BRPI0721721A2 - mÉtodo para obter construÇÕes de dna, fragmento de dna isolado, vetor molecular, cÉlula hospedeira geneticamente modificada, toxina cry de 3 domÍnios modificada, mÉtodo para obter toxina cry 3 domÍnios modificada, composiÇço, mÉtodo para obter uma planta transgÊnica, mÉtodo para suprimir a resistÊncia dos insetos resistentes escolhidos - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA OBTER CONSTRUÇÕES DE DNA, FRAGMENTO DE DNA ISOLADO,VETOR MOLECULAR, CELULA HOSPEDEIRA GENETICAMENTE MODIFICADA, TOXINA CRY DE 3 DOMINIOS MODIFICADA, METODO PARA OBTER TOXINA CRY DE 3 DOMÍNIOS MODIFICADA, COMPOSIÇçO, MÉTODO PARA OBTER UMA PLANTA TRANSGÊNICA, METODO PARA SUPRIMIR A RESISTÊNCIA DOS INSETOS RESISTENTES ESCOLHIDOS.A presente invenção apresenta um método para obtenção de construções de DNA que codificam as toxinas Cry de 3 domínios (também chamadas toxinas Cry, toxinas Bt ou 5-endotoxinas) desprovidas da hélice a-l. Estas construções de DNA foram modificadas para codificar proteínas capazes de matar insetos que apresentam resistência às toxinas Cry não-modificadas correspondentes. As construções de DNA dos genes de toxinas Cry de 3 domínios modificadas e as proteínas Cry de 3 domínios modificadas são apresentadas junto com os métodos, vetores moleculares e as células hospedeiras que contêm estas construções, assim como os métodos recombinantes para produzir as toxinas Cry de 3 domínios modificadas. Além disso, nesta invenção são descritas formulações contendo as Toxinas Cry de 3 domínios modificadas. A resistência dos insetos às toxinas Cry não-modificadas se deve a uma ligação menor da toxina aos receptores que se encontram no intestino do inseto. A presente invenção apresenta a expressão das construções de toxinas Cry de 3 domínios modificadas, os métodos de expressão destas toxinas cry de 3 domínios modificadas, os microorganismos transformados e as plantas transgênicas com construções que expressam as toxinas Cry de 3 domínios modificadas e os métodos para suprimir a resistência a pragas de insetos a toxinas Cry não-modificadas.

Description

MÉTODO PARA OBTER CONSTRUÇÕES DE DNAr FRAGMENTO DE DNA ISOLADO, VETOR MOLECULAR, CÉLULA HOSPEDEIRA GENETICAMENTE MODIFICADA, TOXINA CRY DE 3 DOMÍNIOS MODIFICADA, MÉTODO PARA OBTER TOXINA CRY DE 3 DOMÍNIOS MODIFICADA, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA OBTER XJMA PLANTA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA SUPRIMIR A RESISTÊNCIA DOS INSETOS RESISTENTES ESCOLHIDOS.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As toxinas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) são altamente valorizadas por sua capacidade de controlar pragas de diversas culturas, florestas e insetos que transmitem doenças aos humanos. O desenvolvimento da resistência das pragas de insetos às toxinas Bt é o principal obstáculo para continuar a obter sucesso com este inseticida, que é compatível com o meio ambiente. O principal mecanismo de resistência dos insetos às toxinas Cry envolve uma diminuição da ligação das toxinas Cry a receptores específicos no intestino dos insetos. (Ferré e Van Rie, 2002).

As proteínas CrylA são um grupo de toxinas Bt que matam alguns de insetos lepidópteros chaves. Em linhagens das três principais pragas de algodão [Heliothis virescens (Gahan et al., 2001), Pectinophora gossypiella (Morin et al. , 2003) e Helicoverpa armígera (Xu et al., 2005)], a resistência está ligada às toxinas CrylA com alterações na proteína caderina, que atua como um receptor primário para as toxinas Cry no intestino dos insetos suscetíveis. As mutações no gene da caderina produzem resistência "tipo 1" às toxinas Bt, este tipo de resistência é a resistência que ocorre mais freqüentemente em diferentes insetos. Este tipo de resistência tem altos 3 0 níveis de resistência a pelo menos uma toxina CrylA, que tem caráter recessivo, reduz a ligação de, pelo menos, uma toxina CrylA às membranas de insetos resistentes e apresenta pouca resistência cruzada à toxina CrylC (Ferre e Van Rie, 2002). Curiosamente, a traça-das-crucíferas (DBM), Plutella xylostella, uma praga que ataca a nível mundial vegetais como brócolis e couve-flor, apresenta resistência às toxinas CrylA "tipo 1", mas neste caso não está diretamente associada às mutações no gene da caderina. DBM é o único inseto resistente às toxinas Bt no mundo que foi selecionado no campo (Tabashnik de 2004). A ligação à caderina facilita a clivagem proteolítica de hélice a-1 do domínio Iea formação de um pré-poro oligomérico que é responsável pela toxicidade destas proteínas (Gomeζ et al. 2002) .

Esta invenção mostra que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas produzidas de construções de gene cry de 3 domínios que precisam do DNA que codifica a hélice a-1, matam insetos que são resistentes às toxinas Cry 3 domínios selvagens (Toxinas Cry não-modifiçadas).

As bases genéticas da resistência dos insetos às Toxinas Cry 3 domínios não-modifiçadas está relacionada com as mutações no gene de caderina que codifica o receptor primário das toxinas CrylA. Nos insetos resistentes, o receptor principal está truncado ou ausente, então a ligação das toxinas Cry para as membranas de células do intestino está diminuída ou ausente. Portanto, os insetos resistentes não são sensíveis às toxinas Cry de 3 domínios não-modifiçadas. As toxinas Cry de 3 domínios modificadas que são apresentadas nesta invenção suprem a resistência, já que não precisam da ligação da toxina ao receptor caderina. A toxicidade das toxinas Cry de 3 domínios modificadas foi demonstrada em comparação as duas linhagens de insetos resistentes às toxinas CrylA silvestres e também foi testada com sensibilidade reduzida às toxinas Cry induzidas mediante o silenciamento da transcrição de RNA de caderina. Um grupo de insetos resistentes apresenta resistência tipo 1 por modificação genética no gene caderina, enquanto o outro grupo mostra resistência tipo 1 não ligada às mutações no gene da caderina.

As proteínas CrylA modificadas produzidas pelas construções dos genes que precisam da hélice ct-1 induzem a formação in vitro do pré-poro oligomérico sem a necessidade da ligação ao receptor caderina, ou fragmentos da proteína caderina contendo os locais de ligação toxina Cry ou do anticorpo em formato scFv (scFv73), o qual imita a região da ligação da toxina Cry presente no receptor caderina (Gómez et al., 2002). Em contraste, as proteínas CrylA não-modificadas exigem a presença do anticorpo scFv73 ou de fragmentos de proteína caderina ou da caderina para produzir o pré-poro oligomérico in vitro.

A invenção aqui descrita pode ter aplicações muito amplas por causa da semelhança no modo de ação de proteínas com outras toxinas CrylA com outras toxinas Cry 3 domínios, assim como a presença de vários insetos de um mecanismo comum de resistência às toxinas Cry. Além das proteínas CrylA existem muitas outras toxinas de Bt que são toxinas Cry com uma estrutura de 3 domínios, onde se incluem proteínas com baixa semelhança na seqüência de aminoácidos (de Maagd et al. 2001). Tem sido relatado que as diferentes toxinas Cry 3 domínios (CrylA, CrylB, CrylC, CrylD, CrylE, CrylF, Cry3A, Cry3B, Cry3C5 Cry4A, Cry 4B e Cryll) formam estruturas oligoméricas semelhantes às observadas com a toxina CrylAb e que fossem inseridos na membrana das células do intestino das larvas em branco, formando poros iônicos. Isto sugere que a família de proteínas Cry de 3 domínios tem um mecanismo de ação semelhante (Gomez et al., 2002; Rausell et al. , 2004a, Rausell et al., 2004b; Herrero, S. et al. 2004, Munoz-Garay et al., 2006). Além disso, o mecanismo mais comum de resistência de insetos às toxinas CrylA envolve alterações no receptor caderina primário. Essas alterações impedem a formação das estruturas do pré-poro oligomérico que normalmente é mediada pela interação da toxina Cry com o receptor caderina. Assim, prevemos que diferentes insetos resistentes às toxinas Cry 3 domínios não-modificadas não podem ser sensíveis à toxina Cry 3 domínios modificadas correspondente, ao qual foi identificado o fragmento que codifica a hélice a-1. As toxinas Cry de 3 domínios modificadas produzidas pelas construções genéticas descritas aqui poderão ser apresentadas à população de insetos como inseticidas de aplicação tópica (por exemplo, como inseticidas tipo spray) e organismos transgênicos, ou plantas transgênicas.

ANTECEDENTES

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria membro do grupo de Bacillus cereus (Helgason et al. 2000). Ao contrário de outros membros do grupo de Bacillus cereus, Bt produz cristais paraesporais que são compostos principalmente de proteínas inseticidas chamadas toxinas Cry, toxinas Bt, ou δ-endotoxinas.

As toxinas Bt são tóxicas para alguns insetos específicos e são inócuas aos humanos, vertebrados e plantas. Além disso, são completamente biodegradáveis. Portanto, as toxinas Bt são seguras e efetivas no controle de pragas de insetos. As aplicações destas toxinas incluem: 1) controle de pragas O

desfoliadoras em florestas, 2) controle de mosquitos e moscas

negras que são vetores de doenças nos humanos, 3) controle de

pragas agrícolas através de formulações de inseticidas contendo

toxinas Bt ou microorganismos que as expressem, e 4) controle

de pragas agrícolas por meio de plantas transgênicas que produzem as toxinas Bt.

As proteínas Cry podem ser divididas em vários grupos de acordo com sua homologia. O grupo que contém o maior número de variantes de toxinas Cry é o grupo de proteínas Cry de 3 domínios. Os grupos de homologia de toxinas Cry incluem as toxinas Cry semelhantes às toxinas Bin e Mtx produzidas por Bacillus sphaericus (Crickmore et al. , 1998; Crickmore et al. , 2002). Até esta data temos isolado um grande número de grupos de Bt encontrando desde toxinas ativas até insetos lepidópteros, dípteros ou coleópteros (Schnepf et al. 1998). As toxinas Cry matam insetos porque eles formam poros Uicos na membrana das células epiteliais intestinais da larva.

Estrutura das Toxinas Cry de 3 domínios. Os membros da família das toxinas Cry de 3 domínios são proteínas globulares conformadas por três domínios conectados por conectores simples. As estruturas tridimensionais das toxinas ativadas com proteases CrylAa (específica para lepidópteros) Cry3A, Cry3B (específicas para coleópteros), Cry4Aa e Cry4Ba (específicas para dípteros) e a protoxina de Cry2Aa (específica para dípteros e lepidópteros) foram relatadas (Grouchulski et al. , 1995, Li et al., 1991; Galistki et al. , 2001, Morse et al. , 2001; Boomserm et al., 2005; Boomserm et al., 2006). A identidade de seqüências é baixa entre algumas destas toxinas. Por exemplo, entre as toxinas Cry2Aa e Cry3Aa existem 2 0% da 10

identidade e as toxinas Cry2Aa e CrylAa apresentam somente 17% da identidade em suas seqüências. A pesar da baixa identidade de seqüências destas toxinas, sua estrutura tridimensional é similar, sugerindo que compartilhem mecanismos de ação similares (Figura 1).

Cada toxina da família de toxinas Cry de 3 domínios tem

três domínios estruturais, denominados I, H5 e III. O domínio I

é formado por um ramo de sete hélices-α, onde a hélice central

(hélice ot-5) é cercada por hélices externas. A hélice a-5 é

altamente conservada dentro da família de toxinas Cry de 3

domínios. Este domínio implicou na formação do poro iônico na

membrana do inseto branco. O domínio II consiste em três

lâminas-β anti-paralelas empacadas rodeando um centro

hidrofóbico formando um prisma de estruturas- β. È denominado

domínio II aquele que determina especificidade, é o domínio

mais variável (de Maagd et al., 2001). Os resíduos aminoácidos

envolvidos nos contatos entre os domínios I e II (presentes na

hélice oí-7 e a lâmina β-l) estão altamente conservados dentro

da família de toxinas Cry. o domínio III é formado por duas

folhas de lâminas-β antiparalelas. Este domínio também está

envolvido na especificidade e interação com o receptor (de

Maagd et al. , 2001). Os contatos entre os domínios II e III

(correspondentes às lâminas β-ll e β-12), e a região interior

do domínio III (correspondente às lâminas β-17 e β-23) também

são altamente conservadas dentro da família de toxinas Cry 3 domínios.

Mecanismo de ação. Para matar os insetos, as toxinas Cry de 3 domínios passam de cristais paraesporais compostos de protoxinas a canais iônicos formados por estruturas O

oligoméricas incorporadas na membrana que gera a saída de íons e a Iise celular. 0 cristal paraesporal é ingerido pela larva suscetível, este cristal se solubiliza dentro do intestino da larva. Como mostra a Figura 1, as protoxinas solubilizadas são cortadas por proteases do intestino dando como produto de fragmentos de proteínas de 60-70 kDa (de Maagd et al. , 2001). Essa ativação inicial da toxina envolve o processamento proteolítico da extremidade N-terminal (25-30 aminoácidos para as toxinas Cryl, 58 resíduos de Cry3 e 49 para Cry2Aa) e para o caso das protoxinas Cry longas de 130 kDa (Cryl, Cry4, Cry5, Cry7-Cryl4, Cryl6-21, Cry24-Cry32, Cry39-44, Cry47-48 e Cry50) também é processado na sua extremidade C-terminal aproximadamente a metade da proteína.

Após a clivagem proteolítica inicial, a toxina se liga aos receptores específicos na membrana de microvilosidade apical (cabeça da escova) das células colunares presentes no epitélio intestinal (Schnepf et al. , 1998; de Maagd et al. , 2001). A interação do receptor primário induz a uma segunda clivagem proteolítica da toxina em que se elimina a hélice a-1. Após a segunda clivagem, a molécula da toxina é totalmente ativada e pode ser associada a outras moléculas semelhantes para formar uma estrutura oligomérica. O oligômero da toxina apresenta uma alta afinidade pelo segundo receptor (aminopeptidase ou fosfatase alcalina). A interação com o segundo receptor facilita a inserção nos microdomínios da membrana (Schnepf et al., 1998; Aronson e Shai, 2001; Bravo et al. 2004; Pardo et al. 2006). a inserção da toxina conduz a formação de poros líticos na membrana de microvilosidade apical e finalmente a morte das células (Schnepf et al., 1998; Aronson e Shai, 2001). 15

Nos insetos lepidópteros são descritos, pelo menos, quatro diferentes proteínas capazes de unir as toxinas CrylA: o receptor primário é caracterizado como uma proteína semelhante às caderinas (CADR); 0s receptores secundários são duas proteínas ligadas à membrana por uma ponte de glicosilfosfatidil-inositol (GPI), aminopeptidase-N (APN) e fosfatase alcalina (FAL). Finalmente um glicoconjugado de 270 kDa também é relatado como possível receptor primário (Vadlamudi et al., 1995; Knight et al. , 1994; Jurat-Fuentes et al., 2004; Valaitis et al., 2001).

Nesta invenção utilizaremos a abreviatura CADR para se

referir às proteínas do tipo caderina que atuam como receptor

primário para uma ou mais toxinas Bt. Já que ainda não se

estabeleceu uma nomenclatura sistemática para essas proteínas,

os nomes dos diferentes CADRs presentes em diferentes insetos

variam, por exemplo, Bt-R1 para a caderina de Manduca sexta

(Vadlamudi et al., 1995) e para Bt-R para P. gossypiella (Morin

et al., 2003). As CADRs são proteínas transmembranais com um

domínio citoplasmático e um ectodomínio extracelular contendo

vários motivos repetidos que caracterizam as caderinas, 12

motivos repetidos no caso da Bt-R1 (Vadlamudi et al. , 1995).

Estes ectodomínios contendo locais de ligação a cálcio, as

seqüências de interação com integrinas e seqüências de ligação a caderinas.

2 5 o processo seqüencial na interação da toxina com os

diferentes receptores foi descrito em detalhes para a toxina CrylA em Manduca sexta. Neste inseto, a toxina se une primeiro ao receptor primário Bt-R1. Depois da toxina oligomeriza, ela se uni aos receptores secundários ancorados GPI à membrana, APN OU FAL (Bravo et al., 2004; Jurat-Fuentes et al., 2006). A ligação da toxina CrylAb ao receptor Bt-Ri em M. sexta promove uma clivagem proteolítica adicional na extremidade N- terminal da toxina (eliminando a hélice a-1) . Esta clivagem facilita a formação de uma estrutura pré-poro oligomérica que aumenta sua afinidade com o receptor secundário e que é importante para a inserção da toxina na membrana e para a toxicidade (Gómez et al., 2002; Rausell et al. , 2004a). A incubação da protoxina CrylAb com proteases no intestino de M. sexta, na presença de anticorpos de cadeia única scFv73, que imita o local de ligação presente no 'receptor Bt-Rii também produz preparações de toxina que contém o oligômero de 250 kDa, que carece de hélice a-1 do domínio I (Gomez et al. , 2002, 2003). Este oligômero 250 kDa também forma quando a protoxina de CrylAb é incubado com proteases de intestino de M. sexta, na presença de peptídeos contendo a seqüência de receptor Bt-Ri para a ligação específica da toxina ( regiões repetidas de CADR 7 e 11) (Gomez et al., 2002, 2003).

As estruturas oligoméricas de CrylAb e CrylAc aumentam a sua afinidade de ligação ao receptor do APN umas 100 a 200- vezes, mostrando constantes de dissociação aparentes de 0,75-1 nM (Gomez et al. , 2003, Pardo et al., 2006). O oligômero de 250 kDa, em contraste com o monômero de 60 kDa, é competente na inserção da membrana (Rausell et al., 2004a). Análise da formação de poros em bicamadas lipídicas planas formadas com lipídios sintéticos mostraram diferenças na formação dos poros de oligômeros e monômeros CrylAb. Primeiro, ocorre a formação de poros em uma concentração muito menor com o oligômero do que com o monômero. Em segundo lugar, os canais de íons induzidos pelos oligômeros são mais estáveis e têm uma elevada probabilidade de abertura em oposição aos induzidos pelos monômeros (Rausell et al. , 2004a).

A formação de oligômeros de toxinas Cry é demonstrada para as toxinas CrylAa, CrylAb, CrylCa, CrylDa, CrylEa, CrylFa, CrylCa, Cry3A, Cry3B, Cry3C e Cry4B (Gómez et al. , 2002; Rausell et al., 2004a, Rausell et al., 2004b; Herrero, S. et al., 2004; Munoz-Garay et al., 2006; Tigue, et al. 2001; Likitvivatanavong, et al. 2006). Além disso, a toxina CryllAa oligomeriza na presença de seus receptores (Pérez, correspondência pessoal). Em todos estes casos, a atividade de formação de poro foi muito maior em amostras de toxina que contém estruturas oligoméricas ao contrário daquelas que continham apenas as estruturas monoméricas da toxina. Esses dados apoiam a hipótese de que a formação do oligômero de toxinas Cry aumenta a toxicidade destas proteínas.

Os receptores APN e FAL implicaram no processo de inserção das toxinas CrylA na membrana. A eliminação de APN e FAL por um corte de GPI com tratamento de fosfolipase C específica de fosfatidil-inositol (esta enzima remove proteínas ancoradas com GPI) abate significativamente os níveis de oligômero de Cryl Ab inserido em microdomínios de membrana e reduz drasticamente a atividade de formação de poros da toxina (Bravo et al. , 2004). Além disso, a adição de APN em bicamadas sintéticas planar aumenta a atividade de formação de poros da toxina CrylAa (Schwartz et al., 1997).

Com base nos dados descritos acima,foi proposto um modelo para o mecanismo de ação das toxinas CrylA que envolve a interação seqüencial das toxinas CrylA primeiro com o receptor Bt-Ri e depois com as moléculas de APN-FAL. A interação do monômero de CrylA com o receptor caderina facilita a formação de uma estrutura de pré-poro oligomérico que mostra um aumento na afinidade na ligação o segundo receptor APN ou FAL. 0 pré- poro da toxina se une então a APN ou FAL. Finamente, o pré-poro da toxina é inserido em microdomínios da membrana (balsas lipídicas) induzindo a formação de poros e Iise celular (Bravo et al. , 2004) .

Resistência em insetos às Toxinas Cry. O principal mecanismo de resistência às toxinas Cry envolve uma redução da ligação da toxina aos receptores no intestino do inseto (Ferre e Van Rie,

2002). Mutações em genes que codificam CADRs estão intimamente ligadas com a resistência às toxinas CrylA em pelo menos três principais pragas de insetos: H. virescens (Gahan et al. , 2001), Pectinophora gossypiella (pink bollworm) (Morin et al. ,

2003) e Helicoverpa armígera (Xu et al. , 2005). No caso da traça das crucíferas (DBM) Plutella xylostella, uma praga mundial de vegetais como brócolis e couve-flor, a resistência ao "tipo 1" não está diretamente relacionada com mutações no gene da caderina. No entanto, é possível que a mutação nesta linha de insetos resistentes possa indiretamente afetar a expressão da proteína caderina (Baxter et al. 2005)

A criação de plantas transgênicas que produzem toxinas Cry para matar pragas de insetos é um marco importante em relação à redução no uso de inseticidas químicos e aumentar a utilização de alternativas compatíveis e amigáveis com o meio ambiente para o controle de insetos. As toxinas Cry são produzidas continuamente em plantas transgênicas, o que lhes permite o controle de insetos perfuradores que são protegidos de inseticidas químicos pulverizados sobre a superfície. A produção de toxinas Cry foi aprimorada através da engenharia genética de genes cry fazendo uso de códons compatíveis com as plantas, eliminando as possíveis seqüências de processamento de RNA e corte da região C-terminal da protoxina (Schuler et al., 1998).

As plantas transgênicas resistentes a insetos têm sido utilizadas em larga escala desde 1996. 0 milho Bt e o algodão Bt foram cultivados em 26 milhões de hectares 2005 (James 2 005) . Este uso mais amplo das culturas Bt provoca uma intensa pressão de seleção para resistência a toxinas Bt em populações de pragas de insetos (Tabashnik 1994, Gould 1998). Se a praga de inseto desenvolve resistência, a utilidade de toxinas Bt é encerrada. Em resposta a este desafio, foram desenvolvidas e implementadas estratégias de manejo de resistência para prolongar a eficácia das culturas Bt.

A principal estratégia para prevenir a resistência às culturas Bt é a utilização de abrigos (Gould, 1998). Os abrigos são áreas de cultivo não-transgênicos nas proximidades de culturas Bt. 0 objetivo da estratégia de abrigos é atrasar a resistência mantendo as populações de insetos suscetíveis que podem acasalar com insetos resistentes. Na maioria dos casos estudados, a resistência às toxinas Cry é conferida por mutações recessivas (Ferre e Van Rie, 2002, Connor et al. 2003, Tabashnik et al., 2003). Com a resistência recessiva, o entrecruzamento de homozigotos de insetos resistentes que podem surgir a partir de culturas Bt com insetos homozigotos suscetíveis da área de abrigo produzirá descendência heterozigota a qual é suscetível à toxina Cry expressa pelas culturas Bt. Embora esta estratégia pareça ser útil para retardar a resistência, não foram realizados testes de campo rigorosos de grande escala (Tabashnik et al., 2005). Em qualquer caso, espera-se que a estratégia de refúgio retarde a resistência, mas não a impeça.

A resistência aos cultivos Bt no campo não foi descrita ainda, no entanto a seleção em laboratório gerou grupos resistentes a Bt em muitas pragas de insetos (Tabashnik, 1994; Ferré e Van Rie, 2002; Tabashnik, et al. , 2003). Além disso, a resistência as toxinas Bt em pulverizadores tipo spray foi desenvolvida em populações em campo de borboletas de dorso de diamante, Plutella xylostella (L.) e populações de efeito estufa do enrolador de couve-flor, Trichoplusia ni (Hübner) (Tabashnik, 1994, Ferré e Van Rie, 2002; Janmaat e Myers, 2003, Tabashnik et al. , 2003). Com o uso extensivo de toxinas Bt no mundo e do rápido aumento na sua utilização, a resistência a pragas de insetos a toxinas Cry usadas atualmente é uma ameaça cada vez mais importante para a saúde humana, para a produção de alimentos e para o meio ambiente. Portanto, as toxinas Cry modificadas que matam insetos resistentes são desejáveis e absolutamente necessárias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1.- Mecanismo de ação das toxinas Cry de 3 domínios não- modificadas

Figura 2. - Mecanismo de ação das toxinas Cry de 3 domínios modificadas

Figura 3. - Desenho dos primeiros para reação de PCR das toxinas Cry longas (130 kDa) e curtas (70 kDa)

Figura 4. - Estratégia de PCR para a produção dos genes crylAb e CrylAc desprovidos da extremidade N-terminal da proteína até o final da hélice a-1.

Região do promotor (3 90 bp) Extremidade amino terminal contendo a hélice a-1 Região da toxina desde hélice a-2 até β-23 (1687 bp) Fragmento da extremidade C-terminal de protoxina

(2069 bp)

H Região do terminador (3 68 bp)

Figura 5. - Eletroforese em géis de archilamida SDS-PAGE de Toxinas CrylAb e CrylAc imitadoras modificadas faltando a hélice a-1 mostrando a produção de uma proteína de protoxina de 13 0 kDa.

Figura 6.- Detecção por meio de imunodetecção tipo Western blot das estruturas oligoméricas (250 kDa) da toxina Cryl Ab não- modificada obtida após a incubação da protoxina Cryl Ab com suco gástrico do intestino de Manduca sexta, na presença de fragmentos de proteínas CADR (contendo as repetições, 7-12, 11- 12 ou 12) ou na presença de anticorpos scFv73 ou sem nenhum fragmento de CADR ou anticorpo (controle).

Figura 7. - Detecção por imunodetecção do tipo Western blot das estruturas oligoméricas (250 kDa) obtida unicamente pelo tratamento com tripsina das toxinas Cry de 3 domínios 2 0 modificadas, CrylAbMod e CrylAcMod.

Figura 8. - Eletroforese em géis de agarose mostrando um RNA de cadeia dupla (dsRNA) do fragmento do gene Bt-Ri e do gene de controle obtido após a transcrição ín vitro com T7 polimerase. Figura 9. - Detecção por imunodetecção tipo Western blot de homogeneizados de intestino larval (10 mg) revelados com anticorpo Bt-Ri ou com anticorpos contra proteínas totais de microvilosidades apicais do intestino(anti- BBMV). Os controles (linhas 1 e 2) são duas larvas independentes que foram injetadas com água e cultivadas em dieta artificial sem toxina. As amostras do intestino de 7 larvas independentes (linhas 3 a 9) foram injetadas com 1 pg dsRNA Bt-Ri e cultivadas em dieta artificial 20 ng Cryl Ab/cm2.

Figura 10. - Larvas de Manduca sexta injetadas com Iyg Bt-Ri dsRNA e incubadas em caixas de Petri por três dias em dieta artificial com: A) 20 ng CrylAb/cm2; B) 5 ng Cryl AbMod/cm2; C) água (controle).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições.

O termo "toxina (s) Cry de 3 domínios" se refere a um

(alguns) membro(s) de um subgrupo da família de proteínas inseticidas de cristais também chamadas de toxinas Cry, toxinas Bt, o δ-endotoxinas, que são proteínas globulares formadas por três domínios estruturais distintos (I, II e III) conectados por ligações simples. Embora a identidade de seqüência entre alguns d estas toxinas é baixa, sua topologia estrutural é semelhante, sugerindo que eles compartilham de um mecanismo de ação semelhante (Figura 1). Entre essas toxinas, 3 domínios, a presente invenção é particularmente dirigida ao grupo bem conhecido de toxinas Cry curto(Cry3, Cry2 e Cryll) e toxinas Cry longas (Cryl, Cry4, Cry5, Cry7, Cry8, Cry9, Cryl0, Cryll, Cryl2, Cryl3, Cryl4, Cryl6, Cryl7, Cryl8, Cryl9, Cry20, Cry21, Cry24, Cry2 5, Cry2 6, Cry27, Cry2 8, Cry29, Cry3 0, Cry31, Cry32, Cry3 9, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry47, Cry48 e Cry50), aos quais compartilham mecanismo de ação. Para matar os insetos, estas toxinas devem ser unir a um receptor primário antes de formar uma estrutura oligomérica que é incorporada na membrana de criar poros.

O termo "toxina(s) Cry de 3 domínios não-modifiçada(s)" significa toxina Cry 3 domínios silvestre que não foi modificada. Estas toxinas não-modificadas devem ser ligar ao primeiro receptor e ser processado enzimaticamente, eliminando a hélice a-1 para serem totalmente ativadas e ser tóxico para as larvas suscetíveis (Figura 1).

0 termo "Toxina(s) Cry de 3 -Domínios Modificada(s)" se

referem às toxinas Cry de 3 domínios que foram modificadas para serem desprovidas da hélice a-1. Estas toxinas não devem se ligar ao primeiro receptor nem que sua hélice a-1 seja processada enzimaticamente para ser ativada (Figura 2).

Os termos "Cryl AbMod" e "CrylAcMod" significam duas

Toxinas Cry de 3 domínios Modificadas particulares que são desprovidas de hélice a-1 e que correspondem às toxinas Cry de 3 domínios não-modificadas, CrylAb e CrylAc, respectivamente.

0 termo "Insetos resistentes elegíveis" se referem a

insetos resistentes às toxinas Cry 3 domínios não-modificadas cuja resistência está relacionada com mutações que afetam a expressão do gene do receptor primário (denominado caderina para toxinas CrylA), já que as mutações estejam presentes diretamente no gene do receptor principal ou em outros genes

2 0 que afetam a expressão deste receptor primário. Já que quando o

receptor primário é modificado, truncado, ou não, expressa a ligação de Toxinas Cry 3 domínios não-modificadas à membrana apical das células intestinais é reduzida ou eliminada, e a toxina não pode ser ativada completamente, não forma o

oligômero, não insere na membrana e não matar os insetos. Portanto, estes insetos são resistentes às Toxinas Cry de 3 domínios não-modifiçadas. Esses insetos resistentes são o alvo das toxinas Cry de 3 domínios modificadas da presente invenção, onde as toxinas Cry de 3 domínios modificadas suprem a

3 0 resistência a insetos, uma vez que são capazes de formar oligômeros, de se inserir na membrana e, finalmente, matar estes insetos resistentes.

Como mencionado acima, existe um problema que pode ser um grande problema no início da agricultura, florestas e saúde pública. Esse problema é o aparecimento de resistência às toxinas Cry de 3 domínios não-modificadas em pragas de insetos que continuamente estejam expostas e estas toxinas, já que estas toxinas são pulverizadas ou sejam produzidas por plantas transgênicas. Diferentes estratégias têm surgido para adiar esta questão, mas não se espera que estas estratégias previnam ou se resolvam uma vez que ocorram.

Os inventores desta invenção conceberam e colocaram em prática uma forma de reprimir a resistência dos insetos às toxinas Cry 3 domínios não-modificadas pelos insetos resistentes elegíveis com as toxinas Cry de 3 domínios modificadas, as quais excedem duas etapas no mecanismo de ação das toxinas Cry de 3 domínios não-modificadas (Figura 2): 1) a ligação da toxina ao receptor primário e 2) a clivagem proteolítica adicional na extremidade N-terminal da toxina que permite corte da hélice a-1. Estas etapas são necessárias para facilitar a formação de um pré-poro com estrutura oligomérica pelas toxinas Cry de 3 domínios não-modifiçadas, o pré-poro oligomérico é importante para a inserção da membrana e toxicidade (Gómez et al., 2002; Rausell et al., 2004a). 2 5 Esta invenção é baseada no conhecimento do mecanismo de

ação de certos membros da família de toxinas Cry de 3 domínios (ilustrado na Figura 1), que deverá ser comum para outros membros da família da toxina Cry 3 domínios(Bravo et al., 2004; Gómez et al. , 2002; Rausell et al. , 2004a, Rausell et al. , 2004b; Herrero, S. et al., 2004; Mufioz-Garay et al. , 2006). Esta invenção também se baseia no conhecimento de que os defeitos no receptor primário é o mecanismo mais comum e importante por quais os insetos se tornam resistentes às toxinas Cry (Gahan et al. , 2001, Ferré e Van Rie, 2002; Morin et al., 2003; Xu et al., 2005).

Na primeira concretização, a presente invenção se refere a um método para a obtenção de construção de DNA que codifica toxinas Cry 3 domínios modificadas que são desprovidas da hélice a-1. Como mencionado acima, o corte enzimático in vivo desta porção da toxina facilita a formação de um pré-poro oligomérico nas toxinas Cry de 3 domínios não-modificadas (Figura 1) . A diferença das toxinas Cry de 3 domínios não- modifiçadas, chamadas toxinas Cry de 3 domínios modificadas não requerem para a sua toxicidade nem a ligação ao receptor primário (CADR para toxinas CrylA) nem o corte enzimático da hélice α -1 associada com o receptor primário (Figura 2). Estas construções de DNA são úteis para a produção de toxinas Cry 3 domínios modificadas que excedam a etapa da ligação ao receptor primário e corte da enzima de hélice a-1. As toxinas Cry de 3 domínios modificadas são úteis já que são produzidas por plantas transgênicas ou expressas em outros sistemas, como os microrganismos ou aplicadas de outra forma como inseticidas do tipo spray.

O método de obtenção de construções de DNA que codificam toxinas Cry 3 domínios modificadas que são desprovidas de hélice a-1 consiste nas seguintes etapas:

a) selecionar o gene branco da toxina Cry de 3 domínios que você deseja modificar b) identificar a região de promotor, a região que codifica para o fragmento de proteína e a região codificante de hélice a-1

c) amplificar o gene excluindo a região que codifica para a extremidade amino-terminal e a hélice a-1.

A amplificação do gene que é desprovido da hélice a-1 pode ser realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando um padrão adequado de DNA que contenha o gene da toxina Cry de 3 domínios não-modificadas que foram selecionadas. Isto é feito em duas ou mais etapas de amplificação, dependendo do tamanho do gene e nos fragmentos que se deseja manejar. A primeira etapa de amplificação (PCRl) amplifica somente a região do promotor, o segundo PCR (PCR2) e as etapas subsequentes de amplificação (PCR3) amplificam a região codificadora começando na hélice a-2 até β-23 e se esta também amplifica a região que corresponde à extremidade carboxiterminal da proteína.

Para PCRl, são projetados oligonucleotídeos primeiros da reação de amplificação, incluindo o códon de iniciação (ATG) e o local interno de restrição Ncol. Para PCR2 e ampliações posteriores, os oligonucleotídeos devem ser projetados para obter o número de fragmentos de DNA desejados para incluí-lo na região codificante da proteína incluindo desde a hélice a-2 até a lâmina β-23. Se a extremidade carboxiterminal da proteína estiver presente na toxina Cry de 3 domínios selecionadas também deve ser ampliado incluindo a região do terminador da proteína.

Preferencialmente, os oligonucleotídeos devem incluir locais de restrição em suas extremidades 5' que não estão presentes no gene selecionado. O local interno de Ncol pode ser usado para ligar o produto de PCRl ao PCR2. Os locais de restrição serão selecionados de modo que a extremidade 3' do produto de reação de PCR-I possam ser ligadas apenas à extremidade 5' do produto de reação de PCR-2, e as extremidades 3' do produto de PCR-2 podem estar ligadas apenas à extremidade 5' do produto da PCR-3 e assim por diante. (Figura 3) . Preferencialmente, os locais de restrição específicos incluídos na extremidade 5' do produto de PCRl contendo a região do promotor e na extremidade 3 ' do PCR contendo o terminador devem ser usados para ligar esses fragmentos de DNA a um vetor plasmídico adequado.

A aplicação deste método é ilustrada no exemplo 1 para as toxinas Cry IAb e CrylAc. No entanto, pode ser aplicado a qualquer outra toxina Cry de 3 domínios não-modificadas para se obter a toxina Cry de 3 domínios modificadas correspondente da hélice α-1. A página da web de Neil Crickmore (Crickmore, N., Zeigler, D.R., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J, Bravo, A. e Dean, D. H. "Bacillus thuringiensis toxina nomenclature" 2 005, http://www.Iifesei.sussex.ac.uk/

Home/Neil_Crickmore/Bt/ lista a maioria das toxinas Cry e Toxinas Cry de 3 domínios conhecidas, incluindo os números de acesso NCBI de seu DNA codificante. Qualquer destas toxinas Cry de 3 domínios pode ser selecionada para aplicar o método da presente invenção para obter a respectiva construção de DNA da toxina Cry de 3 domínios modificadas. A expressão destas construções de DNA pode ser obtida facilmente, como se mostra o exemplo 2.

Preferencialmente, o vetor plasmídeo será um vetor com duas origens de replicação que possam ser replicadas em células de Escherichia coli e Bacillus thuringiensis. Os vetores de •expressão podem conter um marcador de seleção, que é um gene codificante de uma proteína necessária para a sobrevivência ou o crescimento da célula hospedeira transformada com o vetor. Normalmente, os genes de marcadores de seleção codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras substâncias (por exemplo, ampicilina, neomicina, ou metotrexato). Os genes marcadores de seleção também podem ser genes que complementam as deficiências auxotróficas ou que proporcionam nutrientes essenciais não disponíveis no meio complexo. A escolha do gene marcador de seleção adequado dependerá da célula hospedeira, no estado da técnica são conhecidos marcadores de seleção adequados para diferentes hospedeiros.

A mistura de ligação pode ser transformada em células de E. coli, e o plasmídeo transformante pode então ser purificado e transformado em células de B. thuringiensis para a expressão de Toxinas Cry de 3 domínios modificadas e a produção de bio- insecticidas. Alternativamente, o gene de toxinas Cry de 3 domínios modificadas pode ser expresso em sistemas heterólogos como outros microrganismos usando vetores adequados (incluindo bactérias, vírus, algas e fungos) ou outros organismos, incluindo células de insetos e plantas transgênicas. Para as plantas transgênicas, o vetor deve ser adequado à transformação e expressão em plantas (como milho, algodão e soja ou outros), para que as plantas produzam toxinas Cry de 3 domínios modificadas. As plantas transformadas desta forma podem assim ser protegidas do ataque de insetos brancos que são resistentes às toxinas Cry de 3 domínios não modificadas. Os usos preferenciais para a aplicação de bio-inseticidas em spray das toxinas Cry de 3 domínios modificadas incluem, sem limitação, a proteção das plantas e as florestas. As pragas que preferencialmente buscam controlar desta forma incluem, mas não estão limitados, insetos lepidópteros.

Para demonstrar como funciona este método, foram obtidos fragmentos de proteínas e toxinas CrylAb e CrylAc que são desprovidas da hélice a-1, por meio do método da presente invenção, tal como ilustrado no Exemplo 1.

As construções de DNA que se codificam em toxinas Cry 3 domínios modificadas que são desprovidas da hélice a-1 obtidos pelo método descrito acima também são abrangidos pelo âmbito da presente invenção.

O exemplo 2 ilustra vetores contendo as construções acima mencionadas que codificam toxinas Cry de 3 domínios modificadas, que são desprovidas da hélice a-1, que estão incluídas no âmbito da presente invenção. É bem conhecido por aqueles versados na técnica que a escolha do vetor dependerá das células hospedeiras que particularmente são usadas. As células hospedeiras geneticamente projetadas que contém os vetores acima mencionados também estão incluídas, algumas células hospedeiras preferidas incluem bactérias, especialmente bactérias Gram positivas, como Bacillus ou bactérias Gram negativas, como Pseudomonas e Escherichia e células de plantas como milho, soja, plantas de batata, algodão e outras.

Os métodos recombinantes para a produção de toxinas Cry de 3 domínios modificadas da presente invenção serão incluídos no âmbito da presente invenção. Em geral, estes métodos incluem as etapas de cultivo de células hospedeiras geneticamente projetadas contendo um vetor que inclui as construções de DNA de toxinas Cry de 3 domínios modificadas. Em condições adequadas de crescimento, as células hospedeiras geneticamente projetadas produzem toxinas Cry de 3 domínios modificadas. Estes métodos incluem também a opção de recuperação das toxinas Cry de 3 domínios modificadas do cultivo celular, quer com esporos ou como proteínas purificadas, ou contidas dentro do organismo hospedeiro.

Estes métodos estão ilustrados no Exemplo 2 para duas Toxinas Cry de 3 domínios modificadas (CrylAbMod e CrylAcMod).

Em outra concretização, são descritas as toxinas Cry de 3 domínios modificadas e codificadas. As toxinas Cry de 3 domínios modificadas não necessitam da ligação ao receptor primário para a formação da estrutura de pré-poros oligomérica. Assim, uma vez que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas que são desprovidas de hélice a-1 são tóxicas aos insetos resistentes escolhidos, ao mesmo tempo continuam sendo tóxicas aos insetos sensíveis às toxinas Cry de 3 domínios não- modificadas.

Como mencionado acima, após solubilização no intestino médio, as três etapas seguintes no modo de ação são: 1) Corte enzimático inicial das proteases do intestino médio, resultando na remoção de um peptídeo N-terminal e região C-terminal (se estiver presente na toxina), 2) ligação ao receptor primário, e 3) segundo corte de enzima que causa a remoção da hélice a-1. Estas três etapas produzem uma proteína capaz de formar estruturas oligoméricas chamadas pré-poro (Fig.l). Um receptor primário (CADR) defeituoso é o mecanismo mais

importante e comum de resistência de insetos a toxinas Cry (Gahan et al. , 2001, Ferré e Van Rie, 2002, Morin et al. , 2003, Xu et al., 2005). As alterações no receptor primário reduzem ou eliminam a ligação de toxinas Cry de 3 domínios não- modificadas, aparentemente impedindo a clivagem enzimática da hélice α-l e inibindo a formação da estrutura oligomérica de pré-poros necessária para a toxicidade. As toxinas Cry de 3 domínios modificadas que são desprovidas da hélice α-l. Assim, para matar insetos, estas toxinas não são obrigadas a se ligara ao receptor primário, nem a clivagem associada a esta ligação resultando na perda de hélice α-l. Como não exigem a ligação ao receptor primário, os defeitos no receptor primário que bloqueariam a ligação, não bloqueiam a sua toxicidade. Em outras palavras, as toxinas Cry de 3 domínios modificadas suprem a resistência de insetos porque não exigem interação com o receptor primário.

Para ilustrar estas toxinas Cry de 3 domínios modificadas, foram obtidas as construções de DNA que codificam toxinas Cry IAB e Cry IAC modificadas (carentes de hélice α-l) como mostrado no Exemplo 1 e as toxinas modificadas foram expressas como mostrado no exemplo 2.

Para demonstrar que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas podem formar estruturas oligoméricas de pré-poro, as protoxinas de duas toxinas Cry de 3 domínios modificadas, 2 0 CrylAbMod e CrylAcMod foram tratadas apenas com a protease tripsina produzindo assim os oligômeros de 2 50 kDa. Em contrapartida, o mesmo tratamento de tripsina das protoxinas das duas toxinas Cry de 3 domínios não-modifiçadas, CrylAb e CrylAc, apenas produz a estrutura do monômero de 60 kDa, conforme mostrado no exemplo 3.

A toxicidade das toxinas Cry de 3 domínios modificadas foi determinada para que se alimentem em bioensaios larvas de insetos suscetíveis e resistentes com dietas contendo diferentes concentrações da toxina Cry de 3 domínios modificada. A toxicidade de CrylAbMod e CrylAcMod foi comparada com duas contrapartes não-modificadas CrylAb e CrylAc contra larvas de primeiro estágio da lagarta-rosada (Pectinophora gossypiella) suscetível (selvagem) e lagarta-rosada resistentes às toxinas CrylAb e CrylAc. A toxicidade de CrylAcMod também foi comparada com a de sua contraparte, CrylAc não-modificada, contra larvas de primeiro estágio de grupos sensíveis e resistentes a CrylAc da traça das crucíferas. As toxinas não- modificadas CrylAb e CrylAc eram altamente tóxicos para larvas suscetíveis, mas não para as larvas resistentes (Tabelas 1 e 2). Em contraste, as toxinas Cry de 3 domínios modificadas de CrylAbMod e CrylAcMod mataram tanto as larvas suscetível como as resistentes (Tabelas 1 e 2). Estes resultados mostram que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas usadas como exemplo (CrylAbMod e CrylAcMod) suprimem o alto nível de resistência às toxinas CrylA não-modifiçadas nos insetos resistentes escolhidos, que estão associados com as mutações que afetam a expressão do receptor primário (CADR em caso de CrylA), seja mutações diretas no gene de tal receptor primário (como no caso da lagarta-rosada) ou em genes que afetam indiretamente a 2 0 expressão dos receptores primários (como parte de trás da traça das crucíferas).

Para testar a toxicidade das toxinas Cry de 3 domínios modificadas da presente invenção contra um inseto branco, Manduca sexta, para os quais ainda não foram isoladas ou

2 5 cultivadas populações de insetos resistentes, foram obtidas

larvas de M sexta com o receptor CADR silenciado e testadas para determinar a resistência à toxina Cryl Ab não-modifiçada, conforme descrito no Exemplo 5. Com essas larvas de M. sexta (com o receptor CADR silenciado), foram testadas quanto à

3 0 toxicidade da toxina Cry de 3 domínios modificada CrylAbMod, como mostrado no Exemplo 6. Os resultados também demonstram que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas matam insetos que são resistentes às toxinas Cry de 3 domínios não-modifiçadas correspondentes.

Em outra concretização, a presente invenção se refere a um

método para eliminar a resistência dos insetos resistentes escolhidos, que matam insetos ao permitir que comam alimentos que contenham uma quantidade suficiente de toxina Cry de 3 domínios modificada da presente invenção. As doses letais dependem de muitos fatores incluindo: a mistura de excipiente utilizada; a técnica e as condições de aplicação; se a formulação é um aerossol, uma película, ou partículas discretas; a espessura da película ou o tamanho das partículas e similares por estilo. A resolução destes fatores e outras considerações necessárias para determinar a dose letal de toxinas Cry de 3 domínios modificadas estão dentro da capacidade daqueles com base nas técnicas.

Para alimentar os insetos resistentes escolhidos com toxinas Cry de 3 domínios modificadas, tais toxinas devem estar disponíveis na dieta das populações de insetos. Isto pode ser feito através da aplicação de formulações contendo as toxinas Cry de 3 domínios modificadas. Isso também pode ser gerado por plantas transgênicas contendo as construções de DNA que codificam as toxinas Cry de 3 domínios modificadas ligadas de maneira operável a vetores de expressão adequados para as plantas, de tal forma que tal planta transgênica produza as toxinas Cry de 3 domínios.

O método para obtenção destas plantas transgênicas é caracterizado, em uma outra concretização, por compreender etapas de transformação da célula de planta com o fragmento de DNA isolado contendo uma região codificante para a toxina cry de 3 domínios modificada, de cultivo das células da planta sob condições adequadas e, finalmente, de regeneração da dita planta transgência. As formulações e organismos transgênicos podem ser

utilizados para culturas agrícolas, florestas e controle do vetor de doenças. Por exemplo, existem algumas árvores geneticamente modificadas para produzir toxinas Bt, também foram geneticamente modificadas algas que produzem toxinas Bt para controle de mosquitos.

Para matar insetos resistentes escolhidos, pode-se aplicar regularmente formulações que contenham as toxinas Cry de 3 domínios modificadas onde a praga de insetos se alimenta. Por exemplo, pode ser aplicado às plantas (folhas, caules, raízes ou outras partes da planta) para matar pragas de insetos resistentes de culturas ou florestas e corpos d'água para matar vetores de doenças humanas de insetos resistentes escolhidos que vivem na água durante a sua fase larval (por exemplo, mosquitos e moscas pretas). Isto pode ser feito em ciclos alternando as aplicações das formulações que contenham toxinas Cry de 3 domínios não-modif içadas (sem Toxinas Cry de 3 domínios modificadas) com aplicações de formulações que contenham toxinas Cry de 3 domínios modificadas. As toxinas Cry de 3 domínios modificadas não podem ser aplicadas até que seja calculada ou observada o aparecimento de insetos resistentes escolhidos, em seguida, as formulações que contêm as toxinas Cry de 3 domínios modificadas podem ser aplicadas para matar insetos resistentes.

Outra concretização da presente invenção diz respeito às novas formulações ou composições contendo uma ou mais toxinas Cry de 3 domínios modificadas para suprimir a resistência dos insetos resistentes escolhidos. Nas formulações, as Toxinas Cry de 3 domínios modificadas podem ser contidas em organismos hospedeiros ou associadas com esporas, ou em uma preparação homogênea de proteínas puras ou uma mistura de esporas com organismos transformados cultivados. As toxinas Cry de 3 domínios modificadas também podem estar contidas em um microorganismo não-esporulante, como Escherichia coli ou microorganismos esporulantes como Bacillus megaterium ou B. thuringiensis associados com esporas do grupo utilizado para expressá-las ou como cristais isolados (e opcionalmente proteína Cry pura) com uma mistura de excipientes. A quantidade da mistura de excipiente utilizada dependerá da potência desejada da formulação. Na escolha da mistura de componentes de excipientes da formulação, deve-se considerar o efeito final previsto para a formulação. Por exemplo, as misturas de excipientes agronomicamente aceitáveis devem ser utilizadas para as formulações que serão aplicadas às culturas e misturas de excipientes ecologicamente aceitáveis devem ser selecionadas para as formulações que serão aplicadas às florestas (para controle de insetos resistentes escolhidos de vetores de insetos) e corpos de água (para controle de vetores de insetos resistentes elegíveis).

A mistura de excipientes pode incluir transportadores, agentes surfactantes, protetores UV e outros componentes, e podem assumir a forma de pós molháveis, líquidos concentrados, grânulos ou outras formulações. Estas formulações e os procedimentos de aplicação são bastante conhecidos na técnica.

O termo "excipiente", como está sendo usado aqui, significa um material inerte sólido ou líquido, que pode ser inorgânico ou orgânico e de origem sintética ou natural, que é misturado com o composto ativo para facilitar sua aplicação às plantas, sementes, solos, água ou outros objetos a serem tratados ou o seu armazenamento, transporte e/ou manejo. Qualquer um dos materiais comumente utilizados na formulação de bio-pesticidas, por exemplo, são adjuvantes adequados aceitáveis em horticultura, agricultura e ecologia. Alguns excipientes sólidos adequados são de barro e silicatos naturais e sintéticos, tais como sílica natural, como terra de diatomáceas, silicatos de magnésio, por exemplo, talco, silicatos de alumínio e magnésio, por exemplo, atapulgita e vermiculita, silicatos de alumínio, por exemplo, caulinitas, montmorilonitas e micas; carbonato de cálcio, sulfato de cálcio, óxidos hidratados de silicone sintéticos e silicatos sintéticos de cálcio ou alumínio; elementos como, por exemplo, carbono e enxofre, resinas naturais e sintéticas, como, por exemplo, resinas cumarona, cloreto de polivinila e polímeros e copolímeros de estireno, betume, ceras, tais como, cera de abelha, por exemplo, parafina, e ceras minerais cloradas, adubos sólidos, por exemplo, superfosfatos; e materiais materiais fibrosos naturais do solo, tais como sabugo de milho.

Exemplos de excipientes líquidos apropriados são água, alcoóis, como o álcool isopropílico e propilenoglicol, cetonas, como a acetona, metil etil cetona, metil isobutil cetona e cicloexanona, éteres, como cellosolvato, hidrocarbonetos 2 0 aromáticos, como benzeno, tolueno e xileno, frações de petróleo, tais como o querosene, óleos minerais leves, hidrocarbonetos clorados, como tetracloro carbono, PERC e triclorometano. Outros compostos adequados são compostos gasosos, que normalmente são vapores ou gases. Misturas de diferentes líquidos são comumente adequadas.

Pode-se adicionar um agente surfactante, pode ser um agente emulsificante, um agente dispersante ou um agente umectante: pode ser não-iônico ou iônico. Qualquer dos agentes surfactantes normalmente aplicados na formulação de herbicidas ou inseticidas podem ser utilizados. Alguns exemplos de agentes surfactantes adequados são sais de sódio e cálcio de ácidos poliacrílicos e sulfônicos; os produtos de condensação de ácidos graxos ou aminas alifáticas ou amidas contenham pelo menos 12 átomos de carbono na molécula com óxido de etileno e/ou óxido de propileno, ésteres de glicerol e ácidos graxos, sorbitano, sacarose ou pentaeditol; condensados destes com óxido de etileno e/ou óxido de propileno, produtos de condensação de alcoóis graxos ou alquilfenóis, por exemplo, p- octifenol ou p-octilcresol, com óxido de etileno e/ou óxido de propileno, sulfatos ou sulfonatos destes produtos de condensação, sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, de preferência, sais de sódio de ésteres de ácido sulfúrico ou ácido sulfônico que contenham pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, por exemplo, lauril sulfato de sódio, sulfato de sódio alquil secundário, sais de sódio de óleo de mamona sulfonado, e alquil-aril sulfonatos de sódio como dodecilbenzeno sulfonato de sódio e polímeros de óxido de etileno e copolímeros de óxido de etileno ou propileno.

Alguns exemplos de protetores UV são mencionados na patente norte-americana No. 5.141.744, onde são descritos macrogéis estáveis (pelo menos seis meses) que contenham protetores UV (como Octal-dimetil PABA) que são usados com pesticidas, incluindo toxinas Bt, que oferecem vantagens na proteção contra a inativação pela luz solar. A patente norte- americana No. 4.094.969 divulga outra maneira de estabilizar formulações de pesticidas que contenham toxinas Bt que rapidamente se degradam com a exposição à luz solar mediante a adição de copolímeros sulfonados.

As composições da presente invenção podem ser preparadas em pó molhável, grânulos, soluções, concentrados emulsionáveis, emulsões, concentrados em suspensão e aerossóis. Os pós umectantes geralmente são compostos para conter de 25 a 75% em peso de composto ativo e, geralmente, contêm, além do transportador sólido, de 3 a 10% em peso do agente de dispersão, de 12 a 15% de um agente surfactante e, quando necessário, de 0 a 10% em peso de estabilizantes e outros aditivos, tais como penetradores ou adesivos. Os pós são normalmente formulados como um pó concentrado que tem uma composição semelhante à pós umectantes, mas sem os agentes dispersantes ou agentes surfactantes, e são diluídos no campo com transportadores sólidos adicionais para produzir uma composição que usualmente contém de 0,5 a 10% em peso do composto ativo. Os grânulos são geralmente preparados para ter um tamanho entre 10 e 100 BS mesh (1.676-0,152mm), e podem ser fabricados por técnicas de aglomeração ou impregnação. Geralmente, os grânulos contêm 0,5 a 25% em peso do composto ativo, 0 a 1% em peso de aditivos como estabilizantes, modificadores de liberação lenta e agentes aglutinantes. Os concentrados emulsionáveis geralmente contêm, além do solvente e, quando necessário, co-solvente, de 10 a 50% peso em volume do composto ativo, de 2 a 2 0% em peso por volume de emulsificantes e de 0 a 20% em peso por volume de aditivos adequados, como estabilizantes, penetrantes e inibidores de corrosão. Os concentrados em suspensão são feitos para produzir um produto estável, não sedimentável e fluido e, geralmente, contêm de 0 a 75% em peso de compostos ativos, 0,5 a 5% em peso dos agentes de dispersão, de 1 a 5% de agentes surfactantes, de 0,1-10% em peso de agentes suspensores, tais como anti- espumantes, inibidores de corrosão, estabilizantes, 3 0 particularmente para a proteína, penetrantes e adesivos, e como transportador, água ou um líquido orgânico em que o composto ativo é substancialmente insolúvel; certos sólidos orgânicos ou sais inorgânicos podem ser dissolvidos no transportador para ajudar a impedir a sedimentação ou como agentes anti- congelantes para a água.

As formulações de grânulos dispersíveis em água estão sob a forma de grânulos secos e rígidos que são essencialmente livres de pós e são resistentes ao desgaste ou uso, minimizando assim a formação de pó. Em contato com a água, os grânulos se decompõem rapidamente para formar suspensões de partículas de material ativo. Tais formulações contêm 90% ou mais em peso de material ativo, de 3 a 7% em peso de surfactantes em pó, que atuam como agentes umectantes dispersantes, agentes suspensores e aglutinantes, e de 1 a 3% em peso de um transportador, que atua como agente suspensor.

As dispersões aquosas e emulsões, por exemplo, as formulações obtidas através da diluição de um pó umectável ou concentrado de acordo com a invenção com água, também são abrangidas pelo âmbito da presente invenção. Tais emulsões

2 0 podem ser do tipo água em azeite ou do tipo azeite em água ou

podem ter uma consistência espessa do tipo maionese.

Fica evidente a partir do exposto que esta invenção fornece formulações que contenham o mínimo de 0,0001% em peso até 95% do peso de uma toxina Cry de 3 domínios modificada da presente invenção, como agente ativo. Dado que os produtos comerciais são de preferência, formulados como concentrados, o usuário final normalmente emprega formulações diluídas de concentração substancialmente mais baixas.

As composições da presente invenção também podem conter

3 0 outros ingredientes ativos, por exemplo, outros compostos com propriedades pesticidas, especialmente inseticida

(especialmente outras toxinas. Cry e Cyt) , acaricida ou fungicida, conforme seja conveniente para o propósito destinado.

As formulações contendo as toxinas Cry de 3 domínios

modificadas são preparadas nas formas conhecidas, por exemplo, a mistura homogênea e/ou líquido dos ingredientes ativos misturado com o transportador.

As toxinas Cry modificadas de 3 domínios modificadas da presente invenção também podem ser administradas para pragas de insetos em plantas transgênicas que expressam estas toxinas modificadas. Existem diversos cultivos transgênicos Bt comercialmente disponíveis, incluindo milho e algodão. Os métodos para construir estas e outras plantas transgênicas que expressam genes de toxinas Cry Bt são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Em breve, existem vários métodos para transformar células e tecidos vegetais: 0 método da "Pistola de genes", também conhecido como bombardeio de micro projéteis ou biobalística (ver patentes norte-americanas No. 4.945.050 a Cornell e 5.141.131 a DowElanco, agora Dow AgroSciences, LLC); método de eletroporação (ver WO 87/06614 de Boyce Thompson Institute e W092/09696 e W093/21335, ambas a Plant Genetic Systems), particularmente úteis na transformação de espécies de monocotiledôneas como o milho e o arroz; e o método mediado por Agrobacterium (Vaeck et al. 1987) que foi praticado com sucesso em dicotiledôneas (plantas de folhas largas como soja e tomate) por muitos anos e recentemente tem sido eficaz em algumas monocotiledôneas (pastos e outros relacionados) (ver: Patentes norte-americanas Nos. 5.177.010 a University of Toledo; No. 5.104.310 a Texas A&M; Pedidos de Patente Européia 0131624B1, 120516, 159418B1 yl76,112 a Schilperoot; Patentes Norte-americanas Nos. 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763, 4.940.838 e 4.693.976 a Schilperoot; Pedidos de Patentes Européias Nos. 116718, 290799, 320500 a Max Planck Institute; Pedidos de Patente Européias 0267159 e 0292435 e Patente norte-americana No 5.231.019 a Ciba Geigy, agora Novartis).

Geralmente, o método Agrobacterium é considerado preferível a pistola de genes, devido à alta freqüência de inserção do DNA externo em um único local, tornando-o mais fácil de controlar. Se estiver usando Agrobacterium para transformar plantas, o DNA a ser inserido no genoma da planta deve ser clonado em plasmídeos especiais, seja em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Este método de tratamento pode ser facilmente utilizado por aqueles versados na técnica para transformar plantas de construções contendo os genes das toxinas Cry de 3 domínios modificadas da presente invenção, para gerar plantas transgênicas que matem ou evitem a aparição de insetos resistentes escolhidos em campo. 2 0 Os seguintes exemplos ilustram como a invenção foi

concebida e posta em prática e mostrar como podem ser usados. Estes exemplos não devem ser utilizados para limitá-la. A descrição feita nos exemplos a seguir se refere a métodos preferenciais da biologia molecular, utilizando estratégias 2 5 disponíveis de protocolos publicados para a construção de vetores e outras moléculas de DNA. Todas as técnicas de clonagem molecular e DNA recombinante necessárias podem ser realizadas por métodos padrões (Sambrook et al., 1995) . EXEMPLOS

EXEMPLO 1. Usando o método da presente invenção para obter exemplos de construções de DNA que codificam toxinas Cry de 3 domínios modificadas que são desprovidas da hélice a-1.

Para ilustrar o método da presente invenção, são

selecionadas duas toxinas Cry de 3- domínios: CrylAb e CrylAc. Para cada uma delas se identificou a região promotora, a região codificante da proteína completa e da hélice a-1 como se segue:

Gene da toxina Região do promotor Região codificante da proteína completa Região N-terminal e codificante da hélice a-1 Região codificante da toxina (a partir da hélice a-2 até lâmina β-23) cryIAb 1-390 pb 390-4272 pb 390-538 pb 538-2225 pb crylAc 11-401 pb 401-4251 pb 401-549 pb 549-2236 pb

pb, pares de bases

Para excluir a região codificante da hélice a-1, as construções genéticas foram amplificadas a partir das Toxinas Cry de 3 domínios modificadas denominadas CrylAbMod e CrylAcMod como se segue:

Nestes casos, foram realizadas 3 etapas de PCR como mostrado na Figura 4. Foi utilizado como padrão o DNA total de Bacillus thuringiensis grupo Bt407 contendo o plasmídeo pHT315 CrylAb e o grupo BtHD73 (que contêm genes crylAb e crylAc respectivamente, conforme relatado no banco de genes, os números de acesso X98793 e ML 1068, respectivamente). Para o PCRl o oligonucleotídeo direto incluiu o local de restrição Hind III na extremidade 5' (que será utilizado para a inserção em um vetor adequado) , seguido pelos primeiros 18 pb da região 2 5 do promotor e do oligonucleotídeo reverso contendo o códon ATG e o local de restrição Neo I na extremidade 5' (a ser ligado com o fragmento PCR2).

Os oligonucleotídeos para PCR2 foram projetados para incluir um local de restrição Neo I na extremidade 5' do oligonucleotídeo direto, seguido pelos primeiros 2 0 pb da hélice oí-2 . 0 oligonucleotídeo reverso incluiu os últimos 20 pb da hélice a-23 seguidos pelo local de restrição site Barrínl (para ser ligado ao fragmento PCR3).

0 oligonucleotídeo direto para PCR3 foi projetado para

incluir o local de restrição BamHl na extremidade 5' seguido por 19 pb da extremidade C-terminal da proteína. 0 oligonucleotídeo reverso incluiu a 21 pb da região terminador e local de restrição SmaI na extremidade 5' (a ser utilizado para a clonagem em um vetor adequado).

Os três fragmentos de PCR foram purificados e ligados

independentemente ao vetor pBCKS, previamente digerido com enzimas de restrição correspondentes para cada produto de PCR. Finalmente, cada plasmídeo pBCKS foi purificado e cortado com enzimas de restrição adequadas para liberar os fragmentos de

2 0 PCR (PCRl HindIII- iVcol; PCR2 NcoI-BamHl e PCR3 BamHl-SmaI) . Estes fragmentos de PCR foram purificados e ligados no vetor de origem dupla de replicação pHT-315 (Lereclus et al., 1989), previamente digeridos com enzimas de restrição HindIII e SmaI. Os plasmídeos resultantes contendo as versões modificadas dos

2 5 genes CrylAb e CrylAc, que são desprovidos da região da

codificação da hélice a-1. Estes genes foram nomeados CrylAbMod e CrylAcMod.

EXEMPLO 2. Obtenção de vetores e células hospedeiras

3 0 contendo construções de DNA que codificam para as toxinas Cry de 3 domínios modificadas e sua utilização em métodos recombinantes para a produção de toxinas Cry de 3-domínio modificadas.

Foram obtidos vetores que compreendam as construções genéticas CrylAbMod e CrylAcModl por clonagem das construções genéticas no vetor de dupla origem de replicação pHT-315 (Lereclus et al. , 1989). As células hospedeiras geneticamente modificadas que contém construções foram obtidas por transformação do grupo acristalífera Bt407 cry (serotipo HL5 Lereclus et al., 1989) com os vetores acima mencionados.

Para produzir as Toxinas cry de 3 domínios modificadas e não modificadas (silvestres), neste exemplo, os grupos transformantes e selvagens foram cultivadas por 3 dias em uma incubadora agitada a 29aC e 200 rpm em um meio nutriente para esporulação (Lereclus et al. , 1995) suplementado com 10 \ig de eritromicina por mi. Os cristais de toxinas Cry de 3 domínios modificadas e não modificado foram recuperadas e purificadas por gradientes de sacarose (Thomas e Ellar, 1983) e solubilizadas em 10 mM de tampão carbonato pH 10,5. Foram separadas amostras de proteína em géis de acrilamida 10% SDS- PAGE (Laemmli, 197 0). Tanto as células geneticamente modificadas, como as proteínas não modificadas produziram proteínas de aproximadamente 13 0 kDa de peso molecular aparente(Fig. 5).

25

EXEMPLO 3. Formação de oligômeros das Toxinas Cry de 3 - domínios modificadas usadas como exemplo (CrylAbMod e CrylAcMod).

A formação in vitro de oligômeros é facilitada pela ativação das protoxinas CrylA com proteases na presença de fragmentos de proteínas Bt-Ri que contém as regiões de ligação à toxina ou na presença de um anticorpo scFv73 que imita estas regiões de ligação a toxina do receptor CADR (Gomez et al., 2003). A protoxina Cryl Ab produz um oligômero de 250 kDa, quando incubada com fragmentos de CADR que contém as repetições 7-12, 11-12 ou 12 do CADR (Fig. 6).

Quando as protoxinas CrylAcMod e CrylAbMod são tratadas com a protease tripsina em ausência de receptor CADR, que produzem um oligômero de 250 kDa, enquanto que, nestas condições, as protoxinas silvestres CrylAB e CrylAC não são formadas para produzir apenas um monômero de 60 kDa ( Fig.7) . Estes resultados indicam que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas produzem o pré-poro oligomérico de 2 50 kDa quando são proteoliticamente ativadas em ausência do receptor primário.

EXEMPLO 4: Toxicidade da proteína Cryl Ab, Cryl Ac, CrylAbMod e CrylAcMod em grupos resistentes e suscetíveis de Pectinophora gossypiella (lagarta-rosada) e Plutella xylostella

(traça das crucíferas).

O tipo mais comum de resistência às toxinas Bt, chamado "modo 1" está relacionada com mutações no gene CADR em vários insetos lepidópteros (Gahan et al. , 2001, Morin et al. , 2003, Xu et al., 2005). No entanto, no caso da traça das crucíferas a resistência tipo 1 apresentada por este inseto não está associada a mutações no gene da caderina (Baxter et al. 2005) O grupo resistente AZP-R da lagarta-rosada foi obtida por meio da seleção de sobreviventes à exposição à toxina CrylAc em 10 campos de algodão (Tabashnik et al. , 2000). A seleção repetida aumentou a resistência do grupo AZP-R à toxina CrylAc até 3.100 vezes em relação ao grupo suscetível APHIS-S da mesma lagarta (Tabashnik et al., 2002a). No grupo AZP-R lagarta-rosada, a resistência à toxina CrylAc é hereditária na forma recessiva e está ligada a 3 alelos mutantes (rl, r2 e r3) do gene CADR (BtR) (Morin et al. , 2003). Os indivíduos com qualquer combinação de 2 alelos r mutantes são resistentes à toxina CrylAc e às plantas de algodão transgênicas que produzem esta toxina (Morin et al., 2003). O grupo AZP-R também apresenta uma resistência cruzada à toxina CrylAb e uma redução à ligação da toxina CrylAb às microvilosidades apicais do intestino larval (Tabashnik et al., 2002b, Gonzalez-Cabrera et al., 2003). A traça das crucíferas é o única praga de inseto que desenvolveu resistência à toxina CrylAc aplicada na forma de spray em campo

(Tabashnik 2 004)

Neste experimento, realizamos bioensaios que confirmaram que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas usadas como exemplo: CrylAb e CrylAc eram altamente tóxicas a larvas suscetíveis, mas não para as larvas resistentes de dois insetos estudados, a lagarta rosada e a traça das crucíferas (Tabelas 1 e 2). A uma concentração de 100 pg de toxina por mi de dieta, a sobrevivência da lagarta-rosada resistente foi alta com CrylAb e CrylAc não-modifiçadas (94% e 100% respectivamente). Ao contrário, as toxinas Cry de 3 domínios modificadas usadas como exemplo (Cryl AbMod e Cryl AcMod) mataram ambas as larvas suscetíveis como as resistentes. A uma concentração de 30 microgramas de toxina por ml de dieta, a sobrevivência da lagarta-rosada resistente foi de 0% com ambas as toxinas Cry de 3 domínios modificadas, CrylAbMod e CrylAcMod (Tabela 2). Estes resultados mostram que as toxinas de 3 domínios modificadas da presente invenção suprem o alto nível de resistência à toxina de 3 domínios não-modificadas correspondente deste exemplo utilizando os insetos resistentes escolhidos, ou seja, as larvas de lagarta-rosada com resistência associada às mutações no receptor primário. A tabela 2 mostra a semelhança da lagarta-rosada, a proteína CrylAcMod que mata a traça das crucíferas rPxAc resistente, a diferença da proteína CrylAc que não é tóxica para o grupo rPxAc de DBM. 0 intervalo de resistência para este grupo até à toxina CrylAc é de mais de 3 0.000 vezes desde a dose LC5O para a toxina CrylAc é de 0,3 ng /poço para o grupo DBM suscetível e de > 10.000 ng/poço para o grupo resistente. No caso da toxina CrylAcMod, o intervalo de resistência reduziu 5 vezes, já que a dose de LC5O para CrylAcMod é de 2 0 ng/poço para o grupo suscetível e de 100 ng/poço para o grupo resistente rPxAc de DBM.

15

TABELA 1. AS toxinas CrylAbMod β CrylAcMod matam a lagarta rosada que é resistente às toxinas CrylAb e CrylAc. Note-se que a concentração da IOOyg de toxina por ml de dieta, a sobrevivência da lagarta-rosada é elevada com as toxinas CrylAb e CrylAc (94% e 100%, respectivamente) . Em contrapartida, 30 microgramas de toxina por ml de dieta, a sobrevivência da lagarta-rosada resistente foi de 0% com toxinas CrylAbMod e CrylAcMod. Portanto, as toxinas modificadas CrylAbMod e CrylAcMod suprem a resistência da lagarta-rosada às toxinas não-modif içadas CrylAb e CrylAc. A IOyg de toxina por ml de dieta, tanto as toxinas modificadas como as não-modifiçadas matam mais de 87% das larvas suscetíveis da largata-rosada. Toxinas Concentração Sobrevivência (%)* (vg de toxina por mL de dieta) Suscetível (APHIS-S) Resistente (AZP-R) Toxinas Não- -Modificadas CrylAb 1 0 90 10 0 100 100 ND* * 80 CrylAc 1 0 94 10 0 98 100 ND 80 Toxinas Modificadas CrylAbMod 1 17 46 10 1,8 6,5 30 0 0 CrylAcMod 1 88 88 10 12 7,5 30 ND 0

* Os valores de sobrevivência foram ajustados de acordo com a mortalidade de controle em uma dieta sem tratamento. A sobrevivência ajustada foi calculada dividindo-se a sobrevivência na dieta com tratamento entre a sobrevivência na dieta sem tratamento. Tamanho da amostra = 40 a 80 larvas por grupo de tratamento. ** ND = não determinado

Tabela 2. A proteína CrylAcMod mata a lagarta dorso de diamante resistente à toxina CrylAc. Note que a 2 0 microgramas (yg) de toxina por ml de dieta, o número de sobreviventes do grupo resistente da lagarta dorso de diamante foi muito alto quando foram tratados com a toxina CrylAc (90,6%). Em contrapartida, a 2 0 microgramas de toxina por ml de dieta, a sobrevivência do grupo resistente da traça das crucíferas foi de 0% quando foi tratada com toxinas CrylAcMod. Portanto, a toxina modificada CrylAcMod sobrepassa a resistência da traça das crucíferas a toxina não-modi ficada CrylAc. A 2 0 μg de toxina por ml de dieta, as toxinas modificadas e não-modificadas CrylAc matam a 100% dos insetos suscetíveis da traça das crucíferas.

Toxinas Concentração_

(pg de toxina por mL de dieta)

Toxina Cry Não-Modificada

CrylAc 0,2_

Sobrevivência (%)* Suscetível Resistente (PxGen8 8) (rPxAc)

97

20

Toxina Cry Modificada CrylAcMod 0,2_

65, 6

100

90,6

90,6

53

20

* Os valores de sobrevivência foram ajustados de acordo com a mortalidade de controle em uma dieta sem tratamento. A sobrevivência ajustada foi calculada dividindo-se a sobrevivência na dieta com tratamento entre a sobrevivência na dieta sem tratamento. Tamanho da amostra = 32 a larvas por grupo de tratamento.

EXEMPLO 5. O silenciamento do receptor CADR em larvas de

Manduca sexta diminui a suscetibilidade a toxina Cryl Ab.

Para determinar se os resultados com a lagarta rosada se estendem a insetos lepidópteros, foram criadas larvas de Manduca sexta com sensibilidade reduzida à toxina Cryl Ab, 2 0 mediante o uso de RNA de interferência (RNAi) para bloquear a produção do receptor CADR (Bt -Ri) . Com RNAi, o RNA de cadeia dupla (dsRNA) de um gene particular interfere na tradução deste gene, inibindo a produção da proteína codificada por esse gene (Sijen et al. , 2001). Para produzir o dsRNA do gene que codifica Bt-Ri de M. sexta, foi amplificado por RTPCR um fragmento de 442 pb do gene (a partir de resíduo 8 a 155) a partir dw cDNA produzido a partir de amostras de RNAm obtido a partir de larvas de 5 instar utilizando os seguintes oligonucleotídeos como os primeiros de reação de rtPCR GCTCTAGAGCTGCCTTCCTGCTGGTGTTTA e GGAATTCCTCCACGCGCACATTG AACAT.

O fragmento de 442 pb foi digerido com enzimas de restrição e Xbal EcoKL e clonado no plasmídeo pLITMUS 28i (HiScribe™) , previamente digerido com as mesmas enzimas de restrição, este vetor tem dois promotores T7 que flanqueiam um local de multiclonagem. Isso permitiu a amplificação de fragmentos

clonados e na transcrição in vitro de ambas as cadeias de DNA da inserção, gerando o dsRNA. A figura 8 mostra o dsRNA obtido por transcrição in vitro do fragmento do gene Bt-Ri amplificado usando a polimerase T7 .

Para testar se a proteína Bt-Ri poderia ser silenciada,

2 0 foram injetadas larvas de primeiro estágio de larvas de M. sexta na hemolinfa seja com Ipg de dsRNA de Bt-Ri em IOOnl de água (controle). Depois de 12 horas em dieta artificial sem toxina, a sobrevivência foi de 74% para 35 larvas injetadas com o dsRNA de Bt-R1 e de 75% para 3 5 larvas de controle. Das

2 5 larvas que sobreviveram por 12 horas com uma dieta sem

tratamento, 24 de cada um dos grupos de larvas injetadas com dsRNA ou controle foram transferidos para uma dieta tratada com 2 0 ng da protoxina Cryl Ab por cm2. Após 3 dias de dieta tratadas com toxinas, todas as larvas de controle morreram

3 0 enquanto todas as larvas injetadas com dsRNA de Bt-R1 sobreviveram (Tabela 3). Mediante um ensaio de imunodetecção tipo Western blot usando um anticorpo específico anti-Bt-Ri mostraram que a injeção de dsRNS reduziu significativamente ou eliminou por completo a proteína Bt-Ri no intestino médio das larvas (Figura 9).Os resultados de bioensaio e de imunodetecção de Bt-Ri indicam que o RNAi diminuiu a produção da proteína Bt- Ri e a suscetibilidade a toxina Cryl Ab nas larvas de Manduca sexta.

TABELA 3. As larvas de M. sexta injetadas com dsRNA de Bt-Ri não são suscetíveis a toxina Cryl Ab. As larvas de M. sexta foram injetadas com 100 nl de água ou com 1 ug de dsRNA de Bt- Ri em 100 nl de água e expostas a uma dieta artificial contendo 2 0 ng de toxina Cryl Ab por cm2.

15

Tratamento No. de larvas expostas Sobrevivência (%)

a 20 ng CrylAb/cm2

H2O_24_ 0_

dsRNA Bt-Ri_24_100_

EXEMPLO 6. A toxicidade das toxinas Cryl Ab e crylAbMod a larvas de M. sexta que tem silenciado o receptor Bt-Ri.

Para determinar se a toxina CrylAbMod é tóxica para as 2 0 larvas com sensibilidade reduzida à toxina Cryl Ab silvestre causada por silenciamento com RNAi de Bt-Ri, foram injetadas larvas de primeiro estágio de M. sexta com uma 1 μg de dsRNA de Bt-Ri como descrito no Exemplo 5. As larvas injetadas foram alimentadas seja com dietas suplementadas ou com 20 ng de 2 5 protoxina Cryl Ab silvestre ou com 5 ng de protoxina CrylAbMod por cm2. As larvas silenciadas no Bt-Ri / por RNAi não eram suscetíveis à toxina Cryl Ab silvestres, mas sem a toxina modificada CrylAbMod (Fig. 10).

Estes resultados mostram que uma das toxinas Cry de 3 domínios modificadas usada como exemplo, a CrylAbMod, suprime o efeito da susceptibilidade reduzida causada pelo bloqueio da expressão de Bt-Ri por RNAi em larvas de M. sexta.

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Claims (27)

1. Método para obter construções de DNA, que codifiquem as toxinas Cry de 3 domínios modificadas desprovidas da hélice a-1, caracterizado pelo fato de que as toxinas Cry de 3 domínios modificadas codificadas são capazes de matar os insetos resistentes escolhidos, suprimindo sua resistência, dito método consistindo nas seguintes etapas: a) selecionar como branco um gene que codifica uma toxina Cry de 3 domínios; b) identificar a região do promotor, as regiões modificantes do fragmento de proteína da respectiva toxina não modificada desde a hélice a-2 até a lâmina β-23, a região codificante da hélice a-1 e a região C-terminal da protoxina se estiver presente na toxina Cry de 3 domínios selecionadas; e c) amplificar a construção genética excluindo a região da codificação da hélice a-1.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de amplificação é realizada por sucessivas amplificações que consistem nas seguintes etapas: a) \ima primeira etapa de amplificação para amplificar somente a região do promotor; b) uma ou mais etapas de amplificação para amplificar a região codificadora começando na hélice a-2 até a lâmina β-23 e a região carboxi-terminal da protoxina, se presente; c) ligar os produtos de PCR obtidos nas etapas a) e b).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios das subfamílias: Cryl, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry7 Cry8, Cry9, CrylO, Cryll, Cryl2, Cryl3, Cryl4, Cryl6, Cryl7, Cryl8, Cryl9, Cry2 0, Cry21, Cry24, Cry2 5, Cry2 6, Cry27, Cry28, Cry29,Cry3 0, Cry31, Cry32, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry47, Cry48 e Cry50.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios da subfamília Cryl.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios é selecionada a partir do grupo que consiste de todas as toxinas Cry de 3 domínios da subfamília CrylA.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios da subfamília CrylAb e CrylAc.

7. Fragmento de DNA isolado compreendendo uma região codificante para uma toxina Cry de 3 domínios modificada, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios modificada codificada é desprovida hélice a-1 e consequentemente é capaz de matar os insetos resistentes escolhidos, suprimindo sua resistência às toxinas Cry de 3 domínios não-modifiçadas.

8. Fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios modificada é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios das subfamílias Cryl, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryll, Cryl2, Cryl3, Cryl4, Cryl6, Cryl7, Cryl8, Cryl9, Cry20, Cry21, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry28, Cry29, Cry30, Cry31, Cry32, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry47, Cry48 e Cry50, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

9. Fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios modificada é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios da subfamília Cryl, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

10. Fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios modificada é selecionada a partir do grupo que consiste de todas as toxinas Cry de 3 domínios da subfamília CrylA, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

11. Fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios modificada é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios das subfamílias CrylAb e CrylAc, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

12. Vetor molecular caracterizado pelo fato de que compreende o fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 7.

13. Vetor molecular de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é um vetor com dupla origem de replicação que pode se replicar em células de Bacillus thuringiensis e de Escherichia coli.

14. Vetor molecular de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vetor é apropriado para a transformação de e expressão em células vegetais.

15. Célula hospedeira geneticamente modificada, selecionada a partir do grupo que consiste em células bacterianas ou de células vegetais, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira compreende o fragmento de DNA isolado de acordo com a reivindicação 7.

16. Toxina Cry de 3 domínios modificada para ser desprovida da hélice a-1, caracterizada pelo fato de ser capaz de matar os insetos resistentes escolhidos, suprimindo sua resistência às toxinas Cry de 3 domínios não-modifiçadas.

17. Toxina Cry de 3 domínios modificada, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios das subfamílias Cryl, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry7, Cry8, Cry9, CrylO, Cryll, Cryl2, Cryl3, Cryl4, Cryl6, Cryl7, Cryl8, Cryl9, Cry20, Cry21, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry28, Cry2 9, Cry30, Cry31, Cry32, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry47, Cry48 e Cry50, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

18. Toxina Cry de 3 domínios modificada, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios da subfamília Cryl, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

19. Toxina Cry de 3 domínios modificada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios da subfamília CrylA, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

20. Toxina Cry de 3 domínios modificada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em todas as toxinas Cry de 3 domínios das subfamílias CrylAb e CrylAc, modificadas para serem desprovidas da hélice a-1.

21. Método para obter uma toxina Cry de 3 domínios modificada desprovida da hélice a-1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) cultivar células hospedeiras geneticamente modificadas que compreendem uma construção de DNA que codifica uma toxina Cry de 3 domínios modificada desprovida da hélice a-1, em condições adequadas para permitir a expressão da toxina Cry 3 domínios modificada e, opcionalmente, b) isolar a toxina Cry de 3 domínios modificada e, opcionalmente, c) purificar a toxina Cry de 3 domínios modificada.

22. Composição que mata os insetos resistentes escolhidos para suprimir sua resistência, caracterizada pelo fato de que contém uma ou mais toxinas Cry de 3 domínios modificadas em uma quantidade suficiente para controlar as pragas brancas e uma mistura de excipientes agronomicamente ou ecologicamente aceitáveis.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a toxina Cry de 3 domínios modificada está presente em uma quantidade de 0,0001% a 95% em peso.

24. Método para obter uma planta transgênica caracterizado por compreender: a) transformar a célula de planta com o fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 7; b) cultivar a dita célula de planta sob condições de crescimento adequadas; e c) regenerar a planta transgênica.

25. Método para suprimir a resistência dos insetos resistentes escolhidos, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa alimentar de tais insetos resistentes escolhidos com doses letais de toxinas Cry de 3 domínios modificadas.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que tais toxinas Cry de 3 domínios modificadas são alimentadas como parte de uma composição.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que tais toxinas Cry de 3 domínios modificadas estão presentes em uma planta transgênica.