BRPI0805220A2 - métodos para produzir um extrato de proteìna a partir de células fixas e para detectar uma proteìna, sistema e kit para produzir um extrato de proteìna, e, método para extrair uma proteìna viral alvo de uma amostra de célula - Google Patents
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Abstract
Métodos para produzir um extrato de proteína de células, tais como células contendo proteínas virais, são fornecidos. Em termos gerais, os métodos envolvem: aumentar o pH das células a um pH pelo menos em torno do pH 10,0 para produzir uma composição intermediária, e depois, na presença de um detergente não iónico, neutralizar o pH da composição intermediária para produzir o extrato de proteína. Kits e composições para praticar os métodos objetos são também fornecidos.
Description
"MÉTODOS PARA PRODUZIR UM EXTRATO DE PROTEÍNA APARTIR DE CÉLULAS FIXAS E PARA DETECTAR UMA PROTEÍNA,SISTEMA E KIT PARA PRODUZIR UM EXTRATO DE PROTEÍNA, E,MÉTODO PARA EXTRAIR UMA PROTEÍNA VIRAL ALVO DE UMAAMOSTRA DE CÉLULA"
REFERÊNCIA CRUZADA
Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.N2 60/747.076, depositado em 11 de maio de 2006, pedido este que é aquiincorporado por referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Em muitos métodos de diagnóstico, as células são tiradas deum paciente e depositadas em um meio líquido contendo um fixador. Ascélulas são fixadas no meio e examinadas citologicamente de modo a fornecerum diagnóstico. Por exemplo, a detecção de células pré cancerosas oucancerosas em tecido cervical é rotineiramente realizada pela avaliaçãomicroscópica de células do colo do útero esfoliadas. Este método,desenvolvido por George N. Papanicolaou e conhecido como o teste "Pap",envolve esfoliar células do colo do útero de uma mulher usando umdispositivo de amostragem, depositando as células esfoliadas em um meio detransporte que contenha um fixador e depois depositando as células sobre umalâmina. As células são depois tingidas e examinadas pela microscopia óticaquanto às anormalidades celulares por um profissional médico treinado. Maisde 55 milhões de testes Pap são realizados a cada ano apenas nos EstadosUnidos.
A despeito do sucesso de tais testes citológicos, os testes sãopropensos a erro. Por exemplo, foi estimado que até 40 % dos testes de Papconvencionais são comprometidos pela presença de contaminantes tais comomuco, células sangüíneas e células inflamatórias obscurecidas. Estescontaminantes levam a resultados falso negativos, resultados falso positivos euma quantidade significante de trabalho de seguimento. Ver, por exemplo,Koss, L. G. (1989), The Papanicolaou Test for Cervical Câncer Detection: ATriumph and a Tragedy, JAMA 261: 737-743; ver também DeMay,"Problems in Pap Smear Interpretation", Arch. Pathol. Lab. Med. 121: 229-23(1997).
Em vista do acima, existe uma necessidade quanto a métodosde diagnóstico molecular complementares para a análise de células que estãopresentes em um meio líquido contendo um fixador. Tais métodos não sãodiretos, entretanto, porque não é sempre possível realizar tais métodos emcélulas fixas. Por exemplo, certos fixadores (por exemplo, aqueles meios detransporte utilizados nos sistemas de teste THINPREP ou SUREPATH®)podem fazer com que as proteínas celulares particulares precipitem ouagreguem, tornando deste modo estas proteínas insolúveis e difíceis ouimpossíveis de detectar confiavelmente usando meios convencionais, porexemplo, usando um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou umoutro teste imunológico.
Existe portanto uma necessidade enorme quanto a métodos ecomposições para extrair proteínas de células fixas em uma maneira quepermita que elas sejam adequadas para o uso em ensaios moleculares, porexemplo, imunológicos, de detecção. A invenção aqui descrita atinge estanecessidade e outras.
Literatura
A literatura de interesse inclui: Patentes U.S. 6.890.729,6.337.189 e pedido de patente U.S. publicada 20050032105.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os métodos para produzir um extrato de proteína de células,preferivelmente células fixas, são fornecidos. Em termos gerais, os métodosenvolvem: aumentar o pH das células a um pH pelo menos em torno do pH10,0 para produzir uma composição intermediária e depois, na presença deum detergente não iônico, neutralizar o pH da composição intermediária paraproduzir o extrato de proteína. O método pode incluir: a) contatar as célulascom um reagente de extração para produzir uma composição intermediáriatendo um pH pelo menos em torno do pH 10,0; e b) contatar a composiçãointermediária com um reagente de neutralização para neutralizar o pH dacomposição intermediária e produzir o extrato de proteína. Um ou ambos doreagente de extração e do reagente de neutralização contém o detergente nãoiônico. Em certas formas de realização, as células fixas podem ser célulascervicais esfoliadas fixas.
DEFINIÇÕES
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicose científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmenteentendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual estainvenção pertence. Ainda, certos elementos são definidos abaixo por causa declareza e facilidade de referência.
O termo "amostra celular" como aqui usado diz respeito a umacomposição líquida contendo uma ou mais células de interesse. Uma amostracelular pode ser uma amostra clínica contendo células removidas de (porexemplo, dissecadas ou esfoliada de) um indivíduo, incluindo mas nãolimitadas a, por exemplo, células de plasma, soro, fluido espinhal, sêmen,fluido linfóide, as seções externas da pele, tratos respiratório, intestinal egenitourinário, lágrimas, saliva, leite, células sangüíneas, tumores ou órgãos.
Em outras formas de realização, a amostra celular pode conter célulascultivadas in vitro (incluindo mas não limitadas às células em meio de culturade célula, células viralmente infectadas, células recombinantes, etc.). Emcertas formas de realização, a amostra celular pode conter células que estãoem mais risco de serem infectadas pelo HPV. Nestas formas de realização, ascélulas podem ser obtidas de um colo do útero, vulva, vagina, ânus, pênis,boca ou garganta. Em certas formas de realização, as células são demembrana mucosa e podem ser epiteliais na origem. Uma amostra celularpode conter ou não contaminantes outros que não células esfoliadas oudissecadas. Por exemplo, muco ou células bacterianas, de levedura ousangüíneas podem estar presentes em uma amostra celular.
"HPV" é Papilomavírus humano, incluindo mas não limitadoàs cepas do HPV 4, 11, 20, 24, 28, 36, 48, 50, 16, 18, 31, 35, 30, 39, 45, 51,52, 56, 59, 58, 33, 66, 68, 69, 26, 53, 73 e 82.
Uma "cepa do HPV oncogênica" é uma cepa do que éconhecida causar câncer cervical como determinado pelo National CâncerInstitute (NCI, 2001).
Uma "proteína E6 oncogênica" é uma proteína E6 codificadapor uma cepa do HPV oncogênica. As cepas oncogênicas exemplares são:HPV 26, HPV 53, HPV 66, HPV 73, HPV 82, HPV 16, HPV 18, HPV 31,HPV 35, HPV 30, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 56, HPV 59,HPV 58, HPV 33, HPV 66, HPV 68, HPV 69 e HPV 82. As seqüências deaminoácido de proteínas E6 oncogênicas são depositadas na base de dados doGenBank da NCBI. Embora não se deseje estar ligado pela teoria, acredita-seno geral que as cepas do HPV 4, 11, 20, 24, 28, 36, 48 e 50 não sejamoncogênicas.
Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usadosintercambiavelmente. O termo "polipeptídeo" inclui polipeptídeos em que acadeia principal convencional foi substituída com cadeias principais que nãoocorrem naturalmente ou sintéticas e peptídeos em que um ou mais dosaminoácidos convencionais foram substituídos com um ou mais aminoácidosque não ocorrem naturalmente ou sintéticos.
O termo "proteína de fusão" ou equivalentes gramaticais destefaz alusão a um composto de proteína de uma pluralidade de componentes depolipeptídeo, que embora não ligado em seu estado nativo, são unidos pelosseus respectivos terminais amino e carboxila através de uma ligação depeptídeo para formar um único polipeptídeo contínuo. As proteínas de fusãopodem ser uma combinação de dois, três ou mesmo quatro ou mais proteínasdiferentes. O termo polipeptídeo inclui proteínas de fusão, incluindo, mas nãolimitadas a, proteínas de fusão com uma seqüência de aminoácido heteróloga,fusões com seqüências líder heterólogas e homólogas, com ou sem resíduosde metionina de termina N; proteínas imunologicamente alvejadas; proteínasde fusão com parceiros de fusão detectáveis, por exemplo, proteínas de fusãoincluindo como um parceiro de fusão uma proteína fluorescente, β-galactosidase, luciferase e outros.
No geral, os polipeptídeos podem ser de qualquercomprimento, por exemplo, maiores do que 2 aminoácidos, maiores do que 4aminoácidos, maiores do que cerca de 10 aminoácidos, maiores do que cercade 20 aminoácidos, maiores do que cerca de 50 aminoácidos, maiores do quecerca de 100 aminoácidos, maiores do que cerca de 300 aminoácidos,usualmente até cerca de 500 ou 1000 ou mais aminoácidos. "Peptídeos" sãono geral maiores do que 2 aminoácidos, maiores do que 4 aminoácidos,maiores do que cerca de 10 aminoácidos, maiores do que cerca de 20aminoácidos, usualmente até cerca de 50 aminoácidos. Em algumas formas derealização, os peptídeos estão entre 5 e 30 aminoácidos no comprimento. Ospolipeptídeos podem ser naturais em que eles podem ser codificados pelogenoma de um organismo ou vírus ou não naturais em que eles não são deocorrência natural.
O termo "agente de captura" refere-se a um agente que ligauma proteína através de uma interação que é suficiente para permitir que oagente se ligue e concentre a proteína de uma mistura homogênea de proteínasdiferentes. Conseqüentemente, o termo "agente de captura" refere-se a umamolécula ou um complexo multi-molecular que pode especificamente ligarum analito, por exemplo, especificamente ligar um analito para o agente decaptura, com uma constante de dissociação (Kd) de menos do que cerca de 10"6 M sem ligar-se a outros alvos. A interação de ligação pode ser mediada poruma região de afinidade do agente de captura. Os agentes de capturarepresentativos incluem anticorpos (incluindo fragmentos e miméticos destes)e proteínas contendo domínio PDZ, etc.
O termo "ligação específica" refere-se à capacidade de umagente de captura para preferencialmente ligar a uma proteína particular queestá presente em uma mistura homogênea de proteínas diferentes. Em certasformas de realização, uma interação de ligação específica discriminará eritreuma proteína particular e outras proteínas em uma amostra, em algumasformas de realização mais do que cerca de 10 a 100 vezes ou mais (porexemplo, mais do que cerca de 1000 ou 10.000 vezes).
O termo "complexo de agente de captura/proteína" é umcomplexo que resulta da ligação específica de um agente de captura com umaproteína, isto é, um "par de parceiro de ligação". Um agente de captura e umaproteína para o agente de captura especificamente ligam-se entre si sob"condições adequadas para a ligação específica", onde tais condições sãoaquelas condições (em termos de concentração salina, pH, detergente,concentração de proteína, temperatura, etc.) que permite que a ligação ocorraentre agentes de captura e proteínas para que se liguem em solução. Taiscondições, particularmente com respeito aos anticorpos e seus antígenos, sãobem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (Antibodies: ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989)). Em certas formas de realização, a afinidade entre um agente decaptura e proteína que são especificamente ligados em um complexo deagente de captura/proteína é caracterizado por um KD (constante dedissociação) de menos do que 10" M, menos do que 10"'M, menos do que 10"8 M, menos do que IO"9 M ou menos do que cerca de IO"10 M.
"Parceiros de ligação" e equivalentes referem-se aos pares demoléculas que podem ser encontrados em um complexo de agente decaptura/analito, isto é, exibem ligação específica entre si.
Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usadosintercambiavelmente aqui para se referir a um agente de captura que tem pelomenos um domínio de ligação de epítopo de um anticorpo. Estes termos sãobem entendidos por aqueles no campo e referem-se a uma proteína contendoum ou mais polipeptídeos que especificamente liga um antígeno. Uma formade anticorpo constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta formaé um tetrâmero e consiste de dois pares idênticos de cadeias de anticorpo,cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Em cada par, as regiõesvariáveis de cadeia leve e pesada são juntas responsáveis pela ligação a umantígeno e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetoras deanticorpo.
Os polipeptídeos de imunoglobulina reconhecidos incluem ascadeias leves capa e lambda e as cadeias pesadas alfa, gama (IgGi, IgG2,lgG3, IgG4), delta, épsilon e mu ou equivalentes em outras espécies. As"cadeias leves" de imunoglobulina de tamanho natural (de cerca de 25 kDa oucerca de 214 aminoácidos) compreendem uma região variável de cerca de 110aminoácidos no término NH2 e uma região constante capa ou lambda noterminal COON. As "cadeias pesadas" de imunoglobulina de tamanho natural(de cerca de 50 kDa ou cerca de 446 aminoácidos), similarmentecompreendem uma região variável (de cerca de 116 aminoácidos) e uma dasregiões constantes de cadeia pesada anteriormente mencionadas, por exemplo,gama (de cerca de 330 aminoácidos).
Os termos "anticorpos" e "imunoglobulina" incluemanticorpos ou imunoglobulinas de qualquer isótipo, fragmentos de anticorposque retêm a ligação específica ao antígeno, incluindo, mas não limitados aosfragmentos Fab, Fv, scFv e Fd, anticorpos quiméricos, anticorposhumanizados, anticorpos de cadeia única e proteínas de fusão quecompreendem uma porção de ligação de antígeno de uma proteína deanticorpo e uma que não de anticorpo. Os anticorpos podem serdetectavelmente rotulados, por exemplo, com um radioisótopo, uma enzimaque gera um produto detectável, uma proteína fluorescente e outros. Osanticorpos podem ser ainda conjugados a outras porções, tais como membrosde pares de ligação específica, por exemplo, biotina (membro de par deligação específica biotina-avidina) e outros. Os anticorpos também podemestar ligados a um suporte sólido, incluindo, mas não limitados a, placas oupérolas de poliestireno e outros. Também abrangidos pelos termos são Fab',Fv, F(ab')2 e ou outros fragmentos de anticorpo que retêm a ligação específicaao antígeno.
Anticorpos podem existir em uma variedade de outras formasincluindo, por exemplo, Fv, Fab e (Fab)2, assim como anticorpos híbridos bi-fiincionais (isto é, bi-específicos) (por exemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J.Immunol. 17, 105 (1987)) e em cadeias únicas (por exemplo, Huston et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) e Bird et al., Science,242, 423-426 (1988), que são aqui incorporadas por referência). (Ver, nogeral, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2a ed. (1984) eHunkapiller e Hood, Nature, 323, 15-16 (1986)). Os anticorpos monoclonais eanticorpos de "demonstração de fago" são bem conhecidos na técnica eabrangidos pelo termo "anticorpos".
O termo "avaliar" inclui qualquer forma de medição e incluideterminar se um elemento está presente ou não. Os termos "determinar","medir", "avaliação", "avaliar" e "ensaiar" são usados intercambiavelmente epodem incluir determinações quantitativas e/ou qualitativas. A avaliação podeser relativa ou absoluta. "Avaliar a presença de inclui determinar a quantidadede alguma coisa presente, e/ou determinar se a mesma está presente ouausente.
Por "localização remota" é intencionado uma localização outraque não a localização em que as células são obtidas e depositadas em umlíquido contendo fixador. Por exemplo, uma localização remota pode ser umasala diferente no mesmo edifício em que as células são obtidas (por exemplo,um outro laboratório), um edifício diferente no mesmo complexo de edifíciocomo as células são obtidas ou uma localização diferente na mesma cidade,estado ou país, etc. Quando uma amostra celular é indicada como sendo"recebida" de uma localização remota, a amostra celular pode ser obtida dalocalização remota ou entregue pessoalmente, enviada pelo correio oumensageiro da localização remota, por exemplo.
"Comunicar" informação refere-se a qualquer meio de obteresta informação de uma localização para a seguinte, seja por materialimpresso fisicamente transportado ou meio legível por computador contendoa informação (por exemplo, pelo correio) ou pela transmissão da informação.Se a informação é transmitida, um sinal digital ou analógico representando ainformação (por exemplo, um sinal eletromagnético tal como um sinal de luzou elétrico) é transmitida em um canal de comunicação adequado (porexemplo, uma rede privada, pública ou sem fio). Quaisquer meiosconvenientes podem ser utilizados para transmitir os dados, por exemplo, fac-símile, modem, internet, e-mail, etc.
Como aqui usado, o termo "meio de transporte" é usado paradescrever líquidos adequados para a coleta de células e a preservação destascélulas em um maneira que permita que elas estejam adequadas para estudoscitológicos com base em líquido. Os meios de transporte são habitualmenteutilizados no teste Pap. As células depositadas no meio de transporte podemser transportadas ou não de uma localização a uma outra neste meio. Os meiosde transporte contêm fixador. A deposição de células em um meio detransporte fixa as células para produzir células fixas. Os meios de transporterepresentativos incluem os meios de transporte SUREPATH® ouPRESERVCYT®.
Uma "célula fixa" é uma célula que foi tratada com ecitologicamente preservada por um fixador químico. As células fixas sãousualmente adequadas para tingimento e análise morfológica e/ou citológicasubseqüentes pela microscopia ótica.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesterelatório descritivo são aqui incorporados por referência no mesmo grau comose cada publicação ou pedido de patente individuais fosse específica eindividualmente indicados como sendo incorporados por referência.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Embora as formas de realização preferidas da presenteinvenção tenham sido mostradas e aqui descritas, estará óbvio àqueleshabilitados na técnica que tais formas de realização são fornecidas apenas porvia de exemplo. Numerosas variações, mudanças e substituições ocorrerãoagora àqueles habilitados na técnica sem divergir da invenção. Deve serentendido que várias alternativas para as formas de realização da invençãoaqui descritas podem ser utilizadas na prática da invenção. E intencionado queas seguintes reivindicações definam o escopo da invenção e que os métodos eestruturas dentro do escopo destas reivindicações e seus equivalentes sejampor meio desta abrangidos.
Os métodos para produzir um extrato de proteína a partir decélulas fixas são fornecidos. Em termos gerais, os métodos envolvem:aumentar o pH das células fixas a um pH pelo menos em torno do pH 10,0para produzir uma composição intermediária e depois, na presença de umdetergente não iônico, neutralizar o pH da composição intermediária paraproduzir o extrato de proteína. O método pode incluir: a) contatar as célulasfixas com um reagente de extração para produzir uma composiçãointermediária tendo um pH pelo menos em torno do pH 10,0; e b) contatar acomposição intermediária com um reagente de neutralização para neutralizaro pH da composição intermediária e produzir o extrato de proteína. Um ouambos do reagente de extração e do reagente de neutralização contêm odetergente não iônico. Em certas formas de realização, as células fixas podemser células cervicais esfoliadas fixas. Kits e composições para praticar osmétodos objetos são também fornecidos. Os métodos objetos encontram usoem uma variedade de aplicações diferentes, incluindo testes de diagnósticoque detectam proteínas particulares no extrato de proteína resultante.
Antes que a invenção objeto seja descrita mais adiante, deveser entendido que a invenção não é limitada às formas de realizaçãoparticulares da invenção descritas abaixo, visto que variações das formas derealização particulares podem ser feitas e ainda caem dentro do escopo dasreivindicações anexas. Também deve ser entendido que a terminologiautilizada é com o propósito de descrever formas de realização particulares enão é intencionada a ser limitante. Ao invés, o escopo da presente invençãoserá estabelecido pelas reivindicações anexas.
Neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, asformas singulares "um," "uma" e "o", "a" incluem referências plurais amenos que o contexto claramente dite de outro modo.
Onde uma faixa de valores é fornecida, é entendido que cadavalor interposto, até o décimo da unidade do limite inferior a menos ocontexto claramente dite de outro modo, entre o limite superior e inferiordesta faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interposto em que a faixaestabelecida, é abrangida dentro da invenção. Os limites superiores einferiores destas faixas menores podem ser independentemente incluídos nasfaixas menores e também estão abrangidos dentro da invenção, sujeitos aqualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixaestabelecida inclui um ou ambos dos limites, faixas excluindo cada um ouambos daqueles limites incluídos também estão incluídos na invenção.
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicose científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmenteentendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual estainvenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiaissimilares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na práticaou teste da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos sãoagora descritos.
Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadaspor referência para o propósito de descrever e divulgar componentes queestão descrito nas publicações que seriam usadas em conexão com a invençãopresentemente descrita.
Como resumido acima, a invenção objeto fornece métodos ecomposições para produzir um extrato de proteína a partir de células fixas. Nadescrição da invenção em maiores detalhes, os métodos são descritos primeiroseguidos por uma descrição dos kits e sistemas para o uso na práticas dosmétodos objetos.
MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNA
Como mencionado acima, a invenção fornece um método paraproduzir um extrato de proteína a partir de células fixas. No geral, os métodosenvolvem duas etapas: a) contatar as células fixas com um reagente deextração tendo um pH que seja maior do que em torno do pH 10,0 paraproduzir uma composição intermediária e b) contatar a composiçãointermediária com um reagente de neutralização. O reagente de extração e/ouo reagente de neutralização contém um detergente não iônico. O extrato deproteína resultante contém um detergente não iônico e tem um pH que éneutro (isto é, entre cerca do pH 7,0 e cerca do pH 8,0). Os métodos no geralproduzem um extrato de proteína contendo proteínas que são facilmentedetectáveis usando agentes de captura para estas proteínas. Como tal, umextrato de proteína produzido pelos presentes métodos é no geral adequadopara o uso em ensaios de ligação, por exemplo, ensaios imunológicos, para adetecção destas proteínas.Em certas formas de realização os métodos podem incluir:aumentar o pH das células fixas a um pH pelo menos em torno do pH 10,0para produzir uma composição intermediária e depois, na presença de umdetergente não iônico, neutralizar o pH da composição intermediária paraproduzir o extrato de proteína. Visto que, como mencionado acima, odetergente não iônico pode estar presente no reagente de extração ou noreagente de neutralização (ou tanto no reagente de extração quanto noreagente de neutralização), certas formas de realização dos presentes métodosincluem: a) contatar células fixas com um reagente de extração para produziruma composição intermediária tendo um pH pelo menos em torno do pH10,0; e b) contatar a composição intermediária com um reagente deneutralização que compreenda um detergente não iônico; para neutralizar odito pH da composição intermediária e produzir o extrato de proteína. Emoutras formas de realização, o método pode incluir: a) contatar as células fixascom um reagente de extração que compreenda um detergente não iônico paraproduzir uma composição intermediária tendo um pH pelo menos em torno dopH 10,0; e, b) contatar a composição intermediária com um reagente deneutralização; para neutralizar o pH da composição intermediária e produzir oextrato de proteína.
Em certas formas de realização, o extrato de proteínaproduzido pelos presentes métodos pode conter mais proteína que sejaacessível aos agentes de captura do que um extrato de proteína fabricadousando outros métodos, por exemplo, métodos que não utilizam: uma etapa deextração de pH alto (isto é, uma etapa que aumenta o pH a mais do que emtorno do pH 10,0 ou pH 11,0), uma etapa de neutralização (isto é, uma etapaque aumente o pH até em torno do pH 7,0 até em torno do pH 8,0) e umdetergente não iônico. Nem o pH alto sozinho nem o detergente não iônicosozinho produzem um tal extrato de proteína. Em formas de realizaçãoparticulares, o reagente de extração de pH alto solubiliza proteínas nas célulasfixas, ao passo que o detergente não iônico impede as proteínas solubilizadasna composição intermediária de re-agregar ou precipitar conforme o pH dacomposição intermediária é neutralizado.
Os reagentes utilizados nos presentes métodos e o extrato deproteína produzido pelos presentes métodos são descritos em maiores detalhesabaixo, como é uma descrição de como os reagentes podem ser usados paraproduzir o extrato de proteína. Como será debatido abaixo, a concentração epH ideais dos reagentes usados nos presentes métodos podem variardependendo de quais reagentes são usados. Entretanto, a concentração e pHideais dos reagentes são facilmente determinados, experimental ouempiricamente.
As células a partir das quais a proteína é extraída usando-se o método dainvenção
A metodologia de acordo com a presente invenção pode serusada para extrair uma proteína alvo ou proteína de interesse de uma amostrade células. A amostra de células pode ser uma população homogênea decélulas ou uma mistura heterogênea de células de tipo diferente. A amostra decélula também pode conter "contaminantes" tais como muco, célulassangüíneas e células inflamatórias que não são de interesse para o propósitode extração da proteína alvo ou não contém a proteína alvo.
Em algumas formas de realização, a proteína alvo é umaproteína viral presente em células infectadas com um vírus, preferivelmenteum vírus patológico e as células são preferivelmente aquelas isoladas de ummamífero, por exemplo, um ser humano.
O vírus patogênico pode ser qualquer vírus patogênico quecausa efeitos patogênicos ou doença em seres humanos ou outros animais. Ovírus patogênico pode ser de várias cepas do vírus da imunodeficiênciahumana (HIV), tais como HIV-I e HIV-2. A proteína viral pode ser umaglicoproteína do HTV (ou antígeno de superfície) tal como HIV GP120 eGP41 ou uma proteína capsídica (ou proteína estrutural) tal como a proteínaP24 do HIV.
O vírus patogênico pode ser o vírus Ebola ou Marburg. Aproteína viral pode ser uma glicoproteína do Ebola ou antígeno de superfícietal como as proteínas GPl ou GP2 do Ebola.
O vírus patogênico pode ser o vírus da hepatite tal como osvírus hepatite A, B, C, D ou E. Por exemplo, a proteína viral pode ser umantígeno de superfície ou proteína de núcleo do vírus B da hepatite tal como oantígeno de superfície da hepatite B pequeno (SHBsAg) (também aludidocomo o antígeno australiano), o antígeno de superfície da hepatite B médio(MHBsAg) e o antígeno de superfície da hepatite B grande (LHBsAg). Oantígeno viral pode ser um antígeno de superfície ou proteína de núcleo dovírus da hepatite C tal como os antígenos NS3, NS4 e NS5.
O vírus patogênico pode ser um vírus sincicial respiratório(RSV). Por exemplo, a proteína viral do RSV pode ser a glicoproteína(proteína G) ou a proteína de fusão (proteína F) de RSV.
O vírus patogênico pode ser um vírus simplex do herpes(HSV) tal como HSV-I e HSV-2. Por exemplo, o antígeno viral do HSV podeser a glicoproteína D de HSV-2.
A proteína alvo pode ser um antígeno de tumor, tal como Her2de células do câncer mamário e CD20 em células de linfoma, um oncogeneviral tal como E6 e E7 do vírus do papiloma humano ou um oncogene celulartal como ras mutado.
Em algumas formas de realização, a amostra de células contêmcélulas fixas em que a proteína alvo está presente. As células fixas utilizadasnos presentes métodos são no geral obtidas depositando-se uma amostra decélulas (obtidas removendo-se as células de um paciente pela dissecação,esfoliação ou lavagem, por exemplo) em um meio líquido. A amostra decélulas pode ser depositada em um meio líquido que já contenha um fixadorquímico ou um fixador químico pode ser adicionado ao meio líquido depoisque as células tenham sido colocadas no meio. Um meio líquido contendo umfixador e as células fixas é aqui chamado uma "amostra celular".
Os fixadores químicos representativos que podem serutilizados nos presentes métodos incluem: álcoois (por exemplo, metanol ouetanol), aldeídos (por exemplo, glutaraldeído ou formaldeído) e cetonas (porexemplo, acetona), assim como tetróxido de ósmio, ácido acético, ácidopícrico e sais iônicos de metal pesado. Outros exemplos de fixadores quepodem ser utilizados nos presentes métodos incluem fixadores com base embissulfito (que também podem incluir ácido acético), fixadores com base emPVP (que também podem conter propileno glicol e metanol) assim comoaqueles descritos na Patente U.S. 3.546.334, 4.578.282, 4.857.300, 5.104.640,5.256.571, 5.432.056 e 5.196.182. Os exemplos de fixadores que podem serutilizados nos presentes métodos, incluindo as concentrações de trabalhodestes fixadores, podem ser encontrados em Baker, (Principies of BiologicalMicrotechnique: A Study of Fixation and Dyeing, 1959) e Williams ("Tissuepreparation for immunocytochemistry." J Clin. Pathol. 1997 50: 422).
De interesse particular nos presentes métodos são os meioslíquidos que são chamados de "meio de transporte" e rotineiramente usadospara a coleta, preservação (isto é, fixação) e transporte de célulascervicovaginais (por exemplo, células cervicais esfoliadas) como parte deuma examinação ginecológica. Os meios de transporte aprovados pelo FDAsão de interesse particular.
Os exemplos de meio de transporte comercialmentedisponíveis que podem ser utilizados incluem: meio de transportePRESERVCYT® com base em metanol (que é vendido como parte do kit deamostragem ginecológica THINPREP® da Cytyc, Inc., Marlborough, Mass.),meio de transporte SUREPΑΤΗ® com base em etanol formalmente conhecidocomo CYTORICH® (TriPath, Inc. Burlington, N.C.) e meio de transporteCYTOLYT® com base em metanol (Cytyc, Inc., Marlborough, Mass.) porexemplo.
As células podem ser obtidas por qualquer métodoconveniente, incluindo mas não limitado à esfoliação (por exemplo,raspagem), dissecação e lavagem. De interesse particular são as célulasepiteliais de origem cervical, células estas que são tipicamente obtidas pelosmétodos de esfoliação usando uma escova, espátula ou raspador adaptados edepositadas em um meio líquido contendo fixador.
Reagente de extração
O reagente de extração utilizado nos presentes métodoscontém componentes que estão presentes em quantidades suficientes emconcentração para produzir um extrato de proteína tendo um pH que seja pelomenos o pH 10,0, na adição do reagente de extração às células fixas.Conseqüentemente, o reagente de extração no geral tem um pH pelo menosem torno do pH 10,0.
O reagente de extração é contatado com as células fixas paraproduzir a composição intermediária. O pH do reagente de extração e acomposição intermediária resultante está no geral pelo menos em torno do pH10,0, por exemplo, na faixa em torno do pH 10,0 até em torno do pH 13,0 ouem torno do pH 11,0 até em torno do pH 12,0. Em certas formas derealização, o reagente de extração pode ter um pH em torno do pH 10,0 atéem torno do pH 10,5, pH 10,5 até em torno do pH 11,0, pH 11,0 até em tornodo pH 11,5, pH 11,5 até em torno do pH 12,0, pH 12,0 até em torno do pH12,5 ou pH 12,5 até em torno do pH 13,0. O reagente de extração pode serfabricado usando qualquer fonte adequada de íons hidróxido, por exemplo,hidróxido de sódio ou potássio ou carbonato de cálcio, por exemplo.
Em certas formas de realização, o reagente de extração podenão conter nenhuma quantidade significante de desnaturante. Entretanto, emoutras formas de realização, além de ter um pH de pelo menos 10,0, oreagente de extração também pode conter um desnaturante, por exemplo, umdetergente iônico tal como dodecil sulfato de sódio (SDS) ou sarkosyl ou umagente caotrópico tal como uréia. Nestas formas de realização, o desnaturante,se presente, pode estar presente em uma concentração que não diminuisignificantemente diminui a sensibilidade de ensaios futuros. A concentraçãode desnaturante, em certas formas de realização, pode ser diminuída durante oprocessamento da amostra, por exemplo, diluindo-se o desnaturante usandotampão de neutralização ou pela adição de um diluente, por exemplo, tampãoou água ao extrato de proteína antes do uso.
Dependendo da concentração do desnaturante usado e do pHdo tampão de extração, o desnaturante pode estar presente no tampão deextração a uma concentração de cerca de 0,01 Ma cerca de 0,05 M, de cercade 0,05 M a cerca de 0,1 M, de 0,1 M a cerca de 0,2 M, de cerca de 0,2 M acerca de 0,5 M, de cerca de 0,5 M a cerca de 1,0 M, de cerca de 1,0 M a cercade 2,0 M, de cerca de 2,0 M a cerca de 4,0 M ou de cerca de 4,0 M a cerca de8,0 Μ. O desnaturante, se presente no reagente de extração, pode estarpresente em uma concentração que esteja bem abaixo da concentração dedesnaturante tipicamente utilizada para desnaturar proteína. Em outraspalavras, o reagente de extração pode conter desnaturante a uma concentraçãoque permita a detecção de uma proteína usando um agente de captura paraesta proteína, depois produzindo um extrato de proteína de acordo com osmétodos objetos. A concentração de desnaturante utilizada é no geralsuficiente para produzir um extrato de proteína contendo proteínas que sãofacilmente detectáveis em um ensaio de ligação que utilize um agente decaptura, por exemplo, em um ensaio de detecção de anticorpo.
Os desnaturantes exemplares e as suas concentrações em umreagente de extração objeto: dodecil sulfato de sódio (SDS): de cerca de 0,01% a cerca de 2 %, por exemplo, 0,05 %, sarkosyl: de cerca de 0,01 % a cercade 5 %, por exemplo, 0,5 %, guanidina: de cerca de 0,1 Ma cerca de 6 M, porexemplo, cerca de 0,5 M e uréia: de cerca de 0,1 Ma cerca de 8 M, porexemplo, cerca de 0,5 M, peso/vol.>
SDS é tipicamente utilizado para desnaturar proteínas em umaconcentração de 0,1 % a 0,5 %, sarkosyl é tipicamente utilizado paradesnaturar proteínas em uma concentração de 2 % p/v, a uréia é tipicamenteutilizada para desnaturar proteínas em uma concentração de 2 M a 8 Μ, ocloridreto de guanidina é tipicamente utilizado para desnaturar proteínas emuma concentração de 3 M a 8 Μ, o cloreto de N-cetil trimetilamônio étipicamente utilizado para desnaturar proteínas em uma concentração de 5 %p/v e N-octilglicosídeo é tipicamente utilizado para desnaturar proteínas emuma concentração de 2 %, p/v (Ver Protein purification Handbook,Amersham Pharmacia Biotech, p. 71 (1999)).
Se nenhum desnaturante está presente em um reagente deextração, o reagente pode ter um pH pelo menos em torno do pH 11,0. Se oreagente de extração contém detergente, então o pH do reagente de extraçãopode ter um pH pelo menos em torno do pH 10,0.
Como será descrito em maiores detalhes abaixo, o reagente deextração, em certas formas de realização, também pode conter um detergentenão iônico.
Em certas formas de realização, o reagente de extração podeconter um tampão para manter o reagente em um pH desejado. Se um tampãoestá presente em um reagente de extração objeto, o tampão pode ter um pKana faixa de cerca de 9,0 a cerca de 12,5 a 25° C. os tampões exemplares quepodem ser utilizados em um reagente de extração de proteína objeto incluemCABS, piperidina, fosfato, CAPS, glicina ou etanolamina, por exemplo.Tampões que têm pouca ou nenhuma capacidade de tamponamento em umpH acima pH de cerca de 10,0 (por exemplo, tris, tricina, hepes, etc.) no geralnão são utilizados para tamponar o pH do reagente de extração, mas nãoobstante pode estar presente em um reagente de extração.O reagente de extrato de proteína objeto pode conter outroscomponentes por exemplo, queladores de íon salino, inibidores de protease,etc., além dos componentes declarados acima.
O reagente de extração de proteína pode ser uma composiçãolíquida ou sólida e, em certas formas de realização, pode conter umacombinação de desnaturantes diferentes.
Os desnaturantes que podem ser utilizados no presente tampãode extração são no geral desnaturantes fortes e incluem mas não são limitadosa: agentes caotrópicos (por exemplo, uréia, cloridreto de guanidina ou um salde tiocianato tal como tiocianato de sódio ou tiocianato de guanidínio, iodetode sódio, perclorato de sódio e outros; ver K. Hamaguchi et ai., Proc. Natl.Acad. Sei. 62: 1129-1136, 1962) e detergentes iônicos (por exemplo, dodecilsulfato de sódio (SDS), sarkosyl ou cloreto de N-cetil trimetilamônio),incluindo detergentes catiônicos, aniônicos e zwitteriônicos (tais comoCHAPS ou CHAPSO). Outros desnaturantes que podem ser utilizados nospresentes métodos são listados nas colunas 7 e 8 da patente U.S. 6.488.671,patente esta que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Em certas formas de realização, um desnaturante fraco talcomo LiCl, L1CIO4, LiBr, CaC^ ou NaCl não é utilizado como umdesnaturante no tampão de extração, embora um tal composto possa estarpresente em um tampão de extração ou extrato de proteína além de umdesnaturante listado no parágrafo anterior.
Como mencionado acima, o reagente de extração é contatadocom (por exemplo, combinado ou misturado com) células fixas. Em certasformas de realização, uma amostra celular contendo as células fixas (porexemplo, um meio de transporte contendo células fixas) pode ser diretamenteadicionado ao reagente de extração. Em outras formas de realização, ascélulas fixas podem ser isoladas da amostra celular (por exemplo, pormétodos de sedimentação, centrifugação, filtração ou afinidade), antes da suaadição ao reagente de extração de proteína. As células podem ser lavadas oucontatadas com outros reagentes antes da sua adição ao reagente de extração.
Todas ou uma porção das células fixas disponíveis podem sercombinadas com o reagente de extração. Por exemplo, em certas formas derealização, uma porção das células fixas pode ser utilizada em teste decitologia e uma porção das células fixas pode ser contatada com o reagente deextração para produzir a composição intermediária. As células fixas e oreagente de extração podem ser combinados e mantidos sob temperaturaadequada (por exemplo, em gelo, em torno da temperatura ambiente ou acerca de 37° C) e por um tempo adequado (por exemplo, de 10 segundos a 24horas) para produzir a composição intermediária. Em certas formas derealização, o reagente de neutralização é contatado com a composiçãointermediária imediatamente depois das células fixas terem sido contatadascom o reagente de extração.
Reagente de neutralização
O reagente de neutralização utilizado nos presentes métodostem um pH que é suficiente para neutralizar o pH da composiçãointermediária debatida acima, no contato com a composição intermediária.
Em outras palavras, o reagente de neutralização contém um detergente nãoiônico e tem um pH que é suficiente para neutralizar o pH da composiçãointermediária debatida acima quando o reagente de neutralização é misturadocom a composição intermediária. Como será descrito em maiores detalhesabaixo, o reagente de neutralização, em certas formas de realização, podeconter um detergente não iônico.
O pH do reagente de neutralização é suficiente para neutralizara composição intermediária fabricada contatando-se células fixas com umreagente de extração objeto. Dependendo do pH do reagente de extração e setampões são utilizados, o pH do reagente de neutralização pode estar entre opH 4,0 a pH 8,0. Em certas formas de realização, o reagente de neutralizaçãopode ter um pH em torno do pH 4,0 até em torno do pH 4,5, pH 4,5 até emtorno do pH 5,0, pH 5,0 até em torno do pH 5,5, pH 5,5 até em torno do pH6,0, pH 6,0 até em torno do pH 6,5, pH 6,5 até em torno do pH 7,0 ou pH 7,0até em torno do pH 7,5. O reagente de neutralização pode ser fabricadousando qualquer fonte adequada de íons hidrogênio, por exemplo, ácidoclorídrico ou ácido acético, por exemplo. Em certas formas de realização, oreagente de neutralização pode ter um pH menor do que o pH 4,0.
O reagente de neutralização pode ser tamponado ou nãotamponado. Se o reagente de neutralização é tamponado, então o reagente deneutralização pode ser tamponado usando qualquer tampão tendo um pKa decerca de 6 a cerca de 8, por exemplo, tris, hepes ou tricina, por exemplo.
Como mencionado acima, o reagente de extração e/ou oreagente de neutralização podem conter um detergente não iônico.
Em certas formas de realização, o detergente não iônicoutilizado pode ser nonidet P-40, n-octilglicosídeo, um detergente TRITON®tal como TRITON® X-100, octil β-tioglicopiranosídeo, um detergenteTWEEN® tal como TWEEN-20 ou NP-40). Dependendo da concentração dodetergente usado, o detergente pode estar presente no tampão de extração ouno tampão de neutralização a uma concentração de cerca de 0,01 Ma cerca de0,05 M, de cerca de 0,05 M a cerca de 0,1 M, de 0,1 Ma cerca de 0,2 M, decerca de 0,2 M a cerca de 0,5 M, de cerca de 0,5 M a cerca de 1,0 M, de cercade 1,0 M a cerca de 2,0 M, de cerca de 2,0 M a cerca de 4,0 M ou de cerca de4,0 M a cerca de 8,0 M. Outros detergentes que podem ser utilizados nospresentes métodos são listados nas colunas 7 e 8 da patente U.S. 6.488.671,patente esta que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Emcertas formas de realização, o detergente pode estar presente tanto no tampãode extração quanto no de neutralização.
Os detergentes exemplares e as suas concentrações em umreagente de neutralizar e/ou extração incluem: Triton X-100: de cerca de 0,1% a cerca de 10 %, por exemplo, cerca de 1 %, NP40: de cerca de 0,1 % acerca de 10 %, por exemplo, cerca de 1 % e Tween-20: de cerca de 0,1 % acerca de 10 %, por exemplo, cerca de 1 %, peso/vol.
Como mencionado acima, o reagente de neutralização écontatado com (por exemplo, combinado ou misturado com) a composiçãointermediária para produzir um extrato de proteína tendo um pH neutro (istoé, um pH na faixa em torno do pH 6,5 até em torno do pH 8,0, por exemplo,na faixa em torno do pH 7,0 e em torno do pH 7,8). O extrato de proteínacontém ainda proteína de células fixas, um detergente não iônico em umaconcentração listada acima e em certas formas de realização, um tampão paramanter o extrato de proteína em uma faixa de pH particular. Se umdesnaturante é adicionado às células fixas, o extrato de proteína pode conterainda este desnaturante. O pH, a escolha de detergente e a concentração dodetergente utilizado (e, se um desnaturante é utilizado, a identidade e aconcentração do desnaturante) são suficientes para permitir que o extrato deproteína seja diretamente utilizado em um ensaio de ligação para detectarproteínas presentes no extrato de proteína.
A neutralização do extrato de célula também pode serrealizada passando-se o extrato através de um filtro ou ponta de filtro queestejam impregnados com reagente de neutralização. Conforme o extratopassa através do material filtrante, o reagente de neutralização é solubilizado eo pH do extrato aproxima-se da neutralidade.
Um método alternativo para neutralizar o extrato de célula épassar o extrato através de uma coluna BioSpin (BioRad) pré-equilibrada comuma solução no pH neutro. O extrato também pode ser colocado em umaseringa ou aparelho similar que contenha gel (ou material de filtração)contendo neutralizador e liberado da seringa pela pressão positiva.
Em certas formas de realização, o extrato de proteína objetocontém proteína E6 do HPV solubilizada (particularmente proteína E6 decepas oncogênicas de HPV) que seja acessível e facilmente detectável por umagente de captura sem tratamento adicional do extrato de proteína (porexemplo, sem outra adição de desnaturante, mudanças de pH ouaquecimento). O extrato de proteína também pode conter membranassolubilizadas ou insolúveis, proteínas outras que não proteína E6 do HPV eoutros conteúdos celulares tais como DNA, RNA, carboidratos, etc. Outroscontaminantes tais como aqueles derivados da contaminação mucal daamostra celular original também podem estar presentes. Os componentes doextrato de proteína no geral não contém células integrais (isto é,citologicamente intactas).
O extrato de proteína pode ser usado imediatamente ouarmazenado, por exemplo, na forma congelada, antes do uso.
Em formas de realização particulares, os extratos de proteínaproduzidos pelos métodos apresentados acima podem ser utilizados emmétodos de detecção de proteína, métodos estes que são descritos em maioresdetalhes abaixo.
Como estaria evidente a partir do acima, uma variedade deconcentrações de desnaturantes, detergentes, tampões, pHs e componentesdiferentes pode ser utilizada nos reagentes descritos acima. A concentração dedesnaturante, detergente, tampão ou pH ou componente em qualquer reagenteé facilmente determinada usando métodos de rotina.
Depois da neutralização do extrato de célula, a proteína E6pode ser concentrada a partir do extrato de célula pela incubação com oextrato com as partículas contendo aglutinante para a E6. O aglutinante podecompreender PDZ, Proteína Associada com E6 (E6AP) ou fragmentos destesou Proteína de Ligação de E6 (E6BP) ou fragmentos desta. Depois que E6 écapturada pelas partículas, as partículas são lavadas e E6 é então liberado daspartículas pela incubação com tampão em pHs maiores do que 10. Aspartículas são separadas da solução de eluição e a solução remanescente édepois neutralizada pelos procedimentos anteriormente descritos.Alternativamente, a proteína E6 pode ser detectada sem a liberação daspartículas de captura.
MÉTODOS DE DETECÇÃO DE PROTEÍNA
O extrato de proteína fabricado pelos métodos debatidos acimapode ser utilizado direta ou indiretamente (isto é, depois da adição dereagentes adicionais) em um método em que a presença de uma ou maisproteínas no extrato de proteína é avaliada. Os métodos de detecção deproteína no geral envolvem um agente de captura que especificamente se ligaa uma proteína. A identidade das proteínas a serem detectadas pode ser deidentidade conhecida (isto é, pré-determinada) ou desconhecida no momentode executar o método.
As proteínas que podem ser detectadas usando os métodos dedetecção de proteína objetos incluem proteínas que são marcadores dediagnóstico para uma doença ou condição, por exemplo, câncer, doençainflamatórias ou infecção por vírus, bactérias ou fungos, por exemplo. Emcertas formas de realização, uma proteína detectada usando os métodosobjetos não é rotineiramente detectável a menos que os métodos de extraçãode proteína objetos sejam utilizados.
As proteínas exemplares que podem ser detectadas usando osmétodos presentes incluem proteínas que são codificadas por um agenteinfeccioso, tal como vírus do papiloma humano (HPV). Em formas derealização particulares, os métodos presentes podem ser utilizados paradetectar a proteína E6 do HPV, uma proteína que tem se mostrado difícil ouimpossível de se detectar em extratos de proteína fabricados a partir de célulasfixas por outros métodos.
Em termos gerais, os métodos de detecção de proteína sãomuito bem conhecidos na técnica e incluem ensaios de ligação, isto é, ensaiosem que a ligação entre uma proteína e um agente de captura para a proteína édetectada. Tais ensaios incluem imunoensaios, isto é, ensaios de ligação queutilizam um anticorpo que especificamente se liga a uma proteína, incluindo,mas não limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não competitivosusando técnicas tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaioimunoabsorvente ligado a enzima), imunoensaios "sanduíche", ensaios deimunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina de difusãoem gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixaçãode complemento, ensaios imunorradiométrico, imunoensaios fluorescentes, eimunoensaios de proteína A, para mencionar alguns. Tais ensaios são rotina ebem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al, eds, 1994,Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc.,Nova Iorque, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Osimunoensaios exemplares são resumidamente descritos abaixo.
Os protocolos de imunoprecipitação no geral envolvemproduzir um extrato de proteína, adicionar um agente de captura, porexemplo, um anticorpo, ao extrato de proteína e incubar o extrato de proteínae o agente de captura por um período adequado de tempo e temperatura. Oagente de captura é depois ligado a um suporte sólido, por exemplo, umsubstrato de afinidade tal como pérolas ligadas à proteína A e/ou proteína G ea mistura é incubada e lavada. O suporte sólido é recolocado em suspensãoem tampão de amostra e a proteína de interesse pode ser detectada pelawestern blotting, por exemplo.
ELISAs podem envolver preparar um extrato de proteína, ligaro extrato de proteína a um suporte sólido (por exemplo, um reservatório deuma placa microtituladora de reservatórios múltiplos), contatar o extrato deproteína ligado ao suporte com um agente de captura, por exemplo, umanticorpo e detectar a ligação entre o agente de captura e a proteína. Emcertos métodos de ELISA, o agente de captura pode ser detectavelmenterotulado com uma porção detectável tal como um substrato enzimático (porexemplo, rábano peroxidase ou fosfatase alcalina) antes de contatar o agentede captura com o extrato de proteína ligado ao suporte. Em outras formas derealização, entretanto, a ligação do agente de captura ao extrato de proteínapode ser detectada por um segundo agente de captura detectavelmente (porexemplo, um segundo anticorpo) que se ligue ao agente de captura contatadocom o extrato de proteína.
Em outros ensaios ELISA, o agente de captura pode ser ligadoa um suporte sólido e o extrato de proteína é contatado com o agente decaptura ligado ao suporte sólido. A ligação de uma proteína no extrato deproteína ao anticorpo do suporte sólido pode ser detectada usando umsegundo agente de captura para a proteína. Tais "ensaios sanduíche" são bemconhecidos na técnica.
Em outros ensaios, a ligação entre um agente de captura e aproteína pode ocorrer em solução antes da imobilização da superfície doagente de captura.
Em particular, os presentes métodos podem ser utilizados paradetectar a proteína E6 de cepas oncogênicas do HPV. Nestas formas derealização, o agente de captura utilizado no método de detecção pode ser, porexemplo, um anticorpo ou um polipeptídeo que compreendam um domínioPDZ que se liga a um ligando PDZ (isto é, um sítio de ligação para umdomínio PDZ) contido na proteína E6. Por exemplo, o método de ligação dedetecção de E6 presente pode utilizar uma proteína contendo o domínio PDZque contém o segundo PDZ de MAGI-I ou o domínio PDZ de DLG ou TIP1,etc, como descrito no pedido publicado US 20040018487 (publicado em 29de janeiro de 2004) e aqui incorporado por referência em sua totalidade. Asproteínas exemplares contendo o domínio PDZ e as seqüências do domínioPDZ são mostradas na TABELA 2 e no EXEMPLO 4 do pedido US20040018487. O termo "domínio PDZ" também abrange variantes (porexemplo, variantes que ocorrem naturalmente) das seqüências (por exemplo,variantes polimórfícas, variantes com substituições conservativas e outras) edomínios de espécies alternativas (por exemplo camundongo, rato).
Tipicamente, os domínios PDZ são substancialmente idênticos àquelesmostrados no pedido de patente U.S. Ser. Ns 09/724.553 que é aquiincorporado por referência, por exemplo, pelo menos cerca de 70 %, pelomenos cerca de 80 % ou pelo menos cerca de 90 % de identidade de resíduode aminoácido quando comparados e alinhados para a correspondênciamáxima, é avaliado na técnica que os domínios PDZ podem ser mutados paradar mudanças de aminoácido que podem fortalecer ou enfraquecer a ligação ealterar a especificidade, embora permaneçam domínios PDZ (Schneider et ai.,1998, Nat. Biotech. 17: 170-5). A menos de outro modo indicado, umareferência a um domínio PDZ particular (por exemplo um domínio MAGI-I2) é intencionada a abranger o domínio PDZ particular e as suas variantes deligação de E6 de HPV deste. Em outras palavras, se uma referência é feita aum domínio PDZ particular, uma referência também é feita às variantes destedomínio PDZ que liga a proteína E6 oncogênica do HPV, comodescrito abaixo. A este respeito é mencionado que a numeração dosdomínios PDZ em uma proteína pode mudar. Por exemplo, o domínio MAGI-12 (da seqüência de aminoácido PSELKGICFIHTKLRKSSRGEGFTWGGDEPDEFLQIKSLVLDGPAALDGKMETGDVIVS VNDTCVLGHTHAQWKIFQSIPIGAS'VDLELCRGYPLPFDPDDPN), como aqui dadocomo referência, pode ser dado como referência como MAGI-I domínio 1 emoutra literatura. Como tal, quando um domínio PDZ particular de umaproteína é dado como referência neste pedido, esta referência deve serentendida em vista da seqüência deste domínio, como aqui descrito,particularmente na listagem de seqüência da Tabela 2 do Pedido US20040018487, mostra a relação entre as seqüências da listagem de seqüência eos nomes e números de acesso do Genbank para vários domínios, ondeapropriado. Como aqui usado, o termo "proteína PDZ" refere-se a umaproteína que ocorre naturalmente contendo um domínio PDZ. As proteínasPDZ exemplares incluem CASK5 MPP1, DLGl, DLG2, PSD95, NeDLG5ΤΊΡ-33, SYNla5 ΊΊΡ-43, LDP5 LIM5 LIMKl5 LIMK2, MPP2, NOSl5 AF6,PTN-4, prELló, 41,8kD, KIAA0559, RGS12, KIAA0316, DVLl5 TIP-40,TIAMl5 MINTl5 MAGI-I5 MAGI-2, MAGI-3, KIAA0303, CBP5 MINT3,TIP-2, KIAA0561 e TIP-1. Como aqui usado, o termo "polipeptídeo dodomínio PDZ" refere-se a um polipeptídeo contendo um domínio PDZ5 talcomo uma proteína de fusão incluindo uma seqüência de domínio PDZ5 umaproteína PDZ que ocorre naturalmente ou um peptídeo do domínio PDZisolado. Um polipeptídeo do domínio PDZ portanto pode ter cerca de 60aminoácidos ou mais no comprimento, cerca de 70 aminoácidos ou mais nocomprimento, cerca de 80 aminoácidos ou mais no comprimento, cerca de 90aminoácidos ou mais no comprimento, cerca de 100 aminoácidos ou mais noComprimento5 cerca de 200 aminoácidos ou mais no comprimento, cerca de300 aminoácidos ou mais no comprimento, cerca de 500 aminoácidos ou maisno Comprimento5 cerca de 800 aminoácidos ou mais no comprimento, cercade 1000 aminoácidos ou mais no comprimento, usualmente até cerca de 2000aminoácidos ou mais no comprimento, cerca de 50 a 2000 aminoácidos nocomprimento, cerca de 50 a 1500 aminoácidos no comprimento, cerca de 50 a1000 aminoácidos no comprimento, cerca de 60 a 1000 aminoácidos noComprimento5 cerca de 70 a 1000 aminoácidos no comprimento. Os peptídeosdo domínio PDZ usualmente não têm mais do que cerca de 200 aminoácidos(por exemplo 50 a 200 aminoácidos, 60 a 180 aminoácidos, 80 a 120aminoácidos ou 90 a 110 aminoácidos) e codificam um domínio PDZ.
Os anticorpos adequados para detectar a proteína E6 do HPVsão descritos na 20050142541 (publicado em 30 de junho de 2005), porexemplo. Os métodos detalhados para identificar a proteína E6 de cepasoncogênicas do HPV são encontrados no pedido de patente U.S. publicadoUS20040018487, métodos estes que são aqui incorporados em sua totalidade.Estes métodos publicados são facilmente adaptados para aplicação nospresentes métodos.
Em certas formas de realização, um anticorpo anti-E6 pode serligado a um suporte sólido e um extrato de proteína produzido pelos métodosobjetos é contatado com o anticorpo ligado ao suporte sólido. A ligação daproteína E6 oncogênica no extrato de proteína pode ser detectada usando umaproteína contendo o domínio PDZ. Em outras formas de realização, umaproteína contendo o domínio PDZ pode ser ligado a um suporte sólido e umextrato de proteína produzido pelos métodos objetos é contatados com aproteína contendo o domínio PDZ ligada ao suporte sólido. A ligação deproteína E6 oncogênica no extrato de proteína pode ser detectado usando umanticorpo anti-E6. Em métodos alternativos, a ligação entre o anticorpo deproteína contendo o domínio PDZ pode ocorrer em solução (isto é, naausência da ligação do anticorpo ou proteína contendo o domínio PDZ a umsuporte sólido), e, depois da ligação, o anticorpo ou proteína contendo odomínio PDZ podem ser ligados a um suporte sólido (por exemplo, pérolas ousemelhante). Nestas formas de realização, a proteína contendo o domínio PDZpode ser uma proteína de fusão tendo um domínio de afinidade que liga aosuporte sólido. A presença da proteína E6 pode ser detectada usando umsegundo agente de captura que reconheça a proteína E6.
Os resultados obtidos dos métodos de ensaio descritos acimapodem ser comparados aos resultados obtidos de controles adequados, porexemplo, um controle positivo (em que um extrato de proteína conhecido porconter a proteína à qual o agente de captura se liga pode ser utilizado) ou umcontrole negativo (por exemplo, em que um reagente de extração de proteínaque não foi contatado com uma amostra celular pode ser utilizado).
Os resultados obtidos dos métodos de ensaio descritos acimapodem indicar a presença, ausência ou, em certas formas de realização, aquantidade de uma proteína em um extrato de proteína.Em certas formas de realização, os resultados obtidos dosmétodos de ensaio descritos acima podem ser comunicados de volta a umalocalização remota, por exemplo, por telefone, fax, e-mail, correio ouquaisquer outros meios. Os resultados podem ser comunicados ao paciente ouum médico do paciente, por exemplo.
Os métodos acima de detecção de proteína podem serrealizados em combinação com um teste diferente, tal como um testecitológico, por exemplo, um teste Pap para identificar células cervicaiscancerosas ou pré-cancerosas ou outros testes moleculares. Nestas formas derealização, a amostra celular pode ser dividida em partes antes do uso. Aprimeira parte pode ser usada em ensaios citológicos e a segunda parte podeser usada nos métodos descritos acima.
De acordo com o acima, certas formas de realização dainvenção também fornecem um sistema para produzir um extrato de proteína.
O sistema no geral contém: a) uma amostra celular contendo células fixas; b)um reagente de extração que tem um pH pelo menos em torno do pH 10,0; ec) um reagente de neutralização, onde as células fixas, reagente de extração eagente de neutralização podem ser utilizados nos métodos acima paraproduzir um extrato de proteína adequado para o uso em um ensaio deligação. O reagente de extração e/ou o reagente de neutralização contém umdetergente não iônico.
KITS
Já em um outro aspecto, a presente invenção fornece kits parapraticar os métodos objetos, por exemplo, para produzir um extrato deproteína a partir de células fixas, em certas formas de realização, para testarquanto a presença de uma proteína no extrato de proteína. Os kits objetosincluem pelo menos um reagente de extração que tenha um pH pelo menosem torno do pH 10,0 e um reagente de neutralização. O reagente de extraçãoe/ou o reagente de neutralização contém um detergente não iônico. Alémdisso, os kits podem incluir um agente de captura para a detecção de umaproteína, e, em certas formas de realização, reagentes (por exemplo, tampõese reagentes de detecção) para a detecção desta proteína usando o agente decaptura. Os componentes acima podem estar presentes em recipientesseparados ou um ou mais componentes podem ser combinados em um únicorecipiente, por exemplo, um frasco de vidro ou plástico.
Além dos componentes acima, os kits objetos podem incluirainda instruções para praticar os métodos objetos. Estas instruções podemestar presentes nos kits objetos em uma variedade de formas, uma ou mais dasquais podem estar presentes no kit. Uma forma em que estas instruçõespodem estar presentes é como informação impressa em um meio ou substratoadequados, por exemplo, um pedaço ou pedaços de papel nos quais ainformação é impressa, na embalagem do kit, em um inserto de embalagem,etc. Já um outro meio seria um meio legível por computador, por exemplo,disquete, CD, etc., no qual a informação foi gravada. Já um outro meio quepode estar presente é um endereço de sítio da web que pode ser usado porintermédio da Internet para acessar a informação em um sítio remoto.
Qualquer meio conveniente pode estar presente nos kits.
UTILIDADE
O método e sistema descritos acima são facilmente utilizadosem uma variedade de métodos de pesquisa e diagnóstico, incluindo métodosde diagnosticar uma doença ou condição ou infecção particulares por umagente infeccioso, tal como um vírus ou bactérias. Em uma forma derealização, o método é utilizado como parte de um diagnóstico para adetecção de células infectadas com o HPV. Visto que a presença de cepasoncogênicas de HPV está associada com células cancerosas e pré-cancerosas,os presentes métodos podem ser utilizados para detectar células cervicaiscancerosas ou pré-cancerosas.
O HPV é conhecido ser um agente causativo nas seguintesdoenças: epidermodisplasia verruciforme (EV), um distúrbio de pele de vidalonga que resulta em alto risco para o câncer de pele (por exemplo,escamocelular); neoplasias cervicais tais como neoplasia intraepitelialcervical (CIN) e carcinoma cervical invasivo (ICC); neoplasias viginais taiscomo neoplasia intraepitelial vaginal (VAIN) e carcinoma vaginal (VC);neoplasias vulvares tais como neoplasia intraepitelial vulvar (VIN) ecarcinoma vulvar; carcinoma peniano (incluindo papulose de Bowenoid);carcinomas anais (AC) e perianais (PC); carcinomas orofaríngeos (OS);carcinomas esofágicos (EC); canceres de pele não melanoma (por exemplo,carcinoma de célula basal-BCC e carcinoma de célula escamosa-SCC); emelanoma. Como tal, em uma forma de realização, os presentes métodospodem ser utilizados como um diagnóstico para qualquer uma destas doenças.
Em uma forma de realização, as células são obtidas (porexemplo, esfoliada ou dissecadas) de um paciente e depositadas em um meiolíquido contendo um fixador que, em certas formas de realização, pode ser ummeio de transporte para teste citológico. As células são usualmente obtidas noconsultório do médico ou clínica, a amostra celular é enviada e recebida poruma instalação de teste em que os métodos de detecção de proteína relatadosacima e, opcionalmente, ensaios de citologia são realizados. Os resultados doteste são comunicados ao paciente, em algumas formas de realização porintermédio do médico e um associado deste.
O paciente do qual as células são utilizadas pode ser ummamífero, por exemplo, um cão ou gato, um roedor (por exemplo,camundongo, porquinho da índia ou rato) ou primata (por exemplo, um serhumano, chimpanzé ou macaco). Em muitas formas de realização, o pacienteserá um ser humano, particularmente um do sexo masculino ou do sexofeminino. Em certas formas de realização, o paciente pode apresentarsintomas de infecção pelo HPV (por exemplo, pode ter verrugas em uma oumais partes do corpo), pode ser suspeito de estar infectado pelo HPV (porexemplo, pode conter células que estão citologicamente compatíveis com umatal infecção) ou pode já ter sido testado positivo para o HPV. Em certasformas de realização, o paciente pode não ter nenhuma indicação de infecçãopelo HPV e os métodos acima podem ser utilizados como parte de umatriagem de rotina.
Em uma forma de realização, os presentes métodos podem serutilizados para detectar qualquer cepa de HPV oncogênico, por exemplo,HPV 26, HPV 53, HPV 66, HPV 73, HPV 82, HPV 16, HPV 18, HPV 31,HPV 35, HPV 30, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 56, HPV 59,HPV 58, HPV 33, HPV 66, HPV 68 ou HPV 69, (particularmente qualqueruma da maioria das cepas do HPV predominantes, por exemplo, HPV 16,HPV 18, HPV 31, HPV 33 e HPV 45) pela detecção da proteína E6 destacepa. Em uma forma de realização, no ponto de iniciar os presentes métodos,não é conhecido se as células fixas contêm a proteína E6 oncogênica ou dequal cepa uma proteína E6 oncogênica é. Se um ensaio de detecção indica apresença de uma proteína E6 oncogênica em células fixas, então a identidadeda cepa de HPV que infectou estas células pode ser determinada por outrosensaios moleculares, por exemplo, aqueles que utilizam anticorpos específicosa uma proteína E6 particular ou outra proteína codificada pelo vírus ou peloseqüenciamento de DNA viral.
Os seguintes exemplos são oferecidos por via de ilustração enão por via de limitação.
EXPERIMENTAL
Extração de amostras clínicas bloqueadas
As células transfectadas com o gene E6 do HPV16 (C33A+)foram fixadas com meio THINPREP® e adicionadas (isto é, "bloqueadas") emporções das amostras clínicas fixadas com THINPREP® como listado abaixo.
As células foram bloqueadas em metade de cada uma das cinco amostrasclínicas (cada metade da amostra clínica tendo 20 milhões de células C33 A+).Esquema de Extração:
Células C33A(+) ThinPrep / 20 M de células por ml
1 a 20 M de células C33A(+) ThinPrep em 1/2 #229 negativoclínico (1,0 ml de extração)
2 a 20 M de células C33A(+) ThinPrep em 1/2 de #230negativo clínico (1,0 ml de extração)
3 a 20 M de células C33A(+) ThinPrep em 1/2 #231 negativoclínico (1,0 ml de extração)
4 a 20M de células C33A(+) ThinPrep em 1/2 #232 negativoclínico (1,0 ml de extração)
5 a 20 M de células C33A(+) ThinPrep em 1/2 #233 negativoclínico (1,0 ml de extração)
6 a 20 M de células C33A(+) ThinPrep (1,0 ml de extração)
Reagente de extração:
Triton X-100 / Lote 092K0171 - (1 % = 250 μΐ)5M de NaCl / Lote 5701-53 - (0,15M = 750 μΐ)0,5 M de Tris Base / Lote 5708-20 - (0,1 M = 5 ml)
0.5 M de Glicina / Lote 5708-9 - (0,1 M = 5 ml)10 % de SDS / Lote 5708-8 - (0,05 % = 125 μΐ)8 M de Uréia / Lote 5678-83 - (0,25 M = 781 μΐ)Adicionar RO/Dl a 20 ml - (8,1 ml)
NaOH 5 N / Lote A09522 - (525 μΐ)Adicionar RO/Dl a 25 ml - (4,475 ml)pH Final - 11,48
Formulação final: 0,1 M Tris /0,1 M de glicina / 0,15 M deNaCl / 1 % de Triton X-100 / 0,05 % de SDS / 0,25 M de uréia pH 11,48Procedimento de extração de proteína:
1. Adicionar a suspensão de célula a tubo de centrífuga de 50 ml2. Girar a 3000 rpm por 10 a 15 minutos
3. Cuidadosamente remover o sobrenadante
4. Transferir os conteúdos a um tubo nunc de 1,5 ml
5. Girar a 3000 rpm por 10 a 15 minutos
6. Cuidadosamente remover o sobrenadante
7. Adicionar a quantidade requerida de reagente de extração à pelota
8. Recolocar em suspensão para romper a pelota de célulaa. Aditivos (DTT @ 1:100)
9. Checar o pH, ajustar a 11,5
10. Misturar na temperatura ambiente (ou temperaturaapropriada para a extração) por 30 minutos
11. Girar a 14.000 rpm por 10 a 15 minutos
12. Remover o sobrenadante clarificado
13. Adicionar DTT @ 1:100
14. Neutralizar ao pH 8,0 com HCl 5 N e testar no ELISA(Neutralizar ao pH 8,0 com 31,0 μΐ de HCl 5 N / 1 ml)100 mM de DTT / NR 5701-90 / DOM 2/7/05
Método ELISA
1 - Revestir a placa (Nunc 439454 Maxisorp F96 / lote542043) com 5 μ^ηιΐ de GST-Magi-PDZ (lote 88,18 / 0,65 μ§/μ\) em PBS(lote 021405) - 100 μΐ por reservatório
11 ml χ 5 μ^πύ = 55 μg χ 1 μ1/0,65 μg = 84,6 μΐ de GST-Magi-PDZ
2 - Incubar durante a noite a 4o C
3 - Lavar 3x (TBS-Tween) com lavador de placa
4 - Bloquear a placa com 250 μΐ de tampão de bloqueio (lote033005)
5 - Incubar por 2 horas a 25° C6 - Lavar 3x (TBS-Tween) com lavador de placa
7 - Adicionar 100 μΐ de MBP-E6 / amostra de lisado aosreservatórios apropriados
8 - Incubar por 1 hora a 25° C
9 - Lavar 3x (TBS-Tween) com lavador de placa
10 - Adicionar 100 μΐ de anticorpo anti-E6 (4C6 - 2,85 mg/ml- lote 02) cerca de 5 μ§/ιη1 aos reservatórios apropriados em 2 % de tampãoBSA HNTG (lote 031805B). O peptídeo de terminal N (HPVI6E6 lote#PN3952-2) é adicionado às amostras apropriadas a 10 μ^ιηΐ para verificar aespecificidade de sinal (o peptídeo é pré-incubado com o anticorpo anti-E6por 45 minutos antes da adição).
11 - Incubar por 2 horas a 25° C
12 - Lavar 3x (TBS-Tween) com lavador de placa
13 - Preparar uma diluição 1:5000 de IgG-HRP anti-camundongo de cabra (Jackson GxM IgG-HRP / catálogo #115-035062 / lote60988) em 2 % de BSA / 0,05 % de tampão Tween 20 (lote 040505).
10,0 ml χ 1/5000 = 0,002 ml χ 1000 μΐ/ml = 2,0 μΐ de IgG-HRP anti-camundongo de cabra
14 - Adicionar 100 μΐ da diluição 1:5000 de IgG-HRP anti-camundongo de cabra aos reservatórios apropriados
(Remover o Substrato TMB e colocar na temperaturaambiente)
15 - Incubar por 1 hora a 25° C
16 - Lavar 5x (TBS-Tween) com lavador de placa
17 - Adicionar 100 μΐ de Substrato Neogen K-Blue TMB (lote041018)
18 - Incubar por 30 minutos a 25° C
19 - Adicionar 100 μΐ de Solução de Parada (lote 030705) eLer a A450Formulação:
2 % de BSA / 0,05 % de tampão Tween - (lote 040505)2 % de bloqueador BSA lote 033005 (49,975 ml)Tween 20 lote AO16759301 (0,025 ml)
Resultados
<table>table see original document page 39</column></row><table>
*Volume de Extração - 1 ml
Como pode ser observados a partir dos resultados mostradosna tabela acima, a ligação de E6 foi detectada para todas as amostra clínicasbloqueadas.
Está evidente que a partir dos resultados e debates acima queos métodos objetos fornecem várias vantagens distintas para a análisemolecular de células fixas. Em particular, os métodos fornecem um métodode rotina para a produção de um extrato de proteína a partir de células fixasem que as proteínas no extrato de proteína são detectáveis em ensaios deligação. Visto que no geral é difícil detectar certas proteínas em células fixas,a invenção objeto representa uma contribuição significante para a técnica.
Todas as publicações e pedidos de patente citados nesterelatório descritivo são aqui incorporados por referência como se cadapublicação ou pedido de patente individuais fossem específica eindividualmente indicados como sendo incorporado por referência. A citaçãode qualquer publicação é para esta divulgação anterior à data de depósito enão deve ser interpretada como uma admissão de que a presente invenção nãoé designada para preceder tal publicação em virtude da invenção anterior.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algunsdetalhes por via de ilustração e exemplo para propósitos de clareza deentendimento, está facilmente evidente àqueles de habilidade comum natécnica considerando-se as divulgações desta invenção que certas mudanças emodificações podem ser feitas a ela sem divergir do espírito ou escopo dasreivindicações anexas.
Claims (44)
1. Método para produzir um extrato de proteína a partir decélulas fixas, caracterizado pelo fato de que compreende:a) contatar as ditas células fixas com um reagente de extraçãopara produzir uma composição intermediária tendo um pH pelo menos emtorno do pH 10,0; eb) contatar a dita composição intermediária com um reagentede neutralização para neutralizar o dito pH da dita composição intermediária eproduzir o dito extrato de proteína,em que um ou ambos do dito reagente de extração e do ditoreagente de neutralização compreende um detergente não iônico.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende:a) contatar as ditas células fixas com um reagente de extraçãopara produzir uma composição intermediária tendo um pH pelo menos emtorno do pH 10,0; eb) contatar a dita composição intermediária com um reagentede neutralização que compreende um detergente não iônico;para neutralizar o dito pH da dita composição intermediária eproduzir o dito extrato de proteína.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende:a) contatar as ditas células fixas com um reagente de extraçãoque compreenda um detergente não iônico para produzir uma composiçãointermediária tendo um pH pelo menos em torno do pH 10,0; e,b) contatar a dita composição intermediária com um reagentede neutralização;para neutralizar o dito pH da dita composição intermediária eproduzir o dito extrato de proteína.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende ainda:receber uma amostra celular que compreenda as ditas célulasfixas antes da etapa a).
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as ditas células são células cervicais fixas.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as ditas células fixas estão presentes no meio de transporteSUREPATH®, CYTOLYT® ou PRESERVCYT®.
7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a dita amostra celular é recebida de uma localização remota.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito pH está na faixa em torno do pH 11,0 até cerca do pH 13.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito reagente de extração compreende um desnaturante.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o dito desnaturante é dodecil sulfato de sódio (SDS), uréia ousarkosyl.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o dito detergente não iônico compreende um detergenteTRITON® ou TWEEN®.
12. Método para detectar uma proteína, caracterizado pelo fatode que compreende:a) produzir um extrato de proteína a partir de células fixas deacordo com o método como definido na reivindicação 1; eb) testar quanto a presença da dita proteína no dito extrato deproteína.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o dito teste utiliza um agente de captura para a dita proteína.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o dito teste inclui um ensaio imunológico.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o dito ensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima(ELISA).
16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a dita proteína é uma proteína do papilomavírus humano(HPV).
17. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a dita proteína é uma proteína E6 do HPV.
18. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que as ditas células fixas são células cervicais esfoliadas.
19. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que as ditas células fixas são recebidas de uma localizaçãoremota antes da dita etapa de contato a).
20. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que compreende ainda:d) comunicar resultados do dito teste a uma localizaçãoremota.
21. Sistema para produzir um extrato de proteína,caracterizado pelo fato de que compreende:a) uma amostra celular que compreende células fixas;b) um reagente de extração que tem um pH pelo menos emtorno do pH 10,0, ec) um reagente de neutralização,em que um ou ambos do dito reagente de extração e do ditoreagente de neutralização compreende um detergente não iônico e onde o ditoreagente de extração e agente de neutralização podem ser utilizados nométodo como definido na reivindicação 1 para produzir um extrato deproteína adequada para o uso em um ensaio de ligação.
22. Sistema de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que compreende ainda reagentes para detectar uma proteína nodito extrato de proteína.
23. Kit para produzir um extrato de proteína a partir de célulasfixas, caracterizado pelo fato de que compreende:a) um reagente de extração que tem um pH pelo menos emtorno do pH 10,0,b) um reagente de neutralização; ec) instruções para realizar o método como definido nareivindicação 1 usando o dito reagente de extração e o dito reagente deneutralização;em que um ou ambos do dito reagente de extração e do ditoreagente de neutralização compreendem um detergente não iônico.
24. Kit de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelofato de que compreende ainda reagentes para detectar uma proteína no ditoextrato de proteína.
25. Kit de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de que os ditos reagentes incluem um agente de captura para a ditaproteína.
26. Kit de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato de que a dita proteína é a proteína E6 do HPV.
27. Método para extrair uma proteína viral alvo de umaamostra de célula, caracterizado pelo fato de que compreende:a) contatar uma amostra de célula contendo células em queuma proteína viral alvo está presente ou suspeita de estar presente com umreagente de extração para produzir uma composição intermediária tendo umpH pelo menos em torno do pH 10,0; eb) contatar a dita composição intermediária com um reagentede neutralização para neutralizar o dito pH da dita composição intermediária eproduzir um extrato da proteína viral alvo.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que um ou ambos do dito reagente de extração e do dito reagentede neutralização compreende um detergente não iônico.
29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que as células na amostra de célula são fixadas com um fixadorquímico.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o fixador químico é selecionado do grupo que consiste deálcoois, aldeídos, cetonas, tetróxido de ósmio, ácido acético, ácido pícrico,sais iônicos de metal pesado e propileno glicol.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o álcool é metanol ou etanol; o aldeído é glutaraldeído ouformaldeído; e a cetona é acetona.
32. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda:receber a amostra de célula que compreende células fixas antesda etapa a).
33. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a proteína viral é codificada por um vírus patogênico.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o vírus patogênico é selecionado do grupo que consiste doHIV, vírus Ebola, vírus Marburg, vírus da hepatite, vírus sincicial respiratório(RSV), vírus simplex do herpes (HSV), vírus do papiloma humano (HPV).
35. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a proteína viral é a proteína E6 ou E7 do HPV.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o HPV é a cepa 4, 11, 20, 24, 28, 36, 48, 50, 16, 18, 31, 35,- 30, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 58, 33, 66, 68, 69, 26, 53, 73 ou 82 do HPV.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o HPV é uma cepa do HPV oncogênica selecionada do grupoque consiste de HPV 26, HPV 53, HPV 66, HPV 73, HPV 82, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 35, HPV 30, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 56,HPV 59, HPV 58, HPV 33, HPV 66, HPV 68, HPV 69 e HPV 82.
38. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que compreende ainda:detectar a presença da proteína viral alvo no extrato.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que a detecção utiliza um agente de captura para a proteína viralalvo.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a proteína viral é a proteína E6 do HPV; e o agente decaptura é um anticorpo contra a proteína E6.
41. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a proteína viral é a proteíná E6 do HPV; e o agente decaptura compreende um polipeptídeo contendo um domínio PDZ.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que o domínio PDZ é o segundo domínio de MAGI-1, o domínioPDZde DLG ou TIP1.
43. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a amostra de célula contém ainda muco ou sangue.
44. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a amostra de célula contém células cervicais esfoliadas.
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