diferem significativamente em seu efeito na manutenção de (a) a estrutura da cadeia principal de polipeptídeos na área de substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos baseados em propriedades comuns das cadeias laterais :

(1) hidrófobo: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr, asn, gln;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gli, pro; e

(6) aromático: trp, tyr, phe.

Substituições não-conservantes englobarão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

Em outro modalidade, os sítios selecionados para modificação são maturados por afinidade usando uma exibição de fagos (vide acima).

Moléculas de ácido nucleico que codificam seqüências mutantes de aminoácido são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estão limitados à mutagênese mediada por oligonucleotídeos (ou sítio direcionadas), mutagênese PCR, e mutagênese de cassette de um mutante anteriormente preparado ou uma versão não-mutante do anticorpo parente. O método preferido para preparar mutantes é mutagênese sítio direcionada, (vide, p.ex., Kunkel (1985) Proc. NatL Acad. Sei. USA 82:488).

Em certos modalidades, o anticorpo mutante só terá um único resíduo da região hipervariável substituído. Em outros modalidades, dois ou mais dos resíduos do anticorpo parente da região hipervariável terão sido substituídos, por exemplo, de cerca de dois até cerca de dez substituições da região hipervariável.

Normalmente, o anticorpo mutante com propriedades biológicas aperfeiçoadas terá uma seqüência de aminoácido contendo pelo menos 75% de identidade de seqüência de aminoácido ou similaridade com a seqüência de aminoácido de domínio variável de cadeia tanto pesado ou leve do anti- corpo parente, mais preferentemente pelo menos 80%, mais preferentemen- te pelo menos 85%, mais preferentemente pelo menos 90%, e mais prefe- rentemente pelo menos 95%. A identidade ou similaridade no que refere-se a esta seqüência é definida aqui como a porcentagem dos resíduos de ami- noácido na seqüência candidata que são idênticos (isto é, o mesmo resíduo) ou similares (isto é resíduo de aminoácido do mesmo grupo baseado nas propriedades de cadeia colateral comum, vide acima) com os resíduos do anticorpo parente, após alinhamento das seqüência e introdução de espa- ços, se necessário, para atingir a máxima identidade percentual. Nenhuma das extensões, deleções ou inserções N-terminais, C-terminais ou internas na seqüência do anticorpo fora do domínio variável deve ser considerada como afetando a identidade ou similaridade da seqüência.

Em seguida à produção do anticorpo mutante, a atividade bioló- gica daquela molécula relativa ao anticorpo parente é determinada. Confor- me observado acima, isto pode envolver a determinação da afinidade de ligação e/ou outras atividades biológicas do anticorpo. Em um modo preferi- do da invenção, um painel de anticorpos mutantes é preparado e é feita a triagem por afinidade de ligação do antígeno tal como NRP1 ou um seu fragmento. Um ou mais dos anticorpos mutantes selecionados a partir desta triagem inicial são opcionalmente submetidos a um ou mais outros ensaios de atividade biológica para confirmar que o(s) anticorpo(s) mutante(s) com afinidade de ligação aumentada são de fato úteis, por exemplo para estudos pré-clínicos.

O(s) anticorpo(s) mutante(s) assim selecionados podem ser submetidos a outras modificações, muitas vezes dependendo do uso pre- tendido do anticorpo. Tais modificações podem envolver maior alteração da seqüência de aminoácidos, fusão com polipeptídeo(s) heterólogo(s), e/ou modificações covalentes, tais como aquelas elaboradas abaixo. No que refe- re-se às alterações da seqüência de aminoácidos, modificações exemplares são elaboradas acima. Por exemplo, qualquer resíduo de cisteína não envol- vido na manutenção da conformação própria do anticorpo mutante também pode ser substituída, geralmente com serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativa da molécuila e evitar a ligação cruzada aberrante. Contrariamente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionadas() ao anticorpo para aper- feiçoar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv). Outro tipo de mutante de aminoáci- do tem um padrão de glicosilação alterado. Isto pode ser conseguido por deleção de uma ou mais parcelas de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada tanto a N quanto a O. Ligada a N refere-se à ligação da parcela de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo, asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto proli- na, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da par- cela de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de ambas essas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada a O, refere-se à ligação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidróxiamino- ácido, mais comumente serina ou treonina, apesar de também poder ser usado 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxil lisina. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida por alteração da seqüência de aminoácidos tal que ela contenha uma ou mais das seqüência dos tripeptí- deos acima descritos (sítios de glicosilação ligados a Ν). A alteração tam- bém pode ser feita pela adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina, à seqüência do anticorpo original (sítios de glicosila- ção ligados a O).

Vetores, células hospedeiras e Processos recombinantes

Anticorpos anti-Nrp2 de acordo com a invenção podem ser pro- duzidos de forma recombinante, através de técnicas e materiais prontamente obteníveis.

Para a produção recombinante de um anticorpo anti-NRP2, o ácido nucleico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável pa- ra clonagem subsequente (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA que codifica o anticorpo é prontamente isolado ou sintetizado empregando procedimentos convencionais (p.ex., através do emprego de amostras de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos DNAs que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados por, um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal, uma ori- gem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento realçador, um promotor, e uma seqüência de terminação de transcrição.

(i) Componente de seqüência de sinal

O anticorpo de acordo com a invenção pode ser produzido de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como um poli- peptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, o qual é de preferência uma seqüência de sinal ou outro polipeptídeo contendo um sítio específico de clivagem na terminação-N da proteína madura ou polipeptídeo. A se- qüência de sinal heteróloga selecionada de preferência é uma que é reco- nhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a seqüência de sinal de anticorpo nativo, a seqüência de sinal é substituída por uma seqüência de sinal procariótica selecionada, por exem- plo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes de enteroto- xina Il estáveis ao calor. Para secreção de levedura, uma seqüência de sinal nativa pode ser substituída por, p.ex., o líder de invertase de levedura, líder de fator α (inclusive líderes de fator α Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líderes de fosfatase ácida, o líder de glucoamilase C. albicans, ou o sinal descrito na WO 90/13646. Na expressão celular de mamíferos, seqüência de sinais de mamíferos assim como líderes de secreção viral, por exemplo, o sinal dD de herpes simplex, sao disponíveis.

O DNA para tal região precursora é ligado na estrutura principal de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

(ii) Origem do componente de replicação

Ambos os vetores de expressão e clonagem contêm uma se- qüência de ácidos nucleicos que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Em geral, na clonagem de vetores essa seqüência é uma que permite que o vetor se replique independente- mente do DNA cromosomal hospedeiro, e inclui origens da replicação ou seqüências que se replicam de forma autônoma. Tais seqüências são bem conhecidas de uma variedade de bactérias, leveduras, e vírus. A origem da replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo 2μ é apropriada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para clonagem de vetores em células de mamíferos. Em geral, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usada apenas porque ela contem o promotor precoce).

(iii) Componente do gene de seleção

Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência contra antibióticos ou outras toxinas, p.ex., ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críti- cos não-disponíveis a partir de meios complexos, p.ex., o gene que codifica racemase D-alanina para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de seleção emprega um medica- mento para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Essas cé- lulas que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produ- zem uma proteína que confere resistência ao medicamento, e portanto so- brevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante empre- gam os medicamentos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células com competência para remover o ácido nucleico do anticorpo, tal como DH- FR, timidina quinase, metalotioneínas I e II, de preferência genes de metalo- tioneína de primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção DHFR são primeiramente identificadas por culturação de todos os transfor- mantes em um meio de cultura que contem metotrexato (Mtx), um antagonis- ta competitivo com DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando se emprega DHFR de tipo selvagem, é a linha de ovário de Hamster chinês (CHO), deficiente em atividade de DHFR.

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospe- deiros de tipo selvagem que contém DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com anticorpo que codifica seqüências de DNA, proteína DHFR de tipo selvagem, e um outro marcador selecionável tal como amino- glicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimen- to celular em um meio contendo um agente de seleção para o marcador se- lecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, p.ex., canamicina, neo- micina, ou G418. Vide Patente U.S. No. 4.965.199.

Um gene de seleção apropriado para uso em levedura é o gene írpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al. (1979) Na- ture 282:39). O gene trpl fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura com carência de capacidade para crescer em triptofa- no, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85:12. A presença da lesão frp1 no genoma da célula hospedeira da levedura então proporciona um ambiente efetivo para detectar a transformação por cresci- mento na ausência de triptofano. Similarmente, cepas de levedura deficien- tes em Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que carregam o gene Leu2.

Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular de 1,6 pm pKD1 podem ser empregados para a transformação de leveduras Kluyve- romyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi reportada para K. Iactis. Van den Berg (1990) Bio/Technology 8:135. Vetores estáveis multicó- pia de expressão para secreção de albumina de soro humano recombinante madura por cepas industriais de Kluyveromyces também foram decritas. Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9:968-975.

(iv) Componente promotor

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um pro- motor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operacionalmen- te ligado ao ácido nucleico do anticorpo. Promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas de pro- motor de β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp), e promotores híbridos tais como o promotor tac. Entretanto, outros promotores bacterianos conhecidos são apropriados. Promotores pa- ra uso em sistemas bacterianos também conterão uma seqüência de Shine- Dalgarno (S.D.) operavelmente ligada ao DNA que codifica o anticorpo.

Seqüências de promotor são conhecidas para eucariotes. Virtu- almente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente a 25 até 30 bases a montante do sítio onde a transcrição se inicia. Outra seqüência encontrada 70 até 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na terminação 3' da maioria dos genes eucarióticos há uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli A para a terminação 3' da seqüência de codificação. Todas essas seqüên- cias são apropriadamente inseridas nos vetores de expressão eucariótica. Exemplos de seqüências de promoção apropriadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofructoqui- nase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quina- se, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase, e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis com a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isoci- tocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com metabo- lismo de nitrogênio, metalotioneina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores apropriados para o emprego em expressão de levedura são ain- da mais descritos em EP 73,657. Realçadores de leveduras também são vantajosamente empregados com promotores de levedura.

Transcrição de anticorpo de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como vírus polioma, vírus "fowlpox", adenovírus (tal como Ade- novírus 2), vírus papiloma bovino, vírus sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite-B e mais preferidamente Vírus Simian 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, p.ex., o promotor de acti- na ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, contanto que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são obtidos con- venientemente como um fragmento de restrição SV40 que também contem a origem viral SV40 da replicação. O promotor precoce imediato do citomega- lovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para a expressão de DNA em hospedeiros mamíferos empregando o vírus de papiloma bovino como um vetor é descrito na Paten- te U.S. No. 4.419.446. Uma modificação desse sistema é descrito na U.S. Patent No. 4.601.978. Vide também Reyes et al. (1982) Nature 297:598-601 sobre a expressão de cDNA β-interferon humano em células de camundon- go sob o controle de um promotor de timidina quinase do vírus de herpes simplex. Alternativamente, a repetição do terminal longo do vírus de sarcoma rous pode ser empregada como o promotor.

(v) Componente de elemento realçador

Transcrição de um DNA que codifica o anticorpo de acordo com esta invenção por eucariotas mais elevados é freqüentemente aumentada através da inserção de uma seqüência realçadora no vetor. Muitas seqüên- cias realçadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteina, e insulina). Tipicamente, entretanto, será empregado um realçador de uma célula eucariótica de vírus. Exemplos in- cluem o realçador SV40 no lado tardio da origem da replicação (bp 100-270), o promotor realçador citomegalovírus precoce, o realçador polioma no lado tardio da origem da replicação, e os realçadores de adenovírus. Vide tam- bém Yaniv (1982) Nature 297:17-18 sobre elementos realçadores para ati- vação de promotores eucarióticos. O realçador pode ser cortado no vetor na posição 5' ou 3' na seqüência que codifica o anticorpo, porém é de preferên- cia localizado em um sítio 5' do promotor.

(vi) Componente de terminação de transcrição

Vetores de expressão empregados em células hospedeiras eu- carióticas (leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, humanos, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão seqüên- cias necessárias para a terminação da transcrição e para estabilizar o mR- NA. Tais seqüências são comumente disponíveis das regiões não-traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo. Um componente de terminação de transcrição útil é a região de poliadenila- ção do hormônio de crescimento bovino. Vide W094/11026 e o vetor de ex- pressão descrito aí.

(vii) Seleção e transformação de células hospedeiras Células hospedeiras apropriadas para clonar ou expressar o DNA nos vetores aqui são as células procariotas, de levedura, ou eucariotas mais elevadas descritas acima. Procariotas apropriados para este fim inclu- em eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia1 e.g., E. coli, Ente- robacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ex., Salmonella typhimu- rium, Serratia, e.g., Serratia marcescans, e Shigella, assim como Bacilli tais como B. subtilis e B. Iieheniformis (p.ex., B. Iieheniformis 41P descritos em DD 266,710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyees. Um hospedeiro preferido de clonagem de E. coli é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras cepas tais como E. coli Β, E. coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27,325) sejam apropria- das. Esses exemplos são mais ilustrativos do que limitantes.

Além dos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros apropriados de clonagem ou de expressão para vetores que codificam anticorpos. Saccharomyces cerevisia- e, ou levedura comum de padeiro, é o mais comumente empregado dentre os microorganismos hospedeiros baixos eucarióticos. Entretanto, um número de outros gêneros, espécies, e cepas são comumente disponíveis aqui, tais como Schizosaccharomyces pombe\ Kluyveromyces hopedeiros tais como, p.ex., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K bulgaricus (ATCC 16,045), K wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K drosophilarum (ATCC 36,906), K . thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neuros- pora crassa-, Schwanniomyces tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tais como, p.ex., Neurospora, Penicillium, Tolypocladi- um, e Aspergillus hospedeiros tais como A. nidulans e A. niger.

Células hospedeiras apropriadas para a expressão anticorpo glicosilado são derivadas dos organismos multicelulares. Exemplos de célu- las invertebradas incluem células de plantas e de insetos. Numerosas cepas e variantes de baculovírus e células hospedeiras de insetos corresponden- temente permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (ca- terpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes aibopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruitfly), e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepais virais para a transfecção estão publicamente disponíveis, por e- xemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser empregados como o vírus de a- cordo com a presente invenção, particularmente para a transfecção de célu- las Spodoptera frugiperda. Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomates, e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.

Entretanto, houve o maior interesse em células de vertebrados e a propagação de células de vertebrados em culturas (cultura de tecidos) se tornou um procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares de hospe- deiros mamíferos úteis são rins de maçados linha CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rins humanos embriônicos (células 293 ou 293 subclonadas para cultivo em cultura de suspensão, Graham et al. (1977) J. Gene Viroi 36:59); células de rins de bebês hamster (BHK, ATCC CCL 10); células do ovário de hamsters chineses/-DHFR (CHO, Ur- Iaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216); células de camun- dongos sertoli (TM4, Mather (1980) Bioi. Reprod. 23:243-251); células de rins de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rins de macacos verdes africanos (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical hu- mano (HELA, ATCC CCL 2); células de rins caninos (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células do pul- mão humano (W138, ATCC CCL 75); células do fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongos (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al. (1982) Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de ex- pressão ou de clonagem descritos acima para a produção de um anticorpo e cultura em meios nutrientes conventionais modificados se apropriado para promotores de indução, selecionando transformadores, ou amplificando os genes que codificam as seqüências desejadas. (viii) Cultivo das células hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comerci- almente disponíveis tais como HarrTs F10 (Sigma), Minimal Essential Médi- um ((MEM)1 (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio Dulbecco's Modified Ea- gle's Médium ((DMEM), Sigma) são apropriados para a cultura de células hospedeiras. Além disso, quaisquer dos meios descritos em Ham et al. (1979) Meth. Enz. 58:44, Barnes et al. (1980) Anal. Biochem. 102:255, Pat. US Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Quaisquer desses mei- os podem ser suplementados se necessário com hormônios e/ou outros fato- res de crescimento epidérmico (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfatos), tamponadores (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como ade- nosina e timidina), antibióticos (tais como o medicamento GENTAMICINA®), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos usualmente presen- tes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário também pode estar incluído em concentrações apropriadas que seriam conhecidas daque- les versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira sele- cionada para expressão, e ficarão nítidas para o versado na técnica.

(ix) Purificação do anticorpo

Quando se usa técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou diretamente secre- tado no meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como uma pri- meira etapa, o detrito particulado é removido, tanto células hospedeiras ou fragmentos lisados, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167 descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelado na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA1 e sulfonilfluoreto de fenilmetila (PMSF) por cerca de minutos. O detrito celular pode ser removido por centrifugação. Onde o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expres- são são geralmente primeiramente concentrados usando um filtro para con- centração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, um Amicon ou uma unidade de ultrafiltração Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode estar incluído em quaisquer das etapas anteriores para inibir a proteolise e antibióticos podem ser incluídos para evitar o crescimen- to de contaminantes casuais.

A composição do anticorpo preparada das células pode ser puri- ficada usando, por exemplo, cromatografia com hidroxilapatita, gel eletrofo- rese, dialise, e cromatografia por afinidade, sendo que a cromatografia por afinidade é a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como um Iigante de afinidade depende das espécies e isótopos de quaisquer domínios da imunoglobulina Fc que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias hu- manas γ1, γ2, ou cadeias pesadas γ4 (Lindmark et ai. (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13). A proteína G é recomendada para todos os isótopos de ca- mundongo e para γ3 humano (Guss et ai. (1986) EMBO J. 5:15671575). A matriz à qual o Iigante de afinidade está ligado é mais comumente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro poroso controlado "pore glass" ou po- li(estirenodivinil)benzeno permite taxas de escoamento mais rápidas e me- nores tempos de processamento do que pode ser conseguido com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para a purificação de proteínas tais como fracionamento em uma coluna trocadora de íons, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE® cromatografia em uma resina trocadora de ânion ou cátion (tais como uma coluna de ácido polias- pártico), cromatofocalização, SDS-PAGE, e precipitação em sulfato de amô- nio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado. Seguindo qualquer/quaisquer etapa/s de purificação prelimi- nar/es, a mistura compreende o anticorpo de interesse e contaminantes po- dem ser submetidos a uma cromatografia de interação hidrófoba com baixo pH empregando uma eluição com solução tampão a um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência realizado a concentrações de baixo nível de sal (por exemplo, de cerca de 0-0,25M de sal). Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas para armazenamento, por misturação do anticorpo contendo o grau de pureza desejado com veículos opcionais fisiologicamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veí- culos, excipientes ou estabiIizantes aceitáveis são não tóxicos para os reci- pientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tamponado- res tais como fosfatos, citratos e outros ácidos orgânicos; antioxidantes in- cluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como, octadecildime- tilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como, metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como soro albumina, gelatina, ou imu- noglobulina; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidonas; aminoácidos tais como glicinas, glutaminas, asparaginas, histidinas, argininas, ou lisinas; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação tais como EDTA; açúcares tais como sucrose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contra íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (p.ex., complexos de proteína Zn); e/ou agentes tenso ativos não-iônicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).

A formulação aqui também pode conter mais do que um com- posto ativo se necessário para a indicação em particular sendo tratada, de preferência aquelas com atividades complementares que não afetam adver- samente uma a outra. Por exemplo, pode ser desejável fornecer ainda um agente imunossupressor, um agente anticâncer, um agente antiangiogênico, um agente antineoplástico, um agente citotóxico e/ou um agente quimioterá- pico. Tais moléculas estão apropriadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em mi- crocápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e poli-(metacrilato de metila) microcápsulas, respectivamente em sistemas de fornecimento de medicamento coloidal (por exemplo, Iiposso- mas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocáp- sulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isto é prontamente obtido por filtração através de membra- nas de filtração estéreis.

Preparações de desprendimento sustentado podem ser prepa- radas. Exemplos apropriados de preparações de desprendimento sustentado incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, estas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exem- plo, filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com desprendimento sustentado incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(-metacrilato de 2-hidroxietila), ou poli(vinilálcoois)), polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, - acetato de vinila- etileno não-degradável, copolímeros de ácido lático - ácido glicólico degra- dáveis tais como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinila e ácido lático - ácido glicólico permitem o desprendimento de molécu- las por mais de 100 dias, certos hidrogéis desprendem proteínas por perío- dos de tempos menores. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo período de tempo, eles podem se desnaturar ou agregar como um resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Es- tratégias racionais podem ser criadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação é uma formação intermolecular de ligação S-S através do inter- câmbio tiodissulfeto, uma estabilização pode ser obtida pela modificação dos resíduos de sulfidrila, por liofilização de soluções ácidas, controle do teor de umidade, pelo emprego de aditivos apropriados, e pelo desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas. Usos Terapêuticos

Pode-se observar que os anticorpos da presente invenção po- dem ser usados para tratar um mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo é administrado a um mamífero não-humano para os propósitos de obtenção de dados pré-clínicos, por exemplo. Mamíferos não-humanos como exem- plos a serem tratados incluem primatas não-humanos, cães, gatos, roedores e outros mamíferos nos quais estudos pré-clínicos são realizados. Tais ma- míferos podem ser estabelecidos como modelos animais para uma doença a ser tratada com o anticorpo ou podem ser usados para estudar a toxicidade do anticorpo de interesse. Em cada uma das modalidades, pode-se realizar estudos de escalonamento das dosagens nos mamíferos. Onde o anticorpo é um anticorpo anti-NRP2, ele pode ser administrado a um roedor hospedei- ro em um modelo de tumor sólido, por exemplo.

Além disso, ou como alternativa, o anticorpo é usado para tratar um humano, por exemplo um paciente sofrendo de uma doença ou distúrbio que se beneficiaria da administração do anticorpo.

A presente invenção abrange a prevenção e tratamento de Iin- fangiogênese tumoral, a prevenção e tratamento de uma metástase tumoral e terapia de câncer antiangiogênica, uma nova estratégia de tratamento de câncer que visou inibir o desenvolvimento de vasos sangüíneos tumorais requisitados para fornecer nutrientes para suportar o crescimento do tumor. A invenção inclui especificamente a inibição do crescimento neoplástico do tumor no sítio primário bem como evitar e/ou tratar a metástase de tumores nos sítios secundários, permitindo portanto o ataque dos tumores por outros produtos terapêuticos. Exemplos de cânceres a serem tratados (incluindo a prevenção) incluem aqui, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Mais particularmente exemplos de tais cân- ceres incluem câncer celular escamoso, câncer de pulmão (incluindo câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não-pequena, ade- nocarcinoma do pulmão, e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peri- tôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal (incluindo câncer gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carci- noma das glândulas salivares, câncer dos rins ou renal, câncer do fígado, câncer da próstata, câncer vulval, câncer da tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, bem como linfoma da célula B (incluindo linfoma de não-Hodgkin folicular de baixo grau (NHL); NHL pe- queno linfocítico (SL); NHL folicular de grau intermediário; NHL intermediário de grau difuso; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL celular não-clivado pequeno de alto grau; NHL doença de volume; linfoma celular de manto; linfoma relacionado a AIDS; e macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia das células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; e distúrbio Iinfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edemas (tais como aqueles as- sociados a tumores cerebrais), e síndrome de Meig. Mais particularmene, cânceres que são passíveis de tratamento pelos anticorpos da invenção in- cluem câncer de mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer pulmonar de célula não-pequena, linfoma de não-Hodgkins (NHL), câncer celular renal, câncer de próstata,câncer de fígado, câncer pancreático, sarcoma de tecido mole, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, câncer de cabeça e pesco- ço, melanoma, câncer ovariano, mesotelioma, e mieloma múltiplo.

Observa-se que quando usados para tratar várias doenças, tais como tumores, os anticorpos da invenção podem ser combinados com ou- tros agentes terapêuticos apropriados para as mesmas doenças ou doenças similares. Quando usados para tratar câncer, os anticorpos da presente in- venção podem ser usados em combinação com terapias de câncer conven- cionais, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia, ou suas combina- ções.

Em certos aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para a combinação da terapia de câncer com o anticorpo da invenção incluem ou- tros agentes antiangiogênicos. Muitos agentes antiangiogênicos foram identi- ficados e são conhecidos nas técnicas, incluindo aqueles listados por Car- meliet e Jain (2000).

Em um aspecto, o anticorpo desta invenção é usado em combi- nação com um antagonista VEGF ou um antagonista receptor VEGF tais como anticorpos anti-VEGF, variantes VEGF, fragmentos de receptor de VEGF solúveis, aptâmeros capazes de bloquear VEGF ou VEGFR, anticor- pos de neutralização anti-VEGFR, inibidores de VEGFR tirosina quinase e quaisquer combinações deles. Alternativamente, ou em adição a, dois ou mais anticorpos anti-NRP1 podem ser co-administrados ao paciente. Em uma modalidade mais preferida, o anticorpo anti-NRP1A ou anti-NRPB da invenção não é usado em combinação com um anticorpo anti-VEGF para gerar efeitos aditivos ou sinergísticos. Anticorpos anti-VEGF preferidos in- cluem aqueles que ligam ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-hVEGF A4.6.1. Mais preferentemente o anticorpo anti-VEGF é bevacizumab ou rani- bizumab.

Em alguns outros aspectos, outros agentes terapêuticos úteis para terapia de combinação para tumor com o anticorpo da invenção inclu- em antagonistas de outros fatores que estão envolvidos no crescimento do tumor, tais como EGFR, ErbB2 (também conhecido como Her2) ErbB3, ErbB4, ou TNF. De preferência, o anticorpo anti-NRP1 da invenção também pode ser usado em combinação com inibidores de receptor de tirosina qui- nase de molécula pequena (RTKIs) que atingem um ou mais receptores de tirosina quinase tais como receptores VEGF, receptores FGF, receptores EGF e receptores PDGF. Muitos RTKIs terapêuticos de molécula pequena são conhecidos na técnica, incluindo e não estando limitado a, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®), semaxanib (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinib (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®), XL880, e CHIR-265.

O anticorpo anti-Nrp da invenção, sozinho ou em combinação com um segundo agente terapêutico (tais como um anticorpo anti-VEGF) ainda pode ser usado em combinação com um ou mais agentes quimioterá- picos. Uma variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada nos pro- cessos de tratamento combinados da invenção. Uma lista de exemplos, mas não-limitante, dos agentes quimioterápicos considerados é fornecida aqui sob "Definição".

Quando o anticorpo anti-Nrp é co-administrado com um segun- do agente terapêutico, o segundo agente terapêutico pode ser administrado primeiro, seguido pelo anticorpo anti-Nrp. Entretanto, a administração simul- tânea ou administração do anticorpo anti-Nrp primeiro também é considera- da. Dosagens apropriadas para o segundo agente terapêutico são aquelas atualmente usadas e podem ser baixadas devido à ação combinada (siner- gia) do agente e anticorpo anti-Nrp.

Para a prevenção ou o tratamento da doença, a dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e do curso da doença, se o anticorpo é adminstrado com propósito de prevenção ou terapia prévia, da história clínica do paciente e resposta ao anticorpo, e o arbítrio do médico clínico atendente. O anticorpo é apropriadamente administrado ao paciente uma vez ou em uma série de tratamentos.Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg até 50 mg/kg (p.ex. 0,1-20mg/kg) do anticorpo é uma dosagem inicial candi- data à administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diá- ria típica deve variar de cerca de 1 pg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repeti- das, por alguns dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da do- ença. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Em um as- pecto preferido, o anticorpo da invenção é administrado a cada duas ou três semanas, a uma dose variando de cerca de 5mg/kg até cerca de 15 mg/kg. Mais preferentemente, um tal regime de dosagem é usado em combinação com um regime de quimioterapia como a terapia de primeira linha para tra- tamento de câncer colorretal metastático. Em alguns aspectos, o regime de quimioterapia envolve a administração tradicional intermitente de altas do- ses. Em alguns outros aspectos, os agentes quimioterápicos são administra- dos usando doses menores e mais freqüentes sem interrupções programa- das ("quimioterapia metronômica"). O progresso da terapia da invenção é facilmente monitorado por técnicas e testes convencionais.

A composição do anticorpo será formulada, dosada, e adminis- trada de um modo consistente com a boa prática médica. Fatores para con- sideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o ma- mífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de fornecimento do agente, o processo de admi- nistração, a programação da administração, e outros fatores conhecidos pe- los clínicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo a ser admi- nistrada será decidida por tais considerações, e é a quantidade mínima ne- cessária para evitar, melhorar, ou tratar uma doença ou um distúrbio. O anti- corpo não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes normalmente usados para evitar ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticor- po presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fato- res discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com as vias de administração conforme usado aqui anteriormente ou cerca de 1 até 99% das dosagens até agora empregadas. Geralmente, alívio ou tratamento de uma doença ou distúrbio envolve a minoração de um ou mais sintomas ou problemas médicos associados à doença ou ao distúrbio. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do medicamento pode realizar uma ou mais combinações que se seguem: reduzir o número de cé- lulas cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir até al- guma extensão e/ou parar) a infiltração de câncer nas células em órgãos periféricos; inibir a metástase tumoral; inibir, até alguma extensão o cresci- mento do tumor; e/ou aliviar em alguma extensão um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Na medida em que o medicamento pode evitar o crescimento e/ou a morte de células cancerosas existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Em algumas modalidades, a composição desta invenção pode ser usada para evitar o início ou a reocorrência da doença ou do distúrbio em um indivíduo ou mamífero.

Os seguintes exemplos pretendem apenas ilustrar a prática da presente invenção e não sao fornecidos como sendo uma limitação. A divul- gação de todas as patentes e literaturas científicas citadas aqui são expres- samente incorporadas na sua totalidade como referência. EXEMPLOS Exemplo 1

Geração e caracterização de anticorpos anti-Nrp2B

Anti-Nrp2B foi isolado de bibliotecas de fagos de anticorpos sin- téticos humanos conforme previamente descrito (Lee et al., J Mol Biol 340, 1073-1093 (2004)). Resumidamente, bibliotecas de anticorpos foram cons- truídas em uma estrutura humana única por introdução de diversidade sinté- tica em posições expostas a solvente dentro das regiões determinantes de complementariedade de cadeia pesada (CDRs). Para aperfeiçoar o desem- penho das bibliotecas, foram construídas bibliotecas de fragmentos de liga- ção de antígeno monovalente e bivalente (Fab), e foram exploradas diferen- tes diversidades de CDR-H3 variando a composição de aminoácidos e com- primento de CDR. A biblioteca foi então expandida com o aumento da varia- bilidade do comprimento de CDR-H3 e usando códons talhados que imitam a composição de aminoácido das seqüências naturais de CDR-H3. Usando essas bibliotecas com CDRs totalmente sintéticos dispostos em uma estrutu- ra única foram gerados anticorpos de alta afinidade. Para mais detalhes de estratégias e métodos para gerar bibliotecas de anticorpos sintéticos com gabarito único, vide, por exemplo, W003/102157 publicado em 11 de de- zembro de 2003, cuja divulgação completa é expressamente anexada aqui como referência.

Os procedimentos de seleção para clones anti-Nrp consistiram em várias combinações de seleções suportadas em sólido e Iigantes em so- lução que são bem conhecidas na técnica. Em seleções suportadas em sóli- do, a biblioteca de fago anticorpo foi frigida com antígeno-alvo revestido so- bre imunoplacas NUNC de 96-poços Maxisorp à concentração de 5ug/ml. No método de seleção Iigante em solução, a biblioteca de fago foi incubada com concentrações descendentes de antígeno biotinilado em solução, que então foi capturada por neutravidina revestida na placa de 6-poços Maxisorp (2- 5μg/ml). A concentração descendente permitiu uma maior estringência na fritura para buscar aglutinantes mais firmes.

Como um resultado de combinação de seleções suportadas em sólido e Iigantes em solução, um clone de uma biblioteca Vh (YW68.4) e ou- tro de uma VhVl (YW126.20), foram identificados como aglutinantes NRP-2. Uma série de ensaios in vitro foram conduzidos para examinar propriedades e atividades dos anticorpos selecionados novos anti-NRP, inclusive ensaios de afinidade de ligação (tais como BIAcore) e ensaios de bloqueio (tais como ensaio de colapso de cone de crescimento induzido de Semaforina e ensai- os HUVEC).

Os CDRs de clones naíves foram engenheirados para aprimorar sua afinidade e estabilidade e anticorpos anti-Nrp2 YW68.4.2 e YW68.4.2.36 foram gerados. Células CHO que expressam proteínas de fusão mNrp2 (a1a2b1b2)-His, hNrp2 (a1a2b1 b2)-Fc, e células de inseto que expressam hNrp2 (b1b2) foram empregadas para varredura e caracterização de anticor- po. As regiões Vl e Vh de anticorpo fago anti-Nrp2B (originalmente designa- das YW68.4.2.36) foram clonadas em um vetor de expressão mamífero res- pectivamente. IgGI ou mlgG2a humano Anti-Nrp2B foi expresso em células CHO mamíferas e purificado com coluna de afinidade com proteína A.

As seqüências de aminoácidos de anticorpos anti-Nrp2B YW68.4.2, e YW68.4.2.36 são mostradas na Figura 10. A seqüência de ami- noácido de anticorpo anti-Nrp2A YW126.20 é mostrada na Figura 11. O ali- nhamento da seqüência de domínio variável de cadeia leve de anticorpo an- ti-Nrp2A YW126.20 com a seqüência humana H é mostrada na Figura 12. O alinhamento da seqüência de domínio variável de cadeia pesada de anticor- po anti-Nrp2A YW126.20 com a seqüência humana Ill (hum III) é mostrada na Figura 13.

Nas experiências seguintes, anticorpo anti- Nrp2B YW68.4.2.36 foi empregado,o qual doravante será referido como «Anti-Nrp2B ». Esse anti- corpo foi direcionado aos domínios de Nrp2 do fator de coagulação V/VII (b1-b2) (figura 1A), visto que esses domínios são necessários para a ligação de VEGFC a neuropilinas (Karpanen et al., Faseb J 20, 1462-1472 (2006)). Além disso, esse anticorpo se liga com afinidade similar a Nrp2 murino e humano mas não se liga a Nrp 1 (figura 1B). Foi confirmado que anti-Nrp2B busca exclusivamente os domínios b1-b2 e não se liga aos t-ésimos domí- nios de CUB (a1-a2) de Nrp2 humano, que são primariamente responsáveis por ligação semaforina (Chen et al., Neuron 21, 1283-1290 (1998); Giger et al., Neuron 21, 1079-1092 (1998)).

Para determinar afinidades de ligação de anticorpos anti-Nrp2B IgGI, medições com ressonância de plasmônio superficial (SRP) com um instrumento BIAcore®-3000 foi empregado. Em primeiro lugar, IgGs huma- nas anti-Nrp2B foram capturadas por chips biossensores CM5 revestidos com IgG anti-humano de coelho para atingir aproximadamente 200 unidades de resposta (RU). Para medições cinéticas, diluições seriais duplas de Nrp2 de camundongo ou humano (a1a2b1b2) (0,5nM a 250nM) foram injetadas separadamente em tampão PBT (PBS com 0,05% (v/v) Tween 20) a 25°C com uma vazão de 30μΙ/ιτιίη. Taxas de associação (kon) e taxas de dissocia- ção (/foff) foram calculadas empregando um modelo simples um-para-um de ligação Langmuir (Software de avaliação BIAcore versão 3.2). A constante de dissociação de equilíbrio (K0) foi calculada como a proporção k0fí/kQn.

Anti-Nrp2B se liga a Nrp murino com um Kd de 4,9 nMea Nrp2 humano com um Kd de 5,3 nM conforme avaliado por medições de resso- nância superficial de plásmon. A capacidade de Anti-Nrp2B bloquear a ligação de VEGFC a Nrp2 foi testada em ambos o formato ELISA e em ensaios de ligação basea- dos em células.

Para testes de especificidade de ligação baseados em ELISA, diluições seriais triplas de Anti-Nrp2B IgGs (0,002nM a 500nM) em Tampão PBST (PBT tampão com 0,5% (p/v) BSA) foram incubadas em placas Maxi- sorp com 96 poços com ^g/ml antígeno por pelo menos 1 hora, e as placas foram lavadas com tampão PBT. Anticorpos ligados foram detetados com conjugados de anticorpo HRP anti-humano diluído 1:2500 em Tampão PBST1 revelado com substrato TMB por aproximadamente 5 minutos, extinto com H3PO4 a 1M e lido por espectrofotometria a 450 nm.

Para avaliar o bloqueio de Nrp2 para se ligar com VEGF, dilui- ções seriais triplas de anti-Nrp2B IgGs foram primeiramente incubadas com placa Maxisorp de 96 poços com NRP2-Fc (δμς/ηιΙ) em tampão PBST por 2 horas, seguido pela adição de VEGF165 or VEGFC biotinilados (comprimento total) por 15 minutos. A quantidade de VEGF biotinilado ligado a Nrp2 foi detectada por conjugados estreptavidina-HRP.

Para avaliar ligação celular, VEGFi65 ou VEGFC biotinilado liga- do a LECs foi executado conforme previamente descrito (Jia et al., J Biol Chem 281, 13493-13502 (2006)) e a ligação foi detetada por conjugados de estreptavidina- fosfatase alcalina. Ligação Sema3F foi executada conforme previamente descrito (Chen et al., 1998, supra).

Anti-Nrp2B bloqueou fortemente ligação VEGFC a Nrp2 (figura 1C) e células HEK-293 transfectadas com Nrp2 de comprimento total. Visto que Nrp2 também pode ligar VEGF (Gluzman-Poltorak et al., J Biol Chem 275, 29922 (2000)), provavelmente empregando os mesmos domínios, a capacidade de anti-Nrp2B bloquear ligação de VEGF165 a Nrp2 foi também testada. Anti-Nrp2B também bloqueia fortemente a ligação de VEGF165 a N- rp2 (figura 1D) com um IC50 similar (0,1 nM). Entretanto, Anti-Nrp2B não foi capaz de bloquear a ligação de Sema3F a LECs (figura 1E) que fortemente expressam Nrp2 (figura 1 suplementar). Esses resultados são consistentes com observações prévias de que os domínios a1-a2 são primariamente res- ponsáveis por ligação de semaforina e os domínios b1-b2 por ligação VEGF (figura 1A). Exemplo 2

Anti-Nrp2B bloqueia funções seletivas mediadas por VEGFC in vitro Materiais e métodos Culturas celulares

Células linfáticas dérmicas endoteliais microvasculares huma- nas HMVEC-dLyAd (LECs) e HUVECS foram adquiridas de Cambrex e culti- vadas em meio EGM-2 (Cambrex). Células C6 LacZ foram adquiridas de ATCC. 66C14 foram uma gentil oferta de Dr. Fred R Miller. Células tumorais foram cultivadas em DMEM (Gibco) suplementado com 10% FBS. Todas as células foram mantidas a 37 0C em uma incubadora a 5% CO2, 95% umida- de.

Ensaio de proliferação celular

Uma placa de fundo negro de 96 poços (VWR) foi revestida com 5μg/ml de Fibronectina (Invitrogen) a 37 0C por 2 horas. LEC's foram colhi- dos e ressuspensos em meio de ensaio (0,1% BSA1 EGM-2) 3000 célu- las/1 OOuI e adicionado a poços. Células foram incubadas a 37 0C por 16 ho- ras. Solução rotuladora BrdU (Kit de proliferação celular ELISA; Roche) foi adicionada e as células foram incubadas por mais 24 horas a 37 0C. A incor- poração de BrdU foi determinada por imunoensaios de quimiluminescência. (6 poços por condição). Resultados

O papel desempenhado por Nrp2 na migração e proliferação mediada por VEGFC foi examinada. Essas são atividades celulares chave induzidas por VEGFC (Joukov et al., Embo J 16, 3898-3911 (1997)). LECs foram previamente mostrados como sendo altamente responsáveis por VEGFC (Makinen et al., EmboJ 20, 4762-4773 (2001); Veikkola et al., Faseb 17, 2006-2013 (2003); Whitehurst et al., Lymphat Res Biol 4, 119-142 (2006)). Empregando um sistema de transpoço ("transwell"), LECs humanos foram introduzidos na câmara superior enquanto VEGFC foi adicionada à câmara inferior para promover migração. LECs que migraram para a inferior foram então fixados, tingidos (figura 2A) e quantificados (figura 2B). Proteína de domínio extracelular VEGFR3 (ECD), compreendendo os três primeiros domínios Ig (ligando ligante) de VEGFR3 foi empregada como um controle positivo para bloquear a migração causada por VEGFC nesta experiência e nas subsequentes (Makinen et al., Nat Med 7, 199-205 (2001)). Para deter- minar se uma função Nrp2 foi necessária para migração de LEC1 Anti-Nrp2B mAbs foram adicionadas às células na câmara superior imediatamente antes das adições de VEGFC. Anti-Nrp2B foi capaz de significativamente reduzir a migração de LEC mediada por VEGFC (figura 2A, 2B; p=0,004). O nível de inibição foi menor do que o verificado com VEGFR3 ECD, o qual inibiu com- pletamente a migração de LEC mediada por VEGFC (figura 2A, 2B; p<0,001 versus controle; p=0,002 versus Anti-Nrp2B). Resultados similares foram ob- tidos empregando outra linha celular primária com resposta para VEGFC, HUVECs.

Como Anti-Nrp2B também bloqueou a ligação de VEGF16S a N- rp2, o papel desempenhado por Nrp2 na modulação da migração de VEGF165 foi avaliado. VEGF165 induziu fortemente a migração em LECs con- forme previamente descrito (Hirakawa et al., Am J Pathol 162, 575-586 (203); Hong et al., Faseb J 18, 1111-1113(2004); Makinen et al., Embo J 20, 4762-4773 (2001); Veikkola et al., Faseb J 17, 2006-2013 (2003)). Um anti- corpo de espécie cruzada reativo anti-VEGF (B20.4.1) foi empregado como um controle positivo para bloquear esta migração causada por VEGF (Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)). Curiosamente, Anti-Nrp2B não a- presentou nenhum efeito na migração mediada por VEGF165 (figura 2C), possivelmente devido à presença de Nrpl (figura 1 suplementar). O bloqueio da função Nrpl empregando Anti-Nrpl mAb, Anti-Nrpl6 (Pan et al., Câncer Cell 11, 53-67 (2007)) dramaticamente reduziu a migração mediada por VEGF, confirmando esta hipótese (figura 2 suplementar). A adição de ambos Anti-Nrpl Be Anti-Nrp2B não resultou em nenhuma outra inibição da migração em comparação com a inibição verificada com Anti-Nrpl6 individualmente (figura 2 suplementar), indicando que Nrp2 não desempenha um papel na migração mediada por VEGF165. Em seguida, o efeito de Anti-Nrp2B na proliferação de LEC indu- zida por VEGFC foi investigado. Notavelmente, Anti-Nrp2B não teve nenhum efeito na proliferação de LEC enquanto que VEGFR3 ECD proporcionou um forte bloqueio (figura 3 suplementar), de acordo com relatórios prévios nos quais Nrp2 siRNA falhou em inibir a proliferação induzida por VEGFC em células endoteliais (Favier et al., Blood 108, 1243-1250 (2006)). Portanto, Nrp2 parece ser importante para a migração causada por VEGFC, mas não para proliferação.

Então, a capacidade de Anti-Nrp2B para modular a função da semaforina foi testada. Emprega-se o ensaio de colapso de cone de cresci- mento neuronal hipocampal, o qual previamente demonstrou que Nrp2 é re- querido para retração mediada por Sema3F das estruturas ricas em actina (Pozas et al., 2001). A adição de Anti-Nrp2B não teve nenhum efeito no co- lapso induzido por semaforina enquanto que a adição de ou domínio recom- binante Nrp2 A1A2 ou Nrp2 ECD inibiu este colapso completamente (figura 4 suplementar). Este resultado é consistente com a observação prévia de que Anti-Nrp2B não se liga à região de ligação com semaforina e não interfere com a ligação de Sema3F com Nrp2. Portanto, Anti-Nrp2B age para bloquear aspectos específicos de função Nrp2, inibindo VEGFC mas não respostas celulares mediadas por VEGF ou Sema3F. Exemplo 3

Anti-Nrp2B bloqueia linfaqioqênese mediada por VEGFC in vivo Materiais e métodos

Ensaio de microbolsa corneal de camundonao

Camundongos adultos CD-1 (CharIes-River) foram anestesiados e uma bolsa de 2x3 mm foi criada a 1 mm do centro da córnea no epitélio por microdissecação conforme descrito anteriormente (Polverini et al., Me- thods Enzymol 198, 440-450 (1991)). Agentes a serem testados quanto a atividade linfangiogênica foram imobilizados em um pélete inerte hidron (2x2 mm). O pelete foi então implantada na base da bolsa. Os animais foram tra- tados com anticorpo de controle (10mg/kg), Anti-Nrp2B (10mg/kg) ou VEG- FR3 ECD 25mg/kg IP duas vezes por semana durante 2 semanas. Então os animais foram sacrificados e as córneas foram dissecadas. Os vasos linfáti- cos foram visualizados por meio de IHC de montagem inegral com anticorpo anti-LYVE-1 (R&D Systems 1:500). As córneas foram fotografadas e foram quantificados os vasos linfáticos LYVE-1 positivos que se elevam do limbus.

Ensaio de permeabilidade de vasos de pele de camundongo

As costas e flancos de camundongos fêmeas adultos C57BL6J foram barbeados e divididos em 4 áreas de tetas. Eles foram então injetados i.v. com 150 μΙ de solução azul "Evan's" azul 0,5%. 1 hora após a injeção da "Evan's" azul, 20 μΙ de PBS contendo BSA ou hVEGF (7,5 pg/ml) com ou sem anticorpo (0,5 mg/ml) foram injetados intradermicamente, aleatoriamen- te em uma das 4 zonas. 1 hora mais tarde, os animais foram sacrificados e a pele foi dissecada e imageada. Amostras de pele para cada zona de injeção foram cortadas e incubadas em solução de formamida a 55°C por 48 horas para extrair o corante azul. A absorbância da solução foi então medida com um espectrômetro a 600 nm. Resultados

Tendo observado uma redução significativa na migração de LEC através do bloqueio de Nrp2 in vitro, foi em seguida examinado se Nrp2 foi requerido para modular a função VEGFC in vivo. Foram estudadas duas ati- vidades bem caracterizadas mediadas por VEGFC in vivo - linfangiogênese adulta e permeabilidade vascular (Cao et al., Circ Res 94, 664-670 (2004); Joukov et al., J Bioi Chem 273, 6599-6602 (1998); Kubo et al., Proc NatIA- cad Sci USA 99, 8868-8873 (2002); Saaristo et al., Faseb J 16, 1041-1049 (2002)). Para estudar linfangiogênese, o ensaio de microbolsa da córnea murina (Kubo et al., 2002, supra) foi utilizado. Neste ensaio, um pélete de VEGFC foi introduzido na córnea avascular de um camundongo adulto. Ao longo de 14 dias, em resposta ao VEGFC, um denso plexo de vasos linfáti- cos cresceu na córnea do limbus (figura 2E; 12,000 pixels2 com tratamento VEGFC verso 2284 pixels no controle). Esses vasos foram rotulados por imuno-histoquímica LYVE-1 (IHC) e quantificados subseqüentemente (figura 2D). Administração sistêmica de VEGFR3 ECD bloqueou quase completa- mente esta linfangiogênese induzida por VEGFC (2671 pixels2; p<0,001). Anti-Nrp2B também bloqueou eficazmente a resposta linfangiogênica corneal (3281 pixels2; p<0,001). Esse bloqueio era similar em grau ao bloqueio ob- servado empregando VEGFR3 ECD (figura 2E, 2D; p=0,67).

Com o fim de avaliar a permeabilidade vascular, foi empregado o ensaio miles (Brkovic e Sirois1 J Cell Biochem 100, 727-37 (2007); Eriks- son et aí., Circulation 107, 532-1538 (2003)). Este ensaio emprega injeção íntradérmica de VEGFC para induzir permeabilidade vascular e injeção intra- vascular de corante Evan's" azul como um traçador para detectar e quantifi- car a permeabilidade em vasos cutâneos (figura 3 suplementar). De forma marcante, tratamento com Anti-Nrp2B não teve efeito na permeabilidade in- duzida por VEGFC, em contraste com o bloqueio observado com tratamento com VEGFR3 ECD (p=0,038). Esses resultados demonstram que, consisten- temente com o que observamos in vitro, Nrp2 parece ser importante para funções seletivas mediadas por VEGFC in vivo. Exemplo 4

Anti-Nrp2B modula função VEGFC pela inibicão da formação complexa de receptor Nrp2/VEGF Materiais e métodos Ensaio de migração celular

Ensaios de migração foram executados empregando uma câma- ra modificada de Boyden com um sistema de 24 múltiplos poços inseridos com 8μΜ de tamanho de poro (BD Biosciences). As placas foram revestidas com 5ug/ml de Fibronectina (Invitrogen) por 2 horas a 37 0C. Células em 100μΙ de meio de ensaio (0,1% BSA, EGM-2) com/sem anticorpos foram a- dicionados à câmara superior. Quimioatraente foi adicionado à câmara infe- rior em 500μΙ de meio de ensaio, e células foram incubadas a 37 0C por 16 horas. Células na membrana superior foram removidas com uma esponja e células na superfície inferior foram fixadas em 70% etanol e tingidas com verde Sytox (Molecular Probes). Imagens foram tiradas da superfície inferior inteira do poço, e contou-se o número de células migradas. (6 poços por condição). Análise FACS LECs confluentes foram incubados com anticorpos de controle Anti-Nrp2B (10 pg/ml) por 5 min, 2 horas ou 20 horas a 37°C. Células foram colhidas com tampão de dissociação de célula livre de enzima (Gibco), e incubadas com anticorpo biotinilado a 1:100 em FACS tamponado (PBS, FBS a 2%, EDTA a 2 mM, azida de sódio a 0,1%) contendo soro de camun- dongo normal a 5%, soro de rato normal a 2% e 10 pg/ml de IgG humano a 10%. Anticorpos foram biotinilados empregando o kit de rotulagem de prote- ína mini-biotin-xx FIuoReporter (Molecular Probes). Células foram então la- vadas com tampão FACS e manchadas com estreptavidina-PE (BD Biosci- ences). Os dados foram então analisados com o sistema FacsCaIibur (BD Biosciences). Ensaio de adesão celular

LECs subconfluentes foram pré-incubados em 100 μΙ de Médi- um 199 com anticorpos de controle ou Anti-Nrp2B (10 pg/ml) por 30 min a 37°C, então depositados em placas de 96 poços de fundo chato NUNC ma- xisorp (eBioscience) revestidos com 1 pg/ml de Fibronectina (Roche) a 10.000 células por poço. As placas foram centrifugadas por 1 min a 140 g para sincronizar contato de células com substrato, e incubadas a 37°C por min. Placas foram então lavadas 3 vezes com PBS, e congeladas a - 80°C. A densidade celular foi determinada com o kit CyQuant (Molecular Probes).

Ensaios de sinalização de receptor de VEGF

HUVECs confluentes foram estimulados por 10 minutos com 200ng/ml de VEGFC na presença ou ausência de anticorpos de controle ou Anti-Nrp2B. As células foram Iisadas e testadas para vários mediadores co- nhecidos como tendo papel na sinalização de receptor de VEGF. A ativação de VEGFR2 foi avaliada empregando ensaios de VEGFR2 total e de fosfo- VEGFR2 ELISA (DuoSet IC ELISA kit, R&D). A ativação de VEGFR3 foi ava- liada empregando um ensaio de ativação de receptor de quinase (KIRA) com uma linha celular VEGFR3-293 conforme previamente descrito (Sadick et al., J Pharm BiomedAnai 19, 883-891 (1999)). Em resumo, 293 linhas celulares estáveis que expressam hVEGFR3 humano rotulado em comprimento total foram testadas quanto à fosforilação de receptor, seguida de estímulo. 5x104 células ficaram sem alimentação ao longo da noite (DMEM com.1% BSA) e foram então estimuladas com 40 ng/ml de VEGFA (Genentech South San Francisco, CA) ou 200 ng/ml VEGFC (Genentech South San Francisco, CA) por 8 minutos. Células foram Iisadas em PBS contendo triton a 1 % e ortova- nadato de sódio. Placas ELISA foram revestidas com anticorpo rótulo de captura (Sigma St Louis, MO). As placas foram revestidas (PBS + 1ug/ml de anticorpo) ao longo da noite e bloqueadas (PBS + .5% BSA) por 1 hora. A- pós 3 lavagens (PBS + 0,05% Tween 20), Iisados foram adicionados por 2 horas, lavados três vezes, seguido por adição de anticorpo de detecção de fosfo 4G10 (Upstate Lake Placed, NY) por 2 horas. A detecção foi executa- da com anticorpo HRP (Amersham Piscataway, NJ) e substrato TMB. As placas foram lidas a 450nm. AKT total, fosfo-AKT, Erk1/2 total, fosfo-Erk1/2 , Src total, fosfo-Src, p38 MAPK total e fosfo-p38 MAPK foram avaliados em- pregando kits ELISA intercalados da BioSource. Resultados

A descoberta de que Anti-Nrp2B interfere com ações VEGFC foi consistente com o fato de que ele bloqueia a ligação de VEGFC a Nrp2. A- lém disso, o fato de que ele bloqueia somente funções seletivas ambos in vitro e in vivo foi altamente inesperada. Uma explicação possível de porquê uma interrupção da migração de LEC e linfangiogênese, mas não a prolife- ração de LEC ou a permeabilidade vascular, foi observada, é que Anti-Nrp2B pode geralmente inibir a migração, possivelmente por interrupção da adesão de LEC à matriz extracelular. Para testar isto, foi avaliado o efeito de Anti- Nrp2B na migração induzida por um número de motogens LEC. Anti-Nrp2B não teve qualquer efeito na migração induzida por VEGF (figura 2C), HGF (figura 3B) ou FGF. Portanto anti-Nrp2B, em geral, não interrompeu a migra- ção de LEC. Além disso, anti-Nrp2B não teve qualquer efeito na adesão de LEC à fibronectina ou colágeno, dois substratos de matriz extracelular.

Uma segunda possibilidade é que Anti-Nrp2B mAb pode causar a internalização de Nrp2 (Jaramillo et al., Exp Cell Res 312, 2778-2790 (2006)). Já que Nrp2 forma um complexo com VEGFR3, mesmo na ausência do Iigante (Favier et al„ 2006, supra; Karkkainen and Alitalo1 Semin Cell Dev Biol 13, 9-18 (2002)), isto poderia resultar em uma cointernalização seletiva de VEGFR3, afetando as funções especificas mediadas por VEGFC. Esta possibilidade ainda foi validada pela descoberta de que a permeabilidade vascular causada por VEGFC é mediada por VEGFR2 e não por VEGFR3 (Joukov et al„ 1998, supra). Para abordar esta possibilidade, LECs foram incubados com anti-Nrp2B a 37r C por 5 minutos, 2 horas ou 20 horas e de- pois realizou-se a análise FACS com anticorpos contra Nrp2, VEGFR2 e VEGFR3 para determinar o nível dos receptores na superfície celular. Ne- nhuma diferença foi observada entre os tratamentos, sugerindo que Anti- Nrp2B não causou uma internalização significante de Nrp2, VEGFR2 or VEGFR3 (figura 3A).

À medida que Nrp2 foi proposto para aumentar o receptor de sinalização VEGF (Favier et al., 2006, supra), em seguida, o efeito de Anti- Nrp2B na ativação de VEGFR2 e VEGFR3 foi estudado, onde a estimulação de VEGFC leva à dimerização do receptor e a uma autofosforilação. Em concordância com os dados anteriores in vitro e in vivo, VEGFR3 ECD blo- queou completamente VEGFR2 mediado por VEGFC (figura 3C; p<0.001) e a fosforilação de VEGFR3. O tratamento Anti-Nrp2B resultou em uma redu- ção de VEGFR2 (figura 3C; p<0,001) e ativação de VEGFR3, mas a um grau significativamente menor do que o tratamento com VEGFR3 ECD (p<0,001). Esta observação levantou a possibilidade de que a atividade inibidora seleti- va de Anti-Nrp2B poderia ser um resultado de exigências diferentes de ativa- ção do receptor VEGF para migração e proliferação, que a migração requer maiores níveis de ativação de receptor do que a proliferação. Para abordar esta possibilidade, avaliou-se a dose de resposta da fosforilação de VEG- FR2 para estimulação de VEGFC (figura 3C). Foi consistentemente obser- vado que a redução da fosforilação de VEGFR2 causada por um tratamento anti-Nrp2B foi equivalente à fosforilação de VEGFR2 obtida por estimulação com 175ng/ml ou 150ng/ml de VEGFC. Então, a análise da dose de resposta da migração para estimulação VEGFC foi realizada (figura 3D). Notou-se que LECs estimulados com 175ng/ml ou 150ng/ml de VEGFC migraram de forma equivalente às células estimuladas por 200ng/ml de VEGFC. De fato, uma significativa redução na migração não foi observada até que os níveis de VEGFC fossem reduzidos para 50ng/ml. Portanto, raciocinou-se que a redução na fosforilação de VEGFR2 induzida por Anti-Nrp2B foi, ela própria, insuficiente para reduzir a migração.

Adicionalmente foiavaliado o efeito de Anti-Nrp2B nos eventos de sinalização a jusante mediado por receptores VEGF. O tratamento com anti-Nrp2B ou a estimulação com 175ng/ml ou 150ng/ml de VEGFC não re- duziu significativamente a ativação de Erk1/2, Akt ou p38 MAPK que modu- lou a proliferação mediada por VEGFR2, permeabilidade e motilidade res- pectivamente, similarmente ao que é observado com Nrpl (Pan et al., 2007). Isto indicou que Nrp2 pode regular a migração e linfangiogênese de LEC por um mecanismo diferente do que o aumento da ativação do receptor VEGF ou sinalização fluxo abaixo.

Por fim, o efeito de Anti-Nrp2B na formação do complexo recep- tor Nrp2/VEGF foi testado. Conforme reportado anteriormente, Nrp2 pode ser coimunoprecipitado com VEGFR2 e VEGFR3 na presença ou ausência de VEGFC (Favier et al., 2006 supra-, Karpanen et al., 2006, supra) (figura 3E). Esta interação foi dramaticamente reduzida por Anti-Nrp2B (figura 3E). Este resultado sugere que o complexo receptor de Nrp2/VEGF é importante para funções específicas mediadas por VEGFC. Além disso, o papel de Nrp2 não é exclusivamente o de aumentar a sinalização do receptor de VEGF em resposta à estimulação do ligante. Exemplo 5

Nrp2 é expresso em tumor Iinfaticamente associado Materiais e métodos Imunohistoauímica

Seções de tecido de 18 pm foram cortadas e montadas sobre lâminas de vidro. As seções foram incubadas ao longo da noite com anticor- po primário (anti-NRP2B (1:500 tingimento de controle executado em coluna vertebral E12.5 de camundongo sendo que a expressão foi bem caracteriza- da), anti-LYVE-1 (anti-R&D, 1:200), anti-PECAM-1 (Benton Dickinson, 1:500), anti-PROX-1 (Chemicon, 1:1000), ou Ki67 (Neovision 1:100) a 4°C. Amostras foram então tingidas com anticorpos secundários Alexa 488 ou Alexa 568 (1:200; amostras moleculares) por 4 horas a temperatura ambien- te (TA). Tingimento com secundário foi empregado apenas para fins de con- trole. Tingimento TUNNEL foi executado com um kit comercial (Roche). Ima- gens foram capturadas com um microscópio Zeiss Axiophot fluorescente. A área de vasos sangüíneos e vasos linfáticos foi determinada a partir de 6 imagens representativas de cada um dos 6 tumores por grupo, avaliados por número médio de pixel por imagem. Resultados

Com o fim de determinar se Nrp2 desempenha um papel na bio- logia linfática adulta, a expressão de Nrp2 no sistema linfático de adultos foi avaliada. Dentro do sistema vascular, a expressão de Nrp2 foi previamente descrita em veias e linfáticos (Herzog et al., Mech Dev 109, 115-119 (2001); Moyon et al., Development 128, 3359-3370 (2001); Yuan et al., Development 129, 4797-4806 (2002)). Conforme descrito acima, LEC em cultura expressa Nrp2 fortemente (figura 1 suplementar). Entretanto, não foi capaz de detectar Nrp2 por IHC em vasos linfáticos colônicos LYVE-1 positivos de camundon- gos adultos normais (figura 4A; para controle positivo de tingimento vide Fi- gura 4 suplementar). O cólon foi avaliado, visto que ele apresenta um feixe rico de vasos linfáticos com um padrão razoavelmente estereotipado. Foram igualmente incapazes de detectar expressão de Nrp2 por IHC dentre os va- sos linfáticos de nódulos linfáticos (figura 4B) e pele de camundongos adul- tos normais. Esses resultados foram confirmados por hibridização Nrp2 in situ (ISH). Em contraste, uma expressão forte de Nrp2 foi observada em va- sos linfáticos LYVE-1 + em nódulos linfáticos adjacentes aos tumores trans- plantados de forma ortotópica ou heterotópica (figura 4C). Isto foi observado para um número de linhas tumorais inclusive a linha de adenocarcinoma de mama de murinos transplantada de forma ortotópica, 66c14 (Aslakson e Mil- Ier1 Câncer Res 52, 1399-1405 (1992)) e a linha de glioblastoma de ratos transplantada de forma heterotópica, C6 (dados não mostrados). Nrp2 foi também observado em linfáticos peritumorais e intratumorais (figura 4D) pa- ra um número de linhas tumorais inclusive 66c14, C6 e PC3 (linha de carci- noma de próstata humana). Essa expressão foi confirmada por ISH em um subconjunto de tipos de tumores. Exemplo 6

Anti-Nrp2B reduz metástase em pulmões em modelos múltiplos de tumores Materiais e métodos

Todos os estudos com animais ocorreram de acordo com o "Guia para o cuidado e emprego de animais de laboratório", publicado por NIH (Publicação NIH 85—23, revisado en 1985). Um Comitê Institucional para o Cuidado e Emprego de animais (IACUC) aprovou todos os protocolos com animais. Modelos de tumor

Para 66C14, células foram colhidas por tripsinização, lavadas, e ressuspensas em PBS a uma concentração de 2x105 células em 10 μΙ PBS. Camundongos foram anestesiados empregando 75 mg/kg de cetamina e 7,5 mg/kg de xilazina, e uma incisão foi efetuada embaixo do membro dianteiro direito. 2x105 células em 10 μΙ de PBS foram injetadas diretamente dentro da quarta capa de gordura mamária exposta de camundongos fêmeas balb-C com 6-8 semanas de idade. Para C6, 2x106 células tumorais em 100 μΙ de PBS foram injetadas subcutaneamente dentro do flanco direito de camun- dongos fêmeas balb-C com 6-8 semanas de idade. Para ambos os conjuntos de estudos, o crescimento tumoral foi monitorado 3 vezes por semana. Quando os tumores atingem um tamanho médio def 80-120 mm3, os ca- mundongos são classificados para resultar tamanhos médios de tumores praticamente iguais, e o tratamento foi iniciado. Este foi considerado como o dia 1 de cada estudo. Animais foram tratados com anticorpo de controle (10mg/kg), Anti-Nrp2B (10mg/kg) ou VEGFR3 ECD 25mg/kg de IP duas ve- zes por semana até o término do estudo. Todos os estudos foram repetidos 3 vezes para garantir a reprodutibilidade. Ao término do estudo, os animais foram anetesiados e perfundi-

dos com PFA a 4%. Tumores foram colhidos, crioprotegidos e congelados em OCT (Tecido-Tek). Pulmões foram inflados por meio de uma perfusão do ventrículo direito de 10ml de PBS seguido por 4% PFA1 e contagem visual de lesões metastáticas foram executadas antes da análise por Micro-CT.

Metástase SLN foi avaliada por implantação heterotópica de células tumorais C6 no ouvido. Resumidamente, um grupo de animais foi pré-tratado com anticorpo de controle (10mg/kg) ou Anti-Nrp2B (10mg/kg), um dia antes da implantação das células tumorais, e duas vezes por semana a partir de então. 1x105 células C6 IacZ foram injetadas subcutaneamente dentro do ouvido de 70 camundongos fêmeas balb/c nus. Os camundongos foram sacrificados nos dias 3, 6, 9, 13 e 15, e nódulos linfáticos sentinela foram identificados por Iinfangiografia cutânea e subseqüentemente disse- cados. Nódulos linfáticos foram homogeinizados e Iisatos testados quanto à atividade de β-galactosidase (Pierce).

Linfangiografia intradérmica foi executada em camundongos de controle e camundongos portando tumores como a seguir. 2μΙ de corante azul "evans" (3% em peso) contendo 20nm de microgrânulos de poliestireno fluorescente a 1% (amostras moleculares) foi injetado intradermicamente no ápice do tumor. Deixou-se que os animais se recuperassem por 2 horas e então eles foram sacrificados. Tumores foram dissecados com cuidado para não incluir tecido peritumoral. Eles foram então ou fixados e então analisa- dos histoquimicamente ou foram incubados em formamida para extrair "e- vans" blue e quantificados com uma medição OD6OO por espectrofotômetro. Análise micro-CT de pulmões

Pulmões foram imersos em 1NBF a 0% por 24 horas, e então foram imersos em uma solução 20% de um agente de contraste para tomografia microcomputada por raios X, baseado em iodo, Isovue370 (Bracco Diagnostics Inc1 Princeton, NJ), diluído com PBS por 24 horas. Os pulmões foram então imersos em e perfundidos através da cânula traquéia com 20ml de óleo de soja (Sigma-AIdrich, St. Louis, MO) a uma taxa de 0,25ml/min.). O óleo de soja foi então empregado para remover o excesso de agente de contraste e para proporcionar um meio de fundo para a formação de imagem. Os pulmões de camundongos foram então imageados ex-vivo por meio de um sistema de tomografia computada por raios-X (micro-CT) tipo VivaCT (SCANCO Medicai, Basserdorf, Suiça). Uma imagem "sagittal scout", comparável com raio X convencionais planares, foi obtida para definir os pontos inicial e final para a aquisição axial de uma série de fatias de ima- gens em corte micro-CT. A localização e o número de imagens axiais foram escolhidos para proporcionar uma cobertura completa do pulmão. Os pul- mões foram então imersos em óleo de soja como meio de fundo. As ima- gens de micro-CT foram geradas por operação do feixe de raios-X a um ní- vel de energia de 45 kV, uma corrente de 160 μΑ e um tempo de integração de 450 milissegundos. Imagens axiais foram obtidas a uma resolução isotró- pica de 21 μΐη. As estimativas de tumor de pulmão (número e volume) foram obtidas por um algoritmo de análise de imagem semiautomatizado que inclui uma etapa de inspeção por um usuário treinado. Tumores pulmonares apa- recem como uma massa sólida hiperintensa relativamente às estruturas po- rosas, em forma de trama de um pulmão normal. Isso se deve à absorção do agente de contraste de iodo por estruturas sólidas (paredes bronquiais e al- veolares, tumores, traquéia, mediastino) contidas dentro do pulmão. Agente de contraste em excesso foi retirado dos espaços cheios de ar na etapa de perfusão com óleo. Massas de tumores potenciais foram extraídas por uma série de etapas de processamento de imagem. O software de análise de i- magem foi desenvolvido internamente (in-house). Ele foi escrito em C++ e empregado nas bibliotecas de funções de software de análise de imagens Analyze (AnaIyzeDirect Inc., Lenexa1 KS1 USA). O algoritmo emprega filtra- gem morfológica de limites de intensidade e crescimento por região para extrair todas as massas tumorais potenciais. Um limite de intensidade (1480 Unidades Hounsfield) foi determinado por análise do histograma de 5 pul- mões arbitrários empregados para o desenvolvimento do algoritmo e o limite ótimo foi escolhido de modo a incluir voxels de tumor e a excluir qualquer ruído de fundo. Operações morfológicas (erosão, dilatação) e de crescimen- to por região foram aplicadas para conectar regiões hiperintensas de voxels e para remover quaisquer voxels de densidade semelhante encontrados nas paredes finas dos bronquíolos e auvéolos. A etapa de crescimento por regi- ão requer um volume mínimo de 2300 voxels conectados (maior do que 0,0231 mm3) para ser aceita como um objeto (massa). Os objetos identifica- dos foram então avaliados por um usuário treinado com o software de visua- lização 3D Analyze. Objetos individuais foram aceitados ou rejeitados como tumores possíveis com base na aparência do objeto e sua localização dentro do pulmão. Objetos foram rejeitados se eles residem fora do pulmão (ex. mediasteinum, detritos de tecidos estranhos) ou se parecem com um vaso cheio de sangue. A contagem tumoral, o volume individual tumoral e o volu- me total tumoral foram determinados para cada pulmão. Esta técnica analíti- ca foi validada por meio de um modelo bem estabelecido de metástase tu- moral. Onze animais com transplantes ortotópicos de células tumorais de adenocarcinoma mamário de mama 4T1 foram avaliados com relação à me- tástase no pulmão por esta técnica micro-CT seguida por análise serial histo- lógica dos pulmões. Estimativas de volume de tumores de pulmão foram al- tamente correlacionadas (r = 0,9, ρ = 0,0002) com estimativas histológicas de tamanho tumoral (contagem de pixel; Figura 5 suplementar). Resultados

Uma abordagem principal para inibir metástase tem sido através da inibição do eixo VEGFC (Chen et al., Câncer Res 65, 9004-9011 (2005); He et al., J Natl Câncer Inst 94, 819-825 (2002); Krishnan et al., Câncer Res 63, 713-722 (2003); Lin et al., Câncer Res 65, 6901-6909 (2005)). Para de- terminar se o bloqueio da função Nrp2 também poderia modular o desenvol- vimento da metástase, os efeitos do tratamento Anti-Nrp2B na formação da metástase no pulmão foram testados em dois modelos tumorais diferentes - o modelo de câncer de mama 66c14, e o modelo de glioblastoma C6. 66c14 é uma linha de adenocarcinoma mamário murino derivada de um tumor ma- mário espontâneo em um camundongo Balb/c (Aslakson e Miller, Câncer Res 52, 1399-1405 (1992)). Essas células expressam VEGFC e formam me- tástase através do sistema linfático para os pulmões (Aslakson e Miller, 1992, supra). O transplante ortotópico dessas células em camundongos Balb/c resultou em desenvolvimento reproduzível de tumores e metástase nos pulmões. Tratamento Anti-Nrp2B não afetou a taxa de crescimento pri- mária dos tumores (figura 5A). Tendo em vista que VEGFR3 ECD reduziu dramaticamente as taxas de crescimento primárias de tumor, este foi excluí- do de qualquer análise posterior de metástase. Um grupo de animais (N=6 para cada grupo) com tumores de tamanhos semelhantes de ambos braços de tratamento foram sacrificados concorrentemente, e os pulmões foram dissecados e inflados para facilitar a análise de nódulos metastáticos. Anti- Nrp2B causou uma redução dramática do número médio de nodules metas- táticos visualmente detectados por pulmão, se comparado com animais de controle tratados com IgG (figura 5B, C), de uma média de 3,5 a 0,8 (P = 0,03). Com o fim de confirmar este resultado e extender nossa avaliação de metástase dentro da parênquima do pulmão que não foi viável por exame visual, executou-se uma análise micro-CT (Li et al., Technol Câncer Res Treat 5, 147-155 (2006)) dos pulmões após necrópsia. Esta análise confir- mou que animais tratados com Anti-Nrp2B tiveram uma redução do número de metástases no pulmão quando comparado com animais de controle tra- tados (figura 5D-F). Entretanto, a análise micro-CT foi mais sensível do que a análise visual, resultando em um maior número absoluto de nódulos me- tastáticos em ambos os grupos. Micro-CT também permitiu que fosse determinada a carga metastática total dentro do pulmão. Tratamento com Anti-Nrp2B também resultou em uma redução do volume metastático total (0,74 cm3) em comparação com o tratamento de controle (1,78 cm3). Adicionalmente, essa análise verificou que a vasta maioria de lesões ocorreu na superfície dos pulmões em ambos os animais de controle e tratados com Anti-Nrp2B. Portanto, Anti-Nrp2B não causou uma redução na metástase pela transferência dos nódulos da superfície do pulmão para o parênquima do pulmão.

A análise FACS1 executada conforme descrito no Exemplo 4, indicou que Nrp2, mas não VEGFR2 ou VEGFR3 foi expresso em células tumorais 66c14. Isto levantou a possibilidade de que tratamento com Anti- Nrp2B estivesse afetando o comportamento da célula tumoral diretamente para ímpactar a metástase. Isto era improvável dado a ausência de efeito no crescimento tumoral primário com o tratamento com Anti-Nrp2B. Adicional- mente, Anti-Nrp2B não teve nenhum efeito na proliferação de células tumo- rais, apoptose ou migração in vitro. Entretanto, para levar em conta a possi- bilidade de que a redução da metástase foi devido a efeitos de Anti-Nrp2B nas células tumorais, também foi avaliado o efeito de Anti-Nrp2B no modelo de glioblastoma de ratos C6. Essas células não expressam Nrp2 na sua su- perfície em um grau apreciável (figura 6E), elas expressam VEGFC, e acre- dita-se que elas sofram metástase para o pulmão através do sistema linfáti- co (Bernstein and Woodard, 1995). Adicionalmente, elas foram engenheira- das para expressar bgalactosidase, a qual pode ser empregada como um marcador para facilitar a deteção de células tumorais.

O transplante subcutâneo dessas células em camundongos nus resultou no desenvolvimento consistente de tumores e de metástase no pulmão. Tratamento com Anti-Nrp2B não afetou a taxa de crescimento primá- ria desses tumores (figura 6A). Adicionalmente, VEGFR3 ECD não reduziu dramaticamente a taxa de crescimento primária tumoral neste modelo de tumor. Isto permitiu que se fizessem comparações entre os efeitos metastá- ticos de VEGFR3 ECD e Anti-Nrp2. Novamente, um grupo de animais (N=10) com tumores de tamanhos semelhantes de todos os braços de tra- tamentos foram sacrificados e os pulmões foram dissecados e inflados para facilitar a análise para nódulos metastáticos. Tratamento com ambos, Anti- Nrp2B e VEGFR3 ECD, causou uma redução no número médio de nódulos metastáticos detetados visualmente por pulmão (figura 6B, C). A redução notada com Anti-Nrp2B foi comparável com a verificada com VEGFR3 ECD. Análise Micro-CT dos pulmões confirmou essas descobertas (figura 6D) e verificou que a vasta maioria de metástases se localizou na superfície dos pulmões em todos os braços de tratamentos. Nódulos se confirmaram como sendo lesões metastáticas por histologia em ambos os modelos de tumor (figura 5H e 6G). Adicionalmente, uma necropsia geral não revelou nódulos na superfície dos outros órgãos em qualquer um dos modelos de tumor.

Embora na descrição precedente a invenção seja ilustrada com referência a certos modos de realização, ela não é de modo algum por estes limitada. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica, a partir da descrição anterior, e caem dentro do escopo das reivindicações anexadas.

Todas as referências citadas através da especificação, e as re- ferências nelas citadas, são aqui expressamente incorporadas por referência em sua totalidade.

Claims (44)

1. Método para inibir a migração de células linfáticas e endoteli- ais, compreendendo a administração a um mamífero com necessidade de uma quantidade eficaz de um antagonista de neuropilin-2 (Nrp2).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido mamífero é um paciente humano.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido paciente humano foi diagnosticado com câncer.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referido paciente humano desenvolveu ou tem o risco de desenvolver uma metásta- se tumoral.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a referida metástase ocorre no sistema linfático.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a referida metástase ocorre em um órgão distante.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em carcinoma, linfoma, blasto- ma, sarcoma, e leucemia.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer celular escamoso, câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de célula não- pequena, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico, câncer gastroin- testinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer de rins ou renal, câncer de fígado, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, linfoma da célula B, leucemia linfocíti- ca crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; distúrbio Iinfoproliferativo pós- transplante (PTLD), proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema associado a tumores cerebrais, e síndrome de Meig.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o referido Iinfoma de célula B é selecionado do grupo que consiste em Iinfoma não de Hodgkin de baixo grau folicular (NHL); NHL Iinfocitico pequeno (SL); NHL folicular de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imu- noblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de célula não- clivada pequena de alto grau; NHL doença volumosa; Iinfoma de célula de manto; Iinfoma relativo a AIDS; e macroglubulinemia de Waldenstrom.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido antagonista de Nrp2 é um anticorpo anti-Nrp2.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo anti-Nrp2 é um anticorpo anti-Nrp2B.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo anti-Nrp2 compreende as seqüências de domínio variável de ca- deia leve e/ou pesada de YW68.4.2 ou YW68.4.2.36, ou um seu fragmento ou variante.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referido anticorpo anti-Nrp2B é selecionado do grupo que consiste em YW68.4.2 e YW68.4.2.36, e seus fragmentos.

14. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo anti-Nrp2 é um anticorpo anti-Nrp2A.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido anticorpo anti-Nrp2A compreende as seqüências de domínio variável de ca- deia leve e/ou pesada de YW126.20, ou um seu fragmento ou variante.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o referido anticorpo anti-Nrp2A é YW126.20, ou um seu fragmento.

17. Processo para inibir linfangiogênese tumoral, compreenden- do a administração, a um mamífero portador de tumor, de uma quantidade eficaz de um antagonista de Nrp2.

18. Processo para inibir metástase tumoral, compreendendo a administração, a um mamífero portador de tumor, de uma quantidade eficaz de um antagonista Nrp2.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou rivindicação 18, em que o referido mamífero é um paciente humano com câncer.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido paciente humano com câncer desenvolveu ou tem o risco de desenvolver metástase tumoral.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a referida 10 metástase tumoral ocorre no sistema linfático.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a referida metástase tumoral ocorre em um órgão distante.

23. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia.

24. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer celular escamoso, câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de célula não- pequena, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gástrico, câncer gastroin- testinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer de rins ou renal, câncer de fígado, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer de cabeça e pescoço, linfoma da célula B, leucemia linfocíti- ca crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; distúrbio Iinfoproliferativo pós- transplante (PTLD), proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema associado a tumores cerebrais, e síndrome de Meig.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o referido linfoma de célula B é selecionado do grupo que consiste em linfoma não de Hodgkin de baixo grau folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL folicular de grau intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imu- noblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de célula não- clivada pequena de alto grau; NHL doença volumosa; Iinfoma de célula de manto; Iinfoma relativo a AIDS; e macroglubulinemia de Waldenstrom.

26. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o referido antagonista Nrp2 é um anticorpo anti-Nrp2.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o referido anticorpo anti-Nrp2 é um anticorpo anti-Nrp2B.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o referido anticorpo anti-Nrp2B compreende as seqüências de domínio variável de ca- deia pesada e/ou leve de YW68.4.2 ou YW68.4.2.36, ou um seu fragmento ou variante.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o referido anticorpo anti-Nrp2B é selecionado do grupo que consiste em YW68.4.2 e YW68.4.2.36 e seus fragmentos.

30. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o referido anticorpo anti-Nrp2 é um anticorpo anti-Nrp2A ou um seu fragmento.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o referido anticorpo anti-Nrp2A compreende as seqüências de domínio variável de ca- deia pesada e/ou leve de YW126.20, ou um seu fragmento ou variante.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o referido anticorpo anti-Nrp2A é YW126.20, ou um seu fragmento.

33. Anticorpo anti-Nrp2B compreendendo a seqüência de região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em YW68.4.2 e YW68.4.2.36, ou um seu fragmento ou varian- te.

34. Anticorpo de acordo com a reivindicação 33, em que a refe- rida variante é uma variante de afinidade madura.

35. Anticorpo de acordo com a reivindicação 33, selecionado do grupo que consiste em YW68.4.2 e YW68.4.2.36 e seus fragmentos.

36. Anticorpo anti-Nrp2A que compreende as seqüências de re- gião variáveis de cadeia pesada e/ou leve de YW126.20, ou um seu frag- mento ou variante.

37. Anticorpo de acordo com a reivindicação 36, em que a refe- rida variante é uma variante de afinidade madura.

38. Anticorpo de acordo com a reivindicação 36, que é YW126.20 ou um seu fragmento.

39. Composição que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 33-38, em mistura com um veículo far- maceuticamente aceitável.

40. Composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de metástase tumoral, que compreende uma quantidade eficaz de um anta- gonista Nrp2 em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.

41. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 40, em que o referido antagonista é um anticorpo anti-Nrp2.

42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 41, em que o referido anticorpo anti-Nrp2 é selecionado do grupo que consiste em YW68.4.2, YW68.4.2.36 e YW126.20, e seus fragmentos e variantes.

43. Antagonista Nrp2 para uso na prevenção ou no tratamento de metástase tumoral.

44. Anticorpo anti-Nrp2 para uso na prevenção ou no tratamento de metástase tumoral.