BRPI0804885A2 - preparado protéico, composição, uso de um preparado protéico e uso de uma composição - Google Patents
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Abstract
PREPARADO PROTéICO, COMPOSIçãO, USO DE UM PREPARADO PROTéICO E USO DE UMA COMPOSIçãO. A presente invenção refere-se a composições que compreendem o preparado protéico, obtido a partir do látex de Hevea brasiliensis, em uma baixa concentração. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso do preparado protéico ou da composição aqui descrita, para a preparação de um medicamento para tratar doenças inflamatórias crónicas, e ao método de tratamento das mesmas que utiliza a mencionada composição ou o preparado protéico.
Description
"PREPARADO PROTÉICO, COMPOSIÇÃO, USO DE UM PREPARADOPROTÉICO E USO DE UMA COMPOSIÇÃO"Campo da Invenção
A presente invenção refere-se genericamente a um preparadoprotéico derivado do látex da planta Hevea brasiliensis e a composições que ocompreendem, em baixa concentração.
Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso do ditopreparado e da dita composição na preparação de um medicamento para tratardoenças inflamatórias agudas e crônicas, particularmente, doenças inflamatórias intestinais (Dll) e síndrome da resposta inflamatória sistêmica(SRIS), assim como ao método de tratamento de tais doenças, que utiliza omencionado preparado protéico, ou a composição com o preparado protéico dapresente invenção.
Antecedentes da Invenção
As doenças inflamatórias intestinais (Dll) são uma família dedoenças crônicas, idiopáticas, recidivantes e tecido-destrutivas, caracterizadaspela disfunção das células T CD4+ e CD8+ da mucosa, produção alterada decifocinas e inflamação celular, podendo levar a danos prolongados eOcasionalmente irreversíveis da função e estrutura gastrintestinal, maisprecisamente, na porção distai do intestino grosso e mucosa colônica. Asprincipais Dll que ocorrem em humanos são subdivididas em dois fenótipos:doença de Crohn e colite ulcerativa.
A doença de Crohn é uma doença crônica caracterizada porinflamação transmural e granulomatosa, que pode causar inflamação emqualquer segmento do trato digestivo, como resultado de respostas imunesdesreguladas contra antígenos intraluminais derivados da flora bacterianacomensal em indivíduos geneticamente susceptíveis.
A colite ulcerativa ocorre como conseqüência de uma recidivaaguda ou crônica de doenças inflamatórias intestinais e é confinada a todo ointestino, começando no reto e progredindo, aparentemente, de maneiracontínua afetando outras porções intestinais.
Tanto a doença de Crohn como a colite ulcerativa sãoacompanhadas de sintomas clínicos tais como diarréia, prolapso retal, perda depeso e dores abdominais, e são histologicamente caracterizadas pelainflamação e ulceração da mucosa colônica.
Os estudos em relação à patogênese das Dll e os possíveisagentes terapêuticos para o tratamento destas doenças têm sido de grandeimportância nas últimas décadas. Sabe-se que a severidade do processoinflamatório intestinal pode ser conseqüência da diminuição dos mecanismosde regulação envolvidos na homeostase da mucosa intestinal, e muitos destesprocessos têm sido atribuídos à deficiência da produção de uma das principaiscitocinas envolvidas na regulação de respostas inflamatórias do organismo, aIL-10. A importância desta citocina na regulação da imunidade da mucosaintestinal tem sido demonstrada pelo desenvolvimento de Dll em camundongoscom deficiência de IL-10 (FIOCCHI C. Inflammatory bowel disease: etiologyand pathogenesis. Gastroenterology, 115: 182-205, 1998).
A importância clínica da expressão da IL-10 é apoiada porestudos que mostram que o aumento imunológico desta citocina previneinflamação e danos à mucosa, em modelos de colite animal e em humanos.Isto fez com que o sistema de citocinas constituísse um objeto de interesse epromissor para o desenvolvimento de drogas antiinflamatórias clinicamenterelevantes.
Sabe-se ainda que, n as Dll e inflamações agudas e crônicascomo artrite reumatóide, SRIS e psoríase, ocorre um desequilíbrio entrecitocinas pro-inflamatórias e anti-inflamatórias, em particular, são detectadosníveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a e IFN-(3, que são secretadas por macrófagos, linfócitos, e neutrófilospolimorfonucleares. Esta atividade leva a uma amplificação da cascatainflamatória e à secreção de mais mediadores inflamatórios, enzimas e radicaislivres que causam injúria tecidual e estão implicados na patogênese dasalterações de Dll, como diarréia, permeabilidade da mucosa e fibrose, etambém na patogênese das inflamações agudas e crônicas como na artritereumatóide.
Dados os potentes efeitos imunossupressores da citocina IL-10,ela passou a ser examinada como um agente terapêutico em potencial para as Dll e outras doenças inflamatórias agudas e crônicas, em humanos. Nestecontexto, têm sido amplamente demonstrado que muitos compostos derivadosde plantas apresentam significantes efeitos antiinflamatórios. Por esta razão,eles representam agentes em potencial para o desenvolvimento de novasdrogas, especialmente, destinadas ao tratamento ou controle de estadosinflamatórios crônicos.
A matrina, por exemplo, é um alcalóide encontrado em plantas dogênero Sophora, e mostrou ter efeitos antiinflamatórios em camundongosinduzidos à colite por ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS), provavelmentepela regulação da produção de TNF-a colônica (CHENG, H.; XIA, B.; ZHANG, L; ZHOU, F.; ZHANG, Y.X.; YE, M.; HU, Z. G.; LI, J.; WANG, Z.L; LI, C; GUO,Q.S. Matrine improves 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis inmice. Pharm. Res., 53(3): 202-208, 2005). Outro exemplo é o extrato da raiz deplantas do gênero Poligalae (Polygala tenuifolia), que se trata de uma plantamedicinal que mostrou ter ação preventiva em colite induzida por TNBS provavelmente pela regulação da produção de IFN-y e IL-4.
Ainda, o látex natural da seringueira Hevea brasiliensis vemsendo há muito tempo estudado, principalmente por suas propriedadesangiogênicas e cicatrizantes. Este material mostrou produzir um acentuadoaumento na vascularização, epitelização, acelerando o processo de granulaçãode feridas crônicas de variadas etiologias e cicatrização completa em tempomais curto e a um custo menor, quando comparado aos disponíveis no mercado.
Assim, através do desenvolvimento de um preparado protéicoderivado do látex de Hevea brasiliensis, e de uma composição que o contém, apresente invenção fornece resultados desejáveis no combate e prevenção dedoenças inflamatórias agudas e crônicas.
Descrição Resumida da Invenção
A presente invenção refere-se, em uma realização, a umpreparado protéico derivado do látex de Hevea brasiliensis e, a composiçõesque compreendem tal preparado protéico em baixa concentração, além deveículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis.
Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso dopreparado protéico ou das composições que o contêm, na preparação de ummedicamento para tratar ou prevenir doenças inflamatórias crônicas e agudas,tais como Dll, SRIS, artrite reumatóide e psoríase, e ao método de tratamentoou prevenção das mesmas, que utiliza o preparado protéico ou composiçõesque o contém.
Breve Descrição das FigurasA Figura 1 ilustra o perfil cromatográfico de 2 litros de soro dolátex em pH 9,0, aplicados em coluna DEAE-celulose (dietilaminoetilcelulose) (5,0 X 50,0 cm), equilibrada com tampão de bicarbonato deamônio 0,01 M, em pH 9,0. A eluição foi realizada em gradiente descontínuoe crescente de cloreto de sódio (0; 0,15; 0,25 e 1,5 M) empregando-se umfluxo de 7 ml/min. O eluato foi monitorado em 1=280 nm. As frações foramdesignadas de FrHb I, FrHb II e FrHb III. O preparado da invenção,doravante mencionado simplesmente como "preparado protéico" éparticularmente aquele cuja composição corresponde ao encontrado nafração FrHb III, em que as proteínas tem caráter ácido acentuado,densidade de carga negativa, e peso molecular variando de 60 a 4 kDa,determinado através de SDS-PAGE (sódio dodecil sulfato - eletroforese degel de poliacrilamida).
A Figura 2 ilustra uma eletroforese em gel de poliacrilamida(PAGE) com SDS do pico 3 (fração FrHb III) tratado com SDS, e pico 3 (fraçãoFrHb III) tratado com SDS e reduzido com 2-mercaptoetanol, sendo que em umpoço foi colocado um padrão com proteínas de massas molecularesconhecidas: ovoalbumina (45 kDA), anidrase carbônica (30 kDa) e citocromo c(12,4 kDa).
A partir da eletroforese, é possível observar 4 bandas protéicas:1) na região de massa molecular 45 kDa, 2) na região 30 kDa, e 3) na regiãode 20 kDa, com comportamento dimérico, pois sofre a ação da redução,desaparecendo desta região, caminhando para a região de 10 kDa.
A banda de 20 kDa, composta de 2 cadeias de 10 KDa,provavelmente é o F8, liberador de interleucina 10 (IL-10). A última banda estána região de 10 Kda.
A Figura 3 ilustra a curva padrão de dosagem da citocina IL-10.Esta curva padrão foi obtida através de diluições seriadas da citocina IL-10 nasconcentrações de: 500, 250, 125, 62,5, 31,2, 15,6 e 7,8 pg/mL. O diluente, semIL-10, foi utilizado como concentração padrão zero (pg/mL).
A Figura 4 ilustra os níveis de IL-10 (pg/mL) nos sobrenadantesdas culturas de células mononucleares cultivadas somente na presença domeio de cultura (Basal), na presença do meio de cultura com adição deConcavalina A (ConA) (50 ug/mL), e na presença do meio de cultura comadição do preparado protéico da invenção(p< 0,05).
A Figura 5 ilustra a variação de peso do grupo de animais controle(C e C + preparado protéico), após indução de colite (TNBS), e tratados via oralcom o preparado protéico (TNBS + preparado protéico). A variação de pesoindicada entre o período -1 e 0 corresponde ao período de jejum a que osanimais foram submetidos antes do experimento (12 h). O tratamento do grupo C, C + Preparado protéico, TNBS e TNBS + Preparado protéico iniciou-se nodia 0. O gráfico representa a média + erro padrão da média (EPM) do aumentoou perda de peso que foi monitorado diariamente (n = 10 animais / grupo).
A Figura 6 ilustra a variação de peso em porcentagem (%) apósindução de colite (dia 0) e o 5o dia de tratamento com o preparado protéico. Ográfico representa a média + EPM do aumento ou perda de peso, verificadodiariamente, durante os 5 dias de tratamento, comparando ao dia 0. (P< 0,01).* P = 0,01 comparado ao grupo TNBS (n = 10 animais / grupo).
A Figura 7 ilustra a taxa de sobrevivência dos animais apósindução de colite por TNBS e tratamento com o preparado protéico.
A Figura 8 ilustra a porcentagem de animais que apresentaramdiarréia durante o período de experimento. Os animais do grupo C receberamadministração de álcool etílico 50% via retal e água via oral, os animais dogrupo C + preparado protéico receberam administração de álcool etílico 50%via retal e o preparado protéico diluído em água, via oral, os animais do grupoTNBS receberam administração de TNBS diluído em álcool etílico 50% via retale água via oral, e os animais do grupo TNBS + preparado protéico receberamadministração de TNBS diluído em álcool etílico 50% via retal e tratamento como preparado protéico diluído em água via oral.
A Figura 9 ilustra a porcentagem de animais que apresentaramprolapso retal durante o período de experimento. Os animais do grupo Creceberam administração de álcool etílico 50% via retal e água via oral, osanimais do grupo C + preparado protéico receberam administração de álcooletílico 50% via retal e preparado protéico diluído em água, via oral, os animaisdo grupo TNBS receberam administração de TNBS diluído em álcool etílico50% via retal e água via oral, e os animais do grupo TNBS + preparadoprotéico receberam administração de TNBS diluído em álcool etílico 50% viaretal e tratamento com o preparado protéico diluído em água via oral.
A Figura 10 ilustra as alterações histológicas encontradas nocólon do grupo TNBS em relação ao grupo controle, corados por Hematoxilina-eosina (HE). Grupo controle (A) recebeu apenas administração via intra-retalde álcool etílico 50%. Grupo TNBS (B) recebeu administração via intra-retal deálcool etílico 50% e ácido trinitrobenzeno sulfônico. Observam-se profundasalterações estruturais causadas pela indução da colite no grupo B, comespessamento da parede do cólon, presença de infiltrado inflamatório, edema edeformidade das paredes intestinais. Aumento original: 40X.
A Figura 11 ilustra a análise histológica do cólon dos animais comcolite induzida por TNBS, tratados com o preparado protéico, em relação aosgrupos controles. Grupo controle (C) recebeu administração via intra-retal deálcool etílico 50%. Grupo controle tratado com o preparado protéico (5mg/kg)(C + preparado protéico) recebeu administração via intra-retal de álcool etílico50% e tratamento diário com o preparado protéico via oral. Grupo TNBS(TNBS) recebeu administração via intra-retal de álcool etílico 50% e TNBS.
Grupo TNBS tratado com o preparado protéico (5 mg/kg) (TNBS + preparadoprotéico) recebeu administração via intra-retal de álcool etílico 50% e TNBS etratamento diário com o preparado protéico via oral. Observa-se grandemelhoria quanto à reação inflamatória e preservação dos tecidos do grupoTNBS + preparado protéico em relação ao grupo TNBS, apresentandocaracterísticas histológicas muito próximas à normalidade (grupo C). Aumentooriginal: 100X(A)e200X (B).
A Figura 12 ilustra a variação média de atividade da enzimamieloperoxidase (MPO) entre os grupos ao final do experimento (5o dia apósindução da colite). p< 0,01. * p< 0,01 comparado ao grupo TNBS.
Descrição Detalhada da InvençãoA presente invenção trata de um preparado protéico derivado dolátex de Hevea brasiliensis com peso molecular menor que 60 kDa,determinado por eletroforese SDS-PAGE, assim como composições quecontém o mencionado derivado protéico em baixas concentrações e veículos,excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis.
A concentração do preparado protéico nas composições dainvenção é, preferencialmente, inferior a 15 ug/mL, mais particularmente estácompreendida entre 1,5 ng/ml e 15 ug/mL
O preparado de acordo com a invenção pode ser administrado naforma sólida, por exemplo em cápsulas e comprimidos, ou na forma líquida.
De maneira adequada à composição da presente invenção,veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos nas dosagense concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato eoutros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico emetionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzila amônio,cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcoolfenólico, butílico ou benzílico; alquila parabenos tais como metila ou propilaparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol);polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos);proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeroshidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina,glutamina, asparagina, histidina, arginina ou usina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas;agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol,trehalose ou sorbitol; contraíons formadores de sais, tais como sódio;complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn e proteína); e/outensoativos não iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol(PEG).
A composição da presente invenção pode ainda apresentar umrevestimento entérico.
As composições da presente invenção, que utilizam baixas
concentrações do preparado protéico, apresentam ótimos resultados deprodução de IL-10, sendo altamente eficientes para a prevenção ou tratamentode doenças inflamatorias crônicas ou agudas. Ainda, a composição da presente invenção, com baixasconcentrações do preparado protéico, foi capaz de aumentar o peso dosanimais testados de forma gradativa, fazendo com que os animaisrecuperassem o peso inicial registrado no dia do experimento (Figura 5).Adicionalmente, os animais apresentaram baixa incidência de diarréia e prolapso retal, e índice de mortalidade 0.
Em vista disso, a administração de composições de acordo com apresente invenção implicou em melhorias significativas quanto aos sinaisclínicos (diarréia, prolapso retal, perda de peso) relacionados à colite, indicandouma atividade antiinflamatória do preparado protéico da invenção, sob as condições específicas aplicadas.
Em outro aspecto, a presente invenção trata do uso do preparadoprotéico ou de composições que o contém em baixas concentrações, paratratar ou prevenir doenças inflamatorias crônicas ou agudas, como as Dll,artrite reumatóide e SRIS.
Ainda outro objeto da presente invenção é o uso do preparadoprotéico ou de composições que o contém em baixas concentrações, napreparação de um medicamento para tratar ou prevenir doenças inflamatoriascrônicas ou agudas.De acordo com a presente invenção, doenças inflamatóriascrônicas ou agudas incluem artrite reumatóide, síndrome de respostainflamatória sistêmica (SRIS), psoríase e Dll, como por exemplo, Retocoliteulcerativa, Colite Ulcerativa, Doença de Crohn.
As concentrações do preparado protéico ou das composiçõesutilizadas para a preparação do medicamento estão compreendidas na faixa de1,5 ng/ml a 15 ug/ml (1,5 x 10'7 a 1,5 x 10"4 %).
A presente invenção refere-se ainda a um método de tratamentoou prevenção de doenças inflamatórias crônicas ou agudas, como Dll, artritereumatóide e SRIS, o método sendo caracterizado pelo fato de se aplicar a umpaciente, necessitado de tratamento, uma quantidade eficaz do preparadoprotéico ou composição que o contém em baixas concentrações.
O preparado protéico ou composições que o contém em baixasconcentrações podem ser administrados por qualquer meio apropriado,incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal,anal, bolus e aplicação tópica. Infusões parenterais incluem administraçãointramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea.Preferencialmente, a composição é administrada por via oral, e apresenta umrevestimento entérico.
De acordo com apresente invenção, uma quantidade eficaz dopreparado protéico ou de uma composição que o contém em baixasconcentrações, administrada ao paciente, está compreendida na faixa de 1,5ng/ml a 15 ug/ml (1,5 x 10"7 a 1,5 x 10"4 %).
Exemplos
Exemplo 1
Obtenção de Preparado Protéico
Obtenção do soro: O látex natural foi extraído de árvorespertencentes a um único seringal, de diversos clones da seringueira Heveabrasiliensis (principalmente RRhim 600 e GT-1), através de incisões na casca auma altura de 60 a 90 cm em formato de meio espiral, que recebiam de 1,5 a2% de hidróxido de amônio, com o objetivo de evitar a auto-coagulação domesmo.
Durante todo projeto o material foi fornecido por empresas daregião de Rio Preto-SP. A extração da borracha foi feita no laboratório pormeio da adição de ácido acético, e o soro do látex, material de interesse deconteúdo protéico, foi, desta forma, obtido.
Cromatografia em coluna de troca iônica - DEAE-celulose(dietilaminoetil celulose): Para a purificação cromatográfica foi utilizada umacoluna de vidro preenchida com matriz DEAE-celulose (5 cm x 50 cm),equilibrada com tampão bicarbonato de amônio 0,01 M (pH 9,0).
A quantidade de proteínas do soro de látex foi determinada pelométodo de LOWRY (Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall, Proteinmeasurement with the folin phenol reagent, RJ. J Biol Chem; 193:265-75(1951)) modificado por HARTREE (Hartree EF Determination of protein: Amodification of the Lowry method that gives a linear photometric response. AnalBiochem 48: 422-427 (1972)), sendo a concentração média das proteínas daspreparações, de 0,36 mg/mL, correspondendo a um total de 720 mg deproteína total aplicado na coluna (2 L de soro).
O soro teve seu pH corrigido para 9,0 através da adição de NaOH5,0 M e foi aplicado à coluna cromatográfica à temperatura ambiente, eluídocom tampão de bicarbonato de amônio 0,01 M em gradiente descontínuo ecrescente de NaCI (0 M; 0,15 M; 0,25 M e 1,5 M de NaCI) na forma "step-wise".O fluxo empregado foi de 7 mL/min e o eluato monitorado a 280 nm emespectrofotômetro. As frações foram coletadas na razão de 30 mL por tubo,com o auxílio de um coletor (Gilson®). A cada adição das diferentesconcentrações de cloreto de sódio, obteve-se: 1o pico (FrHbl) a 0,15 M, 2o pico(FrHbll) a 0,25 M e 3o pico (preparado protéico - FrHblII) a 1,5 M.
O material, de acordo com o perfil cromatográfico, teve seusrespectivos picos característicos reunidos e submetidos à diálise contra águadestilada, liofilizados e armazenados a -20° C, para posterior análise deatividade biológica.
O perfil cromatográfico obtido após completa eluição do material eacompanhamento do perfil por leitura espectrofotométrica da absorbância nocomprimento de onda (A.=280 nm) é ilustrado pela Figura 1.
A seguir, a fração FrHBIII, representativo do preparado protéicoda invenção, foi submetida a ensaios de avaliação de atividade anti-inflamatóriaem modelo in vivo.
Exemplo 2
Avaliação da produção de citocina de IL-10 em amostras de células
mononucleares humanas em presença do preparado protéico
Coleta de sangue periférico: A coleta de sangue foi feita emdoadores voluntários após esclarecimento dos objetivos do estudo eautorização por escrito.
Foram coletadas amostras de 15 mL de sangue venoso de cadadoador, obtida pela punção da veia braquial, após assepsia com álcool iodado.
Obtenção das células: Para a separação das célulasmononucleares, o sangue coletado foi imediatamente diluído com o mesmovolume de meio de cultura (RPMI 1640) e a solução obtida foi colocada sobre ogradiente Ficoll - Hipaque®. Estas células foram cultivadas seguindo oprotocolo previamente estabelecido pelos Laboratórios de Cultura de células.
O método foi desenvolvido sob condições de esterilidade,utilizando-se uma câmara de fluxo laminar. Foram pipetados 10 mL de sanguediluído lenta e cuidadosamente em um tubo de polipropileno de 15 mL,contendo 3 mL de Hystopaque. O preparado foi centrifugado a 400 x g durante30 minutos para a formação de 4 camadas distintas: superior, contendoplasma, meio de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute) e plaquetas;interface, contendo células mononucleares; média, gradiente Ficoll-Hipaque®;e inferior, granulócitos e hemácias.
A camada de,células mononucleares foi ressuspensa em 10 mLde solução salina isotônica e centrifugada a 350 x g durante 10 minutos.Desprezou-se o sobrenadante e repetiu-se o processo 2 vezes. O pellet foiressuspenso em 1,0 mL de meio de cultura. Após a avaliação da viabilidadedas células mononucleares, com solução de azul de Trypan a 0,2%, procedeu-se com a contagem das células em microscópio óptico com auxílio de umacâmara de Neubauer, seguindo a diluição 1:20 (v/v) em corante Turk. Asuspensão de células foi diluída em meio de cultura enriquecido com 10% desoro bovino fetal (SBF) para obtenção de uma concentração de 2,5 x 106células/mL
Metodologia Quantitativa - ELISA: Para a quantificação dacitocina IL-10 foi utilizado o ensaio imunoenzimático ELISA. Foram utilizadasplacas de cultura de 96 poços esterilizadas por radiação v, sendo as culturasde células mononucleares preparadas na concentração de 1,5 x 106 células/mLcontendo 10% de soro bovino fetal (SBF) por poço. Culturas celulares contendosomente meio de cultura foram feitas para o controle de proliferação celularespontânea (Basal), e duplicatas contendo meio de cultura e 100 uL domitógeno Concavalina A (50 ug/mL - Sigma®) foram feitas para controle deestímulo à proliferação.
Foram realizadas diluições seriadas (1:10 v/v) do preparadoprotéico obtido a partir da cromatografia do látex em DEAE-celulose,esterilizada por filtração em filtros de 0,23 um, em meio de cultura estéril RPMI,de modo a se obter as concentrações de 150 ug/mL, 15 ug/mL e 1,5 ug/mL. Asrespectivas diluições (150 à 1,5 ug/mL) do preparado protéico foramadicionadas em volume de 100 uL nos poços correspondentes.
Foram realizados ainda novos testes com concentrações maisdiluídas, de 1,5 ng/ml a 15 ug/ml.
As placas foram então acondicionadas em estufa de cultura decélulas automática, com atmosfera úmida com CO2 5%, a 37°C durante 72horas. Após o período de incubação, os sobrenadantes destas culturas foramcoletados e armazenados em microtubos a -20°C para posterior dosagem dacitocina IL-10.
Os sobrenadantes das culturas de células mononucleares foramdescongelados à temperatura ambiente, centrifugados a 1200 rpm durante 1minuto e diluídas (10 vezes) para a dosagem de IL-10 no momento doexperimento.
Preparo da curva padrão: A curva padrão foi obtida partindo-sede diluições seriadas de IL-10 (kit BD OptEIA™ Set Human IL-10, BDBiosciences Pharmigen - USA) nas concentrações de: 500, 250, 125, 62,5,31,2, 15,6 e 7,8 pg/mL. O diluente, sem IL-10, foi utilizado como concentraçãopadrão zero (pg/mL). Foi utilizada uma placa de 96 poços, utilizando-se aprimeira coluna da placa para a curva padrão. Após a diluição do Anticorpo(Ac) de captura (clone JES3.19F1. Isotype: Rat lgG2a) purificado (1 uL/mL)para IL-10, adicionou-se 50 uL da solução por poço, seguindo um período deincubação de 16 horas a 4°C. A placa foi retornada à temperatura ambiente eforam adicionados 200 uL do tampão de bloqueio por poço, incubando-senovamente durante 2 horas nesta mesma temperatura. Cada poço foi aspiradoe lavado por 4 vezes. Adicionou-se as diluições seriadas do padrão IL-10 naprimeira coluna, as suspensões de células cultivadas com Concavalina A(ConA) na coluna 2, e os sobrenadantes obtidos da cultura diluídos em tampãonas outras colunas, utilizando-se 100 uL por poço. A placa foi incubada durante16 horas a 4°C. Seguiu-se o procedimento de lavagem da placa por 5 vezes.Foram adicionados 100 uL do Ac de detecção (anti IL-10) biotinilado (1 ug/mL -Clone JES3.12G8. Isotype: Rat lgG2a) em tampão de bloqueio Tween e aplaca foi incubada durante 1 hora em temperatura ambiente. O procedimentode lavagem foi repetido por mais 5 vezes. Foram colocados 100 uL de HRP(enzima-conjugado) diluído 1000 vezes incubando a placa por 30 minutos emtemperatura ambiente. O procedimento de lavagem foi, novamente, repetidopor 5 vezes. Foram adicionados 100 uL do reagente colorido o-phenylenediamine/Sigma® (OPD) diluído em tampão próprio sob a proteção daluz, e a placa foi incubada durante 10 minutos. Foram colocados 50 uL desolução "stop" (H2SO4 a 16%) em cada poço para interromper a reação,obedecendo a mesma seqüência de colocação da solução substrato. Adensidade ótica foi determinada nos 30 minutos decorrentes, em comprimentode onda de 490 nm utilizando-se leitor de ELISA (Titertek Muiltiskan MCC/340).Todo o experimento foi feito em duplicata.
A curva padrão da quantificação de IL-10 por ELISA nascondições experimentais descritas acima é ilustrada pela Figura 3.
Ainda, a quantificação da citocina IL-10 nos sobrenadantesobtidos das culturas de células mononucleares do sangue periférico, emcondição basal (sem estímulo), estimuladas por Concavalina A, e tratadas como preparado protéico é ilustrada pela Figura 4.
Observa-se na Figura 4, que a presença do preparado protéicoinduziu significativamente a liberação da citocina IL-10 (pg/mL; p< 0,05) nasconcentrações 1,5 e 15 |o,g/mL em relação à liberação basal. Uma diminuiçãosignificativa da liberação na concentração 150 ug/mL pode ser observada,provavelmente, devido a efeitos citotóxicos e/ou anti-proliferativos.
Os resultados da quantificação da citocina IL-10 expostosreferem-se a uma projeção inicial baseada na avaliação desta citocina nasdiferentes concentrações do preparado protéico.Exemplo 3
Avaliação da atividade antiinflamatória do preparado protéico utilizandoo modelo de colite experimental em camundongosAnimais de experimentação: Foram utilizados camundongosBalb-c, fêmeas, com idade de 2 a 4 meses. Os animais foram divididos em 4grupos, contendo 10 animais cada: Controle (C): composto por animais quereceberam administração do veículo álcool etílico 50% via retal e 0,5 ml_ águaadministrada por gavagem, com auxílio de uma cânula PE 10 acoplada a umaseringa de 1,0 ml_, via oral; Controle (C) + preparado protéico: composto poranimais que receberam o veículo álcool etílico 50% via intra-retal e tratamentocom preparado protéico (5,0 mg/Kg), diluídos em 0,5 mL de água via oral;TNBS: composto por animais que receberam administração de TNBS diluídoem álcool etílico 50% via retal e 0,5 mL de água via oral; e TNBS + preparadoprotéico: composto por animais que receberam administração de TNBS diluídoem álcool etílico 50% via retal igualmente ao TNBS, mas submetidos atratamento com preparado protéico (5,0 mg/Kg), diluídos em 0,5 mL de águavia oral.
Os camundongos foram mantidos dentro dos padrões normais detemperatura, umidade e ciclo de claro/escuro (12h/12h), com livre acesso àração e água "ad libitum".
indução da colite: A colite foi induzida de acordo com o métodopreviamente descrito por NEURATH et al. (NEURATH, M.F.; FUSS, I.;KELSALL, B.L.; STÜBER, E.; STROBER W. Antibodies to interleukin 12abrogate established experimental colitis in mice. J Exp Med., 182: 1281-1290,1995), com modificações. Os camundongos foram desprovidos de alimentação12 h antes do experimento, recebendo apenas água ad libitum.
Para indução da colite, os animais foram previamenteanestesiados com uma solução contendo: Ketamin - S(+) (50 mg/mL,Cristália®) e Dopaser (xilazina 20mg/ml_, Calier®), dose 400 ul_/20g animal, viaintraperitoneal. Nos Grupos TNBS e TNBS + preparado protéico, a colite foiinduzida através de vagarosa administração via retal de 5,0 mg de TNBS em0,1 mL de álcool etílico 50%, com o auxílio de uma cânula de silicone adaptadaem uma seringa de 1,0 mL, de modo que a extremidade da cânula ficasseposicionada a cerca de 4 cm do ânus. Os Grupos Controle e Controle (C) +preparado protéico receberam, como descrito acima, apenas administração viaretal de 0,1 mL do veículo álcool etílico 50%. Os animais foram então mantidosem posição vertical cerca de 2 minutos e retornados à suas caixas. Duas horasapós a indução da colite e, diariamente durante 5 dias, os animais dos gruposC + preparado protéico e TNBS + preparado protéico receberam administraçãovia oral, de 5 mg/Kg do preparado protéico, diluídas em 0,5 mL de água porgavagem. Os animais dos Grupos Controle e TNBS receberam 0,5 mL de águavia oral.
Monitoramento dos animais: Para verificar se a administraçãodo preparado protéico após a indução da colite levaria a alterações clínicas, osanimais de todos os grupos foram pesados com o auxílio de uma balançaeletrônica (Toledo®) e visualmente inspecionados, diariamente, paraverificação de diarréia e prolapso retal. A porcentagem de variação de peso noquinto dia foi calculada individualmente para cada animal, e posteriormentepara cada grupo, em relação ao peso no dia 0 (dia da indução da colite).
Os resultados observados durante os 5 dias de tratamento estãorepresentados nas Figuras 5 e 6, conforme discutido abaixo.
a) Variação do peso após indução de colite: a variação do pesoobtido diariamente dos animais dos grupos Controle, Controle tratado com opreparado protéico, TNBS e TNBS tratado com o preparado protéico é ilustradapela Figura 5. As mudanças de peso individuais dos animais de cada grupoforam registradas diariamente.Como mostrado nas Figuras 5 e 6, o grupo controle que recebeuadministração apenas de álcool etílico 50% ganhou peso corporal. Os animaisdo grupo TNBS - que receberam apenas administração de água por via oral -perderam peso corporal gradualmente nos dois primeiros dias após a induçãoda colite, e passaram a recuperar gradualmente o peso a partir do terceiro dia,porém, ao final do quinto dia de experimento, ainda não haviam recuperado opeso inicial correspondente ao dia do experimento (dia 0). Por outro lado, osanimais do grupo TNBS + preparado protéico - que receberam tratamento viaoral com o preparado protéico (5 mg/kg) - perderam peso corporal apenas noprimeiro dia após a indução da colite, recuperando o peso gradualmente aponto de atingir o peso inicial correspondente ao dia 0, aproximando-se dopeso observado no período de 12 h que antecedem o experimento (período dejejum). Os animais do grupo C e C + preparado protéico gan haram pesocorporal gradualmente durante todo o período de experimento, atingindo opeso corporal médio observado do período antecedente ao jejum.
Na Figura 6, está representada a variação do peso corporal obtidadurante os 5 dias de experimento, em relação ao dia 0. Observa-se umaumento de peso significativo dos animais do grupo controle (C) e controletratados com o preparado protéico (C + preparado protéico), sem diferençasignificativa entre os grupos. Observa-se ainda uma diminuição significativa dopeso corporal dos animais que foram submetidos à indução de colite por TNBS(p< 0,01) em relação aos animais dos grupos controles. Porém, observa-se queo grupo que foi induzido à colite por administração de TNBS e que receberamtratamento via oral com o preparado protéico, embora tenham apresentadoperda de peso significativamente maior durante os 5 dias de experimento, emrelação aos grupos controle (p£0,01), mostraram recuperação de pesoexpressiva, quando comparados ao grupo TNBS (p=0,01).
b) taxa de sobrevivência: A taxa de sobrevivência dos animaisapós indução de colite por TNBS e tratamento com o preparado protéico éilustrada pela Figura 7. Pode-se observar que a indução de colite pelaadministração de solução de TNBS resultou em um índice de até 20% demortalidade no grupo TNBS após 5 dias de experimento.
No entanto, o grupo que recebeu tratamento com o preparadoprotéico após indução da colite, apresentou índice zero de mortalidade, assimcomo ocorreu nos grupos C e C + preparado protéico.
c) diarréia: A porcentagem de animais que apresentaram diarréiadurante o período de experimento é ilustrada pela Figura 8. Os animais dogrupo C receberam administração de álcool etílico 50% via retal e água viaoral, os animais do grupo C + preparado protéico receberam administração deálcool etílico 50% via retal e o preparado protéico diluído em água, via oral, osanimais do grupo TNBS receberam administração de TNBS diluído em álcooletílico 50% via retal e água via oral, e os animais do grupo TNBS + preparadoprotéico receberam administração de TNBS diluído em álcool etílico 50% viaretal e tratamento com o preparado protéico diluído em água via oral.
d) prolapso retal: A porcentagem de animais que apresentaramprolapso retal durante o período de experimento é ilustrada pela Figura 9. Osanimais do grupo C receberam administração de álcool etílico 50% via retal eágua via oral, os animais do grupo C + preparado protéico receberamadministração de álcool etílico 50% via retal e o preparado protéico diluído emágua, via oral, os animais do grupo TNBS receberam administração de TNBSdiluído em álcool etílico 50% via retal e água via oral, e os animais do grupoTNBS + preparado protéico receberam administração de TNBS diluído emálcool etílico 50% via retal e tratamento com o preparado protéico diluído emágua via oral.
Ao avaliar os animais que foram submetidos à indução de colite(Grupo TNBS), observa-se que desenvolveram diarréia severa (Figura 8) eprolapso retal (Figura 9) em escala significantemente maior que os animais quereceberam tratamento com o preparado protéico (Grupo TNBS + preparadoprotéico). Não foi observada ocorrência de diarréia e prolapso retal nos gruposControle e C + preparado protéico.
Análise histopatológica: para determinar se as alteraçõesclínicas (diarréia, prolapso retal e perda de peso) observadas nos animais dosgrupos TNBS e TNBS + preparado protéico, estariam relacionadas à algumaalteração histopatológica, ou até mesmo a danos teciduais no intestino dosanimais analisados, segmentos do cólon distai foram seccionados, fixados eprocessados para análise histológica.
Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical etiveram seus intestinos excisados cirurgicamente, sendo seccionado cerca de2,0 cm do cólon distai de cada animal. Para a avaliação do processoinflamatório, as peças foram fixadas em formalina tamponada 10%, incluídasem parafina, seccionadas e coradas por hematoxilina-eosina (HE). A análisehistológica das secções foi feita através do uso de um microscópio óptico(Nikon Eclipse E800; Nikon Inc, Melville, NY), com aumentos de 40, 100 e 200X. A aquisição das imagens foi realizada por uma câmera digital (NikonDXM1200; Nikon Inc, Melville, NY).
Nota-se na Figura 11 que o cólon dos animais do grupo controle(C), bem como do grupo controle tratado com o preparado protéico (C +preparado protéico) apresentou aspecto histológico compatível com anormalidade, mostrando um epitélio com grande número de criptas dispostaslado a lado e extremamente ricas em células caliciformes, lâmina própria comaspecto normal e sem pigmentos de hemossiderina visíveis. Na base dascriptas está a lâmina muscular da mucosa, seguida da submucosa, ambas semsinais de inflamação. Logo abaixo se observa que os extratos circular elongitudinal das túnicas musculares e, finalmente, a capa serosa, apresentamaspectos histológicos correspondentes à normalidade.
Já o cólon do grupo TNBS apresentou importantes alteraçõeshistológicas em suas diversas camadas (Figuras 10 e 11), como extensoedema da submucosa, desorganização geral das criptas com pontos ondeforam quase totalmente destruídas. Há uma nítida redução das célulascaliciformes e intensa infiltração de células inflamatórias na mucosa esubmucosa, distinguindo-se facilmente a infiltração de leucócitospolimorfonucleares. Em alguns pontos a camada muscular da mucosa édescontínua, ocorrendo uma intensa infiltração de linfócitos, que se estende atéàs camadas musculares. Nota-se aumento do número de vasos e áreasnitidamente hemorrágicas. Ulcerações ocorrem por toda a submucosa,estendendo-se às camadas musculares e, em alguns locais, atingindo inclusivea capa serosa. Em síntese, tem-se uma severa colite caracterizada pordestruição de criptas, redução das células caliciformes, extenso edema, focosde ulceração hemorrágica, intensa e difusa infiltração de neutrófilos e linfócitosna mucosa e submucosa, e necrose focai dos estratos musculares.
No entanto, a análise histopatológica do cólon dos animais dogrupo TNBS + preparado protéico (Figura 11) permite observar que otratamento com o preparado protéico (5 mg/kg) reduziu de forma significativa aextensão e a severidade das alterações histológicas descritas no grupo TNBS.Ainda que seja possível notar discreta quantidade de leucócitospolimorfonucleares infiltrados, indicando persistência de característicasinflamatórias no cólon, as criptas estão bem preservadas e o número de célulascaliciformes é igual ou muito próximo à normalidade. Não são observadasúlceras e as capas musculares estão íntegras e aparentemente sem alterações(Figuras 10 e 11).
Avaliação da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO):sabe-se que a enzima MPO está expressa em altos níveis em leucócitospolimorfonucleares. Assim, o acúmulo destas células na região de uma lesão éuma característica de processo inflamatório, e a quantificação da enzima MPOé usada para estimar a intensidade do infiltrado inflamatório presente emtecidos lesionados.
Desta forma, determinou-se a atividade da enzima MPO, deacordo com método previamente descrito por BRADLEY et al. (BRADLEY,P.P.; PRIEBAT, D.A.; CHRISTENSEN, R.D.; ROTHSTEIN, G. Measurement ofcutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzymemarker. J. Invest. Dermatol., 78: 206-209, 1982), com modificações.
Um segmento de aproximadamente 50 mg de tecido do cólondistai de cada animal, de cada um dos grupos de animais, foi retirado, lavadocom salina gelada, seccionado em pequenos fragmentos e congelados a -70°C. Posteriormente, os fragmentos foram homogeneizados em 5,0 mL detampão fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,4 , gelado, com auxílio deum polytron (KINEMATICA AG) 3 vezes durante 30 segundos em cada ciclo.Os homogenatos foram submetidos à centrifugação (SORVAL RC-5B) durante30 minutos a 12000 x g e 4°C. Os sobrenadantes foram descartados e osprecipitados foram ressuspensos em 1,0 ml_ de tampão fosfato de potássiomonobásico 50 mM, pH 6,0, contendo brometo de hexadecil trimetil amônio(HTABr) 0,5% (p/v). As suspensões foram submetidas a um rápido ciclo decongelamento (-70°C) e descongelamento (25°C), seguido de sonicação comauxílio de um sonicador (Vibra Cell®) por 15 segundos cada ciclo. As amostrasforam centrifugadas (EPPENDORF CENTRIFUGUE 5417R CE) durante 20minutos a 14000 x g e 4°C. Os sobrenadantes foram coletados e armazenadosa -70°C. Uma alíquota de 0,1 mL do sobrenadante de cada amostra foiadicionado a 2,9 mL de tampão fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH6,0, contendo O-dianisidina hidrocloreto (O-da) (0,167 mg/mL) e peróxido dehidrogênio (0,0005% v/v), e a atividade da MPO das amostras foi avaliadaatravés da leitura em espectrofôtometro (Hitachi® U-2000) a 460 nm e 25°C. Amudança na absorbância foi registrada em intervalos de 30 segundos durante 3minutos. Uma unidade (U) da atividade específica da enzima MPO é dada peladegradação de 1 umol de H202 em H20 e O" pela enzima por minuto a 25°C, eo valor final da atividade da MPO expressa em unidade por grama de tecidoúmido (U/g). O cálculo desta atividade é feito da seguinte maneira: AtividadeMPO (U/g) = (A460) x 13,5 / tecido úmido (em gramas); no qual A460 é a variaçãode absorbância à 460 nm entre 1 a 3 minutos após o início da reação. Ocoeficiente 13,5 foi determinado empiricamente de forma que 1 unidade (U) deatividade de MPO representa a quantidade de enzima que reduzirá 1 umol deperóxido por minuto.
Os resultados obtidos demonstram a variação da atividade daenzima mieloperoxidase, quantificada no 6o dia de experimento (dia 5), emsegmentos do cólon dos animais dos grupos experimentais (Figura 12).
Observa-se que a atividade específica da enzima mieloperoxidase(MPO) foi significativa (p < 0,01), e cerca de quatro vezes maior no grupoTNBS em relação aos grupos C e C + preparado protéico, indicando grandequantidade de infiltrado inflamatorio agudo. No entanto, o grupo que recebeutratamento com o preparado protéico após indução da colite (TNBS +preparado protéico) apresentou redução significativa da atividade da MPO emrelação ao grupo TNBS, indicando efetividade do tratamento, e um breveaumento da atividade significativo (p<0,01) quando comparado aos gruposcontroles, indicando presença de infiltrado inflamatorio, mas de pequenamonta.
Os dados descritos acima são corroborados pela Figura 11, naqual observa-se uma intensa presença de infiltrado inflamatorio nos corteshistológicos dos cólons dos animais em que a colite foi induzida pelaadministração de TNBS, em contraste com a leve presença de infiltradoinflamatório nos cortes histológicos dos animais do grupo em que a colite foiinduzida por TNBS e receberam tratamento com o preparado protéico via oral.
Analise Estatística: Os dados de avaliação da diferença dosprocessos de inflamação intestinal entre os grupos experimentais e controleforam realizados através da Análise de variância "ANOVA one-way" (método deDunnetfs). A avaliação da atividade da enzima mieloperoxidase foi feitaatravés da análise de variância ANOVA seguindo "Bonferroni's test". Foramconsideradas diferenças estatisticamente significativas quando p< 0,05.
As informações aqui apresentadas permitem ao homem datécnica realizar a invenção reivindicada mais abaixo exatamente da formacomo aqui mostrado ou em realizações equivalentes não expressamenteindicadas, mas contidas dentro dos princípios revelados e, portanto, protegidasem tais reivindicações.
Claims (19)
1. PREPARADO PROTÉICO, caracterizado pelo fato de serproveniente do látex da planta Hevea brasiliensis, contendo proteínas decaráter ácido, densidade de carga negativa e peso molecular menor ou igual a60 kDa , resultado de cromatografia de soro do dito látex em coluna de trocaiônica DEAE-celulose (dietilaminoetil celulose), equilibrada com tampãobicarbonato de amônio, sendo que o preparado protéico é obtido pela adiçãode 1,5 M de cloreto de sódio.
2. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de compreenderconcentrações inferiores a 15 ug/mL do preparado protéico conforme descritona reivindicação 1, assim como veículos, excipientes ou estabilizantesfarmaceuticamente aceitáveis.
3. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato do preparado protéico estar compreendido entre 1,5ng/ml e 15 ug/mL.
4. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 2ou 3, caracterizada pelo fato de estar na forma sólida ou líquida.
5. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato dos veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveisserem selecionados entre tampões, antioxidantes, conservantes, alquilaparabenos, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, m-cresol,polipeptídeos de baixo peso molecular, proteínas, polímeros hidrofílicos,aminoácidos, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, agentesquelantes, açúcares, contra-íons formadores de sais, e/ou tensoativos nãoiônicos
6. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de apresentar um revestimento entérico.
7. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme descrita em umadas reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de ser no tratamento ouprevenção de doenças inflamatórias agudas ou crônicas.
8. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato das doenças serem doenças inflamatórias intestinais selecionadas dogrupo que compreende retocolite ulcerativa, colite ulcerativa, doença de Crohn.
9. USO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato das doenças serem doenças inflamatórias selecionadas do grupo quecompreende psoríase, artrite reumatóide e síndrome de resposta inflamatóriasistêmica.
10. USO DE UM PREPARADO PROTÉICO, conforme descritona eivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser no tratamento ou prevençãode doenças inflamatórias agudas ou crônicas.
11. USO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato das doenças serem doenças inflamatórias intestinais selecionadas do grupo que compreende retocolite ulcerativa, colite ulcerativa, doença de Crohn.
12. USO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelofato das doenças serem doenças inflamatórias selecionadas do grupo quecompreende psoríase, artrite reumatóide e síndrome de resposta inflamatóriasistêmica.
13. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme descrita em umadas reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a preparação deum medicamento para tratar ou prevenir doenças inflamatórias agudas oucrônicas.
14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato das doenças serem doenças inflamatórias intestinais selecionadas dogrupo que compreende retocolite ulcerativa, colite ulcerativa, doença de Crohn.
15. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato das doenças serem doenças inflamatórias selecionadas do grupo quecompreende psoríase, artrite reumatóide e síndrome de resposta inflamatóriasistêmica.
16. USO DE UM PREPARADO PROTÉICO, conforme descritona reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de ummedicamento para tratar ou prevenir doenças inflamatórias agudas ou crônicas.
17. USO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato das doenças serem doenças inflamatórias intestinais selecionadas dogrupo que compreende retocolite ulcerativa, colite ulcerativa, doença de Crohn.
18. USO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato das doenças serem doenças inflamatórias selecionadas do grupo quecompreende psoríase, artrite reumatóide e síndrome de resposta inflamatóriasistêmica.
19. USO, de acordo com uma das reivindicações 13 ou 16,caracterizado pelo fato da concentração do preparado protéico ou dacomposição utilizada na preparação do medicamento estar compreendida entre 1,5 ng/ml a 15 ug/ml (1,5 x 10"7 a 1,5 x 10"4 %).
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