BRPI0722092B1

BRPI0722092B1 - Construção de dna, método de inibir o crescimento de um fungo patôgenico de planta, e métodos de obter uma planta transgênica que inibe o crescimento de fungo patôgenico de planta e de identificar a referida planta transgênica

Info

Publication number: BRPI0722092B1
Application number: BRPI0722092-8A
Authority: BR
Inventors: Maganlal Shah Dilip; Kay Snyder Anita
Original assignee: Donald Danforth Plant Science Center
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2018-01-09
Also published as: US20110010802A1; BRPI0722092A2; US8558057B2; US7825297B2; WO2008080014A3; US20120180160A1; AR064503A1; US20080201800A1; US20140018520A1; US8163979B2; WO2008080014A2

Description

(54) Título: CONSTRUÇÃO DE DNA, MÉTODO DE INIBIR O CRESCIMENTO DE UM FUNGO PATOGÊNICO DE PLANTA, E MÉTODOS DE OBTER UMA PLANTA TRANSGÊNICA QUE INIBE O CRESCIMENTO DE FUNGO PATOGÊNICO DE PLANTA E DE IDENTIFICAR A REFERIDA PLANTA TRANSGÊNICA (51) lnt.CI.: C12N 15/09; C12N 15/29; C12N 15/82; A01H 1/00; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 22/12/2006 US 60/871,682 (73) Titular(es): DONALD DANFORTH PLANT SCIENCE CENTER (72) Inventor(es): DILIP MAGANLAL SHAH; ANITA KAY SNYDER

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CONSTRUÇÃO DE DNA, MÉTODO DE INIBIR O CRESCIMENTO DE UM FUNGO PATÔGENICO DE PLANTA, E MÉTODOS DE OBTER UMA PLANTA TRANSGÊNICA QUE INIBE O CRESCIMENTO DE FUNGO PATÔGENICO DE PLANTA E DE IDENTIFICAR A REFERIDA PLANTA TRANSGÊNICA.

[001] Este pedido reivindica a prioridade para a data de depósito do Pedido de Patente Provisória U.S. N° 60/871,682 para 22 de dezembro de 2006, que é aqui incorporado para referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se a polipeptídeos antifúngicos derivados de plantas, e métodos para controlar fungos patogênicos empregando os polipeptídeos antifúngicos.

ANTECEDENTES [003] A proteção de culturas agriculturalmente importantes a partir de fungos patogênicos é crucial na melhora de fornecimentos de fungo. Infecções fúngicas são um problema particular em climas úmidos e podem ser tornar um problema maior durante armazenamento de cultura, onde tais infecções podem resultar em deterioração e contaminação de produtos alimentícios e comida com toxinas fúngicas. Infelizmente, métodos de crescimento modernos, sistemas de armazenamento e colheita podem promover infecções patogênicas de plantas.

[004] O controle de patógenos de plantas é adicionalmente complicado pela necessidade de simultaneamente controlar múltiplos fungos de gêneros distintos. Por exemplo, fungos tais como espécies Alternaria; Ascochyta; Botrytis; Cercospora; Colletotrichum; Diplodia; Erysiphe; Fusarium; Gaeumanomyces; Helminthosporium; Macrophomina; Nectria; Peronospora; Phakopsora; Phoma; Phymatotrichum;

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Phytophthora; Plasmopara; Podosphaera; Puccinia; Pythium; Pyrenophora; Pyricularia; Rhizoctonia; Scerotium; Sclerotinia; Septoria; Thielaviopsis; Uncinula; Venturia; e Verticillium são todos patógenos de plantas reconhecidos. Consequentemente, variedades de planta de cultura resistentes ou fungicidas que controlam apenas um subconjunto de patógenos fúngicos limitado pode falhar para liberar proteção adequada sob condições ode mutliplos patógenos estão presentes. É adicionalmente antecipado que fungos patogênicos de planta podem tornar-se resistentes a fungicidas existentes e variedades de cultura, necessitando da introdução de agentes de controle fúngicos com modos distintos de ação para combater os fungos resistentes.

[005] Uma abordagem para inibir atividade patogênica de planta é identificar e isolar polipeptídeos e proteínas que exibem atividade antifúngica contra fungos patogênicos de planta (Bowles, 1990; Brears e outros, 1994). Acredita-se que os polipeptídeos antifúngicos e proteínas que incluem chitinases, ricos em cisteína, proteínas de ligação de chitin, β-1,3-glucanases, permatins (incluindo zeamatins), thionins, proteínas de inativação de ribossoma, e proteínas de transferência de lipídio não-específicas têm um importante papel na defesa de planta contra infecção fúngica. O uso desses produtos de proteína para controlar patógenos de planta em plantas transgênicas tem sido reportado, por exemplo, no Pedido de Patente Européia 0 392 225.

[006] Outro grupo de proteínas conhecido como defensinas tem sido mostrado para inibir patógenos de planta. Defensinas são pequenos peptídeos ricos em cisteína de 45 - 54 aminoácidos que constituem um importante componente da imunidade inata de plantas (Thomma e outros, 2002; Lay and Anderson, 2005). Amplamente distribuídas em plantas, defensinas variam grandemente em sua composição de aminoácido. Entretanto, elas todas têm um formato compacto que é estabilizado pelas ou quatro ou cinco ligações intramoleculares. DePetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 10/229

3/117 fensinas de plantas têm sido extensivamente estudadas pelo seu papel em defesa de plantas. Algumas defensinas de plantas inibem o crescimento de uma ampla faixa de fungos em concentrações micromolares (Broekaert e outros, 1995; Broekaert e outros, 1997; da Silva Conceicao and Broekaert, 1999) e, quando expressas em plantas transgênicas, conferem forte resistência a patógenos fúngicos (da Silva Conceicao and Broekaert, 1999; Thomma e outros, 2002; Lay and Anderson, 2005). Duas pequenas proteínas ricas em cisteína isoladas de semente de rabanete, Rs-AFP1 e Rs-AFP2, inibidas pelo crescimento de muitos fungos patogênicos quando a proteína pura foi adicionada a um meio de ensaio antifúngico in vitro (U.S. 5,538,525). Plantas de tabaco transgênicas contendo o gene que codifica a proteína Rs-AFP2 foram encontradas como sendo mais resistentes ao ataque por fungos do que plantas não-transformadas.

[007] Proteínas defensina antifúngicas têm sido identificadas em Alfafa (Medicago sativa) e mostraram inibir patógenos de planta tais como Fusarium e Verticillium em ambos os testes in vitro e em plantas transgênicas (Patente norte-americana 6,916,970). Sob baixo sal em condições de ensaio in vitro, a defensina de alfafa AlfAFPI inibiu crescimento de Fusarium culmorum por 50% a 1 ug/ml e crescimento de Verticillium dahliae por 50% a 4 ug/ml (isto é, valores IC₅₀ de 1 ug/ml e 4 ug/ml, respectivamente). A expressão da proteína AlfAFPI em plantas de batata transgênicas foi também mostrada como conferindo resistência a Verticillium dahliae em ambos os testes de campo e de estufa(Gao et al, 2000). Análise de modo de ação tem sido mostrada que AlfAFPI (que é alternativamente referido como MsDefl, para Medicaqo sativa Defensin 1) induz hiper-ramificação de F. graminearum e pode bloquear canais de cálcio de tipo L (Spelbrink et al, 2004).

[008] Outros genes de defensina têm sido identificados no legume Medicago truncatula (Hanks et al, 2005). A proteína MtDef2 clonaPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 11/229

4/117 da tem sido demonstrada através de experimentos in vitro como tendo pouca ou nenhuma atividade antifúngica (Spelbrink et al, 2004). Análise da pesquisa de banco de dados de sequência identificou 10 tentativas de sequência de consenso (10 genes que codificam defensina exclusivos representados por múltiplos ESTs) e seis singletos (isto é, seis genes de defensina exclusivos representados por um único EST) com homologia para genes de defensina Medicago. Uma das sequência de consenso de tentativa foi identificada como TC85327 e mostrada como sendo expressa em ambas as raízes Medicago truncatula infectadas por fungo micorrhizal e tratado falso. Não existe nenhuma demonstração que proteínas codificadas por qualquer uma das sequências TC85327 Medicago truncatula possuíam atividade antifúngica neste estudo (Hanks et al, 2005).

[009] Embora proteínas de defensina tais como AlfAFPI (MsDefl) e Rs-AFP2 tenham sido usadas para obter plantas transgênicas que são resistentes a infecções antifúngicas, outras proteínas que proveem níveis aumentados de resistência são necessárias. Em particular, proteínas com atividades específicas aumentadas contra patógenos fúngicos seriam particularmente úteis na melhora de níveis de resistência fúngica obtidos em plantas transgênicas. Além do mais, proteínas que inibem patógenos antifúngicos via modos distintos de ação seriam também úteis no combate a patógenos fúngicos que se tornaram resistentes a proteínas de defensina tais como AlfAFPI (MsDefl) e RS-AFP2.

SUMÁRIO [0010] A presente invenção primeiramente provê construções de DNA isoladas úteis para expressar proteínas antifúngicas MtDef4. As construções de DNA isoladas compreendem um promotor heterólogo, uma sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 com pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 112, e uma sePetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 12/229

5/117 quência de poliadenilação, em que o promotor, a sequência codificando um peptídeo de sinal, a sequência codificando um polipeptídeo MtDef4 maduro e a sequência de poliadenilação são operativamente ligadas.

[0011] As construções de DNA isoladas da invenção podem adicionalmente compreender uma sequência que codifica um peptídeo de sinal que é operativamente ligado à sequência que codifica o polipeptídeo MtDef4. Os peptídeos de sinal usados nas construções de DNA da invenção são selecionados a partir do grupo consistindo em peptídeos de sinal de levedura, peptídeos de sinal de plantas monocotiledôneas, peptídeos de sinal de plantas dicotiledôneas, e peptídeos de sinal sintéticos. Peptídeos de sinal de levedura podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em um peptídeo de sinal de fator a, um peptídeo de sinal invertase, e um peptídeo de sinal PHO1. Peptídeos de sinal de planta dicotiledônea podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em um peptídeo de sinal MtDef1,1, um MtDef1,6, um MtDef2,1 , um MtDef4 e um PRIb de tabaco. Peptídeos de sinal de planta monocotiledônea podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em um peptídeo de sinal de endoproteinase de cisteína e um peptídeo de sinal de α-amilase. Os peptídeos de sinal MtDef4 podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em sequências de peptídeo de sinal SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO: 121. SEQ ID NO: 122, e SEQ ID NO: 123.

[0012] Uma variedade de sequência de DNA codificando polipeptídeos MtDef4 distintos pode ser usada nas construções de DNA da presente invenção. Em geral, uma sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 com pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 112 é usada. As sequências de polipeptídeo MtDef4 codificado da construção de DNA incluem, mas não são limitadas a, sePetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 13/229

6/117 quências que codificam proteínas MtDef4 maduras. Proteínas MtDef4 maduras codificadas por essas sequências podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em sequências de polipeptídeo consistindo em uma sequência de consenso MtDef4 (SEQ ID NO: 71), 30-76 aminoácido de AL386553 (SEQ ID NO:105), MtDef4.1 (SEQ ID NO:112), MtDef4.2 (SEQ ID NO:114), MtDef4.3 (SEQ ID NO:116), MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 125), MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO:135), MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) (SEQ ID NO:136), MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO:137), e MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138). As sequências de polipeptídeo MtDef4 codificadas da construção de DNA também incluem sequências que codificam proteínas MtDef4 compreendendo um peptídeo de sinal MtDef4 e uma pró-proteína MtDef4 madura. As sequências de polipeptídeo de pró-proteína MtDef4 maduras incluem, mas não são limitadas a, uma sequência de consenso de pró-proteínas MtDef4 (SEQ ID NO: 99), pró-proteínas MtDef4 exclisivas tais como AL385796 (SEQ ID NO:77), AW573770 (SEQ ID NO:78), AL386553 (SEQ ID NO:80), AL386552 (SEQ ID NO:81), BE999096 (SEQ ID NO:87), sequências de próproteínas MtDef4.1 (SEQ ID NO:111), sequências de pró-proteína MtDef4.2 (SEQ ID NO:113), sequências de pró-proteína MtDef4.3 (SEQ ID NO:115), uma sequência de pró-proteína MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 151), polipeptídeos que têm pelo menos 70% de identidade de sequência para essas sequências, e os equivalentes funcionais biológicos dessas sequências. O polipeptídeo MtDef4 codificado pela construção de DNA pode assim compreender uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em uma sequência de consenso MtDef4 (SEQ ID NO: 71), 30-76 aminoácidos de AL386553 (SEQ ID NO: 105), uma sequência MtDef4.1 madura (SEQ ID NO: 112), uma sequência MtDef4.2 (SEQ ID NO:114) madura, uma sequência MtDef4.3 (SEQ ID NO:116) madura, uma sequência

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MtDef4.1 (H33R) madura (SEQ ID NO: 125), uma sequência MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) madura ( SEQ ID NO:135), uma sequência MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) madura (SEQ ID NO:136), uma sequência MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) madura (SEQ ID NO:137), uma sequência MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) madura (SEQ ID NO: 138), uma sequência de consenso de pró-proteína MtDef4 (SEQ ID NO: 99), uma sequência de pró-proteína MtDef4 AL385796 (SEQ ID NO:77), AW573770 (SEQ ID NO:78), BI310743 (SEQ ID NO:79), AL386553 (SEQ ID NO:80), AL386552 (SEQ ID NO:81), BE999096 (SEQ ID NO:87), uma sequência de pró-proteína MtDef4.1 (SEQ ID NO:111), uma sequência de pró-proteína MtDef4.2 (SEQ ID NO:113), sequência de pró-proteína MtDef4.3 (SEQ ID NO:115), e uma sequência de próproteína MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:151).

[0013] Uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo MtDef4 é contida dentro de uma sequência que pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 144), um gene MtDef4.1 (H33R) sintético (SEQ ID NO:72), AL386552 (SEQ ID NO: 100), AL385796 (SEQ ID NO: 101), AL386553 (SEQ ID NO: 102), AW573770 (SEQ ID NO: 103), BE999096 (SEQ ID NO: 104), um clone genômico MtDef4.1 (SEQ ID NO: 108), um clone genômico MtDef4.2 (SEQ ID NO: 109), um clone genômico MtDef4.3 (SEQ ID NO:110), uma sequência de codificação deduzida MtDef4.2 (SEQ ID NO: 124), uma sequência de codificação deduzida MtDef4.1 (SEQ ID NO:126), uma sequência de consenso MtDef4 TC94214 (SEQ ID NO: 141) uma sequência de cDNA MsDef4,1 (SEQ ID NO: 142), uma sequência de codificação deduzida MtDef4.3 (SEQ ID NO:143), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) madura (SEQ ID NO: 146), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) madura (SEQ ID NO: 147), uma sequência de codificação mature MtDef4.1 (H33R,

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C20S, C41S) madura (SEQ ID NO: 148) e uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) madura (SEQ ID NO: 149).

[0014] Em certas modalidades da invenção, a construção de DNA isolada usa sequências de promotor e poliadenilação que proveem expressão de sequências operativamente ligadas quando introduzidas em uma planta transgênica. Sequência que codificam polipeptídeos MtDef4 que são pelo menos 85% idênticas a SEQ ID NO:112 são operativamente ligadas a sequências de promotor e poliadenilação que proveem expressão em plantas transgênicas. O promotor que provê expressão em plantas pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido, um promotor induzido por estresse, e um promotor induzido por infecção fúngica. Promotores constitutivos são selecionados a partir do grupo consistindo em um promotor CaMV35S, promotor FMV35S, um promotor de ubiquitina de milho, e um promotor de actina de arroz. Sequências de poliadenilação podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em um CaMV35S, um NOS, uma desidrogenase de lactato de arroz, e uma sequência de poliadenilação Hsp17 de trigo.

[0015] Em outras modalidades da invenção, a construção de DNA isolada pode adicionalmente compreender uma sequência de íntron que provê expressão de sequências operativamente ligadas quando introduzido em um genoma nuclear de uma planta e quando a sequência de íntron é operativamente ligada ao promotor, a sequência que codifica um peptídeo de sinal, a sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 maduro, e a sequência de poliadenilação. Esta sequência de íntron pode ser selecionada a partir do grupo compreendendo um íntron de actina de arroz, um íntron hsp70 de milho, um íntron RUBISCO de pequena subunidade de milho, um íntron de ubiquitina de milho, um íntron Adh1 de milho, um íntron de liase de amônia de fenilalanina de arroz, um íntron de sintase de sacarose, um introm

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CAT-1, um íntron pKANNIBAL, o íntron PIV2 e um íntron de Super Ubiquitina.

[0016] A construção de DNA que provê expressão de um proteína MtDef4 madura em plantas pode compreender um polinucleotídeo contendo um promotor de ubiquitina de milho e íntron, um gene MtDef4.1 (H33R) que codifica ambos um peptídeo de sinal MtDef4 e proteína MtDef4 madura e sinal de poliadenilação. Outra construção de DNA qu provê expressão de uma proteína MtDef4 madura em plantas pode compreender um promotor FMV, um íntron de super ubiquitina, uma sequência MtDef4 genômica que codifica um peptídeo de sinal, um íntron e uma proteína MtDef4 madura, e um terminador tNOS. Construções de DNA que proveem expressão de proteína MtDef4 em plantas podem adicionalmente compreender sequências que codificam peptídeos endereçadores a vacúolo ou peptídeos de retenção em retículo endoplásmico que são operativamente ligados ao polipeptídeo MtDef4 são também contemplados por esta invenção. Um contruto de DNA que provê expressão de uma proteína MtDef4.1 madura em plantas pode compreender um promotor FMV, um íntron de super ubiquitina, uma sequência MtDef4.1 genômica que codifica um peptídeo de sinal, um íntron e uma proteína MtDef4 madura que é operativamente ligada a um peptídeo endereçador de retículo endoplásmico ou vacúolo, e um terminador tNOS. Exemplos de construções de DNA para expressão de proteínas MtDef4s em plantas incluem SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, e SEQ ID NO: 150.

[0017] As construções de DNA da invenção podem adicionalmente compreender uma sequência que codifica um marcador selecionável. Este marcador selecionável é tipicamente usado para selecionar plantas contendo a construção de DNA. O marcador selecionável pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em uma proteína fosfotransferase de neomicina, uma proteína acetiltrasnferase de fosfinotricina,

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10/117 uma proteína sinase de 5-enol-piruvilshikimate-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato, uma proteína fosfotransferase de higromicina, uma proteína sintase de di-hidropteroato, uma proteína sintase de acetolactato insensível a sulfonilureia, uma proteína Q insensível a atrazina, uma proteína de nitrilase capaz de degradar bromoxinil, uma proteína de desalogenase capaz de degradar dalapon, uma proteína monooxigenase de 2,4-diclorofenoxiacetato, uma proteína reductase de dihidrofolato insensível a metotrexato, e uma proteína sintase de octopina insensível a aminoetilcisteína.

[0018] As construções de DNA da invenção podem adicionalmente compreender uma sequência que codifica um marcador pontuável. Este marcador pontuável é tipicamente usado para identificar plantas transgênicas contendo a construção de DNA. O marcador pontuável pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em proteína betaglucuronidase, uma proteína verde-fluorescente, uma proteína amarelo-fluorescente, uma proteína beta-galactosidase, uma proteína luciferase derivada de um gene luc, uma proteína luciferase derivada de um gene lux, uma proteína sialidase, uma proteína fosfotransferase de estreptomicina, uma proteína sintase de nopalina, uma proteína sintase de octopina e uma proteína cloranfenicol acetil transferase.

[0019] Plantas transgênicas compreendendo as construções de DNA acima mencionadas que expressam polipeptídeos MtDef4 em tais plantas são também providas por esta invenção. A planta transgênica pode ser uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea. Plantas monocotiledôneas transgênicas da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em cevada, milho, linho, aveia, arroz, centeio, sorgo, gramado, cana-de-açúcar, e trigo. Plantas dicotiledôneas transgênicas da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo alfafa, arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couve-flor, aipo, ciPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 18/229

11/117 trus, algodão, uma abóbora cucurbita, eucalipto, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e tomate.

[0020] Em outras modalidades da invenção, a construção de DNA usa um promotor e uma sequência de poliadenilação que provê expressão de sequências operativamente ligadas quando induzido em uma célula de levedura. Este promotor pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em um promotor AOX1, um promotor AOX2, um promotor PHO, um promotor MOX, um promotor DAS, um promotor ADH, um promotor GAPDH, e um promotor LAC4. Esta sequência de poliadenilação pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em um AOX1, um AOX2, um CYC1, um p40, um p76, um MOX, um LAC4, e uma sequência de poliadenilação de actina. A construção de DNA pode compreender um polinucleotídeo codificando um Promotor AOX1 operativamente ligado, sequência de sinal de fator yeast α de levedura, sequência de defensina MtDef4.1 (H33R) madura, e uma sequência de poliadenilação AOX1. Alternativamente, a construção de DNA pode compreender um polinucleotídeo codificando um promotor AOX1 operativamente ligado, sequência de sinal de fator-α de levedura, sequência de defensina MtDef4.1 madura, e uma sequência de poliadenilação AOX1. Exemplos de construções de DNA para expressão de Proteínas MtDef4 maduras em leveduras incluem SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 157.

[0021] Construções de DNA para expressão de proteínas MtDef4 maduras em leveduras podem adicionalmente compreender um gene de marcador selecionável ou pontuável. O gene de marcador selecionável pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em genes que codificam uma proteína ADE, uma proteína HIS5, uma proteína HIS4, uma proteína LEU2, uma proteína URA3, Proteína ARG4, uma

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12/117 proteína TRP1, uma proteína LYS2, uma proteína conferindo resistência a antibiótico de bleomicina ou fleomicina, uma proteína conferindo resistência a cloranfenicol, uma proteína conferindo resistência a G418 ou geneticina, uma proteína conferindo resistência à higromicina, uma proteína conferindo resistência a metotrexato, uma proteína AR04OFP, e uma proteína FZV 1-4.

[0022] O gene de marcador pontuável pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em uma proteína beta-glucuronidase, uma proteína verde-fluorescente, uma proteína amarelo-fluorescente, uma proteína beta-galactosidase, uma proteína luciferase derivada de um gene luc, uma proteína luciferase derivada de um gene lux, uma proteína sialidase, uma proteína fosfotransferase de estreptomicina, uma proteína sintase de nopalina, uma proteína sintase de octopina e uma proteína cloranfenicol acetil transferase.

[0023] Células de levedura compreendendo as construções de DNA acima mencionadas que compreendem um promotor e uma sequência de poliadenilação que proveem expressão de sequências operativamente ligadas que codificam proteínas MtDef4 em leveduras são também providas nesta invenção. As células de levedura podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em Candida, Kluveromyces, Hansuela, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, e Yarrowia. [0024] A presente invenção adicionalmente provê métodos para obter plantas transgênicas capazes de inibir crescimento de um fungo patogênico de planta. Esses métodos compreendem as etapas de: introduzir a construção de DNA que provê expressão de um Polipeptídeo MtDef4 em uma planta, uma célula de planta, ou um tecido de planta, e obter uma planta transgênica compreendendo esta construção de DNA que expressa uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de um polipeptídeo MtDef4. A planta transgênica obtida por este método pode ser uma planta dicotiledônea ou monocotiledôPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 20/229

13/117 neas. As plantas monocotiledôneas transgênicas da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em cevada, milho, linho, aveia, arroz, centeio, sorgo, gramado, cana-de-açúcar, e trigo. As plantas dicotiledôneas transgênicas da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em alfafa, arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couve-flor, aipo, citrus, algodão, uma abóbora cucurbita, eucalipto, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e tomate. Para praticar este método, a construção de DNA pode ser introduzida na planta na etapa (a) por um método selecionado a partir do grupo consistindo em bombardeio de partícula, Transfecção de DNA, Eletroporação de DNA e transformação mediada por T-DNA. [0025] A construção de DNA usada em certas modalidades deste método pode adicionalmente compreender um gene de marcador selecionável. Quando a construção de DNA adicionalmente compreender um gene de marcador selecionável, uma planta transgênica da invenção é obtida pelo crescimento da planta, célula de planta, ou tecido de planta sob condições que requerem expressão do gene de marcador selecionável para crescimento da planta. Este gene de marcador selecionável pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em genes que codificam uma proteína fosfotransferase de neomicina, uma proteína acetiltrasnferase de fosfinotricina, uma proteína sinase de 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato, uma proteína fosfotransferase de higromicina, uma proteína sintase de dihidropteroato, uma proteína sintase de acetolactato insensível a sulfonilureia, uma proteína Q insensível a atrazina, uma proteína de nitrilase capaz de degradar bromoxinil, uma proteína de desalogenase capaz de degradar dalapon, uma proteína mono-oxigenase de 2,4diclorofenoxiacetato, uma proteína reductase de di-hidrofolato insensíPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 21/229

14/117 vel a metotrexato, e uma proteína sintase de octopina insensível a aminoetilcisteína.

[0026] Esses métodos de obter plantas transgênicas podem também empregar construções de DNA que adicionalmente compreendem um gene de marcador pontuável que funciona em plantas. Neste caso, a expressão do gene de marcador pontuável é ensaiada para obter uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênica regenerada. Genes de marcador pontuável podem ser selecionados a partir do grupo consistindo em uma proteína beta-glucuronidase, uma proteína verde-fluorescente, uma proteína amarelo-fluorescente, uma proteína beta-galactosidase, uma proteína luciferase derivada de um gene luc, uma proteína luciferase derivada de um gene lux, uma proteína sialidase, uma proteína fosfotransferase de estreptomicina, uma proteína sintase de nopalina, uma proteína sintase de octopina e uma proteína cloranfenicol acetil transferase.

[0027] Neste método, um planta transgênica que expressa uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta do polipeptídeo MtDef4 maduro pode ser obtenível por ensaio de expressão de um transgene de codificação MtDef4 na planta transgênica. Expressão do transgene de codificação MtDef4 pode ser ensaiada por um método selecionado a partir do grupo consistindo em um imunoensaio, um imunoensaio ligado à enzima, um ensaio com base na detecção por hibridização de RNA, e um ensaio com base na detecção por uma reação de cadeia de polimerase de transcriptase reversa. Alternativamente, a expressão do transgene de codificação MtDef4 é ensaiada expondo a planta transgênica a um fungo de planta patogênico e determinando se o crescimento do fungo patogênico de planta é inibido. Uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de polipeptídeo MtDef4 maduro é de pelo menos 0,05 PPM, 0,5 PPM, 1,0 PPM, ou 2,0 PPM, onde PPM são partes por milhão de proteína MtDef4

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15/117 presente em tecido de planta recém-pesado. Tipicamente, quantidades em microgramas de proteína MtDef4 estão presentes por grama recém pesado. Em modalidades preferidas, a quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de proteína MtDef4 é de pelo menos 0,5 PPM. Em modalidades mais preferidas, a quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de MtDef4 é pelo menos 1,0 PPM. Em modalidades mais preferidas, a quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de MtDef4 é pelo menos 2,0 PPM.

[0028] Este método provê inibição do crescmento de uma variedade de fungos patogênicos de panta. O fungo patogênico de planta inibido pelo método pode ser do grupo consistindo em um Alternaria sp., um Ascochyta sp., um Botrytis sp.; um Cercospora sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Erysiphe sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Helminthosporium sp., Macrophomina sp., um Nectria sp., um Peronospora sp., um Phakopsora sp., um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Plasmopara sp., um Puccinia sp., um Podosphaera sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Scerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., um Thielaviopsis sp., um Uncinula sp, um Venturia sp., e um Verticillium sp.

[0029] Esta invenção também provê plantas transgênicas capazes de inibir o crescimento de um fungo patogênicos de planta que é produzido pelos métodos descritos aqui. Plantas transgênicas produzidas por um processo compreendendo as etapas de introduzir uma construção de DNA da invenção em uma planta, uma célula de planta ou um tecido de planta e obter uma planta transgênica compreendendo a construção de DNA que expressa uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de um polipeptídeo MtDef4 são também assim contemplados por esta invenção. A planta transgênica obtida por este métoso pode ser uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotilePetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 23/229

16/117 dônea. As plantas monocotiledôneas transgênicas da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em cevada, milho, linho, aveia, arroz, centeio, sorgo, gramado, cana-de-açúcar, e trigo. As plantas dicotiledôneas transgênicas da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em alfafa, arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couve-flor, aipo, citrus, algodão, uma abóbora cucurbita, eucalipto, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e tomate. Uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de polipeptídeo MtDef4 maduro é pelo menos 0,05 PPM, 0,5 PPM, 1,0 PPM, ou 2,0 PPM, onde PPM são partes por milhão de proteína MtDef4 presente em tecido de planta recém-pesado.

[0030] A presente invenção adicionalmente provê métodos para produzir um polipeptídeo MtDef4 que tem pelo menos 85% identidade de sequência para a sequência de aminoácido como apresentado na SEQ ID NO: 112. Os métodos ara produzir o polipeptídeo MtDef4 maduro compreendem as etapas de: cultivar uma célula de levedura compreendendo uma construção de DNA que provê expressão de um Polipeptídeo MtDef4 em levedura sob condições em que a célula de levedura expressa um polipeptídeo MtDef4 e isola o polipeptídeo MtDef4 da cultura da etapa precedente. O polipeptídeo MtDef4 pode ser isolado na segunda etapa a partir do meio de cultura de célula. Alternativamente, o polipeptídeo MtDef4 pode ser isolado de células de levedura. Em certas modalidades deste método o polipeptídeo MtDef4 é uma proteína MtDef4 madura. A célula de levedurausada neste método pode ser uma célula Pichia que compreende uma construção de DNA contendo um promotor AOX1 que é operativamente ligado a uma sequência que codifica um peptídeo de sinal e uma sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 maduro e as condições que proveem a

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17/117 expressão da proteína MtDef4 madura compreendería cultivar a Célula Pichia na presença de metanol.

[0031] A invenção também provê um anticorpo que reconhece um polipeptídeo MtDef4 com pelo menos 85% de sequência de identidade para SEQ ID NO: 112. Kits para detectar especificamente um polipeptídeo MtDef4 com pelo menos 85% de sequência de identidade para SEQ ID NO: 112, compreendendo um anticorpo que reconhece um polipeptídeo MtDef4 maduro com pelo menos 85% de sequência de identidade para SEQ ID NO: 112 e um reagente para detectar o anticorpo, são também providos por esta invenção.

[0032] Certas sequêncis de nucleotídeo isoladas são também providas por esta invenção. As sequências de nucleotídeo isoladas da invenção compreendem uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R) sintética (SEQ ID NO:72), sequência de clone genômico MtDef4.2 (SEQ ID NO: 109), uma sequência de codificação deduzida MtDef4.2 (SEQ ID NO: 124), uma sequência de clone genômico MtDef4.3 (SEQ ID NO: 110), uma sequência de codificação deduzida MtDef4.3 (SEQ ID NO: 143 ), uma sequência de codificação MtDef4 (H33R, C3S, C47S) madura (SEQ ID NO: 146), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) madura (SEQ ID NO: 147), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) madura (SEQ ID NO: 148) e uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) madura (SEQ ID NO: 149). Oligonucleotídeos derivados das sequências acima mencionadas são adicionalmente contemplados. Tais nucleotídeos podem ser usados para identificar plantas transgênicas contendo essas sequências de nucleotídeo ou para identificar material obtido dessas plantas transgênicas. Métodos parausar esses oligonucleotídeos para identificar os materiais de planta transgênica e kits para realizar esses métodos são também contemplados. [0033] Certas sequências de peptídeo isoladas são também proviPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 25/229

18/117 das por esta invenção. As sequências de peptídeo isoladas da invenção compreendem uma sequência de peptídeo madura MtDef4.2 (SEQ ID NO:114), uma sequência de peptídeo madura MtDef4. (SEQ ID NO:116), uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO:135), uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) (SEQ ID NO:136), uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO: 137), ou uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO:138).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0034] A descrição refere-se aos desenhos em anexo em que referências similares referem-se a partes similares por todas as muitas vistas em que:

[0035] A figura 1 mostra um alinhamento das sequências de aminoácido deduzidas MtDef4 EST e a sequência de peptídeo de consenso MtDef4 derivada em TC94214. Na sequência de peptídeo de consenso MtDef4 deduzida (SEQ ID NO: 70), aminoácidos compreendendo a sequência de peptídeo de sinal deduzida são em menor caso e esboçadas, enquanto os aminoácidos que codificam a proteína MtDef4 de consenso madura são em casos maiores. A fita de sentido da sequência de nucleotídeo da sequência expressa tag correspondente a SEQ ID NO:37 é provida na listagem de sequência. The sequência de consenso MtDef4 madura é também mostrada (SEQ ID NO:71).

[0036] A figura 2 mostra a representação linear do vetor pPIC9 usado para expressar várias proteínas MtDef4. a sequência do cassete de expressão MtDef4 compreendendo o Promotor AOX1, as sequências de fato de combinação α de levedura que codificam o peptídeo de sinal, pró-peptídeo e sítio de divagem KEX2, o gene MtDef4.1 (E.33R), e o sinal de poliadenilação AOX1 em que todos os elementos de expressão são operativamente ligados é provido na SEQ ID NO:

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73.

[0037] A figura 3 mostra a atividade antifúngica potente de proteínas MsDefl (AlfAFP) e MtDef4.1 (H33R) contra F. graminearum PH1. A proteína MtDef4.1 (H33R) madura (SEQ ID NO:125) é simplesmente referida como MtDef4 nesta figura. Na figura 3A., conídia PH-I tipo selvagem suspensa em meio SFM foi incubada com MsDefl ou MtDef4 serialmente diluídos de dois desdobramentos no escuro e imagens foram tomadas após 18 de incubação. Mudanças morfológicas e crescimento foram observados nas concentrações indicadas. A barra de escala branca no painel MsDefl direito inferior é igual a 50 pm. Na figura 3B, resultados gráficos de um ensaio quantitativo autocombinado onde esporos foram incubados com defensinas serialmente diluídas de dois desdobramentos, incubados por 36 h e o crescimento foi monitorado medido a absorbância a 595 nm são mostrados. Inibição de crescimento foi medida usando a seguinte fórmula: Porcento de inibição de crescimento = (OD595 a 36 h de incubação - OD595 a tempo 0 de incubação) / OD595 a 36 h de incubação) x 100. Os valores são médias das três replicações. Barras de erro indicam desvios padrão. [0038] A figura 4 mostra um gráfico da porcentagem de inibição de crescimento do fungo patogênico de planta Fusarium graminearum na presença de proteínas Pichia-expressas MtDef4.1 e MtDef4.1 (H33R). [0039] A figura 5 mostra a hipersensibilidade de mutantes de sensibilidade melhorada para defensina (esd) para MsDefl, mas não para MtDef4.1 (H33R). A proteína MtDef4.1 (H33R) madura (SEQ ID NO: 125) é simplesmente referida como MtDef4 esta figura. Na figura 5, conídia de controle de tipo selvagem e mutantes esd de F. graminearum foram incubados com as concentrações indicadas das defensinas MsDefl e MtDef4.1 (H33R) no escuro e imagens foram tomadas após 18 h de incubação. A barra de escala branca no painel direito inferior é igual a 50 pm.

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20/117 [0040] A figura 6 mostra a sequência do gene MtDef4.1 (H33R) sintético (SEQ ID NO: 72) e peptídeo MtDef4 (H33R) codificado (SEQ ID NO: 151) para expressão de planta monocotiledônea.

[0041] A figura 7 mostra uma representação linear de uma porção de um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium contendo o cassete de expressão MtDef4.1 (H33R) para expressão de MtDef4.1 (H33R) em plantas monocotiledôneas. A sequência do Cassete de expressão MtDef4.1 (H33R) compreendendo o promotor de ubiquitina, íntron de ubiquitina, gene MtDef4.1 (H33R) sintético (referido como Def4 na figura), e sinal de poliadenilação em que todos os elementos de expressão são operativamente ligados é provida na SEQ ID NO: 74.

[0042] A figura 8 mostra uma representação linear de uma porção de um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium contendo o cassete de expressão MtDef4 para expressão de MtDef4.1 (SEQ ID NO: 112) em plantas dicotiledôneas. A sequência do Cassete de expressão MtDef4 (SEQ ID NO. 75) compreende um promotor FMV, um íntron de super ubiquitina, sequências MtDef4 genômicas contendo éxon 1 (MtDef4), um íntron (MtDef4), e éxon 2 (MtDef4), e um terminador tNOS em que todas as sequências são operativamente ligadas.

[0043] A figura 9 mostra uma representação linear de uma porção de um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium contendo o cassete de expressão de MtDef4 endereçado ao vacúolo para expressão de MtDef4.1 (SEQ ID NO:112) em plantas dicotiledôneas. A sequência do Cassete de expressão de MtDef4 endereçado ao vacúolo (SEQ ID NO. 76) compreende um Promotor FMV, um íntron de super ubiquitina, sequências MtDef4 genômicas contendo éxon 1, um íntron, e éxon 2, um sinal endereçador vacuolar CTPP terminal C em quadro a partir do gene de lectina de cevada e um terminador

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21/117 tNOS em que todas as sequências são operativamente ligadas .

[0044] A figura 10 mostra uma representação linear de uma porção de um vetor de transformação de planta mediada por Agrobacterium contendo o cassete de expressão de sinal de retenção de retículo endoplasmático (ER) MtDef4 para expressão de MtDef4.1 (SEQ ID NO: 112) em plantas dicotiledôneas. A sequência do cassete de expressão de MtDef4 endereçada a ER (SEQ ID NO. 76) compreende um Promotor FMV, um íntron de super ubiquitina, sequências MtDef4 genômicas contendo éxon 1, um íntron, e éxon 2, um sinal de retenção em ER em quadro (KDEL) e um terminador tNOS em que todas as sequências são operativamente ligadas.

[0045] A figura 11 mostra as construções de gene quimérico para endereçamento extra e intracelular (vacúolo ou ER) de MsDefl e MtDef4 em A. thaliana. EC é extracelular, VC é vacuolar, VTS é um sinal endereçador vacuolar, ER é um retículo endolásmico e KDEL é o sinal endereçador de retículo endoplasmático.

[0046] A figura 12 mostra o índice de severidade de doença das plantas tipo selvagem e transgênica A. thaliana 7 dias após inoculação. Os resultados dos dois eventos transgênicos correspondentes são mostrados para cada construção. (Defl é o gene de codificação de polipeptídeo MtDefl, Def4 é um gene de codificação de Polipeptídeo MtDef4, EC é extracelular, VC é vacuolar, e ER é retículo endoplasmático).

[0047] A figura 13 mostra os fenótipos das plantas MsDefl-EC e MsDefl-VC tipo selvagem 4 semanas após desafio F. graminearum. Plantas inocluadas modelo tipo selvagem são mostradas para uma comparação.

[0048] A figura 14 mostra a porcentagem de severidade FHB (Fusarium Giberela) de linhagens de trigo de controle e transgênicasa 4,

9, 11 e 14 DAI (Dias após Infeção).

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22/117 [0049] A figura 15 mostra aranhas inoculadas representativas de colino de mascarilha da Virgínia (BW) não-inoculadas, MtDef4 transgenic BW. A N° 11, Alsen and Norm a 14 DAI com esporos de cepas F. graminearum PH-I. Regiões doentesapareceram com brilho branco no preto e imagem branca.

[0050] A figura 16 mostra uma comparação deparâmetros de rendimento entre trigo de colini de mascarilha da Virgínia transgênicos e não-transgênicos (BW) juntamente com verificações FHB (Fusarium Giberela). O painel esquerdo mostra número de espigueta/aranha para BW não-transgênico e BW.A N° 11 transgênico. O painel direito mostra rendimento de semente de uninoculada (UN) e inoculada (IN) em Alsen, Norm, BW não-transgênico e BW.A N° 11 transgênico. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições [0051] Sequência de consenso refere-se a um aminoácido, sequência de DNA ou RNA criada alinhando duas ou mais sequências homólogas e derivando uma nova sequência que representa o aminoácido comum, sequência de DNA ou RNA.

[0052] As frases polipeptídeo antifúngico ou proteína antifúngica como usadas aqui referem-se a polipeptídeos ou proteínas que exibem uma ou mais das seguintes características de inibir o crescimento de células fúngicas, células fúngicas matadoras, interromper ou retardar estágios do ciclo de vida fúngico tais como germinação de esporo, esporulação ou combinação, e/ou interrupção de infecção de célula fúngiva, penetração ou espelhamento dentro da planta.

[0053] A frase equivalentes funcionais biológicos como usada aqui refere-se a peptídeos, polipeptídeos e proteínas que contêm uma sequência ou característica estrutural similar a uma proteína MtDef4 da presente invenção, e que exibe a mesma ou atividade antifúngica similar de uma proteína MtDef4 da presente invenção. Equivalentes

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23/117 funcionais biológicos também incluem peptídeos, polipeptídeos e proteínas que reagem com (isto é, ligação específica) anticorpos monoclonais e/ou policlonais que surgiram contra uma proteína MtDef4 e que exibem a mesma ou atividade antifúngica similar como uma proteína MtDef4.

[0054] As frases combater danos fúngicos, combater ou controlar dano fúngico ou controlar dano fúngico como usadas aqui referem-se à redução de dano em uma planta de cultura ou produto de planta de cultura devido a infecção por patógeno fúngico. De modo mais geral, essas frases referem-se à redução nos efeitos adversos causados pela presença de um fungo indesejado na planta de cultura. Efeitos adversos de crescimento de fungo são compreendidos como incluindo qualquer tipo de dano de tecido de planta ou necrose, qualquer tipo de redução de rendimento de planta, qualquer redução no valor do produto de cultura de planta, e/ou produção de metabolitos fúngicos indesejáveis ou por produtos de crescimento fúngico incluindo, mas não limitado a micotoxinas.

[0055] A frase construção de DNA como usada aqui refere-se a qualquer molécula de DNA em que duas ou mais sequências de DNA distintas normalmente têm sido covalentemente ligadas. Exemplos de construções de DNA incluem, mas não são limitados a plasmídeos, cosmídeos, vírus, BACs (cromossoma artificial bacteriano), YACs (cromossoma artificial de levedura), minicromossomas de planta, sequências de replicação autônomas, fagos, sequências de DNA de duplo fita ou único fita lineares ou circulares, derivadas de qualquer fonte, que são capazes de integração genômica ou replicação autônoma. Construções de DNA podem ser montados por uma variedade de métodos inlcuindo, mas não limitados a, técnicas de DNA recombinantes, técnicas de síntese de DNA, técnicas PCR (Reação de cadeia polimerase), ou qualquer outra combinação de técnicas.

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24/117 [0056] A frase uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta, como usada aqui refere-se ao contexto de uma planta transgênica expressando um polipeptídeo MtDef4, refere-se a ma quantidade de um polipeptídeo MtDef4 que resulta em qualquer diminuição mensurável em crescimento fúngico na planta transgênica e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por um crescimento fúngico na planta transgênica.

[0057] A frase um promotor heterólogo, como usada aqui no contexto de uma construção de DNA, refere-se a: i) um promotor que é derivado de uma fonte distinta a partir do gene estrutural ligado operativamente ou ii) um promotor derivado da mesma fonte que o gene estrutural ligado operativamente, onde a sequência de promotor é modificada de sua forma original.

[0058] O termo homólogo como usado aqui refere-se a um gene relacionado a um segundo gene identificando as sequências de DNA ou as sequências de proteína codificadas. Genes que são homólogos podem ser separados pelo evento de especiação (ver ortólogo). Genes que são homólogos podem também ser genes separados pelo evento de duplicação genética (ver paralog). Homólogos podem ser provenientes dos mesmos ou diferentes organismos.

[0059] As frases Polipeptídeo MtDef4 ou Proteína MtDef4 como usadas aqui referem-se a: i) polipeptídeos ou proteínas com pelo menos 70% de sequência de identidade para um polipeptídeo MtDef4 maduro ou sequência de proteína e ii) polipeptídeos ou proteínas com pelo menos 70% de sequência de identidade para sequência de polipeptídeo e pró-proteína MtDef4 compreendendo um peptídeo de sinal MtDef4 e uma proteína MtDef4 madura. Sequências de polipeptídeo MtDef4 maduro incluem, mas não são limitadas a, uma sequência de consenso MtDef4 (SEQ ID NO: 71), 30-76 aminoácidos de AL386553 (SEQ ID NO: 105), MtDef4.1 (SEQ ID NO:112), MtDef4.2 (SEQ ID

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N0:114), MtDef4.3 (SEQ ID N0:116), MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:125), MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO:135), MtDef4.1 (H33R, C14S, C34S) (SEQ ID NO:136), MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO: 137), MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138), polipeptídeos que têm pelo menos 70% de sequência de identidade para essas sequências, e os equivalentes funcionais biológicos dessas sequências. Sequências de polipeptídeo de próproteínas MtDef4 incluem, mas não são limitadas a, uma sequência de consenso de pró-proteína MtDef4 (SEQ ID NO: 99), as pró-proteínas MtDef4 exclusivas de SEQ ID NO: 77,78, 80, 81 ou 87, uma sequência de pró-proteína MtDef4.1 (SEQ ID NO:111), uma sequência de próproteína MtDef4.2 (SEQ ID NO:113), uma sequência de pró-proteína MtDef4.3 (SEQ ID NO:115), uma pró-proteína MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 151), polipeptídeos que têm pelo menos 70% de sequência de identidade para essas sequências, e os equivalentes funcionais biológicos dessas sequências.

[0060] A frase inibir crescimento de um fungo patogênico de planta como usada aqui refere-se a métodos que resultam em qualquer diminuição mensurável em crescimento fúngico, onde o crescimento fúngico inclui, mas não é limitado a, qualquer diminuição mensurável nos números e/ou extensões de células fúngicas, esporos, conídia, ou micelia. Como usado aqui inibir crescimento de um fungo patogênico de planta é também entendido como incluindo qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados por crescimento fúngco em uma planta. Efeitos adeversos de crescimento fúngico em uma planta inclui qualquer tipo de dano ou necrose, qualquer tipo de redução de rendimento de planta, qualquer redução no valor do produto de planta de cultura, e/ou produção de metabolitos fúngicos indesejáveis ou por produtos de crescimento fúngico incluindo, mas não limitados a, micotoxinas.

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26/117 [0061] O termo ortólogos como usado aqui refere-se a dois ou mais genes homólogos em diferentes espécies que desenvolveram-se de um gene ancestral comum por especiação. Ortólogos podem ter a mesma função biológica em diferentes espécies.

[0062] A frase operativamente ligado como usada aqui refere-se à junção de sequências de ácido nucleico tal que uma sequência pode prover uma função requerida para uma sequência ligada. No contexto de um promotor, operativamente ligada significa que o promotor é conectado a uma sequência de interesse tal que a trasncrição da sequência de interesse seja controlada e regulada por aquele promotor. Quando a sequência de interesse codifica uma proteína e quando a exressão daquela proteína é desejada, operativamente ligada significa que o promotor é ligado à sequência de tal maneira que a trasncrição resultante será eficazmente traduzida. Se a ligação do promotor à sequência de codificaça for uma fusão transcripcional e a expressão da proteína codificada for desejada, a ligação é feita de modo que o primeiro códon de iniciação traduzido na transcrição resultante é o códon de iniciação da sequência de codificação. Alternativamente, se a ligação do promotor à sequência de codificação for uma fusão traduzida e a expressão da proteína codificada for desejda, a ligação é feita de modo que o primeiro códon de iniciação traduzido na sequência não-traduzida 5' associada com o promotor e que é ligada tal que o produto de trasução resultante esteja em quadro com o quadro de leitura aberto de tradução que codifica a proteína desejada. Sequências de ácido nucleico que podem ser operativamente ligadas incluem, mas não são limitadas a, sequências que proveem funções de expressão de gene (isto é, elementos de expressão de gene tal como promotores, regiões não-traduzidas 5', introns, regiões de codificação de proteína, regiões não-traduzidas 3', sítios de poliadenilação, e/ou terminadores transcripcionais), sequências que proveem transferência de

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DNA e/ou funções de integração (isto é, sequências de borda de TDNA, sítios de reconhecimento de recombinase específica de sítio, sítios de reconhecimento de integrase), sequências que proveem funções seletivas (isto é, marcadores de resistência a antibióticos, genes biossinteticos), sequência que proveem funções de marcador pontuável (isto é, genes de relatório), sequências que facilitam manipulações in vitro ou in vivo das sequências (isto é, sequências poliligantes, sequências de recombinação específica de sítio) e sequências que proveem funções de relicação (isto é, origens bacterianas de replicação, sequências de replicação autônoma, sequências centroméricas).

[0063] A frase percentagem de identidade como usada aqui refere-se ao número de elementos (isto é, aminoácidos ou nucleotídeos) em uma sequência que é idêntica dentro de uma extensão definida de dois segmentos de DNA, RNA ou proteína idealmente ligados. Para calcular a percentagem de identidade, os números de elementos idênticos é dividido pelo número total de elementos na extensão definida dos segmentos alinhados e multiplicados por 100. Quando a percentagem de identidade é usada em referência a proteínas, é entendido que certos resíduos de aminoácidos podem não ser idênticos, mas todavia substituições de aminoácidos conservadas que refletem substituições de resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, ácido ou básico, hidrofóbido, hidrofílico, doador de ligação de hidrogênio ou resíduos de aceitador). Tais substituições podem não alterar as propriedades da molécula. Consequentemente, a porcentagem de identidade de sequências de proteína pode ser aumentada para considerar substituições conservativas.

[0064] O termo regeneração como usado aqui refere-se a qualquer método para obter uma planta completa a partir de um dentre uma semente, uma célula de planta, um grupo de células de planta, tecido de caule de planta, ou uma parte excisada da planta.

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28/117 [0065] O termo transformação como usado aqui refere-se a um processo para introduzir uma sequência de DNA exógeno (por exemplo, um vetor, uma molécula de DNA recombinante) em uma célula ou protoplasto em que aquele DNA exógeno é incorporado em um cromossoma ou é capaz de replicação autônoma.

[0066] A frase planta transgênica refere-se a uma planta ou descendência da mesma derivada de célula de planta transformada ou protoplasto, em que o DNA de planta contém uma molécula de DNA exógena não presente originalmente em uma planta nativa, nãotransgênica da mesma espécie.

[0067] O termo vetor como usado aqui refere-se a molécula de DNA ou RNA capaz de replicação em uma célula hospedeiro e/ou a qual outro segmento de DNA ou RNA pode ser capaz operativamente ligado de modo a produzir replicação do segmento anexado. Um plasmídeo é um vetor exemplar.

Construções de DNA Compreendendo Cassetes de Expressão de

Planta [0068] A construção de cassestes de expressão para uso em plantas monocotiledôneas ou plantas dicotiledôneas é bem estabelecido. Cassestes de expressão são construções de DNA onde várias sequências de promotor, codificação, e poliadenilação são operativamente ligadas. Em geral, cassestes de expressão tipicamente compreendem um promotor que é operativamente ligado a uma sequência de interesse que é operativamente ligada a uma região de poliadenilação ou de terminador. Em certos exemplos incluindo, mas não limitados a, expressão de transgenes em plantas monocotiledôneas, pode também ser útil uma sequência de íntron. Quando uma sequência de íntron é incluída ela é tipicamente colocada na região líder não-traduzida 5' do transgene. Em certos exemplos, ode ser 'til incorporar sequências não-traduzidas 5' específicas em um transgene para melhorar a estabiPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 36/229

29/117 lidade de transcrição ou promover tradução eficiente da transcrição. [0069] Uma variedade de promotores pode ser usada na prática desta invenção. Uma ampla classe de promotores 'teis são rferidas como promotores constitutivos em que eles são ativos na maioria dos órgãos de planta por todo o desenvolvimento da planta. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor viral tal como um promotor CaMV35S ou FMV35S. Os promotores CaMV35S e FMV35S são ativos em uma variedade de tecidos de planta transdormados e muitos órgãos de planta (por exemplo, caule, folha, semente e raiz). Versões melhoradas ou duplicada dos promotores CaMV35S e FMV35S são particularmente úteis na prática desta invenção (Patente norteamericana N° 5.378.619, incorporada aqui para referência em sua totalidade). Outros promotores de sintese de nopalina (NOS) e sintase de octopina (OCS) úteis (que são carregados em plasmídeos de indução de tumor de A tumefaciens), os promotores 19S de vírus de mosaico da couve-flor (CaMV), um promotor de ubiquitina de milho, o promotor Act1 de arroz e o promotor 35S de vírus de mosaico de figwort (FMV) (ver, por exemplo, Patente norte-americana N° 5,463,175; incorporada aqui para referência em sua totalidade). É entendido que este grupo de promotores exemplares seja não-limitante e que um versado na técnica poderia empregar outrso promotores que não são explicitamente citados aqui na prática desta invenção.

[0070] Promotores que são ativos em certos tecidos de plantas (isto é, promotores específicos de tecido) podem também ser usados para acionar expressão de MtDef4. A expressão de MtDef4 no tecido que é tipicamente infectado pelos patógenos fúngicos é antecipado como sendo particularmente útil. Assim, a expressão em tecidos reprodutivos, sementes, raízes, ou folhas pode ser particularmente útil na combinação de infeação de certos patógenos fúngicos em certas culturas. Exemplos de promotores específico de tecido, regulado de

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30/117 modo desenvolvido incluem, mas não são limitados a, promotor 7S βconglicinina (Doyle e outros, 1986), promotores específicos de semente (Lam and Chua, 1991), e promotores associados com napina, faseolin, zein, inibidor de tripsina de semente de soja, ACP, stearoyl- desaturase ACP, ou genes de oleosina. Exemplos de promotores específicos de raiz incluem, mas não são limitados a, promotores RB7 e RD2 respectivamente descritos em Patentes U.S. 5.459.252 e 5.837.876. [0071] Outra classe de promotores úteis são promotores que são induzidos por vários estímulos ambientais. Promotores que são induzidos por estímulos ambientais incluem, mas não são limitados a, promotores induzidos por aquecimento (isto é, promotores de choque de aquecimento tal como Hsp70), promotorees induzidos pela luz (isto é, o promotor induzível por luz a partir da pequena subunidade de carboxilase de 1,5-bisfosfato de ribulose, ssRUBISCO, um polipeptídeo de planta muito abundante), promotores induzidos pelo frio (isto é, promotores COR), promotores induzidos por estresse oxidativo (isto é, promotores Catalase), promotores induzidos por seca (isto é, os promotores Em de trigo e rab16A de arroz) e promotores induzidos por múltiplos sinais ambientais (isto é, promotores rd29A, promotores Glutationa-S-transferase (GST)).

[0072] Promotores que são induzidos por infecções fúngicas em plantas podem também serem usados para acionar expressão de MtDef4. Promotores 'teis induzidos por infecções fúngicas incluem aqueles promotores associados com genes envolvidos no metabolismo de fenilpropanóide (por exemplo, liase de fanilalanina amônia, promotores de sintase de chalcona), genes que modificam paredes de células de plantas (por exemplo, glicoproteína rica em hidroxiprolina, proteína rica em glicina, e promotores de peroxidase), genes que codificam enzimas que degradam as paredes de células fúngicas (por exemplo, promotores de chitinase ou glucanase), genes que codificam

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31/117 promotores de proteína similares a taumatin, ou genes de codificam proteínas de função desconhecida que exibem indução significante na infecção fúngica. Promotores de milho e de linho, designados como Mis1 e Fis 1, respectivamente, são também induzidos por infecções fúngicas em plantas e podem ser usados (Pedido de Patente norteamericana 20020115849).

[0073] Um íntron pode também ser incluído na construção de expressão de DNA, especialmente em casos quando a sequência de interesse deve ser expressa em plantas monocotiledôneas. Para uso em planta monocotiledônea, introns tais como o íntron hsp70 de milho (Patente norte-americana N° 5,424,412; incorporada aqui para referência em sua totalidade), o íntron de ubiquitina de milho, o íntron 1 Adh (Callis e outros, 1987), o íntron de sintase de sacarose (Vasil e outros, 1989) ou o íntron Act1 de arroz (McElroy e outros, 1990) podem ser usados. Introns de planta dicotiledônea que são úteis incluem introns tais como o íntron CAT-1 (Cazzonnelli and Velten,2003), o íntron pKANNIBAL (Wesley e outros, 2001; Collier e outros, 2005), o íntron PIV2 (Mankin e outros , 1997) e o íntron de Super Ubiquitina (Patente norte-americana N° 6,596,925, incorporada aqui para referência em sua totalidade; Collier e outros, 2005) que têm sido operativamente integrados em transgenes. É entendido que este grupo de introns exemplares é não-limitante e que um versado na técnica poderia empregar outros introns que não são explicitamente citados na prática desta invenção.

[0074] Certas modalidades desta invenção compreendem uma sequência que codifica um peptídeo de sinal que permite secreção da Proteína MtDef4 madura proveniente das células. Porções do clone genômico MtDef4 (SEQ ID NO: 124), MtDef4 ESTs de comprimento total (SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104), MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:108),

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MtDef4.2 (SEQ ID NO:109), e MtDef4.3 (SEQ ID NO:110) contêm sequências que codificam peptídeos de sinal MtDef4 que podem ser usados para secretar MtDef4 madura de plantas ou outras células. Mais especificamente, sequências de nucleotídeo que codificam qualque uma das sequncias de peptídeo de sinal de SEQ ID NO:117, 118, 119, 120, 121, 122, ou 122 podem ser usadas para secretar MtDef4 madura de plantas ou outras células.

[0075] Peptídeo de sinal MtDef4 que codificam sequências pode ser usado nas construções de DNA da invenção em uma variedade de formas. Essas sequências de sinal MtDef4 podem ser Sequências de sinal MtDef4 que são associadas com uma dada Proteína madura MtDef4 que codifica sequência em um dado clone genômico de DNA e MtDef4 cDNA. Alternativamente, o sinal MtDef4 pode ser operativamente ligado a uma proteína MtDef4 madura distinta que codifica sequência (isto é, Peptídeo de sinal MtDef4 e proteína madura que codificam sequências de proteína derivadas de clones de cDNA ou genômicos distintos podem ser operativamente ligados). Nas construções de DNA, sequências de nucleotídeo que codificam qualquer próproteína MtDef4 compreendendo ambos um peptídeo de sinal MtDef4 e uma proteína MtDef4 madura podem também ser usadas em vez de eptídeo de sinal distinto e proteína MtDef4 madura que codifica sequências. Pró-proteínas MtDef4 codificadas por essas sequências incluem, mas não são limitadas a, uma Sequências de consenso de próproteína MtDef4 (SEQ ID NO: 70 and 99), Pró-proteínas MtDef4 exclusivas tais como AL385796 (SEQ ID NO:77), AW573770 (SEQ ID NO:78), AL386553 (SEQ ID NO:80), AL386552 (SEQ ID NO:81), BE999096 (SEQ ID NO:87), sequências de pró-proteína MtDef4.1 (SEQ ID NO:111), sequências de pró-proteína MtDef4.2 (SEQ ID NO:113), sequências de pró-proteína MtDef4.3 (SEQ ID NO:115), polipeptídeos qe tem pelo menos 70% de sequência de identidade para

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33/117 essas sequências, e os equivalentes funcionais biológicos dessas sequências. É antecipado que o peptídeo de sinal MtDef4s pode ser usado para secretar peptídeos MtDef4 maduros de células de planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Sequências de nucleotídeo sintéticas podem também ser btidas que codificam as sequências de peptídeo de sinal MtDef4. A sequência do fragmento de gene MtDef4 que codifica um peptídeo de sinal pode ser deduzida a partir da sequência de peptídeo de sinal MtDef4 através do uso do código genético. A seguinte tabela provê uma lista de peptídeos de sinal MtDef4 que podem ser usados para secretar MtDef4 madura ou outras proteínas provenientes de células.

Tabela.1 Sequências de Peptídeo de Sinal MtDef4

SEQ ID NO:	Sequência de Aminoácido	Fonte
SEQ ID NO:117	Marsvplvst ifvf111lvatgpsmvaea	consenso de peptídeo de sinal MtDef4 ι
SEQ ID NO:118	Marsvplvs ti fvf111lvatgpsmvaea	MtDef4.1(H33R)
SEQ ID NO:119	Marsvplvst i fvf f11ίvatemgpsmvaa	MtDef4.2
SEQ ID NO:120 r	Marsvplvst i fvf f11Ivatemgpimvaea	MtDef4.3
SEQ ID NO:121 L	Marsvflvstifvfllvlvatgpsmvaea	ÀL385796*
SEQ ID	Marsvs lvf t i f vf 111 wa tgpsmvaea	AW573770*
NO:122
SEQ ID NO:12 3	Marsvplvst i fvf1111vatgpsmvgea	EE999096*
	* Número de acesso GenBank. (incluindo sequências de sinal e de peptídeo maduro

[0076] Alternatvamente, as sequências de peptídeo de sinal deriPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 41/229

34/117 vadas de outras proteínas de defensina Medicago (Hanks et al, 2005) podem ser usadas. Exemplos de peptídeos de sinal de proteína de defensina Medicago incluem, mas não são limitados a, peptídeos de sinal de MtDef1.1, MtDef1,6 e MtDef2,1. Outro exemplo de um peptídeo de sinal útil que codifica sequência que pode ser usado em plantas monocotiledônea é o peptídeo de sinal derivado de um gene de endoproteinase de cisteína de cevada (Koehler and Ho, 1990). Outro exemplo de um peptídeo de sinal útil que codifica sequência que pode ser usado em plantas dicotiledônea é o peptídeo de sinal PRIb de tabaco. É entendido que este grupo de peptídeos de sinal exemplar é nãolimitante e que um versado na técnica poderia empregar outros peptídeos de sinal que não são explicitamente citados aqui na prática desta invenção.

[0077] Nesta invenção, uma sequência codificando uma proteína MtDef4 madura é tipicamente ligada à sequência de codificação de peptídeo de sinal. Uma variedade de sequências de DNA que codifica uma variedade de proteínas MtDef4 maduras pode ser usada na prática desta invenção. A sequência de DNA pode codificar proteínas MtDef4 maduras que incluem, mas não são limitadas a, Sequências de peptídeo maduro MtDef4 tais como SEQ ID NO:71, Sequências de peptídeo maduro MtDef4 derivadas MtDef4 exclusiva codificando ESTs tais como SEQ ID NO:80, MtDef4.1 (SEQ ID NO:112), MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:125), MtDef4.2 (SEQ ID NO:114), MtDef4.3 (SEQ ID NO:116), MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO:135), MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) (SEQ ID NO:136), MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO:137), MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO:138) e os equivalentes funcionais biológicos de qualquer uma das sequências de aminoácido acima. Os equivalentes funcionais biológicos de uma proteína MtDef4 também incluem, mas não são limitados a, polipeptídeo MtDef4 maduros com pelo menos 85% de sequência de identidaPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 42/229

35/117 de para SEQ ID NO: 112. Em certas modalidades da invenção, uma sequência que codifica uma proteína MtDef4 madura pode ser fisicamente derivada ou obtida de DNA genômico ou cDNA obtido de tecido de planta Medicago trimcatula. Tais métodos para obter genes de defensina similares de Medicago truncatula têm sido descritos (Hanks et al, 2005). A sequência de nucleotídeo que codifica MtDef4 endógeno ou nativo é derivada de uma planta dicotiledônea em que é comumente expressa sob o controle da sequência de promotor MtDef4 endógena. Consequentemente, é esperado que a sequência de nucleotídeo que codifica MtDef4 de ocorrência natural ou endógena posa ser expressa em plantas. Em geral, ácidos nucléicos que codificam proteínas MtDef4 podem ser obtidos de Sequências de nucleotídeo de consenso MtDef4, de genes MtDef4 sintéticos derivados de tradução inversa de sequências de polipeptídeo MtDef4, a partir de clones genômicos, a partir de sequências de codificação deduzidas derivadas a partir de clones genômicos, a partir de sequências de cDNA ou EST, and a partir de qualquer uma das sequências acima que foram submetidas a mutagênese. Exemplos de ácidos nucléicos que contêm sequências de nucleotídeo codificando proteína MtDef4 madura incluem, mas não são limitados a, um gene sintético MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:72), ESTs MtDef4 de comprimento completo (SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104), clone genômico MtDef4.1 (SEQ ID NO: 108), um clone genômico MtDef4.2 (SEQ ID NO: 109), um clone genômico MtDef4.3 (SEQ ID NO: 110); e uma sequência de nucleotídeo de consenso MtDef4 (SEQ ID NO: 141). Sequências codificando uma proteína MtDef4variante derivada de mutagênese de sequências de nucleotídeo MtDef4 por síntese direta que codifica substituições de polipeptídeo MtDef4 tais como uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R) madura (SEQ ID NO: 144), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) madura

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36/117 (SEQ ID NO: 146), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) madura (SEQ ID NO: 147), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) madura (SEQ ID NO: 148) e uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) madura (SEQ ID NO: 149) são também contempladas. Sequências de nucleotídeo que codificam várias proteínas MtDef4 podem também ser obtidas de sequências genômicas tais como aquelas para MtDef4.1 (SEQ ID NO: 108), MtDef4.2 (SEQ ID NO: 109), ou MtDef4.3 (SEQ ID NO:110 ) removendo sequências de íntron deduzidas para obter as sequências de codificação MtDef4 deduzidas para MtDef4.1 (SEQ ID NO: 126), MtDef4.2 (SEQ ID NO: 124), e MtDef4.3 (SEQ ID NO:143). A remoção das sequências de íntron de clones genômicos MtDef4 pode ser efetuada por técnicas de ensaio de mutagênese in vitro. Alternativamente, as sequências de íntron podem ser removidas in silico (em um arquivo de computador) e a sequência de codificação resultante sintetizada pelas técnicas de síntese de DNA-padrão. É adicionalmente reconhecido que Medicago sativa de planta mais proximamente relacionada é uma fonte de ESTs MsDef4 que codifica proteínas MsDef4 que são idênticas a, ou de outra maneira biologicamente equivalentes a, o polipeptídeos MtDef4 desta invenção. Um exemplo de um EST MsDef4 é provido aqui pela sequência de cDNA MsDef4,1 (SEQ ID NO: 142). A sequência EST MsDef4,1 EST codifica a mesma sequência de aminoácido (isto é, SEQ ID NO:111) como o gene MtDef4.1 (SEQ ID NO:108). Sequências de nucleotídeo codificando o Polipeptídeos MtDef4 desta invenção podem ser derivadas de outras Medicago sp. Tais como Medicago sativa e assim também podem ser usadas nesta invenção. Porções das sequências de nucleotídeo acima mencionadas que codificam peptídeos MtDef4 maduros podem ser operativamente ligadas ou a sequência de peptídeo de sinal MtDef4 a qual elas são comumente ligadas ou a outro peptídeo de sinal via técPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 44/229

37/117 nicas de DNA recombinante padrão ou por métodos de síntese de DNA.

[0078] Em outras modalidades da invenção, o gene que codifica MtDef4 pode ser sintetizado de novo a partir de uma Sequências de peptídeo maduro MtDef. A sequência do gene MtDef4 pode ser deduzida da sequência de peptídeo MtDef através do uso do código genético. Programas de computador tais como BackTranslate (GCG® Package, Acclerys, Inc. San Diego, CA) podem ser usados para converter uma sequência de peptídeo em sequência de nucleotídeo correspondente que codifica o peptídeo. Examplos de sequências de proteína MtDef4 madura que podem ser usadas para obterás sequências de codificação de nucleotídeo correspondentes incluem, mas não são limitadas a, sequências de peptídeo maduras MtDef4 de consenso tais como SEQ ID NO:71, sequências de peptídeo maduro MtDef4 derivadas de ETs de codificação de mtDef4 tais como SEQ ID NO:80, MtDef4.1 (SEQ ID NO:112), MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 125), MtDef4.2 (SEQ ID NO:114), MtDef4.3 (SEQ ID NO:116), MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO:135), MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) (SEQ ID NO:136), MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO:137), MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138) e os equivalentes funcionais biológicos de qualquer uma das sequências de aminoácidos acima. Equivalentes funcionais biológicos de uma proteína MtDef4 podem também incluir polipeptídeo MtDef4 maduros com pelo menos 85% de sequência de identidade para SEQ ID NO: 112.

[0079] Além do mais, a sequência de nucleotídeo de codificação de MtDef sintética pode ser designada de modo que seja expressa em plantas. Patente norte-americana N° 5,500,365 descreve um método para sintetizar genes de planta para otimizar o nível de expressão da proteína codificada pelo gene sintetizado. Este método refere-se à modificação das sequências de gene estrututrais do transgene exógePetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 45/229

38/117 no, para torná-lo mais similar a planta e portanto, mais eficientemente transcrito, processado, traduzido e expresso pela planta. Características de genes que são expressas bem como em plantas incluem o uso de códons que são comumente usados pelo hospedeiro de planta e eliminação de sequências que podem causar divisão de íntron indesejada ou poliadenilação de uma transcrição de gene. Um método similar para obter expressão melhorada de transgenes em plantas monocotiledôneas é descrito em Patente norte-americana N° 5.689.052. Além do mais, os métodos de projeto sintéticos descritos na Patente norte-americana N° 5.500.365 e Patente norte-americana N° 5.689.052 podem também ser usados para sintetizar uma sequência de codificação de peptídeo de sinal que é otimizada para expressão em plantas em geral ou plantas monocotiledônea em particular. Um exemplo nãolimitante de uma sequência de nucleotídeo sintética otimizada para expressão em plantas monocotiledônea é SEQ ID NO:72. O gene sintético representado pela SEQ ID NO:72 codifica uma pró-proteína MtDef4.1 (H33R) compreendendo umpeptídeo de sinal MtDef4 que é operativamente ligado a uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:125).

[0080] Em outras modalidades da invenção, sequências que codificação peptídeo que proveem a localização de um MtDef4 em organelas subcelulares podem ser operativamente ligadas às sequências que codificam o polipeptídeo MtDef4. Polipeptídeos MtDef4s que são operativamente ligados a um peptídeo de sinal são esperados entrar no percurso de secreção e serem retidos por organelas tais como o retículo endoplasmático (ER) ou alvejadas ao vacúolo ligante operativamente a retenção apropriada ou endereçamento peptídeos para o terminal-C do polopeptídeo MtDef4. Exemplos de peptídeos que endereçam ao vacúolo incluem, mas não são limitados a sinal de endereçamento vacuolar a partir do gene de lectina de cevada. Um vetor de exPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 46/229

39/117 pressão exemplar para endereçamento vacuolar de um peptideo MtDef4 é mostrado na figura 9 e SEQ ID NO: 76. exemplos de peptídeos alvejando ER incluem, mas não são limitados a, um peptideo empreendendo uma sequência de aminoácido KDEL. Um vetor de expressão exemplar para retanção ER de um peptideo MtDef4 é mostrado na figura 10 e SEQ ID NO: 150. Sem procurar ser limitado pela teoria, a localização de polipeptídeos MtDef4 ou no retículo endoplasmático ou no vacúolo pode prover propriedades desejáveis tais como expressão aumentada em plantas transgênicas e/ou eficácia aumentada na inibição de crescimento fúngico em plantas transgênicas.

[0081] Como notado acima, a sequência de interesse pode também ser operativamente ligada a uma região não-traduzida 3' contendo um sinal de poliadenilação. Este sinal de poliadenilação provê a adição de uma sequência de poliadenilação para a extremidade 3' do RNA. O gene de sintase de nopalina de plasmídeo (NOS) de indução de tumor (Ti) de Agrobacterium 3' e as regiões não-traduzidas 3' do gene pea ssRUBISCO contêm sinais de poliadenilação e representam exemplos não-limitantes de tais regiões não-traduzidas que podem ser usadas na prática desta invenção. É entendido que este grupo de regiões de poliadenilação exemplar é não-limitante e que um versado na técnica podería empregar outras regiões de poliadenilação que não são explicitamente citadas aqui na prática desta invenção.

[0082] As construções de DNA que compreendem os cassetes de expressão de plantas descritos acima são tipicamente mantidos em vários vetores. Vetores contêm sequências que proveem replicação do vetor e sequências covalentemente ligadas em uma célula de hospedeiro. Por exemplo, vetores bacterianos contêm origens de replicação que permitem a replicação do vetor em um ou mais hospedeiros. Vetores de transformação de planta mediada por Agrobacterium compreendem sequências que permitem a replicação em ambos E. coli e

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Agrobacterium bem como em uma ou mais sequências de borda posicionadas de modo a permitir a ntegração do cassete de expressão no cromossoma de planta. Tais vetores de Agrobacterium podem ser adaptados para uso ou em Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Sequências de encodificação de marcadores selecionáveis que conferem resistência a antibióticos são também tipicamente incluídas nos vetores para prover sua manutenção em hospedeiros bacterianos

Métodos para Obter Plantas Antifúngicas [0083] Métodos para obter uma planta transgênica capaz de inibir crescimento de um fungo patogênico de planta são também providos por esta invenção. Primeiramente, vetores de expressão adequados para expressão da proteína MtDef4 em várias plantas monocotiledônea e dicotiledônea são introduzidos em uma planta, uma célula de planta ou tecido de planta usando técnicas de transformação como descrito aqui. Depois, uma planta transgênica contendo ou compreendendo o vetor de expressão MtDef4 é obtida regenerando aquela planta transgênica a partir da planta, célula de planta ou tecido de planta que recebeu o vetor de expressão. A etapa final é obter uma planta transgênica que expressa uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta do polipetídeo MtDef4 maduro onde uma quantdade inibidora de fungo patogênico deplanta é um nível de proteína MtDef4 suficiente para prover qualquer diminuição mensurável no crescimento fúngico na planta transgênica e/ou qualquer diminuição mensurável nos efeitos adversos causados pelo crescimento fúngico na planta transgênica.

[0084] Quaisquer dos vetores de expressão MtDef4 podem ser introduzidos nos cromossomas de uma planta hospedeira via métodos tais como transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por Rhizobium, transformação mediada por Sinorhizobium,

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41/117 transformação mediada por partícula, transfecção de DNA, eletroporaçao de DNA, ou transformação mediada por cristalino. Métodos acima mencionados de introdução de transgenes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos no Pedido de Patente norte-americana No. 20050289673 (Agrobacterium-mediated transformation of corn), Patente norte-americana N° 7.002.058 (Agrobacterium-mediated transformation of soybean), Patente norte-americana N° 6.365.807 (particle mediated transformation of rice), e Patente norteamericana N° 5.004.863 (Agrobacterium-mediated transformation of cotton), cada um dos quais são incorporados aqui para referência em sua totalidade. Métodos de usar bactérias tais como Rhizobium ou Sinorhizobium para transformar plantas são descritos em Broothaerts, e outros, Nature. 2005,10;433(7026):629-33. É adicionalmente entendido que o vetor de expressão MtDef4 pode compreender sítios de recombinação específica de sítio atuando em cis reconhecidos por recombinases específicas de sítio, incluindo Cre, Flp, Gin, Pin, Sre, pinD, lnt-B13, e R. Métodos de integrar moléculas de DNA em localizações específicas em genomas de plantas trasgênicas através do uso de recombinases específicas de sítio podem então ser usados (Patente norte-americana 7,102,055). Aqueles versados na técnica irão adicionalmente apreciar que quaisquer dessas técnicas de transferência podem ser usadas para introduzir o vetor de expressão no cromossoma de uma célula de planta, um tecido de planta ou uma planta.

[0085] Métodos de introduzir minicromossomas de planta compreendendo centrômeros de planta que proveem manutenção do minicromossoma recombinante em uma planta transgênica podem também ser usados na prática desta invenção (Patente norte-americana 6,972,197). Nessas modalidades da invena, plantas transgências abrigam os minicromossomas como elementos extracromossômicos que

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42/117 não são integrados nos cromossomas da planta hospedeira.

[0086] Plantas transgênicas são tipicamente obtidas ligante o gene de interesse (isto é, neste caso veotres de expressão MtDef4) a um gene de marcador selecionável, introduzindo os transgenes ligados em uma célula de planta, um tecido de planta ou uma planta por qualquer um dos métodos descritos acima, e regenerar ou de outra maneira recuperar a planta transgênica sob condições que requerem expressão do gene de marcador selecionável para crescimento de planta. O gene de marcador selecionável pode ser um gene que codifica um proteína fosfotransferase de neomicina, a proteína acetiltrasnferase de fosfinotricina, uma proteína sinase de 5-enol-piruvilshikimate-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato, uma proteína fosfotransferase de higromicina, uma proteína sintase de di-hidropteroato, uma proteína sintase de acetolactato insensível a sulfonilureia, uma proteína Q insensível a atrazina, uma proteína de nitrilase capaz de degradar bromoxinil, uma proteína de desalogenase capaz de degradar dalapon, uma proteína mono-oxigenase de 2,4-diclorofenoxiacetato, uma proteína reductase de di-hidrofolato insensível a metotrexato, e uma proteína sintase de octopina insensível a aminoetilcisteína. Os agentes seletivos correspondentes usados juntamente com cada gene podem ser: neomicina (para seleção de proteína fosfotransferase de neomicina), fosfinotricina (para seleção de proteína acetiltrasnferase de fosfinotricina), glicfosato (para seleção de proteína de sintase de 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato), higromicina (para seleção de proteína de fosfotransferase de higromicina), sulfadiazina (para seleção de uma proteína sintase de di-hidropteroato), clorossulfurona (para seleção de uma proteína sintase de acetolactato insensível a sulfonilureia), atrazina (para seleção de uma proteína Q insensível a atrazina), bromoxinil (para seleção de uma proteína de nitrilase), dalapon (para seleção de uma proteína desalogenase), ácido

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2,4-diclorofenoxiacético (para seleção de uma proteína monooxigenase de 2,4-diclorofenoxiacetato), metotrexata (para seleção de uma proteína reductase de di-hidrofolato insensível a metotrexato), ou aminoetilcisteína (para seleção de uma proteína sintase de octopina insensível a aminoetilcisteína).

[0087] Plantas transgênicas também podem ser obtidas ligante um gene de interesse (isto é, neste caso um vetor de expressão MtDef4) a um gene de marcador pontuável, introduzindo os transgenes ligados em uma célula de planta por qualquer um dos métodos descritos acima, e regenerar as plantas transgênicas a partir de células de plantas transformadas que tem teste positivo para expressão do gene de marcador pontuável. O gene de marcador pontuável pode ser um gene que codifica uma proteína beta-glucuronidase, uma proteína verdefluorescente, uma proteína amarelo-fluorescente, uma proteína betagalactosidase, uma proteína luciferase derivada de um gene luc, uma proteína luciferase derivada de um gene lux, uma proteína sialidase, uma proteína fosfotransferase de estreptomicina, uma proteína sintase de nopalina, uma proteína sintase de octopina or uma proteína cloranfenicol acetil transferase.

[0088] Quando o vetor de expressão é introduzido em uma célula de planta ou tecido de planta, as células transformadas ou tecidos são tipicamente regenerados em plantas completas cultivando essas células ou tecidos sob condições que promovem a formação de um planta completa (isto é, o processo de regenerar folhas, caules, e raiz, em certas plantas, tecidos reprodutivos) o desenvolvimento ou regeneração de plantas transgênicas a partir de protoplastos de planta única ou várias células é bem conhecido na técnica (Horsch, R. B. e outros 1985). Esta regeneração e processo de crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas e cultivo de células selecionadas sob condições que irão render plantas enraizadas. Os raPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 51/229

44/117 mos enraizados transgênicos resultantes são depois plantados em um meio de crescimento de planta aprorpiado tal como solo. Alternativamente, transgenes podem ser também introduzidos nos meristemas de ramos de planta isolada e plantas regeneradas sem passar pela cultura de tecido de estágio de caule (Patente norte-americana 7.002.058). Quando o transgene é introduzido em uma planta, ou mais especificamente no tecido meristemático de uma planta, a semente pode ser colhida a partir da planta e selecionada ou pontuada para a presença do transgene. No caso de espécies de planta transgênica que se reproduzem sexualmente as sementes podem ser coletadas a partir de plantas que tem sido auto (autopolinizadas) ou cortadas (isto é, usadas como um doador de pólen ou recipiente) para estabelecer e manter a linhagem da planta transgênica. Plantas transgênicas que não são sexualmente reporduzidas podem ser vegetativamente propagadas para estabelecer e manter a linhagem de planta transgênica. Como usado aqui, linhagem de planta transgênicas derivadas de um evento de transformação onde o transgene foi inserido em uma ou mais localizações no genoma de planta. Em uma aspecto relacionado, a presente invenção também engloba uma semente produzida pela planta transformada, uma descendência da planta transgênica original, produzida de acordo om o processo acima. Tal descendência e sementes irão ter um trasngene de codificação de proteína MtDef4 estavelmente incorporado em seu genoma, e tais plantas de descendência irão inserir as características fornecidas pela introdução de um transgene estável de maneira Mendeliana. Todas as plantas transgênicas tendo incorporado em seus segmentos de DNA transgênicos de genoma que codificam uma ou mais proteína ou polipeptídeos são aspectos desta invenção. É adicionalmente reconhecido que as plantas transgênicas contendo os contrutos de DNA descritos aqui, e materiais derivados das mesmas, podem ser identificadas através do uso de

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PCR ou outros métodos que podem especificamente detectar as sequências nas construções de DNA.

[0089] Uma vez que uma planta transgênica é regenrada ou recuperada, uma variedade de métodos pode ser usada para identificar ou obter uma planta transgênica que expressa uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de MtDef4. um conjunto geral de métodos é realizar ensaios que medem a quantidade de MDef4 que é produzida. Por exemplo, vários métodos de detecção com base em anticorpos empregando anticorpos que reconhecem MtDef4 podem ser usados para quantificar a quantidade de MtDef4 produzida. Exemlos de tais ensaios baseados em anticorpo incluem, mas não são limitados a, ELISAs, RIAs, ou outros métodos em que um anticorpo de reconhecimento de MtDef4 é detectavelmente rotulado com uma enzima, um isótopo, um fluoroporo, uma lantanida, e similares. Usando uma proteína MtDef4 purificada ou isolada como um padrão de referência em tais ensaior (isto é, provendo quantidades conhecidas de MtDef4), a quantidade de MtDef4 presente no tecido de planta em um mol por grama de material de planta ou massa por grama de material de planta pode ser determinada. A proteína MtDef4 irá tipicamente ser expressa na planta transgênica no nível de partes por milhão ou PPM onde os níveis de micrograma de proteína MtDef4 estão presentes em quantidades de grama de tecido de planta recém pesado. Neste caso, 1 micrograma de proteína MtDef4 por 1 grama de tecido de planta recém pesado representa uma concentração de MtDef4 de 1 PPM. Uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de MtDef4 é de elo menos 0,05 PPM (isto é, 0.05 pg Proteína MtDef4 por grama de tecido de planta recém pesado). Em modalidades preferidas, uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta of Proteína MtDef4 é pelo menos 0,5 PPM. Em modalidades mais preferidas, aquantidade de MtDef4 é pelo menos 1,0 PPM. Nas modalidades as mais preferidas, a

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46/117 quantidade de proteína MtDef4 é pelo menos 2,0 PPM.

[0090] Alternativamente, a quantidade de mRNA de codificação de MtDef4 produzida pela planta transgênica pode ser determinada para identificar plantas que expressam quantidade inibidora de fungo patogênico de plantas de Proteína MtDef4. Técnicas ara relacionar a quantidade de proteína produzida para a quantidade de RNA produzido são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem métodos tais como construir uma curva-padrão que se refere a níveis específicos de RNA (isto é, MtDef4 mRNA) para níveis da proteína MtDef4 (determinados pelo método imunológico ou outros métodos). Métodos de quantificar mRNA MtDef4 tipicamente envolvem hibridização específica de um polinucleotídeo ou o mRNA MtDef4 ou a um cDNA (DNA complementar) ou produto PCR derivado do RNA MtDef4. Tais sondas de polinucleotídeo podem ser derivadas de sequências de nucleotídeo de fita senso e antissense do transgene de codificação de proteína MtDef4. Hibridização de uma sonda de polinucleotídeo para o mRNA MtDef4 ou cDNA pode ser detectada por métodos incluindo, mas não limitados a, uso de sondas rotuladas com um isótopo, um fluoroporo, uma lantanida, ou um hapteno tal como biotina ou dogoxigenina. Hibridização da sonda rotulada pode ser detectada quando o RNA MtDef4 está em solução ou imobilizado em um suporte sólido tal como uma membrana. Quando quantificar RNA MtDef4 pelo uso de uma Reação de cadeia polimerase trascriptase reversa quantitativa (qRT-PCR), o produto PCR derivado de MtDef4 pode ser detectado pelo uso de qualquer uma das sondas de olinucleotídeo derivadas de MtDef, pelo uso de um corante intercalado tal como um bromo de etídio ou verde SYBR, ou uso de uma sonda de hibridização contendo um fluoroporo e um arrefecedor tal que a emissão do fluoroporo seja apenas detectada quando o fluoroporo for liberado pela atividade de nuclease 5' da polimerase usada na reação PCR (isto é, a TaqMan® reaction; Applied

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Biosystems, Foster City, CA ) ou quando o fluoroporo e o arrefecedor estiverem deslocados pela síntese mediada por polimerase do fita complementar (isto é, Scorpion® or Molecular Beacon® probes). Vários métodos para conduzir análise qRT-PCR para quantificar níveis de mRNA são bem caracterizadas (Bustin, S. A.; 2002). Sondas fluorescentes que são ativadas pela ação de enzimas que reconhecem complexos de ácido nucléico descombinado (isto é, Invader®, Third Wave Technologies, Madison, Wl) podem também ser usadas para quantificar RNA. Aqueles versados na técnicairão também entender que técnicas de quantificação de RNA tais como Amplificação Baseada em Sequência de Ácido Nucléico Quantitativa (Q-NASBA®) podem ser usadas para quantificar mRNA de codificação de proteína MtDef4e identificar plantas de expressão.

[0091] Plantas tansgências que expressam quantidades inibidoras de fungo patogênico de planta de MtDef podem também ser identificadas pro ensaio direto de tais plantas para inibição do crescmento de um fungo patogênico de planta. Tais ensaios podem ser usados idependentemente ou juntamente com ensaios de expressão de MtDef4 para identificar as plantas transgênicas resistentes. Infecção de certos fungos patogênicos de planta pode resultar em efeitos distintos no crescimento da planta que ao prontamente observados. Consequentemente alguém pode distinguir plantas transgênicas de expressão de MtDef4 desafiando tais plantas transformadas com transgenes de codificação de MtDef4 com fungos de planta patogênicos e observando redução dos sintomas normalmente associados com tais infecções. Tais observações são facilitadas por coinfecção de plantas que não contêm transgene de codificação de MtDef4 com o mesmo tiop e dose de fungos patogênicos de planta usados para infectar as plantas transgênicas que contêm um transgene de codificação de MtDef4. Identificação de plantas tansgências que controlam ou combatem inPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 55/229

48/117 fecção fúngica podem ser baseados na observação de sintomas de doença diminuídos, medição do crescimento fúngico diminuída na planta infectada (isto é, determinando os números de unidades de formação de colônias por grama de tecido infectado) e/ou pela medição da quantidade de micotoxinas presentes em tecido de planta infectada. O uso de ensaios de severidade de doença fúngica e ensaios de formação de colônia juntamente com ensaios de expressão para identificar plantas de batata de expressão de MtDefl transgênica que são resistentes a Verticillium dahilae tem sido descrito (U.S. 6.916.970 and Gao et al, 2000). É similarmente antecipado que uma variedade de plantas trangências de expressão de Mtdef4 que combatem ou controlam patógenos fúngicos podem ser identificadas por plantas transgênicas de pontuação para resistência a patógenos fúngicos que infectam tais plantas. Exemplos de resistância fúngica conferida a transgene MtDef4 que pode ser ensaiada observando reduções em sintomas de doença ou reduções em crescimento fúngico incluem, mas não são limitados a, resistência a milho transgênico para Fusarium verticillioides, Fusarium moniliforme, Stenocarpella maydis, e/ou Cercospora zeae-maydis', resitência de milho transgênico para Giberela (Fusarium graminearum), bolor em pó (Erysiphe graminis f. sp. tritici) ou ferrugem de folha (Puccinia recôndita f. sp. tritici)·, resistência de algodão transgênico para Fusarium oxysporum; resistência de arroz transgênico para Magnaporthe grisea e Rhizoctonia solani, e resistência de semente de soja transgênica para Asian Soybean rust (Phakopsora pachyrhizi), Putrefação de raiz Phytophthor (Phytophthora sp.), Modelo branco {Sclerotinia sp.), Síndrome de morte súbita (Fusarium solani) e/ou putrefação de caule marrom {Phialophora gregata).

[0092] Plantas transgênicas que expressam quantidades inibidoras de fungo patogênico de planta de MtDef4 podem também ser identificadas medindo diminuições nos efeitos adversos causados por cresPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 56/229

49/117 cimento fúngico em uma planta. Tais diminuições podem ser avaliadas comparando a extensão dos efeitos adversos em uma planta transgênica expressando MtDef4 relativa a uma planta de controle que não expressa MtDef4. efeitos adversos de crescimento fúngico em uma planta que podem ser medidos incluindo qualquer tipo de dano de tecido em planta ou necrose, qualquer tipo de redução de rendimento de planta, qualquer redução no valor do produto de planta de cultura, e/ou prdução de metabólitos fúngicos indesejáveis ou por produtos de crescimento fúngico incluindo, mas não limitados a, micotoxinas. Micotoxinas compreendem um número de moléculas de toxina produzidas por espécies fúngicas incluindo, mas não limitadas a, poliquetídeos (incluindo aflatoxins, demetilsterigmatocistin, O-metilsterigmatocistin etc.), fumonisins, alperisins (por exemplo, A-ι, A₂, B-ι, B₂), sphingofungins (A, B, C e D), tricotecenas, fumifunginas, e similares. Métodos de quantificar níveis de micotoxina são amplamente documentados. Além do mais, kits comerciais para medição da micotoxina tal como aflatoxin, fumonisin, deoxinivalenol, e zearalenone são também disponíveis (VIÇAM, Watertown, MA, USA).

[0093] Uma ampla variedade de plantas podem ser transformadas com vetores de expressão MtDef4 para obter plantas transgênicas que combatem infecções fúngicas de controle. Plantas monocotiledônea transgênicas obteníveis pelos vetores de expressão e métodos descritos aqui incluem, mas não são limitados a, cevada, milho, linho, aveia, arroz, centeio, sorgo, gramado, cana-de-açúcar, e trigo. Plantas dicotiledônea transgênicas obteníveis pelos vetores de expressão e métodos descritos aqui, mas não são limitados a alfafa, arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couve-flor, aipo, citrus, algodão, cucurbits, eucalipto, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e

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50/117 tomate.

[0094] Outras proteínas que conferem certas vantagens podem da mesma forma ser coexpressas com os DNAs que codificam os polipeptídeos da presente invenção: (1) DNAs que codificam enzimas tais como oxidase de glicose (que converte glicose para ácido glucônico, concomitantemente produzindo peróxido de hidrogênio que confere ampla resistência de espectro para patógenos de plantas); oxidade de piruvato; oxidade de oxalato; oxidade de colesterol; oxidades de aminoácido; e outras oxidases que que usam oxigênio molecular como substratos primários ou secundários para produzir para produzir peróxidos, incluindo peróxido de hidrogênio; (2) proteínas relacionadas a patogênese tais como proteínas SAR8.2a e SAR8.2b; as formas ácidas e básicas de proteínas PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-I¹, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5, PR-N, PR-O, PR-O¹, PR-P, PR-Q, PR-S, e PR-R de tabaco; chitanases tais como chitanase básica de tabaco e peroxidades de chitanase de pepino / lisozima; tais como peroxidase básica de pepino; glucanases tais como glucanase básica de tabaco; proteínas similares a osmotina; (3) proteínas de capsid virais e replicases de vírus de planta; (4) genes R de planta (genes de resistência) e homólogos do mesmo, incluindo, mas não limitado a Arabidopsis RPS2 (Bent e outros, 1994), Arabidopsis RPMI (Grant e outros, 1995), N-gene de tabaco e Ν'-gene, linho Cf-9, linho L6, e arroz Xa21 ; (5) genes Avr patógenos, tais como Cladosporium fulvum Avr9, que podem ser expressas usando promotores induzíveis por química ou patógeno; (6) genes que são envolvidos na biossíntese de ácido salicílico, tais como 2hidroxilase de ácido benzóico; e (7) outras proteínas de defensinas com modos de ação antifúngicos distintas a partir do modo de ação de MtDef4, incluindo mas não limitado a, MsDef 1, MtDef2, Rs-AFP 1 e RS-AFP2.

Vetores e Sistemas de Transformação

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51/117 [0095] Expressão de proteínas MtDef4 em leveduras é especificamente contemplada aqui. A construção de vetores de expressão para produção de proteínas heterológas em vários gêneros de levedura é bem estabelecida. Em geral, tais vetores de expressão tipicamente compreendem um promotor que é operativamente ligado a uma sequência de interesse que é operativamente ligada a uma região de poliadenilação ou terminador. Exemplos de gêneros de levedura têm sido usados para expressar de forma bem sucedida genes heterológos incluem Candida, Kluveromyces, Hansuela, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, e Yarrowia. Uma descrição geral de vetores de expressão e sistemas de transformação para Saccharomyces é encontrada em Kingsman et al (1985). Vetores de expressão e sistemas de transformação úteis para outras leveduras que não Saccharomyces são descritas em Reiser et al (1990).

[0096] Em geral, o promotor e a região de poliadenilação são selecionados com base em sua operabilidade no hospedeiro de levedura desejado. Por exemplo, os promotores AOX1 ou AOX2 de Pichia podem ser usados juntamente com sequências de poliadenilação AOX1, AOX2, p40 ou p76 de Pichia para expressar uma proteína heteróloga tal como uma proteína MtDef4. Ambos os promotores AOX1 e AOX2 são particularmente úteis em Pichia assim como ambos os promoteres proveem expressão abundante do gene heterólogo ligado quando induzido pela adição de metanol para os meios de crescimento. O uso desses promotores de Pichia e sequências de poliadenilação é descrito Patente norte-americana 4.855.231, que é expressamente incorporada aqui para referência em sua totalidade.

[0097] Similarmente, os promotores Hansuela MOX, DHAS, ou

FMDH podem ser usados para expressar proteínas heterólogos tais como tais como MtDef4 em Hansuela. Os promotores MOX, DHAS, ou

FMDH são particularmente úteis em Hansuela assim como esses proPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 59/229

52/117 motores proveem expressão abudante do gene heterólogo ligado quando induzido pela adição de metanol para os meios de crescimento. O uso dos promotores MOX e DHAS em Hansuela é descrito na Patente norte-americana 5.741.672 enquanto o uso do promotor FMDH em Hansuela é descrito na Patente norte-americana 5.389.525, cada uma das quais é incorporada aqui para referência em sua totalidade.

[0098] Para Kluveromyces, um promotor de lactase e uma sequência de poliadenilação podem ser usados para expressar genes heterólogos tais como MtDef4. Expressão genes heterólogos que são operativamente ligados para o promotor de lactase e sequência de poliadenilação é alcançado pelo crescimento de Kluveromyces na presença de galactose. O uso do promotor de lactase e sequências de poliadenilação em Kluveromyces é descrito na Patente norteamericana 6.602.682, que é expressamente incorporada aqui para refrência em sua totalidade.

[0099] Os vetores de expressão de levedura que proveem secreção de proteínas heterólogos como MtDef4 nos meios de crescimento por levedura transformada são também contemplados. Secreção da proteína MtDef4 madura é tipicamente MtDef4 é tipicamente alcançada pro ligação operativa de uma sequência de sinal ou um peptídeo de sinal e sequência de pró-peptídeo para a sequência de codificação de peptídeo MtDef4. Exemplos de peptídeos de sinal úteis para secreção de proteínas heterólogas em leveduras incluem, mas não são limitadas a, um peptídeo de sinal de fator a, um peptídeo de sinal PHO1, todas as quais são derivadas de levedura. O peptídeo de sinal de fator α é tipicamente derivada de Saccharomyces, Kluveromyces ou Candida, enquanto o peptídeo de sinal PHO1 é derivado de Pichia.

[00100] Uma sequência de peptídeo de sinal particularmente útil ou peptídeo de sinal e sequência de pró-peptídeo para secreção de protePetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 60/229

53/117 ínas em leveduras é derivada de S. cerevisiae fator α e é descrita na Patentes U.S. 4.546.082, 4.588.684, 4.870.008, e 5.602.034. O peptídeo de sinal S. cerevisiae fator α e sequência de pró-peptídeo consistem em 1-83 aminoácido do produto de tradução não processado, primário, do gene de fator de combinação alfa S. cerevisiae (Número de Acesso GenBank: PO1 149). Em certas modalidades, a sequência de peptídeo de sinal do fator de combinação alfa compreendendo 1 a cerca de 19 a 23 aminoácidoda pró-proteína de fator de combinação alfa pode ser diretamente ligada ao terminal N da proteína MtDef4 madura para prover secreção de proteína MtDef4 madura. Neste caso, o peptídeo de sinal é clivado a partir da proteína MtDef4 madura no curso do processo de secreção. Alternativamente, o peptídeo de sinal e propeptídeo do fator de combinação alfa podem ser operativamente ligados à sequência de codificação MtDef4 madura via uma sequência espaçadora. Esta sequência espaçadora pode compreender uma variedade de sequências que proveem processamento proteolítico da sequência líder e gene de interesse. No gene de fator de combinação alfa S. cerevisiae corresponde aos residos de aminoácido 84-89 e é representado pela sequência Lys84-Arg85-Glu86- Ala87-Glu88-Ala 89. A sequência Lys-Arg corresponde ao sítio de reconhecimento protease KEX2 enquanto a sequência Glu-Ala-Glu-Ala corresponde a dipeptidilaminopeptidase duplicado ou sítio de reconhecimento STE13. Em certas modalidades, um fragmento de DNA codificando o sinal de fator alfa do aminoácido 89 S. cerevisiae, região de codificação de própeptídeo, e região de codificação espeaçadora nativa inteira (isto é, os resíduos de 89 aminoácidos de terminal N da proteína precursora de fator de combinação alfa contendo ambos o sítio de divagem de protease Lys-Arg KEX2 em resíduos 84 e 85 bem como dipeptidilaminopeptidase Glu-Ala-Glu-Ala ou sítio de reconhecimento STE 13 no resíduo 86-89 é operativamente ligado à sequência que codifica a proteína

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MtDef4 madura. Quando os 89 aminoácidos de terminal N da proteína precursora de fator de combinação alfa são fundidas no terminal N de uma proteína heteróloga tal como MtDef4, a sequência de própeptídeo é tipicamente dissociado da proteína heteróloga via a clivagem por proteases de levedura endógena nos sítios de reconhecimento KEX2 ou STE13. Em outras modalidades, um fragmento de DNA codificando o menor peptídeo de sinal de fator alfa de 85 aminoácido Saccharomyces cerevisiae, pró-peptídeo e elemento espaçador KEX2 (isto é, os resíduos de 85 aminoácidos Terminal N da proteína precursora de fator de casamento alfa contendo apenas o sítio de clivagem de protease Lys-Arg KEX2 nos resíduos 84 e 85) é operativamente ligado à sequência de codificação da proteína MtDef4 madura. Quando os 85 aminoácidos Terminal N da proteína precursora de fator de combinação alfa são fundidos no N-terminal de uma proteína heteróloga tal como MtDef4, a sequência de pró-peptídeo é tipicamente dissociada da proteína heteróloga via clivagem pelas proteases de levedura endógenas no sítio de reconhecimento KEX2. A proteína MtDef4 pode assim ser expressa sem as repetições glu-ala.

[00101] Para obter leveduras transformadas que expressam MtDef4, os cassetes de expressão de MtDef4 de levedura (isto é, promotor de levedura, sequência de codificação de peptídeo de sinal de levedura, sequência madura de MtDef4, e sequência de poliadenilação) são tipicamente combinados com outras sequências que proveem seleção de levedura transformada. Exemplos de genes de marcador selecionável úteis incluem, mas na são limitados a, genes que codificam uma proteína ADE, uma proteína HIS5, uma proteína HIS4, uma proteína LEU2, uma proteína URA3, Proteína ARG4, uma proteína TRP1, uma proteína LYS2, uma proteína conferindo resistência a um antibiótico de bleomicina ou fleomicina, uma proteína conferindo resistência a cloranfenicol, uma proteína conferindo resistência a G418 ou

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55/117 geneticina, uma proteína conferindo resistência a higromicina, uma proteína conferindo resistência a metotrexato, uma proteína AR04OFP, e uma proteína FZV 1-4.

[00102] Moléculas de DNA compreendendo os cassetes de expressão de MtDef4 de levedura e genes de marcador selecionável são introduzidas em células de levedura por técnicas tais como transfecção em esferoplastos de levedura e eletroporação. Em certas modalidades da invenção, as moléculas de DNA que compreendem os cassetes de expressão de MtDef de levedura e os genes de marcador selecionável são introduzidas como fragmentos de DNA linear que são integrados no genoma da célula hospedeiro de levedura transformada. A integração pode ocorrer ou em sítios aleatórios no genoma da célula hospedeiro de levedura ou em sítios específicos no genoma da célula hospedeiro de levedura. A integração em sítios específicos no genoma de céula hospedeiro de levedura é tipicamente acompanhado por recombinação homóloga entres sequências contidas no vetor de expressão e sequências no genoma da célula hospedeiro de levedura. Recombinação homóloga é tipicamente realizada linearizando o vetor de expressão dentro da sequência homóloga (isto é, por exemplo, dentro da sequência de promotor AOX1 de um vetor de expressão Pichia ao integrar o vetor de expressão no gene AOX1 endógeno na célula hospedeiro Pichia). Em outras modalidades da invenção, os cassetes de expressão de levedura podem também compreender sequências adicionais tais como sequências de replicação autônoma (ARS) que proveem replicação de DNA contendo o cassete de expressão como um elemento extrascromossômico (isto é, não-integrado). Tais elementos extracromossômicos são tipicamente mantidos em células de levedura por seleção contínua para a presença do gene de marcador selecionável ligado. Cromossomas artificiais de levedura (YACs) contendo sequências que proveem replicação e transmissão miótica são outro tipo

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56/117 de veotr que pode ser usado para manter a construção de DNA em um hospedeiro de levedura.

Métodos para Produzir Proteína MtDef4 em Levedura [00103] Células de levedura transformadas com os cassetes de expressão MtDef4 de levedura podem também ser usadas para produzir a proteína MtDEf4. Esta proteína MtDef4 pode ser usada diretamente como um agente antifúngico, como um imunogênio para aumentar anticorpos que reconhecem a proteína MtDef4, ou como um padrão de referência em kits para medir concentrações de proteína MtDef4 em várias amostras. Os métodos de produzir proteína MtDef4, tipicamente, primeiro compreendem a etapa de cultivar células de levedura transformadas com os cassetes de expressão de MtDef4 sob condições em que a célula de levedura expressa um polipeptídeo MtDef4 maduro. Em geral, as condições onde a célula de levedura expressa o polipeptídeo MtDef4 maduro são condições que permitem ou especificamente induzem expressão de promotor de levedura que é operativamente ligado ao gene MtDef4 no cassete de expressão de levedura. Quando a levedura é Pichia e o gene MtDef4 / peptídeo de sinal está sob o controle de um promotor AOX 1 ou AOX2, adição de metanol aos meios de crescimento provê expressão de proteína MtDef4 madura. Similarmente, quando a levedura é Hansuela e o gene MtDef4 / peptídeo de sinal está sob o controle de um promotor MOX, DHAS, ou FMDH, adição de metanol aos meios de crescimento irá prover expressão de proteína MtDef4 madura. Alternativamente, quando a levedura é Kluveromyces e o gene MtDef4 / peptídeo de sinal está sob o controle de um promotor de lactase, adição de galactose aos meios de crescimento irá prover expressão de proteína MtDef4 madura.

[00104] Uma vez que a cultura de levedura transformada foi incubada nas condições de cultura que proveem expressão de MtDef4 madura por um período suficiente de tempo, a proteína MtDef4 maduPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 64/229

57/117 ra pode ser isolada da cultura. Um período suficiente de tempo pode ser determinado cultivando periodicamente porções ou alíquotas da cultura e ensaiando para a presença de MtDef4 madura. Ensaios analíticos tais como SDS-PAGE com coloração de proteína, análise Western Blot, ou qualquer método de imunodetecção (isto é, tal como um ELISA) pode ser usado para monitorar a produção de MtDef4. Por exemplo, incubação na presença de metanol por entre 1 a 8 dias é suficiente para prover expressão de MtDef4 madura a partir do promotor A0X1 em Pichia.

[00105] O isolamento da proteína MtDef4 da cultura pode ser parcial ou completa. Para vetores de expressão de MtDef4 onde um peptídeo de sinal de levedura é operativamente ligado à sequência que codifica a proteína MtDef4 madura, a proteína MtDef4 madura pode ser recuperada dos meios de cultura de célula de levedura. Meios de cultura de célula de levedura que contêm a proteína MtDef4 madura podem ser separados das células de levedura por centrifugação ou filtração, assim efetuando isolamento de proteína MtDef4 madura. Os meios de cultura de célua de levedura que contêm a proteína MtDef4 madura podem ser adicionalmente processados por qualquer combinação de diálise e/ou técnicas de concentração (isto é, precipitação, liofilização, filtração) para produzir uma composição contendo a proteína MtDef4. Produção de proteína MtDef4 pode também compreender etapas de purificação adicionais que resultam ou em uma preparação ou pacialmente pura ou completamente pura da proteína MtDef4. Para efetuar tal purificação, filtração de membranas por exclusão de tamanho pode ser usada. Alternativamente, vários tipos de técnicas de cromatografia tais como cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia por troca de íon, ou cromatografia por afinidade podem ser usados para produzir uma preparação ou parcialmente pura ou completamente pura da proteína MtDef4.

[00106] Combinações de várias técnicas de isolamento podem

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58/117 também ser empregadas para produzir a proteína MtDef4 madura. Por exemplo, o meio de cultura celular pode ser separado das células por centrifugação e dializado ou ajustado. Um tampão preferido para diálise ou ajuste é um tampão de acetato de sódio de 25 mM a erca de pH

4,5-pH 6.0. Este dializato é em seguida submetido a cromatrografia de troca de íon. Por exemplo, uma resina de troca catiônica tal como CMSephadex C-25 equilibrada com um tampão de sódio de 25mM a cerca de pH6.0 pode ser usada. Proteína MtDef4 ligada à resina de troca catiônica é lavada e em seguida eluída. Por exemplo, a coluna acima mencionada é lavada com 25mM de tampão de acetato de sódio a cerca de pH 6.0 e subsequentemente eluída em 1M NaCl, 50mM Tris, pH 7.6. Frações contendo a proteína de defensina são identificadas por um ensaio ou uma absorvência UV e em seguida concentrada por uma membrana de filtração por corte de tamanho. A proteína MtDef4 concentrada é em seguida dializada para obter uma proteína MtDef4 essencialmente pura em um tampão desejável. Tampões desejáveis incluem, mas não são limitados a, tampões tais como 10 mM Tris, pH 7.6. Peptídeos, Polipeptídeos, e Proteínas Contendo Mudanças de Aminoácido Conservadoras na Sequência de Polipeptídeo MtDef4 [00107] Peptídeos, polipeptídeos, e proteínas biológica e funcionalmente equivalentes a MtDef4 incluem, mas não são limitados a, sequências de aminoácido contendo sustituições de aminoácidos conservadoras nas sequências de proteína MtDef4 madura. Exemplos de proteínas MtDef4 maduras que podem ser substituídas para obter equivalentes biológicos incluem, mas não são limitadas a, sequência de consenso MtDef4 (SEQ ID NO: 71), 30-76 aminoácido de AL386553 (SEQ ID NO: 105), MtDef4.1 (SEQ ID NO:112), MtDef4.2 (SEQ ID NO:114), MtDef4.3 (SEQ ID NO:116), MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:125), MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO:135), MtDef4.1 (H33R, C14S, C34S) (SEQ ID NO:136), MtDef4.1 (H33R, C20S,

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C41S) (SEQ ID NO: 137), e MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138). Peptídeos, polipeptídeos, e proteínas biológica e funcionalmente equivalente a MtDef4 também incluem, mas não são limitados a, sequências de aminoácido contendo substituições de aminoácidos conservadoras nas sequências de pró-proteína MtDef4. Exemplos de pró-proteínas que podem ser substituídas para obter equivalentes biológicos incluem, mas não são limitados a, uma sequência de consenso de pró-proteína MtDef (SEQ ID NO: 99), uma sequência de próproteína MtDef4 AL385796 (SEQ ID NO:77), AW573770 (SEQ ID NO:78), AL386553 (SEQ ID NO:80), AL386552 (SEQ ID NO:81), BE999096 (SEQ ID NO:87), uma sequência de pró-proteína MtDef4.1 (SEQ ID NO:111), uma sequência de pró-proteína MtDef4.2 (SEQ ID NO: 113), e uma sequência de pró-proteína MtDef4.3 (SEQ ID NO: 115). Em tais sequências de aminoácido, um ou mais aminoácidos na sequência são substituídos por outros aminoácidos, a carga e a polaridade dos quais são similares aquela do aminoácido nativo, isto é, substituições de aminoácido conservadoras, resultando em uma mudança silenciosa. [00108] Substitutos para um aminoácido dentro da sequência de polipeptídeo MtDef4 podem ser selecionados de outros membros da classe a qual o aminoácido de ocorrência natural pertence. Aminoácidos podem ser divididos nos seguintes qutro grupos: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácido básicos; (3) aminoácidos polares neutros; e (4) aminoácidos não-polares neutros. Aminoácidos representativos dentro desses vários grupos incluem, mas não são limitados a: (1) aminoácidos ácidos (negativamente carregados) tais como pacido aspártico e ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (positivamente carregados) tais como arginina, histidina, e lisina; (3) aminoácidos polares neutros tais como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina, e glutamina; (4) aminoácidos não polares neutros (hidrofóbicos) tais como alanaina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina,

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60/117 triptofano e metionina.

[00109] Mudanças de aminoácido conservadores dentro da sequência de polipeptídeo MtDef4 podem ser por substituição de um aminoácido dentro de um desses grupos com outro aminoácido dentro do mesmo grupo. Equivalentes biologicamente funcionais de MtDef4 podem ter 10 ou menos mudanças de aminoácido conservadores, mais particularmente sete ou menos mudanças de aminoácidos conservadores, e o mais preferível cinco ou menos mudanças de aminoácido conservadores. A sequência de nucleotídeo de codificação (gene, DNA de plasmídeo, cDNA ou DNA sintético) irá assim ter substituições de base correspondentes, permitindo a ela codificar formas de equivalentes biologicamente funcionais de MtDef4.

[00110] Os peptídeos, polipeptídeos e proteínas de equivalente biologicamente funcional, contemplados aqui devem possuir cerca de 70% ou mais de identidade de sequência, preferivelmente cerca de 85% ou mais de identidade de sequência, e o mais preferível cerca de 90% a 95% ou mais de identidade de sequência, para a sequência de, ou correspondente a porção dentro de, sequ~enca MtDef4 de polipeptídeo. Em certas modalidades da invenção, peptídeos, polipeptídeos e proteínas de equivalente biologicamente funcional possuem cerca de 80% ou mais de identidade de sequência, preferivelmente cerca de 85% ou mais de identidade de sequência, e o mais preferível cerca de 90% a 95% ou mais de identidade de sequência, para a sequência de MtDef4.1 (SEQ ID NO:112).

[00111] Como indicadas, modificação e mudanças podem ser feitas na estrutura dos peptídeos da presente invenção e segmentos de DNA que a codificame ainda obter uma molécula funcional que codifica uma proteína ou um peptídeo com características desejáveis. A seguir, uma discussão com base na mudança de aminoácidos de uma proteína para criar um equivalente, ou mesmo uma molécula de segunda geração

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61/117 melhorada. Em modalidades particulares da invenção, proteínas MtDef4 mutantes são contempladas para serem úteis no aumento da atividade antifúngica da proteína, e consequentemente aumentar a atividade antifúngica e/ou expressão do transgene reeombinante em uma célula de planta. As mudanças de aminoácido podem ser alcançadas mudando os códons da sequência de DNA, de acordo com os códons dados na tabela 2.

TABELA 2

Aminoácidos	Códigos dos aminoácidos	Códons
Alanina	Ala (A)	GCA GCC GCG GCU
Cisteína	Cys(C)	UGC UGU
Ácido aspártico	A$p (D)	GAC GAU
Ácido glutâmico	Glu (E)	GAAGAG
Fenilalanina	Phe(F)	UUCUUU
Glicina	Gly(G)	GGA GGC GGG GGU
Histidina	His (H)	CAC CAU
Isoleucina	Ile (1)	AUAAUC AUU
Lisina	Lys(K)	AAAAAG
Leucina	Leu (L)	UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina	Met(M)	AUG
Asparagina	Asn(N)	AAC AAU
Prolina	Pro (P)	CCA CCC CCGCCU
Glutamina	Gln(Q)	CAA CAG
Arginina	Arg(R)	AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina	Ser(S)	AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina	Thr (T)	ACA ACC ACG ACU
Valina	Vai (V)	GUA GUC GUG GUU
Triptofano	Tip(W)	UGG
Tirosina	Tyr(Y)	UAC UAU

[00112] Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda

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62/117 apreciável de atividade bioquímica ou biológica. Uma vez que é a capacidade de intração e natureza de um aproteína que define tal atividade funcional biológica da proteína, certas substituições de sequência de aminoácido podem ser feitas em uma sequência de proteína, e, claro, sua sequência de codificação de DNA subjacente, e todavia obter uma proteína com propriedades similares. É assim contemplado pelos inventores que várias mudanças podem ser feitas nas sequências de peptídeo das composições descritas, ou sequências de DNA correspondentes que codificam tais peptídeos sem perda apreciável de sua utilidade biológica ou atividade.

[00113] Ao fazer tais mudanças, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácidos hidropáticos na conferência de função biológica interativa em uma proteína é geralmente compreendida na técnica (Kyte and Doolittle, 1982, incorporado aqui para referência). É apreciado que o caráter hidropático das contribuições de aminoácido da estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e similares.

[00114] A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático na base de sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte and Doolittle, 1982). Esses são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (- 0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (3,5); aspartato (-3,5); aspargina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (- 4,5). [00115] É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice hidropático similar ou pontuação e ainda resultam em uma proteína com atividade biológica similar isto é, ainda obtêm uma proteína funcionalmente equivaPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 70/229

63/117 lente biológica. Ao fazer tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +-2 é preferida, aqueles que estão dentro de +-1 são particuiarmente preferidos, e aqueles que estão dentro de +- 0,5 são ainda mais particuiarmente preferidos.

[00116] É também compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser feita efetivamente na base de hidrofilicidade. A patente U.S N° 4.554.101, incorporada aqui para referência, declara que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a propriedade biológica da proteína.

[00117] Cmo detalhado na Patente norte-americana N° 4,554,101, os seguintes valores de hidrofilicidadetêm sido atribuídos a resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0.+ 0,1); glutamato (+3,0.± 0,1); serina (+0,3); aspargina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5.+ 0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (3,4).

Substituições não-Conservadoras nos Polipeptídeos MtDef4 [00118] É adicionalmente reconhecido que substituições nãoconservadoras nas sequências de polipeptídeo podem ser feitas para obter polipeptídeos MtDef4 que são os equivalentes biológicos funcionais dos polipeptídeos MtDef4 descritos aqui. Nesses casos, as substituições não-conservadoras podem simplesmente ser testadas para inibição de crescimento fúngico para identificar subtituições que proveem equivalentes biológicos funcionais de um dado polipeptídeo MDef4. Exemplos de substituições em um polipeptídeo MtDef4 que proveem equivalentes funcionais biológicos incluem, mas não são limitados a, substituições de um resíduo de serina para um resíduo de cisteína no polpeptídeo MtDef4 (H33R) para fornecer os equivalentes

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64/117 fncionais ativos biológicos MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO: 135), MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S)(SEQ ID NO: 136), MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO: 137), e MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138).

Fragmentos e Variantes de MtDef4:

[00119] Enquanto o polipeptídeo antifúngico da presente invenção preferivelmente compreende uma sequência de proteína MtDef4 madura, fragmentos e variantes desta sequência possuindo a mesma ou atividade antifúngica similar como aquela desta proteína antifúngica são também englobados pela presente invenção. Assim as sequências de pelo menos 8 ou mais aminoácidos em uma proteína madura MtDef4 com atividade antifúngica são antecipados por esta invenção. Fragmentos ou variantes de MtDef4 com atividade antifúngica que são antecipados por esta invenção podem também compreender substituições de aminoácido, deleções, inserções ou adições em uma sequência de proteína MtDef4.

[00120] O polipeptídeo antifúngico da presente invenção preferivelmente compreende a sequência de proteína MtDef4 madura (SEQ ID NO: 112), fragmentos e variantes desta sequência possuindo a mesma ou atividade antifúngica similar como aquela desta proteína antifúngica como aquela desta proteína antifúngica MtDef4 são também englobados pela presente invenção são antecipados por esta invenção. Assim sequências contíguas de pelo menos 8 ou mais aminoácidos na SEQ ID NO: 112 com atividade antifúngica são antecipados por esta invenção. Os fragmentos ou variantes com atividade antifúngica que são antecipados por esta invenção também podem compreender substituições de aminoácido, deleções, inserções, ou adições da sequência mostrada em SEQ ID NO: 112.

[00121] Fragmentos da proteína MtDef4 madura podem ser formas truncadas em que um ou mais aminoácidos são deletados da extremiPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 72/229

65/117 nade do terminal-N, extremidade do terminal-C, do meio da proteína, ou combinações dos mesmos com atividade antifúngica são também antecipados por esta invenção. Esses fragmentos podem ser de ocorrência natural ou mutantes sintéticos de Mtdef4, e reter a atividade antifúngica de MtDef. Uma proteína MtDef preferida que pode ser usada para obter derivados truncados com atividade antifúngica é a proteína MtDef de SEQ ID NO:112.

[00122] Variantes de MtDef4 incluem formas em que um ou mais aminoácidos têm sido inseridos na sequência natural. Essas variantes podem também ser de ocorrência natural ou mutantes sintética de MtDef4, e devem reter a atividade antifúngica de MtDef4.

[00123] Combinações dos acima mencionados, isto é, formas do polipeptídeo antifúngico contendo ambas as deleções de aminoácidos e adições, são também englobadas pela presente invenção. Substituições de aminoácidos podem também ser apresentadas aqui.

[00124] Os fragmentos e variantes de MtDef englobadas pela presente invenção devem preferivelmente possuir cerca de 70 a 75 % ou mais de identidade de sequência, mais preferivelmente cerca de 80%, 85%, 88% ou mais de identidade de sequência, e o mais preferível cerca de 90% a 95% ou mais de identidade de sequência de aminoacido, para corresponder a regiões da Proteína MtDef4 madura tendo a sequência de aminoácido correspondente mostrada em SEQ ID NO: 112.

Uso de Relações de Função de Estrutura de Denfensina para Projetar

Variantes MtDef4 [00125] As proteínas MtDef4 são membros da família do gene Defensina e são assim atecipadas para possuir certas propriedades estruturais e bioquímicas compartilhadas pelas Defensina. Em particular, as proteína MtDef4 são antecipadas para possuir um motivo α/β estabilizado por cisteína, composto de três β-fitas antiparalelos e uma aPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 73/229

66/117 hélice, que são tipicamente observados em proteínas de Defensina (Almeida et al, J. Mol. Biol. (2002) 315, 749-757; Thomma et al, Planta (2002) 216: 193-202). Sem ser limitado à teoria, a homologia estrutural entre MtDef e outras defensinas pode ser usada para identificar variantes que possuem atividade antifúngica similar ou mesmo aumentada. [00126] Alternativamente, as características estruturais conservadas das defensinas MtDef4 podem também ser usadas para construir derivados de MtDef4 variante com outras propriedades desejáveis. [00127] Por exemplo, os 8 resíduos de cisteína canônica de MtDef4 que tipicamente foram ligações de dissulfeto em proteínas de Defensina iriam tipicamente ser conservados ou mantidos em quaisquer variantes MtDef4. O par previsto de ligações de dissulfeto em MtDef é entre resíduos de cisteína 3 e 47, 14 e 34, 20 e 41, e 24 e 43. Assim, Cys-par 1 é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cys3-Cys47, Cys-par 2 é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cysl4-Cys34, Cys-par 3 é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cys20-Cys41, e Cys-pair 4 é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cys24-Cys43. Enquanto não sendo limitado pela teoria, acredita-se que variantes de cisteína MtDef4 que faltam uma ou mais ligações de dissulfeto podem ser desejáveis para uso em plantas transgênicas que são finalmente usadas como alimentação animal ou como alimentos para consumo humano tal com variantes previstas para serem mais prontamente digeridas por animal ou seres humanos que consomem os produtos transgênicos. Proteínas variantes de MtDef4 que meia-vida mais curta no trato digestivo de animais ou seres humanos são em teoria antecipados para ter menos potencial para se tornarem alergênios de alimento. Seria assim desejável projetar derivados de defensina MtDEf4 que têm menos ligações de dissulfeto ainda retém atividade antifúngica. As variantes de cisteína MtDef4 MtDef4.1 (H33R,C3 S,C47S( SEQ ID NO:135),

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MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) (SEQ ID NO:136), MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO:137), e MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138) todos faltam ligações de dissulfeto previstas ainda retém atividade antifúngica. Consequentemente, cada uma dessas variantes é prevista para ser mais prontamente digerida quando consumidas por humanos ou animais.

Outras Formas Equivalentes Biologicamente Funcionais de MtDef4 [00128] Outras formas equivalentes biologicamente funcionais de MtDef4 úteis na presente invenção incluem conjugados dos polipeptídeos, ou formas equivalentes biologicamente funcionais dos mesmos como descrito acima, com outros peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas, produtos de fusão de formação com os mesmos exibindo a mesma, similar ou maior atividade antifúngica quando comparada com aqueles de MtDef4 tendo a sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 112.

[00129] Coexpressão simultânea de múltiplas proteínas antifúngica e/ou antipatogênicas em plantas é vantajosa em que ela explora mais do que um modo de controle de patógenos de planta. Isto pode, onde onde duas ou mais proteínas antifúngicas são expressas, minimizar a possibilidade de desenvolver espécies fúngicas, ampliar o escopo de esistência e potencialmente resultar em um efeito antifúngico sinergístico, desse modo melhorando o nível de resistência.

Mutagênese de Sítio Específico [00130] Mutagêneses de sítio específico é uma técnica útil na preparação de peptídeos individuais, ou proteínas ou peptídeos equivalentes biologicamente funcionais, através de mutagênese específica do DNA que codifica a proteína. A técnica adicionalmente provê uma capacidade pronta de preparar e testar variantes de sequência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações acima mencionadas, introduzindo uma ou mais mudanças de sequência de nucleoPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 75/229

68/117 tídeo no DNA. Mutagênese de sítio específico permite a produção de mutantes através do uso de sequências de oligonucleotídeos específicos que codificam a sequência de DNA da mutação desejada, bem como um número suficiente de nucleotídeos adjacentes, para prover uma sequência de tamanho suficiente e complexidade de sequência para formar um dúplex estável em ambos os lados da junção de deleção sendo cruzada. Tipicamente, um iniciador de cerca de 17 a 25 nucleotídeos em comprimento é preferido, com cerca de 5 a 10 resíduos em ambos os lados da junção da sequência sendo alterada.

[00131] Em geral, a técnica de mutagênese de sítio específico é bem conhecida na técnica, como exemplificada por várias publicações. Como será apreciado, a técnica tipicamente emprega um vetor de fago que existe em ambas as formas de fita dupla e fita simples. Vetores típicos úteis em mutagênese direcionada a sítio incluem vetores tais como o fago M13. Esses vetores de fago são prontamente disponíveis comercialmente e seu uso é geralmente bem conhecido por aqueles versados na técnica. Plasmídeos de fita dupla são também rotineiramente empregados na mutagênese direcionada a sítio que elimina a etapa de trasnferir o gene de interesse de um plasmídeo para um fago, kits comercialmente disponíveis para realizar mutagênese são também diponíveis e podem ser usados. Kits exemplares incluem o os kits direcionados a sítios QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA, USA). [00132] Em geral, mutagênese direcionada a sítio de acordo com este documento é realizada primeiramente obtendo um vetor de fita única ou fusão separadas de duas fitas de um vetor de fita dupla que inclui dentro de sua sequência de DNA que codifica o peptídeo desejado. Um iniciador de oligonucleotídeo portando a sequência mutada desejada é preparado, geralmente de forma sintética. Este iniciador é em seguida anelado com o vetor de fita simples, e submetido a enzimas de polimerização de DNA tais como fragmento I Klenow de poliPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 76/229

69/117 merase de E. coli, a fim de completar a síntese do fita que porta a mutação. Assim, um heterodúplex é formado em que uma fita codifica a sequência não-mutada original e o segunda fita porta a mutação desejada. Este vetor heterodúplex é em seguida usado para transformar células apropriadas, tais como células de E. coli, e clones são selecionados os quais incluem vetores recombinantes portando a disposição de sequência mutada.

[00133] A preparação de variantes de sequência dos segmentos de DNA de codificação de peptideo selecionados usando mutagênese de sítio específico é provida como um meio de produzir espécies potencialmente úteis e não significa estar limitando assim como existem outras formas nas quais as variantes de sequência de peptídeos e as sequências de DNA que as codificam podem ser obtidas. Por exemplo, vetores recombinantes que codificam a sequência de peptideo desejada podem ser tratados com agentes de mutagênese, tais como hidroxilamina, para obter variantes de sequência.

Composições de Anticorpo MtDef4 e Métodos de Preparar anticorpos [00134] Em modalidades particulares, os inventores contemplam o uso de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam a proteínas MtDef4 descritas aqui. Meios para preparar e caracterizar anticorpos são bem conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1999; incorporado aqui para referência). Os métodos para gerar naticorpos monoclonais (mAbs) geralmente estando junto das mesmas linhagens como aqueles para preparar anticorpos policlonais. Brevemente, um anticorpo policlonal é preparado imunizando um animal com uma composição imunogênica de acordo com a presente invenção e coletando antissoro a partir daquele animal imunizado. Uma ampla faixa de espécies de animal pode ser usada para a preparação de antisoro. Tipicamente o animal usado para a produção de antissoro é um coelho, um camunPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 77/229

70/117 dongo, um rato, um hamster, um porquinho da índia, ou uma cabra. Devido ao volume de sangue relativamente alto de coelhos, um coelho é uma escolha preferida para a produção de anticorpos policlonais. [00135] Como é bem conhecida na técnica, uma dada composição pode variar em sua imunogenicidade. É frequentemente necessário, portanto, incentivar o sistema imune hospedeiro, como pode ser alcançado acoplando um peptídeo ou proteína imunogênica a um veículo. Veículos exemplares e preferidos keyhole limpet hemocyanin (KLH) e alumina de soro bovino (BSA). Outras albuminas tais como ovalbumina, albumina de soro de camundongo ou albumina de soro de coelho podem também ser usadas como veículos. Meios para conjugar um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína para uma proteína de veículo são bem conhecidos na técnica e incluem o uso de glutaraldeído, éster de m-maleimidobencoil-N-hidroxisuccinimida, carbodi-imida e benzidina bis-biazotizada.

[00136] Como é bem conhecida na técnica, a imunogenicidade de uma composição imunogênica particular pode ser melhorada pelo uso de simuladores não-específicos da resposta imune, conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes exemplares e preferidos incluem adjuvante de Freund completo (um estimulador não-específico) da resposta imune contendo Microbacterium tuberculosis morta), adjuvants de Freund incompletos e adjuvante de hidróxido de alumínio.

[00137] A quantidade de composição imunogênica usada na produção de anticorpos policlonais varia da natureza do imunogênio bem como o animal usado para imunização. Uma variedade de rotas pode ser usada para administrar o imunogênio (subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada por amostra de sangue do animal imunogenizado em vários pontos seguindo imunização. Uma segunda injeção, impulsionadora, pode também ser dada. O processo de impulPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 78/229

71/117 so e titulação é repetido até que uma titulação adequada seja alcançada. Quando o nível de imunogenicidade é obtido, o animal imunogenizado pode ser misturado e o soro isolado e armazenado, e/ou o animal pode ser usado para gerar mAbs.

[00138] Anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser prontamente proeparados através do uso de técnicas bem conhecidoas, tais como aquelas exemplificadas na Patente norte-americana N° 4,196,265, incorporada aqui para referência. Tipicamente, esta técnica envolve imunizar um animal adequado com uma composição imunogênica adequada selecionada, por exemplo, uma proteína antifúngica purificada ou parcialmente purificada. A composição de imunização é administrada em uma maneira a efetiva para estimular a produção de células. Roedores tais como camundongos e ratos são animais preferidos, entretanto, o uso de células de coelho, ovelha, ou sapo é também possível. O uso de ratos pode prover certas vantagens, mas camundongos são preferidos, com o camundongo BALB/c sendo o mais preferido assim como é o mais rotineiramente usado e geralmente dá uma alta porcentagem de fusões estáveis.

Seleção de Proteína MtDef4 e Kits de Detecção [00139] A presente invenção contempla métodos e kits para amostras de seleção suspeitas de conter proteínas MtDef4 ou polipeptídeos relacionados a proteínas MtDef4, ou células que produzem tais polipeptídeos. Nas modalidades particulares contempladas aqui MtDef4, os métodos e kits detectam a proteína MtDef4, um kit pode conter um ou mais anticorpos da presente invenção, e pode conter também certos reagentes para detectar uma interação entre uma amostra e um anticorpo da presente invenção. Os reagentes providos podem ser radio, fluorescente, ou enzimaticamente rotulados. O kit pode conter um agente radiorrotulado capaz de ligar ou interagir com um ácido nucleico ou anticorpo da presente invenção.

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72/117 [00140] Os reagentes do kit podem ser providos como uma solução líquida, anexada a um suporte sólido ou como pó seco. Preferivelmente, quando os reagentes são providos em uma solução líquida, a solução líquida é uma solução aquosa. Preferivelmente, quando os reagentes são anexados a um suporte sólido, o suporte sólido pode ser meios de cromatografia, uma placa de teste tendo uma pluralidade de cavidades, ou um slide microscópico. Quando os reagentes providos são um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado, que pode ser proviso.

[00141] Em ainda modalidades adicionais, a presente invenção refere-se a métodos de imunodetecção e kits associados. É proposto que as proteínas MtDef4 ou peptídeos da presente invenção possam ser empregados para detectar anticorpos tendo reatividade com os mesmos, ou, alternativamente, anticorpos preparados de acordo com a presente invenção, podem ser empregados para detectar proteínas MtDef4 ou peptídeos contendo epítopo relacionado com proteína MtDef4. Em geral, esses métodos irão incluir primeiramente obtendo uma amostra suspeita de conter tal uma proteína, peptídeo, ou anticorpo, contactando a amostra com um anticorpo ou um peptídeo de acordo com a presente invenção, como o caso pode ser, sob condições efetivas para permitir a formação de um imunocomplexo, e em seguida detectar a presença do imunocomplexo.

[00142] Em geral, a detecção de formação de imunocomplexo é quase bem conhecida na técnica e pode ser alcançada através da aplicação de numerosas abordagens. Por exemplo, a presente invenção contempla a aplicação de ELISA, RIA, immunoblot (por exemplo, blot de ponto), técnicas de imunofluorescência indireta e similares. Geralmente, a formação de imunocomplexo será detectada através do uso de um rótulo, tal como um radiorrótulo, ou uma etiqueta de enzima (tal como uma fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, ou

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73/117 similares). Claro, pode-se encontrar vantagens adicionais através do uso de um segundo ligante de ligação tal como um segundo anticorpo ou uma disposição de ligação de ligante de biotina / avidina, como é conhecido na técnica.

[00143] Para finalidades de ensaio, é proposto que virtualmente qualquer amostra suspeita de compreender uma proteína MtDef4 ou peptídeo ou um peptídeo relacionado com proteína MtDef4 ou anticorpo procurado ser detectado, como o caso pode ser, pode ser empregado. É contemplado que tais modalidades podem ter aplicação na titulação de amostras antígenas ou de anticorpo, na seleção de hibridomas, e similares. Nas modalidades relacionadas, a presente invenção contempla a preparação de kits que podem ser empregados para detectar a presença de proteínas MtDef4 ou peptídeos relacionados e/ou anticorpos em uma amostra. Amostras podem incluir células, sobrenadantes de células, suspensões de células, extratos de células, frações de enzima, extratos de proteína, ou outras composições livres de células suspeitas de conter proteínas MtDef4 ou petídeos. Falando de modo geral, kits de acordo com a presente invenção irão incluir uma proteína MtDef4 adequada, peptídeo ou um anticorpo direcionado contra tal uma proteína ou peptídeo, juntamente com um reagente de imunodetecção para detectar complexos de anticorpo / antígeno, instruções para o uso desses materiais, e meios para conter o anticorpo ou antígeno e reagente. O reagente de imunodetecção irá tipicamente compreender um rótulo associado com o anticorpo ou antígeno, ou associado com um segundo ligante de ligação. Ligantes exemplares incluem um anticorpo secundário direcionado contra o primeiro anticorpo ou antígeno ou um ligante de biotina ou avidina (ou estreptavidina) tendo um rótulo associado. Claro, como notado acima, um número de rótulos exemplares é conhecido na técnica e todos tais rótulos podem ser empregados em conexão com a presente invenção.

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74/117 [00144] O recipiente irá geralmente incluir um frasco no qual o anticorpo, antígeno ou reagente de detecção pode ser colocado, e preferivelmente aliquotado de modo adequado. Os kits da presente invenção irão tipicamente incluir meios para conter os recipientes de anticorpo, antígeno, e reagente em confinamento fechado para venda comercial. Tais recipientes podem incluir injeção ou recipientes moldados por sopro nos quais os frascos desejados são retidos.

Composições Compreendendo Sequências de Núcleo de Epitópico [00145] A presente invenção é também direcionada a composições de proteína ou peptídeo, livres de células totais e outros peptídeos, que compreendem uma proteína purificada ou peptídeo que incorpora um epítopo que é imunologicamente reativo cruzado com um ou mais anticorpos de proteína anti-MtDef4. Em particular, a invenção refere-se a sequências de núcleo epitópico derivadas de proteínas MtDef4 ou peptídeos.

[00146] Como usado aqui, o termo que incorpora um epítopo que é imunologicamente reativo cruzado com um ou mais anticorpos de proteína anti-MtDef4 pretende referir-se a um antígeno de peptídeo ou proteína que inclui uma estrutura primária, secundária ou terciária similar a um epítopo localizado dentro de uma proteína MtDef4 ou polipeptídeo. O nível de similaridade irá geralmente ser a um tal grau que anticorpos monoclonais e policlonais direcionados contra a proteína MtDef4 ou polipetídeo irão também se ligar a, reagir com, ou de outra maneira reconhecer, o peptídeo reativo cruzado ou antígeno de proteína. Vários métodos de imunoensaio podem ser empregados juntamente com tais anticorpos, tais como, por exemplo, Western blot, ELISA, RIA, e similares, todos os quais são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00147] A identificação de epítopos imunodominantes de proteína

MtDef4, e/ou seus equivalentes funcionais, adequados para uso em

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75/117 vacinas em uma matéria relativamente direcionada. Por exemplo, pode-se empregar os métodos de Hopp, como ensinado na Patente norte-americana N° 4,554,101, incorporada aqui para referência, que ensina a identificação e preparação de epítipos a partir de sequências de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Os métodos descritos em muitos outros documentos, e programas de software com base nos mesmos, podem ser também usados ara identificar sequências de núcleo epitópico (vide, por exemplo, Patente norte-americana N° 4,554,101). A sequência de aminoácido dessas sequências de núcleo epitópico podem em seguida ser protamente incorporadas em peptídeos, ou através da aplicação de síntese de peptídeo ou tecnologia recombinante.

[00148] Peptídeos preferidos para uso de acordo com a presente invenção irão geralmente estar na ordem de cerca de 8 a 20 aminoácidos de comprimento, e mais preferivelmente cerca de 8 a 15 aminoácidos de comprimento. É proposto que peptídeos mais curtos derivados de proteína MtDef4 antigênica irão prover vantagens em certas circustâncias, por exemplo, na preparação de ensaios de detecção imunológicos. Vantagens exemplares incluem o caso de preparação e purificação, a reprodutibilidade de produção melhorada e de custo relativamente baixo, e biodistribuição vantajosa.

[00149] É proposto que vantagens particulares da presente invenção possam ser realizadas através da preparação de peptídeos sintéticos que incluem sequências de núcleo modificadas e/ou epitópico estendido / imunogênicas que resultam em um peptídeo epitópico universal direcionado a proteínas MtDef4, e em particular a sequências relacionadas a MtDef4. Essas sequências de núcleo epitópico são identificadas aqui em aspectos particulares como regiões hidrofílicas do antígeno de polipeptídeo particular. É proposto que essas regiões representam aquelas que mais provavelmente promovem estímulo de

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76/117 células T ou células B, portanto, produção de anticorpo específico. [00150] Uma sequência de núcleo epitópico, como usada aqui, é um estiramento relativamente curto de aminoácidos que é complementar a, e portanto, irá se ligar a, sítios de ligação de antígeno nos anticorpos direcionados a proteína MtDef4 descritos aqui. Adicional ou alternativamente, uma sequência de núcleo epitópico é uma que irá elicitar anticorpos que são reativos cruzados com anticorpos direcionados contra as composições de peptídeo da presente invenção. Assim, certas sequências de núcleo epitópico da presente invenção podem ser operacionalmente definidas em termos de sua capacidade de competir com ou talvez, deslocar a ligação do antígeno de proteína desejada com o antissoro direcionado a proteína correspondente. [00151] Em geral, acredita-se que o tamanho do antígeno de polipeptídeo não seja particularmente crucial, tão comprido como se ele fosse pelo menos grande o suficiente para portar a sequência ou sequências de núcleo identificada. A menor sequência de núcleo útil pela presente descrição seria geralmente na ordem de cerca de 8 aminoácidos de comprimento, com sequências na ordem de 10 a 20 aminoácidos sendo mais preferidas. Assim, o tamanho irá geralmente corresponder aos menores antígenos de peptídeo preparados de acordo com a invenção. Entretanto, o tamanho do antígeno pode ser maior onde desejado, tão comprido como se ele contivesse uma sequência de núcleo epitópico básica.

Composições de Proteína Antifúngicas [00152] Uma composição antifúngca, compreendendo uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta antifúngica de um ou mais polipeptídeos antifúngicos isolados da presente invenção é contemplada. Composições preferidas compreendem a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 112, e um veículo aceitável. A composição antifúngica pode ser usada para inibir o crescimento de,

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77/117 ou morte, fungos patogênicos. As composições podem ser formuladas por métodos convencionais tais como aqueles descritos, por exemplo, Winnacker-Kuchler (1986); van Falkenberg (1972-1973); e K. Martens (1979). Auxílios de formulação necessários, tais como veículos, materiais inertes, tensoativos, solventes, e outros aditivos são também bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo em WinnackerKlucher (1986). Usar essas formulações, é também possível para preparar misturas do presente polieptídeo antifúngico com outras substâncias ativas antifúngicas, fertilizadores e/ou reguladores de crescimento, isto é, na forma de formulações terminadas ou misturas em tanque.

[00153] Composições antifúngicas contempladas aqui também incluem aquelas na forma de células hospedeiras, tais como células bacterianas e fúngicas, capazes de produzir o presente polipeptídeo antifúngico, e que podem colonizar raízes /ou folhas de plantas. Exemplos de células bacterianas que podem ser usadas desta maneira incluem cepas de Agrobacterium, Arthrobacter, Azospyríllum, Clavibacter, Escherichia, Pseudomonas, Rhizobacterium, e similares. [00154] Vários antibióticos fúngicos convencionais e fungicidas químicos com os quais o presente polipeptídeo antifúngico pode ser combinado são conhecidos na técnica e são descritos em Worthington and Walker (1983). Esses incluem, por exemplo, polioxinas, nicomicinas, carboxiamidas, carboidratos aromáticos, carboxinas, morfolinas, inibidores de biossíntese de esterol, e compostos organofosforosos. Outros ingredientes ativos que podem ser formulados em combinação com o presente polipeptídeo antifúngico incluem, por exemplo, inseticidas, isca inseticida, agentes de esterilização, acaricidas, nematicidas, e herbicidas. A Patente norte-americana N° 5,421,839 contém um resumo compreensivo dos muitos agentes ativos com os quais substâncias tais como o presente polipeptídeo antifúngico podem ser forPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 85/229

78/117 muladas.

[00155] Se sozinho ou em combinação com outros agentes ativos, polipetídeos antifúngicos da presente invenção devem ser aplicados em uma concentração na faixa de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, preferivelmente entre cerca de 5 mg/ml e cerca de 50 mg/ml, em um pH na faixa de cerca de 3 a cerca de 9. Tais composições podem ser tamponadas usando, por exemplo, tampões de fosfato entre cerca de 10 mM e 100 mM, mais preferivelmente entre cerca de 15 mM e 50 mM.

[00156] Proteínas MtDef4 e equivalentes biologicamente funcionais são, portanto, esperados como sendo úteis no controle de fungos em uma ampla variedade de plantas, exemplificados por aqueles nos seguintes gêneros e espécie: Alternaria (Alternaria brassicola; Alternaria solaríi); Ascochyta (Ascochyta pisi); Botrytis (Botrytis cinerea); Cercospora (Cercospora kikuchii; Cercospora zeae-maydis); Colletotrichum (Colletotrichum lindemuthianum); Diplodia (Diplodia maydis); Erysiphe (Erysiphe graminis f.sp. graminis; Erysiphe graminis f.sp. hordei); Fusarium (Fusarium nivale; Fusarium oxysporum; Fusarium graminearum; Fusarium culmorum; Fusarium solani; Fusarium moniliforme; Fusarium roseum); Gaeumanomyces (Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici); Helminthosporium (Helminthosporium turcicum; Helminthosporium carbonum; Helminthosporium maydis); Macrophomina (Macrophomina phaseolina; Maganaporthe grisea); Nectria (Nectria heamatococca); Peronospora (Peronospora manshurica; Peronospora tabacina); Phakopsora (Phakopsora pachyrhizi); Phoma (Phoma betae); Yhymatotrichum (Phymatotrichum omnivorum); Phytophthora (Phytophthora cinnamomi; Phytophthora cactorum; Phytophthora phaseoli; Phytophthora parasitica; Phytophthora citrophthora; Phytophthora megasperma f.sp. sojae; Phytophthora infestans); Plasmopara (Plasmopara viticola); Podosphaera (Podosphaera leucotriPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 86/229

79/117 cha); Puccinia (Puccinia sorghi; Puccinia striiformis; Puccinia graminis f.sp. tritici; Puccinia asparagi; Puccinia recôndita; Puccinia arachidis); Pythium (Pythium aphanidermatum); Pyrenophora (Pyrenophora triticirepentens); Pyricularia (Pyricularia oryzae); Pythium (Pythium ultimum); Rhizoctonia (Rhizoctonia solani; Rhizoctonia cerealis); Scerotium (Scerotium rolfsii); Sclerotinia (Sclerotinia sclerotiorum); Septoria (Septoria lycopersici; Septoria glicinas; Septoria nodorum; Septoria tritici); Thielaviopsis (Thielaviopsis basicola); Uncinula (Uncinula necator); Venturia (Venturia inaequalis); Verticillium (Verticillium dahliae; Verticillium alboatrum).

EXEMPLOS [00157] As modalidades descritas são meramente representativas da invenção, as quais podem ser incorporadas em várias formas. Assim, detalhes estruturais e funcionais específicos descritos aqui não devem ser interpretados como limitantes.

Exemplo 1 - A identificação da família do gene de defensina MtDef4 [00158] Usando as sequências de nucleotídeo de MtDef1.1 e MtDef2.1 como sequências de consulta, uma tela do índice de gene Medicago truncatula (MtGI release 7.0) do Instituto de Pesquisa Genômica (TIGR) contendo 189,919 ESTs originando-se de bibliotecas de cDNA 43 foi realizado com ciclos sucessivos de pesquisa usando os programas de computador BLASTN e TBLASTX. (BLASTN compara um sequência de consulta de nucleotídeo contra um banco de dados de sequência de nucleotídeo, enquanto TBLASTN compara uma sequência de consulta de proteína contra um banco de dados de sequência de nucleotídeo que foi traduzido em seis quadros de leitura potenciais). Esta tela leva a uma descoberta de 18 genes de defensina putativos por 10 tentativas de sequência de consenso (TC) e oito singletons (sequências de não sobreposição exclusivas). Alinhamentos de nucleotídeo cuidadosos revelaram que alguns dos singletons origiPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 87/229

80/117 nais podem de fato ser membros de TCs já estabelecidos, e a família foi atualmente dimensionada para 16 consistindo em 10 TCs e 6 singletons. Hanks e outros, 2005 descreve um resumo de ESTs para os TCs e singletons de M. truncatula.

[00159] A sequência de consenso de tentativa TC85327 revelou apenas 54,4% de identidade de nucleotídeo para o gene MsDefl e 41% de identidade de aminoácido para a proteína MsDefl (Gao e outros, 2000). Uma vez que ela foi relacionada às sequências MsDefl (ou MtDefl), MtDef2 e MtDef3, ela foi nomeada MtDef4. TC85327 consiste em sessenta e dois ESTs a partir de trinta bibliotecas diferentes.

[00160] Análise posterior da M. Truncatula empregando entradas de banco de dados de sequência EST atualizadas provê uma sequência de consenso similar para a proteína MtDef4. Esta sequência de consenso de tentativa designada como TC94214, foi montada a partir de um grupo de sessenta e nove (69) ESTs que inclui sete (7) sequências adicionais de sessenta e dois (62) ESTs usadas para montar a sequência de consenso original TC85327. A figura 1 mostra a sequência de consenso TC94214 MtDef4 com sequências de aminoácidos de membro da família MtDef4 exemplares.

[00161] Um subconjunto de 22 ESTs de alta qualidade de comprimento completo (isto é, ESTs englobando a região de codificação MtDef4) foi selecionado a partir de TC94214 e alinhado para derivar uma segunda sequência de consenso MtDef4 que inclui ambas a sequência de consenso de pró-proteína MtDef4 inteira contendo ambos o peptídeo de sinal e a proteína madura (SEQ ID NO: 99). Esses ESTs de comprimento completo são mostrados na tabela 3. Esta análise indica que apenas um dos 22 ESTs MtDef4 de alta qualidade e comprimento completo codificaram um aminoácido distinto dentro da sequência de peptídeo MtDef4 madura. Os ESTs AL386553 (SEQ ID NQ:80)

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81/117 codificam um resíduo de fenilalanina (F) em vez de um resíduo de serina (S) no resíduo 59 na sequência de consenso (SEQ ID NO: 99). Todas as outras variantes de sequência de aminoácido codificadas ocorreram na sequência de peptídeo de sinal. As sequências de peptídeo de sinal putativas são sublinhadas e mostradas em caixa baixa na tabela 3. O número de acesso GenBank sublinhado (isto é, os dois códigos de documento imediatamente seguidos pelo número de seis dígitos, tal como AL385796) da sequência de nucleotídeo de EST correspondente é mostrado para cada uma das sequências de aminoácidos deduzidas.

Tabela 3. Alinhamento de Sequência de Aminoácido Deduzido EST

MtDef4 de Alta Qualidade e Comprimento Completo e Consenso AL385796 marsvflvstifyflIylvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 7 AW573770 marsvsIvftifvflIIwatqpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 78 AW573770 marsvsIvftifvflIIwatqpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 78 BI310743 mgsfssfgftifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 79 AL386553 marsvpivstifvfllllvatqpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFFGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:80 AL386552 marsvpivstifvfllllvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 81

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Tabela 3. Alinhamento de Sequência de Aminoácido Deduzido EST

MtDef4 de Alta Qualidade e Comprimento Completo e Consenso AL387540 marsvpIvstifvfllllvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 82 AL387541 marsvpIvstifvflIlIvatqpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 83 AW287924 marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 84 BE941578 marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 85 BF636345 marsvpIvstifvflIlIvatqpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 86 BE999096 marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvgeaRT CESQSHKFKG PC AS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 87 BI263014 marsvpIvstifvflIlIvatqpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: I BI270683 marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC ASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 89 BI310744 marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC ASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 90 BQ144133 marsvpIvstifvfHllvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 91

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Tabela 3. Alinhamento de Sequência de Aminoácido Deduzido EST MtDef4 de Alta Qualidade e Comprimento Completo e Consenso BQ145044 marsvplvstifvfllllvatqpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 92 BQ153111 marsvpivstifvflIlIvatqpsmvaeaRT CESQSHKFKG PCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 93 BQ154835 marsvpivstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 94 BQ157484 marsvpivstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 95 BQ157772 marsvpivstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 96 BQ159085 marsvpivstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 97 CX535058 marsvpivstifvfllllvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKG PCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 98 Consenso marsvpivstifvfllllvatgpsmvaeaRT CESQSHKFKG PC ASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 99 [00162] Análise dos 22 ESTs MtDef4 de alta qualidade levou à identificação de cinco (5) ESTs exclusivos que são mostrados na tabela 4. Nesta tabela os resíduos exclusivos são sublinhados e as sequências de peptídeo de sinal são indicadas em caixa baixa. O número de acesso GenBank sublinhado (isto é, os dois códigos de documento imediatamente seguidos pelo número de seis dígitos, tal como AL385796) da sequência de nucleotídeo de EST correspondente é mostrado para cada uma das sequências de aminoácidos deduzidas. As sequências de nucleotídeo para cada um dos ESTs exclusivos são também providas como segue: AL386552 é SEQ ID NO: 100, AL385796 é SEQ ID NO: 101, AL386553 é SEQ ID NO: 102, AW573770 é SEQ ID NO: 103, e BE999096 é SEQ ID NO: 104.

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Tabela 4. Polipeptídeos codificados por EST MtDef4

Consensus marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC SEQ ID NO: 99 AL386552 marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC SEQ ID NO: 81 AL385796 (1) marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC SEQ ID NO: 77 AL386553 (1) marsvpIvstifvflIlIvatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFFGGHCRGFRRRCFCTTHC SEQ ID NO: 80 AL386553 (Peptídeo Maduro) RTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFFGGHCRGFRRRCFCTTHC

SEQ ID NO: 105

AW573770 marsvsIvstifvfHIIwatgpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC SEQ ID NO: 78 BE999096 marsvpl vstifvfl 111 vatg psm vgea RTC ESQS H KFKG PCAS D Η N CASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC SEQ ID NO: 87 Exemplo 2.

[00163] Clonagem de um membro da família do gene MtDef4 e Expressão em DNA Genômico Pichia isolado de M. truncatula foi usado como um modelo para amplificação PCR dos genes MtDef4. O iniciador direto, 5'-ATGGTGGCAGAAGCAAGAA-3' (SEQ ID NO: 106) e o iniciador reverso, 5'-CAAAAGATCTACGGACGG-S' (SEQ ID NO: 107) foram usados para amplificação PCR. As condições PCR foram 30 ciclos uma etapa de desnaturação de 90 segundos a 94°C, uma etapa

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85/117 de anelação de 30 s a 45Ό e uma etapa de extensão de 60 segundos a 74Ό. Quatro produtos PCR de 302 bp, 402 bp, 475 bp, e 506 bp foram observados em um gel de agarose e foram clonados no vetor pCR2,1-TOPO™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e seqüenciados usando o Big Dye ©Terminator Mix em um seqüenciador de DNA atomatizado ABI Prism 377. Apenas três desses produtos PCR genômicos foram encontrados para codificar proteínas de defensina e foram nomeados MtDef4.1 (SEQ ID NO: 108), MtDef4.2 (SEQ ID NO: 109) e MtDef4.3 (SEQ ID NO:110). A comparação dessas sequências com sequências EST MtDef4 de TC94214 revelou que os clones genômicos derivados de PCR continham uma sequência de íntron. Os peptídeos codificados por cada um dos clones PCR genômicos MtDef4.1, MtDef4.2 e MtDef4.3 foram deduzidos no computador removendo a sequência de íntron e traduzindo a sequência de cDNA deduzida correspondente. As sequências de cDNA deduzidas incluem aquelas para MtDef4.1 (SEQ ID NO:126), MtDef4.2 (SEQ ID NO: 124), e MtDef4.3 (SEQ ID NO: 143). MtDef4.1 (SEQ ID NO: 108) codificando uma próproteína (SEQ ID NO:111) que contem um peptideo de sinal de 29 aminoácidos (SEQ ID NO: 118) e um peptideo de defensina maduro de 47 aminoácidos (SEQ ID NO:112). As sequências de proteína MtDef4.2 e MtDef4.3 foram mais proximamente relacionadas umas com as outras do que para MtDef4.1. Junção conceituai e tradução das sequências de nucleotídeo MtDef4.1, MtDef4.2, e MtDef4.3 usando o programa de computador Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mostraram que a porcentagem da identidade de sequência de aminoácido foi maior do que aquela da identidade de sequência de nucleotídeo.

Tabela 5: Sequências de Aminoácidos Deduzidas de MtDef4.1, MtDef4.2, MtDef4.3 MtDef4.1

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Tabela 5: Sequências de Aminoácidos Deduzidas de MtDef4.1, MtDef4.2, MtDef4.3 Marsvplvstifvfllllvat-gpsmvaeaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHCSEQ ID NO: 111

MtDef4.1 (H33) (Mature Peptide) RTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC

SEQ ID NO: 112 MtDef4.2 ma rs vp I vstifvff 11 i vate mg ps m vaaRTCETPSNSFKGACFSDTNCASVCQTEGFPGGHCEGFRQRCFCTTHCSEQ ID NO: 113 MtDef4.2 (Mature Peptide)

RTCETPSNSFKGACFSDTNCASVCQTEGFPGGHCEGFRQRCFCTTHC SEQ ID NO: 114 MtDef4.3 marsvpivstifvfflIlvatemgpimvaeaRTCETPSNNFKGLCVSDTNCASVCQTEGFPGGHCEGFRQRCFCTTHCSEQ ID NO: 115 MtDef4.3 (Mature Peptide)

RTCETPSNNFKGLCVSDTNCASVCQTEGFPGGHCEGFRQRCFCTTHC SEQ ID NO: 116 [00164] Para um isolamento de grande escala em proteínas

MtDef4, o gene MtDef4.1 e uma variante do mesmo foram expressos em Pichia pastoris. O gene foi clonado no vetor pPIC9 (Invitrogen, CarPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 94/229

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Isbad, CA) que permite expressão induzível por metanol e secreção da proteína no meio de crescimento de P. pastoris. A sequência de DNA que codifica a proteína MtDef4 madura foi cionada em quadro com o códon de iniciação da sequência de sinal de fator α e pró-peptídeo no sítio de restrição Xhol de PPIC9. Mais especificamente, um sítio de Xhol intoduzido na extremidade 5' da região de codificação madura MtDEf4 tal que Arg (R) de N teminal de proteína MtDef4 madura foi fundida com o sítio de divagem de protease KEX2 localizado no terminal da sequência de sinal de fator α de levedura e pró-peptídeo. A sequência de defensina MtDef4 usada no vetor Pichia foi obtida realizando PCR na sequência de clone genômico MtDef4.1 (SEQ ID NO:108) usando iniciadores RS21 (5AGAAAAGAAGAACTTGTGAGTCACAAAGTCACAAATTC-3', SEQ ID NO: 139) e RS22 (5GATTACGAATTCTTAACAATGTGTAGTGCAAAAGCATCTA CGACG; SEQ ID NO: 140).

[00165] O vetor resultante contido na região de códon da sequência de defensina MtDef4.1 madura (SEQ ID NO:112) fundida no quadro com a sequência de sinal de fator α a jusante do promotor de oxidase de álcool P. pastoris bem como um gene de marcador selecionável HIS4 (Figura 2). A sequência do cassete de expressão de Pichia MtDef4.1 compreendendo o promotor AOX1 operativamente ligado, a sequência de sinal de fator a, a sequência de defensina MtDef4.1 madura, e a sequência de poliadenilação AOX1 são providas em SEQ ID NO: 157).

[00166] Outro clone MtDef4.1 obtido a partir reações de PCR com os iniciadores RS21 e RS22 codificou uma sequência de peptídeo MtDef4.1 madura que difere da sequência de MtDef4.1 madura (SEQ ID NO: 112) em um resíduo de aminoácido. Mais especificamente, o clone MtDef4.1 (H33R) histidina (His) para arginina (Arg) substituição

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88/117 na posição 33 (SEQ ID NO: 125). Este clone é, portanto, designado MtDef4.1 (H33R). A sequência de codificação MtDef4.1 (H33R) madura é provida em SEQ ID NO: 144. A sequência do cassete de expressão de Pichia MtDef4.1 compreende o promotor A0X1 operativamente ligado, a sequência de sinal de fator a, a sequência de defensina MtDef4.1 (H33R) madura, e a sequência de poliadenilação A0X1 são providas em SEQ ID NO: 73.

[00167] Ambos os vetores de levedura MtDef4 linearizados por digestão com Sall e introduzidos na cepa auxotrófica de histidina GS115 por eletroporação. Transformantes onde o cassete de expressão de Pichia MtDef4.1 e o gene de marcador selecionável HIS4 integraram no genoma de P. pastoris (isto é, transformantes His+) foram selecionados por preparação em placas de placas de dextrose que faltaram histidina.

[00168] Os transformantes individuais foram crescidos em meios de glicerol tamponados e a expressão da proteína MtDef4.1 ou MtDef4.1 (H33R) foi induzida pela adição de metanol à cultura. Brevemente, culturas durante a noite das linhagens de Pichia transformadas com metanol a cada 24 horas de um total de 7 dias em uma temperatura de 290. Este procedimento é essencial assim como as d ireções dos fornecedores (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia).

[00169] Proteína MtDef4.1 ou MtDef4.1 (H33R) foi purificada a partir do meio de crescimento primeiramente removendo as células por centrifugação (4.000 g por 5 minutos), ajustando os meios livres de células para 25 mM de acetato de sódio, pH 6.0, e então passando os meios através de resina de troca catiônica CM-Sephadex C-25 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) equilibrada com 25 mM de acetato de sódio, pH 6.0. a resina foi extensivamente lavada com tampão de ligação (25 mM de acetato de sódio, pH 6.0), e a proteína ligada foi em seguida eluída em NaCI a 1 M, Tris a 50 mM, pH 7.6. Frações contenPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 96/229

89/117 do a proteína foram manualmente coletadas e analisadas por SDSPAGE para a presença de MtDef4.1 ou MtDef4.1 (H33R). Frações contendo a proteína de defensina foram concentradas usando um sistema de ultrafiltração Amicon Stirred-Cell II® (Millipore, Bedford, MA) com uma membrana de corte 3-kD e dializadas contra Tris a 10 mM, pH 7.6. As identidades de MtDef4.1 e MtDef4.1 (H33R) foram confirmadas por espectrometria de massa. Brevemente, a proteína purificada foi submetida a análise em um espectrômetro de massa Quadrupole-Time-of-Flight (QTOF) (Applied Biosystems, Foster City, CA). O peso molecular MW de MtDef4.1 foi determinado como sendo 5315,77 e o peso molecular de MtDef4.1 (H33R) foi determinado como sendo 5334,98. Essas massas estão dentro de 0,5 dáltons da massa prevista de peptídeos de defensina madura ligada em ponte por cisteína MtDef4.1 e MtDef4.1 (H33R), desdobrada.

Exemplo 3. Atividade Antifúngica de MtDef4.1 (H33R) [00170] Defensinas Medicago diferem substancialmente de sua atividade antifúngica in vitro de F.graminareum e F. verticillioides. A atividade antifúngica de MtDef4.1 (H33R) foi determinada medindo a inibição de crescimento hifal fúngico em um ensaio in vitro usando placas de microtitulação de 96 cavidades e comparadas com aquelas MsDefl (Figura 3). Suspensões de esporo de F. graminearum e F. verticillioides foram preparadas em meio fúngico com pouco sal 2 x sintético (Liang e outros, 2001) em uma concentração de 40,000 esporo por ml. Cinquenta microtitulações de suspensão de esporo e 50μΙ de diferentes concentrações de cada defensina foram adicionados a cada cavidade de uma placa de microtitulação. Placas de ensaio antifúngico foram incubadas em temperatura ambiente (22-24°C) no escuro por 16 horas. MsDefl inibe o crescimento de F. verticillioides com um IC₅₀ de 2μΜ, ao passo que MtDef4.1 (H33R) inibe o crescimento deste fungo com um IC₅o de 0,5pm. (Tabela 6). MsDefl inibe o crescimento de F.

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90/117 graminearum com um IC₅₀ de 2μΜ, ao passo que MtDef4.1 (H33R) inibe o crescimento deste fungo com um IC₅₀ de 0,75pm. Além do mais, MsDefl induz forte hiper-ramificação de hyphae fúngica, ao passo que MtDef4.1 (H33R) não inibe. Assim, MtDef4.1 (H33R) é uma defensina antifúngica mais potente contra ambos F.graminareum e F. verticillioides do que MsDefl, e provavelmente inibe essses fungos com um modo de ação diferente.

Tabela 6. Atividade Antifúngica In vitro de Defensinas

Proteína	F.	graminearum	F. verticillioides
MIC (μΜ)	IC50 (μΜ)	IC (pM)	MIC (μΜ)	IC50 (μΜ)	IC (pM)
MsDefl	0,375	2	>24	0,5-1,0	2	>24
MtDef4.1 (H33R)	0,25	0,75	6	0,25	0,5	1,5

MIC = concentração inibidora mínima

IC₅o = concentração na qual 50% do crescimento é inibido

IC = concentração inibidora completa para germinação de esporo

Exemplo 4. Comparação de Atividade Biológica de MtDef4.1 (SEQ ID

NO:112)e MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 125) [00171] Para comparar a atividade biológica de MtDef4.1 (SEQ ID NO: 112) e MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 125), as proteínas maduras foram primeiramente obtidas cultivando Pichia transformada com os vetores de expressão de Pichi respectivos (SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO:73). A produção de Proteína MtDef4 madura foi efetuada induzindo a Pichia transformada com metano, colhendo os meios de cultura, e isolando as proteínas MtDef4 maduras essencialmente como anteriormente descrito no exemplo 3. As Proteínas MtDef4 purificadas foram em seguida ensaiadas para inibição de F. graminearum essencialmente como anteriormente descrito no exemplo 3.

[00172] Como mostradas na figura 4, as proteínas MtDef4.1 e

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MtDef4.1 (H33R) exibiram uma atividade biológica similar quando ensaiadas para a inibição de F. graminearum.

Exemplo 5. Demontração de um Modo de Ação Distinto para MtDef4.1 (H33R) e MsDefl [00173] Duas defensinas antifúngicas ricas em cisteína, MsDefl e MtDef4.1 (H33R) de Medicago sp., compartilham 41% da sequência de identidade de aminoácido e amabas as defensinas inibem o crescimento de Fusarium graminearum patógenos fúngicos em concentrações micromolares. Para comparar o modo de ação de MsDefl como o modo de ação de uma proteína MtDef4, muitos mutantes insercionais de F. graminearum que exibem hipersensibilidade a MsDefl foram ensaiados para sensibilidade a MsDefl e MtDef4.1 (H33R).

[00174] MsDefl e MtDef4.1 (H33R) foram expressos em Pichia pastoris de levedura e purificados a partir do meio de crescimento como anteriormente descrito em Spelbrink e outros, 2004 e o no Exemplo 2. A proteína MtDef4.1 (H33R) que compartilha 41% de identidade com MsDefl foi também expressa em P. pastoris e purificada a partir do meio de crescimento de uma maneira similar. A identidade de cada defensina foi confirmada por MALDI-MS no modo de íon positivo usando as matrizes de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico (modo refletor) e ácido sinápico (modo linear). Todas as defensinas foram encontradas como sendo puras e tendo a relação massa / carga prevista. [00175] Ensaios antifúngicos in vitro usando diluição serial de dois desdobramentos de cada defensina foram realizados como descrito (Liang e outros, 2001 ; Spelbrink e outros, 2004). Imagens de campo brilhantes foram feitas usando o canal de luz transmitida em um microscópio confocal Zeiss LSM 510 META. Inibição de crescimento fúngico foi também quantificada espectrofotometricamente 36 h após a adição de cada defensina (Broekaert e outros, 1990). A concentração requerida para 50% de inibição de crescimento foi determinada assim

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92/117 como o valor IC₅₀.

[00176] Cerca de 4.800 mutantes insercionais aleatórios usando a abordagem de integração mediada por enzima de restrição (REMI) (Seong e outros, 2005) foram usados para obter os mutantes fúngicos com hipersensibilidade a MsDefl. F. graminearum do tipo selvagem PH-I e mutantes gerados de PH-I foram rotineiramente cultivados em um meio completo (CM) (Correll e outros, 1987) ou meio de ágar suco de tomate V8 (Correll e outros, 1987). Para ensaios (conidiation), culturas fúngicas foram crescidas no meio de carboximetil celulose (CMC) (Cappelini and Peterson, 1965). Esses transformantes REMI foram usados de modo bem sucedido anteriormente para isolar onze mutantes de patogenicidade (Seong e outros, 2005). A fim de identificar mutantes que exibem hipersensibilidade ou resistência a MsDefl e/ou MtDef4.1 (H33R) com certeza, valores IC_5O (concentração efetiva para 50% de inibição de crescimento) dessas defensinas contra F. graminearum tipo selvagem PH-I foram avaliadas com base na inibição de crescimento observada microscopicamente e medindo a absorbância da cultura em A595 usando um leitor de microplaca (Broekaert e outros, 1990). Duas diferentes concentrações de MsDefl a 1,5 M e 3 μΜ foram usadas para selecionar 4.800 transformantes REMI para sensibilidade alterada para MsDefl. Esses transformantes foram simultaneamente selecionados para sensibilidade alterada para MtDef4.1 (H33R) em duas concentrações diferentes de 0,75 e 1,5 μΜ. Mutantes F. graminearum (mutantes REMI) foram examinados para hipersensibilidade ou resistência a MsDefl e/ou MtDef4.1 (H33R). Nas concentrações testadas, nenhuma dos 4.800 transformantes REMI mostraram resistência a MsDefl ou a MtDef4.1 (H33R). Entretanto, muitos mutantes foram identificados que exibiram hipersensibilidade a MsDefl, mas não a MtDef4.1 (H33R) Dois mutantes, esd1 e esd2, (para sensibilidade melhorada a defensina) foram escolhidos por

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93/117 análise adicional.

[00177] Ambos os mutantes esd, esd1 e esd2, foram mais sensíveis a MsDefl do que a cepa PH-I tipo selvagem. O mutante esd1 foi completamente inibido a 1,5 μΜ de MsDefl (Figura 5). EM concentrações de 6 e 12 μΜ, ele exibiu distorção de esporo (dados não mostrados). O mutante esd2 mostrou sensibilidade muito maior a MsDefl do que esd1. Em 0,375 μΜ, MsDefl inibiu a germinação de esd2 conídia sem causar qualquer distorção em seu tamanho ou formato (Figura 5), mas em 2 μΜ de MsDefl, esporos se tornaram distorcidos e células individuais nos esporos (6 esporos por células) foram claramente visíveis indicando hipersensibilidade a MsDefl (dados não mostrados). Em contraste, a cepa PH-I tipo selvagem, o mutante esd1 e o mutante esd2 foram igualmente sensíveis a MtDef4.1 (H33R). A existência desses dois mutantes distintos que exibem hipersensibilidade seletiva a MsDefl, mas não a MtDef4 indica que essas duas proteínas de defensina têm modos de ação distintos.

Exemplo 6. Geração de Trigo Trasqênico Contendo o Gene MtDef4.1 (H33R) [00178] Para expressão do MtDef4.1 (H33R) em trigo, um gene MtDef4 foi sintetizado com base em códons monocotiledônea preferidos tal que a sequência de aminoácido do peptídeo de sinal MtDef4.1 (H33R) e a proteína madura permaneceram não alterada (Figura 6; SEQ ID NOS:72 e 151). O gene 239 bp MtDef4 sintético (SEQ ID NO:72) foi obtido de GenScript Corporation (Piscataway, NJ, USA). O gene MtDef4.1 (H33R) sintético foi colocado entre promotor/íntron de ubiquitina de milho (Ubil) e a sequência de sinal de poliadenilação CaMV 35S e clonado entre as bordas de T-DNA do vetor de expressão de planta binário pZP211 (Haj dukiewicz e outros, 1994) como mostrado na figura 7. A sequência do cassete de expressão de planta MtDef4.1 (H33R) compreendendo a promotor/íntron de ubiquitina de

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94/117 milho operativamente ligado, o intensificador de iniciador TEV 5, a sequêcia de defensina MtDef4.1 (H33R) que codifica o peptídeo de sinal de a proteína madura, e a sequência de poliadenilação CaMV35S são providos em SEQ ID NO: 74.

[00179] O vetor pZP212 contendo o gene MtDef4.1 (H33R) sintético e um gene de marcador selecionável de fosfotransferase de neomicina (nptll) foi introduzido em Bobwhite suscetível a doença de giberela e parcialmente resistente a cultivares de trigo XC.

[00180] Bobwhite trasgênico e cultivares de trigo XC que compreendem uma construção de DNA para expressão de MtDef4 em plantas foram obtidos. O milho transgênico foi obtido como descrito neste exemplo ou pelo uso de vetores de expressão de planta MtDef4 substancialmente equivalentes e técnicas de transformação. Plantas transgênicas que são homozigotas para inserção de construção de DNA MtDef4 foram obtidas. Plantas de trigo transgênicas na geração T2 também foram obtidas.

Exemplo 7. Identificação de Trigo Transgênico que Inibe Crescimento de Fungos Patogênicos de Planta [00181] Pelo menos vinte sementes de cada linhagem homozigótica bem como sementes de plantas de controle (isto é, a Bob white ou cultivares XC faltando o transgene MtDef4) serão mostradas. Três espigões (cabeças) de cada planta serão inoculadas com Fusarium graminearum (PH-I de cepa) suspensão de esporo (5 X 10⁴esporos/ml). Cerca de três (3) espiguetas únicas/espigão(s) em cada um dos MtDef4 e plantas de trigo de controle serão inoculados usando um método de inoculação de único flósculo 5, 9, 13, 17, 21 e 25 dias após a inoculação (dpi), respectivamente. As espiguetas infectadas (%) = média de 60 espigões a partir de 20 plantas/ linhagem de trigo serão inoculadas. Análise de significância estatística será feita usando o teste t de Student e ANOVA. Uma diminuição

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95/117 significativa na porcentagem de espigões infectados será observada nas plantas de trigo transgênicas relativas às plantas de controle que ao expressam MtDef4.

Exemplo 8. Geração de Milho Contendo o Gene MtDef4 Quimérico [00182] A construção (SEQ ID: 72) de MtDef4.1 (H33R) otimizado de monocotiledônea no vetor pZP212 foi também usado para transformar maiz H99 panificável usando o método em Sidorov et al 2006. Este cassete de expressão de planta MtDef4.1 (H33R) compreendendo a ubiquitina de mais operativamente ligada (Ubil) promotor/íntron, o intensificador de iniciador TEV 5, a sequência de defensina MtDef4.1 (H33R) codificando o peptídeo de sinal e a proteína madura, e a sequência de poliadenilação CaMV35S (SEQ ID NO: 74) foi também subclonado no vetor pTFI 01 e usado para transformação de embriões imaturos Hill de mais mediados por Agrobacterium usando o método em Frame e outros, 2002. Plantas transgênicas foram recebidas e avaliadas por PCR para a presença do cassete MtDef4.1 H33R. Plantas de milho transgênicas que foram positivas para a construção de DNA MtDef4 foram obtidas. Essas plantas transgênicas foram polinizadas ou cruzadas no fundo B73 para obter sementes T1 (descendência de polinização) e F1 (descendência de cruzamento).

Exemplo 9. Avaliação de mais transqênico para inibição de crescimento fúngico [00183] Plantas de mais transgênico que são positivas para o contruto de DNA MtDef4 serão polinizadas ou cruzadas no fundo B73 para obter sementes T1 (descendência de polinização) e F1 (cruzamento por descendência). Sementes T1 e F1 serão produzidas por vários eventos transgenicos indenpendentes.

[00184] Plantas de mais transgênicas na geração T1 serão ensaiadas para expressão de proteína MtDef4 através do uso de um anticorPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 103/229

96/117 po MtDef4. Plantas de mais transgênico na geração T3 serão ensaiadas para resistência de doença fúngica na estufa medindo a quantidade de micotoxinas produzidas quando as plantas são infectadas com micotoxina produzindo Fusarium sp.

Exemplo 10. Geração das vatiantes de cisteína MtDef4 [00185] A Proteína MtDef4 processada e apropriadamente desdobrada é prevista para conter 4 pontes de dissulfeto, com base na homologia de outras defensinas cujas estruturas foram resolvidas (Thomma e outros, 2002; Lay and Andersen, 2005). Enquanto não estando limitado pela teoria, acredita-se que variantes de cisteína MtDef4 que faltam uma ou mais ligações de dissulfeto podem ser desejáveis para uso em plantas transgênicas que são finalmente usadas como alimetação animal ou como alimento para humanos que consumem os produtos de planta transgênicas. Proteínas de variante MtDef4 que têm meia vida mais curta nos tratos digestivos de animais ou humanos são em teoria atecipadasa para ter menos potecial para se tornarem alergênios de alimento.

[00186] Os pares previstos de ligações de dissulfeto em MtDef4 está entre resíduos de cisteína 3 e 47, 14 e 34, 20 e 41, e 24 e 43. Assim, o par Cys é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cys3-Cys47, par Cys 2 é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cysl4-Cys34, par Cys 3 é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cys20 - Cys41, e o par Cys 4 é previsto para ser formado por uma ligação de dissulfeto Cys24-Cys43. Com base nesta previsão, pares de cisteínas foram alterados para resíduos de serina usando Stratagene QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com o direcionamento dos fabricantes e os iniciadores na tabela 9.

Tabela 9. Iniciadores Usados para Obter Variantes Cys MtDef4

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Par Cys	Iniciador	Sequência de Iniciador	Número Cys	Número de Resíduo
1	ftKSOoaa-cis (SCO ID H0:L2?)		Cysl	Cys35er
Ξ	AKS004Q-C2S (SfjQ ID tfD:123 )	ttcaaagogccatctgctaqtgatcacaactg	Cyaí	cysiiser
3	AK50042-C3S (SEQ ID )	GCTAGTGRTCACAJlCTCTGCTTCTGTGTíKCAAAC	Cya3	Cys20âçr
4	AKS0Ú44-C4S (SEQ ID NOrLIO }	CnflCTCTSCTTCTGTCTCCCAMCllGaACG	CyS4	Cya245e-r

I	AHSOO39-Ç0& (SSQ ID HO:131 )	TGCTTTTGCACTACfiCJÍTTCTTAAÜJÍATTCCCCTftGGGC	Cyaâ	CyS475er
Ξ	AKS0041-CSS (SBÜ TD MO:132 )	ÇTGSAGCBCGCTOOCGTGGflTTCCG	Cya5	CysUSer
3	AK30043-C6S fSEQ ID	GGArTCCGTCGTAGATOCTTTTGCflCTACACATTG	Cysâ	Cya-íl$er

WÍSOCNS-CJS (SEQ ID MO: 134)

CCGTCGIAGATGCTTTTÇÇACTACACRTTGTTAííG cysT

Cys43Sei [00187] A construção pPIC9-MtDef4.1 (H33R) para expressão de Pichia descrito anteriormente foi usado como modelo nas reações de mutagênese assim como esta construção foi conhecido para se expressar bem em Pichia (ver Figura 2). Nesta construção, a região de codificação madura MtDef4.1 (H33R) é fundida com a sequência de sinal de fator α de levedura e pró-peptídeo tal que Arg (R) de Terminal N de proteína MtDef4.1 (H33R) madura foi fundida ao sítio de divagem de protease KEX2 localizado no terminal C da sequência de sinal de fator α de levedura e pró-peptódeo. As quatro construções foram sequênciadas e transformados na cepa GS115 P. pastoris. Pichia transformada foi cultivada e induzida com metanol. As proteínas de variante de cisteína MtDef4.1 (H33R) foram purificadas como em Spelbrink e outros 2004. As proteínas purificadas foram adicionadas ao ensaio de microplaca atifúngica in vitro como descrito em Spelbrink e outros 2004. A memos que de outra maneira notado, toda as etapas de transformação, crescimento, indução, purificação, e ensaio antifúngico foram descritas em Spelbrink e outros 2004 e no Exemplo 2.

[00188] Todas as variantes de cisteína MtDef4 inibiram crescimento

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98/117 de Neurospora crassa. Entretanto, a inibição de Neurospora pelas variantes de cisteína MtDef4 é grandemente diminuída quando comparada a MtDef4.1 (H33R) assim como inibição completa de crescimento de Neurospora não é observada em concentrações tão altas quanto 20 μΜ. Duas variantes de MtDef4 (MtDef4.1H33R, C3S, C47S) e MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) inibem crescimento de Fusarium graminearum, com inibição completa em uma concentração de 6 μΜ. As variantes MtDef4-25 e MtDef4-36 são menos ativas do que as outras variantes de cisteína MtDef4 contra F. graminearum, mas realmente proveem completa inibição de F. graminearum em concentrações acima de 30 μΜ.

Tabela 10: Variantes de cisteína MtDef4 e Atividade Biológica

Atividade Antifúngica

Tabela 10 Mutantes Cys/S^r- MtDe£4.1 (H33R)	Fusarium gremiue^fum	AfàürüSpüra crassa
MtDef4.L(H33R,C3Ê,C47S) RISES QSHK FKG PCASDHNCASVCQTERFSGGRC RG FRFtRCFCTTHS SEQ ID KO:135	++++	+
MtD&E4,1{H33R,CÍ4S,C34S) RTCE SOS H KFKG PSAS DHNCASVCQT ERF5 GGRSRG FRRRÇ FCTTRC SEQ ID NO;136	+++	+
MtD«f4.1(H33R,C20S,C41S> RTCESQSIIKFKG PCAS 0HΝΞASVCQTERFSGGRCRGFRRRSFCTT HC SEQ ID NQ:JL37	++-F	+
MtDef4,1(H33R,C24S,C43S) RTC Ξ SQS HEFKG PC AS DHHCASVSQT E.R FSGGRCRG FRRRCFS TTHÇ SEQ ID NO:138	++++
MtDefi.l (H33JR)
SEQ ID HO:125	+++++	++++

Exemplo 11. Vetores de Expressão de Planta Dicotiledônea [00189] Para expressar a proteína MtDef4.1 (H33) em plantas dicotiledôneas, três vetores de transformação de planta mediada por

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Agrobacterium podem ser construídos. Todos os vetores, mostrados aqui nas figuras 8, 9, e 10, contêm sequências de borda direita e esquerda de Agrobacterium e gene de marcador selecionável compreendendo um promotor NOS e um terminador NOS que e operativamente ligado ao gene BAR que codifica uma fosfinotricina acetiltransferase qe confere resistência a glufosinato de herbicida. Os vetores também usam um clone genômico MtDef4.1 (SEQ ID NO: 108) que codifica a proteína MtDef4.1 (SEQ ID NO: 112). O primeiro vetor conferia um cassete de expressão de MtDef4.1 compreendedo um Promotor FMV, um íntron de Superubiquitina, uma sequência genômica que codifica o éxon 1 de MtDef4, o íntron MtDef4, e o éxon 2 de MtDef4, e uma sequência de poliadenilação NOS, em que todos os elementos de expressão são operativamente ligados como mostrado em SEQ ID NO:75. O segundo vetor conteria um cassete de expressão MtDef4 compreendendo um Promotor FMV, um itron de superubiquitina, uma sequência genômica que codifca o Éxon 1 de MtDef4, o íntron MtDef4, e o Éxon 2 de MtDef4 com uma fusão de terminal C em quadro a uma sequência de endereçamento vacuolar, e uma sequência de poliadenilação NOS, em que todos os elementos de expressão são operativamente ligados como mostrado em SEQ ID NO:76. A sequência de endereçamento vacuolar usada neste vetor é o sinal de endereçamento vacuolar CTPP de terminal C proveniente do gene de lectina de cevada. O terceiro vetor conteria um cassete de expressão MtDef4 compreendendo um promotor FMV, um intron de superubiquitina, uma sequência genômica que codifica o Éxon 1 de MtDef4, o íntron MtDef4, e o Éxon 2 de MtDef4 com uma sequência de sinal de retenção ER em quadro, e uma sequência de poliadenilação NOS, em que todos os elementos de expressão são operativamente ligados como mostrado em SEQ ID NO: 150.

[00190] Este vetor dicotiledônea pode ser introduzido em uma cepa

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100/117 de Agrobacteríum adequada e usado para transformar plantas dicotiledônea tais como alfafa, arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couve-flor, aipo, citrus, algodão, uma abóbora cucurbita, eucalipto, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e tomate. Plantas dicotiledônea resistentes a glufosinato podem em seguida ser selecionadas e ensaiadas para expressão do transgene MtDef4. Plantas dicotiledônea que expressam o transgene MtDef4 são em seguida ensaiadas para resistência em patógenos fúngicos. Quando a planta dicotiledônea é uma planta de batata contendo qualquer um dos vetores de expressão dicotiledônea de MtDef4 descritos neste exemplo, plantas de bata transgênicas serão obtidas e ensaiadas para resistência à Verticillium Wilt empregando os procedimetos essencialmente como descritos na Patente norte-americana 6.916.970.

Exemplo 12. Controle de Infecção Fúngica em Arabidopsis Trasngêniça [00191] É bem documentado que A. thaliana é suscetível a F. graminearum (Chen e outros Molecular Plant Pathology 7: 391-403, 2006; Skadsen and Hohn, Physiol. Mol. Plant Pathol. 64: 45 a 53, 2004; Urban e outros Plant J 32: 961-973, 2002). Pata testar defensinas antifúngicas MsDefl e MtDef4 por sua capacidade de conferir resistência a F. graminearum, um patossistema Fusarium-Arabidopsis foliar foi usado (Chen e outros, Ibid; Makandar e outros Mol Plant Microbe Interact 19: 123-129, 2006; Skadsen and Hohn, Ibid).

[00192] Em trigo, F. graminearum exibe uma fase bitrófica durante as primeiras 48 a 72 h de infecção e em seguida comuta para um fase necrotrófica em aproximadamente 72 h após inoculação (Bushnell e outros Histology and physiology of Fusarium Giberela. In Fusarium Giberela of Wheat and Barley. Leonard, KJ. and Bushnell, W.R. (eds.)

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St Paul, MN: American Phytopathological Society Press, pp. 44-83, 2003). Em Arabidopsis, este patógeno colonizao tecido de folha inoculado por enrolamento por ambos o crescimento intracelular e intercelular e morte celular extensiva é observada a frente da hyphae avançada (Chen e outros, Ibid). Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que defensinas antifúngicas quando coexpressas extra e intracelular, irão conferir um nível muito mais alto de resistência a FBH em Bobwhite transgênico e A. thaliana do que defensinas expressas apenas de modo extracelular. A fim de testar esta hipótese, construções de gene de defensina quimérica foram geradas que resultam em sobre-expressão de MsDefl e MtDef4 de modo extracelular ou intracelular (isto é, vacúolo ou retículo endoplasmático) em Columbia de ecotipo A. thaliana. Os vetores MtDef4 usam um clone genômico MtDef4.1 (SEQ ID NO: 108) que codifica a proteína MtDef4.1 (SEQ ID NO: 112). Para o de endereçamento vacuolar, uma fusão de tradução de cada defensina para o sinal de tipo vacuolar de lectina de cevada de terminal C foi feita. Para o de endereçamento de retículo endoplasmático (ER), uma fusão de tradução de cada defensina para a sequência KDEL foi feita. Assim, seis construções para de endereçamento extracelular (EC), vacuolar (VC) e ER de MsDefl e MtDef4 (Figura 11) foram feitos e foram comparados por sua capacidade de conferir resistência a F. graminearum. Para cada construção, muitos eventos transgênicos independentes foram gerados. Eventos transgênicos contendo uma única cópia do cassete de gene quimérico foram analizados para expressão de cada defensina por ELISA em camada F. Expressão da proteína foi transmissível através de cada geração testada. A descendência de 4 semanas (geração T3) de dois eventos independentes expressando a proteína foi testada para resistência a F. graminearum como descrito (Makandar e outros, Ibid). Quatro folhas de cada planta (10 plantas/evento) foram infiltradas com 100 pl de F. graminearum PH-I coniPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 109/229

102/117 dia (5 x 10⁵/ml) usando uma ponta de seringa. A severidade da doença foi avaliada em 2,5 e 7 dias após a inoculação por pontuação visual de sintomas (0 = sem sintomas, 1 = lesões cloróticas cobrindo menos do que 25% da área da folha, 2 = lesões ensopadas por água cobrindo menos do que 25 a 50% da área da folha, 3 = lesões cloróticas cobrindo 50 a 75% da área da folha e crescimento micelial extensivo, 4 = decomposição severa e decolamento de folhas) e por calcular o índice de severidade da doença (DS) (Chen e outros, Ibid).

[00193] Sobre-expressão constitutiva de MsDefl ou MtDef4 pode conferir forte resistência a F. graminearum em plantas Arabidopsis transgênicas como mostrado a figura 12. Certas plantas transgênicas mostram uma redução igual a 59-68 % no índice de severidade da doença (DS) quando comparado aqueles de plantas do tipo selvagem (100%) nos 7 dias após inoculação. Entretanto, diferenças significantes foram notadas entre diferentes construções. As construções MsDefl -EC e MsDefl -VC foram mais efetivas do que o contruto MsDefl - ER em prover resistência a este patógeno. As plantas MsDefl -ER mostraram 65% de índice de severidade de doença e foram mais sucestíveis do que plantas MsDefl -EC ou MsDefl -VC a este patógeno. Similarmente, a construção MtDef4-EC provê forte resistência ao patógeno (apenas 41% DS), mas a construção MtDef4-VC não provê (70% DS). Em contraste a MsDefl endereçado a ER (65% DS), MtDef4 endereçado a ER provê significativamente mais proteção da doença (51% DS) (Figura 8). Resultados similares foram obtidos em 5 dias após inoculação (Tabela 11).

Tabela 11. índice de Severidade da Doença do tipo selvagem e linhagens A. thaliana expressando várias construções.

F. graminearum índice de doença³

Construção 2 dpi 5dpi 7dpi

WT-Col 100 100 100

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103/117

MsDefl-EC	36	32	47
MsDefl -VC	30	41	51
MsDefl -ER	63	65	78
MtDef4-EC	38	41	57
MtDef4-VC	67	70	88
MtDef4-ER	67	51	61

^a índice de doença é expresso como por cento de doença tipo selvagem. Dados para um evento representativo para cada construção são mostrados.

[00194] Quatro semanas após inoculação, 90% das plantas transgênicas expressando as construções MsDefl-EC, MsDefl-VC e MtDef4-EC germinaram normalmente e produziram numerosas flores e estabeleceram sementes viáveis como as plantas tipo selvagem inoculadas em estufa, em comparação as plantas tipo selvagem inoculadas por patógeno, onde apenas 10% germinaram normalmente e estabeleceram sementes viáveis e as plantas restantes mostraram germinação muito retardada e produziram muito poucas flores (Figura 13, plantas MsDefl mostradas).

[00195] A forte resistência a F. graminearum observadas nas plantas MsDefl-EC e MsDefl-VC foi adicionalmente confirmada por tingimento azul de triptano de hyphae fúngica nas folhas infectadas 2, 5 e 7 dias após inoculação. O crescimento do patógeno foi marcadamente reduzido nas folhas inoculadas dessas linhagens transgênicas quando comparado com aquele nas plantas tipo selvagem.

Exemplo 13. Controle de Infecção Fúngica em Trigo Trasnqênico [00196] Um cassete de expressão de gene MtDef4 transgênico consistindo em promotor de ubiquitina de mais e íntron, no líder de vírus de gravura do tabaco (TEV), na sequência de codificação de MtDef4.1 (H33R) códon otimizada para monocotiledôneas, e o terminador CaMV 35S foi feito e clonado entre as bordas de T-DNA no vePetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 111/229

104/117 tor binário pZP212 (Hajdukiewicz e outros, 1994) como descrito no exemplo 6. Este vetor foi usado para transformar Bobwhite (BW) de cultivar de trigo na primavera e Xin Chun 9 (XC9) de cultivar d trigo chinês. Seis eventos de Bobwhite transgênico independentes e um evento de XC9 transgênico foram gerados. Com base na análise de segregação dos sete eventos, três eventos Bobwhite e um evento XC9 continham uma única cópia do gene MtDef4. Plantas homozigóticas de todos os quatro eventos de única cópia foram identificadas na geração T2 (Tabela 12). Plantas homozigóticas de todos os quatro eventos expressaram a Proteína MtDef4 como determinado por ELISA m camada.

Tabela 12. Número total de linhagens transgênicas produzidas e das

linhaqens homoziqótica	s isoladas
Cultivar Linhagem	Condição³	N° de famílias testadas	N° de linhagens isoladas
BW	Única	4	1 (N°11)
BW	Única	6	1 (N° 4)
BW	Múltipla	3	Nenhum
BW	Múltipla	3	Nenhum
BW	Múltipla	4	Nenhum
BW	Única	5	3 ( N° 2, N° 3, N° 10)
XC9	Única	5	3 ( N° 103, N° 104, 426)

³ Com base em relações de segregação ^b isolados em geração T2 [00197] Duas linhagens homozigóticas (geração T3) foram testadas para resistência a FHB na estufa. Trinta e uma e 29 cabeças de linhagens transgênicas BW.A N° 11 e XC9.426 N° 103, respectivamente, foram incbadas usando um método de inoculação de único flósculo. O

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105/117 cultivar Alsen resistente a FHB e o cultivar Norm suscetível a FHB juntamente com BW e XC9 foram inoculados como controles neste ensaio. As cabeças inoculadas foram visualmente pontuadas para os sintomas FHB 4, 9, 11, 14 e 21 dias após inoculação (DAI) e a severidade de sintomas foi expressa como porcentagem de giberela por Stack and Mullen (1998). A maioria dos espigões secos 21 DAI e portanto os dados 21 DAI não foram incluídos na análise. A porcentagem da severidade a FHB para MtDef4 trangênicas e de controle é mostrada na tabela 13. Tabela 13. Porcentagem da Severidade a FHB em avaliações de Estu-

fa das duas linhaaens de triao transaênicas e verificações FHB no 14
DAI.
Linhagem/Cv.	N° de cabeças testadas % de Severidade FHB

BW.A N° 11	31	11*
Bobwhite	12	23
XC9.426 N° 103	20	31
Xin Chun 9	16	34
Alsen	24	12
Norm	7	31

% de severidade FBH é a média de todas as cabeças.

* signficativamente diferente em P = 0,05 comparado a Bobwhite e Norm [00198] A linhagem transgênica BW.A N° 11 mostrou 11% de severidade FHB, similar aquela de Alsen de cultivar resistente a FHB, ao passo que Bobwhite não-transformada mostrou 23% de severidade FHB em 14 DAI. Esta diminuição na severidade FBH é significante em P = 0,05. Por outro lado, a linhagem homozigótica XC9.426 N° 103 transgênica não mostrou qualquer resistência significante quando comparada a cultivar XC9 suscetível a FBH não-transformada (tabela 13). A progressão da severidade FHB de linhagens transgênicas e controles é mosPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 113/229

106/117 trada na figura 14. A figura 15 mostra a severidade FHB em 14 DAI em cabeças representativas das linhagens trasngênicas e de controle. Esses dados indicam que a sobre-expressão constitutiva de MtDef4 confere resistência a FHB em trigo Bobwhite transgênico.

[00199] O número de espigueta por espigões e rendimento de semente são dois parâmetros de rendimento agronomicamente importantes (Makandar e outros, Mol Plant Microbe Interact 19: 123-129, 2006). O número de espiguetas por espigão foi medido como o número médio de espiguetas por espigão de plantas 12 BW e 31 BW.A N° 11. o número de espigueta por espigão de plantas BW.A N° 11 transgênicas foi comparável aqueles de BW não-transgênicas (Figura 16, esquerda.). O rendimento de semente de espigões não inoculados (UN) e inoculados (IN) foi calculado como o rendimento de semente médio (g/espigão) de números variáveis de indivíduos por linhagem (Figura 16, Direita.). Existiu uma diferença significativa ente rendimento de semente espigões de Alsen, Norm e BW não-transênicos UN e IN, com base em estudantes t não pareados em P = 0,05. Não existiu nenhuma diferença significativa entre BW.A N° 11 transgênico UM e IN em P=0,001. Esses resultados indicam que expressão de MtDef4 não teve quaisquer efeitos adversos nos parâmetros de rendimento de plantas transgênicas.

Exemplo 14. Produção de Milho Transgênico MtDef4 [00200] Plantas de mais transgênicas contendo MtDef4.1 (H33R) de endereçamento extracelular foram produzidas pela transformação da construção MtDef4.1 (H33R) otimizada para monocotiledôneas (SEQ ID: 72; Figura 6) no vetor pZP212. Mais H99 panificável foi transformado usando o método em Sidorov et al 2006 como descrito no Exemplo 8. Os resultados de seleção PCR para as plantas MtDef4 T0 foram como segue:

Tabela 14: Resumo de Experimento de Trasformação de Mais com

Mais pa-

Linha-

Linhagens trans-

Linhagens

Porcen-

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107/117

nificável	gens pro- duzidas	plantadas de forma bem sucedida	PCR+ para MtDef4.1 (H33R)	tagem positiva
H99¹	39	34	17	50%

¹ Selecionada com Paronomicina.

[00201] Linhagens de milho transgênicos selecionadas prosseguiram para o estágio de seleção T1. As 20 plantas T1 de cada linhagem foram submetidas a ambas seleções PCR e ELISA, com resultados como segue: Tabela 15. Avaliação de Milho Transqênico Transformado com um Vetores de Expressão de Polipeptídeo MtDef4

Milho panificá- vel	Linhagens avalia- das	Linha- gens PCR+ para MtDef4	Linhagens com Inserções Únicas 1	Detecção de Proteí- naM- tDef4.1 (H33R)²	Porcen- tagem Selecio- nada
H99¹	14	8	8	6	42,9%

¹ Única inserção determinada por análise X2 de dados de segregação.

² Proteína MtDef4 detectada por ELISA em camada [00202] Linhagens T1 selecionadas com inserções de amostra estáveis foram cruzadas com B73 panificável pública usada amplamente para testagem subsequente.

Exemplo 15. Caracterização Adicional de Variantes de Cisteína

MtDef4 [00203] A proteína MtDef4.1 (H33R) e variantes em ponte de cisteína de Def4 foram expressas em Pichia pastoris como na descrição no exemplo 10. Polipeptídeos expressos foram recuperados de meios de cultura de Pichia seguinte a indução. As massas dos vários polipeptídeos MtDef4 expressos foram experimentalmente determinadas usando nano-ESI Quadrúpulo Tempo de voo em um instrumento QSTAR XL (Applied Biosystems, Foster City, CA) em modo de eletroaspersão

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108/117 positivo. Nos experimentos de expressão iniciais, a proteína de variante expressa em SEQ ID NOS: 136, 137, e 138 foi observada ou peso molecular experimentalmente determinado foi menor do que o esperado ou valor previsto foi calculado para Polipeptídeos MtDef4 de variante intactos seguindo secreção e remoção do peptídeo de sinal de fator alfa de levedura ou pró-peptídeo (ver Tabela 16). A atividade biológica das proteínas de controle e variante foi também determinada determinando o vaor IC50 contra Fusaríum graminearum. O MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO: 135) de comprimento completo tem um valor IC50 que foi apenas de cerca de 1,5 vezes maior do que a proteína MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO:SEQ ID NO: 125) tipo selvagem. A variante de proteína MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138) truncada teve um valor IC₅₀ que foi apenas de cerca de 1,8 maior do que a proteína MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 125) de controle tipo selvagem. Atividade biológica das variantes de cisteína SEQ ID NO: 136 e 137 foi reduzida em relação aproteína de controle MtDef4.1 (H33R) mas não completamente eliminada.

Tabela 16. Sumário dos dados de variante de cisteína MtDef4.1 (H33R)

	IC₅₀	MW¹ esperado	MW² observado
MtDef4.1<H33R) SEQ IDNO:125	3,66	5335.01	5334.664
MtDef4.1(H33R,C3S,C47S) SEQ IDNO:135	5.58	5304.89	5305,086
MtDef4.1 (H3 3R,C 14S,C34S) SEQ ID NO: 136	24.16	5304.89	4554.916
MtDef4. l(H33R,C20S,C41S) SEQ ID NO: 137	21.64	5304.89	4058.346
MtDef4.1 (H33R,C24S,C43 S) SEQ ID NO: 138	6.65	5304.89	4058.593

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109/117 ¹ Peso molecular esperado é calculado a partir de sequências completas do peptideo indicado.

² Peso molecular esperado é calculado a partir de sequência completa do peptideo indicado.

[00204] Tomados juntos, esses dados demonstram que certas pontes de cisteína (isto é, ligações de dissulfeto) em polipeptídeos MtDef4 podem ser interrompoidas para obter um polipeptídeo MtDef4 variante que retém atvidade antifúngica. Polipeptídeos MtDef4 que bloqueiam certas ligações de dissulfeto podem ser usados em aplicações onde uma proteína antifúngica que é mais prontamentedigerida por humanos ou animais é desejada. Os dados também indicam que polipeptídeos MtDef4 truncados retêm atividade antifúngica.

Exemplo 16 - Polipeptídeos MtDef4 truncados com atividade antifúnqiça [00205] Análise de computador de ambos os dados de sequência variante de cisteína MtDef4.1 e os pesos moleculares observados correspondentes da Tabela 16 (acima) foi usada para truncações MtDef4 com atividade antifúngica. Mais especificamente, a variante MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO:137) é prevista para dar surgimento a uma ou mais variantes que: a) faltam os últimos dez (10) resíduos de terminal C polipeptídeo MtDef4 maduro (SEQ ID NO: 152); b) faltam ambos os primeiro 6 resíduos de terminal N bem como os últimos 5 resíduos de terminal C do polipeptídeo MtDef4 maduro (SEQ ID NO: 153), e/ou faltam ambos os primeiros resíduos de terminais N bem como os últimos 9 rssíduos de terminal C do polipeptídeo MtDef4 maduro (SEQ ID NO: 154). A variante MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138) é prevista para dar surgimento a variante truncada que falta os útlimos dez (10)resíduos de terminal C do polipeptídeo MtDef4 maduro (SEQ ID NO: 155) e/ou uma variante truncada que falta o primeiro resíduo de terminal N bem como os útimos 9 resíduos de

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110/117 terminal C do polipeptídeo MtDef4 maduro (SEQ ID NO: 156). Cada uma dessas sequências é provida na tabela 17. As sequências de nucleotídeo que codificam os polipeptídeos MtDef4 que contêm mudanças de cisteína para serina podem ser designados com conteúdo G+C apropriado para expressão de planta, construídos em vetores de expressão de planta, e introduzidos em plantas transgênicas para produzir formas truncadas de proteína MtDef4 para controlar infecções fúngicas daquelas plantas.

Tabela 17. Comparação de um polipeptídeo MtDef4 com peptídeos

MtDef4 truncados com atividade antifúngica

SEQ IO NO:	Sequência de aminoácido	Tipo
137	RTCESQSHÉÍFKGPCASDHNSASVCQTERFSGGRCRGFRRRSFÇTTHC	Polipeptídeo MtDe£4 Maduro
152	RTC ESQ3 H fí FKGPC AS DH N SAS VOQTERFSGGRCRG ?	Polipeptídeo MtDe£4 Truncado
153	3 HRFKGPCASDH NSASVCQTERFSGGRCRG FRRRSF	Polipeptídeo MtDe£4 Truncado
154	TCESQ SliK FK&FCAE DHMSAS VCQTERFSGGRCRG FR	Polipeptídeo MtDe£4 Truncado
13»	RTCBSQÊHKFKG PCA3DHNCASV5QT ERFS GGRCRGFRRRCFSTTKC	Polipeptídeo MtDe£4 Maduro
155	R'1'C E SQSHKFKG PCA5 DHKCA5 VSQTERFS GGRCRGF	Polipeptídeo MtDe£4 Truncado
156	TCESQSHKFKG PCASDRHCASVSQTER FSGGRCRGFR	Polipeptídeo MtDe£4 Truncado

[00206] O uso de polipeptídeos de variante MtDef4 truncados para controlar infecções fúngicas é assim contemplado. Como usaod aqui a frase, Polipeptídeo MtDef4 truncado refere-se a um fragmento da proteína MtDef4 madura com atividade antifúngica em que um ou mais aminoácidos são selecionados a partir da extremidade de terminal N, extremidade de terminal C, o meio da proteína, ou combinações dos mesmos. Os polipeptídeos MtDef4 truncados que são úteis para controle fúngico podem compreender os polipeptídeos de SEQ ID NO; 152, 153, 154, 155, ou 156 e variantes dos mesmos que compreenPetição 870170026357, de 20/04/2017, pág. 118/229

111/117 dem substituições de aminoácido constituidoras dessas sequências. Os polipeptídeos MtDef4 truncados que são úteis para controle fúngico podem também compreender deleções de qualquer número de resíduos de terminal N a partir de 1 a 6 de um polipeptídeo MtDef4 maduro e/ou deleções de qualquer número de resíduos de terminal C a partir de 38 a 47 de um polipeptídeo MtDef4 maduro. Polipeptídeos MtDef4 que podem ser truncados no terminal N- e/ou terminal C para render proteínas antifúngicas incluem, mas não são limitados a, uma sequência de consenso MtDef4 (SEQ ID NO: 71), 30-76 aminoácidos de AL386553 (SEQ ID NO: 105), uma sequência MtDef4.1 (SEQ ID NO: 112), uma sequência MtDef4.2 (SEQ ID NO:114), uma sequência MtDef4.3 (SEQ ID NO: 116), uma sequência MtDef4.1 (H33R) (SEQ ID NO: 125), uma sequência MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO:135), uma sequência MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) (SEQ ID NO:136), uma sequência MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO:137), e uma sequência MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO:138).

[00207] Outras modalidades úteis incluem uma construção de DNA compreendendo um promotor heterólogo, uma sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 truncado com pelo menos 85% de sequência de identidade para 7 a 37 resíduos de aminoácido de SEQ ID NO: 112, e uma sequência de poliadenilação, em que o promotor, a sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 truncado e a sequência de poliadenilação são operativamente ligados. Alternativamente, uma sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 truncado com pelo menos 90% ou 95% de sequência de identidade para 7 a 37 resíduos de aminoácido de SEQ ID NO: 112 pode ser usada. A sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 truncado pode ser selecionada das sequências que codificam os polipeptídeos MtDef4 truncados de SEQ ID NOs: 152-156. A sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 truncado

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112/117 pode também compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo MtDef4 truncado com deleções de qualquer número de resíduos determinai N a partir de 1 a 6 de um polipeptídeo MtDef4 maduro e/ou deleções de qualquer número de resíduos de terminal C a partir de 38 a 47 de um polipeptídeo MtDef4 maduro. As construções de DNA que codificam polipetídeos MtDef4 truncados podem adicionalmente compreender sequências que codificam peptídeos de sinal e/ou outros sinais de endereçamento intracelular que são operativamente ligados a sequência que codifica o polipeptídeo MtDef4 truncado.

[00208] Ainda outras modalidades úteis da invenção incluem ácidos nuclêicos isolados que codificam um polipeptídeo MtDef4 truncado e polipeptídeos MtDef4 truncados que têm sido isolados.

[00209] Várias patentes e publicações não-patenteadas são citadas aqui, as descrições de cada uma das quais são incorporadas aqui para referência em sua totalidade.

[00210] Publicações não-patenteadas Bent AF, Kunkel BN, Dahlbeck D, Brown KL, Schmidt R, Giraudat J, Leung J, Staskawicz BJ. (1994) RPS2 of Arabidopsis thaliana: a leucina-rich repeat class of plant disease resistance genes. Science 265(5180): 1856 a 60.

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1/6

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Construção de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende:

(i) um promotor heterólogo;

(ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo MtDef4, sendo que a sequência de nucleotídeos selecionada é do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 72, 109, 124, 110, 143, 146, 147, 148, 149, e sequências de nucleotídeo degeneradas das mesmas codificando as mesmas sequências de aminoácidos; e (iii) uma sequência de poliadenilação, em que o dito promotor, a dita sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo MtDef4 e a dita sequência de poliadenilação são operacionalmente ligadas, e sendo que o dito promotor e a dita sequência de poliadenilação determina à expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o dito polipeptídeo MtDef4 quando introduzido na planta transgênica.
2. Construção de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende uma sequência que codifica um peptídeo de sinal e a sequência que codifica um peptídeo endereçador, que determina para a localização do dito polipeptídeo MtDef4 no retículo endoplasmático (ER), sendo que as ditas sequências codificam o dito peptídeo de sinal e o dito peptídeo endereçador são operacionalmente ligadas à dita sequência que codifica o dito polipeptídeo MtDef4.
3. Construção de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, e SEQ ID NO: 150.
4. Construção de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende uma sequência que codifica um marcador selecionável, selecionado do grupo

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2/6 consistindo em proteína fosfotransferase de neomicina, a proteína acetiltrasnferase de fosfinotricina, uma proteína sintase de 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato, uma proteína fosfotransferase de higromicina, uma proteína sintase de dihidropteroato, uma proteína sintase de acetolactato insensível a sulfonilureia, uma proteína Q insensível a atrazina, uma proteína de nitrilase capaz de degradar bromoxinil, uma proteína de desalogenase capaz de degradar dalapon, uma proteína mono-oxigenase de 2,4diclorofenoxiacetato, uma proteína reductase de di-hidrofolato insensível a metotrexato, e uma proteína sintase de octopina insensível a aminoetilcisteína.
5. Construção de DNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é inserida no genoma de uma planta, célula de planta ou semente.
6. Construção de DNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a planta, célula de planta ou semente é uma planta, célula de planta ou semente de monocotiledônea selecionada do grupo consistindo em células de plantas de cevada, milho, linho, aveia, arroz, centeio, sorgo, gramado, cana-de-açúcar, e trigo.
7. Construção de DNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a planta, célula de planta ou semente é uma planta, célula de planta ou semente de dicotiledônea selecionada do grupo consistindo em células de planta de alfafa, Arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couve-flor, aipo, citrus, algodão, uma abóbora cucurbita, eucalipto, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e tomate.
8. Método para inibir o crescimento de um fungo patogênico de planta, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de proPetição 870170065154, de 01/09/2017, pág. 6/13

3/6 ver uma planta transgênica compreendendo a construção de DNA, como definido na reivindicação 1, sendo que a dita planta transgênica expressa uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de pelo menos 1,0 PPM do polipeptídeo MtDef4 e foi infectada com um fungo patogênico de planta.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta monocotiledônea selecionada a partir do grupo consistindo em planta de cevada, milho, aveia, arroz, centeio, sorgo, gramado, cana-de-açúcar, e trigo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta dicotiledônea selecionada do grupo consistindo em alfafa, arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couve-flor, aipo, citrus, algodão, uma abóbora cucurbita, eucalipto, linho, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e tomate.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a construção de DNA adicionalmente compreende uma sequência que codifica um marcador selecionável, selecionado do grupo consistindo em proteína fosfotransferase de neomicina, a proteína acetiltrasnferase de fosfinotricina, uma proteína sintase de 5enol-piruvilshikimate-3-fosfato (EPSPS) resistente a glifosato, uma proteína fosfotransferase de higromicina, uma proteína sintase de dihidropteroato, uma proteína sintase de acetolactato insensível a sulfonilureia, uma proteína Q insensível a atrazina, uma proteína de nitrilase capaz de degradar bromoxinil, uma proteína de desalogenase capaz de degradar dalapon, uma proteína mono-oxigenase de 2,4diclorofenoxiacetato, uma proteína reductase de di-hidrofolato insensível a metotrexato, e uma proteína sintase de octopina insensível a

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4/6 aminoetilcisteína.
12. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de polipeptídeo MtDef4 maduro é de pelo menos 2,0 PPM.
13 Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o fungo patogênico de planta é selecionado do grupo consistindo em um Alternaria sp., um Ascochyta sp., um Botrytis sp.; um Cercospora sp., um Colletotrichum sp., um Diplodia sp., um Erysiphe sp., um Fusarium sp., Gaeumanomyces sp., Helminthosporium sp., Magnaporthe grisea, Macrophomina sp., um Nectria sp., um Peronospora sp., Phakopsora pachyrhizi, Phialophora gregata, um Phoma sp., um Phymatotrichum sp., um Phytophthora sp., um Plasmopara sp., um Puccinia sp., um Podosphaera sp., um Pyrenophora sp., um Pyricularia sp, um Pythium sp., um Rhizoctonia sp., um Scerotium sp., um Sclerotinia sp., um Septoria sp., Stenocarpella maydis, um Thielaviopsis sp., um Uncinula sp, um Venturia sp., e um Verticillium sp.
14. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R, C3S, C47S) (SEQ ID NO: 135), uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) (SEQ ID NO:136), uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R, C20S, C41S) (SEQ ID NO: 137), ou uma sequência de peptídeo madura MtDef4.1 (H33R, C24S, C43S) (SEQ ID NO: 138).
15. Método para obter uma planta transgênica, que inibe o crescimento de fungo patogênico de planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a. introduzir a construção de DNA, como definida na reivindicação 5, em uma planta, uma célula de planta ou um tecido de planta; e

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b. obter uma planta transgênica compreendendo a construção de DNA, que expressa uma quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de pelo menos 1,0 PPM do polipeptídeo MtDef4, desse modo obtendo uma planta transgênica que inibe o crescimento de fungo patogênico de planta.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta monocotiledônea selecionada a partir do grupo consistindo em cevada, milho, aveia, arroz, centeio, sorgo, gramado, cana-de-açuçar, e trigo.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta dicotiledônea selecionada do grupo consistindo em alfafa, arabidopsis, luzerna cortada, banana, brócolis, feijão, couve, canola, cenoura, aipim, couveflor, aipo, citrus, algodão, uma abóbora cucurbita, eucalipto, linho, alho, uva, cebola, alface, ervilha, amendoim, pimenta, batata, álamo, pinheiro, girassol, açafroa, semente de soja, morango, beterraba, batata-doce, tabaco, e tomate.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a quantidade inibidora de fungo patogênico de planta de polipeptídeo MtDef4 maduro é de pelo menos 2,0 PPM.
19. Método para identificar uma planta transgênica que inibe o crescimento de um fungo patogênico de planta, caracterizado pelo fato de que compreende:

i) expor uma planta transformada com a construção de DNA, como definida na reivindicação 1 a um fungo patogênico de planta; e, ii) observar a redução de um sintoma associado com a infecção de fungo patogênico de planta, medir crescimento fúngico diminuído na planta e/ou quantidades de medição de micotoxinas presentes na planta.

Petição 870170065154, de 01/09/2017, pág. 9/13

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20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende coinfectar plantas de controle que não contêm um transgene de codificação MtDef4 com os fungos patogênicos de plantas usados para infectar as plantas transgênicas que contêm um transgene de codificação MtDef4.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta de milho transgênico e o fungo patogênico de planta é Fusarium verticillioides, Fusarium moniliforme, Stenocarpella maydis, e/ou Cercospora zeaemaydis.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta de algodão transgênico e o fungo patogênico de planta é Fusarium oxysporum.
23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica é uma planta de semente de soja transgênica e o fungo patogênico de planta é Asian Soybean rust (Phakopsora pachyrhizi), Putrefação de raiz Phytophthora (Phytophthora sp.), Modelo branco (Sclerotinia sp.), Síndrome de morte súbita (Fusarium solani) e/ou putrefação de caule marrom (Phialophora gregata).
24. Sequência de polinucleotídeo isolado, caracterizada pelo fato de que é de uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R, C3S,C47S) madura (SEQ ID NO: 146), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R,C14S,C34S) madura (SEQ ID NO: 147), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R,C20S,C41S) madura (SEQ ID NO: 148), uma sequência de codificação MtDef4.1 (H33R,C24S,C43S) madura (SEQ ID NO: 149), e sequências de polinucleotídeos degeneradas das mesmas codificando as mesmas sequências de aminoácidos.

Petição 870170065154, de 01/09/2017, pág. 10/13

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Adesão ^{3EQ ID Sem Número}

1 80

AJ497738 (1)----τ----------------------MVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTEWSGCTJCRGFRBKCFCTTHC- SEQ ID NO:1

ANS59768 (1) ARSVPLVSTISXPIíHLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID »0:2

BQ152800 (1) TCESQSHKFKGPCASDHNCASVOQTERFSGGHCKGEBXRCFCTTBC- SEQ ID NO:3

AJ498514 (1) PSKVAEAKXCESQSRKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGaCRGFRBBCFCTTHC- SEQ ID HO: 4

AL385796 (1)---MERSVFI.VSTIFVFI,I,V1VATGPEMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTEBFSGGHCRGFRRKCFCTTHC- SEQ ID NO: 5

CA990100 (1) SDHNCASVCQTEKFSGGBCBGFBKRCFCTTBC- SEQ ID NO: 6

AN573770 (1)---MARSVELVFTIFVFLLI,WATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERF8GGHCRaFBRFCFCTTHC- SEQ ID NO: 7

BQ151713 (1> -----------------------------------------------------------RFSGGBCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:B

BE943479 (1) -----------STIFVFLLFLVATGPSWAEARTCESQSHKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGHCRGFFFRCFCTTHC- SEQ ID NO: 9

BG583978 (1) --------------------------------------------------NCASVCQTERFSGGHCRGFRRRjCFCTTHC- SEQ ID NO: 10

BG589141 (1) ---------------------------MVAKARTCESQSHKFKGPCANDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHW- SEQ ID NO: 11

BI310743 (1)---MJSFSSFGFTIPVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTEWSGGHCRQFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 12

BI269012 (1, --------------------------------------SHKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGBCRGFRRRCFCrnK:- SEQ ID NO: 13

BG452606 (1) ---------------------------KVAEAR9CESQSBKFKGPCASDHNOlSVCQTERFSGGHCftGFR8KCFCTTHC- SEQ ID NO: 14

AL381562 (1) ---------------VFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFKKRCFCTTHC- SEQ ID NO: 15

BE942125 (1) ---------LVSTIFVFLiLLVJlTGPSMVAEARICESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERrSGGHCRGFRBRCFCrTHC- SEQ ID NO: 16

BG455536 (1) -------TSLVSTIFVFIJiX,VATGPSMVAEARXCESQS8KFKGPCASDBNCASVCQTEKFSGGHCKGFRKRCFCTTHC- SEQ ID NO: 17

BQ157926 (1)------GTSLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSBKFKGPCASDHNCASVCQTERrSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 18

BI2S3488 (1, -------TSLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARICESQSHKFKGPCASDBNCASVCQTEWSGGHCRiGFKBBCFCTTBC- SEQ ID NO: 19

BC457444 (1) --------HQVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFBBRCFCTTBC- SEQ ID NO:20

BG5B2065 (1, -------------IFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSBXFKGPCASDHNCASVCQTEFFSGGHCRGFRRRCFCTTEC- SEQ ID NO:21

AH560708 (1) ---------------------------MVAXARTCESQSBKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGHCBGFRKBCFCTTHC- SEQ ID NO: 22

BQ14413O (1) --------------------------8MVAEAKTCESQSHXFKGFCASDHNCASVCQTEBFSGGSCRGFRRRCFCTTBC- SEQ ID NO:23

BG454920 <1) MVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGeHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:24

BM812997 (1) VPLVSTIFVTLLLLVATGPSMVAEAKTCESQSKKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCBGFRBRCFCTTHC- SEQ ID NO:25

CX538973 (1)-----GSVPLVSTXFVFLLU,VATGPSMVAEARICESQSHXFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGHCRGFRí«CFCTTHC- SEQ ID NO:26

BF003550 (1)---MARSVPLVSTIFVFWLLVATG-------------------------------------------------------SEQ ID NO:27

BF003550 (1, GPSMVAEABICESQSBXFKGPCASDHNCASVCQTERFSGaíCRGEBRRCFCTTHC- SEQ ID NO:28

BQ122363 <1> GPSNVAEARICESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGBCRGFHBRCFCTTHC- SEQ ID NO:29

BQ144201 (1) ATGPSMVAKARTCESQSBKFKGPCASDBNCASVCQTEKFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:30

AL381563 (1) VFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRiCrcTTHC- SEQ ID NO: 31

CA918547 (1)------SVPLVSTIFVFIXLLVATOPSMVAEARTCESQSBKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCriBC- SEQ ID NO : 32

AL386553 (1,---MRRSVPLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFFGGHCRGFRERCFCTTHC- SEQ ID NO: 33

BQ156240 (1) FVCQTERFFGGHXReFRXXCFCTrHC- SEQ ID NO: 34

BQ144143 <11 ---------------------------------------------«KGDHNCASVCQTEKFSGGB---------------SEQ ID NO: 35

BQ144143 (1) CRGFRRRCFCTTBC- SEQ ID NO: 36

BF634083 (1) BC- SEQ ID NO: 37

BI269582 (1) QTERFFGGHCRGFRRXCFCTTHC- SEQ ID NO:38

BQ155489 (1) ATGPSHVAXARTCESQSHKFKGPXXSDHNXXXVCQTERFFGGHCRGFRRXCFCTTHC- SEQ ID NO: 39

BG455005 (1) GFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:40

BQ156458 (1) LVAXGPSMVAEARTCBSQSXKFKGPCXSDXNCAXVCQTERFPeGHXRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:41

BG454853 (1) IPBEGGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 42

BQ151713 (1) SABGARSVPLVSTIFVFLLLI.VATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTL---------------------SEQ ID NO: 43

BG583978 (1, ---------------VFLUXVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASD-------------------------------SEQ ID NO:44

BG583286 (1, --------------FVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQ-----------------------SEQ ID NO: 45

BE998785 (1,----ARSVPLVSTIFVFULI,VATGPSKVAEARXCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 46

AL386552 (1,---MARSVFLVSTXFVFLUXVATGPSMVAEARTCESQSBICFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 47

BQ152697 (1)----ARSVPI.VSTIFVFmiVATGPSMVAEARTCESQSBXFKGPCASDHNCASVC2TBRFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 48

CX523737 (1,----ARSVPLVSTIFVFLLU,VATGPSMVAE*BTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERrSOGHCHGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 49

CX538427 (1)----ARSVPX.VSTIFVFULI.VATGPSKVAEARTCE8QSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 50

A1387540 (1,---MARSVPLVSTIFVFIALLVATGPSMVAEARTCESQSHXFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:51

AL387541 (1)---MARSVPLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSBKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 52

AW287924 <1)---MARSVPLVSTIFVFLIiLVATGPSHVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCPGFRRPCFCTTHC- SEQ ID NO:53

BE941578 <i) —uutsvei.vsTZFVFUjj,viiTafStiV3aaxKXBQSBKFKee<»SDBítaísvcQrEitrsatSHCRaetatRCFCTTac- seq id no.-54

BF636345 (1)---MARSVPLVSTIFVFUXIVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:55

BE999096 (1)---MARSVPLVSTIFVFUiLVATGPSNVGEARTCKSQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGeHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 56

BG450117 (1,---MARSVFBVSTIFVFU£I,VATGPSHVAEARXCESQSBKFKGPCASDHMCASVCQTERFSGGBCKGFRRXCFCTTHC- SEQ ID NO:57

BI263014 (1)---MRRSVPLVSTIFVFLLLI.VATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:58

BI270683 (1)---MARSVPLVSTIFVFLIiLVATGPSHVAEAKrCESQSKKFKGPCASDHNCKSVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTBC- SEQ ID NO:59

BI310744 (1,---MARSVPLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:60

BQ144133 (1,---MARSVPLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSBKFFGPCASDHNCASVCQTERrSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:61

BQ145044 (1)---MARSVPLVSTIFVTLLÜVATGPSMVAEARTCESQSKKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGBCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 62

BQ153111 (1)---M»RSVPLVSTIFVFLLLX.VATGPSMVAEARTCESQSHKFXGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTBC- SEQ ID NO: 63

BQ154835 (1)---MARSVPLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCKSVCQTERFSOG8CRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:64

BQ157484 (1)---MARSVPLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGBCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:65

BQ157772 (1,---MARSVPLVSTIFVFLUC1VATGPSMVAEARTCESQSBKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGBCRGFRRRCFCTTBC- SEQ ID NO: 66

BQ159085 (1)---MARSVPLVSTIFVFLLLLVATGPSMVAEARTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 67

CX535058 (1)---KARSVPLVSTItVFLLLLVATGPSMVAIARTCESQSHKFKGPCASDBNCASVCQTERFSGGHCRGPRRRCFCTTHC- SEQ ID NO: 68

Bf633368 (1)---MARSVPI.V8TIFVFBUU.VATGPSMVAEARTCESQSHKFKGFCASDHNCASVCQTERFSGGHCRGFRRRCFCTTBC- SEQ ID NO:69

Cosenso (1J maravplYatlfvfllllTatgpagvaaaRTCESQSHKFKGPCASDHNCASVCQTERFSGGBCRGFRRRCFCTTHC- SEQ ID NO:70

Maduro (1) RTCESQSHKHCGPCASDHNCASVCQTEKFSGGHCRGFRRRCFCTTSC- SEQ ID NO: 71

Chave: Números de Acesso GenBank para as sequências de nucleotídeo correspondentes dos ESTs que codificam os peptídeos deduzidos são montrados

Fig 1.

2/16 £

<υ

Q

Φ

U

a.

ο.

\0 *

3/16 leipoiui o;udiupsaj3 ap oeâ;qiu| ap waBeiuaojod (Q c

õ

O u

CL

Φ

Ό

O mi o->

w

Φ o

c o

4/16

Fig 4.

5/16

6/16

MARSVPLVSTI FVFLLLLV 1 CCATGGCTAGGTCCGTGCCACTCGTGTCCACCATCTTCGTGTTCCTCCTCCTCCTCGTGG

ATGPSMVAEARTCESQSHKF 61 CCACCGGCCCAAGCATGGTCGCCGAGGCCAGGACCTGCGAGTCCCAATCCCACAAGTTCA

KGPCASDHNCASVCQTERFS 121 AGGGCCCATGCGCCAGCGACCACAACTGCGCCTCCGTGTGCCAAACCGAGCGCTTCTCCG

GGRCRGFRRRCFCTTHC*

180 GCGGCAGGTGCAGGGGCTTCCGCAGGAGGTGCTTCTGCACCACCCACTGCTAATCTAGA

Fig 6

7/16 (Ρ

Ω

W>

«M

8/16

9/16

10/16

Saci (2067)

Ω.

X

LU

TO

O

TO

Ό _l

LU

Ω

4049 bp fc

u.

11/16

Sequência de sinal )BSequência de

12/16 (0 ο

c φ

ο σ

φ

Q

200

150

100

-ά «ρ

θ' &

Α χφ·

Fig 12 dx &

dx

13/16

14/16

9Hd spepusAss θρ % □ 4 DAI 9 DAI

30- §11 DAI 14 DAI

15/16

16/16 (slu6) 3)U3LU3S θρ 0)U3lUlpU3H .SP te

XTCMOOOÍO^CMO r~ τ- ve6ids3 / „u B}sn6ids3