BRPI0805601A2 - peptÍdeos ligantes a imunoglobulinas g presentes no soro de pacientes com neurocisticercose - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao uso da técnica de Phage Display para a seleção, caracterização e utilização de novos peptídeos recombinantes e motivos protéicos que tenham interações com proteínas sorológicas (Imunoglobulinas G) específicas á neurocisticercose. Foram selecionados peptídeos ligantes a lgG de amostras de soro de pacientes portadores da doença. Os peptídeos ligam especificamente a lgG dos pacientes com NC resultando em um diagnóstico preciso, obtido de forma prática. Devido à capacidade de ligação em proteínas sorológicas especificas á doença, esses peptídeos podem ser potencialmente utilizados em Kits de imunodiagnóstico.

Description

"PEPTIDEOS LIGANTES A IMUNOGLOBULINAS G PRESENTES NOSORO DE PACIENTES COM NEUROCISTICERCOSE"

A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização depeptídeos recombinantes e motivos protéicos que se ligam a ImunoglobulinasG (IgG) presentes no soro de pacientes com neurocisticercose (NC). Ospeptídeos foram especificamente imunorreativos com o soro de pacientes comNC e podem ser potencialmente usados em imunodiagnóstico ou emcomposições vacinais para o controle da doença.

Na cisticercose humana o homem é hospedeiro intermediário acidentalde T. solium, quando ingere ovos viáveis do parasito. A forma larvária podeatingir os mais variados tecidos, incluindo a musculatura esquelética ecardíaca, olhos, tecido subcutâneo, cavidade oral e o sistema nervoso central(SNC) (PUSHKER N, BAJAJ MS, BALASUBRAMANYA R. Disseminatedcysticercosis involving orbit, brain and subcutaneous tissue. Journal ofInfection, 51:245-248, 2005).

A neurocisticercose, patologia resultante da presença dosmetacestódeos de Taenia solium no sistema nervoso central (SNC) constitui aforma mais grave da cisticercose, sendo a principal causa de epilepsia nospaíses em desenvolvimento (PATEL R, JHA S, YADAV RK. Pleomorphism ofthe clinicai manifestations of neurocysticercosis. Transactions of the RoyalSociety of Tropical Medicine and Hygiene, 100:134-141, 2006), e tem sidoobservada em associação á outras doenças e também á tumores (NIIZUMA K.et al., Malignant transformation of high-grade astrocytoma associated withneurocysticercosis in a patient with Turcot syndrome. Journal of ClinicaiNeuroscience, 14:53-55, 2007), além de casos raros com quadros deparkinsonismo (LÓPEZ IC. et al. Parkinsonismo sensible a Ievodopa enneurocisticercosis, Neurologia, 23:3-5, 2008).

O complexo teníase-cisticercose constitui uma zoonose fonte depreocupação para profissionais da área de saúde humana e animal, no entantonão há um programa de controle efetivo por parte dos órgãos governamentais.Este complexo está relacionado com fatores extrínsecos como temperaturaambiente, umidade e agentes dispersores dos ovos; fatores intrínsecos comopotencial biótipo do parasito e imunidade natural e adquirida dos hospedeiros,além de fatores socioeconômicos como práticas de criação de suínos,comportamentos alimentares dos hospedeiros, legislação, fiscalização e nívelde educação sanitária da população (SUDEWI AAR. et al. Taenia soliumcysticercosis in Bali, Indonésia: serology and mtDNA analysis. Transactions ofthe Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 102:96-98, 2008).

Os mecanismos de transmissão da cisticercose homem-suíno, homem-homem têm como fator primordial às condições sócio-econômicas e culturaisdo ser humano, uma vez que este é o único hospedeiro definitivo da teníase,não existindo reservatórios silvestres. Dentre essas condições destacam-se assanitárias como falta de higiene pessoal e de saneamento básico, comcontaminação da água e de alimentos com ovos do parasito provenientes deindivíduos infectados pela forma adulta do parasito (GARCIA HH. et al..Seroincidence of porcine T. solium infection in the Peruvian highlands.Preventive Veterinary Medicine, 57:227-236, 2003). Outro fator importante paramanter a endemia de cisticercose numa dada região geográfica é o sistemaprimitivo de criação de suínos, pois permite o contato destes animais com fezeshumanas mantendo o ciclo de vida de T. solium. Esse fator, aliado ao hábito deingestão de carne suína mal-cozida (cozimento ideal é por 30 minutos a 77°C),aumenta a prevalência da teníase estritamente relacionada com a cisticercose(SCIUTTO E. et al. Taenia solium disease in humns and pigs: na ancientparasitosis disease rooted in developing countries and emergirng as majorhealth problem of global dimensions. Microbes and Infection, 2:1875-1890,2000).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o complexo teníase-cisticercose acomete 50.000.000 de indivíduos em todo mundo, estima-se que,anualmente, 50 milhões de pessoas são infectadas pela cisticercose no mundoprovocando aproximadamente 50.000 óbitos anualmente. O gasto estimadocom o tratamento das complicações da doença no Brasil é deaproximadamente US$85 milhões (PAL DK1 CARPIO A, SANDER JW.Neurocysticercosis and epilepsy in developing countries. Journal of Neurology,Neurosurgery and Psyehiatry1 68:137-143, 2000).

Na América Latina, calcula-se que a taxa de prevalência de NC e lesõesoculares é de 100 e 30 casos por 100.000 habitantes, respectivamente,atingindo cerca de 350.000 pessoas (PINTO PSA. et al. Cysticercosisoccurrence and sanitary risks in groups of inspected and non-inspected swinein Brazil. Parasitologia Latinoamericana, 57:129-133, 2002). A enfermidade foiencontrada em 17 países latino-americanos, com maiores taxas de morbidadeno Brasil, Chile, Peru, El Salvador, Guatemala e México, tendo maiorfreqüência em áreas rurais (PFUETZENREITER MP, ÁVILA-PIRES FD.Epidemiologia da teníase/cisticercose por Taenia solium e Taenia saginata.Ciência Rural, 30:541-548, 2000).

A cisticercose acomete milhares de indivíduos nos países menosdesenvolvidos (MEDINA MT. et al. Prevalence, incidence and etiology ofepilepsies in rural Honduras: the Salama Study. Epilepsia, 46:124-131, 2005) eem paises desenvolvidos com alta taxa de imigração de áreas endêmicas(SIKASUNGE CS. et al. Risk factors associated with porcine cysticercosis inselected districts of Eastern and Southern provinces of Zambia. VeterinaryParasitolology, 143:59-66, 2007), emergindo como um sério problema naagricultura e na saúde pública em vários países (WILLINGHAM AL, ENGELSD. Control of Taenia solium Cysticercosis/Teniosis. Advances in Parasitology,61:509-566, 2006).

No Brasil, a neurocisticercose é encontrada com elevada freqüência nosEstados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná e Goiás sendo o gênero femininomais acometido (BENEDETI MR. et al. Perfil clínico-epidemiológico depacientes com Neurocisticercose atendidos no hospital universitário regional demaringá, Paraná, Brasil, Arquivos de Neuropsiquiatria, 65:124-129, 2007). Aprevalência populacional, contudo, não é conhecida pela ausência denotificação da doença (TAKAYANAGUI OM1 LEITE JP. Neurocisticercose.Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 34:283-290, 2001).Incidência de cisticercose em estudos soroepidemiológicos de acordocom levantamento realizado, não considerando as comunidades indígenas,varia de 0,68 -6,2%, sendo mais freqüente em hospitais psiquiátricos (38,5%)que na população geral estudada (0,8% em crianças e 2,3% em adultos). Emcomunidades indígenas, a incidência de cisticercose é 29,4% (AGAPEJEV S.Aspectos clínico-epidemiológicos da neurocisticercose no Brasil. Arquivos deNeuro-psiquiatria, 61:822-828, 2003).

Não considerando as diferenças regionais, a incidência de NC nosdiversos serviços de Neurologia e Neurocirurgia do Brasil, incluindo oshospitais gerais, varia de 0,03 a 13,4% nos estudos clínicos, e de 0,12 a 9%em necropsias. Exclusivamente nos hospitais gerais, a freqüência observadade NC é 1,94 ± 2,03%, mostrando o menor valor (0,19%) no estado de SãoPaulo e o maior (4,8%) no estado do Paraná. Em hospitais psiquiátricos doestado de Minas Gerais, a freqüência de NC corresponde a 12,2% (AGAPEJEVS. Aspectos clínico-epidemiológicos da neurocisticercose no Brasil. Arquivos deNeuro-psiquiatria, 61:822-828, 2003).

A incidência da NC tem sido considerada baixa no nordeste brasileiro,sendo freqüente nos Estados do Sul, Sudeste e Centro-Oeste do país, essefato pode ser justificado pela falta de diagnóstico, visto que sob o ponto de vistaclínico as manifestações não são características (PFUETZENREITER MP,ÁVILA-PIRES FD. Epidemiologia da teníase/cisticercose por Taenia solium eTaenia saginata. Ciência Rural, 30:541-548, 2000).

Na região Centro-Oeste, em um estudo soro-epidemiológico,demonstraram a endemicidade (11,3%) da cisticercose humana na cidade deCatalão - Goiás, localizada a 100Km de Uberlândia (OLIVEIRA, Η. B. et al.Anti-Taenia solium metacestode IgG antibodies in serum samples frominhabitants of a Central-Western region of Brazil. Revista do Instituto deMedicina Tropical de São Paulo, 48: 49-52, 2006).

Em pesquisa para detectar anticorpos IgG anti-metacestódeo de T.solium em doadores de sangue do Hemocentro Regional de Uberlândia, umtotal de 1133 amostras de soro foram analisadas pelo teste deimunofluorescência indireta e o ELISA no Laboratório de Cisticercose daUniversidade Federal de Uberlândia. A soropositividade foi de 5,6%, mostrandodiferenças de acordo com suas cidades de origens: Araguari (13,5%),Tupaciguara (5,0%), Monte Alegre de Minas (4,8%) e Uberlândia (4,7%)(SILVEIRA-LACERDA EP. et al. Anti-Taenia solium metacestodes antibodies inserum from blood donors from four cities of Triângulo Mineiro area, MinasGerais, Brazil, 1995. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo,44: 229-231, 2002), demonstrando assim a endemicidade da cisticercose napopulação amostrada e a problemática do complexo teníase-cisticercose naregião.

A forma metacestódea pode persistir por longos períodos, em muitoscasos por anos, através das ações de seus produtos de excreção e secreção,que modulam a resposta imune do hospedeiro sem licitar uma reaçãoinflamatória, a ausência ou redução da inflamação é resultado da secração deserina proteases, que inibem a ativação do complemento, a ativação delinfócitos e a produção de citocinas, com destaque para as interleucinas (IL) IL-2, IL-5 e IL10 (WANG IC. et al.. Suppression of host Th1-type granulomatousinflammation by Taenia solium metacestodes is related to down-regulation ofosteopontin gene expression. International Journal for Parasitology, 38:239-248,2008).

Em contraste, a resposta inflamatória ao redor de um ou maismetacestódeos degenerados pode principiar uma doença sintomática, atravésda proliferação de linfócitos e posterior diferenciação em células efetoras tipoTh1 e Th2, com subsequente produção de várias citocinas, ou de célulasplasmáticas, com conseqüente produção de anticorpos específicos. Há umequilíbrio parasito - hospedeiro que é mantido como resultado da habilidade doparasito sobreviver no hospedeiro por longos períodos (SCIUTTO E. et al. Theimmune response in Taenia solium cysticercosis: protection and injury, ParasiteImmunology, 29:621-636, 2007).

A patologia, a clínica e a resposta imunológica ao parasito estãorelacionadas e dependem tanto da localização, do número, do tamanho e dafase de desenvolvimento em que se encontram os cisticercos, como da reaçãodos tecidos parasitados (DEL BRUTTO OH. Neurocysticercosis. Seminars inNeurology, 25:243- 251, 2005).

A severidade dos sintomas desta doença são geralmente associadoscom a resposta inflamatória crônica, sugerida pela persistência do antígeno,que também podem ser influenciada por glicoconjugados expressos pelosmetacestódeos de T. solium (ALVAREZ Jl, RIVERA J, TEALE JM. Differentialrelease and phagocytosis of tegument glycoconjugates in neurocysticercosis:implications for immune evasion strategies. Plos Neglected Tropical Diseases,2:1-12,2008).

O conhecimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na relaçãoparasita-hospedeiro tem auxiliado na compreensão da patogenia destaparasitose humana. Por conseqüência, esse conhecimento tem colaborado nodesenvolvimento de testes imunológicos para o diagnóstico laboratorial destadoença (VAZ AJ. Diagnóstico imunológico das parasitoses. In: DE CARLI GA.(Ed). Parasitologia Clínica: seleção de métodos e técnicas de laboratório dasparasitoses humanas. São Paulo: Atheneu, 2001, p.505-539).

O diagnóstico da neurocisticercose é baseado na combinação de dadosclínicos, epidemiológicos, radiológicos e sorológicos (HAWK MW. et al.Neurocysticercosis: a review. Surgical Neurology, 63:123-132, 2005).Ressonância Magnética (RM) e/ ou Tomografia Computadorizada (TC) são asferramentas de diagnóstico mais sensíveis e específicas. Entretanto, devido aseu alto custo e disponibilidade restrita, eles podem ser limitados ao uso nospaíses em desenvolvimento e com altas taxas de infecção.

O critério padrão ou absoluto para o diagnóstico de NC inclui (i)demonstração histológica do parasito em biópsia ou material de operação, (ii)evidência de lesões císticas mostrando o escólex em TomografiaComputadorizada ou Ressonância Magnética e (iii) visualização fundoscópicado parasito em casos de NC intraocular (DEL BRUTTO OH. et al. Proposal ofdiagnostic criteria for human cysticercosis and neurocysticercosis. Journal ofthe Neurological Sciences, 142:1-6, 1996).O diagnóstico clínico da cisticercose é difícil de ser realizado empacientes assintomáticos, estando associado nos sintomáticos, à alteraçõesfisiológicas provocadas pela localização das formas metacestódeas. No casoda NC nem sempre é fácil, devido ao polimorfismo das manifestaçõesneurológicas, comuns a outras doenças do SNC (YANCEY LS1 DIAZ-MARCHAN PJ1 WHITE AC. Cysticercosis: recent advances in diagnosis andmanagement of neurocysticercosis. Current Infectious Disease Reports, 7:7-39,2005).

As manifestações clínicas não são específicas e não há um método fácilde confirmar o diagnóstico de NC (YANCEY LS1 DIAZ-MARCHAN PJ, WHITEAC. Cysticercosis: recent advances in diagnosis and management ofneurocysticercosis. Current Infectious Disease Reports, 7:7-39, 2005).

O desenvolvimento de teste imunológicos, baseados na detecção deanticorpos específicos no soro e Iiquor (LCR), resulta em ferramentasconfiáveis par o diagnóstico da NC. Uma dificuldade para a conclusão dodiagnóstico da NC é a utilização de LCR. Embora amostras de LCRapresentem excelente utilidade no imunodiagnóstico da NC em relação àsamostras de soro, a colheita de LCR é um procedimento invasivo que requerprofissional especializado em local adequado (MACEDO HW. et al. Avaliaçãode testes imunológicos para o diagnóstico da neurocisticercose. JornalBrasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, 38:93-103, 2002). A utilizaçãode amostras de soro em testes utilizando extratos totais tem apresentadobaixos índices de especificidade (MACHADO GA. et al. Assessment ofantigenic fractions of varying hydrophobicity from Taenia solium metacestodesfor the diagnosis of human neurocysticercosis. Tropical Medicine andInternational Health, 12:1-8, 2007).

A maioria dos testes que utilizam antígenos totais perdem emsensibilidade e especificidade, reações cruzadas ocorrem freqüentemente comoutras parasitoses, especialmente equinococose cistica e multilocular,causadas pelo estágio Iarval de Echinococcus granulosus e E.multilocularis,respectivamente (Kong Y. et al. Immunoelectrophoretic analysis of majorcomponent proteins in cystic fluid of Taenia solium metacestodes. KoreanJournal of Parasitology1 30:209-18, 1992).

O desenvolvimento de técnicas de imunodiagnóstico tem contribuídocom significativa importância nos estudos soroepidemiológicos, juntamentecom os vários exames complementares que são indispensáveis no diagnósticoda NC (DORNY P et al. Immunodiagnostic tools for human and porcinecysticercosis, Acta Tropica1 87:79- 86, 2003). A observação de diversos dados,assim como a clínica, a epidemiologia e os exames complementares(neuroimagem, neurofisiológicos, anatomopatológicos e métodos imunológicos)tem sido amplamente empregados no auxílio diagnóstico da NC, uma vez queestes dados em conjunto podem definir o quadro clínico de um paciente (DELBRUTTO OH et al. Proposed diagnostic criteria for neurocysticercosis.Neurology, 57:177-183, 2001).

Novos conceitos no diagnóstico desta parasitose tem sido aperfeiçoadosnos últimos anos; dentre os quais destaca-se a identificação e sequenciamentode antígenos específicos e o desenvolvimento de novas técnicas laboratoriaisde diagnóstico (GARCIA HH et. al. New concepts in the diagnosis andmanagement of neurocysticercosis (Taenia solium). American Journal ofTropical Medicine and Hygiene, 72:3-9, 2005).

O imunodiagnóstico da cisticercose humana constitui o diagnósticoindireto da infecção pela detecção de anticorpos contra antígenos da formametacestódea de T. solium, em amostras de soro, líquido cefalorraquidiano(LCR), saliva ou sangue em papel de filtro, alcançando quase sempre papelcentral no diagnóstico da neurocisticercose (COSTA JM. Testeimunoenzimático (ELISA) no diagnóstico da neurocisticercose. Estudo dediferentes extratos antigênicos na detecção de anticorpos IgG em amostras desoro e líquido cefalorraqueano. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, 44:15-31, 1986).Dentre os testes imunológicos destacam-se, a Reação de Fixação deComplemento (RFC), a Reação de Hemaglutinação Indireta (HAI), a Reação deImunofluorescência Indireta (IFI)1 o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA) inicialmente aplicada no diagnóstico de cisticercose e oImmunoblotting (Enzyme-Linked Immunoelectrotransferblot- EITB).

Dentre todos os métodos imunológicos o ELISA tem sido o ensaio maisestudado no diagnóstico da NC por apresentar significativa sensibilidade eespecificidade, fácil e simples execução e baixo custo. Recomenda-seempregar dois testes imunológicos, sendo um de elevada sensibilidade e outrobastante específico, para maior segurança na interpretação dos resultados(COSTA-CRUZ JM et al. Ocorrência de cisticercose em necropsias realizadasem Uberlândia, Minas Gerais, Brasil. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, 53:227-232, 1995).

Um diagnóstico preciso é a primeira etapa para um tratamento médicoadequado. Tendo em vista este objetivo várias patentes abordam a utilizaçãode kits com antígenos homólogos (Γ. solium) MXPA02004417A ou heterólogos(T. crassiceps) BRPI0504527 e US005874251 para o diagnóstico dacisticercose.

Os extratos antigênicos totais são amplamente utilizados em estudossoroepidemiológicos em áreas endêmicas, mas a identificação e purificação deglicoproteínas são o principal objetivo da maioria dos estudos sorológicos nodiagnóstico da NC (BUENO EC et al. Application of synthetic 8-kD andrecombinant GP50 antigens in the diagnosis of neurocysticercosis by enzyme-Iinked immunosorbent assay. The American Journal of Tropical Medicine andHygiene, 72:278-283, 2005), uma vez que o uso de diferentes extratosantigênicos totais da forma metacestódea de T. solium (extrato salino total,líquido de vesícula e extrato alcalino total) resultam em diferenças significantesnos testes imunológicos (COSTA JM. Teste imunoenzimático (ELISA) nodiagnóstico da neurocisticercose. Estudo de diferentes extratos antigênicos nadetecção de anticorpos IgG em amostras de soro e líquido cefalorraqueano.Arquivos de Neuro-Psiquiatria, 44:15-31, 1986).

Várias técnicas de purificação já foram descritas, nas quais as taxas desensibilidade e especificidade ficaram próximas a 100% (ASSANA E et al.

Isolation of a 14 kDa antigen from Taenia solium cyst fluid by HPLC and itsevaluation in enzyme Iinked immunosorbent assay for diagnosis of porcinecysticercosis. Research in Veterinary Science, 82:370-376, 2007; SATO MO. etal. Evaluation of purified Taenia solium glycoproteins and recombinant antigensin the serologic detection of human and swine cysticercosis. The Journal ofInfectious Diseases1194:1783-1790, 2006).

O uso de peptídeos purificados tem demonstrado ótimos resultados nasdiversas áreas de imunodiagnóstico, onde estão sendo consideradosexcelentes candidatos a antígenos pelos altos índices de sensibilidade eespecificidade, além de demonstrarem pouquíssima reatividade cruzada. Comisso, peptídeos sintéticos vêem ser uma área de pesquisa promissora tantopara uso em testes imunológicos quanto no desenvolvimento de vacinas(FERRER E et al. Molecular cloning and characterisation os Ts8B1, Ts8B2 andTs8B3, three new members of the Taenia solium metacestode 8 kDa diagnosticantigen family. Molecular and Biochemical Parasitology, 152:90-100, 2007;SAKO Y. et al. Recombinant antigens for serodiagnosis of cisticercosis andechinococcosis. Parasitolgy Internacional, 55:569-573, 2006).

Nos últimos anos vários pesquisadores têm testado novas técnicas paradiagnosticar a NC: um teste de co-aglutinação (CO-A) foi utilizado paradetecção de antígenos de metacestódeos de T. solium na urina de pacientescom NC1 encontrando sensibilidade e especificidade moderadas (PARIJA M etal. Detection of specific cysticercus antigen in the urine for diagnosis ofneurocysticercosis. Acta Tropica, 92:253-260, 2004), uma proteína de 10 kDarecombinate de T. solium expressada em uma bactéria foi utilizada paradiagnosticar esta doença por immunoblot (LEE EG et al. Feasibility ofbaculovirus-expressed recombinant 10-kDa antigen in the serodiagnosis ofTaenia solium neurocysticercosis. Transactions of the Royal Society of TropicalMedicine and Hygiene, 99:919-926, 2005, ), insertos de cDNA clonados epurificados foram utilizados para detecção de NC ativa através do teste ELISAcom amostras de soro e LCR, obtendo alta sensibilidade e especificidade(FERRER E et al. Molecular cloning and characterisation os Ts8B1, Ts8B2 andTs8B3, three new members of the Taenia solium metacestode 8 kDa diagnosticantigen family. Molecular and Biochemical Parasitology, 152:90-100, 2007),antígenos de Τ. saginata foram testados como alternativa para o diagnóstico daNC humana, obtendo resultados bastante satisfatórios (OLIVEIRA HB et al.Application of Taenia saginata metacestodes as alternative antigen for theserological diagnosis of human neurocysticercosis. Parasitology Research,101:1007-1113, 2007), e frações obtidas pela purificação do extrato salino deT. solium através do Triton X-114 foram avaliadas no imunodiagnóstico daneurocisticercose humana, encontrando resultados satisfatórios (MACHADOGA et al.. Assessment of antigenic fractions of varying hydrophobicity fromTaenia solium metacestodes for the diagnosis of human neurocysticercosis.Tropical Medicine and International Health, 12:1-8, 2007); outros autores têmtestado antígenos variados para o diagnóstico de NC pelo teste Dot Blot(MANDAL J et al. Evaluation of Iower molecular mass (20-24 kDa) Taeniasolium cysticercus antigen fraction by ELISA and dot blot for the serodiagnosisof neurocysticercosis in children. Parasitology Research, 102:1097-1101,2008).

Várias patentes descrevem diferentes técnicas para diagnóstico da NCcom diversos antígenos totais ou fracionados, assim como proteínaspurificadas. A patente US4801532 se refere a um teste para detecção de NCativa tanto em soro quanto em amostras de LCR. Já as patentesUS2006264614 e CA2526023 sem referem á proteína T 24 purificada paradetecção de cisticercose e NC. A patente US5354660 trata da utilização dasglicoproteínas (GP) GP50, GP42, GP24, GP21, GP18, GP14 e GP13 nodiagnóstico de NC através da técnica de immunoblot. A patente CA1340196trata da utilização de proteínas escretadas/secretadas de Cysticercuscellulosae no imunodiagnóstico da NC

A utilização de marcadores moleculares tem sido amplamente estudadacom o objetivo de definir padrões de diversidade genética e variaçãointerespecífica para Taenia sp e aprimorar os marcadores de diagnóstico epeptídeos para vacinação (HOBERG EP. Taenia tapeworms: Their biology,evolution and socioeconomic significance. Microbes and Infection, 4:859-866,2002).O interesse imediato na aplicação terapêutica da imunidade da NCconcentra-se em estimular o sistema imune contra os antígenos do parasito, nabusca da produção de uma vacina a patente CN1314184 relata a utilização deextrato de Cisticercus cellulosae na vacinação de suínos, esta resultou em umtaxa de proteção de 94 %, além de ser segura e sem toxicidade. Já a patenteCN1231339 se refere a uma vacina de ácidos nucléicos para prevenção e curada cisticercose humana e suína, esta se constitui de um plasmídeo deexpressão com três genes do cisticerco com capacidade protetora (cC1, cC3 ecC4) além de uma unidade de expressão relacionados aos genes do IFN gamae IL-5 suínos, a vacina se mostrou eficaz protegendo contra cisticercosehumana e suína.

A patente CN1634596 se refere a uma vacina constituída de um vírus dahepatite B como carreador com um inserto de um gene do cisticerco comcapacidade protetora em múltiplos locais entre o primeiro e o aminoácido 183,este gene foi expresso e a proteína por ele expressa purificada resultandonuma vacina capaz de prevenir a cisticercose suína.

As patentes US6306365-B1, US6296832-B1, US6068829-A referem-seà identificação de peptídeos Iigantes a diversos órgãos do corpo humanoisolados pela injeção de bibliotecas de peptídeos em pessoas vivas. Essespeptídeos podem ser usados no diagnóstico de diferentes patologias.

As patentes W09946284-A; EP1062232-A; W09946284-A2;AU9930783-A; EP1062232-A2; US6174687-B1; US6232287-B1;JP2002506079-W; AU762991-B; US6610651-B1; US6784153-B1;US2005074812-A1; US6933281-B2 relatam o uso de bibliotecas administradasem camundongos vivos para isolar peptídeos Iigantes a diversos órgãos.

A patente US2008124277 relata a utilização de peptídeos obtidos porbibliotecas como agentes de entrega de fármacos para inibição deangiogênese e crescimento tumoral e indução de apoptose.

As patentes US7083945, US2006068421, US2005202512, GB2408332 US2003104604, EP1452599, US2006035223 utilizam a técnica de PhageDisplay com o intuito de expressar polipeptídeos recombinantes com afinidadepara o ligante, além de propor metodologias que tornam a técnica maiseficiente.

Phage display é uma técnica eficiente para identificar peptídeos ouproteínas que se ligam a outras moléculas com diversas finalidades, comoidentificação de peptídeos Iigantes a outras moléculas. A tecnologia é baseadano princípio de que polipeptídeos podem ser expressos na superfície de fagosfilamentosos pela inserção de um segmento de DNA codificante no genomados mesmos, de modo que o peptídeo ou proteína expressado fica exposto nasuperfície da partícula fusionado a uma proteína endógena.

A tecnologia Phage Display pode beneficiar diagnósticos através daidentificação de moléculas atualmente impossíveis de se obter por métodostradicionais. Anticorpos recombinantes contra antígenos tóxicos ou seqüênciasconservadas e carboidratos podem ser isolados (Soderlind E et ai,Recombining germLinederived CDR sequences for creating diverse single-framework antibody libraries. Nature Biotechnology 18: 852-856, 2000). Avantagem crucial dessa tecnologia está na ligação direta que existe entre ofenótipo experimental e o genótipo encapsulado, mostrando a evolução dosIigantes selecionados até moléculas otimizadas (Azzazy HM et al. Phagedisplay technology: clinicai applications and recent innovations. ClinicaiBiochemistry 35:425-45, 2002).

Esta técnica foi desenvolvida por George Smith em 1985, que expressoupela primeira vez a enzima de restrição EcoRI como uma fusão da proteína(pVIII) do capsídeo do fago. Utiliza-se o bacteriófago M13 (Sidhu SSEngineering M13 for phage display. Biomolecular engineering 18: 57-63, 2001),um vírus bacteriófago filamentoso que infecta bactérias gram-negativas que porsua vez apresentam pilus F (Rodi DJ, Makowski L. Current Opinion inBiotechnology 10:87-93, 1999). A partícula de fago é formada por uma fitasimples de DNA envolta por uma capa protéica constituída por cinco proteínas(plll, pVI, pVII, pVIII e pIX). Destas cinco proteínas existem aproximadamente2800 cópias da pVIII e cinco cópias da plll. Neste sistema, o gene codificadordo peptídeo ou proteína de interesse é geralmente fusionado a um dos genesdessas duas proteínas da capa protéica do fago (Brígido MM1 Maranhão AQ.Bibliotecas Apresentadas em fagos Biotecnologia Ciência eDesenvolvolvimento, 26:.44-55, 2002). Assim, o peptídeo é expresso naextremidade N-terminal da plll ou pVIII.

As seqüências de DNA de interesse são inseridas em uma localizaçãono genoma de bacteriófagos filamentosos, de modo que a proteína codificada éexpressa na superfície do fago filamentoso como um produto de fusão a umadas proteínas da superfície do fago (Azzazy HM. et al. Phage displaytechnology: clinicai applications and recent innovations. Clinicai Biochemistry35:425-45, 2002). O peptídeo ou proteína expresso na superfície do fagopossibilita a seleção de seqüências baseada na afinidade de ligação para umamolécula alvo por um processo de seleção in vitro denominado biopanning(Parmely SF1 Smith GP. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors:affinity purification of target genes. Gene 73:305-318, 1988).

Através da técnica de Phage display epítopos da região N-terminal deTPmy (paramiosina de T. solium), que são altamente imunogênicos nestamolécula, foram mapeados. Utilizando diferentes métodos de seleção eeluição, identificaram peptídeos com homologia à proteína em questão,sugerindo a identificação de um epítopo linear e descontínuo, com prováveispropriedades de determinantes imunodominantes, reveladas análisescomputacionais de antigenicidade (GAZARIAN KG et al. Epitope mapping onN-terminal region of Taenia solium paramyosin. Immunology Letters, 42:191-195, 2000). Esta técnica tem sido utilizada no entendimento de doençasprovocadas por vírus, bactérias, protozoários e parasitos e a interação entreseus antígenos e a resposta imune do hospedeiro, na busca de mapearepítopos ou desenvolvimento de vacinas.

Esta metodologia tem se mostrado útil não apenas para o mapeamentode interações proteína-proteína como na identificação de moléculas alvoimportantes para o desenvolvimento de vacinas e drogas contra parasitoscomo Plasmodium sp, causador de malária e Brugia malayi, causadora defilariose linfática (LANZILLOTTI R, COETZER TL. Phage display: a useful toolfor malaria research? Trends in Parasitology1 24:18-23, 2008; GNANASEKARM et al. novel small heat shock protein 12.6 (HSP12.6) from Brugia malayifunctions as a human IL-10 receptor binding protein. Molecular & BiochemicalParasitology, 159:98-103, 2008), assim desenvolvendo veículos de entrega devacinas por si próprios (BENHAR, I. Biotechnological applications of phage andcell display. BiotechnoIogyAdvances, 19:1-33, 2001).

A capacidade de fagos recombinantes na entrega de antígenos para avacinação contra cisticercose suína foi testada, demonstrando uma capacidadeprotetora desta vacina contra a doença (MANOUTCHARIAN, K et al.Recombinant bacteriophage-based multiepitope vaccine against Taenia soliumpig cysticercosis. Veterinary Immunology and Immunopathology, 99:11-24,2004),.

Antígenos de T. crassiceps de um biblioteca de cDNA foram isolados eavaliados no diagnóstico da NC, foram obtidos 3 clones que reconheceramanticorpos presentes no LCR e soro de paciente com NC confirmada(ROBLES, Y. et al Isolation of the Taenia crassiceps antigens from a phagedisplay cDNA Iibrary and evaluation of their use for use for diagnosis ofNeurocysticercosis. Clinicai Immunology, v.116, p. 265-270, 2005).

A seleção por afinidade de peptídeos de bibliotecas de fagos utilizandoLCR de pacientes foi sugerida como uma ferramenta atrativa para odesenvolvimento de novos reagentes para um teste diagnóstico simples esensível e para o entendimento dos mecanismos moleculares da patogêneseda NC (MANOUTCHARIAN, K et al., Characterization of cerebrospinal fluidantibody specificities in neurocysticercosis using phage display peptide library.Clinicai Immunology, United States, v. 91, n.1, p. 117-121,1999).

Vistas as dificuldades dos testes sorológicos, têm sido desenvolvidasnos últimos anos bibliotecas de peptídeos randômicos expressos na superfíciede fagos, aumentando o interesse desta técnica (Phage display) como fonte deidentificação de um grande número de epítopos e mimetopos.

A aplicação de bibliotecas de peptídeos em fagos para a identificação deanticorpos específicos ao nível de aminoácidos traz informações importantessobre mecanismos moleculares de doenças e ainda possibilita novasferramentas úteis no diagnóstico. Uma vez que esta estratégia não requerinformações detalhadas sobre o antígeno natural, é possível identificar agentesresponsáveis por doenças com etiologia obscura utilizando apenas o soro dopaciente e uma biblioteca de peptídeos.

Várias aplicações das bibliotecas de peptídeos randômicos expostos emfagos têm sido realizadas com sucesso, tais como mapeamento de epítopos,desenvolvimento de vacinas e identificação de peptídeos miméticos de Iigantesnão peptídicos e, preparação de anticorpos monoclonais pela utilização debibliotecas de fagos geradas pela imunização in vitro de células mononuclearesdo sangue periférico (PBMC); estudo de interações proteína-proteína, além dautilização de fagos como veiculadores na entrega de drogas contra célulascancerosas (HOF D, HOEKE MO, RAATS JMH. Multiple-antigen immunizationof chickens facilitates the generation of recombinant antibodies to autoantigens.Clinicai and Experimental Immunology, 151:367-377, 2007; BAIR CL et al. Aphage display system designed to detect and study protein-protein interactions.Molecular Microbiology, Article in press, 2008; MATSUMOTO SE et al. A rapidand efficient strategy to generate antigen-specific human monoclonal antibodyby in vitro immunization and the phage display method. Journal ofImmunological Methods, Article in press, 2008; BAR H, YACOBY I, BENHAR I.Killing câncer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines. BMCBiotechnology, 8:37-50, 2008).

As vantagens da utilização da técnica são a habilidade de selecionarIigantes de alta afinidade, a possibilidade de produzir proteínas solúveis, obaixo custo, o fácil manuseio e a rapidez (SMITH GP, PETRENKO VA. Phagedisplay. Chemical Reviews, 97:391-410, 1997).

T. solium ainda não está bem caracterizada a nível molecular e estanova técnica (phage display) pode definir epítopos que podem ser utilizadospara detecção de anticorpos presentes em amostras de pacientes com NC,para se desenvolver um teste imunodiagnóstico simples e sensível, além deprover informações sobre os mecanismos moleculares da doença(MANOUTCHARIAN K et al. Characterization of cerebrospinal fluid antibodyspecificities in neurocysticercosis using phage display peptide library. ClinicaiImmunology1 91:117-121, 1999).

Na busca de uma metodologia rápida, eficiente e capaz de fornecer umdiagnóstico mais acurado da NC1 bem como a utilização de Iigantes específicoscomo carreadores de substâncias, a presente invenção propõe o uso datécnica de Phage Display para a identificação e seleção de peptídeos Iigantesespecíficos a IgG de pacientes com NC1 determinando motivos protéicosfuncionais, através da interação de bibliotecas de peptídeos apresentados nasuperfícies de fagos filamentosos com proteínas da parasito. Em combinaçãocom outras tecnologias faz com que essa invenção seja prontamente aceita,pois a nova tecnologia apresenta alta sensibilidade e flexibilidade de utilizaçãoem relação a outras tecnologias vigentes para identificação de novosmarcadores para diagnóstico, monitoramento, prognóstico e no uso comocarreadores de drogas para tratamento do câncer, bem como outraspatologias.

Sabendo-se que existem atualmente poucos marcadores e com baixaeficiência para diagnósticos faz-se necessário o desenvolvimento de novosbiomarcadores mais confiáveis, rápidos e precisos que auxiliarão nodiagnóstico, prognóstico e tratamento da NC e outras patologias.

Dessa forma, a presente invenção propõe o uso de seqüênciaspeptídicas, fusionadas ou não, a carreadores, tais como fagos filamentosos,fármacos, ou a qualquer outro tipo de carreador e sua utilização na detecção eidentificação de IgG de pacientes com NC para testes de diagnóstico.

A invenção poderá ser melhor compreendida através da descriçãodetalhada mediante os exemplos para os resultados experimentais obtidos. Osprocedimentos experimentais envolvidos estão detalhados na seqüência. Ametodologia empregada para a seleção, caracterização e utilização depeptídeos recombinantes e motivos protéicos que interajam com IgG presentesno soro de pacientes com NC foi aplicada em diferentes amostras de soro depacientes com NC, outras parasitoses e aparentemente saudáveis,comprovando a eficiência da sua utilização para diagnóstico de pacientes comNC.

Exemplo 1:

Este exemplo se refere à seleção e a caracterização dos peptídeosrecombinantes e motivos protéicos que se ligam a Imunoglobulinas G depacientes com NC. Diversos parâmetros podem ser utilizados para indicar osucesso da seleção de cada peptídeo, como pode ser visualizado na TABELA1. Esses mesmos parâmetros foram anteriormente utilizados (Rodi DJ et al.Quantitative assessment of peptide sequence diversity in M13 combinatorialpeptide Phage Display Libraries. Journal of Molecular Biology 322: 1039-1052,2002).

A TABELA 1 apresenta a identidade das seqüências de aminoácidosselecionadas, bem como as suas respectivas freqüências observadas (FO);freqüências esperadas (FE), que correspondem à probabilidade da seqüênciarandômica; amplificação dos peptídeos decorrentes do processo de seleção emrelação à freqüência esperada dos peptídeos na biblioteca original; grau deinformação de cada peptídeo (l(m)), que é dado por -In (probabilidade deseqüência randômica); e o número provável de clones independentes dentro dabiblioteca (λ). Quanto maior o grau de informação, mais efetiva foi a seleção dopeptídeo, consequentemente, mais raro ele é na biblioteca.

TABELA 1

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Foram obtidos 10 clones com seqüências distintas (Seq. ID N— 1 a 10),sendo que todos eles apresentaram alto grau de informação. Peptídeos queexibem alto grau de informação são menos prováveis de ocorrer ao acaso doque aqueles que possuem baixo nível de informação (Rodi DJ et al.

Quantitative assessment of peptide sequence diversity in M13 combinatorialpeptide Phage Display Libraries. Journal of Molecular Biology 322: 1039-1052,2002).

O elevado grau de informação de cada peptídeo selecionado obtidopelas análises de bioinformática validam os dados de bioppaning e comprovama eficiência da técnica de Phage Display.

Observou-se, ainda, que houve um grande enriquecimento de todos ospeptídeos selecionados em relação as suas freqüências esperadas nabiblioteca de fagos, sugerindo que são específicos para neurocisticercose.

Com a possibilidade de ligação dos peptídeos com alguma moléculatumoral no sentido carboxi terminal para amino terminal nós tambémanalisamos as seqüências no seu sentido reverso, identificadas como Seq. ID

11 ao Seq. ID 20. Por exemplo, a Seq. ID N2 1 tem a seqüência inversa Seq. IDN2 11, a Seq. ID N2 2 possui a seqüência inversa Seq. ID N2 12, a assimsucessivamente, até a Seq. ID N2 10 que possui a seqüência inversa Seq. IDN2 20 como apresentado da TABELA 2.

TABELA 2

<table>table see original document page 20</column></row><table>continuação TABELA 2

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Exemplo 2:

Este exemplo refere-se as seqüências protéicas dos peptídeosselecionados que apresentaram similaridade com algumas proteínas dediversas espécies do gênero Taenia, dentre elas as mais importantes efreqüentes: T. solium e T. saginata, que estão presentes no banco de dados.

A TABELA 3 apresenta o alinhamento das seqüências protéicas dospeptídeos selecionados mostrando as homologias encontradas com asprincipais proteínas relacionadas ás espécies de T. solium e T. saginata nobanco de dados do GeneBank pelo BLAST, com os números de acesso queobtiveram similaridade com os clones selecionados.

TABELA 3

<table>table see original document page 21</column></row><table>continuação TABELA 3

<table>table see original document page 22</column></row><table>continuação TABELA 3

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Quando se analisou os clones obtidos frente às proteínas do gêneroTaenia encontramos similaridade com diversas proteínas com várias funções,várias destas com potencial para alvo de drogas ou vacinas, porém foi dadamaior ênfase as proteínas das espécies T. solium e T. saginata.

Os clones Seq. ID N2 4, Seq. ID N2 7 tiveram similaridade com c-jun deT. solium e Seq. ID N2 10 com c-fos, do mesmo parasito. Estas são altamenteconservadas com relação a outros genes do parasito, sendo idênticas entre T.solium e T. cracisseps, estando relacionadas à proliferação e diferenciaçãocelular do parasito e podem influenciar na infecção.

O clone Seq. ID N2 1 apresentou homologia com um precursor decalreticulina de uma proteína Iigante de cálcio de T. solium com função decontrolar a homeostasia do cálcio intracelular. Após ser secretada pela célula acalreticulina pode se ligar ao C1q, um subcomponente do sistemacomplemento, interferindo na ativação da cascata do sistema complemento nolocal da inflamação pela ligação com C1q, interferindo com o complexo imuneassociado ao anticorpo.

Seq. ID N2 3 e Seq. ID N2 9 se mostraram semelhantes á proteínas dafamília das anexinas, associadas com diversos fenômenos relacionados ámembrana com transportes, organização e formações de canais iônicos e suadistribuição coincide com o grau de inflamação granulomatosa ao redor.

Seq. ID N2 4 e Seq. ID N2 7 se mostraram similares a paramiosina,também conhecida como antígeno B, que possui papel importante nasobrevivência do cisticerco já que inibe a fração C1 da cascata docomplemento, esta foi identificada como candidata para vacinas contrahelmintos.

Seq. ID N2 6 se alinhou á TGTP1 de T. solium, um transportador deglicose que está na superfície externa das formas adultas e Iarvais e podem sercandidatos para intervenção contra parasito, estes poderiam ser potenciaisalvos para vacinas.

Exemplo 3:

Este exemplo se refere aos testes ELISA para estudo daimunoreatividade dos clones de fagos recombinantes selecionados.Os níveis de IgG sérica obtidos por ELISA frente aos clones Seq. ID N2 1a Seq. ID N2 10, obtidos pelo processo de bioppaning, com amostras de sorona diluição 1:200 dos indivíduos dos grupos 1 (neurocisticercose n=40); 2(pacientes infectados por Taenia sp. e por outros parasitos n=40) e 3(indivíduos saudáveis n=40) são mostrados nas FIGURAS 1-10, onde a linhahorizontal indica o IR=1 e o símbolo %, a positividade.

Na FIGURA 1, para o clone Seq. ID N2 1, 80% (32/40) das amostrasforam positivas para o grupo 1, 2,5% (1/40) no grupo 2 e 5 % (2/40) no grupo 3.

Na FIGURA 2, observamos que para o clone Seq. ID N2 2 52,5%(21/40) das amostras foram positivas no grupo 1 e nenhuma (0/40) para osgrupos 2 e 3.

A FIGURA 3 mostra a reatividade para o clone Seq. ID N2 3, para o qual95% (38/40) das amostras no grupo 1 foram positivas e respectivamente 5%(2/40) e 7,5% (3/40) nos grupos 2 e 3.

Na FIGURA 4, quando se testou o clone Seq. ID N2 4 observou-se que97,5% (39/40) das amostras do grupo 1 foram positivas, 15% (6/40) e 10%(4/40) para os grupos 2 e 3, respectivamente.

Com o clone Seq. ID N2 5 , FIGURA 5, foi observada uma positividadede 97,5% (39/40) no grupo 1 e nos grupos 2 e 3 17,5% (7/40) e 10% (4/40),respectivamente.

A FIGURA 6 mostra a positividade para o clone Seq. ID N2 6, o grupo 1apresentou 70% (28/40) de amostras positivas no grupo 1 e nos grupos 2 e 3,respectivamente, 5% (2/40) e 10% (4/40).

A positividade para o clone Seq. ID N2 7, como mostrado na FIGURA 7,no grupo 1 foi 65% (26/40), nenhuma amostra do grupo 2 foi positiva e nogrupo 3 a positividade foi de 7,5% (3/40).

Quando se testou o clone Seq. ID N2 8, 82,5% (3/40) das amostrasforam positivas para o grupo 1 e respectivamente, 25% (10/40) e 2,5% (1/40)nos grupos 2 e 3, como evidenciado na FIGURA 8.

Na FIGURA 9 observa-se que para o clone Seq. ID N- 9, ocorreu umapositividade de 100% (40/40) no grupo 1, 10% (4/40) no grupo 2 e 5% (2/40) nogrupo 3.

A FIGURA 10 mostra a positividade para o clone Seq. ID N- 10, onde97,5% (39/40) das amostras do grupo 1 foram positivas e 7,5% (3/40) nosgrupos 2 e 3.

Os resultados demonstram que os peptídeos foram específicos para oalvo utilizado na seleção. A maioria dos clones apresentou reatividade, emboracom perfis diferenciados entre os fagos. Pela metodologia foi possívelconfirmar a especificidade da seleção em função da maioria dos clonesapresentarem positividade no grupo 1 (índice de reatividade-IR maior que 1).

Em ensaios de competição, as proteínas presentes no extrato total demetacestódeos de T. solium em diferentes concentrações, inibiram a ligaçãodas IgG aos clones de adsorvidos em placas de poliestireno nos testes ELISA.

Os dados demonstram que quantidades crescentes de proteínas do parasitoadicionado ao soro interfere a ligação das IgG no momento do reconhecimentodos fagos na placa. O controle negativo utilizado foi vetor sem inserto,representado pelo fago selvagem M13KE e o controle positivo, foi demonstradopela adição do pool de soros de pacientes com NC sem adição do antígeno.

Estes dados indicam que os peptídeos expressos nos clones de fagos podemser reconhecidos especificamente pelas IgG presentes no soro de pacientescom NC e estes peptídeos apresentam capacidade de mimetizar os epítopospresentes nas proteínas totais de metacestódeos de T. solium. Desta forma, foipossível demonstrar a inibição da reatividade por ensaios de competição paraos clones obtidos.

A TABELA 4 mostra os cálculos da sensibilidade, especificidade,eficiência do diagnóstico (ED) e índice de Youden obtidos nos testes ELISA nadetecção de anticorpos IgG anti-metacestódeo de T. solium em amostras desoro, utilizando os clone selecionados.TABELA 4

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Vários autores testaram diferentes antígenos, purificados ourecombinantes, com diferentes índices de sensibilidade e especificidade. Osfagos testados neste trabalho obtiveram sensibilidade e especificidadesemelhantes ou superiores àqueles demonstrados por outros autores.

A TABELA 5 mostra a reatividade das amostras de soro de pacientes doGrupo 2 (pacientes infectados com Taenia sp. e por outros parasitos) utilizandoos clones de fagos selecionados.

Alguns clones (NC22, NC28, NC212, NC315 e NC3IO) não reagiram comamostras de soro de pacientes infectados com E. granulosus, o que demonstraum grande avanço, uma vez que a reatividade cruzada com amostras de sorode pacientes infectados com este parasito são freqüentemente relatadas.

O estudo dos indivíduos do Grupo 2, ou seja de indivíduos infectadospor Taenia sp. e por outras parasitoses, é importante na análise dos dadosporque representa a realidade da população, especialmente em nosso paísonde as doenças parasitárias são altamente prevalentes. A reatividade cruzadapode estar relacionada à infecções concomitantes ou a presença de anticorposremanescentes de infecções prévias.TABELA 5

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Para melhor compreensão dos exemplos utilizados, segue abaixo umadescrição detalhada dos procedimentos experimentais adotados.

Na obtenção de peptídeos Iigantes a IgG presentes no soro de pacientescom NC foram utilizadas 120 amostras de soro divididas em 3 grupos:

- Grupo 1: Amostras de soro de pacientes com diagnóstico definitivo deneurocisticercose, onde foram utilizadas 40 amostras de soro de pacientes comdiagnóstico definitivo de NC de acordo com os critérios propostosanteriormente (Del Brutto et al. Proposal of diagnostic criteria for humancysticercosis and neurocysticercosis. Journal of the Neurological Sciences142:1-6, 1996). Sob tais critérios, um diagnóstico definitivo de NC é realizadode duas maneiras: a primeira é pela presença de um critério absoluto quepoderia ser a demonstração histológica do parasito por biópsia, visualização doescólex da forma metacestódea por TC ou RM ou a visualização direta doparasito na subretina através do exame de fundo de olho; e a outra maneira, éa presença de dois critérios principais, um critério secundário e um critérioepidemiológico. Neste estudo os pacientes com diagnóstico definitivo foramselecionados por um critério absoluto que, no presente estudo, foi àvisualização por imagem do escólex da forma metacestódea de T. solium.

- Grupo 2: Amostras de soro de pacientes infectados por Taenia sp. epor outros parasitos onde o objetivo foi verificar a reatividade cruzada nosmétodos imunológicos. Foram utilizadas 40 amostras de soro de pacientesinfectados por: Ancilostomideo (n=5), Ascaris Iumbricoides (n=5), Echinococcusgranulosus (n=4), Enterobius vermicularis (n=4), Hymenoiepis nana (n=4),Sehistosoma mansoni (n=4), Strongyloides stereoralis (n=4), Taenia sp. (n=6) eTriehuris triehiura (n=4). As amostras de soro foram colhidas de indivíduos comexames parasitológicos de fezes positivos após a análise de três amostrasfecais pelos métodos de HPJ (Hoffmann, WA; Pons, JA; Janer, JL. Thesedimentation concentration method in schistosomiasis mansoni, Puerto Rico.Journal of Public Health Tropical Medicine 9:283-291, 1934) e/ou Baermann(Baermann, S. Eine Einfache Methode zur Auffindung Von Ankylostomum(Nematoden) - Larven in Erdproden. Mededeel mit. h. Geneesk. LabWeltevredem Feestbundel, Batavia, 41-47, 1917), sendo todas triadas peloLaboratório de Análises Clínicas do HC-UFU.

- Grupo 3: Amostras de soro controle de indivíduos aparentementesaudáveis, onde foram utilizadas 40 amostras de soro de indivíduosvoluntários, assintomáticos, que em três exames parasitológicos de fezesrealizados pelo método de HPJ foram negativos para parasitos intestinais e quenão tinham história anterior de teníase-cisticercose.

Para a purificação das IgG, pool de soros de pacientes diagnosticadospositivamente para neurocisticercose, outras parasitoses e de indivíduosaparentemente saudáveis foram utilizados.

A purificação de imunoglobulinas foi realizada através de beadsmagnéticos a partir de 100 μΙ do pool de soro de pacientes com NC.

Foram colocados em um eppendorf 100 μΙ de beads de proteína G, queforam lavados 3 vezes com tampão MES 0,1 M, pH 5,0; em seguida 100 μΙ dopool de soros foi acrescentado, e incubado sob agitação por 30 minutos. Emseguida os beads foram lavados com tampão MES e a eluição se deu com aadição de 30 μΙ de tampão citrato 0,1 M pH 2,0, no separador magnético osobrenadante foi retirado com as imunoglobulinas G (IgG) remanescentes. OpH foi neutralizado com 1:3 de tampão Tris (1 M) pH 9,1.

Estimou-se a quantidade de anticorpos obtida pelo método de detecçãoe quantificação de proteínas (Johnstone, AP; Thorpe, R. Immunochemistry inpractice. Blackwell Science, 318 p., 1987) onde a Concentração da amostra =Absorbância à 280 nm X Fator de diluição/ coeficiente de extinção à 280nm(1,36 para IgG).

O mesmo procedimento foi realizado para a purificação de anticorpos depacientes com outras parasitoses intestinais e indivíduos aparentementesaudáveis.

Para eluição dos fagos específicos ás IgG de pacientes com NC, foiutilizado o extrato total de metacestódeos de T. solium para a preparaçãoforam utilizados 50 metacestódeos íntegros ou rompidos de T. solium para opreparo do extrato salino total (S) (Costa, JM. Teste imunoenzimático (ELISA)no diagnóstico da neurocisticercose. Estudo de diferentes extratos antigênicosna detecção de anticorpos IgG em amostras de soro e líquido cefalorraqueano.Arquivos de Neuro-Psiquiatria 44:15-31, 1986). Os metacestódeos foramtriturados em graal e ressuspendidos em 2,5 ml_ de água destilada e emseguida a mistura foi submetida a homogeneizador de tecidos (Glas Col®,USA) por cinco ciclos de 1 minuto cada, em banho de gelo, e posteriortratamento de ultra-som (Thornton, Impec Eletrônica, São Paulo, Brasil) a 40kHz por quatro ciclos de 30 segundos cada em banho de gelo. Apósisotonização com 2,5 ml_ de solução de NaCI (0,3 M), foram empregados maistrês ciclos de ultra-som. Em seguida, a mistura foi submetida a 4°C por duashoras sob agitação lenta e posteriormente centrifugada a 12.400 χ g (Du PontSorvall® Products Newton, Conectcut, USA) por 30 minutos a 4°C, osobrenadante obtido constituiu o extrato S.

Para a seleção dos peptídeos sintéticos (expressos na proteína Ill docapsídeo de fagos filamentosos), reativos com os anticorpos acima descritos,utilizou-se uma biblioteca randômica de peptídeos de 12 aminoácidos (aa)(Ph.D-12 mer- New England Biolabs). O procedimento de seleção foi realizadode acordo com as recomendações do fabricante, com algumas modificações.

A sensibilização da placa se deu pela colocação de 150 μΙ/poço das IgGanteriormente purificadas, a 100pg/ml, diluídas em tampão bicarbonato 0.1 M(pH 8.6 ) com posterior incubação overnight a 4°C, sob agitação lenta emcâmara úmida.

Em seguida, a placa foi seca batendo a contra papel para remover asolução residual, para a realização do bloqueio da mesma. O bloqueio se deupela adição de tampão de bloqueio (NaHC03 0,1M, pH 8,6; BSA 5mg/mL) 300μΙ/poço, 1 h a 4°C, sob agitação lenta. Após a incubação, lavou-se a mesmapor 6 vezes com 200 μΙ/poço de TBS-T (tris HCI 50mM- pH 7,5, NaCI 150mM -Tween 20 0,1%) por um minuto, sendo secada, em seguida, com papel paraentão receber 10 μΙ da biblioteca de fagos em 90 μΙ de TBS-T, que foramcolocados no poço sensibilizado com IgG de pacientes com outras parasitoses,nos outros poços foi colocado 20 μΙ de TBS para que estes não ficassemsecos.

Incubou-se a mistura anticorpo - fago por 1 hora sob agitação lenta àtemperatura ambiente e em seguida os fagos não ligados foram transferidospara o poço sensibilizado com IgG de indivíduos aparentemente saudáveis, eem seguida para o poço sensibilizado com IgG de indivíduos positivos para NC,passou-se os fagos por último no poço com a IgG de pacientes com NC paraque àqueles que não fossem específicos à doença ficassem ligados nos outrospoços, realizando desta forma seleções negativas. Os fagos não Iigantes á IgGde pacientes com NC foram descartados e a placa lavada mais 10 vezes com200 μΙ de TBS-T 0,1%, sendo em seguida preparada para a eluição dos fagosIigantes ao soro de pacientes com NC com 100 μΙ de tampão de eluição(extrato total de metacestódeos de T. solium 200 pg/ml em TBS-T) por 40minutos à temperatura ambiente. O eluato foi transferido para um eppendorf emantido sob refrigeração.Titulou-se uma pequena quantidade de amostra deste eluato (1 μΙ_) e orestante, foi utilizado para re-amplificação, realizada em 20 mL de culturacontendo tetraciclina de Escherichia coli (ER 2738) em fase inicial decrescimento (OD 600 ^ 0,3) e incubada por 4,5 horas em agitador comtemperatura controlada a 37°C, antes do procedimento de precipitação dosfagos para titulação posterior.

A cultura foi transferida para um tubo de centrifuga e centrifugada (10minutos, 10.000 rpm, 4°C), as células residuais descartadas e o sobrenadantetransferido para um tubo limpo e re-centrifugado. O sobrenadante foitransferido para um tubo limpo, onde se adicionou 1/6 do volume de PEG-NaCI(20% peso/volume de polietileno glicol-8000; NaCI 2,5M) e a misturapermaneceu em repouso durante toda noite a 4°C. No dia seguinte,centrifugou-se o precipitado (15 minutos, 10.000 rpm, 4°C), o sobrenadante foidescartado e o tubo novamente centrifugado, nas mesmas condiçõesanteriores por mais 5 minutos para remoção do sobrenadante residual. O pelletde fagos foi ressuspendido em 1mL de TBS 1X, transferido para um microtuboe centrifugado (10 minutos, 10.000 rpm, 4° C) para a retirada das célulasresiduais e o sobrenadante transferido para um novo microtubo, para adição dePEG-NaCI (1/6 do volume). Incubou-se a mistura por 1 hora em gelo, composterior centrifugação (15 minutos, 14.000 rpm, 4°C), o sobrenadante foidescartado e o tubo re-centrifugado por mais 5 minutos para retirada dosobrenadante residual, e o pellet ressuspendido em 200 pL de TBS 1X ecentrifugado por 1 minuto, o sobrenadante foi transferido para outro tuboestando pronto para titulação.

Os fagos re-amplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foramutilizados em um segundo ciclo (2,0 X 1011 ufc) e assim subseqüentemente porum total de quatro ciclos, sendo que a partir do terceiro aumentou-se aestringência do tampão de lavagem de 0,1% para 0,5%, utilizando-se então0,5% de Tween 20 em todas as lavagens.

Para todas as titulações utilizou-se 1 pL dos fagos, diluídos em 9 pL domeio de cultura LB. As diluições foram 101 à 106 , para o eluato e eluatoamplificado, os fagos, nos títulos conforme descrito anteriormente, foramincubados com 200 μΙ_ de E. coli (ER 2738) e plaqueados em meio sólidocontendo IPTG (0,5mM) e X-gal (40 pg/mL), juntamente com 3 mL de AgaroseTop (10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCIl 1 g deMgCI2 . 6 H2 0/ litro).

Após incubação em estufa por toda noite a 37°C, as colônias azuis(resultantes do sistema de α-complementação do vetor) foram contadas para aobtenção dos títulos de entrada e saída para todos os ciclos de seleção(número de colônias azuis X fator de diluição),

As colônias que apresentarem coloração azul, demonstrando a quebrado substrato X-gal e a expressão do gene da β-galactosidase dos fungos pelasbactérias ER 2738, foram re-amplificadas separadamente em microtubos parao armazenamento dos clones selecionados. Para isso, adicionou-se ascolônias isoladas a 1mL de meio de cultura contendo E. coli (ER 2738) em fasede crescimento inicial e tetraciclina, após incubação por overnight a 37°C sobagitação vigorosa, os tubos foram centrifugados a 10.000 rpm por 30segundos, para retirada do sobrenadante da cultura a ser utilizado para aextração de DNA, e posterior armazenamento do pellet juntamente com omesmo volume de glicerol 50%. Cento e quatorze clones, devidamenteidentificados foram utilizados para os processos de caracterização descritosabaixo.

Para obtenção de DNA dos fagos foram utilizadas as colônias isoladas ecrescidas como descrito anteriormente. Após o crescimento, as culturas foramcentrifugadas (10 minutos 10.000 rpm, 4°C), sendo o sobrenadante utilizadopara a precipitação com 1/6 do volume de PEG-NaCI (20% polietileno glicol-8000, NaCI 2,5M) por 10 min a temperatura ambiente, o material foi, emseguida, centrifugado a 14.000 rpm por 10 minutos 4°C, o sobrenadante foidescartado e o pellet ressuspendido em 100 μΙ_ de tampão Iodeto de Sódio(Tris-HCI 10mM pH 8,0, EDTA 1mM e Nal 4M), e a precipitação de ácidonucléico foi realizada com adição de 250 μι. de etanol absoluto, este materialfoi deixado 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugado por 10 minutos a14.000 rpm a 4°C, o sobrenadante descartado e o pellet lavado com etanol70%, sendo em seguida centrifugado e o pellet ressupendido em 20 μΙ_ deágua mili-Q (Barbas, CF et al. Phage display. A Iaboratory Manual. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).

A qualidade e quantidade de DNA presente nas amostras foi avaliadapor amostragem em gel de agarose 0,8 %.

A reação de sequenciamento foi realizada utilizando-se o kit Big DyeTerminator (Pharmacia), 3 μΙ_ do DNA obtido e 1 pL de Primer universal (96M13 - 5' HO CCCTCATTAGTTAGCGCGTAACG 3' - Amersham Biosciences),que amplifica a região de aa codificantes dos peptídeos randômicos fusionadosnosfagos M 13 recombinantes.

A reação de amplificação aconteceu em termociclador (Eppendorff). Aprecipitação do material amplificado se deu acrescentando-se acetato deamônio 4M e etanol absoluto às amostras, seguido de centrifugação por 40minutos a 14.000 rpm em centrifuga refrigerada e lavagem com etanol 70%com posterior centrifugação por 10 minutos nas condições anteriores. Adiluição foi realizada com 10 pL de tampão de corrida apropriado (Loadingbuffer). O sequenciamento se deu utilizando-se o seqüenciador automáticoMegaBace 1000 (Amersham Biosciences).

A análise das seqüências de DNA provenientes do seqüenciadorautomático foi processada em software do próprio equipamento (SequenceAnalyser, Base Calier, Cimarron 3.12, Phred 15). Logo após esta pré-análise,as seqüências dos vetores foram retiradas e somente aqueles insertos comresíduos perfeitos foram traduzidas.

Para análise dos dados as seqüências de DNA geradas pelosequenciamento foram analisadas utilizando-se programas de bioinformáticadisponíveis on-line.

Para a tradução das seqüências de aminoácidos utilizou-se o programaDNA2PR012, específico para seqüências de bibliotecas da New EnglandBiolabs (http://relic.bio.anl.gov/dna2pro12.aspx). Para o cálculo da freqüênciade cada aminoácido presente nos peptídeos seqüenciados e a diversidade dosmesmos, foi utilizado o programa AAFREQ (http://relic.bio.anl.gov/aaf reqs3. aspx).

Para calcular a diversidade e a derivação padrão dos aminoácidos emcada posição nos peptídeos utilizou-se o programa DIVAA(http://relic.bio.anl.gov/divaa.aspx). Foi utilizado o programa M0TIF2(http://relic.bio.anl.gov/motif2.aspx) para a identificação de motivos de trêsaminoácidos dentro a população de peptídeos que foi selecionada contra IgGsde pacientes com NC.

Os motivos protéicos consenso gerados foram analisados quanto ahomologias com proteínas de Taenia sp depositadas no GENEBANK peloprograma BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Para encontrar um ponto máximo de similaridade entre toda a populaçãode peptídeo selecionada e uma proteína de interesse envolvida com NC oucom parasito do gênero Taenia em especial T. solium e T. saginata ou umaproteína encontrada no BLAST por homologia, utilizou-se o programa MATCHdisponível em http://relic.bio.anl.gov/match.aspx.

Para a realização dos testes ELISA os clones considerados maisrelevantes, após análise por bioinformática, devido à presença repetida dedomínios consenso na população de fagos, foram utilizados.

O procedimento seguiu em linhas gerais, os mesmos parâmetrosmencionados para os ensaios anteriores, portanto os clones foram re-amplificados e precipitados com PEG-NaCI, para limpeza do meio de cultura,sendo utilizados os clones NC22, NC28, NC212, NC215, NC223, NC39,NC310, NC336, NC41, NC43 (isolados previamente pelo procedimento debioppaning) tendo como controle negativo em cada placa o fago helper (M13).

Placas de poliestireno (Interlab, Brasil) foram sensibilizadas com o clonea uma concentração de 1X1010 diluídos em 100 pL de tampão carbonatobicarbonato (pH 9,6) e incubadas durante toda a noite sob agitação à 4°C.

Após três lavagens com PBS acrescido de 0,05% Tween 20 (PBS-T)adicionou-se 300 pL de tampão de bloqueio PBS-Tween 20 0,05% - leitedesnatado 5% (PBST-M)1 sendo a placa incubada por mais 1 hora a 37°C, eem seguida lavada 6 vezes. Após as lavagens as amostras de soro foramadicionadas, diluídas 1: 200 em PBST-M pré adsorvido com partículas virais defago M13 (selvagem), sendo a placa incubada por 1 hora a 37°C.

Lavou-se a placa mais 6 vezes para adição do anticorpo conjugado, anti-IgG humana (IgG, Fc HRP - USBiological), diluídos 1:2000 em PBST-M1 comincubação a 37°C por 1 hora. Após as lavagens revelou-se a reação utilizando-se OPD (O-Phenylenediamine dihydrochloroide - Sigma Chemical), numvolume final de 100 μΙ_ de tampão apropriado contendo H2 02 e interrompidapela adição de 25 μΙ_ de H2 S04 2 Ν. A leitura da absorbância foi feita em leitorMultiscan Plus Versão 2.03, com filtro de 492 nm.

Experimentos de inibição foram realizados da mesma forma que o teste-ELISA, exceto pela adição de um passo de pré-incubação do soro comproteínas presentes no extrato total de metacestódeos de T. soliumpreviamente á sua incubação na placa, logo após o bloqueio. Concentraçõesvariadas de proteínas totais foram adicionadas na ordem de 0 a 200 Mg.

O índice ELISA (IE) foi calculado utilizando-se a média das trêsamostras negativas contendo o fago helper (fago sem peptídeo sintético). (IE =densidade ótica de cada amostra/ cut off do helper = média + 2 desviospadrão). As amostras com IE >1 foram consideradas positivas.

A sensibilidade, especificidade, eficiência do diagnóstico (ED) e o índicede Youden (IY) foram determinados (Mineo, JR et al. Pesquisa na áreabiomédica: do planejamento à publicação. Uberlândia: EDUFU: Editora daUniversidade Federal de Uberlândia, 2005. 273p.).

A média geomética dos valores do IR para cada extrato em cada grupofoi calculada utilizando o programa GraphPad Prism Versão 4.0 - Windowssoftware.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS BIOLÓGICAS

(1) Informações gerais do Pedido de Patente

(1) Dados do Requerente:

a) Nome: Universidade Federal de Uberlândia

b) Endereço: Av. João Naves de Ávila, 2121 - Bloco 5L, Bairro Santa Mônica,CEP: 38400-902 - Uberlândia, MG.

(ii) Título da invenção: "PEPTÍDEOS LIGANTES A IMUNOGLOBULINAS GPRESENTES NO SORO DE PACIENTES COM NEUROCISTICERCOSE"

(iii) Número de seqüências constantes do pedido: 20 (vinte)

(iv) Formato para leitura no computador: Microsoft Word; Windows XP;computador tipo PC.

(2) Informações gerais das seqüênciasCaracterísticas das moléculas seqüenciadas:

a) Tipo: PROTEÍNA

b) Nome da Proteína: peptídeo recombinante fusionado à plll

c) Identidade das Seqüências: Seq. ID N2 1 a Seq ID Ns 20.

d) Fonte original das moléculas: bacteriófago M13

3- Informações para Seq. ID N2 1

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linearDescrição da seqüência: Seq. ID N- 1:

His Ala Asp Fen Asp Asn Arg Asn Asp Ser Ser Val1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 2

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidosb) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 2:

Thr Leu Tyr Ser Ala Ser Leu Lys Pro Val Pro Ala

15 8 12

3- Informações para Seq. ID N- 3

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 3:

Leu Asn Pro His Tyr Tyr Pro Met Lys Pro Thr His1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 4

a Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 4:

Ala Asp Asp Trn His Thr Leu Met Pro Pro Glu Arg1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N- 5

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 5:

Ser Val Thr Ala Fen Asp Pro Glu Asn Ile Thr Ile1 5 8 123- Informações para Seq. ID N- 6

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N- 6:His Pro Leu Tyr Asn Leu Gly His Arg Val Asp Lys1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 7

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 7:

His Thr Leu Lys Tyr Pro Thr Ser Ala Ser Gly Ser1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 8

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linearDescrição da seqüência: Seq. ID N2 8:His Glu Ile Arg Ala Pro Fen Asp Ala Ala Ans Lys1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 9

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linearDescrição da seqüência: Seq. ID N- 9:

Asn Met Asn Leu Thr Pro Fen Asp His Trp Asn Asp1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 10

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 10:

Tyr His Gln Thr Fen Ile Pro Fen Ala Leu Pro Lys1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 11

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 11:

Val Ser Ser Asp Asn Arg Asn Asp Fen Asp Ala His1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 12Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 12:

Ala Pro Val Pro Lys Leu SerAIa Ser Tyr Leu Thr15 8 123- Informações para Seq. ID N2 13Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 13:

His Thr Pro Lys Met Pro Tyr Tyr His Pro Asn Leu1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 14

a Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linearDescrição da seqüência: Seq. ID N2 14:

Arg Glu Pro Pro Met Leu Thr His Trn Asp Asp Ala1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 15Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linearDescrição da seqüência: Seq. ID N2 15Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asp Fen Ala Thr Val Ser1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 16Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácidoc) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 16:

Lys Asp Val Arg His Gly Leu Asn Tyr Leu Pro His1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N217

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 17:

Ser Gly Ser Ala Ser Thr Pro Tyr Lys Leu Thr His1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 18

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 18:

Lys Ans Ala Ala Asp Fen Pro Ala Arg Ile Glu His1 5 8 12

3- Informações para Seq. ID N2 19

Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 19:

Asp Asn Trp His Asp Fen Pro Thr Leu Asn Met Asn1 5 8 123- Informações para Seq. ID N- 20Características da seqüência:

a) Tamanho: 12 aminoácidos

b) Tipo: aminoácido

c) Topologia: linear

Descrição da seqüência: Seq. ID N2 20:Lys Pro Leu Ala Fen Pro Ile Fen Thr Gln His Tyr1 5 8 12

Claims (9)

1.- PEPTÍDEOS LIGANTES A IMUNOGLOBULINAS G PRESENTES NOSORO DE PACIENTES COM NEUROCISTICERCOSE, caracterizados porcompreender as seqüências Seq ID N2 1 a Seq ID N2 20.

2.- PEPTÍDEOS RECOMBINANTES LIGANTES Á COMPONENTES E/OUMOLÉCULAS ENVOLVIDAS DIRETA OU INDIRETAMENTE NA RESPOSTAIMUNE À CISTICERCOSE E SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS,caracterizados por compreender as seqüências Seq ID N2 1 a Seq ID N2 20.

3.- PEPTÍDEOS RECOMBINANTES MIMÉTICOS DE ANTÍGENOSENVOLVIDOS NA CISTICERCOSE E SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS,caracterizados por compreender as seqüências Seq ID N2 1 a Seq ID N2 20.

4.- PEPTÍDEOS e SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS de acordo com asreivindicações 1, 2 ou 3 caracterizados por serem usadas em processos deimunodiagnóstico para detecção in vitro ou in vivo como sondas para detectar apresença de moléculas ligantes, como os anticorpos circulantes, que reajamcontra componentes ou moléculas envolvidas direta ou indiretamente emdoenças tal como a cisticercose, preferencialmente neurocisticercose.

5.- PEPTÍDEOS E SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS de acordo com areivindicação 4 caracterizados pelas moléculas ligantes aos anticorposcirculantes serem detectados por ensaios imunológicos, como por testesimunoenzimáticos (tais como enzyme Iinked immunosorbent assay (ELISA),Western Blot, imunofluorescência, imunohistoquímica e outros), testes porimunoaglutinação, sensores eletroquímicos, ou de qualquer outra forma dedetecção relacionada direta ou indiretamente em amostras de fluídos corporais,como sangue, saliva, urina, leite, preferencialmente soro.

6.- USO DOS PEPTÍDEOS E SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS conformedefinidos nas reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por serem integrantes napreparação de uma composição farmacêutica como componente de agentesatuantes no tratamento, de doenças tal como cisticercose, principalmente aneurocisticercose.

7.- USO DOS PEPTÍDEOS E SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS conformedefinidos nas reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por serem utilizados emdiagnósticos como carreadoras de moléculas tais como partículas (radioativas,fluorescentes, magnéticas, biodegradáveis ou outras), drogas diversas ouqualquer outra substância de ação direta ou indireta sobre doenças tal comocisticercose, principalmente a neurocisticercose.

8.- USO DOS PEPTÍDEOS E SUAS SEQÜÊNCIAS REVERSAS conformedefinidos nas reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por ser na preparação deuma composição vacinai, para estimular o sistema imune humano ou animalcontra cisticercose.

9.- COMPOSIÇÃO VACINAL conforme a reivindicação 8, caracterizado porcompreender um ou mais compostos descritos pelas seqüências Seq IDN-IaSeq ID N2 20.