BRPI0806285A2 - sequência geneticamente modificada do antìgeno asp-2 de trypanosoma cruzi, proteìna recombinante asp-2 e vìrus geneticamente modificados que expressam o antìgeno asp-2 recombinante - Google Patents
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Abstract
SEQUêNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTìGENO ASP-2 DE TRYPANOSOMA CRUZI, PROTEìNA RECOMBINANTE ASP-2 E VìRUS GENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM O ANTìGENO ASP-2 RECOMBINANTE. A presente invenção diz respeito à construção de uma seqüência geneticamente modificada do antígeno ASP-2 de Tiypanosoma cruzi, uma proteína recombinante codificada pela referida seqüência e vírus geneticamente modificados que expressam o antígeno ASP-2 recombinante. A invenção é útil para a imunização de mamíferos contra doença de Chagas.
Description
"SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO ASP-2 DETRYPANOSOMA CRUZI1 PROTEÍNA RECOMBINANTE ASP-2 E VÍRUSGENETICAMENTE MODIFICADOS QUE EXPRESSAM O ANTÍGENO ASP-2RECOMBINANTE"
A presente invenção diz respeito à construção de uma seqüênciageneticamente modificada do antígeno ASP-2 de Trypanosoma cruzi, uma proteínarecombinante codificada pela referida seqüência e vírus geneticamente modificadosque expressam o antígeno ASP-2 recombinante. A invenção é útil para a imunizaçãode mamíferos contra doença de Chagas.
A infecção pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi causa a doença deChagas, uma doença negligenciada que afeta mais de 16 milhões de habitantes naAmérica Latina. Mais de 300.000 novos pacientes tornam-se infectados pelo T. cruzianualmente, apesar do uso de fármacos ter diminuído sensivelmente os índices demortalidade e morbidade associados a esta doença. Os fármacos utilizados para otratamento da doença de Chagas em indivíduos infectados cronicamente não sãoeficazes e parasitas naturalmente multiresistentes a quimioterapia já foram descritosem várias regiões da América Latina (URBINA. J.A. Specific treatment of Chagasdisease: Current status and new developments. Curr. Opin. Infect. Dis. 14, 733-741. 2001).
A proteção imunológica contra esse parasita parece ser altamente dependenteda indução das respostas das células T CD8+ e interferon gama (IFN-gama),similarmente ao encontrado para os estágios pré-eritrocíticos para espécies dePlasmodium ou para infecções causadas por Toxoplasma gondii. Células T CD4+ comperfil de secreção de citocinas de linfócitos T helper tipo 1 (Th1) e anticorpos tem sidodescritos como mediadores da proteção contra todas as doenças citadasanteriormente. Portanto, o desenvolvimento de uma vacina contra T. cruzi ajudaria naindução de ampla imunidade contra antígenos de parasitas (BRENER Z. andGAZZINELLI R.T. Immunological control of Trypanosoma cruzi infection andpathogenesis of Chagas disease. Int. Arch. Allergy Immunol. 1997. 114,103-110).
Vários estudos focalizaram o desenvolvimento de uma vacina utilizando-separasitas T. cruzi atenuados (MENEZES H. Active immunization of mice with the aviru-Ient Y strain of Trypanosoma cruzi against experimental infection of mice. Rev. Inst.Med. Trop. Sao Paulo. 1968. 10, 1-4) ou mortos (BASOMBRIO M.A. Trypanosomacruzi: Partial prevention of the natural infection of guinea pigs with a killed parasitevaccine. Exp. Parasitol. 1990. 71,1-8). Infelizmente, a maioria das imunizações só foicapaz de atrasar as manifestações da doença ou, na melhor das circunstâncias,diminuir a patologia associada. A proteção efetiva contra T. cruzi poderia seralcançada quando forem utilizados adjuvantes que direcionam uma resposta Th1(HOFT D.F. & EICKHOFF C.S. Type 1 immunity provides both optimal mucosal andsystemic protection against a mucosally invasive, intracellular pathogen. Infect. Immun.2005. 73, 4934-4940) e/ou vacinas de subunidades de DNA que codificam certosantígenos do parasito (SEPULVEDA P., HONTEBEYRIE M., LIEGEARD P., MASCILLIA., NORRIS K.A. DNA-based immunization with Trypanosoma cruzi complementreguIatory protein elicits complement Iytic antibodies and confers protection againstTrypanosoma cruzi infection. Infect. Immun. 2000. 68, 4986-4991. SCHNAPP A.R.,EICKHOFF C.S., SCHARFSTEIN J.,HOFT D.F. Induction of B- and T-cell responses tocruzipain in the murine model of Trypanosoma cruzi infection. Microbes Infect. 2002. 4,805-813. FRALISH B.H. & TARLETON R.L. Genetic immunization with LYT1 or a poolof trans-sialidase genes protects mice from Iethal Trypanosoma cruzi infection.Vaccine. 2003. 21, 3070-3080).
Quando vacinas de DNA plasmidiais foram utilizadas, dois antígenos foramtestados com sucesso: trans-sialidase (TS) e proteína-2 de superfície amastigota(ASP-2) (COSTA F., FRANCHIN G., PEREIRA-CHIOCCOLA V.L., RIBEIRAOM. M.,SCHENKMAN S., RODRIGUES, M.M. Immunization with a plasmid DNA containingthe gene of trans-sialidase reduces Trypanosoma cruzi infection in mice. Vaccine.1998. 16, 768-774. FUJIMURA A.E., KINOSHITA S.S., PEREIRA-CHIOCCOLA V.L.,RODRIGUES M.M. DNA sequences encoding CD4+ and CD8+ T-cell epitopes areimportant for efficient protective immunity induced by DNA vaccination with aTrypanosoma cruzi gene. Infect. Immun. 2001. 69, 5477-5486. GARG. N. &TARLETON R.L. Genetic immunization elicits antigen-specific protective immuneresponses and decreases disease severity in Trypanosoma cruzi infection. Infect.Immun. 2002. 70, 5547-5555. BOSCARDIN S.B., KINOSHITA S.S., FUJIMURA A.E.,RODRIGUES M.M. Immunization with cDNA expressed by amastigotes ofTrypanosoma cruzi elicits protective immune response against experimental infection.Infect. Immun. 2003. 71, 2744-2757. FRALISH B.H. & TARLETON R.L. Geneticimmunization with LT1 or a pool of traris-sialidase genes protects mice from IethalTrypanosoma cruzi infection. Vaccine. 2003. 21, 3070-3080. VASCONCELOS J.R.,HIYANE M.I., MARINHO C.R., CLASER C., MACHADO. A.M., GAZZINELLI R.T.,BRUNA-ROMERO O., ALVAREZ J.M., BOSCARDIN S.B., RODRIGUES M.M.Protective immunity against Trypanosoma cruzi infection in a highly susceptible mousestrain after vaccination with genes encoding the amastigote surface protein-2 andtrans-sialidase. Hum. Gene Ther. 2004. 15, 878-886)
ASP-2 é um antígeno amastigota de superfície com uma função aindadesconhecida (LOW H.P., SANTOS M.A., WIZEL B. & TARLETON R.L. Amastigotesurface proteins of Trypanosoma cruzi are targets for CD8+ CTL. J. Immunol. 1998.160, 1817-1823).
Vírus recombinantes têm se mostrado eficientes para o desenvolvimento devacinas. Testes clínicos com candidatos de vacinas baseados em vírus recombinantespara malária, tuberculose e AIDS demonstram níveis sem precedentes de respostaimunológica celular contra os produtos recombinantes expressos pelos vírus, quandoem comparação com formulações vacinais baseadas em proteínas recombinantespurificadas ou vacinas de DNA plasmidiais (ROCHA C., CAETANO B., MACHADO A.,BRUNA-ROMERO O. Recombinant viruses as tools to induce protective cellularimmunity against infectious diseases. Int. Microbiol. 2004. 7, 89-94).
Uma vantagem no uso de vírus recombinantes situa-se no fato de a própriapartícula viral desempenhar um efeito adjunto por ela mesma, o que permite evitar ouso de outros compostos adjuvantes ou citocinas. Portanto, adenovírusrecombinantes, vírus influenza, vírus vaccínia (MVA) destacam-se pela suaspropriedades imuno-modulatórias (GUILLOT L., LE GOFFIC R., BLOCK S., ESCRIOUN., AKIRA S., CHIGNARD. M. SITAHAR M. Involvement of toll-like receptor 3 in theimmune response of Iung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A vírus.J. Biol. Chem. 2003. 280, 5571-5580).
O mecanismo de ação das vacinas baseadas em adenovírus recombinantesconsiste na infecção de células do hospedeiro, resultando na expressão dos antígenosheterólogos ao nível do citoplasma das células infectadas. O antígeno assim expressopoderá ainda ser secretado. Os adenovírus recombinantes são altamenteimunogênicos, devido à sua capacidade em infectar células imunes especializadas naapresentação de antígenos, como as células dendríticas, por exemplo. Soma-se aisso, o efeito imuno-estimulador exercido por algumas proteínas do capsídeo viral, oque resulta na potencialização da resposta imune, bem como num melhordirecionamento do perfil de citocinas produzidas pelas células efetoras para um tipoTh 1, o que é importante na proteção contra agentes parasitários como o T. cruzi.
A grande maioria das técnicas de construção de poxvírus recombinantes, entreos quais se inclui o vírus MVA (Vírus Vaccinia Ankara Modificado), envolve arecombinação homóloga de DNA em células infectadas. De uma forma geral, aprodução de vírus recombinantes emprega vetores plasmidiais de transferênciacontendo um cassete de expressão onde o gene exógeno é controlado por umpromotor forte, normalmente precoce e tardio, dos poxvírus. Este cassete éflanqueado por seqüências de DNA homólogas à seqüências presentes no genoma dovírus, e servirão para dirigir a recombinação ao lócus desejado.
Em nossas construções, os plasmídeos de transferência dirigem a inserção dosgenes exógenos nos sítios denominados Região de Deleção Il e/ou Região deDeleção Ill do genoma do vírus MVA. Estas são regiões genômicas cujos genespresentes foram alterados, removidos ou mutados durante o processo de geração dovírus, a cerca de 40 anos atrás. Desta forma, estas regiões ditas naturalmentemodificadas (ou mutadas) são propícias para a inserção de cassetes de expressão degenes exógenos, uma vez que a inserção destes elementos não altera nenhumafunção vital do vírus MVA. A taxa de recombinação é relativamente alta, em torno de0,1%, e os vírus recombinantes podem ser selecionados, purificados em placa eamplificados.
A segurança do vetor vacinai baseado no MVA foi experimentalmentedemonstrada quando macacos artificialmente imuno-suprimidos foram inoculados comaltas doses do vírus (109 PFUs - uma quantidade 100 vezes superior à dosenormalmente usada para imunização por poxvírus). Durante todo período deacompanhamento os animais não demonstraram nenhuma anormalidadehematológica ou patológica. Estas características não-replicativas do MVA fazem comque o vírus possa ser trabalhado em condições de Biossegurança de Nível 1, etambém impedem que o vírus se espalhe para indivíduos não vacinados ou mesmopara o meio-ambiente. Apesar da extensa limitação replicativa em determinadascélulas tais como as de mamíferos, o MVA manteve todas as características tãopeculiares que fazem dos Poxvírus atraentes vetores de expressão eucariota,incluindo-se sua enorme capacidade de acomodar DNA exógeno em seu genoma (até25 Kb); controle viral preciso da expressão de proteínas codificadas por genes viraisou recombinantes;absoluta ausência de persistência viral ou integração no genoma dohospedeiro; e facilidade para a produção de vetores e vacinas recombinantes.
Na presente invenção, os plasmídeos de transferência consistem basicamentede cDNAs codificantes das proteínas de interesse vacinai clonados no plasmídeopLW44 (Figura 1) ou similares. Ao seu lado, e em orientação oposta, está clonado ogene marcador que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). A co-expressãodesta proteína é usada para facilitar a seleção dos vírus recombinantes. Estes doisgenes são, por fim, flanqueados por seqüências de DNA do vírus MVA homólogas aosítio de inclusão no genoma do vetor viral, denominado Região de Deleção III.
Na figura 2, no sentido 5' - 3', o cassete de inserção consiste de: Seqüêncianucleotídica homóloga à porção 5'da Região de Deleção Il e/ou Região de Deleção Illdo genoma de MVA (1); Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (2); genecodificador de proteína marcadora - Proteína Verde Fluorescente (GFP) ou proteínavermelha Fluorescente (RFP) (3); sítio de clonagem para o cDNA/Gene exógeno deinteresse (4), Promotor modificado precoce/tardio do vírus Vaccínia (5); nucleotídicahomóloga à porção 3'da Região de Deleção Il e/ou Região de Deleção Ill do genomade MVA (6). Embora tanto as regiões de Deleção Il e Ill do vírus MVA possam serigualmente utilizadas para a inserção de cassetes de expressão de genes exógenos,as construções descritas nesta patente foram criadas a partir da inserção de diferentescassetes de expressão apenas na região de Deleção III, ficando a inserção na região Ilcomo uma alternativa metodológica factível, a ser usada oportunamente.
A seguir, a presente invenção será descrita detalhadamente através deexemplos. É necessário frisar que a invenção não está limitada a esses exemplos,mas que também inclui variações e modificações dentro dos limites nos quais elafunciona.
EXEMPLO 01: Construção dos Plasmídeos de Transferência
A construção dos plasmídeos de transferência contendo o cDNA que codifica osegmento selvagem da neuraminidase (NA) do vírus WSN contém o segmento da NAclonado em orientação negativa no plasmídeo de transferência pPR7 entre aseqüência truncada do promotor da polimerase I humana (pol I) e a seqüência daribozima do vírus da hepatite δ. Este tipo de construção permite a síntese de umamolécula de vRNA sintética nas células transfectadas. O plasmídeo pPRNA38 foiconstruído a partir do plasmídeo pPRNA35. Ele codifica um segmento recombinanteda NA, na qual a ORF da NA é seguida pela duplicação da região promotora 3', umsítio de clonagem Xho\ / Nhe\, uma duplicação dos últimos 42 nucleotídeos da ORF daNA e a região promotora 5'original (Figura 03).
O plasmídeo de transferência pPRNA38-dTS foi construído para a expressãode um fragmento de 660 nucleotídeos do gene da TS, o qual contém os epítoposreconhecidos por linfócitos Β, T CD4+ e CD8+. Resumidamente, para a construção doplasmídeo pPRNA38-TS, o fragmento da TS foi obtido por PCR utilizando osoligonucleotídeos senso GGG CTC GAG CAT GGG GAA AAC AGT CGT TGG e anti-senso GGG GCT AGC TAA ATG GAT ACT TGC CCA ACG TTA TAA ATA CCG CCAAGA AAT TGA TTT GT. Este último contém a seqüência que codifica para os epitoposda TS reconhecidos pelos linfócitos T CD8+. O produto de amplificação obtido foipurificado e posteriormente clonado no plasmídeo pPRNA38, entre os sítios Xho\ eNhe I.
EXEMPLO 02: Produção dos vírus Influenza recombinantes por genéticareversa
A estratégia de expressão utilizada pelos pesquisadores da presente invençãofoi baseada nos estudos de Flick e Hobom, os quais demonstraram que o complexopolimerase do vírus influenza é capaz de reconhecer os promotores 3'e 5'mesmoquando estes se localizam no interior de um pseudo-segmento viral. Desta forma, ospesquisadores da presente invenção exploraram essas observações para construirvírus influenza recombinantes, carregando de maneira estável um segmentobicistrônico da NA, na qual uma seqüência heteróloga se encontra sob o controle deuma região promotora 3'duplicada. Tais segmentos bicistrônicos podem ser transcritose replicados de duas maneiras distintas, após a interação da região promotora 5' comcada uma das duas regiões promotoras 3'. Neste tipo de construção, a regiãocodificadora da NA se encontra na posição 3' proximal e a seqüência heteróloga estálocalizada próxima à extremidade 5'. Dessa forma, uma vez que a expressão daproteína NA é essencial para a viabilidade viral, nós asseguramos que um segmentobicistrônico completo, foi mantido ao longo da propagação dos vírus recombinantes.Os vírus influenza foram obtidos por genética reversa de acordo com a técnicadescrita previamente por Fodor e colaboradores (Figura 04).
Resumidamente, monocamadas sub-confluentes de células co-culturas decélulas MDCK e HEK 293T, cultivadas em meio mínimo modificado por Dulbecco(DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) foram transfectadas pelosplasmídeos codificando o segmento selvagem ou recombinantes da NA, bem como osplasmídeos que codificam os demais 7 segmentos do vírus influenza, juntamente comos plasmídeos que codificam as quatro proteínas do complexo de replicação do vírusinfluenza (pcDNA-PB1, pcDNA-PB2, pcDNA-PA e pcDNAA-NP), utilizando o reagentede transfecção Fugene 6 (Roche) (Figura 05).
Desta forma, oito complexos ribonucleoprotéicos foram reconstituídos in vivopermitindo a transcrição e a replicação de todos os segmentos virais e a síntese denovos vírions. Após 24 horas de incubação a 35°C, as células transfectadas foramincubadas durante mais dois dias em DMEM suplementado 2% SFB. Os vírusrecombinantes assim obtidos foram amplificados uma vez em células MDCK epurificados duas vezes por placas de Iise em células MDCK, antes de seremsubmetidos a uma amplificação final em células MDCK. Os estoques virais terão seustítulos infecciosos determinados em células MDCK pelo método de placas de Iise sobuma camada de agarose em meio DMEM com 2% de SFB. A presença da seqüênciaheteróloga no genoma viral foi analisada pelas técnicas de PCR e seqüenciamento.
EXEMPLO 03: Obtenção e caracterização de vírus influenza recombinantescarreando uma seqüência heteróloga.
Os vírus carreando um fragmento da proteína TS (vNA38-TS), a porção n-terminal(VNA38-ASP2-PTN1) ou mediai (vNA38-ASP2-PTN2) da proteína ASP-2 doTripanosoma cruzi foram obtidos pela técnica de obtenção de vírus recombinantesinteiramente a partir de plasmídeos (conforme descrito na figura 01). Os resultadosilustrados na Figura 06 representam os vírus vNA38-ASP2-PTN1 e vNA38-ASP2-PTN2 após clonagem e amplificação complementar em células MDCK. Os genomasdos vírus portadores dos segmentos bicistrônicos acima mencionados foramanalisados por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos que permitem analisar a região deinserção da seqüência heteróloga. Fragmentos de amplificação do tamanho esperadoforam obtidos foram observados (dados não mostrados), indicando que os mesmoshaviam conservado a seqüência heteróloga nos seus genomas.
EXEMPLO 04: Produção de um fragmento da proteína heteróloga TS emcélulas MDCK infectadas pelos vírus influenza recombinantes.
Monocamadas confluentes foram infectadas com 2 m.o.i do vírus selvagemvNA ou do dois clones vírus recombinante vNA38-TS. 24 horas após as infecções,extratos celulares foram preparados e a proteína TS foi analisada por western blot.Conforme apresentado na Figura 05, níveis significativos das proteínas TS puderamser detectados nas células MDCK, demonstrando a capacidades dos vírus influenzarecombinantes em expressar essas seqüências heterólogas.
EXEMPLO 05: Produção dos Vírus Parentais e Recombinantes em cultivocelular.
A multiplicação dos vetores virais parentais (MVA) ou recombinantes deve serfeita em células fibroblásticas de embriões de galinha (CEF)1 produzidos através docultivo primário de embriões de cerca de 10 dias de postura. Brevemente, os embriõessão dissecados em condições estéreis para retirada dos órgãos internos. Em seguidaas células são dispersas mecanicamente, através de passagem em seringas, etambém quimicamente, através da incubação com tripsina. As células são lavadaspara remoção de hemácias e outros contaminantes, e em seguida são suspensas esedimentadas em frascos plásticos contendo meio E-MEM ou DMEM suplementadoscom 10% de soro fetal bovino. A construção dos vetores poxvirais se baseia narecombinação homóloga dos vírus em células infectadas na presença de plasmídeosde transferência contendo os DNAS codificadores dos antígenos-alvo.
Em seguida, os recombinantes são gerados através da transfecção dosplasmídeos de transferência em células de embrião de galinha (CEF) previamenteinfectadas pelo vírus MVA. Resumidamente, CEFs são infectados com MOI de 0,1 a 1dos vírus MVA parentais. Após uma hora de adsorção, adiciona-se às célulasinfectadas uma solução contendo 2 \ig do plasmídeo de transferência e 5μΙ do agentetransfectante Lipofectamina (Invitrogen, EUA). As células são incubadas por 5 horas,quando o meio de transfecção é removido e substituído por meio de cultivosuplementado com 2,5% de soro fetal bovino. As células são então incubadas pormais 48 horas e coletadas ao final do período. Os vírus recombinantes sãoselecionados e purificados em ciclos sucessivos de purificação de placa, através davisualização em microscópio da presença da proteína marcadora GFP (fluorescênciaverde). Cabe ressaltar que, através da maneira como o vetor de transferência foielaborado, somente vírus recombinantes contendo o cassete de expressão do geneexógeno deverão expressar também a proteína GFP. Após os ciclos de purificaçãodos clones recombinantes, estes têm seus títulos amplificados em ciclos sucessivosde infecção de número crescente de células. Quando títulos da ordem de 109 PFUs/mlsão alcançados, as suspensões virais são purificadas em colchão de sacarose ehomogeneizadas em Tris-HCI 10mM, sendo aliquotados e estocados a -70°C.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: A) Plasmídeo pl_W44, vetor de transferência para construção dosvírus MVA recombinantes. O Sítio de clonagem do gene codificador da proteína deinteresse é clonado entre os sítios de restrição para as enzimas Smal e Xbal. O genecodificador da proteína GFP está representado. Os promotores não estãorepresentados. B) Exemplo de plasmídeo pronto para utilização, onde o genecodificador da proteína A2, por exemplo, de Leishmania, foi inserido.
Figura 02 - (A) Plasmídeo de transferência para construção dos vírus MVArecombinantes. B) Detalhe do cassete de inserção e expressão contendo osseguintes elementos gênicos: Seqüência nucleotídica homóloga à porção 5'da Regiãode Deleção II e/ou Região de Deleção III do genoma de MVA (1); Promotor modificadoprecoce/tardio do vírus Vaccíriia (2); gene codificador de proteína marcadora -Proteína Verde Fluorescente (GFP) ou proteína vermelha Fluorescente (RFP) (3); sítiode clonagem para o cDNA/Gene exógeno de interesse (4), Promotor modificadoprecoce/tardio do vírus Vaccínia (5); nucleotídica homóloga à porção 3'da Região deDeleção Il e/ou Região de Deleção Ill do genoma de MVA (6).
Figura 03: Representação esquemática dos plasmídeos de transferência parasíntese dos segmentos bicistronicos da NA derivados do vírus influenza A/WSN/33. Oplasmídeo pPR-NA35 é derivado do plasmídeo pPR-NA, o qual contém o cDNA dosegmento completo da NA em orientação negativa sob o controle do promotortruncado da polimerase I humana. Ele contém o cDNA do segmento recombinante daNA em orientação negativa, no qual a ORF da NA é seguida pela duplicação dopromotor 3', um sítio de clonagem Xhol/Nhel e o promotor 5'original. O plasmídeopPR-NA38 é derivado do plasmídeo pPR-NA35. Ele foi construído para conservar aintegridade da extremidade 5' ao longo dos seus últimos 70 nucleotídeos. Isto foiobtido pela inserção de uma duplicação dos últimos 42 nucleotídeos da ORF da NA(quadrado branco) os quais foram inseridos entre o promotor 5' e o "linker" Xhol/Nhel.pb: pares de base, SMC: sítio múltiplo de clonagem.
Figura 04: Genética reversa do segmento que codifica a neuraminidase dovírus A/WSN/33 sem vírus auxiliar (Plasmid only). Alternativamente, os vírusrecombinantes poderão ser obtidos por genética reversa. Assim, células HEK 293T(7x105 células em placas de 35 mm2, respectivamente) serão co-transfectadas com oplasmídeo que codifica o segmento da NA selvagem ou recombinante (500 ng), porcada um dos plasmídeos que codificam os demais segmentos do vírus influenza (500ng de cada plasmídeo); e pelos plasmídeos que permitem a expressão das proteínasdo complexo polimerase (PA, PB1 e PB2: 500 ng de cada) e da nucleoproteína NP(500 ng) em 10 μΙ de Fugene 6 (Roche), permitindo a reconstituição de 8 complexosribonucleoprotéicos funcionais in vivo e desta forma, a transcrição e a replicação dossegmentos virais. Os sobrenadantes serão coletados 72 horas após a transfecção.Após uma etapa de amplificação em células MDCK, os vírus transfectantes serãoclonados e posteriormente amplificados em células MDCK. * 4 plasmídeos deexpressão das proteínas do complexo polimerase PA, PB1 e PB2 e da nucleoproteínaNP. ** 8 plasmídeos de transferência dos segmentos do vírus influenza selvagem orecombinantes. *** vírus recombinantes.
Figura 05: Os vírus recombinantes foram obtidos por genética reversa semvírus auxiliar. Resumidamente, células HEK 293T (7x105 células em placas de 35mm2, respectivamente) foram co-transfectadas com o plasmídeos pPRNA38-TS (500ng), por cada um dos plasmídeos que codificam os demais segmentos do vírusinfluenza (500 ng de cada plasmídeo); e pelos plasmídeos que permitem a expressãodas proteínas do complexo polimerase (PA, PB1 e PB2: 500 ng de cada) e danucleoproteína NP (500 ng) em 10 μΙ de Fugene 6 (Roche). Os sobrenadantes dascélulas foram coletados 72 horas após a transfecção. Os vírus foram submetidos auma etapa de amplificação em células MDCK1 clonados por placa de Iise e submetidosa uma amplificação complementar em células MDCK. Os resultados aquirepresentados ilustram os fenótipo de 2 clones virais independentes de cada um dosvírus recombinantes.LISTA DE SEQÜÊNCIASEQ. ID N. 01 - Fragmento ASP
Fragmento ASP2-PTN1
1 ATG GGA ATG CAG GTG CAG ATC CAG AGC CTG TTT CTG CTC CTC CTG TGG GTG CCC GGG TCC. 60
Met Gly Met Gln Val Gln Ile Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser61 AGA GGA GGT ACC GCC GCT GTG GAG AGT AAG TCC GGG GAT GCG CCG CTG CCT CAA TGG GTC 120
Arg Gly Gly Thr Ala Ala Val Glu Ser Lys Ser Gly Asp Ala Pro Leu Pro Gln Trp Val
121 GAT ATT TTT GTG CCG GAA AAG ACG CAG GTG CTG CCC AAA GAG GGG TCT AAA AGT GGA GTG 180 Asp Ile Phe Val Pro Gly Lys Thr Gln Val Leu Pro Lys Glu Gly Ser Lys Ser Gly Val 181 AAG AAA GCA TTT GCT GCG CCT TCT CTC GTC AGT GCT GGT GGA GTA ATG GTT GCC TTT GCT 240 Lys Lys Ala Phe Ala Ala Pro Ser Leu vai Ser Ala Gly Gly Val Met Val Ala Phe Ala 241 GAA AGC TTG TTC GTT TAT ATC GTC CAT GAA CAT AAC TTG TTT GGG ATT AAG CCT TAC GAA 300 Glu Ser Leu Phe Val Tyr Ile vai HiS Gly His Asn Leu Phe Gly Ile Lys Pro Tyr Glu 301 ATT GTG GCC GGG TAC ATC AAG GCT GCG GAA TCG TGG CCG TCC ATT GTC GCT GAG GTC AAT 360 Ile Val Ala Gly Tyr Ile Lys Ala Ala GlU Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Glu Val Asn 461 GCT ACT ACA TGG AGG ACA CAC ACC GTT ATT GGC AGT AGG AAT GGC AAT GAT CGT TTG TGT 420 Ala Thr Thr Trp Arg Thr HiS Thr Val Ile Gly Ser Arg Asn Gly Asn Asp Arg Leu Cys 421 TAT TTG CAA CGG CCC ACA GCA GTT GCA AGG GAC AGT AAG GTG TTT CTA CTT GTG GGA AGC 480 Tyr Leu Gln Arg Pro Thr Ala Val Ala Arg Asp Ser Lys Val Phe Leu Leu Val Gly Ser 481 GAT ACT ACA AGA TAT GAC AGC GAT GAT AAT ATG TGG GTG AAA GAT GGC TGG GAT ATT CAA 540 Asp Thr Thr Arg Tyr Asp Ser Asp Asp Asn Met Trp Val Lys Asp Gly Trp Asp Ile Gln 541 CTG GTT GAG GGT GTG GCC ACG CAG TCC AAG GAC GGC GTG CAG AGT AAA CTG GTC AGC TGG 600 Leu Val Glu Gly Val Ala Thr Gln Ser Lys Asp Gly Val Gln Ser Lys Leu Val Ser Trp 601 GGT GAA CCC AAG TCG CTT TTA AAA CAG ATA CTC AAT CAC ACT CAA GAT CAG CTG AGG TAG 660 Gly Glu Pro Lys Ser Leu Leu Lys Gln Ile Leu Asn His Thr Gln Asp Gln Leu Arg STOP
Fragmento ASP2-PTN2
1 ATG GGA ATG CAG GTG CAG ATC CAG AGC CTG TTT CTG CTC CTC CTG TGG GTG CCC GGG TCC 60
Met Gly Met Gln Val Gln Ile Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser61 AGA GGA GGT ACC GAT GTT GTG ACT GCT GGT GGT TCA GGC ATT GTG ATG CAG AAT GAC ACG 120
Arg Gly Gly Thr Asp Val Val Thr Ala Gly Gly Ser Gly Ile Val Met Gln Asn Asp Thr
121 CTT GTG TTT CCT CTG ATG GTG AAT GGG CAA AAT TAC CCT TTT TCC TCG ATC ACT TAC TCG 180 Leu Val Phe Pro Leu Met Val Asp Gly Gln Asn Tyr Pro Phe Ser Ser Ile Thr Tyr Ser 181 ACG GAC AAA GGC AAT ACC TGG GTG TTC CCA GAG GGC ATT TCT CCT GTA GGA TGC CTT GAT 240 Thr Asp Lys Gly Asn Thr Trp Val Phe Pro Glu Gly Ile Ser Pro Val Gly Cys Leu Asp 241 CCC CGC ATC ACC GAA TGG GAG ACG GGA CAA ATT CTC ATG ATC GTT CAG TGT AAA GAT GAC 300 Pro Arg Ile Thr Glu Trp Glu Thr Gly Gln Ile Leu Met Ile Val Gln Cys Lys Asp Asp 301 CAG AGT GTG TTC GAG TCG CGT GAC ATG GGG AAA ACG TGG ACG GAG GCT ATC GGG ACA CTC 360 Gln Ser Val Phe Glu Ser Arg Asp Met Gly Lys Thr Trp Thr Glu Ala Ile Gly Thr Leu 361 TCA GGC GTG TGG GTC ATG TCA CAA CCA GGA GTT CGT CTA TAC AAA ATT TTT CGT GTG GGA 420 Ser Gly Val Trp Val Met Ser Gln Pro Gly Val Arg Leu Tyr Lys Ile Phe Arg Val Gly 421 GCC CTC ATC ACC GCC ACC ATT GAG GGA AGG AAG GTC ATG CTT TAC ACT CAG AGA GGG TAC 480 Ala Leu Ile Thr Ala Thr Ile Glu Gly Arg Lys Val Met Leu Tyr Thr Gln Arg Gly Tyr 481 ACC TCG GGG GAG AAA GAG GCC ACT GCA CTC TAC CTT TGG GTC ACG GAC AAC AAC CGC ACG 540 Thr Ser Gly GlU Lys Glu Ala Thr Ala Leu Tyr Leu Trp vai Thr Asp Asn Asn Arg Thr 541 TTT CAT GTT GGA CCG CTT TTT TTG GAG GAT AAT GTG AAT GAG ACG CTT GCC AAC GCC CTA 600 Phe His Val Gly Pro Leu Phe Leu Glu Asp Asn Val Asn Glu Thr Leu Ala Asn Ala Leu 601 CTG TAC TCG GAT GGT GCG TTG CAC CTT TTA AAG GAG AGG GCC AAT GAA AAA GAC GAG TAG 660 Leu Tyr Ser Asp Gly Gly Leu His Leu Leu Lys Glu Arg Ala Asn Glu Lys Asp Asp STOP
Claims (5)
1. "SEQÜÊNCIA GENETICAMENTE MODIFICADA DO ANTÍGENO ASP-2 DETRYPANOSOMA CRUZI caracterizada pela seqüência de nucleotídeos compreendera Seq. ID no(1).
2. PROTEÍNA RECOMBINANTE ASP-2 caracterizada pela seqüência deaminoácidos compreender a Seq. ID no(1).
3. VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA O ANTÍGENOASP-2 RECOMBINANTE caracterizado por compreender a Seq. ID no(1).
4. VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA O ANTÍGENOASP-2 RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 03, caracterizado pelo vírusser um vírus influenza.
5. VÍRUS GENETICAMENTE MODIFICADO QUE EXPRESSA O ANTÍGENOASP-2 RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 03, caracterizado pelo vírusser um vírus Ankara modificado (MVA).
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|---|---|---|---|---|
| WO2022246526A1 (pt) * | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Fundação Oswaldo Cruz | Proteína quimérica recombinante, seu uso, e, composição |
-
2008
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| B07E | Notice of approval relating to section 229 industrial property law |
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