BRPI0806044A2 - método e kit para determinação de agentes moduladores de sirtuìnas, processo para modulação de sirtuìnas, compostos moduladores de sirtuìnas e composições compreendendo os mesmos - Google Patents
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Abstract
MéTODO E KIT PARA DETERMINAçãO DE AGENTES MODULADORES DE SIRTUINAS, PROCESSO PARA MODULAçãO DE SIRTUINAS, COMPOSTOS MODULADORES DE SIRTUìNAS E COMPOSIçõES COMPREENDENDO OS MESMOS. A presente invenção descreve um kit e um método para a determinação de agentes moduladores de sirtuínas, especificamente a modulação da expressão das sirtuínas, através da detecção e comparação dos mRNAs das sirtuinas e da <225>-actina. A presente invenção provê ainda um processo para a modulação da atividade de sirtuinas bem como compostos e composições farmacêuticas capazes de modular a expressão gênica das sirtuinas.
Description
Relatório Descritivo de Patente de Invenção
Método E Kit para Determinação de Agentes Moduladores deSirtuínas, Processo para Modulação de Sirtuínas, CompostosModuladores de Sirtuínas ε Composições Compreendendo os Mesmos
Campo da Invenção
A presente invenção descreve um kit e um método para a determinaçãode agentes moduladores de sirtuínas, especificamente a modulação daexpressão das sirtuínas, através da detecção e comparação dos mRNAs dassirtuínas e da β-actina.
A presente invenção provê ainda um processo para a modulação daatividade de sirtuínas bem como compostos e composições farmacêuticascapazes de modular a expressão gênica das sirtuínas.
Antecedentes da Invenção
As sirtuínas fazem parte de um grande grupo de enzimas, a família dasdesacetilases de histonas ou HDACs1 cujo papel principal é reverter aacetilação regulatória das proteínas tipo histona, influenciando diretamente naestrutura dos nucleossomos e conseqüentemente na transcrição gênica. Alémdas histonas, um crescente número de proteínas tem sido identificado comoalvo das HDACs, entre eles estão proteínas estruturais e diversos fatores detranscrição. As sirtuínas afetam uma ampla série de processos fisiológicos,incluindo regulação da expectativa de vida, regulação da atividade metabólica eenzimática, resposta celular ao stress, neurodegeneração, reparo de DNA,recombinação de DNAr, apoptose e controle de proliferação celular.Atualmente, as sirtuínas são alvos importantes de pesquisas relacionadas àrestrição calórica, câncer, doenças neurodegenérativas, diferenciaçãomuscular, inflamação e obesidade.Diversos estudos foram conduzidos de forma a auxiliar na identificaçãode moduladores de sirtuínas. Blander e colaboradores ("SIRT1 shows nosubstrate specificity in vitro" J Biol Chem. 280(1 1):9780-5, 2005) descreveramum método inédito até então para identificar especificidade para umaseqüência de deacetilase a partir do uso de bibliotecas de peptídeos contendoIisina acetilada. Após a incubação com SIRT1, o subconjunto de peptídeosdeacetilados foi capturado seletivamente usando um Iinker fotolábil de N-hidroxisuccinimida biotinilado e pequenas esferas de streptavidina e analisadossubseqüentemente. Tais estudos revelaram que o reconhecimento do substratopelo SIRT1 independe da seqüência de aminoácidos próxima à Iisina acetilada.Já Garske et al. ("SIRTI top 40 hits: use of one-bead, one-compound acetyl-peptide Iibraries and quantum dots to probe deacetylase specificity."Biochemistry 45(l):94-101, 2006) também descrevem um método inédito e deelevada escalabilidade para determinação da especificidade de substratos dedeacetilases usando uma biblioteca de peptídeos acetilados de uma-esfera,um composto (OBOC). Uma biblioteca de 104.907 peptídeos únicos foiconstruída e tríada utilizando a deacetilase SIRT1 NAD+-dependente paraseqüências de peptídeos mais eficientes. Como resultado, foi encontrado queSIRT1 pode discriminar substratos peptídicos dependendo do contexto em queos mesmos se encontram.
O documento WO 08/027379 descreve um método para monitorar amodulação da atividade de sirtuínas através da determinação do nível deacetilação de substratos da surtuína.
Os documentos WO 07/149270 e WO 06/096780 descrevem um métodopara triar moléculas moduladoras da atividade de sirtuínas compreendendocomo etapa determinante a determinação do nível de acetilação de umdeterminado peptídeo.
O documento WO 07/084162 descreve novas moléculas com atividadeinibidora de sirtuínas, úteis no tratamento e/ou prevenção de câncer e doençasautoimunes.Os estudos acima ilustram as dificuldades e discrepâncias que surgemde métodos para identificar substratos específicos para sirtuínas. Nos casos debibliotecas de peptídeos, tais bibliotecas foram limitadas a seqüênciaspequenas e são influenciadas por quais aminoácidos podem ser incorporados,e fornecem informações sobre seqüências artificiais em um contexto artificial.
Como os métodos propostos pelo estado da técnica não mostram umconsenso em seus resultados, pode-se ver que há a necessidade de ummétodo para a identificação de moduladores de sirtuína e em um ambientecelular apropriado. A identificação de agentes moduladores ajudará a elucidar opapel das sirtuínas na célula e irá facilitar o desenvolvimento de ensaiosdiagnósticos e o tratamento de pacientes com moduladores de sua atividade,bem como métodos para identificar novos compostos moduladores.
A presente invenção difere de todos os documentos do estado datécnica por propor um novo método para a determinação da modulação daatividade de sirtuínas através da modulação de sua expressão gênica. Nenhumdos documentos do estado da técnica descreve ou sequer sugere que aatividade das sirtuínas pode ser modulada com agentes que modulem suaexpressão. O estado da técnica até o momento se preocupou somente com amodulação da atividade enzimática da sirtuína já expressa na célula.
Sumário da Invenção
Em um primeiro aspecto a presente invenção prove um método e um kitpara a determinação de agentes moduladores da expressão gênica dassirtuínas.
É portanto um objeto da presente invenção um método para adeterminação de agentes moduladores compreendendo as etapas de:
a) contactar célula(s) de tecido(s) compreendendo pelo menos um geneda família das sirtuínas e o gene da β-actina, com um agente modulador;
b) determinar a abundância relativa do mRNA do(s) gene(s) da famíliadas sirtuínas;
c) determinar a abundância relativa do mRNA do gene da β-actina; ed) determinar a razão mRNA 5//?77mRNA β-actina.
Em especial, célula(s) de tecido(s) compreendendo os genes citadosacima são de zebrafish.
É um adicional objeto da presente invenção um kit para a determinaçãode agentes moduladores compreendendo:
a) meios para determinar a abundância relativa do mRNA dos genes dafamília das sirtuínas; e
b) meios para determinar a abundância relativa do mRNA do gene da β-actina.
Em um segundo aspecto, a presente invenção provê um processo paraa modulação de sirtuínas, onde a modulação das sirtuínas é realizada pelamodulação da expressão gênica das sirtuínas.
É um objeto adicional da presente invenção um processo para amodulação de sirtuínas compreendendo a etapa de contactar um agentemodulador da expressão de sirtuínas com células compreendendo pelo menosum gene da família das sirtuínas.
É um objeto adicional da presente invenção um agente modulador daexpressão de sirtuínas.
É um objeto adicional da presente invenção uma composiçãofarmacêutica compreendendo:
a) um agente modulador da expressão de sirtuínas; e
b) um veículo farmaceuticamente aceitável.
Descrição das Figuras
A Figura 1 mostra uma das árvores geradas que foi construída utilizandodistância proporcional (distância-p) através do método de Neighbour-Joining(NJ)1 utilizando o programa MEGA4.0.2. A árvore apresenta sete ciadosterminais bem resolvidos com alto valor de suporte, correspondendo a cadauma das sirtuínas descritas. A árvore filogenética agrupou consistentemente asseqüências ortólogas SIRT1-SIRT7 de Danio rerio (Dr), Gallus gal/us (Gg)1 Musmuscu/us (Mm) e Homo sapiens (Hs)A Figura 2 mostra o padrão de expressão de SIRT1 (A), SIRT2 (B)1SIRT3 (C)1 SIRT3.2 (D)1 SIRT4 (E)1 SIRT5 (F)1 SIRT6 (G) and SIRT7 (H) emzebrafish. Esses resultados são expressos como uma razão de mRNA desirtuina/p-actina (mean ± S.E.) de quatro experimentos independentesreplicados. No eixo Υ, I é taxa de RNAm, no eixo X, 1 é baço, 2 é brânquias, 3é cérebro, 4 é coração, 5 é fígado, 6 é gônada feminina, 7 é gônada masculina,8 é músculo e 9 é rim. I é β-actina, Il é SIRT1, Ill é SIRT2, IV é SIRT3, V éSIRT3.2, Vl é SIRT4, Vll é SIRT5, Vlll é SIRT6, IX é SIRT7.
A Figura 3 mostra a avaliação do efeito do resveratrol na modulação daatividade de sirtuínas de zebrafish em diversos tecidos em quatro animais(grupos de 1 a 4 no eixo X). No eixo Υ, I é taxa de RNAm X, a é músculo e b éfígado.
Descrição Detalhada da Invenção
Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar umadas inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, oescopo da mesma.
Sirtuínas
Para efeitos dessa invenção, a expressão "sirtuínas" se refere àsseqüências (DNA e/ou RNA) bem como as respectivas proteínas,compreendendo pelo menos 50% de homologia com as seqüências (DNA e/ouRNA) bem como as respectivas proteínas dos genes escolhidos do grupo quecompreende SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7 ecombinações dos mesmos.
As respectivas seqüências dos genes SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4,SIRT5, SIRT6, SIRT7 estão descritas no GenBank, sob os códigos de acessopara as espécies Danio rerio (XP_001334440, AAH67165, XP_684225,XP 690925 (SIRT 3.2), AAH83418, AAH75987, NP_001002071, XP_698800),Homo sapiens (Q96EB6, Q8IXJ6, Q9NTG7, Q9Y6E7 Q9NXA8, Q8N6T7,Q9NRC8) Mus muscu/us (BAD38898, BAD38897, XP_420920, XP_415273,ΧΡ_418925, NΡ_001034409, ΝΡ_001026277) e Gallus gallus (ΝΡ_062786,ΝΡ_071877, CAJ18608, Q8R216 ΝΡ_849179, ΝΡ_853617, ΑΑΡ83960).
Em uma realização preferencial, as sirtuínas úteis na presente invençãopossuem seqüências de DNA com homologia de pelo menos 50% com asseqüências ilustradas na Figura 1.
β-Actina
Para efeitos dessa invenção, a expressão "β-actina" se refere àsseqüências (DNA e/ou RNA) bem como as respectivas proteínas,compreendendo pelo menos 50% de homologia com as seqüências (DNA e/ouRNA) bem como as respectivas proteínas do gene da β-actina.
Preferencialmente a seqüência da β-actina está descrita no GenBanksob o número de acesso NM_001101.
Células compreendendo pelo menos um gene da família das sirtuínas
Para efeitos dessa invenção, células adequadas são células de animaisvertebrados. Preferencialmente, o vertebrado é escolhido do grupo quecompreende peixes, aves, mamíferos e combinações dos mesmos.
Em uma realização preferencial o vertebrado é escolhido do grupo quecompreende Danio rerio, Gallus gallus, Mus musculus, Homo sapiens ecombinações dos mesmos.
A célula é escolhida de diversos tecidos do animal. Exemplos deórgãos/tecidos incluem, sem contudo limitar, cérebro, rim, gônadas (masculinae feminina), baço, brânquias, fígado, músculo, coração e combinações dasmesmas.
O zebrafish (Danio rerio) apresenta inúmeras características vantajosasque primeiramente o tornaram um modelo vertebrado proeminente paraestudos da biologia do desenvolvimento e da genética e, mais tarde, estendidoàs outras áreas das ciências biológicas. O zebrafish combina a relevância deser um vertebrado com a escala de estudo de um organismo invertebrado. Oconhecimento acumulado proveniente do "Projeto Genoma Zebrafisti' aliado àcapacidade de absorver rapidamente substâncias químicas diretamente daágua fazem com que, cada vez mais, seja também utilizado como espéciemodelo para estudos toxicológicos, farmacológicos e de doenças humanas.
A identificação dos genes relacionados às sirtuínas no genoma dezebrafish e a determinação de seus padrões de expressão em diferentestecidos constitui uma ferramenta extremamente poderosa para a triagem demoléculas moduladoras das atividades destas proteínas.
Método de determinação de Agentes Moduladores
O método de determinação de agentes moduladores da expressãogênica de sirtuínas compreende as etapas de:
a) contactar células compreendendo pelo menos um gene da família dassirtuínas e o gene da β-actina, com um agente modulador;
b) determinar a abundância relativa do mRNA do gene da família dassirtuínas;
c) determinar a abundância relativa do mRNA do gene da β-actina; e
d) determinar a razão mRNA S//?77mRNA β-actina.
Preferencialmente, a determinação das abundâncias relativas érealizada através de ensaios de amplificação do mRNA para ambos os genes.
Tais ensaios são de conhecimento comum do técnico no assunto e nãoprecisam ser descritos aqui com maiores detalhes.
Caso o composto possua uma razão mRNA S//?77mRNA β-actina maiorque 1, o composto será classificado como um modulador positivo (amplificador)da expressão gênica das sirtuínas.
Caso o composto possua uma razão mRNA S//?77mRNA β-actina menorque 1, o composto será classificado como um modulador negativo (inibidor) daexpressão gênica das sirtuínas.
Composição farmacêutica
Para efeitos desta invenção, por "composições farmacêuticas" entende-se toda e qualquer composição que contenha um princípio ativo, com finsprofiláticos, paliativos e/ou curativos, atuando de forma a manter e/ou restaurara homeostase, podendo ser administrada de forma tópica, parenteral, enterale/ou intratecal.A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para sereferir a compostos, materiais, composições, e/ou forma de dosagem que são,dentro do âmbito da medicina, apropriados para uso em contato com os tecidosde humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica,ou outro problema ou complicação, proporcional com uma relação razoável debenefício/risco.
A composição da presente invenção pode ser administrada em forma dedosagem oral, como tabletes, cápsulas (cada qual inclui a liberação sustentadaou formulações com tempo de liberação) pílulas, pós, granulados, elixires,tinturas, suspensões, xaropes, e emulsões.
A composição farmacêutica da presente invenção compreende:
a) um agente modulador da expressão de sirtuínas; e
b) um veículo farmaceuticamente aceitável,
onde a razão mRNA S/R77mRNA β-actina da célula sem a presença doagente modulador é diferente da razão mRNA S//?77mRNA β-actina da célulasem a presença do agente modulador.
Exemplo
Foram identificados oito genes relacionados às sirtuínas no genoma dezebrafish SIRT1-7 e um parálogo da S/RT3, chamada de SIRT3.2 (Tabela 1)utilizando as seqüências deduzidas de aminoácidos de Homo sap/ens(Q96EB6, Q8IXJ6, Q9NTG7, Q9Y6E7 Q9NXA8, Q8N6T7, Q9NRC8) Musmuscu/us (BAD38898, BAD38897, XP_420920, XP_415273, XP_418925,NP_001034409, NP_001026277) e Gallus gal/us (NP_062786, NP_071877,CAJ18608, Q8R216 NP_849179, NP_853617, AAP83960). A identidade decada uma das oito seqüências de zebrafish foi confirmada através de análisesfilogenéticas (Figura 1)
Tabela 1. Resumo de Seqüências: Número de acesso, seqüência dos primerse condições de amplificação por PCR.
Condições PCR<table>table see original document page 10</column></row><table>
O mapeamento do padrão e dos níveis de expressão de cada um dosoito genes relacionados às sirtuínas de zebrafish foi determinado em oitotecidos (baço, brânquias, cérebro, coração, fígado, gônadas femininas egônadas masculinas, músculo esquelético e rins), através da análise de RT-PCR semi-quantitativo comparando a abundância relativa do mRNA de cadaum dos genes relacionados às sirtuínas com o mRNA do gene que codificapara β-actina (média ± E.P.) (Figura 2 e Tabela 2).
Table 2. Padrão de expressão gênica: expressão relativa de mRNA de genesrelacionados à sirtuína em diferentes tecidos de zebrafish.
<table>table see original document page 10</column></row><table><table>table see original document page 11</column></row><table>
No sentido de avaliar a modulação nesta família de proteínas, o efeito doresveratrol (3,4', 5-trihidroxi-trans-estibeno), uma fitoalexiana que é encontradaem alguns alimentos tais como, na casca da uva, amendoim e vinho tinto, foiavaliado e promoveu um aumento significativo da expressão do gene SIRT1em músculo esquelético e fígado no modelo proposto (Figura 3).
Claims (21)
1. Método para a determinação de agentes moduladores de sirtuínascaracterizado por compreender as etapas de:a) contactar célula(s) de tecido(s) compreendendo pelo menos um geneda família das sirtuínas e o gene da β-actina, com um agente modulador;b) determinar a abundância relativa do mRNA do gene da família dassirtuínas;c) determinar a abundância relativa do mRNA do gene da β-actina; ed) determinar a razão mRNA S//?77mRNA β-actina.
2. Método para determinação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelas células serem escolhidas do grupo que compreende células de peixes,aves, mamíferos e combinações dos mesmos.
3. Método para a determinação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelas células de peixes serem células de Danio rerio.
4. Método para a determinação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelas células de aves serem células de Gallus gallus.
5. Método para a determinação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelas células de mamíferos serem células de Mus muscu/us e/ou Homosapiens.
6. Método para a determinação, de acordo com as reivindicações 2 a 5,caracterizado pelo tecido ser escolhido do grupo que compreende cérebro, rim,gônadas (masculina e feminina), baço, brânquias, fígado, músculo, coração ecombinações dos mesmos.
7. Método para a determinação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopela sirtuína possuir pelo menos 50% de homologia com pelo menos umaseqüência escolhida do grupo que compreende XP_001334440, AAH67165,XP_684225, XP_690925, AAH83418, AAH75987, NP_001002071, XP_698800,Q96EB6, Q8IXJ6, Q9NTG7, Q9Y6E7 Q9NXA8, Q8N6T7, Q9NRC8, BAD38898,BAD38897, XP_420920, XP_415273, XP_418925, NP_001034409,NP_001026277, NP_062786, NP_071877, CAJ18608, Q8R216 NP_849179,NP_853617, AAP83960 e combinações dos mesmos.
8. Método para a determinação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopela β-actina possuir pelo menos 50% de homologia com a seqüênciaNM_001101.
9. Método para a determinação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopela determinação da abundância relativa do mRNA das sirtuínas e/ou β-actinaser determinada por PCR.
10. Kit para a determinação de agentes moduladores de sirtuínas caracterizadopor compreender:a) meios para determinar a abundância relativa do mRNA do gene dafamília das sirtuínas; eb) meios para determinar a abundância relativa do mRNA do gene da β-actina.
11. Kit para a determinação, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelos meios para determinação da abundância relativa do mRNA das sirtuínase/ou β-actina compreender primers capazes de se alinharem com umaseqüência de nucleotídeos possuindo pelo menos 50% de homologia com pelomenos uma seqüência escolhida do grupo que compreende XP_001334440,AAH67165, XP_684225, XP_690925, AAH83418, AAH75987, NP_001002071,XP_698800, Q96EB6, Q8IXJ6, Q9NTG7, Q9Y6E7 Q9NXA8, Q8N6T7,Q9NRC8, BAD38898, BAD38897, XP_420920, XP_415273, XP_418925,N P_001034409, NP_001026277, NP_062786, NP_071877, CAJ18608,Q8R216 NP_849179, NP_853617, AAP83960, NM-001101 e combinações dosmesmos.
12. Processo de modulação da expressão de sirtuínas caracterizado porcompreender a etapa de contactar um agente modulador da expressão desirtuínas com uma célula compreendendo pelo menos um gene da família dassirtuínas.
13. Processo de modulação, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelas células serem escolhidas do grupo que compreende células de peixes,aves, mamíferos e combinações dos mesmos.
14. Processo de modulação, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelas células de peixes serem células de Danio rerio.
15. Processo de modulação, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelas células de aves serem células de Gallus ga/lus.
16. Processo de modulação, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelas células de mamíferos serem células de Mus muscu/us e/ou Homosapiens.
17. Processo de modulação, de acordo com as reivindicações 13 a 16,caracterizado pelo tecido ser escolhido do grupo que compreende cérebro, rim,gônadas (masculina e feminina), baço, brânquias, fígado, músculo, coração ecombinações dos mesmos.
18. Processo de modulação, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopela sirtuína possuir pelo menos 50% de homologia com pelo menos umaseqüência escolhida do grupo que compreende XP_001334440, AAH67165,XP_684225, XP_690925, AAH83418, AAH75987, NP_001002071, XP_698800,Q96EB6, Q8IXJ6, Q9NTG7, Q9Y6E7 Q9NXA8, Q8N6T7, Q9NRC8, BAD38898,BAD38897, XP_420920, XP_415273, XP_418925, NP_001034409,NP_001026277, NP_062786, NP_071877, CAJ18608, Q8R216 NP_849179,NP_853617, AAP83960 e combinações dos mesmos.
19. Composição farmacêutica caracterizada por compreender:a) um agente modulador da expressão de sirtuínas; eb) um veículo farmaceuticamente aceitável,onde a razão mRNA S//?77mRNA β-actina da célula sem a presença doagente modulador é diferente da razão mRNA S//?77mRNA β-actina da célulasem a presença do agente modulador.
20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizadapelo agente modulador ser resveratrol.
21. Agente modulador da expressão de sirtuínas caracterizado por ser utilizadona fabricação de um medicamento útil no tratamento de doençasneurodegenerativas.
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