BRPI0805608A2 - método, equipamento e sistema para diagnóstico de estresses e doenças em plantas superiores - Google Patents
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Abstract
MéTODO, EQUIPAMENTO E SISTEMA PARA DIAGNóSTICO DE ESTRESSES E DOENçAS EM PLANTAS SUPERIORES. A presente invenção refere-se a um método, um, equipamento e um sistema de diagnóstico rápido de estresses e doenças em plantas superiores. A metodologia proposta está baseada na hipótese de que quando uma planta entra em desequilíbrio, ocorrem mudanças em seu metabolismo que acabam por alterar a composição química de seus órgãos. Esta mudança química leva a uma mudança nas propriedades fisicas, como a fluorescência das folhas. Em função da complexidade do material das folhas, o método propõe que o sinal seja tratado com métodos estatísticos e a classificação feita através de softwares baseados em aprendizado de máquina. Como exemplo de aplicação da invenção são mostrados resultados para a doença Greening em citros. Atualmente, ela é a pior doença dos citros por não possuir tratamento, ter alta disseminação e afetar todas as variedades de laranjeiras, sendo o diagnóstico realizado através de inspeção visual, o que confere alta subjetividade, grande porcentagem de erro e a doença só é diagnosticada após a expressão dos sintomas (~ 8 meses). Durante a fase assintomática, a árvore infectada é um foco de disseminação da doença. A presente invenção consegue fazer o diagnóstico assintomático de Greening direto na folha com porcentagem de acerto acima de 80%.
Description
Relatório Descritivo de Patente de Invenção "MÉTODO, EQUIPAMENTO ESISTEMA PARA DIAGNÓSTICO DE ESTRESSES E DOENÇAS EM PLANTASSUPERIORES".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método, equipamento e sistema dediagnóstico rápido de estresses e doenças em plantas superiores. Será apresentado comoexemplo o caso da doença Greening em citros onde o diagnóstico é feito através dafolha utilizando-se o referido equipamento baseado em espectroscopia de fluorescênciadotado de softwares para tratamento e classificação dos dados.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O Brasil, desde o início da década de 90, mantém-se como o maiorprodutor mundial de laranja, sendo responsável por 80% do comércio internacional desuco de laranja concentrado e congelado. Para essa produção, avaliada em US$ 900milhões, gasta-se cerca de US$ 410 milhões de insumos, movimentandoaproximadamente US$ 1,5 bilhão com a venda de produtos citrícolas, entre sucos efrutas frescas (FNP Consultoria & Comércio, 2008. Disponível em<http://www.fhp.com.br/agricultura/citros/prod_area_laranja.php> Acesso em 23set.2008). O segundo maior produtor são os Estados Unidos, seguido do México, Chinae Espanha. A Espanha e os Estados Unidos são os principais exportadores de frutasfrescas, o que corresponde respectivamente a 38 e 18% das exportações mundiais(BOTEON, M.; VIDAL, A . J. Citricultura no Brasil e na Flórida. Citricultura Atual, n.23, p. 3,2001).
O Estado de São Paulo tem cerca de 34,2 milhões de plantas emformação e 163,5 milhões de plantas cítricas em produção, respondendo por mais de80% da produção nacional de frutos cítricos. Atualmente, é responsável por 97% dasexportações brasileiras, sendo o grande núcleo dinâmico do complexo citrícolabrasileiro. Este mercado destina cerca de US$ 1,5 bilhão de divisas para o país, Estado emunicípios e emprega 400 mil pessoas. O parque citrícola paulista, juntamente com otriângulo mineiro, conta com 198 milhões de árvores. A colheita de laranja é feitadurante todo o ano devido à composição das variedades como "Hamlin", "Lima","Pêra", "Seleta", "Bahia", "Natal", "Valência" e "Folha Murcha". Destas algumas sãopróprias para a produção de suco, como a "Pêra" que representa 38% do total deárvores, seguida de "Valência", "Natal" e "Hamlin", com respectivamente 17, 25 e 7%(BARROS, Μ. H. C. ; BOTEON, Μ. . O Brasil é o único país que produz o ano inteiro.Hortifruti Brasil, v. 3, p. 21, 2002.)·
Com o avanço da tecnologia no campo, as plantas passaram a sermultiplicadas por enxertia, o que trouxe grandes vantagens em termos de precocidade euniformidades dos pomares. Porém, ao mesmo tempo diminuiu a variabilidade,tornando a cultura um alvo constante de inúmeras pragas e doenças que, encontrandocondições favoráveis ao seu desenvolvimento, são capazes de causar danosirreversíveis. Os custos fitossanitários, junto com os fertilizantes, ultrapassam 60% docusto da produção. A qualidade e a quantidade das frutas cítricas são freqüentementeameaçadas devido aos danos deixados na planta, que dependendo da intensidade doataque, podem torná-la improdutiva ou levar a sua erradicação.
Em meados de 2004 foi relatada uma nova doença nos pomares paulistas.Uma doença devastadora e sem cura, originária da Ásia e África. Huanglongbing(HLB), também conhecida como Greening, hoje é a doença mais temida entre osprodutores de laranja por não possuir cura nem tratamento, por ter um alto poder dedisseminação e afetar todas as variedades comerciais de laranjeiras. A solução maiseficiente até o momento para minimizar perdas é a erradicação das plantas assim queconfirmado o diagnóstico positivo da doença.
O Greening tem como agente causai uma bactéria que habita o floema daplanta hospedeira sendo conhecida como Candidatus Liberibacter. Há três tipos debactérias relacionadas à Greening, Candidatus Liberibacter africanus, CandidatusLiberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus, esta última é o principalagente causai no Estado de São Paulo. Os sintomas da Greening são visualmente osmesmos, independentes de onde ocorre a doença. Ramos, folhas e frutos são afetadospela doença. Inicialmente os sintomas aparecem nos ramos e galhos, que se destacampela cor amarelada em contraste com a coloração verde das folhas dos ramos nãoafetados. As folhas apresentam coloração amarela pálida, com áreas verdes, formandomanchas irregulares e assimétricas (mosqueadas). O fruto fica deformado e assimétrico.
A parte branca da casca, em alguns casos, apresenta uma espessura maior que o normal.Também ocorre redução no tamanho dos frutos e intensa queda.Por não possuir cura, o Greening é hoje a doença mais temida nacitricultura. Ela já foi responsável pela erradicação de mais de 2 milhões de pés de citrose a grande maioria deles em época de maior produtividade.
Em particular, a citricultura paulista apresenta algumas característicaspeculiares que conduzem a uma alta vulnerabilidade da cultura à ocorrência deepidemias de doenças conhecidas, como o declínio, e de novas doenças, como a mortesúbita dos citros (MSC) e a Greening, com importantes conseqüências para asustentabilidade do agronegócio:
1) Os pomares de citros de São Paulo ocupam uma área quase contínua deaproximadamente 615.300 ha (FNP. Citrus. AGRIANUAL 2003: anuário daagricultura brasileira. FNP consultoria & agroinformativos, São Paulo, p.295-314, 2003.), sem grandes variações de relevo ou barreiras físicas e com grandetráfego de pessoas entre eles;
2) As plantas cítricas são perenes e, portanto, estão expostas durante todo o ano epor vários anos ao ataque de pragas e doenças. Além disso, a emissão debrotações novas pode ser observada durante grande parte do ano, o que confereuma continuidade de tecidos suscetíveis e de inóculo entre as estações decultivo;
3) Os pomares paulistas apresentam uma variabilidade genética muito baixa.Apenas quatro variedades de laranjeiras doces (Citrus sinensis Osbeck): 'Pêra-Rio', 'Natal', 'Valência' e 'Hamlin', propagadas vegetativamente por enxertia,representam 92% da citricultura brasileira. O porta-enxerto utilizado emaproximadamente 85% das árvores é o limoeiro 'Cravo' (C. Iimonia Osbeck)devido a sua rusticidade, vigor conferido à copa e resistência às condições dedeficiência hídrica do norte e noroeste do Estado.
Atualmente, há alguns métodos de diagnóstico da Greening. Odiagnóstico mais comum é realizado através de inspeção visual das folhas com sintomasda doença. O controle da Greening no Estado de São Paulo e no Triângulo Mineiro temsido feito através de inspeções visuais periódicas realizadas por técnicos do Fundecitrusou treinados por eles. Este método tem como características a alta subjetividade e agrande porcentagem de erro, além do que, a doença só é diagnosticada após a expressãodos sintomas, ou seja, após um longo período de fase assintomática da árvore(aproximadamente 8 meses). Durante a fase assintomática da doença, a árvore infectadaé um foco invisível de disseminação da doença levando a um atraso muito grande naerradicação do pé. Entretanto, o arranquio após a visualização dos sintomas é a únicaforma de controle atual da doença.
O documento JP2006267092-A descreve um kit de detecção da Greeningem estágios primários, baseando-se no reconhecimento da queda das concentrações demanganês e ferro nos tecidos da árvore infectada. O procedimento de detecção inclui aobtenção de um extrato de material vegetal solúvel em água contendo sistema tampão,seguido de análise em espectrofotometria de absorção. A determinação da doença, noentanto, é inespecífica, uma vez que concentrações baixas de manganês e ferro em umvegetal podem ter variadas causas fisiológicas, incluindo deficiência destes minerais nanutrição da planta. De maneira análoga, o documento JP2004264101-A clama adetecção da Greening em extratos vegetais via a análise da concentração de amido porreação de iodo, apresentando com isto, a mesma desvantagem na inespecificidadefisiológica da deficiência.
Um método descrito no documento W02007021485-A2 promete adetecção das bactérias causadoras da Greening, dentre a detecção de outros váriospatógenos e contaminantes químicos de vegetais e animais, utilizando o efeito Ramande espalhamento da irradiação polarizada aplicada. No entanto, a detecção ficacondicionada a amostras aquosas que são submetidas a um complexo tratamento queinclui secagem sobre superfície metálica coloidal, seguida de contato com membranaultrafiltrante.
O Apta Citrus, ligado ao Instituto Agronômico de Campinas (IAC), é oúnico centro do Estado de São Paulo a emitir laudos técnicos para o diagnóstico daGreening. Este laudo é baseado em uma técnica chamada de PCR (Polymerase ChainReaction) que consiste na análise genética das folhas em busca do DNA da bactériacausadora da Greening. Entretanto, a detecção do DNA da bactéria só é possível emfolhas sintomáticas (mosqueadas), e mesmo assim pode falhar em 10% dos casos. Parao diagnóstico em folhas assintomáticas (sem sinais visíveis da doença), o IAC utilizauma variação mais complexa da técnica, chamada de PCR de tempo real, cujasensibilidade é pelo menos 1000 vezes maior do que a técnica convencional. Entretanto,em função de sua complexidade, o PCR de tempo real não tem sido utilizado emexames de rotina, somente para trabalhos científicos. Apesar da técnica PCR seraltamente eficiente, ela é cara e demorada (BOVÉ, J. M. History, aetiology, fieldidentification, transmission, and world distribution of huanglongbing: a destructive,newly-emerging, century-old disease of citrus. Huanglongbing GreeningInternational Workshop, ν. 1, ρ. 1, 2006) O custo de análise por amostra, utilizando-se PCR convencional, fica em torno de US$ 25.00 e um laudo pode demorar em tornode 20 dias. A utilização de PCR em larga escala é economicamente inviável, além deproduzir um mapeamento de infestação bastante defasado temporalmente. Já odocumento CN1824802-A clama a detecção da doença em árvores assintomáticas emapenas 3 h após a amostragem, no entanto é restrito à detecção causada pela bactériaCandidatus Liberobacter asiaticum Jagoueix e ao citros do tipo mandarina.
E neste momento que a fluorescência se torna um dispositivorelativamente simples e eficiente que pode fazer a diferença. A fluorescência é umatécnica que permite detectar alterações químicas que ocorrem nas folhas de plantasafetadas pela Greening e por outras doenças antes que suas manifestações visuais sejamperceptíveis.
No documento BR200201249-A, a auto-fluorescência de folhas, inatos eramos permite a detecção de cancro-cítrico em citros assintomáticos, após a exposição afontes de luz com comprimentos de onda curtos. No entanto, a técnica se limita àdetecção desta doença, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri.
Esta invenção desenvolvida na Embrapa Instrumentação Agropecuáriatem como objetivo proteger uma nova metodologia e equipamento de diagnóstico deestresses e doenças em plantas superiores, tal como a Greening dos citros. Trabalhorealizado anteriormente no Laboratório de Óptica e Lasers da Embrapa InstrumentaçãoAgropecuária LOLEIA (documento PI 05059757-7), mostrou a possibilidade de sedistinguir folhas saudáveis de doentes, e também, de se distinguir doenças (MSC eDeclínio) através da razão entre os máximos do espectro de emissão de fluorescênciautilizando-se espectrômetros comerciais. A idéia básica da metodologia proposta era aseguinte: quando a planta entra em desequilíbrio, seja ele causado por stress ou pordoença, ocorrem mudanças em seu metabolismo que acabam por alterar a composiçãoquímica de seus órgãos. Esta mudança química leva a uma mudança nas propriedadesfísicas, como por exemplo, reflectância e fluorescência das folhas. Baseado nestahipótese foi desenvolvido um estudo em laboratório, utilizando-se equipamentoscomerciais, a respeito da emissão de fluorescência das folhas de citros saudáveis edoentes. Observou-se a possibilidade de diferenciar árvores saudáveis, de árvores comDeclínio ou com MSC através da razão entre os picos de emissão de fluorescência,método descrito na PI 05059757-7.
No pedido PI 05059757-7, a idéia de um módulo portátil para realizaçãode medidas espectroscópicas em folhas foi protegida para diagnóstico da morte súbitados citros com excitação utilizando lâmpada, Ied ou laser na região de 420 a 480 nm.Em 2006 o LOLEIA montou um sistema utilizando fluorescência induzida por laser(FIL) semelhante ao proposto no documento PI 05059757-7, com uma sonda construídacom fibras ópticas e sistema de detecção constituído por conjunto de fotodiodoscalibrados que permite a obtenção do espectro de emissão da folha de formaextremamente rápida (~ 1 s) e excitação com laser em 470 nm. Com este novo sistematornou-se possível a realização de um grande volume de amostras em tempo reduzido.
Nesta época o Greening já era considerada a pior doença do setor citrícola brasileiro, eentão o LOLEIA iniciou pesquisas para avaliar a possibilidade do diagnóstico daGreening utilizando a espectroscopia de fluorescência. Com os resultados iniciaisobservou-se que a melhor distinção para a doença Greening era observada com outrolaser de excitação com comprimento de onda em 561 nm. Com o módulo portátilreformulado, foi realizado um estudo criterioso para avaliar a possibilidade dediagnóstico do Greening através das folhas. Deste estudo, resultou uma novametodologia de diagnóstico de doenças diferente da proposta na PI 05059757-7 (paraMSC). Embora na metodologia atual se utilize um equipamento similar ao protegidopara a MSC, com comprimento de onda de excitação diferente, o sistema como um todoé totalmente diferente e discutiremos abaixo as principais diferenças.
No sistema atual não são utilizadas razões entre picos como nodocumento PI 05059757-7. Foi desenvolvido um software para coletar os espectros defluorescência e realizar um tratamento estatístico dos mesmos (Figuras 1 e 2) com ointuito de avaliar de forma mais criteriosa todo o espectro de emissão para conseguir umnúmero maior de informações, que possibilite um diagnóstico mais preciso das doenças.
Após serem tratadas pelo método estatístico de Análise de ComponentesPrincipais (PCA, do inglês Principal Component Analysis), nitidamente eram definidosaglomerados em gráficos tridimensionais das três primeiras componentes principaiscomo mostra a Figura 3.
Como o sistema ficou muito sensível, ele também diferenciava avariedade da copa e do porta-enxerto, motivo pelo qual foi elaborado outro pedido depatente com este tema, o "Método e Equipamento para Certificação de Mudas deCitros". Desta forma, para cada combinação de copa e porta-enxerto foi realizado umprocesso de calibração do sistema. Para cada combinação de copa e porta-enxerto erautilizado um conjunto de amostras com folhas saudáveis e doentes para fornecerinformações ao sistema de espectros típicos de cada classe de amostras. Em geral foramavaliadas as seguintes classes: amostras saudáveis, doentes com Greening na fasesintomática, doentes com Greening na fase assintomática, com MSC e com Declínio.
Utilizando-se ferramentas de aprendizado de máquina, um outro softwarefoi desenvolvido de tal forma que o banco de dados de calibração era utilizado para queo sistema pudesse ser capaz de medir uma folha totalmente desconhecida e classificar ostatus da árvore como saudável ou doente, e se doente identificar a doença. No caso daGreening, foi possível não apenas identificar a doença na fase sintomática comotambém na fase assintomática. Este resultado mostra o grande potencial da técnica parapossibilitar a realização de diagnóstico precoce da doença.
Na patente da MSC a análise espectroscópica só era realizada após aobtenção de um mapeamento do pomar por imagens de fluorescência, que faziam adistinção entre árvores saudáveis e doentes. Na patente atual, o diagnóstico é feitoutilizando-se apenas a espectroscopia de fluorescência.
Portanto, diferente da patente PI 05059757-7, o equipamento apenascomo foi protegido não é capaz de realizar diagnóstico automatizado. O sistemacompleto necessita do software de aquisição e tratamento estatístico dos dados, bancode dados de calibração e do software classificador. Sendo assim, nesta patentesolicitamos a proteção do sistema completo composto pelo equipamento para realizaçãode medidas de espectroscopia de fluorescência, softwares de aquisição e tratamento dedados, banco de dados e software classificador para realização de diagnóstico deGreening através de folhas de citros.
SUMÁRIO DA INVENÇÃOA presente invenção vem mostrar que estresses e doenças em plantassuperiores, como Greening, por exemplo, principal problema atual da citriculturabrasileira, podem ser detectadas de forma rápida, precisa, precoce e economicamenteviável por meio de espectroscopia de fluorescência realizada diretamente nas folhas eoutras partes da planta, em conjunto com a criação de banco de dados e modelos depredição ou discriminação estatísticos, matemáticos e/ou computacionais deaprendizado de máquina, contribuindo assim para o controle de doenças.
A primeira concretização da presente invenção é um Método paradiagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores, particularmente Greening,caracterizado por compreender os seguintes estágios:
a) Calibrar o software classificador, coletando o espectro de emissão de pelo menos150 folhas de árvores doentes e 150 folhas de árvores saudáveis;
b) Coletar pelo menos 03 folhas de cada árvore geo-referenciada do pomar a seravaliado;
c) Detectar e medir o espectro de emissão de fluorescência de todas as folhascoletadas em (b);
d) Analisar os espectros gerados em (c); e
e) Gerar um laudo para cada árvore.
f) Baseados nas coordenadas e no laudo de cada árvore, efetuar o levantamento domapa de sanidade do pomar;
Uma segunda concretização da presente invenção é um equipamento paradiagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores caracterizado por compreenderuma fonte de excitação, um cabo óptico de excitação, um filtro óptico ajustável, umacoplador de fibra óptica, um cabo óptico misto, uma sonda, um cabo óptico deemissão, um miniespectrômetro e um software classificador processador de dados.
Uma concretização adicional da invenção é um sistema caracterizado porusar o referido método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores emassociação com um equipamento de espectroscopia para diagnosticar doenças eestresses em plantas superiores, através de espectroscopia de emissão de fluorescência.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura I - Tela do software de aquisição.Figura 2 - Tela do software para tratamento dos dados.Figura 3 - Gráfico das três primeiras componentes principais geradas a partir dosespectros de emissão de fluorescência coletados pelo sistema portátil desenvolvido peloLOLEIA para laranjeiras Pêra em porta-enxerto Sunky saudáveis (38), com Greeningsintomáticas (39) e com Greening assintomáticas (40).
Figura 4 - Tela do software classificador ressaltando a janela de classificação (41).
Figura 5 - Equipamento para diagnóstico de Greening
Figura 6 - Espectros típicos de emissão de folhas de laranja 'Hamilin' com porta-enxerto de limão Cravo obtidos no sistema portátil de espectroscopia de fluorescênciainduzida por laser (FIL) desenvolvido e construído no (LOLEIA).
Figura 7 - Gráfico de PCA gerado através dos espectros de folhas de laranjeiraHamilin' com porta-enxerto de limão 'Cravo' sadias, e doentes com GA, GS, MSC eDeclínio em estação chuvosa. Todos os espectros foram obtidos no sistema portátil deespectroscopia de fluorescência induzida por laser (FIL) desenvolvido e construído no(LOLEIA).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em princípio, para se desenvolver o método proposto nesta invenção,realizou-se uma caracterização espectroscópica das folhas e pigmentos fotossintéticosextraídos das folhas para que fossem observadas as diferenças espectrais entre ummaterial saudável e doente utilizando-se um espectrômetro de fluorescênciaconvencional.
Após este estudo, foram realizadas alterações em um equipamentomontado para diagnóstico da MSC (PI 05059757-7) de tal forma que viabilizasse odiagnóstico da Greening. Entretanto somente as alterações ópticas do equipamento nãoforam suficientes.
Na Figura 5 temos um esquema do novo sistema montado objeto dapresente invenção. 42- folha de citros a ser analisada; 43- sonda; 44- cabo óptico; 45-aclopador de fibra óptica; 46- filtro regulável; 47- fibras ópticas de excitação; 48- laserde diodo; 49- fibra óptica de emissão; 50- miniespectrômetro; 51- lap-top; 52-sinal/tratamento de dados; 53- banco de dados; 54- software classificador; 55- laudo; nodetalhe aparece o perfil lateral da sonda (56), que contém os seguintes elementos: 57 -fibras ópticas de excitação; e 58 - fibra óptica de emissão.Para o diagnóstico da Greening foi desenvolvida uma nova metodologiaque também é objeto da presente invenção. A metodologia é composta por três estágios:1 - Construção de um banco de dados - Inicialmente o sistema precisade um banco de dados com informações de espectros de emissão de fluorescênciapossíveis de uma folha de uma dada combinação de copa e porta-enxerto. Para tanto sãocoletadas pelo menos 150 folhas de árvores saudáveis, 150 folhas de árvores doentessintomáticas e 150 folhas de árvores doentes assintomáticas. Os espectros destas 450folhas são coletados pelo equipamento do presente pedido, cuja patente está sendosolicitada, e são tratados por métodos estatísticos através de um software tambémdesenvolvido dedicado para o equipamento.
O programa desenvolvido para a coleta de dados permite ajustar váriosparâmetros de aquisição (Figura 1), entre os quais o tempo de integração (em ms), que éo intervalo de tempo no qual o miniespectrômetro coleta luz antes de enviar aoprograma as informações sobre o espectro (1). Permite modificar também o número decoletas que o programa faz para compor, pelo cálculo da média, um único espectro (2);trata-se de um procedimento útil na redução do ruído. Existe ainda o ajuste do boxcar(3), que controla a intensidade da suavização do espectro aplicada pelo programa.
Outra classe de elementos ajustáveis na tela principal diz respeito àvisualização dos espectros coletados. E possível determinar os limites inferior e superiordos comprimentos de onda exibidos na tela, em nm (4), assim como da intensidade (5),em unidades arbitrárias. E possível ainda visualizar um ou mais espectros já coletados,bem como removê-los da tela mais tarde (6). Nesse caso, os espectros são exibidos emcores diferentes, e o usuário tem a opção de habilitar ou desabilitar uma legenda geradaautomaticamente (7).
Havendo mais de um espectro na tela, é necessário que o usuárioespecifique qual deles deverá ser salvo no banco de dados (8). Para salvar um espectro,porém, é necessário fornecer a descrição do mesmo, como a natureza da excitação que ogerou (9) e da amostra analisada. Os dados sobre a amostra exigidos pelo programa são:as variedades do porta-enxerto (10) e da copa (11), a doença que contamina a planta(12) e o local de origem da mesma (13). Os conjuntos de opções para cada um dessescasos podem ser editados clicando-se no botão à direita dos respectivos campos.Há ainda dados sobre a amostra que devem ser preenchidos pelo própriousuário: o número do talhão (14), da rua (15) e do número (16) que identificam a plantae a data da coleta da amostra (18). O número da folha (17) é atribuído automaticamentepelo programa, de modo a evitar confusão no caso de haver mais de uma amostraprocedente da mesma planta. Também a data de aquisição do espectro (19) é registradaautomaticamente. O programa permite ainda o registro de observações adicionais que ousuário porventura tenha a fazer sobre a amostra em questão (20).
Pela tela de aquisição o usuário pode ainda iniciar ou interromper avisualização instantânea dos dados na tela (21), acessar as configurações dominiespectrômetro (22) e, finalmente, salvar na base de dados o espectro atualmenteselecionado, juntamente com as informações inseridas nos respectivos campos (23).
A análise dos dados armazenados (Figura 2) deve ser identificada por umnome escolhido pelo usuário (24). Este deve também selecionar o intervalo dosespectros a ser utilizado na análise (25) e especificar o número de casas decimais a serlevado em consideração (26). Há ainda a opção de escolher o valor limite do desviopadrão associado a cada comprimento de onda; variáveis cujo desvio padrão é inferior aesse limite são desconsideradas, de modo a evitar a ocorrência de divisões por zero (27).
Outro problema é evitado estabelecendo-se uma diferença mínima entre doiscomprimentos de onda como requisito para que o programa os considere como variáveisdistintas (28). Isso impede que eventuais diferenças mínimas de arredondamento dovalor dos comprimentos de onda feitas pelo programa resultem em erro na análise. Hátambém um campo disponível (29) para que o usuário registre observações sobre aanálise em questão.
E possível selecionar os espectros que serão visualizados na tela (31),escolher entre distingui-los ou não pelo emprego de diferentes cores (33), excluir daanálise os espectros selecionados (32) ou exportá-los em formato legível para outrosprogramas (37).
Os procedimentos de análise disponíveis são o cálculo do quociente entreas intensidades dos pontos de máximo ou mínimo e o PCA. No primeiro caso, o usuáriopode escolher os limites dos dois intervalos, dentro dos quais serão calculados os pontosde máximo (ou de mínimo) que serão usados para a determinação do índice (30), etambém visualizar graficamente o resultado (35). No segundo, o usuário deve escolhertrês componentes principais (34) a fim de visualizar o gráfico tridimensional que ascontém (37).
Obtém-se então um gráfico tridimensional (Figura 3) com osaglomerados que separam as diferentes classes de árvores (saudáveis (38), sintomáticas(40) e assintomáticas (39)) e um banco de dados com informações características decada classe de amostra.
2 - Software classificador - Utilizando-se ferramentas de aprendizadode máquina, estatísticas e/ou matemáticas e o banco de dados, um modelo classificadoré construído.
Na figura 4 é indicada a janela onde o diagnóstico da folha é mostrado(41). A classificação é praticamente instantânea para o espectro que acaba de ser salvo eo diagnóstico fornecido segundo os critérios de um classificador previamente gerado.Juntamente com o resultado, a tela exibe uma estimativa do grau de segurança dodiagnóstico efetuado (41). O usuário tem a opção de trocar, a qualquer momento, oclassificador em uso por outro que esteja disponível no banco de dados do programa.
3 - Avaliação do pomar - São coletadas pelo menos 3 folhas de cadaárvore do pomar. As árvores são georeferenciadas para possibilitar o levantamento domapa de infestação. O espectro de emissão das folhas é medido e o laudo para cadaárvore é obtido pela prevalência de diagnóstico resultante das folhas coletadas. Destaforma, cada árvore georeferenciada tem um laudo e é possível se construir o mapa deinfestação.
Em experimentos realizados com o novo equipamento e metodologia emum talhão de 1000 árvores de laranjeira Pêra em limão cravo obteve-se um índice deacerto acima de 80% , mesmo em árvores assintomáticas.
EXEMPLO
No gráfico da Figura 6 são apresentados espectros típicos obtidos nosistema portátil com laser em 56 Inm para Hamilin em Limão-cravo. Esse conjunto deamostras possui plantas sadias (59), com Declínio (60), com Morte Súbita dos Citros(61), com Greening assintomáticas (62) e Greening sintomáticas (63).
Com os dados de todo o conjunto de folhas coletadas foram feitasanálises de PCA para melhor separação das doenças, como mostrado na Figura 7,contendo os mesmos tipos de amostras: sadias (64), com MSC (65), com Declínio (66),com Greening assintomáticas (67) e com Greening sintomáticas (68).
Com este conjunto de dados foi construído um software cujo modeloclassificador é capaz de diagnosticar folhas de Hamilin em Limão-cravo com precisãosuperior a 80%.
Claims (25)
1.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores, caracterizadopor usar espectroscopia, compreendendo os seguintes estágios:a) Calibrar o software classificador, coletando o espectro de emissão de pelo menos 150 folhas de árvores doentes e 150 folhas de árvores saudáveis;b) Coletar pelo menos 03 folhas de cada árvore georeferenciada do pomar a seravaliado;c) Detectar e medir o espectro de emissão de fluorescência de todas as folhascoletadas em (b);d) Analisar os espectros gerados em (c); ee) Gerar um laudo para cada árvore.
2.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores de acordocom a reivindicação 1, caracterizado por diagnosticar Greening em citros.
3.) Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por diagnosticar Greeningem citros em diferentes combinações de copa e porta-enxerto.
4.) Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser usado paraelaboração de um mapa de sanidade do pomar.
5.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do sinal ser difratado e detectado porum miniespectrômetro.
6.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores, de acordocom a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da calibração prévia do sistema serfeita utilizando ferramentas de aprendizado de máquina.
7.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores, de acordocom a reivindicação 1, caracterizado por usar software classificador dedicado aosistema.
8.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das variações nos espectros defluorescências refletirem o resultado de alterações na composição química dosconstituintes das plantas.
9.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores de acordocom a reivindicação 8, caracterizado pelo fato dos constituintes serem fluorescentes.
10.) Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato dos constituintesfluorescentes serem pigmentos fotossintéticos da planta.
11.) Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato dos constituintesfluorescentes serem, principalmente, as clorofilas a e b, e alguns pigmentosacessórios, tais como carotenóides e xantofilas.
12.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores de acordocom as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato das folhas fluorescerem emcomprimentos de ondas entre 600 e 800 nm.
13.) Método para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores de acordocom as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato do comprimento de ondautilizado para diagnóstico da Greening ser de cerca 561 nm.
14.) Equipamento para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiorescaracterizado por compreender uma fonte de excitação, um cabo óptico deexcitação, um filtro óptico ajustável, um acoplador de fibra óptica, um cabo ópticomisto, uma sonda, um cabo óptico de emissão, um miniespectrômetro e um softwareclassificador processador de dados.
15.) Equipamento para diagnóstico de doenças e estresses em plantas superiores deacordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato da fonte de excitação dafluorescência ser lâmpada, Ied ou laser.
16.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato da fonte deexcitação da fluorescência emitir radiação na região do ultravioleta até o visível(200 a 700 nm).
17.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato da luz deexcitação ser conduzida até a folha através de fibra óptica.
18.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato da coleta dosinal ser feita através de fibra óptica.
19.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do sinal serdifratado por grade de difração.
20.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato do softwarede análise e diagnóstico utilizar modelos de aprendizado de máquina, estatísticose/ou matemáticos.
21.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato doequipamento ser responsável pela realização de medidas espectroscópicas deemissão de fluorescência.
22.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato do caboóptico misto compreender fibras ópticas de excitação e fibras ópticas para coletaremissão.
23.) Equipamento de acordo com a reivindicação 22 caracterizado pelo fato do caboóptico misto compreender 6 fibras ópticas de excitação e 1 fibra óptica para coletaremissão.
24.) Equipamento de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pela da detecção dosinal ocorrer através de arranjo de fotodiodos calibrados.
25.) Sistema caracterizado por usar o método de acordo com a reivindicação 1 emassociação com um equipamento de acordo com a reivindicação 14 paradiagnosticar doenças e estresses em plantas superiores, através de espectroscopia deemissão de fluorescência.
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