BRPI0806047A2 - novos compostos da famìlia das pterocarpaquinonas, processo de produção, composição farmacêutica contendo os novos compostos da famìlia das pterocarpaquinonas, usos e método terapêutico - Google Patents

Abstract

NOVOS COMPOSTOS DA FAMILIA DAS PTEROCARPAQUINONAS, PROCESSO DE PRODUçãO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA CONTENDO OS NOVOS COMPOSTOS DA FAMìLIA DAS PTEROCARPAQUINONAS, USOS E MéTODO TERAPêUTICO. Esta invenção pertence a área químico-farmacêutica, sendo os novos compostos da família das pterocarpaquinonas de fórmula (I) desta invenção são capazes de serem ativados por redução, gerando espécies alquilantes no meio intracelular, e apresentam efeito citotóxico seletivo, marcadamente para células animais mamiferos humanos e/ou não humanos que dividem constantemente; sendo portanto úteis no tratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenómeno de proliferação celular indesejada bem como. Tais compostos também são efetivos para o tratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas à elevação dos níveis TNF-<244> em animais mamíferos humanos e não humanos; bem como, esta invenção se refere ao processo de produção, a composições farmacêuticas contendo os ditos compostos de fórmula (1); aos usos dos ditos compostos de fórmula (1); ao medicamento contendo tais compostos e métodos de tratamento.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

NOVOS COMPOSTOS DA FAMÍLIA DAS PTEROCARPAQUINONAS, PROCESSO DEPRODUÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO OS NOVOS COMPOSTOS DAFAMÍLA DAS PTEROCARPAQUINONAS, USOS E MÉTODO TERAPÊUTICO

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção pertence à área químico-farmacêutica, sendo os novoscompostos da família das pterocarpaquinonas desta invenção são capazes deserem ativados por redução, gerando espécies alquilantes no meio intracelular,e apresentam efeito citotóxico seletivo, marcadamente para células animaismamíferos humanos e/ou não humanos que dividem constantemente; sendo,portanto úteis no tratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas aofenômeno de proliferação celular indesejada bem como. Tais compostostambém são efetivos para o tratamento de doenças e/ou disfunçõesrelacionadas à elevação dos níveis TNF-α em animais mamíferos humanos enão humanos.

Esta invenção também se refere a um processo de produção econômica eecologicamente viável dos novos compostos da família daspterocarpaquinonas.

O uso destes compostos e as composições farmacêuticas contendo estescompostos também são objetos desta invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O câncer é um grande problema de saúde pública em todo mundo,afetando indiscriminadamente todas as camadas da sociedade. Acomete emtorno de sete milhões de pessoas por ano, sendo a segunda causa de mortepor doença nos EUA1 segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), entre11,4% a 13,7% do total de óbitos no Brasil está diretamente relacionado aneoplasias, sendo o terceiro maior fator de mortalidade no País.

Devido ao grande investimento dos laboratórios farmacêuticos nodesenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o tratamento do câncer,uma diversidade de fármacos é disponível para uso clínico. Entretanto, a altatoxicidade em geral associada a essas substâncias e o desenvolvimento delinhagens de células com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (MDR,do inglês multi drug resistance) exige um esforço contínuo visando odesenvolvimento de novos agentes terapêuticos.

Em contraste, os avanços terapêuticos têm sido bem mais modestos noque se refere ao combate das parasitoses. Isso reflete a falta de interesse einvestimentos do setor privado, já que parasitoses como malária, Ieishmaniosese doença de chagas, por exemplo, afetam principalmente populações de baixarenda na África, Ásia e América do Sul.

Negligenciadas pelo setor privado, o controle dessas endemias depende,quase que exclusivamente, de iniciativas governamentais (universidades,institutos de pesquisa e laboratórios oficiais), havendo uma grande carência dealternativas para o tratamento quimioterápico. A abordagem terapêutica paraestas parasitoses é complicada pelo aparecimento de resistência, tal qualmencionado para os agentes anticancerígenos, havendo também nestes casosa necessidade um esforço contínuo visando o desenvolvimento de novosfármacos.

Cabe colocar em destaque que alguns alvos moleculares são comuns aosagentes anticancerígenos e antiparasitários, tais como o DNA e enzimas damaquinaria de biossíntese do DNA. Entretanto, estas enzimas apresentampequenas diferenças estruturais (isoformas) em função da espécie, o que tornapossível a descoberta de inibidores biosseletivos.

Por outro lado, no caso das doenças parasitárias a biosseletividadetambém pode ser alcançada pela escolha de alvos biológicos que não seencontram presentes em células humanas, explorando as diferenças dafisiologia destes organismos em relação às células humanas.

Substâncias desenvolvidas para o tratamento do câncer podem encontraruma aplicação terapêutica como agentes antiparasitários. É o caso damiltefosina, um alquilfosfolipídeo desenvolvido e licenciado pelo governoindiano em março de 2002 para o tratamento da Ieishmaniose visceral por viaoral, que encontra-se atualmente em teste clínico de fase IV, envolvendo 1200pacientes (Sindermann, 2006). Um outro exemplo é a paromomicina, umantibiótico aminoglicosídeo, um dos fármacos que vêm sendo testados emformulações para o tratamento tópico da Ieishmaniose cutânea do NovoMundo. O seu uso tem se mostrado mais eficiente para o tratamento parenteraldo que os compostos antimoniais. O caso da artemisinina também merecedestaque. A potente ação antimalarial e o novo mecanismo de ação desteterpenóide conduziram à preparação de um grande número de derivados, osquais foram também avaliados como agentes antineoplásicos. A aplicaçãoclínica desses derivados é preconizada tanto para o tratamento da maláriaquanto de certos tipos de câncer (Vennerstom, 2005; Posner1 2002; 2003;2004; 2004; Chen, 96). Finalmente, a atavaquona, uma naftoquinonaoriginalmente investigada por suas propriedades anticancerígenas, vem sendousada em terapêutica como antiprotozoário. É efetiva no tratamento depneumonia causada por Pneumocystis carinii e, em associação com oproguanil é usada no tratamento e prevenção da malária. Em associação coma azitromicina, é usada no tratamento da babesiosis. Seu uso para otratamento de Ieishmaniose cutânea foi recomendado em publicação recente.

O metotrexato é um inibidor da síntese do ácido fólico. Como o ácidofólico é essencial a síntese da cadeia de DNA1 vemos que esta substância vemsendo utilizado na clínica como um fármaco antineoplásico. Entretanto, seuderivado trimetrexato apresenta ação antiparasitária contra Pneumocystiscarinii.

Inibidores da topoisomerase também são ferequentemente utilizados tantono tratamento de neoplasias, como no tratamento de parasitoses, como é ocaso tanto dos antimoniais pentavalentes como da 9- anilinoacridina.

A glutationa (GSH) é uma enzima que protege o Plasmodium falciparumdo estresse oxidativo de espécies reativas do oxigênio (ERO) (em particularOH). A manutenção dos níveis intracelulares de GSH depende basicamenteda redução do tioperóxido GS-SG para GSH, catalisada pela glutationaredutase (GR). Esta enzima tem sido explorada no desenho de substânciascom ação antimalarial. Foi mostrado que a inibição de glutationa-S-transferases(GST) por agentes antimalariais de natureza quinônica, pode ser usada parainibir a resistência a agentes antineoplásicos.Em 1863, Virchow descreveu a ocorrência de infiltrado de leucócitos emtecidos neoplasicos e com isso lançou a hipótese de que a origem do câncerestava relacionada com sítios de inflamação crônica (Balkwill and Mantovani,2001). Desde então, vários estudos têm corroborado esta relação entre câncere inflamação. Aproximadamente 25% de todos os casos de câncer tem acontribuição de infecção crônica e inflamação (Hussain and Harris, 2007).

Inflamação intestinal, por exemplo, está associada com câncer de cólon,Carcinomas de próstata e pâncreas são associados com inflamações em taisórgãos. Fumo e exposição à sílica também estão associados à inflamaçãopulmonar e carcinoma; muitos agentes infecciosos causam tanto inflamaçãoquanto câncer (Itzkowitz and Yio, 2004; Nelson et al„ 2004; Whitcomb, 2004;Lin and Karin, 2007). De fato, a inflamação pode contribuir para cada estágiodo desenvolvimento tumoral.(Lin and Karin, 2007). Muitos agentes como víruse compostos químicos que promovem o processo inflamatório tambéminduzem alterações somáticas. Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênioinduzidas pela inflamação, que servem para combater a infecção, tambémcausam dano ao DNA nas células hospedeiras. Essas alterações, conhecidascomo iniciação, podem ser mantidas em um tecido normal até que as célulasiniciadas sejam estimuladas a crescer, em um processo chamado promoção.

Fatores liberados no meio inflamatório podem atuar como promotores, uma vezque esses fatores estimulam a regeneração tecidual, mas também induzemproliferação celular e resistência a apoptose nas células tumorais. Por último,esses mesmos fatores facilitam a invasão e metástase de células tumorais,culminando na progressão, o último estágio da carcinogênese (Coussens andWerb, 2002; Lin and Karin, 2007).

Dentre os fatores inflamatórios que regulam o câncer, citocinas equimiocinas são os agentes mais importantes envolvidos no desenvolvimentotumoral. Essas moléculas podem atuar como mediadores da relação entrecélulas hospedeiras e tumorais (Kundu e Surh 2008). Os mediadoresinflamatórios, como quimiocinas e citocinas, são os responsáveis pelorecrutamento de leucócitos da circulação sangüínea para o foco inflamatório(Sacca et al., 1997; Yang et al., 1998). Além disso, promovem a expressão demoléculas de adesão no endotélio, que permitem a passagem dos leucócitospara o tecido inflamado (Blease et al., 1998).

No processo inflamatório o TNF-α é uma citocina pró-inflamatória depapel importante na resposta inata de vertebrados (Varfolomeev e AshKenazi12004). Há duas décadas, o TNF-α é descrito como o mediador principal dapatogênese do choque séptico (Beutler et al., 1985). Esta citocina é um dosprodutos mais abundantes secretados por macrófagos, e diversas outrascélulas, como neutrófilos, células Natural Killer (NK) e células T, são capazesde liberá-la quando estimuladas com LPS (Goetz et al., 2004).

O TNF-α é sintetizado na forma de precursor que fica ancorado àmembrana plasmática. Para passar a forma ativa, o pró- TNF-α é hidrolizadopela enzima conversora de TNF-α (TACE), uma metaloproteinase, liberando aforma solúvel de 17 KDa (Bárbara et al., 1996; Moss, 1997).

Para exercer suas atividades biológicas, o TNF-α precisa se ligar areceptores de membrana. São conhecidos dois receptores distintos capazes dese ligar ao TNF-α com alta afinidade: o TNF-R1 e o TNF-R2. De acordo comBárbara (1996) e Chen (2002), o TNF-R1 seria o mais ativo e, portanto, inicia amaior parte das respostas biológicas.

A ligação do TNF-α ao domínio extracelular do TNF-R1 resulta na suatrimerização, liberando do domínio intracelular (ICD) do TNF-R1 uma proteínaconhecida como proteína silenciadora de Domínios de Morte (SODD). O ICDlivre então é reconhecido por uma proteína adaptadora do domínio de morteassociado ao receptor TNF (TRADD). Esta se liga ao receptor e atrai a proteínaque interage com o receptor RIP (Ting et al., 1996), o fator associado aoreceptor de TNF (TRAF2) e a proteína com domínio de morte associado ao Fas(FADD) (Chen e Goeddel, 2002).

Dependendo do estímulo, o TNF-R1 pode ativar 3 vias diferentes desinalização intracelular. Uma delas leva à apoptose por intermédio da FADD,que recruta a enzima caspase-8 para o complexo de receptores TNF,destravando uma seqüência de reações que culmina com a morte celular. Umasegunda sinalização é através da ação do TRAF2 que sinaliza para inibidoresde apoptose, como a proteína inibidora celular de apoptose 1 e 2 (clAP-1 eclAP-2). Essa via é capaz também de ativar a via das MAP cinase e do NF-kB.

A terceira via está ligada à ativação das enzimas do complexo IKK,responsável pela ativação do NF-kB (Chen e Goeddel, 2002).

A supressão do TNF-α já é uma ferramenta reconhecida, inclusive naclínica, para o tratamento de doenças inflamatórias. Atualmente, novoscompostos vêm sendo sintetizados como análogos da Talidomida, que possuiseveros efeitos colaterais, como potentes inibidores da expressão de TNF-a,para serem utilizados como antiinflamatórios (Hutchison et al., 2008; Lima etal„ 2002).

Apesar de primeiramente ser descoberto como um fator que induznecrose tumoral, daí o seu nome, há alguns anos já se sabe que esse efeitoaparentemente antineoplásico na verdade só ocorre quando o TNF-α éadministrado localmente e altas concentrações o que acarreta inúmeros efeitoscolaterais como febre, anemia, perda de peso e fatiga, tendo sido, portantodescartado como terapia antineoplásica (Slosarek & Balkwill, 2003).Interessantemente, vários trabalhos já associam o TNF-α endógeno comoindutor de crescimento tumoral e facilitador da invasão tumoral e metástasesendo o TNF-α responsável por induzir em tumores a produção de fatores desobrevivência tumoral, por aumentar a mobilidade, invasão tumoral e aumentara resistência a drogas citotóxicas, dentre outros efeitos que favorecem oestabelecimento e a progressão tumoral (Slosarek et al, 2006; Wu et al, 1999;Shin et al., 2000). Por essas razões, terapias que envolvam a inibição do TNF-α no tratamento de cânceres já estão sendo propostas, inclusive trabalhos maisrecentes apontam o tratamento com inibidores de TNF-α uma importanteferramenta na redução de tumores e na inibição de metástases (Waterston etal., 2004; Stasi et al., 2005; Glasmacher et al., 2005).Além de neoplasias, sabidamente, o TNF encontra-se relacionado aoutras doenças tais como artrite reumatóide, espongilite anquiloisante, doençade Crohn, psoríase, infecções virais como hepatites e AIDS, além infecçõesbacterianas como lepra, tuberculose, brucelose, e de parasitoses comotripanossomíases e leishimanioses.

Drigo et al em 2006, demonstraram que a progressão da cardiomiopatiaassociada à doença de Chagas está diretamente relacionada aos níveis séricosdo TNF-α nos portadores desta cardiomiopatia que apresentaram paradacardíaca. O uso do Etanercept, um bloqueador do TNF-α, durante a fasecrônica da doença de Chagas atenuou o desenvolvimento da cardiomiopatiaassociada a doença de Chagas (Bilate etal, 2007).

Variações polimórficas na região promotora do gene TNFA vendo sendoassociadas a formas severas de infecções como malária, meningites, lepra ebrucelose humana e bovina (Caballero et al, 2000; McGuire et al, 1994;Cabrera etal, 1995; Nadei etal, 1996; Roy etal 1997).

Recentemente, da Silva et al, desenvolveram uma nova família decompostos químicos denominadas de pterocarpanoquinonas de primeirageração, as quais são constituídas de um esqueleto pentacíclico mostrado nafigura 1, onde os anéis AeB (sistema naftoquinônico) substituíram um anelaromático oxigenado presente na estrutura dos pterocarpanos.

A ação citotóxica dessas naftoquinonas pentacíclicas de primeira geraçãofoi avaliada em linhagens de células de câncer de mama (MCF-7) (da Silva,2002), leucemia (K562, Jurkat, Daudi, Raji, HL-60), inclusive sobre a linhagemLucena I (fenótipo MDR) (Netto, 2008) e pulmão (A549 e H460, de fenótipoMDR). Os resultados obtidos com as células de fenótipo MDR, mostram queestas substâncias não são substratos para bombas de efluxo presentes nestascélulas (Litman, 2001; Juranka, 1989). As pterocarpanoquinonas de primeirageração foram avaliadas ainda em Leishmania amazonensis e Plasmodiumfalciparum (cepa resitente à cloroquina) em cultura (Netto, 2008c), mostrando-se bastante efetivas frente a esses protozoários. Em contrapartida,apresentaram baixa toxicidade (alta biosseletividade) para linfócitos ativadospelo PHA e linfócitos de murinos (da Silva, 2008).

Pterocarpanoquinonas de segunda geração também foram sintetizadas(da Silva, 2008), onde o anel D originalmente de 5 membros foi substituído porum anel de 6 membros. Estas substâncias também apresentaram ação tóxicaem linhagens de célula MCF-7 e em Leishmania amazonensis e Plasmodiumfalciparum (cepa resitente à cloroquina) em cultura (Netto, 2008c), mostrando-se também bastante efetivas frente a esses protozoários. Também aspterocarpanoquinonas de segunda geração apresentaram baixa toxicidade(alta biosseletividade) para linfócitos ativados pelo PHA e linfócitos de murinos(da Silva, 2008).

Foi demonstrado (Netto, 2007) que as pterocarpanoquinonas de primeirageração, tal qual a mitomicina e análogos antraciclinas e a kalfungina (umanaftoquinona), são ativadas por redução, sendo capazes de reagir com otiofenol, usado como modelo de nucleófilos biológicos. Assim, em adição acitotoxicidade apresentada por todas as quinonas, decorrente do mecanismoredox que conduz em última instância ao estresse oxidativo, aspterocarpanoquinonas de primeira geração podem atuar como precursores deintermediários reativos gerados in situ. Este possível mecanismo de ação éespecialmente interessante no caso de tumores onde a região central, poucovascularizada, recebe pequeno aporte de oxigênio e é pouco exposta aoestresse oxidativo. Este possível mecanismo de ação pode estar relacionadocom a atividade destas moléculas em células resistentes ao estresse oxidativo.

O processo de produção destas pterocarpanoquinonas de primeira esegunda geração é, entretanto, economicamente inviável, pois requer na etapachave do procedimento sintético uma reação mediada por quantidadesestequiométricas de paládio. Outro problema é a utilização de fenóis contendomercúrio em suas estruturas, fato que torna este processo de produçãoambientalmente inadequado e inapropriado para a produção de fármacos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOÉ um objeto desta invenção novos compostos da família daspterocarpanoquinonas, de formula geral(I):

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seus sais, solvatos e racematos. Os novos compostos da família daspterocarpanoquinonas possuem a capacidade de serem ativados por redução,gerando espécies alquilantes no meio intracelular, sendo, portanto úteis notratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno deproliferação celular indesejada bem como, no tratamento de doenças e/oudisfunções relacionadas à elevação dos níveis TNF-aem um animal mamíferohumano e/ou não humano.

O segundo objeto desta invenção é o processo de produção de novoscompostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmula geral (I):ecologicamente.

Um terceiro objeto desta invenção é uma composição farmacêuticacontendo os novos compostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmulageral (I):<formula>formula see original document page 11</formula>

e/ou, seus sais, solvatos e racematos para o tratamento de doenças e/oudisfunções relacionadas ao fenômeno da proliferação celular indesejada, emanimais mamíferos humanos ou não humanos.

O quarto objeto desta invenção trata-se uma composição farmacêuticacontendo os novos compostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmulageral (I):

<formula>formula see original document page 11</formula>

e/ou, seus sais, solvatos e racematos para o tratamento de doenças e/oudisfunções relativas ao aumento dos níveis do TNF-α, em animais mamíferoshumanos ou não humanos.

O quinto objeto desta invenção trata-se do uso dos novos compostos deformula (I):<formula>formula see original document page 12</formula>

e/ou, seus sais, solvatos e racematos para a fabricação de um medicamentovoltado para o tratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas aofenômeno de proliferação celular indesejada tais como neoplasias eparasitoses em animais mamíferos humanos ou não humanos.

O sexto objeto desta invenção trata do o uso dos novos compostos deformula (I):

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e/ou, seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, para a fabricação de um medicamento voltado parao tratamento de doenças e/ou disfunções relativas ao aumento dos níveis doTNF-α em animais mamíferos humanos ou não humanos.

É ainda um objeto desta invenção, um medicamento contendo umaquantidade farmaceuticamente aceitável de um ou mais dos novos compostosda família das pterocarpanoquiinonas de fórmula (I).

O oitavo objeto desta invenção se refere a um método de tratamento dedoenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno de proliferação celularindesejada, tais como neoplasias e parasitoses em animais mamíferos.O último objeto desta invenção se refere a um método de tratamento deuma doença e/ou disfunção relativa ao aumento dos níveis do TNF-α emanimais mamíferos.

FIGURAS

Figura 1: Efeito citotóxico do composto LBQ 1 em diferentes linhagens decélulas neoplásicas, em A = K562, em B = Lucena, em C= Daudi e em D =HL60.

Figura 2: Verificação in vivo da eficácia da pterocarpaquinona LQB1 emcélulas de leishmania.

Figura 3: Efeito in vitro do LQB 1 na inibição da liberação de TNF-α peloPBMC. Os resultados são expressos em média ± erro padrão. (# em relação aogrupo controle; § em relação aos grupos incubados com LQB 1, com p<0,05).

Figura 4: Efeito in vivo do LQB 1 na inibição da liberação de neutrófilos noLBA. Os resultados são expressos em média ± erro padrão. (* em relação aogrupo veículo; ** em relação ao grupo incubado com 1 mg/Kg (Dose do IC50).p< 0,05).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção tem como objetivo descrever novos compostos dafamília pterocarpanoquinonas, de fórmula geral (I):

<formula>formula see original document page 13</formula>

onde:

R1 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C8 cíclico ou alifático; aril C3 a C8cíclico ou alifático; alquenil C3 a C8 cíclico ou alifático; alquenilil C3 a C8 cíclicoou alifático; um grupo éter C2 a C8; formila; metal alcalino; metal alcalinoterroso; halogênio; nitro; amino; amina; C02R3; um grupo álcool C1 a C8;R2 pode ser Η; hidroxila; alquil C1 a C8 cíclico ou alifático; aril C3 a C8cíclico ou alifático; alquenil C3 a C8 cíclico ou alifático; alquenilil C3 a C8 cíclicoou alifático; um grupo éter C2 a C8; formila; metal alcalino; metal alcalinoterroso; halogênio; nitro; amino; amina; um grupo álcool C1 a C8; e,

R3 pode ser H; alquil C1 a C8 cíclico ou alifático; aril C3 a C8 cíclico oualifático; alquenil C3 a C8 cíclico ou alifático; alquenilil C3 a C8 cíclico oualifático; metal alcalino; metal alcalino terroso; e halogênio.

Onde o novo composto da família das pterocarpaquinonas de fórmula (I):

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pode se apresentar na forma de seus sais, solvatos e racematos.

Preferencialmente, R1 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C6 cíclico oualifático; metal alcalino; halogênio; nitro; amino; amina; C02R3; um grupo éterC2 a C6; formila; um grupo álcool C1 a C6; e,

R2 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C6 cíclico ou alifático; um grupo éterC2 a C6; formila; e,

R3 pode ser Η; OH; alquil C1 a C3 cíclico ou alifático; metal alcalino e;halogênio.

Mais preferencialmente ainda, R1 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C6cíclico ou alifático; nitro; amino; amina; C02R3; um grupo éter C2 a C6; grupo álcool C1 a C6; formila;

R2 pode ser H; hidroxila; formila; um grupo éter C2 a C6; e,

R3 pode ser H; alquil C1 a C3 cíclico ou alifático; Na; K e; halogênio.

Os ditos compostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmula (I):<formula>formula see original document page 15</formula>

que são objetos desta invenção tem a capacidade de serem ativados porredução, gerando espécies alquilantes no meio intracelular, fato diretamenterelacionado a danos tanto na estrutura da molécula de DNA como namaquinaria enzimática responsável pela duplicação do DNA. Desta forma, osditos compostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmula (I) objetosdesta invenção promovem a interrupção do ciclo celular, interrompendo assima proliferação celular de células de animais mamíferos humanos e/ou nãohumanos que se dividam constantemente, ou seja, células com proliferaçãoindesejada.

Os novos compostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmula (I):

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são capazes de apresentam efeito citotóxico seletivo, capaz de interromper ociclo celular em células que se dividem constantemente, como por exemplo,células neoplásicas e células de parasitos em geral, sem, entretanto,apresentar toxicidade para os linfócitos de animais mamíferos humanos e/ounão humanos ativados pelo PHA, que também encontram-se em rápidaproliferação.Também foi verificado nos testes realizados o efeito que os novoscompostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmula (I):

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objeto desta invenção possuem de provocar a redução dos níveis do fator denecrose tumoral alfa (TNF-α) in vivo em animais mamíferos humanos e/ou nãohumanos.

Portanto, os novos compostos da família das pterocarpanoquinonas aquidescritos podem ser empregados no tratamento de doenças e/ou disfunçõesrelacionadas ao fenômeno de proliferação celular indesejada tais comoneoplasias e parasitoses; bem como, podem ser empregados no tratamento dedoenças e/ou disfunções relacionadas à elevação dos níveis TNF-α, como, porexemplo, doenças e/ou disfunções inflamatórias em geral; preferencialmente,em doenças e/ou disfunções inflamatórias reativas provocadas pela infestaçãode parasitos no corpo de um animal mamífero humano e/ou não humano.

Somente para efeitos desta invenção, parasitoses são aquelas doençasou disfunções causadas por organismos unicelulares pertencentes aos reinosbactéria e protista, em animais mamíferos, humanos ou não humanos.

Preferencialmente, os novos compostos de fórmula (I):

<formula>formula see original document page 16</formula>podem ser empregados no tratamento de tumores resistentes a múltiplasdrogas (MDR) tais como; leucemias; tumores sólidos de órgãos como pulmão;mama; fígado; dentre outros. Ainda preferencialmente, as parasitoses destainvenção são doenças ou disfunções pertencentes ao grupo de doenças oudisfunções que compreende a leishmaniose; malária; doença de chagas;toxoplasmose; lepra; tuberculose; brucelose; dentre outras.

Esta invenção também provê um processo de produção dos novoscompostos de formula (I):

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e/ou seus sais, solvatos e racematos usando procedimento sintéticoecologicamente correto e economicamente adequado, visto o uso decatalisadores à base de paládio em quantidades catalíticas e a ausência dereagentes contendo mercúrio.

O processo de produção dos novos compostos da família daspterocarpaquinonas de formula (I):

<formula>formula see original document page 17</formula>

bem como de seus sais, solvatos e racematos objeto desta invenção,apresenta as etapas de:

a) Síntese do intermediário 1;b) Purificação do intermediário 1;

c) Síntese dos compostos de fórmula (I);

d) Purificação dos compostos de formula (I).

A etapa a) ocorre à partir da reação entre a acroleína e a Iausona napresença de um solvente e de uma solução acida em refluxo durante umperíodo de tempo compreendido entre 2 a 12 horas.

Os solventes que podem ser empregados nesta etapa do processo deobtenção das novas pterocarpaquinonas de fórmula (I) desta invenção sãosolventes orgânicos tais como: benzeno, acetona, tolueno, metanol, etanoldentre outros, preferencialmente o solvente orgânico empregado é o tolueno; asolução ácida empregada nesta etapa pode conter ácidos orgânicos, tais comoo ácido acético, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido fenil borônico, ácidovalérico, ácido acrílico, ácido propiônico, ácido benzóico, ácido oxálico, ácidosuccínico, ácido terafitálico, ácido fumárico, ácido tricloroacético, ácidotartárico, dentre outros, preferencialmente, a solução ácida empregada nestaetapa é uma solução contendo ao menos ácido acético e ácido fenil borônico; eo período de reação é inferior a 6 horas.

Na etapa b) o produto obtido em a) é concentrado e purificado com oauxílio de agentes extratores da fase orgânica. A concentração pode ser obtidapor meios conhecidos pelo homem da arte, como por exemplo, pelo uso deevaporadores rotatórios.

Os agentes extratores empregados na purificação podem ser, porexemplo, éteres, ésteres e álcoois, empregando-se preferencialmente o acetatode etila como agente extratores; em seguida a fase é lavada sucessivamentecom um ou mais sais orgânicos e/ou sais inorgânicos, preferencialmente seempregam o bicarbonato de sódio e o cloreto de sódio. Agentes secantes quepodem ser empregados são todos aqueles conhecidos pelo homem da arte,como por exemplo o sulfato de magnésio, sulfato de cobre, cloreto de cálcio e asílica, preferencialmente se emprega nesta invenção o sulfato de sódio.

O intermediário 1 produzido de acordo com as etapas a) e b) é acromenoquinona, que servirá de substrato reacional para o inicio da etapa c).A etapa c) ocorre pela reação de oxa-Heck catalítica, envolvendo acromenoquinona com um fenol orto-substituído por halogênio; na presença deum solvente orgânico; um sal de metal e fosfinas na presença de quantidadessub-estequiométricas de um catalisador em período de tempo compreendidoentre 1 a 24 horas sob refluxo em atmosfera modificada.

O fenol orfo-substituído por halogênio preferencialmente empregadonesta invenção é o orfo-iodo fenol podendo ser substituído ou não substituídonos carbonos 3 e 5 do anel aromático. O solvente orgânico empregado nestaetapa pode ser escolhido do grupo contendo benzeno, acetona, tolueno,metanol, etanol dentre outros, preferencialmente se emprega a acetona comosolvente.

Para fins desta invenção, entende-se por quantidade sub-estequiométrica do catalisador, a menor percentagem molar do catalisadornecessária para que a reação ocorra com o máximo de rendimento possível.

O catalisador empregado por esta invenção é um catalisador contendopaládio, podendo ser cloreto de paládio ou acetato de paládio,preferencialmente é empregado o acetato de paládio como catalisador nestainvenção.

O sal metálico empregado na etapa c) é um sal de metal nobre,preferencialmente, se emprega o carbonato de prata, sob refluxo durante umperíodo compreendido entre 8 a 20 horas, em atmosfera de nitrogênio.

Um segundo período de refluxo pode ser realizado sob as mesmascondições do primeiro refluxo da etapa c) com a adição de uma quantidadeadicional do fenol orfo-substituído por halogênio ao meio reacional, para oaproveitamento máximo da cromenoquinona.

A etapa d) ocorre de maneira análoga a etapa b) resultando na obtençãodos novos compostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmula (I)objetos desta invenção.Um processo de síntese alternativo dos novos compostos de fórmula (I):

<formula>formula see original document page 20</formula>

desta invenção, ocorre pelo emprego na etapa c) do cromenodimetoxi, quevem a ser a forma reduzida e metilada da cromenoquinona, como ponto departida. As condições catalíticas empregadas pelo uso do cromenodimetoxi sãoidênticas as condições empregadas pela cromenoquinona.

Uma composição farmacêutica contendo os novos compostos de formula

<formula>formula see original document page 20</formula>

e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, em uma quantidade farmaceuticamente aceitável,além de compostos não ativos farmaceuticamente aceitáveis, voltada para otratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno daproliferação celular indesejada, em animais mamíferos humanos ou nãohumanos, é um objeto desta invenção.

Uma composição farmacêutica contendo os novos compostos de formula (1)<formula>formula see original document page 21/formula>

e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, em uma quantidade farmaceuticamente aceitável,além de compostos não ativos farmaceuticamente aceitáveis voltada para otratamento de doenças e/ou disfunções relativas ao aumento dos níveis doTNF-α em animais mamíferos humanos ou não humanos é um outro objetodesta invenção.

Para esta invenção, temos que uma quantidade farmaceuticamenteaceitável dos novos compostos de formula (I) está compreendida entre 0,05 μΜa 1M de um dos novos compostos de fórmula (I); ou uma combinação dediferentes novos compostos da família das pterocarpaquinonas de fórmula (I)desta invenção.

Preferencialmente, ntende-se por quantidade farmaceuticamenteaceitável, a concentração entre 0,5 a 750μΜ dos compostos de formula (I);mais preferencialmente ainda, a composição farmacêutica contem entre 1 a450μΜ de um dos novos compostos de fórmula (I); ou uma combinação dediferentes novos compostos da família das pterocarpaquinonas de fórmula (I)desta invenção.

Ainda para fins desta invenção, compostos não ativos farmaceuticamenteaceitáveis podem ser todos aqueles compostos conhecidos pelo homem daarte, que sejam empregados usualmente na indústria farmacêutica, tais como,adjuvantes, diluentes, conservantes, antioxidantes, antimicrobianos,edulcorantes, flavorizantes, dispersantes, dentre outros.

O uso dos novos compostos de formula (I):<formula>formula see original document page 22/formula>

e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles para a fabricação de um medicamento voltado parao tratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno deproliferação celular indesejada tais como neoplasias e parasitoses em animaismamíferos humanos ou não humanos é também um objeto desta invenção.

É ainda um objeto desta invenção o uso dos novos compostos de formula(I) e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveisfarmaceuticamente aceitáveis, sozinhos ou uma combinação deles para afabricação de um medicamento voltado para o tratamento de doenças e/oudisfunções relativas ao aumento dos níveis do TNF-α em animais mamíferoshumanos ou não humanos.

Para esta invenção, o medicamento deve conter uma quantidadefarmaceuticamente aceitável de um ou mais dos novos compostos da famíliadas pterocarpaquinonas de fórmula (I):

<formula>formula see original document page 22/formula>

pode ser encontrado sob todas as formas farmacêuticas conhecidas pelohomem da arte, podendo ser empregado sob a forma líquida, sólida ou semi-sólida, como por exemplo, na forma de soluções, soluções injetáveis, poções,supensões, emulsões, tinturas, elixires, xaropes, pastilhas, comprimidos,tabletes, hóstias, pílulas, pérolas, drágeas, cápsulas, pós, óvulos, cremes,cataplasma, ungüentos, ceratos, linimentos, pastas, loções, pomadas, géis,aerossóis, pensos (adesivos) transdérmicos, ampolas, sprays, além de outras.

Um método de tratamento de uma doença e/ou disfunção relacionada aofenômeno de proliferação celular indesejada, compreendendo a administraçãode uma quantidade terapeuticamente aceitável dos novos compostos deformula (I):

<formula>formula see original document page 23/formula>

e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, há um animal mamífero humano ou não humanoportador de uma doença e/ou disfunção relacionadas ao fenômeno deproliferação celular indesejada.

Um método de tratamento de uma doença e/ou disfunção relativa aoaumento dos níveis do TNF-α, compreendendo a administração de umaquantidade terapeuticamente aceitável dos novos compostos de formula (I):

e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, há um animal mamífero humano ou não humanoportador de doenças e/ou disfunções relativas ao aumento dos níveis do TNF-a.

As doenças e/ou disfunções relacionadas tanto ao fenômeno deproliferação celular indesejada, como ao aumento dos níveis do TNF-α àsquais esta invenção se refere são as neoplasias e parasitoses.

Preferencialmente as neoplasias desta invenção são tumores resistente amúltiplas drogas (MDR) tais como Ieucemias e tumores sólidos de órgãos comopulmão; mama; fígado e outros órgão e tecidos; e as parasitoses sãocompreendidas do grupo de doenças ou disfunções tais como a leishmaniose;malária; doença de chagas; toxoplasmose; lepra; tuberculose; brucelose dentreoutras doenças e/ou disfunções provocadas pela infestação de parasitos nocorpo de um animal hospedeiro, podendo ser um animal mamífero humano ounão humano.

Os exemplos abaixo são meramente ilustrativos das concretizações destainvenção, não devendo ser utilizados na limitação dos direitos dos inventores.

Exemplo 1: Novas pterocarpaquinonas de formula (1) produzidas.

<table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table>

Exemplo 2: síntese dos compostos de fórmula (I).

2.1 - Síntese do intermediário 1 (a-desidro-desmetil-lapachona):

Uma solução de Iausona (1,0 g, 5,74 mmol), acroleína (13,2 ml_), ácidofenil borônico (0,7g, 5,74mmol) e ácido acético glacial (26,4ml_) em tolueno(2101OmL) foi refluxada por até 6 horas. A formação do produto foi monitoradapor TLC. A mistura reacional foi resfriada, concentrada em evaporador rotatórioe extraída com acetato de etila. O extrato orgânico foi lavado sucessivamentecom NaHCOs e solução saturada de NaCI1 seca sob Na2SC>4 e o solventeevaporado. O material bruto foi purificado em coluna cromatográficafornecendo um sólido vermelho (0,6 g; 50% de rendimento), pf = 215- 217°C.

2.2 - Síntese de LQBs:

Para a síntese do LQB1 foi empregada uma solução de cromeno quinona(106 mg; 0,5 mmol) em acetona (50 mL), sob agitação, foram adicionados83mg de o-iodofenol (0,75mmol), 413mg de Ag2CO3 (1,5mmol), 26,2mg dePPh3 (0,1 mmol; 20 mol %), e 11,2mg de (AcO)2Pd (0,05mmol; 10mol%). Amistura reacional foi refluxada por 16 h sob atmosfera de N2. Após este tempo,a análise por TLC indicou a formação de um produto ligeiramente menos polarque o cromeno quinona, entretanto ainda restava uma quantidade significativado cromeno quinona. Foram adicionados ao meio reacional mais 83mg(0,75mmol) de o-iodofenol. Esta nova mistura foi refluxada por mais 16h,quando então a análise por TLC indicou o total consumo do cromenoquinona.

O solvente foi evaporado em evaporador rotatório, o produto extraído comacetato de etila, a fase orgânica lavada com solução saturada de NaCI e secasob Na2SO4. Após purificação em coluna cromatográfica foram obtidos 62,3mg(0,21 mmol) do LBQ1 em 41 % de rendimento, pf: 145°C, m/z 304.Para síntese dos demais LQBs o processo empregado é o mesmo, aúnica modificação é o orto-iodo fenol empregado. Conforme descrito, para asíntese dos demais LQBs são empregados O-iodo fenóis substituídos ou nãosubstituídos nos carbonos 3 e 5 do anela aromático. A tabela abaixoexemplifica alguns dos LQBs obtidos, e os O-iodo fenóis empregados em suasíntese.

PRODUÇÃO DE LQBs

<table>table see original document page 26</column></row><table>

2.3 - Processo alternativo de Síntese:

A uma solução em agitação do cromenodimetoxi (0,5 mmol) em acetona(50 mL), sob agitação, foram adicionados 83mg de o-iodofenol (0,75mmol),413mg de Ag2CO3 (1,5mmol), 26,2mg de PPh3 (0,1 mmol; 20 mol %), e 11,2mgde (AcO)2Pd (0,05mmol; 10mol%). A mistura reacional foi refluxada por 16 hsob atmosfera de N2. Após este 16 horas o solvente foi evaporado emevaporador rotatório, o produto extraído com acetato de etila, a fase orgânicalavada com solução saturada de NaCI e seca sob Na2SO^ O produto bruto foitratado com CAN (I1OmmoI) em diclorometano (10mL) como solvente atemperatura ambiente, por um período de 12 horas. Após este tempo o produtofoi obtido nas condições descritas acima. Após purificação em colunacromatográfica foram obtidos (0,29 mmol) do LBQ1 em 49% de rendimento, pf:145°C.

Exemplo 3 - Teste clínicos:

3.1 - Câncer

3.1.1 - Linhagens celulares e cultura de células:

Foram utilizadas as linhagens celulares estabelecidas K562, Lucena-1,Daudi, Raji, Jurkat e HL-60. As células são crescidas em garrafas de 25 cm3,em 5mL de meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Onúmero de células foi contado por microscopia ótica em câmara de Neubauer eajustado para a concentração de 2x104 células/mL antes dos repiques,realizados duas vezes por semana. Para a linhagem Jurkat, a quantidade decélulas foi ajustada para 2x105/mL. A linhagem denominada Lucena-1 foiselecionada a partir de uma amostra de K562, que foi exposta a concentraçõescrescentes de VCR, iniciando-se por 3nM até um máximo de 60nM, a partir daqual as células sobreviventes foram mantidas. Para as culturas de Lucena-1além do meio de cultura e SFB foi adicionado 60nM de VCR. As culturas sãomantidas em estufa de CO2 5% a 37°C.

3.1.2 - Medida de viabilidade celular:

A fim de se medir a viabilidade celular após incubação com ospterocarpanos sintéticos, as células leucêmicas foram testadas utilizando-se oensaio colorimétrico com MTT (brometo de 3,4,5-dimetiazol-2-il-2,5-difeniltetrazol) (Mosmann, 1983; Denizot, 1986; Barile, 1994). As placascontendo células, igualmente na concentração de 2x104/mL, foram incubadasna estufa por 72 horas na presença das substâncias. A linhagem Jurkat foiincubada na concentração de 2x105/mL, e os linfócitos do sangue periférico a106/mL. A solução de MTT foi preparada em uma concentração de 5mg/mLdiluído em solução salina, sendo posteriormente adicionado nas células naquantidade de 20mL por poço da placa de ELISA. Foram aguardadas 3 horasapós esta incubação e as placas foram então centrifugadas a 1500rpm por 7minutos. O sobrenadante foi descartado após a centrifugação. O MTT reagecom a desidrogenase mitocondrial reduzindo os sais de tetrazólio, gerandocomo resultado cristais de formazan azul-arroxeados que foram então diluídosem 200μΙ_ de DMSO.

Após este procedimento a intensidade da coloração formada pôde sermedida em leitor de ELISA a um comprimento de onda de 490nm. Comobranco, descontado dos valores obtidos, foi utilizado apenas meio e 10% SFB1e como controles, somente células na ausência dos compostos. As leiturasforam feitas em triplicatas.

3.1.3 - Obtenção de linfócitos ativados de sangue periférico:

O sangue periférico foi obtido de doadores saudáveis com uso de seringaheparinizada, a fim de se impedir a coagulação, e armazenado em tubos de15mL. A esses tubos foi adicionado histopaque, substância capaz de formarum gradiente de densidade que possibilita a separação dos diferentes tiposcelulares do sangue. O sangue com o histopaque foi centrifugado por 30minutos a 1500rpm. No precipitado são encontradas as hemácias e célulaspolimorfonucleares em sua maioria, enquanto que o sobrenadante é compostobasicamente pelo plasma e uma camada de histopaque. Entre essas duascamadas forma-se uma interface da qual podem-se extrair as célulasmononucleares. Estes foram lavados em PBS e posteriormenteressuspendidos em meio RPMI com 10% de soro fetal bovino. As célulasmononucleares (80% linfócitos) foram então ajustados para uma concentraçãode 1x106/mL, correspondente à concentração dessas células circulantes nosangue. A incubação com os compostos se deu na presença de 5mg/mL defitohemaglutinina (PHA), um conhecido agente mitógeno, já que células emdivisão são normalmente mais sensíveis a quimioterápicos em geral.

3.2 - Leishimania:

3.2.1 - Manutenção dos parasitos:

O agente etiológico foi cultivado in vitro segundo técnica descrita porTrager & Jensen (1976) que consiste na manutenção do parasita numasuspensão de hemácias a 370 C, em condições de esterilidade, em umaatmosfera de 5 a 10% de C02 e aproximadamente 5% de 02.Soluções com diferentes concentrações (0.1 - 1000 pg-ml) de cadaamostra a ser testada foram esterilizadas por irradiação gama. Serãoadcionados 100mL de uma suspensão de 2% de hemácias 0+ e 0,2% deparasitemia aos poços da placas de cultura. Em seguida serão adicionados10mL das soluções contendo as amostras em teste ou o fármaco de referência,(artesunato, mefloquina ou cloroquina; 50 nM) segundo (Desjardins, 1979) e(Chulay, 1982) . Após 72 horas de incubação a 370 C em atmosfera de 10%de C02 e aproximadamente 5% de 02, uma pequena alíquota da suspensãoserá recolhida com auxílio de pipeta Pasteur e colocada em lâmina de vidropara realização de esfregaço a ser corado pelo método de May-Grunwald-Giemsa. A parasitemia será determinada segundo a seguinte equação:

% P A = HAx 100 HC

PA: Parasitemia

HA: Número de hemácias parasitadas tratadas com amostras.

HC: Número de hemácias parasitadas sem tratamento

3.2.2 - Produção de oxido nítrico:

A produção de oxido nítrico foi estimada, indiretamente, medindo-se aconcentração de nitrito no sobrenadante das culturas dos macrófagos. Osmacrófagos peritoneais murinos serão obtidos e plaqueados em placas de 96poços. Após a retirada das células não aderentes, os macrófagos serão ou nãoinfectados e as moléculas selecionadas serão adicionadas em diversasconcentrações (1 a 100 μΜ). Após 72h, as placas serão centrifugadas e osobrenadante será avaliado colorimetricamente quanto a concentração denitrito adicionando-se reagente de Griess. A absorbância será medida nocomprimento de onda de 570nm. A produção de óxido nítrico é um importantemecanismo Ieishmanicida do macrófago e serve como parâmetro de avaliaçãodo estado de ativação dessas células.

3.2.3 - teste in vitro:

Células totais de Iinfonodos (principalmente linfócitos) de camundongosforam incubadas em placas de 96 poços a 37°C, com as moléculas estudadasem diversas concentrações (1 a 100 μΜ), com o estímulo ou não deconcanavalina A. Após 72h, a viabilidade das células será estimadacolorimetricamente pela quantidade de Iactato desidrogenase (LDH) liberadano sobrenadante das culturas.

3.2.4 - teste in vivo:

As moléculas selecionadas foram testadas em um modelo deIeishmaniose cutânea experimental murina. Camundongos BALB/c serãoinfectados na orelha com L. amazonensis-GFP e tratados pela via intralesionalcom as moléculas aprovadas nas etapas anteriores. A eficácia do tratamentofoi monitorada por dois parâmetros: a) crescimento da lesão medido compaquímetro, e b) carga parasitária medida por fluorimetria, conformemetodologia previamente estabelecida (Boek, 2006).

3.3 - Toxoplasmose:

3.3.1 - Obtenção de taquizoítas de Toxoplasma gondii:

Taquizoítas de 7. gondii (cepa RH) serão mantidos por passagens nacavidade peritoneal de camundongos a cada 2 ou 3 dias. Após esse período,será feito lavado peritoneal injetando 3 ml de solução de Hank. O lavado serácentrifugado a 100g por 5 minutos, o sobrenadante coletado e centrifugado a1000g por 10 minutos. Os parasitas serão ressuspensos em DMEM econtados.

3.3.2 - Macrófagos peritoneais:

Macrófagos peritoneais serão obtidos por lavagem peritoneal decamundongos suíços (CF1) com 5 ml de solução de Hank. Os macrófagosserão plaqueados em lamínulas de vidro em placas de 24 poços. Após 1 horade aderência a 37°C, as células serão lavadas com solução de Hank a 37°C ecultivadas com "Dulbeccos Modified Eagle's Médium" (DMEM) contendo 5% desoro fetal bovino (SFB) a 37°C, em atmosfera de 5% de CO2.

3.3.3 - Ativação de macrófagos peritoneais e interação comparasitas:

Interações serão feitas com macrófagos residentes ou ativados com 50U/ml de interferon-γ recombinante de camundongo (IFN-γ; Sigma) e 100 ng/mlde lipopolissacarídeo bacteriano (LPS; Sigma). Para comprovação doenvolvimento do óxido nítrico (NO) na destruição dos protozoários utilizaremoso NG monometil L-arginina (LNMA-SIGMA) que bloqueia a produção de NO.

Após ativação dos macrófagos, 1 mg/ml de LNMA será acrescida ao meio decultura.

3.3.4 - Preparo das interações para observação em microscopiaóptica:

Após os diferentes pontos de interação, as células serão fixadas emsolução de Bouin (70 % solução saturada de ácido Pícrico, 23 % formol e 7 %ácido acético), lavadas, coradas com solução de Giemsa (diluído em águadestilada na proporção de 1:10), desidratadas numa série de soluções acetona-xilol, montadas sobre Entellan e observadas em microscópio óptico. As célulascoradas serão quantificadas da seguinte forma: a) % de macrófagos comparasitas, b) % de macrófagos sem parasitas e c) número de parasitas pormacrófago. Esses resultados de quantificação serão usados para analisar odesenvolvimento da infecção e a sobrevivência dos parasitas.

3.3.5 - Preparo das interações para observação em microscopiaeletrônica:

Após diferentes pontos de interações com diferentes tratamentos, ascélulas serão fixadas no método karnowski (2,5% de glutaraldeído, 4% deParaformaldeído em tampão cacodilato de sódio a 0,1M). Após a fixação, ascélulas serão lavadas em tampão cacodilato de sódio e então pós-fixadas comtetróxido de ósmio a 1%. Após o processo de fixação, as células serãodesidratadas em uma série de concentrações de acetona e em seguidaincluídas em resina Epóxi. Após a ultramicrotomia, os cortes serãocontrastados em acetato de uranila e citrato de chumbo e posteriormenteobservado em microscopia eletrônica de transmissão.

3.3.6 - Cultivo de LLCMK2:

Cultivo de células fibroblásticas LLCMK2 in vitro foi feito com DMEMsuplementado com 5 % de Soro Fetal Bovino. As células foram cultivadas em5% de atmosfera de CO2.3.3.7 - Interação Parasito-Célula:

As interações de Toxoplasma gondii com Macrófagos ou célulasfibroblásticas LLCMK2 foram realizadas nos tempos de 1, 24 e 48 horas deinteração. Todas as interações foram realizadas na presença ou ausência dadroga LQB-118 de acordo com os resultados apresentados.

3.4 - Ação das novas pterocarpaquinonas de fórmula (!) sobre o TNF:

3.4.1 - Inalação de LPS:

Para a inalação de LPS1 foi utilizada uma câmara de inalação de vidrocom volume de 1 litro, com capacidade para até 8 camundongos. Oscamundongos foram colocados nesta câmara e inalaram por cinco minutos osaerossóis produzidos por pressão positiva de 2 ml_ de uma suspensão de LPScontendo 0,5 mg/mL, preparado em salina fisiológica (NaCI 0,9%). Os animaisdo grupo controle inalaram apenas salina fisiológica.

3.4.2 - Tratamento com LQB:

Grupos de animais foram tratados com LQB dissolvido em salinafisiológica com 10% de etanol (veículo), nas doses de 1, 10 e 100 mg/Kg. Assubstâncias foram administradas em um volume de 200 μί por viaintraperitonial (i.p.) 1 hora antes da inalação de LPS. Em paralelo, grupos deanimais foram tratados com 200 μΙ do veículo.

3.4.3 - Lavado Broncoalveolar (LBA):

Três horas após a inalação de LPS, os animais foram sacrificados pordeslocamento cervical, suas traquéias foram expostas, canuladas e ospulmões foram lavados com salina fisiológica para um volume final de 1,5 mLem tubos mantidos a 4°C (Figura 10). Uma alíquota de 300 μί do lavado foiutilizada para a contagem e identificação das células e o restante foicentrifugado a 1.500 χ g por 10 minutos (SORVALL, EUA). O sobrenadante foiestocado a -20°C para posterior dosagem de citocinas.

3.4.4 - Contagem de células:

O número total de células foi determinado em um contador de células dotipo Coulter Counter (Coulter Eletronics Inc. - EUA). A identificação dosdiferentes tipos de células presentes no LBA foi feita após citocentrifugação de200 μΙ de LBA a 80 χ g por 1 minuto (Shandon - EUA). As lâminas preparadasa partir da citocentrifugação foram coradas com o kit Diff-Quick (SHANDON,EUA).

Foram contadas cerca de 200 células em cada lâmina. A identificaçãodo tipo celular foi baseada conforme as descrições morfológicas descritas porStevens e Lowe (1995).

3.4.5 - Obtenção de células mononucleares de sangue periférico(PBMC) humano:

Células mononucleares foram obtidas a partir do sangue periférico dedoadores sadios, por centrifugação com gradiente de Ficoll. 20 mL de sangueperiférico foram cuidadosamente colocados em 16 mL de Ficoll seguido decentrifugação a 1500 χ g por 30 minutos. Depois de recolhido, o PBMC foilavado duas vezes com salina fisiológica e ressuspendido em meio de culturaRPMI 1640 contendo estreptomicina 0,1 mg/mL, penicilina 100 U/mL,suplementado com 10% de SFB.

3.4.6 - INCUBACÃO COM LPS in vitro:

O PBMC ressuspendido em RPMI foi semeado em placa de 24 poços (8χ 105 células/poço). As células foram incubadas com LPS na concentração de2 μg/mL a 37°C em 4% de CO2 por 2 horas. Após a incubação com LPS, osobrenadante foi recolhido e centrifugado a 14000 χ g por 1 minuto paradescartar qualquer célula eventual. O sobrenadante foi estocado a -20°C paraposterior dosagem de citocinas.

3.4.7 - Incubação com LQB in vitro:

Os grupos de células tratadas receberam, concomitantemente comestímulo de LPS, LQB diluído em 0,5% DMSO (veículo) nas concentrações de10, 25, 50 e 100 μΜ. Um grupo de células recebeu apenas o veículo.

Claims (36)

1. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas de fórmula geral (I):<formula>formula see original document page 34</formula>em que:R1 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C8 cíclico ou alifático; aril C3 a C8 cíclicoou alifático; alquenil C3 a C8 cíclico ou alifático; alquenilil C3 a C8 cíclico oualifático; um grupo éter C2 a C8; formila; metal alcalino; metal alcalino terroso;halogênio; nitro; amino; amina; C02R3; um grupo álcool C1 a C8;R2 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C8 cíclico ou alifático; aril C3 a C8 cíclicoou alifático; alquenil C3 a C8 cíclico ou alifático; alquenilil C3 a C8 cíclico oualifático; um grupo éter C2 a C8; formila; metal alcalino; metal alcalino terroso;halogênio; nitro; amino; amina; um grupo álcool C1 a C8; e,R3 pode ser H; alquil C1 a C8 cíclico ou alifático; aril C3 a C8 cíclico oualifático; alquenil C3 a C8 cíclico ou alifático; alquenilil C3 a C8 cíclico oualifático; metal alcalino; metal alcalino terroso e halogênio; e seus sais; solvatose racematos.

2. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com areivindicação 1, onde:R1 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C6 cíclico ou alifático; metal alcalino;halogênio; nitro; amino; amina; C02R3; um grupo éter C2 a C6; formila; umgrupo álcool C1 a C6; e,R2 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C6 cíclico ou alifático; um grupo éter C2 aC6; formila; e,R3 pode ser Η; OH; alquil C1 a C3 cíclico ou alifático; metal alcalino ehalogênio.

3. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com areivindicação 1 onde:R1 pode ser H; hidroxila; alquil C1 a C6 cíclico ou alifático; nitro; amino; amina;R2 pode ser H; hidroxila; formila; um grupo éter C2 a C6; e,R3 pode ser H; alquil C1 a C3 cíclico ou alifático; Na; K e halogênio.

4. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com asreivindicações 1 a 3, compreendendo a capacidade de serem ativados porredução, gerando espécies alquilantes no meio intracelular.

5. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com asreivindicações 1 a 3, compreendendo a capacidade de capazes de apresentarefeito citotóxico seletivo em animais mamíferos humanos e/ou não humanos.

6. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com areivindicação 5 compreendendo a capacidade de interromper a proliferaçãocelular de células que se dividem constantemente.

7. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com asreivindicações 1 a 3 compreendendo a capacidade de provocar a redução dosníveis do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) in vivo em animais mamíferoshumanos e/ou não humanos.

8. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com areivindicação 1 compreendendo a capacidade de serem empregados notratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno deproliferação celular indesejada; bem como, poderem ser empregados notratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas à elevação dos níveisTNF-α, em um animal mamífero humano e/ou não humano hospedeiro.

9. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com areivindicação 8 onde, as doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômenode proliferação celular indesejada são neoplasias e parasitoses.

10. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com areivindicação 9, em que, as parasitoses são preferencialmente doenças oudisfunções pertencentes ao grupo de doenças ou disfunções que compreendea leishmaniose; malária; doença de chagas; toxoplasmose; lepra; tuberculose;brucelose; dentre outras.

11. Novos compostos da família das pterocarpanoquinonas, de acordo com areivindicação 9, em que, preferencialmente, as neoplasias são tumoresresistentes a múltiplas drogas (MDR); tais como leucemias; tumores sólidos deórgãos como pulmão; mama; fígado; dentre outros.

12. Processo de produção do composto de fórmula (I), <formula>formula see original document page 36</formula> compreendendo as etapas de: citaras etapas de:a) Síntese do intermediário 1;b) Purificação do intermediário 1;c) Síntese dos compostos de fórmula (I);d) Purificação dos compostos de formula (I).

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, compreendendo na etapa a) areação entre a acroleína e a Iausona na presença de um solvente orgânico ede uma solução acida, em refluxo durante um período de tempo compreendidoentre 2 a 12 horas.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, onde na etapa a)preferencialmente se emprega o tolueno como solvente.

15. Processo de acordo com a reivindicação 13, onde a solução ácida da etapaa) pode conter ácidos orgânicos, tais como o ácido acético, ácido fórmico,ácido fumárico, ácido fenil borônico, ácido valérico, ácido acrílico, ácidopropiônico, ácido benzóico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido terafitálico,ácido fumárico, ácido tricloroacético, ácido tartárico, dentre outros.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que, preferencialmente éempregada uma solução contendo ao menos ácido acético e ácido fenilborônico.

17. Processo de acordo com a reivindicação 13, compreendendo um período dereação inferior a 6 horas.

18. Processo de acordo com a reivindicação 12, compreendendo na etapa b) aconcentração e purificação da cromenoquinona.

19. Processo de acordo com a reivindicação 12, onde, a etapa c) tem inicio pelareação entre a cromenoquinona e um fenol o/ío-substituído por halogênio; napresença de um solvente orgânico; um sal de metal e fosfinas na presença dequantidades sub-estequiométricas de um catalisador em período de tempocompreendido entre 1 a 24 horas sob refluxo em atmosfera modificada.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, onde preferencialmente éempregado um orto-iodo fenol substituído ou não substituído nos carbonos 3 e-5 do anel aromático.

21. Processo de acordo com a reivindicação 19, compreendendopreferencialmente o uso da acetona como solvente.

22. Processo de acordo com a reivindicação 19, compreendendo o emprego deuma quantidade sub-estequiométrica do catalisador a base de paládio paraacelerar esta etapa da reação.

23. Processo de acordo com a reivindicação 19, compreendendo o emprego docarbonato de prata como sal metálico preferencialmente empregado.

24. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a reação ocorre entre-8 a 20 horas, em atmosfera de nitrogênio.

25. Processo de acordo com a reivindicação 19, compreendendo o empregoopcional de um segundo período de refluxo, pela a adição de uma quantidadeadicional do fenol o/fo-substituído por halogênio ao meio reacional.

26. Processo de acordo com a reivindicação 19, onde a etapa d) ocorre demaneira análoga a etapa b).

27. Composição farmacêutica contendo os novos compostos da família daspterocarpaquinonas de formula (I):<formula>formula see original document page 38</formula> e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles; em uma quantidade farmaceuticamente aceitável;além de compostos não ativos farmaceuticamente aceitáveis, voltada para otratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno daproliferação celular indesejada, em animais mamíferos humanos ou nãohumanos, é um objeto desta invenção.

28. Composição farmacêutica contendo os novos compostos de formula (I): <formula>formula see original document page 38</formula> e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, em uma quantidade farmaceuticamente aceitável,além de compostos não ativos farmaceuticamente aceitáveis voltada para otratamento de doenças e/ou disfunções relativas ao aumento dos níveis doTNF-α em animais mamíferos humanos ou não humanos é um outro objetodesta invenção.

29. Uso dos novos compostos de formula (I):<formula>formula see original document page 39</formula> e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles para a fabricação de um medicamento voltado parao tratamento de doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno deproliferação celular indesejada tais como neoplasias e parasitoses em animaismamíferos humanos ou não humanos é também um objeto desta invenção.

30. Uso dos novos compostos de formula (I): <formula>formula see original document page 39</formula> e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveisfarmaceuticamente aceitáveis, sozinhos ou uma combinação deles para afabricação de um medicamento voltado para o tratamento de doenças e/oudisfunções relativas ao aumento dos níveis do TNF-α em animais mamíferoshumanos ou não humanos.

31. Medicamento compreendendo uma quantidade farmaceuticamenteaceitável de um ou mais dos novos compostos da família daspterocarpanoquiinonas de fórmula (I):<formula>formula see original document page 40</formula> podendo ser encontrado nas formas farmacêuticas de: soluções, soluçõesinjetáveis, poções, supensões, emulsões, tinturas, elixires, xaropes, pastilhas,comprimidos, tabletes, hóstias, pílulas, pérolas, drágeas, cápsulas, pós, óvulos,cremes, cataplasma, ungüentos, ceratos, linimentos, pastas, loções, pomadas,géis, aerossóis, pensos (adesivos) transdérmicos, ampolas, sprays, além deoutras.

32. Método de tratamento de uma doença e/ou disfunção relacionada aofenômeno de proliferação celular indesejada, compreendendo a administraçãode uma quantidade terapeuticamente aceitável dos novos compostos deformula (I): <formula>formula see original document page 40</formula> e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, há um animal mamífero humano ou não humanoportador de uma doença e/ou disfunção relacionadas ao fenômeno deproliferação celular indesejada.

33. Método de tratamento de uma doença e/ou disfunção relativa ao aumentodos níveis do TNF-α, compreendendo a administração de uma quantidadeterapeuticamente aceitável dos novos compostos de formula (I):<formula>formula see original document page 41</formula> e/ou seus sais, solvatos e racematos farmaceuticamente aceitáveis, sozinhosou uma combinação deles, há um animal mamífero humano ou não humanoportador de doenças e/ou disfunções relativas ao aumento dos níveis do TNF-a.

34. Método de tratamento, de acordo com as reivindicações 32 e 33, no qual,as doenças e/ou disfunções relacionadas ao fenômeno de proliferação celularindesejada são neoplasias e parasitoses.

35. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 34, onde asneoplasias são tumores resistente a múltiplas drogas (MDR) tais comoIeucemias e tumores sólidos de órgãos como pulmão; mama; fígado e outrosórgão e tecidos.

36. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 34, onde asparasitoses são compreendidas do grupo de doenças ou disfunções tais comoa leishmaniose; malária; doença de chagas; toxoplasmose; lepra; tuberculose;brucelose dentre outras doenças e/ou disfunções provocadas pela infestaçãode parasitos no corpo de um animal hospedeiro, podendo ser um animalmamífero humano ou não humano.