BRPI0804859B1

BRPI0804859B1 - Peptídeos sintéticos para a obtenção de polímero proteíco para imunização contra leishmaniose, produtos e seus usos

Info

Publication number: BRPI0804859B1
Application number: BRPI0804859-2A
Authority: BR
Inventors: Carlos Delfin Chavez Olortegui; Carlos Alberto Pereira Tavares; Eduardo Antonio Ferraz Coelho
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2021-11-03
Also published as: WO2010020028A1; BRPI0804859A2

Abstract

peptídeos sintéticos para a obtenção de polímero proteíco para imunização contra a leishmaniose, produtos e seus usos. as leishmanioses são doenças endêmicas em diversos países no mundo. atualmente, estima-se que cerca de 370 milhões de pessoas encontram-se expostas aos riscos de infecção e que 12 milhões sejam clinicamente afetadas pela doença. a presente invenção refere-se a dois peptídeos sintéticos antigênicos (epitopos/mimotopos), selecionados e sintetizados pelas técnicas de phage display e spot synthesis, e ao processo de obtenção de polímero protéico obtido através da conjugação destes peptídeos. o antígeno polimérico formado por esses peptídeos sintéticos foi capaz de induzir proteção contra leishmaniose visceral (lv) e oferecer diagnóstico específico para a sua detecção. além disso, a invenção também compreende o uso desse polímero protéico, a composição vacinal com ele produzida, método de vacinação, método de diagnóstico da doença e kit diagnóstico.

Description

A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de peptídeos antigênicos (epitopos ou mimotopos), previamente selecionados pelas técnicas de spot synthesis(síntese peptídica múltipla) e phage display(expressão de peptídeos na superfície de fagos), modificados quimicamente e posterior formação de polímeros proteicos compostos por esses peptídeos sintéticos capazes de induzir proteção contra Leishmaniose Visceral (LV) e oferecer imunodiagnóstico específico para a sua detecção.

As leishmanioses são doenças endêmicas em diversos países no mundo. Atualmente, estima-se que cerca de 370 milhões de pessoas encontram-se expostas aos riscos de infecção e que 12 milhões sejam clinicamente afetadas pela doença.

A forma visceral da doença ocorre devido a infecções causadas pelas espécies Leishmania donovanie L. infantumem países do Velho Mundo e pela espécie L. chagasi nas Américas (DESJEUX, P. Leishmaniasis. Public health aspects and control. Clin. Dermatol., v. 14, p.: 417-442, 1996.). A espécie L. amazonensispode causar um amplo espectro de formas clínicas de leishmanioses, que abrangem desde lesões cutâneas simples à doença visceral.

A espécie Leishmania chagasi possui ampla distribuição geográfica nas Américas, sendo encontrada no Brasil, na Argentina, Colômbia, Bolívia, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Paraguai e Venezuela. Em seu ciclo de transmissão, o cão é considerado o principal reservatório doméstico do parasita, sendo a doença canina considerada mais importante epidemiologicamente em relação à doença humana, devido à elevada prevalência da infecção canina, quando comparada aos casos humanos registrados. Cães infectados, mesmo quando assintomáticos, podem apresentar grande quantidade de parasitas na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor e, conseqüentemente, a transmissão para o homem (TESH, R.

Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am. J. Med. Hyg., v. 52, p. 287-292, 1995).

Vacinas contra as leishmanioses são de difícil desenvolvimento e, por isso, ainda raras. Uma vacina canina encontra-se disponível, denominada de Leishmune®. Esta utiliza como ativo vacinai um complexo antigênico purificado, incluindo proteínas, que corresponde ao complexo Fucose-Manose Ligante (FML), presente na superfície do parasita, de acordo com o pedido de patente nacional no. PI 9302386-3, intitulada “Composição contendo frações de células de Leishmania, denominadas antígeno FML "fucose mannose ligand"ou "ligante de fucose-manose", uso do antígeno FML e de suas subfrações e componentes para as aplicações em imunodiagnóstico específico da Leishmaniose Visceral (LV) humana e animal, para aplicações em vacinação, tratamento ou imunoterapia contra a leishmaniose visceral humana e canina”.

A Leishmune® tem como característica primária a indução de resposta humoral. O cão vacinado desenvolve rapidamente resposta por meio da produção de anticorpos específicos contra o parasita. Alguns testes apresentados em trabalhos utilizando a referida vacina demonstram que ela protege cerca de 86% dos animais vacinados, quando inseridos em áreas endêmicas. Os dados destes estudos foram questionados pela comunidade científica, bem como pela indústria, uma vez que os animais controle se localizavam em cidade distinta da que alocou os animais vacinados. Outra importante falha do teste citado foi a presença de cães, nos dois grupos, utilizando coleiras impregnadas com repelentes de insetos. O parasita é transmitido pela picada de um inseto, e se o contato com o inseto vetor é impedido pelo uso de coleiras repelentes, o cão não está realmente exposto ao desafio natural preconizado. Com base nos dados acima, é questionável o percentual de proteção descrito. Desta forma, outros estudos foram executados e alguns estão em execução, a pedido do órgão regulador em saúde pública.

Em particular, no que tange à Saúde Pública, é sabido que, por regulamentação da OMS, animais soropositivos devem ser sacrificados. Esta medida é adotada pelo Ministério da Saúde do Brasil. Uma vez vacinado com o produto acima citado, o animal desenvolverá elevada resposta imunológica baseada na produção de anticorpos específicos contra o parasita, tornando-se soropositivo. O diagnóstico preconizado pelos órgãos públicos é o sorológico, por ser barato e de fácil execução, podendo ser aplicado em todas as regiões do país, sem maior ônus. Os cães vacinados seguindo-se à risca tal medida deverão ser sacrificados.

A não diferenciação, por métodos tradicionais, de animais infectados daqueles apenas vacinados gera um grande problema para a saúde pública. Os donos de animais vacinados apresentam a carteira de vacinação e impedem que este seja sacrificado. Levando-se em conta que em cada 100 animais vacinados cerca de 14 podem vir a se tornar infectados, causando o aumento de possíveis reservatórios domésticos para a leishmaniose. Outra questão importante está relacionada aos inquéritos epidemiológicos realizados pelo Ministério da Saúde, que constituem uma importante forma de identificação da evolução da doença em diferentes regiões. Este inquérito baseia-se, em parte, nos resultados sorológicos de cães. Com o advento da vacinação pela Leishmune®, os resultados obtidos não são reais, pois animais soropositivos podem ter sido apenas vacinados e não infectados. Por meio de exames que detectam a presença do parasita, tais como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e imunocitoquímica, é possível diferenciar os cães soropositivos devido à vacinação ou à infecção. No entanto, a execução destes exames exige técnicas aprimoradas, equipamentos e reagentes de elevado custo, além de técnicos capacitados, para garantir fidelidade dos resultados. A PCR é realizada em clínicas particulares, seu uso em saúde pública é de difícil implantação e de elevado custo financeiro.

Adicionalmente, a Leishmune® apresenta elevado custo de produção, chegando ao mercado a preços que impossibilitam o acesso da maioria da população ao produto. O Brasil, sabidamente, possui uma larga faixa de sua população com baixa renda e este público não tem acesso ao produto citado. Sendo uma doença em expansão em diferentes regiões do País, torna-se cada vez mais importante adotar medidas que impeçam a continuidade da transmissão do parasita, principalmente a infecção de cães, que habitam domicílios e peri-domicílios. O possível uso deste produto em campanhas de saúde pública terá elevado custo, além dos problemas já citados. Assim, a Leishmune® contrasta com as medidas de controle adotadas para a epidemia vigente interferindo nos inquéritos epidemiológicos sobre o critério de sacrifício de cães soropositivos e, ainda, sendo de elevado custo para uso na saúde pública. Já o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC) também é dificultado por vários fatores, tais como a ocorrência de manifestações clínicas comuns a outras doenças, a variedade de sintomatologia que os animais desenvolvem, a ausência de lesões características nos estágios iniciais da doença e a baixa especificidade e/ou sensibilidade dos testes sorológicos utilizados (ROURA, X.; SÁNCHEZ, A.; FERRER, L. Diagnosis of canine leishmaniasis by a polymerase chain reaction technique. Vet. Rec., V. 144, P.: 262-264, 1999).

As análises histológicas, utilizando fragmentos da pele ou dos linfonodos, são necessárias para a confirmação da LVC, entretanto, deve-se procurar dissociar as alterações histo-patológicas, como a inflamação ou granuloma, de um diagnóstico positivo da doença (KEENAN, C.N., HENDRICKS, L.D., LIGHTNER, L, WEBSTER H.K., JOHNSON A.J. Visceral leishmaniasis in a German shepherd dog. I. Infection, clinical disease and clinical pathology. Vet. Pathol., v. 21, p. 74-79, 1984; TAFURI, Wg.LI.; TAFURI, W.L; GENARO, O; MICHALICK, M.M.S.; FRANÇA-SILVA, J.C.; MAYRINK, W.; NASCIMENTE, E. Histophatological and immunohistochemical study of type 3 and type 4complement receptors in the liver and spleen of dogs naturally and experimentally infected with Leishmania (Leishmania) chagasi. Rev. Inst. Med. Trop., v. 38, p. 81-88, 1996e; TAFURI, Wg. L; DE OLIVEIRA, M.R.; MELO, M.N.; TAFURI, W.L. Canine visceral leishmaniasis: a remarkable histhophatologic picture of one case reported from Brazil. Vet. Parasitol., v. 96, p. 203-212, 2001).

O teste parasitológico, com a detecção e identificação do parasita a partir de biópsias de tecidos e/ou aspirados da medula óssea, é o método conclusivo para o diagnóstico da doença. Entretanto, é considerado um método totalmente invasivo.

Outras técnicas laboratoriais, tais como a imuno-histoquímica e a PCR não têm a praticidade de serem empregadas em triagens de campo (FERRER, L; AISA, M.J.; ROURA, X.; PORTÚS, M. Serological diagnosis and treatment of canine leishmaniasis. Vet. Rec., v. 136, p. 514-516, 1995.; TAFURI, Wg.L.; SANTOS, R.L.; ARANTES, R.M.E.; GONÇALVES, R.; MELO, M.N.; MICHALICK, M.S.M.; TAFURI, W.L An alternative immunohistochemical method for detecting Leishmania amastigotes in paraffin-embedded canine tissues. J. Immunol. Meth., v. 292, p. 17-23, 2004).

Os testes sorológicos utilizados no diagnóstico laboratorial da LVC visam à detecção de anticorpos e/ou antígenos específicos ao parasita. Nestes casos, as técnicas mais utilizadas são a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), a análise de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA), o teste de aglutinação direta (DAT) e o Western-Blot (MANCIANTI, F.; PEDONESE, F.; POLI, A. Evaluation of dot enzyme-linked immunosorbent assay (dot-ELISA) for the serodiagnosis of canine leishmaniasis as compared with indirect immunofluorescence assay. Vet Parasito/.,v. 65, p. 1-9, 1996.; CARVALHO, F.A.A.; CHAREST, H.; TAVARES, C.A.P.; MATLASHEWSKI, G.; VALENTE, E.P.; RABELLO, A.; GAZZINELLI, R.T.; FERNANDES, A.P. Diagnosis of american visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinant Leishmania donovani A2 antigen. Diag. Microbiol. Infect. Dis., v. 43, p.: 289- 295, 2002; DA COSTA, R.T.; FRANÇA, J.C.; MAYRINK, W.; NASCIMENTO, E.; GENARO, O.; CAMPOS-NETO, A. Standardization of a rapide immunochromatographic test with the recombinant antigens K39 and K26 for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans. Royal Soc. Trop. Med. Hyg., v. 97, p. 678-682, 2003; TAVARES, C.A.; FERNANDES, A.P.; MELO, M.N. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Exp. Rev. Molec. Diagn., v. 3, p.: 657-667, 2003; ALMEIDA, M.A.O.; JESUS, E.E.V.; SOUSA-ATTA, M.L.B.; ALVES L.C.; BERNE, M.E.A., ATTA, A.M. Clinical and serological aspects of visceral leishmaniasis in Northeast Brazilian dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Vet. Parasitol., v. 127, p. 227-232, 2005; BOARINO, A.; SCALONE, A.; GRADONI, L; FERROGLIO, E.; VITALE, F.; ZANATTA, R.; GIUFFRIDA, M.G.; ROSATI, S. Development of recombinant chimeric antigen expressing immunodominant B epitopes of Leishmania infantum for serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Clin. Diagn. Lab. Immunol., v. 12, p. 647-653, 2005; METTLER, M.; GRIMM, F.; CAPELLI, G.; CAMP, H.; DEPLAZES, P. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays, an immunofluorescent-antibody test, and two rapid tests (immunochromatographic- dipstick and gel tests) for serological diagnosis of syntomatic and asyntomatic Leishmania infections in dogs. J. Clin. Microbiol., v. 43, p. 5515-5519, 2005; DA SILVA, E.S.; VAN DER MEIDE, W.F.; SCHOONE, G.J.; GONTIJO, C.M.F.; SCHALLIG, H.D.F.H.; BRAZIL, R.P. Diagnosis of canine leishmaniasis in the endemic area of Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil by parasite, antibody and DNA detection assays. Vet. Res. Communic., v. 30, p. 637-643, 2006). Entretanto, tais técnicas apresentam sensibilidade e/ou especificidade variáveis e, nos estágios iniciais da doença, em animais clinicamente curados ou em cães saudáveis, porém, residentes em áreas endêmicas da doença, os mesmos podem apresentar resultados falseados (FERRER, L.; AISA, M.J.; ROURA, X.; PORTÚS, M. Serological diagnosis and treatment of canine leishmaniasis. Vet. Rec., v. 136, p. 514-516, 1995; TAVARES, C.A.; FERNANDES, A.P.; MELO, M.N. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Exp. Rev. Molec. Diagn., v. 3, p.: 657-667, 2003).

Deve-se ressaltar a especificidade comprometida dos testes quando os mesmos são utilizados em áreas endêmicas de outras doenças, também comuns em nosso meio, tais como doença de Chagas, babesiose, dentre outras (FERRER, L.; AISA, M.J.; ROURA, X.; PORTÚS, M. Serological diagnosis and treatment of canine leishmaniasis. Vet. Rec., v. 136, p. 514-516, 1995; MANCIANTI, F.; PEDONESE, F.; POLI, A. Evaluation of dot enzyme- linked immunosorbent assay (dot-ELISA) for the serodiagnosis of canine leishmaniasis as compared with indirect immunofluorescence assay. Vet Parasitol., v. 65, p. 1-9, 1996; TAVARES, C.A.; FERNANDES, A.P.; MELO, M.N. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Exp. Rev. Molec. Diagn., v. 3, p.: 657-667, 2003).

As medidas adotadas pela OMS para o controle da LVC baseiam-se na identificação dos animais infectados, seguida do seu sacrifício, no combate aos vetores flebotomíneos e no tratamento dos casos humanos. Entretanto, tais medidas não têm se mostrado muito eficazes no controle da doença (GRIMALDI JR, G.; TESH, R.B. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev., v. 6, p. 230- 250, 1993).

O tratamento clínico da LVC, independente do fármaco utilizado, não é viável como medida de controle da doença, pois têm custo elevado e, freqüentemente, cães tratados e clinicamente curados apresentam recidivas, permanecendo como fontes de infecção para o vetor, além de aumentar o risco de seleção de linhagens resistentes a tais fármacos, com sérias implicações para o tratamento dos casos humanos (GRAMICCIA M, GRADONI L. The current status of zoonotic leishmaniases and approaches to disease control Int J Parasitol. 35(11-12):1169-80, 2005).

Tal fato, associado à letalidade da leishmaniose visceral (LV) humana na ausência do tratamento, levou a OMS a preconizar a eliminação de cães infectados ou daqueles que se portarem como soropositivos nos testes imunológicos de triagem para os antígenos de Leishmania como medida de controle da infecção pelos órgãos de Saúde Pública.

A proteção à re-infecção alcançada, em modelos murinos, após a cura da leishmaniose cutânea causada pela espécie L. major tem sido a alavanca preconizada pela OMS para estimular o desenvolvimento de vacinas que possam ser empregadas como uma medida de controle efetivo da doença (WHO, 1993).

Formas vivas atenuadas de parasitas, extratos antigênicos totais ou solúveis, antígenos semi-purificados ou purificados e, mais atualmente, proteínas recombinantes e plasmídeos de DNA vêm sendo utilizados em diferentes protocolos experimentais como candidatos à vacina (BUTTON, L.L. and McMASTER, W.R. Molecular cloning of the major surface antigen of Leishmania. J. Exp. Med., v. 167, p.: 724-729, 1988; FERNANDES, A.P.; HERRERA, E.C.; MAYRINK, W.; GAZZINELLI, R.T.; LIU, W.Y.; COSTA, C.A.; TAVARES, CAP.; MELO, M.N.; MICHALICK, M.S.M.; GENTZ, R.; NASCIMENTO, E. Immune responses induced by a Leishmania (Leishmania) amazonensis recombinant antigen in mice and lymphocytes from vaccinated subjects. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, v. 39, p.:70-78, 1997.; SJÕLANDER, A.; BALDWIN, T.M.; CURTIS, J.M.; HANDMAN, E. Induction of a Th1 immune response and simultaneous lack of activation of a Th2 response are required for generation of immunity to leishmaniasis. J. Immunol., v. 160, p.: 3949-3957, 1998; SKEIKY, Y.A.W.; KENNEDY, M.; KAUFMAN, D.; BORGES, M.M.; GUDERIAN, J.A.; SCHOLLER, J.K.; OVENDALE, P.J.; PICHA, K.S.; MORRISSEY, P.J.; GRABSTEIN, K.H.; CAMPOS-NETO, A.; REED, S.G. LelF: a recombinant Leishmania protein that induces an IL-12-mediated Th1 cytokine profile. J. Immunol., v. 161, p.: 6171-6179, 1998; WEBB, J.R.; CAMPOS-NETO, A.; OVENDALE, P.J.; MARTIN, T.I.; STROMBERG, E.J.; BADARO, R.; REED, S.G. Human and murine immune responses to a novel Leishmania major recombinant protein encoded by members of a multicopy gene family. Infect. Immun., v. 66, p.: 3279-3289, 1998; PIEDRAFITA, D.; XU, D.; HUNTER, D.; HARRISON, R.A.; LIEW, F.Y. Protective immune responses induced by vaccination with an expression genomic library of Leishmania major. J. Immunol., v. 163, p.: 1467-1472, 1999; STÃGER, S.; SMITH, D.F.; KAYE, P.M. Immunization with a recombinant stage-regulated surface protein from Leishmania donovani induces protection against visceral leishmaniasis. J. Immunol., v. 165, p.: 7064-7071, 2000; Fragaki et al., 200 FRAGAKI, K.; SUFFIA, I.; FERRUA, B.; ROUSSEAU, D.; LE FICHOUX, Y.; KUBAR, J. Immunisation with DNA encoding Leishmania infantum protein papLe22 decreases the frequency of parasitemic episodes in infected hamsters. Vaccine, v. 19, p.: 1701-1709, 2001; OLIVEIRA DA SILVA, V.; BORJA-CABRERA, G.P.; PONTES, N.N.C.; SOUZA, E.P.; LUZ, K.G.; PALATNIK, M.; SOUZA, C.B.P. A phase III trial of efficacy of the FML-vaccine against canine kalazar in an endemic area of Brazil (São Gonçalo do Amaranto, RN). Vaccine, v. 19, p.: 1082-1092, 2001; RAFATI, S.; SALMANIAN, A.H.; TAHERI, T.; VAFA, M.; FASEL, N. A protective cocktail vaccine against murine cutaneous leishmaniasis with DNA encoding cysteine proteinases of Leishmania major. Vaccine, v. 19, p.: 3369-3375, 2001; STREIT, J.A.; RECKER, T.J.; FILHO, F.G.; BEVERLEY, S.M.; WILSON, M.E. Protective immunity against the protozoan

Leishmania chagasi is induced by subclinical cutaneous infection with virulent but not avirulent organisms. J. Immunol., v. 166, p.: 1921 -1929, 2001).

Portanto, procura-se desenvolver novos antígenos que apresentem maior sensibilidade e, principalmente, maior especificidade em relação àqueles atualmente disponíveis visando à obtenção de um diagnóstico laboratorial específico para as leishmanioses, que também possam ser utilizados como candidatos a vacinas contra essa importante doença, de forma a se conseguir maior eficácia no controle da infecção por Leishmania.

Até o presente momento, nenhum processo de obtenção de potenciais imunógenos contra a infecção por Leishmania spp. utilizou os métodos de phage displaye spot synthesis.O processo biotecnológico de síntese de polipeptídeos artificiais através dos métodos de phage displaye spot synthesis tem sido empregado com finalidades diversas como, por exemplo, o mapeamento de interações proteína-proteína (BIALEK, K.; SWISTOWSKI, A.; FRANK, R. Epitope-targeted proteome analysis: towards a large-scale automated protein-protein-interaction mapping utilizing synthetic peptide arrays. Anal Bioanal Chem., v. 376, p.: 1006-1013, 2003) e identificação de epitopos e mimotopos para anticorpos específicos (REINEKE, U.; IVASCU, C.; SCHLIEF,M.; LANDGRAF, C.; GERICKE, S.; ZAHN, G.; HERZEL, H.; VOLKMER-ENGERT, R.; SCHNEIDER-MERGENER, J. Identification of distinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated sequences. J. Immunol. Methods, v. 267, p.: 37-51,2002.).

As técnicas de phage display e spot synthesissão muito menos onerosas em relação àquelas normalmente empregadas para a produção de proteínas recombinantes, pois apresentam um rendimento final mais elevado em relação às técnicas de purificação convencionais, além de serem de maior facilidade de realização técnica e, por esses motivos, mais úteis nas triagens de grande escala (NOYA, O.; PATARROYO, M.E.; GUZMAN, F.; ALARCON DE NOYA, B.; Immunodiagnosis of parasitic diseases with synthetic peptides. Curr. Prot. Peptide Sci., v. 4, p. 299-308, 2003).

Algumas patentes encontradas no estado da técnica revelam tecnologias desenvolvidas no intuito de apresentar produtos de imunização contra a leishmaniose e diagnosticar a doença, como segue abaixo.

A patente EP1371375A1, intitulada "Vaccine to protect animals against Leishmania”, se refere ao uso da proteína P36, ou fragmento da mesma, oriunda de Leishmania infantumenvolvendo um sistema de expressão, através de vírus Vaccinia recombinante ou através de plasmídeo pRSET-B para induzir uma resposta imunológica celular do tipo Th1 no organismo alvo.

A patente EP1372705A, intitulada "Leishmania vaccines”,refere-se a um sistema de vacina de DNA envolvendo um vetor que expressa o gene A2 de Leishmania donovani, além de adjuvantes biologicamente aceitáveis capazes de recrutar resposta imune no organismo no qual a vacina é administrada, além do método de sua administração.

A patente EP1395282A1, intitulada "Vaccine complex for preventing or treating leishmaniasis”, refere-se a um complexo imunomodulador específico composto de antígenos de excreção/secreção de Leishmania e sua administração em infecções do parasita nos mamíferos, particularmente em homens, felinos e eqüídeos.

A patente EP1422238A2, intitulada "Leishmania antigens for use in the therapy and diagnosis of leishmaniasis”,envolve o uso de polipeptideos que contém pelo menos uma porção imunogênica de antígenos de Leishmania para composição de vacinas, compostos farmacêuticos e as seqüências de nucleotídeos necessárias para a produção de tais polipeptideos, que podem ser empregados na profilaxia, diagnóstico e tratamento da doença.

A patente EP1615663A1, intitulada "Agent for treating Leishmania infections”,consiste na utilização de vetores de expressão de drogas para serem utilizadas contra a infecção por Leishmania e na obtenção de uma vacina. Esta invenção emprega o imunógeno P36 LACK em conjunto com o gene para a proteína Antioxidante Tiol-específico (TSA), o gene para a proteína 11 de membrana de cinetoplastídeos (KMP11) e o antígeno GP63 de Leishmania infantumpara a produção de resposta imune.

A patente US20040235772A1, intitulada “DNA expression construct for the treatment of infections with leishmaniasis”,se refere a uma invenção que compreende uma vacina baseada no imunógeno p36 e em um vetor de expressão contendo uma porção cassete de dupla fita, contendo o gene expresso. Este vetor de DNA recombinante pode ser ligado a um oligopeptídeo para aumentar a eficiência de transfecção.

O pedido de patente WO200864181A2, intulado “Canine Leishmaniase Vaccine”,descreve o uso de uma vacina obtida a partir de uma proteína de membrana de Leishmania (KMP11) que previne a implantação e a difusão do parasita em órgãos internos, ao induzir resposta imune contra Leishmania.

O pedido de patente W02006097642A2 intulado “Composition comprenant la région N-terminale d’histone H2B de Leishmania- Utilisation pour induire une réponse immunitaire". Esse pedido descreve um polipetídeo antigênico constituído de um fragmento de uma histona H2B de Leishmania capaz de conferir imunização contra a leishmaniose.

A patente EP0679259B1 intitulada “Diagnosis of leishmaniasis”descreve um método de diagnóstico (na forma de kit) para pacientes com suspeita de leishmaniose, onde um antígeno conhecido (K39), preferencialmente com um polipeptídeo (Gp63), é testado para reatividade com anticorpos do sujeito teste.

Embora existam várias produtos para vacinação contra a leishmaniose, as mesmas apresentam os seguintes problemas: possuem alto-custo e alguns métodos de vacina baseados em DNA têm o inconveniente do potencial de integração ou de recombinação gênica das seqüências exógenas com o DNA do hospedeiro mamífero. Já os testes para diagnóstico de leishmaniose presentes no mercado possuem baixa especificidade e podem fornecer resultados falsos positivos.

Para solucionar estes problemas, a presente tecnologia propõe o uso de um antígeno proteico totalmente sintético, constituído de peptídeos previamente selecionados pelas técnicas de phage displaye spot syntesis, para a obtenção de um imunógeno capaz proteger cães através da indução de uma resposta celular contra a leishmaniose visceral e um método de diagnóstico utilizando o produto acima. A presente invenção permite a obtenção em grande quantidade e a baixo custo do polímero antigênico e, ainda, um diagnóstico preciso e sem falsos positivos para a doença, uma vez que as imunizações não induzem resposta humoral frente ao parasita.

O processo de obtenção utiliza, inicialmente, a técnica do phage display para a seleção de inúmeros peptídeos imunogênicos que após uma outra etapa de seleção por spot-synthesis e posterior síntese e polimerizacao química são capazes de induzir a proteção e ser utilizada como vacina. A técnica de phage display é uma técnica utilizada para a seleção in vitrona qual uma proteína ou peptídeo é geneticamente fundido a proteínas de superfície de um bacteriófago filamentoso, resultando na expressão de uma proteína heteróloga na superfície do capsídeo virai. A inserção de seqüências de nucleotídeos nos fagos é feita em uma região pré-determinada do genoma virai e permite a construção de uma biblioteca conformacional (SMITH, G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, v. 228, p.: 1315-.1317, 1985.).

Esta biblioteca possui uma população de ligantes em potencial. Cada membro da biblioteca apresenta uma forma distinta de peptídeo e, portanto, diferentes capacidades de interação deste com a molécula alvo. Fagos que apresentam em sua superfície peptídeos com especificidade de ligação desejada podem ser selecionados há partir da biblioteca através da ligação com uma molécula imobilizada em uma superfície e a seqüência do peptídeo selecionado pode ser deduzida da seqüência do DNA do fago (SCOTT, J.K.; SMITH, G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, v. 249, p.: 386-390, 1990.).

Esta técnica possibilita a expressão de urn grande número (maior que 1011) de peptídeos ou proteínas na superfície de fagos (SIDHU, S.S.; LOWMAN, H.B.; CUNNINGHAM, B.C.; WELLS, J.A. Phage Display for selection of novel bindings peptides. Methods in Enzymology, v. 63, p.: 328- 333, 2000.). Quanto maior o número de formas representadas na biblioteca, mais facilmente será encontrado um ligante específico (POSNER, R.G.; FAY, S.P.; DOMALEWSKI, M.D.; SKLAR, LA Continuous spectrofluorometric analysis of formyl peptide receptor ternary complex interactions. Mol. Pharm., v. 45, p.: 65-73,1994).

A partícula viral do bacteriófago M13 é composta por cinco proteínas estruturais denominadas de P3, P6, P7, P8 e P9. No fago selvagem, encontram-se cerca de 2.800 cópias da P8. Nas extremidades do capsídeo, encontram-se de 3 a 5 cópias das demais proteínas estruturais. A P7 e P9 encontram-se na extremidade distai enquanto que a P3 e P6 estão na proximal. A incorporação de proteínas exógenas na superfície dos fagos é feita pela fusão destas às proteínas estruturais. As duas principais proteínas utilizadas para este fim são a P8 e P3. A P3 é necessária para o reconhecimento e infecção da célula e é a principal proteína estrutural para a apresentação de proteínas exógenas. A P8 é responsável por cerca de 99% da massa molecular da proteína do fago.

Quando comparadas a outras bibliotecas de expressão, os sistemas utilizando fagos filamentosos apresentam algumas vantagens. Uma delas baseia-se no fato de que fagos filamentosos não lisam as células infectadas, o que possibilita a separação de partículas virais do conteúdo intracelular, eliminando-se muito da reatividade cruzada com proteínas celulares. Outra vantagem desta estratégia é a seleção de epitopos descontínuos, significando ser possível selecionar um mimotopo (GEYSEN, H. M.; RODDA, S.J.; MASON, T.J. A priori delineation of a peptide witch mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol., v. 23, p.: 709-715, 1986).

Para o desenvolvimento dos peptídeos sintéticos, foram utilizadas amostras de soro de cães com leishmaniose visceral ativa para a seleção de clones de bacteriófagos expressando peptídeos de interesse, específicos aos anticorpos presentes nas amostras de soro dos cães.

Anticorpos da classe IgG foram purificados a partir das amostras de soro e utilizados nos ciclos de bio-seleção (bio-pannings)utilizados na técnica de phage display.

Através deste processo é possível obter dois peptídeos sintéticos e o polímero protéico resultante da conjugação dos mesmos sendo este produto bastante eficaz para imunização e diagnóstico da leishmaniose. Estes peptídeos sintéticos, 11H e 12A, foram conjugados covalentemente por meio dos resíduos de aminoácidos de lisina (lys), inseridos em suas seqüências peptídicas. A ligação dos peptídeos foi otimizada com a utilização de glutaraldeído, que serviu como um ligante adicional (ou "braço") entre os peptídeos sintéticos.

A tecnologia acima citada pode ser melhor compreendida, de forma não limitante, através dos exemplos abaixo:

Exemplo 1. Reatividade dos clones de fagos após os três ciclos de seleção

Após os três ciclos de bio-seleção (bio-pannings 1, 2 e 3), foi feita uma ELISA tipo sanduíche para se verificar o aumento da afinidade entre os clones selecionados e amplificados e as imunoglobulinas anti-L. chagasi (Figura 01). As imunoglobulinas utilizadas no experimento foram as mesmas usadas na seleção inicial dos fagos, nos ciclos de bio-panning.

Pode-se observar que a reatividade dos clones de fagos foi maior no panning3 (P3) sugerindo que, após cada ciclo, a especificidade dos clones amplificados foi aumentada.

Exemplo 2. Seleção individual dos clones de fagos

A análise individual da reatividade dos clones selecionados no P3 foi realizada através de uma ELISA tipo sanduíche. Foram sensibilizadas duas placas de ELISA com o pool de IgGs anti-L. chagasi, purificadas a partir das amostras de soro dos cães com LV (na concentração de 10 μg/mL). Como controle negativo, foi usado o sobrenadante de cultura de fagos silvestres.

O objetivo desta etapa é individualizar e selecionar apenas os clones com as maiores reatividades. Na análise da figura 02, pode-se observar uma elevada variabilidade na reação de ELISA dos clones de fagos individuais frente ao extrato protéico solúvel de L. chagasi.

Os clones que apresentaram leitura de absorbância com valores iguais ou maiores a 0,8 (Abs de 492nm), foram considerados positivos.

Dos cerca de 190 clones selecionados, 25 deles mostraram-se positivos. Tais clones foram então utilizados para serem testados frente às imunoglobulinas de cães saudáveis e daqueles com doença de Chagas.

Exemplo 3. Especificidade dos clones positivos frente às imunoglobulinas purificadas de cães saudáveis.

Os 25 clones considerados reativos com IgGs de cães com LV foram analisados em relação à sua reatividade com IgGs de cães saudáveis. O resultado, representado na figura 03, demonstra que nenhum dos 25 clones positivos apresentou reatividade considerada significante frente aos anticorpos purificados a partir de amostras de soro de cães saudáveis.

Exemplo 4. Especificidade dos clones positivos frente às IgGs de cães com doença de Chagas

A especificidade dos 25 clones positivos foi verificada novamente através do ensaio de ELISA, na qual as placas de ELISA foram sensibilizadas com anticorpos IgGs purificados de cães infectados com Trypanosoma cruzi. (na concentração de 10 μg/mL).

A figura 04 demonstra que a reatividade dos 25 clones selecionados em relação às IgGs anti-T. cruzi foi baixa, alcançando, na maioria dos clones, absorbância de 0.1 até a alguns valores em torno de 0.5. O que demostra a especificidade deste polímero sintético no diagnóstico preciso da leishmaniose.

Os clones que apresentaram elevada reatividade (>1.4) em relação aos anticorpos IgGs ant\-L.chagasi e baixa reatividade (<0.2) em relação aos anticorpos anti-T. cruzi foram selecionados. Dessa forma, 3 clones (denominados de 3B, 11H e 12A) foram selecionados para o seqüenciamento e posterior realização de ensaios imunológicos.

Exemplo 5. Imunoensaios com os peptídeos sintetizados, ligados à membrana de celulose

O DNA dos 3 clones descritos acima foram individualmente extraídos, quantificados, seqüenciados e, após determinação da estrutura primária dos peptídeos correspondentes, estes foram sintetizados (spot-syntesis) sobre uma membrana de celulose (com 7 repetições de cada peptídeo). As membranas de celulose contendo os peptídeos imobilizados foram então submetidos à imunoensaios de spof-ELISA, com a utilização de amostras de soros de cães com LV e de soros de cães saudáveis (Figura 06).

Pode-se observar que apenas os clones 11H e 12A apresentaram reatividade em relação às amostras de soro de cães com LV. O peptídeo 3B não apresentou reação frente às amostras de soro e, dessa forma, não mais foi utilizado nos experimentos.

Exemplo 6. Síntese e purificação dos peptídeos em fase sólida

Uma vez verificada a reatividade dos peptídeos 11H e 12A, frente a anticorpos de animais portadores de LVC os mesmos foram sintetizados na sua forma solúvel usando o método de síntese em fase sólida, estratégia F- moc.

Os peptídeos foram purificados por cromatografia em fase reversa utilizando a coluna Sephasil PeptideC18 - Shimadzu (volume 4.24 ml_, diâmetro 0.46 cm e altura 15 cm) acoplada a sistema de HPLC.

O perfil cromatográfico de um dos peptídeos apresentou um pico principal quando foi utilizado um gradiente de acetronitrila que variou de 0 a 25% de acetronitrila em 75 minutos. O perfil cromatográfico está representado na figura 06. Os picos principais foram liofilizados e sua análise foi realizada por espectrometria de massa, para confirmação da massa molecular dos peptídeos (figura 07).

Exemplo 7. Análise por eletroforese em gel de policrilamida a 15% dos peptídeos sintetizados e polimerizados com glutaraldeído

Os polipeptídeos 11H e 12 Aforam acoplados da seguinte forma:

Foram adicionados uma miligrama de peptídeo 11 H + 1 miligrama do peptídeo 12 A+1000 μl de PBS 1x. Adicionou-se 1 ml_ de solução de glutaraldeído a 1% (980 μl_ de PBS + 20μL de glutaraldeído a 25%). Gotejou-se a solução de glutaraldeído a 1%, a temperatura de 4°C e agitou-se com velocidade constante por 1 hora. Interrompeu-se a reação utilizando-se solução de NaBH4 (10mg para cada 1 ml_), por 1 hora, sob agitação constante e à temperatura de 4°C. Dialisou-se em membrana de diálise (de 3000 kDa) overnight sob agitação a 4°C com PBS 1X. O polímero foi então dosado pelo método de Bradford. Para a polimerização dos peptídeos 11H e 12A, foram acrescidos 2 resíduos de aminoácidos (lisina e tirosina) em cada peptídeo. O acréscimo dos dois aminoácidos na posição C-terminal de cada peptídeo possibilita também a dosagem dos peptídeos e do polímero formado, assim como a ligação com as placas de ELISA (Figura 08).

Na análise por eletroforese em gel de policrilamida 15%, pode-se observar que o polímero composto pelos peptídeos 11H e 12A apresentou uma massa molecular aproximada entre 25-40 KDa (Figura 09).

Exemplo 8. Avaliação da eficiência do polímero como imunógeno

A eficácia protetora induzida pela imunização com o polímero formado pelos dois peptídeos sintetizados com os resíduos adicionais de lisina e tirosina foi avaliada em camundongos BALB/c contra a infecção desafio com L amazonensis.

Na avaliação do desenvolvimento das lesões (figura 10), pode-se observar que os animais imunizados com o polímero composto pelos peptídeos 11H e 12A apresentaram redução significativa no tamanho dos edemas, quando comparados aos grupos controles. Na avaliação da carga parasitária, pode-se observar (figura 11) que os animais imunizados com o polímero apresentaram redução significativa na carga recuperada de parasitas, em relação aos grupos controles, que não apresentaram diferenças entre si.

Dessa forma, pôde-se observar a concordância entre os resultados obtidos na avaliação do tamanho médio das lesões e na carga parasitária dos animais imunizados com o polímero composto pelos peptídeos 11H e 12A e dos animais dos grupos controle. Estes resultados indicaram a eficácia dos peptídeos polimerizados, mesmo tendo sido selecionados a partir de amostras de soro de cães infectados com L. chagasi, em conferir proteção heteróloga contra L. amazonensis.

Na avaliação da resposta imune celular, foi realizada a determinação dos níveis de IFN-gama, IL-4 e IL-10 nos sobrenadantes de cultura celular dos esplenócitos dos animais imunizados e/ou desafiados.

Pode-se observar, pela análise da Figura 12, que os animais dos grupos controle apresentaram, antes e após a infecção desafio, uma baixa produção de IFN-Y utilizando os peptídeos sintéticos ou o extrato protéico solúvel de L. amazonensis (SLALA) como antígenos estimuladores das células.

Nos animais imunizados com os peptídeos polimerizados, observou-se que seus esplenócitos produziram níveis elevados de IFN-y, antes e após o desafio, quando estimulados tanto com os polímero, quanto com o SLALA. A produção observada foi significativamente maior após o desafio, em relação aos níveis obtidos antes da infecção, utilizando o polímero ou o SLALA como antígenos sensibilizadores.

Na avaliação dos níveis de IL-4 e IL-10 nos sobrenadantes das culturas de esplenócitos, pode-se observar que, antes da infecção desafio, os níveis dessas citocinas foram similares nos grupos avaliados, utilizando-se o polímero ou o SLALA como antígenos estimuladores (Figura 13).

Após o desafio, os animais que receberam PBS produziram níveis significativamente maiores de IL-4 e IL-10 em relação aos animais imunizados com o adjuvante de Freund ou com o polímero associado ao adjuvante (Figura 14), utilizando-se o SLALA como antígeno estimulador.

Comparando-se os níveis destas citocinas entre os grupos adjuvantes e polímero mais adjuvante, verificou-se que os níveis de IL-4 foram similares entre os dois grupos. Entretanto, na avaliação dos níveis de IL-10, pode-se observar que tal citocina encontra-se com valores médios significativamente maiores no grupo adjuvante, em relação aos animais imunizados com o polímero, utilizando-se o extrato protéico do parasita como antígeno estimulador das células esplénicas.

A produção de anticorpos foi também avaliada nos animais imunizados com o polímero, antes e após a infecção desafio com L. amazonensis.

Pode-se observar, pela análise da Figura 15, que, utilizando-se o SLALA como antígeno sensibilizador das placas de ELISA, pode-se observar que, antes da infecção desafio, os animais de todos os grupos apresentaram baixos níveis de IgG total, lgG1 e lgG2a. Entretanto, após o desafio, observou-se que os animais dos grupos PBS e adjuvante produziram níveis de lgG1, específicos ao parasita, significativamente maiores em relação aos níveis de lgG2a (Figura 15). Os níveis de anticorpos IgG total, lgG1 e lgG2a específicos aos peptídeos 11H e 12A permaneceram baixos, antes e após a infecção desafio.

Os resultados apresentados indicam que a o polímero composto pelos peptídeos sintéticos 11H e 12A induziu o desenvolvimento de uma resposta imune Th1, que se correlaciona com o perfil de resposta imune observado no fenótipo de proteção contra as leishmanioses, tanto no modelo murino, quanto em cães assintomáticos e/ou resistentes à infecção (Pinelli et al., 1994; Quinnell et al., 2001; Santos-Gomes et al., 2002).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 01- Reatividade dos fagos dos pannings 1, 2 e 3. Sensibilização da placa de ELISA com 10 mg/ml de IgG policlonal anti-L. chagasi e incubação com 1x1010 fagos eluídos dos pannings 1, 2 e 3 (P1, P2 e P3). Como controle negativo, fagos silvestres, que não expressam peptídeos de interesse, foram utilizados nos ensaios.

Figura 02- ELISA tipo sanduíche para a individualização dos clones de fagos. Sensibilização da placa de ELISA com 5 μg/ml de IgGs anti-L. chagasi e incubação com 50 μl do sobrenadante de cultura de K91 infectada com os fagos de interesse e, no controle negativo, 50 μl de sobrenadante de cultura de K91 infectadas com fagos silvestres.

Figura 03- Especificidade dos clones positivos frente às IgGs de cães saudáveis. Sensibilização da placa de ELISA com 10 μg/ml de IgGs de cães saudáveis e incubação com 50 μl de sobrenadante de bactérias K91 infectada com os fagos de interesse. Como controle positivo, a placa foi sensibilizada com o pool de IgGs anti-L. chagasi e incubada com 50 μl do sobrenadante de um dos fagos positivos.

Figura 04- Especificidade dos clones positivos frente às IgGs de cão anti-T. cruzi:clone 2 (peptídeo 11H), clone 16 (peptídeo 12 A) e clone 18 (peptídeo 3B). Sensibilização da placa de ELISA com 10 μg/ml de IgGs de cães chagásicos e incubação com 50 μl de sobrenadante de cultura de K91 infectada com os fagos selecionados. As barras de cor preta representam reação dos clones com IgGs de cães com LV; as barras maleadas representam a reação dos clones em relação às IgGs anti-T. cruzi.

Figura 05- Análise da reatividade dos peptídeos sobre a membrana de celulose com amostras de soro de cães com LV. Pools de soros positivos (A) e negativos (B) foram usados na diluição 1:250. Foi empregado o anticorpo anti- IgG de cão, conjugado à peroxidase, na diluição de 1:500.

Figura 06- Perfil de eluição dos peptídeos sintéticos em coluna de fase reversa C18 e sistema de HPLC.

Figura 07- Análise por espectrometria de massa dos picos purificados.

Figura 08- Polimerização dos peptídeos 1H e 12A. Os peptídeos 11H e 12A foram acoplados utilizando-se uma solução de glutaraldeido a 1%. Este é capaz de interagir com as lisinas e o grupo amino das cisteínas formando uma ligação covalente.

Figura 09- Eletroforese dos peptídeos polimerizados em gel de poliacrilamida SDS-PAGE a 15%, corado pela prata. Alíquotas de 20 μl foram separadas em gel de policrilamida 15% em condições não-redutoras e posteriormente coradas pela prata. Canaleta (A) 10 μg do polímero 11H-12A; canaleta (B) 20 μg de polímero e, na canaleta e (C), o padrão de baixo peso molecular (5 μg).

Figura 10- Avaliação do tamanho médio das lesões nas patas infectadas de camundongos BALB/c imunizados com o polímero, após a infecção desafio com L. amazonensis. No painel A, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero e adjuvante. No painel B, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante.

Figura 11- Quantificação de parasitas nas patas de camundongos BALB/c imunizados com peptídeos sintéticos, após cerca de 9 semanas da infecção desafio com L. amazonensis. No painel A, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero e adjuvante. No painel B, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante.

Figura 12- Produção de IFN-y pelos esplenócitos de camundongos BALB/c imunizados, antes e após a infecção desafio com L. amazonensis. No painel A, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero e adjuvante. No painel B, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante. A estimulação dos esplenócitos foi realizada com 50 μg/ml de SLALA ou com 10 μg/ml do polímero, sendo incubadas por 48 horas a 37° C e 5% de CO2.

Figura 13- Produção de IL-4 e IL-10 pelos esplenócitos de camundongos BALB/c imunizados com o polímero, antes da infecção desafio com L. amazonensis. No painel A, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero e adjuvante. No painel B, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante. A estimulação dos esplenócitos foi realizada com 50 μg/ml de SLALA ou com 10 μg/ml do polímero, sendo incubadas por 48 horas a 37° C e 5% de CO2.

Figura 14- Produção de IL-4 e IL-10 pelos esplenócitos de camundongos BALB/c imunizados com o polímero, antes e após a infecção desafio com L. amazonensis. A e B) C1=PBS, C2=Adjuvante e C3=polímero e adjuvante. Em C, D, E e F, temos: C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante. A estimulação dos esplenócitos foi realizada com 50 μg/ml de SLALA ou com 10 μg/ml do polímero, sendo incubadas por 48 horas a 37° C e 5% de CO2.

Figura 15- Produção de IgG total, lgG1 e lgG2a nos animais imunizados, cerca de 9 semanas após a infecção desafio com L. amazonensis. C1=PBS, C2=Adjuvante, C3=polímero e adjuvante, C4=polímero não relacionado e adjuvante, C5=polímero 11H e adjuvante, C6=polímero 12A e adjuvante e, em C7=SLALA e adjuvante. Sensibilização das placas de ELISA com 1,0 μg/ml do extrato protéico solúvel de L. amazonensis (SLALA) e incubação com as amostras de soro de camundongos, na diluição de 1:100.

Claims

1. PEPTÍDEO SINTÉTICO imunogênico contra Leishmania caracterizado por ser definido pela Seq. ID n° 1.

2. PEPTÍDEO SINTÉTICO imunogênico contra Leishmania caracterizado por ser definido pela Seq. ID n° 2.

3. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE POLÍMERO PROTEICO compreendendo os peptídeos sintéticos definidos nas reivindicações 1 e 2, caracterizado por compreender a conjugação dos peptídeos sintéticos definidos pelas Seq. ID n° 1 e Seq. ID no2, através do emprego de glutaraldeído, como promotor de ligação entre resíduos de lisina presentes em ambos os peptídeos e compreender as seguintes etapas: a. Conjugação dos peptídeos sintéticos definidos pelas Seq. ID no1 e Seq. ID no2 com uma solução de glutaraldeído a 1%, à temperatura de 4 oC sob agitação constante por 1 hora; b. Término da reação com uma solução de NaBH4, à temperatura de 4 oC sob agitação constante por 1 hora; c. Diálise em membrana 3000 kDa, à temperatura de 4 oC sob agitação constante overnight com PBS 1X.

4. POLÍMERO PROTEICO obtido pelo processo definido na reivindicação 3, caracterizado por conter os peptídeos sintéticos definidos pelas Seq. ID n° 1 e Seq. ID no2 conjugados.

5. POLÍMERO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender repetições e combinações variadas dos peptídeos Seq. ID n° 1 e Seq. ID no2.

6. POLÍMERO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por apresentar massa molecular entre 25 e 40 kDa.

7. USO DO POLÍMERO PROTEICO definido na reivindicação 4, caracterizado por ser em uma composição vacinal contra Leishmania.

8. COMPOSIÇÃO VACINAL compreendendo o polímero proteico definido na reivindicação 4, caracterizada por compreender o polímero proteico contendo repetições e combinações variadas dos peptídeos Seq. ID n° 1 e Seq. ID no2 como componente imunógeno contra leishmaniose em mamíferos, capaz de estimular resposta imune do tipo Th1.

9. COMPOSIÇÃO VACINAL, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por conter um adjuvante como imunoestimulante.