BRPI0722357A2

BRPI0722357A2 - Processo para produzir um mosto de cervejeiro, mosto, cerveja, e, composição

Info

Publication number: BRPI0722357A2
Application number: BRPI0722357-9A
Authority: BR
Inventors: Niels Elvig; Per Linaa Joergensen; Michael Thomas
Original assignee: Novozymes As; Novozymes Inc
Priority date: 2007-12-12
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2014-03-18
Also published as: RU2010128656A; EP2222830A1; ZA201003611B; MX2010006016A; HUE026621T2; CN101918525A; WO2009075682A8; RU2524413C2; ES2551711T3; PL2222830T3; WO2009075682A1; DK2222830T3; EP2222830B1

Description

I “PROCESSO PARA PRODUZIR UM MOSTO DE CERVEJEIRO, MOSTO, CERVEJA, E, COMPOSIÇÃO”

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Este pedido contém uma Listagem de Seqüência na forma legível de computador. A forma legível de computador é aqui incorporada por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um processo de maceração melhorado para a produção de um mosto de cervejeiro e para a produção de uma cerveia.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Nos processos de maceração modernos, enzimas são frequentemente adicionadas como um suplemento quando o malte da maceração é baixo em enzimas ou para permitir o uso de todos os grãos 15 triturados auxiliares. As enzimas também podem ser aplicadas na maceração de maltes bem modificados com alto teor de enzima de modo a aumentar a recuperação de extrato assim como a quantidade de açúcares fermentáveis. É assim bem conhecido aplicar enzimas de desramificação, por exemplo, isoamilase ou pululanase para aumentar os açúcares fermentáveis produzidos. 20 As enzimas de desramificação podem ser aplicadas em processos para a produção de cerveja de baixa caloria. Tais processos são o assunto de Willox et al. (MBAA Technical Quarterly, 1977, 14: 105), Patente U.S. N25 4.528.198, 4.666.718 e 4.318.927, e GB 2056484 e GB 2069527.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Os presentes inventores agora descobriram

surpreendentemente que usando-se uma certa pululanase, a maceração pode ser obtida usando uma quantidade menor de proteína enzimática.

Consequentemente, em um primeiro aspecto a invenção fornece um processo para produzir um mosto de cervejeiro que compreende formar uma mistura a partir de malte triturado, e contatar a dita mistura com uma pululanase (E.C. 3.2.1.41), em que a dita pululanase tem uma seqüência de aminoácido que a) é pelo menos 50 % idêntica à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, ou b) é codificada por uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condições de baixa severidade com i) um filamento complementar de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, ou ii) uma subsequência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos.

Em um segundo aspecto a invenção fornece um mosto produzido pelo processo do primeiro aspecto.

Em um terceiro aspecto a invenção fornece mosto concentrado e/ou seco produzido pelo processo do primeiro aspecto.

Em um quarto aspecto a invenção fornece cerveja produzida a partir do mosto do segundo e terceiro aspectos.

Em um quinto aspecto a invenção fornece uma composição adequada para o uso no processo do primeiro aspecto, a dita composição compreendendo pululanase (E.C. 3.2.1.41), glicoamilase e opcionalmente alfa-amilase, em que a pululanase tem uma seqüência de aminoácido que a) é pelo menos 50 % idêntica à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, ou b) é codificada por uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condições de baixa severidade com i) um filamento complementar de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, ou ii) uma subsequência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os processos cervejeiros são bem conhecidos na técnica, e no geral envolvem as etapas de maltagem, maceração e fermentação. A maceração é o processo de converter amido a partir do malte de cevada moída e auxiliares sólidos em açúcares fermentáveis e não fermentáveis para produzir mosto da composição desejada. A maceração tradicional envolve misturar malte de cevada moída e auxiliares com água em uma temperatura e volume ajustados para continuar as mudanças bioquímicas iniciadas durante o processo de maltagem. O processo de maceração é conduzido em um período de tempo em várias temperaturas de modo a ativar as enzimas endógenas responsáveis pela degradação de proteínas e carboidratos. Sem dúvida a mudança mais importante realizada na maceração é a conversão de moléculas de amido em açúcares fermentáveis. As enzimas principais responsáveis pela conversão de amido em um processo de maceração tradicional são as alfa- e beta-amilases. A alfa-amilase muito rapidamente reduz amido insolúvel e solúvel pela separação das moléculas de amido em muitas cadeias mais curtas que podem ser atacadas pela beta-amilase. O dissacarídeo produzido é maltose. Além da maltose formada durante a maceração oligômeros de glicose ramificados curtos são produzidos. Os oligômeros de glicose ramificados curtos são açúcares não fermentáveis e contribuem para o sabor assim como para a quantidade de calorias da cerveja acabada.

Depois da maceração, quando todo o amido foi quebrado, é necessário separar o extrato líquido (o mosto) dos sólidos (grãos gastos). A separação do mosto, filtração, é importante porque os sólidos contêm quantidades grandes de proteína, amido deficientemente modificado, material graxo, silicatos e polifenóis (taninos). A seguir da separação do mosto dos grãos gastos o mosto pode ser fermentado com levedura de cervejeiro para produzir uma cerveja.

Informação adicional sobre processos de fabricação de cerveja convencionais pode ser encontrado em “Technology Brewing and Malting” por Wolfgang Kunze do Research and Teaching Institute of Brewing, Berlim (VLB), 2a Edição revisada 1999, ISBN 3-921690-39-0.

Os oligômeros de glicose ramificados curtos formados durante a maceração podem ser hidrolisados ainda pela adição de enzimas exógenas (enzimas adicionadas além do malte). As enzimas de desramificação tais como pululanase e isoamilase hidrolisam a ramificam ligações alfa-1-6 glicosídicas nestes oligômeros, liberando deste modo glicose ou maltose e oligômeros de cadeia reta que são submetidas à ação de enzimas endógenas (derivadas do malte) e/ou exógenas, por exemplo, alfa-amilases, beta- amilases e glicoamilases.

A presente invenção fornece um novo processo adequado para produzir um mosto que é baixo em açúcares não fermentáveis. O processo aplica-se a uma atividade de pululanase expressamente selecionada.

Definições

Por toda esta divulgação, vários termos que são no geral entendidos por aqueles de habilidade comum na técnica, são usados. Vários termos são usados com significado específico, como definido abaixo.

Como aqui usado a expressão “grão triturado” é entendida como o material contendo amido ou açúcar que é a base para a produção de cerveja, por exemplo, o malte da cevada e o auxiliar. No geral, o grão triturado não contém nenhuma água adicionada.

A expressão “malte” é entendida como qualquer grão de cereal maltado, em particular cevada.

A expressão “auxiliar” é entendida como a parte do grão triturado que não é malte de cevada. O auxiliar pode compreender qualquer material vegetal rico em amido, por exemplo, grão não maltado, tal como cevada, arroz, milho, trigo, centeio, sorgo e açúcar e/ou xarope facilmente fermentável.

A expressão “mistura” é entendida como uma pasta fluida contendo amido que compreende grão triturado macerado em água.

A expressão “mosto” é entendida como a descarga líquida não fermentada a seguir da extração do grão triturado durante a maceração.

A expressão “grãos gastos” é entendida como os sólidos drenados que permanecem quando o grão triturado foi extraído e o mosto separado.

A expressão “cerveja” é entendida como mosto fermentado, isto é, uma bebida alcoólica fermentada a partir do malte de cevada, opcionalmente auxiliar e lúpulos.

A expressão “seqüência homóloga” é usada para caracterizar uma seqüência tendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 70 %, preferivelmente pelo menos 75 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou 90 %, ou pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % pelo menos 99 % ou ainda pelo menos 100 % idêntica a uma seqüência conhecida. A parte relevante da seqüência de aminoácido para a determinação de homologia é o polipeptídeo maduro, isto é, sem o peptídeo de sinal. A expressão “seqüência homóloga” também é usada para caracterizar seqüências de DNA que hibridizam em severidade baixa, severidade média, severidade média/alta, severidade alta, ou ainda severidade muito alta com uma seqüência conhecida. As condições experimentais adequadas para determinar a hibridização em severidade baixa, média, ou alta entre uma sonda de nucleotídeo e uma seqüência de DNA ou RNA homóloga envolve a pré-imersão do filtro contendo os fragmentos de DNA ou RNA a hibridizar em 5 x SSC (Cloreto de sódio /Citrato de sódio, Sambrook et al., 1989) por 10 min e pré-hibridização do filtro em uma solução de 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt (Sambrook et al., 1989), 0,5 % de SDS e 100 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão sonificado (Sambrook et al., 1989), seguido pela hibridização na mesma solução contendo uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda aleatoriamente iniciada (Feinberg e Vogelstein, 1983, Anal. Biochem. 132: 6-13), rotulada com 32P-dCTP (atividade específica > 1 x 109 cpm/micrograma) por 12 horas a cerca de 45 0C. O filtro é depois lavado duas vezes por 30 minutos em 2 x SSC, 0,5 % de SDS a cerca de 55 0C (severidade baixa), mais preferivelmente a cerca de 60 0C (severidade média), ainda mais preferivelmente a cerca de 65 0C (severidade média/ alta), ainda mais preferivelmente a cerca de 70 0C (severidade alta) e ainda mais preferivelmente a cerca de 75 0C (severidade muito alta). As moléculas às quais a sonda de oligonucleotídeo hibridiza sob estas condições são detectadas usando uma película de raio x.

A expressão “identidade” quando usada com respeito às seqüências de polipeptídeo ou DNA e aludida nesta divulgação é entendida como o grau de identidade entre duas seqüências indicando uma derivação da primeira seqüência a partir da segunda. A identidade pode ser adequadamente determinada por meio de programas de computador conhecidos na técnica tais como GAP fornecidos no pacote de programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versão 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman e Wunsch, 1970, Journal of Molecular Biology 48: 443-453. Os seguintes ajustes para a comparação de seqüência de polipeptídeo são usados: penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1. O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácido da presente invenção e uma seqüência de aminoácido diferente (“seqüência estranha”) é calculada como o número de emparelhamentos exatos em um alinhamento das duas seqüências, dividido pelo comprimento da “seqüência da invenção” ou o comprimento da “seqüência estranha”, a que for a mais curta. O resultado é expressado em identidade percentual.

Produção de mosto

De acordo com o primeiro aspecto a invenção fornece um processo para produzir um mosto de cervejeiro que compreende formar uma mistura a partir de malte triturado e contatar a dita mistura com uma pululanase (E.C. 3.2.1.41), em que a dita pululanase tem uma seqüência de aminoácido que a) é pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou 90 %, ou pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou ainda pelo menos 99 % idêntica à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, ou b) é codificada por uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob severidade baixa, severidade média, severidade média/alta, severidade alta, ou ainda severidade muito alta com i) um filamento complementar de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, ou ii) uma subsequência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 1000 nucleotídeos, ou ainda pelo menos 1500 nucleotídeos. Em uma forma de realização preferida, a pululanase tem uma seqüência de aminoácido que difere em não mais do que 100 aminoácidos, preferivelmente em mais do que 80 aminoácidos, mais preferido em mais do que 50 aminoácidos, mais preferivelmente em mais do que 30 aminoácidos, ainda mais preferivelmente em mais do que 20 aminoácidos e o mais preferivelmente em mais do que 10 aminoácidos da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3.

O grão triturado do primeiro aspecto compreende grão maltado contendo amido e/ou auxiliar. O grão triturado pode preferivelmente compreender de 0 % a 100 %, preferivelmente de 20 % a 100 %, preferivelmente de 30 % a 100 %, mais preferivelmente de 40 % a 100 %, ainda mais preferivelmente de 50 % a 100 %, ainda mais preferivelmente de 60 % a 100 %, tal como de 80 % a 100 % ou ainda o mais preferivelmente de 90 % a 100 % de auxiliar, grão não maltado e/ou cevada não maltada. Em uma forma de realização particular o auxiliar é composto de 100 % de cevada não maltada. Além disso, o grão triturado preferivelmente compreende de 0 % a 100 %, preferivelmente de 20 % a 100 %, preferivelmente de 30 % a 100 %, mais preferivelmente de 40 % a 100 %, ainda mais preferivelmente de 50 % a 100 %, ainda mais preferivelmente de 60 % a 100 %, ou o mais preferivelmente de 70 % a 100 %, ou ainda mais preferivelmente de 90 % a 100 % de grão maltado e/ou cevada maltada. Em uma forma de realização particular o grão triturado compreende aproximadamente 50 % de grão maltado, por exemplo, cevada maltada e aproximadamente 50 % de auxiliar, por exemplo, grão não maltado, tal como cevada não maltada.

O grão maltado usado no processo do primeiro aspecto pode compreender qualquer grão maltado e preferivelmente grão maltado selecionado de cevada maltada, trigo, centeio, sorgo, painço, milho e arroz e o mais preferivelmente cevada maltada.

O auxiliar usado no processo do primeiro aspecto pode ser obtido de tubérculos, raízes, hastes, folhas, legumes, cereais e/ou grão inteiro. O auxiliar pode compreender amido e/ou açúcar brutos e/ou refinados contendo material derivado de plantas como trigo, centeio, aveia, milho, arroz, milho, painço, sorgo, batata, batata doce, cassava, tapioca, sagu, banana, beterraba açucareira e/ou cana de açúcar. Preferivelmente, o auxiliar compreende grão não maltado, por exemplo, grão não maltado selecionado da lista que consiste de cevada, trigo, centeio, sorgo, painço, milho e arroz e o mais preferivelmente cevada não maltada. O auxiliar que compreende carboidratos facilmente fermentáveis tais como açúcares ou xaropes podem ser adicionados à mistura de malte de cevada antes, durante ou depois do processo de maceração da invenção mas são preferivelmente adicionados depois do processo de maceração.

De acordo com a invenção, uma atividade enzimática de pululanase (E.C. 3.2.1.41) é exogenamente fornecida e presente na mistura. A pululanase pode ser adicionada aos ingredientes da mistura, por exemplo, à água e/ou ao grão triturado antes, durante ou depois de formar a mistura. Em uma forma de realização particularmente preferida uma alfa-amilase (E.C. 3.2.1.1) e/ou uma glicoamilase (E.C. 3.2.1.3), são adicionadas e presentes na mistura juntas com a pululanase.

Em uma outra forma de realização preferida, uma outra enzima é adicionada à mistura, a dita enzima sendo selecionada do grupo que consiste de isoamilase, protease, lacase, xilanoase, lipase, fosfolipolase, fitase, fitina e esterase.

Durante o processo de maceração, o amido extraído do grão triturado é gradualmente hidrolisado em açúcares fermentáveis e dextrinas menores. Preferivelmente, a mistura é negativa em amido no teste de iodo, antes de extrair o mosto.

O processo de maceração no geral aplica um aumento gradativo controlado na temperatura, onde cada etapa favorece uma ação enzimática em relação à outra, eventualmente proteínas degradantes, paredes celulares e amido. Os perfis de temperatura da maceração são no geral conhecidos na técnica. Na presente invenção a etapa de sacarificação (degradação de amido) no processo de maceração é preferivelmente realizada entre 60 0C e 66 °C, mais preferivelmente entre 61 0C e 65 °C, ainda mais preferivelmente entre 62 0C e 64 0C e o mais preferivelmente entre 63 0C e

64 °C. Em uma forma de realização particular da presente invenção a temperatura de sacarificação é de 64 °C.

A obtenção do mosto a partir da mistura tipicamente inclui separar por meio de peneira o mosto dos grãos gastos, isto é, do grão

r

insolúvel e material de casca que forma parte do grão triturado. Agua quente pode ser conduzida através dos grãos gastos para remover por enxague, ou espargir, qualquer extrato remanescente do grão triturado. A aplicação de uma celulase controlável por termostato no processo da presente invenção resulta na redução eficiente do nível de beta-glicano facilitando a separação do mosto por meio de peneira garantindo assim tempo de ciclo reduzido e alta recuperação de extrato. Preferivelmente a recuperação de extrato é de pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 81 %, mais preferivelmente pelo menos 82 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 83 %, tal como pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 % e o mais preferivelmente pelo menos 91 %.

A seguir da separação do mosto dos grãos gastos do grão triturado de qualquer uma das formas de realização anteriormente 5 mencionadas do primeiro aspecto, o mosto pode ser usados como tal ou pode ser desidratado para fornecer um mosto concentrado e/ou seco. O mosto concentrado e/ou seco pode ser usado como extrato de fermentação, como extrato de malte aromatizado, para bebidas de malte não alcoólicas, vinagre de malte, cereais matinais, para a fabricação de confeitos, etc.

Em uma forma de realização preferida, o mosto é fermentado

para produzir uma bebida alcoólica, preferivelmente uma cerveja, por exemplo, cerveja ale, ale forte, amarga, escura tipo stout, preta tipo porter, cerveja de fermentação baixa, cerveja de exportação, licor de malte, vinho de cevada, tipo happoushu, cerveja com alto teor alcoólico, cerveja com baixo 15 teor alcoólico, cerveja de baixa caloria ou cerveja light. A fermentação do mosto pode incluir semear o mosto com uma pasta fluida de levedura que compreende levedura fresca, isto é, levedura não anteriormente usada para a invenção ou a levedura pode ser levedura reciclada. A levedura aplicada pode ser qualquer levedura adequada para a fabricação de cerveja, especialmente 20 leveduras selecionadas de Saccharomyces spp. tais como S. cerevisiae e S. uvarum, que incluem variantes natural ou artificialmente produzidas destes organismos. Os métodos para a fermentação de mosto para a produção de cerveja são bem conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica.

O processo da invenção pode incluir adicionar hidrogel de sílica ao mosto fermentado para aumentar a estabilidade coloidal da cerveja. Os processos podem incluir ainda adicionar terra diatomácea ao mosto fermentado e filtrar para dar a cerveja clara.

De acordo com um aspecto da invenção é fornecido cerveja produzida a partir do mosto do segundo ou terceiro aspectos, tal como uma cerveja produzida pela fermentação do mosto para produzir uma cerveja. A cerveja pode ser qualquer tipo de cerveja, por exemplo, cerveja ale, ale forte, amarga, escura tipo stout, preta tipo porter, cerveja de fermentação baixa, cerveja de exportação, licor de malte, vinho de cevada, tipo happoushu, cerveja com alto teor alcoólico, cerveja com baixo teor alcoólico, cerveja de baixa caloria ou cerveja light.

Enzimas

As enzimas a serem aplicadas na presente invenção devem ser selecionadas quanto a sua capacidade para reter atividade suficiente na temperatura de processo dos processos da invenção, assim como sob o regime de pH na mistura e devem ser adicionadas em quantidades eficazes. As enzimas podem ser derivadas de qualquer fonte, preferivelmente de uma planta ou uma alga e mais preferivelmente de um microorganismo, tal como de uma bactéria ou um fungo.

Pululanase (E.C. 3.2.1.41)

Uma enzima de pululanase preferida a ser usada nos processos e/ou composições da invenção é uma pululanase tendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 50 %, tal como pelo menos 55 %, tal como pelo menos 60 %, tal como pelo menos 65 %, tal como pelo menos 66 %, tal como pelo menos 70 %, tal como pelo menos 75 %, tal como pelo menos 80 %, tal como pelo menos 85 %, tal como pelo menos 86 %, tal como pelo menos 87 %, tal como pelo menos 88 %, tal como pelo menos 89 %, tal como pelo menos 90 %, tal como pelo menos 95 %, tal como pelo menos 98 % ou ainda 100 % idêntica à seqüência mostrada na SEQ ID NO: 4; íon particular quando alinhado usando o Programa Needle usando Matriz: BLOSUM62; penalidade de início de intervalo: 10,0; penalidade de extensão de intervalo: 0,5; Matriz de Identidade sem Intervalo.

O mais preferivelmente a pululanase é derivada de Bacillus acidopullulyticus. A pululanase pode ter a seqüência de aminoácido divulgada por Kelly et al., 1994 (FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106) (SEQ ID NO: 6) ou uma seqüência homóloga.

Isoamilase (E.C. 3.2.1.68)

Uma outra enzima aplicada nos processos e/ou composições da invenção pode ser uma enzima desramificadora alternativa, tal como uma isoamilase (E.C. 3.2.1.68). A isoamilase hidrolisa ligações de ramificação alfa-l,6-D-glicosídica em amilopectina e beta-restringem dextrinas e podem ser distinguidas das pululanases pela incapacidade da isoamilase para atacar pululano e pela ação limitada sobre as dextrinas alfa-restritas. A isoamilase pode ser adicionada em quantidades eficazes bem conhecidas pela pessoa habilitada na técnica. A isoamilase pode ser adicionada sozinha ou junto com uma pululanase.

Alfa-amilase (EC 3.2.1.1)

Uma enzima de alfa-amilase particular a ser usada nos processos e/ou composições da invenção pode ser uma alfa-amilase de Bacillus. As alfa-amilases de Bacillus bem conhecidas incluem alfa-amilase derivada de uma cepa de B. Iieheniformis, B. amiloliquefaeiens e B. stearothermophilus. No contexto da presente invenção, uma alfa-amilase de Bacillus considerada é uma alfa-amilase como definida na WO 99/19467 da página 3, linha 18 até a página 6, linha 27. Uma alfa-amilase preferida tem uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade com a SEQ ID NO: 4 na WO 99/19467 (aqui divulgada como SEQ ID NO: 7), tal como pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou particularmente pelo menos 99 %. A alfa-amilase maltogênica mais preferida é a SEQ ID NO: 9 ou compreende as variantes desta divulgadas na WO 99/43794. As variantes e híbridos considerados são descritos na WO 96/23874, WO 97/41213 e 20 99/19467. Especificamente considerada é uma alfa-amilase (E.C. 3.2.1.1) de B. stearothermophilus tendo a seqüência de aminoácido divulgada como SEQ ID NO: 3 na WO 99/19467 (aqui divulgada como SEQ ID NO: 10) com as mutações: 1181* + Gl82* + N193F.

As alfa-amilases de Bacillus podem ser adicionadas nas quantidades de 1,0 a 1000 NU/kg de DS, preferivelmente de 2,0 a 500 NU/kg 5 de DS, preferivelmente de 10 a 200 NU/kg de DS.

Uma outra alfa-amilase particular a ser usada nos processos da invenção pode ser qualquer alfa-amilase fungica, por exemplo, uma alfa- amilase derivada de uma espécie dentro de Aspergillus e preferivelmente de uma cepa de Aspergillus niger. Especialmente considerado são alfa-amilases 10 fúngicas que exibem uma identidade alta, isto é, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 % ou ainda pelo menos 90 % de identidade às seqüências de aminoácido mostradas na SEQ ID NO: 1 na WO 2002/038787 (aqui divulgada como SEQ ID NO: 11). As alfa-amilases 15 fungicas podem ser adicionadas em uma quantidade de 1 a 1000 AFAU/kg de DS, preferivelmente de 2 a 500 AFAU/kg de DS, preferivelmente de 20 a 100 AFAU/kg de DS.

Glicoamilases (E.C. 3.2.1.3)

Uma outra enzima particular a ser usada nos processos e/ou 20 composições da invenção pode ser uma glicoamilase (E.C. 3.2.1.3) derivada de um microorganismo ou uma planta. Preferidas são as glicoamilases de origem fungica ou bacteriana selecionada do grupo que consiste de glicoamilases de Aspergillus, em particular glicoamilases Gl ou G2 de A. niger (Boel et al., 1984, EMBO J. 3(5): 1097-1102), ou variantes destas, tais 25 como as divulgadas na WO 92/00381 e WO 00/04136; a glicoamilase de A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae (Agric. Biol. Chem., 1991, 55(4): 941- 949), ou variantes ou fragmentos destas.

Outras glicoamilases consideradas incluem glicoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (Patente U.S. N- Re. 32.153), Talaromyces duponti e Talaromyces thermophilus (Patente U.S. N° 4.587.215). As glicoamilases preferidas incluem as glicoamilases derivadas de Aspergillus oryzae, tais como uma glicoamilase tendo pelo menos 90 %, 5 pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou particularmente pelo menos 99 % ou ainda pelo menos 90 % de identidade à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 na WO 00/04136. Outras glicoamilases preferidas incluem as glicoamilases derivadas de Talaromyees emersonii tais como uma glicoamilase tendo pelo menos 90 10 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou particularmente pelo menos 99 % ou ainda pelo menos 90 % de identidade com a seqüência de aminoácido de Talaromyees emersonii (WO 99/28448).

As glicoamilases bacterianas consideradas incluem glicoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamilolyticum (EP 135.138) e C. thermoidrosulfuricum (WO 86/01831).

Também considerados são os produtos comerciais AMG 200L; AMG 300 L; SAN® SUPER e AMG® E (da Novozymes); OPTIDEX® 300 (da Genencor Int.); AMIGASE® e AMIGASE® PLUS (da DSM); G-ZYME® 20 G900 (da Enzyme Bio-Systems); G-ZYME® G990 ZR (glicoamilase de A. niger e teor de protease baixa). As glicoamilases podem ser adicionadas em quantidades eficazes bem conhecidas pela pessoa habilitada na técnica.

Protease

As proteases adequadas incluem proteases microbianas, tais como as proteases fungicas e bacterianas. As proteases preferidas são as proteases ácidas, isto é, proteases caracterizadas pela capacidade para hidrolisar proteínas sob condições ácidas abaixo do pH 7.

As proteases são responsáveis pela redução do comprimento global de proteínas de peso molecular alto para proteínas de peso molecular baixo na mistura. As proteínas de peso molecular baixo são uma necessidade para a nutrição de levedura e as proteínas de peso molecular alto garante a estabilidade da espuma. Assim é bem conhecido pelas pessoas habilitadas que a protease deve ser adicionada em uma quantidade balanceada que ao mesmo 5 tempo permite o caminhar dos aminoácidos livres para a levedura e deixa as proteínas com peso molecular alto o bastante para estabilizar a espuma. As proteases podem ser adicionadas nas quantidades de 0,1 a 1000 AU/kg de DS, preferivelmente de 1 a 100 AU/kg de DS e o mais preferivelmente de 5 a 25 AU/kg de DS.

Celulase (E.C. 3.2.1.4)

A celulase pode ser de origem microbiana, tal como derivável de um cepa de um fungo filamentoso (por exemplo, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium). Os exemplos específicos de celulases incluem as endoglicanase (endoglicanase I) obteníveis de H. insolens e 15 definida ainda pela seqüência de aminoácido da fig. 14 na WO 91/17244 (aqui divulgada como SEQ ID NO: 12) e a endoglicanase de H. insolens de 43 kD descrita na WO 91/17243.

Uma celulase particular a ser usada nos processos da invenção pode ser uma endo-glicanase, tal como uma endo-l,4-beta-glicanase. 20 Especialmente considerada é a beta-glicanase mostrada na SEQ.ID.NO: 2 na WO 2003/062409 (aqui divulgada como SEQ ID NO: 14) e seqüências homólogas. As preparações de celulase comercialmente disponíveis que podem ser usadas incluem CELLUCLAST®, CELLUZYME®, CEREFLO® e ULTRAFLO® (disponíveis da Novozymes A/S), LAMINEX® e SPEZYME® 25 CP (disponíveis da Genencor Int.) e ROHAMENT® 7069 W (disponível da Rohm, Alemanha).

As beta-glicanases podem ser adicionadas nas quantidades de

1,0 a 10000 BGU/kg de DS, preferivelmente de 10 a 5000 BGU/kg de DS, preferivelmente de 50 a 1000 BGU/kg de DS e o mais preferivelmente de 100 a 500 BGU/kg de DS. MATERIAIS E MÉTODOS

Enzimas

A Pululanase 1 derivada de Bacillus acidopullulyticus e tendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO: I. A Pululanase 1 é disponível da Novozymes como Promozyme 400L.

A Pululanase 2 derivada de Bacillus deramificans (Patente U.S. N2 5.736.375) e tendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 2. A Pululanase 2 é disponível da Novozymes como Promozyme D2.

A Pululanase 3 derivada de Bacillus acidopullulyticus e tendo a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 4.

A alfa-amilase fungica ácida derivada de Aspergillus niger e tendo a seqüência mostrada na SEQID NO: 11.

A glicoamilase Gl derivada de Aspergillus niger (Boel et al.,

supra).

Métodos

Atividade de alfa-amilase (NU)

A atividade da alfa-amilase pode ser determinada usando amido de batata como substrato. Este método é fundamentado na decomposição do amido de batata modificado pela enzima e a reação é seguida misturando-se as amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente, uma cor azul escuro é formada, mas durante a decomposição do amido a cor azul fica mais fraca e gradualmente vira em um marrom avermelhado, que é comparada com um padrão de vidro colorido.

Uma Unidade Quilo Novo de alfa amilase (KNU) é igual a 1000 NU. Um KNU é definido como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é, a 37 0C +/- 0,05; 0,0003 M de Ca2+; e pH 5,6) degrada 5,26 g de matéria seca de amido (Merck Amilum solubile).

Atividade de alfa-amilase ácida (AFAU) A atividade de alfa-amilase ácida pode ser medida em AFAU (Unidades de Alfa-amilase Fúngica Ácida), que são determinadas em relação

a um padrão de enzima. I FAU é definido como a quantidade de enzima que degrada 5,260 mg de matéria seca de amido por hora sob as condições padrão abaixo mencionadas.

glican-glicanoidrolase, E.C. 3.2.1.1) hidrolisa as ligações alfa-l,4-glicosídica

nas regiões internas da molécula de amido para formar dextrinas e

oligossacarídeos com comprimentos de cadeia diferentes. A intensidade de

cor formada com iodo é diretamente proporcional à concentração de amido. A

atividade de amilase é determinada usando colorimetria reversa como uma

redução na concentração de amido sob as condições analíticas especificadas. ALFA-AMILASE

AMIDO+ IODO -► DEXTRINAS + OLIGOSSACARÍDEOS

quantidade de enzima, que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto a 37 0CepH 4,3.

A alfa-amilase ácida, uma endo-alfa-amilase (1,4-alfa-D-

λ = 590 nm ^O0, pH 2,5

azul/violeta t = 23 s. descoloração

Condições padrão/condições de reação:

15

Substrato: Tampão: Iodo (12): CaC12:

Amido solúvel, aprox. 0,17 g/L

Citrato, aprox. 0,03 M

0,03 g/L

1,85 mM

2,50 ± 0,05

40 0C

20

0,025 AFAU/mL Faixa de trabalho da enzima: 0,01-0,04 AFAU/mL Atividade de Glicoamilase (AGU)

A Unidade de Glicoamilase Novo (AGU) é definida como a

23 segundos 590 nm

25 A atividade é determinada como AGU/ml por um método modificado depois (AEL-SM-0131, disponível sob requisição daNovozymes) usando o kit Glucose GOD-Perid da Boehringer Mannheim, 124036. Padrão: AMG-standard, lote 7-1195, 195 AGU/ml. 375 microL de substrato (1 % de maltose em 50 mM de acetato de sódio, pH 4,3) são incubados 5 minutos a 37 °C. 25 microL de enzima diluída em acetato de sódio são adicionados. A reação é interrompida depois de 10 minutos pela adição de 100 microL de NaOH 0,25 M. 20 microL são transferidos para uma placa de microtítulo de 96 reservatórios e 200 microL de solução de GOD-Perid (124036, Boehringer Mannheim) são adicionados. Depois de 30 minutos na temperatura ambiente, a absorbância é medida a 650 nm e a atividade calculada em AGU/ml a partir do AMG-standard. Uma descrição detalhada do método analítico (AEL-SM- 0131) está disponível sob requisição da Novozymes.

Atividade de pululanase (PUN):

Uma unidade de pululanase (PUN) é definida como a quantidade de enzima, que é capaz de formar 1 micromol de glicose a partir de substrato de pululano por minuto a 50 0C em um tampão de citrato no pH 5.

As amostras de pululanase são incubadas com substrato (pululano vermelho). A endo-pululanase hidrolisa as ligações alfa-1,6- glicosídicas em pululano vermelho, liberando produtos da degradação do substrato vermelho. O substrato não degradado é precipitado usando etanol. A quantidade de cor liberada é medida espectrofotometricamente a 510 nm e é proporcional à atividade de endo-pululanase na amostra. A formação de cor das amostras é comparada com a formação de cor produzida pelas amostras com atividade de pululanase conhecida.

A pululanase é uma pululano 6-glicano-hidrolase com a classificação de enzima número E.C. 3.2.1.41.

Condições de reação Temperatura 50 0C ± 2 0C

pH 5,0

Concentração de Substrato 0,67 % de pululano vermelho Concentração de Enzima 0,04 a 0,13 PUN/ml

Tempo de Reação 30 min.

Comprimento de onda 510 nm

Reagentes/ Substratos

Solução de cloreto de potássio 0,5 M

Substrato de pululano vermelho 2 %. Fornecedor Megazyme, Austrália Tampão de Citrato 0,05 M pH 5,0

Tampão de Citrato 0,05 M pH 5,0 com 25 mM de cisteína Etanol 99,8 %

Preparação de padrão de pululanase de 904 PUN/g diluídos em tampão de citrato 0,05 M para uma série de diluição padrão de 0,05 a 0,20 PUN/ml Branco Tampão de Citrato 0,05 M

As amostras de enzima são diluídas em tampão de citrato 0,05 M até uma atividade entre 0,06 a 0,20 PUN/ml e comparadas com a série de diluição de padrão.

Exemplo 1

Neste exemplo, a capacidade de pululanases diferentes para

reduzir a quantidade de carboidratos não fermentáveis (dextrina/DP4/4+) em um mosto foi analisada.

100 % de malte bem modificado foi misturado usando um perfil de temperatura de maceração que compreende de 46 0C por 26 minutos, seguidos por um aumento de 1 °C/minuto até 64 0C depois do que a temperatura foi mantida constante. As amostras foram coletadas a 98, 128 e 158 minutos.

As enzimas foram adicionadas a 0 minutos. A glicoamilase e a alfa-amilase foram adicionadas a todos os tratamentos em quantidades de 1000 AGU/kg de DS e 250 AFAU/kg de DS respectivamente. A pululanase foi adicionada de acordo com a tabela 1.

As amostras foram fervidas 10 minutos e filtradas (Tamanho de poro 0,20 micro-m). As amostras foram analisadas pela HPLC e a % de carboidrato não fermentável (DP4/4+) foi calculada.

Tabela 1: % de carboidrato não fermentável depois de tempos de maceração de 98, 128 e 158 minutos. Quantidade em Tempo de Maceração mg/kg de DS 98 minutos 128 minutos 158 minutos Nenhuma 0 28,87 25,16 22,94 Pululanase 1 0,74 27,64 24,55 21,96 Pululanase 1 3,65 23,96 21,35 18,92 Pululanase 1 7,25 20,71 17,74 16,11 Pululanase 1 14,39 16,36 14,47 13,22 Pululanase 2 1,86 28,34 25,21 22,79 Pululanase 2 9,26 26,81 23,28 21,36 Pululanase 2 18,40 25,68 22,33 20,17 Pululanase 2 36,59 23,56 20,58 18,35 Pululanase 3 1,37 27,11 23,38 20,51 Pululanase 3 2,74 24,46 20,93 18,18 Os dados na tabela 1 foram usados para calcular, pela regressão, as dosagens de enzima de pululanase 1 e pululanase 2 necessárias para se obter o mesmo efeito como 2,74 mg de proteína enzimática/kg de

pululanase 3 (ver a tabela 2).

Tabela 2. mg/kg DS de proteína enzimática de pululanase necessária para se obter o mesmo efeito como com 2,74 mg de Pululanase 3 e tempos de maceração de 98, 128 e 158 minutos. Tempo de Maceração Pululanase 1 Pululanase 2 98 minutos 3,38 27,33 128 minutos 4,04 31,06 158 minutos 4,56 40,37 A partir destes resultados pode ser observado que a Pululanase

3 é a enzima mais eficiente. Consequentemente, menos proteína enzimática de Pululanase 3 é necessária para reduzir a quantidade de carboidratos não fermentáveis (dextrina/DP4/4+) e desse modo aumentar a atenuação do mosto.

Exemplo 2

O perfil de pH e o perfil de temperatura de pululanases diferentes foram analisados no presente exemplo.

10

15 As investigações de perfil de pH e temperatura foram fundamentadas na análise de atividade de enzima relativa com as condições descritas abaixo.

Pontos fundamentais do método analítico:

As ligações alfa-l,6-glicosídicas em pululano foram hidrolisadas por uma enzima pululanase e a capacidade de reduzir açúcar aumentada foi detectada por um método de Somogyi-Nelson modificado.

No presente experimento a atividade é avaliada como atividade relativa, onde a amostra mais ativa é dada como 100 %. As condições de ensaio são como segue:

Tampão: citrato 0,1 M + 0,2 M de fosfate (ajustado no perfil de pH, pH 5 no perfil de temperatura)

Substrato: 0,2 % de pululano Sigma (p-4516)

Temperatura: 60 0C no perfil de pH, ajustada no perfil de

temperatura

Tempo de reação: 30 minutos

Os açúcares reduzidos liberados pelas pululanases foram detectados de acordo com o princípio descrito em Nelson, 1944, J. Biol. Chem. 153: 375-380 e Somogyi, 1945, J. Biol. Chem. 160: 61-68. Em resumo, a reação de hidrólise é interrompida pela adição de reagente parceiro de Somogyi em um volume que corresponde ao volume da amostra (por exemplo, 2 ml para uma amostra de 2 ml). As amostras são fervidas por 20 minutos e esfriadas antes da reação de cor. Esta reação é realizada pela adição de reagente de Nelson correspondendo a Vi do volume da amostra (por exemplo, 2 ml para 4 ml de amostra + reagente parceiro de Somogyi). As amostras são misturadas por 2 minutos seguidos pela adição de água na mesma quantidade como o reagente de Nelson. As amostras são incubadas 30 minutos no escuro e medidas em um espectrofotômetro a 540 nm. Os reagentes podem ser preparados como segue:

Reagente parceiro de Somogyi:

Dissolver 70,2 g de Na2HP04x2H20 e 80,0 g de KNAC4H4O6X4H2O (tartarato duplo de sódio e potássio) em 1000 ml de H2O (levemente aquecida). Além disso adicionar 60 g de NaOH; 16,0 g de CuS04x5 H2O e 360,0 g de Na2SO4 e completar até 2000 ml. Ajustar o pH a 10,8 com NaOH

Reagente de Nelson:

Dissolver 100,0 g de (ΝΗ4)6Μθ7θ24χ7 H2O em 1200 ml de H2O. Adicionar 84,0 ml de H2SO4 cuidadosamente. Adicionalmente, dissolver

12,00 g de Na2HAs04x7H20 (hidrogeno arseniato de dissódio) em 100 ml de H2O e adicionar esta solução lentamente à primeira solução e completar até 2000 ml.

Os perfis de pH e temperatura para as três pululanases são dados nas tabelas 3 e 4 abaixo.

Tabela 3: Perfil de pH dado em (%) de atividade de enzima relativa a 60 0C pH Pululanase 1 Pululanase 2 Pululanase 3 2,4 2,2 1 0,2 2,8 6 2,4 30,7 3,7 10,8 68,5 90 4,2 23,1 100 100 5 94 77,4 92,4 5,8 92,8 31,7 74,2 6,3 43,1 4,4 45,3 6,7 3,7 0 1,8 7,3 0 0 0 Tabela 4: Perfil de temperatura dado e ■m (%) de atividade de enzima relativa no p H 5,0 Temp. °C Pululanase 1 Pululanase 2 Pululanase 3 30 22,8 36,7 19,7 45 64,4 72,5 47,3 55 100 100 76,8 60 99,6 85,2 92,6 62,5 87,1 70 101,2 65 42,1 54,4 100 70 9,4 12,7 75,6 Estes resultados mostram que a pululanase 3 tem um perfil de

pH e atividade amplos nas temperaturas altas quando comparada com as outras duas pululanases. Estas propriedades tomam a pululanase 3 uma enzima muito robusta na fabricação de bebida fermentada (condições de maceração), em particular para as temperaturas de sacarificação entre 62 0C e

65 °C.

Exemplo 3

Teste de maceração por infusão foram feitos com as

Pululanase 1 e 3 (SEQ ID NOS: 1 e 4). 6 amostras de maceração foram preparadas com 100 % de cevada como substrato (grão triturado).

A cevada (DS %: 86,73) foi moída e para cada amostra 50,0 g (DS total de 43,34 g) foram misturados com 200 g de água de torneira a 50 0C e 3,0 ml de H3PO4 1 M.

A todas as amostras foram adicionadas uma mistura de enzima idêntica sem nenhuma pululanase.

As amostras 1 a 6 foi depois adicionada pululanase de acordo com a seguinte tabela:

Atividade de enzima por dose /g

Amostra Pululanase 1 Pululanase 3 na PUN/g PUN/g 1 0,1 - 2 0,2 - 3 0,5 - 4 - 0,1 5 - 0,2 6 - 0,5 As amostras foram depois testadas em equipamento de maceração automatizada funcionando no seguinte programa.

Tempo em minutos Temp. 0C 0 a 30 50 a 44 Elevar para 64 44 a 104 64 104 a 120 Elevar para 80 120 a 140 80 140-155 Cair para 20 Depois da maceração todas as amostras foram adicionadas com água de torneira a um total de 300 g e filtradas. As amostras filtradas foram depois fervidas por 10 minutos e diluídas 1:1 com água desionizada. As subamostras de 50 ml foram centrifugadas e submetidas à análise de densidade padrão para o cálculo de RDF % (grau real de fermentação). Os resultados são dados como RDF % e o açúcar do mosto (DP2 e DP4+) em %.

PUN/g Pululanase 1 Pululanase 3 0 0 0 0,1 64 64,6 0,2 65 66,1 0,5 67,3 69,5 Pululanase 1 Pululanase 3 PUN/g DP2 DP4+ DP2 DP4+ 0 48,5 31,5 48,5 31,5 0,1 48,5 30 49 29 0,2 49,5 29 50 27,5 0,5 50,5 36,5 n.d. n.d. Os resultados mostram que a pululanase 3 é claramente melhor do que a pululanase 1 para a fabricação de uma alta % de RDF e ainda a pululanase 3 é capaz de produzir níveis de maltose (níveis de DP2) ainda melhores do que os da pululanase 1.

Exemplo 4

Teste de maceração por infusão foram feitos com a Pululanase 3 (SEQ ID NO: 4) para avaliar as propriedades de geração de maltose da pululanase 3. 6 amostras de maceração foram preparadas com 100 % de cevada como substrato (grão triturado).

A cevada (DS %: 86,73) foi moída e para cada amostra 50,0 g (DS total de 43,34 g) foram misturados com 200 g de água de torneira a 50 0C e 5 % de Na2SO3 e H3PO4 1 M.

A todas as amostras foi adicionada uma mistura de enzima idêntica sem nenhuma pululanase.

As amostras 1 a 6 foi depois adicionada pululanase 3 de acordo com a seguinte tabela:

Amostra na Pululanase 3 PUN/g 1 - 2 0,1 3 0,3 4 0,5 5 1,0 6 2,0 As amostras foram depois testadas em equipamento de maceração automatizada funcionando com o seguinte programa.

Tempo em minutos Temp. 0C Oa 30 50 30 a 44 Elevar para 64 44 a 104 64 104 a 120 Elevar para 80 120 a 140 80 140 a 155 Cair para 20 Depois da maceração todas as amostras foram adicionadas com água de torneira a um total de 300 g e filtradas. As amostras filtradas foram depois fervidas por 10 minutos e diluídas a 1:1 com água desionizada. As subamostras de 50 ml foram centrifugadas e submetidas à análise. Os

resultados foram como segue:

PUN/g % de glicose % de maltose % de dextrina RDF % 0 3,8 47,5 34 61,2 0,1 3,8 48,2 32 63,2 0,3 3,8 49,8 28,8 65,7 0,5 3,7 51,2 26,4 68,6 1 3,7 52,6 23,9 71 2 3,6 55,6 20,1 74,3 Os resultados mostram que a concentração de maltose é

aumentada com o aumento da dosagem de pululanase 3 e o aumento na % de maltose é seguido pelo aumento na atenuação (RDF %). A fração de dextrina (análise de HPLC DP4/4+) é ao mesmo tempo decrescente.

Apenas a beta-amilase da cevada pode produzir maltose nesta reação e a pululanase 3 está facilitando a ação da beta-amilase da cevada.

A concentração de glicose é baixa e não afetada pela ação da pululanase 3 o que é uma vantagem quando da fermentação do mosto produzido. A Pululanase 3 ajuda a degradar a dextrina e facilita a formação de maltose, pela beta-amilase da cevada e por esta atenuação aumentada (RDF %) do mosto.

Claims

1. Processo para produzir um mosto de cervejeiro, caracterizado pelo fato de que compreende formar uma mistura de malte triturado e contatar a dita mistura com uma pululanase, em que a dita pululanase tem uma seqüência de aminoácido que a) é pelo menos 86 % idêntica à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; ou b) é codificada por uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condições de baixa severidade com i) um filamento complementar de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; ou ii) uma subsequência de (i) de pelo menos IOO nucleotídeos.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pululanase é derivada de Bacillus acidopullulyticus.

3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar a dita mistura com uma glicoamilase e/ou alfa-amilase.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a glicoamilase e/ou alfa-amilase é derivada de AspergUlus niger ou Talaromyces emersonii.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar a mistura com uma enzima selecionada do grupo que consiste de celulase, isoamilase, xilanoase e protease.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o grão triturado compreende grão maltado e/ou não maltado.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o grão não maltado e/ou o grão maltado é selecionado da lista que consiste de cevada, trigo, centeio, sorgo, painço, milho e arroz.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o grão maltado compreende grão maltado selecionado de cevada, trigo, centeio, sorgo, painço, milho e arroz maltados.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o mosto é concentrado e/ou secado.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda fermentar o mosto para se obter uma bebida alcoólica.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a bebida alcoólica é uma cerveja.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a cerveja é cerveja ale, ale forte, amarga, escura tipo stout, preta tipo porter, cerveja de fermentação baixa, cerveja de exportação, licor de malte, vinho de cevada, tipo happoushu, cerveja com alto teor alcoólico, cerveja com baixo teor alcoólico, cerveja de baixa caloria ou cerveja light.

13. Mosto, caracterizado pelo fato de que é produzido pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

14. Mosto concentrado e/ou seco, caracterizado pelo fato de que está de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

15. Cerveja, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir do mosto de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

16. Composição adequada para o uso no processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a dita composição caracterizado pelo fato de que compreende uma pululanase, uma glicoamilase e opcionalmente uma alfa-amilase, em que a dita pululanase tem uma seqüência de aminoácido que a) é pelo menos 50 % idêntica à seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; ou b) é codificada por uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condições de baixa severidade com i) um filamento complementar de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4. ou ii) uma subsequência de (i) de pelo menos 100 nucleotídeos.

17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a glicoamilase e/ou a alfa-amilase são derivadas de Aspergillus niger ou Talaromyees emersonii.