BRPI0721898A2

BRPI0721898A2 - Peptídeos relacionados ao colágeno

Info

Publication number: BRPI0721898A2
Application number: BRPI0721898-2A
Authority: BR
Inventors: William A Kinney; Bruce E Maryanoff; Mabel Alamino Cejas; Brett Tounge
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2007-08-01
Filing date: 2007-08-01
Publication date: 2014-02-25
Also published as: AU2007357143A1; WO2009017482A1; CA2695361A1; KR20100053582A

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEOS RELACIONADOS AO COLÁGENO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a peptídeos relacionados ao colágeno (CRPs) que têm grupos de aminoácidos hidrofóbicos nas terminações N- e C-, a trímeros e fibrilas miméticos dos mesmos, e à síntese, aos métodos de uso e às composições dos mesmos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O colágeno, a proteína mais abundante em mamíferos, é 10 amplamente distribuído dentro do corpo e a rigidez de sua tripla hélice em forma de corda e fibrilas agregadas possibilita-o executar um papel estrutural essencial, ajudando a fornecer resistência mecânica aos tecidos. Os colágenos fibrilares mais abundantes, tipos I, Il e III, ocorrem na pele, ossos, cartilagens, tendões, ligamentos, vasos sanguíneos e no humor vítreo dos 15 olhos. Os colágenos fibrilares mais complexos, como os tipos IV e VI, formam redes bi- e tridimensionais, suportando os tecidos intersticiais do corpo e sendo o componente fundamental das membranas basais às quais as camadas de células epiteliais e endoteliais podem ligar-se.

Em geral, os colágenos fibrilares contêm três cadeias de 20 peptídeos separadas entrelaçadas uma em torno da outra para formar uma tripla hélice (Rich A e Crick FHC, J. Mo!. Biol., 1961, 3, 483-506). Restrições geométricas e a estabilidade da tripla hélice de colágeno exigem que cada terceiro aminoácido seja a glicina (Gli ou G), resultando em uma seqüência - GXY- repetitiva, sendo que XeY, cada uma, representam frequentemente a 25 prolina (Pro ou P) e hidróxi prolina (Hip ou O). A tripla hélice de colágeno tem tipicamente mais de 300 nm de comprimento e acima de 1000 ami- noácidos. As fibrilas resultantes do conjunto de tais triplas hélices de colágeno excedem a 1 μηι de comprimento.

Em tecidos saudáveis e não danificados, o colágeno suporta a parede de vasos sanguíneos e seus tecidos circundantes e está escondido pelas camadas de células endoteliais, e não pode entrar em contato com as plaquetas que circulam dentro da corrente sanguínea, as quais regulam o processo de coagulação. Entretando, o dano à parede do vaso, que ocorre em conseqüência de trauma mecânico ou ruptura da placa aterosclerótica em paredes de vasos sanguíneos lesados, pode remover a camada de célula endotelial e permitir que o colágeno interaja com as plaquetas e 5 outras proteínas do plasma sanguíneo, ativando assim as plaquetas para agregação e adesão. Esses processos são essenciais à reação da coagulação, e são bem entendidos no campo.

Configuração triplo-helicoidal

O colágeno tem fascinado os cientistas a longo tempo por causa de suas características estruturais extraordinárias e pela importância biológica dessas proteínas. O estudo da estrutura, estabilidade e função das triplas hélices de colágeno têm sido facilitado pelo uso de peptídeos relacionados ao colágeno sintético. (Feng Y, Melacini G, Taulane JP e Goodman M, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 10351-10358; Fields GB E Prockop DJ, Biopolymers 1996, 40, 345-357 e referências citadas nesses; Holmgren SK, Taylor KM, Bretscher LE e Raines RT, Nature 1998, 392, 666- 667; Jenkins CL e Raines RT, Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 49-59; e Shah NK, Ramshaw JAM, Kirkpatrick A, Shah C e Brodsky, B. Biochemistry 1996, 35, 10262-10268). Por exemplo, o uso de peptídeos triplo-helicoidais sintéticos que compreendem motivos de reconhecimento específicos permitiram que as propriedades de ligação ao receptor dos colágenos fossem investigadas em detalhes. Adicionalmente, a conformação triplo-helicoidal dos colágenos pode ser um pré-requisito para seu reconhecimento pelas plaquetas e outros receptores de colágeno. Certas seqüências triplo-helicoidais, além disso, podem interagir diretamente com os receptores de plaquetas como o GpVI, incluindo a seqüência de repetição de tripletos glicina-prolina-hidróxi prolina (GPO). Para peptídeos simples relacionados ao colágeno, a seqüência (GPO)10 forma triplas hélices termicamente estáveis, com uma temperatura de fusão de 58-70°C. Os aminoácidos hidróxi prolina estabilizam a estrutura triplo-helicoidal facilitando a formação de pontes de hidrogênio mediadas por água e fornecendo efeitos estereoeletrônicos.

Além disso, a Publicação Internacional Número W007/052067 descreve uma série de peptídeos de colágeno triplo-helicoidais incluindo o domínio de colágeno tipo Ill e tendo uma atividade de adesão plaquetária baseada na afinidade pelo domínio A3 do fator plaquetário de von Willebrand. A Publicação Internacional W007/017671 descreve peptídeos de 5 trímeros contendo repetições GPO que, sem reticulação entre os peptídeos, são capazes de ativar plaquetas. A Publicação Internacional W006/098326 descreve um filme de colágeno sintético preparado a partir de um polipeptídeo POG e um composto de fosfato de cálcio. A Publicação de Patente Japonesa 2005206542 descreve estruturas de tecido de colágeno 10 contendo seqüências de polipeptídeo Pro-X-Gli e Y-Z-Gli (sendo que XeZ representam prolina (Pro) e hidróxi prolina (Hip) e Y representa um resíduo de aminoácido que tem um grupo carboxila). A Publicação de Patente Japonesa 2005126360 descreve composições cosméticas e alimentares contendo a seqüência de polipeptídeos Pro-Y-Gli-Z-Ala-Gli (sendo que Y 15 representa Gln1 Asn1 Leu1 lie, Val ou Ala; e Z representa Ne ou Leu) preparados pela síntese de fase sólida para inibição da colagenase. a Publicação de Patente US n° 2003/162941 (equivalente à PJ 2003321500) descreve polipeptídeos de colágeno com uma seqüência Pro-Y-Gli (sendo que Y representa Pro ou Hip), que tem uma estrutura triplo-helicoidal. A 20 Patente US n° 5.973.112 (equivalente à W099/10381) descreve mímicos de colágeno tripeptídeo da seqüência de Xaa-Xbb-Gli (sendo que Xaa representa um resíduo de aminoácido; e Xbb representa 4(f?)-fluoro-L- prolina (Flp), 4(S)-fluoro-L-prolina, 4,4-difluoroprolina, ou uma hidróxi prolina modificada de acetila, mesil ou trifluorometil. O colágeno mímico (Pro-Flp- 25 Gli)io mostrou estabilidade aumentada em relação às triplas hélices do colágeno Pro-Pro-Gli e Pro-Hip-Gli.

Automontaqem

Várias estratégias têm sido empregadas para induzir a formação da estrutura triplo-helicoidal em seqüências ligando o colágeno isolado (conforme discutido na Patente US n° 6.096.863, equivalente à Publicação Internacional W098/007752, e referências nessas). A formação da estrutura em tripla hélice em seqüências de colágeno isoladas pode ser induzida pela adição de inúmeras repetições de Gli-Pro-Hip em ambas as extremidades de uma seqüências de colágeno. Entretanto, mesmo com mais de 50% da seqüência de polipeptído consistindo em repetições de Gli-Pro-Hip, as triplas hélices resultantes podem não ter estabilidade térmica suficiente para 5 sobreviver a condições fisiológicas. Embora possa ser alcançada uma estabilização substancial na estrutura triplo-helicoidal com a introdução de ligações covalentes entre as regiões C-terminal das três cadeias de peptídeos, o grande tamanho (90-125 resíduos e aminoácidos) dos compostos de peptídeos triplo-helicoidais "ramificados" resultantes torna-os 10 difíceis de sintetizar e purificar (conforme discutido na Patente US n° 6.096.863 e referências nessa). Apesar dos CRPs oligomerizados, via conjunto de dendrímero ou reticulação covalente, poderem induzir eficazmente a agregação plaquetária sem serem imobilizados, nos CRPs menos organizados como aqueles que têm uma seqüência de (PGO)io, falta 15 essa propriedade (Rao GHR, Fields CG, White JG e Fields GB, J. Bioi Chem. 1994, 269, 13899-13903; Morton LF, Hargreaves PG, Farndale RW, Young RD e Barnes MJ, Biochem. J. 1995, 306, 337-344; Knight CG, Morton LF, Onley DJ, Peachey AR, Ichinohe T, Okuma M, Farndale RW e Barnes MJ. Cardiovasc. Res. 1999, 41, 450-457). A disponibilidade e utilidade dos 20 CRPs capazes de automontagem têm dependido da facilidade de sua preparação, da simplicidade e estabilidade da estrutura da CRP e do potencial da atividade de agregação. Embora a síntese possa ser desafiadora e relativamente complexa, materiais baseados em CRP e em escala de micrômeros foram obtidos a partir da automontagem de entidades 25 triplas torcidas, anexadas covalentemente pelo emprego de um nó de cisteína (Koide T, Homma DL, Asada S and Kitagawa K, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5230-5233; e Kotch F e Raines RT, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2006, 103, 3028-3033).

Portanto, ainda são necessárias abordagens simplificadas para construir um motivo estrutural semelhante ao colágeno para facilitar o alinha- mento de peptídeos e iniciação e propagação de fibrilas. Especificamente, são necessários CRPs relativamente curtos, de hélice única que sejam facilmente sintetizados e capazes de automontagem não-covalente em trímeros que têm propriedades de mimetizar o colágeno.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se amplamente a um polipeptídeo relacionado ao colágeno (CRP) capaz de automontagem não covalente em um trímero que tem propriedades de mimetizar o colágeno.

O CRP tem um aminoácido hidrofóbico natural ou sintético na região N-terminal e C-terminal em cada extremidade, sendo que os aminoácidos mencionados são capazes de iniciar a propagação de fibrilas para formar fibrilas semelhantes ao colágeno.

A presente invenção também refere-se a um CRP de Fórmula

(I):

B-(Z)m-X

sendo que

Z é um tripleto selecionado do grupo consistindo em Gli-Pro-J,

Pro-J-Gli e J-Gli-Pro;

J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hp1 fPro, mPro e Pro para cada tripleto Z;

m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15;

por exemplo, se Z é Gli-Pro-J e m é 8, então cada um dos oito substituintes de J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hip, fPro, mPro e Pro; e

BeX são independentemente selecionados do grupo que consiste em Fs-Phe, Phe (opcionalmente mono ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO- Tyr, fenilglicina, 2-naftila-Ala, 1-naftila-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Vai.

Os CRPs aqui descritos são úteis na construção de colágenos sintéticos que podem ser usados para iniciar a agregação plaquetária e para o tratamento de diagnóstico de transtornos hemorrágicos. Os CRPs da presente invenção são adicionalmente úteis em composições como um hemostático. BREVE DESCR1CÃ0 PO DESENHO

A Figura 1 é uma curva de resposta à dosagem ilustrando a atividade dos CRPs que têm SEQ ID 25, SEQ ID 26, SEQ ID 27, SEQ ID 28, SEQ ID 34 e SEQ ID 35 comparadas ao colágeno para estimulação da agregação plaquetária.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção refere-se amplamente a um CRP capaz de automontagem não covalente em um trímero que tem propriedades de mimetizar o colágeno.

O CRP tem um aminoácido hidrofóbico natural ou sintético na

região N-terminal e C-terminal em cada extremidade, sendo que os aminoácidos mencionados são capazes de iniciar a propagação de fibrilas para formar fibrilas semelhantes ao colágeno.

A presente invenção também refere-se a um CRP de Fórmula

(I):

B-(Z)m-X

sendo que

Z é um tripleto selecionado do grupo consistindo em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro;

J é, independentemente selecionado do grupo consistindo em

Hyp1 fPro, mPro e Pro para cada tripleto Z;

m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15;

por exemplo, se Z é Gly-Pro-J e m é 8, então cada um dos oito substituintes de J é, independentemente, selecionado do grupo consistindo em Hyp, fPro, mPro e Pro; e

BeX são independentemente selecionados do grupo que consiste em Fs-Phe, Phe (optionalmente mono- ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO- Tyr, fenil-Gly, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Vai.

Os CRPs da presente invenção são capazes de automontagem não-covalente em um trímero. O trímero de CRP resultante é adicionalmente capaz de automontagem de ordem mais alta por interações hidrofóbicas ordenadas e de empilhamento aromático não-covalente, em fibrilas semelhantes ao colágeno.

Uma modalidade da presente invenção inclui uma substância fibrilar semelhante ao colágeno que compreende uma pluralidade de CRPs da presente invenção.

Modalidades da presente invenção incluem uma substância fibrilar semelhante ao colágeno que compreende uma pluralidade de CRPs da presente invenção, sendo que os CRPs estão presentes na substância fibrilar semelhante ao colágeno na forma de uma pluralidade de trímeros de CRP.

Em uma modalidade da invenção, o trímero de CRP é um homotrímero, sendo que os três CRPs são homólogos.

Em uma modalidade da invenção, o trímero de CRP é um heterotrímero, sendo que os três CRPs são heterólogos.

Uma modalidade da invenção é um CRP Fórmula (I), sendo que Z é um tripleto selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro, sendo que J é Hyp em pelo menos quatro tripletos Z consecutivos.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo

que J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hyp, fPro e Pro para cada tripleto Z.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo que J é, independentemente, selecionado do grupo que consiste em Hyp e Pro para cada tripleto Z.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo

que m é 10.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo que BeX são independentemente selecionados do grupo que consiste em F5-Phe, Phe (opcionalmente mono ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Vai. Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo que BeX são independentemente selecionados do grupo que consiste em F5-Phe1 Phe e Leu.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo

que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe1 Phe (opcionalmente mono ou dissubstituída em fenila com fluoro, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4- (OH)2-Phe1 MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp1 Cha, Chg e Leu.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe, Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituída em fenila com fluoro, hidróxi, metil ou CF3) e Leu.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe, Phe e Leu.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo que X é selecionado de um grupo que consiste em Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr1 fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp1 Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Vai.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I), sendo que X é Phe.

Uma modalidade da invenção é um CRP de Fórmula (I) selecionado a partir de:

SEQ ID 1: B-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)n-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11;

SEQ ID 2: B-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)p-X, sendo que p é um

número inteiro selecionado a partir de 0,1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7;

SEQ ID 3: B-(GIy-Pro-Hyp)12-(Gly-Pro-J)q-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3;

SEQ ID 4: B-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)n-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11;

SEQ ID 5: B-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)p-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; SEQ ID 6: B-(Pro-Hyp-GIy)12-(Pro-J-Gly)q-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3;

SEQ ID 7: B-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)n-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11;

SEQ ID 8: B-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)p-X, sendo que p é um

número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; ou

SEQ ID 9: B-(Hyp-GIy-Pro)12-(J-Gly-Pro)q-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3.

Em modalidades alternativas, o CRP de Fórmula (I) é selecionado a partir de:

SEQ ID 10: B-(Gly-Pro-J)n-(Gly-Pro-Hyp)4-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11;

SEQ ID 11: B-(Gly-Pro-J)p-(Gly-Pro-Hyp)8-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7;

SEQ ID 12: B-(Gly-Pro-J)q-(Gly-Pro-Hyp)12-X, sendo que q

sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3;

SEQ ID 13: B-(Pro-J-Gly)n-(Pro-Hyp-Gly)4-X, sendo que n sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11;

SEQ ID 14: B-(Pro-J-Gly)p-(Pro-Hyp-Gly)8-X, sendo que p sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7;

SEQ ID 15: B-(Pro-J-Gly)q-(Pro-Hyp-Gly)12-X, sendo que q sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3;

SEQ ID 16: B-(J-Gly-Pro)n-(Hyp-Gly-Pro)4-X, sendo que n sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11;

SEQ ID 17: B-(J-Gly-Pro)p-(Hyp-Gly-Pro)8-X, sendo que p sendo

que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; ou SEQ ID 18: B-(J-Gly-Pro)q-(Hyp-Gly-Pro)12-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3.

Ainda em outras modalidades, o CRP de Fórmula (I) é selecionado a partir de:

SEQ ID 19: B-(Gly-Pro-J)r-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)s-X, sendo que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, sendo que a combinação de (Gly-Pro-J)r, (Gly-Pro-J)s e (Gly- Pro-Hyp)4 não excede a (Z)15;

SEQ ID 20: B-(Gly-Pro-J)t-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)u-X, sendo que teu são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e, sendo que a combinação de (Gly-Pro-J)t, (Gly-Pro-J)u e (Gly-Pro-Hyp)8 não exceda a (Z)15;

SEQ ID 21: B-(Pro-J-Gly)r-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)s-X, sendo que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, sendo que a combinação de (Pro-J-Gly)r, (Pro-J-Gly)s e (Gly- Pro-Hyp)4 não exceda a (Z)15;

SEQ ID 22: B-(Pro-J-Gly)t-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)u-X, sendo que teu são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5 ou

6 e, sendo que a combinação de (Pro-J-Gly)t, (Pro-J-Gly)u e (Gly-Pro-Hyp)8 não exceda a (Z) 15;

SEQ ID 23: B-(J-Gly-Pro)r-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)s-X, sendo

que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, sendo que a combinação de (J-Gly-Pro)r, (J-Gly-Pro)s e (Gly- Pro-Hyp)4 não exceda a (Z)15; ou

SEQ ID 24: B-(J-Gly-Pro)t-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)u-X, sendo que t e u são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5, ou

6 e, sendo que a combinação de (J-Gly-Pro)t, (J-Gly-Pro)u e (Gly-Pro-Hyp)8 não exceda a (Z)15.

Em certas modalidades, o CRP de Fórmula (I) é selecionado a

partir de:

SEQ ID 25: F5Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe;

SEQ ID 26: Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe;

SEQ ID 27: Leu-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe;

SEQ ID 31: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe;

SEQ ID 32: Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe; e SEQ ID 33: Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe.

Na discussão da presente invenção, outras seqüências de polipeptídeos incluem: ComparadorSEQ ID 28: GIy-(GIy-Pro-Hyp)IO-GIy;

Comparador SEQ ID 29: Ac-(GIy-Pro-Hyp)IO-GIy;

Referência SEQ ID 30: (Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-Ala)-(Pro-Hyp-

Gly)5;

Referência SEQ ID 34: (Pro-Hyp-GIy)IO; e

ComparadorSEQ ID 35: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Ph.

A título de exemplo, um CRP de Fórmula (I) tendo uma SEQ ID 25 tem a seguinte estrutura:

A presente invenção refere-se adicionalmente a um método de 10 formação de uma substância fibrilar semelhante ao colágeno, compre- endendo as etapas de seleção de uma pluralidade de CRPs de Fórmula (I) e, mistura da pluralidade de CRPs sob condições aquosas favoráveis para iniciar e propagar a formação de uma pluralidade de trímeros, compósitos supramoleculares e fibrilas semelhantes ao colágeno.

Em uma modalidade do método, a pluralidade de trímeros de

CRP é selecionada a partir de um pluralidade de homotrímeros, heterotrí- meros e misturas dos mesmos.

Em uma modalidade do método, a substância fibrilar semelhante ao colágeno é selecionada a partir de uma pluralidade de compósitos supramoleculares ou fibrilas semelhantes ao colágeno.

Em uma modalidade do método, as condições aquosas favoráveis compreendem adicionalmente a mistura da pluralidade de peptídeos relacionados ao colágeno em água ou em uma solução salina aquosa a uma temperatura menor que cerca de 50°C.

Em uma modalidade do método, a solução salina aquosa é

selecionada a partir de salina tamponada, solução tampão de fosfato, solução salina balanceada de Hank, salina tamponada com fosfato, salina tamponada com Tris, salina tamponada com Hepes e misturas das mesmas.

Em uma modalidade do método, a solução salina aquosa é PBS.

Definições

A respeito das modalidades da presente invenção, as seguintes definições e outras fornecidas por todo este relatório não devem ser interpretadas, dentro do conhecimento de um versado na técnica, como limitadoras do escopo da presente invenção.

O termo "tripleto" refere-se a um conjunto de três aminoácidos conforme definido pelo conjunto Gly-Pro-J tendo os três aminoácidos Gly, Pro e J, o conjunto Pro-J-Gly tendo os três aminoácidos Pro, J e Gly e, o conjunto J-Gly-Pro tendo os três aminoácidos J1 Gly e Pro.

O termo "homotrímero" refere-se a uma tripla hélice formada por três CRPs idênticas de Fórmula (I).

O termo "heterotrímero" refere-se a uma tripla hélice formada pelos CRPs Fórmula (I).

O termo "trímero" refere-se a uma tripla hélice formada por três CRPs de Fórmula (I).

O termo "compósitos supramoleculares" refere-se a trímeros de CRP montados de várias formas, incluindo fibrilas semelhantes ao colágeno e estruturas fibrilares.

Os termos "Ala" ou "A" referem-se ao aminoácido alanina; "Cha" refere-se ao aminoácido mimético ciclohexil-alanina; "Chg" refere-se ao aminoácido mimético ciclohexil-glicina; "Fs-Phe" refere-se ao aminoácido mimético 1,2,3,4,5-F5-fenilalanina; "fPro" refere-se ao aminoácido mimético 25 (4R)-fluoroprolina; "Gly" ou "G" refere-se ao aminoácido glicina; "Hyp" ou "O" refere-se ao aminoácido mimético (4R)-hidróxi-prolina; "Met" refere-se ao aminoácido metionina; "mPro" refere-se ao aminoácido mimético (4S)- metilprolina; "Phe" ou "F" refere-se ao aminoácido fenilalanina; "Pro" ou "P" refere-se ao aminoácido prolina; e "Tyr" refere-se ao aminoácido tirosina.

Discussão da invenção

Certos monômeros de automontagem têm sido descritos, nos quais monômeros de dietil éster ácido dioxâmico fenileno meta-substituído foram mostrados por raio X em estado sólido serem capazes de automontagem em uma cadeia helicoidal por meio de ligação de hidrogênio (ponta a ponta), com as hélices adjacentes alinhadas lado a lado por tt- empilhamento (Blay G, Fernandez I, Pedro JR1 Ruiz-Garcia R, Munoz MC, 5 Cano J e Carrasco R, Eur. J. Org. Chem. 2003, 1627-1630). O design inicial pelos inventores da presente invenção para um trímero de CRP de automontagem envolveu a anexação de um grupo amida de éster fenil oxâmico nos N- e C-terminais de uma seqüência (GPO)i0 para facilitar a montagem ponta a ponta por meio de ligação de hidrogênio.

Entretanto, devido a forte interação de empilhamento aromático

não-covalente entre o benzeno e o hexafluorobenzeno (Hunter CA and Sanders JKM, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 5525-5534; Gdaniec M, Jankowski W, Milewska MJ and Polofiski T, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 3903-3906 (também, Referências 9 e 10 citadas nesses); e Lozman OR1 15 Bushby RJ e Vinter JG, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 2001, 1446-1453), os inventores da presente invenção levantaram a hipótese de que o empilhamento aromático (ponta a ponta e lado a lado) e interações hidrofóbicas ordenadas tornariam os trímeros de CRP da presente invenção adicionalmente capazes de automontagem de alta ordem em fibrilas e fibras 20 semelhantes ao colágeno.

Consequentemente, o design de automontagem por ligação de hidrogênio evoluiu para o design da presente invenção na qual as interações entre os grupos hidrofóbicos e aromáticos foram utilizadas para a montagem ponta a ponta por π-empilhamento e interações hidrofóbicas ordenadas. As 25 seqüências dos CRPs lineares da presente invenção são capazes de automontar-se em trímeros e, subsequentemente, em compósitos e fibrilas supramoleculares através de meios não-covalentes. Outros pesquisadores observaram que a seqüência de colágeno inclui regiões de telopeptídeo contendo especificamente resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e 30 aromáticos como Tyr, Phe e Leu. A importância de tais resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e aromáticos para a automontagem triplo- helicoidal tem sido indicada (Helseth DL, Jr. e Veis A, J. Bioi Chem., 1981, 256, 7118-7128; Prockop DJ e Fertala A, J. Biol. Chem. 1998, 273, 15598- 15604; and, Traub W, FEBS Letters 1978, 92, 114-120).

Como conseqüência, investigou-se o potencial para iniciar a propagação de fibrila por um trímero de CRP da presente invenção, por exemplo, por um trímero de CRP tendo uma seqüência SEQ ID 25: F5Phe- (GIy-Pro-Hyp)IO-Phe. Conforme mostrado abaixo no Exemplo 3, a modelagem molecular computacional foi usada para avaliar a interface cabeça-cauda entre dois trímeros de CRP tendo SEQ ID 25. Um campo de força XED (distribuição extendida de elétron) foi usado para atrair as duas triplas hélices uma em direção a outra. À medida que as triplas hélices se aproximavam uma a outra, os pares fenil/pentafluorofenila adotaram uma orientação face-a-face, resultando em uma energia de ligação de interface total de -55,2 kcal/mol. Quando os anéis aromáticos foram colocados em uma orientação borda-a-face, a montagem reminimizada reverteu à orientaçãoface-a-face.

As interfaces dos trímeros de CRP análogos que têm seqüências SEQ ID 26: Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe e SEQ ID 27: Leu-(Gly- Pro-Hyp)10-Phe, também foram examinados. Comparativamente, no caso da seqüência SEQ ID 26, foi observada um energia de interface mais baixa 20 (energia total de -49,2 kcal/mol) sem interações face a face observadas. Uma entrega adicional na energia de ligação ocorreu para a SEQ ID 27 (energia/total de -32,5 kcal/mol). As fortes interações entre as extremidades opostas dos trímeros de CRP tendo SEQ ID 25 e as interações entre as extremidades opostas dos trímeros de CRP tendo SEQ ID 26 e SEQ ID 27 25 apoiam a hipótese do inventor de que o potencial dos trímeros de CRP da presente invenção inicia a propagação de fibrila devido ao empilhamento aromático e interações hidrofóbicas entre os trímeros de CRP.

Embora o trabalho de modelagem tenha examinado a interface ponta a ponta dos trímeros de CRP para iniciar a propagação de fibrila, o escopo da presente invenção pretende incluir outras interfaces possíveis como as interfaces desalinhadas nas quais ocorrem interações hidrofóbicas em uma orientação ponta a ponta entre CRPs em diferentes locais dentro de um trímero de CRP e interações lado a lado com trímeros de CRP adjacentes onde for permitido pelas interações hidrofóbicas, como no casos do telopeptídeos de colágeno.

Configurações CRP

Em adição ao anteriormente mencionado, modalidades não-

limitadoras, a presente invenção abrange também os CRPs e homotrímeros e heterotrímeros do mesmo que consistem em seqüências em qualquer combinação representativa de Fórmula (I).

O comprimento geral de um CRP conforme descrito na presente invenção pode estar em uma faixa de 26 a minoácidos até 47 aminoácidos. Em uma modalidade da presente invenção, o comprimento geral de um CRP pode ser de até 32 aminoácidos.

Um CRP conforme descrito na presente invenção pode ser polimerizado ou ligado a um parceiro de acoplamento peptídeo ou não 15 peptídeo por exemplo, mas não se limitando a, uma molécula efetora, um rótulo, um marcador, uma droga, uma toxina, um veículo ou molécula de transporte ou uma molécula alvo como um anticorpo ou fragmento de ligação desses ou outro ligante. Técnicas para acoplar um polipetídeo de CRP aos parceiros de acoplamento peptídeos e não peptídeos são bem 20 conhecidas na técnica.

Em algumas modalidades, um CRP conforme descrito na presente invenção pode ser revestido em uma superfície sólida ou suporte insolúvel. O suporte pode estar na forma particulada ou sólida, incluindo por exemplo uma placa, tubo de ensaio, cápsulas, esfera, um filtro, tecido, 25 polímero ou uma membrana. Métodos para fixar um polipeptídeo de CRP a superfícies sólidas ou suportes insolúveis são conhecidos pelos versados na técnica.

Em alguma modalidades, o suporte pode ser uma proteína, por exemplo uma proteína do plasma ou uma proteína de tecido, como uma imunoglobulina ou fibronectina. Em outras modalidades, o suporte pode ser sintético e pode ser, por exemplo, um polímero biocompatível, biode- gradável. Polímeros adequados incluem polietileno glicóis, poliglicolídeos, polilactídeos, polioésteres, polianidridos, polifosfazenos, e poliuretanos. Um outro aspecto da invenção fornece um conjugado incluindo um polipeptídeo, conforme descrito na presente invenção, anexado a um polímero inerte.

A inclusão de grupos reativos em uma das extremidades do CRP permite o acoplamento químico a carreadores inertes de modo que o produto resultante pode ser entregue a lesões patológicas como ferimentos crônicos ou lugares de ferimentos traumáticos agudos sem entrar dentro da corrente sanguínea.

Os CRPs da presente invenção podem ser gerados total ou parcialmente por síntese química, por exemplo, de acordo com métodos de síntese de peptídeos bem estabelecidos, como líquido padrão ou, de preferência, em fase sólida, cujas descrições gerais são amplamente disponíveis (consultar, por exemplo, em J.M. Stewart e J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. Edição, Pierce Chemical Company1 Rockford, Illinois, EUA (1984), em M. Bodanzsky e A. Eodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nova York, EUA (1984); em J. H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford University Press, Oxford 1991; em Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, Califórnia, em G. A. Grant1 (Ed.) Synthetic Peptides, A User's Guide. W. H. Freeman & Co., New York 1992, EUA1 E. Atherton and R.C. Sheppard1 Solid Phase PeptideSynthesis1 A Practical Approach. IRL Press 1989 and in G.E. Fields1 (Ed.) Solid-Phase Peptide Synthesis (Mpetodos em Enzimologia Vol. 289). Academic Press, New York, EUA, e Londres 1997), ou podem ser preparados em solução, pelo método de fase líquida ou por qualquer combinação de fase sólida, fase líquida e química de solução.

Modificações estruturais da CRP

O CRP conforme descrito na presente invenção, pode ser quimicamente modificado, por exemplo, pela adição de uma ou mais moléculas de polietileno glicol, açúcares, fosfatos, e/ou outras moléculas, 30 sendo que a molécula ou moléculas não são naturalmente anexadas a proteínas de colágeno de ocorrência natural Modificações químicas adequadas de CRPs e métodos de preparo de CRPs por síntese química são bem conhecidos pelos versados na técnica e também são abrangidos pela presente invenção. O mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou em grau variado em vários locais no CRP. Além disso, as modificações podem ocorrer em qualquer lugar na seqüência de CRP, 5 incluindo na cadeia principal do CRP, em quaisquer cadeias laterais de aminoácidos e no terminal amino ou carboxila. Consequentemente, um dado CRP pode conter muitos tipos de modificações.

Como indicado acima, o CRP conforme descrito na presente invenção pode ser estruturalmente modificado. Um CRP estruturalmente 10 modificado é substancialmente similar na forma tridimensional e na atividade biológica ao CRP aqui descrito e compreende, de preferência, uma disposição espacial de porções químicas reativas que assemelha-se muito à disposição tridimensional dos grupos ativos na seqüência do CRP. Modificações adicionais também podem ser feitas pela substituição de 15 grupos químicos dos aminoácidos com outros grupos de estrutura similar.

Adicionalmente, os CRPs conforme descritos na presente invenção podem ser estruturalmente modificados para compreender um ou mais D-aminoácidos. Por exemplo, um CRP pode ser um enantiômero no qual um ou mais resíduos de L-aminoácido na seqüência de aminoácidos do 20 CRP são substituídos pelo resíduo de D-aminoácido correspondente ou um polipeptídeo inverso-D, que é um polipeptídeo que consiste em D- aminoácidos dispostos em orderm inversa quando comparados à seqüência de L-aminoácidos descrita acima (Smith CS, et al., Drug Development Res., 1988, 15, páginas 371-379). Métodos de preparação de polipeptídeos 25 estruturalmente modificados adequados são bem conhecidos na técnica. Composições de CRP

Os CRPs da presente invenção podem ser isolados e/ou purificados e subsequentemente usados conforme desejado. Em uma moda- lidade da presente invenção, os CRPs podem ser usados em uma com- 30 posição, como uma composição farmacêutica ou uma composição adequada ao uso como um dispositivo médico, que pode incluir um ou mais compo- nentes opcionais incluindo, mas não se limitando a, um ou mais excipientes conhecidos na técnica. Em adição a essas modalidades não-limitadoras, a presente invenção também abrange CRPs, assim como homotrímeros e heterotrímeros dos mesmos, que consistem em seqüências em qualquer combinação representativa de Fórmula (I) nessas composições.

Certos polipeptídeos têm sido descritos para uso em várias

composições farmacêuticas, dispositivos médicos, e produtos combinados. Por exemplo, a Publicação Internacional W007/044026 descreve um peptídeo mimético do colágeno com arcabouço de polietileno glicol hidrogel diacrilato para reparo de cartilagem danificada. A Publicação de Patente US 10 n° US2006/073207 descrece uma composição de coacervato amorfo de heparinato de colágeno/elastina/sódio bovino para várias aplicações médicas. A Publicação de Patente US US2005/147690 descreve compo- sições de um filme de poliuretano modificado que tem uma superfície incrustada de colágeno/elastina/heparina para uso em um enxerto vascular. 15 A Publicação de Patente Japonesa 2005060550 descreve composições para adesão a substratos contendo uma seqüência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp), tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a 600.000. A Publicação de Patente Japonesa 2005060315 descreve composições farmacêuticas contendo uma 20 seqüência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp) tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a 600.000 e vitamina C. A Publicação de Patente Japonesa 2005060314 descreve composições cosméticas contendo uma seqüência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sendo que Y representa Pro ou Hyp) tendo uma estrutura triplo- 25 helicoidal com peso molecular de 100.000 a 600.000. A Publicação de Patente Japonesa 2005058499 descreve uma composição de tecido não- trançado impregnado com um polipetídeo de seqüência Pro-Y-Gly (sendo que

Y representa Pro ou Hyp), tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a 600.000, que pode ser degradada pela colagenase. A

Publicação de Patente Japonesa 2005058106 descreve composições comestíveis contendo uma seqüência de polipeptídeos Pro-Y-Gly (sendo que

Y representa Pro ou Hyp), tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 100.000 a 600.000, que pode ser degradada pela colagenase. A Publicação de Patente Japonesa 2005053878 descreve polipeptídeos tendo as seqüências Pro-X-Gly e Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly (sendo que X representa Pro ou Hyp; Y representa Gin, Asn, Leu, lie, Val ou Ala; e Z 5 representa Ile ou Leu), tendo uma estrutura triplo-helicoidal com peso molecular de 70.000 a 600.000, que pode ser degradada pela colagenase. A Publicação Internacional W098/52620 descreve compostos de biopolímeros com uma seqüência Gly-Pro-Nleu covalentemente ligada a uma superfície ou superfícies de um material a granel biocompatível para uso como uma prótese 10 de implante. A Patente US n° 6.096.863 descreve complexos peptídeo-amfifilo tendo uma porção lipofílica e uma porção de peptídeo tendo uma seqüência semelhante ao colágeno R2O2C(CH2)2CH(CO2Ri)NHCO(CH2)2CO(Gly-Pr0- Hyp)o4-[peptídeo]-(Gly-Pro-Hyp)cM, sendo que Ri e R2 são, cada um, independentemente, um a vinte grupos hidrocarbila preparados via síntese 15 de fase sólida. As Patentes US n° 6.096.710 e n° 6.329.506 descrevem derivados de colágeno sintético triplo-helicoidais tendo tripletos de ami- noácidos de repetição Gly-Xp-Pro, Gly-Pro-Yp, Gly-Pro-Hyp e Gly-Pro-Pro, sendo que Xp e Yp são resíduos de peptóides selecionados a partir de aminoácidos N-substituídos.

A presente invenção estende-se a vários aspectos, não apenas

aos CRPs conforme descritos na presente invenção, opcionalmente acoplados a outras moléculas, peptídeos, polipeptídeos e membros de ligação específicos, mas inclui, também, uma composição farmacêutica, medicamento, fármaco, dispositivo médico ou componentes dos mesmos, ou 25 outras composições que compreendem tais CRPs. Tal composição far- macêutica, medicamento, fármaco, dispositivo médico ou componentes dos mesmos, ou outra composição pode ser usada para vários propósitos, incluindo, mas não se limitando a fins de diagnóstico, terapêutica e preven- ção.

A presente invenção também estende-se ao uso de tais CRPs

no preparo dessas composições e um método para fazer tais composições compreendendo a mistura de CRPs com os excipientes opcionais desejados e outros ingredientes opcionais. Exemplos de excipientes adequados incluem, mas não se limitam a veículos, carreadores, tampões, estabiliza- dores, e similares que são bem conhecidos na técnica.

Nas modalidades em que a composição é uma composição 5 farmacêutica, a composição pode conter, em adição a tais CRPs, um agente ativo farmaceuticamente secundário, sendo que o produto da combinação resultante pode ser adicionamente misturado com um excipiente como aqueles bem conhecidos como farmaceuticamente aceitáveis na técnica. Exemplos de tais excipientes adequados são apresentados em, por 10 exemplo, Handbook of Pharmaceutical Excipients. (Quinta Edição, Outubro de 2005, Pharmaceutical Press, Eds. Rowe RC, Sheskey PJ e Weller P). Tais materiais não devem ser tóxicos e não devem interferir com a eficácia de tais CRPs ou de agentes ativos farmaceuticamente secundários. Tais composições da presente invenção podem ser administradas de maneira 15 localizada no local desejado ou podem ser entregues de modo que o CRP ou agentes ativos farmaceuticamente secundários tenham como tecidos- alvos ou células particulares. Agentes ativos farmaceuticamente secundários adequados incluem, mas não se limitam a, hemostáticos (como trombina, fibrinogênio, ADP, ATP, cálcio, magnésio, TXA2, serotonina, epinefrina, fator 20 plaquetário 4, fator V, fator XI, PAI-1, trombospondina e similares e combinações dos mesmos), anti-infecciosos (como anticorpos, antígenos, antibióticos, agentes antivirais e similares e combinações dos mesmos), analgésicos e combinações de analgésicos ou, agentes anti-inflamatórios (como anti-histamínicos e similares).

No amplo uso de tais composições, a composição pode ser

aplicada topicamente no local do ferimento como um hemostato, como por exemplo, uma formulação farmacêutica, ou como um componente de um curativo de ferimento. A composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, de maneira substancialmente 30 simultânea ou seqüencial dependendo do problema de saúde a ser tratado. Tais CRPs, sozinhos ou em um artigo ou dispositivo que compreenda esses CRPs, incluindo um curativo para ferimentos, podem ser fornecidos em um kit, por exemplo, lacrado em um recipiente adequado que proteja o conteúdo do ambiente externo. Esse kit pode incluir instruções de uso.

Em uma modalidade, o CRP conforme descrito na presente invenção pode ser útil na simulação da hemostase em trauma agudo, por 5 exemplo, após um acidente de tráfego ou lesões de guerra, por meio da aplicação tópica aos ferimentos que de outro modo causariam perda sanguínea fatal. Um método de estimulação da hemóstase nesses locais de lesões pode compreender o contato do local com uma composição que compreende o CRP conforme descrito na presente invenção, sendo que a 10 composição compreende um substrato de modo que o CRP esteja presente na superfície do substrato em uma quantidade suficiente para induzir e manter a hemóstase.

Em outra modalidade, o CRP descrito na presente invenção pode ser útil na estimulação da hemóstase em lesões crônicas como úlceras. Sem se ater à teoria, em relação ao mecanismo proposto, acredi- tamos que o CRP pode agir primeiramente para aumentar a fixação celular, e então a liberação dos conteúdos ativados de grânulos de plaquetas pode estimular a migração de células da corrente sanguínea e dos tecidos próximos danificados que contribuem para o processo de cura. Um método de estimulação da hemóstase nesses Iocias de lesões crônicas em um indivíduo pode compreender o contato do local com uma composição que compreende o CRP conforme descrito na presente invenção, sendo que a composição compreende um substrato de modo que o CRP esteja presente na superfície do substrato em uma quantidade suficiente para induzir a hemostase.

Esses CRPs da presente invenção conforme descrito aqui podem ser amplamente úteis como reagentes preciosos em inúmeros testes de laboratório e clínicos, incluindo aqueles para diagnóstico de transtornos hemorrágicos. Por exemplo, tais CRPs conforme descrito na presente 30 invenção podem ser úteis na construção de colágenos sintéticos que podem então ser usados para iniciar a agregação plaquetária. Em outro exemplo, tais CRPs podem ser úteis na investigação ou triagem de compostos de teste que inibem a agregação e ativação plaquetária e/ou coagulação sanguínea. Em um exemplo adicional, tais CRPs podem ser úteis como reagente para pesquisa sobre a ativação e/ou agregação de plaquetas. Um método de ativação e/ou agregração plaquetária pode compreender o 5 tratamento de plaquetas com tais CRPs conforme descrito na presente invenção.

Em uma modalidade, as plaquetas podem ser tratadas in vitro na presença de plasma sanguíneo. A atividade das plaquetas tratadas, isto é, plaquetas após o contato com tais CRPs conforme descrito na presente 10 invenção, pode ser medida ou determinada, por exemplo, na presença ou ausência de um fator ou agente, composição de teste ou substância de interesse, empregando experimentos de controle adequados conforme esperado na técnica. O efeito de um fator sobre a ativação plaquetária e/ou agregação pode ser determinado por um método que compreende tratar as 15 plaquetas com tais CRPs descritos na presente invenção e determinar o efeito do fator sobre e ativação e/ou agregação plaquetária. A ativação e/ou agregação plaquetária pode ser determinada na presença ou ausência do fator ou com o fator em diferentes concentrações.

Em outra modalidade da presente invenção, tais CRPs também podem ser úteis no diagnóstico de transtornos plaquetários, como no diagnóstico que usa rotineiramente filbrilas de colágeno extraídas de tecidos animais como reagente em agregometria plaquetária, ou preparações de colágeno imobilizado como no Analisador de Função Plaquetária e outros instrumentos. Por exemplo, tais CRPs podem ser usados para investigar a atividade ou função plaquetária ou para diagnosticar uma disfunção na atividade plaquetária pela determinação da ativação e/ou agregação plaquetária em uma amostra tratada com CRPs, conforme descrito na presente invenção. Por exemplo, tais CRPs conforme descrito na presente invenção podem ser colocados em contato com uma amostra sanguínea obtida de um indivíduo, então a agregação das plaquetas pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Em outra modalidade da presente invenção, tais CRPs podem ser úteis como um revestimento de superfície bioativa que age para assegurar a adesão celular diretamente, bem como agregar e ativar as plaquetas localmente, como pela da contribuição para a produção e liberação de outras moléculas bioativas. Um método pode, por exemplo, 5 compreender o contato das plaquetas com tais CRPs conforme descrito na presente invenção, as quais podem ser imobilizadas sobre um suporte sólido ou semissólido, na presença de plasma sanguíneo, para agregar ou ativar as plaquetas no suporte ou próximo ao dito suporte.

Os CRPs da presente invenção também podem ser amplamente usados no tratamento de transtornos hemorrágicos.

Em uma modalidade, como os CRPs conforme descritos na presente invenção são adsorvidos ou de outro modo contidos no ou sobre um suporte sólido ou semi-sólido, como em um suporte de polímero inerte, o suporte resultante pode ser útil para servir como um composto auxiliar ou 15 alternativo para a transfusão de plaquetas em casos de insuficiência plaquetária, o que pode resultar em trombocitopenia autoimune ou ablação terapêutica da medula óssea como na terapia de câncer, bem como em transtornos hemorrágicos a partir de outras causas, como a doença de Glanzmann. Nessa modalidade, os CRPs que são adsorvidos sobre ou de 20 outro modo contidos dentro ou sobre um suporte sólido ou semi-sólido, podem ser administrados a um indivíduo que precise do mesmo, como, por exemplo, indivíduos que podem ter insuficiência plaquetária e/ou podem ter uma condição médica conforme especificado acima.

Tais CRPs conforme descritos na presente invenção, que são 25 adsorvidos ou de outro modo contidos dentro ou sobre um suporte sólido ou semissólido, podem ser úteis na indução de formação de trombo no aneurismo aórtico. Por exemplo, tais CRPs podem ser revestidos sobre o lado externo de uma espiral embólica para segurar o tecido e/ou evitar a dilatação de uma artéria distendida. Nessa modalidade, a formação de 30 trombo no tecido vascular danificado de um indivíduo pode ser induzido por meio do contato do tecido vascular com tais CRPs conforme descrito na presente invenção, que são adsorvidos ou de outro modo contidos no ou sobre um suporte sólido ou semissólido, como em um suporte de polímero inerte. Exemplos de suportes de polímeros inertes aceitaveis incluem, mas não se limitam a stents, espirais embólicas, e similares. Tal indivíduo pode sofrer de problemas médicos como, por exemplo, artéria ou outros vasos 5 sanguíneos distendidos e/ou aneurisma aórtico. Em uma modalidade, o suporte pode ser um suporte polimérico inerte que compreende proteínas, polietileno glicol, ou lipossomas, que é revestido como um CRP instantâneo que adsorve ao suporte.

Tais CRPs da presente invenção, conforme descrito aqui, podem 10 ser adicionalmente úteis em uma composição que compreende uma matriz de polímero tridimensional quimicamente definido suplementado com os ditos peptídeos relacionados ao colágeno para a diferenciação direcionada de células-tronco embrionárias. A Publicação Internacional W007/075807, aqui incorporada inteiramente por referência para todos os propósitos, 15 descreve uma composição que compreende uma matriz de polímero tridimensional quimicamente definido suplementado com um polipeptídeo IV de colágeno que suporta a diferenciação direcionada de células-tronco embrionárias.

Ainda outra modalidade da presente invenção é direcionada a um método de tratamento de uma condição hemostática em um indivíduo que necessite do mesmo, compreendendo a administração de uma compo- sição que compreende um CRP da presente invenção, sendo que a compo- sição pode incluir, mas não se limitar a tais CRPs conforme descrito pela presente invenção. Uma composição de polipeptídeo pode, opcionalmente, incluir um substrato durante a administração. Tal composição pode, tipica- mente, ser administrada de acordo com um regime suficiente para mostrar benefício ao indivíduo. A quantidade real administrada e a taxa e curso do tempo da administração, dependerão de vários fatores como por exemplo, a natureza e severidade da doença ou problema de saúde sendo tratado. A composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com terapias adjuntivas de outros tratamentos, de modo simultâneo ou seqüencial, dependendo da doença ou problema de saúde tratado. De acordo com esse método para tratamento de um problema hemostático, a composição de CRP conforme descrito pela presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com um excipiente e outros ingredientes opcionais para fornecer hemóstase. Em outra moda- 5 Iidade1 tais CRPs podem ser combinados com um substrato adequado para uso como um hemostato. O hemostato da composição de CRP pode estar em variadas formas, que incluem mas não se limitam a, um pó, uma fibra, um filme ou uma espuma.

As espumas contendo CRP podem ser preparadas por processos como, por exemplo, liofilização ou espumejamento com solvente supercrítico. Detalhes desses processos são bem conhecidos na técnica e apresentados em, por exemplo, S. Matsuda, Polymer J., 1991, 23(5), 435- 444 (liofilização) e Pedido de Patente Européia EP 464.163 B1 (espumeja- mento com solvente supercrítico). Em geral, uma espuma Iiofilizada contendo CRP da presente invenção pode ser preparada primeiramente pela dissolução do CRP, e qualquer ingrediente opcional conhecido na técnica como, por exemplo, plastificantes, em um solvente adequado sob temperaturas suficientes para essa dissolução, e então derramando a solução contendo CRP dentro de um molde. O CRP pode estar presente na solução que o contém em uma quantidade, baseada no peso total da solução contendo CRP, em uma faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de10 mg/mL, ou em uma faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 1 mg/mL, ou cerca de 0,3 mg/mL. Plastificantes adequados incluem, mas não se limitam a glicerol; polietileno glicol; glicerina; propileno glicol; monoacetato de glicerol; diacetato de glicerol; triacetato de glicerol e misturas dos mesmos, e podem ser usados em uma quantidade, baseada no peso seco final da espuma contendo CRP, em uma faixa de cerca de 0,5 por cento a cerca de 15 por cento, ou em uma faixa de 1 por cento a cerca de 5 por cento. Para minimizar possíveis efeitos deletérios ao CRP, a temperatura de dissolução não deve exceder a cerca de 50°C. A dissolução pode ser realizada sob condições aquosas favoráveis que incluem, mas não se limitam a, em água ou em soluções salinas aquosas, como a salina tamponada, solução tampão de fosfato, solução salina balanceada de Hank, salina tamponada com fosfato (PBS)1 salina tamponada com Tris1 salina tamponada com Hepes1 e misturas das mesmas.

Em uma modalidade, os solventes podem ser tamponados em uma faixa de pH de cerca de 6 a cerca de 8. Depois do molde ser pre- enchido com a quantidade desejada de solução, o molde é então transferido para um liofilizador, que o congelará, e então secará a vácuo a solução para remover o solvente da espuma resultante. Embora a espessura da espuma resultante possa variar dependendo de, por exemplo, a quantidade de solução dentro do molde, a concentração de CRP na solução, e similares, a espuma resultante tipicamente pode ter uma espessura em uma faixa de cerca de 0,5 mm a cerca de 10 mm, ou em uma faixa de cerca de 1 mm a cerca de 5 mm, e um tamanho de poro em uma faixa de cerca de 1 mícron a cerca de 500 mícrons. As espumas podem ser feitas em uma variedade de tamanhos que podem ser adequados ao uso para enfrentar desafios hemostáticos em locais hemorrágicos.

Filmes contendo CRP podem ser preparados por processos como, por exemplo, fundição do filme a partir de um solvente adequado. Detalhes deste processo são bem conhecidos na técnica e foram 20 apresentados em, por exemplo, Bagrodia S e Wilkes GL, "Effects of Solvent Casting Copolymer Materials As Related to Mechanical Properties," J Biomed Mater Res., 1976 (Jan), 10(1), 101-11. De acordo com esta modalidade, o CRP da presente invenção, juntamente como qualquer ingrediente opcional conhecido na técnica como por exemplo, plastificantes, 25 pode ser dissolvido em uma quantidade suficiente de solvente aquoso. O CRP pode estar presente na solução em uma quantidade, baseada no peso total da solução, em uma faixa de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL, ou em uma faixa de 0,1 mg/mL a cerca de 1 mg/mL, ou cerca de 0,3 mg/mL. Plastificantes adequados incluem, mas não se limitam a glicerol, polietileno 30 glicol, glicerina, propileno glicol, monoacetato de glicerol, diacetato de glicerol, triacetato de glicerol e misturas dos mesmos, e podem ser usados em uma quantidade, com base no peso seco final do filme contendo CRP, em uma faixa de cerca de 0,5 por cento a cerca de 15 por cento, ou em uma faixa de cerca de 1 por cento a cerca de 5 por cento.

Exemplos de solventes aquosos adequados incluem, mas não se limitam a, água, solventes orgânicos miscíveis, álcoois e misturas dos 5 mesmos. Exemplos de solvente orgânicos miscíveis adequados e álcoois incluem, mas não se limitam a, acetona, etanol, isopropanol, propanol, metanol e similares e misturas dos mesmos. Para minimizar possíveis efeitos deletérios ao CRP, a temperatura de dissolução não deve exceder a cerca de 50°C. A solução contendo CRP pode então ser adicionada, por 10 exemplo, por gotejamento ou de outro modo, derramando uma quantidade adequada para cobrir uma área da superfície desejada em um substrato de fundição.

Exemplos de substratos de fundição adequados incluem aqueles que compreendem um material que liberará facilmente o filme contendo CRP, e podem incluir mas não serem limitados àqueles feitos de vidro, metal, recipientes revestidos por Teflon e similares. O tamanho e formato de tais substratos podem variar de acordo com as necessidades da composição. O solvente pode então ser removido da solução contendo CRP por evaporação ou por secagem a ar, então o filme resultante pode ser opcionalmente submetido a secagem por vários métodos, como através de secagem a vácuo, para remover qualquer solvente residual. Se um filme mais espesso for desejado, o processo pode ser repetido pela fundição de uma ou mais camadas da solução contendo CRP no topo da superfície superior do filme previamente fundido. Embora a espessura do filme resultante possa variar dependendo de, por exemplo, a quantidade de solução derramada sobre o substrato de fundição, a concentração dos CRPs na solução e similares, tipicamente a espessura de cada camada de filme pode estar numa faixa de cerca de 50 mícrons a cerca de 150 mícrons. Conforme especificado acima a respeito da espuma, os filmes podem também ser preparados em uma variedade de tamanhos.

Os pós contendo CRP podem ser obtidos por trituração, manual- mente ou mecanicamente, ou pulverização de fibras, filmes, ou espumas compreendidas pelo CRP da presente invenção usando processos bem conhecidos na técnica. Técnicas exemplificadoras para trituração ou pulverização de fibras, filmes ou espumas em pós incluem, mas não se limitam, àquelas que usam pilão e almofariz, lâmina giratória, ou esmeril de 5 impacto, como um moinho de esferas. Esses e outros meios para a trituração dos CRP em um pó podem ser realizados à temperatura ambiente ou por processos de trituração criogênica, em temperaturas abaixo do ponto de congelamente do CRP. O pó resultante contendo CRP pode ser opcionalmente peneirado para obter um pó que tem tamanho de partícula na 10 faixa de cerca de 1 mícron a cerca de 2000 mícrons, ou em uma faixa de cerca de 10 mícrons a cerca de 500 mícrons.

Os pós, filmes e/ou espumas contendo CRP podem ser aplica- dos diretamente no local da hemorragia como um hemostato para acentuar ou causar hemóstase. Alternativamente, o CRP descrito na presente inven- 15 ção pode ser aplicado em combinação com um componente do substrato, e em tais modalidades, o CRP é, deste ponto em diante no presente documento, referido como componente CRP-hemostato. O substrato pode ser um substrato adequado para a implantação em um indivíduo, ou pode ser um substrato não implantável.

Exemplos de substratos implantáveis adequados incluem, mas

não se limitam a, dispositivos médicos, como âncoras de sutura, grampos, tachas cirúrgicas, clipes, parafusos, e filmes; estruturas para engenharia tecidual, como feltros não trançados, tecidos ou redes trançadas; espumas; e pós. Esses substratos implantáveis podem compreender qualquer material 25 adequado para a implantação no corpo e incluem, mas não se limitam a, polímeros biocompatíveis, bioabsorvíveis como poliésteres alifáticos, poli(aminoácidos) como a poli(L-lisina e poli(ácido glutâmico), copoli(éter- ésteres), oxalatos de polialquileno como aqueles que têm um comprimento do grupo alquila de um a dez átomos de carbono, polioxaamidas, policarbo- 30 natos derivados de tirosina, poli(iminocarbonatos), poliortoésteres, polioxa- ésteres, poliesteramidas, polioxaésteres contendo grupos amina, poli (anidridos), polifosfazenos, biomoléculas (incluindo biopolímeros como o colágeno, elastina, e gelatina, e polissacarídeos, como amidos, alginato, pectina, carbóxi metil celulose, sais de carbóxi metil celulose, celulose regenerada oxidada, e similares), e copolímeros e combinações dos mesmos, bem como materiais não absorvíveis incluindo, mas não se Iimi- 5 tando a, algodão, linho, seda, náilon, como náilon 6-6 e poliamidas aro- máticas, como aquelas comercialmente disponíveis junto a E. I. du Pont de Nemours e Companhia sob os nomes comerciais "KEVLAR" ou NOMEX, poliésteres, como poli(etileno tereftalato), fluoropolímeros, como o politetrafluoroetileno, poli(etileno-propileno) fluorados (FEP) e polivinilideno 10 fluorado (PFA), poliolefinas, como polietileno e polipropileno, poliuretanos e combinações dos mesmos.

Para uso na presente invenção, "bioabsorvível" deverá referir-se a materiais que degradam-se prontamente via reações enzimáticas ou hidrolíticas após exposição a tecido corporal por um período de tempo 15 relativamente curto. "Degradar" deverá significar que o material fragmenta- se em pequenos segmentos que podem ser substancialmente metaboliza- dos ou eliminados pelo corpo. A bioabsorção completa deve ocorrer dentro de cerca de vinte meses, embora a bioabsorção possa ser completada por exemplo, dentro de cerca de nove meses, dentro de cerca de seis meses, ou 20 dentro de cerca de três meses ou menos.

Entende-se que os poli(iminocarbonatos), para o propósito desta invenção, incluem aqueles polímeros conforme descritos por Kemnitzer e Kohn, no Handbook of Biodegradable Polymers, editado por Domb, et. al., Hardwood Academic Press, pp. 251-272 (1997).

Entende-se que os copoli(éter-ésteres), para o propósito desta

invenção, incluem aqueles copoliésteres-éteres conforme descrito no Journal of Biomaterials Research, volume 22, páginas 993-1009, 1988 por Cohn e Younes, e em Polymer Preprints (ACS Division of Polymer Chemistry), Volume 30(1), página 498, 1989 por Cohn (e.g. PEO/PLA). Os oxalatos de 30 polialquileno, para o propósito desta invenção, incluem aqueles descritos nas Patentes US n22: 4.208.511; 4.141.087; 4.130.639; 4.140.678; 4.105.034; e 4.205.399. Entende-se que policarbonatos derivados de tirosina, para o propósito desta invenção, incluem aqueles polímeros conforme descritos por Pulapura et al., Biopolymers, Volume 32, Número 4, página 411-417, e Ertel et al., J. Biomed. Mater. Res., 1994, 28, 919-930. Para o propósito desta invenção, entende-se que os polifosfazenos, 5 polímeros à base de monômero misturado de co-, ter- e de ordem mais alta feitos a partir de L-lactídeo, D, L-lactídeo, ácido láctico, glicolídeo, ácido glicólico para-dioxanona, carbonato de trimetileno e épsilon-caprolactona incluem aqueles descritos por Allcock na The Encyclopedia of Polymer Science, Volume 13, páginas 31-41, Wiley Intersciences, John Wiley & Sons, 10 1988 e por Vandorpe, et al no Handbook of Biodegradable Polymers, editado por Domb, et al, Hardwood Academic Press, pp. 161-182 (1997). Entende-se que as poliesteramidas, para o propósito desta invenção, incluem aqueles polímeros conforme descrito no pedido de Patente US n° 20060188547, e Patente US n°. 5.919.893. Os polianidridos incluem aqueles derivados a 15 partir de diácidos de forma HOOC-C6H4-O-(CH2)m-O-C6H4-COOH, sendo que m é um número inteiro na faixa de 2 a 8, e copolímeros desses com diácidos alfa-ômega alifáticos de até 12 átomos de carbono. Os polioxaésteres, polioxamidas e polioxaésteres contendo aminas e/ou grupos amido são descritos em uma ou mais das seguintes Patentes US n—: 20 5.464.929; 5.595.751; 5.597.579; 5.607.687; 5.618.552; 5.620.698; 5.645.850; 5.648.088; 5.698.213; 5.700.583; e 5.859.150. Entende-se que poliortoésteres, para o propósito desta invenção, incluem aqueles polímeros conforme descritos por Heller em Handbook of Biodegradable Polymers, editado por Domb, et al, Hardwood Academic Press, páginas 99-118 (1997). 25 Entende-se que os poliuretanos, para o propósito desta invenção, incluem aqueles polímeros conforme descrito na Patente US n—.: 6.326.410; 6019996; 5571529; e 4.960.594.

Entende-se que os poliésteres alifáticos, para o propósito desta invenção, incluem, mas não se limitam a, homopolímeros e copolímeros de lactídeo (que inclui ácido láctico D-, L- e meso lactídeo), glicolídeo (incluindo ácido glicólico), épsilon-caprolactona, p-dioxanona (1,4-dioxan-2-ona), car- bonato de trimetileno (1,3-dioxan-2-ona), derivados alquila de carbonato de trimetileno, conforme descrito na Patente US n°. 5.412.068, delta-valero- lactona, beta-butirolactona, gama-butirolactona, épsilon-decalactona, hidro- xibutirato, hidroxivalerato, 1,4-dioxepan-2-ona (incluindo seu dímero 1,5,8, 12-tetraoxaciclotetradecano-7,14-diona), 1,5-dioxepan-2-ona, 6,6-dimetil-1,4- dioxan-2-ona e combinações dos mesmos.

Em uma modalidade, o poliéster alifático é um compolímero elastomérico. "Copolímeros elastoméricos" são definidos com um material que à temperatura ambiente pode ser estendido repetidamente a pelo menos cerca de duas vezes seu comprimento original e na liberação 10 imediata do estresse, retornará aproximadamente ao seu tamanho original. Elastômeros biocompatíveis bioabsorvíveis incluem, mas não se limitam àqueles selecionados a partir do grupo que consiste em copolímeros elastoméricos de épsilon-caprolactona e glicolídeo (como aqueles que têm uma razão molar de épsilon-caprolactona para glicolídeo em uma faixa de 15 cerca 30:70 a cerca de 70:30, ou em uma faixa de cerca de 35:65 a cerca de 65:35, ou em uma faixa de cerca de 45:55 a 35:65); copolímeros elastoméricos de épsilon-caprolactona e lactídeo, incluindo L-lactídeo, D- lactídeo, combinações dos mesmos ou copolímeros de ácido láctico (como aqueles que têm uma razão molar de épsilon-caprolactona para lactídeo em 20 uma faixa de cerca 35:65 a cerca de 65:35, ou em uma faixa de cerca de 45:55 a 30:70) copolímeros elastoméricos de p-dioxanona (1,4-dioxan-2- ona) e lactídeo incluindo L-lactídeo, D-lactídeo e ácido láctico (como aqueles que têm uma razão molar de p-dioxanona para lactídeo em uma faixa de cerca de 40:60 a cerca de 60:40); copolímeros elastoméricos de épsilon- 25 caprolactona e p-dioxanona (como aqueles que têm uma razão molar de épsilon-caprolactona para p-dioxanona em uma faixa de cerca de 30:70 a cerca de 70:30); copolímeros elastoméricos de p-dioxanona e carbonato de trimetileno (como aqueles que têm uma razão molar de p-dioxanona para carbonato de trimetileno em uma faixa de cerca de 30:70 a cerca de 70:30); 30 copolímeros elastoméricos de carbonato de trimetileno e glicolídeo (como aqueles que têm uma razão molar de carbonato de trimetileno para glicolídeo em uma faixa de cerca de 30:70 a cerca 70:30); copolímeros elastoméricos de carbonato de trimetileno e lactídeo incluindo L-lactídeo, D- lactídeo, misturas dos mesmos ou copolímeros de ácido láctico (como aqueles que têm uma razão molar de carbonato de trimetileno para lactídeo em uma faixa de cerca de 30:70 a cerca de 70:30) e misturas do mesmos.

Em outra modalidade, o copolímero elastomérico é épsilon-caprolactona e glicolídeo que tem uma razão molar de épsilon-caprolactona para glicolídeo em uma faixa de cerca de 35:65 a cerca de 65:35. Em ainda outra modalidade, o copolímero elastomérico é épsilon-caprolactona e glicolídeo que tem uma razão molar de cerca de 35:65.

Exemplos de substratos não-implantáveis adequados incluem,

mas não se limitam a, bandagens e curativos para ferimentos. Para uso na presente invenção, uma "bandagem" deverá significar um pedaço de pano ou outro material usado para atar ou envolver uma parte do corpo doente ou ferida. Bandagens são colocadas diretamente sobre o ferimento ou usadas 15 para atar um curativo ao ferimento. Para uso na presente invenção, um "curativo para ferimento" deverá significar um pedaço de pano ou outro material que é colocado diretamente sobre o ferimento e serve ao propósito de proteger o ferimento; promover a cura; e/ou fornecer, reter, ou remover a umidade, e é opcionalmente mantido no lugar pelo uso de uma bandagem.

Substratos não-implantáveis podem ser de várias formas

incluindo, mas não se limitando a, tecidos, espumas, gazes, filmes, banda- gens adesivas, hidrocoloides, géis e combinações dos mesmos. Esses substratos não-implantáveis podem compreender qualquer material adequa- do para aplicação (sem implantação) ao corpo e incluem, mas não se 25 limitam a, polímeros biocompatíveis e bioabsorvíveis como poliésteres alifáti- cos, poli(aminoácidos), como poli(L-lisina) e poli(ácido glutâmico), copoli (éter-ésteres), oxalatos de polialquileno como aqueles com grupos alquila tendo um a dez átomos de carbono, polioxa-amidas, policarbonatos derivados de tirosina, poli(iminocarbonatos), poliortoésteres, polioxaésteres, 30 poliesteramidas, polioxaésteres contendo grupos amina, poli(anidridos), polifosfazenos, biomoléculas (incluindo biopolímeros como colágeno, elas- tina, e gelatina, e polissacarídeos, como amidos, alginato, pectina, carbóxi metil celulose, sais de carbóxi metil celulose, celulose regenerada oxidada e similares) e copolímeros e combinações dos mesmos, bem como materiais não-bioabsorvíveis incluindo algodão, linho, seda, náilon, como náilon 6-6 e poliamidas aromáticas, como aquelas comercialmente disponíveis junto a E.

I. du Pont de Nemours e Compahia sob os nomes comerciais "KEVLAR" ou "NOMEX," poliésteres, como poli(etileno tereftalato), fluoropolímeros como politerafluoroetileno, poli(etileno-propileno fluorado (FEP) e fluoreto de polivinilidino (PFA), poliolefinas como polietileno e polipropiieno, poliuretanos e combinações dos mesmos Esses materiais são definidos conforme 10 descrito acima.

O componente CRP-hemostato pode ser aplicado na superfície de tais substratos por meio de técnicas de revestimento convencionais, como revestimento por imersão, revestimento por aspersão, revestimento por liofilização, e técnicas de revestimento eletrostático. Detalhes desses métodos de revestimento são bem conhecidos da técnica e apresentados, por exemplo, na Patente US n° 6.669.980; Yun JH, et al., 40(3) ASAIO J.M, 401-5 (Julho-Setembro 1994); e, Krogars K, et al, EurJ Pharm Sci., 2002 (Outubro), 17 (1-2), 23-30. Em geral, uma solução contendo a quantidade desejada do componente CRP-hemostato pode ser preparada e aplicada à superfície do substrato desejado por meio da técnica de revestimento selecionada. O substrato pode então ser submetido a secagem por meio de processos de secagem convencionais incluindo, mas não se limitando a, secagem a ar, secagem a vácuo e em forno a vácuo, ou secagem a liofilização. O CRP deve ser usado em uma quantidade necessária para alcançar as propriedade hemostáticas desejadas, como coagulação sanguína, agregação plaquetária, e similares, mas geralmente o CRP está presente com o propósito de substrato de revestimento em uma quantidade em uma faixa de cerca de 0,01 mg/cm2 a cerca de1 mg/cm2 de substrato, ou em uma faixa de cerca de 0,1 mg/cm2 a cerca de 0,5 mg/cm2, ou em uma faixa de cerca de 0,4 mg/cm2.

Em outra modalidade na qual o substrato é um gel injetável ou aspersível ou líquido formador de gel, o componente CRP-hemostato, que pode estar na forma de um pó ou substância fibrilar semelhante ao colágeno, pode ser combinado com um gel ou líquido injetável ou aspersível por meio de técnicas de mistura convencionais conhecidos na técnica. O gel injetável ou aspersível ou líquido formador de gel pode compreender uma solução salina aquosa e um material gelificante.

Exemplos desolução salina aquosa adequados incluem, mas não se limitam a, solução tampão fisiológica, salina, água, salina tamponada, solução tampão de fosfato, solução salina balanceada de Hank, PBS, salina tamponada com Tris, salina tamponada com Hepes, e misturas das 10 mesmas. Em uma modalidade, a solução salina aquosa por ser uma solução tampão de fosfato ou PBS.

Exemplos de materiais gelificantes adequados incluem, mas não se limitam a proteínas como colágeno, elastina, trombina, fibronectina, gelatina, fibrina, tropoelastina, polipeptídeos, laminina, proteoglicanos, cola 15 de fibrina, coágulo de fibrina, coágulo de plasma rico em plaquetas (PRP), coágulo de plasma pobre em plaquetas (PPP), hidrogéis de peptídeo de automontagem, e atelocolágeno; polissacarídeos como, amido, pectina, celulose, celulose alquila (por exemplo, metil celulose), celulose alquila hidróxi alquila (por exemplo, celulose etil hidróxi etil), celulose hidróxi alquila 20 (por exemplo, celulose hidróxi etil), sulfato de celulose, sais de carbóxi metil celulose, carbóxi metil celulose, carbóxi etil celulose, quitina, carbóxi metil quitina, ácido hialurônico, sais de ácido hialurônico, alginato, ácido algínico alginato de ligação cruzada, propileno glicol alginato, glicogênio, dextrana, sulfato de dextrana, curdlana, pectina, pululana, xantana, condroitina, 25 sulfatos de condroitina, carbóxi metil dextrana, carbóxi metil quitosana, quitosana, heparina, sulfato de heparina, heparana, suflato de heparana, sulfato de dermatana, sulfato de queratana, carragenas, quitosana, amido, amilose, amilopectina, poli-N-glucosamina, ácido polimanurônico, ácido poliglucurônico ácido poliglucurônico), e derivados; polinucleotídeos como, 30 ácidos ribonucléicos, ácidos desoxirribonucleicos, e outros como, poli(N- isopropil acrilamida), poli(oxialquileno), copolímeros de poli(óxido de etileno)- poli(óxido de propileno), poli(vinil álcool), poliacrilato, polímeros de monos- tearoil glicerol cossuccinato/polietileno glicol (MGSA/PEG) e copolímeros e combinações dos mesmos.

Na definição dos materiais de celulose aqui descritos, o termo "alquila" refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto que pode ser uma cadeia 5 reta ou ramificada contendo cerca de 1 a cerca de 7 átomos de carbono, exceto quando indicado de outra forma para uma modalidade particular, por exemplo, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila, isopentila, neopentila, hexila, 2,3-dimetilbutila, neo-hexila, ou heptila.

Em uma modalidade, o material gelificante compreende polissa- carídeos. Em outra modaliade, o material gelificante compreende carbóxi metil celulose de sódio.

O gel ou líquido injetável ou aspersível pode ser preparado pela dissolução de uma quantidade eficaz de material gelificante em uma solução salina aquosa para formar um gel inicial.

Uma "quantidade eficaz" de material gelificante é definida como

a quantidade de material gelificante suficientemente necessária para permitir que o gel ou líquido injetável ou aspersível seja injetado ou aspergido sobre a área afetada e permanecer substancialmente no local após a aplicação. Embora a quantidade eficaz de material gelificante varie dependendo de, por 20 exemplo, o material gelificante selecionado, a quantidade de CRP desejada, e similares, o versado na técnica pode determinar facilmente uma quan- tidade eficaz de material gelificante sem demasiada experimentação. Em uma modalidade, em que o material gelificante é carbóxi metil celulose, o material gelificante pode estar presente em uma quantidade, com base no 25 peso total da solução, em uma faixa de cerca de 0,1 por cento a cerca de 5 por cento, ou em uma faixa de cerca de 0,5 por cento a cerca de 3 por cento.

O componente CRP-hemostato pode então ser combinado com o gel inicial por quaisquer técnicas de mistura convencionais conhecidas na técnica incluindo, mas não se limitando a, mistura manual com uma 30 espátula, agitação magnética, ou mistura mecânica usando um motor a e uma pá ou lâmina rotativa. Para minimizar possíveis efeitos deletérios ao CRP, a temperatura de mistura não deve exceder a cerca de 50 °C. O CRP- hemostato está presente no gel resultante em uma quantidade eficaz para induzir a hemostase quando aplicado ao local da hemorragia, e está tipicamente em uma faixa de, com base no peso total do gel final, cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 10 mg/mL, ou em uma faixa de cerca de 0,1 mg/mL a 5 cerca de 1 mg/mL, ou cerca de 0,3 mg/mL. Em uma modalidade, o gel ou líquido injetável ou aspersível pode estar na forma de gel antes da injeção, embora em uma modalidade alternativa, o gel ou líquido injetável ou aspersível pode estar na forma líquida antes da injeção, mas em uma forma de gel e capaz de permanecer substancialmente no lugar no momento da 10 administração no local desejado.

Nas modalidades em que o componente CRP-hemostato está na forma de pó, o CRP pode estar combinado com qualquer veículo de pó adequado conhecido na técnica. Em uma modalidade, o veículo pode ser um líquido pulverizador revestindo partículas de pó usando métodos apresen- 15 tados em, por exemplo, Maa YF, et al., SJ Curr Pharm Biotechnol., 2000 (Nov.), 1(3), 283-302. O componente CRP-hemostato pode estar presente em uma quantidade, com base no peso total do pó, em uma faixa de cerca de 0,5 por cento a cerca de 100 por cento, ou em uma faixa de cerca de 2 por cento a cerca de 10 por cento.

Exemplos de veículos de pó adequados incluem, mas não se

limitam, polissacarídeos, como amido, pectina, celulose, alquila celulose (por exemplo, metilcelulose), alquila hidróxi alquila celulose (por exemplo, etila hidróxi etila celulose), hidróxi alquila celulose (por exemplo, hidróxi etil celulose), sulfato de celulose, sais de carbóxi metil celulose, carbóxi metil 25 celulose, carbóxi etil celulose, quitina, carbóxi metil quitina, ácido hialurônico, sais de ácido hialurônico, alginato, ácido algínico alginato de ligação cruzada, alginato de propileno glicol, glicogênio, dextrana, sulfato de dextrana, curdlana, pectina, pululana, xantana, condroitina, sulfatos de condroitina, carbóxi metil dextrana, carbóxi metil quitosana, quitosana, 30 heparina, sulfato de heparina, heparana, sulfato de heparana, sulfato de dermatana, sulfato de queratana, carragenas, quitosana, amido, amilose, amilopectina, poli-N-glucosamina, ácido polimanurônico, ácido poliglucurô- nico, manitol, lava porosa, poliésteres, e copolímeros e misturas dos mesmos.

Síntese geral de CRP

Os CRPs da presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas em solução ou em fase sólida Por exemplo, embora os CRPs possam ser preparados por outros métodos (por exemplo, métodos de solução) e então anexados a um material de suporte para acoplamento subsequente, é preferível que sejam usadas técnicas padrão de síntese orgânica em fase sólida, como técnicas de síntese de polipeptídeos em fase sólida (SPPS). Isto é, um CRP da presente invenção pode ser sintetizado, subsequentemente anexado a um material de suporte, acoplado com vários reagentes, e então removido do suporte material usando uma variedade de técnicas. De preferência, entretando, o CRP é sintetizado sobre um material de suporte, acoplado com reagentes, e então removido de um material de suporte usando uma variedade de técnicas.

Para a preparação de CRPs (oligopeptídeos, polipeptídeos, ou proteínas), a síntese de peptídeo em fase sólida envolve uma etapa de ligação covalente (isto é, ancoragem) que liga a cadeia de CRP nascente ao material de suporte (tipicamente, um suporte polimérico insolúvel) contendo 20 grupos funcionais apropriados para anexação. Subsequentemente, o CRP ancorado é estendido por uma série de ciclos de adição (desproteção/aco- plamento) que envolvem a adição gradual de aminoácidos N-protegidos e protetores de cadeia lateral na direção CaN. Uma vez que a montagem da cadeia tenha sido realizada, os grupos protetores são removidos e o CRP é 25 clivado a partir do suporte. Em alguns casos, outros grupos são adicionados ao CRP antes dos grupos protetores serem removidos.

Tipicamente, o SPPS começa pelo uso de um cabo para anexar um resíduo de aminoácido inicial a um material de suporte funcionalizado. Um cabo (isto é, conector) é um espaçador bifuncional que, em uma 30 extremidade, incorpora características de um grupo protetor uniformemente clivado, e na outra extremidade, um grupo funcional, geralmente um grupo carboxila, que pode ser ativado para permitir o acoplamento ao material de suporte funcionalizado. Cabos conhecidos incluem os cabos de ácido lábil p- alcoxibenzila (PAB)1 cabos de ésteres de o-nitrobenzila fotolábeis, e cabos como aqueles descritos por Albericio et al., J. Org. Chem., 55, 3730-3743 (1990) e referências citadas nesse, e nas Patentes US n°s 5.117.009 (Barany) e 5.196.566 (Barany et al.).

Por exemplo, se o material de suporte é preparado com monô- meros amino-funcionais, tipicamente, os cabos apropriados são acoplados quantitativamente em uma etapa única nos suportes amino-funcionalizados para fornecer um ponto de partida geral de estruturas bem definidas para a montagem da cadeia de polipeptídeos. O grupo protetor do cabo é removido e o resíduo C-terminal do primeiro aminoácido N'-protegido é acoplado quantitativamente ao cabo. Uma vez que o cabo estiver acoplado ao material de suporte e o aminoácido inicial estiver anexado ao cabo, o ciclo de síntese geral prossegue. O ciclo da síntese geralmente consiste na desproteção do grupo amino N-protegido do aminoácido no material de suporte, lavagem, e, se necessário, uma etapa de neutralização, seguida por reação com uma forma carboxila ativada do próximo aminoácido N-protegido. O ciclo é repetido para formar o CRP de interesse. Os métodos de síntese de peptídeo em fase sólida usando materiais de suporte insolúveis funcionali- zados são bem conhecidos.

Quando as técnicas de SPPS são usadas para sintetizar CRPs sobre o material de suporte, metodologias Fmoc envolvem o uso de técnicas ortogonais moderadas com o uso do grupo protetor de base lábil 9- fluorenilmetilóxicarbonila (Fmoc). Aminoácidos Fmoc podem ser preparados 25 com o uso de carbonato de fluorenilmetil succinimidil (Fmoc-OSu)1 cloreto de Fmoc, ou sulfato de [4-(9-fluorenil metilóxi carbonilóxi)fenil]dimetilsulfônio metil (Fmoc-ODSP). O grupo Fmoc pode ser removido com o uso de piperidina em dimetilformamida (DMF) ou N-metilpirrolidona, ou com o uso de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) em DMF. Após a remoção de 30 Fmoc, a N1-amina liberada da resina suportada está livre e pronta para anexação imediata do lipídeo sem uma etapa de neutralização interveniente. O análogo hidrofóbico imobilizado do CRP desejado pode ser então removido, por exemplo, com o uso de ácido trifluoroacético (TFA) à temperatura ambiente. Tais metodologias de síntese de polipeptídeo em fase sólida Fmoc são bem conhecidas aos elementos versados na técnica.

Uma variedade de materiais de suporte para a preparação dos 5 complexos da presente invenção pode ser usada. Eles podem ser de materiais inorgânicos ou orgânicos e podem estar em uma variedade de formas (como membranas, partículas, cápsulas esféricas, fibras, géis, vidros, etc). Exemplos incluem, vidro poroso, sílica, poliestireno, polietileno terefta- lato, polidimetilacrilamidas, algodão, papel, e similares. Poliestirenos funcio- 10 nalizados, como resinas de poliestireno aminofuncionalizado, poliestireno aminometila, poliestireno aminoacila, poliestireno p-metilbenzidrilamina ou polietileno glicol-poliestireno também podem ser usadas para esse propósito. Síntese específica de CRP

Acredita-se que o versado na técnica pode, com base na descrição da presente invenção, utlizar a presente invenção em sua mais completa extensão. As modalidades específicas a seguir devem ser interpretadas como meramente ilustrativas, e não como limitantes, em qualquer aspecto, do restante da descrição.

Materiais e Métodos: aminoácidos Fmoc, HBTU/HOBT, DIEA, NMP e DCM foram adquiridos junto a Applied Biosystems, Inc. A piperidina foi adquirida junto a Sigma-Aldrich. A resina Fmoc-Gly-Wang foi adquirida junto a Bachem e a resina Fmoc-Phe-Wang junto a Novabiochem. A espectometria de massa MALDI-TOF foi realizada na M-Scan Inc. com o uso de uma estação de trabalho de Biospectometria Voyager-DE PRO de Applied Biosystems acoplada com um espectômetro de massa com dessorção a laser de Extração Atrasada com ácido a-ciano-4-hidróxi cinâmico como matriz. A análise de aminoácido foi realizada na Molecular Structural Facility de U.C. Davis com o uso de uma analisador de aminoácido Beckman 6300 Li-baseado. Os CRPs obtidos eram de pureza maior de 90% e o contéudo do polipeptídeo foi considerado para preparar as soluções para cada experimento. Adicionalmente, a concentração do CRP foi confirmada medindo a absorção em 214 (ε = 6,0 χ 104 M‘1cm'1 em PBS) ou 215 nm (ε = 6,5 χ 104 M'1cm'1 em água). Todas as filtrações de polipeptídeos para experimentos de microscopia eletrônica foram realizadas com o uso de filtro Nuclepore (0,4-mm; membrana de policarbonato) de Whatman, o resto das filtrações foi feito com o uso de filtros de seringa Acrodisc (0,45-mm; membrana de politetrafluoroetileno) de Pall.

A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, conforme comumente compreendido pelo versado na técnica a qual a invenção pertence. Abreviações usadas na especificação instantânea são as seguintes:

Abreviação Significado DCM diclorometano Ac acetila DIEA A/./V-di-isopropiletilamina DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DMF dimetilformamida Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonila Fmoc-Osu carbonato de fluorenilmetila succinimidil Fmoc-ODSP metil sulfato de [4-(9-fluorenil-metiloxicarbonilóxi)fenil]-dimetilsulfô- nio HBTU hexafluorofosfato de 2-[(1 H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametilurô- nio HOBT hidroxibenzotriazol NMP A/-metil-pirrolidona PBS solução salina tamponaa de fosfato TFA ácido trifluoroacético Tm temperatura de fusão Exemplo 1

SEQ ID 25: (F5)-Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe Comparador SEQ ID 29: Ac-(GIy-Pro-Hyp)IO-GIy Comparador SEQ ID 35: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Phe O CRP tendo SEQ ID 25 e polipeptídeos comparadores com

SEQ ID 29 e SEQ ID 35 foram sintetizados por química FastMoc padrão, purificados por HPLC de fase reversa e caracterizados.

O CRP tendo SEQ ID 25 foi sintetizado em um sintetizador ABI 431 usando química FastMoc (escala de 0,1 mmol) e resina de Fmoc-Phe- Wang (0,74 mmol/g, rede de 100-200). O CRP foi clivado a partir da resina com TFA/tri-isopropilsilano/água (95:2,5:2,5) por 2 horas. A purificação por HPLC foi realizada em um purificador de coluna de fase reversa Phenomenex C-18 (25 χ 5 cm), com o uso de um gradiente linear de 10-95% B (A: 0,2% TFA/H2O; B: 0,16% TFA/MeCN) em torno de 60 minutos em uma taxa de fluxo de 50 mL/min. O CRP foi obtido como um pó branco em 32% 5 de rendimento total. Para a SEQ ID 25: (F5)-Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe: MALDI-TOF-MS (M+Na)+ calculado para C138H185F5N32O4S, 3096,3; encontrado, 3096,8. O polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 35: F5Phe- (Gly-Pro-Hyp)5-Phe foi sintetizado de modo similar ao CRP tendo SEQ ID 25: (F5)-Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe.

O polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 29: Ac-(Gly-Pro-

Hyp)10-Gly foi sintetizado em um sintetizador ABI 433A com o uso de química FastMoc (escala de 0,1 mmol) e Fmoc-Gly-Wang (0,7 mmol/g, rede de 100-200). O polipeptídeo comparador foi clivado a partir da resina com 95% TFA por 2 horas. A purificação por HPLC foi realizada em duas colunas 15 de fase reversa C-18 (25 χ 2,5 cm), com o uso de um gradiente de etapa de 0-100% B em torno de 90 minutos (A: 0,1% TFA/H20; B: 80% MeCN/H20 contendo TFA a 0,1%) em uma taxa de fluxo de 6 mL/min. O polipeptídeo comparador foi obtido como um pó branco em 34% de rendimento total. Para a SEQ ID 29: Ac-(GIy-Pro-Hyp)IO-GIy: MALDI-TOF-MS (M+Na)+ calculado 20 para C124H177N31O43, 2811,3; encontrado, 2812,2.

Espectroscopia de dicroísmo circular (CD)

As soluções de CRP tendo SEQ ID 25, e polipeptídeos comparadores tendo SEQ ID 29 e SEQ ID 35 (0,25 mM e 0,013 mM em água) foram armazenados a 4°C por 24 horas e monitorados para a 25 formação de trímero. O espectro CD foi medido a 25°C em um instrumento Jasco J-710 com o uso de células de comprimento de trajetória de 0,1 cm por sinal em uma média de 10 ou 20 varreduras a uma velocidade de varredura de 100 nm/min. Verificou-se que o CRP tendo SEQ ID 25 e polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 29 adotam estruturas tripo- 30 helicoidais por espectroscopia CD (Gmax = 225 nm). As curvas de fusão CD foram obtidas em um espectômetro Aviv 215 equipado com um sistema de controle de temperatura. A elipticidade a 225 nm foi monitorada partir de 20 a 100°C, a uma taxa de 1°C/min, com incrementos de 3°C, tempo de equilíbrio de 5 minutos e comprimento de trajetória de 0,1-cm.

Verificou-se que homotrímero de CRP tendo SEQ ID 25 tinha Tm de cerca de 57°C. O resultado para o trímero CRP de SEQ ID 25 foi 5 confirmado por um estudo 1HRMN dependente de temperatura, no qual a desproteção acentuada característica para a d-H de prolina (originalmente δ 3,0-3,5 ppm) ocorreu de cerca de 55 0C a cerca de 65 0C (com equilíbrio). Portando, o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 era estável à temperatura ambiente. Comparativamente, a estabilidade térmica para o trímero de CRP 10 tendo SEQ ID 25 foi levemente mais alta do que aquela para um composto mimético de colágeno recentemente descrito (Tm = 47 °C) com três cadeias de peptídeos ligadas covalentemente por um par de ligações dissulfeto. (Kotch F e Raines RT, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2006, 103, 3028-3033). A temperatura de fusão mais baixa para o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 15 comparado ao trímero de polipeptídeo de referência tendo SEQ ID 29 (Tm 70°C) pode ser atribuível a algumas rachaduras estruturais ("desgaste") nas extremidades do trímero de CRP tendo SEQ ID 25 pelos grupos fenila e pentafluorofenila.

Dispersão dinâmica de Iuz (DLS)

As medidas de DLS foram feitas em um instrumento Malvern

Zetasizer Zen 1600 equipado com um laser de 633-nm (He-Ne, 4,0 mW) e detecção de retroespalhamento a 173°. Soluções de CRP tendo SEQ ID 25 e o polipeptídeo de referência tendo SEQ ID 29 (0,5 mg/mL em água) foram aquecidas a 70°C por 10 minutos, filtradas quentes através de um filtro d 25 0,45-mm e medidas em cadinhos plásticos (1,0 cm) quando as soluções alcançavam a temperatura ambiente (no tempo = 0) e após 24 horas.

As medidas DLS foram tomadas para determinar o tamanho dos compósitos supramoleculares formados pelo CRP tendo SEQ ID 25 e polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 29 em água a 25°C. Uma solução 30 fresca de CRP tendo SEQ ID 25 continha duas espécies, dimensionadas em 3 nm e 190 nm, as quais após 24 horas, convergiram em um material agregado com um tamanho aproximado de 1000 nm. Em contraste, o polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 29 mostrou duas espécies com tamanhos de cerca de 4 e 100 nm, que não aumentaram durante o mesmo período de tempo. Esses resultados sugerem que o mecanismo de empilhamento fenila-pentafluorofenila aromática hipotetizado estava faci- 5 Iitando a formação do CRP tendo SEQ ID 25 em um compósito supra- molecular.

Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

O tamanho e morfologia do compósito supramolecular do CRP tendo SEQ ID 25 também foram avaliados por Timagens EM tomadas com 10 um TEM Philips EM 300. Soluções aquosas de CRP tendo SEQ ID 25 (0,05 mg/mL) foram filtradas através de filtros de 0,4-mm e depositadas sobre grades de cobre revestidas com filmes de carbono. As soluções foram submetidas à secagem a 40°C e imagens foram registradas a 80 kV. Artérias de ratos foram tingidas com glutaraldeído a 2% e colocadas dentro de blocos 15 de epóxi para TEM. Seções finas das artérias dentro de blocos de epóxi (cerca de 200-500 nm de tamanho) foram cortadas com o uso de uma ferramenta de seção de diamante. As seções foram montadas sobre grades de cobre e imagens registradas a 60 kV. Em cada experimento, filbrilas de compósito de pm, (diâmetro médio: 0,26 pm), lembrando fibrilas de colágeno 20 encontradas no tecido aórtico de ratos (diâmetro médio: 0,05 pm) foram observadas. As dimensões de fibrilas tendo SEQ ID 25 exigiram uma montagem ponta a ponta (linear) e lado a lado (lateral) de pelo menos 100 CRP trímeros tendo SEQ ID 25 em cada direção.

Espectroscopia RMN de prótons O espectro RMN de prótons de CRP tendo SEQ ID 25 (1 mM em

D2O incubados a 4°C por 24 horas) foi coletado em um espectrômetro DMX- 600 RMN (Bruker Biospin, Inc., Billerica, MA 01821-3991) equipado com uma ressonância tripla (1H, 13C1 15N), eixo triplo, ponta de prova de gradiente. Um NOESY unidimensional, com pré-saturação durante o tempo 30 de repetição e tempo de misturação, foi usado para coletar os dados. A temperatura foi elevada em incrementos de 10°C e o espectro foi medido após equilíbrio de 15 min. Exemplo 2

SEQ ID 25: F5Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe SEQ ID 26: Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe SEQ ID 27: Leu-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe SEQ ID 28: GIy-(GIy-Pro-Hyp)IO-GIy.

Os CRPs tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26, e SEQ ID 27 e o polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 28 foram sintetizados por química FastMoc padrão, purificados em HPLC de fase reversa, e caracterizados. Síntese de peptídeo

Os CRPs tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 e o

polipeptídeo comparador tendo SEQ ID 28 foram sintetizados em um sintetizador ABI 431 com o uso de química FastMoc (escale de 0,1 mmol) e resina Fmoc-Phe-Wang (0,74 mmol/g, rede de 100-200) ou resina Fmoc-Gly- Wang (0,66 mmol/g, rede de 100-200). Os CRPs e o polipeptídeo foram 15 clivados a partir da resina com TFA/triisopropilsilano/água (95:2,5:2,5) por 2 horas. A purificação foi realizada por RP-HPLC (Zorbax 300 SB-C18, 21,2 x 150 mm, a 60°C) com o uso de um gradiente linear de 5-95% B (A:TFA/água a 0,05%; B: TFA/MeCN a 0,05%) durante 15 minutos a uma taxa de fluxo de 20 mL/min. As frações foram analisadas por LC/MS em um Agilent 1100 20 acoplado com detector Finnigan LCQ com o uso de uma coluna Zorbax 300 SB-C18 (3,5 mm 4,6 x 150 mm) a 60 0C e um gradiente linear de 5-95% B (A: ácido fórmico a 0,02%/água; B: fórmico/MeCN a 0,02%) durante 20 minutos a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.

Conforme mostrado na Tabela 1, as frações contendo material 25 (>90%) puro foram combinadas e Iiofilizadas para render os peptídeos como pós brancos. O conteúdo do peptídeo foi determinado pela medida da absorção a 215 nm e usando o coeficiente de extração de.(£= 6,5 * 104 M'1 cm'1) determinado para o peptídeo de referência de SEQ ID 34: (Pro-Hyp- Gly)io (fornecedor: Peptides International). Calculados e Encontrados, os 30 valores MS foram determinados com o uso de MALDI-TOF-MS (M+Na)+. Tabela 1

SEQ Fórmula MS MS % de Conteúdo do

ID Calculado Encontrado rendimento Peptídeo

C138H185F5N32O43 3096,3 3096,7 31 95 26 C138H190N32O43 3006,4 3007,0 26 95 27 C135H192N32O43 2972,4 2973,0 35 96 28 C124H178N32O43 2826,3 2826,9 32 90 Análise de CRP Espectroscopia de CD: Soluções de CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 e o peptídeo comparador tendo SEQ ID 28 (0,25 mM e 5 0,013 mM em água) foram armazenadas a 4°C por 24 horas e monitoradas para formação de tripla hélice. Os espectros de CD foram medidos 25°C em um instrumento Jasco J-710 com o uso de células de comprimento de trajetória de 0,1 cm por sinal em uma média de 10 ou 20 varreduras a uma velocidade de varredura a 100 nm/min. As curvas de fusão de CD foram 10 obtidas em um espectrômero Aviv 215 equipado com um sistema de controle de temperatura Peltier. A elipticidade a 225 nm foi monitorada de 20 a 100°C, a uma taxa de 1°C/min, com incrementos de 3°C, tempo de equilíbrio de 5 minutos e comprimento de trajetória de 0,1-cm.

O espectro de CD de três CRPs (0,25 mM em água) a 25°C 15 mostrou uma banda de 225 nm (Gmax) característica de uma tripla hélice de colágeno. A estabilidade térmica das triplas hélices formadas pelos CRPs tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 também foram estudadas comparativamente pelo monitoramento da elipticidade a 225 nm a partir de 20-100°C, com incrementos de 3°C e tempo de equilíbrio de 5 minutos. As 20 temperaturas de fusão dos três CRPs foram muito similares (na faixa de 56- 59°C) indicando que, independentemente das diferenças estruturais em seus N-terminus, todos eles formaram trímeros estáveis.

Exemplo 3

SEQ ID 31: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe SEQ ID 32: Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe

SEQ ID 33: Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe

Conforme será descrito a seguir com mais detalhe, a estrutura do modelo de um trímero de CRP da presente invenção foi interpretada a partir da estrutura de raio X do trímero de polipeptídeo semelhante ao colágeno tendo SEQ ID 30: (Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-AIa)-(Pro-Hyp-GIy)5 (Bella J, Eaton M, Brodsky B e Berman HM, Science 1994, 266, 75-81). O trímero de polipeptídeo semelhante ao colágeno tendo SEQ ID 30 foi mutado 5 para incorporar F5Phe no N-terminal (posição-Pro) e Phe no C-terminus (posição-Gly) para fornecer um CRP tendo SEQ ID 31 (similar à SEQ ID 25, mas sem repetição de GPO). Os polipeptídeos tendo SEQ ID 32 e SEQ ID 33 foram preparados de modo similar com o uso de Phe e Leu, respectivamente.

Química computacional

A estrutura de cristal do polipeptídeo semelhante ao colágeno tendo SEQ ID 30 foi usada como ponto de partida para a modelagem. Visto que essa estrutura continha um resíduo de alanina central, o resíduo foi primeiramente mutado para glicina. Uma de cada das unidades B e X do 15 CRP de Fórmula (I) foi então adicionada ao N-término e C-término de cada cadeia da tripla hélice tendo SEQ ID 30. No C- término, o resíduo de Gly da SEQ ID 30 foi substituído por Phe (para SEQ ID 31, SEQ ID 32 e SEQ ID 33). No N- término, os segmentos Pro-Hyp foram substituídos com um único F5Phe (SEQ ID 31), Phe (SEQ ID 32) e Leu (SEQ ID 33).

Devido à natureza da seqüência, cada um dos CRPs tendo SEQ

ID 31, SEQ ID 32 e SEQ ID 33 continha uma repetição de motivo GPO a menos (comparado a SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27), mas foram adequados para a modelagem molecular de SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27. Cada trímero de CRP foi minimizado com o uso de uma cadeia 25 principal constrita, campo de força OPLS-AA (Jorgensen WL e Tirado-Rives J, J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 1657-1666), GB/água SA (Qui D, Shenkin PS, Hollinger FP e Still CW, J. Phys. Chem. A., 1997, 101, 3005-3014) com

o uso de Macromodel 9.0 (MacroModeI 9.0, 2005, Schrõdinger, Inc., 1500 SW FirstAve., Suite 1180, Portland, OR 97201) para relaxar qualquer tensão causada pelas modificações. Cada trímero de CRP foi então emparelhado com um trímero CRP de mesma seqüência por alinhamento de duas das unidades de trímeros ao longo do eixo central do trímero. Nessa etapa, tomou-se cuidado para fornecer um alinhamento robusto das unidades hidrofóbicas de reconhecimento.

Cada um dos pares de trímero CRP alinhados tendo SEQ ID 31, SEQ ID 32 ou SEQ ID 33 foram avaliados para automontagem e propagação 5 fibrilar com o uso de campo de força XED em que cada par de trímero alinhado foi minimizado a <0,01 rms (gradiente conjugado sem constrições; Hunter CA, Sanders JKM, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5525-5534; Vinter JG, J. Comp.-Aid. Moi Design, 1994, 8, 653-668; Vinter JG, J. Comp.-Aid. Mol. Design, 1996, 10, 417-426; e Chessari G, Hunter CA, Low CMR, Packer 10 MJ, Vinter JG e Zonta C, Chem. Eur. J., 2002, 8, 2860-2867). Todos os íons de amônio e carboxilados foram carregados a 1/8 da carga total para responder aos efeitos de solvatação parcial. Após a minimização, e energia de interação (IE) entre as duas unidades de tripla hélice foi calculada e consistiu nos componentes de Coulomb e de van der Waals. Essa energia 15 incluiu termos intermoleculares entre cada unidade de tripla hélice. Os termos e energias intramoleculares entre as cadeias no mesmo feixe de tripla hélice não foram incluídos. Os resultados de várias combinações de elementos de reconhecimento estão resumidos na Tabela 2.

A energia de interface modelada para o par de trímero de CRP 20 alinhado tendo SEQ ID 31 é mostrada na (Tabela 2, entrada 1). Três pares de anéis aromáticos adotaram orientações face a face e uma ponte de hidrogênio foi observada na interface. A estrutura foi testada para reorientar os aromáticos em uma disposição borda a borda e então reminimização (Tabela 2, entrada 2). A estrutura da interface resultante reverteu as 25 interações face a face com energia de interface similar. A interface do par de trímero de CRP tendo SEQ ID 32 exibiu interações borda a face (Tabela 2, entrada 3) ou face-a-face com ângulo deslocado. As energias totais de interface do par de trímero de CRP tendo SEQ ID 33 foram mais baixas (Tabela 2, entrada 4). Tabela 2

Energias de interação calculadas para pares de trímero (kcal/mol)

Entrada SEQID EITotaI Coulomb van der Waals

I 1SEQID 31 -55,2 -15,0 -40,2

2 2SEQID 31 -56,4 -15,2 -41,2

3 3SEQID 32 -49,2 -7,0 -42,2

4 SEQ ID 33 -32,5 -5,6 -36,9

1 Modelo Phe-pentafluorofenilalanina (iniciando com orientação face-a-face) de SEQ ID 31;

2 Modelo Phe-pentafluorofenilalanina (iniciando com orientação em forma de T) de SEQ ID 31, Minimiza para trás de orientações face-a-face;

3 Minimiza em direção a orientações borda-a-face.

Conforme mostrado na Tabela 2, os polipeptídeos tendo SEQ ID 31, SEQ ID 32 e SEQ ID 33 têm as exigências estruturais para montagem ponta a ponta em graus variados. Analogamente, os polipeptídeos tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 também teriam exigências estruturais para montagem ponta a ponta de modo similar.

Exemplo 4

Estudos de agregação plaquetária A capacidade do CRP tendo SEQ ID 25 para mimetizar a função

biológica do colágeno foi avaliada em um ensaio de agregação de plaquetas humanas. Um concentrado de plasma rico em plaquetas (PRP) humanas de voluntários saudáveis foi adquirido junto a Biological Specialties, Inc. (Colmar, PA). O PRP não tinha mais que 5 horas, visto que o PRP que tem 20 mais de 24 horas produz respostas consideravelmente atenuadas para o colágeno e para CRP de SEQ ID 25. O PRP foi centrifugado em 730 g durante 15 minutos. O pélete plaquetário resultante foi lavado duas vezes em tampão CGS (13 mM de citrato de sódio, 30 mM de glicose, 120 mM de NaCI1 pH 6,5) contendo 1 U/mL de apirase (grau V, Sigma-Aldrich) e 25 ressuspenso em tampão de Tyrode (140 mM de NaCI1 2,7 mM de KCI, 12 mM de NaHCO3, 0,76 mM Na2HPO4, 5,5 mM de dextrose, 5,0 mM de Hepes,

0,2% de BSA1 pH 7,4). As plaquetas "lavadas" foram diluídas 3 x 108 plaquetas/mL e mantidas >45 minutos a 37°C antes do uso.

Para o ensaio, 105 μΙ_ de plaquetas lavadas, 2 mM de CaCI2 e 2,5 mM de fibrinogênio foram adicionados a uma placa de microtitulação com 96 poços. A agregação plaquetária foi iniciada pela adição de concentrações seriais de fibrilas de colágeno nativas (tipo I equino; 92% de identidade com a seqüência de colágeno humana; Chrono-Iog Corp., 5 Havertown1 PA) ou peptídeos teste. O tampão foi adicionado a um conjunto de poços para controle. A placa do ensaio foi agitada constantemente e colocada de forma intermitente em um leitor de microplaca (Softmax, Molecular Devices, Menlo Park1 CA1 EUA) para Ier a densidade ótica (650 nm) no tempo O e 5 minutos após a adição das soluções do composto. A 10 agregação foi calculada como a diminuição na densidade ótica entre as medições no tempo-0 e 5-minutos e expressas como percentagem da agregação.

As condições para a preparação do peptídeo para estudos de agregação plaquetária são mostradas na Tabela 3. Os peptídeos foram 15 dissolvidos em PBS (pH 7) ou água (pH final 5) em uma concentração de 2 mg/mL. Algumas amostras foram aquecidas em banho-maria (70°C) por 10 minutos, filtradas através de um filtro de 0,45-mm e incubadas por 24 horas ou 7 dias a 4°C. Medições de UV a 215 nm antes e após a filtração não indicaram perda de peptídeos. Algumas soluções de teste de CRP com SEQ 20 ID 25 em PBS (pH 7) ou água foram incubadas por 24 horas ou 7 dias (4°C), e outras amostras foram desnaturadas (H+F) e reaneladas a 4°C.

Tabela 3

Condições para preparação de peptídeo e resultados para estudos de agregação plaquetária

Peptídeo Solvente Condições* pH Tempode EC50 ± SEM

_Incubação μΑ/ιτιί)_

Colágeno — — — — 0,25 ± 0,02

SEQID 25 PBS — 7 7 dias 0,37 ± 0,06

SEQID 25 PBS H + F 7 7 dias 2,7 ± 0,20

SEQID 25 PBS H + F 7 24 h 9,2 ± 0,82

SEQID 25 Água — 5 24 h 1,4 ±0,27

SEQID 34 PBS H + F 7 24 h Não Ativo

* H+F representa aquecido a 70°C por 10 minutos e filtrado através de um

filtro de 0,45-μιτι

As soluções diferentes de CRP tendo SEQ ID 25 induziram a agregação plaquetária, mas incubações mais curtas e amostras "H+F" mostraram uma potência diminuída. O CRP tendo SEQ ID 25 (não tratada, envelhecida 7 dias em PBS; EC50 = 0,37 μg/mL) foi aproximadamente equipotente ao colágeno Tipo I equino (EC50 = 0,25 μg/mL), considerando 5 que o polipeptídeo de referência 30-meros tendo SEQ ID 34 (Pro-Hyp-Gly)io deixou de agregar plaquetas. O peptídeo de SEQ ID 34 (Pro-Hyp-Gly)io foi adquirido junto a Peptides International, Inc.

Esses resultados indicam que o trímero de CRP que tem SEQ ID 25 pode automontar-se ao longo do tempo em agregados de comprimento e 10 conformação apropriados para satisfazer as exigências estruturais para o reconhecimento de plaquetas (presumivelmente em receptores de colágeno plaquetário). Além disso, foi observada a automontagem de um CRP curto (8-nm) tendo SEQ ID 25 por meios não-covalentes em trímeros de CRP e então em fibrilas semelhantes a colágeno com propriedades de mimetizar o 15 colágeno. De modo notável, fibrilas de compósito, com comprimento de micrômetros, e contendo tripla hélice foram formados, conforme determinado por dados de CD, DLS, e TEM. Também, o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 agiu como um material funcional semelhante à proteína, com capacidade para induzir a agregação plaquetária de modo análogo ao colágeno. Os 20 motivos de reconhecimento aromático-aromático e hidrofóbico-hidrofóbico para um CRP de Fórmula (I) oferecem uma abordagem objetiva para automontagem de peptídeos que mimetizam o colágeno e fornecem trímeros de CRP capazes de montagem em estruturas fibrilares biologicamente funcionais.

Exemplo 5

A inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno ou trímero de CRP que tem SEQ ID 25 foi obtida com o uso do antagonista GPIIb/llla integrina elarofiban (Hoekstra WJ1 et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 5254-5265). A agregação plaquetária induzida por trímero CRP tendo SEQ ID 25 e colágeno foi inibida pelo elarofiban, um inibidor de GPIIb/llla.

Plaquetas lavadas foram incubadas com várias doses de elarofiban (10, 100 e 1000 nM) por 5 minutos antes da adição do trímero de CRP tendo SEQ ID 25 e colágeno. A inibição dose-dependente de agregação plaquetária foi observada. Esses dados sugerem que o colágeno bem como o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 ativaram a agregação plaquetária ao engatilhar a sinalização de GPIIb/llla.

Exemplo 6

A inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno ou trímero de CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26, SEQ ID 27, SEQ ID 28 e SEQ ID 34 foi realizada pelos métodos descritos no Exemplo 4. De acordo com as modalidades da presente invenção, a Figura 1 mostra que os trímeros de 10 CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 estimularam a agregação plaquetário em graus variados, com o trímero de CRP tendo SEQ ID 25 e o trímero CRP tendo SEQ ID 26 sendo mais potentes. Polipetídeos de referência tendo SEQ ID 28, SEQ ID 34 e SEQ ID 35 não foram efetivos na estimulação da agregação plaquetária. A Figura 1 com EC50valores (± SEM) 15 pg/mL) obtidos para o colágeno e o trímero de CRP tendo SEQ ID 25, SEQ ID 26 e SEQ ID 27 são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4

EC^n valores (± SEM) ιια/mü

Peptídeo_ECl

50

Colágeno 0,56 ± 0,09

SEQ ID 25 2,44 ± 0,20

SEQ ID 26 13,06 ±1,28

SEQ ID 27 > 30

Exemplo 7

CRP revestido e espuma PCL/PGA revestida de controle PBS em modelo de ferimento de baco Etapa A. Suspensão de CRP

Uma suspensão teste foi preparada pela dissolução do CRP tendo SEQ ID 25 em solução salina tamponada com fosfato ("PBS") tendo pH 7,4 a uma concentração de 0,33 mg de CRP/mL de PBS, e então pela incubação da suspensão por 7 dias a 4°C.

Etapa B. Preparação de espuma de substrato PCL/PGA

Um poli(épsilon-caprolactona-co-glicolídeo) ("espuma PCL/PGA") de 3 mm de espessura foi preparado pela liofilização de 50 gramas de uma solução com 3 porcento em peso de PCL/PGA 35/65 (mol/mol) em 1,4- dioxano em um molde de alumínio de 4,5” x 4,5” sob condições de temperatura de cerca 5 a cerca de -5°C por cerca de 3 horas em um secador 5 de baixa temperatura (FTS Systems, Model TD3B2T5100). A espuma PCL/PGA resultante foi removida do molde, e então cortada em vários quadrados de 2” x 2”.

Etapa C. Preparação de espuma revestida de polipeptídeo

Um quadrado de espuma PCL/PGA preparado de acordo com o 10 procedimento apresentado na Etapa B acima foi colocado em um molde de alumínio 2” x 2” Após a mistura da suspensão de CRP preparada de acordo com procedimento apresentado na Etapa A acima até parecer homogênea, 7 mLs da suspensão foram então derramados dentro do molde para cobrir substancialmente a superfície superior da espuma. O molde foi então 15 colocado dentro de um secador de baixa temperatura (FTS Systems, Model TD3B2T5100), pré-resfriado a -50°C, e Iiofilizado a -25°C por cerca de 44 horas.

Etapa D. Preparação de espuma de controle revestida de PBS

Espumas revestidas de polipetídeo foram preparadas pela 20 adição de 7 mL de PBS a um molde 2” x 2” contendo uma espuma PCL/PGA com espessura de 3 mm de acordo com o procedimento apresentado na Etapa B acima para cobrir substancialmente a superfície superior da espuma. O molde foi colocado dentro de um secador de baixa temperatura (FTS Systems, Model TD3B2T5100), pré-resfriado a -50°C, e Iiofilizado a - 25 25°C por cerca de 44 horas.

A espuma revestida de CRP e o controle revestido de PBS foram então cortados em vários pedaços de 2 cm X 3 cm para testagem subsequente.

Modelo de lesão de baço Duas lacerações lineares (cada uma das quais tinha 1 cm de

extensão e 0,3 cm de profundidade) foram feitas em um baço de suíno. Após permitir a sangria dos ferimentos por cerca de 3 a 5 segundos, um pedaço de espuma revestido por CRP produzido de acordo com a Etapa C foi aplicado a mão à superfície de um ferimento (Grupo Teste 1), e um pedaço de espuma revestido de PBS preparado de acordo com a Etapa D foi aplicado a mão à superfície do outro ferimento (Grupo Teste 2). Uma 5 pressão similar para baixo foi então aplicada aos locais do teste por 30 segundos. Após a remoção do pedaço de espuma revestido, cada respectivo ferimento foi avaliado visualmente para determinar se a hemóstase foi alcançada. Se necessário, foi reaplicada pressão sobre cada ferimento, respectivamente, com um pedaço de espuma revestido e limpo de um tipo 10 similar em intervalos de 30 segundos. O tempo para alcançar a hemóstase, a parada do sangramento, para cada ferimento é mostrado abaixo na Tabela

5.

Tabela 5

Tempo para a hemóstase (segundos)

GrupoTeste 1_GrupoTeste 2

Pedaços Aplicados 2 2

Tempo 95 +/- 65 170 +/-70

Os resultados indicam que a espuma revestida de CRP foi útil no

alcance da hemóstase em menos tempo que a espuma controle.

Enquanto o relatório supracitado ensina os princípios da presente invenção, com exemplos fornecidos a propósito de ilustração, será entendido que a prática da invenção abrange todas as variações, adapta- 20 ções e/ou modificações usuais, conforme ocorre dentro do escopo das se- guintes reivindicações e suas equivalentes. Igualmente, todas as publica- ções, pedidos de patente, patentes, e outras referências apresentadas na especificação acima estão aqui incorporadas inteiramente por referência e para todos os propósitos.

Claims

1. Peptídeo relacionado ao colágeno da Fórmula (I): B-(Z)m-X em que Z é um tripleto selecionado do grupo consistindo em Gli-Pro-J1 Pro-J-Gli e J-Gli-Pro; J é independentemente selecionado do grupo que consiste em Hp1 fPro, mPro e Pro para cada tripleto Z; m é um número inteiro selecionado a partir de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15; e, BeX são independentemente selecionados do grupo que consiste em F5-Phe, Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituída em fenila com fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO- Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, He e Vai.

2. Substância fibrilar semelhante ao colágeno, que compreende uma pluralidade de peptídeos relacionados ao colágeno, como definidos na reivindicação 1.

3. Substância, de acordo com a reivindicação 2, que compre- ende uma pluralidade de peptídeos relacionados ao colágeno como defini- dos pela reivindicação 1, sendo que os peptídeos relacionados ao colágeno estão presentes na substância fibrilar semelhante ao colágeno na forma de uma pluralidade de trímeros de peptídeos relacionados ao colágeno.

4. Substância, de acordo com a reivindicação 3, em que os trímeros de peptídeos relacionados ao colágeno são homotrímeros.

5. Substância, de acordo com a reivindicação 3, em que os trímeros de peptídeos relacionados ao colágeno são heterotrímeros.

6. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 1, em que Z é um tripleto selecionado do grupo que consiste em Gly-Pro-J, Pro-J-Gly e J-Gly-Pro, sendo que J é Hyp em pelo menos quatro tripletos Z consecutivos.

7. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 1, em que J é independentemente selecionado do grupo que consiste em Hyp1 fPro e Pro para cada tripleto Z.

8. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 7, em que J é independentemente selecionado do grupo que consiste em Hyp e Pro para cada tripleto Z.

9. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que m é 10.

10. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que BeX são independentemente selecionados do grupo que consiste em F5-Phe, Phe (opcionalmente mono ou dissubstituída na fenila porfluoro, cloro, bromo, hidróxi, metil ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Vai.

11. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 10, em que BeX são independentemente selecionados do grupo que consiste em F5-Phe, Phe e Leu.

12. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 1, em que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe, Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituída na fenila por fluoro, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil- Ala, Trp, Cha, Chg e Leu.

13. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 12, em que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe, Phe (opcionalmente mono- ou dissubstituída na fenila por fluoro, hidróxi, metil ou CF3) e Leu.

14. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 13, em que B é selecionado do grupo que consiste em F5-Phe, Phe e Leu.

15. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que X é selecionado do grupo que consiste em Phe (opcional- mente mono- ou dissubstituída na fenila por fluoro, cloro, bromo, hidróxi, metila ou CF3), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, fenilglicina, 2-naftil-Ala, 1-naftil- Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile e Vai.

16. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 1, em que X é Phe.

17. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo é B-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)n-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

18. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo é B-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)p-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

19. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(GIy-Pro-Hyp) 12-(Gly-Pro-J)q-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

20. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)n-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

21. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)p-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

22. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-Hyp-GIy)12-(Pro-J-Gly)q-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

23. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)n-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

24. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)p-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

25. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Hyp-Gly-Pro)12-(J-Gly-Pro)q-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

26. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Gly-Pro-J)n-(Gly-Pro-Hyp)4-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

27. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Gly-Pro-J)p-(Gly-Pro-Hyp)8-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

28. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo é B-(Gly-Pro-J)q-(Gly-Pro-Hyp)12-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

29. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-J-Gly)n-(Pro-Hyp-Gly)4-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

30. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-J-Gly)p-(Pro-Hyp-Gly)8-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

31. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-J-Gly)q-(Pro-Hyp-Gly)12-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

32. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(J-Gly-Pro)n-(Hyp-Gly-Pro)4-X, sendo que n é um número inteiro selecionado a partir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

33. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(J-Gly-Pro)p-(Hyp-Gly-Pro)8-X, sendo que p é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

34. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(J-Gly-Pro)q-(Hyp-Gly-Pro)12-X, sendo que q é um número inteiro selecionado a partir de 0, 1, 2 ou 3; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

35. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Gly-Pro-J)r-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)s- X, sendo que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, sendo que a combinação de (Gly-Pro-J)r, (Gly-Pro- J)s e (Gly-Pro-Hyp)4 não excede a (Z) 15; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

36.Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Gly-Pro-J)t-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)u- X, sendo que teu são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e, sendo que a combinação de (Gly-Pro-J)t, (Gly-Pro-J)u e (Gly- Pro-Hyp)8 não excede a (Z)15; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

37. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-J-Gly)r-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)s- X, sendo que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, sendo que a combinação de (Pro-J-Gly)r, (Pro-J- Gly)s e (Gly-Pro-Hyp)4 não excede a (Z)15; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

38. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(Pro-J-Gly)t-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)u- X, sendo que t e u são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 e, sendo que a combinação de (Pro-J-Gly)t, (Pro-J-Gly)u e (Gly- Pro-Hyp)8 não excede a (Z)15; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

39. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(J-Gly-Pro)r-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)s- X, sendo que r e s são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e, sendo que a combinação de (J-Gly-Pro)r, (J-Gly- Pro)s e (Gly-Pro-Hyp)4 não excede a (Z)15; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

40. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- dicação 1, em que o peptídeo é B-(J-Gly-Pro)t-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)u- X, sendo que t e u são cada um número inteiro selecionado a partir de 1, 2,3, 4, 5, ou 6 e, sendo que a combinação de (J-Gly-Pro)t, (J-Gly-Pro)u e (Gly- Pro-Hyp)8 não excede a (Z)15; e todas as outras variáveis são conforme anteriormente definido.

41. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- 1, em que o peptídeo é F5Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe.

42. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- 1, em que o peptídeo é Phe-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe.

43. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- 1, em que o peptídeo é Leu-(GIy-Pro-Hyp)IO-Phe.

44. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- 1, em que o peptídeo é F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe.

45. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- 1, em que o peptídeo é Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe.

46. Peptídeo relacionado ao colágeno, de acordo com a reivin- 1, em que o peptídeo é Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe.

47. Método para formação de uma substância fibrilar semelhante ao colágeno, que compreende as etapas de selecionar uma pluralidade de peptídeos relacionados ao colágeno como definido na reivindicação 1, e misturar a pluralidade de peptídeos relacionados ao colágeno sob condições aquosas favoráveis para iniciar e propagar a formação de uma pluralidade de trímeros, compósitos supramoleculares e fibrilas semelhantes ao colágeno.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que a pluralidade de trímeros é selecionada a partir de uma pluralidade de homotrímeros, heterotrímeros ou misturas dos mesmos.

49. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que a substância fibrilar semelhante ao colágeno é selecionada a partir de uma pluralidade de compósitos supramoleculares ou fibrilas semelhantes ao colágeno.

50. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que as condições aquosas favoráveis compreendem a mistura da pluralidade de peptídeos relacionados ao colágeno em água ou em uma solução salina aquosa a uma temperatura menor que cerca de 50 0C.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, em que a solução salina aquosa é selecionada do grupo que consiste em solução salina tamponada, solução tampão de fosfato, solução salina balanceada de Hank, solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com Tris, solução salina tamponada com Hepes e misturas das mesmas.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, em que a solução salina aquosa é uma solução salina tamponada com fosfato.