BRPI0805560B1 - processo de produção de um preparado enzimático para hidrólise de celulose de resíduos lignocelulósicos e sua aplicação na produção de etanol - Google Patents

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Abstract

processo de produção de um preparado enzimático para hidrólise de celulose de resíduos lignocelulósicos e sua aplicação na produção de etanol o processo da presente invenção baseia-se na produção microbiana de enzimas realizada a partir do crescimento do fungo penicilllum funiculosum em meio de cultivo adaptado com substrato celulósico. o processo da invenção compreende especialmente o tratamento fermentativo de um substrato lignocelulósico por meio de um fungo especialmente adaptado, visando à obtenção de um preparado enzimático capaz de hidrolisar a celulose e a hemicelulose para a produção de etanol.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICO PARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS E SUA APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DE ETANOL
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção trata da produção de um preparado enzimático a partir de processo microbiológico, capaz de hidrolisar as frações hemicelulósicas e celulósicas das fibras de resíduos lignocelulósicos provenientes de ambientes florestais e agroindustriais. O objetivo deste processo hidrolítico é gerar altas concentrações de açúcares do tipo glicose e significantes concentrações de xilose que podem ser fermentadas por microrganismos com o objetivo de produzir etanol. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O Brasil possui um excedente substancial de resíduos agroindustriais e agro-florestais sendo um dos maiores produtores de etanol e celulose do mundo. Por conseqüência, uma tecnologia que viabilize a produção de etanol a partir destes resíduos lignocelulósicos excedentes, além de contribuir para a solução de problemas ambientais, agregará valor a estes excedentes agroindustriais e agro-florestais, gerando vantagens econômicas para o país.
Para que se possa realizar o aproveitamento das frações polissacarídicas visando à produção de etanol é necessário hidrolisar estas frações eficientemente. O fracionamento desses polissacarídeos é efetuado através de um pré-tratamento, que consiste de uma reação conhecida como hidrólise ácida que objetiva a hidrólise da fração hemicelulósica. O sólido resultante desta etapa, rico na fração celulósica, ainda precisa ser tratado com o objetivo de remover a lígnina solúvel sob condições alcalinas para garantir a acessibilidade das enzimas à fibra celulósica. A conversão de celulose em etanol envolve dois passos fundamentais: hidrólise das longas cadeias das moléculas de celulose em açúcares (glicose) e fermentação desses açúcares em etanol. Na natureza, esses processos são encetados por fungos e bactérias, que secretam as enzimas capazes de hidrolisar a celulose (chamadas celulases), e principalmente por leveduras, quando se trata da fermentação dos açúcares em álcool. A maior dificuldade que precisa ser superada se refere ao próprio microrganismo, que precisa ser resistente às condições operacionais, principalmente no que tange às concentrações de inibidores gerados no meio reacional.
Atualmente, um dos grandes gargalos para a produção bioquímica de etanol de segunda geração é a obtenção de um preparado enzimático de baixo custo e que apresente uma boa eficiência de hidrólise de polissacarídeos como a celulose (cujo monômero é a glicose) e hemicelulose (heteropolímero cujo monômero principal é a xilose). A obtenção dessas enzimas vem sendo alvo de intensa pesquisa pelo mundo, com participação de grandes empresas (inclusive petroleiras) e órgãos governamentais, e é fundamental para o desenvolvimento de tecnologias denominadas "limpas".
Entretanto, os altos custos dessas enzimas inviabilizam sua grande aplicação em escala comercial e impedem a implementação de plantas industriais.
TÉCNICA RELACIONADA A produção de etanol por tecnologia biológica vem sendo estudada de há muito, porém nos últimos anos sofreu um grande impulso. O grande obstáculo a ser superado se refere â produtividade, ou seja, conseguir um processo economicamente viável e com bons rendimentos, utilizando matéria-prima com grande disponibilidade e baixo valor agregado. O documento de patente GB 2253633, que corresponde ao documento de patente brasileiro PI 9200100-9 de 15/01/92, descreve um processo para produzir etanol a partir de biomassa em que o substrato inclui um hidrolisado de celulose, hemicelulose e amido, visando produzir açúcares fermentáveis de seis carbonos. Para a fermentação é utilizada uma cepa de levedura geneticamente modificada (Brettanomyces custersii CBS 5512) que produz a enzima β-glucosidade, o que torna esta levedura com habilidade de fermentar tanto glicose quanto celobiose. No entanto, ainda permanece sem solução a fermentação de pentoses.
Torget e colaboradores (US 5,705,369) descrevem um processo genérico de pré-hidrolise de materiais lignocelulósicos em que são investigadas diferentes combinações de faixas de temperatura e de tempo de reação, visando obter melhor percentual de separação de hemicelulose e lignina da celulose.
Warzwoda e colaboradores (BR 0600409-1) descrevem um processo de produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas a partir de resíduos (madeiras de espécies folhosas e palhas de cereais). Tais resíduos são utilizados como fonte de carbono indutora para obtenção dessas enzimas, utilizando-se cepas de Trichoderma reesei geneticamente melhoradas e notadamente recombinadas. As cepas selvagens deste microorganismo têm a capacidade de secretar, em presença de um substrato indutor (a celulose, por exemplo), o complexo enzimático considerado o mais adaptado à hidrólise da celulose. Trata-se, portanto, de um processo para produção de enzimas celulolíticas e/ou hemicelulolíticas produzidas pela cepa especializada.
Santa Anna e colaboradores (BR 0505299-8) ensinam um processo para produção de etanol visando o tratamento do resíduo sólido resultante da hidrólise ácida de bagaço de cana. Segundo este processo um hidrolisado da fração hemicelulósica do bagaço de cana, rico em xilose, foi obtido por meio da hidrólise branda com ácido sulfúrico diluído, e fermentado utilizando-se uma cepa da levedura Pichia stipitis adequadamente aclimatada ao substrato principal do hidrolisado (xilose). O resíduo sólido resultante da hidrólise ácida (celulignina) foi tratado no próprio reator para remoção de lignina, através de uma série de lavagens alcalinas a fim de deixar as fibras celulósicas aptas a receberem uma carga enzimática.
Santa Anna e colaboradores (BR 0605017-4) descrevem um processo para obtenção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos por via enzimática segundo o qual a fração hemicelulósica é submetida a uma hidrólise branda com ácido sulfúrico, e o material sólido resultante desta hidrólise, submetido ao processo de sacarificação (hidrólise enzimática) simultânea à fermentação alcoólica rápida, em condições tais que permitam aumentar significativamente a conversão em etanol em tempos muito reduzidos, utilizando altas concentrações de sólidos (15% a 25 %).
Chung e Day (WO 2008/095098) apresentam um processo para obtenção de açúcares a partir de biomassa lignocelulósica no qual se faz um pré-tratamento alcalino a quente do material com uma mistura de hidróxido de cálcio e água à temperatura de 80°C a 140°C durante cerca de 30 min a 3 horas. Após o tratamento, o bagaço é prensado; o líquido contém principalmente componentes solúveis de lignina, além de cal (que pode ser recuperada) e o material sólido fibroso é submetido à hidrólise por enzimas celulásicas. Segundo os autores, este tratamento modifica a estrutura lignocelulósica de modo que possa ser rapidamente solubilizada pela celulase, mesmo usando altos teores de sólidos (10% a 30%), sem que a atividade enzimática seja afetada. Foram utilizadas enzimas comerciais, como por exemplo, Spezyme CP (Genecor International Co) e Novo I88 (Novozyme). O objetivo do processo da presente invenção é oferecer um preparado enzimático contendo enzimas preparadas in situ (ou dedicadas) de baixo custo, capaz de viabilizar economicamente o escalonamento da tecnologia bioquímica para aplicação em processos de obtenção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos. O preparado obtido pode ser aplicado ao sólido gerado após a hidrólise da fração hemicelulósica e também a processos de fermentação que utilizam sacarificação simultânea (SSF), como os mencionados acima.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO O processo da presente invenção baseia-se na produção microbiana de enzimas realizada a partir do crescimento do fungo em meio de cultivo adaptado com substrato celulósico. A invenção tem por objetivo a produção das enzimas celulásicas por via fermentativa utilizando o fungo Penicillium funiculosum, na qual podem ser usados substratos sintéticos (como o avicel ou carboximetilcelulose -CMC), ou ainda os próprios resíduos lignocelulósico e agroflorestais, in natura ou pré-tratados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O processo da presente invenção compreende especialmente o tratamento fermentativo de substratos lignocelulósicos e agro florestais por meio de um fungo especialmente adaptado, visando à obtenção de um preparado enzimático capaz de hidrolisar a celulose e a hemicelulose para a produção de álcool. A invenção fundamenta-se na produção das enzimas celulásicas por via fermentativa utilizando o fungo Penicillium funiculosum ATCC 11797, podendo ser usados substratos sintéticos, ou os próprios resíduos lignocelulósicos e agros florestais, in natura ou pré-tratados. A etapa seguinte do processo compreende a concentração das enzimas produzidas na fermentação, utilizando sistemas de membrana -como um sistema combinado de microfiltração e ultrafiltração, ou por evaporação - por exemplo, rotaevaporador. Finalmente, adiciona-se a este concentrado de enzimas um aditivo, de maneira a melhorar a atuação das enzimas na quebra da celulose. Este aditivo compreende um biotensoativo do tipo glicolipídeo que promove o aumento da acessibilidade das enzimas à celulose e hemicelulose.
Para melhor compreensão do invento, o processo pode ser descrito resumidamente da seguinte maneira: O fungo é colocado em contato com o substrato celulósico em um meio de cultivo adaptado por um período de quatro a sete dias, para que as enzimas sejam produzidas. Durante este tempo, o microrganismo libera para o meio de cultivo altas concentrações de proteínas com propriedades catalíticas, ou seja, enzimas celulásicas e hemicelulásicas, tais como xilanases, endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidases, com a finalidade de quebrar as frações celulósicas e hemicelulósicas presentes no substrato. Após este período, o meio de cultivo contendo as enzimas é submetido a um processo de concentração pelo uso de membranas ou processos evaporativos, seguido de aditivação. O preparado enzimático (extrato) foi produzido com materiais residuais da produção convencional de etanol, como por exemplo, bagaço e palha de cana-de-açúcar, apresentando baixo custo de produção, permitindo que seja produzido in situ, tornando viável o escalonamento da produção de etanol de segunda geração.
Também pode ser utilizado como fonte de lignocelulose material agro florestal, como por exemplo, cavacos e resíduos da indústria de papel e celulose.
Os Exemplos que se seguem são apresentados a título de ilustração apenas, não representando, todavia, qualquer tipo de limitação ao invento. EXEMPLO 1 Neste Exemplo pretende-se demonstrar a potencialidade de utilização do processo agora proposto para a obtenção do preparado enzimático.
Utilizando o processo da invenção conforme descrito em detalhe anteriormente, foi possível produzir um extrato com altas concentrações de enzimas celulásicas, expressas em atividades enzimáticas (Ul/L) e concentrações protéicas (mg/L). A Tabela 1 a seguir apresenta o resultado da medida de atividade enzimática dos extratos ao final da fermentação e depois da concentração.
Esses extratos enzimáticos concentrados foram testados no processo de hidrólise (sacarificação) da celulose e hemicelulose contidas no bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, ou seja, submetido à hidrólise branda e lavagens com aquecimento para remoção da lignina, e os resultados estão na Tabela 2. A medida dos açúcares (glicose, xilose e celobiose) foi avaliada pelos métodos de cromatografia líquida (HPLC) e medida espectrofotométrica de açúcares redutores totais (ART). Nesta tabela, também são apresentados, a título de comparação, resultados obtidos com um preparado comercial (GENENCOR®), normalizada na mesma concentração enzimática por grama de celulose. A Tabela 2 apresenta as quantidades de glicose, proveniente da hidrólise da celulose. Observa-se também que, no extrato concentrado da invenção, há enzimas xilanásicas que podem converter a hemicelulose em xilose, que também poderá ser aproveitada para conversão a etanol. Isto comprova que o extrato enzimático produzido poder ser aplicado em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) e sacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF). EXEMPLO 2 Este Exemplo tem por objetivo demonstrar a aplicabilidade do preparado enzimático, objeto da presente invenção, na hidrólise de resíduo lignocelulósico pré-tratado por hidrólise branda e lavagens com aquecimento para remoção da lignina, proveniente da produção convencional de etanol de cana-de-açúcar. O preparado enzimático foi aplicado em concentrações entre 5 e 30 FPU/g, em temperaturas entre 30°C e 60°C, durante 6 a 48 horas de sacarificação. A concentração de glicose liberada após o tratamento variou de 10 a 40 g/L).
Os resultados alcançados nos permitem afirmar ser esta uma grande vantagem do extrato produzido pelo processo da invenção, por P. funiculosum, em relação ao preparado comercial avaliado, pois sinaliza que esse pool enzimático produzido pode ser aplicado em processos de sacarificação e co-fermentação simultâneas, que é uma forma de condução mais integrada e menos complexa em termos de equipamentos.
Outra vantagem do extrato de P. funiculosum é a elevada atividade β-glucosidásica, que permite a conversão de todo o dissacarídeo celobiose gerado em glicose (açúcar fermentável), enquanto que com o produto comercial permanece uma quantidade residual de celobiose, um dissacarídeo que não pode ser aproveitado para obtenção de etanol, no processo fermentativo.
Outra vantagem observada é a ação sinérgica das enzimas deste preparado, na hidrólise da celulose e hemicelulose quebrando esses polissacarídeos a monômeros de açúcares, e não gerando açúcares intermediários residuais não fermentáveis, que não são aproveitados para a produção de etanol.
Além disso, foi produzido a partir de resíduos agroindustriais ou agros florestais abundantes no Brasil, e aplicado in situ na hidrólise desses mesmos resíduos, inclusive resíduos com composições distintas, obtendo-se produtividade superior ou similar àquela resultante de produtos comerciais.
Outra grande vantagem desta invenção esta relacionada ao alto custo das enzimas celulásicas oferecidas no mercado, fato que até então eram impeditivos ao escalonamento da tecnologia bioquímica de conversão de materiais celulósicos para etanol. Esta invenção possibilita a produção destas enzimas “in situ” ou dedicadas, reduzindo fortemente o custo de produção das mesmas.
REIVINDICAÇÕES

Claims (6)

1- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICO PARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESlDUOS LIG NOCELULÓSICOS, caracterizado por compreender as etapas de: - colocar o fungo da cepa Penicillium funiculosum ATCC 11797 em contato com um substrato celulósico em um meio de cultivo adaptado por um período de quatro a sete dias, para que enzimas celulásicas e hemicelulásicas, tais como xilanases, endoglucanases, exoglucanases e p-glucosidases sejam produzidas; - submeter o meio de cultivo contendo as enzimas a um processo de concentração pelo uso de membranas ou processos evaporativos e aditivação; - aplicar o extrato enzimático produzido em processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), com hidrólise do resíduo lignocelulósico em açúcares fermentáveis e a sua fermentação de forma a gerar álcool.
2- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICO PARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOS LIG NOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material lignocelulósico compreender o bagaço de cana-de-açúcar in natura ou pré-tratado, submetido à hidrólise branda e lavagens com aquecimento para remoção da lignina; e por o material agro florestal compreender cavacos e resíduos da indústria de papel.
3- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICO PARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o extrato enzimático produzido poder ser aplicado na hidrólise da celulose e hemicelulose quebrando esses polissacarídeos a monômeros de açúcares, e não gerando celobiose.
4- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICO PARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS» de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o preparado enzimático ser produzido in situ, com materiais residuais da produção convencional de etanol de cana-de-açúcar.
5- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM PREPARADO ENZIMÁTICO PARA HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o aditivo utilizado ser um biotensoativo do tipo glicolipídeo que promove o aumento da acessibilidade das enzimas à celulose e hemicelulose,
6- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL POR HIDRÓLISE DE CELULOSE DE RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS, caracterizado oor utilizar o preparado enzimático produzido in situ de acordo com a reivindicação 1, com materiais residuais in natura e pré-tratados da produção convencional de etanol de cana-de-açúcar, tais como bagaço e palha, e cavacos e materiais residuais da indústria de papel e celulose.
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