BRPI0722195A2

BRPI0722195A2 - seqüência de nucleotìdeo isolada, vetor de expressão, método de impactar a fertilidade masculina em uma planta, método de restaurar a fertilidade masculina de uma planta mach-estéril, método de produção de sementes hìbridas, região de regulação isolada, região reguladora, método de manutenção de um estado homozigoto recessivo de uma planta, método de restaurar a fertilidade masculina em uma planta macho-estéril.

Info

Publication number: BRPI0722195A2
Application number: BRPI0722195-9A
Authority: BR
Inventors: Marc C Albertsen; Yongzhong Wu; Mary Trimell; Bailin Li; Tim W Fox; Keith Lowe; Marianna Faller
Original assignee: Pioneer Hi Bred Internac Inc; Du Pont
Priority date: 2007-08-03
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2012-10-09
Also published as: EP2631243A2; EP2173883A1; EP2631243A3; WO2009020458A1; CN101802201A; AR101779A2; AR064085A1; CL2008000072A1; BRPI0722195B1; EA201070229A1; CA2695530C; CA2695530A1; ZA201000532B; MX2010001347A

Abstract

SEQüêNCIA DE NUCLEOTìDEOS ISOLADA, VETOR DE EXPRESSãO, MéTODO DE IMPACTAR A FERTILIDADE MASCULINA EM UMA PLANTA, MéTODO DE RESTAURAR A FERTILIDADE MASCULINA DE UMA PLANTA MACHO-ESTéRIL, MéTODO DE PRODUçãO DE SEMENTES HìBRIDAS, REGIãO DE REGULAçãO ISOLADA, REGIãO REGULADORA, MéTODO DE MANUTENçãO DE UM ESTADO HOMOZIGOTO RECESSIVO DE UMA PLANTA, MéTODO DE RESTAURAR A FERTILIDADE MASCULINA EM UMA PLANTA MACHO-ESTéRIL. São descritas sequências de nucleotídeos do gene Mscal, essencial para a fertilidade masculina em plantas, com a molécula de DNA e a seqüência de aminoácidos estabelecida. Seqüências do promotor e as suas regiões essenciais também são identificadas. As seqüências de nucleotídeos são úteis para afetar a fertilidade masculina em plantas.

Description

SEQÜENCIA DE NUCLEOTIDEOS ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODO DE IMPACTAR A FERTILIDADE MASCULINA EM UMA PLANTA, MÉTODO DE RESTAURAR A FERTILIDADE MASCULINA DE UMA PLANTA MACHO-ESTÉRIL, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE SEMENTES HÍBRIDAS, REGIÃO DE REGULAÇÃO ISOLADA, REGIÃO REGULADORA, MÉTODO DE MANUTENÇÃO DE UM ESTADO HOMOZIGOTO RECESSIVO DE UMA PLANTA, MÉTODO DE RESTAURAR A FERTILIDADE MASCULINA EM UMA PLANTA MACHO-ESTÉRIL.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O desenvolvimento de reprodução de plantas híbridas tem possibilitado avanços consideráveis na qualidade e quantidade das culturas produzidas. Rendimentos aumentados e a combinação de características desejáveis, como resistência a doenças e insetos, tolerância ao calor e a seca, juntamente com as variações na composição de plantas, são todos possíveis por causa dos procedimentos de hibridização. Esses procedimentos freqüentemente dependem fortemente do fornecimento do pólen contribuído por um progenitor macho para que um progenitor fêmea possa produzir o híbrido resultante.

As culturas de campo são criadas através de técnicas que se aproveitam do método de polinização das plantas. A planta é auto-polinizada se o pólen de uma flor é transferido para a mesma ou para outra flor da mesma planta ou de uma planta geneticamente idêntica. Uma planta é polinizada por cruzamento quando o pólen vem de uma flor presente em uma planta diferente.

Em certas espécies, como Brassica campestris, a planta é normalmente auto-estéril e pode ser polinizada apenas por cruzamento. Em espécies autopolinizadoras, como soja e algodão, as plantas macho e fêmea são anatomicamente justapostas. Durante a polinização natural, os órgãos reprodutores masculinos de uma dada flor polinizam os órgãos reprodutores femininos da mesma flor.

As plantas de milho (Zea mays L.) apresentam uma situação única em que elas podem ser reproduzidas tanto por autopolinização quanto por técnicas de polinização cruzada. 0 milho tem flores masculinas, localizado no pendão e flores femininas, localizadas na espiga, na mesma planta. Esta planta pode fazer autopolinização ou polinização cruzada. A polinização natural ocorre no milho quando o vento sopra o pólen dos pendões para as sedas que se projetam a partir do topo das espigas incipientes.

0 desenvolvimento de híbridos de milho requer o desenvolvimento de linhagens homozigóticas, no cruzamento dessas linhas, e na avaliação dos cruzamentos. A reprodução de linhagens e seleção recorrente são dois dos métodos de reprodução utilizados para o desenvolvimento de linhagens puras a partir de populações. Programas de reprodução combinam características desejáveis de duas ou mais linhagens puras, ou de várias fontes de ampla base, em grupos de reprodução a partir dos quais novas linhagens puras são desenvolvidas por auto-fecundação e seleção de fenótipos desejados. Uma variedade de milho híbrido é o cruzamento de duas dessas linhagens puras, cada uma das quais pode ter uma ou mais características desejáveis ausentes na outra ou que complemente a outra. As novas linhagens são cruzadas com outras linhagens puras e os híbridos destes cruzamentos são avaliados para determinar aqueles que têm potencial comercial. A progênie híbrida da primeira geração é designada Fl. No desenvolvimento de híbridos são solicitadas somente as plantas híbridas Fl. O híbrido Fl é mais vigoroso do que seus pais puros. Este vigor híbrido, ou heterose, pode se manifestar de várias maneiras, incluindo o aumento do crescimento vegetativo e maior rendimento.

Sementes de milho híbrido podem ser produzidas por um sistema de esterilidade masculina incorporando-se o despendoamento manual. Para produção de sementes híbridas, o pendão masculino é removido da linhagem progenitora feminina crescente, que pode ser plantada no padrão de várias linhas alternadas com a linhagem do progenitor masculino. Consequentemente, desde que haja isolamento suficiente de fontes de pólen de milho estrangeiros, as espigas da linhagem feminina serão fertilizadas apenas com o pólen da linhagem masculina. A semente resultante é, portanto, um híbrido (Fl) e formará plantas híbridas.

Variações de campo que impactem o desenvolvimento das plantas podem resultar em pendoamento de plantas após o despendoamento manual do progenitor feminino estar concluído. De outra forma, um pendão da planta feminina da linhagem pura pode não ser completamente removido durante o processo de despendoamento. Em qualquer hipótese, o resultado é que a planta fêmea irá espalhar pólen com sucesso e algumas plantas fêmeas serão auto-polinizadas. Isso resultará no colhimento de sementes das fêmeas puras juntamente com as sementes híbridas, que são normalmente produzidas. As sementes fêmeas puras não apresentam heterose e, portanto, não são tão produtivas como as sementes Fl. Além disso, a presença de sementes fêmeas puras pode representar um risco de segurança de germoplasma para a empresa que produzir o híbrido.

Alternativamente, a linhagem feminina pode ser mecanicamente despendoada por máquina. 0 despendoamento mecânico é quase tão confiável quanto o despendoamento manual, mas é mais rápido e menos oneroso. No entanto, a maioria das máquinas de despendoamento produz mais danos às plantas do que o despendoamento feito à mão. Assim, nenhuma forma de despendoamento é inteiramente satisfatória atualmente, e uma necessidade para alternativas que reduzam ainda mais os custos de produção e eliminem a autopolinização do progenitor feminino na produção de sementes híbridas continua a existir.

Um sistema confiável de esterilidade masculina genética proporcionaria vantagens. O trabalhoso processo de despendoamento pode ser evitado em alguns genótipos, usando-se linhagens macho estéril citoplasmático (CMS). Na ausência de um gene restaurador de fertilidade, as plantas de uma linhagem CMS são machos estéreis em conseqüência de fatores resultantes do genoma citoplasmático, ao contrário do nuclear. Assim, esta característica é herdada exclusivamente através do progenitor feminino em plantas de milho, uma vez que apenas a fêmea fornece citoplasma a semente fertilizada. Plantas CMS são fertilizadas com o pólen de uma outra linhagem que não é macho- estéril. 0 pólen da segunda linhagem pode ou não contribuir com genes que fazem as plantas híbridas machos-férteis. Normalmente, as sementes de milho normal despendoado e as sementes produzidas de CMS de um mesmo híbrido devem ser misturadas para assegurar que cargas adequadas de pólen estejam disponíveis para a fecundação quando as plantas híbridas são cultivadas, e para assegurar a diversidade citoplasmática.

Um tipo de esterilidade genética é divulgado em U.S. Patents 4,654,465 e 4,727,219 de Brar, et al. No entanto, esta forma de esterilidade masculina genética exige a manutenção de múltiplos genes mutantes em locais separados dentro do genoma e requer um sistema complexo de marcação para se rastrear os genes e se fazer uso do sistema convenientemente. Patterson também descreveu um sistema gênico de translocações cromossômicas que pode ser eficaz, mas que é complicado. (Veja, U.S. Patents No. 3,861,709 e 3,710,511.)

Muitas outras tentativas foram feitas para melhorar estes sistemas. Por exemplo, Fabijanski, et al. desenvolveram vários métodos de causar esterilidade masculina em plantas (ver EPO 89/3010153.8 publicação no. 329.308 e PCT/CA90/00037 aplicação PCT publicada como WO 90/08828). Um método inclui a entrega, na planta, de um gene que codifica uma substância citotóxica associado a um promotor específico de tecido masculino. Outro envolve um sistema anti-senso em que um gene essencial para a fertilidade é identificado e um antisenso deste gene é inserido na planta. Fabijanski, et al. mostra também vários sistemas de antisensos citotóxicos. Veja EP0329308. Ainda outros sistemas usam genes "repressores" que inibem a expressão de um gene essencial para a esterilidade masculina. Veja PCT/GB90/00102, publicado como WO 90/08829. Para ainda outro exemplo veja US Patent No. 6,281,348. Um outro melhoramento deste sistema é um descrito em U.S. Patent No. 5,478,3 69 em que um método de transmitir a esterilidade masculina controlável é conseguido através da inativação ou, de outro modo, silenciando um gene nativo da planta que seja essencial para a fertilidade masculina e transformando a planta com o gene essencial à fertilidade masculina ligado a um promotor indutível, controlando a expressão do gene. Ou seja, a expressão da seqüência endógena é impedida, por qualquer dos métodos já conhecidos por um perito na arte, de impedir a expressão de uma seqüência (como um método antisenso, Co-supressão, mutação, o uso de ribozimas ou hairpins, diferentes sistemas de repressão e similares, conforme discutido). A planta é, portanto, constitutivamente estéril, tornando-se fértil somente quando o promotor é induzido e seu gene ligado à fertilidade masculina é expresso.

Em uma série de circunstâncias, uma característica de planta masculina estéril é expressa pela manutenção de um estado homozigoto recessivo. As dificuldades surgem na manutenção da condição homozigótica, quando um gene de restauração deve ser utilizado para manutenção. Por exemplo, uma mutação natural em um gene essencial para a fertilidade masculina pode conferir um fenótipo de esterilidade masculina para as plantas, quando este alelo mutante está no estado de homozigose. Porém, uma vez que esta homozigose resulta em esterilidade masculina, a linhagem macho-estéril homozigoto não pode ser mantida. A fertilidade é restabelecida quando a forma não-mutante do gene é introduzida na planta. No entanto, esta forma de manutenção remove a condição desejada de homozigoto recessivo, restaura em plenitude a fertilidade masculina em metade da descendência resultante, e impede a manutenção das linhagens maternas de machos estéreis puros. Esses problemas podem ser evitados quando a produção de pólen contendo o gene da restauração é eliminada, proporcionando assim uma planta mantenedora produzindo apenas pólen que não contenha o gene da restauração, e os descendentes conservam a sua condição de homozigoto quando fertilizados por tal pólen. Um exemplo de uma abordagem é mostrado em Dellaporta et al. 6,743,968, no qual a planta é produzida contendo um construção hemizigótica, compreendendo um gene que produz um produto fatal para uma célula, ligado a um promotor pólen-específico, e ao gene de restauração. Quando cruzado com a planta macho estéril homozigoto recessivo, a progênie mantém então o estado homozigoto recessivo.

Como se observa, um aspecto essencial da maior parte dos trabalhos em curso com os sistemas de esterilidade masculina, é a identificação de genes que afetam a fertilidade masculina. Tal gene pode ser usado em uma variedade de sistemas para controlar a fertilidade masculina, incluindo os descritos neste documento.

Esterilidade masculina genética resulta de uma mutação, supressão ou outro impacto em um dos genes essenciais para uma etapa específica na microesporogênese, o termo aplicado a todo o processo de formação de pólen. Esses genes podem ser referidos coletivamente como genes de fertilidade masculina (ou, alternativamente, os genes da esterilidade masculina). Há muitos passos na via global, onde a função do gene impacta na fertilidade. Isto parece adequadamente suportado pela freqüência de esterilidade genética de macho em milho. Novos alelos de esterilidade masculina mutantes são descobertos em materiais que variam de linhagens elite a populações não adaptadas.

Na patente No. 5,478,3 69 está descrito um método pelo qual o gene de fertilidade masculina Ms45 foi rotulado e clonado no cromossomo 9 do milho. Anteriormente, havia sido descrito um gene da esterilidade masculina no cromossomo 9, ms2, que nunca havia sido clonado e seqüenciado. Este não é alélico para o gene referido na patente '369. Veja Albertsen, M., Phillips, RL, "Developmental Cytology of 13 Genetic Male Sterile Loci in Maize" Canadian Journal of Genetics & Cytology 23:195-208 (Jan. 1981). O único gene de fertilidade clonado antes deste tinha sido o gene de Arabadopsis descrito em Aarts, et al., supra.

Exemplos de genes que tenham sido descobertos posteriormente e que são fundamentais para a fertilidade masculina são numerosos e incluem o gene ABORTED MICROSPORES (AMS) de Arabidopsis, Sorensen et al. The Journal Plant (2 003) 33 (2) : 413-423), o gene MSl de Arabidopsis (Wilson et al. The Journal Plant (2001) 39 (2) :170-181); o gene NEFl (Ariizumi et al. The Journal Plant (2004) 39 (2) :170-181); o gene AtGPATl de Arabidopsis (Zheng et al. The Plant Cell (2 003) 15:1872- 1887), a mutação de dde2-2 de Arabidopsis mostrou-se deficiente no gene aliene óxido sintase (Malek et al. Planta (2002) 216: 187-192), o gene pólen-1 faceless de Arabidopsis (flpl) (Ariizumi et al, Plant Mol. Biol. (2003) 53:107-116); o gene MALE MEIOCYTE DEATHl de Arabidopsis (Yang et al. The Plant Cell (2003) 15: 1281-1295), o gene dedo de zinco tapete-específico, TAZl (Kapoor et al. The Plant Cell (2002) 14:2353-2367), e o gene TAPETUM DETERMINANTl (Lan et al, The Plant Cell (2003) 15:2792-2804)

A tabela abaixo lista um número de mutantes de fertilidade masculina ou genes conhecidos de Zea mays.

<table>table see original document page 8</column></row><table> msl7 macho estéril 17 msl7, macho estéril 17 Emerson, RA. 1932. Science 75:566 ms2 macho estéril 2 macho estéril 2, ms2 Eyster, WH. 1931. J Hered 22 :99-102 ms 20 macho estéril 20 ms20, macho estéril 20 Eyster, WH. 1934. Genetics of Zea mays. Bibliographia Genetica 11:187-392 ms23 macho estéril 23 : ms*-6059, ms*- 6031, ms*-6027, ms*-6018, ms*-6011, ms35, macho estéril 23, ms *-Bear 7, ms23 West, DP e Albertsen, MC. 1985. MNL 59:87 ms24 macho estéril 24 ms24, macho estéril 24 West, DP e Albertsen, MC. 1985. MNL 59:87 ms25 macho estéril 25 ms*-6065, ms*- 6057, ms25, macho estéril 25, ms*- 6022 Loukides, CA; Broadwater, AH; Bedinger, PA. 1995. Am J Bot 82:1017- 1023 ms27 macho estéril 27 ms27, macho estéril 27 Albertsen, MC. 1996. MNL 70:30-31 ms28 macho estéril 28 ms28, macho estéril 28 Golubovs kaya, IN. 1979. MNL 53:66-70 ms29 macho estéril 29 macho estéril 29, ms*-JH84A, ms29 Trimnell, MR et al. 1998. MNL 72:37-38 ms3 macho estéril 3 Grupo 3, ms3, macho estéril 3 Eyster, WH. 1931. J Hered 22:99-102 ms 30 macho estéril 30 ms30, msx, ms*- 6028, ms*-Li89, macho estéril 30, ms*-LI89 Albertsen, MC et al. 1999. MNL .73:48 ms31 macho estéril 31 ms*-CG889D, ms31, macho estéril 31 Trimnell, MR et al. 1998. MNL 72:38 ms32 macho estéril 32 macho estéril 32, ms 3 2 Trimnell, MR et al. 1999. MNL 73:48-49 <table>table see original document page 10</column></row><table> 6026 ms7 macho estéril 7 ms 7, macho estéril 7 Beadle, GW. 1932. Genetics 17:413-431 ms8 macho estéril 8 macho estéril 8, ms 8 Beadle, GW. 1932. Genetics 17:413-431 ms9 macho estéril 9 Grupo 5, macho estéril 9, ms9 Beadle, GW. 1932. Genetics 17:413-431 ms49 macho estéril 49 ms*-MB92, ms49, macho estéril 49 Trimnell, M et al. 2002. MNL 76:38-39

Ainda existe a necessidade de se identificar as seqüências de nucleotideos essenciais para a fertilidade masculina em plantas. Ainda permanece também a necessidade de se identificar as regiões reguladoras que direcionem, preferencialmente, a expressão ao tecido do masculino de uma planta.

Na presente invenção os inventores fornecem novas moléculas de DNA e as seqüências de aminoácidos codificados que são essenciais para a fertilidade masculina em plantas. Estas podem ser usadas em qualquer um dos sistemas onde o controle da fertilidade é útil, incluindo os descritos acima.

Assim, um objeto da invenção é fornecer uma seqüência de ácido nucléico, a expressão do qual é essencial para a fertilidade masculina em plantas e, no qual uma mutação da seqüência provoca a esterilidade masculina, quando no estado de homozigose.

Outro objetivo é fornecer as regiões reguladoras que direcionem preferencialmente a expressão de seqüências de nucleotideos operacionalmente ligadas ao tecido(s) masculino(s) de uma planta.

Um objeto maior da invenção é fornecer um método de usar tais seqüências de nucleotideos para mediar à fertilidade masculina em plantas.

Outros objetos da invenção ficarão evidentes na descrição e reivindicações que se seguem. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere às seqüências de ácido nucléico e, especificamente, às moléculas de DNA e aos aminoácidos codificados por estas moléculas de DNA, que são fundamentais para a fertilidade masculina. 0 impacto da expressão funcional de tais seqüências resulta na mediação da fertilidade masculina. Regiões reguladoras que direcionam a expressão preferencialmente para o tecido masculino também são fornecidas. A invenção também se refere ao uso de tais seqüências de nucleotídeos para mediar à fertilidade das plantas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um mapa do locus do gene Mscal da fertilidade masculina.

A Figura 2 é a seqüência de nucleotídeos do gene Mscal (SEQ ID NO: 1)

A figura 3 é a seqüência da proteína de Mscal (SEQ ID NO: 2) A Figura 4 é a seqüência de nucleotídeos de mscal-ref (SEQ ID NO: 3)

A Figura 5 é um alinhamento de alelos mscal-mgl2 férteis e estéreis, (a seqüência de nucleotídeos dos férteis é SEQ ID NO: 4; a seqüência da proteína é SEQ ID NO: 5, a seqüência de nucleotídeos de mscal-mg!2 estéreis é SEQ ID NO : 6 e a seqüência de proteína é a SEQ ID NO: 7). A seqüência do alelo fértil contém 490 pares de bases adicionais, excluídos da região 3' da seqüência estéril.

A Figura 6 mostra o alinhamento do gene Mscal do tipo selvagem de milho híbrido Missouri 17 (Mol7) (SEQ ID NO: 8) com os alelos mscal-mgl2 em uma planta fértil (MG12-Fert) (SEQ ID NO: 9) e numa planta estéril (Mgl2-Ster) (SEQ ID NO: 10). A região circulada é referente ao motivo redox CCMC (SEQ ID NO: 11) e a do sítio de ligação de gluteredoxina (ligação GSH) (SEQ ID NO: 12) é sublinhada. A Figura 7 mostra o alinhamento dos alelos de mscal, Ms22-6036 provenientes de uma planta fértil (Fert) SEQ ID NO: 13), com iHtia planta estéril (6036s) (SEQ ID NO: 14) . A seqüência estéril contém uma inserção de 850 pares de bases na extremidade 3'. A inserção contém TIRs pequenas perfeitas de oito pares de bases (indicado como "TIR"), com cerca de 200 pares de bases de uma seqüência tipo transposon.

A Figura 8 mostra um gráfico de alinhamento da seqüência Mscal com os alelos mscal-ref mutantes (mscal-mgl2 e mscal-6036) . A Figura 9 é o promotor íntegro do Mscal (SEQ ID NO: 15) A FiguralO é a seqüência de nucleotídeos do gene Mscal de arroz (SEQ ID NO: 16)

A Figura 11 é a seqüência da proteína Mscal de arroz (SEQ ID NO: 17)

A Figura 12 é o promotor íntegro de Mscal de arroz (SEQ ID NO: 18)

Figura 13 é a seqüência alelo mscal de arroz (SEQ ID NO: 19).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Todas as referências citadas estão aqui incorporadas por referência.

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um daqueles com competências normais na arte à qual pertence esta invenção. Salvo indicação em contrário, as técnicas empregadas ou omissas são metodologias padronizadas bem conhecidas daqueles com competências normais na arte. Os materiais, os métodos e os exemplos são ilustrativos e não limitantes.

A invenção inclui o uso das seqüências mostradas aqui para impactar a fertilidade masculina em uma planta, ou seja, para controlar a fertilidade masculina através da manipulação do genoma, utilizando os genes da invenção. A título de exemplo, sem limitação, qualquer um dos métodos descritos acima pode ser usado com as seqüências da invenção, tal como introduzir uma seqüência mutante em uma planta para causar esterilidade, causar mutações na seqüência nativa, introduzir um "antisenso" da seqüência na planta, se utilizar de formações hairpin, ligando estas com outras seqüências para controlar a sua expressão, ou qualquer um de muitos processos disponíveis a um técnico no assunto para impactar a fertilidade masculina em uma planta.

0 gene Mscal (também conhecido como Ms22) aqui descrito está localizado no braço curto do cromossomo 7 de milho e seu alelo dominante codifica uma proteína essencial para a fertilidade masculina. 0 mapa do locus é representado na Figura .1. 0 gene Mscal pode ser utilizado nos sistemas descritos acima, e em outros sistemas para impactar a fertilidade masculina.

Mutações referidas como ms22 ou mscal foram primeiramente notificadas como machos fenotipicamente estéreis com as anteras não exsudando do pendão e ausência de tecido esporogênico. West e Albertsen (1985) Maize Newsletter 59:87; Neuffer et al. (1977) Mutants of maize. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. O locus mutante foi originalmente denominado ms22, entretanto, mais tarde foi alterado para mscal, ou antera convertida de macho estéril. Veja Chaubal et al. "The trans forma ti on of anthers in the mscal mutant of maize" Planta (2003)216:778-788.

O estudo dos mutantes inclui coletar as anteras de espiguetas jovens de pendões imaturos em famílias de plantas segregando em 1:1 para plantas com esterilidade masculina /fertilidade masculina para o estudo microscópico. Utilizando- se uma família F2 segregando para a mutação mscal, obteve-se o isolamento do DNA de plantas macho estéreis, resolvido por eletroforese, hibridizado com marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, e mapeado no cromossomo 7. Veja Chaubal et al. "The transformation of anthers in the mscal mutant of maize" Planta (2003)216:778-788. Os mutantes mscal são incomuns no fato de que o primórdio do estame desenvolve-se normalmente, mas a diferenciação e divisão celular não ocorrem, com o tecido desenvolvendo-se como tecido vascular não-funcional. Não há divisão assimétrica das células arquesporiais nos grandes esporógenos primários e nas pequenas células parietais primárias. Em vez disso, a antera contêm células parenquimatosas e vertentes vasculares não funcionais, sem formação de células normais de antera, como micrósporos, tapete, a camada média e o endotécio. Todas as camadas de células da antera convertem-se em plantas mutantes nas estruturas vegetativas. Como o gene Mscal opera após a iniciação primordial do estame e antes da divisão das células arquesporiais, a interrupção da expressão do gene age como um bloqueio do desenvolvimento. Ao contrário de outros genes de esterilidade masculina, como MAClt EMSl ou GNE2 (Sorensen et al. (2002) Plant J. 29:581-594) ao invés de se quebrar as células no estágio quarteto, os microsporos nunca se desenvolvem. Mutações no gene SPOROCYTELESS/NOZZLE agem no início do desenvolvimento, mas impactam ambas a antera e a formação de óvulos de tal forma que as plantas são machos e fêmeas estéreis. Yang et al. 0 gene SPOROCYTELESS de Arabidopsls é necessário para a iniciação da esporogênese e codifica vima nova proteína nuclear. Genes Dev. 1999 Aug 15;13(16):2108-17. Quando interrompida, a expressão do gene Mscal não afeta o tecido floral. Pelo contrário, a antera é transformada em uma estrutura vegetativa e a microsporogênese nunca começa e o resultado final é grande aumento de confiabilidade na manutenção da esterilidade masculina.

A invenção também é direcionada para afetar a fertilidade masculina de uma planta através do impacto da seqüência de nucleotídeos de Mscal. Impactar a fertilidade masculina refere- se a uma mudança na fertilidade masculina da planta de um fenótipo de fertilidade antes do impacto da seqüência de nucleotídeos. Isto pode resultar na esterilidade masculina, como quando a seqüência é impactada de forma que a expressão do gene essencial para fertilidade masculina Mscal não ocorra como na condição tipo selvagem. A fertilidade de uma planta também pode ser afetada, por exemplo, introduzindo-se em uma planta que contém um alelo mscal mutado, uma seqüência de nucleotideos Mscal que restaura a fertilidade. Claramente, muitas variações são possíveis para se impactar a fertilidade masculina, dependendo da aplicação específica. 0 impacto da seqüência de nucleotideos Mscal pode ser feito usando-se muitas ferramentas disponíveis para um técnico no assunto, como discutido nos exemplos abaixo. A título de exemplo, o gene pode conter uma inserção, como a mostrada no alelo mscal-6036, ou ter uma exclusão, como por exemplo, no alelo mscal -mgl2. 0 uso de mutagênese, genes anti-senso, co-supressão, formações hairpin, seleção de plantas mutantes e inserção de uma ou mais seqüências adicionais que agem para interromper a expressão do gene são alguns exemplos dos muitos meios disponíveis para interromper a expressão do gene Mscal. Além disso, a invenção é direcionada para restaurar a fertilidade masculina em uma planta com expressão de Mscal interrompida, através da introdução na planta de uma seqüência Mscal tipo selvagem para complementação.

Será evidente para um perito na área que as variações, mutações e derivações, incluindo fragmentos menores do que a seqüência inteira estabelecida podem ser utilizadas, os quais retenham a esterilidade masculina controlando as propriedades do gene. Conforme utilizado aqui, um "fragmento funcional" da seqüência Mscal é uma seqüência de nucleotideos que é formada por uma ou mais deleções da seqüência íntegra e que mantém a funcionalidade de ser essencial para a fertilidade masculina. Umas das competências normais na arte pode facilmente acessar a variante ou fragmento através da sua introdução em plantas homozigóticas para um alelo Mscal de macho estéril estável, seguida pela observação do desenvolvimento dos tecidos masculinos na planta. As seqüências da invenção podem ser isoladas a partir de qualquer planta, incluindo, mas não se limitando a milho (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), Alfafa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio (Secale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girassol (Helianthus annuus), trigo (Tritieum aestivum), soja (Glyeine max) , tabaco (Nieotiana tabaeum), milheto (Panieum spp.), batata (Solanum tuberosum) , amendoim (Araehis hypogaea), algodão (Gossypium hirsutum) , batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot eseulenta) , café (Cofea spp.), coco (Cocos nueifera) , abacaxi (Ananas eomosus), citros (Citrus spp.), cacau (Theobroma eaeao) , chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Fieus easiea), goiaba (Psidium guajava) , manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), aveia (Avena sativa), cevada (Hordeum vulgare), legumes, plantas ornamentais, e coníferas. Preferencialmente, as plantas incluem o milho, soja, girassol, cártamo, canola, trigo, cevada, centeio, alfafa, arroz, algodão e sorgo.

Seqüências de outras plantas podem ser isoladas de acordo com técnicas bem conhecidas, com base em sua homologia de seqüência com a região de codificação homóloga das seqüências aqui enunciadas. Nestas técnicas, a totalidade ou parte da seqüência de codificação conhecida é usada como uma sonda que hibridiza seletivamente a outras seqüências presentes em uma população de fragmentos clonados de DNA genômico (ou seja, bibliotecas genômicas) de um organismo escolhido. Métodos estão disponíveis na arte da hibridação de seqüências de ácidos nucléicos. Um extenso guia para a hibridação de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 nOverview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); e Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al. , Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)

Assim, a invenção também inclui as seqüências de nucleotídeos que hibridizam seletivamente com as seqüências de nucleotídeos Mscal sob condições estritas. Ao se referir a uma seqüência que "hibridiza seletivamente" com Mscal, o termo inclui uma referência à hibridação, sob condições estringentes de hibridação, de uma seqüência de ácido nucléico com a seqüência de ácido nucléico alvo especificada para um grau detectável maior do que a sua hibridização com ácido nucléicos não-alvos.

Os termos "condições estringentes" ou "condições estringentes de hibridação" inclui referência às condições sob as quais uma sonda irá hibridizar a sua seqüência alvo, a um grau detectável maior do que a outras seqüências. Condições estringentes são dependentes da seqüência alvo e serão diferentes dependendo da estrutura do polinucleotídeo. Ao controlar o rigor da hibridação e/ou das condições de lavagem, grupos-alvo podem ser identificados que são 100% complementares para uma sonda (marcação homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguns pareamentos errôneos nas seqüências para que menores graus de similaridade sejam detectados (marcação heteróloga). Geralmente, as sondas deste tipo estão em uma faixa de cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento para cerca de 250 nucleotídeos de comprimento.

Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleie Aeid Probes, Parte I, Capitulo 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); e Current Protocols in Molecular Biology, Capitulo 2, Ausubel, et al. , Eds., Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1995). Veja também Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Em geral, as seqüências que correspondem às seqüências de nucleotídeos da presente invenção, e que hibridizam com a seqüência de nucleotídeos divulgada aqui serão, pelo menos, 50% homólogos, 70% homólogos, e até 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homólogos ou mais com a seqüência divulgada. Isto é, a similaridade de seqüência entre a sonda e o alvo pode variar, de partilhando, pelo menos, cerca de 50%, cerca de 70%, e até cerca de 85% ou mais de similaridade de seqüência.

A especificidade é tipicamente a função das lavagens de pós-hibridação, sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final os fatores principais. Geralmente, as condições estringentes de temperatura de lavagem são selecionadas para serem de cerca de 50C a cerca de 20C inferiores ao ponto de fusão (Tm) para a seqüência específica a uma força iônica e pH definidos. 0 ponto de fusão, ou desnaturação, do DNA ocorre através de uma estreita faixa de temperatura e representa o rompimento da dupla hélice em suas fitas simples complementares. 0 processo é descrito pela temperatura do ponto médio da transição, Tm, que também é chamada de temperatura de fusão. As fórmulas estão disponíveis na arte para a determinação das temperaturas de fusão.

Condições de hibridação preferidas para a seqüência de nucleotídeos da invenção incluem hibridação a 42sC em 50% (p/v) formamida, 6X SSC, 0,5% (p/v) de SDS, 100 (g/ml de DNA de esperma de salmão). Condições de lavagem de baixa estringência exemplares incluir hibridização a 42 sC em uma solução de 2X SSC, 0,5% (p/v) de SDS por 30 minutos e repetir. Condições de estringência moderada exemplares incluem uma lavagem em 2X SSC, 0,5% (p/v) de SDS, a 502C por 3 0 minutos e repetição. Condições de alta estringência exemplares incluem uma lavagem em 0.IX SSC, 0,1% (p/v) de SDS, a 65aC por 30 minutos por uma hora e repetir. As seqüências que correspondem ao promotor da presente invenção podem ser obtidas através de todas as condições acima. Para fins de definição da invenção, as condições de alta estringência são utilizadas.

Os seguintes termos são usados para descrever as relações entre seqüência de dois ou mais ácidos nucléicos ou polinucleotídeos: (a) "seqüência referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de seqüência", e (d) "percentuais de identidade de seqüência.".

(a) Como usado aqui, "seqüência referência" é uma seqüência definida usada como uma base de comparação de seqüência. Uma seqüência referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma seqüência especifica, por exemplo, como um segmento de um cDNA ou seqüência gênica de tamanho integral, ou o cDNA ou seqüência gênica completa.

(b) Como usado aqui, "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e específico de uma seqüência de nucleotídeos, em que a seqüência de nucleotídeos na janela de comparação pode incluir adições ou deleções (ou seja, as lacunas) em relação à seqüência de referência (que não contém adições ou deleções) para o melhor alinhamento das duas seqüências. Geralmente, a janela de comparação é de pelo menos nucleotídeos contíguos de comprimento, e, opcionalmente, pode ser de 30, 40, 50 ou 100 nucleotídeos de comprimento, ou mais. Aqueles com habilidade na arte entendem que, para se evitar uma alta similaridade a uma seqüência referência devido à inclusão de lacunas na seqüência de polinucleotídeo, uma penalidade de lacuna é geralmente introduzida e é subtraída do número de casamentos.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte. Assim, a determinação do percentual de identidade de seqüência entre duas seqüências pode ser feita usando-se um algoritmo matemático. Exemplos não-limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; o método de pesquisa de alinhamento local de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei.

E.U.A. 87: 2264, modificado por Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90: 5873-5877.

Implementações por computador destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüências para se determinar a identidade de seqüência. Tais implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponibilizado pela Intelligenetics, f Mountain View, Califórnia), o programa ALIGN (versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Pacote GCG Wisconsin Genetics Software Package, versão 10 (disponível a partir da Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, USA). Alinhamentos que usam esses programas podem ser feitos usando- se os parâmetros padronizados. 0 programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins et al. (1988) Gene 73: 237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155-65; e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307-331. 0 programa ALIGN é baseado no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna (gap length penal ty) de 12, e uma penalidade de lacuna {gap penalty) de 4 podem ser usadas com o programa ALIGN quando se compara seqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. Pesquisas de nucleotídeo no BLAST podem ser realizadas com o programa blastn, pontuação (score) = 100, tamanho de palavra (wordlength) = 12, para se obter as seqüências de nucleotídeos homólogas para uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína da invenção. Pesquisas de proteína no BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3, para se obter seqüências de aminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. Para se obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, pode-se utilizar o BLAST Gapped (em BLAST 2,0) conforme descrito por Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389.

Alternativamente, o PSI-BLAST (BLAST de 2,0) pode ser usado para se executar uma busca iterada que detecta as relações distantes entre as moléculas. Veja Altschul et al. (1997) supra. Quando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, o PSI-BLAST, os parâmetros padronizados dos respectivos programas (por exemplo, blastn para seqüências de nucleotídeos, BLASTX de proteínas) pode ser usado. Veja http://www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento )também pode ser realizado manualmente por inspeção.

Salvo disposição em contrário, os valores de identidade/similaridade de seqüência contidos neste documento referem-se ao valor obtido utilizando-se GAP versão 10 e utilizando-se os seguintes parâmetros: % de identidade e % de semelhança para uma seqüência de nucleotídeos utilizando-se Peso de GAP de 50 e Peso de comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de semelhança para uma seqüência de aminoácidos utilizando-se Peso de GAP de 8 e Peso de Comprimento de 2, e a Matriz de pontuação BLOSUM62 ou qualquer outro programa equivalente. Por programa "equivalente" destina-se todo o programa de comparação de seqüências que, para quaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamento de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos idênticos encontrados, e um percentual de identidade de seqüência idêntico quando comparado com o alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.

0 GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para encontrar o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de lacunas. O GAP considera todos os possíveis alinhamentos e posições de lacuna e cria o alinhamento com o maior número de bases pareadas e o menor número de lacunas. Ela permite a prestação de uma penalidade de criação de lacuna e uma penalidade de extensão de lacuna em unidades de bases pareadas. 0 GAP deve dar um lucro do número de pareamentos pela penalidade de criação de lacuna para cada lacuna que se insere. Se uma penalidade de extensão de lacuna maior que zero é escolhida, o GAP deve, além disso, fazer um lucro para cada lacuna inserida do tamanho da lacuna vezes a penalidade de extensão de lacuna. Os valores da penalidade de criação de lacuna e os valores de penalidade de extensão de lacuna padronizados na versão 10 do Pacote GCG Wisconsin Genetics Software Package para seqüências protéicas são 8 e 2, respectivamente. Para seqüências de nucleotídeos o valor padronizado da pena de criação de lacuna é de 50, enquanto que o padrão da penalidade de extensão de lacuna é de 3. As penalidades de criação lacuna e extensão de lacuna podem ser expressas como um número inteiro selecionado do grupo composto de números inteiros de 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidades de criação lacuna e extensão de lacuna podem ser de .0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, .50, 55, 60, 65 ou superiores. O GAP apresenta um membro da família dos melhores

alinhamentos. Pode haver muitos membros desta família, mas nenhum outro membro tem uma qualidade melhor. O GAP mostra quatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade, Relação, Identidade e Semelhança. A qualidade é a métrica maximizada a fim de alinhar as seqüências. A Razão é a qualidade, dividido pelo número de bases no segmento curto. A Identidade percentual é a porcentagem dos símbolos que realmente correspondem. A Similaridade percentual é a porcentagem dos símbolos que são semelhantes. Os símbolos que estão em regiões correspondentes às lacunas são ignorados. A semelhança é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior ou igual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz de pontuação utilizada na versão 10 do Wisconsin GCG Genetic Software Package é BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. E.U.A. 89:10915). (c) Como usado aqui, "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de ácido nucléico ou polipeptídeo faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. Quando o percentual de identidade de seqüência é usado em referência às proteínas, é reconhecido que as posições de resíduos que não são idênticas, muitas vezes diferem por substituições de aminoácidos conservados, onde resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservadoras, o percentual de identidade de seqüência pode ser ajustado para corrigir a natureza conservadora da substituição. Seqüências que diferem por tais substituições conservadoras são ditas como tendo "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Meios para se fazer este ajuste são bem conhecidos por aqueles de habilidade na arte. Normalmente, isso envolve a marcação de uma substituição conservadora como uma substituição parcial ao invés de uma discordância completa, alimentando assim o percentual de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, onde há um aminoácido idêntico é dada uma pontuação de 1, e a uma substituição não-conservadora é atribuída uma pontuação de zero, a uma substituição conservadora é atribuída uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservadoras é calculada, por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia). (d) Como usado aqui, "percentagem de identidade de seqüência", significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências otimamente alinhadas em uma janela de comparação, em que a parte da seqüência de nucleotídeos na janela de comparação pode incluir acréscimos ou deleções (ou seja, as lacunas) como em comparação com a seqüência de referência (que não inclui os acréscimos ou deleções) para o melhor alinhamento das duas seqüências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais as bases de ácidos nucléicos ou resíduos de aminoácidos idênticos ocorrem em ambas as seqüências para gerar o número de posições compensadas, dividindo o número de posições compensadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para render o percentual de identidade de seqüência.

O uso do termo "polinucleotídeo" não se destina a limitar a presente invenção a polinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles de competências normais na arte reconhecerão que polinucleotídeos podem incluir ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem naturalmente as moléculas e seus análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de seqüências, incluindo, mas não se limitando a, formas de fita simples, formas de dupla fita, hairpins, estruturas de tronco-e-laço, e assim por diante.

Identidade para a seqüência da presente invenção significaria uma seqüência de nucleotídeos que tenha pelo menos 65% de identidade de seqüência, mais preferencialmente pelo menos 7 0% de identidade de seqüência, mais preferencialmente pelo menos 75% de identidade de seqüência, mais preferencialmente pelo menos 80% de identidade, mais preferencialmente em pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de seqüência.

O promotor do gene Mscal é também o tema da presente invenção, como mostrado na seqüência de 1132 pares de base da Figura 9 (SEQ ID NO: 15) . A região reguladora do gene compreende as bases 1 até 1132 da Figura 9, SEQ ID NO: 15 e outros fragmentos funcionais da mesma. As regiões do promotor podem ser facilmente identificadas por um perito na arte. O códon de início putativo contendo o motivo ATG é identificado na base 1133 da SEQ ID NO: 1 (ver Figura 2) e a montante do códon de início está o promotor presuntivo.

Por "promotor" entende-se uma região reguladora do DNA geralmente composto por uma caixa TATA capaz de direcionar a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no local apropriado de início de transcrição de uma seqüência de codificação específica. 0 promotor pode adicionalmente incluir outras seqüências de reconhecimento geralmente posicionadas a montante ou a 5' da caixa TATA, e referidas como elementos promotores a montante, que influenciam a taxa de iniciação da transcrição. É reconhecido que, tendo-se identificado as seqüências de nucleotídeos da região promotora divulgada aqui, está dentro do estado da arte se isolar e identificar novos elementos regulatórios da região a montante da caixa TATA de uma região promotora particular aqui identificada. Assim, a região promotora aqui divulgada é geralmente também definida por conter elementos regulatórios a montante, tais como aqueles responsáveis pela expressão temporal e tecidual da seqüência de codificação, intensificadores e similares. Da mesma forma, os elementos promotores que permitem a expressão no tecido desejado, tais como tecido masculino, podem ser identificados, isolados e usados com outros promotores centrais para confirmação de expressão tecido-masculino preferencial. Por promotor central entende-se a seqüência mínima necessária para iniciar a transcrição, tais como a seqüência chamada de caixa TATA que é comum aos promotores de genes que codificam proteínas. Assim, o promotor a montante da Mscal, opcionalmente, pode ser usado em conjunto com o seu próprio promotor central ou com promotores centrais de outras fontes. O promotor pode ser nativo ou não nativo da célula na qual se encontra.

A título de exemplo, uma caixa TATA putativa pode ser identificada por análise de extensão de iniciador, conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. eds; John Wiley e Sons, New York pp.4.8.1 - 4.8.5 (1987). Regiões reguladoras dos genes da antera, como promotores, podem ser identificados em subclones genômicos através da análise funcional, normalmente verificados pela observação da expressão do gene repórter em tecidos da antera e numa expressão de nível baixo ou ausente do gene repórter em tecidos não-antera. A possibilidade das regiões regulatórias em residir "a montante" ou a 5' do sítio de início de tradução pode ser testada por subclonagem de um fragmento de DNA que contém a região a montante em vetores de expressão para os experimentos de expressão transiente. Espera-se que pequenos fragmentos subgenômicos possam conter as regiões essenciais para a expressão preferencial em tecido masculino. Por exemplo, as regiões essenciais dos promotores CaMV 19S e 35S foram identificadas em fragmentos relativamente pequenos derivados de pedaços maiores do genoma, como descrito em U.S. Pat. No. 5,352,605.

A seleção de um vetor de expressão adequado, com o qual para testar a expressão funcional dependerá do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro, e tais métodos são bem conhecidos por um perito na arte. Para eucariontes, as regiões no vetor incluem as regiões que controlem início de transcrição e controlem processamento. Estas regiões são operacionalmente ligadas a um gene repórter, como CYP, UidA, codificando glucuronidase (GUS), ou luciferase como aqui descrito. Vetores de expressão contendo as supostas regiões reguladoras localizadas em fragmentos genômicos podem ser introduzidos em tecidos intactos, tais como anteras formadas, embriões ou em calos. Métodos de entrega de DNA são descritos abaixo. Para os sistemas de ensaio transientes, diversas análises podem ser empregadas. Em um exemplo, anteras estagiadas isoladas são colocadas imediatamente em meio de cultura de pendão (Pareddy, D.R. e J.F. Petelino, Crop Sei. J.,- Vol. 29; pp. 1564-1566; (1989)) solidificado com 0,5% Phytagel (Sigma , St. Louis) ou outros meios de solidificação. 0 DNA do vetor de expressão é introduzido dentro de 5 horas, de preferência por entrega mediada por micro projétil com partículas de 1,2 μπι a 1000 -1100 Psi. Após a entrega de DNA, as anteras são incubadas a 2 6 9C em cima do mesmo meio de cultura de pendão por 17 horas e analisadas através da preparação de um homogeneizado de tecido inteiro e realização de ensaio de atividade GUS ou lucifierase (ver Gruber, et al., supra) .

A seqüência promotora isolada da presente invenção pode ser modificada para prover uma faixa de níveis de expressão da seqüência de nucleotídeos heteróloga. Pode-se utilizar uma região menor do que a região do promotor íntegro mantendo-se a capacidade de dirigir uma expressão preferencial em antera. No entanto, reconhece-se que os níveis de expressão de mRNA podem ser diminuídos com deleções de partes da seqüência promotora. Assim, o promotor pode ser modificado para ser um promotor fraco ou forte. Geralmente, por "promotor fraco" entende-se um promotor que conduz a expressão de uma seqüência de codificação em um nível baixo. Por "nível baixo" entendem-se níveis de cerca de 1/10.000 transcritos, de aproximadamente 1/100.000 transcritos, para cerca de 1/500.000 transcritos. Inversamente, um promotor forte dirige a expressão de uma seqüência de codificação a níveis altos, ou de cerca de 1/10 transcritos para cerca de 1/100 transcritos para cerca de 1/1.000 transcritos. Geralmente, pelo menos, cerca de 3 0 nucleotídeos de uma seqüência promotora isolada serão usados para conduzir a expressão de uma seqüência de nucleotídeos. Reconhece-se que para aumentar os níveis de transcrição, enhancers podem ser utilizados em combinação com as regiões promotoras da invenção.

Os enhancers são seqüências de nucleotídeos que agem no sentido de aumentar a expressão de uma região promotora. Os enhancers são conhecidos na arte e incluem a região intensificadora SV40, o elemento enhancer 35S, e assim por diante.

O promotor da presente invenção pode ser isolado a partir da região 5' de sua região de codificação original ou região 5' não traduzida (5'UTR). Da mesma forma o terminador pode ser isolado da região 3' ladeando seu respectivo códon de parada. 0 termo "isolado" refere-se a um material, como um ácido nucléico ou proteína, que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o material conforme encontrado no ambiente natural, ou se o material está em seu ambiente natural, o mesmo material foi alterado pela intervenção humana deliberada para uma composição e/ou colocado em um locus de uma célula que não é o locus nativo do material. Métodos para o isolamento de regiões promotoras são bem conhecidos na arte.

"Variantes funcionais" das seqüências reguladoras também estão abrangidas pelas composições da presente invenção. Variantes funcionais incluem, por exemplo, as seqüências regulatórias nativas da invenção, com uma ou mais substituições de nucleotídeos, deleções ou inserções. Variantes funcionais da invenção podem ser criadas por mutagênese sítio-dirigida, indução de mutação, ou podem ocorrer como variantes alélicas (polimorfismos).

Conforme utilizado aqui, um "fragmento funcional" da seqüência regulatória é uma seqüência de nucleotídeos que é uma variante da seqüência regulatória formada por uma ou mais exclusões de uma seqüência maior. Por exemplo, a parte 5' do promotor até a caixa TATA perto do local de início da transcrição pode ser deletada sem abolir a atividade do promotor, como descrito por Opsahl-Sorteberg, HG. et al. " Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleruone cell specific expression" Gene 341:49-58 (2004). Tais variações devem manter a atividade do promotor, nomeadamente a capacidade de conduzir expressão nos tecidos masculinos. A atividade pode ser medida por análise de Northern blot, medições de atividade repórter quando se usando fusões de transcrição, e assim por diante. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), aqui incorporados por referência.

Os fragmentos funcionais podem ser obtidos através do uso de enzimas de restrição para clivar a seqüência de nucleotídeos do elemento regulador naturalmente ocorrente aqui divulgada; através da síntese de uma seqüência de nucleotídeos a partir da seqüência de DNA naturalmente ocorrente, ou podem ser obtidos através do uso de tecnologia de PCR. Ver particularmente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350, e Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, New York).

As seqüências que hibridizam com seqüências regulatórias ) da presente invenção estão dentro do escopo da invenção. As seqüências que correspondem às seqüências de promotor da presente invenção e hibridizam com as seqüências promotoras aqui divulgadas serão pelo menos 50% homólogas, 70% homólogas, e até 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, .96%, 97%, 98%, 99% homólogas ou mais com a seqüência divulgada.

Fragmentos menores podem ainda conter as propriedades de regulação do promotor assim identificado e análise de deleção é um método de identificação das regiões essenciais. Análise de deleção pode ocorrer tanto nas extremidades 5' quanto 3 ' da região reguladora. Fragmentos podem ser obtidos por mutagênese sítio-dirigida, mutagênese usando a reação em cadeia da ' polimerase e similares. (Veja, Directed Mutagenesis: A Practical Approach IRL Press (1991)). As deleções a 3' podem delinear a região essencial e identificar a extremidade 3 ' de modo a que esta região poderá então ser operacionalmente ligada a um promotor central de escolha. Uma vez que a região essencial é identificada, a transcrição de um gene exógeno pode ser controlada pela região essencial mais um promotor central. Pelo promotor central entende-se a seqüência chamada de caixa TATA que é comum a todos os promotores de genes que codificam proteínas. Assim, o promotor a montante de Mscal, opcionalmente, pode ser usado em conjunto com o seu próprio promotor central ou com promotores centrais de outras fontes. 0 promotor pode ser nativo ou não nativo da célula na qual se encontra.

0 promotor central pode ser qualquer um dos promotores centrais conhecidos como os promotores 3 5S ou 19S do vírus do mosaico da couve-flor (U.S. Patent No. 5,352,605), promotor da ubiquitina (U.S. Patent No. 5,510,474) o promotor central de IN2 (U.S. Patent No. 5,364,780) ou um promotor do vírus do mosaico do Figo (Gruber, et al. nVectors for Plant Trans forma ti on" Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology) et al. eds, CRC Press pp.89-119 (1993)).

As seqüências do promotor de outras unidades podem ser isoladas de acordo com técnicas bem conhecidas, com base em sua homologia com o grupo de seqüências promotoras aqui enunciadas. Nestas técnicas, a totalidade ou parte da seqüência do promotor conhecido é usada como uma sonda que híbrida seletivamente a outras seqüências presentes em uma população de clones de fragmentos de DNA genômicos (isto é, bibliotecas genômicas) de um organismo escolhido. Métodos estão disponíveis na arte da hibridação de seqüências de ácidos nucléicos.

A seqüência íntegra do promotor ou partes desta pode ser usada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com seqüências do promotor correspondente. Para realizar a hibridação específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem seqüências que são únicas e, de preferência pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 2 0 nucleotídeos de comprimento. Essas sondas podem ser usadas para amplificar seqüências do promotor correspondente de um organismo escolhido pelo processo bem conhecido da reação em cadeia da polimerase (PCR) . Esta técnica pode ser usada para isolar seqüências do promotor adicional de um organismo desejado ou como um teste de diagnóstico para se determinar a presença da seqüência do promotor em um organismo. Exemplos incluem triagem por hibridação de bibliotecas de DNA plaqueadas (tanto placas ou colônias; ver, por exemplo, Innis et al., eds., (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press) .

Além disso, um promotor da presente invenção pode ser ligado com seqüências de nucleotídeos além do gene Mscal para expressar outras seqüências de nucleotídeos heterólogas. A seqüência de nucleotídeos para o promotor da invenção, bem como os fragmentos e variantes desta, podem ser fornecidas em cassetes de expressão, juntamente com seqüências de nucleotídeos heterólogas para expressão na planta de interesse, mais particularmente no tecido masculino da planta. Tal cassete de expressão é provido de uma pluralidade de sítios de I restrição para a inserção da seqüência de nucleotídeos que deve ficar sob a regulação do promotor de transcrição. Esses cassetes de expressão são úteis na manipulação genética de qualquer planta para alcançar uma resposta fenotípica desejada.

Exemplos de seqüências de nucleotídeos que podem ser usadas, como o gene exógeno do vetor de expressão com o promotor de Mscal, ou outros promotores ensinados aqui ou conhecidos daqueles com habilidade na arte, incluem unidades nucleotídicas complementares, tais como as moléculas anti-senso (RNA anti-senso callase, RNA anti-senso barnase, RNA anti-senso chalcona sintase e RNA anti-senso Ms45), ribozimas e seqüências guia externas, um nucleotídeo de fita simples ou aptâmero. A seqüência de nucleotídeos exógena pode também codificar enzimas de degradação ou modificação de carboidratos, amilases, enzimas desramificadoras e pectinases, como o gene da alfa-amilase, auxinas, rol B, citotoxinas, toxina diftérica, DAM metilase, avidina, ou podem ser selecionados a partir de um sistema de regulação procariótico. A título de exemplo, Mariani, et al. , Nature vol. 347, pp. 737; (1990), mostraram que a expressão, no tapete, de uma RNase -Tl de Aspergillus oryzae ou uma RNase de Bacillus cereus, designada "barnase", induziu a destruição das células do tapete, resultando em infertilidade masculina. Quaas, et al. Eur. J. Biochem. Vol. 173: pp. 617 (1988) descreveram a síntese química da RNase-Tl, enquanto que a seqüência de nucleotídeos do gene barnase é divulgada em Hartley, J. Molec. Biol.; Vol. 202: pp. 913 (1988). 0 gene rolB de Agrobacterium rhizogenes codifica para uma enzima que interfere no metabolismo de auxina, catalisando a liberação de indóis livres de indoxil-S-glicosídeos. Estruch, et al. EMBO J. Vol. 11: pp. 3125 (1991) e Spena, et al. Theor. Appl. Genet.; Vol. 84: pp. 520 (1992), mostraram que a expressão antera- específica do gene rolB em tabaco resultou em plantas com anteras murchas, nas quais, a produção de pólen foi severamente diminuída e o gene rolB é um exemplo de um gene que é útil para o controle de produção de pólen. Slightom, et al. , J. Biol.

) Chem. Vol. 261: pp. 108 (1985) divulgam a seqüência de nucleotídeos do gene rolB. Moléculas de DNA que codificam o gene da toxina da difteria podem ser obtidas a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD), ATCC No. .39359 ou ATCC No. 67011, ver Fabijanski, et al., E.P. Appl. No. .90902754.2, "Molecular Methods of Hybrid Seed Production" para se obter exemplos e métodos de utilização. 0 gene da DAM metilase é usado para causar esterilidade nos métodos discutidos na U.S. Patent No. 5,689,049 e PCT/US95/15229 Cigan, A.M. e Albertsen, M.C., nReversible Nuclear Genetic System for Male Sterility in Transgenic Plants. " Ver também a discussão da utilização do gene de avidina para se causar esterilidade em U.S. Patent No. 5,962,7 69 nInduction of Male Sterility in Plants by Expression of High Leveis of Avidin" por Albertsen et al.

A invenção inclui vetores com o gene Mscal e/ou seu promotor. Um vetor é preparado compreendendo Mscal, um promotor que irá conduzir a expressão do gene na planta e uma região de terminação. Como se observa, o promotor na construção pode ser o promotor nativo ou um promotor substituído que proporcionará a expressão na planta. 0 promotor da construção pode ser um promotor induzível, de modo que a expressão da molécula senso ou anti-senso na construção pode ser controlada pela exposição ao indutor. A este respeito, um promotor compatível em planta pode ser empregado na construção, influenciado pelo resultado final desejado. Ao vincular a seqüência de nucleotídeos Mscal a outro promotor, será preferível que o promotor dirija a expressão da seqüência suficientemente cedo no desenvolvimento da planta na qual a seqüência de Mscal ou fragmento ou variante desta é expressa após iniciação primordial, mas antes da divisão das células arquesporiais. Exemplos da diversidade de fatores que poderiam ser usados incluem os promotores constitutivos virais como os promotores 19S e 3 5S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) ou o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária. Veja Kay et al., (1987) Science 236:1299 e o pedido de patente europeu, European patent application No. O 342 926, e o promotor da ubiquitina (ver, por exemplo, US patent 5,510,474) ou qualquer outro promotor tipo ubiquitina, que codifica uma proteína ubiquitina, mas pode ter diferentes seqüências específicas (por exemplo US Patents 5,614,399 e 6,054,574) .

Será evidente para um perito na matéria que a construção também pode conter um dos outros promotores da variedade disponível, dependendo da aplicação específica. Por exemplo, o promotor pode estar relacionado com um marcador de seleção, ou um gene de interesse para a expressão na célula vegetal. Neste sentido, qualquer promotor compatível com planta pode ser empregado. Esses podem ser os promotores 3 5S e tipo ubiquitina acima referidos, ou qualquer outro promotor de gene de planta, como, por exemplo, o promotor para a subunidade menor da ribulose-1 ,5-bis-fosfato carboxilase; ou promotores de plasmídeos induzidos por tumor de Agrobacterium tumefaciens, como os promotores da nopalina e octopina sintases, e o promotor da proteína de transferência de lipídio de cevada, LTP2 (Kalla et al. Plant J. (1994) 6 (6): 849-60), o promotor END2 (Linnestad et al. US Patent 6,903,2 05) e o promotor PG47 da poligalacturonase (Ver Allen e Lonsdale, J. Plant (1993) 3:261-271; WO 94/01572; US Patent 5,412,085. Ver aplicação internacional WO 91/19806 de uma revisão dos promotores de plantas ilustrativos, devidamente empregada na presente invenção.

A variedade de promotores compatíveis com plantas disponíveis inclui promotores tecido específico e induzíveis. Um elemento regulador induzível é aquele que é capaz de, direta ou indiretamente, ativar a transcrição de uma ou mais seqüências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as seqüências de DNA ou genes não serão transcritas. Normalmente, o fator de proteína que se liga especificamente ao elemento regulador induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa que é, então, direta ou indiretamente convertida à forma ativa pelo indutor. 0 indutor pode ser um agente químico como uma proteína, metabólito, regulador de crescimento, herbicidas ou compostos fenólicos ou um estresse fisiológico imposto diretamente pelo calor, frio, sal, ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um patógeno ou agente da doença, tais como um vírus. Uma célula que contenha um elemento regulador induzível poderá ser exposta a um indutor externo pela aplicação do indutor na célula ou planta, como por pulverização, aplicação de água, aquecimento ou métodos similares.

Qualquer promotor induzível pode ser utilizado na presente invenção. Veja Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993). Promotores induzíveis exemplares incluem os promotores de receptor de ecdisona, U.S. Patent No. 6,504,082; promotores do sistema ACEl que responde ao cobre (Mett et al. PNAS 90: 4567- 4571 (1993)); os genes In2-1 e In2-2 de milho que respondem a fitotoxicidade de herbicidas de benzenossulfonamida (U.S. Patent No. 5,364,780; Hershey et al. , Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) e Gatz et al. , Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)) ; o promotor GST de milho, que é ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicos que são usados como herbicidas pré- emergentes, e o promotor PR-Ia de tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados quimicamente de interesse incluem promotores de resposta a esteróide (ver, por exemplo, o promotor induzível por glucocorticóide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. USA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14 (2) :247-257) e os promotores induzíveis por tetraciclina e reprimiveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e U.S. Patent Nos. 5,814,618 e 5,789,156).

Promotores tecido-preferenciais podem ser utilizados para alvejar a transcrição e/ou a expressão melhorada dentro de um tecido vegetal particular. Os promotores podem expressar no tecido de interesse, juntamente com a expressão em outro tecido vegetal, podem expressar fortemente no tecido de interesse e * para um grau muito menor do que outros tecidos, ou pode manifestar alta preferência no tecido de interesse. Promotores tecido-preferenciais incluem aqueles descritos no Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3) :337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2): . 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2): 513- .524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773- .778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23 (6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90 (20): 9586-9590, e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3): 495-505. Em um melhoramento, os promotores são aqueles que expressam preferencialmente para o tecido masculino ou feminino da planta. A invenção não exige que qualquer promotor tecido qualquer um dos muitos promotores conhecidos de um técnico no assunto podem ser empregados. 0 promotor nativo de Mscal aqui descrito é um exemplo de um promotor útil. Outro promotor deste é o promotor 5126, que direciona a expressão preferencial do gene ao qual ele está vinculado para o tecido masculino das plantas, conforme descrito nas U.S. Patents Nos. 5,837,851 e 5,689,051. Outros exemplos incluem o promotor Ms45 descrito na US Patent No. 6,037,523; o promotor Ms26 descrito na US Publication No. 20060015968; o promotor SF3 descrito na U.S. Patent No. 6,452,069, o promotor BS92-7 descrito na WO 02/063021; o elemento regulador SGB6 descrito na U.S. Patent No. 5,470,359, o promotor TA29 (Koltunow et al. (1990) "Different temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development." Plant Cell 2:1201-1224; Goldberg, R. B., Beals, Τ. P. e Sanders, P. M., (1993) "Anther development: basic principies and practical applications" Plant Cell 5:1217-1229; e US Patent No. 6,399,856), o promotor do gene metallothionein-like tipo 2 (Charbonnel-campaa et al. Gene ( 2000) 254:199-208), e o promotor Bca9 de Brassica (Lee et al. Plant Cell Rep. (2003) 22:268-273).

Determinadas construções também podem incluir um promotor preferencial para tecido de gametas, dependendo de vários componentes e as aplicações nas quais estas são empregadas. Promotores preferenciais para gameta masculino incluem o promotor PG47, supra, bem como promotor ZM13 (Hamilton et al. Plant Mol. Biol. (1998) 38:663-669); promotores do fator depolimerizador de actina (como Zmabpl, Zmabp2; ver, por exemplo Lopez et al. Proc. Natl. Acad. USA (1996) 93: 7415- 7420), o promotor do gene tipo pectina metiltransferase de milho, ZmC 5 (Wakeley et al. Plant Mol. Biol. (1998) 37: 187- 192), o promotor do gene de perfil Zmprol (Kovar et al. The Plant Cell (2000) 12:583-598); o gene de f itosulfocina pentapeptideo sulfatada (sulphated pentapeptide

phytosulphokine) ZmPSKl (Lorbiecke et al. Journal of Experimental Botany (2005) 56 ( 417): 1805-1819), o promotor da proteína ligadora de calmodulina Mpcbp (Reddy et al. J. Biol. Chem. (2000) 275 (45) :35457-70).

Outros componentes do vetor podem ser incluídos, dependendo também da utilização prevista do gene. Exemplos incluem marcadores selecionáveis, seqüências alvo ou regulatórias, seqüências estabilizadoras ou líder, íntrons etc. Descrições gerais e exemplos de vetores de expressão de plantas e genes repórteres podem ser encontradas em Gruber, et al. "Vectors for Plant Transformation" em Method in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds;CRC Press pp. 89-119 (1993). A seleção de um vetor de expressão apropriado dependerá do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. 0 cassete de expressão também irá incluir na extremidade 3' terminal da seqüência de nucleotídeos heteróloga de interesse, uma região de terminação da transcrição e tradução funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a seqüência de nucleotídeos promotora da presente invenção, pode ser nativa com a seqüência de DNA de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de término de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também, Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990); Bailas et al. Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Aeid Res. 15:9627-9639 (1987).

Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente seqüências 5' líder. Tais seqüências líder podem atuar para melhorar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na arte e incluem, a título de exemplo, os líderes de picornavírus, líder EMCV (região 5' não-codificante de Encefalomiocardite), Elroy-Stein et al. Proe. Nat. Aead. Sei. USA. 86:6126-6130 (1989); líderes de potivirus, por exemplo, líder do TEV (Vírus da Cauterização do Tabaco), Allison et al. ; Líder MDMV (Vírus do Mosaico Anão do Milho), Virology 154:9-20 (1986); proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina humana (BIP), Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991); líder não traduzido do mRNA da proteína capsidial do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4), Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987); líder do Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; e líder do vírus da mancha clorótica de milho (MCMV) Lommel et al. Virology 81:382- 385 (1991). Veja também Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987). O cassete também pode conter seqüências que potencializam a tradução e/ou a estabilidade do mRNA como íntrons.

Nos casos em que é desejável ter o produto expresso da seqüência de nucleotídeos heteróloga direcionado para uma organela especial, particularmente um plastídeo, amiloplasto, ou para o retículo endoplasmático, ou secretado na superfície da célula ou de forma extracelular, o cassete de expressão pode compreender ainda uma seqüência de codificação para um peptídeo de trânsito. Peptídeos de trânsito são bem conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, o peptídeo de trânsito para a proteína transportadora de acil, a subunidade menor da RUBISCO, EPSP sintase de planta, peptídeo de transito de cloroplasto Brittle-I de Zea mays (Nelson et al. Plant Physiol 117 (4) : 1235-1252 (1998), Sullivan et al. Plant Cell 3 (12) :13 3 7-4 8 ; Sullivan et al. Planta (1995) 196 (3) :477-84; Sullivan et al ., J. Biol. Chem. (1992) 267 (26) :18999-9004) e similares. Um profissional do ramo compreenderá imediatamente as muitas opções disponíveis para expressão de um produto em uma organela específica. Por exemplo, a seqüência alfa-amilase de cevada é freqüentemente utilizada para direcionar a expressão no retículo endoplasmático (Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)). 0 uso de peptídeos de trânsito é bem conhecido (por exemplo, ver U.S. Patents Nos. 5,717,084; 5,728,925) .

Na elaboração do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a se prover as seqüências de DNA na orientação correta e, quando apropriado, no quadro de leitura adequado. Para este fim, adaptadores ou conectores podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações que podem ser envolvidas para fornecimento de sítios de restrição convenientes, remoção do DNA supérfluo, retirada de sítios de restrição, ou similares. Para esse efeito, a mutagênese in vitro, o reparo por iniciadores, digestão com enzimas de restrição, anelamento, e re-substituições, como transições e transversões, podem estar envolvidos.

Tal como referido aqui, a presente invenção fornece vetores capazes de expressar genes de interesse. Em geral, os vetores devem ser funcionais em células vegetais. Às vezes, pode ser preferível ter vetores que são funcionais em E. coli (por exemplo, para a produção de proteínas para a sensibilização de anticorpos, sequenciamento de DNA, construção de inserções e obtenção de quantidades de ácidos nucléicos). Vetores e procedimentos para clonagem e expressão em E. coli são discutidos em Sambrook et al. (supra).

O vetor de transformação que inclui a seqüência promotora da presente invenção, ou outro promotor operacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotídeos heteróloga em um cassete de expressão e/ou a uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção, pode também conter pelo menos uma seqüência de nucleotídeos adicional de um gene para ser co-transformado no organismo. Alternativamente, a seqüência(s) adicional pode ser fornecida em outro vetor de transformação.

Genes repórteres podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de genes repórteres adequados conhecidos na arte podem ser encontrados, por exemplo, em Jefferson et al. (1991) em Plant Molecular Biology Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33; DeWet et al. Mol. Cell. Biol. 7:725-737 (1987), Goff et al. EMBO J. 9:2517-2522 (1990); Kain et al. BioTechniques 19:650-655 (1995) e Chiu et al. Current Biology 6:325-330 (1996).

Genes repórteres selecionáveis para a seleção das células ou tecidos transformados podem ser incluídos nos vetores de transformação. Estes podem incluir os genes que conferem resistência a antibióticos ou resistência a herbicidas. Exemplos de genes marcadores de seleção adequados incluem, mas não estão limitados a, os genes que codificam a resistência a cloranfenicol, Herrera Estrella et al. EMBO J. 2:987-992 (1983), metotrexato, Herrera Estrella et al. Nature 303:209-213 (1983); Meijer et al. Plant Mol. Biol. 16:807-820 (1991); higromicina, Waldron et al. Plant Mol. Biol. 5:103-108 (1985), Zhijian et al. Plant Science 108:219-227 (1995); estreptomicina, Jones et al. Mol. Gen. Genet. 210:86-91 (1987); espectinomicina, Bretagne-Sagnard et al. Transgenic Res. 5:131- .137 (1996); bleomicina, Hille et al. Plant Mol. Biol. 7:171-176 10 (1990); sulfonamida, Guerineau et al. Plant Mol. Biol. 15:127- 136 (1990); bromoxinil, Stalker et al. Science 242:419-423 (1988); glifosato, Shaw et al. Science 233:478-481 (1986), e fosfinotricina, DeBlock et al. EMBO J. 6:2513-2518 (1987).

Marcadores contáveis ou rastreáveis também podem ser empregados, onde a presença da seqüência produz um produto mensurável. Exemplos incluem uma β-glucuronidase, ou gene UidA (GUS), que codifica uma enzima, para a qual, vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, US Patents 5,2 68,463 e 5,599,670); cloranfenicol acetil transferase (Jefferson et 20 al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907) e fosfatase alcalina. Outros marcadores rastreáveis incluem os genes de antocianina/flavonóides em geral (Veja a discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990) 2:115-127), incluindo, por exemplo, um gene R-locus, que codifica um produto que 25 regulamenta a produção de antocianinas (cor vermelha) nos tecidos da planta (Dellaporta et al. , em Chromosome Structure and Functionl Kluwer Academic Publishers, Appels e Gustafson eds. , pp. 263-282 (1988)); os genes que controlam a biossintese de pigmentos flavonóides , tal como o gene Cl de milho (Kao et 30 al. Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e C2 de milho (Wienand et al. , Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B (Chandler et al. Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene pl (Grotewold et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold et 35 al. Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko et al. Plant Mol. Biol. (1999) 39:11-19), o gene do lócus bronze (Ralston et al. Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al. Plant Cell (1990) 2 (11): 1039-1049), entre outros. No entanto, outros exemplos de marcadores adequados incluem o gene da proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiology 129: 913-42), o gene da proteína amarelo fluorescente (PhiYFPD de Evrogen; ver Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54); um gene lux, que codifica uma luciferase cuja presença pode ser detectada usando-se, por exemplo, película de raios-X, a contagem de cintilação, espectrofotometria de fluorescência, câmeras de vídeo com pouca luz, câmeras de contagem de fótons ou liominometria em placa de vários poços (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); o gene de uma proteína verde fluorescente (GFP) (Sheen et al. Plant J. (1995) 8 (5) :777-84); e DsRed2 onde as células da planta transformadas com o gene marcador estão na cor vermelha e, assim, visualmente selecionáveis (Dietrich et al. (2002) Biotechnigues 2 (2 ) :286-293). Outros exemplos incluem um gene de p-lactamase (Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. (1983) 80:1101), que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene α-amilase (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241), e um gene da tirosinase (Katz et al. J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona que, posteriormente, se condensam para formar melanina, um composto facilmente detectável. Claramente, muitos marcadores similares, estão disponíveis para um técnico no assunto.

O método de transformação/transfecção não é essencial para a presente invenção; vários métodos de transformação ou transfecção estão atualmente disponíveis. Uma vez que novos métodos estão disponíveis para se transformar culturas ou outras células do hospedeiro, eles podem ser diretamente aplicados. Assim, uma grande variedade de métodos foi desenvolvida para se inserir uma seqüência de DNA no genoma de uma célula hospedeira para obter a transcrição ou transcrição e tradução da seqüência para efetuar alterações fenotípicas no organismo. Assim, qualquer método que prevê uma transformação/transfecção eficiente pode ser empregado.

Métodos disponíveis de introdução de vetores de expressão em tecido vegetal para um técnico no assunto são variados e dependerão da planta selecionada. Procedimentos para a transformação de uma grande variedade de espécies de plantas são bem conhecidos e descritos em toda a literatura. Veja, por exemplo, Miki et al, " Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods in Plant Molecular Biotechnology, supra; Klein et al, Bio/TechnoIogy 10:268 (1992); e Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988). Por exemplo, o construto de DNA pode ser introduzido no DNA genômico da célula vegetal utilizando-se técnicas como a entrega mediada por microprojétil, Klein et al. Nature 327: 70-73 (1987); eletroporação, Fromm et al. Proe. Natl. Aead. Sei. 82: 5824 (1985), precipitação com polietileno glicol (PEG), Paszkowski et al. EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); transferência direta de genes WO 85/01856 e EP No. 0 275 069; na transformação por protoplastos in vitro, U.S. Patent No. 4,684,611, e microinjeção de protoplastos ou calo embriogênico de célula vegetal, Crossway, Mol. Gen. Geneties 202:179-185 (1985). O co- cultivo de tecidos vegetais com Agrobaeterium tumefaeiens é uma outra opção, onde as construções de DNA são colocadas em um sistema de vetor binário. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. .30 5,591,616; Ishida et al. , nHigh Effieieney Transformation of Maize (Zea mays L.) mediated by Agrobaeterium tumefaeiens" Nature Bioteehnology 14:745-750 (1996) . As funções de virulência de Agrobaeterium tumefaeiens hospedeiro irão direcionar a inserção da construção de DNA nas células vegetais, quando a célula é infectada por bactérias. Veja, por exemplo, Horsch et al. Science 233: 496-498 (1984), e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 4803 (1983).

Métodos padronizados para a transformação da canola são descritos em Moloney et al. nHigh Efficiency Transformation of Brassica napus using Agrobacterium Vectors" Plant Cell Reports 8:238-242 (1989). A transformação do milho é descrita por Fromm et al, Bio / Technology 8:833 (1990) e Gordon-Kamm et al, supra. Agrobacterium é usado principalmente em dicotiledôneas, mas certas monocotiledôneas como o milho podem ser transformadas por Agrobacterium. Ver supra e U. S. Patent No. 5,550,318. A transformação de arroz é descrita por Hiei et al. nEfficient Transformation of Rice (Oryza sativs L.) Mediated by Agrobacterium and Sequence Analysis of the Boundaries of the T- DNA" The Plant Journal 6(2): 271-282 (1994, Christou et al, Trends in Biotechnology 10:239 (1992) e Lee et al, Proc. Nat Ί Acad. Sei. USA 88:6389 (1991). 0 trigo pode ser transformado por técnicas semelhantes às utilizadas para a transformação do milho ou do arroz . A transformação do sorgo é descrita no Casas et al, supra e sorgo por Wan et al, Plant Physicol. 104:37 (1994). A transformação de soja é descrita em um número de publicações, incluindo U.S. Patent No. 5,015,580.

Ao se referir a "introdução" da seqüência de nucleotídeos em uma planta, entende-se que isso pode ocorrer por meio de métodos diretos de transformação, como transformação do tecido vegetal mediada por Agrobacterium, bombardeio de microprojéteis, eletroporação, ou qualquer um dos muitos métodos conhecidos para um perito na a arte, ou, pode ocorrer através do cruzamento de uma planta com a seqüência de nucleotídeos heteróloga com outra planta, de modo que a descendência tem a seqüência de nucleotídeos incorporada em seus genomas. Tais técnicas de criação são bem conhecidas por um perito na arte.

Os métodos de melhoramento de plantas utilizadas neste documento são bem conhecidos por um perito na arte. Para uma discussão de técnicas de reprodução vegetal, consulte Poehlman (1987) Breeding Field Crops. AVI Publication Co., Westport Conn. Muitas das plantas que seriam as mais preferidas neste método são criadas através de técnicas que se aproveitam do método de polinização da planta.

Métodos de retro-cruzamento podem ser utilizados para se

introduzir um gene nas plantas. Essa técnica tem sido usada por décadas para a introdução de características em uma planta. Um exemplo de uma descrição deste e de outras metodologias de reprodução que são bem conhecidas pode ser encontrado em referências como Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988). Num protocolo de retro- cruzamento típico, a variedade original de interesse (progenitor recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (progenitor não recorrente) que carrega o gene de interesse a ser transferido. As descendências resultantes desse cruzamento são, então, cruzadas novamente com o progenitor recorrente e o processo é repetido até que se obtenha uma planta em que praticamente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas do progenitor recorrente são recuperadas na planta convertida, em adição ao único gene transferido do progenitor não recorrente.

Em certas incorporações da invenção, é desejável se manter a condição de macho estéril homozigoto recessivo de uma planta macho-estéril, quando se utiliza uma abordagem de restauração de transgênicos, ao diminuir o número de plantas, as plantações e os passos necessários para a manutenção de uma planta com essas características. Homozigose é uma condição genética existente quando alelos idênticos residem em Ioci correspondentes em cromossomos homólogos. Heterozigose é uma condição genética existente quando alelos diferentes residem em Ioci correspondentes em cromossomos homólogos. Hemizigose é uma condição genética existente quando há apenas uma cópia de um gene (ou conjunto de genes), sem contrapartidas alélicas no cromossomo irmão. Em um melhoramento, a condição homozigoto recessivo resultante confere a planta uma característica de interesse, que pode ser qualquer característica desejada e que resulta do genótipo recessivo, como o aumento da tolerância à seca ou ao frio, precocidade, mudança de óleo ou teor de proteínas, ou qualquer de uma multidão de muitas características de interesse para os cruzamentos de plantas. Em um melhoramento, o estado homozigoto recessivo confere esterilidade masculina sobre a planta. Quando a seqüência que é o complemento funcional da condição homozigótica é introduzida na planta (isto é, uma seqüência que, quando introduzida e expressa na planta que tem a condição homozigoto recessivo, restaura a condição de tipo selvagem), a fertilidade é restaurada em virtude da recuperação do fenótipo do tipo selvagem fértil.

Manutenção do estado homozigoto recessivo é conseguida através da introdução em uma planta de uma construção transgene restaurador que é ligado a uma seqüência que interfere com a função ou a formação de gametas masculinos da planta para se criar um mantedor ou planta doadora. 0 transgene restaurador, através da introdução em uma planta que é homozigoto recessiva para o traço genético, restaura a função genética da característica, com a planta produzindo pólen viável com apenas uma cópia do alelo recessivo, mas não contendo o transgene restaurador. 0 transgene é mantido no estado hemizigoto na planta mantedora. Pelo transgene, entende-se qualquer seqüência de ácido nucléico que é introduzida no genoma de uma célula através de técnicas de engenharia genética. Um transgene pode ser uma seqüência de DNA nativo, ou uma seqüência de DNA heterólogo (isto é, DNA "estrangeiro"). 0 termo seqüência de DNA nativo se refere a uma seqüência de nucleotídeos que é naturalmente encontrada na célula, mas que pode ter sido modificada de sua forma original. 0 pólen do mantedor pode ser utilizado para fertilizar plantas que são homozigóticas para o caráter recessivo, e os descendentes, portanto, manterão a sua condição de homozigoto recessivo. A planta mantedora contendo a construção com o transgene restaurador é propagada por auto- fecundação, usando-se as sementes resultantes para se produzir novas plantas que são plantas homoζigóticas recessivas e que contêm a construção do transgene restaurador.

A planta mantedora serve como doadora de pólen para a planta que tem o traço homozigoto recessivo. 0 mantedor é otimamente produzido a partir de uma planta que tem o traço homozigoto recessivo e que também tem seqüências de nucleotídeos introduzidas nela que irão restaurar o traço criado pelo alelo homozigoto recessivo. Além disso, a seqüência de restauração está relacionada com as seqüências de nucleotídeos que interferem com a função ou a formação de gametas masculinos. 0 gene pode operar para impedir a formação de gametas masculinos ou impedir a função dos gametas masculinos por qualquer variedade de melhoramentos bem conhecidos e não limitados a uma metodologia específica. A título de exemplo, mas não de prescrição, isto pode incluir o uso de genes que expressam um produto citotóxico nos gametas masculinos (Ver, por exemplo, 5,792,853; 5,689,049; PCT/EP89/00495) ; que inibem a formação de produto de um outro gene importante para a função ou formação de gametas masculinos (ver U.S. Patent Nos. 5,859,341; 6,297,426), que combinam com outro produto do gene para produzir uma substância, impedindo a formação ou função de genes (ver U.S. Patent Nos. 6,162,964;6,013,859; 6,281,348; 6,399,856; 6,248,935; 6,750,868; 5,792,853); que são anti-senso para, ou causam a co- supressão de um gene essencial para a função ou formação de gametas masculinos (ver U.S. Patent Nos. 6,184,439; 5,72 8,92 6; 6,191,343; 5,728,558; 5,741,684); que interferem com a expressão através da utilização de formações hairpin (Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; WO 99/53050 e WO 98/53083) ou similares. Muitas seqüências de nucleotídeos que inibem a formação ou função de pólen são conhecidas, e as seqüências que cumprem essa função serão suficientes. Uma discussão de genes que podem afetar o bom desenvolvimento ou a função está incluída na U.S. Patent No. 6,399,856 e inclui genes com efeitos inibitórios tais como genes de citotoxinas, genes de metilases e genes de inibição do crescimento. Exemplo de tais genes incluem, mas não estão limitados a um gene da cadeia-A da toxina da difteria (Czako, M. e An, G. (1991) nExpression of DNA coding for Diptheria toxin Chain A is toxic to plant cells" Plant Physiol. 95 687-692. e Greenfield et al PNAS 80:6853 (1983), Palmiter et al, Cell 50:435 (1987)); mutantes de divisão de ciclo celular, como o CDC em milho (Colasanti, J., Thers, M. e Sundaresan, V., nIsolation and Characterization of cDNA clones encoding a functional P34 cdc2 homologue from Zea mays" PNAS 88, 3377-3381 (1991)); o gene WT (Farmer, AA, Loftus, TM, Mills, AA, Sato, KV , Neill, J., Yang, M., Tron, T., Trumpower, BL e Stanbridge, EG Hum. Mol. Genet. 3, 723-728 (1994)) e P68 (Chen, J. J., Pai, J. K., Petryshyn, R., Kuo, I., Yang, J. M., Throop, M. S., Gehrke, L. e London, I. M. nEukaryotic translation initiation kinases" PNAS 88, 315-319 (1991)) .

Outros exemplos dos chamados genes "citotóxicos" são discutidos supra e podem incluir, mas não estão limitados a, o gene pelE da pectato liase, de Erwinia chrysanthermi (Kenn J. et al Bacteroil 168:595 (1986)); o gene T-urfl3 de genomas mitocondriais de milho cms-T (Braun et al. Plant Cell 2:153 (1990), Dewey et al. PNAS 84:5374 (1987)); gene CytA da toxina do Bacillus thuringiensis israeliensis que provoca rompimento da membrana celular (McLean et al J. Bacteriol 169:1017 (1987), U.S. Patent No. 4,918,006); DNAses, RNAses, (U.S. Patent No. .5,633,441); proteases, ou genes de RNA anti-senso. Um gene adequado pode também codificar uma proteína envolvida na inibição do desenvolvimento de pistilo, interação com estigma de pólen, crescimento e fecundação de tubo polínico, ou uma combinação destes. Adicionalmente, genes que interferem com o acúmulo normal de amido no pólen ou afetam o equilíbrio osmótico dentro de pólen podem ser adequados.

Em um melhoramento ilustrativo, o gene da DAM-metilase é usado, discutido em supra e na US Patent Nos. 5,792,852 e 5,689,049, cujo produto da expressão catalisa a metilação de resíduos de adenina no DNA da planta. Adeninas metiladas irão afetar a viabilidade das células e serão encontradas apenas em tecidos em que o gene da DAM-metilase é expresso. Em outro melhoramento, um gene α-amilase pode ser usado com um promotor preferencial de tecido masculino. Durante o período inicial de germinação de sementes de cereais, as células da camada de aleurona irão sintetizar α-amilase, que participa na hidrólise do amido para formar glicose e mal tose, de modo a fornecer os nutrientes necessários para o crescimento do germe (J. C. Rogers e Milliman C. , J. Biol. Chem., 259 (19): 12234-12240, 1984; Rogers, J. C., J. Biol. Chem., 260: 3731-3738, 1985). Em um melhoramento, o gene da α-amilase usado pode ser o gene a- amilase-1 de Zea mays. Young et al. vCloning of an a-amylase cDNA from aleurone tissue of germinating maize seed" Plant Physiol. 105(2) 759-760 e GenBank No de acesso L25805, GI:426481). Seqüências de codificação de α-amilase não são normalmente encontradas em células de pólen, e quando a expressão é dirigida ao tecido masculino, o resultado é uma avaria da fonte de energia para os grãos de pólen, e a repressão do desenvolvimento do pólen.

Aquele com experiência na área apreciará prontamente que os métodos descritos aqui são aplicáveis a outras culturas que têm o potencial de cruzar. A título de exemplo, mas não de prescrição, pode-se incluir o milho, soja, sorgo, ou qualquer planta com capacidade de cruzar.

Normalmente, para produzir mais plantas tendo a condição recessiva, pode-se cruzar a planta recessiva com outra planta recessiva. Isto pode não ser desejável para alguns traços recessivos e pode ser impossível para as características recessivas que afetam o desenvolvimento reprodutivo. Alternativamente, pode-se cruzar a planta homozigoto com uma segunda planta com o gene da restauração, mas isso requer novos cruzamentos para afastar por segregação o gene restaurador e, mais uma vez, alcançar o estado fenotípico recessivo. Em vez disso, em um processo a condição homozigoto recessivo pode ser mantida, ao se cruzar com a planta mantedora. Este método pode ser usado com qualquer situação em que é desejado manter-se o estado recessivo. Isso resulta em um sistema econômico que é relativamente fácil de operar para se manter uma população de plantas homozigóticas recessivas.

Um gene esporofítico é aquele que opera independentemente dos gametas. Quando a condição homozigoto recessiva é aquela que produz a esterilidade masculina, impedindo o desenvolvimento esporófito masculino, a planta mantedora, necessariamente, deverá conter uma construção com transgene restabelecedor funcional capaz de complementar a mutação e tornar a planta homozigoto recessiva capaz de produzir pólen viável. A ligação deste gene esporofítico restaurador com uma segunda seqüência de nucleotídeos funcional, a qual interfere com a função ou a formação dos gametas masculinos da planta, resultará em uma planta mantedora que produz pólen viável e que contém apenas o alelo recessivo do gene esporofítico em seu locus natural devido à ação da segunda seqüência de nucleotídeos em interferir com a formação ou função de pólen. Esta fração de pólen viável é não-transgênica em relação a construção transgene restaurador.

Em um outro melhoramento, um gene marcador, como discutido em supra, pode ser fornecido com o transgene de restauração na construção. A título de exemplo, sem limitação, o uso de um marcador resistente a herbicida, como um bar, permite a eliminação das células que não tenham o transgene de restauração. Em outro exemplo, ao usar-se um marcador contável, como a proteína fluorescente Ds Red2, a transmissão inadvertida do transgene também pode ser detectada visualmente, e este escapa eliminado da progênie. Claramente, muitas outras variações na construção de restauração estão disponíveis para um técnico no assunto.

Em um melhoramento ilustrativo, é fornecida uma forma de manutenção de um estado homozigoto recessivo de uma planta macho-estéril em um locus genético, na qual é utilizada uma primeira seqüência de nucleotídeos que é um gene essencial para a fertilidade masculina, uma segunda seqüência de nucleotídeos, que inibe a função ou formação de gametas masculinos viáveis, uma terceira seqüência de nucleotídeos opcional, que é operacionalmente ligada à primeira seqüência e que expressa a seqüência preferencialmente em células de plantas do sexo masculino, uma quarta seqüência de nucleotídeos opcional operacionalmente ligada a uma quarta seqüência de nucleotídeos, a quarta seqüência dirigindo a expressão para gametas masculinos, e uma quinta seqüência de nucleotídeos opcional, que é um marcador de seleção ou contável permitindo a seleção de células vegetais.

Por exemplo, é desejável se produzir plantas fêmeas macho- estéreis para uso no processo de produção de híbridos que são estéreis, como resultado de serem homozigotos para uma mutação no gene Ms45; um gene que é essencial para a fertilidade masculina. Tal mutante no alelo Ms45 é designado como ms45 e uma planta, que é homozigoto para ms45 (representado pela notação ms45/ms45), exibe o fenótipo de macho estéril homozigoto recessivo e não produz pólen funcional. Veja, U.S. Patents Nos. 5,478,369; 5,850,014; 6,265,640; e 5,824,524. Em ambos os processos de produção de linhagens puras e híbridas, é importante se manter esta condição de homozigoto recessivo. Quando seqüências que codificam o gene Ms45 são introduzidas em uma planta que é homozigota recessiva para ms45, resulta-se em fertilidade masculina. Pelo método da invenção, uma planta que é homozigota recessiva ms45/ms45 pode ter introduzido nela um gene ms45 esporofítico funcional e, portanto, é macho fértil. Este gene pode ser ligado a um gene que funciona para processar o pólen contendo a construção transgene restaurador não- funcional ou impedir a sua formação, ou que produz um produto letal no pólen, ligado ao promotor que direciona sua expressão para os gametas masculinos para produzir uma planta que só produza pólen contendo ms45 sem a construção transgene restaurador.

Um exemplo é uma construção que inclui o gene Ms45, ligado com um promotor 5126, um promotor preferencial de tecido masculino (Ver E.U. Patent No. 5.750.868, 5.837.851 e 5.689.051) e ainda ligado ao gene citotóxico da DAM metilase, sob o controle do promotor da poligalacturonase, promotor PG47 (Ver U.S. Patent No. 5,750,868; 5,837,851; e 5,689,051) em uma condição hemizigótica. Portanto, a planta resultante produz o pólen, mas os únicos pólens viáveis resultam do alelo que não contém a construção restauradora Ms45/DAM metilase e, assim, contém apenas o gene ms45. Este pode, por conseguinte, ser usado como um polinizador para fertilizar a planta homozigoto recessivo (ms45/ms45) , e a descendência produzida continuará a ser macho estéril, como resultado da manutenção da homozigose para ms45. Os descendentes também não irão conter a construção transgene restaurador introduzida.

Em outro exemplo de construção de restauração, o gene Mscal está relacionado com um promotor Mscall e ligado ainda ao gene da α-amilase de Zea mays sob o controle do promotor PG47 preferencial de tecido masculino. O marcador contável utilizado em um melhoramento é DS-Red2.

Um resultado desejável do processo da invenção é aquele em que a planta com a seqüência de nucleotídeos restauradora pode ser auto-fertilizada, que significa que o pólen da planta é transferido para a flor da mesma planta para atingir a propagação de plantas restauradoras. (Note que quando se refere a "autofertilização", isso inclui a situação em que a planta que produz o pólen é fertilizada com pólen da mesma planta, e a situação em que duas ou mais plantas idênticas puras são plantadas em conjunto e o pólen de uma planta pura idêntica poliniza uma linhagem pura separada, mas idêntica). A construção transgene restaurador não estará presente nas células do pólen, mas será contida em 50% dos óvulos (o gameta feminino). As sementes resultantes da autofertilização podem ser plantadas, e a seleção é feita para as sementes tendo a construção transgene restaurador. 0 processo de seleção pode ocorrer por qualquer um dos muitos processos conhecidos, sendo o mais comum aquele onde a seqüência de nucleotídeos de restauração está ligada a um gene marcador. 0 marcador pode ser contável ou selecionável, e permite que as plantas produzidas a partir das sementes com o gene da restauração sejam identificadas.

Em um melhoramento da invenção, é possível se prever que o promotor preferencial para tecido de gameta masculino é induzível. É permitido então, no processo, o controle adicional, onde for desejado, permitindo-se que a planta tendo as seqüências de nucleotídeos de restauração seja constitutivamente macho-estéril. Este tipo de esterilidade masculina é estabelecido em U.S. Patent No. 5,859,341. Para que a planta se torne fértil, a substância indutora deve ser fornecida, e a planta irá se tornar fértil. Novamente, quando combinado com o processo de invenção conforme descrito em supra, o único pólen produzido não irá conter as seqüências de nucleotídeos de restauração.

Descrições mais detalhadas são fornecidas abaixo por meio de instrução e ilustração e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

EXEMPLO 1

Clonagem e sequenciamento do gene Mscal

Seguindo-se o mapeamento da mutação de mscal ao braço curto do cromossomo 7, uma metodologia de clonagem baseada em mapa foi realizada para clonagem do gene mscal. 0 processo de rastreamento de biblioteca genômica é comumente conhecido entre os hábeis na arte e é descrito em Sambrook, J., Fritsch, EF, Maniatis T., et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, NY (1989) . Uma grande população de mapeamento foi desenvolvida utilizando-se o alelo mscal-ref (West, DP e Albertsen, MC. Three new male-sterile genes 1985. MNL 59:87). Utilizaram-se marcadores para mapear saturadamente esta população e iam intervalo (de 155 KB) foi definido por meio dos marcadores pcol44723 e B49 pl5.f que cobrem 2 clones de BAC (Cromossomo Artificial Bacteriano). 0 sequenciamento e desenvolvimento de marcadores adicionais a partir do BACs reduziram o intervalo para 9Kb. A seqüência desta região revelou somente um quadro aberto de leitura, que codifica para um gene putativo de glutarredoxina específico de planta. A seqüência de nucleotídeos é mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO: 1) e a seqüência de proteínas é mostrada na Figura 3 (SEQ ID NO: .2). Outros membros da família das glutarredoxina foram mostrados previamente como tendo um papel no desenvolvimento da planta (Shuping Xing, Mario G. Rosso e Sabine Zachgo. ROXYl, a member of the plant glutaredoxin family, is required for petal development in Arabidopsis thaliana (2005) Development 132, .1555-1565). Os genes das glutarredoxinas são, invariavelmente, pequenas oxidoredutases estáveis ao aquecimento, as quais são creditadas funcionamentos em uma ampla variedade de processos celulares desde a síntese de DNA até o dobramento de proteínas, regulação redox de transcrição e tradução e sinalização celular, entre outros. Em uma comparação por BLAST do gene Mscal, as seqüências com maior similaridade foram as regiões que tinham 77% de identidade com uma proteína tipo glutarredoxina, acesso nº XP_476652 do GenBank.

Análises de Southern do alelo mscal referência indicaram que o gene da glutarredoxina foi deletado. 0 sequenciamento do alelo referência revelou uma deleção de 7823 pb, juntamente com uma inserção de 1268pb 4Kb à jusante do gene da glutarredoxina. A seqüência do gene mscal-ref é mostrada na Figura 4 (SEQ ID NO: ) . EXEMPLO 2

Identificação e Clonagem dos alelos Adicionais de mscal Dois outros alelos mutantes de mscal estavam disponíveis, mscal-mgl2 e mscal-6036 (Trimnell M, Fox T, Albertsen MC (2001) New male-sterile mutant allele of Mscal. MNL 75 (63) :31). A clonagem e o sequenciamento do alelo mscal-mgl2 revelou uma deleção de 490 pb na região 3' do gene da glutarredoxina. O alinhamento de um alelo mscal-mgl2 fértil e estéril é mostrado na Figura 5. O alinhamento da região de glutarredoxina de uma planta do tipo selvagem (Missouri 17), com uma planta mscal- mgl2 fértil e uma planta mscal-mgl2 estéril é mostrado na Figura 6. O sítio de ligação GSH (LPWFVGGRLLG) está ausente na planta estéril. Um motivo para a região redox, CCMC, estava presente no gene, e a região de ligação GSH, LPWFVGGRLLG, presente na planta fértil, está ausente no mutante estéril, como pode ser visto no alinhamento apresentado na Figura 6.

Na clonagem e sequenciamento do alelo mscal-6036, uma inserção de ~ 850 pb foi detectada. O alinhamento mostrando a comparação com uma planta fértil em relação ao alelo estéril é mostrado na Figura 7. Esta inserção criou uma duplicação do sítio do hospedeiro de 8pb (GTCGAGAA) e também parece conter TIRS pequenas e perfeitas (Veja a região da seguinte seqüência à jusante da base 854 na Figura 7, marcada como início com um "TIR") . Também foi notado que há ~ 2 00 pb de homologia significativa nas extremidades da inserção, remanescentes de um transposon de planta. Um alinhamento gráfico da região codificadora de mscal, região genômica, o alelo de referência, o alelo mscal-mgl2 e o alelo mscal-6036 é mostrado na Figura 8.

EXEMPLO 3

Identificação do Promotor

A montante do provável códon de início de tradução a 1133 pb da SEQ ID NO: 1 de Mscal, 1132 pb de DNA estavam presentes no clone genômico de Mscal. Uma caixa TATA razoável foi observada por inspeção, começando na base 921 da SEQ ID NO: 1 e cerca de 2 00 pb a montante do códon de início de tradução. Veja a Figura 9, que é SEQ. ID N015. A caixa TATA putativa (TATAAAA) é sublinhada. Assim, a presente invenção engloba uma molécula de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: SEQ ID NO: 15 (Figura 9), ou aquelas com identidade de seqüência, que hibridizam com a mesma sob condições estringentes e fragmentos da mesma, e tendo a função de uma região reguladora preferencial para tecido masculino.

EXEMPLO 4

Rastreamento de biblioteca para identificação de Mscal de Arroz Como mencionado acima, Mscal é um gene de fertilidade masculina em milho. Quando ele é mutado, e feito homozigoto recessivo, resulta-se em esterilidade masculina. Um ortólogo de Mscal foi identificado em arroz. A população de arroz Deleteagene foi preparada e usada para triagem de indivíduos contendo deleções do gene ms cal. (Xin Li et al., A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. The Plant Journal Volume 27 Pagina 235 - August 2001) . Com esse processo, bibliotecas de deleções aleatórias são produzidas utilizando-se nêutrons rápidos para causar mutações. As bibliotecas são selecionadas para os mutantes deletérios específicos usando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR). Num protocolo típico, 18 sementes de linhas são agrupadas, plantadas, as mudas coletadas e o DNA genômico isolado do tecido. 0 DNA isolado de todas as linhas mutantes é então coletado em grupos, começando com mega grupos, cada um com o DNA de 2592 linhas. Um par de iniciadores específico para as seqüências que flanqueiam um gene alvo de deleção é selecionado, juntamente com outro par de iniciadores aninhados internamente. Os iniciadores utilizados para mscal foram as seguintes:

5' TGAGCATGCATGCTAAGCTAGTACTCCAGC (SEQ ID NO: 20) 5' GTGATCCTCTCTGATGGTGACAACGAAGAC (SEQ ID NO: 21)

0 objetivo é rastrear a biblioteca com um iniciador específico para o gene e um iniciador específico para o elemento de inserção de tal forma que se possa discriminar entre a amplificação do DNA do tipo selvagem de DNA de inserção em grandes grupos. Os iniciadores amplificam tanto os genes tipo-selvagem quanto os mutantes, mas o tempo de extensão do PCR é reduzido, a fim de suprimir a amplificação do DNA do tipo-selvagem. Uma extensão de tempo longa é primeiramente usada para confirmar a qualidade dos iniciadores, então, utiliza-se um tempo de extensão menor para se determinar em que condições a amplificação do DNA do tipo-selvagem é suprimida. Este tempo é usado para se selecionar os mega grupos. A segunda rodada de PCR utilizando iniciadores aninhados é usada para aumentar a sensibilidade. A eletroforese em gel detecta a presença de fragmentos amplificados em alelos deletérios, e se uma banda é encontrada em um mega grupo, a análise de PCR continua em grupos menores até uma única planta ser identificada.

Os iniciadores derivados do gene mscal de arroz resultaram num produto de deleção putativo no rastreamento inicial de 10 mega grupos (com 2 592 famílias por grupo) , que abrange toda a população mutante. Deste uma deleção do produto foi identificada no mega grupo 7. Este produto foi clonado e seqüenciado e foi identificado como um alelo deletério do gene mscal do arroz como mostrado na Figura 13. Exames subseqüentes foram realizados em nove super grupos compostos de 288 famílias por grupo, a 16 grupos (com 16 famílias por grupo) , os grupos sub 9 (duas famílias por grupo) para finalmente se identificar as famílias individuais que abrigam a deleção. Duas famílias foram identificadas. Sementes de cada uma destas famílias foram cultivadas e genotipadas utilizando-se um conjunto de iniciadores tipo-selvagem e um conjunto de iniciadores que amplificam especificamente ao longo da deleção. A família 21-77 foi identificada como contendo a deleção no gene mscal de arroz e 2 plantas dentro desta família eram homozigóticas para a deleção mscal e eram completamente macho-estéreis, enquanto que as plantas irmãs eram macho-férteis, confirmando a função de Mscal de arroz como sendo necessária para a fertilidade masculina, análoga à função de Mscal de milho. 0 exame citológico das anteras mostrou que elas são pequenas e formadas erroneamente, sem evidência de desenvolvimento de microsporos. Os estigmas das flores mutantes pareciam ser normais. Cruzamentos em uma das panículas mutantes resultaram em conjunto de sementes, demonstrando-se que a flor fêmea é viável. 0 segundo mutante teve a sua panicula ensacada e não produziu qualquer semente, confirmando o fenótipo a esterilidade masculina.

EXEMPLO 5

Clonagem e sequenciamento de Mscal de arroz

O gene Mscal do arroz tipo selvagem da variedade vegetal M2 02 (Johnson, C.W., Carnahan, H.L., Tseng,S.T., Oster, J.J., e Hill, J.E. Registration of nM202" rice. Crop Science, Vol 26. January-February. 1986 página 198) foi clonado e seqüenciado usando-se métodos descritos em supra e os 2860 pares de base da seqüência de nucleotídeos são mostrados na FiguralO (SEQ ID NO: 18) . A seqüência de aminoácidos putativa é mostrada na Figura 11 (SEQ ID NO: 17) . Um motivo para a região redox, CCMC, e a região de ligação GSH, VPWFVGGRLLG (SEQ ID NO: 11 e 12, respectivamente) estão presentes na proteína mscal de arroz, como mostrado na Figurall. 0 subclone deste gene é muito similar em tamanho e composição de seqüência para o clone genômico de Mscal de milho que foi mostrado capaz de complementar a mutação mscal de milho.

EXEMPLO 6

Identificação do promotor de Mscal de arroz

A montante do provável códon de início de tradução a 1317 pb da SEQ ID NO: 16 (figura 10) de Mscal estavam presentes 1316 pb de DNA no clone genômico de Mscal de arroz. Uma caixa TATA razoável foi observada por inspeção, começando na base 1008 da SEQ ID NO: 16 e, cerca de 200 pb a montante do códon de início de tradução. Veja a Figura 12, que é a SEQ. ID NO: 18 mostrando o promotor. A caixa TATA putativa (TATATATATATA) (SEQ ID NO: 22). é sublinhada. Assim, a presente invenção engloba uma molécula de DNA tendo uma seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 16 (ou aquelas com identidade de seqüência ou que hibridizam sob condições estringentes ou fragmentos da mesma), e tendo uma função de regulação preferencial para tecido masculino.

EXEMPLO 7

Preparação de construto com o gene Mscal

Uma construção designada PHP27077 é feita através da montagem dos componentes de DNA que se seguem:

1. o DNA base do plasmídeo pSBll (pSB31 sem o fragmento EcoRI carregando os genes 35SGUS e 35SBAR, Ishida et al. Nature

Biotechnol. (1996) 14:745-750) . Este DNA base contém seqüências fronteiriças de T-DNA e a origem de replicação de PBR322.

2. 0 gene 35S:PAT que codifica a enzima fosfinotricina- acetiltransferase (PAT) de Streptomyces viridochomagenes (nucleotídeos 6-557 do número de adesão A02774, Strauch et al. 1988, EP 027 59 57-A; SEQ ID NO: 23) sob o controle transcricional do promotor 3 5S do vírus do mosaico da couve- flor (CaMV) e terminador do mesmo (nucleotídeos 6906-7439 e 7439-7632, respectivamente, a partir de Franck et al. 1980, Cell 21: 285-294; SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25).

3. A seqüência Mscal conforme estabelecido na Figura 2 (SEQ ID NO: 1)

EXEMPLO 8

Transformação de plantas mscal de milho

Uma fêmea macho-estéril que era homozigoto para o alelo mutante mscal-ref, (mscal) foi repetidamente cruzada com massas do pólen de plantas de milho Hi-type II (Armstrong 1994, In: Freeling e Walbot (eds) . The Maize Handbook. Springer, New York, pp 663-671) resultando na introgressão deste alelo mscal na transformação de germoplasmas favoráveis de milho ao longo de múltiplas gerações. A fonte de material resultante da transformação consistia de embriões segregando (1:1 ou 3:1) para mscal e permitia tanto para a transformação direta em uma base mscal homozigota quanto para o teste de complementação da mutação genética mscal em plantas T0. A transformação genética mediada por Agrobacterum foi realizada de acordo com Zhao et al. 1999, (United States Patent number 5,981,840). A genotipagem e análise molecular (integração e unidades de transcrição de plantas/PTU) dos transformantes foram feitas de acordo com Cigan et al. , (Sex. Plant. Reprod. 1(2001) 4:135- 142) . Eventos de PTU intactos e copia única, foram identificados pela análise de Southern. A genotipagem de Mscal foi realizada por PCR dos eventos de cópia única. Não se observou diferença morfológica entre as plantas transgênicas e as plantas não-transgênicas controle, exceto para o grau de fertilidade masculina. Transformantes foram completamente macho-férteis, enquanto as plantas não-transgênicas controle foram completamente macho-estéreis, indicando que a expressão do gene Mscal complementou o fenótipo macho-estéril do homozigoto recessivo mscal.

EXEMPLO 9

Transformação de plantas mscal com um construto com Mscal tendo uma mudança de quadro

A segunda construção, PHP27618, é essencialmente a mesma que PHP27077, mas tem uma mudança de quadro introduzida no gene mscal, acrescentando quatro pares de base na posição 1508 da seqüência SEQ ID NO: 1) para interromper a tradução putativa do gene. Eventos de PTU intactos e cópia única foram identificados pela análise de Southern. A genotipagem de Mscal foi realizada por PCR sobre os eventos de cópia única. A pontuação dos fenótipos de fertilidade/esterilidade masculina foi tomada na floração. Os resultados mostram que o fragmento genômico Mscal com mudança de quadro não restaura a fertilidade masculina para plantas mscal/mscal, o que indica que o produto de tradução putativo mostrado na Figura 3 é o quadro correto de tradução para o gene Mscal. Os resultados específicos são mostrados abaixo.

PHP27077 - 10 eventos copia única

Eventos Genótipo_Fertilidade

Mscal/Mscal F

Mscal/mscal F

mscal/mscal F

PHP27618 (quadro trocado)- 6 eventos copia única

Eventos Genótipo_Fertilidade

^ 2 Mscal/mscal F

4 mscal/mscal S

EXEMPLO 10

Expressão do promotor

A construção PHP28154 foi elaborada com as bases 1-1109 do promotor Mscal (SEQ ID NO: 15) e incluiu também a proteína fluorescente (CFP) marcadora (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: .913-42). Após transformação via Agrobacterium (em GS3) , os eventos foram submetidos à reação em cadeia da polimerase ^ quantitativa (QPCR) do gene PAT para se determinar o número de cópia. Foram enviadas para a estufa plantas duplicadas para a maioria dos eventos. A dissecção dos tecidos a partir das duplicatas foi iniciada por volta do estágio três para quatro das folhas até o estágio oito das folhas. Nenhiim sinal pôde ser visto nos meristemas vegetativos, ou em qualquer outra parte da planta, como por exemplo, as raízes e folhas. Muito após o meristema ter feito a transição para uma estrutura floral e das anteras estarem sendo formadas, o sinal CFP pôde ser observado no início das anteras até as anteras desenvolvidas (~ lmm) . 0 sinal desapareceu quando a antera tinha desenvolvido as células mãe de pólen totalmente, pouco antes da meiose. Essa observação de expressão de CFP demonstra o papel de Mscal na determinação da morfologia da antera.

EXEMPLO 11

Estudo de complementação de um fragmento de promotor de Mscal alternativo

Outra construção, PHP27 612, foi preparada incluindo uma porção menor da seqüência genômica de Mscal. Este fragmento incluía 1291 bases do Mscal genômico, a partir da posição 610-1900 pb da SEQ ID NO: 1 (Figura 2), que corresponde a um comprimento de promotor de 522 bases, 610-1132 bases da seqüência do promotor na Figura 9. (SEQ ID NO: 15). A construção foi elaborada com os seguintes componentes:

Biotechnol. (1996) 14:745-750). Este DNA base contém seqüências fronteiriças de T-DNA e a origem de replicação de pBR322.

2. O gene PG47PRO: ZM-AAl que contém a região de codificação de alfa-amilase 1 de Zea mays.

3. LTP2: DS-Red2 (ALTl), que contém região de codificação de fluorescência vermelha (uma variante da proteína de fluorescência vermelha (DsRed), de Diseosoma sp. de Clontech mutada para remoção do sítio BstEII, seqüência códon inalterada) dirigido pelo promotor LTP2, supra.

As plantas foram transformadas com PHP27612 como descrito em supra, em mutantes estéreis mseal. A introdução da construção não complementa a mutação e as plantas permaneceram estéreis, indicando que há elementos reguladores fora deste fragmento de 1291 pares de bases que são necessários para a função biológica normal de Mseal.

Como é evidente a partir do exposto, as seqüências de nucleotídeos que mapeiam para o braço curto do cromossomo 7 do genoma de Zea mays, no mesmo local, como o gene Mseal, e seus alelos, são genes essenciais para a fertilidade masculina em plantas, ou seja, são necessários para a fertilidade de uma planta, ou, quando sofrem uma mutação da seqüência encontrada em uma planta fértil, causam esterilidade na planta. Assim, pode-se observar que a invenção alcança, pelo menos, todos os seus objetivos.

Claims

1. Uma seqüência de nucleotídeos isolada caracterizada por compreender uma seqüência selecionada do grupo constituído por: (a) SEQ ID NO: 1; (b) codificação de uma seqüência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2; (c) SEQ ID NO: 16 (d) uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das seqüências anteriores aonde a seqüência é φ fundamental para a fertilidade masculina em uma planta; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores, em condições muito rigorosas de lavagem de 0.1 SSC, 0.1% (p/v) SDS a 65°C onde a seqüência é fundamental para a fertilidade masculina em uma planta, e (f) um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1, na qual o fragmento é uma seqüência essencial para a fertilidade masculina em uma planta.

2. Uma seqüência de nucleotídeos caracterizada por compreender a SEQ ID NO: 1.

3. Uma seqüência de nucleotídeos caracterizada por codificar ^^25 uma seqüência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO: 2.

4. Uma seqüência de nucleotídeos caracterizada por compreender a SEQ ID NO: 16.

5. Uma célula vegetal caracterizada por compreender a seqüência de nucleotídeos da reivindicação 1.

6. Uma planta caracterizada por compreender a seqüência de nucleotídeos da reivindicação 1.

7. Um vetor de expressão caracterizado por compreender a seqüência de nucleotídeos da reivindicação 1.

8. Método de impactar a fertilidade masculina em uma planta caracterizado por impactar a expressão de uma seqüência de nucleotídeos em uma planta, sendo a seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo constituída por: (a) SEQ ID NO: 1; (b) codificação da seqüência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2; (C) SEQ ID NO: 16 (d) uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade para qualquer uma das seqüências anteriores em que a seqüência é fundamental para a fertilidade masculina em uma planta; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores, em condições muito rigorosas de lavagem em 0.1 SSC, 0.1% (p/v) SDS a 65°C onde a seqüência é fundamental para a fertilidade masculina em uma planta, e (f) um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1, no qual o fragmento é uma seqüência essencial para a fertilidade masculina em uma planta.

9. O método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a expressão da seqüência de nucleotídeos ser impactada por um método selecionado do grupo consistindo de mutagênese, introdução de uma segunda seqüência orientada no sentido anti- senso em relação à seqüência de nucleotídeos, co-supressão, introdução de seqüências codificando formações hairpin , e introdução de uma segunda seqüência de nucleotídeos que perturba a expressão da seqüência.

10. O método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o impacto da expressão da seqüência de nucleotídeos resultar na esterilidade masculina na planta.

11. Um método de restaurar a fertilidade para a planta da reivindicação 10 caracterizado por compreender a introdução, na planta macho-estéril, de uma seqüência de nucleotídeos compreendendo uma seqüência selecionada do grupo constituído por: (a) SEQ ID NO: 1; (b) codificação da seqüência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 2; (C) SEQ ID NO: 16 (d) uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade para qualquer uma das seqüências anteriores em que a seqüência é fundamental para a fertilidade masculina em uma planta; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores, sob condições muito rigorosas de lavagem de 0.1 SSC, 0.1% (p/v) SDS a 65°C onde a seqüê fundamental para a fertilidade masculina em uma planta, e (f) um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1, onde o fragmento é uma seqüência essencial para a fertilidade masculina em uma planta.

12. O método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a expressão da seqüência de nucleotídeos ser impedida, e posteriormente introduzida uma segunda seqüência de nucleotídeos ligada a um promotor induzível na planta, em que a segunda seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo constituído por: (a) SEQ ID NO: 1; (b) codificação de uma seqüência de aminoácidos compreendendo SEQ ID NO: 2; (C) SEQ ID NO: 16 (d) uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade para qualquer uma das seqüências anteriores em que a seqüência é fundamental para a fertilidade masculina em uma planta; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores, sob condições muito rigorosas de lavagem de 0,1 SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 65°C onde a seqüência é fundamental para a fertilidade masculina em uma planta, e (f) um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1, onde o fragmento é uma seqüência essencial para a fertilidade masculina em uma planta. de tal forma que a planta é constitutivamente macho estéril e a fertilidade é induzida através da indução do promotor.

13. Um método de restaurar a fertilidade de uma planta estéril da reivindicação 12 caracterizado por compreender a exposição das plantas constitutivamente macho-estéreis à substância indutora de modo que a planta seja macho fértil.

14. Um método de produção de sementes híbridas caracterizado por compreender: (a) Plantação em justaposição de polinização-cruzada, uma primeira semente de uma linhagem parental macho fértil selecionada e uma segunda semente selecionada de uma linhagem parental fêmea tendo a esterilidade masculina produzida de φ acordo com o método da Reivindicação 10; (b) polinizar de forma cruzada a planta fêmea macho-estéril, com pólen da planta macho fértil, e (c) colher as sementes da planta fêmea macho-estéril.

15. Método de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a linhagem parental fêmea é macho-estéril como resultado de mutação para a seqüência de nucleotídeos, e onde a dita seqüência de nucleotídeos mutante é dominante, ainda que inclua o crescimento de sementes híbridas para produzir uma terceira planta progenitora macho-estéril, produzindo um quarto das plantas progenitoras compreendendo um ou mais genes que controlam uma característica genética desejada e inter-fertilização das terceiras e quartas plantas- progenitoras para produção da segunda semente híbrida.

16. Uma região de regulação isolada caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo constituído por: (a) SEQ ID NO: 15; (b) SEQ ID NO: 18; (c) bases 1-1109 da SEQ ID NO: 15 (d) bases 1-609 da SEQ ID NO: 15; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores sob condições de lavagem em 2X SSC, 0,5% (p/v) de SDS, a 65°C por 30 minutos e que é necessária para a expressão preferencial no tecido masculino; (f) uma seqüência com a identidade de 90% para qualquer uma das seqüências anteriores e que é necessária para a expressão preferencial no tecido masculino; e (g) um fragmento funcional de uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 18, onde o dito fragmento é necessário para a expressão preferencial no tecido masculino.

17. Uma região reguladora caracterizada por compreender a SEQ ID NO: 15.

18. Uma região reguladora caracterizada por compreender as bases 1-1109 da SEQ ID NO: 15.

19. Uma região reguladora caracterizada por compreender as bases 1-610 da SEQ ID NO: 15.

20. Um vetor de expressão caracterizado por compreender a seqüência da reivindicação 16.

21. As células vegetais caracterizadas por compor o vetor da reivindicação 20.

22. O vetor de expressão da reivindicação 20 caracterizado por compreender ainda uma seqüência de nucleotídeos exógena, onde a seqüência de nucleotídeos exógena é operacionalmente ligada à região de regulação.

23. O vetor de expressão da reivindicação 21 caracterizado pelo fato de o produto da seqüência de nucleotídeos exógena interromper a formação ou a função do tecido masculino.

24. Método de impactar a fertilidade masculina em uma planta caracterizado pelo fato de que compreende introduzir em uma planta o vetor de expressão da reivindicação 22 no qual o elemento regulador controla a expressão da seqüência de nucleotídeos exógena, de forma que a fertilidade masculina da planta é afetada.

25. Método de acordo com a reivindicação 24 caracterizado por impactar a fertilidade masculina das plantas resultando na esterilidade masculina da planta.

26. Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado pelo fato de o elemento regulador ser induzido.

27. Método de acordo com a reivindicação 26 caracterizado pelo fato de a planta ser constitutivamente estéril quando a região reguladora não é induzida, e ser fértil guando o elemento regulador e o promotor são induzidos.

28. Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por compreender a realização da fertilização-cruzada da planta macho-estéril, com uma segunda planta, a segunda planta compreende uma segunda seqüência de nucleotídeos exógena, o produto da segunda seqüência de nucleotídeos exógena evitando a ruptura da formação ou função do tecido masculino, produzindo uma planta macho-fértil híbrida.

29. Método de restaurar a fertilidade de uma planta estéril de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por compreender a exposição de plantas constitutivamente macho-estéreis à substância indutora de modo que a planta é macho fértil.

30. Método de produção de sementes híbridas caracterizado por incluir: (a), produção de uma primeira planta compreendendo um vetor de expressão selecionado de acordo com a reivindicação -8, de modo que a planta é macho estéril, (b) produção de uma segunda planta, que é macho fértil; (c) realização da fertilização cruzada da primeira planta com a segunda planta para produção de sementes híbridas.

31. Método de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por a seqüência exógena que resulta em esterilidade masculina ser dominante e, posteriormente compreender em crescer as sementes híbridas para produzir uma terceira planta progenitora macho estéril; produzir uma quarta planta progenitora compreendendo um ou mais genes que controlam uma característica genética desejada, e fertilizar por cruzamento a terceiras e quartas plantas progenitoras produzidas para produção da segunda semente híbrida.

32. Método de manutenção de um estado homozigoto recessivo de uma planta macho estéril caracterizado pelo fato de o método compreender: (a) a criação de uma primeira planta compreendendo alelos homozigotos recessivos do gene Mscal e que é macho-estéril; (b) o fornecimento de uma segunda planta compreendendo alelos ^^ homozigotos recessivos do gene Mscal e uma construção hemizigótica, a construção contendo: (i) uma primeira seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos de Mscal, que, quando expressa na primeira planta iria restaurar a fertilidade masculina; (ii) uma segunda seqüência de nucleotídeos que, quando expressa inibe a função ou a formação de gametas masculinos viáveis na segunda planta, de tal forma que gametas masculinos viáveis são produzidos na segunda planta contendo os alelos recessivos de Mscal e que não contenham o construto; e (c) fertilizar a primeira planta com os gametas masculinos da segunda planta para produzir descendentes que mantêm o estado φί25 homozigoto recessivo da primeira planta.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a uma terceira seqüência de nucleotídeos, sendo que a terceira seqüência de nucleotídeos regula a expressão da primeira seqüência de nucleotídeos.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de as funções da terceira seqüência de nucleotídeos funcionam apenas na presença de uma substância ou condição indutora.

35. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a uma terceira seqüência de nucleotídeos, a terceira seqüência de nucleotídeos dirigindo a expressão preferencialmente em gametas masculinos.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste de uma seqüência de nucleotídeos do gene da DAM metilase, o gene da alfa-amilase de Zea mays, e um gene de codificação de citotoxina.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste na região reguladora do gene da poligalacturonase 47, gene Zml 3, gene da pectinametilesterase, gene da proteína de ligação de calmodulina, gene do fator de depolimerização de actina, gene da prolfilina e gene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatadas.

38. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que inclui ainda uma terceira seqüência de nucleotídeos que codifica um produto, a expressão do qual é capaz de ser utilizada para a seleção de células vegetais com o construto.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste de gene da fluorescência vermelha, gene da proteína ciano fluorescente, gene da proteína amarelo fluorescente, gene da luciferase, o gene da proteína verde fluorescente, gene pl antocianina e gene de codificação de fosfinotricina acetiltransferase.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que compreende ainda seleção para a referida segunda planta, identificando-se as plantas tendo a dita construção.

41. Método de manutenção de um estado homozigoto recessivo de uma primeira planta quando se cruza a primeira planta com uma segunda planta, caracterizado por o método compreender: (a) a criação de uma primeira planta compreendendo alelos homozigotos recessivos de um gene Mscal, a expressão do qual resulta na esterilidade masculina; (b) o fornecimento de uma segunda planta compreendendo alelos homozigotos recessivos do gene Mscal e uma construção em uma condição hemizigótica compreendendo: (i) uma seqüência de nucleotídeos que constituem a primeira seqüência de nucleotídeos Mscal, a qual, quando expressa na primeira planta irá restaurar a fertilidade masculina; (ii) uma segunda seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo da seqüência do gene da DAM metilase, do gene da alfa-amilase de Zea mays, e do gene de codificação de citotoxina; (iii) uma terceira seqüência de nucleotídeos operacionalmente ligada a uma segunda seqüência de nucleotídeos direcionando a expressão para gametas masculinos da planta, de tal forma que gametas masculinos viáveis são produzidos na segunda planta contendo os alelos recessivos, e que não contenham o construto e (c) a fertilização da primeira planta com os gametas masculinos da segunda planta para produzir descendentes que são macho-estéril e manter o estado homozigoto recessivo da primeira planta.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que inclui ainda uma quarta seqüência de nucleotídeos que codifica um produto capaz de ser utilizado para a seleção de células vegetais contendo o construto.

43. Método de acordo com a reivindicação 42 caracterizado pelo fato de que a quarta seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo de gene vermelho fluorescente, gene da proteína ciano fluorescente, do gene da proteína amarelo fluorescente, gene da luciferase, o gene da proteína verde fluorescente, o gene pl antocianina e o gene de codificação da fosfinotricina acetiltransferase.

44. Método de acordo com a reivindicação 41 caracterizado pelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeos é uma região reguladora selecionada do grupo consistindo do gene da poligalacturonase 47, gene Zml3, gene da pectinametilesterase, gene da proteína de ligação a calmodulina, gene do fator de despolimerização da actina, gene da prolfilina e gene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatada.

45. Método de acordo com a reivindicação 32 caracterizado pelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo constituído por: (a) SEQ ID NO: 1; (b) seqüência de codificação de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2; (c) SEQ ID NO: 16 (d) uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade para qualquer uma das seqüências anteriores em que a seqüência impacte a fertilidade masculina em uma de plantas; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores, em condições muito rigorosas de lavagem de 0,1 SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 65°C onde a seqüência impacte a fertilidade masculina em uma planta, e (f) um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1, o fragmento é uma seqüência que impacta a fertilidade masculina em uma planta.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a uma terceira seqüência de nucleotídeos reguladora da expressão da primeira seqüência de nucleotídeos.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo constituído por: (a) SEQ ID NO: 15; (b) SEQ ID NO: 18; (c) bases 1-1109 da SEQ ID NO: 15 (d) bases 1-609 da SEQ ID NO: 15; (e) uma seqüência que hibridiza a qualquer uma das seqüências anteriores, em condições de uma lavagem em 2X SSC, 0,5% (p/v) de SDS, a 65°C por 3 0 minutos e que é necessária para a expressão preferencial em tecido masculino; (f) lima seqüência com identidade de 90% para qualquer uma das seqüências anteriores e que é necessária para a expressão preferencial em tecido masculino; e (g) um fragmento funcional de uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 18, onde o dito fragmento é necessário para a expressão preferencial em tecido masculino.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a uma quarta seqüência de nucleotídeos, a quarta seqüência de nucleotídeos dirigindo preferencialmente a expressão em gametas masculinos.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste de uma seqüência de nucleotídeos do gene da DAM metilase, gene da alfa-amilase de Zea mays, e um gene de codificação de citotoxina.

50. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a quarta seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste na região reguladora do gene -47 poligalacturonase, gene Zml3, gene da pectinametilesterase, gene da proteína de ligação de calmodulina, gene do fator de despolimerização da actina, gene da prolfilina e gene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatadas.

51. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que inclui ainda uma terceira seqüência de nucleotídeos que codifica um produto capaz de ser utilizado para a seleção de células vegetais com o construto.

52. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por compreender ainda a seleção para a referida segunda planta, identificando as plantas tendo a dita construção.

53. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeos funciona ^ apenas na presença de uma substância ou condição indutora.

54. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos está ligada a uma terceira seqüência de nucleotídeos, a terceira seqüência de nucleotídeos dirigindo preferencialmente a expressão em gametas masculinos.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste de uma seqüência de nucleotídeos do gene da DAM metilase, gene da alfa-amilase de Zea mays, e um gene de codificação de citotoxina.

56. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste na região reguladora do gene poligalacturonase, gene Zml3, gene da pectinametilesterase, gene da proteína de ligação de calmodulina, gene do fator de despolimerização da actina, gene da prolfilina e gene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatadas.

57. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por incluir ainda uma terceira seqüência de nucleotídeos que codifica um produto capaz de ser utilizado para a seleção de células vegetais com o construto.

58. Método de acordo com a reivindicação 57 caracterizado pelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo de gene da fluorescência vermelha, gene da proteína ciano fluorescente, gene da proteína amarelo fluorescente, gene da luciferase, o gene da proteína verde fluorescente, gene pl antocianina e gene de codificação da fosfinotricina acetiltransferase.

59. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por compreender ainda a seleção da dita segunda planta através da identificação das plantas que contem a dita construção.

60. Método de produção de sementes de uma planta com gametas feminino e masculino, caracterizado por compreender: (a) a introdução em uma planta macho-estéril composta por alelos homozigotos recessivos do um gene Mscal, de um construto na condição hemizigoto compreendendo: (i) uma seqüência de nucleotídeos que constitui a primeira seqüência de nucleotídeos Mscal; (ii) uma segunda seqüência de nucleotídeos, que quando expressa inibe a função ou formação de gametas masculinos na planta, de tal forma que a planta produz gametas masculinos viáveis que não contêm o construto; (b) auto-fertilização da planta, e (c) produção de sementes que contenham a construção.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a uma terceira seqüência de nucleotídeos regulando a expressão da primeira seqüência de nucleotídeos.

62. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a segunda seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a uma terceira seqüência de nucleotídeos, a terceira seqüência de nucleotídeos dirigindo preferencialmente a expressão em gametas masculinos.

63. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por incluir ainda uma terceira seqüência de nucleotídeos que codifica um produto capaz de ser utilizado para a seleção de células vegetais contendo a construção.

64. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que ainda inclui a identificação de plantas tendo a dita construção.

65. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeos é ^^ selecionada do grupo constituído: (a) SEQ ID NO: 1; (b) seqüência de codificação de aminoácidos compreendendo a 15 SEQ ID NO: 2; (C) SEQ ID NO: 16 (d) uma seqüência tendo pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das seqüências anteriores onde a seqüência impacte a fertilidade masculina em uma planta; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores, em condições muito rigorosas de lavagem de 0,1 SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 65°C onde a seqüência impacte na fertilidade masculina em uma planta, e (f) um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1, onde o fragmento é φ£5 uma seqüência que impacte a fertilidade masculina em uma planta.

66. Método de restaurar a fertilidade masculina em uma planta macho-estéril, a planta macho-estéril composta por alelos homozigotos recessivos de Mscall caracterizado pelo fato de que o método compreende a introdução na dita planta de uma seqüência de nucleotídeos Mscal que é o complemento funcional do estado homozigoto recessivo.

67. Método de restaurar a fertilidade masculina em uma planta macho-estéril, a planta macho-estéril composta por alelos homozigotos recessivos de um gene que afeta a fertilidade masculina, caracterizado por o método compreender a introdução na dita planta de uma seqüência de nucleotideos que é o complemento funcional do estado homozigoto recessivo, onde a seqüência de nucleotideos é selecionada do grupo constituído por: (a) SEQ ID NO: 1; (b) seqüência de codificação de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2; (C) SEQ ID NO: 16 (d) úma seqüência tendo de pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das seqüências anteriores em que a seqüência impacte a fertilidade masculina em uma planta; (e) uma seqüência que hibridiza com qualquer uma das seqüências anteriores, em condições muito rigorosas de lavagem de 0,1 SSC, 0,1% (p/v) de SDS a 65°C onde a seqüência impacte a fertilidade masculina em uma planta, e (f) um fragmento funcional da SEQ ID NO: 1, o fragmento é uma seqüência que impacta a fertilidade masculina em uma planta.