BRPI0801904A2 - compostos inibidores da enzima epsp sintase como ingredientes ativos de herbicidas - Google Patents

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Caetano Melissa Soares
Da Cunha Elaine Fontes Ferreira
Castro Ramalho Teodorico De
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Univ Fed Lavras
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COMPOSTOS INIBIDORES DA ENZIMA EPSP SINTASE COMO INGREDIENTES ATIVOS DE HERBICIDAS. A presente invenção refere-se a estruturas químicas análogas ao glifosato, inibidor da enzima EPSP sintase e principal ingrediente ativo do herbicida Roundup(r), obtidas por substituição de grupos funcionais que proporcionam melhor interação com essa enzima. A substituição do átomo de hidrogênio ligado ao carbono próximo ao grupo fosfato por um grupo metóxi ou metil confere a um dos compostos uma melhor interação com o sítio ativo da enzima alvo, sendo, portanto, um inibidor mais potente que o glifosato. A tecnologia deve ser utilizada para erradicação de plantas daninhas em culturas extensivas de difícil controle de plantas invasoras. Os dados referentes à melhor interação da invenção com a enzima alvo em relação ao composto já existente são baseados na simulação computacional do ancoramento molecular ("docking"), técnica que se baseia em simular a afinidade de uma droga ao sítio receptor de uma enzima.

Description

COMPOSTOS INIBIDORES DA ENZIMA EPSP SINTASE COMOINGREDIENTES ATIVOS DE HERBICIDAS
A presente invenção refere-se a estruturas químicas inibidoras daEPSP sintase, obtidas por substituição de grupos funcionais que proporcionemmelhor interação com essa enzima. A substituição do átomo de hidrogênioligado ao carbono próximo ao grupo fosfato por um grupo metóxi ou metilconfere a um dos compostos objeto da presente invenção, uma melhorinteração com o sítio ativo da enzima alvo, sendo, portanto, um inibidorpotente. A tecnologia deve ser utilizada para erradicação de plantas daninhasem culturas extensivas de difícil controle de plantas invasoras.
A presente invenção é análoga ao glifosato, que é um dos herbicidasmais comercializados no mundo, porém mais potente do que esse.
O glifosato pertence ao grupo químico das glicinas substituídas,classificado como não-seletivo e de ação sistêmica, e age no interior da planta,circulando com a seiva. Apresenta largo espectro de ação, o que possibilita umexcelente controle de plantas daninhas anuais ou perenes, tanto de folhaslargas como estreitas.
Quanto à absorção, o glifosato é absorvido basicamente pela regiãoclorofilada das plantas (folhas e tecidos verdes) e translocado,preferencialmente pelo floema, para os tecidos meristemáticos. Atua como umpotente inibidor da atividade da enzima EPSP sintase (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase). Nenhuma outra classe de herbicidas comerciais inibe essaenzima que é catalisadora de uma das reações de síntese dos aminoácidosaromáticos essenciais fenilalanina, tirosina e triptofano. Quando ocorre aredução desses aminoácidos a planta pára de crescer, mas essa simplesredução de aminoácidos não explica a ação final do herbicida. Acredita-se quea desregulação da rota do ácido shikímico resulta na perda de carbonosdisponíveis para outras reações celulares na planta, uma vez que 20% docarbono das plantas são utilizados nessa rota metabólica. A enzima EPSPsintase influencia também em outros processos como a inibição da síntese declorofila impedindo a fotossíntese, estimula a produção de etileno e nitrato emníveis tóxicos à planta, reduz a síntese de proteínas e eleva a concentração doácido 3-indol acético (IAA) na gema apical inibindo o desenvolvimento dasgemas laterais impedindo o crescimento e acelerando a morte da planta.
Várias pesquisas demonstram que o glifosato forma um complexoternário com a enzima EPSP sintase e o S3P (EPSPS-S3P-glifosato). Ocomplexo ternário formado é semelhante ao complexo EPSPS-S3P-PEPrequerido para a catalise (com substrato natural PEP). Enquanto algumasmodificações na estrutura do PEP são toleradas, menores mudançasestruturais no glifosato levam a uma perda significativa no potencial inibidor,reduzindo a atividade herbicida.
Até o momento, não existem análogos ao glifosato mais ativos e oscompostos descritos na literatura são a-substituídos ao grupamento ácido ouN-substituídos. É importante salientar que uma das primeiras enzimasresistentes ao glifosato é a EPSP sintase mutante Gly96Ala da Klebsiellapneumoniae. A enzima mutante é insensível ao glifosato com afinidadeinalterada pelo primeiro substrato, shikimato-3-fosfato (S3P), mas apresentauma afinidade 30 vezes menor pelo segundo substrato, fosfoenolpiruvato(PEP) (ESCHENBURG, Susanne; HEALY, Martha L; PRIESTMAN, Melanie A.;SCHONBRUNN, Gerald H.; LUSHINGTON, Ernest How the mutation glycine96to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. 2002. Planta, v. 216, p. 129-135).De acordo com Eschenburg et al., a concentração mínima do glifosato capazde inibir 50% da atividade enzimática (IC50) da EPSP sintase da Escherichiacoli nativa é 0,01 mM e da mutante Gly96Ala >10mM.
A atuação do glifosato como herbicida foi descoberta pela empresaMonsanto em 1970 e a primeira formulação comercial foi lançada nos EstadosUnidos em 1974, com o nome comercial de Roundup®. Atualmente é utilizadoem mais de 130 países, sendo aplicado para controle de plantas daninhas nasáreas agrícolas, industriais, florestais, residenciais e ambientes aquáticos. Atoxicidade relativamente baixa pode ser atribuída à modalidade bioquímica deação do glifosato em um caminho metabólico nas plantas (chamadomecanismo do ácido "shikimico"), similar ao existente em algunsmicroorganismos mais complexos, não existindo, entretanto, em animais.Apesar da elevada eficiência, o herbicida não tem ação sobre as sementes daservas no solo e, portanto, deve ser aplicado quando as espécies a seremeliminadas emergirem do solo. A presente invenção, segundo os cálculosrealizados, mostrou-se mais estável no sítio ativo da enzima alvo,apresentando melhor interação, sendo assim um inibidor mais potente que oglifosato e, consequentemente, um melhor herbicida para o controle de ervasdaninhas.
Por meio de busca de anterioridade nos bancos de patentes,pesquisando-se sobre os análogos de glifosato, foram encontrados algunsácidos aminofosfônicos substituídos, como pode ser visto nas patentes GB1471591 e IE 47653, mas nenhum dos compostos com a substituição no localproposto nesta invenção e não apresentam a mesma aplicação.
O objeto da presente invenção são novos inibidores da EPSP sintaseanálogos ao glifosato, que serão utilizados como princípio ativo para herbicidamais potente que o existente no mercado, na erradicação de plantas daninhasem culturas extensivas de difícil controle de plantas invasoras.
A presente invenção será descrita com referência ao esquema abaixo:
A enzima 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase catalisa a reação detransferência do grupamento enolpiruvil do fosfoenolpiruvato (PEP) para oshikimato-3-fosfato (S3P) formando os produtos 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSP) e fosfato inorgânico (Pi) (Esquema 1).
Esquema 1 - No esquema 1, pode-se observar a reação catalisada pela EPSPsintase, onde o glifosato é competidor do substrato natural PEP e atua inibindoa enzima impedindo, portanto, a formação dos produtos 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSP) e fosfato inorgânico (Pi).
Descreve-se, a seguir, com detalhes, a realização da presenteinvenção:
Os dados referentes à melhor interação da invenção com a enzimaalvo em relação ao composto já existente são baseados na simulaçãocomputacional do ancoramento molecular ("docking"), técnica que se baseiaem simular a afinidade de uma droga ao sítio receptor de uma enzima. Oancoramento molecular utiliza a estrutura tridimensional dos biorreceptorespara analisar interações com ligantes. É um método que prediz a orientaçãopreferida de uma molécula em relação a uma segunda quando vinculadas umaa outra para formar um complexo estável. O conhecimento da orientaçãopreferida, por sua vez, pode ser utilizado para prever a afinidade entre as duasmoléculas usando, por exemplo, funções.
Docking é freqüentemente utilizado para prever a ligação e aorientação de pequenas moléculas em relação à proteína alvo,desempenhando um papel importante na concepção racional de novosinibidores.
Pesquisas de síntese, testes biológicos e elaboração de formulaçõespodem ser conduzidos focando-se o interesse nas estruturas propostas,evitando experimentos preliminares e, consequentemente, insucesso e custoselevados durante o processo.
A disponibilidade de programas computacionais de química e osbancos de dados em rede são, atualmente, ferramentas fundamentais para adescoberta e o planejamento de compostos. Estas informações permitem umaanálise rápida da atividade biológica versus propriedades físico-químicas deuma série de moléculas de interesse.
O ancoramento molecular é uma das mais importantes técnicas deinvestigação das interações moleculares entre a proteína e um ligante noscasos em que a estrutura 3D da proteína já foi elucidada. Este tipo desimulação encontra a estrutura mais estável do complexo proteína-ligante ecalcula essa estabilidade relativa (KUNTZ, I.D.; BLANEY, J.M.; OATLEY, S.J.;et al. A geometric approach to macromolecule- ligand interations. 1982. Journalof molecular biology. v. 161, p. 269-288. LEACH, P.G.L.; ZNOJIL, M. On theelementary schrodinger bound-states and their multiplets. 1992. Journal ofmathematical physics. V. 33, p. 2785-2794.).Estruturas químicas de inúmeras enzimas, obtidascristalograficamente, são amplamente disponíveis em bancos de dados, comoo PDB (Protein Data Bank) e a inserção da droga no sítio ativo dessas enzimaspode ser modelada computacionalmente (docking) (BERMAN, H. M.;5 Wesrbrook, J.; Feng, Z; GMiland, G. et al. Nucleic Acids Research 2000, 28,235.).
O aspecto inovador da presente invenção consiste no fato de seestabelecer computacionalmente a estrutura mais estável do complexoproteina-ligante e calcular essa estabilidade relativa. Estruturas químicas,10 especialmente uma (B), apresenta atividade herbicida substancialmente maiordo que todas aquelas existentes no estado da técnica (SIKORSKI, J.A.;GRUYS, K. Understanding Glyphosate's molecular mode of action with EPSPsynthase: Evidence favoring an allosteric inhibitor model. Acc. Chem. Res,1997. v. 30, p. 2-8.).<formula>formula see original document page 6</formula>
A substituição do átomo de hidrogênio ligado ao carbono próximo aogrupo fosfato por um grupo metóxi ou metil confere a um dos compostos umamelhor interação com o sítio ativo da enzima alvo, sendo, portanto, um inibidormais potente que o glifosato. A substituição dos grupos funcionais no qualforam obtidos os análogos A e B, não alteram a forma de ação do glifosato; elecontinua sendo pós-emergente, sistêmico e não seletivo.
Tabela 1. Glifosato e análogos e seus respectivos valores de energiaintermolecular (Kcal/mol).<table>table see original document page 7</column></row><table>A estrutura cristalográfica da enzima EPSP sintase, incluindo águas decristalização, S3P, e o inibidor glifosato, foram obtidos do "Protein Data Bank"(PDB - código: 1G6S). Os átomos de hidrogênio foram adicionados à estruturado complexo.
A posição e a orientação inicial usada para o ancoramento dos doisderivados do glifosato na enzima EPSP sintase foram obtidas pela modificaçãodo ligante extraído do PDB.
Modificou-se o átomo de hidrogênio ligado ao carbono, próximo aogrupo fosfato na estrutura do inibidor, por grupamentos metil e metoxi, dandoorigem à estrutura dos análogos.
Foram estabelecidos computacionalmente os valores de energiaintermolecular para o glifosato e para a presente invenção também na enzimamutante Gly96Ala, onde foi realizada apenas a substituição do resíduo deaminoácido Glicina 96 pela Alanina no sítio ativo da enzima EPSP sintase(Tabela 2).
Tabela 2. Energia intermolecular para glifosato e análogos na enzima EPSPsintase mutante Gly96Ala.
<table>table see original document page 8</column></row><table>Esses dados corroboram com os dados experimentais, uma vez que oglifosato se mostrou menos estável na enzima mutante com relação à enzimanativa. O análogo com substituinte metóxi, de acordo com a presenteinvenção, apresentou-se mais estável que os produtos existentes no mercado,tanto na enzima nativa quanto na enzima mutante. De maneira semelhante aoglifosato, apresentou menor estabilidade no docking com a enzima mutante, oque significa que a enzima mutante Gly96Ala seria também insensível àpresente invenção.
Os resultados de docking se basearam na complementaridadereceptor-ligante, considerando propriedades estéricas e eletrostáticas, bemcomo o potencial de interação no complexo e energia intramolecular do ligante.
Estudos de docking permitiram propor herbicidas altamente potentes,estruturalmente parecidos com compostos já conhecidos, todavia comatividades biológicas calculadas significativamente superiores tanto para aenzima nativa EPSP sintase quanto para a enzima mutante Gly96Ala,tornando-os úteis como herbicidas no controle de ervas daninhas.

Claims (5)

1. "COMPOSTOS INIBIDORES DA ENZIMA EPSP SINTASE COMOINGREDIENTES ATIVOS DE HERBICIDAS" caracterizados peladeterminação computacional de estruturas químicas potencialmente úteis comoherbicidas, compostos análogos ao "glifosato" substituídos na posição a aogrupamento fosfato e que possuem a seguinte fórmula:Ou um correspondente sal ou solvato agronomicamente aceitável, onde Xrepresenta grupo metileno ou carbono ligado direta ou indiretamente a um oudois substituintes polares ou não polares, consistindo de carbono duplamenteligado =C(H)2 ou C(R')2, oxigênio duplamente ligado (=0), hidroxila, alquila de1 a 10 carbonos, alquenilas de 1 a 10 carbonos, grupo alquila substituído porgrupo carregado, como -S(R")2+, -N(R")3+, -P(R")3+ ou -OS03+, alcoxilade 1 a 10 carbonos, arila de 6 a 10 carbonos; halogênios, halogenetos demetila, haletos de metileno (=CT2); epóxidos opcionalmente substituídos (ouoxirano); acila (-CO-R'); (-C02-R'); CH20H e hidrogênio; onde halogênio éF, Cl, Br e I; grupo polar ou apoiar, ou grupos doadores e aceptores deelétrons, tal como metóxi (-CH2OH) ou amina (-CH2NH2) substituindo umhidrogênio ligado ao carbono próximo ao grupo fosfato.
2. "COMPOSTOS INIBIDORES DA ENZIMA EPSP SINTASE COMOINGREDIENTES ATIVOS DE HERBICIDAS" de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pela determinação das atividades biológicas (herbicida) dessescompostos até duas vezes maior que as atividades biológicas experimentais decompostos derivados.
3. "COMPOSTOS INIBIDORES DA ENZIMA EPSP SINTASECOMO INGREDIENTES ATIVOS DE HERBICIDAS" de acordo com areivindicação 1 e 2, caracterizado pelo uso dos estudos de docking parapredição das atividades herbicidas das estruturas químicas propostas.
4.
"COMPOSTOS INIBIDORES DA ENZIMA EPSP SINTASE COMO INGREDIENTES ATIVOS DE HERBICIDAS" de acordo com a reivindicação 1 a 3, caracterizado por constituir-se de compostos análogos ao glifosato,inibidores da enzima EPSP sintase (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase),com as seguintes fórmulas ou correspondentes sais ou solvatos agronomicamente aceitáveis:<formula>formula see original document page 10</formula>
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2013110147A1 (pt) * 2011-12-30 2013-08-01 Embrapa - Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária Desenho computacional para novos inibidores de alfa-amilases

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